ES2241316T3 - Modulacion de proteinas quinasa de linaje multiple. - Google Patents
Modulacion de proteinas quinasa de linaje multiple.Info
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Abstract
Un procedimiento para identificar un compuesto que modula la actividad de una proteína de quinasa de linaje múltiple y promueve la supervivencia celular o muerte celular, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto in vitro dicha célula que contiene dicha proteína de quinasa de linaje múltiple con dicho compuesto; (b) determinar si dicho compuesto incrementa o disminuye la actividad de dicha proteína de quinasa de linaje múltiple ; y (c) determinar si dicho compuesto promueve la supervivencia celular o muerte celular.
Description
Modulación de proteínas quinasa de linaje
múltiple.
La presente invención se refiere, en parte, a
procedimientos para modular miembros de la familia de las quinasas
de linaje múltiple (MLK), procedimientos para identificar compuestos
que modulan una proteína de quinasas de linaje múltiple y promover
la supervivencia celular o promover la muerte celular,
procedimientos para identificar compuestos que pueden ser útiles en
el tratamiento de trastornos neurodegenerativos y/o inflamación, y
procedimientos de tratamiento de trastornos neurodegenerativos con
compuestos que inhiben una proteína de quinasa de linaje
múltiple.
múltiple.
La familia de las MLK comprende un grupo de
proteínas en las que la secuencia de proteínas de los dominios
quinasa de los miembros de la familia se parecen estrechamente a las
MAPKKK pero tienen mayor similitud entre sí que otras MAPKKK. Los
miembros de la familia de MLK comprenden una parte de las cascadas
de las quinasas muy complejas tales como, por ejemplo, la cascada de
señalización de estrés, que implica modulación de, entre otros, la
quinasa N-terminal c-Jun (JNK), que
a su vez modula, entre otros, factores de transcripción que
incluyen c-Jun, ATF2, y ELK - 1. JNK se describe en
las patentes de Estados Unidos números 5.534.426, 5.593.884,
5.605.808, y en el documento WO 95/03324, cada una de las cuales se
incorpora en esta memoria descriptiva por referencia en su
totalidad.
La familia MLK incluye, en parte, los grupos
siguientes: 1) la quinasa 1 de linaje múltiple (MLK1); 2) la quinasa
2 de linaje múltiple (MLK2); 3) la quinasa 3 de linaje múltiple
(MLK3); 4) la quinasa que lleva cremallera de leucina (LZK); 5) la
quinasa que lleva cremallera de leucina dual (DLK); y 6) la quinasa
6 de linaje múltiple (MLK6). La MLK1 tiene un dominio catalítico
similar a ambas quinasas específico para Tyr y Ser/Thr. Dorow, y
col., Eur. J. Biochem., 1993, 213, 701 - 710. La MLK2
también tiene un dominio catalítico similar a ambas quinasas
específico para Tyr o Ser/Thr. Dorow, y col., Eur. J.
Biochem., 1993, 213, 701 - 710. La MLK2 también se conoce
como MST. Katoh, y col., Oncogene, 1995, 10, 1447 -
1451. La MLK3 comprende una proteína que, además del dominio
quinasa, contiene dos cremalleras de leucina con una región básica
carboxi - terminal adyacente, y una región rica en prolina. Ing, y
col., Oncogene, 1994, 10, 1745 - 1750. La MLK3 también
se conoce como SPKR (Gallo y col., J. Biol. Chem,
1994, 269, 15092 - 15100, y PTK1 (Ezoe, y col.,
Oncogene, 1994, 9, 935 - 938). LZK es una quinasa que
lleva cremallera de leucina. Sakuma, y col., J. Biol. Chem,
1997, 272, 28622 - 28629. DLK tiene un dominio quinasa y dos
motivos de cremallera de cremallera de leucina supuestos. Holzman, y
col., J. Biol. Chem, 1994, 269, 30808 - 30817. DLK
también se conoce como ZPK (Reddy, y col., Biochem. Biophys.
Res. Comm., 1994, 202, 613 - 620) y MUK (Hirai, y col.,
Oncogene, 1996, 12, 641 - 650). Los miembros de la
familia MLK también se describen en, por ejemplo, las patentes de
Estados Unidos números 5.676.945, 5.554.523, documento WO 93/15201,
patente canadiense 2.148.898, Diener, y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1997, 94, 9687 - 9692, DeAizpurua, y col.,
J. Biol. Chem, 1997, 272, 16364 - 16373, Tung, y
col., Oncogene, 1997, 14, 653 - 659, Sells, y col.,
Trends in Cell Bioq., 1997, 7, 161 - 167, Mata, y
col., J. Biol. Chem, 1996, 271, 16888 - 16896, Hirai,
y col., J. Biol. Chem, 1997, 272, 15617 - 15173, Fan,
y col., J. Biol. Chem, 1996, 271, 24788 - 24793,
Blouin, y col., DNA and Cell Biol., 1996, 15, 631 -
642, Pombo, y col., Nature, 1995, 377, 750 - 754,
Kiefer y col., EMBO J., 1996, 15, 7013 - 7025, Hu, y
col., Genes & Dev., 1996, 10, 2251 - 2264, Su y
col., EMBO J., 1997, 16, 1279 - 1290, y Dorow, y col.,
Eur. J. Brochem., 1995, 234, 492 - 500.
Recientemente, se identificó otra quinasa relacionada con MLK en la
base de datos de EST. La secuencia de ADN de este clon, MLK6, se
describe mediante siete entradas de superposición. Sus números de
identificación de clon son: 1007489, 1460085, 510915, 666323, F5555,
482188 y 178522, las secuencias de cada una de los cuales se
incorporan en esta memoria descriptiva como referencias en su
totalidad. Cada una de las referencias citadas en el párrafo
presente se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia
en su totalidad.
Recientemente, la expresión estable de ZPK de ha
mostrado que reduce la capacidad proliferativa de fibroblastos NIH
3T3 se mide mediante un ensayo de formación de colonias. Bergeron, y
col., Biochem. Biophys. Res. Comm., 1997, 231, 153 -
155. Sin embargo, Bergeron, y col., no proporcionaron ningún dato
que mostrara que ZPK modulaba la actividad de un sustrato de ZPK o
si ZPK promovía la muerte celular.
La expresión de una construcción que codifica Myc
- MLK2 en células Swiss 3T3 se ha mostrado que conduce a apoptosis
aproximadamente 20 horas después de inyección. Nagata y col.,
EMBO J., 1998, 17, 149 - 158.
Los solicitantes han desarrollado numerosos
compuestos indolo e indeno que, entre otros, inhiben el crecimiento
celular asociado a estados hiperproliferativos e inhiben la muerte
en una variedad de cultivos embriónicos, tal como ganglios de la
raíz dorsal, ganglios cervicales superiores, estriados y neuronas
motoras. Las patentes de Estados Unidos números 5.475.110,
5.591.855, 5.594.009, 5.461.146, 5.621.100, 5.621.101, 5.705.511, y
5.756.494, cada una de las cuales es de cesión común con la
solicitud presente solicitud, y cada una de las cuales se incorpora
en esta memoria descriptiva como referencia. Los compuestos
descritos en la patente de Estados Unidos Nº 5.705.511 que tienen la
fórmula G se refieren en la presente solicitud por tener la fórmula
I. Los solicitantes también muestran que la apoptosis de las
neuronas motoras se inhibe por un derivado de K - 252a, un
indolocarbazol que también modula la cascada de señalización de
estrés. Maroney, y col., J. Neurosci., 1998, 18, 104
- 111, que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia
en su totalidad.
Debido a la lo inadecuado de los compuestos de
selección que modulan miembros de la cascada de señalización de
estrés y promueven la muerte celular o supervivencia celular,
continúa siendo una necesidad procedimientos selectivos, nuevos y
compuestos de selección. Además, continúa siendo una necesidad de
ensayos de selección para compuestos terapéuticos que pueden ser
útiles en el tratamiento de inflamación y trastornos degenerativos.
La presente invención se refiere a éstos, así como a otros, fines
importantes.
La presente invención proporciona procedimientos
para identificar compuestos que modulan la actividad de una proteína
de quinasa de linaje múltiple y promueve la supervivencia celular
que comprende las etapas de poner en contacto la célula que contiene
la proteína de quinasa de linaje múltiple con el compuesto,
determinando si el compuesto disminuye la actividad de la proteína
de quinasa de linaje múltiple, y determinando si el compuesto
promueve supervivencia celular.
La presente invención también proporciona
procedimientos para identificar compuestos que modulan la actividad
de una proteína de quinasa de linaje múltiple y promueve la muerte
celular comprendiendo las etapas de poner en contacto la proteína de
quinasa de linaje múltiple con el compuesto, determinando si el
compuesto incrementa la actividad de la proteína de quinasa de
linaje múltiple, y determinando si el compuesto promueve la muerte
celular.
La presente invención también proporciona
procedimientos para identificar compuestos que pueden ser útiles en
el tratamiento de trastornos neurodegenerativos que comprenden poner
en contacto una célula o extracto de células que contiene una
proteína de quinasa de linaje múltiple con el compuesto y
determinando si el compuesto disminuye la actividad de la proteína
de quinasa de linaje múltiple.
La presente invención también proporciona
procedimientos para identificar compuestos que pueden ser útiles en
el tratamiento de inflamación que comprende poner en contacto una
célula o extracto de células que contiene una proteína de quinasa de
linaje múltiple con el compuesto y determinando si el compuesto
disminuye la actividad de una proteína de quinasa de linaje
múltiple.
La presente invención también proporciona
procedimientos para tratar un mamífero que tiene o es sospechoso de
tener un trastorno degenerativo que comprende la administración a
dicho mamífero de un compuesto que inhibe o reduce la actividad de
la proteína de quinasa de linaje múltiple.
La presente invención también proporciona
procedimientos para tratar un mamífero que tiene inflamación que
comprende la administración a dicho mamífero de un compuesto que
inhibe o reduce la actividad de la proteína de quinasa de linaje
múltiple.
La presente invención también proporciona
procedimientos para modular la actividad de una proteína de quinasa
de linaje múltiple que comprende poner en contacto la proteína de
una célula que contiene la proteína con un compuesto que tiene la
fórmula II:
en la
que:
el anillo B y el anillo F, independientemente, y
cada uno junto con los átomos de carbono a los que están unido, se
seleccionan entre el grupo constituido por:
un anillo aromático carbocíclico de 6 miembros en
el que entre 1 y 3 átomos de carbono se pueden reemplazar por átomos
de nitrógeno;
un anillo aromático carbocíclico de 5 miembros no
saturado; y
un anillo aromático carbocíclico de 5 miembros no
saturado en el que bien un átomo de carbono se reemplaza con un
átomo de oxígeno, nitrógeno, o azufre;
un átomo de carbono se reemplaza con un átomo de
oxígeno, nitrógeno, o azufre;
dos átomos de carbono se reemplazan con un átomo
de azufre y uno de nitrógeno, un átomo de oxígeno y un átomo de
nitrógeno, dos átomos de nitrógeno; o tres átomos de carbono se
reemplazan con tres átomos de nitrógeno;
R^{1} se selecciona entre el grupo constituido
por:
H, alquilo sustituido o no sustituido que tiene
entre 1 y 4 átomos de carbonos, arilo sustituido o no sustituido,
arilalquilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no
sustituido, o heteroarilalquilo sustituido o no sustituido;
-C(=O)R^{9}, en el que R^{9} se
selecciona entre el grupo constituido por alquilo, arilo y
heteroarilo;
-OR^{10}, donde R^{10} se selecciona entre el
grupo constituido por H y alquilo que tiene entre 1 y 4 átomos de
carbono;
-C(=O)NH_{2}, -NR^{11}R^{12},
-(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12},
-(CH_{2})_{p}OR^{10},
-O(CH_{2})_{p}OR^{10} y
-O(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}, en los que p está
entre 1 y 4; y en los que bien o
R^{11} y R^{12} se seleccionan cada uno de
ellos independientemente entre el grupo constituido por H y alquilo
que tienen entre 1 y 4 átomos de carbono; o
R^{11} y R^{12} juntos forman un grupo de
unión de fórmula
-(CH_{2})_{2}-X^{1}-(CH_{2})_{2}-,
en el que X^{1} se selecciona entre el grupo constituido por -O-,
-S-, y -CH_{2}-;
R^{2} se selecciona entre el grupo constituido
H, alquilo que tiene entre y 4 átomos de carbono, -OH, alcoxi que
tiene entre 1 y 4 átomos de carbono, -OC(=O)R^{9},
-OC(=O)NR^{11}R^{12},
-O(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12},
-O(CH_{2})_{p}OR^{10}, arilalquilo sustituido o
no sustituido que tiene entre 6 y 10 átomos de carbono, y
heteroarilalquilo sustituido o no sustituido;
R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} se
seleccionan cada uno de ellos independientemente entre el grupo
constituido por:
H, arilo, heteroarilo, F, Cl, Br, I, -CN,
CF_{3}, -NO_{2}, -OH, -OR^{9},
-O(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12},
-OC(=O)R^{9}, -OC(=O)NR^{2}R^{7},
-OC(=O)NR^{11}R^{12},
-O(CH_{2})_{p}OR^{10}, -CH_{2}OR^{10},
-NR^{11}R^{12}, -NR^{10}S(=O)_{2}R^{9},
-NR^{10}C(=O)R^{9};
-CH_{2}OR^{14}, en el que R^{14} es el
residuo de un aminoácido después de que se retire el grupo
hidroxilo del grupo carboxilo;
-NR^{10}C(=O)NR^{11}R^{12},
-CO_{2}R^{2}, -C(=O)R^{2},
-C(=O)NR^{11}R^{12}, -CH=NOR^{2}, -CH=NR^{9},
-(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12},
-(CH_{2})_{p}NH
R^{14}, o -CH=NNR^{2}R^{2A} en los que R^{2A} es el mismo que R^{2};
R^{14}, o -CH=NNR^{2}R^{2A} en los que R^{2A} es el mismo que R^{2};
-S(O)_{y}R^{2}-(CH_{2})_{p}S(O)_{y}R^{9},
-CH_{2}S(O)_{y}R^{14} en el que y es 0, 1 ó 2;
alquilo que tiene entre 1 y 8 átomos de carbono, alquenilo que tiene
entre 2 y 8 átomos de carbono, y alquinilo que tiene entre 2 y 8
átomos de carbono, en los que
cada grupo alquilo, alquenilo, o alquinilo está
no sustituido; o
cada grupo alquilo, alquenilo, o alquinilo está
sustituido con 1 a 3 grupos seleccionados entre el grupo constituido
por arilo que tiene entre 6 y 10 átomos de carbono, heteroarilo,
arilalcoxi, heterocicloalcoxi, hidroxialcoxi, alquiloxi- alcoxi,
hidroxialquiltio, alcoxi-alquiltio, F, Cl, Br, I,
-CN, -NO_{2}, -OH, -OR^{9},
-X^{2}(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12},
-X^{2}(CH_{2})_{p}C(=O)NR^{11}R^{12},
-X^{2}(CH_{2})_{p}OC(=O)NR^{11}R^{12},
-X^{2}(CH_{2})_{p}CO_{2}R^{9},
-X^{2}(CH_{2})_{p}S(O)_{y}R^{9},
-X^{2}(CH_{2})_{p}NR^{10}C(=O)NR^{11}R^{12},
-OC(=O)R^{9}, -OCONHR^{2},
-O-tetrahidropiranilo, -NR^{11}R^{12},
-NR^{10}C(=O)R^{9}, -NR^{10}CO_{2}R^{9},
-NR^{10}C(O)NR^{11}R^{12}, -NHC(=NH)
NH_{2}, NR^{10}S(O_{2})R^{9}, -S(O)_{y}R^{9}, -CO_{2}R^{2}, -C(=O)NR^{11}R^{12}, -C(=O)R^{2}, -CH_{2}OR^{10}, -CH=NNR^{2}R^{2A}, -CH=NOR^{2}, -CH=N
R^{9}, -CH=NNHCH(N=NH)NH_{2}, -S(=O)_{2}NR^{2}R^{2A}, -P(=O)(OR^{10})_{2}, -OR^{14}, y un monosacárido que tiene entre 5 y 7 átomos de carbono en el que cada grupo hidroxilo del monosacárido está bien independientemente no sustituido o reemplazado con H, alquilo que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono, alquilcarboniloxi que tiene entre 2 y 5 átomos de carbono, o alcoxi que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono;
NH_{2}, NR^{10}S(O_{2})R^{9}, -S(O)_{y}R^{9}, -CO_{2}R^{2}, -C(=O)NR^{11}R^{12}, -C(=O)R^{2}, -CH_{2}OR^{10}, -CH=NNR^{2}R^{2A}, -CH=NOR^{2}, -CH=N
R^{9}, -CH=NNHCH(N=NH)NH_{2}, -S(=O)_{2}NR^{2}R^{2A}, -P(=O)(OR^{10})_{2}, -OR^{14}, y un monosacárido que tiene entre 5 y 7 átomos de carbono en el que cada grupo hidroxilo del monosacárido está bien independientemente no sustituido o reemplazado con H, alquilo que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono, alquilcarboniloxi que tiene entre 2 y 5 átomos de carbono, o alcoxi que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono;
X^{2} es O, S, o NR^{10};
R^{7} y R^{8} están cada uno de ellos
independientemente seleccionados entre el grupo constituido por H,
alquilo, que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono, alcoxi que tiene
entre 1 y 4 átomos de carbono, arilalquilo sustituido o no
sustituido que tiene entre 6 y 10 átomos de carbono,
heteroarilalquilo sustituido o no sustituido,
-(CH_{2})_{p}OR^{10}, -(CH_{2})_{p}
OC(=O)NR^{11}R^{12}, y -(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}; o R^{7} y R^{8} juntos forman un grupo de unión de fórmula -CH_{2}-X^{3}-CH_{2}-, en el que X^{3} es X^{2} o un enlace;
OC(=O)NR^{11}R^{12}, y -(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}; o R^{7} y R^{8} juntos forman un grupo de unión de fórmula -CH_{2}-X^{3}-CH_{2}-, en el que X^{3} es X^{2} o un enlace;
m y n son cada uno de ellos independientemente 0,
1, ó 2;
Y se selecciona entre el grupo constituido por
-O-, -S-, -N(OR^{10})-,
-N^{+}(O^{-})(R^{10})-, -N(OR^{10})-, y
-CH_{2}-;
Z se selecciona entre el grupo constituido por un
enlace, -O-, -CH=CH-, -S-, -C(=O)-, -CH(OR^{10})-,
-N(R^{10})-,
-N(OR^{10})-, CH(NR^{11}R^{12})-, -C(=O)N(R^{17})-, -N(R^{17})C)=O)-, -N(S(O)_{y}R^{9})-, -N(SO)_{y}NR^{11}R^{12})-, -N(C(=O)R^{17})-, -C(R^{15}
R^{16})-, N^{+}(O^{-})R^{10})-, -CH(OH)-CH(OH)-, y -CH(O(C=O)R^{9})CH(OC(=O)R^{9A})-, en los que R^{9A} es el mismo que R^{9},
-N(OR^{10})-, CH(NR^{11}R^{12})-, -C(=O)N(R^{17})-, -N(R^{17})C)=O)-, -N(S(O)_{y}R^{9})-, -N(SO)_{y}NR^{11}R^{12})-, -N(C(=O)R^{17})-, -C(R^{15}
R^{16})-, N^{+}(O^{-})R^{10})-, -CH(OH)-CH(OH)-, y -CH(O(C=O)R^{9})CH(OC(=O)R^{9A})-, en los que R^{9A} es el mismo que R^{9},
R^{15} y R^{16} están independientemente
seleccionados entre el grupo constituido por H, -OH,
-C(=O)R^{10}, -O(C=O)R^{9}, hidroxialquilo,
y -CO_{2}R^{10},
R^{17} se selecciona entre el grupo constituido
por H, alquilo, arilo, y heteroarilo;
A^{1} y A^{2} se seleccionan entre el grupo
constituido por H, H; H, OR^{2}; H, -SR^{2}; H,
-N(R^{2})_{2}; y un grupo en el que A^{1} y
A^{2} juntos forman un resto seleccionado entre el grupo
constituido por =O, =S, y =NR^{2};
B^{1} y B^{2} se seleccionan entre el grupo
constituido por H, H; H, OR^{2}; H, -SR^{2}; H,
-N(R^{2})_{2}; y un grupo en el que B^{1} y
B^{2} juntos forman un resto seleccionado entre el grupo
constituido por =O, =S, y =NR^{2};
con la condición de que al menos uno de los pares
A^{1} y A^{2}, o B^{1} y B^{2}, forman =O.
La presente invención también proporciona
procedimientos para modular la actividad de una proteína de quinasa
de linaje múltiple que comprende poner en contacto la proteína o
célula que contiene la proteína con un compuesto que tiene la
fórmula III:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
Z_{1} es H y Z_{2} es H o Z_{1} y Z_{2}
juntos forman =O;
R_{1} se selecciona entre el grupo constituido
por H, Cl, CH_{2}SO_{2}C_{2}H_{5}, Br,
CH_{2}S(CH_{2})_{2}NH_{2},
CH_{2}S(CH_{2})_{2}N(CH_{3})_{2},
CH_{2}S(CH_{2})_{2}NH_{2},
n-C_{4}H_{9}, NHCONHC_{6}H_{5},
NHCONHC_{2}H_{5}, CH_{2}SC_{2}H_{5},
CH_{2}SC_{6}H_{5}, N(CH_{3})_{2}, CH_{3},
CH_{2}OCONH
C_{2}H_{5}, NHCO_{2}CH_{3}, CH_{2}OC_{2}H_{5}, CH_{2}N(CH_{3})_{2}, OH, O-n-propilo; CH=NNH-C(=NH)NH_{2}, CH=N-N(CH_{3})_{2}, CH_{2}S(CH_{2})_{2}NH-n-C_{4}H_{9}, CH_{2}OCH_{2}OCH_{2}CH_{3}, CH_{2}S[3-(1,2,4-triazina)], CH_{2}CH_{2}SCH_{3};
C_{2}H_{5}, NHCO_{2}CH_{3}, CH_{2}OC_{2}H_{5}, CH_{2}N(CH_{3})_{2}, OH, O-n-propilo; CH=NNH-C(=NH)NH_{2}, CH=N-N(CH_{3})_{2}, CH_{2}S(CH_{2})_{2}NH-n-C_{4}H_{9}, CH_{2}OCH_{2}OCH_{2}CH_{3}, CH_{2}S[3-(1,2,4-triazina)], CH_{2}CH_{2}SCH_{3};
\vskip1.000000\baselineskip
R_{2} se selecciona entre el grupo constituido
por H, Br, Cl, I,
CH_{2}S(CH_{2})_{2}N(CH_{3})_{2},
NHCONHC_{2}H_{5}, CH_{2}SC_{2}H_{5},
CH_{2}OCH_{2}OCH_{2}CH_{3}, CH_{2}S[3-(1,2,4-
triazina)], CH_{2}CH_{2}SCH_{3}; y CH_{2}OH;
X se selecciona entre el grupo constituido por H,
CH_{2}OH, CH_{2}NH-SerinaH, CO_{2}CH_{3},
CONC_{6}H_{5}, CH_{2}NHCO_{2}C_{6}
H_{5}, CH_{2}NHCO_{2}CH_{3}, CH_{2}N_{3}, CONHC_{2}H_{5}, CH_{2}NH-glicina, CON(CH_{3})_{2}, -CH_{2}NHCO_{2}-, CONH_{2}, CONHCH_{3}H_{7}, CH_{2}
NH-serina, CH_{2}SOCH_{3}, CH=NOH, CH_{2}NH-prolina, CH_{2}CH_{2}(2-piridilo), CH=NNH-C(=NH)NH_{2}, CONH(CH_{2})_{2}OH, CH=NNHCONH_{2}, CH_{2}OCOCH_{3}, -CH_{2}OC(CH_{3})_{2}O-, CH_{2}SC_{6}H_{5}, CH_{2}SOC_{6}H_{5}, CO_{2}n-hexilo, -CONHCH_{3}, y CO_{2}(CH_{2})_{4}CH_{3}; o uno de las siguientes fórmulas
H_{5}, CH_{2}NHCO_{2}CH_{3}, CH_{2}N_{3}, CONHC_{2}H_{5}, CH_{2}NH-glicina, CON(CH_{3})_{2}, -CH_{2}NHCO_{2}-, CONH_{2}, CONHCH_{3}H_{7}, CH_{2}
NH-serina, CH_{2}SOCH_{3}, CH=NOH, CH_{2}NH-prolina, CH_{2}CH_{2}(2-piridilo), CH=NNH-C(=NH)NH_{2}, CONH(CH_{2})_{2}OH, CH=NNHCONH_{2}, CH_{2}OCOCH_{3}, -CH_{2}OC(CH_{3})_{2}O-, CH_{2}SC_{6}H_{5}, CH_{2}SOC_{6}H_{5}, CO_{2}n-hexilo, -CONHCH_{3}, y CO_{2}(CH_{2})_{4}CH_{3}; o uno de las siguientes fórmulas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y R se selecciona entre el grupo
constituido por OH, y
OCH_{3}.
La presente invención también proporciona
procedimientos de modulación de la actividad de una proteína de
quinasa de linaje múltiple que comprende poner en contacto la
proteína o una célula que contiene la proteína con un compuesto que
tiene la fórmula IV:
en la
que
Z_{1} es H y Z_{2} es H o Z_{1} y Z_{2}
juntos forman =O;
R_{1} es H o Br;
R_{2} es H;
R_{3} es H, CH_{2}CH=CH_{2},
CH_{2}CH_{2}CH_{2}OH, o
y
R_{4} es H, CH_{2}CH=CH_{2} o
CH_{2}CH_{2}CH_{2}OH
Para los propósitos de ilustrar las realizaciones
de la presente invención, en los dibujos se muestran ciertas
características. Sin embargo, se debe entender que esta invención
no se limita a las realizaciones precisas mostradas.
La figura 1 es un dibujo esquemático que muestra
una preparación general de indenopirrolocarabazoles unidos por
puentes.
La figura 2 es un dibujo esquemático que muestra
una preparación general de indenopirrolocarabazoles unidos por
puentes.
La figura 3 es un dibujo esquemático que muestra
una preparación general de indenopirrolocarabazoles unidos a
resina.
La figura 4 es un dibujo esquemático que muestra
la preparación de indenopirrolocarabazoles, protegidos,
solubles.
La figura 5 es un dibujo esquemático que muestra
la preparación de intermedio V.
La figura 6 es un dibujo esquemático que muestra
la preparación general de indenopirrolocarabazoles unidos por
puentes usando el procedimiento A.
La figura 7 es un dibujo esquemático que muestra
la preparación general de indenopirrolocarabazoles unidos por
puentes usando el procedimiento B.
La figura 8 es un dibujo esquemático que muestra
la preparación de indenopirrolocarabazoles unidos por puentes
sustituidos en el anillo B.
La figura 9 es un dibujo esquemático que muestra
la derivatización del anillo E de indenopirrolocarabazoles unidos
por puentes.
La figura 10 muestra un gráfico de dos
experimentos separados que muestran la cantidad de células PC - 12
neuronalmente diferenciadas viables que permanecen después de 5 días
de cultivo en ausencia de NGF. Las células se expresan como
porcentaje de control NGF en cada grupo (control de vector en
ausencia de NGF, n = 12; los otros grupos, n = 3). La diferencia
entre control de vector y conjuntos estables de células que
expresan un mutante MLK - 3 negativo dominante en ausencia de NGF
es estadísticamente significativa como se determina por una prueba T
de dos lados (p < 0,05).
La figura 11A muestra la fosforilación de GST -
SEK muestras por quinasas por FLAG - MLK - 3 expresada por
baculovirus (mezcla de dominio de longitud completa y quinasa)
usando un ensayo basado en gel radiactivo.
La figura 11B muestra el producto proteico de
mielina fosforilada marcado por ^{32}P formado como resultado de
una reacción quinasa catalizada por FLAG - MLK - 3 expresada por
baculovirus (mezcla de dominio de longitud completa y quinasa) o
dominio GST - MLK - 3.
La figura 12 es un ensayo de inmunotransferencia
que muestra la fosforilación de GSt - SEK - 1 muestra por quinasa
mediante FLAG - MLK - 3 expresada por baculovirus (mezcla de dominio
de longitud completa y quinasa) como se detecta por un anticuerpo
SEK - 1 fosfo específico.
La figura 13 muestra la fosforilación de proteína
básica de mielina mediante dominio quinasa GST - MLK - 3
bacterianamente expresado que usa (\circ) el ensayo de
precipitación de ácido tricloroacético de multiselección, o el
(\bullet) procedimiento de membrana de fosfocelulosa.
La figura 14 muestra una curva de unión por
saturación de [^{3}H]K252a incubada con lisado de células
de insecto infectadas con baculovirus MLK - 3.
La figura 15A muestra la cantidad de
c-jun marcado con ^{32}P en una reacción de
inmunoprecipitación/quinasa a partir de las células que
sobreexpresan MLK - 3, MLK - 2 p DLK y tratada con bien DMSO al
0,25% (control) o K - 252a 500 nM.
La figura 15B muestra un gráfico que cuantifica
el porcentaje de actividad que permanece en las reacciones de
inmunopercipitado/quinasa a partir de muestras descritas en la
figura 15A. Las columnas representan la media de muestras
duplicadas en las que la barra de error indica el intervalo de la
media.
La figura 15C muestra la cantidad de
c-jun marcado con ^{32}P en una reacción de
inmunoprecipitación/quinasa a partir de las células que
sobreexpresan HA - JNK1 sola o con MEKK1 a diversas cantidades de
ADNc como se indica y se trata bien con DMSO al 0,25% (control) o
500 nM de compuesto III-3 (véase la tabla 3). Las
columnas representan la media de muestras duplicadas donde la barra
de error indica el intervalo de la media.
La figura 16 muestra que el compuesto
III-3-promueve la supervivencia
neuronal de una manera dependiente de la concentración. Las neuronas
disociadas se cultivaron a partir de ganglios simpáticos (SG) (A),
ganglios de la raíz dorsal (DGR) (B), ganglios filiares (CG) (C), y
neuronas motoras (MN) (D), en presencia o ausencia de los factores
tróficos indicados. Las células se contaron 48 horas después de
sembrar como se describe en materiales y procedimientos. Los datos
representan medias \pm DT de las determinaciones por triplicado o
cuadriplicado. Se muestra uno de tres experimentos.
La figura 17 muestra microfotografías de
contraste de fase de cultivos E12 DGR (A, E), E9 simpático (B, F),
E8 ciliar (C, G) y E.5 neuronas motoras (D, H) después de 48 h en
cultivo (24 horas para neuronas filiares) en presencia del factor
neurotrófico respectivo (20 ng/ml de NGF para neuronas simpáticas y
sensoriales 10 ng/ml de CTNF para neuronas filiares, 30 \mug/ml de
extracto muscular (MEX) para motoneuronas ( A - D) o en presencia de
compuesto III -
3 1 \muM (E - H). Bar = 200 \mum.
3 1 \muM (E - H). Bar = 200 \mum.
La figura 18 muestra una microfotografía de
explantes de ganglios de la raíz dorsal in vitro. Los
explantes de DRG de pollitos (E9) se sembraron en medio de placas
de 96 pocillos que contienen BSA al 0,5%. Después de 2 h de período
de unión, se realizaron adiciones: (A) DMSO control; (B) 20 ng/ml de
NGF; (C) compuesto III - 3 250 nM. Cuarenta y ocho horas más tarde,
el medio se retiró y se fijaron los explantes con paraformaldehído
al 4% en solución salina tamponada con fosfato.
La figura 19 muestra el número de neuronas
motoras lumbares de pollito que sobrevive en E10 después de
tratamiento diario (E5-9) con dosis específicas del
compuesto III - 3.Los datos presentados son la media \pm DT de 5
-
6 animales/grupo de tratamiento. El experimento reseñado se repitió dos veces. Los datos son de un experimento representativo y representan un lado de la columna lumbar. * p < 0,01, ** p < 0,001, prueba de t de Student entre compuesto III - 3 y grupos control con corrección de Bonferroni.
6 animales/grupo de tratamiento. El experimento reseñado se repitió dos veces. Los datos son de un experimento representativo y representan un lado de la columna lumbar. * p < 0,01, ** p < 0,001, prueba de t de Student entre compuesto III - 3 y grupos control con corrección de Bonferroni.
La figura 20 muestra el número de neuronas
motoras en el núcleo espinal de ratas hembras del bulbo cavernoso
(SNB) que sobrevive en PN10 o PN60 después de tratamiento diario
(PN1 - 5) compuesto III - 3, o vehículo control (Solutol™ al 5%). En
PN10 (A,B) o ON 60 (B), se sacrificaron las ratas y al región y la
región de la médula espinal que contiene el SNB se diseccionó y se
procesó para histología; las neuronas motoras teñidas con violeta
Cresilech se contaron después en secciones en serie de la región
5-sacra 1 lumbar de la médula espinal como se ha
descrito previamente (Wingfield, y col., Steroids,
1975, 26, 311 - 327). Los datos experimentales son la media
\pm ETM de 4 - 8 animales/grupo de tratamiento.
La figura 21 muestra pérdida de
inmunorreactividad ChAT después de axotomía hipoglosal en la rata
adulta después de tratamiento con el compuesto III - 3. Las
microfotografías del núcleo hipoglosal después de transección del
nervio hipoglosal y tratamiento con (A) solución de vehículo junto
(Solutol (CM) al 5%) y (B) 200 \mug del compuesto III -
3 aplicado al sitio de la transacción. (C) Número de ChAT - neuronas motoras hipoglosales inmunorreactivoas después de los tratamientos descritos en (A) y (B) anteriores. Los resultados se expresan como el porcentaje de ChAT -
neuronas motoras hipoglosales inmunorreactivoas con 100% definido como el número de ChAT - neuronas motoras hipoglosales inmunorreactivoas en el núcleo hipoglosal contralateral, no lesionado.
3 aplicado al sitio de la transacción. (C) Número de ChAT - neuronas motoras hipoglosales inmunorreactivoas después de los tratamientos descritos en (A) y (B) anteriores. Los resultados se expresan como el porcentaje de ChAT -
neuronas motoras hipoglosales inmunorreactivoas con 100% definido como el número de ChAT - neuronas motoras hipoglosales inmunorreactivoas en el núcleo hipoglosal contralateral, no lesionado.
La figura 22 muestra la inhibición de la ruta MLk
- 3 demuestra in vivo eficacia y bloqueo de casos de
fosforilación hacia abajo. La figura 22A muestra el incremento de
neuronas inmunorreactivas de tirosina hidrolasa de la sustancia
negra después de la lesión de MPTP tras la administración sistémica
del compuesto III - 3. La figura 22B es una inmunotransferencia
representativa que muestra el incremento inducido por MPTP en los
niveles de MKK4 fosforilada. la figura 22C muestra una
inmunotransferencia representativa y ELISA que muestra atenuación de
MKK4 fosforilada inducida por MPTP en presencia del compuesto III -
3.
La figura 23 muestra la inducción de IL - 2 en
células Jurkat. La figura 23A muestra el curso del tiempo de la
inducción de IL - 2. La figura 23b muestra la inhibición de la
inducción de IL - 2 por el compuesto III - 3. La figura 23c muestra
la inhibición de la inducción de IL - 2 por el compuesto III - 3 y
compuesto I - 4.
Como se ha empleado anteriormente y a los largo
de la descripción, los siguientes términos, salvo que se indique
otra cosa, se entenderá que tienen los significados siguientes.
"Apoptosis" se refiere a una forma
morfológica específica de al muerte celular caracterizada por la
fragmentación de células y sus núcleos en partículas unidas a
membrana. La apoptosis se puede desencadenar mediante, por ejemplo,
tratamiento con compuestos que inducen apoptosis tal como etopósido,
estaurosporina, factor á de necrosis tumoral, ceramida, y similares,
o por condiciones tales como irradiación por rayos X.
