BG105360A - Модулиране на сложна линия киназни белтъци - Google Patents
Модулиране на сложна линия киназни белтъци Download PDFInfo
- Publication number
- BG105360A BG105360A BG105360A BG10536001A BG105360A BG 105360 A BG105360 A BG 105360A BG 105360 A BG105360 A BG 105360A BG 10536001 A BG10536001 A BG 10536001A BG 105360 A BG105360 A BG 105360A
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- group
- carbon atoms
- protein
- alkyl
- carbons
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
- G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/91—Transferases (2.)
- G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
- G01N2333/9121—Phosphotransferases in general with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. general tyrosine, serine or threonine kinases
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
Abstract
Изобретението се отнася до методи за определяне на съединения, които модулират активността на сложна линия киназен белтък и спомагат за оцеляването на клетката или за клетъчната смърт. Осъществяват се етапи на контактуване на съединението с клетката, съдържаща сложна линия киназен белтък, определя се дали съединението намалява активността на сложната линия киназен белтък и дали то спомага за клетъчното оцеляване. Създадени са и методи за определяне на съединения, които могат да бъдат използванипри лечението на невродегенеративни нарушения и/или възпаления, представени са също и методи за модулиране активността на сложна линия киназен белтък, осъществявани чрез контактуване на белтъка или клетка, съдържаща белтъка, с индено- или индоло- съединение от изобретението. Създадени са и методи за третиране на невродегенеративни нарушения и/или възпаления.
Description
Област на изобретението
Настоящето изобретение е насочено, отчасти, към методи за модулиране на членове от фамилията на сложна линия киназа (MLK), методи за определяне на съединения, които модулират сложна линия киназен белтък и спомагат или оцеляването на клетката, или клетъчната смърт, методи за определяне на съединения, които могат да бъдат полезни при лечението на невроденегеративни заболявания и/или възпаление и методи на лечение на невродегенеративни заболявания със съединения, които инхибират сложна линия киназен белтък.
Техническа същност на изобретението
Фамилията MLK се състои от група белтъци, където белтъчната последователност на киназните области на членовете на фамилията силно наподобява МАРККК, но имат по-голямо сходство един с друг, отколкото с други МАРККК. Членовете на фамилията MLK съдържат част от много сложни киназни каскади, такива като, например, стрес сигналната каскада, която включва модулирате на, освен всичко друго, киназата с c-Jun N-край (JNK), която от своя страна модулира, освен всичко друго, факторите на транскрипция, включително c-Jun, ATF2 и ELK-Е JNK е описана в Патенти на САЩ 5,534,426, 5,593,884, 5,605,808 и WO 95/03324, всеки от който е включен тук като цяло чрез позоваване.
Фамилията MLK включва, от своя страна, следните групи: 1)сложна линия киназа 1 (MLK1); 2)сложна линия киназа 2 (MLK2); 3)сложна линия киназа 3 (MLK3); 4) левцин зигзагообразна киназа (LZK); 5) двойна левцин зигзагообразна киназа (DLK); и 6) сложна линия киназа 6
(MLK6). MLK1 има каталитична киназна област подобна на киназите, специфични както за Туг, така и за Ser/Thr. Dorow, et al., Eur. J. Biochem., 1993,213, 701-710. MLK2 също има каталитична киназна област подобна на киназите, специфични както за Туг, така и за Ser/Thr. Dorow, et al., Eur. J. Biochem., 1993, 213, 701-710. MLK2 е известна също като MST, Katoh, et al., Oncogene, 1995,10, 1447-1451. MLK3 съдържа белтък, който освен киназната област, съдържа две левцин зигзагообразни с прилежаща основна област с карбоксилен край и област богата на пролин. Ing, et al., Oncogene, 1994, 9, 1745-1750. MLK3 е известна също като SPRK (Gallo, et al., J. Biol. Chem., 1994, 269, 15092-15100) и PTK1 (Ezoe, et al., Oncogene, 1994, 9, 935-938). LZK е левцин зигзагообразна киназа. Sakuma, et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 28622-28629. DLK има киназна област и две предполагаеми левцин зигзагообразни подвижни части. Holzman, et al., J. Biol. Chem., 1994, 269, 30808-30817. DLK е известна също като ZPK (Reddy, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm.,1994, 202, 613-620) и MUK (Hirai, et al., Oncogene, 1996, 12, 641-650). Членове на фамилията MLK също са описани, например, в Патенти на САЩ 5,676,945, 5,554,523, WO 93/15201, патент на Канада 2,148,898, Diener, et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1997, 94, 9687-9692, DeAizpurua, et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 16364-16373, Tung, et al., Oncogene, 1997, 14, 653659, Sells, et al., Trends in Cell Biol., 1997, 7, 161-167, Mata, et al., J. Biol. Chem., 1996, 271, 16888-16896, Hirai, et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 15167-15173, Fan, et al., J. Biol. Chem., 1996, 271, 24788-24793, Blouin, et al., DNA and Cell Biol., 1996, 75, 631-642, Pombo, et al., Nature, 1995, .377, 750-754, Kiefer, et al., EMBO J., 1996, 75, 7013-7025, Hu, et al., Genes & Dev., 1996, 10, 2251-2264, Su, et al., EMBO J., 1997, 16, 1279-1290 и Dorow, et al, Eur. J. Biochem., 1995, 234, 492-500. Напоследък, друга киназа, свързана с MLK е идентифицирана в базата данни на EST. ДНК последователността на този клон, MLK6, е описана от седем съвпадащи съобщения. Идентификационните номера на техния клон са: 1007489,
1460085, 510915, 666323, F5555, 482188 и 178522, последователностите на всички, които са включени тук чрез позоваване в тяхната цялост.
Всяко от позоваванията, цитирано в настоящия параграф, е включено тук чрез позоваване в неговата цялост.
Напоследък се доказа, че трайната експресивност на ZPK намалява пролиферативния капацитет на NIH ЗТЗ фибробласти, измерено чрез тест на образуване на колония. Bergeron, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 1997, 231, 153-155. Bergeron, et al., обаче, не са успели да получат никакви данни, доказващи, че ZPK модулира активността на ZPK субстрата или че ZPK спомага клетъчната смърт.
Експресивност на структура, кодираща Myc-MLK2 в Swiss ЗТЗ клетки, е показала, че води до апоптоза, приблизително 20 часа след инжектиране. Nagata, et al., EMBO J., 1998,17, 149-158.
Заявителите са развили многобройни индоло и индено съединения, които, между другото, инхибират клетъчния растеж, свързан с хиперпролиферативни състояния и инхибират смъртта в различни ембрионни култури, такива като ганглион на дорзално коренче, на ивицестото тяло, горния цервикален ганглий и мотоневрони. Всеки един от патентите на САЩ 5,475,110, 5,591,855, 5,594,009, 5,461,146, 5,621,100, 5,621,101, 5,705,511 и 5,756,494 е в основата на настоящата заявка и всеки от тях е включен тук като цяло чрез позоваване. Съединения, повторно цитирани в патент на САЩ 5,705,511, с формула G, се отнасят до настоящата заявка, като съдържащи формула I. Заявителите са показали също, че мотоневронната апоптоза се инхибира от производно на К-252а, индолкарбазол, който също модулира стрес сигналната каскада. Maroney, et al., J. Neurosci., 1998, 18, 104-111, който е включен тук като цяло чрез позоваване.
Вследствие неадекватност при изследване на съединения, които модулират членове на стрес сигналната каскада и спомагат или клетъчната смърт, или клетъчното оцеляване, продължава да има нужда от нови, селективни методи за изследване на съединения. Освен това, продължава да има нужда от тестове за изследване на лекарствата, които могат да бъдат използвани за лечение на възпалителни и невродегенеративни заболявания. Настоящето изследване е насочено към тези, както и към други, важни крайни цели.
Резюме на изобретението
Настоящето изобретение осигурява методи за идентификация на съединения, които модулират активност на сложна линия киназни белтъци и спомагат за клетъчното оцеляване, състоящи се от етапи на контактуване на клетката, съдържаща сложна линия киназен белтък със съединението, определяне дали съединението намалява активността на сложна линия киназен белтък и определяне дали съединението спомага клетъчното оцеляване.
Настоящето изобретение осигурява също методи за идентифициране на съединения, които модулират активност на сложна линия киназни белтъци и спомагат клетъчната смърт, състоящи се от етапи на контактуване на клетката, съдържаща сложна линия киназен белтък със съединението, определяне дали съединението увеличава активността на сложна линия киназен белтък и определяне дали съединението спомага клетъчната смърт.
Настоящето изобретение осигурява също методи за идентифициране на съединения, които могат да бъдат използвани при лечение на невродегенеративни заболявания, състоящи се от контактуване на клетка или клетъчен екстракт, съдържащ сложна линия киназен белтък, със съединението и определяне дали съединението намалява активността на сложната линия киназен белтък.
Настоящето изобретение осигурява също методи за идентифициране на съединения, които могат да бъдат използвани при лечение на възпаления, състоящи се от контактуване на клетка или клетъчен екстракт, съдържащ сложна линия киназен белтък, със съединението и определяне дали съединението намалява активността на сложната линия киназен белтък.
Настоящето изобретение осигурява също методи за лечение на бозайници, които страдат или се предполага, че страдат от
невродегенеративно нарушение, състоящи се от прилагане върху споменатия бозайник на съединение, което инхибира или намалява активността на сложна линия киназен белтък.
Настоящето изобретение осигурява също методи за лечение на бозайници, които страдат от възпаление, състоящи се от прилагане върху споменатия бозайник на съединение, което инхибира или намалява активността на сложна линия киназен белтък.
Настоящето изобретение осигурява също методи за модулиране активността на сложна линия киназен белтък, състоящи се от контактуване на белтъка или клетка, съдържаща белтъка, със съединение с формула II:
където пръстен В и пръстен F, независимо и всеки заедно с въглеродните атоми, към които те са прикрепени, са избрани от групата, състояща се от:
Μβ ненаситен 6-членен карбоцикличен ароматен пръстен, където от 1 до 3 въглеродни атома могат да бъдат заменени от азотни атоми;
ненаситен 5-членен карбоцикличен ароматен пръстен; и ненаситен 5-членен карбоцикличен ароматен пръстен, където или един въглероден атом е заменен с кислороден, азотен или серен атом;
два въглеродни атома са заменени със серен и азотен атом, кислороден и азотен атом или два азотни атома; или три въглеродни атома са заменени с три азотни атома;
R1 е избран от групата, съдържаща:
Н, заместен или незаместен алкил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома, заместен или незаместен арил, заместен или незаместен арилалкил, заместен или незаместен хетероарил или заместен или незаместен хетероарилалкил;
-C(=O)R9, където R9 е избран от групата, съдържаща алкил, арил и хетероарил;
-OR10, където R10 е избран от групата, съдържаща Н и алкил, имащ от 1 до 4 въглерода;
-C(=O)NH2, -NRhR12, -(CH2)pNR“R12, -(CH2)pOR10, O O(CH2)POR10 и -O(CH2)pNRnR12, където p е от 1 до 4; и където или
12
R и R са всеки независимо избран от групата, съдържаща Н и алкил, имащ от 1 до 4 въглерода; или
12
R и R заедно образуват свързваща група е формула -(СНг^-Х^СН^-, където X1 е избран от групата, съдържаща -0-, -S- и СН2-;
R е избран от групата, съдържаща Н, алкил, имащ от 1 до 4 въглерода, -ОН, алкокси, имащ от 1 до 4 въглерода, -OC(=O)R9, OC(=O)NRnR12, -O(CH2)pNR11R12, -O(CH2)POR10, заместен или незаместен арилалкил, имащ от 6 до 10 въглерода и заместен или незаместен хетероарилалкил;
R3, R4, R5 и R6 са всеки независимо избран от групата, съдържаща:
Н, арил, хетероарил, F, Cl, Br, I, -CN, CF3, -ΝΟ2-, -OH, -OR9,
-OiCH^pNR11^2, -OC(=O)R9, -OC(=O)NR2R7, -OC(=O)NRnR12, O(CH2)pOR10, -CH2OR10, -NRnR12, -NR10S(=O)2R9, -NR10C(=O)R9; CH2OR14, където R14 е остатък на аминокиселина след като хидроксилната група на карбоксилната група е премахната;
-NR10C(=O)NR11R12, -CO2R2, -C(-O)R2, -C(=O)NRnR12, -CH=NOR2, CH=NR9, -(CH2)pNRnR12, -(CH2)PNHR14 или -CH=NNR2R2A, където R2A e същия като R2;
-S(O)yR2-(CH2)pS(O)yR9, -CH2S(O)yR14, където у e 0, 1 или 2;
алкил, имащ от 1 до 8 въглерода, алкенил, имащ от 2 до 8 въглерода и алкинил, имащ от 2 до 8 въглерода, където всяка алкилна, алкенилна или алкинилна група е незаместена; или всяка алкилна, алкенилна или алкинилна група е заместена с от 1 до 3 групи, избрани от групата, съдържаща арил, имащ от 6 до 10 въглерода, хетероарил, арилалкокси, хетероциклоалкокси, хидроксиалкокси, алкилокси-алкокси, хидроксиалкилтио, алкоксиалкилтио, F, Cl, Вг, I, -CN, -NO2, -OH, -OR9, -X2(CH2)pNRnR12, X2(CH2)pC(=O)NRnR12, -X2(CH2)pOC(=O)NRnR12, -X2(CH2)pCO2R9, X2(CH2)pS(O)yR9, -X2(CH2)pNR10C(=O)NRnR 12, -OC(=O)R9, -OCONHR2, О-тетрахидропиранил, -NRnR12, -NR10C(=O)R9, -NR10CO2R9,
NR10C(=O)NRnR12, -NHC(=NH)NH2, NR10S(O)2R9, -S(O)yR9, -CO2R2,C(=O)NRnR12, -C(=O)R2, -CH2OR10, -CH=NNR2R2A, -CH=NOR2, CH=NR9, -CH=NNHCH(N=NH)NH2, -S(=O)2NR2R2A, -P(=O)(OR10)2, -OR14 и монозахарид, имащ от 5 до 7 въглерода, където всяка хидроксилна група на монозахарида е независимо или незаместена или заменена от Н, алкил, имащ от 1 до 4 въглерода, алкилкарбонилокси, имащ от 2 до 5 въглерода, или алкокси, имащ от 1 до 4 въглерода;
X2 е О, S или NR10;
8
R и R са всеки независимо избран от групата, съдържаща Н, алкил, имащ от 1 до 4 въглерода, алкокси, имащ от 1 до 4 въглерода, заместен или незаместен арилалкил, имащ от 6 до 10 въглерода, заместен или незаместен хетероарилалкил, -(CH2)POR10, -(CH2)pOC(^O)NRR12 и (CH2)pNR R , или R и R заедно образуват свързваща група с формула СН2-Х -СН2-, където X е X или връзка;
ш и η са независимо 0, 1 или 2;
Υ е избран от групата, съдържаща -0-, -S-, -N(R10)-, -N+(O')(R10)-, N(OR10)- и -СН2-;
Z е избран от групата, съдържаща връзка, -0-, -СН=СН-, -S-, С(=О)-, -CH(OR10), -N(R10)-, -N(OR10)-, -CH(NRnR12)-, -C(=O)N(R17)-, N(R17)C(=O)-, -N(S(O)yR9)-, -N(S(O)yNRnR12)-, -N(C(=O)R17)-, -C(R15R16)-, -N+(O)(R10)-, -CH(OH)-CH(OH)- и -CH(O(C=O)R9)CH(OC(=O)R9A)-, където R9A е същия като R9;
R15 и R16 са независимо избрани от групата, съдържаща Н, -ОН, C(=O)R10, -О(С О)R9, хидроксиалкил и -CO2R10;
R е избран от групата, съдържаща Н, алкил, арил и хетероарил;
А1 и А2 са избрани от групата, съдържаща Η, Η; Н, OR2; Н, -SR2; Н, -N(R )2; и група, където А и А взети заедно образуват единица, избрана от групата, съдържаща =0, =S и “ NR2;
В1 и В2 са избрани от групата, съдържаща Η, Η; Н, -OR2; Н, -SR2, Н, -N(R2)2; и група, където В1 и В2 заедно образуват единица, избрана от групата, съдържаща =0, =-S и =NR2;
при условие, че поне една от двойките А1 и А2, или В1 и В2, образуват =0.
