CN102186982A - 生产发酵产物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在用于从含淀粉材料产生发酵产物的方法中增加发酵产物产量的方法。更具体而言，所述方法包括使用转化酶增加发酵产物产量。

Description

生产发酵产物的方法
技术领域
本发明涉及在用于从含淀粉材料产生发酵产物的方法中增加发酵产物产量(yield)的方法。
背景技术
从含淀粉材料产生发酵产物(如乙醇)，在本领域是众所周知的。一般而言使用两种不同的方法。最常使用的方法，通常称作“常规方法”，包括在高温使用(通常为)细菌α-淀粉酶液化经糊化的淀粉，然后在葡糖淀粉酶和发酵生物的存在下进行同时糖化和发酵。另一种众所周知的方法，通常称作“生淀粉水解(raw starch hydrolysis)”方法(RSH)，包括在初始糊化温度以下通常在酸性真菌α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和发酵生物存在下同时液化和发酵粒状淀粉。
用于常规方法中的高温液化生成糊精和可溶性糖，其进一步经糖化和发酵。然而作为所用高温的结果，在还原糖上的羰基基团和氨基酸上的氨基基团之间发生Maillard缩合反应并形成Maillard产物。RSH方法并不像常规方法那样涉及高温“烹制”。然而一些因素如水分含量水平和pH也可影响Maillard缩合反应。在两个方法中，掺入Maillard产物的糖不再可用于发酵，而总体发酵产物产量降低。
在发酵方法过程中生成的Maillard产物如上述的那些可具有其它的有害作用。例如，掺入Maillard产物的氨基酸导致在干酒糟(dried distillers grains)中可用的必需氨基酸如赖氨酸的减少，而干酒糟是发酵方法的副产物，用于如动物饲料的应用。还已知Maillard反应产物抑制一些发酵生物如酵母的生长，且可抑制通常用于发酵方法的酶如α-淀粉酶和其它糖源生成酶。
许多含淀粉材料如玉米除了淀粉之外还含有大量的蔗糖。转化酶和蔗糖酶是通常将蔗糖水解为葡萄糖和果糖的酶。然而，也已知这些酶具有转糖基活性，并能够在某些条件下合成寡糖。这些和其它涉及寡糖水解的糖苷酶也发生酶可逆反应的现象，或缩合，其中游离的单糖连接在一起同时释放水。该现象基本上类似任何化学反应的可逆性。
仍需要改进的方法，用于从含淀粉材料产生发酵产物如乙醇。非常需要增加发酵产物产量的方法改进。
发明内容
本发明涉及用于在含淀粉材料产生发酵产物的方法中增加发酵产物产量的方法。
在第一个方面，本发明涉及从含淀粉材料产生发酵产物的方法，其包括使用糖源生成酶和发酵生物在所述含淀粉材料起始糊化温度以下的温度在转化酶的存在下同时糖化和发酵含淀粉材料。
在第二个方面，本发明涉及从含淀粉材料产生发酵产物的方法，其包括下述步骤：
(a)在α-淀粉酶存在下将含淀粉材料液化；
(b)使用糖源生成酶糖化在步骤(a)中获得的经液化的材料；
(c)使用发酵生物进行发酵；
其中在液化步骤之前或过程中添加转化酶。
附图说明
图1显示通过重量损失测量的变化量的转化酶对乙醇产量随时间的作用。
图2显示通过HPLC测量的变化量的转化酶对乙醇产量随时间的作用。
发明详述
本发明涉及用于从含淀粉材料产生发酵产物特别是乙醇的方法，其中所述方法包括糖化和发酵，或液化、糖化和发酵步骤。
在一个实施方案中，本发明涉及用于在转化酶存在下从含淀粉材料产生发酵产物的方法，所述含淀粉材料未经糊化(即，未经烹制)。根据本发明，所需的发酵产物如乙醇可不经液化包含含淀粉材料和水的浆料来产生。在另一个实施方案中，本发明的方法包括在起始糊化温度之下，优选在α-淀粉酶和/或糖源生成酶的存在下糖化含淀粉材料如粒状淀粉，以产生可由合适的发酵生物发酵为所需发酵产物的糖。
在一个实施方案中，将转化酶添加至水性浆料。在另一个实施方案中，转化酶在糖化和/或发酵之前或过程中添加。在另一个实施方案中，转化酶可减少Maillard产物形成。在另一个实施方案中，转化酶可增加蔗糖水解。
在一个实施方案中，所需的发酵产物，优选乙醇，是从未糊化的(即，未经烹制的)，优选磨制的谷类谷粒如玉米产生的。
术语“起始糊化温度”意指淀粉糊化开始的最低温度。通常而言，在水中加热的淀粉在约50℃至75℃开始糊化；糊化的准确温度取决于具体的淀粉且可由本领域技术人员容易地确定。因此，起始糊化温度可根据植物物种、具体植物物种的变种以及生长条件而变动。关于本发明，给定含淀粉材料的起始糊化温度可确定为使用Gorinstein.S.和Lii.C.，Starch/
Figure BDA0000056304240000031
Vol.44(12)pp.461-466(1992)所述的方法，在5％的淀粉颗粒中丧失双折射的温度。
在糖化之前，可制备含淀粉材料如粒状淀粉的浆料，其具有10-55％w/w干固形物(DS)，优选25-45％w/w DS，更优选30-40％w/w DS的含淀粉材料。浆料可包含水分和/或工艺水(process water)，例如釜馏物(逆流(backset))、洗涤水(scrubber water)、蒸发器冷凝液或馏出物、来自蒸馏的侧线汽提器水(side-stripper water)或来自其它发酵产物设备(plant)的工艺水。由于本发明的方法在起始糊化温度以下进行，因此不发生显著的粘度增加，如果需要，可使用高水平的釜馏物。在一个实施方案中，含水浆料包含约1至约70％v/v，优选15-60％v/v，特别为约30至约50％v/v的水和/或工艺水，如釜馏物(逆流)、洗涤水、蒸发器冷凝物或蒸馏物，来自蒸馏的侧线汽提器水，或来自其它发酵产物设备的工艺水，或其组合等。
可通过优选以干磨或湿磨将其粒度减小到0.05至3.0mm，优选0.1-0.5mm来制备含淀粉材料。根据本发明，含淀粉材料中至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或者优选至少99％的干固形物转化为可溶的淀粉水解物。
在一个实施方案中，所述方法在低于起始糊化温度的温度进行，意指温度通常位于30-75℃的范围内，优选45-60℃的范围内。
在另一个实施方案中，所述方法在25℃至40℃，如28℃至35℃，如30℃至34℃，优选约32℃的温度进行。
