ES2245125T3 - Ensayo de deteccion de las proteinas prion en una conformacion asociada con una enfermadad. - Google Patents
Ensayo de deteccion de las proteinas prion en una conformacion asociada con una enfermadad.Info
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Abstract
Un método de ensayo para determinar la presencia de proteína prión (PrP) en su conformación relacionada con la enfermedad (PrPSc), comprendiendo las etapas de: pretratar una muestra, sospechosa de contener proteína PrP, para destruir o eliminar proteínas no relacionadas con la proteína PrP, reduciendo de ese modo la concentración de proteína en la muestra que no sea proteína PrPSc; tratar la muestra pretratada con un compuesto que destruya o hidrolice toda, o sustancialmente toda, la PrPc en la muestra pero no hidrolice la PrPSc en la muestra; parar la reacción de hidrolización; poner en contacto la muestra sometida al pretratamiento, y tratarla con una pareja de unión que se una a la PrPSc en la muestra; y determinar la presencia de PrPSc en la muestra basada en la unión de la pareja de unión.
Description
Ensayo de detección de las proteínas prión en una
conformación asociada con una enfermedad.
Esta invención tiene que ver con el campo de los
bioensayos, y más concretamente, a un ensayo que hace posible aislar
y detectar una conformación de enfermedad de una proteína presente
en una muestra natural conteniendo también una conformación de no
enfermedad de la proteína.
Los priones son patógenos infecciosos que causan
enfermedades priónicas invariablemente fatales (encefalopatías
espongiformes) del sistema nervioso central en humanos y animales.
Los priones se diferencian significativamente de las bacterias,
virus y viroides. La hipótesis dominante es que no es necesario
ácido nucleico para permitir que prosiga la infectividad de una
proteína prión.
Una etapa importante en el estudio de los priones
y las enfermedades que causan fue el descubrimiento y purificación
de una proteína denominada proteína prión [Bolton, McKinley y col.
(1982), Science 218: 1.309-1.311;
Prusiner, Bolton y col. (1982), Biochemistry 21:
6.942-6.950; McKinley, Bolton y col. (1983),
Cell 35: 57-62]. Los genes completos
que codifican la proteína prión han sido después clonados,
secuenciados y expresados en animales transgénicos. La PrP^{c}
está codificada por un gen del huésped de copia única [Basler,
Oesch y col. (1986), Cell 46: 417-428]
y, cuando la PrP^{c} es expresada, se encuentra generalmente en la
superficie exterior de las neuronas. Muchas líneas de evidencia
indican que las enfermedades priónicas resultan de la
transformación de la forma normal de la proteína prión (PrP^{c})
en la forma anormal (PrP^{Sc}). No existe una diferencia
detectable en la secuencia de aminoácidos de las dos formas. Sin
embargo, la PrP^{Sc}, cuando es comparada con la PrP^{c}, tiene
una conformación con contenido de lámina \beta superior y
\alpha-hélice inferior [Pan, Baldwin y col.
(1993), Proc Natl Acad Sci USA 90:
10.962-10.966; Safar, Roller y col. (1993), J
Biol Chem 268: 20.276-20.284]. La
presencia de la forma anormal PrP^{Sc} en los cerebros de humanos
o animales infectados es el único marcador diagnóstico específico
de las enfermedades priónicas. La PrP^{Sc} juega un papel clave
en la transmisión y patogénesis de las enfermedades priónicas
(encefalopatías espongiformes), y es un factor crítico en la
degeneración neuronal [Prusiner (1997), The Molecular and Genetic
Basis of Neurological Disease, 2ª edición; 103-143].
Las enfermedades priónicas más comunes en animales son el scrapie de
ovejas y cabras y la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) del
ganado vacuno [Wilesmith y Wells (1991), Curr Top Microbiol
Immunol 172: 21-38]. Se han identificado
cuatro enfermedades priónicas de los humanos: (1) el kuru, (2) la
enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ), (3) la
enfermedad de
Gertsmann-Streussler-Sheinker (GSS),
y (4) el insomnio familiar fatal (IFF) [Gajdusek (1977),
Science 197: 943-960; Medori,
Tritschler y col. (1992), N Engl J Med 326:
444-449]. Inicialmente, la presentación de las
enfermedades priónicas humanas heredadas encerraba un enigma que ha
sido explicado después mediante el origen genético celular de la
PrP. En Goldmann (British Medical Bulletin 49:
839-859, 1993) se discute y examina el papel de la
proteína prión PrP en la patogénesis de las encefalopatías
espongiformes
transmisibles.
transmisibles.
Los priones existen en múltiples aislados (cepas)
con diferentes características biológicas cuando estas distintas
cepas se infectan en huéspedes genéticamente idénticos [Prusiner
(1997), The Molecular and Genetic Basis of Neurological Disease, 2ª
edición; 165-186]. Las cepas se diferencian por el
tiempo de incubación, por la topología de la acumulación de la
proteína PrP^{Sc} y, en algunos casos, también por la
distribución y características de la patología cerebral [DeArmond y
Prusiner (1997), Greenfield's Neuropathology, 6ª edición:
235-280]. Debido a que la PrP^{Sc} es el principal
y, muy probablemente, el único componente de los priones, la
existencia de cepas de priones ha encerrado el enigma de cómo la
información biológica puede estar cifrada en una molécula que no
esté compuesta de ácidos nucleicos. Se ha descubierto que el
tratamiento proteolítico parcial de homogenados cerebrales
conteniendo algunos aislados priónicos genera péptidos con
movilidades electroforéticas ligeramente diferentes [Bessen y Marsh
(1992), J Virol 66: 2.096-2.101; Bessen y Marsh
(1992), J Gen Virol 73: 329-334; Telling, Parchi y
col. (1996), Science 274: 2.079-2.082].
Estos descubrimientos sugerían diferentes sitios de escisión
proteolítica debido a la distinta conformación de las moléculas de
PrP^{Sc} en diferentes cepas de priones. Alternativamente, las
diferencias observadas podrían ser explicadas mediante la formación
de diferentes complejos con otras moléculas, el formar sitios de
escisión distintos en la PrP^{Sc} en cepas diferentes [Marsh y
Bessen (1994), Phil Trans R Soc Lond B 343:
413-414]. Algunos investigadores han propuesto que
los diferentes aislados priónicos pueden diferir en los patrones de
glicosilación de la proteína prión [Collinge, Sidle y col. (1996),
Nature 383: 685-690; Hill, Zeidler y col (1997),
Lancet 349: 99-100]. Sin embargo, la exactitud de
ambos patrones de glicosilación y del trazado del mapa peptídico en
diagnósticos de múltiples cepas priónicas está actualmente aún
debatido [Collings, Hill y col. (1997), Nature 386: 564;
Somerville, Chong y col. (1997), Nature 386: 564].
EP-A-0861 900
describe anticuerpos monoclonales producidos por inmunización de
ratones PrP^{0/0} con un fragmento recombinante de PrP.
En Serban y col., Neurology, Vol. 40, Nº 1, enero
de 1990, se proporciona un sistema para detectar PrP^{Sc} mediante
inmunorreactividad intensificada después de la desnaturalización.
El ensayo directo, suficientemente sensible y específico, para la
PrP^{Sc} infecciosa en muestras biológicas podría potencialmente
abolir, completamente, la necesidad de inoculaciones en animales.
Desafortunadamente, no parece ser posible con los ensayos de
PrP^{Sc} actuales (se estima que el actual límite de sensibilidad
de la detección de PrP^{Sc} basada en proteinasa K y Western blot
está en un intervalo de 1 \mug/ml, lo que corresponde a
10^{4}-10^{5} unidades infecciosas priónicas).
Adicionalmente, está en cuestión la especificidad de los ensayos
tradicionales de PrP^{Sc} basados en proteinasa K, a la luz de
los recientes descubrimientos de únicamente la relativa o ninguna
resistencia a la proteinasa K de preparaciones priónicas
indudablemente infecciosas [Hsiao, Groth y col. (1994), Proc
Natl Acad Sci USA 91: 9.126-9.130;
Telling y col. (1996), Genes & Dev.].
La transtiretina humana (TTR) es una proteína
plasmática normal compuesta de cuatro unidades idénticas
estructuradas predominantemente en láminas \beta, y sirve como
transportador de hormona tiroxina. El autoensamblaje anormal de la
TTR en fibrillas amiloides origina dos formas de enfermedades
humanas, a saber, la amiloidosis sistémica senil (ASS) y la
polineuropatía amiloide familiar (PAF) [Kelly (1996), Curr Opin
Strut Biol 6(1): 11-7]. El origen
de la formación amiloide en la PAF son mutaciones puntuales en el
gen TTR; la causa de la ASS es desconocida. El diagnóstico clínico
es verificado histológicamente, detectando depósitos de amiloide
in situ en el material para biopsia.
Hasta la fecha, se sabe poco acerca del mecanismo
de la transformación de la TTR en amiloide in vivo. Sin
embargo, varios laboratorios han demostrado que la conversión de la
amiloide puede ser estimulada in vitro mediante la
desnaturalización parcial de TTR humana normal [McCutchen, Colon y
col. (1993), Biochemistry 32(45):
12.119-27; McCutchen y Kelly (1993), Biochem
Biophys Res Commun 197(2):
415-21]. El mecanismo de la transición
conformacional implica un intermedio conformacional monómero que
polimeriza en fibrillas amiloides estructuradas en láminas \beta
lineales [Lai, Colon y col. (1996), Biochemistry
35(20): 6.470-82]. El proceso puede
ser mitigado por la unión con moléculas estabilizadoras tales como
tiroxina o triyodofenol [Miroy, Lai y col. (1996), Proc Natl
Acad Sci USA 93(26):
15.051-6].
En vista de los aspectos anteriores, existe
claramente la necesidad de un ensayo específico, de alto flujo a
través, y rentable para ensayar materiales de muestra para la
presencia de una proteína patogénica, incluyendo transtiretina y
proteína prión.
Hay algunas proteínas conocidas que existen en
dos o más conformaciones. A menudo, tales proteínas tienen una
primera conformación que es la conformación normal de la proteína, y
una segunda, la conformación relacionada con la enfermedad. Las dos
proteínas están a menudo presentes juntas y, con frecuencia, es
difícil determinar la presencia de la conformación de la proteína
relacionada con la enfermedad debido a que (1) es difícil obtener
parejas de unión, tales como anticuerpos, que se unan a esta
conformación; y (2) la conformación relacionada con la enfermedad
está presente, a menudo, en una concentración relativamente baja
dentro de la muestra, y con respecto a la conformación de no
enfermedad. La presente invención se refiere a métodos de ensayo que
utilizan tratamientos, enzimas y parejas de unión, tales como
anticuerpos, para detectar la conformación de enfermedad de la
proteína PrP, denominada PrP^{Sc}, de la manera siguiente:
pretratar una muestra, sospechosa de contener
proteína PrP, para destruir o eliminar proteínas no relacionadas con
la proteína PrP, reduciendo de ese modo la concentración de
proteína en la muestra que no sea proteína PrP^{Sc};
tratar la muestra pretratada con un compuesto que
destruya o hidrolice toda, o sustancialmente toda, la PrP^{c} en
la muestra pero no hidrolice la PrP^{Sc} en la muestra;
parar la reacción de hidrolización;
poner en contacto la muestra sometida al
pretratamiento, y tratarla con una pareja de unión que se una a la
PrP^{Sc} en la muestra; y
determinar la presencia de PrP^{Sc} en la
muestra basada en la unión de la pareja de unión.