Настоящето изобретение осигурява също методи за модулиране активността на сложна линия киназен белтък, състоящи се от контактуване на белтъка или клетка, съдържаща белтъка, със съединение с формула Ш:
където
Zi е Н и Ζ2 е Н или Ζι и Z2 заедно образуват =0;
Ri е избран от групата, съдържаща Н, Cl, CH2SO2C2H5, Br CH2S(CH2)2NH2, CH2S(CH2)2N(CH3)2, CH2S(CH2)2NH211-С4Н9, NHCONHC6H5, NHCONHC2H5, CH2SC2H5, CH2SC6H5, N(CH3)2, СНз, CH2OCONHC2H5, NHCO2CH3, CH2OC2H5, CH2N(CH3)2, OH, 0-nпропил, CH=NNH-C(=NH)NH2, CH=N-N(CH3)2, CH2S(CH2)2NH-n-C4H9, CH2OCH2OCH2CH3, СН28[3-(1,2,4-триазин)], CH2CH2SCH3;
Г\
CH=N—N NCH3 \_7
R2 е избран от групата, съдържаща Н, Br, Cl, I, CH2S(CH2)2N(CH3)2, NHCONHC2H5, CH2SC2H5, СН2ОСН2ОСН2СН3, СН28[3-(1,2,4-триазин)], CH2CH2SCH3 и CH2OH;
X е избран от групата, съдържаща Н, СН2ОН, CH2NH-CepHHH, СО2СН3, CONHC6H5, CH2NHCO2C6H5, CH2NHCO2CH3, CH2N3, CONHC2H5, СН2МНТлицин, CON(CH3)2, -CH2NHCO2-, CONH2, CONHC3H7, CH2NH-CepHH, CH2SOCH3, CH=NOH, СН2ХН-Пролин, СН2СН2(2-Пиридил), CH-NN HC(-NH)NH2, CONH(CH2)2OH, CH=NNHCONH2, CH2OCOCH3, -CH2OC(CH3)2O-, CH2SC6H5, CH2SOC6H5, СО2п-хексил, CONHCH3 и CO2(CH2)4CH3; или една от следните формули
/—\
CON О \_/
R е избран от групата, съдържаща ОН и ОСН3.
Настоящето изобретение осигурява също методи за модулиране активността на сложна линия киназен белтък, състоящи се от контактуване на белтъка или клетка, съдържаща белтъка, със съединение
с формула IV:
където
Zi е Н и Z2 е Н или Ζι и Z2 заедно образуват =0;
Ri е Н или Вг;
R2eH;
IV
R3 е H, СН2СН=СН2, СН2СН2СН2ОН или
R4 е Н, СН2СН=СН2 или СН2СН2СН2ОН.
Кратко описание на схемите
С цел илюстриране на аспектите на настоящето изобретение, някои признаци са показани в схемите. Трябва да се знае, обаче, че това изобретение не се ограничава само до показаните аспекти.
Фигура 1 е схематично представяне на общото приготвяне на мостови инденопиролокарбазоли.
Фигура 2 е схематично представяне на общото приготвяне на мостови инденопиролокарбазоли.
Фигура 3 е схематично представяне на приготвянето на инденопиролокарбазоли със синтетична смола като свързващо вещество.
Фигура 4 е схематично представяне на приготвянето на защитени, разтворими инденопиролокарбазоли.
Фигура 5 е схематично представяне на приготвянето на междинния продукт V.
Фигура 6 е схематично представяне на приготвянето на мостови инденопиролокарбазоли, използвайки метод А.
Фигура 7 е схематично представяне на приготвянето на мостови инденопиролокарбазоли, използвайки метод В.
Фигура 8 е схематично представяне на приготвянето на заместени в В-пръстена мостови инденопиролокарбазоли.
Фигура 9 е схематично представяне на получаването на производни в Е пръстена на мостови инденопиролокарбазоли.
Фигура 10 представя графика на два отделни експеримента, очертаваща количеството на жизнеспособни невронни диференцирани PC-12 клетки, оставащи след 5 дневно култивиране при отсъствието на NGF. Резултатите са представени като процент на контролни NGF във всяка група (контрол на носителя при отсъствието на NGF, п=12; всички други групи, п=3). Разликата между контрола на носителя и стабилните
извадки на клетки, изразяващи доминантен негативен MLK-3 мутант при отсъствие на NGF е статистически значима, като се определя чрез двустранен Т-тест (р<0.05).
Фигура 11А показва фосфорилирането на GST-SEK-1 безжизнена киназа от FLAG-MLK-3 (смес на цяла дължина и област на киназа), извлечена от пръчковиден вирус, използвайки тест на основата на радиоактивен гел.
Фигура ИВ показва 32Р-белязан фосфоририлиран миелинов основен белтъчен продукт, образуван в резултат на реакция на киназа, катализирана от FLAG-MLK-3 (смес на цяла дължина и област на киназа), извлечена от пръчковиден вирус, или от GST-MLK-3 киназна област.
Фигура 12 е имунен анализ, показващ фосфорилирането на GSTSEK-1 безжизнена киназа от FLAG-MLK-3 (смес на цяла дължина и област на киназа), извлечена от пръчковиден вирус, определен чрез фосфоспецифично SEK-1 антитяло.
Фигура 13 е фосфорилирането на миелинов основен белтък от бактериално извлечена GST-MLK-3 киназна област, използувайки (о) мултискринингов тест на преципитация на трифлуороцетна киселина, или (·) метод на фосфоцелулозната мембрана.
Фигура 14 показва кривата на сатурация на [ Н]К252а инкубирана с лизат на клетки на насекоми, инфектирани с MLK-3 пръчковиден вирус.
Фигура 15 А показва количеството 32Р-белязан c-jun при имунопреципитатна/киназна реакция от клетки свръхизвличащи MLK-3, MLK-2 или DLK и обработвани или с 0.025% DMSO (контрол), или 500 пМ К-252а.
Фигура 15В показва графично количествено определяне на процентната активност, оставаща при имунопреципитатни/киназни реакции от проби, описани във фигура 15 А. Колоните представляват средните дублирани проби, където границата на грешката показва варирането на средната стойност.
Фигура 15C показва количеството Р-белязан c-jun при имунопреципитация/киназна реакция от клетки, които са свръхекспресивни по отношение на HA-JNK1 самостоятелно или с МЕКК1 при различни количества на клетъчна ДНК, както е показано и обработвани или с 0.025% DMSO (контрол), или 500 пМ от Съединение Ш-З (виж таблица 3). Колоните представляват средните удвоени проби, където границата на грешката показва варирането на средната стойност.
Фигура 16 показва, че Съединение Ш-З спомага невронното оцеляване в модел зависещ от концентрацията. Дисоциирани неврони се култивират от симпатиковите ганглии (SG) (А), ганглиите на дорзалния корен (DRG) (В), цилиарния ганглий (CG) (С) и мотоневрони (MN) (D) при наличието или отсъствието на показаните торфични фактори. Клетките били изброени 48 часа след поставянето, както е описано в материали и методи. Данните представят средните стойности ± SD на тройно или четворно повторените определяния. Показан е един от три експеримента.
Фигура 17 показва фазово контрастни микрографии на култури на Е12 DRG (А,Е), Е9 симпатикови (B,F), Е8 цилиарни (C,G) и Е5.5 моторни неврони (D,H) след 48 часа в култура (24 часа за цилиарни неврони) при наличието на съответния невротропен фактор (20 ng/mL NGF за симпатиковите и сензорни неврони 10 ng/mL CNTF за цилиарни неврони, 30 pg/mL мускулен екстракт (МЕХ) за мотоневрони (А-D) или в присъствието на 1 μΜ Съединение Ш-З (Е-Н). Бар = 200 pm.
Фигура 18 показва фотомикрография на експлантанти на ганглий на дорзалния корен in vitro. Експлантанти от пиле DRG (Е9) се поставят в 96 гнездни плочки в среда, съдържаща 0.05% BSA. След 2 часов период за прикрепване, се правят допълнително: (А) контролен DMSO; (В) 20 ng/mL NGF; (С) 250 пМ Съединение Ш-З. Четирдесет и осем часа покъсно, средата се отстранява и експлантите се фиксират с 4% параформалдехид във фосфатен буферен разтвор.
Фигура 19 показва броя на пилешките лумбални моторни неврони, оцеляващи върху Е10 след еднодневно обработване (Е5-9) със специфични дози на Съединение Ш-З. Представените данни са средната стойност ± SD на група от 5-6 обработвани животни. Този експеримент се повтаря два пъти. Данните са от един представителен експеримент и представят една страна на лумбалната колона. *р<0.01, **р<0.001, t-тест на Student между Съединение Ш-З и контролни групи с корекция на Bonferroni.
Фигура 20 показва броя на моторни неврони в спиналните ядра на булбус кавернозус (SNB) на женски плъх, оцеляващи върху PN10 или PN60 след еднодневно обработване (PN1-5) със Съединение Ш-З, или контролен пълнител (5% Разтвор™). Върху PN10 (А,В) или PN60 (В), плъховете били убити и областта на гръбначния мозък, съдържаща SNB била отпрепарирана и приготвена за хистология; Cresylecht виолетово оцветените моторни неврони били след това преброени в серия от срезове на гръбначния мозък на ниво L5-S1, както е описано по-рано (Wingfield, et al., Steroids, 1975, 26, 311-327). Експерименталните данни са средните ± S.E.M. от 4-8 животни на обработвана група.
Фигура 21 показва загуба на ChAT имунореактивност след аксонотомия на подезичния нерв при възрастен плъх след обработване със Съединение Ш-З. Фотомикрографии на ядрото на подезичния нерв след прерязването му и обработването с (А) пълнителен разтвор (5% Разтвор™) и (В) 200ug Съединение Ш-З, приложено от страната на прерязването. (С) Брой на ChAT-имунореактивни моторни неврони на подезичния нерв след обработването, описано в (А) и (В) по-горе. Резултатите са представени като процент на ChAT-имунореактивни моторни неврони със 100% определени като брой на ChATимунореактивни моторни неврони в контралатералното ненаранено ядро на подезичния нерв.
Фигура 22 показва инхибиране на MLK-3 пътя демонстрира in vivo ефикасност и блокаж на фосфорилиране на по-долните нива. Фигура 22А показва нарастване на хидролаза на тирозин на имунореактивни неврони на черното вещество след лезия на МРТР при системно въвеждане на Съединение Ш-З. Фигура 22В е представително имунно оцветяване, показващ МРТР, предизвикващ нарастване нивата на форфорилирана МКК4. Фигура 22С очертава представително имунно оцветяване и ELISA, показващ отслабване на МРТР индуцирана фосфорилирана МКК4 при наличието на Съединение Ш-З.
Фигура 23 показва индукция на IL-2 в клетки на Jurkat. Фигура 23А показва кривата на времето на индукция на IL-2. Фигура 23В показва инхибиране индукцията на IL-2 от Съединение Ш-З. Фигура 23С показва инхибиране на индукция на IL-2 от Съединение Ш-З и Съединение 1-4.
Подробно описание на изобретението
Използуваните по-горе и в цялото описание на настоящето изобретение термини, освен ако не е споменато друго, трябва да се разбира, че имат следните значения.
“Апоптоза” се отнася до специфична морфологична форма на клетъчна смърт, характеризираща се с фрагментация на клетки и техните ядра до частици оградени е мембрана. Апоптоза може да бъде предизвикана, например, от обработване със съединения причиняващи апоптоза, такива като етопозид, стауроспорин, туморонекротичен фактор-α, церамид и подобните, или от условия, такива като рентгенова радиация.
Терминът “клетъчна смърт” се отнася до смърт на клетки от апоптоза, некроза или други начини, широко известни на специалистите в областта. “Клетъчна смърт” може да бъде характеризирана, например, като намаляване общия брой на клетките или намаляване клетъчната жизнеспособност в сравнение с необработваната контролна популация на клетки. Съединения, които “спомагат клетъчна смърт” водят до намаляване броя на клетките или клетъчната жизнеспособност в сравнение с контролната популация. Обратно на това, съединения, които “спомагат клетъчното оцеляване” водят до нарастване броя на клетките или клетъчната жизнеспособност, или които забавят или намаляват степента на клетъчната смърт.
Термините “реагира селективно” или “свързва се специфично” описва съединения, които физически или химически взаимодействат пряко с MLK белтък. Обратно на това, съединенията, които “не реагират селективно” или “не се свързват специфично” могат да повлияят белтъците на по-долните или по-горните нива на MLK белтъка и по този начин могат да повлияят активността на MLK белтъците, но не взаимодействат физически или химически пряко с MLK белтък.
Терминът “модулира” се отнася до нарастване или намаляване активността на определен белтък или производен субстрат.
Настоящето изобретение е насочено, в частност, към методи за определяне на съединения, които модулират активността на MLK белтък и спомагат или оцеляването на клетката, или клетъчната смърт. Съединения, които водят до нарастване активността на MLK белтъка могат да спомагат клетъчната смърт, докато съединения, които водят до намаляване активността на MLK белтъка могат да спомагат оцеляването на клетката.
MLK белтъкът може да бъде всеки белтък, определен като принадлежащ към MLK клас на белтъците. За предпочитане, MLK белтъкът се избира от групата, състояща се от MLK1, MLK2, MLK3, (SPRK, РТК1), LZK, DLK (ZPK, MUK) и MLK6, които са описани погоре. В предпочитан аспект на изобретението, методите определят съединения, които пряко взаимодействат или се свързват с MLK белтъка, както е определено чрез изследвания на свързване, изследвания на киназа или други еквивалентни изследвания.
За да се определят съединенията, които модулират активността на MLK белтъка и предизвикват клетъчно оцеляване или клетъчна смърт, клетка или клетки, съдържащи MLK белтък влиза в съприкосновение с изследваното съединение. Съприкосновението се извършва в буфери или среда, които са добре известни на специалистите в областта. Друга възможност е съприкосновението да се извърши in vivo, където животно, като, например, мишка или друго подходящо животно, известно на специалистите в областта, е в съприкосновение чрез въвеждане на фармацевтична смес, съдържаща изследваното съединение и фармацевтично приемлива сол, носител или разредител. Освен това, могат да бъдат използувани различен брой клетки и концентрации на изследвани съединения. Определя се дали изследваното съединение нараства или намалява активността на MLK белтъка. Освен това, определя се също дали изследваното съединение спомага клетъчното
оцеляване или клетъчната смърт.