在一个实施方案中，进行发酵从而使得糖水平，如葡萄糖水平保持在低水平，如6％w/w以下，如约3％w/w以下，如约2％w/w以下，如约1％w/w以下，如约0.5％以下，或0.25％w/w以下，如约0.1％w/w以下。所述低水平的糖可通过简单的使用经调整量的酶和发酵生物来实现。
本领域技术人员可容易地确定使用的酶和发酵生物的剂量或量。酶和发酵生物的使用量也可经选择以保持麦芽糖在发酵液中的低浓度。举例而言，麦芽糖水平可保持为约0.5％w/w以下，如约0.2％w/w以下。
本发明的方法可在pH约3至约7，优选pH 3.5至6，或更优选pH 4至5进行。在一个实施方案中，发酵持续6至120小时，且优选24至96小时。
本发明的另一个方面涉及用于从含淀粉材料产生发酵产物的方法，包括
(a)在α-淀粉酶的存在下液化含淀粉材料；
(b)使用糖源生成酶糖化在步骤(a)中获得的经液化的材料；
(c)使用发酵生物发酵；
其中在液化步骤之前或过程中添加转化酶。
在一个实施方案中，转化酶可预防Maillard反应产物在液化步骤之前或过程中形成。转化酶可在液化步骤之前或过程中从浆料中可得到的可溶糖或多糖合成蔗糖或其它非还原糖或寡糖。非还原糖如蔗糖并不易受Maillard反应影响，但可用于糖化和发酵。
在另一个实施方案中，转化酶可增强蔗糖水解。
糖化步骤(b)和发酵步骤(c)可顺序或同时进行。在一个实施方案中，糖化和发酵步骤顺序进行。在另一个实施方案中，糖化和发酵步骤同时进行。
在一个具体实施方案中，本发明的方法还在步骤(a)之前包括下述步骤：
x)减小含淀粉材料的粒度；
y)形成包含含淀粉材料和水的浆料。
含水浆料可含有10-55％w/w含淀粉材料的干固形物(DS)，优选25-45％w/w的干固形物(DS)，更优选30-40％w/w干固形物。将浆料加热到糊化温度以上，并可添加α-淀粉酶，优选细菌或酸性真菌α-淀粉酶以起始液化(稀化(thinning))。在一个实施方案中，在进行步骤(a)中的α-淀粉酶处理前，浆料可经喷射蒸煮(jet-cooked)以进一步使其糊化。
在一个实施方案中，液化可作为三步热浆方法来进行。将浆料加热至60-95℃，优选80-85℃，并添加α-淀粉酶以起始液化(稀化)。然后可将浆料在95-140℃，优选105-125℃的温度喷射蒸煮约1-15分钟，优选约3-10分钟，特别是约5分钟左右。使浆料冷却至60-95℃并添加更多的α-淀粉酶以完成水解(二次液化)。液化方法通常在pH 4.5-6.5，特别是在pH 5-6进行。
糖化步骤(b)可使用本领域众所周知的条件进行。举例而言，完全的糖化方法可持续约24至约72小时，然而，通常仅在30-65℃，通常约60℃的温度进行通常40-90分钟的预糖化，然后是在同时发酵和糖化方法(SSF方法)中在发酵过程中的完全糖化。糖化通常在20-75℃，优选40-70℃，通常约60℃的温度，在pH 4-5的pH，通常在约pH 4.5进行。
发酵产物，特别是乙醇生产中最广泛使用的方法为同时糖化和发酵(SSF)方法。其中对糖化没有保持阶段，意思是发酵生物(如酵母)和酶可一起添加。SSF可通常在25℃至40℃，如28℃至35℃，如30℃至34℃，优选约32℃左右的温度进行。在一个实施方案中，发酵进行6至120小时，且优选24至96小时。
发酵培养基
“发酵培养基”指进行发酵的环境，其包括发酵底物，即，由发酵生物代谢的糖源。
所述发酵培养基可包含营养物(nutrient)和针对所述发酵生物的生长刺激剂(growth stimulator)。营养物和生长刺激剂在发酵领域广泛应用，并包括氮源(如氨)；尿素，维生素和矿物质，或其组合。
发酵生物
术语“发酵生物”指任何适用于发酵方法并能够产生所期望的发酵产物的生物，包括细菌和真菌生物。特别合适的发酵生物能够将糖(如葡萄糖或麦芽糖)直接或间接发酵(即转化)为所期望的发酵产物。发酵生物的实例包括真菌生物，如酵母。优选的酵母包括酵母属菌种(Saccharomyces spp.)，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的菌株。
在一个实施方案中，将所述发酵生物添加于发酵培养基中，从而使得活的(viable)发酵生物(如酵母)在每mL发酵培养基中的计数为105到1012，优选107到1010，特别是约5x107的范围内。
商业上可得到的酵母包括，例如，RED STARTM和ETHANOL REDTM酵母(可由Fermentis/Lesaffre，USA得到)，FALITM(可由Fleischmann’s Yeast，USA得到)，SUPERSTART和THERMOSACCTM新鲜酵母(可由Ethanol Technology，WI，USA得到)，BIOFERM AFT和XR(可由NABC-North American Bioproducts Corporation，GA，USA得到)，GERT STRAND(可由Gert Strand AB，Sweden得到)，以及FERMIOL(可由DSM Specialties得到)。
含淀粉材料
根据本发明，可使用任何合适的含淀粉的材料。所述起始材料通常基于期望的发酵产物而选择。适用于本发明方法的含淀粉的材料的实例包括全谷粒、玉米、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、西米、木薯(cassava)、树薯(tapioca)、高粱、稻、豌豆(pea)、豆(bean)或甘薯，或其组合，或谷类。也涵盖蜡质和非蜡质类型的玉米和大麦。
术语“粒状淀粉”意指未烹制的生淀粉，即，以其天然形式存在于谷类、块茎或谷粒中的淀粉。淀粉在植物细胞中作为不溶于水的微小颗粒形成。当置于冷水中时，淀粉颗粒可吸收少量液体并膨胀(swell)。在高至50℃-75℃的温度，膨胀可为可逆的。然而，在更高温度开始称为“糊化”的不可逆膨胀。待加工的粒状淀粉可为高度精制的淀粉质量，优选至少90％，至少95％，至少97％或至少99.5％纯，或其可为更加粗制的含淀粉材料，其含有包括非淀粉部分(如胚残余物和纤维)的(例如，经磨制的)全谷粒。原材料(如全谷粒)可通过例如磨制减小粒度以打开其结构并允许进一步的加工。根据本发明优选两个方法，湿磨和干磨。在干磨中，将整粒磨碎并使用。湿磨给出胚和粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)的良好分离，并常常用于使用淀粉水解物产生(例如)糖浆的场合(location)。干磨和湿磨在淀粉加工领域都是众所周知的，并等同地涵盖于本发明的方法中。在一个实施方案中，粒度减少至约0.05到3.0mm，优选0.1-0.5mm，或使得至少30％，优选至少50％，更优选至少70％，甚至更优选至少90％的含淀粉材料可穿过具有0.05到3.0mm筛网，优选0.1到0.5mm筛网的筛。