Dependiendo de las etapas utilizadas en el
ensayo, se puede utilizar uno de dos tipos de anticuerpos. La
muestra es tratada con un compuesto, por ejemplo una
metaloendopeptidasa, que hidrolice selectivamente la PrP^{c} pero
no la PrP^{Sc}. Después de eso, la muestra tratada puede ser
sometida a dos tipos diferentes de tratamiento, cada uno de los
cuales utiliza un tipo de anticuerpo generalmente diferente.
El primer tipo general de anticuerpo se une
selectivamente a la conformación de enfermedad de la proteína. Por
ejemplo, los anticuerpos que identifiquen selectivamente a la
PrP^{Sc} se unen a un epítopo en el C-terminal de
la proteína. Cuando una proteína PrP está en su configuración
PrP^{Sc}, su C-terminal puede ser unido a
anticuerpos del tipo descrito en la Patente U.S. 5.846.533,
publicada el 8 de diciembre de 1998; también se hace referencia a
WO 98/37210 que reivindica el descubrir anticuerpos que se unen a la
PrP^{Sc}.
El segundo tipo general de anticuerpo se une a
las conformaciones de enfermedad y de no enfermedad de la proteína.
Por ejemplo, los anticuerpos que identifiquen un epítopo en el
N-terminal de la proteína PrP, identifican ambas
PrP^{Sc} y PrP^{c} a continuación de la desnaturalización de las
proteínas. Cuando la proteína PrP está en la configuración
PrP^{Sc}, el N-terminal no está expuesto y, tal
cual, no puede ser unido por un anticuerpo. Para exponer un epítopo
del N-terminal, se desnaturaliza la PrP^{Sc}, por
ejemplo mediante exposición a guanadina HCl, bajo condiciones (pH,
temperatura, y tiempo) que originen que la PrP^{Sc} se despliegue
o cambie su estructura tridimensional de manera que se exponga un
epítopo del C-terminal. En esta configuración
desplegada, se puede utilizar una amplia gama de parejas de unión
para su detección, incluyendo anticuerpos disponibles
comercialmente. Puesto que tales anticuerpos también se unen a la
PrP^{c}, se tiene que eliminar toda la PrP^{c} mediante
hidrólisis selectiva.
Un ejemplo de un anticuerpo que se una a un
epítopo del N-terminal es el anticuerpo monoclonal
3F4 producido por la línea celular de hibridoma ATCC HB9222,
registrada el 8 de octubre de 1986 en la American Type Culture
Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, y revelada y
descrita en la Patente U.S. 4.806.627, publicada el 21 de febrero
de 1989, revelando anticuerpos que se unen selectivamente a la
PrP^{c} en su forma nativa. Además del anticuerpo, en el ensayo
de la invención se podrían utilizar otras parejas de unión que se
uniesen a la conformación relacionada con la no enfermedad, pero no
a la conformación relacionada con la enfermedad. Están disponibles
comercialmente anticuerpos tales como los 3F4 y otros utilizados en
los ensayos descritos en los ejemplos.
Una porción de una muestra conteniendo dos
conformaciones de una proteína (por ejemplo, PrP^{c} y PrP^{Sc})
puede ser hecha reaccionar con una pareja de unión (por ejemplo R1)
que se une a ambas conformaciones, y otra porción de la misma
muestra es hecha reaccionar con una pareja de unión (por ejemplo
3F4) que se une únicamente a una de las dos formas (por ejemplo
PrP^{c}). La conformación relacionada con la enfermedad es
determinada comparando las dos. Si la pareja de unión que se une a
ambas conformaciones muestra más unión que la pareja de unión que
se une únicamente a una conformación, esto demuestra que en la
muestra están presentes ambas conformaciones. Por ejemplo, si R1 se
une a más proteína que el 3F4, la PrP^{Sc} está presente en la
muestra.
Un aspecto es proporcionar un inmunoensayo que
sea aplicable a muestras de ensayo conteniendo proteínas, las
cuales muestras sean sospechosas de contener una proteína que
existe en una conformación de no enfermedad nativa y una
conformación relacionada con la enfermedad (proteína PrP).
Otro aspecto es proporcionar un ensayo que
diferencie entre (1) proteínas relacionadas con la enfermedad, o
porciones de las mismas, que no sean hidrolizadas por un
tratamiento limitado con proteasa, con una proteasa tal como la
proteinasa K (proteínas resistentes a la proteasa, por ejemplo, PrP
27-30); y (2) proteínas relacionadas con la
enfermedad que sean hidrolizadas por un tratamiento limitado con
proteasa, con una proteasa tal como la proteinasa K (por ejemplo,
PrP^{Sc} sensible a la proteasa).
El inmunoensayo puede determinar rápida y
exactamente la presencia de proteínas en la conformación relacionada
con la enfermedad (PrP^{Sc}), incluso aunque el anticuerpo
utilizado en el ensayo no se una o tenga un grado muy bajo de
afinidad de unión por la proteína en la conformación relacionada con
la enfermedad, y la conformación relacionada con la enfermedad esté
presente en una concentración inferior a la de la conformación de
no enfermedad.
Una característica es que la señal obtenida puede
ser intensificada mediante el empleo de animales transgénicos, por
ejemplo, ratones que sean utilizados para detectar la presencia de
una proteína en una muestra.
Otra característica es que, para intensificar la
sensibilidad, se puede utilizar fluorescencia sincrónica
intensificada por disociación, o un fluorómetro inducido por láser
de longitud de onda dual.
Otra ventaja es que el ensayo puede detectar
niveles de la conformación de la proteína, causante de la
enfermedad, a una concentración de 1x10^{3} partículas/ml o
inferior.
Un objeto específico es proporcionar un ensayo
diagnóstico para determinar la presencia de proteína prión
infecciosa en materiales de muestra variables obtenidos o derivados
de tejidos y/o fluidos corporales humanos, de primate, de mono, de
cerdo, bovinos, de oveja, de cabra, de ciervo, de venado, de gato,
de perro, de ratón, de pollo, y de
pavo.
pavo.
Otro objeto es proporcionar un rápido ensayo para
la proteína prión infecciosa nativa en los cerebros de animales,
transgénicos y no transgénicos, inyectados con material de muestra
conteniendo potencialmente priones.
Otro objeto es proporcionar un método para
evaluar procedimientos de descontaminación, comprobando el nivel de
desnaturalización de las proteínas patogénicas (priones) después de
tales tratamientos.
Otra ventaja es que el proceso puede ser
realizado sin un anticuerpo directamente capaz de identificar una
conformación infecciosa de una proteína, y sin utilizar una etapa
con proteinasa K para eliminar la señal de isoformas normales (no
enfermedad) de la proteína.
Una característica importante del ensayo es el
diseño rápido, rentable, y de alto flujo a través que puede ser
diseñado con la capacidad para escrutar 96 muestras por día y placa
de 96 pocillos.
Estos y otros objetos, ventajas, y
características serán evidentes para aquellos especializados en la
técnica al leer los detalles del método de ensayo, el desarrollo de
anticuerpos y pruebas, y el ratón transgénico, más completamente
descritos a continuación, con referencia a las figuras
adjuntadas.
Antes de que los presentes ensayos y métodos sean
revelados y descritos, se comprende que esta invención no se limita
a anticuerpos, proteínas, marcadores, ensayos o métodos concretos ya
que tales pueden, por supuesto, variar. También se comprende que la
terminología utilizada aquí es con el propósito de describir
únicamente formas de realización concretas, y no se pretende ser
limitante puesto que el campo de aplicación de la presente
invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones
adjuntadas.
A menos que se definan de otra manera, todos los
términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo
significado generalmente comprendido por un especializado en la
técnica a la que pertenece esta invención. Aunque en la práctica o
ensayo de la presente invención se pueden utilizar cualquier método
y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí, ahora se
describen los métodos y materiales preferidos.
Las publicaciones comentadas aquí son
proporcionadas únicamente para la revelación anterior a la fecha de
presentación de la presente solicitud. Las fechas de las
publicaciones proporcionadas están sometidas a cambio si se
descubre que la fecha real de la publicación es diferente de la
proporcionada aquí.
El término "proteína", como se utiliza aquí,
pretende abarcar cualquier secuencia de aminoácidos e incluir
secuencias modificadas tales como glicoproteínas, El término incluye
proteínas y péptidos de existencia natural, además de aquellos que
sean sintetizados recombinante o sintéticamente. El término
"proteína" pretende específicamente comprender proteínas de
existencia natural que existan en al menos dos conformaciones
diferentes, en donde ambas conformaciones tienen la misma, o
sustancialmente la misma, secuencia de aminoácidos pero tienen
diferentes estructuras tridimensionales. Las dos conformaciones de
la proteína incluyen al menos una conformación que no esté
relacionada a un estado de enfermedad, y al menos una conformación
que esté relacionada con un estado de enfermedad, patogénico. Una
proteína específica como la utilizada a propósito de esta
revelación es una proteína PrP que incluye la forma de no
enfermedad, mencionada como la forma PrP^{c}, y la forma
relacionada con la enfermedad, mencionada como la PrP^{Sc}.
Aunque una proteína prión, o la forma PrP^{Sc} de una proteína
PrP, es infecciosa y patogénica, la conformación de enfermedad de
otras proteínas no es infecciosa aunque sea patogénica. Como se
utiliza aquí, el término patogénico puede querer decir que la
proteína causa realmente la enfermedad, o puede querer decir
sencillamente que la proteína está asociada con la enfermedad y, por
lo tanto, está presente cuando la enfermedad está presente. De este
modo, una proteína patogénica como la utilizada a propósito de esta
revelación no es necesariamente una proteína que sea el agente
causativo específico de una enfermedad.
Los términos "pretratamiento",
"tratamiento de desplegamiento", y "tratamiento limitado con
proteasa" pretenden abarcar las descripciones y uso de estos
términos como se suministran en las respectivas secciones que tengan
estos encabezamientos.
Los términos "proteína PrP", "PrP" y
semejantes son utilizados intercambiablemente aquí, y significarán
ambos la forma PrP^{Sc} infecciosa de la partícula conocida por
causar enfermedades (encefalopatías espongiformes) en humanos y
animales, y la forma PrP^{c} no infecciosa que, bajo condiciones
apropiadas, se transforma en la forma PrP^{Sc} infecciosa.