Клетките, които са в съприкосновение с изследваните съединения, могат да бъдат клетки на който и да е бозайник. За предпочитане, клетката е невронна клетка. За предпочитане, клетката е въвлечена в невродегенеративно заболяване. За целите на настоящето изследване, “невродегенеративно заболяване”, “невродегенеративна нарушение” и “невродегенеративно състояние” са взаимозаменими и се използват, за да опишат всяко заболяване или нарушение, въвличащо нервни клетки или клетки, обхванати в нервната система, включващи, но не се ограничават само до, болест на Alzheimer, заболяване на моторния неврон, амиотрофична латерална склероза, болест на Parkinson, цереброваскуларно заболяване, исхемични състояния, деменция от СПИН, епилепсия, болест на Huntingtion и контузионни или проникващи наранявания на главния или гръбначния мозък.
Активността на MLK белтъка може да бъде определена с различни техники. Например, активността на MLK може да бъде определена чрез измерване активността на субстрата на MLK белтъка. Такива субстрати са добре известни и лесно различими за специалистите в областта. За предпочитане, субстратът е член на фамилия кинази на митогенно
активирана белтък киназа или фамилия кинази на митогенно активиран белтък или по-нататъшни субстрати, които включват, но не се ограничават само до, белтък избран от групата съдържаща JNK1, JNK2, JNK3, ERK1, ERK2, ρ38α, ρ38β, ρ38γ, ρ38δ, МЕК1, MEK2, МККЗ, MKK4 (SEK1), MEK5, MKK6, MKK7, jun, ATF2, ELK1 и AEX-3 хомолог на бозайник, а също така общи субстрати на Ser/Thr белтъчни кинази, такива като миелинов основен белтък (МВР). Реактиви и методи за измерване активността на субстратите също са известни на специалистите в областта. Наличието на MLK също може да бъде определено чрез измерване количеството на MLK белтъка или mRNA, кодиращ MLK белтъка. Реагиращи вещества, включително антитела и олигонуклеотидни проби, както и методи за измерване количеството на DNA или белтъка, включително Северни и Западни оцветявания, са добре известни на специалистите в областта. Активността на MLK белтъка може също да бъде определена чрез киназен тест in vitvo. Киназните тестове in vitro са добре известни на специалистите в областта. На специалистите в областта са известни и други техники на измерване активността на белтъка и които са обхванати от настоящето изобретение. Така, специалист в областта може да определи дали изпитваното съединение модулира, т.е. увеличава или намалява активността на MLK белтъка.
Дали изпитваното съединение спомага или не клетъчното оцеляване или клетъчната смърт, се определя по няколко начина. За предпочитане е причиняването на клетъчно оцеляване или клетъчна смърт да се определя чрез използване на клетки, за които съществува риск да умрат и сравняване количеството на клетките, които са били в контакт с изпитваното съединение и останалите живи с количеството клетки, които не са били в контакт с изпитваното съединение и останалите живи. За предпочитане е клетките да са първични ембрионни клетки от мотоневрони, които са програмирани да умрат. Първичните ембрионални клетки от мотоневрони са описани в Maroney, et al., 1998, 18, 104-111,
което е включен тук чрез позоваване в неговата цялост. Първичните ембрионални клетки от мотоневрони ще умрат, освен ако не бъдат избавени от изпитваното съединение. Така, по-големият брой живи мотоневронни клетки в популацията на мотоневронни клетки, обработвани с изпитваното съединение, сравнени с броя мотоневронни клетки в популацията на мотоневронните клетки, които не са били обработвани с изпитваното съединение, е показателен за изпитвано съединение, което спомага клетъчното оцеляване. Обратно на това, помалкият брой живи мотоневронни клетки в популацията на мотоневронни клетки, обработвани с изпитваното съединение, сравнени с броя мотоневронни клетки в популацията на мотоневронните клетки, които не са били обработвани с изпитваното съединение, е показателен за изпитвано съединение, което спомага клетъчната смърт.
В друг предпочитан аспект на изобретението, нормални клетки, или див тип клетки, се превръщат в клетки, за които съществува риск да умрат, чрез свръхекспресивност на MLK белтък, както е описано в Примерите по-долу и след това се осъществява контакт с изпитваното съединение. Клетките, които са свръхекспресивни по отношение на MLK белтъци, могат да загинат, освен ако не бъдат спасени от изпитваното съединение. Свръхекспресивност на MLK белтъци може да бъде извършена, използвайки преносители, които могат да осъществят експресивност на даден белтък вътре в клетката. Носителите на експресивност са добре известни на специалистите в областта. В допълнение, методи, приготвящи носители на експресивност, също са известни на специалистите в областта. Носители на експресивност, които могат да изразяват някой от MLK белтъците, могат да бъдат приготвени по подобен начин на тези, описани в Примерите. По-големият брой живи клетки в популацията на клетките на свръхекспресия, обработвани с изпитваното съединение, сравнени с броя живи клетки в популацията на клетките на свръхекспресивност, които не са били обработвани с изпитваното съединение, е показателен за изпитвано съединение, което спомага клетъчното оцеляване. Обратно на това, по-малкият брой живи клетки в популацията на клетките на свръхекспресивност, обработвани с изпитваното съединение, сравнени с броя живи клетки в популацията на клетките на свръхекспресивност, които не са били обработвани с изпитваното съединение, е показателен за изпитвано съединение, което
спомага клетъчната смърт.
В друг предпочитан аспект на изобретението, подпомагането на клетъчното оцеляване се определя чрез наблюдаване или измерване намаляване на апоптозата. Цитоплазматичното свиване и ядреното кондензиране са свързани с апоптоза. Така, специалист в областта може да измери намаление при апоптоза чрез измерване или наблюдаване намаляването на цитоплазматичното свиване и/или ядреното кондензиране. Освен това, специалист в областта може да измери апоптозата чрез прилагане на общоприети техники на оцветяване.
В друг предпочитан аспект на изобретението, нормални, див тип невронни клетки могат да бъдат използвани за да идентифицират съединения, които спомагат клетъчната смърт. Нормалните невронни клетки ще оцелеят, освен ако не е предизвикана смъртта им от изследваното съединение. По-малкият брой живи клетки в популацията на нормални клетки, обработвани с изпитваното съединение, сравнени с броя живи клетки в популацията на нормални клетки, които не са били обработвани с изпитваното съединение, е показателен за изпитвано съединение, което спомага клетъчната смърт. Обратно на това, поголемият или равен брой живи клетки в популацията на нормални клетки, обработвани с изпитваното съединение, сравнени с броя живи клетки в популацията на нормални клетки, които не са били обработвани с изпитваното съединение, не е показателен за изпитвано съединение, което спомага клетъчната смърт.
Настоящето изобретение се отнася също, отчасти, за методи за модулиране активността на MLK белтък, състоящи се от контактуване на белтъка или клетка, съдържаща белтъка, със съединение с формула G (означената тук с формула I) представено в Патент на САЩ № 5,705,511, който е прехвърлен на правоприемника на настоящата заявка и е включен тук чрез позоваване в неговата цялост.
Настоящето изобретение се отнася също, отчасти, за методи за модулиране активността на MLK белтък, състоящ се от контактуване на белтъка или клетка, съдържаща белтъка, със съединение с формула III, представена по-долу:
където
Z\ е Н и Z2 е Н или Z\ и Z2 заедно образуват =0;
Ri е избран от групата, състояща се от Н, Cl, CH2SO2C2H5, Br, CH2S(CH2)2NH2, CH2S(CH2)2N(CH3)2, CH2S(CH2)2NH2, П-С4Н9, NHCONHC6H5, NHCONHC2H5, CH2SC2H5, CH2SC6H5, N(CH3)2, ch3,
CH2OCONHC2H5, NHCO2CH3, CH2OC2H5, CH2N(CH3)2, OH, 0 п-пропил
CH=NNH-C(=NH)NH2, CH=N-N(CH3)3, CH2S(CH2)2NH-n-C4H9,
CH2OCH2OCH2CH3, СН28[3-(1,2,4-триазин)], CH2CH2SCH3,
R2 е избран от групата, състояща се от Н, Br, Cl, I, CH2S(CH2)2N(CH3)2, NHCONHC2H5, CH2SC2H5, СН2ОСН2ОСН2СН3, СН28[3-(1,2,4-триазин)], CH2CH2SCH3 и СН2ОН;
X е избран от групата, състояща се от Н, СН2ОН, CH2NH-CepiniH, СО2СН3, CONHC6H5, ch2nhco2c6h5, ch2nhco2ch3, ch2n3,
CONHC2H5, CH2NH-Fjihlihh. CON(CH3)2, -CH2NHCO2-, CONH2, CONHC3H7, CH2NH-CepHH, CH2SOCH3, CH=NOH, СН2КН-Пролин,
СН2СН2(2-Пиридил), CH=NNHC(=NH)NH2, CONH(CH2)2OH, ch=nnhconh2, CH2OCOCH3, -CH2OC(CH3)2O-, ch2sc6h5, CH2SOC6H5, СО2п-хексил, CONHCH3 и CO2(CH2)4CH3; или една от следните формули
/-\ со1\_/
и
R е избран от групата, състояща се от ОН и ОСН3.
В предпочитан аспект на изобретението, Ζι и Z2 са Η, X е СО2СН3, Ri е NHCONHC2H5, R2 е СН2СН2(2-Пиридил) и R е ОН. В други предпочитани аспекти на изобретението Ζι и Z2 са Η, X е СО2СН3, Ri и R2 са СН2ОСН2ОСН2СН3 и R е ОН; или Z! и Z2 са Η, X е СО2СН3, Ri и R2 са CH2SCH2CH3 и R е ОН; или Zb Z2, Ri и R2 са Η, X е СО2СН3; и R е ОН; или Zj, Z2, Ri и R2 са Η, X е СО2(СН2)4СН3 и R е ОН; или Zb Z2 и Rb са Н, R2 е СН2ОН, X е СО2СН3 и R е ОН; или Ζι и Ζ2 са Н, Ri и R2 са Н28[3-(1,2,4-триазин)], X е СО2СН3 и R е ОН; или Ζι и Ζ2 са Н, Ri е Br, R2 е I, X е СО2СН3; и R е ОН; или Ζι и Z2 са Н, Ri и R2 са CH2CH2SCH3, X е СО2СН3 и R е ОН; или Zb Z2, Ri и R2 са Η, X е СО2СН3 и R е ОСН3; или Ζι и Ζ2 заедно образуват =0, Ri и R2 са Br, X е СО2СН3 и R е ОН.
Настоящето изобретение се отнася също, отчасти, за методи за модулиране активността на MLK белтък, състоящ се от контактуване на белтъка или клетка, съдържаща белтъка, със съединение с формула II, представена по-долу:
където пръстен В и пръстен F, независимо и всеки заедно с въглеродните атоми, към които те са прикрепени, са избрани от групата, състояща се от:
а) ненаситен 6-членен карбоцикличен ароматен пръстен, при който от 1 до 3 въглеродни атома могат да бъдат заменени от азотни атоми;
б) ненаситен 5-членен карбоцикличен ароматен пръстен; и
в) ненаситен 5-членен карбоцикличен ароматен пръстен, при който или
1) един въглероден атом е заменен от кислород, азот или серен атом;
2) два въглеродни атома са заменени от серен и азотен атом, кислороден и азотен атом, или два азотни атома; или
3)три въглеродни атома са заменени от три азотни атома; R1 е избран от групата, състояща се от:
a) Н, заместен или незаместен алкил с от 1 до 4 въглерода, заместен или незаместен арил, заместен или незаместен арилалкил, заместен или незаместен хетероарил, или заместен или незаместен хетероарилалкил;
6)-C(=O)R9, където R9 е избран от групата, състояща се от алкил, арил и хетероарил;
b) OR10, където R10 е избран от групата, състояща се от Н и алкил имащ от 1 до 4 въглерода;
© r)-C(=O)NH2, -NR11R12,-(CH2)pNR11R12, -(CH2)pOR10, (CH2)pOR10H-O(CH2)pNRnR12, където p е от 1 до 4; и където или
1) R и R са всеки независимо избран от групата, състояща се от Н и алкил имащ от 1 до 4 въглерода; или
2) R11 и R12 заедно образуват свързваща група с формула (СНгЬ-ХЧСНгХ-, където X1 е избран от групата, състояща се от -0-, -Sи -СН2-;
R е избран от групата, състояща се от Н, алкил имащ от 1 до 4 въглерода, -ОН, алкокси имащ от 1 до 4 въглерода, -OC(=O)R9, OC(=O)NRnR12, -O(CH2)pNRnR12, -O(CH2)pOR10, заместен или © незаместен арилалкил имащ от 6 до 10 въглерода и заместен или незаместен хетероарилалкил;
R3, R4, R5 и R6 са всеки независимо избран от групата, състояща се от:
а) Н, арил, хетероарил, F, CI, Br, I, -CN, CF3, -NO2,-OH, -OR9, O(CH2)pNRnR12, -OC(=O)R9,-OC(=O)NR2R7, -OC(=O)NRnR12, O(CH2)pOR10, -CH2OR10, -NRnR12, -NR10S(=O)2R9, -NR10C(=O)R9;
б) -CH2OR14, където R14 е остатъка на аминокиселина, след като хидроксилната група на карбоксилната група е премахната;
в)- NR10C(=O)NRnR12, -CO2R9, -C(=O)R2, -C(=O)NRnR12, CH=NOR2, -CH=NR9, -(CH2)pNRnR12, -(CH2)PNHR14, или -CH=NNR2R2A където R2A е същия както R2;
r)-S(O)yR2 -(CH2)pS(O)yR9, -CH2S(O)yR14, където у e 0,1 или 2;
д) алкил имащ от 1 до 8 въглерода, алкенил имащ от 2 до 8 въглерода и алкинил имащ от 2 до 8 въглерода, където
1)всяка алкилна, алкенилна или алкинилна група е незаместена;
или
2) )всяка алкилна, алкенилна или алкинилна група е
заместена с от 1 до 3 групи, избрани от групата, състояща се от арил имащ от 6 до 10 въглерода, хетероарил, арилалкокси, хетероциклоалкокси, хидроксиалкокси, алкилокси-алкокси, хидроксиалкилтио, алкокси-алкилтио, F, Cl, Вг, I, -CN, -NO2, -OH, -OR9, X2(CH2)pNRnR12, -X2(CH2)pC(=O)NRnR12, -X2(CH2)pOC(=O)NRnR12, X2(CH2)PCO2R9, -X2(CH2)pS(O)yR9, -X2(CH2)pNR10C(=O)NR11R12, OC(=O)R9, -OCONHR2, -О-тетрахидропиранил, -NRnR12, -NR10C(=O)R9, NR10CO2R9, -NR10C(=O)NR11R12, -NHC(=NH)NH2, NR10S(O)2R9, -S(O)yR9, -CO2R2, -C(=O)NRnR12, -C(=O)R2, -CH2OR10, -CH=NNR2R2A, -CHNOR2, -CH=NR9, -CH=NNHCH(N=NH)NH2, -S(=O)2NR2R2A, -P(=O)(OR10)2, -OR14
и монозахарид имащ от 5 до 7 въглерода, където всяка хидроксилна група на монозахарида е независимо или незаместена или е заменена от Н, алкил имащ от 1 до 4 въглерода, алкилкарбонилокси имащ от 2 до 5 въглерода, или алкокси имащ от 1 до 4 въглерода;
Х2еО, S, hbhNR10;
8
R и R са всеки независимо избран от групата, състояща се от Н, алкил имащ от 1 до 4 въглерода, алкокси имащ от 1 до 4 въглерода, заместен или незаместен арилалкил имащ от 6 до 10 въглерода, заместен или незаместен хетероарилалкил, -(CH2)POR10, -(CH2)pOC(=O)NRnR12 и 11 12 7 8 (CH2)PNR R ; или R и R заедно образуват свързваща група с формула -СН2-Х3-СН2-, където X3 е X2 или връзка;
m и η са всеки независимо 0,1, или 2;
Υ е избран от групата, състояща се от -0-, -S-, -N(R10)-, -N+(O')(R10), -N(OR10)- и -СН2-;
Z е избран от групата, състояща се от връзка, -0-, -СН=СН-, -S-, С(=0)-, -CH(OR10)-, -N(R10)-, -N(OR10)-, CH(NRnR12)-, -C(=O)N(R17)-, N(R17)C(=O)-, -N(S(O)yR9)-, -N(S(O)yNRnR12)-, -N(C(=O)R17)-, -C(R15R16), -N+(O’)(R10)-, -CH(OH)-CH(OH)- и -CH(O(C=O)R9)CH(OC(=O)R9A)-, където R е същия, както R ;
R15 и R16 са независимо избрани от групата, състояща се от Н, -ОН, -C(=O)R10, -O(C=O)R9, хидроксиалкил и -CO2R10;
R е избран от групата, състояща се от Н, алкил, арил и хетероарил;
А1 и А2 са избрани от групата, състояща се от Η, Η; Н, OR2; Н, -SR2;
Н, -N(R )2,; и група, където А и А заедно образуват единица избрана от групата, състояща се от =О, =S и =NR2;
В1 и В2 са избрани от групата, състояща се от Η, Η; Н, -OR2; Н, -SR2; Н, -N(R2)2; и група, където В1 и В2 заедно образуват единица избрана от групата, състояща се от =0, =S и =NR2;
при условие, че поне една от двойките А1 и А2, или В1 и В2 образуват =0.