发酵产物
术语“发酵产物”意指使用发酵生物通过包括发酵步骤的方法生成的产物。根据本发明所涵盖的发酵产物包括醇类(例如，乙醇、甲醇和丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、琥珀酸和葡糖酸)；酮类(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶类；维生素(例如，核黄素、B12和β-胡萝卜素)；以及激素。在一个优选实施方案中，所述发酵产物是乙醇，例如，燃料乙醇；饮用乙醇，即可饮用的中性酒精；或工业乙醇或在可消费醇工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳制品工业(例如，发酵乳制品)、皮革工业和烟草工业中使用的产品。优选的啤酒类型包括爱儿啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、钵尔透啤酒(porter)、陈贮啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(malt liquor)、发泡酒(happoushu)、高醇啤酒(high-alcohol beer)、低醇啤酒(low-alcohol beer)、低热量啤酒(low-calorie beer)或清淡啤酒(light beer)。所用的优选发酵方法包括醇发酵方法。根据本发明所得的发酵产物，如乙醇，可优选用作燃料。然而，如果其为乙醇，其亦可用作饮用乙醇。
回收
在发酵之后，可从发酵培养基中分离发酵产物。可蒸馏浆料以提取期望的发酵产物，或可从发酵培养基中通过微滤或膜过滤技术提取期望的发酵产物。或者，可通过提馏(stripping)回收发酵产物。回收技术在本领域为众所周知的。在一个实施方案中，发酵产物如乙醇可任选地在发酵之后通过蒸馏来回收。
酶
即使在本发明的方法的上下文中未特别提及，可理解的是酶为以有效量使用。
转化酶/蔗糖酶
转化酶是蔗糖酶的常用名。如本文中使用的“转化酶”和“蔗糖酶”具有相同含意。转化酶的正式名称为β-呋喃果糖苷酶(E.C.3.2.1.26)，且该酶催化的反应是β-呋喃果糖苷中的末端非还原性β-呋喃果糖苷残基的水解。也已知转化酶具有转糖基活性并能够在某些条件下合成寡糖。
转化酶可来为任何来源，包括细菌、真菌或植物来源。在RSH方法中，将转化酶在液化之前或过程中，或糖化和发酵之前或过程中添加至浆料，并以有效量添加。在一个实施方案中，转化酶是以0.001至1.00mg/g DS的量添加的。在另一个实施方案中，转化酶是以0.01至0.09mg/g DS的量，或者以0.05至0.80mg/g DS的量添加的，或者以0.05至0.40mg/g DS的量添加的，或者以0.05至0.20mg/g DS或0.10至0.20mg/g DS的量添加的。
包含转化酶的商业组合物包括来自面包酵母和产朊假丝酵母(Candida utilis)的转化酶(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，来自酵母的转化酶(USB Corporation，Cleveland，OH)，(Centerchem，Inc.Norwalk，CT)，Invertase(Advanced Enzyme Technologies，Ltd.，Thane，India)和
Figure BDA0000056304240000072
(Novozymes，A/S)。
α-淀粉酶
根据本发明可使用任何α-淀粉酶(如真菌、细菌或植物来源的)。在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶为酸性α-淀粉酶，例如，酸性真菌α-淀粉酶或酸性细菌α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”意指α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，当其以有效量添加时，在3到7，优选3.5到6，或更优选4-5的范围内的pH具有最佳活性。
细菌α-淀粉酶
根据本发明，所述细菌α-淀粉酶优选源自芽孢杆菌属。
在一个优选实施方案中，所述芽孢杆菌属α-淀粉酶源自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，枯草杆菌(Bacillus subtilis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearotherlnophilus)的菌株，但也可源自其它芽孢杆菌属菌种。涵盖的α-淀粉酶的特定实例包括示于WO99/19467的SEQ ID NO：4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶，示于WO 99/19467的SEQ ID NO：5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶，和示于WO 99/19467的SEQ IDNO：3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(所有序列通过提述并入本文)。在一个实施方案中，所述α-淀粉酶可为分别与示于WO 99/19467的SEQ ID NOS：1，2或3中的任何序列具有至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，例如至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的同一性程度的酶。