Los términos "prión", "proteína prión"
y "proteína PrP^{Sc}" y otros fueron utilizados aquí
intercambiablemente para mencionar a la forma PrP^{Sc} infecciosa
de la PrP, y es una contracción de las palabras "proteína" e
"infección". Las partículas están compuestas en gran parte, si
no exclusivamente, de moléculas de PrP^{Sc} codificadas por un
gen PrP. Los priones son distintos de las bacterias, virus y
viroides. Los priones conocidos infectan a los animales para causar
el scrapie, una enfermedad degenerativa transmisible del sistema
nervioso de ovejas y cabras, así como la encefalopatía espongiforme
bovina (EEB), o "enfermedad de las vacas locas", y la
encefalopatía espongiforme felina de los gatos. Los cuatros
enfermedades priónicas conocidas por afectar a humanos son (1) el
kuru, (2) la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ),
(3) la enfermedad de
Gertsmann-Streussler-Sheinker (GSS),
y (4) el insomnio familiar fatal (IFF). Como se utiliza aquí,
"prión" incluye todas las formas de priones que causen todas
o alguna de estas enfermedades u otras, en cualquier animal
utilizado y, en particular, en humanos y animales de granja
domesticados.
El término "gen PrP" es utilizado aquí para
describir material genético que exprese proteínas incluyendo
polimorfismos y mutaciones patogénicas conocidos. El término "gen
PrP" se refiere en general a cualquier gen de alguna especie que
codifique cualquier forma de una proteína PrP. Algunas secuencias de
PrP comúnmente conocidas están descritas en Gabriel y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:
9.097-9.101 (1992), y las Patentes U.S. 5.565.186,
5.763.740, 5.792.901; y WO 97/04814. El gen PrP puede ser de
cualquier animal, incluyendo los animales "huésped" y "de
ensayo" descritos aquí, y cualquier y todos los polimorfismos y
mutaciones del mismo, siendo reconocido que los términos incluyen
otros tales genes PrP que estén aún por ser descubiertos. La
proteína expresada por tal gen puede tomar la forma PrP^{c} (no
enfermedad) o PrP^{Sc} (enfermedad).
El término "pareja de unión" se refiere a
cualquier molécula que se une la molécula diana de interés.
Preferentemente, la unión es de una afinidad lo suficientemente alta
para que haga posible unir moléculas diana de interés presentes a
baja concentración, por ejemplo, 1x10^{3} partículas por ml o
menos. Más preferentemente, la pareja de unión es selectiva en
unirse únicamente a la molécula diana, y no a otras moléculas.
Parejas de unión preferidas son los anticuerpos definidos
abajo.
El término "anticuerpo" representa una
proteína inmunoglobulina que es capaz de unirse a un antígeno.
Anticuerpo, como se utiliza aquí, significa que incluye el
anticuerpo entero así como cualquier fragmento de anticuerpo [por
ejemplo F(ab)', Fab, Fv] capaz de unirse al epítopo, antígeno
o fragmento antigénico de interés. Los anticuerpos para los ensayos
de la invención pueden ser inmunorreactivos o inmunoespecíficos y,
por lo tanto, se unen específica y selectivamente a una proteína de
interés, por ejemplo, a una proteína
\beta-amiloide A4 o una proteína PrP. Se pueden
utilizar anticuerpos que sean inmunorreactivos e inmunoespecíficos
para la forma de no enfermedad nativa y la forma de enfermedad
tratada, pero no para la forma de enfermedad no tratada (por
ejemplo, para la PrP^{c} nativa y la PrP^{Sc} tratada pero no
para la PrP^{Sc} nativa), debido a que la muestra es tratada para
eliminar, esto es, hidrolizar la PrP^{c}. Los anticuerpos para la
PrP son preferentemente inmunoespecíficos, por ejemplo, no
sustancialmente interreactivos con materiales afines. Algunos
anticuerpos específicos que se pueden utilizar a propósito de la
invención están revelados en la solicitud PCT publicada WO 97/10505.
Esta solicitud PCT publicada corresponde a la USSN 08/713.939,
publicada como Patente U.S. 5.846.533. Los anticuerpos revelados en
la solicitud PCT, que se unen a la PrP^{Sc}, pueden ser
utilizados para llevar a cabo el ensayo básico de la presente
invención cuando la muestra haya sido tratada suficientemente con
dispasa, para hidrolizar toda o sustancialmente toda la PrP^{Sc}
presente en la muestra. Otro anticuerpo útil para unirse a la
PrP^{c} es el anticuerpo monoclonal 3F4 263K producido por la
línea celular de hibridoma ATCC HB9222, registrada el 8 de octubre
de 1986 en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn
Drive, Rockville, MD 20852, y revelado y descrito en la Patente
U.S. 4.806.627, publicada el 21 de febrero de 1989, revelando
anticuerpos que se unen selectivamente a la PrP^{c}. El término
"anticuerpo" abarca todos los tipos de anticuerpos, por
ejemplo, policlonales, monoclonales, y aquellos producidos por
metodología de expresión en fagos. Anticuerpos particularmente
preferidos son los anticuerpos que tienen un grado relativamente
alto de afinidad por la PrP^{c} nativa y la PrP^{Sc} tratada,
pero un grado relativamente bajo de afinidad, o sustancialmente
ninguno, por la PrP^{Sc}. Más específicamente, los anticuerpos
tienen preferentemente cuatro veces o más, más preferentemente
quince veces o más, y aún más preferentemente 30 veces o más de
afinidad de unión por la PrP^{c} nativa y la PrP^{Sc}
desnaturalizada comparada con la afinidad de unión por la
PrP^{Sc} nativa.
"Anticuerpo purificado" se refiere al que
está suficientemente libre de otras proteínas, carbohidratos, y
lípidos, con los que está naturalmente asociado. Tal anticuerpo
"se une, de manera preferente", a una conformación de
enfermedad desnaturalizada de una proteína tal como la conformación
de lámina \beta desnaturalizada de la proteína PrP^{Sc} (o un
fragmento antigénico de la misma), y sustancialmente no reconoce o
se une a otras moléculas no relacionadas antigénicamente. Un
anticuerpo purificado es, preferentemente, inmunorreactivo e
inmunoespecífico para una especie específica, y más preferentemente,
inmunoespecífico para la PrP^{c} nativa y para formas
desnaturalizadas de PrP^{c} y PrP^{Sc} o, alternativamente,
para la PrP^{Sc} nativa o no tratada.
"Fragmento antigénico" de una proteína (por
ejemplo, una proteína PrP) significa una porción de tal proteína que
es capaz de unirse a un anticuerpo.
Mediante "se une específicamente" se quiere
decir alta avidez y/o alta afinidad de unión de un anticuerpo hacia
un polipéptido específico, por ejemplo, un epítopo de una proteína,
por ejemplo, PrP^{Sc} desnaturalizada o proteína
\beta-amiloide A4 desnaturalizada. La unión del
anticuerpo a su epítopo en este polipéptido específico es
preferentemente más fuerte que la unión del mismo anticuerpo a
cualquier otro epítopo, particularmente aquellos que puedan estar
presentes en moléculas en asociación con o en la misma muestra, como
el polipéptido específico de interés por ejemplo, se une más
fuertemente a fragmentos de epítopos de una proteína tal como
PrP^{Sc}, de modo que, ajustando las condiciones de unión, el
anticuerpo se une casi exclusivamente a un sitio epitópico o
fragmentos de una proteína deseada tal como un fragmento de epítopo
expuesto mediante la desnaturalización de la PrP^{Sc}, y no
expuesto en la PrP^{Sc} nativa.
Mediante "anticuerpo marcado
detectablemente", "anti-PrP marcado
detectablemente", o "fragmento anti-PrP marcado
detectablemente" se quiere decir un anticuerpo (o fragmento de
anticuerpo que conserva la especificidad de unión) que tiene un
marcador detectable unido. El marcador detectable está normalmente
unido mediante conjugación química, pero donde el marcador es un
polipéptido, podría estar unido alternativamente mediante técnicas
de ingeniería genética. Los métodos para la producción de proteínas
marcadas detectablemente son conocidos en la técnica. Marcadores
detectables conocidos en la técnica, salvo normalmente, son
radioisótopos, fluoróforos, marcadores paramagnéticos, enzimas (por
ejemplo, peroxidasa de rábano picante), u otras porciones o
compuestos que emitan una señal detectable (por ejemplo,
radioactividad, fluorescencia, color) o emitan una señal detectable
después de la exposición del marcador en su sustrato. En la técnica
se conocen diversas parejas de marcador/sustrato (por ejemplo,
peroxidasa de rábano picante/diaminobencidina,
avidita/estreptavidina, luciferasa/luciferina), métodos para marcar
anticuerpos, y métodos para utilizar anticuerpos marcados [ver, por
ejemplo, Harlow y Lane, eds. (Antibodies: A Laboratory Manual
(1988), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY)]. El europio es un marcador particularmente preferido.
Las abreviaturas utilizadas aquí incluyen:
SNC para sistema nervioso central;
EEB para encefalopatía espongiforme bovina;
ECJ para enfermedad de
Creutzfeldt-Jacob;
IFF para insomnio familiar fatal;
GdnHCl para Guanidina Clorhidrato;
GSS para enfermedad de
Gertsmann-Streussler-Sheinker;
Hu para humano;
HuPrP para proteína prión humana;
Mo para ratón;
MoPrP para proteína prión de ratón;
SHa para hámster sirio;
SHaPrP para proteína prión de hámster sirio;
Tg para transgénico;
Tg(SHaPrP) para ratón transgénico
conteniendo el gen PrP de un hámster sirio;
Tg(HuPrP) para ratones transgénicos
conteniendo el gen PrP humano completo;
Tg(ShePrP) para ratones transgénicos
conteniendo el gen PrP de oveja completo;
Tg(BovPrP) para ratones transgénicos
conteniendo el gen PrP de vaca completo;
PrP^{Sc} para la isoforma scrapie de la
proteína prión;
PrP^{c} para la isoforma normal común,
contenida en las células, de la proteína prión;
PrP 27-30 o PrP^{Sc}
27-30 para la forma de PrP^{Sc} resistente al
tratamiento o a la proteasa;
MoPrP^{Sc} para la isoforma scrapie de la
proteína prión de ratón;
MHu2M para un gen PrP quimérico de ratón/humano
en donde la región del gen PrP de ratón está reemplazada por una
secuencia humana correspondiente, que se diferencia de la PrP de
ratón en 9 codones;
Ratones Tg(MHu2M) son ratones transgénicos
de la invención, los cuales incluyen el gen quimérico MHu2M;
MHu2MPrP^{Sc} para la isoforma scrapie del gen
PrP quimérico humano/de ratón;
PrP^{ECJ} para la isoforma ECJ de una proteína
PrP;
Prnp^{0/0} para la ablación de ambos alelos de
un gen endógeno de la proteína prión, por ejemplo, el gen
MoPrP;
Tg(SHaPrP^{+/0})81/Prnp^{0/0}
para una línea concreta (81) de ratones transgénicos expresando
SHaPrP; +/0 indica heterocigoto;
Tg(HuPrP)/Prnp^{0/0} para un ratón
híbrido obtenido cruzando un ratón, con un gen humano de la proteína
prión (HuPrP), con un ratón con ambos alelos del gen endógeno de la
proteína prión rotos;
Tg(MHu2M)/Prnp^{0/0} para un ratón
híbrido obtenido cruzando un ratón, con un gen quimérico de la
proteína prión (MHu2M), con un ratón con ambos alelos del gen
endógeno de la proteína prión rotos;
TTR para transtiretina;
FVB para una cepa endogámica patrón de ratones
utilizados a menudo en la producción de ratones transgénicos, puesto
que los óvulos de ratones FVB son relativamente grandes y toleran la
microinyección de ADN exógeno relativamente bien;
[PrP_{\beta}] B concentración de proteína prión
en conformación de lámina \beta;
[\betaA4_{\beta}] B concentración de \beta
A4 en conformación de lámina \beta;
[DRC] B concentración de una conformación de una
proteína relacionada con la enfermedad.