El término "muerte celular" se refiere a la
muerte de células por apoptosis, necrosis, u otros medios
ampliamente conocidos en la técnica. "Muerte celular" se
caracteriza, por ejemplo, como un descenso en el número de células
totales o un descenso en la viabilidad celular comparada con
poblaciones de células controles no tratados. Los compuestos que
"promueven la muerte celular" dan como resultado un descenso en
número de células o un descenso en la viabilidad celular comparado
con las poblaciones control. Por el contrario, los compuestos que
"promueven al supervivencia celular" dan como resultado un
incremento en los números de células o viabilidad celular, o que
ralentiza o reduce la velocidad de muerte celular.
Los términos "reacciona selectivamente" o
"se une específicamente" describe compuestos que física o
químicamente interactúa directamente con una proteína MLK. Por el
contrario, los compuestos que "no reaccionan selectivamente" o
se "unen selectivamente" pueden afectar a las proteínas cadena
abajo o cadena arriba de la proteína MLK, y de este modo afectan a
la actividad d3e proteínas MLK, pero no interactúan física o
químicamente directamente con una proteína MLK.
El término "modula" se refiere a incremento
o descenso de una actividad de una proteína particular de sustrato
de la misma.
La presente invención se refiere, en parte, a
procedimientos para identificar los compuestos que modulan la
actividad de una proteína MLK y promueve bien la supervivencia
celular o muerte celular. Losa compuestos que dan como resultado un
incremento de la actividad de al proteína MLK pueden promover la
muerte celular, mientras que los compuestos que dan como resultado
un descenso de la actividad de la proteína MLk pueden promover la
supervivencia celular.
La proteína MLK puede ser cualquier proteína que
identificada por pertenecer a la clase de MLK de proteínas.
Preferiblemente, la proteína MLK se selecciona entre el grupo
constituido por MLK1, MLK2, MLK3, (SPRK, PTK1), LZK, DLK (ZPOK,
MUK), y MLK6 que se han descrito anteriormente. En las reacciones
preferidas de la invención, los procedimientos identifican
compuestos que interactúan directamente o se unen con la proteína
MLK como se determina en los ensayos de unión, ensayos de quinasa. u
otros ensayos equivalentes.
Con el fin de identificar compuestos que modulan
la actividad de la proteína MLK y promover la supervivencia celular
o muerte celular, o célula o células que contienen la proteína MLK
se pone en contacto con el compuesto de ensayo. El contacto puede
tener lugar en tampones o medios bien conocidos por los experto en
la técnica. Además, se pueden usar números variables de células y
concentraciones de compuestos de ensayo. Se determina si el
compuesto de ensayo incrementa o disminuye la actividad de la
proteína MLK. Además, también se determina si el compuesto de ensayo
promueve la supervivencia celular o muerte celular.
Las células que están en contacto con los
compuestos de ensayo pueden ser cualquier célula de mamífero.
Preferiblemente, la célula es una célula neuronal. Preferiblemente,
la célula está implicada en una enfermedad neurodegenerativa. Para
propósitos de la presente invención, una "enfermedad
neurodegenerativa", un "trastorno neurodegenerativo" son
intercambiables y se usan para describir cualquier enfermedad o
trastorno que implica células neuronales o células implicadas en el
sistema neuronal, incluyendo, pero sin limitación a, enfermedad de
Alzheimer, enfermedad de neuronas motoras, esclerosis lateral
amiotrófica, enfermedad de Parkinson, enfermedad cerebrovascular,
demencia por SIDA, enfermedad de Huntington, y lesiones por
conmoción o penetrantes del cerebro o médula espinal.
La actividad de la proteína MLK se puede
determinar mediante numerosas técnicas. Por ejemplo, la actividad de
MLK se puede determinar midiendo la actividad de un sustrato de la
proteína MLK. Tales sustratos se conocen bien y fácilmente
discernibles por los expertos en la técnica. Preferiblemente, el
sustrato es un miembro de la familia de la proteína quinasa activada
por mitógeno de la familia o de la familia de la proteína quinasa
activada por mitógeno o sustratos adicionales hacia debajo de la
ruta que incluye, pero no se limita a, una proteína seleccionada
entre el grupo constituido por JNK1, JNK2, JNK3, ERK1, ERK2,
p38\alpha, p38\beta, p38\gamma, p38\delta, MEK1, MEK2,
MKK3, MKK4 (SEK1), MEK5, MKK6, MKK7, jun, ATF2, ELK1, y el homólogo
de mamífero de AEX-3, y también sustratos generales
de proteína quinasas de Ser/Thr tal como la proteína básica de
mielina (MBP). Los reactivos y procedimientos para medir la
actividad de los sustratos los conocen bien los expertos en al
técnica. La presencia d MLK también se puede determinar midiendo la
cantidad de la proteína MLK o ARNm que codifica la proteína MLK. Los
expertos en al técnica conocen bien los reactivos, incluyendo
anticuerpos y sondas de oligionucleótidos, así como procedimientos
de medición de la cantidad de ADN o proteína, incluyendo
transferencias de Northern y Western. La actividad de la proteína
MLK también se puede determinar mediante un ensayo de quinasa in
vitro. Los ensayos de quinasa in vitro los conocen bien
los expertos en al técnica. Otras técnicas para medir la actividad
de la proteína los conocen bien los expertos en al técnica y se
pretende que estén abarcadas por la presente invención. De este
modo, los expertos en la técnica pueden determinar si el compuesto
de ensayo modula, es decir, incrementa o disminuye, la actividad de
la actividad de la proteína.
Si el compuesto promueve o no la supervivencia
celular o muerte celular se puede determinar de numerosas maneras.
Preferiblemente, la promoción de la supervivencia celular o muerte
celular se determina usando células con riesgo de teñirse y
comparando la cantidad de células que se pusieron en contacto con el
compuesto de ensayo y permanecen vivas con la cantidad de células
que no se pusieron en contacto con el compuesto de ensayo y
permanecen vivas. Preferiblemente, las células son neuronas motoras
embriónicas primarias que están programadas para morir. Las v se
describen en el documento de Maroney, y col., J. Neurosci.,
1998, 18, 104 - 111, que se incorpora en esta memoria
descriptiva como referencia en su totalidad. Las neuronas motoras
embriónicas primarias morirán salvo que sean rescatadas por el
compuesto de ensayo. De este modo, numerosas neuronas motoras vivas
en la población de neuronas motoras tratadas con el compuesto de
ensayo comparado con el número de neuronas motoras en al población
de neuronas motoras que no se tratan con el compuesto de ensayo es
indicativo de un compuesto de ensayo que promueve la supervivencia
celular. Por el contrario, un número menor de neuronas motoras en al
población de neuronas motoras tratadas con el compuesto de ensayo
comparado con el número de neuronas motoras en al población de
neuronas motoras que no se trataron con el compuesto de ensayo es
indicativo de un compuesto de ensayo que promueve la muerte
celular.
En otra realización de al invención, las células
normales, o células de tipo salvaje se convierten en células en
riesgo de sobreexpresar la proteína MLK, como se describe más
adelante en los ejemplos, y después puestas en contacto con el
compuesto de ensayo. Las células que sobreexpresan proteínas MLK
pueden morir salvo que sean rescatadas por el compuesto de ensayo.
La sobreexpresión de proteínas MLK se puede lograr usando vectores
capaces de expresar la proteína particular en el interior de la
célula. Los vectores de expresión los conocen bien los expertos en
la técnica. Además, los expertos en al técnica conocen bien los
vectores de expresión. Los vectores de expresión que expresan
cualquiera de las proteínas MLK se pueden preparar de una manera
similar a los descritos en los ejemplos. Un gran número de células
vivas en al población de células sobreexpresadas que no se trataron
con el compuesto de ensayo es indicativo de un compuesto de ensayo
que promueve la supervivencia celular. Por el contrario, un número
menor de células vivas en la población de células sobreexpresadas
tratadas con el compuesto de ensayo comparado con el número de
células vivas en al población de células sobreexpresadas que no se
trataron con el compuesto de ensayo es indicativo de un compuesto
de ensayo que promueve muerte celular.
En otra realización de la invención, la promoción
de supervivencia celular se determina observando o midiendo un
descenso de apoptosis. La contracción citoplásmica y condensación
nuclear están asociadas a apoptosis. De este modo, los expertos en
al técnica pueden medir un descenso en apoptosis midiendo u
observando una contracción citoplásmica y/o condensación nuclear.
Además, los expertos en la técnica pueden medir apoptosis empleando
técnicas de tinción convencionales.
En otra realización de la invención, células
normales, de tipo salvaje se pueden usar para identificar compuestos
que promueven muerte celular. Las células neuronales normales
sobrevivirán salvo que estén inducidas a morir por el compuesto de
ensayo. Un menor número de células vivas en la población de células
normales tratadas con el compuesto de ensayo comparado con el número
de células vivas en la población de células normales que no se
trataron con el compuesto de ensayo es indicativo de un compuesto de
ensayo que promueve muerte celular. Por el contrario, un número
mayor o igual de células vivas en la población de células normales
tratadas con el compuesto de ensayo comparado con el número de
células vivas en al población de células vivas que no se trataron
con el compuesto de ensayo no es indicativo de un compuesto de
ensayo que promueve muerte celular.
La presente invención también se dirige, en parte
a procedimientos para modular la actividad de una proteína MLK que
comprende poner en contacto la proteína o una célula que contiene la
proteína con un compuesto que tiene la fórmula G (fórmula I indicada
en esta memoria descriptiva) expuesta en la patente de estados
unidos Nº 5.705.511, que es de cesión común con la solicitud
presente y se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia
en su totalidad.
\newpage
La presente invención también se refiere, en
parte, a procedimientos para modular la actividad de una proteína
MLK que comprende poner en contacto la proteína o una célula que
contiene la proteína con un compuesto que tiene la fórmula III a
continuación:
Z_{1} es H y Z_{2} es H o Z_{1} y Z_{2}
juntos forman =O;
R_{1} se selecciona entre el grupo constituido
por H, Cl, CH_{2}SO_{2}C_{2}H_{5}, Br,
CH_{2}S(CH_{2})_{2}NH_{2},
CH_{2}S(CH_{2})_{2}N(CH_{3})_{2},
CH_{2}S(CH_{2})_{2}NH_{2},
-n-C_{4}H_{9}, NHCONHC_{6}H_{5},
NHCONHC_{2}H_{5}, CH_{2}SC_{2}H_{5},
CH_{2}SC_{6}H_{5}, N(CH_{3})_{2}, CH_{3},
CH_{2}OCONHC_{2}
H_{5}, NHCO_{2}CH_{3}, CH_{2}OC_{2}H_{5}, CH_{2}N(CH_{3})_{2}, OH, O n-propilo, CH=N-N(CH_{3})_{2}, CH_{2}S(CH_{2})_{2}NH-n-C_{4}H_{9}, CH_{2}OCH_{2}O
CH_{2}CH_{3}, CH_{2}S[3-(1,2,4-triazina)], CH_{2}CH_{2}SCH_{3},
H_{5}, NHCO_{2}CH_{3}, CH_{2}OC_{2}H_{5}, CH_{2}N(CH_{3})_{2}, OH, O n-propilo, CH=N-N(CH_{3})_{2}, CH_{2}S(CH_{2})_{2}NH-n-C_{4}H_{9}, CH_{2}OCH_{2}O
CH_{2}CH_{3}, CH_{2}S[3-(1,2,4-triazina)], CH_{2}CH_{2}SCH_{3},
R_{2} se selecciona entre el grupo constituido
por H, Br, Cl, I,
CH_{2}S(CH_{2})_{2}N(CH_{3})_{2},
NHCONHC_{2}H_{5}, CH_{2}SC_{2}H_{5},
CH_{2}OCH_{2}OCH_{2}CH_{3}, CH_{2}S[3-(1,2,4-
triazina)], CH_{2}CH_{2}SCH_{3}; y CH_{2}OH;
X se selecciona entre el grupo constituido por H,
CH_{2}OH, CH_{2}NH-SerinaH, CO_{2}CH_{3},
CONC_{6}H_{5}, CH_{2}NHCO_{2}C_{6}
H_{5}, CH_{2}NHCO_{2}CH_{3}, CH_{2}N_{3}, CONHC_{2}H_{5}, CH_{2}NH-glicina, CON(CH_{3})_{2}, -CH_{2}NHCO_{2}-, CONH_{2}, CONHCH_{3}H_{7}, CH_{2}
NH-serina, CH_{2}SOCH_{3}, CH=NOH, CH_{2}NH-prolina, CH_{2}CH_{2}(2-piridilo), CH=NNHC(=NH)NH_{2}, CONH(CH_{2})_{2}OH, CH=NNHCONH_{2}, CH_{2}OCOCH_{3}, -CH_{2}OC(CH_{3})_{2}O-, CH_{2}SC_{6}H_{5}, CH_{2}SOC_{6}H_{5}, CO_{2}n-hexilo, -CONHCH_{3}, y CO_{2}(CH_{2})_{4}CH_{3}; o uno de las siguientes fórmulas
H_{5}, CH_{2}NHCO_{2}CH_{3}, CH_{2}N_{3}, CONHC_{2}H_{5}, CH_{2}NH-glicina, CON(CH_{3})_{2}, -CH_{2}NHCO_{2}-, CONH_{2}, CONHCH_{3}H_{7}, CH_{2}
NH-serina, CH_{2}SOCH_{3}, CH=NOH, CH_{2}NH-prolina, CH_{2}CH_{2}(2-piridilo), CH=NNHC(=NH)NH_{2}, CONH(CH_{2})_{2}OH, CH=NNHCONH_{2}, CH_{2}OCOCH_{3}, -CH_{2}OC(CH_{3})_{2}O-, CH_{2}SC_{6}H_{5}, CH_{2}SOC_{6}H_{5}, CO_{2}n-hexilo, -CONHCH_{3}, y CO_{2}(CH_{2})_{4}CH_{3}; o uno de las siguientes fórmulas
y
R se selecciona entre el grupo constituida por
OH, y OCH_{3}.
En realizaciones preferidas de la invención,
Z_{1} y Z_{2} son H, X es CO_{2}CH_{3}, R_{1} es
NHCONHC_{2}H_{5}, R_{2} es
CH_{2}CH_{2}(2-piridilo), y R es OH. En
otras realizaciones preferidas de la invención, Z_{1} y Z_{2}
son H, X es CO_{2}CH_{3}; R_{1} y R_{2} son
CH_{2}OCH_{2}OCH_{2}CH_{3}, y R es OH; o Z_{1}, Z_{2},
R_{1}, y R_{2} son H, X es
CO_{2}(CH_{2})_{4}CH_{3}, y R es OH; o
Z_{1}, Z_{2}, y R_{1}, son H, R_{2} es CH_{2}OH, X es
CO_{2}CH_{3}, y R es OH; o Z_{1}, y Z_{2} son H, R_{1} y
R_{2} son H_{2}S[3-(1,2,4-triazina)], X
es CO_{2}CH_{3}, y R es OH; o Z_{1} y Z_{2} son H, R_{1}
es Br, R_{2}, es I, X, es CO_{2}CH_{3}; y R es OH; o Z_{1} y
Z_{2} son H, R_{1} y R_{2} son CH_{2}CH_{2}SCH_{3}; X
es CH_{2}CH_{3}, y R es OH; o Z_{1}, Z_{2}, R_{1}, y
R_{2} son H, X es CO_{2}CH_{3}, y R es CH_{3}; o Z_{1} y
Z_{2} juntos forman =O, R_{1} y R_{2} son Br, X es
CO_{2}CH_{3}, y R es OH.
La presente invención también se dirige, en parte
a procedimientos para modular la actividad de una proteína MLK que
comprende poner en contacto la proteína o una célula que contiene la
proteína con un compuesto que tiene la fórmula II a
continuación:
en al que el anillo B y anillo F,
independientemente, y cada uno juntos forman con los átomos de
carbono a los que están unidos, se seleccionan entre el grupo
constituido
por:
- a)
- un anillo aromático carbocíclico no saturado de 6 miembros en el que 1 a 3 átomos de carbono se pueden reemplazar con átomos de nitrógeno;
- b)
- un anillo aromático carbocíclico no saturado en el que bien
- 1)
- un átomo de carbono se reemplaza con un átomo de oxígeno, nitrógeno, o azufre;
- 2)
- dos átomos de carbono se reemplazan con un átomo de azufre y un átomo de nitrógeno, o dos átomos de nitrógeno; o
- 3)
- tres átomos de carbono se reemplazan con tres átomos de nitrógeno;
R^{1} se seleccionan entre el grupo constituido
por:
- a)
- H, alquilo sustituido o no sustituido que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono, arilo sustituido o no sustituido, arilalquilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, o heteroarilalquilo sustituido o no sustituido;
- b)
- -C(=O)R^{9}, donde R^{9} se selecciona entre el grupo constituido por alquilo, arilo y heteroarilo;
- c)
- -OR^{10}, donde R^{10} se selecciona entre el grupo constituido por H, alquilo que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono;
- d)
- -C(=O)NH_{2}, -NR^{11}R^{12}, -(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}, -(CH_{2})_{p}OR^{10}, -O(CH_{2})_{p}OR^{10} y -O(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}, en los que p está entre 1 y 4; y en los que bien
- 1)
- R^{11} y R^{12} se seleccionan cada uno de ellos independientemente entre el grupo constituido por H y alquilo que tienen entre 1 y 4 átomos de carbono; o
- 2)
- R^{11} y R^{12} juntos forman un grupo de unión de fórmula -(CH_{2})_{2}-X^{1}-(CH_{2})_{2}-, en el que X^{1} se selecciona entre el grupo constituido por -O-, -S-, y -CH_{2}-;
R^{2} se selecciona entre el grupo constituido
H, alquilo que tiene entre y 4 átomos de carbono, -OH, alcoxi que
tiene entre 1 y 4 átomos de carbono, -OC(=O)R^{9},
-OC(=O)R^{11}R^{12},
-OC(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12},
-O(CH_{2})_{p}OR^{10}, arilalquilo sustituido o
no sustituido que tiene entre 6 y 100 átomos de carbono, y
heteroarilalquilo sustituido o no sustituido;
R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} se
seleccionan cada uno de ellos independientemente entre el grupo
constituido por:
a) H, arilo, heteroarilo, F, Cl, Br, I, -CN,
CF_{3}, -NO_{2}, -OH, -OR^{9},
-O(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12},
-OC(=O)R^{9}, -OC(=O)NR^{2}R^{7},
-OC(=O)NR^{11}R^{12},
-O(CH_{2})_{p}OR^{10}, -CH_{2}OR^{10},
-NR^{11}R^{12}, -NR^{10}S(=O)_{2}R^{9},
-NR^{10}C(=O)R^{9};
b) -CH_{2}OR^{14}, en el que R^{14} es el
residuo de un aminoácido después de que se retire el grupo
hidroxilo del grupo carboxilo;
c) -NR^{10}C(=O)NR^{11}R^{12},
-CO_{2}R^{2}, -C(=O)R^{2},
-C(=O)NR^{11}R^{12}, -CH=NOR^{2}, -CH=NR^{9},
-(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12},
-(CH_{2})_{p}
NHR^{14}, o -CH=NNR^{2}R^{2A} en los que R^{2A} es el mismo que R^{2};
NHR^{14}, o -CH=NNR^{2}R^{2A} en los que R^{2A} es el mismo que R^{2};
d)
-S(O)_{y}R^{2}-(CH_{2})_{p}S(O)_{y}R^{9},
-CH_{2}S(O)_{y}R^{14} en el que Y es 0, 1 ó
2;
e) alquilo que tiene entre 1 y 8 átomos de
carbono, alquenilo que tiene entre 2 y 8 átomos de carbono, y
alquinilo que tiene entre 2 y 8 átomos de carbono, en los que
- 1)
- cada grupo alquilo, alquenilo, o alquinilo está no sustituido; o
- 2)
- cada grupo alquilo, alquenilo, o alquinilo está sustituido con 1 a 3 grupos seleccionados entre el grupo constituido por arilo que tiene entre 6 y 10 átomos de carbono, heteroarilo, arilalcoxi, heterocicloalcoxi, hidroxialcoxi, alcoxi-alcoxi, hidroxialquiltio, alcoxi-alquiltio, F, Cl, Br, I, -CN, -NO_{2}, -OH, -OR^{9}, -X^{2} (CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}, -X^{2}(CH_{2})_{p}C(=O)NR^{11}R^{12}, -X^{2}(CH_{2})_{p}OC(=O)NR^{11}R^{12}, -X^{2}(CH_{2})_{p}CO_{2}R^{9}, -X^{2}(CH_{2})_{p}S(O)_{y} R^{9}, -X^{2}(CH_{2})_{p}NR^{10}C(=O)NR^{11}R^{12}, -OC(=O)R^{9}, -OCONHR^{2}, -O-tetrahidropiranilo, -NR^{11}R^{12}, -NR^{10}C(=O)R^{9}, -NR^{10}CO_{2}R^{9}, -NR^{10}C(O)NR^{11}R^{12}, -NHC(=NH)NH_{2}, NR^{10}S(O_{2})R^{9}, -S(O)_{y}R^{9}, -CO_{2}R^{2}, -C(=O)NR^{11}R^{12}, -C(=O)R^{2}, -CH_{2}OR^{10}, -CH=NNR^{2}R^{2A}, -CH=NOR^{2}, -CH=NR^{9}, -CH=NNHCH(N=NH)NH_{2}, -S(=O)_{2}NR^{2} R^{2A}, -P(=O)(OR^{10})_{2}, -OR^{14}, y un monosacárido que tiene entre 5 y 7 átomos de carbono en el que cada grupo hidroxilo del monosacárido está bien independientemente no sustituido o reemplazado con H, alquilo que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono, alquilcarboniloxi que tiene entre 2 y 5 átomos de carbono, o alcoxi que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono;
X^{2} es O, S, o NR^{10};
R^{7} y R^{8} están cada uno de ellos
independientemente seleccionados entre el grupo constituido por H,
alquilo, que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono, alcoxi que tiene
entre 1 y 4 átomos de carbono, arilalquilo sustituido o no
sustituido que tiene entre 6 y 10 átomos de carbono,
heteroarilalquilo sustituido o no sustituido,
-(CH_{2})_{p}OR^{10}, -(CH_{2})_{p}
OC(=O)NR^{11}R^{12}, y -(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}; o R^{7} y R^{8} juntos forman un grupo de unión de fórmula -CH_{2}-X^{3}-CH_{2}-, en el que X^{3} es X^{2} o un enlace;
OC(=O)NR^{11}R^{12}, y -(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}; o R^{7} y R^{8} juntos forman un grupo de unión de fórmula -CH_{2}-X^{3}-CH_{2}-, en el que X^{3} es X^{2} o un enlace;
m y n son cada uno de ellos independientemente 0,
1, ó 2;
Y se selecciona entre el grupo constituido por
-O-, -S-, -N(OR^{10})-,
-N^{+}(O^{-})(R^{10})-, -N(OR^{10})-, y
-CH_{2}-;
Z se selecciona entre el grupo constituido por un
enlace, -O-, -CH=CH-, -S-, -C(=O)-, -CH(OR^{10})-,
-N(R^{10})-,
-N(OR^{10})-, CH(NR^{11}R^{12})-, -C(=O)N(R^{17})-, -N(R^{17})C(=O)-, -N(S(O)_{y}R^{9})-, -N(SO)_{y}NR^{11}R^{12})-, -N(C(=O)R^{17})-, -C(R^{15}
R^{16})-, -N^{+}(O^{-})R^{10})-, -CH(OH)-CH(OH)-, y -CH(O(C=O)R^{9})CH(OC(=O)R^{9A})-, en los que R^{9A} es el mismo que R^{9},
-N(OR^{10})-, CH(NR^{11}R^{12})-, -C(=O)N(R^{17})-, -N(R^{17})C(=O)-, -N(S(O)_{y}R^{9})-, -N(SO)_{y}NR^{11}R^{12})-, -N(C(=O)R^{17})-, -C(R^{15}
R^{16})-, -N^{+}(O^{-})R^{10})-, -CH(OH)-CH(OH)-, y -CH(O(C=O)R^{9})CH(OC(=O)R^{9A})-, en los que R^{9A} es el mismo que R^{9},
R^{15} y R^{16} están independientemente
seleccionados entre el grupo constituido por H, -OH,
-C(=O)R^{10}, -O(C=O)R^{9}, hidroxialquilo,
y -CO_{2}R^{10},
R^{17} se selecciona entre el grupo constituido
por H, alquilo, arilo, y heteroarilo;
A^{1} y A^{2} se seleccionan entre el grupo
constituido por H, H; H, OR^{2}; H, -SR^{2}; H,
-N(R^{2})_{2}; y un grupo en el que A^{1} y
A^{2} juntos forman un resto seleccionado entre el grupo
constituido por =O, =S, y =NR^{2};
B^{1} y B^{2} se seleccionan entre el grupo
constituido por H, H; OR^{2}; H, -SR^{2}; H,
-N(R^{2})_{2}; y un grupo en el que B^{1} y
B^{2} juntos forman un resto seleccionado entre el grupo
constituido por =O, =S, y =NR^{2};
con la condición de que al menos uno de los pares
A^{1} y A^{2}, o B^{1} y B^{2}, forman =O.
La presente invención también proporciona
procedimientos para modular la actividad de una proteína de quinasa
de linaje múltiple que comprende poner en contacto la proteína o
célula que contiene la proteína con un compuesto que tiene la
fórmula IV a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
Z_{1} es H y Z_{2} es H o Z_{1} y Z_{2}
juntos forman =O;
R_{1} es H o Br;
R_{2} es H;
R_{3} es H, CH_{2}CH=CH_{2},
CH_{2}CH_{2}CH_{2}OH, o
y
R_{4} es H, CH_{2}CH=CH_{2} o
CH_{2}CH_{2}CH_{2}OH.
En realizaciones preferidas de la invención
R_{1}, R_{2}, R_{4}, Z_{1}, y Z_{2} son
H y R_{3} es CH_{2}CH=CH_{2}. En otras realizaciones
preferidas de la invención, R_{1} es Br y R_{2}, R_{3},
R_{4}, Z_{1}, y Z_{2} son H; o R_{1}, R_{2}, Z_{1}, y
Z_{2} son H y R_{3} y R_{4} son CH_{2}CH=CH_{2}; o
R_{1}, R_{2}, R_{3}, Z_{1}, y Z_{2} son H y R_{4} es
CH_{2}CH=CH_{2}; o R_{1}, R_{2}, Z_{1}, y Z_{2} son H; y
R_{3} y R_{4} son CH_{2}CHCH_{2}OH; o R_{1}, R_{2},
R_{4}, Z_{1}, y Z_{2} son H y R_{3} es
La presente invención también proporciona
procedimientos para identificar compuestos que pueden ser útiles en
el tratamiento de trastornos neurodegenerativos que comprenden poner
en contacto una célula o extracto que contiene una proteína de
quinasa de linaje múltiple con el compuesto y determinar si el
compuesto disminuye la actividad de la proteína de quinasa de
linaje múltiple. Las células, y extractos de las mismas incluyen,
las descritas anteriormente. Los compuestos que se encuentran
mediante los procedimientos presentes (es decir, los compuestos que
inhiben o reducen la actividad de una proteína de quinasa de linaje
múltiple) puede ser útil para tratar enfermedades
neurodegenerativas. La proteína se selecciona preferiblemente entre
el grupo constituido por la quinasa 1 de múltiple linaje, la
quinasa 2 de múltiple linaje, la quinasa 3 de múltiple linaje, la
quinasa que lleva cremallera de leucina, quinasa que lleva
cremallera de leucina dual, y la quinasa 6 de múltiple linaje. La
célula se pone en contacto in vitro. Preferiblemente, la
actividad de la proteína se determina midiendo la actividad o estado
de fosforilación de un sustrato de dicha proteína.
Preferiblemente, el sustrato se selecciona entre el grupo
constituido por JNK1, JNK2, JNK3, ERK1, ERK2, p38\alpha,
p38\beta, p38\gamma, p38\delta, MEK1, MEK2, MKK3, MKK4
(SEK1), MEK5, MKK6, MKK7, jun, ATF2, ELK1, y el homólogo de mamífero
de AEX-3, y así como los sustratos generales de
Ser/Thr tal como la proteína básica de mielina (MBP). La actividad
de la proteína también se puede determinar midiendo la actividad de
un sustrato de la proteína, cantidad de un sustrato de la proteína,
o ARNm que codifica el sustrato de al proteína. La actividad de la
proteína también se puede determinar mediante un ensayo de quinasa
in vitro o ensayo de unión. Las células preferiblemente son
neuronas motoras embriónicas primarias, células que sobreexpresan
una proteína de quinasa de linaje múltiple, o una célula neuronal,
pero puede ser cualquier célula o extracto de ellas.
Preferiblemente, se identifican los compuestos que se unen
directamente a la proteína de quinasa de linaje múltiple, como se ha
descrito anteriormente.
La presente invención también proporciona
procedimientos para identificar compuestos que pueden ser útiles en
el tratamiento de inflamación que comprende poner en contacto una
célula o extracto que contiene una proteína de quinasa de linaje
múltiple con el compuesto y determinar si el compuesto disminuye la
actividad de la proteína de quinasa de linaje múltiple. Las
células, y extractos de las mismas, incluyen las descritas
anteriormente. Los compuestos que se encuentran en los
procedimientos presentes, (es decir, los compuestos que inhiben o
reducen la actividad de una proteína de quinasa de linaje múltiple)
pueden ser útiles para tratar inflamación. La proteína se
selecciona preferiblemente entre el grupo constituido por la quinasa
1 de múltiple linaje, la quinasa 2 de múltiple linaje, la quinasa 3
de múltiple linaje, la quinasa que lleva cremallera de leucina,
quinasa que lleva cremallera de leucina dual, y la quinasa 6 de
múltiple linaje. La célula se pone en contacto in vitro.
Preferiblemente, la actividad de la proteína se determina midiendo
la actividad o estado de fosforilación de un sustrato de dicha
proteína. Preferiblemente, el sustrato se selecciona entre el grupo
constituido por JNK1, JNK2, JNK3, ERK1, ERK2, p38\alpha,
p38\beta, p38\gamma, p38\delta, MEK1, MEK2, MKK3, MKK4
(SEK1), MEK5, MKK6, MKK7, jun, ATF2, ELK1, y el homólogo de mamífero
de AEX-3, y así como los sustratos generales de
Ser/Thr tal como la proteína básica de mielina (MBP). La actividad
de la proteína también se puede determinar midiendo la actividad de
un sustrato de la proteína, cantidad de un sustrato de la proteína,
o ARNm que codifica el sustrato de al proteína. La actividad de la
proteína también se puede determinar mediante un ensayo de quinasa
in vitro o ensayo de unión.
Las células son preferiblemente neuronas motoras
embriónicas primarias, células que sobreexpresan una proteína de
quinasa de linaje múltiple, o una célula neuronal, pero puede ser
cualquier célula o extracto de ellas. Las células también incluyen,
pero no se limitan a, las implicadas en inflamación tales como, por
ejemplo, linfocitos, macrófagos y otros leucocitos bien conocidos
por los expertos en la técnica. Preferiblemente, se identifican los
compuestos que se unen directamente a la proteína de quinasa de
linaje múltiple.
La presente invención también proporciona
procedimientos para tratar un mamífero que tiene o sospechoso de
tener un trastorno neurodegenerativo que comprende la administración
al mamífero de un compuesto que inhibe o reduce la actividad de la
proteína de quinasa de linaje múltiple. Un compuesto que inhibe o
reduce la actividad de la proteína de quinasa de linaje múltiple
incluye, pero no se limita a, compuestos que tienen la fórmula I,
II, III, y IV. Los compuestos preferidos incluyen los descritos
anteriormente con respecto al procedimiento para seleccionar
compuestos que modulan la actividad de una proteína de quinasa de
linaje múltiple y bien promueven supervivencia celular o muerte
celular. Un mamífero preferido es un ser humano. Un individuo puede
ser sospechoso de tener una enfermedad neurodegenerativa.
La presente invención también proporciona
procedimientos para tratar un mamífero que tiene inflamación que
comprende la administración a dicho mamífero de un compuesto que
inhibe o reduce la actividad de la proteína de quinasa de linaje
múltiple. Un compuesto que inhibe o reduce la actividad de la
proteína de quinasa de linaje múltiple incluye, pero no se limita a,
compuestos que tienen la fórmula I, II, III, y IV. Los compuestos
preferidos incluyen los descritos anteriormente con respecto al
procedimiento para seleccionar compuestos que modulan la actividad
de una proteína de quinasa de linaje múltiple y bien promueven
supervivencia celular o muerte celular. Un mamífero preferido es un
ser humano.
La puesta en contacto con compuestos que tienen
las fórmula I - IV puede tener lugar en tampones o medios, que sin
bien conocidos por los expertos en la técnica. Como alternativa, la
puesta en contacto puede tener lugar mediante la administración de
una composición farmacéutica que contiene el compuesto de ensayo y
una sal, vehículo, o diluyente farmacéuticamente aceptable a un
animal o mamífero, tal como, por ejemplo, un ratón u otro animal
adecuado conocido por los expertos en la técnica. Además, se pueden
usar números variables de células y concentraciones de los
compuestos. Las células que se ponen en contacto con los compuestos
de ensayo puede ser cualquier célula de mamífero. Preferiblemente,
la célula es una neurona. Preferiblemente, la célula está implicada
en una enfermedad neurodegenerativa, tal como, por ejemplo,
enfermedad de Alzheimer, enfermedad de neuronas motoras, esclerosis
lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson, enfermedad
cerebrovascular, afecciones isquémicas, demencia por SIDA,
epilepsia, enfermedad de Huntington, y lesiones por conmoción o
penetrantes al cerebro o médula espinal. Los compuestos que tienen
la fórmula I, y procedimientos para prepararlos, se describen en al
patente de Estados Unidos Nº 5.705.511, que se incorpora en esta
memoria descriptiva como referencia en su totalidad. Los compuestos
que tienen la fórmula III, y procedimientos de prepararlos, se
describen en las patentes de estados nidos números 5.741.808,
5.621.100, 5.621.101, 5.461.146, y 5.756.494, y en el documento WO
97/46567, cada uno de los cuales se incorpora en esta memoria
descriptiva por referencia en su totalidad. Los compuestos que
tienen la fórmula IV, y procedimientos para prepararlos, se
describen en las patentes 5.741.808, 5.621.100, 5.621.101,
5.461.146, y 5.756.494, y en el documento WO 97/46567, cada uno de
los cuales se incorpora en esta memoria descriptiva por referencia
en su totalidad.
Los compuestos que tienen la fórmula II incluyen
diastereoisómeros y enantiómeros alrededor de los átomos de carbono
a los que los sustituyentes R^{2}, R^{7}, y R^{8} están
unidos.
Los indenopirrolocarbazoles unidos por puentes se
representan por la fórmula II:
En algunas realizaciones preferidas de los
compuestos de fórmula II, R^{1} es H. En realizaciones
adicionales preferidas, R^{2} es H, hidroxilo, o alquilo
sustituido o no sustituido.
En otras realizaciones preferidas R^{3},
R^{4}, R^{5}, y R^{6} son independientemente H, alquilo
sustituido o no sustituido, halógeno, alcoxi sustituido o no
sustituido, amino sustituido o no sustituido, o arilo sustituido o
no sustituido. En realizaciones preferidas, R^{7} y R^{8} son
independientemente H, o alquilo sustituido o no sustituido.
En algunas realizaciones preferidos, Y es O. En
realizaciones preferidas Z es un enlace, O, S, o N sustituido o no
sustituido. Todavía en otras realizaciones preferidas, m y n son
independientemente 1 ó 2. En algunas realizaciones especialmente
preferidas, Y es O, Z es un enlace u O, y m y n son
independientemente 1 ó 2.
En realizaciones preferidas adicionalmente,
A^{1}A^{2} y B^{1}B^{2} son =O o H,H.