所述芽孢杆菌属α-淀粉酶也可为变体和/或杂合体，特别是WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059和WO 02/10355(所有文件通过提述并入本文)任一中所描述的。特别涵盖的α-淀粉酶变体公开于美国专利号6,093,562、6,297,038或美国专利号6,187,576(通过提述并入本文)，并包括在位置R179到G182具有一个或两个氨基酸缺失的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSG α-淀粉酶)变体，优选WO 1996/023873公开的双缺失-参见，例如，第20页第1-10行(通过提述并入本文)，优选与WO 99/19467公开的SEQID NO：3所列的野生型BSG α-淀粉酶氨基酸序列相比对应于Δ(181-182)，或使用WO 99/19467中的SEQ ID NO：3的编号方式缺失氨基酸R179和G180(所述文献通过提述并入本文)。甚至更优选的是芽孢杆菌属α-淀粉酶，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其较之WO 99/19467公开的SEQ ID NO：3所列的野生型BSG α-淀粉酶氨基酸序列具有对应于Δ(181-182)的双缺失，且进一步包括N193F取代(也表示为I181*+G182*+N193F)。
细菌杂合α-淀粉酶
特别涵盖的杂合α-淀粉酶包括地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的445个C-末端氨基酸残基(示于WO 99/19467的SEQ ID NO：4)，以及源自解淀粉芽孢杆菌的α淀粉酶的37个N-末端氨基酸残基(示于WO 99/19467的SEQ ID NO：5)，并具有下列取代中的一个或多个，特别是全部：
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+1201F+A209V+Q264S(使用WO 99/19467的SEQ ID NO：4的地衣芽孢杆菌编号方式)。也优选具有一个或更多下述突变(或在其它芽孢杆菌属α-淀粉酶骨架中的对应突变)的变体：H154Y，A181T，N190F，A209V和Q264S和/或位置176和179之间两个残基的缺失，优选E178和G179的缺失(使用WO 99/19467的SEQ ID NO：5编号方式)。
在一个实施方案中，所述细菌α-淀粉酶和细菌杂合α-淀粉酶以0.0005-5KNU每g DS，优选0.001-1KNU每g DS，例如约0.050KNU每g DS的量添加。
真菌α-淀粉酶
真菌α-淀粉酶包括源自曲霉属菌株的α-淀粉酶，如米曲霉(Aspergillus oryzae)，黑曲霉(Aspergillus niger)和川地曲霉(Aspergillus kawach ii)α-淀粉酶。
优选的酸性真菌α-淀粉酶为Fungamyl-样α-淀粉酶，其源自米曲霉的菌株。根据本发明，术语“Fungamyl-样α-淀粉酶”指下述的α-淀粉酶，即与WO96/23874的SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的成熟部分显示高同一性，即，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或甚至100％的同一性。
另一个优选的酸性α-淀粉酶源自黑曲霉的菌株。在一个优选实施方案中，所述酸性真菌α-淀粉酶来自黑曲霉，作为“AMYA_ASPNG”以原始登录号P56271公开于Swiss-prot/TeEMBL数据库中，并描述于WO 89/01969(实施例3，通过提述并入本文)。源自黑曲霉的商业上可得到的酸性真菌α-淀粉酶是SP288(可由Novozymes A/S，Denmark得到)。
其它涵盖的野生型α-淀粉酶包括源自根毛霉属(Rhizomucor)和多孔菌属/亚灰树花菌属(Meripilus)的菌株，优选微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)(WO2004/055178通过提述并入本文)或巨多孔菌/大型亚灰树花菌(Meripilus giganteus)菌株的那些α-淀粉酶。
在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶源自川地曲霉，并由Kaneko等J.Ferment.Bioeng.81：292-298(1996)“Molecular-cloning and determination of the nucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stableα-amylase from Aspergillus kawachii.”公开，并进一步作为EMBL：#AB008370公开。
所述真菌α-淀粉酶也可为包括淀粉结合域(SBD)和α-淀粉酶催化域的野生型酶(即，非杂合体)，或其变体。在一个实施方案中，所述野生型α-淀粉酶源自川地曲霉的菌株。
真菌杂合α-淀粉酶
在一个优选实施方案中，所述真菌酸性α-淀粉酶为杂合α-淀粉酶。真菌杂合α-淀粉酶的优选实例包括公开于WO 2005/003311或美国专利公开号2005/0054071(Novozymes)或美国专利申请号60/638,614(Novozymes)中的那些，通过提述并入本文。杂合α-淀粉酶可包括α-淀粉酶催化域(CD)和碳水化合物结合域/模块(CBM)，如淀粉结合域，以及任选的接头。