Настоящето изобретение се отнася също, отчасти, за методи за модулиране активността на MLK белтък, състоящи се от контактуване на белтъка или клетка, съдържаща белтъка, със съединение с формула IV, представена по-долу:
където
Zi е Н и Z2 е Н или Zj и Z2 заедно образуват =0;
Ri е Н или Br;
R2eH;
R3 е H, CH2CH=CH2, CH2CH2CH2OH или CH2CH2CH2-
R4 е H, CH2CH=CH2 или CH2CH2CH2OH.
В предпочитан аспект на изобретението,
Ri, R2, R4, Zi и Z2 са H и R3 е СН2СН=СН2. В друг предпочитан аспект на изобретението, Ri е Вг и R2, R3, R4, и Z2 са Н; или Rb R2, Zj и Z2 са Н и R3 и R4 са СН2СН=СН2; или Rb R2, R3, Zi и Z2 са Н и R4 е СН2СН=СН2; или Rb R2, Zi и Z2 са Н и R3 и R4 са СН2СН2СН2ОН; или Rb R2, R4, Z] и Ζ2 са Н и R3 е
СН2СН2СН2— Ν Ο
Настоящето изобретение дава също методи за идентифициране на съединения, които могат да бъдат използвани при лечение на неврологични нарушения, включващи контактуване на клетка или клетъчен екстракт, съдържащ сложна линия киназен белтък със
съединението и определяне дали съединението намалява активността на сложна линия киназен белтък. Клетките и получените екстракти от тях, включват тези описани по-горе. Съединенията, които са открити чрез настоящите методи (напр. тези съединения, които инхибират или намаляват активността на сложна линия киназен белтък) могат да бъдат използвани за лечение на невродегенеративни нарушения. Белтъкът се избира за предпочитане от групата, състояща се от сложна линия киназа 1, сложна линия киназа 2, сложна линия киназа 3, левцин зигзагообразна киназа, двойна левцин зигзагообразна киназа и сложна линия киназа 6. Клетката контактува in vitro или in vivo. За предпочитане, активността на белтъка се определя чрез измерване активността или степента на фосфорилизиране на субстрата на дадения белтък. За предпочитане, субстратът се избира от групата, състояща се от JNK1, JNK2, JNK3,
ERK1, ERK2, ρ38α, ρ38β, ρ38γ, ρ38δ, ΜΕΚ1, ΜΕΚ2, МККЗ, ΜΚΚ4 (SEK1), ΜΕΚ5, ΜΚΚ6, ΜΚΚ7, jun, ATF2, ELK1 и хомолог на бозайник АЕХ-3, както и общите Ser/Thr субстрати, такива като, например, миелинов основен белтък (МВР). Активността на белтъка може да бъде определена също чрез измерване активността на субстрата на белтъка, количеството на субстрата на белтъка или mRNA кодираща субстрата на белтъка. Активността на белтъка може да бъде определена също така чрез киназен тест in vitro или свързващ тест. Клетките са, за предпочитане, първични ембрионални мотоневронни клетки, клетки които притежават свръхекспресивност по отношение на сложна линия киназен белтък или невронна клетка, но могат да бъдат всяка клетка или клетъчен екстракт. За предпочитане, съединенията, които директно се свързват със сложна линия киназен белтък, се определят както е описано по-горе.
Настоящето изобретение дава също така методи за идентифициране на съединения, които могат да бъдат използвани при лечение на възпаление, включващи контактуване на клетка или клетъчен екстракт, съдържащ сложна линия киназен белтък със съединението и определяне дали съединението намалява активността на сложната линия киназен белтък. Клетките и получените екстракти от тях включват тези описани по-горе. Съединенията, които са открити чрез настоящите методи (напр. тези съединения, които инхибират или намаляват активността на сложна линия киназен белтък) могат да бъдат използвани за лечение на възпаление. Белтъкът се избира за предпочитане от групата, състояща се от сложна линия киназа 1, сложна линия киназа 2, сложна линия киназа 3, левцин зигзагообразна киназа, двойна левцин зигзагообразна киназа и сложна линия киназа 6. Клетката контактува in vitro или in vivo. За предпочитане е, активността на белтъка да се определя чрез измерване активността или степента на фосфорилизиране на субстрата на дадения белтък. За предпочитане, субстратът се избира от групата, състояща се от JNK1, JNK2, JNK3, ERK1, ERK2, ρ38α, ρ38β, ρ38γ, ρ38δ, МЕК1, MEK2,
МККЗ, МКК4 (SEK1), МЕК5, МКК6, МКК7, jun, ATF2, ELK1 и хомолог на бозайник АЕХ-3, както и общите Ser/Thr субстрати, такива като, например, миелинов основен белтък (МВР). Активността на белтъка може да бъде определена също чрез измерване активността на субстрата на белтъка, количеството на субстрата на белтъка или mRNA кодираща субстрата на белтъка. Активността на белтъка може да бъде определена също чрез киназен тест in vitro или свързващ тест.
Клетките са за предпочитане първични ембрионални мотоневронни клетки, клетки които притежават свръхекспресивност по отношение на сложна линия киназен белтък или невронна клетка, но могат да бъдат всяка клетка или клетъчен екстракт. Клетките включват също, но не се ограничава само до това, тези въвлечени във възпалението, такива като, например, лимфоцити, макрофаги и други бели кръвни клетки, добре известни на специалистите в областта. За предпочитане, се определят съединенията, които пряко свързват сложна линия киназен белтък.
Настоящето изобретение дава също така методи за лечение на бозайници, които имат или се предполага, че имат невродегенеративно нарушение, включващи прилагане върху бозайника на съединение, което инхибира или намалява активността на сложна линия киназен белтък. Съединение, което инхибира или намалява активността на сложна линия киназен белтък, но не се ограничава само до, съединения с формула I, II, III и IV. Предпочитаните съединения включват тези, описани по-горе, по отношение на метода на изследване на съединенията, които модулират активността на сложна линия киназен белтък и спомагат клетъчното оцеляване или клетъчната смърт. Предпочитан бозайник е човека. Индивидът може да бъде е предполагаемо невродегенеративно заболяване, ако той има симптоми на определено невродегенеративно заболяване, ако е в група на висок риск или има фамилна анамнеза за невродегенеративно заболяване.
Настоящето изобретение дава също така методи за лечение на бозайник с възпаление, включващи прилагане върху даден бозайник на
съединение, което инхибира или намалява активността на сложна линия киназен белтък. Съединение, което инхибира или намалява активността на сложна линия киназен белтък, включва, но не се ограничава само до съединения с формула I, II, III и IV. Предпочитаните съединения включват тези, описани по-горе, по отношение на метода на изследване на съединенията, които модулират активността на сложна линия киназен белтък и спомагат клетъчното оцеляване или клетъчната смърт. Предпочитан бозайник е човека.
Контактуването със съединения с формула Ι-IV може да се извърши в буфери или среда, които са известни на специалистите в областта. Друга възможност е контактуването да се извърши чрез прилагане на фармацевтичен състав, съдържащ изпитваното съединение и фармацевтично приемлива сол, носител или разтворител върху подходящо животно или бозайник, такъв като, например, мишка или друго подходящо животно, известно на специалистите в областта. Освен това, могат да бъдат използвани различен брой клетки и концентрации на съединения. Клетките, които контактуват с изпитваните съединения, могат да бъдат клетки на бозайници. За предпочитане, клетката е невронна клетка. За предпочитане, клетката е въвлечена в невродегенеративното заболяване, такова като, например, болест на Alzheimer, болест на моторния неврон, амиотрофична латерална склероза, болест на Parkinson, цереброваскуларна болест, иехемични състояния, СПИН деменция, епилепсия, болест на Huntington и контузионни и проникващи травми на главния или гръбначния мозък. Съединения с формула I и методи за приготвяне на същото, са описани в Патент на САЩ 5,705,511, който е включен тук чрез позоваване в неговата цялост. Съединения с формула III и методи за приготвяне на същото, са описани в Патенти на САЩ 5,741,8098, 5,621,100, 5,621,101, 5,461,146 и 5,756,494 и WO 97/46567 и всеки е включен тук чрез позоваване в неговата цялост. Съединения с формула IV и методи за приготвяне на същите, са описани в Патенти на САЩ 5,741,8098,
5,621,100, 5,621,101, 5,461,146 и 5,756,494 и WO 97/46567 и всеки е включен тук чрез позоваване в неговата цялост.
Съединения с формула II включват диастереомери и енантиомери около въглеродните атоми към които са прикрепени заместителите R2, R7 hR8.
Предпочитани мостови инденопиролокарбазоли са представени чрез формула II:
Ri
П
В предпочитани аспекти на съединенията с формула II, R’e Н. В понататъшни предпочитани аспекти, R2 е Н, хидроксид или заместен или незаместен алкил.
В други предпочитани аспекти, R3, R4, R5 и R6 са независимо Н, заместен или незаместен алкил, халоген, заместен или незаместен алкокси, заместен или незаместен амино или заместен или незаместен арил. В по-нататъшни предпочитани аспекти, R7 и R8 са независимо Н, заместен или незаместен алкил.
В някои предпочитани аспекти, Y е О. В по-нататъшни предпочитани аспекти Z е връзка, О, S или заместен или незаместен N. В някои още по-нататъшни предпочитани аспекти, m и η са независимо 1 или 2. В някои особено предпочитани аспекти, Υ е Ο, Ζ е връзка или О и m и η са независимо 1 или 2.
12
В по-нататъшни предпочитани аспекти, А А и В В са =0 или Н,Н.
В някои особено предпочитани аспекти, R1, R4, R6 и R7 са всеки Н, Y е =0, η е 1, А1 А2 и В*В2 са =0 или Н,Н, R2 е Н, ОН или по-низш алкил, R3 е Н или заместен алкил, R5 и R8 са всеки Н или алкокси група, която за предпочитане е метокси, Ζ е връзка или О и m е 1 или 2.
Някои особено предпочитани аспекти на съединенията с формула II са съединения П-1, П-2, П-З, П-4а, II-4b, П-5, П-6, II-7a, II-7b, П-8, П-9, ΠΙΟ, П-11 и П-12, показани по-долу в Таблица 1.
Съединенията, представени с формула II, се представят по-нататък тук като Съединение (II).
Както се използва тук, понятието “карбоцикличен” се отнася до циклични групи, където пръстенът се състои само от въглеродни атоми. Понятията “хетероцикло” или “хетероцикличен” се отнасят до циклични групи, където пръстенът включва поне един хетероатом, такъв като Ο, N или S.
Както се използва тук, понятието “алкил” означава правоверижна, циклична или разклонена алкидна група, имаща от 1 до 8 въглеродни атома, такива като метил, етил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, секбутил, трет-бутил, пентил, изоамил, неопентил, 1-етилпропил, хексил, октил, циклопропил и циклопентил. Алкидната част на алкил съдържащите групи, такива като алкокси, алкоксикарбонил и алкиламинокарбонилни групи, имат същото значение като определения по-горе алкил. По-низши групи, които се предпочитат, са алкидни групи, както са определени по-горе, които съдържат от 1 до 4 въглерода. Терминът “алкенил” цели включване на правоверижни или разклонени въглеводородни вериги, имащи поне една въглерод-въглерод двойна връзка. Примери на алкенилни групи включват етенилни и пропенилни групи. Както се използва тук, терминът “алкинил” цели включване на правоверижни или разклонени въглеводородни вериги, имащи поне една въглерод-въглерод тройна връзка. Примери на алкинилни групи включват етинилни и пропинилни групи.
Ацилната част на ацил съдържащите групи, такива като ацилокси групи, цели включване на правоверижни или разклонени алканоилни групи, имащи от 1 до 6 въглеродни атома, такива като формил, ацетил, пропаноил, бутирил, валерил, пивалоил или хексаноил.
Както се използва тук, понятието “арил” означава група, имаща от 6 до 12 въглеродни атома, такива като фенил, бифенил и нафтил. Предпочитани арилни групи включват незаместени или заместени фенилни и нафтилни групи. Понятието хетероарил”, както се използва тук, означава арилна група, където един или повече пръстенни въглеродни атома са заменени от хетеро (т.е. не въглеродни) атоми, такива като Ο, N или S. Предпочитаните хетероарилни групи включват пиридил, пиримидил, пиролил, фурил, тиенил, имидазолил, триазолил, тетразолил, хинолил, изохинолил, бензоимидазолил, тиазолил, пиразолил и бензотиазолил групи.
Понятието “аралкил” (или “арилалкил”) цели означаване група, имаща от 7 до 15 въглеродни атома, състоящи се от алкилна група, която носи арилна група. Примери на аралкилни групи включват бензил, фенетил, бензхидрил и нафтилметил групи.
Алкилни групи и алкилни единици, съдържащи в себе си заместителни групи, такива като аралкил, алкокси, арилалкокси, хидроксиалкокси, алкокси-алкокси, хидрокси-алкилтио, алкоксиалкилтио, алкилкарбонилокси, хидроксиалкил и ацилокси групи, могат да бъдат заместени или незаместени. Заместена алкилна група има от 1 до 3 независимо избрани заместители, за предпочитане хидрокси, понизш алкокси, по-низш алкокси-алкокси, заместен или незаместен арилалкокси-по-низш алкокси, заместен или незаместен хетероарилалкокси-по-низш алкокси, заместен или незаместен или лактам.
арилалкокси, заместен или незаместен хетероциклоалкокси, халоген, карбоксил, по-низш алкоксикарбонил, нитро, амино, моно- или ди-понизш алкиламино, диоксолан, диоксан, дитиолан, дитион, фуран, лактон
Ο
Заместен арил, заместен хетероарил и заместени аралкилни групи, всяка имаща от 1 до 3 независимо избрани заместители, които са за предпочитане по-низш алкил, хидрокси, по-низш алкокси, карбокси, понизш алкоксикарбонил, нитро, амино, моно- или ди-по-низш алкиламино и халоген.