El método de ensayo comprende el proporcionar una
muestra sospechosa de contener una proteína que adopta una primera
conformación y una segunda conformación relacionada con la
enfermedad, y es capaz de detectar una conformación de enfermedad de
la proteína cuando está presente en una concentración muy baja con
respecto a la concentración de otras proteínas y compuestos que
incluyen la conformación de no enfermedad.
El método de ensayo revelado permite a uno aislar
y detectar la presencia de una conformación de una proteína,
relacionada con la enfermedad (PrP^{Sc}), presente en una muestra
conteniendo también la conformación de la proteína relacionada con
la no enfermedad (PrP^{c}). La muestra es tratada (por ejemplo,
puesta en contacto con dispasa) de una manera que hidrolice la
PrP^{c} y no la PrP^{Sc}. La reacción de hidrolización se para
(por ejemplo, mediante la adición de EDTA). La muestra tratada es
puesta en contacto con una pareja de unión (por ejemplo, un
anticuerpo marcado que se une a la PrP^{Sc}), y la existencia de
unión proporciona una indicación de que está presente PrP^{Sc}.
Alternativamente, la PrP^{Sc} de la muestra tratada es
desnaturalizada (por ejemplo, puesta en contacto con guanadina) o
desplegada para que haya epítopos expuestos. La PrP^{Sc}
desplegada es puesta en contacto con una pareja de unión (por
ejemplo, 3F4 marcado) y la aparición de unión indica la presencia
de PrP^{Sc} en la muestra.
Conforme a alguna de las formas de realización
del ensayo, es necesario pretratar la muestra, que se va a ensayar,
para (1) eliminar tantas proteínas contaminantes como sea posible; y
(2) aumentar la concentración de proteína en la muestra,
relacionada con la enfermedad, con respecto a la conformación de la
proteína relacionada con no enfermedad. Por ejemplo, la muestra
inicial puede ser tratada químicamente con un compuesto que degrade
o desnaturalice preferentemente las proteínas contaminantes y/o la
forma aflojada de no enfermedad de la proteína, y/o se exponga a
anticuerpos que se unen (para eliminar), de manera preferente, a
contaminantes y/o la conformación de no enfermedad de la
proteína.
Puede ser posible intensificar además la
sensibilidad de diversos aspectos de la invención, concentrando la
conformación de enfermedad de una proteína añadiendo un compuesto
que se una selectivamente a la conformación de enfermedad para
formar un complejo, y centrifugando la muestra para precipitar el
complejo, el cual es ensayado después según los métodos descritos
aquí. Los aspectos concretos en cuanto a tales métodos de
concentración están descritos detalladamente en nuestra solicitud
copendiente Nº de Serie 09/026.967, publicada como Patente U.S.
5.977.324 y titulada "Process for Concentrating Protein with
Disease-Related Conformation".
Las diferentes formas de realización del ensayo
descrito arriba son todas tipos de inmunoensayos "directos",
significando que la muestra es directamente ensayada con el
anticuerpo marcado, con o sin tratamiento para cambiar la
conformación de cualquier proteína, con conformación relacionada con
la enfermedad, presente en la muestra. También se puede utilizar un
ensayo "indirecto". Por ejemplo, puede ser conveniente
aumentar en la muestra el número de proteínas relacionadas con la
enfermedad (si las hubiese), mediante el empleo de un ratón
transgénico y, de ese modo, intensificar cualquier señal obtenida.
Para llevar a cabo estas formas de realización, en primer lugar se
utiliza la muestra para inocular un ratón transgénico que ha tenido
su genoma modificado, de manera que desarrollará síntomas de
enfermedad cuando sea inoculado con proteínas en la conformación
relacionada con la enfermedad. Después de que los ratones sean
inoculados, se deja que pase un periodo de tiempo suficiente (por
ejemplo, 30 días), después de lo cual se sacrifica el animal
transgénico y se utiliza una muestra, tal como tejido cerebral
homogeneizado del ratón, en el ensayo directo descrito arriba. La
presente revelación intensifica la capacidad de los ratones
transgénicos para detectar priones, acortando el periodo de tiempo
que tiene que pasar hasta que se pueda hacer una determinación como
si la muestra original incluyera proteínas en la conformación
relacionada con la enfermedad. También sería posible utilizar
ratones del tipo revelado y descrito en cualquiera de las Patentes
U.S. 5.565.186, 5.763.740, ó 5.792.901, o aplicar PrP etiquetada
como se reveló en la Patente U.S. 5.750.361 para purificar por
afinidad la PrP^{Sc} del cerebro de un ratón Tg y, después de eso,
aplicar el ensayo de la presente invención. Sin la presente
revelación, el ratón es inoculado, y uno tiene que esperar hasta
que el ratón inoculado demuestre realmente síntomas de la
enfermedad. Dependiendo del ratón, este puede tardar varios meses o
incluso años. Cualquiera de los ensayos de la presente revelación
podría ser utilizado con cualquier ratón transgénico, tal como
aquellos descritos antes. Se podría utilizar el ensayo también
antes de que el ratón desarrolle síntomas de enfermedad, acortando
de ese modo el tiempo necesario para determinar si una muestra
incluye proteínas infecciosas.
La metodología del ensayo puede ser aplicada a
cualquier tipo de muestra, cuando la muestra sea sospechosa de
contener una proteína PrP que exista en al menos dos conformaciones.
La proteína tiene que existir en una conformación que se una a
anticuerpos conocidos, anticuerpos que se puedan generar u otras
parejas de unión específica. La segunda conformación tiene que
suficientemente distinta de la primera conformación en términos de
su capacidad para ser hidrolizada por un compuesto (por ejemplo,
dispasa). En su forma conceptualmente más sencilla, la invención se
desarrolla mejor cuando un compuesto hidrolice rápida y
completamente la conformación de no enfermedad de la proteína, sin
afectar a la conformación relacionada con la enfermedad.
La invención fue desarrollada para ensayar
muestras para la presencia de proteínas PrP y determinar si la
muestra incluía una proteína PrP en su conformación de enfermedad,
esto es, incluía PrP^{Sc}. Por consiguiente, la mayoría de la
revelación siguiente está dirigida a utilizar el inmunoensayo de la
presente invención para detectar la presencia de PrP^{Sc} en una
muestra.
Los anticuerpo utilizados (3F4), marcados con
europio, tienen una alta afinidad de unión por la PrP^{c}
(conformación de no enfermedad), la cual comprende una conformación
rica en alfa-hélice. Los anticuerpos tienen una baja
afinidad de unión por la PrP^{Sc} (conformación de enfermedad),
la cual comprende una conformación rica en lámina \beta. La IgG
puede ser obtenida a partir de anticuerpos monoclonales,
policlonales o recombinantes comunes, reconociendo típicamente la
secuencia 90-145 de la PrP^{c}, y proteína prión
conformacionalmente desplegada. Las diferentes conformaciones de la
proteína prión recombinante fueron reticuladas químicamente a placas
de poliestireno mediante una etapa de activación con glutaraldehído.
Las relativas afinidades de la IgG marcada con europio, con
conformación de \alpha-hélice, lámina \beta y
de ovillo, de proteína prión de hámster sirio recombinante
correspondiente a la secuencia 90-231, fueron
determinadas mediante fluorescencia sincrónica intensificada por
disociación en un formato de placa de poliestireno de 96
pocillos.
Después de que los anticuerpos marcados hayan
sido suministrados con suficiente tiempo, temperatura y condiciones
químicas (por ejemplo, pH) para unirse a las proteínas apropiadas
presentes en las respectivas porciones, se determina el nivel de
unión del anticuerpo marcado a la proteína.
Una vez que un anticuerpo se ha unido a su diana,
la detección puede ser difícil debido a la baja concentración de la
molécula diana en la muestra. Para la detección se pueden utilizar
diferentes métodos.
Dispositivos particularmente útiles son la
fluorescencia sincrónica intensificada por disociación y, más
preferentemente, los fluorómetros inducidos por láser, de longitud
de onda dual [ver Hemmilä y col., Bioanalytical Applications of
Labeling Technologies (eds. Hemmilä) 113-119 (Wallas
Oy. Turku, Finlandia, 1995)].
Estos dispositivos hacen posible detectar
concentraciones en una cantidad en el intervalo de aproximadamente
1x10^{3} partículas por ml o inferior. Se prefiere un alto grado
de sensibilidad debido a que, en la mayoría de las muestras, la
concentración de proteína en la conformación de enfermedad será muy
baja. Por ejemplo, la conformación de no enfermedad de la proteína
podría estar presente en una cantidad de aproximadamente 1x10^{8}
partículas/ml, mientras que la conformación de enfermedad de la
proteína esté únicamente presente en una cantidad de 1x10^{4}
partículas/ml.
El ensayo se puede utilizar para comprobar la
presencia de la conformación de enfermedad de una proteína PrP
dentro de cualquier tipo de muestra. Algunas de las muestras más
típicas a ensayar incluyen productos farmacéuticos que comprenden
componentes que están derivados de mamíferos vivos, o utilizan
materiales derivados de mamíferos vivos en su procesamiento. También
sería conveniente ensayar órganos para trasplantes y artículos
alimenticios tales como buey, el cual fuera sospechoso de contener
priones infecciosos. El ensayo podría ser utilizado para comprobar
la presencia de la conformación de enfermedad de PrP^{Sc}
infecciosa en productos farmacéuticos, cosméticos, tejido para
biopsia o autopsia, cerebro, médula espinal, nervio periférico,
músculo, fluido cerebroespinal, sangre y componentes sanguíneos,
nodos linfáticos, y cultivos derivados de animales o humanos
infectados, o potencialmente infectados, por formas de enfermedad de
proteínas tales como priones. Se podrían ensayar los cerebros de
vacas sospechosas de estar infectadas con priones (esto es,
BoPrP^{Sc}), para determinar si las vacas pueden ser utilizadas
sin peligro para el consumo humano.
Los tratamientos son: (1) pretratamiento, (2)
tratamiento de desplegamiento, y (3) tratamiento de hidrólisis. Un
ensayo puede utilizar todos, o los tratamientos (1) y (3) de los
tres tipos básicos de tratamiento que están definidos arriba. En
general, las condiciones para el pretratamiento son suaves,
moderadas aquellas del tratamiento de desplegamiento, y son severas
aquellas para el tratamiento de hidrólisis. Cada tipo de
tratamiento puede emplear los mismos medios (por ejemplo,
proteasas, pH, temperatura, etc.) pero cada uno emplea un grado
diferente, por ejemplo, concentración superior, mayor tiempo, mayor
temperatura. Sin embargo, el tratamiento de hidrólisis tiene que
emplear un compuesto que hidrolice selectivamente sólo la
conformación de no enfermedad y no la conformación de
enfermedad.