En algunas realizaciones especialmente
preferidas, R^{1}, R^{4}, R^{6}, y R^{7} son cada uno H, Y
es =O, n es 1, A^{1}A^{2} y B^{1}B^{2} son =O o H,H,
R^{2} es H, OH es alquilo inferior, R^{3} es H o alquilo
sustituido, R^{5}, y R^{8} son cada uno H o alcoxi, siendo
preferido metoxi, Z es un enlace u O, y m es 1 ó 2.
Algunas realizaciones especialmente preferidas de
los compuestos de fórmula II son los compuestos II - 1, II - 2, II
-
3, II - 4a, II - b, II - 5, II - 6, II - 7a, II - 7b, II - 8, II - 9, II - 10, II - 11, y II - 12 expuestos en al tabla I, más adelante.
3, II - 4a, II - b, II - 5, II - 6, II - 7a, II - 7b, II - 8, II - 9, II - 10, II - 11, y II - 12 expuestos en al tabla I, más adelante.
Los compuestos representados por la fórmula II se
denominan de aquí en adelante compuesto (II).
Como se usa en esta memoria descriptiva, el
término"carbocíclico" se refiere a grupos carbocíclicos en los
que la porción anillo se compone solamente de átomos de carbono. Los
términos "heterociclo" y "heterocíclico" se refieren a
grupos cíclicos en los que al porción anillo incluye al menos
un heteroátomo tal como O, N, o S.
Como se usa en esta memoria descriptiva, el
término "alquilo" significa un grupo alquilo de cadena lineal,
cíclico, o ramificado que tiene entre 1 y 8 átomos de carbono,
tales como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo,
sec-butilo, terc-butilo, pentilo,
isoamilo, neopentilo, 1-etilpropilo, hexilo,
octilo, ciclopropilo, y ciclopropilo. El resto alquilo de grupos
que contienen alquilo, tales como grupos alcoxi, alcoxicarbonilo,, y
alquilaminocarbonilo, tiene el mismo significado que alquilo
definido anteriormente. Grupos alquilo inferior, que se prefieren,
son grupos son grupos alquilo como se han definido anteriormente
que contienen entre 1 y 4 átomos de carbono. El término
"alquenilo" pretende incluir cadenas hidrocarbonadas de
cadena lineal o ramificada que tienen al menos un doble enlace
carbono - carbono. Los ejemplos de grupos alquenilo incluyen cadenas
hidocarbonadas de cadena lineal o ramificada que tienen al menos un
doble enlace carbono carbono. Los ejemplos de grupos alquinilo
incluyen grupos etinilo y
propinilo.
propinilo.
El resto acilo de grupos que contienen acilo
tales como grupos aciloxi pretende incluir un grupo alcanoílo de
cadena lineal o ramificado que tiene entre 1 y 6 átomos de carbono,
tales como formilo, acetilo, propanoílo, butirilo, valerilo,
pivaloílo o hexanoílo.
Como se usa en esta memoria descriptiva el
término "arilo" significa un grupo que tiene entre 6 y 12
átomos de carbono tal como fenilo, bifenilo y naftilo. Los grupos
arilo preferidos incluyen grupos fenilo y naftilo no sustituidos o
sustituidos. El término "heteroarilo" como se usa en esat
memoria descriptiva significa un grupo arilo en el que uno o más
átomos de carbono en el anillo se reemplaza por átomo hetero (es
decir, no carbono) tal como O, N o S. Los grupos heteroarilo
preferidos incluyen grupos piridilo, pirimidinilo, pirrolilo,
furilo, tienilo, imidazolilo, triazolilo, tetrazolilo, quinolilo,
isoquinolilo, benzoimidazolilo, tiazolilo, pirazolilo, y
benzotiazolilo.
El término "aralquilo" (o "arlalquilo")
propone significar un grupo que tiene entre 7 y 10 átomos de
carbono, cocnstituido por un grupo alquilo que lleva un grupo
arilo. Los ejemplos de grupos aralquilo incluyen grupos bencilo,
fenetilo, bencidrilo y naftilmetilo.
Los grupos y restos alquilo contenidos en os
grupos sustituidos tales como grupos aralquilo, alcoxi, arilalcoxi,
hidroxialcoxi, alcoxi - alcoxi, hidroxi - alquiltio, alcoxi -
alquiltio, alquilcarboniloxi, hidroxialquilo, y aciloxi pueden ser
sustituidos o no sustituidos. Un grupo alquilo sustituido tiene
entre 1 y 3 sustituyentes seleccionados independientemente,
preferiblemente hidroxi, alcoxi inferior, alcoxi inferior - alcoxi,
arilalcoxi inferior sustituido o no sustituido alcoxi,
heteroarilalcoxi inferior sustituido o no sustituido alcoxi,
arilalcoxi sustituido o no sustituido, heterocicloalcoxi sustituido
o no sustituido, halógeno, carboxilo, alcooxicarbonilo inferior,
nitro, amino, mono - o di alquilamino inferior, dioxolano, dioxano,
ditiolano, furano, lactona, o lactama.
Grupos arilo sustituido, heteroarilo sustituido y
aralquilo sustituido cada uno tiene entre 1 y 3 sustituyentes
seleccionados independientemente que son preferiblemente alquilo
inferior, hidroxi, alcoxi inferior, carboxi, alcoxicarbonilo
inferior, nitro, amino, mono- o di-alquilamino
inferior, y halógeno.
Los grupos heterocíclicos formados con un átomo
de nitrógeno incluyen grupos pirrolidinilo, piperidinilo,
piperidino, morfolinilo, morfolino, tiomorfolino,
N-metilpiperazinilo, indolilo, isoindolilo,
imidazol, imidazolina, oxazolina, oxazol, triazol, tiazolina,
tiazol, pirazol, pirazolona, y triazol. Los grupos heterocíclicos
formados con un átomo de oxígeno incluye grupos furano,
tetrahidrofurano, pirano, y tetrahidrofurano.
Los grupos "hidroxialquilo" son grupos
alquilo que tienen un grupo hidroxilo añadidos a ellos. Los
halógenos incluyen flúor, cloro, bromo y yodo.
Como se usa en esta memoria descriptiva, el
término "heteroarilalquilo" significa un grupo arilalquilo que
contiene un heteroátomo. El término "oxi" significa la
presencia de un átomo de oxígeno. De este modo, grupos "alcoxi"
son grupos alquilo que se unen a través de un átomo de oxígeno y
grupos "carboniloxi" son grupos carbonilo que están unidos a
través de un átomo de oxígeno.
El término "heterocicloalcoxi" significa un
grupo alcoxi que tiene un grupo heterocilo unido al resto alquilo
del mismo, y el término "arilalcoxi" significa un grupo alcoxi
que tiene un grupo arilo unido al resto alquilo del mismo. El
término "alquilcarboniloxi" significa un grupo de fórmula
-O-C=O)-alquilo.
Como se usa en esta memoria descriptiva, el
término "alquiloxi-alcoxi" significa un grupo
alcoxi que contiene un sustituyente alquiloxi unido a su resto
alquilo. El término "alcoxi-alquiltio"
significa un grupo alquiltio (es decir, un grupo de fórmula
-S-alquilo) que contiene un sustituyente alcoxi
unido a su resto alquilo. El término
"hidroxi-alquiltio" significa un grupo
alquiltio (es decir, un grupo de fórmula
-S-alquilo) que contiene un sustituyente hidroxi
unido a su resto alquilo.
Como se usa en esta memoria descriptiva, el
término "monosacárido" tiene sus significados de costumbre como
un azúcar simple.
Como se usa en esta memoria descriptiva, el
término "aminoácido" significa una molécula que contiene tanto
un grupo amino como un grupo carboxilo. Las realizaciones de
aminoácidos incluyen \alpha-aminoácidos; es decir,
ácidos carboxílicos de fórmula general
HOOC-CH(NH_{2})-(cadena lateral).
Las cadenas laterales de aminoácidos incluyen
restos de origen natural y no natural. Las cadenas de aminoácidos de
origen no natural (es decir no naturales9 son restos que se usan en
lugar de cadenas de aminoácidos de origen natural en, por ejemplo,
análogos de aminoácidos. Véase, por ejemplo, Lehninger,
Biochemistry, edición segunda, Worth Publishers, Inc, páginas
73 - 75, incorporada en esta memoria descriptiva.
Los \alpha-aminoácidos
preferidos incluyen glicina, alanina, prolina, ácido glutámico, y
lisina, que tiene la configuración D, la configuración L, o como un
racemato.
Las cadenas laterales de
\alpha-aminoácidos representativos adicionales se
muestran más adelante en al tabla 1.
En algunas realizaciones preferidas, los grupos
sustituyentes para los compuestos de fórmula II incluyen el residuo
de un aminoácido después de retirar el resto hidroxilo del grupo
carboxilo del mismo, es decir, grupos de fórmula
-C(=O)-CH(NH_{2})-(cadena lateral).
Los grupos funcionales presentes en los
compuestos de fórmula II pueden contener grupos protectores. Por
ejemplo, los sustituyentes de la cadena lateral de aminoácidos de
los compuestos de fórmula II se pueden sustituir con grupos
protectores tales como grupos benciloxicarbonilo o
t-butoxicarbonilo. Los grupos protectores se conocen per
se como grupos funcionales químicos que se pueden añadir
selectivamente a y retiras de las funcionalidades, tales como
grupos hidroxilo y grupos carboxilo. Estos grupos se presentan en un
compuesto químico para hacer tal funcionalidad inerte condiciones
de reacción química a la que se exponen el compuesto. Se puede
emplear cualquier diversidad de grupos protectores con al presente
invención. Uno de tales grupos protectores es el grupo
benciloxicarbonilo (Cbz; Z). Otros grupos protectores preferidos
según la invención se pueden encontrar en Greene, T. W. y Wuts, P.
G. M., "Protective Groups in Organic Synthesis" 2º
edición. Ed., Wiley y Sons, 1991.
Los compuestos de indenopirrolocarbazol unidos
por puentes han evidenciado actividades farmacológicas funcionales
importantes que encuentran utilidad en una diversidad de
situaciones, incluyendo tanto arenas de investigación como
terapéuticas. Estos derivados son útiles como agentes terapéuticos.
Las actividades de los compuestos muestran efectos positivos en la
función y/o supervivencia de células sensibles al factor trófico. El
efecto sobre la función y/o supervivencia de las células sensibles
al factor trófico, por ejemplo, células de un linaje neuronal, se
ha demostrado usando cualquiera de los siguientes ensayos: (1)
ensayo de colina acetiltransferasa de médula espinal cultivada
("ChAT"); o (2) ensayo de actividad de ChAT de neuronas del
cerebro anterior basal cultivadas.
Como se usa en esta memoria descriptiva, el
término "efecto" cuando se usa para modificar los términos
"función" y "supervivencia" significa una alteración o
cambio positivo o negativo. Un efecto que es positivo puede
denominarse aquí "potenciación" o "potenciando" y un
efecto que es negativo se puede denominar en esta memoria
descriptiva "inhibición" o "inhibiendo".
Como se usa en esta memoria descriptiva, los
términos "potenciar" o "potenciando" cuando se usan para
modificar los términos "función" o "supervivencia"
significa que la presencia de un compuesto de indenopirrolocarbazol
unido por puentes tiene un efecto positivo sobre la función y/o
supervivencia de una célula sensible al factor trófico comparado con
una célula en ausencia del compuesto. Por ejemplo, y no a modo de
limitación, con respecto a la supervivencia de, por ejemplo, una
neurona colinérgica, el compuesto evidenciaría la potenciación de
supervivencia de una población neuronal colinérgica con riesgo de
morir (debido a, por ejemplo, lesión, una afección patológica, una
afección degenerativa o progresión natural) cuando se compara con
una población neuronal colinérgica no presentada con tal com-
puesto, s la población tratada tiene un período comparativamente mayor de funcionalidad que la población no tratada.
puesto, s la población tratada tiene un período comparativamente mayor de funcionalidad que la población no tratada.
Como se usa en esta memoria descriptiva,
"inhibir" o "inhibiendo" significan que una respuesta
específica de un material deseado (por ejemplo, actividad
enzimática) está comparativamente disminuida en presencia de un
compuesto indenopirrolocarbazol unido por puentes.
Como se usa en esta memoria descriptiva, el
término "trk" se refiere a la familia de receptores de
neurotrofina de alta afinidad actualmente comprendiendo taka,
trkB, y trkC, y otras proteínas asociadas a membrana q
las que se puede unir una neurotrofina.
Como se usa en esta memoria descriptiva,
inhibición de VEGFR implica utilidad en, por ejemplo, enfermedades
en las que la angiogénesis juega papeles importantes, tales como
cáncer de tumores sólidos, endometriosis, retinopatía diabética,
psoriasis, hemangioblastoma, así como otras enfermedades oculares y
cánceres.
La inhibición de trk implica utilidad en, por
ejemplo, enfermedades de al próstata tales como cáncer de próstata e
hiperplasia de próstata benigna, y tratamiento de dolor
inflamatorio.
La inhibición del factor del receptor del factor
de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR) implica utilidad en,
por ejemplo, diversas formas de neoplasia, artritis reumatodide,
fibrosis pulmonar, mielofibrosis, curación de heridas anormales,
enfermedades con puntos finales cardiovasculares, tales como
aterosclerosis, reestenosis, reestenosis
post-angioplastia, etc.
Como se usa en esta memoria descriptiva, los
términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a cualquier
proliferación maligna de células en un animal. Los ejemplos
incluyen próstata, hiperplasia de próstata benigna, ovarios, mama,
pulmón, pancreático, colorrectal, gástrico, estómago, tumores
sólidos, cabeza y cuello, neuroblastoma, carcinoma de células
renales, leucemia, otras malignidades reconocidas de los sistemas
hematopoyéticos, y otros cánceres reconocidos.
Como se usa en esta memoria descriptiva los
términos "neurona," "célula de linaje neuronal" y
"célula neuronal" incluyen, pero no se limitan a, una población
heterogénea de tipos neuronales que tienen transmisores singulares o
múltiples y/o funciones singulares o múltiples; preferiblemente,
éstos son colinérgicos u neuronas sensoriales. Como se usa en esta
memoria descriptiva, la frase "neurona colinérgica" significa
neuronas del Sistema Nervioso Central (SNC) y sistema nervioso
periférico (SNP) cuyo transmisor es acetilcolina; los ejemplos son
neuronas del cerebro anterior basal, estriadas y de la médula
espinal. Como se usa en esta memoria descriptiva, la frase
"neurona sensorial" incluye neuronas sensibles a señales
ambientales (por ejemplo, temperatura, movimiento) de, por ejemplo,
piel, músculo y articulaciones; un ejemplo es una neurona de los
ganglios de la raíz dorsal.
Una "célula sensible al factor trófico",
como se define en esta memoria descriptiva, es una célula que
incluye un receptor al que se puede unir específicamente un factor
trófico; los ejemplos incluyen neuronas (por ejemplo, neuronas
colinérgicas y sensoriales) y células no neuronales (por ejemplo,
monocitos y células neoplásicas).
Los compuestos de indenopirrolocarbazol descritos
en esta memoria descriptiva encuentran utilidad tanto en situaciones
de investigación como terapéuticas, por ejemplo, inhibición de
actividad enzimática. Por ejemplo, en un entorno de investigación,
los compuestos se pueden usar en el desarrollo de ensayos y modelos
para una potenciación adicional del entendimiento de los papeles que
inhiben serina/proteína o tirosina proteína quinasa (por ejemplo,
PKC, trk tirosina quinasa) juegan en los aspectos
mecanísticos de los trastornos y enfermedades asociados. En una
situación terapéutica, los compuestos que inhiben estas
actividades enzimáticas se pueden usar para inhibir las
consecuencias perjudiciales de están enzimas con respecto a
trastornos tales como cáncer.
Como los ejemplos más adelante demuestran, se
puede determinar la inhibición de actividad enzimática usando los
compuestos de indenopirrolocarbazol unidos por puentes usando, por
ejemplo, los siguientes ensayos:
- 1.
- ensayo de inhibición de actividad de trk tirosina quinasa;
- 2.
- inhibición de fosforilación de trk estimulada por NGF en una preparación de células enteras;
- 3.
- ensayo de inhibición de quinasa de receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR);
- 4.
- ensayo de inhibición de actividad de PKC;
- 5.
- ensayo de inhibición de PDGFR.
Los compuestos de indenopirrolocarbazol unidos
por puentes descritos se pueden usar para potenciar la función y/o
supervivencia de células de linaje neuronal en un mamífero, por
ejemplo, un ser humano, En estos contextos, los compuestos se pueden
utilizar individualmente o con otros pirrolocarbazoles y/o
indolocarbazoles condensados, o en combinación con otras moléculas
beneficiosas que también evidencian la capacidad de afectar la
función y/o supervivencia de una célula diseñada.
Se caracterizan una diversidad de trastornos
neurológicos mediante células neuronales que mueren, lesionadas,
comprometidas funcionalmente, que padecen degeneración axonal, en
riesgo de morir, etc. Estos trastornos incluyen, pero no se limitan
a. enfermedad de Alzheimer; trastornos de neuronas motoras (por
ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica); enfermedad de parkinson;
trastornos cerebrovasculares (por ejemplo, accidente
cerebrovascular, isquemia); enfermedad de Huntington; demencia por
SIDA; epilepsia; esclerosis múltiple; neuropatía periféricas (por
ejemplo, las que afectan a neuronas DGR en neuropatía periférica
asociada a quimioterapia) incluyendo neuropatía diabética;
trastornos inducidos por aminoácidos excitativos; y trastornos
asociados con lesiones por conmoción o penetrantes del cerebro o
médula espinal.
ChAT cataliza la síntesis de la acetilcolina
neurotransmisora, y se considera un marcador enzimático para una
neurona colinérgica funcional. Una neurona funcional también es
capaz de sobrevivir. La supervivencia de neuronas se ensaya mediante
cuantificación de la captación y conversión enzimática específica de
un tinte (por ejemplo, calceína AM) por neuronas vivas.
Debido a sus utilidades variadas, los compuestos
descritos en esta memoria descriptiva que incluyen los compuestos
identificados mediante los procedimientos descritos en esta memoria
descriptiva , encuentran utilidad en una diversidad de situaciones.
Los compuestos se pueden usar en el desarrollo de de modelos in
vitro de supervivencia de células neuronales, función,
identificación, o para la selección de otros compuestos sintéticos
que tienen actividades similares a las de los compuestos descritos
en esta memoria descriptiva, o compuestos identificados por los
procedimientos descritos en esta memoria descriptiva. Los
compuestos descritos en esta memoria descriptiva, así como los
identificados usando los procedimientos descritos en esta memoria
descriptiva, se pueden utilizar en un entorno de investigación para
investigar, definir y determinar dianas moleculares asociadas a
respuestas funcionales. Por ejemplo, marcando radiactivamente un
compuesto de indenopirrolocarbazol unidos por puentes, o un
compuesto identificado por los procedimientos descritos en esta
memoria descriptiva, asociados a uan función específica celular (por
ejemplo, mitogénesis), la entidad diana a la que se une el derivado
se puede identificar, aislar, y purificar para caracterización.
Los compuestos, descritos en esta memoria
descriptiva así como los identificados usando los procedimientos
descritos en esta memoria descriptiva, son útiles, entre otros, no
solamente para potenciar las actividades inducidas por factor
trófico o células sensibles al factor trófico, por ejemplo, neuronas
colinérgicas, pero también pueden funcionar como agentes promotores
de supervivencia de neuronas mediante cascadas de señalización hacia
abajo de las proteínas de unión a GTP pequeñas, pero sin limitación
a, ras, rac y cdc 42 (Denhardt, Biochem., 1996, 318,
729). Específicamente, activación de ras conduce a fosforilación
activación de quinasa activada por receptor extracelular (ERK), que
se ha unido a crecimiento biológico y procedimientos de
diferenciación. La estimulación de rac/cdc42 conduce a un incremento
en al activación de JNK y p38, respuestas que están asociadas a
estrés, apoptosis, e inflamación. Aunque las respuestas del factor
de crecimiento son principalmente mediante la ruta ERK, que afectan
a estos últimos procesos pueden conducir a mecanismos alternativos
de supervivencia neuronal que pueden imitar la potenciación del
factor de crecimiento que potencia las propiedades de supervivencia
(Xia y col., Science, 1995, 270, 1326). Los compuestos también
pueden funcionar como agentes de promoción de supervivencia para
células neuronales y no neuronales mediante mecanismos relacionados
a, pero también distintos de supervivencia mediada por el factor de
crecimiento, por ejemplo, inhibición de las rutas de JNK y p38 que
pueden conducir a supervivencia mediante la inhibición de procesos
de muerte celular apoptópica.
Los presentes compuestos son útiles en el
tratamiento de trastornos asociados a un descenso de actividad de
ChAT o la muerte, lesión de las neuronas motoras de al médula
espinal, y también tienen utilidad en, por ejemplo, enfermedades
asociadas a muerte celular apoptópica del sistema nervioso
periférico y central, sistema inmune y enfermedades
inflamatorias.
Los compuestos descritos en esta memoria
descriptiva pueden encontrar utilidad en el tratamiento de estados
patológicos que implican proliferación celular maligna, tal como
muchos cánceres.
Las sales farmacéuticamente aceptables de los
compuestos descritos en esta memoria descriptiva, así como los
compuestos identificados por los procedimientos presentes, incluyen
las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables, sales
metálicas, sales amónicas, sales de adición de aminas orgánicas, y
sales de adición de aminoácidos. Los ejemplos de sales de adición de
ácido son sales de adición de ácidos inorgánicos tales como
clorhidrato, sulfato y fosfato, y sales de adición de ácidos
orgánicos tales como acetato, meleato, fumarato, tartrato, citrato
y lactato; los ejemplos se sales metálicas de las sales metálicas
son sales de metales alcalinas tales como sal de litio, sal de
sodio y sal de potasio, sales de metales alcalinos tales como sal
de magnesio y sal de calcio, sal de aluminio, y sal de cinc; los
ejemplos de las sales de amonio son sales de amonio y sal de
tetrametilamonio; los ejemplos de las sales de adición de aminas
orgánicas son sales con morfolina y piperidina; y los ejemplos de
las sales de adición de aminoácidos son sales con glicina,
fenilalanina, ácido glutámico y lisina.
Los compuestos proporcionados en esta memoria
descriptiva, incluyen los identificados por los procedimientos
presentes, se pueden formular en composiciones farmacéuticas
mediante mezcla con excipientes y vehículos no tóxicos
farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones se pueden preparar
para uso en administración parenteral, particularmente en la forma
de soluciones o suspensiones líquidas; o administración oral en
forma de comprimidos o cápsulas, o por vía intranasal,
particularmente en forma de polvos, gotas nasales, o aerosoles; o
por vía dérmica, mediante, por ejemplo, parches transdérmicos.
La composición se puede administrar
convenientemente en forma de dosificación unitaria y se puede
preparar mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos en
la técnica farmacéutica, por ejemplo, como se describe en
Remington's Pharmacéutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton,
PZ, 1980). Las formulaciones para administración parenteral pueden
contener como excipientes comunes agua estéril o solución salina,
polialquilenglicoles tales como polietilenglicol, aceites y
naftalenos hidrogenados, vegetales de origen vegetal y similares.
En particular, polímero de lactida biocompatible, biodegradable,
copolímero de lactida/glicolida, o copolímeros de polioxietileno
polioxipropileno pueden que excipientes útiles para controlar la
liberación de los compuestos activos. Otros sistemas de
distribución parenteral potencialmente útiles APRA estos
compuestos activos incluyen partículas de copolímero de etileno -
acetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión
implantables, y liposomas. La formulaciones para administración por
inhalación contienen como excipientes, por ejemplo, lactosa, o
pueden ser soluciones acuosas que contienen, por ejemplo,
polioxietileno-9-lauril éter,
glicocolato y desoxicolato, o soluciones oleosas para administración
en forma de gotas nasales, o como un gel a aplicar por vía
intranasal. Las formulaciones para administración parenteral
también pueden incluir glicocolato para administración bucal, un
salicilato para administración rectal, o ácido cítrico para
administración vaginal. Las formulaciones para parches transdérmicos
son preferiblemente emulsiones lipófilas.
Los compuestos de esta invención se pueden
emplear como el agente activo solo en una composición farmacéutica.
Como alternativa, se pueden usar en combinación con otros
ingredientes activos, por ejemplo, otros factores de crecimiento que
facilitan la supervivencia neuronal o regeneración axonal en
enfermedades o trastornos.
Los compuestos de la invención y las sales
farmacéuticamente aceptables de los mismos se pueden administrar por
vía oral o no oral, por ejemplo, como una pomada o una inyección.
Las concentraciones de los compuestos de esta invención en una
composición terapéutica pueden variar. La concentración dependerá de
factores tales como la dosificación total del fármaco a
administrar, las características químicas (por ejemplo,
hidrofobicidad) del compuesto empleado, la vía de administración,
la edad, peso corporal y síntomas de un paciente, etc. Los
compuestos de esta invención típicamente se proporcionan en una
solución acuosa de tampón fisiológico que contiene aproximadamente
0,1 a 10% p/v del compuesto para administración parenteral. Los
intervalos de dosis típicos están entre aproximadamente 1 \mug/kg
a aproximadamente 1 g/kg de peso corporal al día; un intervalo de
dosis preferido está entre aproximadamente 0,01 mg/kg y 100 mg/kg
de peso corporal al día, y preferiblemente entre aproximadamente
0,1 y 20 mg/kg una vez a cuatro veces al día. Una dosificación
preferida de fármaco a administrar probablemente depende de
variables tales como el tipo y grado de progresión de la enfermedad
o trastorno, el estado de salud global y el paciente particular, la
eficacia biológica relativa del compuesto seleccionado, y
formulación del excipiente del compuesto, y su vía de
administración.
Los compuestos de la invención que incluyen el
compuesto de ensayo y compuestos identificados mediante los
procedimientos se la presente invención, y las sales
farmacéuticamente aceptables de los mismos se pueden administrar
solos, o en forma de diversas composiciones farmacéuticas, según la
actividad farmacológica y el propósito de administración. Las
composiciones farmacéuticas de acuerdo a la presente invención se
pueden preparar mezclando uniformemente una cantidad eficaz de un
compuesto do una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como
ingrediente activo, con un vehículo farmacéuticamente aceptable. El
vehículo puede tomar un amplio intervalo de formas según las formas
de composición adecuadas para administración. Se desea que tales
composiciones farmacéuticas se preparen en forma de dosificación
unitaria adecuadas para administración oral y no oral. Las formas
para administración no oral incluyen pomada e inyección.
Los comprimidos se pueden preparar usando
excipientes tales como lactosa, glucosa, sacarosa, manitol y
metilcelulosa, agentes disgregantes tales como almidón, alginato de
sodio, carboximetilcelulosa de calcio y celulosa cristalina,
lubricantes tales como estearato de magnesio y talco, aglutinantes
tales como gelatina, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona,
hidroxipropilcelulosa y metilcelulosa, tensioactivos tales éster de
ácido graso de sacarosa y éster de ácido graso de sorbitol, y
similares de una manera convencional. Se prefiere que cada
comprimido contenga 15 - 300 mg de ingrediente activo.
Se pueden preparar gránulos que usan excipientes
tales como lactosa y sacarosa, agentes disgregantes tales como
almidón, aglutinantes tales como gelatina, y similares de una manera
convencional. Se pueden preparar polvos usando excipientes tales
como lactosa y manitol, y similares de una manera convencional. Se
pueden preparar cápsulas usando gelatina, agua, sacarosa, goma
arábiga, sorbitol, glicerina, celulosa cristalina, estearato de
magnesio, talco, y similares de una manera convencional. Se
prefiere que cada cápsula contenga 15 - 300 mg del ingrediente
activo.
Se pueden preparar preparaciones de jarabe usando
azúcares tales como sacarosa, agua, etanol, y similares de una
manera convencional.
Se puede preparar una pomada usando bases de
pomadas tales como vaselina, parafina líquida, lanolina y macrogol,
emulsionantes tales como lauril sulfato sódico , cloruro de
benzalconio, éster de ácidos grasos de mono sorbitán,
carboximetilcelulosa de sodio y goma arábiga, y similares de una
manera convencional.
La preparaciones inyectables se pueden preparar
usando disolventes tales como agua, solución salina fisiológica,
aceites vegetales (por ejemplo, aceite de oliva y aceite de
cacahuete), oleato de etilo y propilenglicol, agentes solubilizante
tales como benzoato sódico, salicilato de sodio, y uretano, agentes
isotónicos tales como cloruro sódico y glucosa, conservantes tales
como fenol, cresol, éster de ácido
p-hidroxibenzoico y clorobutanol, antioxidantes
tales como ácido ascórbico y pirosulfito de sodio y similares de una
manera convencional.
La invención además se ilustra adicionalmente por
medio de los siguientes ejemplos que pretenden ilustrar la
invención. Estos ejemplos no pretenden, no se construyen como
limitantes del alcance de la descripción.
La vía de síntesis general empleada para preparar
los indenopirrolocarbazoles unidos por puentes de esta invención que
tienen la fórmula II se muestra en la figuras 1 y 2. Los
procedimientos generales para la síntesis de los
indenopirrolocarbazoles (II) (VIII) se pueden realizar como se
describe en la patente de Estados Unidos Nº 5.705.511, cuya
descripcón se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia
en su totalidad. Cuando R^{1} es H, el nitrógeno de lactama de los
indenopirrolocarbazoles (II)/(VIII) se protege con un grupo
protector que conduce a (IV)/(IX). Los compuestos protegidos se
tratan con una base apropiada en un(os) disolvente(s)
orgánico(s) anhidro(s), que da como resultado la
generación de una solución de color rojo oscuro que se cree que es
el carabanion. La reacción de carbanion con un reactivo
bi-funcional (V) da como resultado una adición
electrófila al enlace (=Y de (V) que conduce al intermedio inicial
(VI)/(X). El tratamiento del (de los) intermedio(s) (VI)/(X)
y/o (VII)/(XI) con un ácido sulfónico o ácido de lewis, por ejemplo
eterato trifluoruro de boro, proporciona los
indenopirrolocarbazoles (I)/(II).
La estrategia de protección del nitrógeno de
lactama (mostrado en las figuras 3 y 4) se puede llevar a cabo bien
mediante un procedimiento catalizado por ácido o por base. La
reacción catalizada por ácido se puede llevar a cabo con un
reactivo de unión a resina que permite la inmovilización del
indenopirrolocarbazol (III)/(VIII) a un soporte polimérico, tal como
una resina de ácido Rink, basado en poliestireno (XII) (figura 3),
proporcionando (XIII). Como alternativa, la reacción catalizada por
ácido se puede llevar acabo con un reactivo soluble para
proporcionar un compuesto (XIV) (figura 4). El compuesto sililo -
protegido (XV) se produce en condiciones básicas (figura 4).
La figura 5 describe varios procedimientos para
preparar en intermedio (V). El procedimiento (a) describe las
transformaciones de diversos acetales (XVI) a (XVII, Z = enlace).
Por ejemplo, éster - acetal/cetal (XVI, D = COOR) se reduce
completamente en el correspondiente alcohol y posteriormente se
oxida (por ejemplo, oxidación de Swern o de Dess - Martin) en el
aldehído - acetal/cetal (XVII, R^{8} = H). Como alternativa, éster
- cetal/cetal se reduce parcialmente con DIBAL para producir
aldehído (XVII, R^{8} = H) directamente. De manera similar, la
reducción de nitrilo - acetal (XVI, D = CN) con DIBAL proporciona
aldehído (XVII, R^{8} = H). Ceto - acetales/cetal se preparan
mediante la adición de reactivos de Grignard a amida - acetal/cetal
(XVI, D = CON(OMe)Me).
El intermedio (XVII, Z = enlace) también se puede
obtener mediante un procedimiento en dos etapas esquematizado en el
procedimiento (b). La adición de un reactivo organometálico (XIX) a
acetal/cetal (XVIII) proporciona el alqueno (XX) que tras
ozonolisis seguida de un tratamiento reductor produce el ceto -
cetal (XVII). La preparación del intermedio (XVII, Z = heteroátomo)
mediante un procedimiento de dos etapas se esquematiza en el
procedimiento (c). El acoplamiento del acetal (XXII) con el alqueno
(XXI) seguido de ozonolisis (con un procesamiento reductor) del
alqueno resultante proporciona el ceto - acetal/cetal (XVII). Como
alternativa, el intermedio (XVII, Z = heteroátomo) se prepara
mediante un procedimiento de dos etapas esquematizado en el
procedimiento (d). La reacción del compuesto (XXIV) con el
acetal(cetal (XVIII) proporciona(XXV) que se
transforma en el ceto - acetal/cetal (XVII) mediante los
procedimientos descritos en el procedimiento (a). la condensación
del ceto - acetal/cetal (XVII) con hidroxialminas, hidracinas,
N-alquil, -N-alcoxiaminas, y aminas
proporciona el intermedio (XXVI) que lleva una funcionalidad
electrófila C=N.
El indenopirrolocarbazol unido a resina (XIII)
(figura 6, procedimiento A) se trata con un exceso de un reactivo de
Grignard en forma de una base, que da como resultado la generación
de una solución rojo oscuro del carbanion. La reacción posterior con
(V) conduce a productos derivados de adición electrófila al grupo
C=Y. El procesamiento acuoso y escisión del (de los)
producto(s) con ácido diluido (TFA al 1% en cloruro de
metileno) de la resina da como resultado aislamiento de (de los)
compuesto(s) (XXVII) y/o (XXVIII). El tratamiento de (de
los) intermedio(s)
(XXVII) y/o (XXVIII) con bien un ácido sulfónico o un ácido de Lewis, por ejemplo trifluriuroeterato de boro, proporciona el indenopirrolocarbazol unido por puentes (II).
(XXVII) y/o (XXVIII) con bien un ácido sulfónico o un ácido de Lewis, por ejemplo trifluriuroeterato de boro, proporciona el indenopirrolocarbazol unido por puentes (II).
Se emplea una estrategia similar para la reacción
del intermedio soluble protegido por lactama, por ejemplo, (XV)
(figura 7, procedimiento B). Sin embargo, en este caso el
intermedio (XV) se trata conn Tritón B en piridina como una base en
lugar del reactivo de Grignard. El (los) intermedio(s)
(XXXIX) y/o (XXX) se pueden aislar con el grupo protector de
lactama intacto, que es capaz de purificación cromatográfica. Como
en el procedimiento A, (figura 6), el tratamiento con un ácido de
Lewis (tal como trifluoruro eterato de boro) proporciona los
indenopirrolocarbazoles unidos por puentes (II), donde R^{1} =
H.
La introducción de grupos R^{3}, R^{4},
R^{5} y R^{6} se puede llevar a cabo como se describe en las
patentes de Estados Unidos números 5.701.511 y 4.923.986, cuyas
descripciones se incorporan en esta memoria descriptiva como
referencia en su totalidad. un sustituyente R^{3} se puede
introducir de otra manera después de la construcción de los
indenopirrolocarbazoles unidos por puentes, como se muestra en al
figura 8. La posición 3 del anillo B se broma con NBS proporcionando
el compuesto (XXXI). Un fragmento carbonado se introduce
posteriormente empleando reacciones de Stille, Suzuki, Heck, Kumada
o Castro - Stephens catalizado por paladio para proporcionar los
compuestos de tipo (XXXII), (XXXIII), etc. además, el compuesto
(XXXI) puede proporcionar acceso a los compuestos en los que el
grupo bromo se desplaza con un heteroátomo, por ejemplo, un grupo
basado en amina mediante la utilización de la química de aminación
de Buchwald catalizada por paladio.
Mediante un procedimiento oxidante, un grupo
ligado a oxígeno se puede introducir en el cabono de indeno del
anillo E, como se muestra en la figura 9, compuesto (XXXIV). Como se
muestra esta química también da como resultado la oxidación del
grupo metileno de lactama (anillo A) proporcionando un derivado
imida.