Хетероциклични групи, образувани с азотен атом, включват пиролидинил, пиперидинил, пиперидино, морфолинил, морфолино, тиоморфолино, N-метилпиперазинил, индолил, изоиндолил, имидазол, имидазолин, оксазолин, оксазол, триазол, тиазолин, тиазол, пиразол, пиразолон и триазолни групи. Хетероциклични групи, образувани с кислороден атом, включват фуран, тетрахидрофуран, пиран и тетрахидропиранови групи.
“Хидроксиалкилни” групи са алкилни групи, които имат прикачена към тях хидроксилна група. Халогени включват флуор, хлор, бром и йод.
Както се използва тук, понятието “хетероарилалкил” означава арилалкилна група, която съдържа хетероатом. Понятието “окси” представя наличието на кислороден атом. Така, “алкокси” групи са алкилни групи, които са свързани чрез кислороден атом и “карбонилокси” групи са карбонилни групи, които са свързани чрез кислороден атом.
Понятието “хетероциклоалкокси” означава алкокси група, която има хетероцикло група, свързана към производната алкилна единица и понятието “арилалкокси” означава алкокси група, която има арилна група, свързана към производната алкилна единица. Понятието “алкилкарбонилокси” означава група с формула -О-С(=О)-алкил.
Както се използва тук, понятието “алкилокси-алкокси” означава алкокси група, която съдържа алкилокси заместител, свързан към нейната алкилна половина. Понятието “алкокси-алкилтио” означава алкилтио група (т.е. група с формула -S-алкил), която съдържа алкокси заместител, свързан към нейната алкилна половина. Понятието “хидрокси-алкилтио” означава алкилтио група (т.е., група с формула -S35
алкил), която съдържа хидрокси заместител, свързан към нейната алкидна единица.
Както се използва тук, понятието “монозахарид” има общоприето значение на проста захар.
Както се използва тук, понятието “аминокиселина” означава молекула, съдържаща както амино група, така и карбоксилна група. Те включват α-аминокиселини, т.е., карбоксилни киселини с обща формула НООС-СН(№42)-(странична верига).
Страничните вериги на аминокиселините включват естествено възникващи и неестествено възникващи единици. Неестествено възникващите (т.е. неестествени) аминокиселинни странични вериги са единици, които се използват на мястото на естествено възникващи аминокиселинни странични вериги в, например, аминокиселинни аналози. Виж, например, Lehninger, Biochemistry, Second Edition, Worth Publishers, Inc, 1975, pp 73-75, включено тук чрез позоваване.
Предпочитани α-аминокиселини включват глицин, аланин, пролин, глутаминова киселина и лизин, имащи D конфигурация, L-конфигурация или като рацемат.
Страничните вериги на по-нататък представителните ааминокиселини са показани по-долу в Таблица 1.
Таблица 1
СН,HO-CHjОД-СН,HO-CJVCHr
HS-СН,HOjC-CHCNHjhCHrS-S-CHjCHj-CHr
CH3-S-CHrCH2CH3-CHrS-CH2-CH2HO-CH2-CH2CHj-CH(OH> HO2C-CH2-NHC(=O)-CH,[>
HOaC-CHj-CHjNH2C(=O)-CH2-CH2(CH3)rCH(CH3)2-CH-CH2CH3-CH2-CH2HjN-CHj-CHj-CHr H2N-C(=NH)-NH-CH2-CH2-CH2H2N-C(=O)-NH-CH2-CH2-CH2CHj-CHj-CH(CH3> CH3-CH2-CH2-CH2H2N-CH2-CH2-CH2-CH2B някои предпочитани аспекти, заместителните групи за съединенията с формула II включват остатъка на аминокиселина след заместването на хидроксилната група на производната карбоксилна група, т.е. групи с формула -С(=О)-СН(МН2)-(странична верига).
Функционалните групи, присъстващи в съединенията с формула II, могат да съдържат защитни групи. Например, аминокиселинните странично верижни заместители на съединенията с формула II могат да бъдат заместени от защитни групи, такива като бензилоксикарбонил или Абутилоксикарбонилни групи. Защитните групи са известни, сами по себе си, като функционални групи, които могат да бъдат селективно свързани към и заместени от функционални групи, такива като хидроксилни и карбоксилни групи. Тези групи присъстват в химично съединение, за да предложат такива функционални инертни към химични реакции условия, към които съединението е изложено. Всяка разновидност на защитни групи може да бъде употребена в настоящето изобретение. Такава една защитна група е бензилоксикарбонилната (Cbz; Z) група. Други предпочитани защитни групи съгласно изобретението могат да бъдат открити в Green, T.W. и Wuts, P.G.M., “Protective Groups in Organic Synthesis ”2d.Ed., Wiley&Sons, 1991.
Мостовите инденопиролокарбазолни съединения имат явни важни функционални фармакологични действия, които намират приложение в множество области, включвайки както изследователски, така и лечебни сфери. Тези производни се използват като терапевтични вещества. Действията на съединенията показва положителни ефекти върху функцията и/или оцеляването на клетките, отговорни за трофичния фактор. Ефектът върху функцията и/или оцеляването на клетките, отговорни за трофичния фактор, т.е. клетките на невронния ред, е показан чрез използване на някой от следните тестове: (1) тест на култивирана холинацетилтрансфераза (ChAT) от гръбначния мозък; или тест на активността на култивирана ChAT от базалните неврони на предния мозък.
Както се използва тук, понятието “ефект”, когато се използва за модифициране на термините “функция” и “оцеляване”, означава положително или отрицателно изменение или промяна. Ефект, който е
положителен, може да бъде отнесен тук до “усилване” и ефект, който е отрицателен, може да бъде отнесен тук до “инхибиране”.
Както се използват тук, понятията “усилване” и “инхибиране”, когато се използват за модифициране термините “функция” или “оцеляване”, означават, че наличието на мостово инденопиролокарбазолово съединение има положителен ефект върху функцията и/или оцеляване на клетка, отговорна за трофичния фактор, сравнена с клетка в отсъствието на съединението. Например, но не само, по отношение на оцеляването на т.н. холинергичен неврон, съединението явно ще усили оцеляването на холинергичната невронна популация при риск от загиване (вследствие на, например, травма, болестно състояние, дегенеративно състояние или естествена прогресия), когато се сравнява с холинергичната невронна популация без такова съединение, ако обработваната популация има относително по-голям функционален период, отколкото необработваната популация.
Както се използват тук, “инхибира” и “инхибиране” означават, че специфичен отговор на определено вещество (напр., ензимна активност) е сравнително намален при наличието на мостово инденопиролокарбазолово съединение.
Както се използва тук, терминът “trk” се отнася до фамилия с висок афинитет на невротрофични рецептори, състоящи се понастоящем от trkA, trkB и trkC и други протеини, свързани с мембрани, към които невротрофинът може да се свързва.
Както се използва тук, инхибиране на VEGFR означава използване, например при заболявания, където важна роля играе ангиогенезата, такива като солидни ракови тумори, ендометриоза, диабетна ретинопатия, псориазис, хемангиобластома, както и други очни болести и ракови заболявания.
Инхибирането на trk означава използване, например при заболявания на простатата, такива като рак на простатата и
доброкачествена хиперплазия на простатата и лечение на болка от възпаление.
Инхибиране на произхождащ от тромбоцит рецептор на растежния фактор (PDGFR) означава използване, например при различни форми на неоплазия, ревматоиден артрит, белодробна фиброза, миелофиброза, патологично зарастване на рани, заболявания със сърдечно съдов характер, такива като атеросклероза, рестеноза, рестеноза след ангиопластика и др.
Както се използват тук, термините “рак” и “раков” се отнасят до злокачествена пролиферация на клетки при бозайник. Примерите включват простата, доброкачествена хиперплазия на простата, яйчник, гърда, мозък, бял дроб, панкреас, колоректум, стомах, солидни тумори, глава и шия, невробластом, бъбречен клетъчен карцином, лимфом, левкемия, други известни злокачествени състояния на хемопоетичните системи и други известни ракови заболявания.
Както се използват тук, термините “неврон”, “клетка на невронен ред” и “невронна клетка” включват, но не само, хетерогенна популация на невронни видове, имащи единични или множествени трансмисери и/или единични или множествени функции; за предпочитане, това са холинергични и сензорни неврони. Както се използва тук, фразата “холинергичен неврон” означава неврони на централната нервна система (CNS) периферната нервна система (PNS), чийто невротрансмисер е ацетилхолин; примерни са базалния преден мозък, ивицестото тяло в мозъка и гръбначно мозъчните неврони. Както се използва тук, фразата “сензорен неврон” включва неврони, които са отговорни за дразнителите от околната среда (напр. температура, движение), например от кожа, мускули и стави; примерен е неврон от ганглий на дорзален корен.
“Клетка, отговорна за трофичния фактор” както е определена тук, е клетка, която включва рецептор, към който трофичен фактор може да бъде специфично свързан; примерите включват неврони (напр.
холинергични и сензорни неврони) и неневронни клетки (напр. моноцити и неопластични клетки).
Мостовите инденопиролокарбазолови съединения описани тук намират приложение, както в изследователски, така и терапевтични области, например, при инхибиране ензимната активност. Например, в изследователската област съединенията могат да бъдат използвани при развитие на тестове и модели за по-нататъшно улесняване разбирането на ролята, която инхибирането на киназата на серин/треониновия или тирозиновия белтък (напр., РКС, trk тирозиновата киназа) играе в механичните аспекти на свързаните с тях нарушения и заболявания. В терапевтична област, съединенията, които инхибират тази ензимна активност, могат да се използват да инхибират вредните последствия на тези ензими по отношение на нарушения, такива като рак.
Както показват примерите по-долу, инхибиране на ензимната активност, използвайки мостовите инденопиролокарбазолови съединения, може да бъде определено, използвайки например следните тестове:
1. trkA Тест за инхибиране активността на тирозин киназа;
2. Инхибиране на NGF-стимулирано trk фосфорилиране в цялостен клетъчен препарат;
3. Тест за инхибиране на киназа на съдово ендотелиален рецептор на растежния фактор (VEGFR);
4. Тест за инхибиране на РКС активността;
5. Тест за инхибиране на PDGFR.
Разкритите мостови инденопиролокарбазолови съединения могат да бъдат използвани за ускоряване функцията и/или оцеляване на клетките на невронния ред при бозайник, напр. човек. В този смисъл, съединенията могат да бъдат използвани индивидуално или с други кондензирани пиролокарбазоли и/или индолокарбазоли или в съчетание с други изгодни молекули, които също доказват възможността да се влияе на функцията и/или оцеляването на дадена клетка.
Голям брой неврологични нарушения се характеризират с невронни клетки, които са умрели, наранени, функционално неспособни, претърпели аксонална дегенерация, рискови да умрат и т.н. Тези нарушения включват, но не само, болест на Alzheimer, нарушения на моторния неврон (напр. амиотрофична латерална склероза); болест на Parkinson; цереброваскуларни нарушения (напр. инсулт, исхемия); болест на Huntington; СПИН деменция; епилепсия; множествена склероза; периферни невропатии (например тези, които повлияват DRG неврони при периферна невропатия свързана с химиотерапия) включително диабетна невропатия; нарушения, предизвикани от възбудни аминокиселини; и нарушения, свързани с контузионни или проникващи травни на главния или гръбначния мозък.
ChAT катализира синтеза на невротрасмиторния ацетилхолин и той се смята, че е ензимен маркер за функционалния холинергичен неврон. Функционален неврон също може да оцелее. Невронно оцеляване се изследва чрез количествено определяне на специфичното поглъщане и ензимното превръщане на боята (напр. калцеин АМ) от живите неврони.
Поради разнообразното им използване, описаните тук съединения, включително тези съединения, идентифицирани чрез описаните тук методи, намират приложение в различни области. Съединенията могат да се използват при развитието на модели in vitro на невронно клетъчно оцеляване, функция, идентификация или за изследване на други синтетични съединения, които имат подобни действия като тези на описаните тук съединения, или съединения, определени чрез описаните тук методи. Описаните тук съединения, както и тези определени чрез използване на описаните тук методи могат да се използват в изследователска област за откриване, очертаване и определяне молекулните мишени, свързани с функционални отговори. Цялата мишена, към която производното се свързва, може да бъде определена, изолирана и пречистена за характеризиране, например чрез рентгенобелязане на мостово инденопиролокарбазолно съединение или
съединение, определено чрез описаните тук методи, свързано със специфична клетъчна функция (напр. митогенеза).
Съединенията, както тези описани тук, така и тези определени чрез използване на описаните тук методи, се използват, между другото, не само за ускоряване предизвиканите от трофичния фактор действия на трофично отговорните клетки, напр., холинергични неврони, но също така може да действа като вещества спомагащи оцеляването за други невронни клетъчни видове, напр., допаминергични или глутаматергични. Растежният фактор може да регулира оцеляването на неврони чрез сигнализиране на каскадна верига на малките GTP свързващи белтъци, които включват, но не само, ras, гас и cdc42 (Denhardt, Biochem. J., 1996, 318, 729). Специфично е, че активирането на ras води до фосфорилиране и активиране на извънклетъчната рецепторно активирана киназа (ERK), която е свързана с биологичното нарастване и процесите на диференциация. Стимулиране на rac/cdc42 води до нарастване активирането на JNK и р38, отговори, които са свързани със стрес, апоптоза и възпаление. Въпреки че отговорите на растежния фактор са първоначално по пътя на ERK, повлияване на последните процеси може да доведе до алтернативни механизми на невронно оцеляване, което може да наподобява свойствата на растежния фактор, който ускорява оцеляването (Xia et al., Science, 1995, 270, 1326). Съединенията могат също да функционират като вещества спомагащи оцеляването за невронни и неневронни клетки чрез механизми, които се отнасят, но не само, до оцеляване посредством растежния фактор, например, инхибиране пътя на JNK и р38, което може да доведе до оцеляване чрез инхибиране процесите на апоптозна клетъчна смърт.
Настоящите съединения се използват при лечението на нарушения свързани с намаляване активността на ChAT или смърт, травма на мотоневроните на гръбначния мозък, а също така се използва, например, при заболявания свързани с апоптозна клетъчна смърт на централната и
периферната нервна система, имунната система и при възпалителни заболявания.
Описаните тук съединения могат също да намерят приложение при лечението на болестни състояния, включващи злокачествена клетъчна пролиферация, такава като много видове рак.
Фармацевтично приемливи соли на съединенията, описани тук, както и тези съединения, определени чрез настоящите методи, включват фармацевтично приемливи кисели адитивни соли, метални соли, амониеви соли, органични аминни адитивни соли и аминокиселинни адитивни соли. Примери на кисели адитивни соли са неорганични кисели адитивни соли, такива като хлороводород, сулфат и фосфат и органични кисели адитивни соли, такива като ацетат, малеат, фумарат, тартарат, цитрат и лактат; примери на метални соли са соли на алкални метални, такива като литиева сол, натриева сол, калиева сол, соли на алкалоземни метали, такива като магнезиева сол и калциева сол, алуминиева сол и цинкова сол; примери на амониеви соли са амониева сол и тетраметиламониева сол; примери на органични аминни адитивни соли са соли с морфолин и пиперидин; и примери на аминокиселинни адитивни соли са соли с глицин, фенилаланин, глутаминова киселина и лизин.