Antes de llevar a cabo el tratamiento o el ensayo
por anticuerpos de la muestra, es necesario someter la muestra a
pretratamiento. Se realiza el pretratamiento para destruir o
eliminar las proteínas no afines, así como alguna forma de no
enfermedad de la proteína presente dentro de la muestra. Ejemplos de
metodología de pretratamiento abarcan el producir una columna que
incluya anticuerpos unidos a superficies soporte, los cuales
anticuerpos se unen a la conformación de no enfermedad de la
proteína, eliminado de ese modo tanta conformación de no enfermedad
de las proteínas como sea posible. También se pueden utilizar
anticuerpos que se unan a proteínas no afines pero comunes.
Alternativamente, la muestra puede ser sometida a tratamiento
físico, tal como presión o temperatura hidrostática de largo plazo,
solas o en combinación con productos químicos tales como ácidos o
álcalis como se indicó antes, para destruir proteínas presentes en
la muestra, las cuales proteínas no son afines a aquellas que se van
a ensayar o que están en conformación de no enfermedad. En algunos
casos, serán destruidas las proteínas en conformación de no
enfermedad y de enfermedad. Sin embargo, será destruido un
porcentaje relativamente alto de las proteínas en la conformación
de no enfermedad porque estas proteínas están inicialmente en una
conformación más libre, que sea más vulnerable a la destrucción. De
este modo, la metodología del pretratamiento produce una muestra que
incluye una concentración relativamente inferior de la conformación
de no enfermedad de la proteína con respecto a la concentración de
la conformación de enfermedad de la proteína. Además, la muestra
pretratada tendrá una concentración inferior de proteínas no afines.
Esto aumenta la sensibilidad del ensayo, haciendo posible que
detecte concentraciones inferiores de la conformación de enfermedad
de la proteína. Se prefiere la eliminación de proteínas sobre la
destrucción de tales porque la destrucción disminuirá la
sensibilidad si se destruye la conformación de enfermedad. Un método
de pretratamiento particularmente útil está revelado en nuestra
solicitud de patente Nº de serie 09/026.967, publicada como Patente
U.S. 5.977.324, y titulada "Process for Concentrating Protein with
Disease-Related Conformation".
El tratamiento de desplegamiento desnaturaliza la
proteína pero no hidroliza las proteínas de interés, y puede incluir
el exponer las proteínas a cualquier método físico y/o químico que
cause que la proteína, que está originalmente presente en una
apretada conformación relacionada con la enfermedad (por ejemplo,
PrP^{Sc}), adopte una conformación más aflojada que tenga un mayor
grado de afinidad de unión por cualquier pareja de unión tal como
anticuerpos (por ejemplo, exponer un epítopo del
N-terminal de la PrP^{Sc}). En general, el
tratamiento de desplegamiento implica el someter la proteína a
algunos métodos que originen epítopos en la proteína, los cuales no
estuvieran previamente expuestos, o parcialmente expuestos, para
llegar a estar expuestos, o llegar a estar más expuestos, para que
un anticuerpo u otra pareja de unión pueda unirse más rápidamente
al epítopo recién expuesto.
Los métodos utilizados para el tratamiento de
desplegamiento pueden comprender: (1) físicos, tales como presión o
temperatura hidrostática, (2) químicos, tales como pH ácido o
alcalino, sales caotrópicas, detergentes desnaturalizantes,
clorhidrato de guanidina y proteinasas tales como la proteinasa K,
y (3) combinaciones de los anteriores. Se tienen que tomar en
cuenta la concentración, temperatura y tiempo a fin de que se
obtenga el efecto deseado, por ejemplo, el desplegamiento pero no
la hidrólisis.
El tiempo del tratamiento variará dependiendo del
tratamiento utilizado, pero debería ser realizado durante
suficiente tiempo para obtener el efecto deseado, por ejemplo, para
el tratamiento de desplegamiento exponer nuevos sitios de unión
pero siempre que no desnaturalice o hidrolice completamente la
proteína. Cuando se lleva a cabo el tratamiento de desplegamiento en
proteínas PrP sin tratamiento químico, se aumenta la temperatura a
unos 40ºC hasta unos 80ºC, durante suficiente tiempo, ara obtener
la cantidad deseada de desplegamiento de PrP^{Sc}. Se puede
disminuir la temperatura y acortar el tiempo si se sube el pH hasta
12 ó 13.
El tratamiento de hidrólisis es un tratamiento
lítico que es el método de tratamiento más importante utilizado en
los ensayos de la invención. Después de que una muestra haya sido
sometida al tratamiento de pretratamiento, es sometida al
tratamiento de hidrólisis. Este tratamiento destruirá o hidrolizará
toda, o sustancialmente toda, la proteína en la muestra, la cual
está en conformación de no enfermedad, y no hidrolizará la proteína
en la conformación de enfermedad. El tratamiento de hidrólisis es,
preferentemente, vía una enzima tal como una hidrolasa que actúa en
los enlaces peptídicos, preferentemente una proteasa neutra, más
preferentemente una metaloendopeptidasa, y sumamente preferente
dispasa o peptidasa A de leucostoma. Las proteasas utilizadas en el
método de la invención pueden ser utilizadas solas, en combinación,
o conjuntamente con enzimas que tengan actividad similar pero
distinta, tales como una carbohidrasa, por ejemplo, colagenasa,
amilasa, o serín-proteasa alcalina. La concentración
de los compuestos tratadores, así como el tiempo y temperatura,
variarán con la proteína a tratar y el resultado final a obtener.
El tratamiento se lleva a cabo para hidrolizar toda, o
sustancialmente toda, la no PrP^{c} presente, pero no hidrolizar
la PrP^{Sc}. El objeto de este tratamiento es hidrolizar tanta
proteína de no enfermedad como sea posible (preferentemente toda),
mientras se hidroliza tan poca (preferentemente ninguna) proteína
relacionada con la enfermedad como sea posible. El tratamiento está
preferentemente diseñado de manera que pueda ser rápida y
completamente detenido en cualquier momento dado. Por ejemplo, la
hidrólisis de PrP^{c} con dispasa u otra proteasa afín puede ser
detenida añadiendo EDTA.
La lista siguiente de enzimas son compuestos
preferidos para su uso en el método de la invención:
Enzima | Fuente biológica |
Dispasa | Bacillus polymyxa |
Atrolisina A, B, C, E y F | Serpiente de cascabel Crotalus atrox |
Envelisina | Diversos miembros de la clase Echinoidea |
Oligopeptidasa Thimet | afín a la sacarolisina de Saccharomyces cerevisiae |
Matrilisina | Útero de rata |
Vibriolisina | Vibrio proteolyticus (antiguamente Aeromonas proteolytica) |
Cocolisina | Streptococcus thermophilus |
Micolisina | Streptomyces griseus |
(Continuación)
Enzima | Fuente biológica |
Meprin A | \begin{minipage}[t]{105mm} Membrana apical renal e intestinal de ratus norvergicus y musculus albinus \end{minipage} |
Astacina | El cangrejo de río Astacus fluviatilis |
Aureolisina | Staphylococcus aureus |
Leishmanolisina | Diversas especies de protozoos Leishmania |
Peptidil-Asp-metaloendopeptidasa | Pseudomonas fragi |
Autolisina | Chlamydomonas reinhardtii |
Deuterolisina | \begin{minipage}[t]{105mm} Penicillium roqueforti; las variantes de la especie incluyen Penicillium caseicolum, Aspergillus sojae, y Aspergillus oryzae \end{minipage} |
Botrolisina | Veneno de serpiente de cascabel Bothrops jararaca |
Estromelisina 1 y 2 | Fibroblastos sinoviales reumatoides humanos |
Bacilolisina | \begin{minipage}[t]{105mm} Bacillus Subtilis; las variantes de la especie incluyen Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus megaterium, Bacillus mesentericus, Bacillus cereus, y Bacillus stearothermophilus \end{minipage} |
Termolisina | \begin{minipage}[t]{105mm} Bacillus thermoproteolyticus; las variantes de la especie incluyen Micrococcus caseolyticus y Aspergillus oryzae \end{minipage} |
Aeromonolisina | Hongo de la miel Armillaria mellea |
Leucolisina | \begin{minipage}[t]{105mm} Veneno de serpiente mocasín boca de algodón, Agkistrodon piscivorus \end{minipage} |
Micolisina | \begin{minipage}[t]{105mm} Streptomyces griseus, Streptomyces naraensis, y Streptomyces cacaoi \end{minipage} |
Pseudo-lisina | Pseudomonas aeruginosa |
Peptidil-Lys-metaloendopeptidasa | Pseudomonas fragi |
Neprilisina | \begin{minipage}[t]{105mm} Ampliamente distribuida en los tejidos de mamíferos, incluyendo cerebro, hígado y pulmón; abundante en la membrana apical de riñón \end{minipage} |
Metaloendopeptidasa lítica \beta | \begin{minipage}[t]{105mm} Achromobacter lyticus y Lysobacter enzymogenes \end{minipage} |
Ofiolisina | Veneno de la cobra rey Ophiophagus hannah |
Pitrilisina | Escherichia coli |
Insulisina | Mamíferos y Drosophila melanogasters |
Serralisina | \begin{minipage}[t]{105mm} Pseudomonas aeruginosa; las variantes de la especie incluyen Escheria freundii, Serratia marcescens, y Erwinia chrysanthemi \end{minipage} |
El método de la invención no se limita a estas
enzimas y, de este modo, se pueden utilizar otras enzimas conocidas
por aquellos especializados en la técnica, para funcionar en el
método de la invención.
Los métodos de acoplamiento químico o de afinidad
de la proteína PrP al soporte de plástico están descritos en general
en la bibliografía disponible y pueden variar. Los anticuerpos
utilizados en el ensayo diagnóstico son Fab policlonales,
monoclonales o recombinantes, y necesitan ser específicos de la
especie, con unión preferencial a la PrP^{c} nativa o a la forma
desnaturalizada de la PrP^{Sc}, preferentemente con al menos una
reactividad 4 veces inferior con la PrP^{Sc} infecciosa,
asumiendo la misma cantidad de antígeno.
Un aspecto de la invención es un proceso de dos
etapas para diagnosticar la enfermedad priónica midiendo
cuantitativamente la forma infecciosa nativa de la proteína
PrP^{Sc} en un material de muestra, o en los cerebros de animales
susceptibles inoculados con tal material. La muestra es pretratada
para eliminar tanta proteína no afín y de no enfermedad como sea
posible. La muestra pretratada es sometida en primer lugar a
tratamiento de hidrólisis, y reticulada después al soporte
plástico.