Ejemplo 2 -
A
Se cargó secuencialmente un matraz de fondo
redondo de tres cuellos equipado con un agitador mecánico en la
parte superior y una trampa de Dean Stark con resina de ácido Rink
XII (10,00 g, 0,64 mmoles/g),
1-metil-2-pirrolidinona
(80 ml), benceno (350 ml), VIII - A (A^{1}, A^{2} = H_{2},
B^{1}, B^{2} = O, R^{3} = R^{4} = R^{5} = R^{6} = H))
(3,00 g) y ácido p-toluenosulfónico (1,00 g). La mezcla de
reacción se calentó a reflujo durante 20 horas, y después se filtró.
Se lavó la resina con THF (5 x 175 ml) y el filtrado se reservó.
Después la resina se lavó secuencialmente con DMSO (4 x 100 ml),
NaHCO_{3} acuoso al 2% (4 x 100 ml), agua (4 x 100 ml), DMSO (2 x
200 ml), THF (4 x 100 ml) y acetato de etilo (4 x 100 ml). La
resina se secó a vacío (24 horas) para producir 11,70 (0,47
mmoles/g) de VII - A unido a resina, (XIII -
A).
A).
Los lavados de THF originales se evaporaron y el
residuo se diluyó con agua (750 ml), y el precipitado resultante se
filtró y se lavó posteriormente con agua, NaHCO_{3} acuoso al 2%
(4 x 100 ml), y agua (4 x 100 ml). Después de secar a vacío, se
recuperó VII - A (1,28 g).
Ejemplo 2 -
B
De una manera similar, VIII - B (A^{1}, A^{2}
= O, B^{1}, B^{2} = H_{2}, R^{3} = R^{4} = R^{5}=
R^{6} = H), (0,5 g) se acopló a resina de ácido Rink XII (1,52 g)
para producir 1,58 g de VIII - B unido a resina, (XIII - B).
Ejemplo 2 -
C
De una manera similar, VIII - C (A^{1}, A^{2}
= O, B^{1}, B^{2} = H_{2}, R^{3} = R^{4} = R^{5}=
R^{6} = 10-OMe), (1,02 g) se acopló a resina de
ácido Rink XII (3,12 g) para producir 3,70 (0,46 mmoles/g) de
compuesto VIII - C unido a resina, (XIII - C) junto con el compuesto
recuperado VIII - C (0,44 g).
A una suspensión de (XIII - A), (1,25 g) en THF
(24 ml) se añadió solución 1 M de EtMgBr (6,25 m en THF) y la
reacción se agitó durante 1 hora antes de la adición de HMPA (5,0
ml). Después de agitar durante 10 minutos, se añadió
dietoxibutiraldehído (3,0 g) (que se preparó según el procedimiento
de la bibliografía de Paquette, y col., J. Am. Chem. Soc.
1997, 119, 9662 - 71), y la reacción se agitó durante 20
horas. La reacción se inactivó con NH_{4}Cl acuoso al 10% (5 ml)
y se filtró. La resina se lavó sucesivamente con NH_{4}Cl acuoso
al 10% (3 x 10 ml), agua (3 x 10 ml), THF (3 x 10 ml), DMF (3 x 10
ml), agua (3 x 10 ml), THF (3 x 10 ml), y éter (3 x 10 ml). La
resina se secó a vacío, se recogió en cloruro de metileno (15 ml),
y se trató con ácido fluoroacético (0,15 ml). Después de agitar
durante 1 hora, la reacción se filtró, y el filtrado se evaporó. El
residuo resultante se recogió en cloruro de metileno (20 ml) y se
trató con tosilato de piridinio (50 mg), y la solución resultante se
agitó durante 4 horas. En este momento la reacción se lavó con
NHCO_{3} saturado y salmuera, y se secó sobre MgSO_{4}.
Después de filtración y evaporación del
disolvente, el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (Zorbax
RX-8, 4 x 25 cm, eluido con MeCN al 60%/agua p/
ácido trifluoroacético al 0,1%). Las fracciones apropiadas se
neutralizaron con NHCO_{3} y se extrajo en cloruro de metileno (3
x 50 ml) y se secaron sobre MgSO_{4}. Después de filtración y
evaporación de disolvente , se obtuvieron 70,2 mg del compuesto II
- 1 en forma de un polvo blanco que tenía las siguientes
características: ^{13}C RMN (DMSO-d_{6})
\delta 171,8, 143,3, 142,4, 141,4, 140,1, 140,0, 136,6, 129,2,
127,9, 127,4, 127,1, 126,8, 124,1, (2C), 122,7, 121,6, 121,5,
118,3, 112,1, 88,1, 79,2, 56,6, 45,6, 33,4, 24,8;
^{1}H RMN (DMSO-d_{6})
\delta 9,21 (d, J = 7,5, 1H), 8,62 (s, 1H), 7,98 (d,
J = 7,7, 1H), 7,86 (d, J = 8,3, 1H), 7,71 (d, J
= 7,3, 1H), 7,49 (d, J = 7,9, 7,4, 1H), 7,41 (d, J =
7,5, 7,4, 1H), 7,36 - 7,27 (m, 2H), 6,86 (d, J = 6,0, 1H),
5,63 - 5,58 (m, 1H), 4,91 (s, 2H), 4,53 (d, J = 3,3, 1H),
2,23 - 2,14 (m, 1H), 1,96 - 1,92 (m, 1H), 0,96 - 0,88 (m, 1H), 0,60
- 0,57 (m, 1H); EM m/z (M + H) calculado 379, observado
379.
También aislado mediante HPLD preparativa de esta
mezcla de producto de reacción fue el compuesto II - 2 (0,5 mg)
que tenía las siguientes características: ^{1}H RMN
(DMSO-d_{6}) \delta 9,17 (d, J = 8,1,
1H), 8,62 (s, 1H), 7,98 (d, J = 7,0, 1H), 7,85 (d, J
= 6,8, 1H), 7,57 (d, J = 6,8, 1H), 7,49 (d, J = 7,9,
7,4, 1H), 7,44 - 7,26 (m, 3H), 6,81 (d, J = 6,0, 1H), 5,43 -
5,33 (m, 1H), 4,43 (s, 2H), 2,23 - 2,14 (m, 1H), 1,96 - 1,92 (m,
1H), 1,45 - 1,55 (m, 2H), 0,96 - 0,88 (m, 1H), 0,60 - 0,57 (m, 1H),
0,29 (t, J = 7,3, 3H); EM m/z (M + H) calculado 407,
observado 407.
Ejemplo 3 -
B
De una manera similar, como se ha descrito
anteriormente para el compuesto II - 1, la resina (XIII - A) (70,3
mg) se trató con
1,1-dietoxi-2-pentanona
(0,75 ml) (que se preparó según el procedimiento de bibliografía de
Sworin, y col., J. Org. Chem., 1988, 53, 4894 - 6),
para producir el compuesto II - 3 (3,5 mg) que se aisló mediante
HPLC preparativa (gel de sílice, eluido con EtOAc al 50%/tolueno) y
tenía las siguientes propiedades: ^{1}H RMN
(DMSO-d_{6}) \delta 9,42 (d, J = 8,2,
1H), 8,58 (s, 1H), 7,95 (d, J = 7,4, 1H), 7,79 (d, J
= 8,3, 1H), 7,71 (d, J = 7,1), 7,50 - 7,20 (m, 4H), 6,81 (d,
J = 5,9, 7,4, 1H), 4,90 (s, 2H), 4,46 (s, 1H), 2,35 - 2,20
(m, 1H), 1,98 (s, 3H), 1,75 - 1,60 (m, 1H), 1,25 - 1,00 (m, 1H),
0,35 - 0,15 (m, 1H); EM m/z (M + H) calculado 393, observado
393.
Ejemplo 3 -
C
De una manera similar, (XIII - A) (74,3 mg) se
trató con
1,1-dietoxi-2-hexanona
(que se preparó según el procedimiento de bibliografía de Brenner,
J. Org. Chem., 1961, 26, 22 - 7) (0,75 ml), para
producir el compuesto II - 4a (2,10 mg) y compuesto II - 4b (1,06
mg) que se aislaron individualmente mediante HPLC preparativa
(Zorbax RS-8, 4 x 25 cm, MeCN al 60%/agua p/ ácido
trifluoroacético al 0,1%). El compuesto II - 4a tenía las
siguientes propiedades: ^{1}H RMN (DMSO-d_{6})
\delta 9,30 (d, J = 8,3, 1H), 8,55 (s, 1H), 7,97 (d,
J = 7,2, 1H), 7,65 (d, J = 8,5, 1H), 7,59 (d, J
= 7,5), 7,48 (dd, J = 7,8, 7,2, 1H), 7,39 - 7,15 (m, 3H),
6,31 (dd, J = 5,9, 5,5, 1H), 5,02 (s, 1H), 4,88 (s, 2H),
0,88 (s, 3H) otras señales alifáticas perdidas en picos de
disolvente; EM m/z (M + H) calculado 407, observado 407. El
compuesto II - 4b tenía las siguientes propiedades: ^{1}H RMN
(DMSO-d_{6}) \delta 9,43 (d, J = 8,1,
1H), 8,59 (s, 1H), 7,99 (d, J = 7,3, 1H), 7,75 - 7,65 (m,
2H), 7,49 (dd, J = 7,0, 6,4, 1H), 7,43 (dd, J = 8,2,
8,1, 1H), 7,36 - 7,25 (m, 2H), 6,75 (s, 1H), 4,91 (s, 2H), 4,50 (s,
1H), 1,95 (s, 3H) otras señales alifáticas perdidas en picos de
disolvente; EM m/z (M + H) calculado 407, observado 407.
Ejemplo 3 -
D
De una manera similar, (XIII - C) (1,00 mg) se
trató con dietoxibutiraldehído (3,65 g) para producir el compuesto
II - 6 (87,8 mg) que se aisló mediante HPLC preparativa (Zorbax
RS-8, 4 x 25 cm, MeCN al 60%/agua p/ ácido
trifluoroacético al 0,1%) y tenía las siguientes propiedades:
^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 9,09 (d,
J = 8,6, 1H), 8,60 (s, 1H), 7,95 (d, J = 7,4, 1H),
7,84 (d, J = 8,3, 1H), 7,47 (d, J = 7,2, 7,0, 1H),
7,35 (s, 1H), 7,29 (dd, J = 7,0, 7,0, 1H), 6,98 (dd,
J = 8,6, 1,9, 1H), 6,83 (d, J = 6,0, 1H), 5,65 - 5,55
(m, 1H), 4,88 (s, 2H), 4,48 (d, J = 3,9, 1H), 3,82 (s, 3H),
2,25 - 2,10 (m, 1H), 2,08 - 1,85 (m, 1H), 0,96 - 0,75 (m, 1H), 0,65
- 0,50 (m, 1H); EM m/z (M + Na) calculado 431, observado
431.
Ejemplo 3 -
E
De una manera similar, la ersina (XIII - B)
(153,2 mg) se trató con dietoxibutiraldehído (1,5 g) para producir
el compuesto II - 8 (3,6 mg) que se aisló mediante HPLC
preparativa (Zorbax RS-8, 4 x 25 cm, MeCN al
60%/agua p/ ácido trifluoroacético al 0,1%) y tenía las siguientes
propiedades: ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta
9,09 (d, J = 7,9, 1H), 8,81 (s, 1H), 7,81 - 7,73 (m, 3H),
7,48 - 7,35 (m, 3H), 7,24 (dd, J = 7,6,7,5 1H), 6,85 (d,
J = 6,2, 1H), 5,65 - 5,59 (m, 1H), 4,86 (s, 2H), 4,61 (d,
J = 3,6, 1H), 3,82 (s, 3H), 2,21 - 2,13 (m, 1H), 1,96 - 1,90
(m, 1H), 0,89 - 0,79 (m, 1H), 0,61 - 0,56 (m, 1H); EM m/z (M
+ H) calculado 379, observado 379.
Ejemplo 4 -
A
A una suspensión fría (0ºC) de NaH (2,68 g, 60%)
en THF (150 ml) se añadió a una solución de
1,1-dietoxietanol (que se preparó según el
procedimiento de bibliografía de Zirkle, y col., J. Org.
Chem., 1961, 26, 395 - 407) (9,00 g) en >THF (20 ml),
y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1
hora antes de añadir cloruro de metalilo (8,0 ml). La mezcla de
reacción se calentó a reflujo durante toda una noche, se enfrió y
se filtró a través de un obturador de celita. Se retiró el
disolvente mediante un rotavapor, y el residuo de purificó mediante
cromatografía en columna (sílice, éter al 20%/hexano) para
proporcionar 1,1-dieoxietil metalil éter (11,5,
90%). la ozonolisis de una solución enfriada (-30ºC) de este éter
(6,00 g) en EtOAc (80 ml) se llevó a cabo hasta que no era
detectable material de partida mediante TLC (1 hora). En este
momento, la reacción se purgó con oxígeno, se trató con
Pd((OH)_{2} (150 mg) y se agitó en una atmósfera de
hidrógeno durante toda una noche. El catalizador se retiró por
filtración, y el filtrado se concentró mediante un rotavapor. El
residuo resultante se purificó mediante cromatografía en columna
(sílice, EtOAc al 20%/hexano) para producir el compuesto del título
(4,53 g, 82%).
Ejemplo 4 -
B
Según el procedimiento A (figura 6), la resina
(XIII - A) (230,2 mg) se trató con EtMgBr (1,25 ml) seguido de
(1,1-dietoxietoxi)acetona (ejemplo 3 - A)
(1,2 ml). Después de tratamiento y escisión de la resina, una mezcla
del producto de reacción bruto (10,5 mg) se recogió en cloruro de
metileno (20 ml) y se trató con BF_{3}eterato (20 \mul).
Después de agitación durante 2,5 horas, la solución se lavó con
NaHCO_{3} saturado acuoso y salmuera antes de secar sobre
MgSO_{4}. Después de la filtración y retirada del disolvente, el
residuo resultante se purificó mediante HPLC preparativa (Zorbax
RS-8, 4 x 25 cm, MeCN al 60%/agua p/ ácido
trifluoroacético al 0,1%) para proporcionar el compuesto II - 7a
(2,34 mg) y el compuesto II - 7b (1,34 mg). El compuesto (II - 7a)
tenía las siguientes propiedades: ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta
9,35 -
9,20 (m, 1H), 7,87 (d, J = 7,6, 1H), 7,62 (d, J = 7,0, 1H), 7,60 - 7,45 (m, 1H), 7,49 (dd, J = 7,7, 7,5, 1H), 7,40 (d, J = 8,1, 1H), 7,37 - 7,26 (m, 3H), 6,22 (s, 1H), 5,20 - 4,85 (m, 1H), 4,47 (s, 1H), 3,67 (d, J = 12,7, 1H), 3,52 (d, J = 11,8, 1H), 3,40 (d, J = 12,7, 1H), 3,38 (d, J = 11,8, 1H), 1,91 (s, 3H); EM m/z (M + H) calculado 409, observado 409. El compuesto II - 7b tenía las siguientes propiedades: ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 9,58 - 9,22 (m, 1H), 7,82 (d, J = 7,4, 1H), 7,60 -
7,40 (m, 3H), 7,37 - 7,27 (m, 3H), 7,21 (d, J = 8,1, 1H), 5,81 (s, 1H), 5,21 (s, 1H), 5,10 - 4,80 (m, 1H), 4,59 (d, J = 13,5, 1H), 4,38 (d, J = 13,5, 5,3, 1H), 4,21 (d, J = 13,1, 1H), 3,82 (d, J = 13,2, 1H), 1,13 (s, 3H); EM m/z (M + H) calculado 409, observado 409.
9,20 (m, 1H), 7,87 (d, J = 7,6, 1H), 7,62 (d, J = 7,0, 1H), 7,60 - 7,45 (m, 1H), 7,49 (dd, J = 7,7, 7,5, 1H), 7,40 (d, J = 8,1, 1H), 7,37 - 7,26 (m, 3H), 6,22 (s, 1H), 5,20 - 4,85 (m, 1H), 4,47 (s, 1H), 3,67 (d, J = 12,7, 1H), 3,52 (d, J = 11,8, 1H), 3,40 (d, J = 12,7, 1H), 3,38 (d, J = 11,8, 1H), 1,91 (s, 3H); EM m/z (M + H) calculado 409, observado 409. El compuesto II - 7b tenía las siguientes propiedades: ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 9,58 - 9,22 (m, 1H), 7,82 (d, J = 7,4, 1H), 7,60 -
7,40 (m, 3H), 7,37 - 7,27 (m, 3H), 7,21 (d, J = 8,1, 1H), 5,81 (s, 1H), 5,21 (s, 1H), 5,10 - 4,80 (m, 1H), 4,59 (d, J = 13,5, 1H), 4,38 (d, J = 13,5, 5,3, 1H), 4,21 (d, J = 13,1, 1H), 3,82 (d, J = 13,2, 1H), 1,13 (s, 3H); EM m/z (M + H) calculado 409, observado 409.
A una solución del compuesto II - 1 (8,1 mg) en
THF (2 ml) se añadió NBS (4,6 mg), y la reacción se agitó durante
toda una noche. Se añadió NBS adicional (4,5 mg), y la reacción se
agitó durante 2,5 horas. El material ion soluble se retiró por
filtración y se concentro mediante un rotavapor. El residuo
resultante se purificó mediante cromatografía en columna
(C-18,MeCN al 60%/agua p/ ácido trifluoroacético al
0,1%): Las fracciones apropiadas se neutralizaron con NaHCO_{3}
y se extrajeron en cloruro de metileno (3 x 20 ml) y se secaron
sobre MgSO_{4}. Después de filstración y evaporación del
disolvente, se obtuvo el compuesto II - 5 (5,1 mg) en forma de un
polvo blanco que tenía las siguientes características: ^{1}H RMN
(DMSO-d_{6}) \delta 9,22 (d, J = 7,4,
1H), 8,67 (s, 1H), 8,14 (s, 1H), 7,86 (d, J = 8,7, 1H), 7,72
(d, J = 7,0, 1H), 7,63 (d, J = 7,8, 1H), 7,42 (dd,
J = 7,5, 7,3, 1H),7,35 (dd, J = 7,3,7,2, 1H), 6,86
(d, J = 6,0, 1H), 5,63 - 5,58 (m, 1H), 4,94 (s, 2H), 4,54
(d, J = 3,1, 1H), 2,30 - 2,14 (m, 1H), 2,00 - 1,82 (m, 1H),
0,96 - 0,88 (m, 1H), 0,62 - 0,50 (m, 1H); EM m/z (M + H)
calculado 457/9 (1:1), observado 457/9 (1:1).
A una solución de VIII - 4 [A^{1}, A^{2} =
H_{2}, B^{1}, B^{2} = O, R^{3} = R^{4} = R^{5}= R^{6}
= H)] (1,05 g) en DMF (25 ml) se añadió trietilamina(0,75
ml) y cloruro de t-butildimetilsililo
(TBs-Cl) (0,65 g). Después de agitar durante 3
horas, la reacción se inactivó con NaHCO_{3} acuoso saturado y se
extrajo con EtOAc. La fase orgánica se lavó con agua y salmuera y se
secó sobre MgSO_{4}. Después de filtración y evaporación del
disolvente, el residuo se trituró con éter para proporcionar el
compuesto XV (848 mg). Los lavados se evaporaron para producir un
residuo que se purificó mediante cromatografía en columna (sílice,
EtOAc al 1%/CH_{2}Cl_{2}) y proporcionó un producto adicional
(502 mg, rendimiento combinado de 94%) que tenía las siguientes
propiedades espectrales: ^{1}H RMN (DMSO-d_{6})
\delta 11,94 (s, 1H), 9,32 (d, J = 7,6, 1H), 8,03 (d,
J = 7,7, 1H), 7,64 (d, J = 7,2, 1H), 7,58 (d, J
= 8,1, 1H), 7,44 (dd, J = 7,7, 7,6, 1H), 7,39 (dd, J
= 7,7, 7,6, 1H), 7,32 (d, J = 7,3, 1H), 7,25 (d, J =
7,6, 7,3, 1H), 5,00 (s, 2H), 4,14 (s, 2H), 0,99 (s, 9H), 0,46 (s,
6H); EM m/z (M + H) calculado 425, observado 425.
Una solución de Tritón B es piridina (0,45 M) se
preparó disolviendo una solución de Tritón B al 40% en metanol (10
ml) en piridina (10 ml). El disolvente se retiró a presión reducida
(10 mm de Hg (2,6664 kPa)) hasta un volumen final de
aproximadamente 8 ml. El residuo se diluyó con piridina hasta 50
ml, se filtró y se almacenó en nitrógeno. Una solución de XV (20,3
mg) en piridina (2,0 ml) se purgó con argón y se trató con 300
\mul de Tritón B ((0,45 M es piridina) y dietoxibititaldehído (50
\mul). Después de agitar durante 2 horas, la reacción se extrajo
en EtOAc, se lavó con HCl acuoso 1 N, salmuera y se secó sobre
MgSO_{4}. Después de filtración y evaporación del disolvente, el
aducto se recogió en CH_{2}Cl_{2}(10 ml) y se trató con
BF_{3} etearato (10 \mul) Después de agitar durante 2 horas, la
solución se lavó con NaHCO_{3} acuoso saturado y salmuera antes de
secar sobre MgSO_{4}. La retirada del disolvente mediante un
rotavapor proporcionó un residuo que se purificó mediante HGPLC
preparativa (Zorbax RX-8, 2,5 x 25 cm,
C-18, MeCN al 60%/agua p/ ácido trifluoroacético al
0,1%). Las fracciones apropiadas se neutralizaron con NaHCO_{3} y
se extrajeron en cloruro de metileno (3 x 20 ml) y se secaron sobre
MgSO_{4}. Después de la filtración y evaporación del disolvente,
se obtuvo II - 1 (11,8 mg, 65% de rendimiento) cuyos espectros de
^{1}H RMN y EM y tiempo de retención de HPLC eran idénticos al
material preparado y aislado mediante en procedimiento A, descrito
en el ejemplo 3 -
A.
A.
A una suspensión del compuesto bromo II - 5 (6,2
mg g) en 1-propanol (4,0 ml) se añadió ácido
3-aminofenilbórico (3,8 mg). Después de agitación
durante 0,25 horas, Pd(OAc)_{2} (2,0 mg) Ph_{3}P
(4,8 mg), NaCO_{3} (2,8 mg), y agua (2,0 ml) se añadieron
secuencialmente. La mezcla se calentó a reflujo durante 0,75 horas,
se enfrió, se extrajo en CH_{2}Cl_{2}, y se lavó con agua y
salmuera. La fase orgánica se secó MgSO_{4}, y el disolvente se
retiró mediante un rotavapor para proporcionar un residuo que se
purificó mediante HGPLC preparativa (Zorbax RX-8,
2,5 x 25 cm, C-18, MeCN al 60%/agua p/ ácido
trifluoroacético al 0,1%). Las fracciones apropiadas se
neutralizaron con NaHCO_{3} y se extrajeron en cloruro de
metileno (3 x 20 ml) y se secaron sobre MgSO_{4}. Después de la
filtración y evaporación del disolvente, se obtuvo el compuesto II
- 9 (3,1 mg, 49% de rendimiento) y tenía las siguientes propiedades
espectrales: ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta
9,22 (d, J = 7,5, 1H), 8,66 (s, 1H), 8,00 - 7,25 (m, 8H),
7,12 (dd, J = 7,1, 7,0, 1H), 6,95 - 6,80 (m, 3H), 6,53 (d,
J = 6,0, 1H), 5,63 - 5,58 (m, 1H), 4,99 (s, 2H), 4,55 (s,
1H), 2,25 - 2,10 (m, 1H), 1,95 - 1,90 (m, 1H), 1,95 - 1,90 (m, 1H),
0,98 - 0,88 (m, 1H), 0,65 - 0,57 (m, 1H); EM m/z (M + H)
calculado 470, observado
470.
470.
A una solución del compuesto II - 1 (5,0 mg g) en
DMSO (1 ml) se añadió NaCN (4,3 mg) y la mezcla se calentó hasta
145ºC durante 1 hora. La mezcla se enfrió, se extrajo en EtOAc, y se
lavó con agua (3 x 20 ml) y salmuera. La fase orgánica se secó
sobre MgSO_{4}, se filtró y se evaporó para proporcionar un
residuo que se purificó mediante HGPLC preparativa (Zorbax
RX-8, 2,5 x 25 cm, MeCN al 55%/agua p/ ácido
trifluoroacético al 0,1%). Las fracciones apropiadas se
neutralizaron con NaHCO_{3} y se extrajeron en cloruro de
metileno (3 x 20 ml) y se secaron sobre MgSO_{4}. Después de la
filtración y evaporación del disolvente, se obtuvo el compuesto II
- 10 (2,7 mg, 50% de rendimiento) y tenía las siguientes
propiedades espectrales: ^{1}H RMN (DMSO-d_{6})
\delta 11,4 (s, 1H), 8,86 (d, J = 7,9, 1H), 8,79 (d,
J = 7,6, 1H), 7,90 (d, J = 8,3, 1H), 7,62 - 7,55 (m,
2H), 7,49 (d, J = 7,6, 7,4, 3H), 7,40 (dd, J = 7,4,
7,3, 1H), 7,35 (dd, J = 7,5, 7,4, 1H), 6,86 (d, J =
6,0, 1H), 6,0 (s, 1H), 5,40 - 5,30 (m, 1H), 2,25 - 2,14 (m, 1H),
2,03 - 1,90 (m, 1H), 1,10 - 0,98 (m, 1H), 0,82 - 0,77 (m, 1H).
Según el procedimiento A, se hizo reaccionar la
resina (XIIIa) (150,2 mg) con EtMgBr (1,0 ml) seguido de
2,5-dioxopentanoato de etilo (Schmidt, y col.,
Synthesis, 1993, 809) (1,5 ml). Después de reprocesamiento y
escisión de la resina, el producto de reacción bruto se recogió en
cloruro de metileno (20 ml) y se trató con Br_{3} eterato (20
\mul). Después de agitar durante 2,5 horas, la solución se lavó
con NaHCO_{3} acuoso saturado y salmuera antes de secar sobre
MgSO_{4}. Después de filtración y retirada de disolvente, el
residuo resultante se purificó mediante HGPLC preparativa (Zorbax
RX-8, 2,5 x 25 cm, MeCN al 55% - 75%/agua p/ ácido
trifluoroacético al 0,1%) para producir el compuesto II - 11 (6,4
mg) que tenía las siguientes propiedades: ^{1}H RMN
(DMSO-d_{6}) \delta 9,36 (d, J = 7,7,
1H), 8,68 (s, 1H), 8,00 (d, J = 7,7, 1H), 7,83 (d, J
= 8,3, 1H), 7,58 - 7,15 (m, 5H), 6,97 (d, J = 5,9, 3H), 4,93
(s, 2H), 4,82 (s, 1H), 4,48 (c, J = 7,1, 2H), 2,42 - 1,91
(m, 2H), 1,37 (t, 3H, J = 7,1), 1,25 - 0,63 (m, 2H).
A una solución del compuesto II - 11 (3,4 mg g)
en THF (2 ml) se trató con una solución 2 M de LiBH_{4} (1,0 ml,
en THF) y al reacción se agitó durante 1,5 horas. La reacción se
inactivó mediante la adición de HCl acuoso 1 N (4 ml). Después de
agitar durante 20 minutos, se añadió NaOH acuoso al 10% (15 ml) y al
mezcla se extrajo en cloruro de metileno (3 x 10 ml). Después de
secar sobre MgSO_{4}, la mezcla se filtró y se evaporó el
disolvente para producir el compuesto II - 12 (0,32 mg) que tenía
las siguientes propiedades: ^{1}H RMN
(DMSO-d_{6}) \delta 9,35 (d, J = 7,7,
1H), 8,62 (s, 1H), 7,98 (d, J = 7,7, 1H), 7,83 (d, J
= 8,2, 1H), 7,75 (d, J = 8,2, 1H), 7,50 - 7,25 (m, 4H), 6,84
(dd, J = 7,7, 1H), 6,11 (s, 1H), 4,91 (s, 2H), 4,71 (s, 1H),
4,50 - 4,40 (m, 1H), 4,30 - 4,20 (m, 1H), 2,42 - 1,91 (m, 2H), 1,25
- 0,63 (m, 2H); EM m/z (M + H) calculado 409, observado
409.
ChAT es un marcador bioquímico específico para
las neuronas colinérgicas funcionales. Las neuronas colinérgicas
representan una información colinérgica importante en la formación
del hipocampo, núcleo olfativo, núcleo interpendular, córtex,
amígdala, y partes del tálamo. En la médula espinal, las neuronas
motoras son neuronas colinérgicas que contienen ChAT (Phelps, y
col., J. Comp. Neurol., 1988, 273, 459 - 472). La
actividad ChAT se ha usado para estudiar so efectos de las
neurotrofinas (por ejemplo, NGF o NT - 3) en al supervivencia y/o
función de neuronas colinérgicas. El ensayo ChAT también sirve como
una indicación de la regulación de los niveles de ChAT en las
neuronas colinérgicas.
Procedimientos: Células de la espina
dorsal de rata fetal se disociaron, y se realizaron experimentos
como se describe en (Smith, y col., J. Cell Biology,
1985, 101, 1608 - 621; Glicksman, y col., J.
Neurochem., 1993, 61, 210 -
221). Se prepararon células disociadas a partir de médulas espinales diseccionadas ratas (día embriónico 14 - 14) mediante técnicas de disociación de tripsina convencionales (Smith y col., anteriormente). Se sembraron células a 6 x 10^{5}células/cm^{2} en pocillos de cultivo de tejidos de plástico recubiertos con poli-l-ornitina en medio N2 sin suero suplementado con albúmina sérica bovina al 0,05% (BSA) (Bottenstein, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 514 - 517). Los cultivos se incubaron a 37ºC en una atmósfera humidificada de CO_{2} al 5%/aire al 95% durante 48 horas. La actividad ChAT se midió después de 2 días in vitro usando una modificación del procedimiento de Fonnum (Fonnum, Neurochem, 1975, 24, 407 - 409) según McManaman, y col. y Glicksman, y col. McManaman, y col., Develop. Biol., 1988, 125, 311 - 320; Glicksman, y col., J. Neurochem., anteriormente).
221). Se prepararon células disociadas a partir de médulas espinales diseccionadas ratas (día embriónico 14 - 14) mediante técnicas de disociación de tripsina convencionales (Smith y col., anteriormente). Se sembraron células a 6 x 10^{5}células/cm^{2} en pocillos de cultivo de tejidos de plástico recubiertos con poli-l-ornitina en medio N2 sin suero suplementado con albúmina sérica bovina al 0,05% (BSA) (Bottenstein, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 514 - 517). Los cultivos se incubaron a 37ºC en una atmósfera humidificada de CO_{2} al 5%/aire al 95% durante 48 horas. La actividad ChAT se midió después de 2 días in vitro usando una modificación del procedimiento de Fonnum (Fonnum, Neurochem, 1975, 24, 407 - 409) según McManaman, y col. y Glicksman, y col. McManaman, y col., Develop. Biol., 1988, 125, 311 - 320; Glicksman, y col., J. Neurochem., anteriormente).
Los compuestos que tienen la fórmula II descritos
en los ejemplos se enumeran en la tabla 2. Los valores para
R^{1}, R^{4}, R^{6}, y R^{7} son H; Y es O; y n es 1.
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Se clonó MLK3 como se describe en (Lee, y col.,
Oncogene, 1993, 8, 3403 - 3410; Ezoe, y col.,
Oncogene, 1994, 9, 935 - 938). Se preparó ADNc a
partir de 200 ng de ARNm de melanocitos poliadenilado y 5% de la
reacción se usó como molde para amplificar un repertorio de ADNc de
PTK usando mezclas de bien dos o cuatro cebadores de
ligonucleótidos altamente degenerados derivados de las secuencias
de consenso de los subdominios VIb y IX conservados de las PKT
conocidas:
PKT1,
5'-CGGATCCACMGIGAYYT-3' (SEC ID Nº
1);
PTK2,
5'-GGAATTCCAWAGGACCASACRTC-3' (SEC
ID Nº 2);
PTK3,
5'-CGGATCCRTICAYMGIGAYYTIGCIGCIMGIAA-3'
(SEC ID Nº 3);
PTK4,
5'-GGAATTIAYIGGAWAIGWCCAIACRTCISW-3'
(SEC ID Nº 4).
Se llevaron a cabo cuarenta ciclos de PCR usando
la Taq ADN polimerasa (AmpliTaq; Perkin - Elmer/cetros) y un
ciclador térmico de ADN automático; cada ciclo consistía en 40 s a
94ºC, 2 minutos a 37ºC y 3 minutos a 63ºC. Los productos de ocho
PCR se reunieron, se trataron con ADN polimerasa (Klenow), se
escindieron con BamH1 plus y se sometieron a electroforesis en un
gel de poliacrilamida al 5%. La tinción como bromuro de etidio
identificó una banda predominante de 200 - 230 pares de bases que
se escindió, se eluyó y se clonó en M13mp13. En un experimento,
parte del ADNc amplificado por PCR no se escindió, pero en su lugar
se clonó romo en M13mp18 escindido con Sma1. La secuencia de
nucleótidos se determinó mediante el procedimiento de secuenciación
de terminación de cadena.
Un ADNc, identificado como PTK1, se usó como una
sonda para seleccionar genotecas de ADNc de melanocitos y melanoma
humano. Un clon, designado PTK1-3,2, incluía la fase
abierta de lectura de 2541 nucleótidos, que codifica una proteían de
847 aminoácidos. Este ADNc se cortó con Nco1, se hizo romo con ADN
polimerassa (Klenow), se cortó otra vez con EcoR1 y se ligó en el
vector ADNpC3-EE cortado con BamH1, se hizo romo y
después se cortó con EcoR1. El vector ADNpC3-EE se
construyó insertando en el sitio HindIII/BamH1 un oligo que codifica
un codón de partida seguido de un epítope EE, MEEEEYMPME (SEC ID Nº
5) (Grussenmeyer, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
1985, 82, 7952 - 7954). La vesión destruida por quinasa de
MLK3 se preparó realizando la mutación K144R usando PCR que emplea
una técnica publicada previamente (Chen, y col.,
Biotechniques, 1994, 17, 657 - 659). El primer oligo
mutagénico era
5'-GTGGCTGTGCGGGCAGCTCGCCAG-3' (SEC
ID Nº 6) y el segundo oligo era
5'-GAGACCCTGGATCTCGCGCTT-3' (SEC ID
Nº 7). Usando MLK3 como molde, estos oligos se usaron en PCR para
generar un fragmento de 806 pares de bases y se empleó en una
segunda reacción de PCR usando un cebador de T7 como el otro
amplímero y MLK3 como molde para generar un fragmento de 1285 pares
de bases. El fragmento se separó mediante electroforesis en gel de
agarosa, se aisló, se clonó en pGEM-5 (Promega) y se
secuenció). El fragmento se escindió con HindIII y HpaI, y se
insertó en ADNpCA3-EE-MLK3 se cortó
con HindIII y HpaI. Se detectó uan mutación puntual adicional en el
nucleótido 1342. Para corregir esto, un fragmento Pf1M1 (nucleótido
1093 - 1418) se escindió a partir de la MLK3 de tipo salvaje y se
usó para reemplazar el fragmento idéntico en MLK3 mutada K144R.
Para obtener la proteína MLK3, el ADNc se clonó
en el vector de expresión de baculovirus pFB-FLAG.
MLK3 se escindió a partir de PKT1-3.2 mediante
digestión con Nco1, se hizo romo con la ADN polimerasa (Klenow), se
cortó otra vez con Not1 y se ligó en pFB-FLAG
digerido con Stu1 y Not1. pFB-FLAG se derivó a
partir de pFB (Life Technologfies) y tiene la secuencia codificadora
para el epítope FLAG JHopp, y col., Biotechnology,
1988, 6, 1205 - 1210) con un codón de partida, MDYKDDDDK
(SEC ID Nº 8), se añadió al poliengarce en el sitio BamH1.