所涵盖的杂合α-淀粉酶的特定实例包括美国专利申请号60/638,614实施例中的表1到5中公开的那些，包括具有催化域JA118和罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)SBD(US 60/638,614中的SEQ ID NO：100)的Fungamyl变体，具有罗耳阿太菌AMG接头和SBD(US 60/638,614中的SEQ ID NO：101)的微小根毛霉α-淀粉酶，具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(其作为美国申请号11/316,535中氨基酸序列SEQ ID NO：20，SEQ IDNO：72和SEQ ID NO：96的组合公开于表5)，或作为WO2006/069290中表5中的V039，和具有罗耳阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的巨多孔菌/大型亚灰树花菌α-淀粉酶(US 60/638,614中的SEQ ID NO：102)。其它特别涵盖的杂合α-淀粉酶为任何列于美国申请号11/316,535和WO 2006/069290实施例4中表3、4、5、6中所列的任何杂合α-淀粉酶(通过提述并入本文)。
涵盖的杂合α-淀粉酶的其它特定实例包括美国专利公开号2005/0054071中公开的那些，包括第15页表3公开的那些，如具有川地曲霉接头和淀粉结合域的黑曲霉α-淀粉酶。
也涵盖下述α-淀粉酶，其与任何上面提及的α-淀粉酶显示高同一性，即，与成熟酶序列显示至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或甚至100％同一性。
当根据本发明使用时，酸性α-淀粉酶可以以0.001到10AFAU/g DS，优选0.01到5AFAU/g DS，特别为0.3到2AFAU/g DS。或者，酸性α-淀粉酶可根据本发明以0.001到1FAU-F/g DS，优选0.01到1FAU-F/g DS的量添加。
商业α-淀粉酶产品
优选的包含α-淀粉酶的商业组合物包括来自DSM(Gist Brocades)的MYCOLASETM；BANTM、TERMAMYLTM SC、FUNGAMyLTM、LIQUOZYMETM X、LIQUOZYMETM SC和SANTM SUPER、SANTM EXTRA L(Novozymes A/S)和CLARASETM L-40,000、DEX-LOTM、
Figure BDA0000056304240000111
FRED-L、
Figure BDA0000056304240000112
HPA、
Figure BDA0000056304240000113
ALPHA、
Figure BDA0000056304240000114
XTRA、
Figure BDA0000056304240000115
AA、
Figure BDA0000056304240000116
DELTA AA和GC358(Genencor Int.)，FUELZYMETM-LF(Verenium Inc)，以及以商品名SP288出售的酸性真菌α-淀粉酶(可由Novozymes A/S，Denmark得到)。
糖源生成酶
术语“糖源生成酶”包括葡糖淀粉酶(其为葡萄糖生成者)，β-淀粉酶和产麦芽糖淀粉酶(其为麦芽糖生成者)以及支链淀粉酶和α-葡糖苷酶。糖源生成酶能够产生碳水化合物，其可由所述发酵生物用作能量源，例如，当用于本发明的方法以供产生发酵产物，例如乙醇时。所产生的碳水化合物可直接或间接的转化为期望的发酵产物，优选乙醇。根据本发明，可使用糖源生成酶的混合物。特别涵盖的混合物为包含至少葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，特别是酸性淀粉酶，甚至更优选酸性真菌α-淀粉酶的混合物。葡糖淀粉酶活性(AGU)和真菌α-淀粉酶活性(FAU-F)之间的比例(AGU每FAU-F的比例)可在本发明的一个实施方案中为1-100AGU/FAU-F，特别是2-50AGU/FAU-F，如在10-40AGU/FAU-F范围内，特别是当进行一步发酵(RSH)时，即，当糖化和发酵同时进行而无液化步骤时。
在一个常规淀粉到乙醇的方法中(即，包括液化步骤(a))，所述比例可优选定义于EP 140,410-B1，特别是当步骤(b)中的糖化和步骤(c)中的发酵同时进行时。
葡糖淀粉酶
根据本发明使用的葡糖淀粉酶可源自任何合适的来源，例如源自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的，选自下组：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等，(1984)，EMBO J.3(5)p.1097-1102)，或其变体，如公开于WO 92/00381，WO 00/04136和WO 01/04273(来自Novozymes，Denmark)的那些；公开于WO 84/02921的泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.，(1991)，55(4)p.941-949)，或它们的变体或片段。其它曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等，(1996)，Prot.Eng.9，p.499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等，(1995)，Prot.Eng.8，p.575-582)；N182(Chen等，(1994)，Biochem.J.301，p.275-281)；二硫键、A246C(Fierobe等，(1996)，Biochemistry，35，p.8698-8704)；以及在A435和S436位置导入Pro残基(Li等，(1997)，Protein Eng.10，p.1199-1204)。
其它的葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)(之前表示为罗耳伏革菌(Corticium rolfsii))葡糖淀粉酶(参见美国专利号4,727,026和Nagasaka等(1998)“Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamylases from Corticium rolfsii，Appl Microbiol Biotechnol 50：323-330)，踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是源自埃莫森踝节菌(Talaromyces emersonii)(WO 99/28448)、Talaromyces leycettanus(美国专利号Re.32,153)，杜邦踝节菌(Talaromyces duponti)，嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)(美国专利号4,587,215)的。