Para medir la concentración de PrP^{Sc} cuando
sea mucho menor que la de PrP^{c}, el sistema de detección tiene
que tener una sensibilidad excepcional y una escala lineal de al
menos 10^{4}. El ensayo descrito aquí puede detectar fácilmente
PrP^{Sc} a una concentración de (aproximadamente) 50 pg/ml
utilizando IgG marcada con europio. Asumiendo
10^{5}-10^{6} moléculas de PrP^{Sc} por
unidad de ID_{50}, el presente ensayo puede detectar fácilmente
5x10^{2} B 5x10^{3} unidades de ID_{50} por ml.
El ensayo puede detectar PrP^{Sc} en mezclas
(mediante método directo) donde la concentración de PrP^{Sc} sea
inferior al 1% de la concentración de PrP^{c}. Se puede lograr
sensibilidad adicional por inmunoprecipitación, utilizando un
formato "sándwich" para un ensayo en estado sólido,
centrifugación diferencial con extracción con detergente para
eliminar la PrP^{c}, el método indirecto en animales
transgénicos, o combinaciones de estos métodos. Una estimación
conservadora es que tales procedimientos deberían permitir la
medición de entre 5 y 10 unidades de ID_{50} por ml o inferior, o
menos conservadoramente, medir entre 0'1 y 0'01 unidades de
ID_{50} por ml. Tales mediciones proporcionarían un rápido método
"positivo" para establecer la esterilidad biológica, que es la
"ausencia" de infectividad.
Los métodos para generar anticuerpos son
conocidos en general por aquellos especializados en la técnica. Por
cuanto que la forma de enfermedad está a menudo en una
configuración más apretada que la forma de no enfermedad, con menos
epítopos expuestos, uno puede generar fácilmente anticuerpos que se
unan únicamente a la forma de no enfermedad de la proteína, o a la
forma de enfermedad tratada. Por ejemplo, se pueden generar
anticuerpos, que detecten formas tratadas de la proteína PrP^{c}
y la proteína PrP^{Sc}, inmunizando conejos o ratones con
conformaciones \alpha-helicoidales de PrP
recombinante, PrP^{c} nativa de cerebros de animales, péptidos
sintéticos en conformaciones \alpha-helicoidales
o de ovillo, o contra PrP^{Sc} desnaturalizada o PrP
27-30. Únicamente se deberían seleccionar
anticuerpos con afinidad al menos 4 veces superior por la PrP^{c}
(o conformación desnaturalizada de la PrP^{Sc} de la misma
especie) comparada con su afinidad por la PrP^{Sc}. Puede variar
el método de generación, purificación, marcaje y detección de
anticuerpos.
La IgG o Fab's pueden ser purificados a partir de
diferentes fuentes mediante HPLC de afinidad utilizando HPLC en
columna de proteína A y de exclusión granulométrica. Los
anticuerpos purificados pueden ser marcados con europio, y
detectados mediante fluorescencia sincrónica. La unión del
anticuerpo a diferentes conformaciones de proteína PrP se puede
medir mediante fluorescencia sincrónica intensificada por
disociación. Sin embargo, puede variar el sistema de detección de
la IgG unida a PrP en el soporte sólido, in situ o en
solución. Además, es posible utilizar métodos inmunológicos
directos o indirectos comprendiendo ensayos directos con
radiomarcadores, fluorescencia, luminiscencia, amplificación con
avidita-biotina, o de unión enzimática con sustratos
cromáticos o luminiscen-
tes.
tes.
Un anticuerpo que se puede utilizar en la
invención está revelado en U.S. 4.806.627, publicada el 21 de
febrero de 1989, revelando el anticuerpo monoclonal 3F4 263K
producido por la línea celular ATCC HB9222, registrada el 8 de
octubre de 1986. La línea celular que produce el anticuerpo puede
ser obtenida de la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn
Drive, Rockville, MD 20852.
En general, la infección por scrapie fracasa,
para producir una respuesta inmune, con organismos huésped que son
tolerantes a la PrP^{Sc} de la misma especie. Los anticuerpos que
se unen a PrP^{c} o a PrP^{Sc} están revelados en la Patente
U.S. 5.846.533, publicada el 8 de diciembre de 1998. Se puede
utilizar cualquier unión de anticuerpo a PrP^{c} y no a
PrP^{Sc}, y aquellos especializados en la técnica pueden generar
tales utilizando procedimientos conocidos, por ejemplo, ver los
métodos para producir librerías de anticuerpos expresados en fagos
en la U.S. 5.223.409. Sin embargo, han sido provocados anticuerpos
policlonales anti-PrP en conejos después de
inmunización con grandes cantidades de SHaPrP 27-30
desnaturalizada con ácido fórmico o SDS [Bendheim, Barry y col.,
(1984), Nature 310: 418-421; Bode,
Pocchiari y col., (1985), J Gen Virol 66:
2.471-2.478; Safar, Ceroni y col., (1990),
Neurology 40: 513-517]. De manera similar, en
ratones han sido producidos un puñado de anticuerpos monoclonales
anti-PrP contra PrP 27-30 [Barry y
Prusiner (1986), J Infect Dis 154: 518-521;
Kascsak, Rubenstein y col., (1987), J Virol 61:
3.688-3.693]. Estos anticuerpos fueron generados
contra PrP 27-30 desnaturalizada con ácido fórmico o
SDS, y son capaces de reconocer PrP^{c} nativa y PrP^{Sc}
tratada o desnaturalizada de SHa y humanos igualmente bien, pero no
se unen a PrP^{Sc} nativa. De modo no sorprendente, fue trazado el
mapa de los epítopos de estos anticuerpos para las regiones de la
secuencia conteniendo diferencias de aminoácidos entre la PrP de SHA
y la de Mo [Rogers, Yehiely y col., (1993), Proc Natl Acad Sci
USA 90: 3.182-3.186].
No está completamente claro porqué muchos
anticuerpos del tipo descrito en las publicaciones citadas arriba se
unirán a PrP^{c} y a PrP^{Sc} tratada o desnaturalizada, pero
no a PrP^{Sc} nativa. Sin atarse a ninguna teoría concreta, se
sugiere que tal puede tener lugar debido a que los epítopos que
están expuestos cuando la proteína está en la conformación
PrP^{c}, no están expuestos, o parcialmente ocultos, en la
configuración PrP^{Sc} donde la proteína es relativamente
insoluble y más compactadamente plegada a la vez.
Por lo que concierne a la invención, la
indicación de que no ocurra unión significa que la constante de
equilibrio o de afinidad K_{a} es 10^{6} l/mol o inferior.
Además, la unión será reconocida como existente cuando la K_{a}
sea 10^{7} l/mol o mayor, preferentemente 10^{8} l/mol o mayor.
La afinidad de unión de 10^{7} l/mol o más puede ser debida a (1)
un único anticuerpo monoclonal (esto es, muchos de una clase de
anticuerpo), o (2) una pluralidad de diferentes anticuerpos
monoclonales (por ejemplo, muchos de cada uno de cinco diferentes
anticuerpos monoclonales), o (3) muchos anticuerpos policlonales.
También es posible utilizar combinaciones de (1)-(3). Los
anticuerpos preferidos seleccionados se unirán al menos cuatro
veces más ávidamente a las formas PrP^{Sc} tratada o
desnaturalizada de la proteína cuando se compara con su unión a la
conformación nativa de PrP^{Sc}. El diferencial de cuatro veces
en una afinidad de unión puede ser realizado utilizando varios
anticuerpos diferentes como por (1)-(3) arriba, y como semejante,
alguno de los anticuerpos en una mezcla podría tener menos de una
diferencia de cuatro veces.
Se puede utilizar varios tipos diferentes de
ensayos de la invención con uno o más anticuerpos distintos.
Aquellos especializados en la técnica reconocerán que los
anticuerpos pueden ser marcados con marcadores conocidos, y
utilizados con robótica, ensayos tipo "sándwich", detectores
electrónicos, citometría de flujo, y otros actualmente
disponibles.
A continuación se dan las mutaciones patogénicas
y polimorfismos conocidos en el gen PrP relacionados con las
enfermedades priónicas, y las secuencias de humano, de oveja y
bovina están dadas en la U.S. 5.565.186, publicada el 15 de octubre
de 1996.
Mutaciones humanas patogénicas | Polimorfismos humanos | Polimorfismos en oveja | Polimorfismos bovinos |
Inserto de 2 octarrepeticiones | Met/Val en el | Arg/Glu en el | 5 ó 6 |
codon 129 | codon 171 | octarrepeticiones | |
Inserto de 4 octarrepeticiones | Glu/Lys en el | Ala/Val en el | |
codon 219 | codon 136 | ||
Inserto de 5 octarrepeticiones | |||
Inserto de 6 octarrepeticiones | |||
Inserto de 7 octarrepeticiones | |||
Inserto de 8 octarrepeticiones | |||
Inserto de 9 octarrepeticiones | |||
Pro-Leu en el codon 102 | |||
Pro-Leu en el codon 105 | |||
Ala-Val en el codon 117 | |||
Terminación en el codon 145 | |||
Asp-Asn en el codon 178 | |||
Val-Ile en el codon 180 | |||
Phe-Ser en el codon 198 | |||
Glu-Lys en el codon 200 | |||
Val-Ile en el codon 210 | |||
Asn-Arg en el codon 217 | |||
Met-Ala en el codon 232 |
Los ejemplos siguientes están expuestos con el
fin de proporcionar a aquellos especializados en la técnica una
completa revelación y descripción de cómo hacer y utilizar los
ensayos de la presente invención, y no pretenden limitar el campo
de aplicación de lo que los inventores consideran como su invención,
no pretenden representar o presuponer que los experimentos a
continuación sean todos o los únicos experimentos realizados. Se
han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los
números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.),
pero algunos errores y desviaciones experimentales deberían ser
justificados. A menos que se indique lo contrario, las partes son
partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio en
peso, la temperatura está en grados centígrados, y la presión es, o
casi, la atmosférica.
Para determinar los niveles de PrP^{Sc} en
hámsters afectados, se sacrificaron un hámster infectado con
priones y un hámster normal, y se extrajeron sus cerebros. Se
preparó un homogenado al 10% (p/v) de cada uno de los cerebros,
dispersando el tejido cerebral en PBS. Después, el homogenado de
cerebro fue sometido a una centrifugación a baja velocidad de 500
xg, durante 15 minutos, para separar las proteínas suspendidas de
los detritus celulares no deseados. Se midió la concentración de
proteína total del sobrenadante (S1) utilizando un Ensayo de
Proteínas BCA (Pierce), y se ajustó la concentración de cada
homogenado de cerebro con PBS hasta 3'5 mg/ml. Se guardó una porción
del homogenado para que sirviera como control de las proteínas
cerebrales totales.
Se añadió la metaloendopeptidasa dispasa
(Worthington) al resto de cada muestra, en una proporción enzima a
proteína de 1:35. Los homogenados fueron digeridos con 100 \mug/ml
de dispasa durante 60 minutos a 37ºC, en presencia de 0'15% de
Zwittergent 3-12 (Calbiochem), o 0'2% ó 2% de
dodecilsarcosinato sódico (Sarkosyl). También se puso a 37ºC una
muestra sin la dispasa, para que sirviera como control de la
digestión. Después de la digestión, se inactivó la dispasa mediante
la adición de EDTA 50 mM.