Съединенията, приготвяни тук, включително тези, определени чрез настоящите методи, могат да бъдат в състава на фармацевтични смеси чрез разбъркване с фармацевтично приемливи нетоксични пълнители и носители. Такива състави могат да се приготвят за използване при парентерално приложение, особено под формата на течни разтвори или суспензии; или орално приложение, особено под формата на таблети или капсули; или интраназално, особено под формата на прахове, назални капки или аерозоли; или кожно, например чрез трансдермални пластири.
Съставът може да бъде обичайно приложен в единична доза и може да бъде приготвен чрез някой от методите, добре известни на специалистите в областта, например, както е описано в Remington’s
Pharmaceutical Sciences (Mack Pub.Co., Easton, PA, 1980). Смесите за парентерално приложение могат да съдържат като обичайни пълнители стерилна вода или физиологичен серум, полиалкиленови гликоли, такива като полиетилен гликол, земни и растителни масла, хидрогенирани нафталини и подобни. В частност, биосъвместим, биологически разпадащ се лактиден полимер, лактиден/гликолиден кополимер или полиоксиетилен-полиоксипропиленови кополимери могат да бъдат полезни пълнители, за да контролират освобождаването на активните съединения. Други потенциални полезни парентерални систези за предлагане за тези активни съединения включват етилен-винил ацетат кополимерни частици, осмотични помпи, имплантиращи се инфузионни системи и липозоми. Състави за инхалационно прилагане съдържат като пълнители, например, лактоза, или могат да бъдат водни разтвори, съдържащи, например, полиоксиетилен-9-лаурил етер, гликохолат и деоксихолат или мастни разтвори за приложение под формата на назални капки или като гел за интраназално прилагане. Състави за парентерално прилагане могат да включват гликохолат за букално приложение, салицилат за ректално прилагане или лимонена киселина за вагинално прилагане. Предпочитаните състави за трансдермални пластири са липофилни емулсии.
Съединенията на това изобретение могат да се използват като самостоятелно активно вещество във фармацевтичен състав. Друга възможност е те да се използват в съчетание с други активни съставки, например, други растежни фактори, които улесняват невронното оцеляване или аксоналната регенерация при болести или нарушения.
Съединенията на изобретението и фармацевтично приемливи производни соли могат да се прилагат орално или неорално, например, като мехлем или инжекция. Концентрациите на съединенията на това изобретение в терапевтичната смес могат да варират. Концентрацията ще зависи от фактори, такива като общата дозировка на лекарството, която трябва да се приложи, химичната характеристика (например,
хидрофобност) на приложените съединения, начина на приложение, възрастта, телесно тегло и симптомите на пациента и др. Съединенията на това изобретение обикновено се получават във водно физиологичен буферен разтвор, съдържащ около 0.1 до 10% тегло/обем съединение за парентерално прилагане. Характерната доза варира от около lpg/kg до около lg/kg телесно тегло за ден; предпочитани граници са от около 0.01 mg/kg до 100 mg/kg телесно тегло за ден и за предпочитане около 0.1 до 20 mg/kg един до четири пъти дневно. Предпочитана дозировка на лекарството, която да бъде приложена, зависи от различни неща, такива като вид и степен на прогресиране на заболяването или нарушението, цялостното здравословно състояние на даден пациент, относителната биологична ефикасност на избраното съединение и състава на пълнителя на съединението и начина на прилагане.
Съединенията на изобретението, включително изпитваното съединение и съединенията, определени чрез методите на настоящето изобретение и фармацевтично допустимите производни соли, могат да бъдат прилагани самостоятелно или под формата на различни фармацевтични състави, съгласно фармацевтичното действие и целите на прилагане. Фармацевтичните състави, съгласно настоящето изобретение, могат да бъдат приготвени чрез равно смесване на ефективно количество на съединение или производна фармацевтично приемлива сол като активна съставка с фармацевтично приемлив носител. Носителят може да бъде от различни форми съгласно формата на състава, подходящ за прилагане. Ако е желателно, такива фармацевтични състави се приготвят под формата на единична доза, подходяща за орално или неорално прилагане. Формите за неорално прилагане включват мехлем и инжекция.
Таблетите могат да бъдат приготвени използвайки пълнители, такива като лактоза, глюкоза, сукроза, манитол и метил целулоза, разпадни вещества, такива като нишесте, натриев алгинат, калциева карбоксиметил целулоза и кристална целулоза, лубриканти, такива като магнезиев стеарат и талк, свързващи вещества, такива като желатин, поливинилов алкохол, поливинилов пиролидон, хидроксипропил целулоза и метил целулоза, повърхностно активни вещества, такива като естер на сукрозна мастна киселина и естер на сорбитолна мастна киселина и подобни по обичайния начин. За предпочитане е всяка таблета да съдържа 15-300 mg от активната съставка.
Гранулите могат да бъдат приготвени използвайки пълнители, такива като лактоза и сукроза, разпадни вещества, такива като нишесте, свързващи вещества, такива като желатин и подобни по обичайния начин. Праховете могат да бъдат приготвени използвайки пълнители, такива като лактоза и манитол и подобни по обичайния начин. Капсулите могат да бъдат приготвени използвайки желатин, вода, сукроза, гумиарабика, сорбитол, глицерин, кристална целулоза, магнезиев стеарат, талк и подобни по обичайния начин. За предпочитане е всяка капсула да съдържа 15-300 mg от активната съставка.
Сиропни форми на препаратите могат да бъдат приготвени използвайки захари, такива като сукроза, вода, етанол и подобни по обичайния начин.
Мехлеми могат да се приготвят използвайки мехлемни основи, такива като вазелин, течен парафин, ланолин и макрогол, емулгатори, такива като натриев лаурил лактат, бензалкониум хлорид, естер на сорбитан мономастна киселина, натриев карбоксиметил целулоза и гумиарабика и подобни по обичайния начин.
Инжекционните препарати могат да бъдат приготвени използвайки разтворители, такива като вода, физиологичен разтвор, растителни масла (например маслинено масло и фъстъчено масло), етил олеат и пропилея гликол, разтварящи вещества, такива като натриев бензоат, натриев салицилат и уретан, изотонични вещества, такива като натриев хлорид и глюкоза, консерванти, такива като фенол, крезол, р-хидроксибензоен естер и хлорбутанол, антиоксиданти, такива като аскорбинова киселина и натриев пиросулфит и подобни по обичайния начин.
Изобретението е илюстрирано по-нататък чрез следните примери, които целят изясняване на изобретението. Тези примери не целят, нито могат да бъдат тълкувани като ограничаващи обхвата на изложеното.
ПРИМЕРИ
Пример 1: Общо описание на процесите на синтез и примери
Общият начин на синтез, използван за приготвяне на мостови инденопиролокарбазоли на това изобретение с формула II е показан на фигури 1 и 2. Общите процедури на синтез на инденопиролокарбазоли (III)/(VHI) могат да бъдат извършени както е описано в Патент на САЩ №5,705,511, разкриването на който е включено тук чрез позоваване в неговата цялост. Когато R1 е Н, лактамният азот на инденопиролокарбазолите (III)/(VIII) е защитен с подходяща защитна група водеща до (IV)/(IX). Защитените съединения се обработват с подходяща основа в безводен органичен разтворител(и), което води до възникване на тъмно червен разтвор, който се знае че е карбанион. Реакция на карбаниона с бифункционален реагент (V) води до електрофилно присъединяване към C=Y връзката на (V) водещо до първоначален междинен продукт (VI)/(X). Обработване на междинен продукт(и) (VI)(X) и/или (VII)/(XI) с било сулфонова киселина, било с Люисова киселина, например борен трифлуор етерат, дава мостови инденопиролокарбазоли (1)/(11).
Лактамната азотна защитна стратегия (показани във фигура 3 и 4) може да бъде извършена чрез киселинно или основно катализиран процес. Киселинно катализираната реакция може да бъде извършена било с вещество със синтетична смола като свързваща, позволяващо и мобилизация на инденопиролокарбазола (1П)/(УП1) към полимерен носител, такъв като на полистиролова основа, Rink кисела смола (ХИ)(Фигура 3), получавайки (XIII). Друга възможност е, киселинно катализираната реакция да бъде извършена с разтворимо вещество за
получаване на съединение (Х1У)(Фигура 4). Силил защитеното съединение (XV) се получава при основна катализа (Фигура 4).
Фигура 5 описва няколко метода за приготвяне на междинен продукт (V). Процедура (а) описва превръщането на различни ацетали (XVI) в (XVII, 7=връзка). Например, естер-ацетал/кетал (XVI, D=COOR) е напълно редуциран до съответния алкохол и последващо оксидиран (напр., Swem или Dess-Martin оксидация) до алдехидацетал/кетал (XVII, К8=Н). Друга възможност е, естер-ацетал/кетал (XVI, D=COOR) да е частично редуциран с DIBAL за директно получаване на алдехид (XVII, R8=H). По подобен начин, редукцията на нитрил-ацетал (XVI, D=CN) с DIBAL дава алдехид (XVII, R8=H). Кетоацетали/кетал се приготвят чрез присъединяване на Gridnard реагенти към Weinreb амид-ацетал/кетал (XVI, D=CON(OMe)Me).
Междинен продукт (XVII, 7 ^връзка) също може да бъде получен чрез двустепенна процедура, очертана в Процедура (б). Присъединяването на органо-метален реагент (XIX) към ацетал/кетал (XVIII) дава алкен (XX), който при озонолиза, последвана от редуктивна обработка, дава кето-ацетал/кетал (XVII). Приготвянето на междинен продукт (XVII, Z=-x етер о атом) чрез двустепенна процедура е очертано в Процедура (в). Свързване на ацетал (ХХП) с алкен (XXI), последвано от озонолиза (с редуктивна обработка) на получаващия се алкен дава кето-ацетал/кетал (XVII). Друга възможност е, междинният продукт (XVII, /=хетероатом) да бъде приготвен чрез двустепенна процедура, очертана в Процедура (г). Реакция на съединение (XXIV) с ацетал/кетал (XVHI) дава (XXV), което се превръща в кето-ацетал/кетал (XVII) с методите, описани в Процедура (а). Кондензиране на кетоацетал/кетал (XVII) с хидроксиламини, хидразини, Х-алкил-Nалкоксиамини и амини дава междинен продукт (XXVI), притежаващ електрофилна C=N функционалност.
Инденопропилкарбазолът със синтетична смола като свързващо вещество (Х1П)(Фигура 6, Метод А) се обработва с излишък от Grignard
реагент като основа, което води до възникването на тъмно червен разтвор на карбанион. Последваща реакция с (V) води до продукти, произлезли от електрофилно присъединяване към C=Y група. Водна обработка и разцепване на продукта(и) с разредена киселина (1% TFA в метиленхлорид) от смолата води до изолиране на съединение(я) (XXVII) и/или (XXVIII). Обработване на междинния продукт(и) (XXVII) и/или (XXVIII) било със сулфонова киселина, било с Lewis киселина, напр. борен трифлуорид етерат, дава мостови инденопиролокарбазоли (П).
Подобна стратегия се употребява за реакция на разтворимия лактам защитен междинен продукт, например (ХУ)(Фигура 7, Метод В). В този случай, обаче, междинният продукт (XV) се обработва с Тритон В в пиридин като основа вместо Grignard реагент. Междинният продукт(и) (XXIX) и/или (XXX) може да бъде изолиран с интактна лактамова защитна група, която може да бъде хроматографски пречистена. Както в метод А (Фигура 6) обработването с Lewis киселина (такава като борен трифлуорид етерат) дава мостови инденопиролокарбазоли (II), където R1=H.
Въвеждането на групи R3, R4, R5 и R6 може да бъде извършено както е описано в Патенти на САЩ № 5,705,511 и 4,923,986, разкриването на които се включва тук чрез позоваване в неговата цялост. R3 заместител може да бъде въведен по друг начин след образуването на мостови инденопиролокарбазоли, както е показано във Фигура 8. Позиция 3 на В пръстена е бромирана с NBS, давайки съединение (XXXI). След това е въведен въглероден фрагмент въведен чрез използване на паладиево катализирани реакции на Stille, Suzuki, Heck, Kumada или Castro-Stephens за получаване на съединения от типа (ХХХП), (ХХХШ) и др. Освен това, съединение (XXXI) може да осигури достъп до съединения, където бромната група е заместена с хетероатом, например, аминно основна група чрез използване на паладиево катализирано аминиране по Бухвалд.
Чрез окислителен процес, свързаната с кислород група може да бъде въведена към инденовия въглерод на Е пръстен, както е показано на Фигура 9, съединение (XXXTV). Този химизъм на процеса води, също така, до окисление на метиленовата група на лактама (А пръстен), давайки имидно производно, както е показано по-долу.
Пример 2: Приготвяне на междинни продукти със свързващо вещество Rink смола: (XIII-A), (ΧΙΠ-B) и (ΧΙΠ-С), (Фигура 3) Пример 2-А
Тригърлена облодьнна колба свързана с окачена механична бъркалка и Dean-Stark сепаратор се зарежда последователно с Rink кисела смола XII (10.00 g, 0.64 mmol/g), 1-метил-2-пиролидинон (80 mL), бензен (350 mL), VIII-A (А^А^Нг, В',В2=О, R3=R4=R5=R6=H)) (3.00 g) и р-толуенсул фонова киселина (1.00 g). Реакционната смес се нагрява на обратен хладник в продължение на 20 часа и след това се филтрува. Смолата се измива с THF (5x175 mL) и филтратът се оставя настрани. Смолата след това се измива последователно с DMSO (4x100 mL), 2% воден NaHCO3 (4x100 mL), вода (4x100 mL), DMSO (2x200 mL), THF (4x100 mL) и етилацетат (4x100 mL). Смолата се изсушава под вакуум (24 часа) за получаване на 11.70 (0.47 mmol/g) от свързващата смола VJll-A, (XIII-A).
Първичните THF промивни води се изпаряват, остатъкът се разрежда с вода (750 mL) и получаващият се преципитат се филтрува и се измива последователно с вода, 2% воден NaHCO3 (4x100 mL) и вода (4x100 mL). След изсушаване под вакуум се открива VIII-A (1,28 g).
Пример 2-В
По подобен начин, VIII-В (Α',Α^Ο, В^В^Нг, R3=R4;=R5:=R6=H), (0.5 g) се свързва с Rink киселата смола ХП (1.52 g) за получаване на 1.58 g от свързващата смола VIII-В, (ΧΙΠ-Β).
Пример 2-С
По подобен начин, VIII-C (А1,А2=Н2, В1,В2=О, R3=R4=R5=H, R6=10ОМе) (1.02 g) се свързва с Rink киселата смола ХП (3.12 g) за получаване на 3.70 (0.46 mmol/g) от съединението със свързващата смола VIII-C, (ХШ-С), заедно с възстановеното съединение ХП1-С (0.44 g).