涵盖的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP 135,138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO 86/01831)以及瓣环栓菌(Trametes cingulata)，纸质大纹饰孢菌(Pachykytospora papyracea)，以及大白桩菇(Leucopaxillus giganteus)的葡糖淀粉酶，其均披露于WO 2006/069289；或WO2007/124285中公开的红边隔孢伏革菌(Peniphora rufomarginata)，或其混合物。根据本发明涵盖的还有杂合葡糖淀粉酶。所述杂合葡糖淀粉酶的实例公开于WO 2005/045018。特定的实例包括实施例1表1和4中公开的杂合葡糖淀粉酶(该杂合体通过提述并入本文)。
涵盖的还有葡糖淀粉酶，其与任何上面提及的葡糖淀粉酶显示高同一性，即，与上面提及的成熟酶序列显示至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或甚至100％的同一性。
商业上可得到的包含葡糖淀粉酶的组合物包括AMG 200L、AMG 300L、SANTM SUPER、SANTM EXTRA L、SPIRIZYMETM PLUS、SPIRIZYMETMFUEL、SPIRIZYMETM B4U、SPIRIZYMETM ULTRA和AMGTM E(来自Novozymes A/S)；OPTIDEXTM 300、GC480、GC 147(来自Genencor Int.)；AMIGASETM和AMIGASETM PLUS(来自DSM)；
Figure BDA0000056304240000121
G900、
Figure BDA0000056304240000122
480ETHANOL、
Figure BDA0000056304240000123
L-400、
Figure BDA0000056304240000131
L-500、VHP和G990ZR(来自Genencor Int.)。
在一个实施方案中，葡糖淀粉酶以0.0001-20AGU/g DS，优选0.001-10AGU/g DS，特别是0.01-5AGU/g DS，如0.1-2AGU/g DS的量添加。
β-淀粉酶
β-淀粉酶(E.C 3.2.1.2)为传统上给予外作用的(exo-acting)产麦芽糖淀粉酶的名称，其催化直链淀粉，支链淀粉以及相关的葡萄糖聚合物中1，4-α-糖苷键的水解。自非还原的链末端以逐步的方式连续移除麦芽糖单元直至分子降解，或者，在支链淀粉的情况下，直至到达分枝点。释放的麦芽糖具有β异头物构型，由此得到β-淀粉酶的名称。
已经从多种植物和微生物中分离了β-淀粉酶(W.M.Fogarty和C.T.Kelly，Progress in Industrial Microbiology，vol.15，pp.112-115，1979)。这些β-淀粉酶的特征在于具有40℃到65℃的最适温度以及4.5到7的最适pH。来自大麦的商业上可得到的β-淀粉酶为来自Novozymes A/S，Denmark的NOVOZYMTM WBA和来自Genencor Int.，USA的SPEZYMETM BBA 1500。
产麦芽糖淀粉酶
淀粉酶也可为产麦芽糖α-淀粉酶。“产麦芽糖α-淀粉酶”(葡聚糖1，4-α-麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能够将直链淀粉和支链淀粉水解成α构型的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的产麦芽糖淀粉酶商业上可由Novozymes A/S得到。产麦芽糖α-淀粉酶描述于美国专利号4,598,048，4,604,355和6,162,628，其通过提述并入本文。
在一个优选实施方案中，所述产麦芽糖淀粉酶可以0.05-5mg总蛋白/克DS或0.05-5MANU/g DS的量添加。
所述糖源生成酶可为任何糖源生成酶，包括上面“糖源生成酶”部分所列的那些。在一个优选实施方案中，所述糖源生成酶为葡糖淀粉酶。在一个优选实施方案中，所述葡糖淀粉酶选自源自如下菌株的组：曲霉属，优选黑曲霉或泡盛曲霉的菌株，踝节菌属，特别是埃莫森踝节菌的菌株；或阿太菌属(Athelia)，特别是罗耳阿太菌的菌株；栓菌属(Trametes)，优选瓣环栓菌的菌株；大纹饰孢菌属(Pachykytospora)的菌株，优选纸质大纹饰孢菌(Pachykytospora papyracea)的菌株；或白桩菇属(Leucopaxillus)，优选大白桩菇的菌株；或隔孢伏革菌属(Peniophora)的菌株，优选菌种红边隔孢伏革菌(Peniophora rufomarginata)的菌株；或其混合物。
所述α-淀粉酶可为任何α-淀粉酶，包括在上面“α-淀粉酶”部分提及的那些。在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶为酸性α-淀粉酶，特别是酸性真菌α-淀粉酶。在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶选自真菌α-淀粉酶的组。在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶源自曲霉属，特别为黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉或川地曲霉的菌株，或根毛霉属，优选微小根毛霉的菌株，或多孔菌属/亚灰树花菌属，优选巨多孔菌/大型亚灰树花菌的菌株。
在本发明的一个实施方案中，葡糖淀粉酶活性(AGU)和真菌α-淀粉酶活性(FAU-F)之间的比例(AGU每FAU-F的比例)可为0.1-100AGU/FAU-F，特别是2-50AGU/FAU-F，如在10-40AGU的范围内，而酸性α-淀粉酶对葡糖淀粉酶的比例在0.3-5.0AFAU/AGU的范围内。本发明的上述组合物适用于产生本发明的发酵产物(如乙醇)的方法。