Como control, se realizó la digestión con
proteinasa K en cada muestra de S1 sin tratar, con 20 \mug/ml a
una proporción de enzima a proteína de 1:50 (Bolton, 1982), en
presencia de 0'15% de Zwittergent, Sarkosyl al 0'2% ó 2%. Estas
reacciones se terminaron mediante la adición de PMSF 2 mM.
Las muestras digeridas fueron centrifugadas a
100.000 xg durante 1 hora. El gránulo conteniendo todas las
proteínas insolubles fue resuspendido en un volumen mínimo de PBS y
0'15% de Zwittergent. Posteriormente, las muestras digeridas y las
muestras de homogenado de cerebro completas fueron sonicadas en un
sonicador con baño de agua, durante 20 minutos, para desnaturalizar
la proteína que quedaba después de la digestión.
Después, se analizó cada muestra por su contenido
de proteína PrP mediante inmunoblot. Se puso una alícuota de 100
\mul de cada muestra en un tubo Eppendorf de 1'5 ml, con un
volumen igual de tampón de carga de la muestra (1X = TrisCl 50 mM,
pH 6'8; DTT 100 mM, 2% de SDS; 0'1% de azul de bromofenol; y 10% de
glicerina). Además, se puede añadir una alícuota de
\beta-mercaptoetanol para asegurar la
desnaturalización de las proteínas en el gel. Las muestras fueron
aplicadas sobre un gel de poliacrilamida al 10%, proporción molar
de bisacrilamida:acrilamida de 1:29; para 15 V/cm durante unas 4
horas. Las muestras fueron cada una hervidas durante 10 minutos, y
se cargó 15 \mul de cada muestra sobre el gel. Para una
descripción más detallada de la separación de proteínas vía PAGE,
ver Schägger y Von Jagow, Nature 166: 368-379
(1987); y Laemmli (G.B.) (1970), Nature 227,
680-685.
680-685.
El gel fue extraído del aparato PAGE, y
transferido sobre nylon no cargado (Amersham) utilizando un aparato
de electroblotting. El gel y el nylon fueron emparedados entre
piezas de papel Whatman 3MM remojadas en un tampón de transferencia
conteniendo Tris, glicina, SDS y metanol. El sándwich fue colocado
entre electrodos con placas de grafito, con el nylon en el lado
anódico. Se aplicó una corriente de 0'65 mA/cm^{2} durante
1'5-2 horas. Después de la transferencia, se tiñó
el gel con azul Coomasie para asegurarse de que la transferencia
fue completa.
El filtro de nylon fue colocado en una bolsa de
plástico termosellable, y se añadieron 0'1 ml de solución bloqueante
por cm^{2} de filtro. La solución bloqueante contenía 5% (p/v) de
leche descremada en polvo (Carnation), 0'01% de antiespumante A, y
0'02% de azida sódica en PBS. Después de agitar 1 hora a temperatura
ambiente, se añadió el anticuerpo monoclonal 3F4 en una dilución
1:100, y se incubó el filtro durante 2-4 horas a
4ºC, con suave agitación en un agitador de plataforma. Después de
la incubación, se eliminaron la solución bloqueante y el
anticuerpo, y se lavó el filtro tres veces.
El filtro fue incubado con un anticuerpo
secundario anti-Ig en solución bloqueante durante
1-2 horas a temperatura ambiente. El anticuerpo
secundario fue radiomarcado para permitir la detección por
inmunoblot. Para la sonda I^{125} radiomarcada, se añadió
aproximadamente 10^{4} cpm del reactivo por cm^{2} de filtro.
Después de la incubación, se lavó el filtro varias veces en PBS,
cada lavado siendo de unos 10 minutos de duración. El filtro fue
colocado en una casete con una pieza de película Xomat para rayos X
(Kodak) a -70ºC.
Los resultados del inmunoblot fueron como
sigue:
- Tira 1
- S1 de hámster normal
- \quad
- Resultado: banda intensa a aproximadamente 33-35 Kd
- Tira 2
- S1 de hámster normal a 37ºC
- \quad
- Resultado: banda intensa a aproximadamente 33-35 Kd
\newpage
- Tira 3
- S1 de hámster normal digerido con 100 \mug/ml de dispasa, 0'15% de Zwittergent
- \quad
- Resultado: sin banda
- Tira 4
- S1 de hámster normal digerido con 100 \mug/ml de dispasa, 0'2% de Sarkosyl
- \quad
- Resultado: sin banda
- Tira 5
- S1 de hámster normal digerido con 100 \mug/ml de dispasa, 2% de Sarkosyl
- \quad
- Resultado: sin banda
- Tira 6
- S1 de hámster normal digerido con 20 \mug/ml de proteinasa K, 0'2% de Sarkosyl
- \quad
- Resultado: sin banda
- Tira 7
- S1 de hámster normal digerido con 20 \mug/ml de proteinasa K, 2% de Sarkosyl
- \quad
- Resultado: sin banda
- Tira 8
- S1 de hámster infectado con priones
- \quad
- Resultado: banda intensa a aproximadamente 33-35 Kd
- Tira 9
- S1 de hámster infectado con priones a 37ºC
- \quad
- Resultado: banda intensa a aproximadamente 33-35 Kd
- Tira 10
- S1 de hámster infectado con priones, digerido con 100 \mug/ml de dispasa, 0'15% de Zwittergent
- \quad
- Resultado: banda muy intensa a aproximadamente 33-35 Kd
- Tira 11
- S1 de hámster infectado con priones, digerido con 100 \mug/ml de dispasa, 0'2% de Sarkosyl
- \quad
- Resultado: banda muy intensa a aproximadamente 33-35 Kd
- Tira 12
- S1 de hámster infectado con priones, digerido con 100 \mug/ml de dispasa, 2% de Sarkosyl
- \quad
- Resultado: banda muy intensa a aproximadamente 33-35 Kd
- Tira 13
- S1 de hámster infectado con priones, digerido con 20 \mug/ml de proteína quinasa, 0'2% de Sarkosyl
- \quad
- Resultado: banda muy intensa a aproximadamente 27-30 Kd
- Tira 14
- S1 de hámster infectado con priones, digerido con 20 \mug/ml de proteína quinasa, 2% de Sarkosyl
- \quad
- Resultado: banda muy intensa a aproximadamente 27-30 Kd
Estos resultados mostraron que la PrP^{c} de
cerebro de hámster normal no fue detectada después de la digestión
con dispasa o proteinasa K, mientras que las muestras de cerebro
infectado con priones mostraron una señal muy intensa de la proteína
resistente a la proteasa. Las muestras infectadas con priones,
digeridas con proteinasa K, mostraron un desplazamiento esperado en
la magnitud del peso molecular correspondiente a la digestión del
N-terminal de la proteína. La digestión con dispasa
no mostró desplazamiento en el peso molecular. Este descubrimiento
demostró que la dispasa es selectiva para la conformación normal de
la proteína.
Para determinar los niveles de PrP^{Sc} en
ratones afectados, se sacrificaron un ratón infectado con priones y
un ratón normal, y se extrajeron sus cerebros. Se prepara en PBS un
homogenado cerebral al 10% (p/v) de los ratones normal e infectado
con priones. Después de una centrifugación a baja velocidad a 500
xg durante 15 minutos, se mide la proteína total en el sobrenadante
(S1) utilizando ensayos espectrofotométricos, y se ajusta la
concentración a 2'5 mg/ml con PBS.
Las muestras son digeridas con 500 U/ml de
leucolisina durante 45 minutos a 37ºC, en presencia de 2% de
Sarkosyl. La digestión se detiene mediante la adición de EDTA 50
mM. Dos alícuotas de las proteínas, obtenidas en S1 antes y después
de la digestión con leucolisina, son sometidas a electroforesis a
4ºC, en una plancha de gel de poliacrilamida al 8%, como se
describió en la referencia Laemmli pero en ausencia de SDS y
2-mercaptoetanol. Esto permite que las proteínas no
desnaturalizadas migren a través de la poliacrilamida, conservando
mientras la estructura nativa de la proteína. Una vez inmovilizadas
en la poliacrilamida, las proteínas del gel son luego transferidas a
nitrocelulosa para la detección de las proteínas. La transferencia
puede suceder como en el Ejemplo 1, o se puede utilizar un aparato
de transferencia semiseca (referencia Maniatis).
Las muestras digerida y no digerida de ambos
ratones infectado y normal son detectadas en un Western blot como
se describe en el Ejemplo 1, pero utilizando un anticuerpo
monoclonal que identifique la forma PrP^{Sc} nativa de la
proteína. Tales anticuerpos están descritos en WO 98/37411,
publicada el 27 de agosto de 1998, y en la Patente U.S. 5.846.533,
publicada el 8 de diciembre de 1998. Preferentemente, el anticuerpo
utilizado es el anticuerpo R1 específico para PrP^{Sc}. Los
anticuerpos son añadidos a una concentración de aproximadamente
1:100 a 1:200, dependiendo del anticuerpo utilizado y de la
cantidad de proteína pronosticada a inmovilizar en la
nitrocelulosa.
La nitrocelulosa es colocada en una bolsa de
plástico termosellable, y se añade 0'1 ml de solución bloqueante
por cm^{2} de filtro. La solución bloqueante contiene 5% (p/v) de
leche descremada en polvo (Carnation), 0'01% de antiespumante A, y
0'02% de azida sódica en PBS, y se añade Tween 20 hasta una
concentración final del 0'02%. El Tween 20 es un detergente suave
que ayuda además a reducir el fondo. Después de agitar 1 hora a
temperatura ambiente, se añade el anticuerpo R1 en una dilución
1:100, y el filtro es incubado durante 2-4 horas a
4ºC, con suave agitación en un agitador de plataforma. Después de la
incubación, se eliminan la solución bloqueante y el anticuerpo, y
se lava el filtro tres veces.
El filtro es incubado con un anticuerpo
secundario anti-Ig en solución bloqueante durante
1-2 horas a temperatura ambiente. El anticuerpo
secundario es conjugado enzimáticamente con peroxidasa de rábano
picante, para permitir la detección por inmunoblot. El anticuerpo
secundario es añadido a un nivel mucho más diluido que el
anticuerpo primario, de 1:500 a 1:2.000. Después de la incubación,
se lava el filtro varias veces en PBS, cada lavado siendo de unos 10
minutos de duración. El filtro es colocado luego en una casete con
una pieza de película Xomat para rayos X (Kodak) a -70ºC.
El blot resultante tendrá una banda
correspondiente a la PrP^{Sc} en la muestra de cerebro de ratón
infectado con priones tratado, antes y después de la digestión con
leucolisina. La muestra de proteína de cerebro de ratón normal
mostrará una banda de bajo nivel debido a la unión de la PrP^{Sc}.
Sin embargo, la tira con la muestra de cerebro normal, sometida a
hidrólisis con leucolisina, no tendrá una banda detectable puesto
que la leucolisina habrá hidrolizado la proteína PrP en la
muestra.