Пример 3: Приготвяне на Съединение (П-1), Съединение (П-2), Съединение (П-З), Съединение (П-4а), Съединение (П-4Ь), Съединение (II-6) и Съединение (П-8) (Метод А, Фигура 6) Пример 3-А
Към суспензия на (ХШ-А), (1.25 g) в THF (24 mL) се прибавя 1.0 М разтвор на EtMgBr (6.25 mL в THF) и реакционната смес се разбърква в продължение на 1 час преди да се прибави НМРА (5.0 mL). След 10 минутно разбъркване, се прибавя диетоксибутиралдехид (3.0 g) (който се приготвя съгласно описаната в литературата процедура на Paquette, et al., J.Am.Chem.Soc.,1997, 119, 9662-71) и реакционната смес се разбърква в продължение на 20 часа. Реакционната смес се охлажда рязко с 10% воден NH4CI (5 mL) и се филтрува. Смолата се измива последователно с 10% воден NH4CI (3x10 mL), вода (3x10 mL), THF (3x10 mL), DMF (3x10 mL), вода (3x10 mL), THF (3x10 mL) и етер (3x10 mL). Смолата се изсушава под вакуум, разтваря се в метилен хлорид (15 mL) и се обработва с трифлуороцетна киселина (0.15 mL). След разбъркването в продължение на 1 час, реакционната смес се филтрува и филтратът се изпарява. Получаващият се остатък се разтваря в метилен хлорид (20 mL) и се обработва с пиридиниев тозилат (50 mg) и получаващият се разтвор се разбърква в продължение на 4 часа. В това време реакционната смес се измива с наситен воден NaHCO3 и солна луга и се изсушава над MgSO4.
След филтруването и изпаряването на разтворителя, остатъкът се пречиства чрез препаративна HPLC (Zorbax RX-8, 4 χ 25 cm, отмити с
60% MeCN/вода w/0.1 % трифлуороцетна киселина). Подходящите фракции се неутрализират с NaHCO3 и екстрахират с метален хлорид (3 х 50 mL) и изсушават над MgSO4. След филтрацията и изпаряването на разтворителя, се получават 70.2 mg от съединение II-1 като бяла прах, която има следната характеристика: 13С NMR (DMSO-de) δ 171.8, 143.3,
142.4, 141.4, 140.1, 140.0, 136.6, 129.2, 127.9, 127.4, 127.1, 126.8, 124.1 (2С), 122.7, 121.6, 121.5, 118.3, 112.1, 88.1, 79.2, 56.6, 45.6, 33.4, 24.8; !Н NMR (DMSO-de) d 9.21 (d, 7= 7.5, 1H), 8.62 (s, 1H), 7.98 (d, J= 7.7, 1 H), 7.86 (d, 7= 8.3, 1 H), 7. 71 (d, J = 7.3, 1 H), 7.49 (dd, 7= 7.9, 7.4, 1H), 7.41 (dd, J= 7.5, 7.4, 1H), 7.36 - 7.27 (m, 2 H), 6.86 (d, 7= 6.0, 1H), 5.63 - 5.58 (m, 1H), 4.91 (s, 2H), 4.53 (d, 7= 3.3, 1H), 2.23 - 2.14 (m, 1 H), 1.96 - 1.92 (m, 1 H), 0.96- 0.88 (m, 1 H), 0.60 - 0.57 (m, 1H); MS m/z (M+H) изчислено 379, установено 379.
Също чрез препаративна HPLC на тази реакционна смес на продукта се изолира съединение П-2 (0.5 mg), което има следната характеристика: !Н NMR (DMSO-de) δ 9.17 (d,«7=8.1, 1Н), 8.62 (s, 1H), 7.98 (d,7=7.0, 1H), 7.85 (d,7=6.8, 1H), 7.57 (d,7=6.8, 1H), 7.49 (dd, J= 7.9,
7.4, 1H), 7.44 - 7.26 (m, 3H), 6.81 (d, 7= 6.0, 1 H), 5.43 - 5.33 (m, 1H), 4.43 (s, 2H), 2.23 - 2.14 (m, 1H), 1.96 - 1.92 (m, 1H), 1.45 - 1.55 (m, 2H), 0.960.88 (m, 1H), 0.60 - 0.57 (m, 1H), 0.29 (t,7=7.0, 3H); MS m/z (M+H) изчислено 407, установено 407.
Пример З-В
По подобен начин, както е описано по-горе за съединение П-1, смола (ХШ-А) (70.3mg) се обработва с 1,1-диетокси-2-пентанон (0.75 mL) ) (който е приготвен съгласно известната от литературата процедура на Sworin.c7/ al., J. Org. CAem.,1988,53,4894-6), за получаване на съединение П-З (3.5 mg), което е изолирано чрез препаративна TLC (силикагел, елюиран с 50% EtOAc/толуол) и има следните характеристики: !Н NMR (DMSO-de) δ 9.42 (d, J= 8.2, 1H), 8.58 (s, 1H), 7.95 (d, J= ΊΑ, 1H), 7.79 (d,
J= 8.3, IH), 7.71 (d, J= 7.1 ), 7.50 - 7.20 (m, 4H), 6.81 (d, J= 5.9, IH), 4.90 (s, 2H), 4.46 (s, IH), 2.35 - 2.20 (m, IH), 1.98 (s, 3H), 1.75 - 1.60 (m, IH),
1.25 - 1.00 (m, IH), 0.35 - 0.15 (m, IH); MS m/z (M+H) изчислено 393, установено 393.
Пример 3-C
По подобен начин, (XIII-A) (74.3 mg) се обработва с 1,1-диетокси-2хексанон (който се приготвя съгласно известната от литературата процедура на Brenner, J. Org. Chem.,1961,16,22-7) (0.75 mL) за получаване на съединение П-4а, (2.10 mg) и съединение П4Ь (1.06 mg), които се изолират индивидуално чрез препаративна HPLC (Zorbax RX-8, 4 х 25 cm, 65% MeCN/вода w/ 0.1% трифлуороцетна киселина). Съединение П-4а има следните характеристики: ’Н NMR (DMSO-d6) δ 9.30 (d, J= 8.3, IH), 8.55 (s, IH), 7.97 (d, ./= 7.2, IH), 7.65 (d, J= 8.5, IH), 7.59 (d, J= 7.5,), 7.48 (dd, J= 7.8, 7.2, IH) 7.39 - 7.15 (m, 3H), 6.31 (dd 5.9, 5.5, IH), 5.02 (s, IH), 4.88 (s, 2H), 0.88 (s, ЗН) други алифатни сигнали са загубени под пиковете на разтворителя; MS m/z (M+H) изчислено 407, установено 407. Съединение П-4Ь има следните характеристики: 'Н NMR (DMSO-ф) d 9.43 (d, J= 8.1, Ш), 8.59 (s, Ш), 7.99 (d, J= 7.3, IH), 7.75 - 7.65 (m, 2H), 7.49 (dd, J= 7.0, 6.4, IH), 7.43 (dd, J= 8.2, 8.1, IH), 7.36 - 7.25 (m, 2H), 6.75 (s, IH), 4.91 (s, 2H), 4.50 (s, IH), 1.95 (s, ЗН) други алифатни сигнали са загубени под пиковете на разтворителя; MS m/z (М+Н) изчислено 407, установено 407.
Пример 3-D
По подобен начин, (ХШ-С) (1.00 g) се обработва с диетоксибутиралдехид (3.65 g) за получаване на съединение П-6 (87.8 mg), което е изолирано чрез препаративна HPLC (Zorbax RX-8, 2.5 х 25 cm, 65% MeCN/вода w/ 0.1% трифлуороцетна киселина) и има следните характеристики: Щ NMR (DMSO-d()) δ 9.09 (d, J- 8.6, IH), 8.60 (s, IH),
7.95 (d, J= ΊΑ, 1H), 7.84 (d, J= 8.3, 1 H), 7.47 (dd, J= 7.2, 7.0, 1H), 7.35 (s,
1H), 7.29 (dd, 7.0, 7.0, 1 H), 6.98 (dd, J= 8.6, 1.9, 1H), 6.83 (d, J= 6.0,
1H), 5.65 - 5.55 (m, 1H), 4.88 (s, 2H), 4.48 (d, J= 3.9, 1H), 3.82 (s, 3H), 2.25
- 2.10 (m, 1H), 2.08 - 1.85 (m, 1H), 0.96 - 0.75 (m, 1H), 0.65 - 0.50 (m, 1H);
MS m/z (M+Na) изчислено 431, установено 431.
Пример З-Е
По подобен начин, смола (XIII-B) (153.2 mg) се обработва с диетоксибутиралдехид (1.5 mL) за получаване на съединение П-8 (3.6 mg), което е изолирано чрез препаративна HPLC (Zorbax RX-8, 2.5 х 25 cm, 65% MeCN/вода w/0.1% трифлуороцетна киселина) и има следните характеристики: Щ NMR (DMSO-сЦ) δ 9.09 (d, <7= 7.9, 1Н), 8.81 (s, 1H), 7.81 - 7.73 (m, 3H), 7.48 - 7.35 (m, 3H), 7.24 (dd, J= Ί.6, 7.5, 1H), 6.85 (d, J= 6.2, 1H), 5.63 - 5.59 (m, 1H), 4.86 (s, 2H), 4.61 (d, J= 3.6, 1H), 3.82 (s, 3H), 2.21 - 2.13 (m, 1H), 1.96 - 1.90 (m, 1H), 0.87 - 0.79 (m, 1H), 0.61 0.56 (m, 1H); MS m/z (М+Н) изчислено 379, установено 379.
Пример 4: Приготвяне на Съединение П-7а и Съединение П-7Ь (Метод А, Фигура 6)
Пример 4-А
Приготвяне на (1,1-диетоксиетокси)ацетон
Към студена (0 °C) суспензия на NaH (2.68 g, 60%) в THF (150 mL) се прибавя към разтвор на 1,1-диетоксиетанол (който се приготвя съгласно известната от литературата процедура на Zirkle, et. al., J. Org. Chem., 1961, 26, 395-407) (9.00 g) в THF (20 mL) и реакционната смес се разбърква при стайна температура в продължение на 1 час преди прибавяне на металил хлорид (8.0 mL). Реакционната смес се нагрява на обратен хладник в продължение на една нощ, охлажда се и се филтрува през слой на селите. Разтворителят се премахва чрез ротационно изпаряване и остатъкът се пречиства чрез колонна хроматография (силициев двуокис, 20% етер/хексан) за получаване на 1,1-диетоксиетил металил етер (11.5, 90%). Озонолиза на охладен (-30 °C) разтвор на този етер (6.00 g) в EtOAc (80 mL) се извършва докато изходен материал не се установява чрез TLC (1 час). В това време, реакционната смес се продухва с кислород, обработва се с Pd(OH)2 (150 mg) и се разбърква под налагане на водород в продължение на една нощ. Катализаторът се филтрува и филтратът се концентрира чрез ротационно изпаряване. Получаващият се остатък се пречиства чрез колонна хроматография (силициев двуокис, 20 % EtOAc/хексан) за получаване съединението от заглавието (4.53 g, 82 %).
Пример 4-В
Съгласно Метод А (Фигура 6), смола (XIII-A) (230.2 mg) се обработва с EtMgBr (1.25 mL), последвано от (1,1-диетоксиетокси)ацетон (Пример 3-А) (1.2 mL). След обработване и отделяне от смолата, част от суровата реакционна смес на продукта (10.5 mg) се разтваря в метален хлорид (20 mL) и се обработва с BF3 етерат (20 uL). След разбъркване в продължение на 2.5 часа, разтворът се измива с наситен воден NaHCO3 и водна луга преди изсушаване над MgSO4,. След филтруване и премахване на разтворителя, получаващият се остатък се пречиства чрез препаративна HPLC (Zorbax RX-8, 4 х 25 cm, 65% MeCN/вода w/ 0.1% трифлуороцетаа киселина) за получаване на съединение П-7а (2.34 mg) и съединение П-7Ь (1.34 mg). Съединение (П-7а) има следните характеристики: *Н NMR (CDC13) δ 9.35 - 9.20 (m, IH), 7.87 (d, J= 7.6, IH), 7.62 (d, J= 7.0, IH), 7.60 - 7.45 (m, IH), 7.49 (dd, J= Ί.Ί, 7.5, IH), 7.40 (d, J= 8.1, IH), 7.37 - 7.26 (m, 3H), 6.22 (s, IH), 5.20 - 4.85 (m, IH), 4.47 (s, IH), 3.67 (d, J= 12.7, IH) 3.52 (d, J= 11.8, IH), 3.40 (d, J= 12.7, IH), 3.38 (d, J= 11.8, IH), 1.91 (s, 3H); MS m/z (M+H) изчислено 409, установено 409. Съединение II-7b има следните характеристики: *Н NMR (CDC13) δ 9.58 - 9.22 (m, IH), 7.82 (d, 7.4, Ш), 7.60-7.40 (m, 3H), 7.37 - 7.27 (m,
3H), 7.21 (d, J= 8.1, IH), 5.81 (s, IH), 5.21 (s, IH), 5.10 - 4.80 (m, IH), 4.59 (d, J= 13.5, 1H), 4.38 (dd, J= 13.5, 5.3, 1H), 4.21 (d, 13.1, 1H), 3.82 (d,
J= 13.2, 1H), 1.13 (s, 3H); MS m/z (M+H) изчислено 409, установено 409.
Пример 5: Приготвяне на Съединение П-5 (Фигура 8)
Към разтвор на съединение II-1 (8.1 mg) в THF (2 mL) се прибавя NBS (4.6 mg) и реакционната смес се разбърква в продължение на една нощ. Прибавят се още NBS (4.5 mg) и реакционната смес се разбърква в продължение на 2.5 часа. Неразтворимото вещество се отфилтрува и филтратът се концентрира чрез ротационно изпаряване. Получаващият се остатък се пречиства чрез колонна хроматография (С-18, 65% MeCN/вода w/ 0.1% трифлуороцетна киселина). Подходящите фракции се неутрализират с NaHCO3 и се екстрахират с метилен хлорид (3 х 20 mL) и се изсушават над MgSO4,. След филтруване и изпаряване на разтворителя, съединение П-5 (5.1 mg) се получава като бял прах, който има следната характеристика: Ή NMR (DMSO-сЦ) δ 9.22 (d, J = 7.4, 1 Η), 8.67 (s, 1 Η), 8.14 (s, 1H), 7.86 (d, J= 8.7, 1H), 7.72 (d, J= 7.0, 1H), 7.63 (d, J= 7.8, 1H), 7.42 (dd, J= 7.5, 7.3, 1H), 7.35 (dd, J= 7.3, 7.2, 1H), 6.86 (d, J= 6.0, 1H), 5.63 - 5.58 (m, 1H), 4.94 (s, 2H), 4.54 (d, J= 3.1, 1H), 2.30 - 2.14 (m, 1H), 2.00 - 1.82 (m, 1H), 0.96- 0.88 (m, 1H), 0.62 - 0.50 (m, 1H); MS m/z (M+H) изчислено 457/9 (1:1), установено 457/9 (1:1).
Пример 6: Приготвяне на междинен продукт XV (Фигура 4)
Към разтвор на VHI-A [ΑζΑΜίζ, В^В^О, R3=R4=R5=R6=H)J (1,05g) в DMF (25 mL) се прибавя триетиламин (0.75 mL) и t-бутилдиметилсилил хлорид (TBS-C1) (0.65 g). След разбъркване в продължение на 3 часа, реакционната смес се охлажда рязко с наситен воден NaHCO3 и се екстрахира с EtOAc. Органичният слой се измива с вода и водна луга и се изсушава над MgSO4. След филтруване и изпаряване на разтворителя, получаващият се остатък се разпрашава с етер за получаване съединение XV (848 mg). Промивните води се изпаряват за оставане на остатък, който се пречиства чрез колонна хроматография (силициев двуокис, 1 %
EtOAc/CH2C12) и дава допълнителен продукт (502 mg, съчетан добив от 94%), който има следните спектрални характеристики: *Н NMR (DMSOф) δ 11.94 (s, 1Н), 9.32 (d, J= 7.6, IH), 8.03 (d, J = 7.7, IH), 7.64 (d, J= 12, IH), 7.58 (d, J= 8.1, IH), 7.44 (dd, J= 7.7, 7.6, IH), 7.39 (dd, J= 7.7, 7.6, IH), 7.32 (d, J = 7.3, IH), 7.25 (dd, J - 7.6, 7.3, IH), 5.00 (s, 2H), 4.14 (s, 2H), 0.99 (s, 9H), 0.46 (s, 6H); MS m/z (M+H) изчислено 425, установено 425.