本文中所描述和要求保护的发明不限于本文中所公开的具体实施方案的范围，因为这些实施方案旨在说明本发明的数个方面。任何等同的实施方案意欲在本发明的范围内。事实上，根据前述说明，除本文所显示和描述的之外，本发明的各种修改形式对于本领域技术人员是显而易见的。此类修改也意欲落入所附权利要求的范围内。
本文中引用了多种文献，其公开通过全文提述并入本文。本发明进一步由下述实施例描述，其不应视为限定本发明的范围。
材料和方法
材料：
葡糖淀粉酶T(GA)：来源于埃默森踝节菌并在WO 99/28448中作为SEQID NO：7公开的葡糖淀粉酶，可从Novozymes A/S，Denmark应要求得到。
α-淀粉酶A(AAA)：具有突变I181*+G182*+N193F，公开于美国专利6,187,576号并应要求可从Novozymes A/S，Denmark获得的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体。
转化酶：来源于面包酵母I4504-1G，可从Sigma-Aldrich，St.Lous，MO获得。
酵母：RED STARTM，可从Red Star/Lesaffre，USA获得。
方法
同一性
两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“同一性”描述。
就本发明而言，两个氨基酸序列间的同一性程度，以及两个核苷酸序列间的同一性程度，可通过“比对(align)”程序来确定，所述程序为Needleman-Wunsch比对(即，全局比对)。所述程序用于多肽，以及核苷酸序列的比对。缺省计分矩阵BLOSUM50用于多肽比对，缺省的同一性矩阵用于核苷酸比对。缺口第一个残基的罚分为-12(对于多肽)和-16(对于核苷酸)。缺口其它残基的罚分为-2(对于多肽)和-4(对于核苷酸)。
“比对”是FASTA程序包版本v20u6的一部分(参见W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，″Improved Tools for Biological Sequence Analysis″，PNAS85：2444-2448，和W.R.Pearson(1990)″Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA，″Methods in Enzymology 183：63-98)。FASTA蛋白质比对使用对缺口大小无限制的Smith-Waterman算法(参见″Smith-Waterman algorithm″，T.F.Smith和M.S.Waterman(1981)J.Mol.Biol.147：195-197)。
葡糖淀粉酶活性
葡糖淀粉酶活性可以以葡糖淀粉酶单位(AGU)测定。
葡糖淀粉酶活性(AGU)
Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在37℃，pH4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间5分钟的标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量。
可使用自动分析仪***。将变旋酶(mutarotase)添加到葡萄糖脱氢酶试剂中，使得任何存在的α-D-葡萄糖转化为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶特异性地与上述反应中的β-D-葡萄糖反应，形成NADH，其使用光度计在340nm处测定作为起始葡萄糖浓度的量度。
  AMG温育：
  底物：   麦芽糖23.2mM
  缓冲液：   乙酸盐0.1M
  pH：   4.30±0.05
  温育温度：   37℃±1
  反应时间：   5分钟
  酶工作范围：   0.5-4.0AGU/mL
  颜色反应：
  GlucDH：   430U/L
  变旋酶：   9U/L
  NAD：   0.21mM
  缓冲液：   磷酸盐0.12M；0.15MNaCl
  pH：   7.60±0.05
  温育温度   37℃±1
  反应时间：   5分钟
  波长：   340nm
更详细描述此分析方法的文件夹(EB-SM-0131.02/01)可根据要求由Novozymes A/S，Denmark得到，其通过提述并入本文。
α-淀粉酶活性(KNU)
α-淀粉酶活性可使用马铃薯淀粉作为底物来确定。该方法基于酶对于改性马铃薯淀粉的分解，并通过将淀粉/酶溶液的样本与碘溶液混合来跟踪反应。起初，形成了蓝黑色(blackish blue)，但在淀粉分解过程中，蓝色越来越淡，并逐渐变为红棕色(reddish-brown)，将其和有色玻璃标准(colored glass standard)进行比较。
一个千Novo α-淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件下(即，在37℃+/-0.05；0.0003M Ca2+；以及pH 5.6)糊精化5260mg的淀粉干物质Merck Amylum Solubile的酶量。
更详细描述该分析方法的文件夹EB-SM-0009.02/01可根据要求由Novozymes A/S，Denmark得到，其通过提述并入本文。
酸性α-淀粉酶活性(AFAU)
当根据本发明使用时，酸性α-淀粉酶的活性可以以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)测定。
酸性α-淀粉酶活性(AFAU)
酸性α-淀粉酶活性可以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)进行测量，其相对于酶标准物来确定。1AFAU定义为在下面提及的标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。