Se logró la expresión baculoviral del dominio
quinasa de MLK3 mediante escisión del fragmento MLK3 a partir del
pGEXKG-MLK(KD) usando EcoR1 y Xho1 y ligando
en un vector pFB cortado con EcoR1 y Xho1 en el que la secuencia
codificadora para glutatión S-transferasa (GST) se
había clonado cadena arriba. Esto se logró obteniendo la seceuncia
codificadora de GST y el poliengarce del vector pGEXKG mediante PCR
usando el ector como molde (Guan, y col., anal. bioch,
1991, 192, 262 - 267). El 5' oligo para PCR creó un sitio de
restricción Bgl2 en el extremo 5' del fragmento. Este fragmento
aislado después se digirió con Bgl2 y HinD3 y se ligó en pFB
digerido con BamH1 y HinD3.
Un fragmento de ADNc que incluía tanto el
dominio quinasa de MLK3 como una porción de la cremallera de leucina
(nucleótidos 736 - 1791) se obtuvo mediante PCR usando el ADNc de
PTK1. El fragmento aislado se digirió con las enzimas de restricción
EcoR1 y Xho1, sitios que se incluyeron en los oligos de PCR, y se
clonaron en pGEX-KG digerido con EcoR1 y Xho1. Este
fragmento en pGEX-Kg se acortó después mediante PCR
para incluir solamente el dominio quinasa (nucleótidos 736 -
1638).
MLK2 se clonó usando PCR degenerada (Dorow, y
col., Eur. J. Biochem., 1993, 13, 701 - 710; Dorow, y
col., Eur. J. Biochem., 1995, 234, 492 - 500). Los
segmentos de los ADNc que codifican subdominios catalíticos de las
proteínas quinasas expresadas en la línea celular de tumor epitelial
Colo 16 se amplificaron a partir de ARN mediante PCR de
transcriptasa inversa. Los cebadores de PCR degenerada se basaron
en secuencias que codifican motivos conservados en subdominios Vib
y VIII de los dominios catalíticos de la familia quinasa de
receptores del factor de crecimiento epidérmico. Las secuencias de
los cebadores eran como sigue: cebador delantero,
5'-CGGATCCGTG(A)GT(CG)G(A)ACC(T)T-3'
(SEC ID Nº 9), cebador inverso,
5'-GGAATTCACCA(G)TAA(G)CTCCAG(C)ACATC-3'
(SEC ID Nº 10). Se clonaron productos de PCR en M13 y se
secuenciaron usando un kit de secuenciación de T7 Super - -
Base (Bresatec). Se usó un producto de PCR de 216 pares de bases
como sonda para seleccionar una genoteca de ADNc \lambdagt11 de
colon humano (Clontech, nº de catálogo 10346)). El fragmento se
marcó por cebado aleatorio, la hibridación se realizó a 65ºC y se
lavaron los filtros para una rigurosidad de NaCl 0,2X/citrato
(cloriro sódico 150 mM, citrato sódico 15 mM, pH 7,0) y SDS al 0,5%
a 65ºC. Los filtros se autorradiografiaron durante 16 horas a -70ºC
sobre película Kodak XAR - 5. Se aislaron cuatro clones y el más
largo, 1,2 kb, se usó para volver a sondar la misma genoteca usando
las mismas condiciones. Se seleccionaron cuatro clones más y uno de
estos clones representó un fragmento se 1034 pares de bases de MLK2.
Este clon se usó para sondar una genoteca \lambdagt11 de cerebro
humano. Aproximadamente 500.000 clones se seleccionaron y se aisló
un clon de 3454 pares de bases, que representa la región
codificadora entera de MLK2.
MLK2 se clono, a partir de ATG a la cola poliA,
en el vector pKH3 entre los sitios BamH1 y EcoR1 en dos etapas ya
que existe un sitio BamH1 en la mitad de al secuencia MLK2. El
vector pKH3 se construyó insertando tres copias de la diana del
epítope HA seguido de un sitio BamH1 entre los sitios Xba1 y EcoR1
del poliengarce pRK7. Para realizar la versión mutagenizada, K125A,
el fragmento BamH1 de MLK2 5' se clonó en el vector Promega p Alter
y se mutó como se recomienda por el fabricante. Después el fragmento
se clonó otra vez en el vector pkH3 de MLK2.
El ADNc de JNK1 se obtuvo como se ha desrito en
(Coso, y col., Cell, 1995, 81, 1137 - 1146). Al ADNc
se obtuvo mediante PCR usando como molde ADNc de músculo esquelético
humano (Invitrogen) y se clonó en ls sitios Bgl2 / Sal1 de
ADNpc3-HA, un plásmido de expresión de ADNpc3
modificado que codifica el epítope HA (Wilson y col., Cell,
1984, 37, 767 - 778). Después éste se escindió a partir de
ADNpc3, incluyendo el epítope HA, y se ligó en
pGEX-4T3 (Pharmacia). El ADNc de JNK1 se escindió a
partir de la construcción pGEX-4T3 como un
fragmento Bgl1 / Sal1 y se ligó ADNpc3-HA, un vector
con el epítope HA añadido en el sitio Hind3/BamH1 de ADNpc3.
DLK se clonó e el vector de expresión ADNpc3 con
el epítope FLAG añadió como se describe en (Holtzman, y col., J,
Biol. Chem., 1994, 269, 30808 - 30817). Un fragmento de
ADNc para DLK se aisló mediante clonación por PCR degenerada basada
en oligonucleótido. Se extrajo e ARN total a partir de riñones de
13,5 días embriónicos (32 órganos) y riñones de 17,5 días
embriónicos (16 órganos) usando un procedimiento reactivo de
fenol/guanidina isotiocianato preparado comercialmente según las
instrucciones del fabricante (TRIzol Reagent, Life Technologies,
Inc. Después de la digestión con ADNasa I sin ARNasa, el ERN total
se transcrivió inversamente con ARNasa H - tranbscriptasa inversa
(Superscript, Life Technologies, Inc.) a partir de un cebador de
oligonucleótido sintético oligo (dT) a un ADNc de cadena sencilla.
Los cebadores de oligonucleótidos degenerados correspondientes a los
subdominios catalíticos de proteína tirosina quinasa Vib y IX
descrito originalmente por Wilks (Wilks, Proc. Natl Acad Sci
USA., 1989, 86, 1603 -
1607) se modificaron a sitios 5' Eco e HindIII, respectivamente (5'-ATAATTC(GT)GC(TAGC)GCCA(GA)GTC(TAGC)CGGTG-3') (SEC ID Nº 11), (5'-ATAAGCTTCC(TC)(AG)T(GC)AAGTGGA(TC)(GC)GC(AGC)CC(CT)GA-3') (SEC ID Nº 12). Se llevaron a cabo cuarenta ciclos de PCR durante 1,5 minutos a 94ºC, 2 minutos a 37ºC, y 3 minutos a 63ºC. Se añadieron reactivos recién preparados y se completaron 40 ciclos adicionales antes de una extensión de 10 minutos a 72ºC. El producto de amplificación de ADN de 200 - 210 pares de bases resultante se aisló mediante gel, se subclonó en un plásmido pGEM7zf(+) preparado (Promega), y se transformó en Escherichia coli. Se preparó ADN de plásmido miniprep a partir de bacterias transformadas y una porción digerida con endonucleasas de restricción EcoRI e HindIII; se secuenciaron los clones que contenían inserciones.
1607) se modificaron a sitios 5' Eco e HindIII, respectivamente (5'-ATAATTC(GT)GC(TAGC)GCCA(GA)GTC(TAGC)CGGTG-3') (SEC ID Nº 11), (5'-ATAAGCTTCC(TC)(AG)T(GC)AAGTGGA(TC)(GC)GC(AGC)CC(CT)GA-3') (SEC ID Nº 12). Se llevaron a cabo cuarenta ciclos de PCR durante 1,5 minutos a 94ºC, 2 minutos a 37ºC, y 3 minutos a 63ºC. Se añadieron reactivos recién preparados y se completaron 40 ciclos adicionales antes de una extensión de 10 minutos a 72ºC. El producto de amplificación de ADN de 200 - 210 pares de bases resultante se aisló mediante gel, se subclonó en un plásmido pGEM7zf(+) preparado (Promega), y se transformó en Escherichia coli. Se preparó ADN de plásmido miniprep a partir de bacterias transformadas y una porción digerida con endonucleasas de restricción EcoRI e HindIII; se secuenciaron los clones que contenían inserciones.
El fragmento de ADNc de 195 pares de bases DLK
obtenido mediante PCR degenerada se marcó radiactivamente y se usó
para seleccionar aproximadamente 1 x 10^{6} recombinantes de un
Uni-ZAP II (Stratagene, La Jolla, CA), genoteca de
ADNc de cerebro de ratón adulto cebado con oligo (DT) (Holzman, y
col., Mol Cell Biol, 1990, 10, 5830 -
5838). Los filtros se hibidaron en un tampón constituido por formamida al 50%, 5 x SSC, solución de Denhardt 3 x, SDS al 0,25%, 1 mg/ml de ácido poliadenílico, y 200 mg/ml de ADN de esperma de salmón a 42ºC. Los filtros se lavaron una vez a temperatura ambiente en SSC 2 x, SDS al 0,2% y dos veces durante 30 minutos a 65ºC. Se identificaron veinticinco únicos clones; 10 clones se purificaron hasta homogeneidad, se escindieron in vivo según el protocolo del fabricante y se mapearon por restricción. Los dos clones más largos (3401 y 3397 pares de bases, respectivamente, difiriendo solamente en sus extremos 5') se secuenciaron junto con ambas hebras sobre su longitud completa.
5838). Los filtros se hibidaron en un tampón constituido por formamida al 50%, 5 x SSC, solución de Denhardt 3 x, SDS al 0,25%, 1 mg/ml de ácido poliadenílico, y 200 mg/ml de ADN de esperma de salmón a 42ºC. Los filtros se lavaron una vez a temperatura ambiente en SSC 2 x, SDS al 0,2% y dos veces durante 30 minutos a 65ºC. Se identificaron veinticinco únicos clones; 10 clones se purificaron hasta homogeneidad, se escindieron in vivo según el protocolo del fabricante y se mapearon por restricción. Los dos clones más largos (3401 y 3397 pares de bases, respectivamente, difiriendo solamente en sus extremos 5') se secuenciaron junto con ambas hebras sobre su longitud completa.
El fragmento de ADNc de DLK NotI - XhoI de
longitud completa (3401 pases de bases) se subclonó en el vector de
expresión ADNpc3 eucariótico basado en promotor de citomegalovirus
(Invitrogen, San Digo, CA) (construcciones designada
ADNpc3-DLK). A continuación, se preparó una
construcción dirigida (pFLAG-DLK) de epítope de
NH4-Met FLAG (DYKDDDDK) (SEC ID Nº 13). Se usó PCR
para amplificar fragmentos de ADNc que codificaba un sitio 5'
HindIII, secuencia de consenso de Kozak de DLK que incluye el
inicio ATG, el epítope FLAG, y la secuencia del marco abierto de
lectura de ADNc de DLK que se extiende entre el nucleótido 88 y un
sitio EcoRI interno en el nucleótido 758. (Oligonucleótidos
sintéticos purificados por HPLC usados en catidades
equimoleculares:
5'-ATAAAGCTTCCAGAGGCCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGGCCTGCCTCCATGAAACCCG
AACA-3' (Sec ID Nº 14)
AACA-3' (Sec ID Nº 14)
para el cebador de polaridad positiva de la
construcción FLAG y
5'-GACAGGGCGGCCGGCTCT-3' (SEC ID Nº
15) para el cebador de sentido opuesto). Fragmentos amplificados
digeridos por HindIII y EcoRI purificados sobre gel
se subclonaron en el HindIII - EcoRI para preparar
plásmido ADNpc3 - DLK. Las construcciones se secuenciaron junto a
ambas hebras para asegurar la fidelidad de la Taq polimerasa y
mantener el marco de lectura.
La porción 5' de MLK1 se obtuvo a partir de la
base de datos de EST nº de acceso AA160611). Este clon era una
fusión entre MLK1 y otro ADNc de identidad desconocida. Contenía la
secuencia en 5' no publicada previamente de MLK1 junto con una
parte del dominio previamente publicado de MLK1 (Dorow, y col.,
Eur. J. Biochem., 1993, 213, 701 - 710). La secuencia
de ADNc de MLK1 del clon de EST es como sigue:
Esto se traduce en:
La porción en 3' de MLK1 se clonó inicialmente
mediante PCR degenerada como se ha publicado previamente (Dorow, y
col., Eur. J. Biochem., 1993, 213, 701 - 710). El
protocolo para clonar la porción en 3' de MLK1 era como se describió
anteriormente para MLK2 con las siguientes excepciones. De los
cuatro clones obtenidos a partir de la reselección de la genoteca
con el clon de 1,2 kb, tres de los cuatro clones representaban
MLK1. Ninguno de los clones incluían el dominio quinasa entero, que
se obtuvo mediante PCR.
Alícuotas de 1 ml de fago de genotecas ampliadas
(ADNc de línea celular de carcinoma de colon T84 humano y epitelio
de colon humano normal en 1 Uni-ZAPXR (Stratagene,
no de catálogo 937204) se lisaron mediante suspensión en 20 ml de
agua y se congelaron instantáneamente. Una muestra de 5 ml de del
fago lisado se usó como molde de PCR en dos reacciones para cada
genoteca. Los cebadores que representan los vectores se recogieron a
partir de las secuencias de nucleótidos que flanquean los sitios de
clonación. En el caso de la genoteca de la línea celular de colon
T84, se usaron los cebadores de secuenciación de T3 y T7 (Promega).
En cada reacción, un cebador era la hebra 3' - 5' del gen MLK1, 100
pares de bases aproximadamente del extremo 5' de la secuencia
conocida. El segundo cebador era uno de los dos bebedores de
vectores. Las reacciones de PCR contenían tampón PCR 1 x, cloruro de
magnesio 2,5 mM, Taq polimerasa 1 U (todos de Bresatec), dNTP 0,2 M
y 0,4 mM de cada cebador en un total de 50 ml. Las condiciones de
reacción eran 60 segundos a 95ºC, 90 segundos a 52ºC, 90 segundos a
72ºC durante 30 ciclos con un tiempo de extensión de 15 minutos en
el final del ciclo. Los productos de PCR se clonaron y se
secuenciaron como se ha descrito anteriormente. El clon más largo,
de al selección de la genoteca y un fragmento de PCR que incluía al
secuencia adicional de MLK1 se ligaron juntos para crear un ADNc de
MLK1 de 1,08 kb en pUC18.
El clon de MLK1 de la base de adtos de EST se
proporcionó en el vector Bluescript (Stratagene). El ADNc de MLK1 se
la genoteca de colon se ligó en el clon de EST mediante digestión
del anterior con EcoRI, se hizo romo con Klenow, después se cortó
con AfIII. Este fragmento aislado se clonó en en ADNc de MLK1 de la
base de datos de EST cortado con XhoI, hecha roma con Klenow, y se
cortó con AfIII. Esta nueva construcción después se escindió a
partir de pBluescript mediante digestión con Not1 y Apa1 y se ligó
en ADNpc3 - EE también cortado con Not1 y Apa 1. Todas las uniones
de clonación se secuenciaron verificadas.
pEGEXGK-MLK3 (KD) se transformó
en la cepa de E. coli BL21 mediante electroporación. Las
bacterias que contenían el plásmido se inocularon en un fermentador
Applikon de 15 litros en 10 litros de volumen del siguiente medio
enriquecido: 1,95 g/l de K_{2}HPO_{4}, 0,9 g/ de
KH_{2}PO_{4}, 0,1 g/l de ampicilina, 0,3 g/l de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,92 g/l de MgSO_{4} \cdot 7
H_{2}O , 42,7 mg/l de citrato sódico, 21,8 mg/l de de FeSO_{4}
\cdot 7 H_{2}O, 0,5 ml de metales en pequeñas cantidades Pichia
(Higgins, y col., Methods Molecular Biology, 1998,
103, 149 - 177), 20 g/l de casa aminoácidos, 40 g/l de glicerol,
25,5 mg/l de CaCl_{2}. Se hicieron crecer las bacterias durante
toda una noche a 800 rpm/ 68% de oxígeno disuelto 68%/ 30ºC hasta
que el cultivo alcanzó una DO600 = 4,4. La producción de proteína
recombinante se indujo mediante la adición de
isopropil-\beta-D-tiogalactósido
1 mM, con fermentación continuada a 25ºC durante hasta 6 horas.
Después se recuperaron las bacterias por centrifugación y el
sedimento celular se almacenó congelado a -20ºC hasta
purificación.
GST - MLK3_{KD} parcialmente purificado se
preparó mediante sonicación de 100 gramos de sedimento celular
bacteriano en Tris - HCl 100 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM,
ditiotreitol (DTT) 5 mM, pH 7,5 (tampón A). Se hizo la solución al
1% con Tritón X - 100, después se agitó sobre hielo durante 1 hora.
La solución de sobrenadante después de centrifugación durante 45
minutos a 20.000 x g se mezcló durante 1 hora sobre hielo con 10 ml
de resina glutatión Sefarosa 4B (Pharmacia) equilibrada en tampón A.
La resina sedimentada se lavó con dos veces con 12,5 volúmenes de
tampón A, después se eluyó con 200 ml de Tris - HCl 100 mM, NaCl
150 mM, DTT 5 mM (tampón B), que contenía glutation 20 mM, pH 7,5.
La proteína se dializó durante toda una noche frente a tampón B y se
almacenó en alícuotas a -80ºC.
Baculovirus recombinantes que expresan FLAG -
MLK3 y GST - MLK3_{KD} se produjeron a partir de sus respectivos
vectores de transferencia,
pFB-FLAG-MLK3 y
pFB-GST- MLK3_{KD} usando el sistema
BAC-TO-BAC (Life Technologies)
según el manual de instrucciones. Los cultivos en suspensión de las
células Sf21 (Vaughn, y col., In Vitro, 1977, 13, 213
- 217) se desarrollaron a 27ºC/120 rpm en medio de Grace
suplementado (Link, Nature, 1970 , 226, 466 - 467) con
suero fetal bovino (FBS) al 10% inactivado por calor. Para producir
FLAG-MLK3 recombinante, células Sf21 a una densidad
de 1,5 x 10^{6} células/ml en medio de Grace suplementado que
contenía FBS al 5% se infectaron con una multiplicidad de infección
(MOI) de 3,1 y se recogió a las 39 horas después de infección. Para
producir GST - MLK3_{KD}, células Sf21 a una densidad de 1,5 x
10^{6} células/ml en medio de Grace suplementado que contenía FBS
al 5% se infectaron con una MOI de 2 y se recogió a las 41 horas
después de la invención. En ambos casos, las células sedimentadas se
volvieron a suspender en tampón constituido por HEPES 10 mM, NaCl
50 mM, SC Pefabloc 0,5 mM, pepstatina 5 \muM, 10 \mug/ml de
aprotinina, 10 \mug/ml de leupeptina, pH 7,4. La solución de
sobrenadante después de centrifugación durante 1 hora a 147.000 x g
se reajustó hasta pH 7,4 con base Tris 3 M y después se almacenó a
-70ºC antes de la purificación.
GST - MLK3_{KD} baculoviral parcialmente
purificado se preparó mediante cromatografía de afinidad sobre
glutatión. Para 10 ml de extracto celular (26,6 mg de proteína
total), se añadió 1 ml de resina de glutatión Sefarosa 4B
(Pharmacia) equilibrada en HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 (tampón
C) y la proteína se dejó que se uniera durante 45 minutos a 4ºC. la
resina se lavó después en formato de columna con 30 volúmenes de
columna, después de eluyó con 5 volúmenes de columna de tampón C
que contenía glutatión 20 mM. El producto final reunido se dializó
durante toda una noche contra tampón C y se almacenó en alícuotas a
-70ºC.
FLAG - MLK3_{KD}baculoviral parcialmente
purificado se preparó mediante cromatografía de afinidad de
anticuerpo. Proteína de 15 ml de extracto (19,5 mg, de proteína
total) con NaCl 0,1 M adicional en 0,25 ml de columna de anticuerpo
de péptido FLAG monoclonal M2 acoplado a resina de agarosa (Sigma)
mediante carga repetida (un total de tres veces). La resina se había
equilibrado con un lavado de 5 volúmenes de columna de Tris - HCl 50
mM, 150 mM, pH 7,4 (TBS), un lavado de 3 volúmenes de columna de
glicina 0,1 M, pH 3,5, seguido de otro lavado de 5 volúmenes de
columna con TBS, antes de cromatografía. La proteína recombinante se
eluyó principalmente mediante 5 volúmenes de columna de péptido FLAG
0,2 mM (N - Asp - Tyr - Lys - Asp - Asp - Asp - Asp - Lys - C) (SEC
ID Nº 18) en TBS. La proteína se almacenó en alícuotas a -80ºC antes
del ensayo.
La línea celular PC - 12 derivada de un tumor de
feocromocitoma de rata se ha usado extensivamente como un modelo de
células neuronales para examinar los casos moleculares que conducen
a muerte neuronal (para revisión, véase, Troy, y col., Adv.
Neurology, 1997, 103 - 111). El factor de crecimiento
nervioso (NGF) induce células PC - 12 para diferenciar se en
fenotipo neuronal simpático (Greene, Cell Biol, 1978,
78, 747 - 755). Las células PC - 12 diferenciadas de NGF son
dependientes de NGF para supervivencia y experimentan una muerte
apotópica descrita morfológicamente tras la retirada de NGF del
medio de cultivo. Se desarrolló un sistema celular para determinar
el efecto de miembros de la familia de la quinasa de linaje mixta
sobre muerte de células PC - 12 después de la retirada de NGF.
Células PC - 12 se transfectaron con ADNc que codifica un mutante
dominante negativo (DN) de MLK - 3 que usa sistema de transferencia
de lípido Pfx como recomienda el fabricante (Invitrogen, Carlsbad,
CA). Un conjunto estable de transfectante que expresa
DN-MLK-3 se seleccionó usando G418
sulfato (Mediatech Inc, Rendón, VA). Aproximadamente 30% de células
en estos conjuntos expresa MLK3 DN como se determina mediante
inmunoquímica. Los conjuntos de células que expresan establemente
la quinasa mutante se sembraron en placas de formato de 96 pocillos
de cultivo de tejido recubiertas con poliornitina/laminina (10
\mug/ml de cada uno en solución salina tamponada con fosfato) a
una densidad de 2 x 10^{4} células /pocillo y se trataron 100
ng/ml de NGF durante 7 días. Se retiró el medio que contenía el
NGF, la monocapa de células se lavó con solución salina tamponada
con fosfato que contenía anticuerpo de NGF neutralizante (nº de
catálogo N6655; Sigma, San Luis, mO) a uan dilución final de 1:1000
se reemplazó durante 1 - 5 días. La viabilidad celular se
cuantificó mediante un ensayo de viabilidad celular usando la
conversión de la sal tetrazolio, MTS, a un formazán coloreado que
se leyó a uan absorbancia de 570 m sobre un CytoFluor 2350
(JMillipore, Bedford, MA) según recomienda el fabricante (Promega,
Madion, WIU). Los conjuntos estables que expresan DN - MLK3 se
rescataron parcialmente a partir de la muerte celular producida por
la retirada de NGF (figura 10).
Con el fin de demostrar que la proteína MLK
expresada en el sistema de expresión bien de baculovirus o
bacteriano es enzimáticamente activo, se pueden usar varios formatos
de ensayo. La proteína MLK puede ser una construcción de longitud
completa o un dominio quinasa expresado en un sistema de expresión
bien de baculovirus o bacteriano, El ensayo puede ser baasdo en
anticuerpos tal como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas
(ELISA), fluorescencia en tiempo resuelto (TRF), o polarización de
fluorescencia (FP). El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal
con reactividad hacia fosfoserina, fosfotreonina, o sustrato
específico d fosfo. Como alternativa, un procedimiento no basado en
anticuerpo se puede usar como un ensayo basado en gel radiactiv0o
(véase la figura 11), ensayo de precipitación de ácido
tricloroacético (TCA) de selección múltiple (figura 13, ensayo de
proximidad se centelleo, procedimiento de placa rápida, o ensayo de
filtro de fosfocelulosa (figura 13). El ensayo se puede diseñar
para controlar la fosforilación de un sustrato acoplado a un sistema
de ensayo acoplado utilizando las quinasas cadena abajo en una ruta
de señalización, El sustrato puede ser un sustrato específico tal
como SEK - 1 un sustrato relativamente no específico tal como
proteína básica de mielina (MBP).
La actividad quinasa de MLK - 3 se ensayó
controlando la incorporación de ^{32}P de
[\gamma-^{32}P]-ATP en una
sustancia de MÑLK (por ejemplo, SEK - 1 muertas por quinasa;
proteína básica de mielina). Los 50 \mul de mezcla de ensayo
contenía tampón A (MOPS 20 mM, pH 7,2
\beta-glicerol fosfato 25 mM, EGTA 5 mM,
ortovanadato de sodio 1 mM, ditiotreitol 1 mM), MgCl_{2} 15 mM,
ATP 100 \muM, 10 \muCi de
[\gamma-^{32}P]-ATP, y 0,1
\mug de sustrato de SEK-1 muertas por quinasa
(Stressgen, Ing; S- transferasa - SEK-1 glutatión
unido (GST-SEK-1) se liberó de
perlas de glutatión - agarosa con glutatión 10 mM, pH 8,0) o 25
\mug de MBP (Sigma Chemical Co.). La reacción se inició mediante
la adición de proteína MLK (dominio quinasa o preparación que
contiene dominio tanto de longitud completa como quinasa) o proteína
control. La mezcla se incubó durante 30 minutos a 30ºC. La final de
la reacción se añadió tampón demuestra reductor 2 x. La mezcla de
sometió a ebullición durante 5 minutos, se cargó en bien gel SDS al
12% - PAGE (usando MBP como sustrato) o gel al 8%
(SEK-1 como sustrato). Después de electroforesis, se
secó el gel. La cuantificación de incorporación de fosfato en
sustrato, SEK-1, se realizó sobre un Molecular
Dynamics Phosphorimager (Sunnyvale, CA). Los resultados de lso
experimentos designados APRA mostrar las actividades emzimáticas de
MLK-3 expresada en baculovirus (dominio de longitud
completa marcado con FLAG o quinasa marcado con GST) usando GST -
SEK1 muerta por quinasa o MBp como sustrato se muestran en las
figuras 11A y 11B.
La actividad quinasa se MLK-3
expresada en baculovirus se examinó mediante ensayo de
inmunotransferencia. Los 20 \mul de mezcla de ensayo contenía
tampón A, MgCl_{2} 15 mM, ATP 100 \muM, y 0,1 \mug de sustrato
de SEK-1 muerta por quinasa. la reacción se dejó
que procediera durante 30 minutos a 30ºC, después se inactivó con
10 \mul de tampón de muestra reductor 4 x. La proteínas se
separaron sobre un gel Tris al 8% - glicina y se transfirió
electroforéticamente a membrana Immobilon PVDF. La membrana se
incubó con anticuerpo SEK-1 (Thr 233) específico de
fosfo (New England Biolabs, Inc) seguido de IgG anticonejo marcada
con peroxidasa de rábano picante (Bio - Rad). La detección de las
bandas inmunorreactivas se realizó mediante quimioluminiscencia
potenciada (Amersham). La fosfolilación de GTS -
SEK-1 muerta por quinasa mediante proteína FLAG -
MLK3 (la preparación de baculovirus contenía dominio de longitud
completa y quinasa) se ilustra en al figura 12.
La actividad quinasa de dominio GST -
MLK-3 quinasa expresado bacteriológicamente se
determinó usando el ensayo "en placa" de ácido tricloroacético
Multiscreen de Millipore como describe Pitt, y col., J. Biomol.
Screening, 1996, 1, 47 - 51). Los ensayos se realizaron
en placas de 96 pocillos Multiscreen Durapore (Millipore). Cada 50
\mul de mezcla de ensayo contenía Hepes 20 mM, pH 7,4, MgCl_{2}
20 mM, MnCl_{2} 20 mM, DTT 2 mM, Na_{3}VO_{4} 0,1 mM, 1
\muCi de [\gamma-^{32}P] ATP, y 30 \mug de
sustrato de sustrato de MBP. La reacción se inició añadiendo
proteína MLK y se dejó proceder durante 15 minutos a 37ºC. La
reacción se detuvo con 25 \mul de TCA al 50%. Las placas se
dejaron equilibrar durante 30 minutos a 4ºC, después se lavaron con
TCA al 25% enfriado con hielo. Se añadió cóctel de centelleo a las
placas, y se determinó al radiactividad usando contador de
centelleo Wallac MicroBeta 1450 PLUS. La respuesta de dosis de
proteína frente a la formación de MBP marcada con ^{32}P se
muestra en al figura 13.
El ensayo de quinasa se realizó en 50 \mul de
mezcla de reacción que contenía Hepes 20 mM, pH 7,4, MgCl_{2} 20
mM, MnCl_{2} 20 mM, DTT 2 mM, Na_{3}VO_{4} 0,1 mM, 1 \muCi
de [\gamma-^{32}P] ATP, y 30 \mug de sustrato
de sustrato de MBP. La reacción se inició añadiendo proteína MLK y
se dejó que procediera durante 15 minutos a 37ºC. La reacción se
detuvo con 75 \mul de ácido fosfórico 75 mM. Una alícuota de
solución inactivada se cargó directamente sobre la membrana se
fosfocelulosa (Pierce). Como alternativa, se puede usar la placa
multiscreen de fosfoceliulosa de 96 pocillos (Millipore). Las
membranas se lavaron con H_{3}PO_{4} 75 mM. La MBP fosforilada
marcada con ^{32}P unida se eluyó con tubos de recogida añadiendo
hidróxido sódico 1 M. la radiactividad se determinó mediante un
recuento de Cerenkov en un contador de centelleo Beckman (Somerset,
NJ). la formación de MBP fosforilada con una concentración
creciente de dominio quinasa GST - MLK-3 expresada
bacteriológicamente se muestra en al figura 13.
K-252a (compuesto III - 3; véase
la tabla 4), un metabolito de indazol de especie Nocardia, se
une a una diversidad de serina/treonina y tirosina quinasas
(Ángeles y col., anal. Biochem., 1996, 236, 49 - 55;
Knight, y col., Anal. Biochem., 1997, 247, 376 - 381). Un
ligando K-252a tritiado se usó para determinar la
unión a MLK-3 de longitud completa recombinante
humana a partir de una preparación bruta de células por
baculovirus. [^{3}H]K-252a se marcó
específicamente con tritio en las posiciones 3 y 9 mediante contrato
con productos de investigación NEN (Billerica, MA) y tenía una
actividad específica de 40 Ci/moles. Las reacciones de unión se
realizaron en 1 ml en una placa se 96 pocillos. La mezcla de
reacción contenía tampón MOPS 50 mM, pH 7, NaCl 150 mM, MnCl_{2}
5 mM, BSA 1 mg/ml, DMSO al 1% y [^{3}H]K252a. Las muestras
se llevaron a cabo por triplicado con una concentración de 5
\mug/ml de MLK-3 derivada con baculovirus bruta.
La unión no específica se definió como unión en presencia e K252a
1,2 \muM y se sustrajo de la unión total para proporcionar la
unión específica. A esta dilución 12 - 15% de los conteos totales
estaban unidas no específicamente a proteína y 75 - 85% de estos
conteos estaban específicamente unidas a MLK (figura 14). Todos los
experimentos se realizaron durante dos horas a 4ºC. Los complejos
[^{3}H]K252a/MLK-3 se recogieron sobre
filtros Watman GF/C usando un recogedor Brandel, se lavaron con
tampón MOPS/NaCl frío y se contaron sobre un contador Micro Beta de
Wallac. Un experimento de unión de saturación se realizó para
obtener una K_{d} para K252a. Se muestra un ejemplo de los
resultados de uno de estos experimentos (figura 14). Se obtuvo una
K_{d} de 0,89 nM (límites de confianza: 0,2 a 1,5 nM).
K-252a y derivados de este
compuesto se proporcionaron mediante Kyowa - Hakko. Kogyo Co. Ltd.
(Tokio, Japón) (Kaneko y col., 1997). Los compuestos se disolvieron
en dimetil sulfóxido de calidad de cultivo celular (DMSO) y se
almacenaron en oscuridad a 4ºC. Todas las diluciones de compuestos
se realizaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que
contenía albúmina sérica bovina al 1%. El anticuerpo de
hematglutinina (HA) se compró en BabCO (Richmond, CA). Sustrato
AP-1 (c-jun) se compró en Amersham
(Arlington Heights,
IL).
IL).
Células Cos 7 de riñón de mono verde se
obtuvieron de ATCC, Rockville, Maryland (CLR 1651) y se mantuvieron
en DMEM que contenía suero bovino al 10%, glutamina 2 mM, piruvato 1
mM, penicilina 50 U/ml/estreptomicina a 37ºC en CO_{2} al 10%,
atmósfera de aire al 90%. las células Cos 7 se separaron para
subcultivo añadiendo tripsina al 0,25%.
Se sembraron células Cos 7 a 80% de confluencia y
se transfectaron con 2 \mug cada una de las construcciones de ADNc
usando lipofectamina como recomienda el proveedor (Gibco BRL,
Gaithersburg, MD). Un ADNc de longitud completa de
MLK-3, MLK-2 humanas, o DLK de ratón
o una MLK-1 humana parcial como se ha descrito
anteriormente, y JNK1 humana marcada con Hemaglutinina A,
proporcionada amablemente por J. Silvio Gutkind (NIH, Bethesda, MD),
se subclonaron en el vector ADNpc3 (Invitrogen, San Diego, CA).
Después de 48 horas de transfección, las células se trataron con
DMSO al 0,025% o 500 nM de los compuestos indicados durante 72 horas
seguido de lisis en 0,4 l de tampón Ttritón (Tritón
X-100 al 1%, cloruro sódico 50 mM, Tris 10 mM (pH
7,6), albúmina sérica bovina al 0,1%, pirofosfato sódico 30 \muM,
fluoruro sódico 50 mM, 20 \mug/ml de aprotinina,
fenilmetilsulfnilfluoruro 1 mM, vanadato sódico 1 mM). La actividad
de JNk del lisado se ensayó mediante ensayo de inmunoprecipitación
/quinasa como se describe mas adelante.
Lisado de células Cos 7 se midió para
concentración de proteína usando el kit Micro BCA de Pierce
(Rockford, IL) y cantidades iguales de proteína se
inmunoprecipitaron con el anticuerpo HA durante 1 hora a 4ºC. Los
inmunoprecipitados se sedimentaron mediante centrifugación en una
microcentrífuga durante 20 segundos, se volvió a suspender en tampón
Tritón, se lavó mediante centrifugación 2 veces más, seguido de un
lavado final en tampón quinasa (Hepes 20 mM pH 7,4, MgCl_{2} 20
mM, ditiotreitol 2 mM, vanadato sódico 0,1 mM). El
inmunoprecipitado se volvió a suspender en tampón quinasa que
contenía ATP 1 \muM y 5 \muCi
[\gamma-^{32}P]ATP y sustrato (1
\mug/muestra de AP - 1) y se incubó durante 15 minutos a 30ºC. la
reacción de quinasa se detuvo mediante adición de tampón de muestra
reductor (Laemmli, Nature 1970: 227; 680 - 685). Las muestras se
calentaron hasta 80ºC durante 5 minutos y se cargaron en geles de
SDS al 10% - poliacrilamida. Las proteínas se separaron mediante
electroforesis. El gel se secó y la cuantificación de radiactividad
en el sustrato AP - 1 se realizó en un Molecular Dynamics
Phosphoroimager (Sunnyvale, Ca). Los resultados de los experimentos
en los que MLK-3, MLk-2 y DLK se co
- expresan con HA - JNK1 y se incubaron en ausencia de
K-252a se muestran en las figuras 15A y 15B. Por el
contrario, un derivado del compuesto parentela
K-252a llamado compuesto III - 3 (véase la tabla 4),
que era un inhibidor más selectivo de quinasa, no interfirió con la
ruta JNK activada pot otra MAPKKK cadena arriba de NK, MEKK1
(figura 15C).