Un homogenado cerebral al 10% (p/v) de vacas
normal e infectada con priones es resuspendido en 1 l de Tris HCl 25
mM, pH 8'0, EDTA 5 mM (tampón A). Este es centrifugado a 10.000 xg
durante 20 minutos, y se descarta el sobrenadante conteniendo
proteínas citoplásmicas solubles. Se resuspende el gránulo en 1 ml
de tampón A, se pasa dos veces a través de un disruptor de células
(Microfluidics International, modelo MF110), y se centrifuga a
30.000 xg durante 1 hora, después de lo cual se descarta el
sobrenadante y se lava el gránulo una vez con tampón A, y se
centrifuga nuevamente a 30.000 xg durante 1 hora. En esta fase, se
podría almacenar el gránulo a -20ºC antes de la hidrólisis.
La digestión con metaloendopeptidasa lítica
\beta se hace a una proporción enzima a proteína de 1:40. La
proteína es digerida con 100 \mug/ml de metaloendopeptidasa
lítica \beta (Sigma) durante 75 minutos a 40ºC, en una solución
tamponada a pH 8'0 conteniendo 0'2% de Sarkosyl. La digestión se
para mediante la adición de EDTA 50 mM. Después de la hidrólisis de
la conformación PrP^{c} de la proteína prión, la PrP^{Sc} puede
ser desnaturalizada para permitir que el anticuerpo 3F4 identifique
su epítopo. Las muestras normal e infectada con priones son
tratadas con una solución de desnaturalización de guanidina HCL 6M.
La solución de desnaturalización se prepara diluyendo 10 x tampón
[HEPES 250 mM (pH 7'9); Cl_{2}Mg 30 mM; ClK 40 mM] con cinco
volúmenes de agua destilada. Se añade una cantidad adecuada del
guanidina HCl, y se lleva la solución a 1 x utilizando agua
destilada. Finalmente, se añade ditiotreitol hasta una
concentración final de 1 mM. Las muestras hidrolizadas son
sometidas a tratamiento con la solución de desnaturalización,
durante 30 minutos a 4ºC.
Después, las muestras son cargadas sobre geles de
poliacrilamida al 10% como se describió en el Ejemplo 1, y
transferidas a una membrana de nylon. La membrana de nylon es
colocada en una bolsa de plástico termosellable, y se añade 0'1 ml
de solución bloqueante por cm^{2} de filtro. La solución
bloqueante contiene 5% (p/v) de leche descremada en polvo
(Carnation), y 0'02% de azida sódica en PBS. Después de agitar 1
hora a temperatura ambiente, se añade el anticuerpo monoclonal 3F4
en una dilución 1:200, y se incuba el filtro durante
2-4 horas a 4ºC, con suave agitación en un agitador
de plataforma. Después de la incubación, se eliminan la solución
bloqueante y el anticuerpo, y se lava el filtro tres veces. El
filtro es incubado con un anticuerpo secundario
anti-Ig en solución bloqueante durante
1-2 horas a temperatura ambiente, lavado el filtro
varias veces en PBS, y colocado en una casete con una pieza de
película Xomat para rayos X (Kodak) a -70ºC.
La determinación de la infección por priones se
basa en la comparación de la identificación de la PrP en las
muestras normal e infectada. Las tiras conteniendo S1 no
hidrolizado deberían contener cantidades relativamente similares de
proteína PrP, identificada por el anticuerpo 3F4. Las tiras
conteniendo las muestras hidrolizadas, tratadas con guanidina HCl,
permitirán la detección de PrP^{Sc} en la muestra infectada
puesto que la única forma que queda después de la hidrólisis es la
forma PrP^{Sc}. La relación de señal entre la muestra hidrolizada
y la no hidrolizada de la vaca infectada determinará el porcentaje
de PrP que está en la conformación PrP^{Sc}. La muestra
hidrolizada de vaca normal servirá además como control de que la
hidrólisis de la conformación PrP^{c} fue completa.
Para determinar los niveles de PrP^{Sc} en
ratones infectados, se sacrifican un ratón infectado con priones y
un ratón normal, y se extraen sus cerebros. Se preparó un
homogenado al 10% (p/v) de cada uno de los cerebros, dispersando el
tejido cerebral en PBS. Después, el homogenado de cerebro fue
sometido a una centrifugación a baja velocidad de 500 xg, durante 15
minutos, para separar las proteínas suspendidas de los detritus
celulares no deseados. Se midió la concentración de proteína total
del sobrenadante (S1) utilizando un Ensayo de Proteínas BCA
(Pierce), y se ajustó la concentración de cada homogenado de
cerebro con PBS hasta 3'5 mg/ml. Se guardó una porción del
homogenado para que sirviera como control de las proteínas
cerebrales totales.
Luego, cada muestra fue analizada para el
contenido de proteínas PrP^{Sc} y PrP^{c} mediante inmunoblot.
Se procesaron dos alícuotas de 100 \mul de cada muestra y se
sometieron a electroforesis, a 4ºC, en una plancha de gel de
poliacrilamida al 8% como se describió en el Ejemplo 2, esto es,
bajo condiciones no desnaturalizantes. El gel es cargado en dos
tiras de muestra del ratón afectado y en dos tiras de muestra del
ratón de control y, preferentemente, se aplica una tira de cada uno
en una cara del gel, una tira de cada uno en la otra cara del gel,
con los pocillos no conteniendo muestra y separando las dos caras.
Se aplica el gel y se transfiere a nylon como en el Ejemplo 1.
Después de la transferencia, se corta el nylon
para separarlo en dos blots independientes, cada uno conteniendo una
tira de muestra afectada y una tira de control. Cada filtro de nylon
es colocado en una bolsa de plástico termosellable, y se añade 0'1
ml de solución bloqueante por cm^{2} de filtro. La solución
bloqueante contiene 5% (p/v) de leche descremada en polvo
(Carnation), y 0'02% de azida sódica en PBS. Después de agitar 1
hora a temperatura ambiente, a un blot se añade anticuerpo
monoclonal 3F4 en una dilución 1:200, y al otro blot anticuerpo R1
en una dilución 1:200, y se incuba el filtro durante
2-4 horas a 4ºC, con agitación suave en un agitador
de plataforma. A continuación de la incubación, se eliminan la
solución bloqueante y el anticuerpo, y se lava cada filtro tres
veces.
El anticuerpo secundario es adecuadamente marcado
para permitir la detección por inmunoblot. El anticuerpo secundario
es añadido a un nivel mucho más diluido que el anticuerpo primario,
de 1:500 a 1:2.000. Después de la incubación, se lava el filtro
varias veces en PBS, cada lavado siendo aproximadamente de 10
minutos de duración. Luego, el filtro es colocado en una casete con
una pieza de película Xomat para rayos X (Kodak) a -70ºC.
Se puede determinar el nivel de PrP^{Sc} en la
muestra afectada comparando los niveles de señal relativos de cada
anticuerpo en el ratón afectado frente al de control. Este proceso
puede ser una comparación física para determinar las diferencias
relativas en el nivel de señal entre el anticuerpo R1 y el 3F4, o
puede ser una comparación cuantitativa. Las técnicas de comparación,
ambas físicas y cuantitativas, serán conocidas por aquellos
especializados en la técnica. La comparación cuantitativa puede ser
valorada utilizando técnicas de barrido del blot en las que se
determinan los niveles utilizando programas de ordenador diseñados
especialmente para calcular los niveles comparativos. Uno de tales
métodos es utilizar un programa de hojas de cálculo Excel
modificado. Tales programas permiten ajustes entre muestras,
basados en variables tales como el fondo, el tiempo de hibridación,
etc.
Los niveles de tinción de 3F4 deberían ser
coherentes entre las muestras de control normales de ambos blots con
anticuerpos R1 y 3F4. El nivel de diferencia entre la tinción de R1
y la tinción de 3F4 en la muestra afectada debería permitir la
cuantificación de PrP^{Sc} en la muestra restando el nivel de
señal de PrP^{c}, utilizando el anticuerpo 3F4, del nivel de señal
de PrP^{Sc} y PrP^{c} del anticuerpo R1. Tal cuantificación
puede ser ajustada basada en la sensibilidad, concentración de los
anticuerpos, etc.
Claims (10)
1. Un método de ensayo para determinar la
presencia de proteína prión (PrP) en su conformación relacionada
con la enfermedad (PrP^{Sc}), comprendiendo las etapas de:
pretratar una muestra, sospechosa de contener
proteína PrP, para destruir o eliminar proteínas no relacionadas
con la proteína PrP, reduciendo de ese modo la concentración de
proteína en la muestra que no sea proteína PrP^{Sc};
tratar la muestra pretratada con un compuesto que
destruya o hidrolice toda, o sustancialmente toda, la PrP^{c} en
la muestra pero no hidrolice la PrP^{Sc} en la muestra;
parar la reacción de hidrolización;
poner en contacto la muestra sometida al
pretratamiento, y tratarla con una pareja de unión que se una a la
PrP^{Sc} en la muestra; y
determinar la presencia de PrP^{Sc} en la
muestra basada en la unión de la pareja de unión.
2. El método de ensayo de la Reivindicación 1, en
donde el compuesto que hidroliza la PrP^{c}, pero no la
PrP^{Sc}, es seleccionado del grupo que se compone de
metaloendopeptidasa y dispasa.
3. El método de ensayo de la Reivindicación 2, en
donde dicha metaloendopeptidasa es seleccionada de
peptidil-Lys-metaloendopeptidasa,
metaloendopeptidasa lítica \beta, y
peptidil-Asp-metaloendopeptidasa.
4. El método de ensayo de la Reivindicación 1, en
donde el compuesto que hidroliza la PrP^{c}, pero no la
PrP^{Sc}, es seleccionado de atrolisina A, B, C, E y F,
envelisina, oligopeptidasa Thimet, matrilisina, vibriolisina,
cocolisina, micolisina, meprin A, astacina, aureolisina,
leishmanolisina, autolisina, deuterolisina, botrolisina,
estromelisina 1 y 2, bacilolisina, termolisina, aeromonolisina,
leucolisina, pseudo-lisina, neprilisina,
ofiolisina, pitrilisina, insulisina, y serralisina.
5. El método de ensayo de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde el pretratamiento comprende
el extraer la proteína en la muestra poniendo en contacto la
muestra con anticuerpos unidos a un soporte, los cuales anticuerpos
se unen a la proteína que no sea PrP^{Sc}.
6. El método de ensayo de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde la pareja de unión es el
anticuerpo R1, específico para PrP^{Sc}.
7. El ensayo de cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 5, en donde la pareja de unión es un anticuerpo
3F4 (ATCC HB9222).
8. El método de ensayo de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde la pareja de unión está unida
a un marcador detectable.
9. El método de ensayo de la Reivindicación 8, en
donde se lleva a cabo la detección utilizando fluorescencia
sincrónica intensificada por disociación.
10. El método de ensayo de la Reivindicación 8,
en donde se lleva a cabo la detección utilizando un fluorómetro
inducido por láser, de longitud de onda dual.
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