酸性α-淀粉酶，其为内切α-淀粉酶(1，4-α-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)水解淀粉分子内部区域中的α-1，4-葡糖苷键以形成具有不同链长的寡糖和糊精。与碘形成的颜色的强度与淀粉浓度成正比。使用反向比色法(reverse colorimetry)在规定的分析条件下测定淀粉浓度的降低作为淀粉酶活性。
Figure BDA0000056304240000171
标准条件/反应条件
Figure BDA0000056304240000172
更详细描述该分析方法的文件夹EB-SM-0259.02/01可根据要求由Novozymes A/S，Denmark得到，其通过提述并入本文。
确定FAU-F
FAU-F真菌α-淀粉酶单位(Fungamyl)相对于已知强度的酶标准物进行测量。
Figure BDA0000056304240000173
更详细描述该分析方法的文件夹(EB-SM-0216.02)可根据要求由Novozymes A/S，Denmark得到，其通过提述并入本文。
实施例
实施例1
预液化
将添加30％的工业稀釜馏物(逆流)的32％(w/v)玉米粒粉(corn grain flour)悬浮于自来水中并充分混合。将玉米浆料pH调整至pH 6.0。将合适量的转化酶，如上所示，添加于玉米浆料，并充分混合，然后在水浴中在50℃温育2小时。
液化
在预液化之后，添加合适量的液化酶(α-淀粉酶A)，并对玉米浆料混合物在85℃进行烹制2小时。在液化过程中，周期性地混合玉米浆料以确保玉米醪适当混合和烹制。
同时糖化和发酵(SSF)
将玉米醪冷却至室温并对其添加酵母进行如下所述的SSF，且通过重量损失和HPLC分析确定乙醇产量。
酵母再水化(rehydration)
将5.5g的RedStarTM酵母在100ml蒸馏水中再水化，并在发酵开始之前在32℃温育30分钟。将大约5千万个细胞/g DS的酵母添加至每个发酵物。
乙醇产量确定的重量损失方法
将尿素和青霉素分别添加至终浓度0.5ppm和3mg/L。在15ml聚丙烯管中进行小规模(～4g)发酵，对于每个实验条件重复五次。所述管是通过钻1/32英寸(1.5mm)的洞来准备的，然后在添加液化的玉米醪之前对空管进行称重。在添加醪之后再次对管进行称重以确定每个管中醪的确切重量。使用该重量如下所述计算所需的酶剂量：
Figure BDA0000056304240000191
根据上表所述的剂量添加酶，并将100μl再水化的酵母添加至每个管以开始发酵。通过随时间称管重来跟踪发酵进展大约54小时。在每次称重之前将管短暂涡旋震荡。将重量损失值通过下式换算为乙醇产量(g乙醇/g DS)：
Figure BDA0000056304240000192
结果总结于图1。
HPLC分析
在24和54小时发酵之后，对分别来自每个处理组的两次重复进行残余糖和乙醇浓度的HPLC分析。通过将50μl 40％H2SO4添加至每个管并充分混合来终止反应。将管在3000rpm离心15分钟以澄清上清，然后将1ml澄清的上清经过0.45μM过滤器，并置于HPLC小瓶中。将小瓶保持在4℃直至进行分析。结果总结于图2。

Claims (20)

1.一种用于从含淀粉材料产生发酵产物的方法，包括：
(a)在α-淀粉酶存在下将含淀粉材料液化；
(b)使用糖源生成酶糖化在步骤(a)中获得的经液化的材料；
(c)使用发酵生物进行发酵；
其中在液化步骤之前或过程中添加转化酶。
2.权利要求1的方法，其中所述转化酶来源于酵母。
3.权利要求1或2的方法，其中所述转化酶以0.001至1.00mg/g DS的量添加。
4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述含淀粉材料来源于玉米、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、西米、木薯(cassava)、树薯(manioc)、木薯淀粉(tapioca)、高粱、稻或马铃薯。
5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述含淀粉材料的干固形物含量为10-55％w/w的范围。
6.权利要求1-5任一项所述的方法，其中糖化步骤(b)和发酵步骤(c)同时进行。
7.权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述糖源生成酶选自下组：葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、产麦芽糖淀粉酶、支链淀粉酶和β-淀粉酶。
8.权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述发酵产物在发酵之后回收。
9.权利要求1-8任一项所述的方法，其中所述发酵产物是燃料乙醇、饮用乙醇或工业乙醇。
10.权利要求1-9任一项所述的方法，其中所述发酵生物是酵母。
11.权利要求1-10任一项所述的方法，还在步骤(a)之前包括下述步骤：
x)减小含淀粉材料的粒度；
y)形成包含含淀粉材料和水的浆料。
12.一种从含淀粉材料产生发酵产物的方法，包括在转化酶存在下，使用α-淀粉酶和糖源生成酶以及发酵生物在低于所述含淀粉材料的起始糊化温度之下的温度同时糖化和发酵含淀粉材料。
13.权利要求12的方法，其中所述转化酶来源于酵母。
14.权利要求12或13的方法，其中所述含淀粉材料是粒状淀粉。
15.权利要求12-14任一项所述的方法，其中所述含淀粉材料的干固形物含量范围是10-55％w/w。
16.权利要求12-15任一项所述的方法，其中所述发酵产物在发酵之后回收。
17.权利要求12-16任一项所述的方法，其中所述发酵产物是燃料乙醇、饮用乙醇或工业乙醇。
18.权利要求12-17任一项所述的方法，其中所述发酵生物是酵母。
19.权利要求12-18任一项所述的方法，其中所述糖源生成酶选自下组：葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、产麦芽糖淀粉酶、支链淀粉酶和β-淀粉酶。
20.转化酶在将糊化或未糊化的含淀粉材料发酵为发酵产物的方法中的用途。
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