Intentos en clones de derivación expresando
constitutivamente la familia MLK no han tenido éxito, sugiriendo que
la sobreexpresión de la MLK puede afectar a la supervivencia
celular (Berrgeron y col., Biochem. Biophys. Res. Commun.,
1997, 231, 153 - 155; Nagata y col., EMBO.,
1998, 17, 149 - 158). Por lo tanto, en el desarrollo de un
ensayo de células enteras para rastreo de casos bioquímicos
inducidos por MLK, se puede requerir una línea celular que contenía
un sistema de expresión inducible modificado por ingeniería
genérica de la quinasa de interés. Por ejemplo, una línea celular PC
- 12 transfectada con un transactivador controlado por
tetraciclina. Cuando las células se transfectaron adicionalmente
con un gen de interés conducido por el promotor inducible
tertO, la expresión de ese gen está estrechamente controlada
por tetraciclina en el medio (Shockett, y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1995, 92, 6522).
Para cuantificar la activación de MLK, se puede
medir la fosforilación de sustratos cadena abajo tales omo MEK4, JNK
o c-jun en formatos de ensayo múltiple como se ha
descrito anteriormente. Otros planteamiento para cuantificar la
activación de MLK en células enteras es usar una actividad
enzimátira reportera tal como el sistema reportero de luciferasa c
- jun comercialmente disponible a través del sistema PathDetect™
(Stratagene, Lajolla, CA). (En este sistema, la línea celular
inducible por tetraciclina se transecta con dos plásmidos. Un
plásmido expresa constitutivamente uan fusión del dominio
transactivador NH2 terminal de jun con el dominio de unión de ADN
GAL4 de levadura (proteína de fusión jun - DBD). El otro plásmido
lleva las secuencias codifcadoras para la luciferasa de luciérnaga
conducida por cinco repeticiones en tándem del sitio de unión de
GAL4. Tras activación de MLK, el sustrato cadena debajo de JNK,
proteína de fusión jun - DBD, se fosforila, se une a los sitios de
unión de GAL, e induce la transcripción del gen de luciferasa. La
luciferasa se ensaya fácilmente en lisadis celulares mediante la
adición de su sustrato (Promega, Madison, WI) y la medición de
quimioluminiscencia.
Se diseccionaron médulas espinales de fetos de
ratas Sprague - Dawley (Charles River Laboratories, Wilmington, MA)
de edad embriónica (E) 14,5 - 15. Se disociaron células solamente de
la parte ventral de la médula espinal, y se enriquecieron
adicionalmente APRA evaluar las neuronas motoras mediante
centrifugación en una etapa de gradiente de metrizamida al 6,5%,
como se ha descrito anteriormente (Henderson, y col., 1993),
y se analizaron para evaluar la pureza mediante la tinción con
anticuerpo receptor de neurotrofina de baja afinidad (IgG - 192,
Boehringer -
Mannheim) (datos no mostrados. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos previamente revestidas con poli-l-ornitina y laminina (5 \mug/ml cada uno) a una densidad de 6 x 10^{4} células/cm^{2} en medio N2 exento de suero químicamente definido (Bottenstein, y col., 1979, anteriormente). Con el fin de separar la unión de efectos de supervivencia, la adición de los compuestos a los cultivos se realizó después de un período de unión inicial de 1 - 3 horas. La supervivencia neuronal se determinó después de 4 días usando calceína AM (Molecular Probes, Eugene, OR) en un ensayo de viabilidad fluorométrica (Bozyczko - Coiné, y col., 1993, anteriormente). Los conteos microscópicos se neuronas se correlacionaban directamente con los valores de fluorescencia relativa. En resumen, medios de cultivo se diluyó en serie en DPBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbeccos) y después se añadió una concentración final de solución madre de calceína AM 6 \muM a cada uno de los 96 pocillos. las placas se incubaron durante 30 minutos a 37ºC, seguido de lavados de dilución en serie en DBPS. La señal fluorescente se leyó usando un fluorímetro de lectura placas de Millipore (Cytofluor 2350) a exciutación = 485 nm y emisión = 538 nm. Para cada placa, el fondo medio derivado de pocillos que recibían calceína AM, pero no conteniendo células, se restó de todos los valores. la linealidad de la señal de fluorescencia se verificó para la concentración y tiempo de incubación para el intervalo de densidades celulares en estos experimentos. Un ejemplo de porcentaje de supervivencia por encima del control de neuronas motoras en presencia de compuestos de ensayo a 250 nM se muestra en la tabla
3.
Mannheim) (datos no mostrados. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos previamente revestidas con poli-l-ornitina y laminina (5 \mug/ml cada uno) a una densidad de 6 x 10^{4} células/cm^{2} en medio N2 exento de suero químicamente definido (Bottenstein, y col., 1979, anteriormente). Con el fin de separar la unión de efectos de supervivencia, la adición de los compuestos a los cultivos se realizó después de un período de unión inicial de 1 - 3 horas. La supervivencia neuronal se determinó después de 4 días usando calceína AM (Molecular Probes, Eugene, OR) en un ensayo de viabilidad fluorométrica (Bozyczko - Coiné, y col., 1993, anteriormente). Los conteos microscópicos se neuronas se correlacionaban directamente con los valores de fluorescencia relativa. En resumen, medios de cultivo se diluyó en serie en DPBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbeccos) y después se añadió una concentración final de solución madre de calceína AM 6 \muM a cada uno de los 96 pocillos. las placas se incubaron durante 30 minutos a 37ºC, seguido de lavados de dilución en serie en DBPS. La señal fluorescente se leyó usando un fluorímetro de lectura placas de Millipore (Cytofluor 2350) a exciutación = 485 nm y emisión = 538 nm. Para cada placa, el fondo medio derivado de pocillos que recibían calceína AM, pero no conteniendo células, se restó de todos los valores. la linealidad de la señal de fluorescencia se verificó para la concentración y tiempo de incubación para el intervalo de densidades celulares en estos experimentos. Un ejemplo de porcentaje de supervivencia por encima del control de neuronas motoras en presencia de compuestos de ensayo a 250 nM se muestra en la tabla
3.
Se diseccionaron cortezas cerebrales de fetos de
ratas de 18 días embriónicas y se digirieron enzimáticamente para
obtener una suspensión de células individuales. Las células se
sembraron a una densidad de 1,56 x 10^{5}/cm^{2} en placas de
cultivo de tejidos de 96 pocillos recubiertos con
poli-ornitina/laminina en medio basal neural exento
de suero que contenía suplementos B27 Las placas se recubrieron con
una solución de poli-ornitina/laminina (8 \mug/ml
cada uno) preparadas en PBS durante al menos 2 horas a 37ºC. Los
días 5 - 7 in vitro, las neuronas corticales se expusieron a
Ac25 -
35 (20 \muM) bien en presencia o en ausencia de compuestos de ensayo. Soluciones madre de Ab25 - 35 (Sigma, San Luis, MO) (1 mM) se prepararon en H_{2}O destilada estéril desionizada. La supervivencia neuronal relativa se determinó a las 48 horas después de la adición de péptidos usando la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) como indicador de la integridad de membrana plasmática/viabilidad celular. LDH se midió usando el kit de detección de citotoxicidad (Boehringer - Mannheim, Indianápolis, IN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos se expresan como porcentaje de inhibición de LDH liberada con relación a cultivos tratados con Ab25 - 35
solo.
35 (20 \muM) bien en presencia o en ausencia de compuestos de ensayo. Soluciones madre de Ab25 - 35 (Sigma, San Luis, MO) (1 mM) se prepararon en H_{2}O destilada estéril desionizada. La supervivencia neuronal relativa se determinó a las 48 horas después de la adición de péptidos usando la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) como indicador de la integridad de membrana plasmática/viabilidad celular. LDH se midió usando el kit de detección de citotoxicidad (Boehringer - Mannheim, Indianápolis, IN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos se expresan como porcentaje de inhibición de LDH liberada con relación a cultivos tratados con Ab25 - 35
solo.
^{1} \begin{minipage}[t]{150mm} El compuesto tiene la fórmula III en la que Z_{1}, Z_{2}, R_{1}, y R_{2} son H; X es CO_{2}CH_{3}; y R es OH. \end{minipage} |
^{2} \begin{minipage}[t]{150mm} El compuesto tiene la fórmula III en la que Z_{1}, Z_{2} son H; X es CO_{2}CH_{3}; R_{1}, y R_{2} son CH_{2}CH_{2}CH_{3}; y R es OH. \end{minipage} |
^{3} \begin{minipage}[t]{150mm} El compuesto tiene la fórmula I en la que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{5}, y R_{6} son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es CH_{2}CH_{2}OAc; R_{4} es CH_{2}CH_{2}(2\text{-}piridilo); y X es CH_{2}. \end{minipage} |
^{4} \begin{minipage}[t]{150mm} El compuesto tiene la fórmula I en la que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{5}, y R_{6} son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es H; R_{4} es CH_{2}CH_{2}(2\text{-}piridilo); y X es CH_{2}. \end{minipage} |
Las neuronas motoras se siembran a una densidad
de 6 x 104 células/cm2 en pocillos de 16 mm de diámetro. Se deja que
las células se adhieran durante 2 horas antes del tratamiento. La
células se trataron con bien DMSO al 0,0125% o compuesto 500 nM
durante 2 horas en medio definido N2. Después las células se
enjuagan con solución salina tamponada con fosfato enfriado con
hielo seguido de lisis en 0,4 ml de tampón Tritón como se ha
descrito anteriormente en el ejemplo 30. El lisado de los cultivos
de las neuronas motoras se normalizó hasta un número de células y se
inmunoprecipitó con anticuerpo JNK1 /nº de catálogo
sc-474) comprado en Santa Cruz Biotechnology (santa
Cruz, CA). La actividad de JNK del inmunoprecipitado se ensayó en
presencia de ^{32}P-ATP y sustrato
c-jun como se ha descrito anteriormente. El perfil
de la actividad inhibidora de los 4 compuestos de ensayo se comparó
en las neuronas motoras y en células Cos 7 que sobreexpresan bien
DLK, MLK-1, MLK-2 o
MLK-3 (tabla 3).
Para determinar si al inhibición de la ruta de
JNK regulada por estas quinasas está correlacionada con compuestos
neurotróficos, los inventores evaluaron el efecto de los compuestos
sobre la actividad de JNK en células Cos 7 que sobreexpresan
HA-JNK y MLK3. Después de un período de transfección
de 48 horas, las células se incubaron con los compuestos a 500 nM
durante 2 horas seguido de lisis celular. El lisado se
inmunoprecipitó y la actividad quinasa se midió como se ha descrito
previamente. Los resultados se reseñaron como porcentaje de
inhibición de muestra control en la que el control es actividad de
JNK en presencia de DMSO. Como se puede observar en la tabla 4, la
mayoría de los compuestos que eran activos en la actividad de ChAT
de la médula espinal y/o del cerebro delantero basal eran potentes
inhibidores de la activación por MLK-3 de JNK.
^{1} El compuesto que tiene la fórmula III en
la que Z_{1} y Z_{2} son H; X es CO_{2}CH_{3}; R_{1} es
NHCONHC_{2}H_{5}; R_{2} es
CH_{2}CH_{2}(2-piridilo); y R es OH.
^{2} El compuesto que tiene la fórmula III en
la que Z_{1} y Z_{2} son H; X es CO_{2}CH_{3}; R_{1} y
R_{2} son CH_{2}OCH_{2}OCH_{2}CH_{3}; y R es OH.
^{3} El compuesto que tiene la fórmula III en
la que Z_{1} y Z_{2} son H; X es CO_{2}CH_{3}; R_{1} y
R_{2} son CH_{2}SCH_{2}CH_{2}; y R es OH.
^{4} El compuesto que tiene la fórmula I en la
que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, y R_{4} son H; B_{1} y
B_{2} juntos representan O; R_{2} es CH_{2}CH_{2}OH; R_{5}
y R_{6} son OCH_{3}; y X es CH_{2}.
^{5} El compuesto que tiene la fórmula I en la
que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{5}, y R_{6} son H;
B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es
CH_{2}CH_{2}OAc; R_{4} es Br; y X es CH_{2}.
^{6} El compuesto que tiene la fórmula I en la
que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{5}, y R_{6} son H;
B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es
CH_{2}CH_{2}OAc; R_{4} es CH_{2}CH_{2}(2-
piridilo); y X es CH_{2}.
^{7} El compuesto que tiene la fórmula I en la
que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, y R_{6}
son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es
CH_{2}CH_{2}OH; y X es CH_{2}.
^{8} El compuesto que tiene la fórmula I en la
que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, y R_{6}
son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es
CH_{2}CH_{2}CH_{2}OH; y X es CH_{2}.
^{9} El compuesto que tiene la fórmula I en la
que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5},
y R_{6} son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; y X es
S.
^{10} El compuesto que tiene la fórmula I en la
que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, y R_{6}
son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es
CH_{2}CH_{2}CH_{2}NHCO(4-(OH)Ph); y X es
CH_{2}.
^{11} El compuesto que tiene la fórmula III en
la que Z_{1}, Z_{2}, R_{1}, y R_{2} son H; X es
CO_{2}(CH_{2})_{4}CH_{3}; y R es OH.
^{12} El compuesto que tiene la fórmula III en
la que Z_{1}, Z_{2}, y R_{1}, son H; R_{2} es CH_{2}OH; X
es CO_{2}CH_{3}; y R es OH.
^{13} El compuesto que tiene la fórmula III en
la que Z_{1} y Z_{2} juntos forman =O; R_{1} y R_{2} son
Br; X es CO_{2}CH_{3}; y R es OH.
^{14} El compuesto que tiene la fórmula I en la
que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{5}, y R_{6} son H;
B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es H; R_{4} es
CH_{2}CH_{2}(2- pirimidilo); y X es CH_{2}.
^{15} El compuesto que tiene la fórmula III en
la que Z_{1}, y Z_{2} son H; R_{1} es Br; R_{2} es I; X es
CO_{2}CH_{3}; y R es OH.
^{16} El compuesto que tiene la fórmula III en
la que Z_{1}, Z_{2}, R_{1}, y R_{2} son H; X es
CO_{2}CH_{3}; y R es OH.
^{17} El compuesto que tiene la fórmula III en
la que Z_{1}, y Z_{2} son H; R_{1} y R_{2} son
CH_{2}CH_{2}SCH_{3}; X es CO_{2}CH_{3}; y R es OH.
^{18} El compuesto que tiene la fórmula I en la
que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{5}, y R_{6}
son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{4} es
CH_{2}CH_{2}(2-piridazinilo); y X es
CH_{2}.
^{19} El compuesto que tiene la fórmula I en la
que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{5}, y R_{6} son H;
B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es H; R_{4} es
CH_{2}CH_{2}(2-piridilo); y X es
CH_{2}.
^{20} El compuesto que tiene la fórmula III en
la que Z_{1}, Z_{2}, R_{1} y R_{2} son H; X es
CO_{2}CH_{3}; y R es OCH_{3}.
^{21} El compuesto que tiene la fórmula I en la
que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, y R_{6}
son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es
(CH_{2})_{3}-NH-C(=O)-3,5-dihidroxifenilo;
y X es CH_{2}.
^{22} El compuesto que tiene la fórmula I en la
que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, y R_{6}
son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es benzoílo;
y X es CH_{2}.
^{23} El compuesto que tiene la fórmula I en la
que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{5}, y R_{6} son H;
B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{4} es
CH=CH-C\equivN; y X es CH_{2}.
La activación de MLK puede conducir a la
inducción de la transcripción de c-jun,
dando como resultado un incremento de la proteína
c-Jun. La cantidad aumentada de proteína
c-Jun se puede medir mediante un ensayo
convencional, identificado como un ensayo de desplazamiento en gel.
Garner, y col., Nucleic Acids Res., 1981, 9, 3047 -
3060, que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia
en su totalidad. Los oligómeros de ADN de doble cadena marcados
radiactivamente, que codifican un sitio de unión a ADN de
c-Jun, se incuban con in extracto celular nuclear
seguido de electroforesis en gel de archilamida y cuantificación del
ADN marcado radiactivamente desplazado a una movilidad más lenta.
Esto representa la parte de ADN que está unida a la proteína
c-Jun y es directamente proporcional a la cantidad
de proteína c-Jun en el extracto.
La activación de las MLK también pueden inducir
la fosforilación c-Jun. Estos se puede detectar
usando anticuerpos que específicamente reconocen la forma
fosforilada de la proteína en sistemas de detección tales. como por
ejemplo, transferencias de Western o ELISA.
Medio L15 de Leibovitz, glucosa, bicarbonato
sódico, tripsina y antibióticos eran de Gibco. Se preparó extracto
muscular como se ha descrito en (Henderson, y col., Nature,
1983, 302, 609 - 611, que se incorpora en esta memoria
descriptiva como referencia en su totalidad. Todos los otros
reactivos eran de Sigma, salvo que se indique de otra manera.
Se aislaron neuronas motoras (embriónicas de 5,5
días) con un procedimiento inmunológico según el procedimiento
expuesto en Bloch - Gallego, y col., Development,
1991, 111, 221 - 232, que se incorpora en esta memoria
descriptiva como referencia en su totalidad, con modificaciones como
se describe en Weng, y col., NeuroReport, 1996, 7,
1077 - 1081, que se incorpora en esta memoria descriptiva como
referencia en su totalidad. Se sembraron neuronas motoras en placas
de cultivo de tejido de 35 mm (Nunc) pre - recubiertas con
poli-DL-ornitina y laminina (1
\mug/ml), Upstate Biotech). El medio de cultivo era L15 con
bicarbonato sódico (22,5 mM), glucosa (20 mM), progesterona (2 x
10^{-8}M), selenito sódico (3 x 10^{-8}M), con albúmina (0,1
mg/ml), insulina (5 \mug/ml), penicilina - estreptomicina, y
suero de caballo al 10% inactivado por calor. El extracto muscular
se suplementó a 30 \mug/ml. El compuesto III - 3 se preparó como
una solución madre 4 mM en DMSO y se almacenó protegido de la luz a
4ºC. La concentración final de DMSO en cultivos tratados y control
era 0,125%.
Los ganglios simpáticos paravertebrales (SG; día
embrional 12 (E12)), ganglios de la raíz dorsal (DRG; E9), y
ganglios filiares (CG; E8) se diseccionaron de embriones de pollo
en el día nembriónico indicado como se describe en Lindsay, y col.,
Dev. Biol., 1985, 112, 319 - 328, que se incorpora en
esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad. Después
de tripsinación y disociación, las suspensiones de células
nerviosas se sembraron en placas de cultivo recubiertas con
poliornitina - laminina en medio de cultivo F14 de Ham, suplementado
con suero de caballo al 10%. Inmediatamente después de sembrar, los
factores de supervivencia se añadieron a las concentraciones
siguientes: factor de crecimiento nervioso (NGF), 20 ng/ml; factor
neurotrofico ciliar (CNTF), 10 ng/ml. Los cultivos se mantuvieron a
37ºC y CO_{2} al 5% en un ambiente humidificado.
Las neuronas se sembraron en placas de cultivo de
35 mm con cuadrículas (Nunc). Áreas seleccionadas de cada placa que
comprenden juntas aproximadamente el 10% de la superficie se
barrieron para evaluar la presencia de células brillantes de fase
inmediatamente después de la siembra y otra vez después de 48 horas
para determinar los porcentajes de supervivencia. La supervivencia
celular se confirmó mediante tinción vital con azul de triptófano
(no mostrado).
Los ganglios se colocaron en placas de 96
pocillos recubiertas previamente con
poli-l-ornitina y laminina (5 \mug
de cada uno/ml de solución salina tamponada con fosfato) en medio
N2 exento de suero (Bottenstein, y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 1979, 76, 514 - 517, que se incorpora en esta
memoria descriptiva como referencia en su totalidad) que contiene
albúmina sérica bovina (BSA) al 0,5% y se mantuvieron durante 48
horas a 37ºC y CO_{2} al 5% en un ambiente humidificado. Los
ganglios tratados recibieron bien compuesto III - 3 250 nM o 20
ng/ml de NGF 2 horas después de la siembra.
Retirada de NGF de cultivos disociados de
neuronas sensibles de ganglios de la raíz dorsal E9 (DGR) y
neuronas de los ganglios simpáticos (SG) E12 les produce que se
sometan a PCD en 48 horas. Estos se evitaron mediante la adición
del compuesto III - 3 al medio de cultivo en el tiempo de la
retirada de NGF. AT 1 \muM, compuesto III - 3 mantenido al 94% de
neuronas del SG y 890% de neuronas de DGR vivas después de 48 horas
(control tratado con NGF: SG 65%, DRG 66%). De manera similar el
compuesto III - 3 promovía la supervivencia de 76% de neuronas de
ganglios ciliares (CG) dependientes de CNTF después de 24 horas (67%
de control tratado cor CNTF). En presencia de suero al 10%, los
efectos de supervivencia del compuesto III - 3 eran dependientes de
concentración, con una meseta alcanzada aproximadamente a 1 \mu
para las tres poblaciones de neuronas (fig. 16 A - C). Las neuronas
supervivientes mostraron crecimiento hacia el exterior de neuritas
extenso con neuritas más gruesas y más curvadas como se compara
con los cultivos control. (Fig. 17 E - H). Después de cuatro días,
la actividad promotora de supervivencia estaba todavía intacta:
DGR: 52% de compuesto III - 3 41% de control tratado con factor de
crecimiento; SG: 83% de compuesto III - 3, 55% de control tratado
con NGF; CG: 58% de compuesto III - 3, 50% de control tratado con
CNTF). En condiciones óptimas, los cultivos se pueden mantener con
compuesto III - 3 durante una semana y más tiempo (no
mostrado).
Neuronas motoras de pollo cultivadas pueden
supervivir extender los procesamientos en presencia de extracto
muscular, mientras que mueren rápidamente en su ausencia. En los
experimentos de los inventores, después de 48 horas, el 65% de las
neuronas motoras sobrevivió en presencia de extracto muscular, en
contraposición al 14% de controles no tratados. En condiciones sin
suero, el, efecto de supervivencia del compuesto III - 3 era máximo
a 300 nM, y era algo mayor (79%) que la inducida por extracto
muscular. La dependencia de la concentración del efecto de
supervivencia del compuesto III - 3 en este sistema es diferente
que en las neuronas periféricas, ya que concentraciones del
compuesto III - 3 superiores 300 mostraron un efecto
progresivamente reducido (fig. 16A). Esto pudiera indicar una
sensibilidad particular de neuronas motoras a algún aspecto de la
actividad del compuesto III - 3. Morfológicamente, las neuronas
motoras rescatadas con el compuesto III - 3 mostraron cuerpos
celulares de brillo de fase y eran capaces de extenderse a neuritas
largas, que parecía ligeramente más gruesas que las inducidas por
extracto muscular (Figura 17). Después de cuatro días en cultivo, el
56% de las neuronas motoras estaban vivas con el compuesto III - 3,
comparado con el 42% con extracto muscular. A 300 nM, las neuronas
tratadas con el compuesto III - 3 sobrevivieron in vitro
durante al menos una semana (no mostrado).
Los resultados de los experimentos anteriores
demuestran que el compuesto III - 3 no solamente promueve la
supervivencia de de neuronas embriónicas de lso sistemas nerviosos
periféricos y central, pero también da como resultado un
crecimiento hacia el exterior de neuritas robusto. Muchas de estas
extensiones parecen ser más gruesas que las generadas en presencia
de factores de crecimiento (comparar la figura 17 A - D con la fig
17 E - H). Este efecto también se observó en el crecimiento hacia
el exterior neurítico generado de ganglios de raíces dorsales
embriónicos cultivados en presencia de 250 nm de compuesto III - 3
(figura 18 C). Las neuritas se desarrollaron en respuesta tanto a
NGF (fig. 18B) como al compuesto III - 3; las generadas por NGF eran
mucho más finas y más ramificadas que las desarrolladas en
presencia del compuesto III - 3 que parecían gruesas y posiblemente
fasciculadas.
El ejemplo presente se describe en detalle en
Glicksman, y col., J. Neurobiol., 1998, 35, 361 -
370, que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia
en su totalidad. En E6, se realizó una ventana en la cáscara de los
huevos de pollo (Spafas, Preston, CT) y se aplicó bien vehículo
(Solutol™ HS 15al 5%, polietilenglicol 660 hidroxiestearato; BASF
Aktiengesellschaft, Ludwigshafen, Alemania (en solución salina
tamponada con fosfato, pH 7,2)) o la dosis especificad del
compuesto III - 3 en el vehículo directamente en el interior de la
membrana corioalntoica vascularizada una vez al día de E6 a E9 como
se describe en Oppenheim, y col., Science, 1991, 251,
1616 - 1617, que se incorpora en esta memoria descriptiva como
referencia en su totalidad). Se sacrificaron los embriones en E10 y
se retiraron sus médulas espinales, se fijaron en solución de
Carnoy (ácido acético glacial al 10%, etanol absoluto al 60%,
cloroformo al 30%), se procesaron para obtener secciones en
parafina en serie, y se tiñeron con tionina. Cada sección 20ª de los
segmentos 1 - 8 se contaron según los criterios previamente
descritos (Clarke, y col., Methods In Cell Biology: Cell
Death 1995, Schwart y Osborne, Eds., Academia Press,
Nueva York, pp. 277 - 321, que se incorpora en esta memoria
descriptiva como referencia en su totalidad.
Ratas Sprague - Dawley preñadas sin un tiempo de
embarazo determinado se obtuvieron de Laboratorios Harlan
(Indianápolis, IN). Crías de rata hembras se inyectaron
diariamente, por vía subcutánea (SC), sobre los músculos perineales
diana, con el compuesto III - 3 en Solutol™ HS 15 al 5% o vehículo
junto comenzando el día del nacimiento (P1) y continuando durante 5
días (P5). En P10 o P60, las crías se decapitaron, se recogió
sangre en tubos capilares heparinizados, y la región de la médula
espinal que contenía núcleo espinal sexualmente dimórficos del
bulvo cavernoso (SNB) y el área perineal que contenía el bulbo
cavernoso (BC) y músculos del levator ani (LA) se diseccionaron
después de la perfusión de los animales con solución
salina/formalina. La región de la médula espinal que contien el SNF
se fijó posteriormente, se embebió en Paraplast, se seccionaron a 10
\mum, y se tiñeron con violeta Ceresylech (Noordeen, y col.,
Science, 1995, 229, 671 - 673, que se incorpora en
esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad). Las
neuronas motoras se contaron a x 500 en secciones en serie desde la
región lumbar 5 a la sacra 1 de la médula espinal como se ha
descrito previamente (Nordeen, y col., anteriormente). La
enumeración microscópica se realizó en secciones codificadas por un
observador ciego para los grupos de tratamiento. Los recuentos de
neuronas motoras se corrigieron para el tamaño de células y espesor
de la sección (Konisgsmark, Contemporary Research Methods
in Neuroanatomy, Nauta y Ebbessson, Eds., 1970, Springer
- Verlag, Nueva York, pp. 315 - 340, que se incorpora en esta
memoria descriptiva como referencia en su totalidad) y análisis
estadístico era por análisis de varianza de una vía (ANOVA). la
musculatura perineal se fijó posteriormente, se descalcificó, se
embebió en Paraplast, se seccionó a 10 \mum y se tiñó con
Tricromo de Milligan. Usando microscopía de campo brillante (x
250), músculos BC y LA en hembras normales y tratadas con el
compuesto III - 3 (450 animales por grupo) se identificaron
positivamente por tanto su localización como en presencia de fibras
estriadas. La estructura del tejido muscular se trazó a partir de
las secciones alternativas que usan un microscopio de proyección
(62,5), y el área de sección transversal se midió usando una
almohadilla de digilitación y un sistema morfométrico basado en
ordenador (Sigmascan, Jandel Scientific). Se calculó el volumen
muscular tomando el total de área de sección transversal y
multiplicándolo por el espesor de la sección, y se corrigió para el
porcentaje de la estructura muestreada.
La sangre recogida se centrifugó durante 5
minutos a temperatura ambiente; después, se retiró el plasma y se
congeló a -20ºC. Los niveles de testosterona en suero (6 - 7
animales/grupo) se midieron mediante radioinmunoensayo siguiendo
los procedimientos expuestos en Wingfield, y col., Steroids,
1975, 26, 311 - 327, que se incorpora en esta memoria
descriptiva como referencia en su totalidad.
El nervio hipoglosal izquierdo se transfectó en
el cuello de ratas adultas hembras Sprague - Dawley (120 - 180 g)
bajo anestesia de Neumbutol, y 50 \mul del compuesto III - 3 o su
vehículo (Solutol™ HS 15 al 5%) se aplicaron a una pieza de
Gelfoam™ (AJ Buck, Owings Mills, MD), después se envolvieron
alrededor del extremo proximal del nervio transfectado. Después de
7 días, lso animales se anestesiaron y se prefundieron con
paraformaldehído al 4% en tampón Sorenson, fosfato 0,07 M, pH 7,2.
El tronco cerebral se retiró y se cortaron secciones coronales en
serie de 40 \mum en un criostato (Chiu, y col.,
NeuroReport, 1994, 5, 693 - 696, que se incorpora en
esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad). Cada
quinta sección se procesó para evaluar la inmunohistoquímica de ChAT
como se ha descrito previamente (Chiu, y col., J. Com.
Nerol., 1993, 328, 351 - 363, que se incorpora en esta
memoria descriptiva como referencia en su totalidad) usando una
dilución 1:350 de un anticuerpo monoclonal anti - ChAT obtenido de
Chemicon. Las células que se tiñeron claramente en los antecedentes
anteriores se contaron en las secciones teñidas; el número de
células enumeradas se expersó como la relación del número de
células ChAT - inmunorreactivas en el lado axomotizado del núcleo
hipoglosal frente al número de células inmunorreactivas en el lado
control (no lesionado).
El compuesto III - 3 rescató neuronas motoras de
embrión de rata de la muerte apoptópica in vitro e inhibió
una ruta de señalización que da como resultado la activación de
JNK1 en esta células (Maroney, y col., J. Neurosci.,
1998, 18, 104 - 111, que se incorpora en esta memoria
descriptiva como referencia en su totalidad). Para determinar la
actividad potencial in vivo, el compuesto III - 3 se ensayó
en dos modelos de muerte de neuronas motoras programadas
desarrolladamente regulada y en un modelo de diferenciación inducido
por axotomía en neuronas motoras adultas. En pollo, aproximadamente
el 50% de las neuronas motoras de la médula espinal padecen PCD
durante E5 - 10 (Hamburger, y col., J. Neurosci.,
1982, 1, 38 - 55; Purves, y col., Body and Brain: A
Trphic Theory of Naural Connections, 1988, Harvard
University Press, Cambridge, MA, los cuales se incorporan en esta
memoria descriptiva como referencia en su totalidad). La aplicación
del compuesto III - 3 a la membrana corialantoica durante este
período evitaban la muerte de las neuronas motoras de una menra
dependiente de la dosis (fig. 19). El cuarenta por ciento de las
neuronas motoras que morirían normalmente se rescataron a las dosis
más altas ensayadas (2,3 y 7 \mug/día), mientras que el 25% de
las neuronas motoras se rescataron a dosis más bajas (1,2 y 1,8
\mug/día) (fig. 19).
Durante la vida perinatal temprana de las ratas
hembras (el estado embriónico tardío hasta el día postnatal (PN)
a), más del 50% de las neuronas motoras en el SNB se eliminan
mediante PCD (Beedlove, J. Neurobiol., 1986, 17, 157
- 176, que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia
en su totalidad). En machos, las neuronas motoras en este núcleo
inervan los músculos del pene estriados implicaban los reflejos
copuladores I. La secreción testicular de esteroides androgénicos
reduce la muerte de neuronas motoras de SNB en machos previene mucha
de la atrofia de los músculos BD y LA inervados por las neuronas.
La administración de testosterona a crías hembras dan como
resultado un número completamente masculino de neuronas motoras de
SNB (noorden, y col., anteriormente) y prevenía la atrofia muscular
de BC y LA (Waiman, y col., Endocrinology, 1941, 29,
955 - 978) que se incorpora en esta memoria descriptiva como
referencia en su totalidad). La administración SC diaria del
compuesto III - 3 (PN 1 - 5) a ratas hembra atenuaba
significativamente la muerte de neuronas motoras (Fig. 20 A). El
rescate de muerte de las neuronas motoras de SNB por el compuesto
III - 3 se produjo a dos dosis (0,5 y 1 mg/kg al día). A las dosis
más máximas eficaces de 0,5 y 1 mg/kg al día, la administración del
compuesto III - 3 dio como resultado un 70% de aumento de la
supervivencia de las neuronas motoras que igualó el efecto de la
testosterona (fig. 20 A). El compuesto III - 3 no alteró los
niveles de testosterona en plasma de hembras tratadas. Las
mediciones radio inmunes de testosterona en plasma en el grupo de 1
mg/kg al día dio como resultado ninguna diferencia significativa
cuando se compara con el grupo control de vehículo (0,016 \pm
0,008 ng/ml) y 0,029 \pm 0,015 ng/ml de error estándar de la
media (E. T. M.), respectivamente).
Para determinar si el tratamiento con el
compuesto III - 3 era eficaz en el mantenimiento a largo plazo de la
supervivencia de neuronas motoras, se trataron las hembras con el
compuesto III - 3 (0,5 y 1 mg/kg al día) durante el mismo período
de tiempo PN (1 - 5). La mitad de los animales en el grupo del
vehículo y ambos grupos de tratamiento se sacrificaron el PN 10.
Los animales restantes se mantuvieron después sin tratamiento
adicional del compuesto III -
3 hasta sacrificio en PN60. Como se ha observado previamente (figura 20 B). Además, el 100% de estas neuronas motoras rescatadas eran identificables morfológicamente 55 días después del último tratamiento con el compuesto III - 3 (figura 20 B). La inhibición por el compuesto III - 3 de la muerte de las neuronas motoras durante el período neonatal permitió la supervivencia de las neuronas motoras en la edad adulta.
3 hasta sacrificio en PN60. Como se ha observado previamente (figura 20 B). Además, el 100% de estas neuronas motoras rescatadas eran identificables morfológicamente 55 días después del último tratamiento con el compuesto III - 3 (figura 20 B). La inhibición por el compuesto III - 3 de la muerte de las neuronas motoras durante el período neonatal permitió la supervivencia de las neuronas motoras en la edad adulta.
A pesar de la clara demostración y efectos
asoladores de la pérdida de neuronas motoras en enfermedad de seres
humanos adultos tales como neuronas motoras de adultos con
esclerosis lateral amiotrófica en al mayoría de los modelos
animales de lesión de neuronas motoras son resistentes a muerte. Sin
embargo, la lesión axonal no da como resultado cambios morfológicos
(Oppenheim, y col., anteriormente) como bioquímicos (Oppenheim, y
col., anteriormente; Rende, y col., J. Com. Neurol., 1992,
319, 285 - 298, que se incorpora en esta memoria descriptiva
como referencia en su totalidad; (Chiu, y col., J. Com.
Neurol., 1993, 328, 351 - 363, que se incorpora en esta
memoria descriptiva como referencia en su totalidad) en neuronas
motoras adultas que pueden imitar cambio degenerativo que precede a
la muerte en neuronas motoras enfermas y degenerativas. un ejemplo
de este tipo de cambio se produce de la axotomía del nervio
hipoglosal que inerva la lengua. La sección transversal de este
nervio en la rata adulta dio como resultado la pérdida de 95% de
las neuronas motoras hipoglosales ChAT - inmunorreactivas en el
núcleo ipsilateral después de 7 días (Chiu, y col.,
NeuroReport, 1994, 5, 693 - 696, que se incorpora en
esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad). La
pérdida de inmunorreactividad ChAT no era permanente. Cuatro
semanas después de axotomía, el 100% de las neuronas motoras había
recuperado los niveles de control de la inmunorreactividad ChAT
(Borke, y col., J. Neurocytol., 1993, 22, 141 - 153,
que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su
totalidad). La inmunorreactividad ChAT en las neuronas motoras
hipoglosales contralaterales no estaba afectada (Chiu y col.,
anteriormente) (figura 21 y tabla 5).
Cuando se aplicó en Gelfoam™ al extremo proximal
del nervio hipoglosal, atenuó dependientemente de la dosis del
compuesto III - 3 el descenso en al inmuunorreactividad ChAT en las
neuronas motoras hipoglosales ipsilaterales valoradas 7 días
después de la axotomía. La dosis máxima eficaz (50 \mug) dio como
resultado 40% más de neuronas motoras ChAT - inmunorreactivas
comnparado con las axotomizadas, control no tratado (figura 21 B y
tabla 5). había una dependencia de la dosis en forma de campana con
tanto las dosis bajas como las altas que dan como resultado una
supervivencia mayor que el control no tratado, pero menos que la
lograda a 50 \mug. Como era verdad con el modelo de SNB, no
estaba asociada a la pérdida de peso, mortalidad, o enorme daño
tisular en estos animales a cualquiera de las dosis ensayadas.
En tres modelos separados de degeneración de
neuronas motoras in vivo, actividad neuroprotectora
demostrada por el compuesto III - 3: PCD regulada desarrolladamente
de neuronas motoras de la médula espinal lumbar en embriones
(figura 19), muerte sensible a andrógenos de neuronas motoras de SNB
(figura 20), y pérdida inducida por axotomía de un marcador
funcional, ChAT, en neuronal motoras hipoglosales adultas (figura
21 y tabla 5). El compuesto III - 3 era eficaz cuando se
administraba periféricamente mediante inyección SC, aplicado
localmente al extremo de corte de un nervio, o superpuesto en una
membrana corioalantoica de embrión de pollo. En contraposición a la
molécula precursora K - 252a, el compuesto III - 3 era
aproximadamente cinco veces más potente en la mediación de la
supervivencia en los cultivos enriquecidos de neuronas motoras
(datos no mostrados) y no mostraron actividad inhibidora frente a la
tirosina quinasa taka y varias serina treonina quinasas (Maroney y
col., anteriormente; Kaneko, y col., J. Med. Chem.
1997, 40, 1863 - 1869, que se incorpora en esta memoria
descriptiva por referencia en su
totalidad).
totalidad).
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ \begin{minipage}[t]{145mm} El compuesto III - 3 o vehículo se añadieron en espuma de gel al extremo proximal del nervio hipoglosal inmediatamente después de su transfección. Después de 7 días, se sacrificaron los animales se seccionaron en serie a través del núcleo hipoglosal, y cada quinta sección se inmunotiñó con anticuerpos anti - ChAT. Los recuentos de las neuronas ChAT positivas se realizaron en los lados ipsilaterales (experimental) y contralaterales (control) del núcleo.\end{minipage} \cr * p < 0,05, comparado estadísticamente con los animales tratados con vehículo control\cr}
Se administró a una dosis (40 mg/kg) que produce
pérdida de terminales dopaminérgicos estriados en cuerpos de las
células en la sustancia negra. La tirosina hidroxilasa se usó como
un marcador para terminales del nervio dopaminérgico en la
sustancia negra. El compuesto III - 3 administrado sistemáticamente
atenuaba la pérdida de las neuronas tirosina hidrolasa
inmunorreactivas de la sustancia negra después de la lesión de MPTP
(figura 22 a; Saporito y col., 1999). Ya que el compuesto III - 3
es un inhibidor conocido de MLK3, la activación del sustrato hacia
abajo e MLK3 se midió en ratones tratados con MPTP. Los niveles de
MKK4 fosforilada se midió usando anticuerpo anticuerpo específico
fosfo - MKK4 (New England Biolabs, Beverly, MA) que reconoce la
forma monofosfosforilada de MKK4 bien mediante inmunotransferencia
(figura 22b) 9 ELISA (figura 22c c). La administración de MPTP
elevó los niveles de MKKK4 en la sustancia negra hasta 5 veces más
sobre los niveles control (figura 22 b). Las elevaciones máximas se
produjeron 4 horas después de al administración de MPTP y coincidía
con los niveles del SNC máximos de MPP^{+} La fosforilación de
MKK4 mediada por MPTP se atenuó mediante tratamiento previo con
l-deprenil, indicando que estos casos de
fosforilación estaban mediados por MPP^{+} (fig. 22 c). Además, la
fosforilación de MKK4 estaba parcialmente inhibida con el
tratamiento previo del compuesto III - 3 a una dosis (1 mg/kg) que
produce protección contra la pérdida dopaminérgica nigroestriada
inducida por MPTP (figura 22 c). Estos datos demuestran que MPTP
(MPP^{+}) activa MKK4, un sustrato hacia abajo de MLK3. Además,
estos datos demuestran que un inhibidor conocido de MLK3, inhibe la
activación de esta ruta de quinasa in vivo.
Se eligieron células del sistema inmune ya que
muchas quinasas están implicadas en la regulación de numerosas
funciones inmunológica, por ejemplo, la inducción de la síntesis de
citocinas y la inducción de una respuesta biológica de citosina.
Una reciente reseña (Hambleton, y col., Proc. Natl.Acad. Sci.
USA 1996, 93, 2774 - 2778, que se incorpora en esta
memoria descriptiva como referencia en su totalidad) mostraba que el
tratamientote líneas celulares derivadas de monocitos con LPS
producía una rápida activación de actividad de JNK. Cuando los
monocitos se ponen en contacto con endotoxinas tales como
lipopolisacáridos (LPS) producen que las citocinas inflamatorias,
IL-1 y TNF-\alpha. La inhibición
de la producción de estas dos citocinas puede ser un tratamiento
útil de ciertos trastornos inflamatorios del sistema inmune. Estas
citocinas se pueden medir fácilmente mediante kits ELISA
comerciales. Los inventores diseñaron experimentos para determinar
(1) si los indolo - y pirrolocarbazoles pueden inhibir la síntesis
de IL-1 y TNF-\alpha en una línea
celular de monocitos de los inventores THP-1, (2)
si JNK esta activada por LPS en células THP-1, y
(3) si la activación de JNK por LPS se puede inhibir por indolo - y
pirrolocondensados.
Se desarrollaron células THP-1 en
medio RPMI 1640 suplementado con suero fetal bovino al 10%. LPS
(E. coli serotipo 0111.B14, extraído con TCA) se compro en
Sigma y se disolvió en PBS. Se compraron kits ELISA para ensayar
IL-1 y TNF-\alpha se compraron en
Boerhinger - Mannheim y se realizaron ensayos sobre medio de
cultivo THP-1 como indica el fabricante. Se
obtuvieron curvas patrones según las indicaciones con cada
ensayo.
Se realizaron experimentos en placas de cultivo
de 12 pocillos con bien 1 ó 2 ml de células THP-1 a
4 x 10^{4} células /ml. Se indujeron IL-1 y
TNF-\alpha mediante la adición de LPS al medio de
cultivo y se recogió el medio a diversos tiempos posteriormente
para ensayo de citosina. Se retiraron células mediante
centrifugación y se congelaron los sobrenadantes a -70ºC hasta
ensayo. Para minimizar los costes de los experimentos se realizaron
cultivos por duplicado y los sobrenadantes duplicados se reunieron
después de la centrifugación. Cada sobrenadante reunido se ensayó
por duplicado. Soluciones madre de indolo- y pirrolocarbazoles
condensados en DMSO al 100% se diluyeron hasta las concentraciones
deseadas en bien medio que contenía suero bovino fetal al 10% o
medio que contenía 0,5 mg/ml de BSA. Salvo que se indique otra cosa,
los compuestos se añadieron a las células THP-1 1
hora antes de la adición de LPS.
Se realizaron ensayos para evaluar la actividad
de JNK después de inmunoprecipitar la proteína de JNK de un
extracto de células THP-1 lisadas. Las células
THP-1 lisadas sobre hielo durante 15 minutos en 500
\mul de tampón Frac (Tris - HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM,
pirofosfato de sodio 30 \muM, 1 mg/ml de BSA, Tritón - X - 100 al
1%). El extracto se centrifugó durante 10 minutos a 14 K y se
añadieron 5 \mul de anticuerpo JNK (Santa Cruz) al sobrenadante.
El extracto se centrifugó durante 60 minutos a 4ºC, se añadieron
75\mul de proteína A Sefarosa lavada (20% p/v en Frac) y el
extracto se centrifugó otros 30 minutos para unir e complejo
anticuerpo a la proteína A Sefarosa. La proteína A Sefarosa se lavó
dos veces con tampón Frac, una vez con Hepes 20 mM, pH 7,6,
MgCl_{2} 20 mM, DTT 2 mM, después se incubó durante 15 minutos a
30ºC en 30 \mul de tampón quinasa (Hepes 20 mM, MgCl_{2} 20 mM,
DTT 2 mM, 1 pH 7,6, g de c-jun recombinante, y
ATP-\gamma-^{32}P, 2 pH 7,6, Ci.
La reacción se terminó mediante la adición de 10 pH 7,6,l de tampón
de carga gel SDS 4 X, se calentó durante 3 minutos a 80ºC, y las
proteínas se analizaron sobre un gel de SADS al 10%. El gel se
secó, se unió a un placa Phosphorimager, y las bandas radiactivas
se analizaron sobre una Phosphorimager.
Los resultados de los experimentos iniciales
indicaban que a 2 pH 7,6 g/ml proporcionaron el máximo rendimiento
de IL-1 y esta concentración de LPS se usó en todos
los experimentos posteriormente. El tiempo mínimo después de la
adición de LPS para un rendimiento máximo de las citocinas se
determinó tomando alícuotas de medio para ensayo a diversos tiempos
después de la adición de LPS. El primer experimento indicó que tanto
IL-1 como TNF-\alpha alcanzaban
el máximo rendimiento en menos de 5 horas después de al adición de
LPS. Ya que el tiempo de recolección más temprano era 2,4 horas en
el primer experimento, un segundo experimento se realizó con
recogidas de medio partiendo de 15 minutos después de la adición de
LPS. El resultado de este experimento donde solamente
TNF-\alpha se ensayó mostró que alcanzaba un
máximo rendimiento a las 3 horas después de la adición de LPS. No se
encontró TNF-\alpha significativo en el medio
hasta 90 minutos después de la adición de LPS.
Las rápida consecución de rendimiento máximo
indicó una regulación estrecha de al síntesis de las 2 citocinas y
una rápida regulación hacia abajo. Los cultivos de las células se
trataron durante 30 minutos antes de la adición de LPS con bien
Actinomicina D, un inhibidor de la síntesis de ARN, o
cicloheximida, un inhibidor de la síntesis de proteína. Se recogió
medio 3 horas después de la adición de LPS y se ensayó
TNF-\alpha. Tanto la síntesis de ARN como de
nueva proteína se requieren para la inducción de
TNF-\alpha. ya que se encontró
TNF-\alpha en el medio de células tratadas con
cualquier inhibidor. Los siguientes experimentos se realizaron para
determinar si el compuesto III - 3 inhibiría la inducción de
IL-1 y TNF-\alpha. El compuesto
III - 3 inhibía la inducción de tanto IL-1 como
TNF-\alpha con valores de CI_{50} de 267 nM y
139 nM respectivamente. Los resultados de estos experimentos se
obtuvieron con células en medio que contenía suero bovino fetal al
10%. ya que los ensayos con tejido de médula espinal y tejido de
cerebro delantero basal para evaluar la actividad neurotrófica de
los compuestos se realizan en medio sin suero (500 \mug/ml) era
de interés para determinar los valores de CI_{50} para la
inhibición de la IL-1 y TNF-\alpha
en medio sin suero. Cuando las células THP-1 se
trataron con el compuesto III - 3 en medio sin suero (500
\mug/ml) los valores de CI_{50} se redujeron 10 veces más de
269 nM a 233 nM. Salvo que se establezca otra cosa todos los
experimentos realizados de aquí en adelante se realizaron en medio
sin suero. La inhibición del compuesto III - 3 de la inducción de
IL-1 y TNF-\alpha en células
THP-1 sugiere que el compuesto III - 3 podría ser
útil como agente terapéutico en el tratamiento de afecciones
patológicas producidas por la producción de cantidades normales
anteriores de estas citocinas. El choque séptico es una de tales
afecciones. El choque séptico se produce por el crecimiento de
bacterias gram negativas en la circulación que a su vez libera
grandes cantidades de la endotoxina LPS. Después la LPS estimula
principalmente los monociitos y macrófagos para producir grandes
cantidades de IL-1 y TNF-\alpha
que después produce daño tisular masivo y en muchos casos la
muerte.
Se ensayaron varios compuestos para evaluar su
capacidad de inhibir el TNF-\alpha y se comparó
con la capacidad de inhibir JNK. Los resultados se muestran en la
tabla 6.
Los experimentos se llevaron a cabo para
determinar si el compuesto III - 3 inhibía la inducción de IL - 2
en células Jurkat.
Se desarrollaron células Jurkat en medio RPMI
1640 suplementado con suero fetal bovino al 10%. El
TNF-\alpha era de Promega y anticuerpos anti CD3
y anti CD28 eran de Pharmigen. Los experimentos de Jurkat se
hicieron en 200 \mul en una placa de 96 pocillos. La IL - 2 se
midió con un kit ELISA comprado de Boehringer Mannheim. Los
anticuerpos para CD3 y CD28 se dejó que se unieran al plástico de
la placa de 96 pocillos (18 horas en POBS) antes de la adición de
las células Jurkat. Las células retrataron con compuestos 1 hora
antes de añadir a la placa recubierta con anticuerpo. Los
anticuerpos CD3 y CD28 se usaron para activar el receptor de las
células T e inducir IL - 2. La IL - 2 se liberó de las células
Jurkat entre 6 y 24 horas después del inicio de la inducción
(figura 23 A). No se preparó ninguna IL -
2 (figura 23 A CNT). El efecto del compuesto III - 3 (1 hora de tratamiento con el compuesto III - 3 antes de la inducción) en la inducción de IL - 2 se ensayó a continuación. (figura 23 B). Una concentración del compuesto III - 3 de 500 nM inhibía la inducción de IL - 2 más de un 80% (figura 23 B). Se realizó un experimento de dosis respuesta más extenso con el compuesto III - 3 y con el compuesto I - 4 que produjo unos valores de CI_{50} de 139 nM para el compuesto III - 3 y 207 nM para el compuesto I - 4 (figura 23 C).
2 (figura 23 A CNT). El efecto del compuesto III - 3 (1 hora de tratamiento con el compuesto III - 3 antes de la inducción) en la inducción de IL - 2 se ensayó a continuación. (figura 23 B). Una concentración del compuesto III - 3 de 500 nM inhibía la inducción de IL - 2 más de un 80% (figura 23 B). Se realizó un experimento de dosis respuesta más extenso con el compuesto III - 3 y con el compuesto I - 4 que produjo unos valores de CI_{50} de 139 nM para el compuesto III - 3 y 207 nM para el compuesto I - 4 (figura 23 C).
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\vskip0.400000\baselineskip
<110> Maroney, Anna
\hskip1cmWalton, Kevin
\hskip1cmKnight, Ernest
\hskip1cmGlicksman, Marcie
\hskip1cmDionea, Craig
\hskip1cmNeff, Nicola
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimientos para modular proteínas
de quinasa de linaje múltiple y compuestos de selección que modulan
proteínas de quinasa de linaje múltiple
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> CEPH0431
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<140>
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<141>
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<160> 18
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<170> PatentIn Ver. 2.0
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<210> 1
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<211> 17
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia novedosa
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<400> 1
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\sa{Cys Gly Gly Ala Thr Cys Cys Ala Cys Met Gly
Ile Gly Ala Tyr Tyr}
\sac{Thr}
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<210> 2
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia novedosa
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<400> 2
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\sa{Gly Gly Ala Ala Thr Thr Cys Cys Ala Trp Ala
Gly Gly Ala Cys Cys}
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<210> 3
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<211> 33
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia novedosa
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<400> 3
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\sa{Cys Gly Gly Ala Thr Cys Cys Arg Thr Ile Cys
Ala Tyr Met Gly Ile}
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Ile Met Gly Ile Ala}
\sac{Ala}
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<210> 4
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia novedosa
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<400> 4
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\sa{Gly Gly Ala Ala Thr Thr Ile Ala Tyr Ile Gly
Gly Ala Trp Ala Ile}
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Ile Ser Trp}
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<212> PRT
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia novedosa
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Glu}
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia novedosa
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia novedosa
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<400> 7
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia novedosa
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<400> 8
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\sa{Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys}
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<210> 9
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\vskip0.400000\baselineskip
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la secuencia
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia novedosa
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<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskipggaattcacc agtaagctcc agcacatc
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<210> 11
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<213> Secuencia Artificial
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<210> 12
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia novedosa
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<400> 12
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\hfill39
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<210> 13
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<211> 8
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia novedosa
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<400> 13
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\sa{Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys}
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<210> 14
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia novedosa
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<400> 14
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\hfill60
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<210> 15
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<211> 18
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia novedosa
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<400> 15
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacagggcgg ccggctct
\hfill18
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<210> 16
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<211> 583
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia novedosa
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<211> 194
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia novedosa
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<212> PRT
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia novedosa
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys}
Claims (70)
1. Un procedimiento para identificar un compuesto
que modula la actividad de una proteína de quinasa de linaje
múltiple y promueve la supervivencia celular o muerte celular, que
comprende las etapas de:
- (a)
- poner en contacto in vitro dicha célula que contiene dicha proteína de quinasa de linaje múltiple con dicho compuesto;
- (b)
- determinar si dicho compuesto incrementa o disminuye la actividad de dicha proteína de quinasa de linaje múltiple ; y
- (c)
- determinar si dicho compuesto promueve la supervivencia celular o muerte celular.
2. El procedimiento de la reivindicación 1 para
identificar un compuesto que promueve la supervivencia celular que
comprende la etapa de determinar si dicho compuesto disminuye la
actividad de dicha proteína de quinasa de linaje múltiple.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 para
identificar un compuesto que promueve la muerte celular que
comprende la etapa de determinar si dicho compuesto incrementa la
actividad de dicha proteína de quinasa de linaje múltiple.
4. El procedimiento según la reivindicación 2, en
el que dicho compuesto puede ser útil en el tratamiento de un
trastorno neurodegenerativo o inflamación.
5. El procedimiento de la reivindicación 2 o
reivindicación 4 en el que dicha proteína se selecciona entre el
grupo constituido por quinasa 1 de linaje múltiple, quinasa 2 de
linaje múltiple, quinasa 3 de linaje múltiple, quinasa que leva
cremallera de leucina, quinasa que lleva cremallera de leucina dual,
y quinasa 6 de linaje múltiple.
6. El procedimiento de la reivindicación 3 en el
que dicha proteína se selecciona entre el grupo constituido por
quinasa 1 de linaje múltiple, quinasa 2 de linaje múltiple, quinasa
3 de linaje múltiple, quinasa que leva cremallera de leucina,
quinasa que lleva cremallera de leucina dual, y quinasa 6 de linaje
múltiple.
7. El procedimiento de la reivindicación 5 o
reivindicación 6 en el que dicha actividad de proteína se determina
por un ensayo de quinasa in vitro o ensayo de unión.
8. El procedimiento de la reivindicación 5 o
reivindicación 6 en el que dicha célula es una célula neuronal.
9. El procedimiento de la reivindicación 5 en el
que dicha actividad de proteína se determina midiendo la actividad o
estado de fosforilación de un sustrato de dicha proteína.
10. El procedimiento de la reivindicación 6 en el
que dicha actividad de proteína se determina midiendo la actividad o
estado de fosforilación de un sustrato de dicha proteína.
11. El procedimiento de las reivindicaciones 9 ó
10 en el que dicho sustrato se selecciona entre el grupo
constituido por JNK1, JNK2, JNK3, ERK1, ERK2, p38\alpha,
p38\beta, p38\gamma, p38\delta, MEK1, MEK2, MKK3, MKK4 (SEK1),
MEK5, MKK6, MKK7, jun, ATF2, ELK1, y el homólogo de mamífero de
AEX-3.
12. El procedimiento de la reivindicación 5 en el
que dicha actividad de proteína se determina midiendo la actividad
de un sustrato de dicha proteína, cantidad de un sustrato de dicha
proteína, o ARNm que codifica dicho sustrato de dicha proteína.
13. El procedimiento de la reivindicación 6 en el
que dicha actividad de proteína se determina midiendo la actividad
de un sustrato de dicha proteína, cantidad de dicha proteína, o ARNm
que codifica dicha proteína.
14. El procedimiento de la reivindicación 5 o
reivindicación 6 en el que dicha promoción de supervivencia celular
se determina usando células en riesgo de morir y comparando la
cantidad de células vivas que estaban en contacto con dicho
compuesto con la cantidad de células vivas que no estaban en
contacto con dicho compuesto.
15. El procedimiento de la reivindicación 5 o
reivindicación 14 en el que dichas células son células de neuronas
motoras embriónicas primarias.
16. El procedimiento de la reivindicación 5 o
reivindicación 14 en el que dichas células sobreexpresan dicha
proteína de quinasa de linaje múltiple.
17. El procedimiento de la reivindicación 5 en el
que dicha promoción de supervivencia celular se determina
observando una disminución de apoptosis.
18. El procedimiento de la reivindicación 6 en el
que dicha promoción de supervivencia celular se determina
observando un incremento de apoptosis.
19. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 5 ó 6 en el que dicha célula está implicada en una
enfermedad neurodegenerativa.
20. El procedimiento de la reivindicación 2 en el
que dicha célula está implicada en inflamación.
21. El uso de un compuesto que tiene la
fórmula:
que inhibe una proteína de quinasa
de linaje múltiple en la fabricación de un medicamento para uso en
el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo o
inflamación,
en al que el anillo B y el anillo F,
independientemente, del otro junto con el los átomos de carbono a
los que están unidos, forman o bien
un anillo aromático carbocíclico de 6 miembros no
saturado en el que entre uno y tres de (de los) átomo(s) de
carbono se reemplaza por átomo(s) de nitrógeno; o
un anillo aromático carbocíclico de 5 miembros no
saturado en el que bien un átomo de carbono se reemplaza con un
átomo de oxígeno, nitrógeno, o azufre.
o
dos átomos de carbono se reemplazan con un átomo
de azufre y uno de nitrógeno, o un átomo de oxígeno y un átomo de
nitrógeno.
A^{1} y A^{2} juntos representan O, y B^{1}
y B^{2} juntos representan O;
R^{1} es H, alquilo de 1 - 4 átomos de carbono
(Inclusive), arilo, arilalquilo, heteroarilo, y heteroarilalquilo;
COR^{9}, en el que R^{9} es alquilo de 1 - 4 átomos de carbono
(inclusive), o arilo, preferiblemente fenilo o o naftilo;
-OR^{10}, donde R^{10} es H o alquilo de 1 - 4 átomos de
carbono (inclusive); -CONH_{2}, -NR^{7}R^{8},
-(CH_{2})_{n}NR^{7}R^{8},en los que n es un número
entero de 1 - 4 (inclusive) o
-(CH_{2})_{n}NR^{7}R^{8}, y bien
R^{7} y R^{8} o independientemente son H o
alquilo de 1 - 4 átomos de carbono (inclusive); o
R^{7} y R^{8} se combinan juntos para formar
un grupo de unión de la fórmula general
-(CH_{2})_{2}-X^{1}-(CH_{2})_{2}-,
el que X^{1} es O, S, y CH_{2};
R^{2} es H, -SO_{2}R^{9}; -CO_{2}R^{9},
-COR^{9}, alquilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusivo),
preferiblemente un alquilo de 1 -
4 átomos de carbono (inclusive), alquenilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive), preferiblemente un alquenilo de 1 - 4 átomos de carbono (inclusive), o alquinilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive), preferiblemente un alquinilo de 1 - 4 átomos de carbono (inclusive); o un monosacárido de 5 - 7 átomos de carbono (inclusive) donde cada grupo hidroxilo del monosacárido independientemente está o bien no sustituido o se reemplaza por H, alquilo de 1 - 4 átomos de carbono (inclusive), alquilcarboniloxi de 2 - 5 átomos de carbono (inclusive) o alcoxi de 1 - 4 átomos de carbono (inclusive); y o bien
4 átomos de carbono (inclusive), alquenilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive), preferiblemente un alquenilo de 1 - 4 átomos de carbono (inclusive), o alquinilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive), preferiblemente un alquinilo de 1 - 4 átomos de carbono (inclusive); o un monosacárido de 5 - 7 átomos de carbono (inclusive) donde cada grupo hidroxilo del monosacárido independientemente está o bien no sustituido o se reemplaza por H, alquilo de 1 - 4 átomos de carbono (inclusive), alquilcarboniloxi de 2 - 5 átomos de carbono (inclusive) o alcoxi de 1 - 4 átomos de carbono (inclusive); y o bien
cada alquilo de 1 - 8 átomos de carbono
(inclusive), alquenilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive), o
alquinilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive) está no
sustituido; o
cada alquilo de 1 - 8 átomos de carbono
(inclusive), alquenilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive), o
alquinilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive) independientemente
está sustituido con 1 - 3 arilo de 6 - 10 átomos de carbono
(inclusive), preferiblemente fenilo o naftilo; heteroarilo, F, Cl,
Br, I, -CN, NO_{2}, -OR^{9},
-O(CH_{2})_{p}NR^{7}R^{8},
-OCOR^{9},
-OCONHR^{9}, O-tetrahidropiranilo, NH_{2}, -NR^{7}R^{8}, -NR^{10}COR^{9}, -NR^{10}CO_{2}R^{9}, -NR^{10}CONR^{7}R^{8}, -NHC(=NH)NH_{2},
-NR^{10}SO_{2}R^{9}, -S(O)_{y}R^{11}, en el que R^{11} es H o alquilo de 1 - 4 átomos de carbono, arilo de 6 - 10 átomos de carbono, preferiblemente fenilo o naftilo, o heteroarilo e y es 1 ó 2; -SR^{11}, -CO_{2}R^{9}, -CONR^{7}R^{8}, -CHO, COR^{9}, -CH_{2}OR^{7}, -CH= NHR^{11}R^{12}, -CH=NOR^{11}, -CH=NR^{9}, -CH=NNHCHCH(N=NH)NH_{2}, -SO_{2}NR^{12}R^{13}, -PO(OR^{11})_{2}, u OR^{14} en el que R^{14} es el residuo de un aminoácido después de que el grupo hidroxilo del grupo carboxilo es retirado;
-OCONHR^{9}, O-tetrahidropiranilo, NH_{2}, -NR^{7}R^{8}, -NR^{10}COR^{9}, -NR^{10}CO_{2}R^{9}, -NR^{10}CONR^{7}R^{8}, -NHC(=NH)NH_{2},
-NR^{10}SO_{2}R^{9}, -S(O)_{y}R^{11}, en el que R^{11} es H o alquilo de 1 - 4 átomos de carbono, arilo de 6 - 10 átomos de carbono, preferiblemente fenilo o naftilo, o heteroarilo e y es 1 ó 2; -SR^{11}, -CO_{2}R^{9}, -CONR^{7}R^{8}, -CHO, COR^{9}, -CH_{2}OR^{7}, -CH= NHR^{11}R^{12}, -CH=NOR^{11}, -CH=NR^{9}, -CH=NNHCHCH(N=NH)NH_{2}, -SO_{2}NR^{12}R^{13}, -PO(OR^{11})_{2}, u OR^{14} en el que R^{14} es el residuo de un aminoácido después de que el grupo hidroxilo del grupo carboxilo es retirado;
y bien
R^{12} y R^{13} independientemente son H,
alquilo de 1 - 4 átomos de carbono (inclusive), arilo de 6 - 10
átomos de carbono, preferiblemente fenilo o naftilo, o heteroarilo;
o
R^{12} y R^{13} se combinan juntos para
formar un grupo de unión, preferiblemente
-(CH_{2})_{2}-X^{1}-(CH_{2})_{2},
cada R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} es
independientemente H, arilo, preferiblemente un arilo de 6 - 10
átomos de carbono (inclusive), más preferiblemente fenilo o
naftilo; heteroarilo; F, Cl, Br, I, -CN, CF_{3}, -NO_{2}, -OH,
-OR^{9}, -O(CH_{2})_{n}NR^{7}R^{8},
-OCOR^{9}, -OCONHR^{9}, NH_{2}, -CH_{2}OH, -CH_{2}OR^{14}, -NR^{7}R^{8}, -NR^{10}COR^{9}, -NR^{10}CONR^{7}R^{8}, -SR^{11}, -S(O)_{y}R^{11} en el que y es 1 ó 2; -CO_{2}R^{9}, -COR^{9}, -CONR^{7}R^{8}, -CHO, -CH=NOR^{11}, -CH=NR^{9}, -CH=NNR^{11}R^{12}, -(CH_{2})_{n}SR^{9}, en el que n es un número entero de 1 - 4 (inclusive), -(CH_{2})_{n}S(O)_{y}R^{9}, -CH_{2}SR^{15} en el que R^{15} es alquilo de 1 - 4 átomos de carbono (inclusive); -CH_{2}S(S(O)_{y}R^{14}, -(CH^{2})_{n}NR^{7}R^{8}, -(CH_{2})_{n}NHR^{14}, alquilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive), preferiblemente alquilo de 1 - 4 átomos de carbono (inclusive); alquenilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive), preferiblemente alquenilo de 1 - 4 átomos de carbono (inclusive); alquinilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive), preferiblemente alquinilo de 1 - 4 átomos de carbono (inclusive); y o bien cada alquilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive), alquenilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive) o alquinilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive) esta no sustituido; o
-OCOR^{9}, -OCONHR^{9}, NH_{2}, -CH_{2}OH, -CH_{2}OR^{14}, -NR^{7}R^{8}, -NR^{10}COR^{9}, -NR^{10}CONR^{7}R^{8}, -SR^{11}, -S(O)_{y}R^{11} en el que y es 1 ó 2; -CO_{2}R^{9}, -COR^{9}, -CONR^{7}R^{8}, -CHO, -CH=NOR^{11}, -CH=NR^{9}, -CH=NNR^{11}R^{12}, -(CH_{2})_{n}SR^{9}, en el que n es un número entero de 1 - 4 (inclusive), -(CH_{2})_{n}S(O)_{y}R^{9}, -CH_{2}SR^{15} en el que R^{15} es alquilo de 1 - 4 átomos de carbono (inclusive); -CH_{2}S(S(O)_{y}R^{14}, -(CH^{2})_{n}NR^{7}R^{8}, -(CH_{2})_{n}NHR^{14}, alquilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive), preferiblemente alquilo de 1 - 4 átomos de carbono (inclusive); alquenilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive), preferiblemente alquenilo de 1 - 4 átomos de carbono (inclusive); alquinilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive), preferiblemente alquinilo de 1 - 4 átomos de carbono (inclusive); y o bien cada alquilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive), alquenilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive) o alquinilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive) esta no sustituido; o
cada alquilo de 1 - 8 átomos de carbono
(inclusive), alquenilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive) o
alquinilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive) está sustituido
como se describe en (d) (2) de la reivindicación 58;
X es o bien alquileno no sustituido de 1 - 3
átomos de carbono (inclusive); o
X es alquileno de 1 - 3 átomos de carbono
(inclusive) sustituido con un grupo R^{2}, preferiblemente
OR^{10}, -R^{10}, R^{15}, en el que R^{15} es un alquilo de
1 - 4 (inclusive); fenilo, naftilo, arilalquilo de 7 - 14 átomos de
carbono (inclusive), preferiblemente bencilo; o
X es -CH=CH-,
-CH(OH)-CH(OH)-, -O-, -S-, -S(=O)-,
-S(=O)_{2}, -CR^{10})_{2}-, -C(=O)-,
-C(=NOR^{11})-, -C(OR^{11})(R^{11})-,
-C(=O)CHR^{15})-, -CHR^{15})C(=O)-,
-C(=NOR^{11})CHR^{15})-,
-CHR^{15})C(=NOR^{11})-, -CH_{2}Z-,
-Z-CH_{2}-, -CH_{2}ZCH_{2}-,
en los que Z es, C(OR^{11})(R^{11}),
O, S, C(=O), C(=NOR^{11}), o NR^{11};
A^{1} y A^{2} juntos son cada uno
independientemente H, H; H, -OR^{11}; H, -NR^{11}R^{12}; o
juntos representan =S o =NR^{11}; B^{1} y B^{2} juntos
representan O; cada uno de R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4},
R^{5}, R^{6}, y X son como se definen en (c), (d), (e), y (f)
de la reivindicación 58;
o
A^{1} y A^{2} juntos representan O, y B^{1}
y B^{2} juntos son cada uno de ellos independientemente H, H;
-OR^{11}; H, -SR^{11}, H, -NR^{11}R^{12}, o juntos
representan =S o =NR^{11}; y cada uno de R^{1}, R^{2},
R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6}, y X son como se definen en (c),
(d), (e), y (f) de la reivindicación 58.
22. El uso de la reivindicación 21 en el que
A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3} y R_{4} son H; B_{1} y
B_{2} juntos representan O; R_{2} es
CH_{2}CH_{2}CH_{2}OH; R_{5} y R_{6} son OCH_{3}; y X es
CH_{2}.
23. El uso de la reivindicación 21 en el que
A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{5} y R_{6} son H;
B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es
CH_{2}CH_{2}OAc; R_{4} es Br; y X es CH_{2}.
24. El uso de la reivindicación 21 en el que
A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{5} y R_{6} son H;
B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es
CH_{2}CH_{2}OAc; R_{4} es
CH_{2}CH_{2}(2-Pir); y X es CH_{2}.
25. El uso de la reivindicación 21 en el que
A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{5} y R_{6} son H;
B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es H; R_{4} es
R_{2} es CH_{2}CH_{2}(2-Pirimidinilo);
y X es CH_{2}.
26. El uso de la reivindicación 21 en el que
A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{5} y R_{6} son H;
B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es H; R_{4} es
CH_{2}CH_{2}(2-Pir); y X es CH_{2}.
\newpage
27. El uso de la reivindicación 21 en el que
A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{5} y R_{6} son H;
B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es H; R_{4} es
CH_{2}CH_{2}(2-Piridazinilo); y X es
CH_{2}.
28. El uso de la reivindicación 21 en el que
A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{4}, R_{5} y R_{6} son
H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es
CH_{2}CH_{2}OH; y X es CH_{2}.
29. El uso de la reivindicación 21 en el que
A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{4}, R_{5} y R_{6} son
H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es
CH_{2}CH_{2}CH_{2}OH; y X es CH_{2}.
30. El uso de la reivindicación 21 en el que
A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} y
R_{6} son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; y X es
S.
31. El uso de la reivindicación 21 en el que
A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{4}, R_{5} y R_{6} son
H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es
CH_{2}CH_{2}CH_{2}NHCO(4-(OH)Ph); y X es
CH_{2}.
32. El uso de la reivindicación 21 en el que
A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{4}, R_{5} y R_{6} son
H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es
CH_{2}CH_{2}OH; y X es CH_{2}.
33. El uso de un compuesto que tiene la
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
que inhibe una proteína de quinasa
de linaje múltiple en la fabricación de un medicamento para uso en
el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo o
inflamación.
en la que:
el anillo B y el anillo F, independientemente, y
cada uno junto con los átomos de carbono a los que están unido, se
seleccionan entre el grupo constituido por:
(a) un anillo aromático carbocíclico de 6
miembros en el que entre 1 y 3 átomos de carbono se pueden
reemplazar por átomos de nitrógeno;
(b) un anillo aromático carbocíclico de 5
miembros no saturado; y
(c) un anillo aromático carbocíclico de 5
miembros no saturado en el que o bien
- (1)
- un átomo de carbono se reemplaza con un átomo de oxígeno, nitrógeno, o azufre;
- (2)
- dos átomos de carbono se reemplazan con un átomo de azufre y uno de nitrógeno, un átomo de oxígeno y un átomo de nitrógeno, o dos átomos de nitrógeno; o
- (3)
- tres átomos de carbono se reemplazan con tres átomos de nitrógeno;
R^{1} se selecciona entre el grupo constituido
por:
(a) H, alquilo sustituido o no sustituido que
tiene entre 1 y 4 átomos de carbonos, arilo sustituido o no
sustituido, arilalquilo sustituido o no sustituido, heteroarilo
sustituido o no sustituido, o heteroarilalquilo sustituido o no
sustituido;
(b) -C(=O)R^{9}, en el que R^{9} se
selecciona entre el grupo constituido por alquilo, arilo y
heteroarilo;
(c) -OR^{10}, donde R^{10} se selecciona
entre el grupo constituido por H y alquilo que tiene entre 1 y 4
átomos de carbono;
(d) -C(=O)NH_{2}, -NR^{11}R^{12},
-(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12},
-(CH_{2})_{p}OR^{10},
-O(CH_{2})_{p}OR^{10} y
-O(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}, en los que p está
entre 1 y 4; y en los que o bien
- (1)
- R^{11} y R^{12} se seleccionan cada uno de ellos independientemente entre el grupo constituido por H y alquilo que tienen entre 1 y 4 átomos de carbono; o
- (2)
- R^{11} y R^{12} juntos forman un grupo de unión de fórmula -(CH_{2})_{2}-X^{1}- (CH_{2})_{2}-, en el que X^{1} se selecciona entre el grupo constituido por -O-, -S-, y -CH_{2}-;
R^{2} se selecciona entre el grupo constituido
H, alquilo que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono, -OH, alcoxi que
tiene entre 1 y 4 átomos de carbono, -OC(=O)R^{9},
-OC(=O)NR^{11}R^{12},
-O(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12},
-O(CH_{2})_{p}OR^{10}, arilalquilo sustituido o
no sustituido que tiene entre 6 y 10 átomos de carbono, y
heteroarilalquilo sustituido o no sustituido;
R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} se
seleccionan cada uno de ellos independientemente entre el grupo
constituido por:
(a) H, arilo, heteroarilo, F, Cl, Br, I, -CN,
CF_{3}, -NO_{2}, -OH, -OR^{9},
-O(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12},
-OC(=O)R^{9}, -OC(=O)NR^{2}R^{7},
-OC(=O)NR^{11}R^{12},
-O(CH_{2})_{p}OR^{10}, -CH_{2}OR^{10},
-NR^{11}R^{12}, -NR^{10}S(=O)_{2}R^{9},
-NR^{10}C(=O)R^{9};
(b) -CH_{2}OR^{14}, en el que R^{14} es el
residuo de un aminoácido después de que se retire el grupo
hidroxilo del grupo carboxilo;
(c) -NR^{10}C(=O)NR^{11}R^{12},
-CO_{2}R^{2}, -C(=O)R^{2},
-C(=O)NR^{11}R^{12}, -CH=NOR^{2}, -CH=NR^{9},
-(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12},
-(CH_{2})_{p}
NHR^{14}, o -CH=NNR^{2}R^{2A} en los que R^{2A} es el mismo que R^{2};
NHR^{14}, o -CH=NNR^{2}R^{2A} en los que R^{2A} es el mismo que R^{2};
(d)
-S(O)_{y}R^{2}-(CH_{2})_{p}S(O)_{y}R^{9},
-CH_{2}S(O)_{y}R^{14} en el que y es 0, 1 ó
2;
(e) alquilo que tiene entre 1 y 8 átomos de
carbono, alquenilo que tiene entre 2 y 8 átomos de carbono, y
alquinilo que tiene entre 2 y 8 átomos de carbono, en los que
- (1)
- cada grupo alquilo, alquenilo, o alquinilo está no sustituido; o
- (2)
- cada grupo alquilo, alquenilo, o alquinilo está sustituido con 1 a 3 grupos seleccionados entre el grupo constituido por arilo que tiene entre 6 y 10 átomos de carbono, heteroarilo, arilalcoxi, heterocicloalcoxi, hidroxialcoxi, alquiloxi-alcoxi, hidroxialquiltio, alcoxi-alquiltio, F, Cl, Br, I, -CN, -NO_{2}, -OH, -OR^{9}, -X^{2}(CH_{2})_{p} NR^{11}R^{12}, -X^{2}(CH_{2})_{p}C(=O)NR^{11}R^{12}, -X^{2}(CH_{2})_{p}OC(=O)NR^{11}R^{12}, -X^{2}(CH_{2})_{p}CO_{2}R^{9}, -X^{2}(CH_{2})_{p}S(O)_{y}R^{9}, -X^{2}(CH_{2})_{p}NR^{10}C(=O)NR^{11}R^{12}, -OC(=O)R^{9}, -OCONHR^{2}, -O-tetrahidropiranilo, -NR^{11}R^{12}, -NR^{10}C(=O)R^{9}, -N R^{10}CO_{2}R^{9}, -NR^{10}C(O)NR^{11}R^{12}, -NHC(=NH)NH_{2}, NR^{10}S(O_{2})R^{9}, -S(O)_{y}R^{9}, -CO_{2}R^{2}, -C(=O)NR^{11}R^{12}, -C (=O)R^{2}, -CH_{2}OR^{10}, -CH=NNR^{2}R^{2A}, -CH=NOR^{2}, -CH=NR^{9}, -CH=NNHCH(N=NH)NH_{2}, -S(=O)_{2}NR^{2}R^{2A}, -P(=O)(OR^{10})_{2}, -OR^{14}, y un monosacárido que tiene entre 5 y 7 átomos de carbono en el que cada grupo hidroxilo del monosacárido está independientemente o bien no sustituido o está reempalzado con H, alquilo que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono, alquilcarboniloxi que tiene entre 2 y 5 átomos de carbono, o alcoxi que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono;
X^{2} es O, S, o NR^{10};
R^{7} y R^{8} están cada uno de ellos
independientemente seleccionados entre el grupo constituido por H,
alquilo, que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono, alcoxi que tiene
entre 1 y 4 átomos de carbono, arilalquilo sustituido o no
sustituido que tiene entre 6 y 10 átomos de carbono,
heteroarilalquilo sustituido o no sustituido,
-(CH_{2})_{p}OR^{10}, -(CH_{2})_{p}
OC(=O)NR^{11}R^{12}, y -(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}; o R^{7} y R^{8} juntos forman un grupo de unión de fórmula -CH_{2}-X^{3}-CH_{2}-, en el que X^{3} es X^{2} o un enlace;
OC(=O)NR^{11}R^{12}, y -(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}; o R^{7} y R^{8} juntos forman un grupo de unión de fórmula -CH_{2}-X^{3}-CH_{2}-, en el que X^{3} es X^{2} o un enlace;
m y n son cada uno de ellos independientemente 0,
1, ó 2;
Y se selecciona entre el grupo constituido por
-O-, -S-, -N(OR^{10})-,
-N^{+}(O^{-})(R^{10})-, -N(OR^{10})-, y
-CH_{2}-;
Z se selecciona entre el grupo constituido por un
enlace, -O-, -CH=CH-, -S-, -C(=O)-, -CH(OR^{10})-,
-N(R^{10})-,
-N(OR^{10})-, CH(NR^{11}R^{12})-, -C(=O)N(R^{17})-, -N(R^{17})C)=O)-, -N(S(O)_{y}R^{9})-, -N(SO)_{y}NR^{11}R^{12})-, -N(C(=O)R^{17})-, -C(R^{15}
R^{16})-, -N^{+}(O^{-})R^{10})-, -CH(OH)-CH(OH)-, y -CH(O(C=O)R^{9})CH(OC(=O)R^{9A})-, en los que R^{9A} es el mismo que R^{9},
-N(OR^{10})-, CH(NR^{11}R^{12})-, -C(=O)N(R^{17})-, -N(R^{17})C)=O)-, -N(S(O)_{y}R^{9})-, -N(SO)_{y}NR^{11}R^{12})-, -N(C(=O)R^{17})-, -C(R^{15}
R^{16})-, -N^{+}(O^{-})R^{10})-, -CH(OH)-CH(OH)-, y -CH(O(C=O)R^{9})CH(OC(=O)R^{9A})-, en los que R^{9A} es el mismo que R^{9},
R^{15} y R^{16} están independientemente
seleccionados entre entre el grupo constituido por H, -OH,
-C(=O)R^{10}, -O(C=O)R^{9}, hidroxialquilo,
y -CO_{2}R^{10},
R^{17} se selecciona entre el grupo constituido
por H, alquilo, arilo, y heteroarilo;
A^{1} y A^{2} se seleccionan entre el grupo
constituido por H, H; H, OR^{2}; H, -SR^{2}; H,
-N(R^{2})_{2}; y un grupo en el que A^{1} y
A^{2} juntos forman un resto seleccionado entre el grupo
constituido por =O, =S, y =NR^{2};
B^{1} y B^{2} se seleccionan entre el grupo
constituido por H, H; H, OR^{2}; H, -SR^{2}; H,
-N(R^{2})_{2}; y un grupo en el que B^{1} y
B^{2} juntos forman un resto seleccionado entre el grupo
constituido por =O, =S, y =NR^{2};
con la condición de que al menos uno de los pares
A^{1} y A^{2}, o B^{1} y B^{2}, forman =O.
34. El uso de un compuesto que tiene la
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
que inhibe una proteína de quinasa
de linaje múltiple en la fabricación de un medicamento para uso en
el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo o
inflamación,
en la que
Z_{1} es H y Z_{2} es H o Z_{1} y Z_{2}
juntos forman =O;
R_{1} es H o Br;
R_{2} es H;
R_{3} es H, CH_{2}CH=CH_{2},
CH_{2}CH_{2}CH_{2}OH, o
y
R_{4} es H, CH_{2}CH=CH_{2} o
CH_{2}CH_{2}CH_{2}OH.
35. El uso de la reivindicación 34 en el que
R_{1}, R_{2}, R_{4}, Z_{1}, y Z_{2} son H y R_{3} es
CH_{2}CH=CH_{2}.
36. El uso de la reivindicación 34 en el que
R_{1} es Br y R_{2}, R_{3}, R_{4}, Z_{1}, y Z_{2} son
H.
37. El uso de la reivindicación 34 en el que
R_{1}, R_{2}, Z_{1}, y Z_{2} son H y R_{3} y R_{4} son
CH_{2}CH=CH_{2}.
38. El uso de la reivindicación 34 en el que
R_{1}, R_{2}, R_{3}, Z_{1}, y Z_{2} son H y R_{4} es
CH_{2}CH=CH_{2}.
39. El uso de la reivindicación 34 en el que
R_{1}, R_{2}, Z_{1}, y Z_{2} son H y R_{3} y R_{4}
CH_{2}CH=CH_{2}; o R_{1}, R_{2}, R_{4}, Z_{1}, y
Z_{2} son H y R_{3} es
40. El uso de un compuesto que tiene la
fórmula:
que inhibe una proteína de quinasa
de linaje múltiple en la fabricación de un medicamento para uso en
el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo o
inflamación,
en la que
Z_{1} es H y Z_{2} es H o Z_{1} y Z_{2}
juntos forman =O;
R_{1} se selecciona entre el grupo constituido
por H, Cl, CH_{2}SO_{2}C_{2}H_{5}, Br,
CH_{2}S(CH_{2})_{2}NH_{2},
CH_{2}S(CH_{2})_{2}N(CH_{3})_{2},
CH_{2}S(CH_{2})_{2}NH_{2},
n-C_{4}H_{9}, NHCONHC_{6}H_{5},
NHCONHC_{2}H_{5}, CH_{2}SC_{2}H_{5},
CH_{2}SC_{6}H_{5}, N(CH_{3})_{2}, CH_{3},
CH_{2}OCONHC_{2}
H_{5}, NHCO_{2}CH_{3}, CH_{2}OC_{2}H_{5}, CH_{2}N(CH_{3})_{2}, OH, O-n-propilo; CH=NNH-C(=NH)NH_{2}, CH=N-N(CH_{3})_{2}, CH_{2}S(CH_{2})_{2}
NH-n-C_{4}H_{9}, CH_{2}OCH_{2}OCH_{2}CH_{3}, CH_{2}S[3-(1,2,4-triazina)], CH_{2}CH_{2}SCH_{3};
H_{5}, NHCO_{2}CH_{3}, CH_{2}OC_{2}H_{5}, CH_{2}N(CH_{3})_{2}, OH, O-n-propilo; CH=NNH-C(=NH)NH_{2}, CH=N-N(CH_{3})_{2}, CH_{2}S(CH_{2})_{2}
NH-n-C_{4}H_{9}, CH_{2}OCH_{2}OCH_{2}CH_{3}, CH_{2}S[3-(1,2,4-triazina)], CH_{2}CH_{2}SCH_{3};
y
R_{2} se selecciona entre el grupo constituido
por H, Br, Cl, I,
CH_{2}S(CH_{2})_{2}N(CH_{3})_{2},
NHCONHC_{2}H_{5}, CH_{2}SC_{2}H_{5},
CH_{2}OCH_{2}OCH_{2}CH_{3}, CH_{2}S[3-(1,2,4-
triazina)], CH_{2}CH_{2}SCH_{3}; y CH_{2}OH;
X se selecciona entre el grupo constituido por H,
CH_{2}OH, CH_{2}NH-SerinaH, CO_{2}CH_{3},
CONC_{6}H_{5}, CH_{2}NHCO_{2}
C_{6}H_{5}, CH_{2}NHCO_{2}CH_{3}, CH_{2}N_{3}, CONHC_{2}H_{5}, CH_{2}NH-glicina, CON(CH_{3})_{2}, -CH_{2}NHCO_{2}-, CONH_{2}, CONHCH_{3}H_{7}, CH_{2}NH-serina, CH_{2}SOCH_{3}, CH=NOH, CH_{2}NH-prolina, CH_{2}CH_{2}(2-piridilo), CH=NNH-C(=NH)NH_{2}, CONH(CH_{2})_{2}
OH, CH=NNHCONH_{2}, CH_{2}OCOCH_{3}, -CH_{2}OC(CH_{3})_{2}O-, CH_{2}SC_{6}H_{5}, CH_{2}SOC_{6}H_{5}, CO_{2}n-hexilo, -CONHCH_{3}, y CO_{2}(CH_{2})_{4}CH_{3};
C_{6}H_{5}, CH_{2}NHCO_{2}CH_{3}, CH_{2}N_{3}, CONHC_{2}H_{5}, CH_{2}NH-glicina, CON(CH_{3})_{2}, -CH_{2}NHCO_{2}-, CONH_{2}, CONHCH_{3}H_{7}, CH_{2}NH-serina, CH_{2}SOCH_{3}, CH=NOH, CH_{2}NH-prolina, CH_{2}CH_{2}(2-piridilo), CH=NNH-C(=NH)NH_{2}, CONH(CH_{2})_{2}
OH, CH=NNHCONH_{2}, CH_{2}OCOCH_{3}, -CH_{2}OC(CH_{3})_{2}O-, CH_{2}SC_{6}H_{5}, CH_{2}SOC_{6}H_{5}, CO_{2}n-hexilo, -CONHCH_{3}, y CO_{2}(CH_{2})_{4}CH_{3};
y
R se selecciona entre el grupo constituido por
OH, y OCH_{3}.
41. El uso de la reivindicación 40 en el que
Z_{1} y Z_{2} son H; X es CO_{2}CH_{3}; R_{1} es
NHCONHC_{2}H_{5}; R_{2} es
CH_{2}CH_{2}(2-piridilo), y R es OH.
42. El uso de la reivindicación 40 en el que
Z_{1} y Z_{2} son H, X es CO_{2}CH_{3}; R_{1} y R_{2}
son CH_{2}OCH_{2}OCH_{2}CH_{3}, y R es OH.
43. El uso de la reivindicación 40 en el que
Z_{1} y Z_{2} son H; X es CO_{2}CH_{3}; R_{1} y R_{2}
son CH_{2}CH_{2}SCH_{3}; y R es OH.
44. El uso de la reivindicación 40 en el que
Z_{1}, Z_{2}, R_{1}, y R_{2} son H; X es CO_{2}CH_{3},
y R es OH.
45. El uso de la reivindicación 40 en el que
Z_{1}, Z_{2}, R_{1}, y R_{2} son H; X es
CO_{2}(CH_{2})_{4}CH_{3}; y R es OH.
46. El uso de la reivindicación 40 en el que
Z_{1}, Z_{2}, y R_{1} son H; R_{2} es CH_{2}OH; X es
CO_{2}CH_{3}; y R es OH.
47. El uso de la reivindicación 40 en el que
Z_{1} y Z_{2}, son H; y R_{1} y R_{2} son H_{2}S(
3-(1,2,4-triazina)); X es CO_{2}CH_{3}; y R es
OH.
48. El uso de la reivindicación 40 en el que
Z_{1} y Z_{2}, son H; R_{1} es Br; R_{2} es I; X es
CO_{2}CH_{3}, y R es OH.
49. El uso de la reivindicación 40 en el que
Z_{1} y Z_{2} son H; R_{1} y R_{2} son
CH_{2}CH_{2}SCH_{3}; X es CO_{2}CH_{3}, y R es OH.
50. El uso de la reivindicación 40 en el que
Z_{1}, Z_{2}, R_{1}, y R_{2} son H; X es CO_{2}CH_{3};
y R es OCH_{3}.
51. El uso de la reivindicación 40 en el que
Z_{1} y Z_{2} juntos forman =O; R_{1} y R_{2} son Br; X es
CO_{2}CH_{3}; y R es OH.
52. Un procedimiento de modulación de la
actividad de una proteína de quinasa de linaje múltiple que
comprende poner en contacto dicha proteína o célula que contiene
dicha proteína con un compuesto que tiene la fórmula
en la
que
Z_{1} es H y Z_{2} es H o Z_{1} y Z_{2}
juntos forman =O;
R_{1} es H o Br;
R_{2} es H;
R_{3} es H, CH_{2}CH=CH_{2},
CH_{2}CH_{2}CH_{2}OH, o
y
R_{4} es H, CH_{2}CH=CH_{2} o
CH_{2}CH_{2}CH_{2}OH.
53. El procedimiento de la reivindicación 52 en
el que R_{1}, R_{2}, R_{4}, Z_{1}, y Z_{2} son H y
R_{3} es CH_{2}CH=CH_{2}.
54. El procedimiento de la reivindicación 52 en
el que R_{1} es Br y R_{2}, R_{3}, R_{4}, Z_{1}, y
Z_{2} son H.
55. El procedimiento de la reivindicación 52 en
el que R_{1}, R_{2}, Z_{1}, y Z_{2} son H y R_{3} y
R_{4} son CH_{2}CH=CH_{2}.
56. El procedimiento de la reivindicación 52 en
el que R_{1}, R_{2}, R_{3}, Z_{1}, y Z_{2} son H y
R_{4} es CH_{2}CH=CH_{2}.
57. El procedimiento de la reivindicación 52 en
el que R_{1}, R_{2}, Z_{1}, y Z_{2} son H y R_{3} y
R_{4} son CH_{2}CH=CH_{2}; o R_{1}, R_{2}, R_{4},
Z_{1}, y Z_{2} son H y R_{3} es
58. Un procedimiento de modulación de la
actividad de una proteína de quinasa de linaje múltiple que
comprende poner en contacto dicha proteína o célula que contiene
dicha proteína con un compuesto que tiene la fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
el anillo B y el anillo F, independientemente, y
cada uno junto con los átomos de carbono a los que están unido, se
seleccionan entre el grupo constituido por:
(a) un anillo aromático carbocíclico de 6
miembros en el que entre 1 y 3 átomos de carbono se pueden
reemplazar por átomos de nitrógeno;
(b) un anillo aromático carbocíclico de 5
miembros no saturado; y
(c) un anillo aromático carbocíclico de 5
miembros no saturado en el que o bien
- (1)
- un átomo de carbono se reemplaza con un átomo de oxígeno, nitrógeno, o azufre;
- (2)
- dos átomos de carbono se reemplazan con un átomo de azufre y un átomo de nitrógeno, un átomo de oxígeno y un átomo de nitrógeno, o dos átomos de nitrógeno; o
- (3)
- tres átomos de carbono se reemplazan con tres átomos de nitrógeno;
R^{1} se selecciona entre el grupo constituido
por:
(a) H, alquilo sustituido o no sustituido que
tiene entre 1 y 4 átomos de carbonos, arilo sustituido o no
sustituido, arilalquilo sustituido o no sustituido, heteroarilo
sustituido o no sustituido, o heteroarilalquilo sustituido o no
sustituido;
(b) -C(=O)R^{9}, en el que R^{9} se
selecciona entre el grupo constituido por alquilo, arilo y
heteroarilo;
(c) -OR^{10}, en el que R^{10} se selecciona
entre el grupo constituido por H y alquilo que tiene entre 1 y 4
átomos de carbono;
(d) -C(=O)NH_{2}, -NR^{11}R^{12},
-(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12},
-(CH_{2})_{p}OR^{10},
-O(CH_{2})_{p}OR^{10} y
-O(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}, en los que p es
entre 1 y 4 átomos de carbono; y en los que bien
- (1)
- R^{11} y R^{12} se seleccionan cada uno de ellos independientemente entre el grupo constituido por H y alquilo que tienen entre 1 y 4 átomos de carbono; o
- (2)
- R^{11} y R^{12} juntos forman un grupo de unión de fórmula -(CH_{2})_{2}-X^{1}- (CH_{2})_{2}-, en el que X^{1} se selecciona entre el grupo constituido por -O-, -S-, y -CH_{2}-;
R^{2} se selecciona entre el grupo constituido
H, alquilo que tiene entre y 4 átomos de carbono, -OH, alcoxi que
tiene entre 1 y 4 átomos de carbono, -OC(=O)R^{9},
-OC(=O)NR^{11}R^{12},
-O(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12},
-O(CH_{2})_{p}OR^{10}, arilalquilo sustituido o
no sustituido que tiene entre 6 y 10 átomos de carbono, y
heteroarilalquilo sustituido o no sustituido;
R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} se
seleccionan cada uno de ellos independientemente entre el grupo
constituido por:
(a) H, arilo, heteroarilo, F, Cl, Br, I, -CN,
CF_{3}, -NO_{2}, -OH, -OR^{9},
-O(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12},
-OC(=O)R^{9}, -OC(=O)NR^{2}R^{7},
-OC(=O)NR^{11}R^{12},
-O(CH_{2})_{p}OR^{10}, -CH_{2}OR^{10},
-NR^{11}R^{12}, -NR^{10}S(=O)_{2}R^{9},
-NR^{10}C(=O)R^{9};
(b) -CH_{2}OR^{14}, en el que R^{14} es el
residuo de un aminoácido después de que se retire el grupo
hidroxilo del grupo carboxilo;
(c) -NR^{10}C(=O)NR^{11}R^{12},
-CO_{2}R^{2}, -C(=O)R^{2},
-C(=O)NR^{11}R^{12}, -CH=NOR^{2}, -CH=NR^{9},
-(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12},
-(CH_{2})_{p}
NHR^{14}, o -CH=NNR^{2}R^{2A} en los que R^{2A} es el mismo que R^{2};
NHR^{14}, o -CH=NNR^{2}R^{2A} en los que R^{2A} es el mismo que R^{2};
(d)
-S(O)_{y}R^{2}-(CH_{2})_{p}S(O)_{y}R^{9},
-CH_{2}S(O)_{y}R^{14} en el que y es 0, 1 ó
2;
(e) alquilo que tiene entre 1 y 8 átomos de
carbono, alquenilo que tiene entre 2 y 8 átomos de carbono, y
alquinilo que tiene entre 2 y 8 átomos de carbono,en los que
- (1)
- cada grupo alquilo, alquenilo, o alquinilo está no sustituido; o
- (2)
- cada grupo alquilo, alquenilo, o alquinilo está sustituido con 1 a 3 grupos seleccionados entre el grupo constituido por arilo que tiene entre 6 y 10 átomos de carbono, heteroarilo, arilalcoxi, heterocicloalcoxi, hidroxialcoxi, alquiloxi-alcoxi, hidroxialquiltio, alcoxi-alquiltio, F, Cl, Br, I, -CN, -NO_{2}, -OH, -OR^{9}, -X^{2}(CH_{2})_{p} NR^{11}R^{12}, -X^{2}(CH_{2})_{p}C(=O)NR^{11}R^{12}, -X^{2}(CH_{2})_{p}OC(=O)NR^{11}R^{12}, -X^{2}(CH_{2})_{p}CO_{2}R^{9}, -X^{2}(CH_{2})_{p}S(O)_{y}R^{9}, -X^{2}(CH_{2})_{p}NR^{10}C(=O)NR^{11}R^{12}, -OC(=O)R^{9}, -OCONHR^{2}, -O-tetrahidropiranilo, -NR^{11}R^{12}, -NR^{10}C(=O)R^{9}, -N R^{10}CO_{2}R^{9}, -NR^{10}C(O)NR^{11}R^{12}, -NHC(=NH)NH_{2}, NR^{10}S(O_{2})R^{9}, -S(O)_{y}R^{9}, -CO_{2}R^{2}, -C(=O)NR^{11}R^{12}, -C (=O)R^{2}, -CH_{2}OR^{10}, -CH=NNR^{2}R^{2A}, -CH=NOR^{2}, -CH=NR^{9}, -CH=NNHCH(N=NH)NH_{2}, -S(=O)_{2}NR^{2}R^{2A}, -P(=O)(OR^{10})_{2}, -OR^{14}, y un monosacárido que tiene entre 5 y 7 átomos de carbono en el que cada grupo hidroxilo del monosacárido está bien independientemente no sustituido o está reempalzado con H, alquilo que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono, alquilcarboniloxi que tiene entre 2 y 5 átomos de carbono, o alcoxi que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono;
X^{2} es O, S, o NR^{10};
R^{7} y R^{8} están cada uno de ellos
independientemente seleccionados entre el grupo constituido por H,
alquilo, que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono, alcoxi que tiene
entre 1 y 4 átomos de carbono, arilalquilo sustituido o no
sustituido que tiene entre 6 y 10 átomos de carbono,
heteroarilalquilo sustituido o no sustituido,
-(CH_{2})_{p}OR^{10}, -(CH_{2})_{p}
OC(=O)NR^{11}R^{12}, y -(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}; o R^{7} y R^{8} juntos forman un grupo de unión de fórmula -CH_{2}-X^{3}-CH_{2}-, en el que X^{3} es X^{2} o un enlace;
OC(=O)NR^{11}R^{12}, y -(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}; o R^{7} y R^{8} juntos forman un grupo de unión de fórmula -CH_{2}-X^{3}-CH_{2}-, en el que X^{3} es X^{2} o un enlace;
m y n son cada uno de ellos independientemente 0,
1, ó 2;
Y se selecciona entre el grupo constituido por
-O-, -S-, -N(OR^{10})-,
-N^{+}(O^{-})(R^{10})-, -N(OR^{10})-, y
-CH_{2}-;
Z se selecciona entre el grupo constituido por un
enlace, -O-, -CH=CH-, -S-, -C(=O)-, -CH(OR^{10})-,
-N(R^{10})-,
-N(OR^{10})-, CH(NR^{11}R^{12})-, -C(=O)N(R^{17})-, -N(R^{17})C)=O)-, -N(S(O)_{y}R^{9})-, -N(SO)_{y}NR^{11}R^{12})-, -N(C(=O)R^{17})-, -C(R^{15}
R^{16})-, -N^{+}(O^{-})R^{10})-, -CH(OH)-CH(OH)-, y -CH(O(C=O)R^{9})CH(OC(=O)R^{9A})-, en los que R^{9A} es el mismo que R^{9},
-N(OR^{10})-, CH(NR^{11}R^{12})-, -C(=O)N(R^{17})-, -N(R^{17})C)=O)-, -N(S(O)_{y}R^{9})-, -N(SO)_{y}NR^{11}R^{12})-, -N(C(=O)R^{17})-, -C(R^{15}
R^{16})-, -N^{+}(O^{-})R^{10})-, -CH(OH)-CH(OH)-, y -CH(O(C=O)R^{9})CH(OC(=O)R^{9A})-, en los que R^{9A} es el mismo que R^{9},
R^{15} y R^{16} están independientemente
seleccionados entre entre el grupo constituido por H, -OH,
-C(=O)R^{10}, -O(C=O)R^{9}, hidroxialquilo,
y -CO_{2}R^{10},
R^{17} se selecciona entre el grupo constituido
por H, alquilo, arilo, y heteroarilo;
A^{1} y A^{2} se seleccionan entre el grupo
constituido por H, H; H, OR^{2}; H, -SR^{2}; H,
-N(R^{2})_{2}; y un grupo en el que A^{1} y
A^{2} juntos forman un resto seleccionado entre el grupo
constituido por =O, =S, y =NR^{2};
B^{1} y B^{2} se seleccionan entre el grupo
constituido por H, H; H, OR^{2}; H, -SR^{2}; H,
-N(R^{2})_{2}; y un grupo en el que B^{1} y
B^{2} juntos forman un resto seleccionado entre el grupo
constituido por =O, =S, y =NR^{2};
con la condición de que al menos uno de los pares
A^{1} y A^{2}, o B^{1} y B^{2}, forman =O.
59. Un procedimiento de modulación de la
actividad de una proteína de quinasa de linaje múltiple que
comprende poner en contacto dicha proteína o célula que contiene
dicha proteína con un compuesto que tiene la fórmula
en la
que
Z_{1} es H y Z_{2} es H o Z_{1} y Z_{2}
juntos forman =O;
R_{1} se selecciona entre el grupo constituido
por H, Cl, CH_{2}SO_{2}C_{2}H_{5}, Br,
CH_{2}S(CH_{2})_{2}NH_{2},
CH_{2}S(CH_{2})_{2}N(CH_{3})_{2},
CH_{2}S(CH_{2})_{2}NH_{2},
n-C_{4}H_{9}, NHCONHC_{6}H_{5},
NHCONHC_{2}H_{5}, CH_{2}SC_{2}H_{5},
CH_{2}SC_{6}H_{5}, N(CH_{3})_{2}, CH_{3},
CH_{2}OCONHC_{2}
H_{5}, NHCO_{2}CH_{3}, CH_{2}OC_{2}H_{5}, CH_{2}N(CH_{3})_{2}, OH, O-n-propilo; CH=NNH-C(=NH)NH_{2}, CH=N-N(CH_{3})_{2}, CH_{2}S(CH_{2})_{2}
NH-n-C_{4}H_{9}, CH_{2}OCH_{2}OCH_{2}CH_{3}, CH_{2}S[3-(1,2,4-triazina)], CH_{2}CH_{2}SCH_{3};
H_{5}, NHCO_{2}CH_{3}, CH_{2}OC_{2}H_{5}, CH_{2}N(CH_{3})_{2}, OH, O-n-propilo; CH=NNH-C(=NH)NH_{2}, CH=N-N(CH_{3})_{2}, CH_{2}S(CH_{2})_{2}
NH-n-C_{4}H_{9}, CH_{2}OCH_{2}OCH_{2}CH_{3}, CH_{2}S[3-(1,2,4-triazina)], CH_{2}CH_{2}SCH_{3};
y
R_{2} se selecciona entre el grupo constituido
por H, Br, Cl, I,
CH_{2}S(CH_{2})_{2}N(CH_{3})_{2},
NHCONHC_{2}H_{5}, CH_{2}SC_{2}H_{5},
CH_{2}OCH_{2}OCH_{2}CH_{3}, CH_{2}S[3-(1,2,4-
triazina)], CH_{2}CH_{2}SCH_{3}; y CH_{2}OH;
X se seleccioan entre el grupo constituido por H,
CH_{2}OH, CH_{2}NH-SerinaH, CO_{2}CH_{3},
CONC_{6}H_{5}, CH_{2}NHCO_{2}
C_{6}H_{5}, CH_{2}NHCO_{2}CH_{3}, CH_{2}N_{3}, CONHC_{2}H_{5}, CH_{2}NH-glicina, CON(CH_{3})_{2}, -CH_{2}NHCO_{2}-, CONH_{2}, CONHCH_{3}H_{7}, CH_{2}NH-serina, CH_{2}SOCH_{3}, CH=NOH, CH_{2}NH-prolina, CH_{2}CH_{2}(2-piridilo), CH=NNH-C(=NH)NH_{2}, CONH(CH_{2})_{2}
OH, CH=NNHCONH_{2}, CH_{2}OCOCH_{3}, -CH_{2}OC(CH_{3})_{2}O-, CH_{2}SC_{6}H_{5}, CH_{2}SOC_{6}H_{5}, CO_{2}n-hexilo, -CONHCH_{3}, y CO_{2}(CH_{2})_{4}CH_{3};
C_{6}H_{5}, CH_{2}NHCO_{2}CH_{3}, CH_{2}N_{3}, CONHC_{2}H_{5}, CH_{2}NH-glicina, CON(CH_{3})_{2}, -CH_{2}NHCO_{2}-, CONH_{2}, CONHCH_{3}H_{7}, CH_{2}NH-serina, CH_{2}SOCH_{3}, CH=NOH, CH_{2}NH-prolina, CH_{2}CH_{2}(2-piridilo), CH=NNH-C(=NH)NH_{2}, CONH(CH_{2})_{2}
OH, CH=NNHCONH_{2}, CH_{2}OCOCH_{3}, -CH_{2}OC(CH_{3})_{2}O-, CH_{2}SC_{6}H_{5}, CH_{2}SOC_{6}H_{5}, CO_{2}n-hexilo, -CONHCH_{3}, y CO_{2}(CH_{2})_{4}CH_{3};
y
R se selecciona entre el grupo constituido por
OH, y OCH_{3}.
60. El procedimiento de la reivindicación 59 en
el que Z_{1} y Z_{2} son H; X es CO_{2}CH_{3}; R_{1} es
NHCONHC_{2}H_{5}; R_{2} es
CH_{2}CH_{2}(2-piridilo), y R es OH.
61. El procedimiento de la reivindicación 59 en
el que Z_{1} y Z_{2} son H, X es CO_{2}CH_{3}; R_{1} y
R_{2} son CH_{2}OCH_{2}OCH_{2}
CH_{3}, y R es OH.
CH_{3}, y R es OH.
62. El procedimiento de la reivindicación 59 en
el que Z_{1} y Z_{2} son H; X es CO_{2}CH_{3}; R_{1} y
R_{2} son CH_{2}CH_{2}SCH_{3}; y R es OH.
63. El procedimiento de la reivindicación 59 en
el que Z_{1}, Z_{2}, R_{1}, y R_{2} son H; X es
CO_{2}CH_{3}, y R es OH.
64. El procedimiento de la reivindicación 59 en
el que Z_{1}, Z_{2}, R_{1}, y R_{2} son H; X es
CO_{2}(CH_{2})_{4}CH_{3}; y R es OH.
65. El procedimiento de la reivindicación 59 en
el que Z_{1}, Z_{2}, y R_{1} son H; R_{2} es CH_{2}OH; X
es CO_{2}CH_{3}; y R es OH.
66. El procedimiento de la reivindicación 59 en
el que Z_{1} y Z_{2}, son H; y R_{1} y R_{2} son H_{2}S(
3-(1,2,4-triazina)); X es CO_{2}CH_{3}; y R es
OH.
67. El procedimiento de la reivindicación 59 en
el que Z_{1} y Z_{2}, son H; R_{1} es Br; R_{2} es I; X es
CO_{2}CH_{3}, y R es OH.
68. El procedimiento de la reivindicación 59 en
el que Z_{1} y Z_{2} son H; R_{1} y R_{2} son
CH_{2}CH_{2}SCH_{3}; X es CO_{2}CH_{3}, y R es OH.
69. El procedimiento de la reivindicación 59 en
el que Z_{1}, Z_{2}, R_{1}, y R_{2} son H; X es
CO_{2}CH_{3}; y R es OCH_{3}.
70. El procedimiento de la reivindicación 59 en
el que Z_{1} y Z_{2} juntos forman =O; R_{1} y R_{2} son Br;
X es CO_{2}CH_{3}; y R es OH.
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