Пример 7: Приготвяне на Съединение П-1 чрез Метод В (Фигура 7)
Разтвор на Triton В в пиридин (0.45 М) се приготвя чрез разреждане 40% разтвор на Triton В в шетанол (10 mL) в пиридин (10 mL). Разтворителят се премахва под редуцирано налягане (20 mm Hg) до краен обем от ~ 8 mL. Остатъкът се разрежда с пиридин до 50 mL, филтрува се и се съхранява под азот. Разтвор на XV (20.3 mg) в пиридин (2.0 mL) се продухва с аргон и се обработва с 300 pL of Triton В (0.45 М в пиридин) и диетоксибутиралдехид (50 uL). След разбъркване в продължение на 2 часа, реакционната смес се екстрахира в EtOAc, измива се с 1N воден HCI, водна луга и се изсушава над MgSO4. След филтруване и изпаряване на разтворителя, продуктът на присъединяване се разтваря в СН2С12 (10 mL) и се обработва с BF3 етерат (10 pL). След разбъркване в продължение на 2.0 h, разтворът се измива с наситен воден NaHCO3 и водна луга преди изсушаване над MgSO4. Премахване на разтворителя чрез ротационно изпаряване дава остатък, който се пречиства чрез препаративна HPLC (Zorbax RX-8, 2.5 х 25 cm, 65% MeCN/вода w/ 0.1 % трифлуороцетна киселина). Подходящите фракции се неутрализират с NaHCO3 и се екстрахират с метилен хлорид (3 х 20 mL) и се изсушават над MgSO4. След филтруване и изпаряване на разтворителя, се получава П-1 (11.8 mg, 65% добив), чиито ‘Н NMR и MS спектър и HPLC време на задържане са идентични с тези на приготвеното и изолирано вещество чрез Метод А, описани в Пример 3-А.
Пример 8: Приготвяне на Съединение П-9 (Фигура 8)
Към суспензия на бромно съединение П-5 (6.2 mg) в 1-пропанол (4.0 mL) се прибавя 3-аминофенилборна киселина (3.8 mg). След разбъркване в продължение на 0.25 час, последователно се прибавят Pd(OAc)2 (2.0 mg) Ph3P (4.8 mg), Na2CO3 (2.8 mg) и вода (2.0 ML). Сместа се нагрява на обратен хладник в продължение на 0.75 час, охлажда се, екстрахира се в СН2С12 и се измива с вода и солна луга. Органичният слой се изсушава над MgSO4 и разтворителят се премахва чрез ротационно изпаряване за получаване остатък, който се пречиства чрез препаративна HPLC (Zorbax RX-8, 2.5 χ 25 cm, 50% MeCN/вода w/0.1°% трифлуороцетна киселина). Подходящите фракции се неутрализират с NaHCO3 и се екстрахират с метилен хлорид (3 х 20 mL) и се изсушават над MgSO j. След филтруване и изпаряване на разтворителя, се получава съединение П-9 (3.1 mg, 49% добив) и има следните спектрални характеристики: 1Н NMR (DMSO-d6) δ 9.22 (d, J= 7.5, 1H), 8.66 (s, 1H), 8.00 - 7.25 (m, 8H), 7.12 (dd, J= 7.1, 7.0, 1H), 6.95 - 6.80 (m, 3H), 6.53 (d, J= 6.0, 1H), 5.63 - 5.58 (m, 1H), 4.99 (s, 2H), 4.55 (s, 1H), 2.25 - 2.10 (m, 1H), 1.95 -1.90 (m, 1H), 0.98 - 0.88 (m, 1H), 0.65 - 0.57 (m, 1H); MS m/z (M+H) изчислено 470, установено 470.
Пример 9: Приготвяне на Съединение 11-10 (Фигура 9)
Към разтвор на съединение II-1 (5.0 mg) в DMSO (1 mL) се прибавя NaCN (4.3 mg) и сместа се загрява до 145° С в продължение на 1 час. Сместа се охлажда в EtOAc и се измива с вода (3 х 20 mL) и солна луга. Органичният слой се изсушава над MgSO4, филтрува се и се изпарява за получаване на остатък, който се пречиства чрез препаративна HPLC (Zorbax RX-8, 2.5 χ 25 cm, 55% MeCN/вода w/ 0.1% трифлуороцетна киселина). Подходящите фракции се неутрализират с NaHCO3, екстрахират се с метилен хлорид (3 х 20 mL) и се изсушават над MgSO4. След филтрация и изпаряване на разтворителя се получава съединение ΠΙΟ (2.7 mg, 50% добив) и има следните спектрални характеристики: 'Н
NMR (DMSO-de) δ 11.4 (s, IH), 8.86 (d, J= 7.9, IH), 8.79 (d, J= 7.6, IH),
7.90 (d,./ 8.3, IH), 7.62 - 7.55 (m, 2H), 7.49 (dd, J= 7.6, 7.4, 3H), 7.40 (dd,
J= ΊΑ, 7.3, IH), 7.35 (dd, 7.5, 7.4, IH), 6.86 (d, J=6.O,1H), 6.03 (s, IH),
5.40 - 5.30 (m, IH), 2.25 - 2.14 (m, IH), 2.03 - 1.90 (m, 1 H), 1.10 - 0.98 (m,
IH), 0.82 - 0.77 (m, IH).
Пример 10: Приготвяне на Съединение П-11 (Метод А, Фигура 6)
Съгласно Метод А, смола (ХШа) (150.2 mg) реагира с EtMgBr (1.0 mL) последвано от етил 2,5-диоксопентаноат (Schmidt, er al., Synthesis, 1993, 809) (1.5 mL). След обработване и отцепване от смолата суровата ф реакционна смес на продукта се разтваря в метилен хлорид (20 mL) и се обработва с BF3 етерат (20 mL). След разбъркване в продължение на 2.5 часа, разтворът се измива с наситен воден NaHCO3 и солна луга преди изсушаване над MgSO4. След филтруване и премахване на разтворителя получаващият се остатък се пречиства чрез препаративна HPLC (Zorbax RX-8, 4 х 25 cm, 55%-75% градиент MeCN/вода w/0.1% трифлуороцетна киселина) за получаване на съединение II-11 (6.4 mg), което има следните характеристики: '11 NMR (DMSO-сЦ) δ 9.36 (d, J= Ί.Ί, IH), 8.68 (s, Ш), 8.00 (d, J = 7.7, IH), 7.83 (d, J = 8.3, IH), 7.58-7.15 (m, 5H), 6.97 (d, J= 5.9, IH), 4.93 (s, 2H), 4.82 (s, IH), 4.48 (q, J= 7.1, 2H), 2.42 - 1.91 (m, 2H), 1.37 • (t, 3H, J= 7.1 ), 1.25 - 0.63 (m, 2H).
Пример 11: Приготвяне на Съединение П-12
Разтвор на съединение П-11 (3.4 mg) в THF (2 mL) се обработва с 2 М разтвор на LiBH4 (1.0 mL в THF) и реакционната смес се разбърква в продължение на 1.5 h. Реакционната смес се охлажда рязко чрез прибавянето на 1 N воден HCI (4 mL). След разбъркване в продължение на 20 min, се прибавя 10% воден NaOH (15 mL) и сместа се екстрахира с метилен хлорид (3 х 10 mL). След изсушаване над MgSO4, сместа се филтрува и разтворителят се изпарява за получаване на съединение П-12 (0.32 mg), което има следните характеристики: Щ NMR (DMSO-сЦ) δ 9.35 (d, J = Ί.Ί, 1H), 8.62 (s, 1H), 7.98 (d, J= Ί.Ί, 1H), 7.83 (d, J= 8.2, 1H), 7.75 (d, J = 8.2, 1H), 7.50 - 7.25 (m, 4H), 6.84 (d, J= Ί.Ί, 1H), 6.11 (s, 1H), 4.91 (s, 2H), 4.71 (s, 1H), 4.50 - 4.40 (m, 1H), 4.30 - 4.20 (m, 1H), 2.42 - 1.91 (m,
2H), 1.25 - 0.63 (m, 2H); MS m/z (M+H) изчислено 409, установено 409.
Пример 12: Усилване активността на гръбначно мозъчния ChAT
ChAT е специфичен биохимичен маркер за функционалните холинергични неврони. Холинергичните неврони представляват основния холинергичен достъп до хипокампуса, обонятелните ядра, ф интерпедункуларните ядра, кората, тонзилата на малкия мозък и части от таламуса. В гръбначния мозък мотоневроните са холинергични неврони, които съдържат ChAT (Phelps, et al., J. Comp. Neurol., 1988, 273, 459-472). Активността на ChAT се използва за изучаване ефектите на невротропините (напр., NGF или NT-З) върху оцеляването и/или функцията на холинергичните неврони. Изследването на ChAT служи също така като индикатор на регулацията на нивата на ChAT в холинергичните неврони.
Методи-. Клетки от фетален гръбначен мозък на плъхове са дисоциирани и опитите са извършени както е описано (Smith, et al., J. ® Cell Biology, 1985, 101, 1608-1621; Glicksman, et al., J. Neurochem., 1993,
61, 210-221). Дисоциираните клетки са приготвени от гръбначен мозък дисециран от плъхове (ембрионална възраст 14- 15 дни) чрез стандартни техники на трипсинова дисоциация (Smith et al., supra.). Клетките се поставят в гнезда, покрити с поли-1-орнитин плъстична тъканна култура при 6 х 103 клетки/cm2 в N2 среда без серум, допълнена с 0.05% говежди серумен албумин (BSA) (Bottenstein, et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1979, 76, 514-517). Културите са инкубирани при 37°С в овлажнен атмосферен въздух на 5% СО2/95% в продължение на 48 часа. Активността на ChAT се измерва след 2 дни in vitro, използвайки модификация на процедурата на Fonnum (Fonnum, Neurochem., 1975, 24,
407-409) съгласно McManaman, et al. и Glicksman, et al. (McManaman, et al., Develop. Biol., 1988, 125, 311-320; Glicksman, et al., J. Neurochem., supra.).
Съединенията c формула II, описани в примерите са изброени в
Таблица 2.
Стойностите за R1, R4, R6 и R7 са Η; Y е О; и η е 1.
Таблица 2
Съединение No. | AiA2 | BjB2 | r2 | Кз | r5 | r8 | Z | m |
II-1 | 0 | н,н | н | н | Η | Η | връзка | 1 |
П-2 | 0 | н,н | Et | н | Η | Η | връзка | 1 |
П-З | 0 | н,н | н | н | Η | Me | връзка | 1 |
П-4а | 0 | н,н | н | н | Η | Me | връзка | 2 |
П-4Ъ | 0 | н,н | н | н | Η | Me | връзка | 2 |
П-5 | 0 | н,н | н | Вг | Η | Me | връзка | 1 |
II-6 | 0 | н,н | н | н | 10- ΟΜ е | Η | връзка | 1 |
П-7а | 0 | н,н | н | н | Η | Me | 0 | 1 |
П-7Ь | о | н,н | н | н | Η | Me | 0 | 1 |
П-8 | н,н | 0 | н | н | Η | H | връзка | 1 |
П-9 | 0 | н,н | н | 3- nh2 -Ph | Η | H | връзка | 1 |
П-10 | 0 | 0 | 0 н | Η | Η | H | връзка | 1 |
II-11 | 0 | н,н | н | Η | Η | CO2 -Et | връзка | 1 |
П-12 | 0 | н,н | н | Η | Η | CH2 -OH | връзка | 1 |
Пример 13: pCDNA3-EE-MLK3, pcDNA3-EE-MLK3(K144R)
MLK се клонира както е описано (Lee, et al., Oncogene, 1993, 8, 3403-3410; Ezoe, et al., Oncogene, 1994, 9, 935-938). Клетъчната DNA ce приготвя от 200 ng полиаденилирани меланоцитни mRNA и 5% от реакционната смес се използват като шаблон за разширяване репертоара на РТК клетъчни DNA, използвайки смеси било на два или четири високо дегенеративни олигонуклеотидни първични структури, възникнали от съгласуваната последователност на консервираните VIb и IX подобласти на известните РТК: РТК1, 5’-CGGATCCACMGIGAYYT3’ (СЕКВ ИД. №;1); РТК2, 5’-GGAATTCCAWAGGACCASACRTC-3’ (СЕКВ ИД. №:2); РТКЗ, 5’CGGATCCRTICAYMGIGAYYTIGCIGCIMGIAA-3’ (СЕКВ ИД. №:3); РТК4, 5’-GGAATTIAYIGGAWAIGWCCAIACRTCISW-3’ (СЕКВ ИД. №:4). Четирдесет цикли на PCR са извършени, използвайки Taq DNA полимераза (AmpliTaq; Perkin-Elmer/Cetus) и автоматичен DNA термичен цикъл; всеки цикъл се състои от 40 секунди при 94°С, 2 минути при 37°С и 3 минути при 63°С. Продуктите на осем PCR се обединяват, обработват се с DNA полимераза (Klenow), разцепват се с BamHl плюс EcoRl и се извършва електрофореза в 5% полиакриламиден гел. Оцветяване с етидиев бромид определя преобладаваща 200-230 Ьр ивица, която е изрязана, елюирана и клонирана в М13шр18. В един експеримент, част от PCR, увеличен с DNA не е разцепена, но независимо от това, клонирана тъпо в М13шр18, разцепена със Smal. Нуклеотидната последователност се определя чрез метода на редуване на верижното прекъсване.
Една cDNA, определена като РТК1, се използва като проба за изследване на меланом при човека и меланоцит cDNA библиотеки. Клон, обозначен като РТК 1-3.2, включва цялата отворена четяща рамка 2541 nt, кодираща белтък от 847 аминокиселини. Тази cDNA е изрязана с Ncol, затъпена с DNA полимераза (Klenow), изрязана отново с EcoRl и лигирана в носител pCDNA3-EE отрязана с BamHl, затъпена и тогава отрязана с EcoRl. Носителят pCDNA3-EE е създаден чрез въвеждане в участъка на Hindlll/BamHl олиго за кодиране на първичния кодон, последвано от ЕЕ епитоп, MEEEEYMPME (Секв. Ид. №5) (Grussenmeyer, et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 7952-7954). Версията на мъртвата киназа на MLK3 е направена чрез мутация на K144R, използвайки публикувани по-рано PCR техники (Chen, et al., Biotechniques, 1994, 17, 657-659). Първият мутагенен олиго е 5’GTGGCTGTGCGGGCAGCTCGCCAG-3’ (Секв. Ид. №6) и вторият олиго е 5’-GAGACCCTGGATCTCGCGCTT-3’ (Секв. Ид. №7). Използвайки MLK3 като временна, тези олиго се използват в PCR за създаване на фрагмент от 806 Ьр и се прилагат във втората PCR реакция, използвайки първичен Т7 като друг увеличител и MLK3 като временен за създаване на фрагмент от 1285 Ьр. Фрагментът се отделя чрез електрофореза в агарозен гел, изолира се, клонира се в pGEM-5 (Promega) и се определя последователността на аминокисе линиите остатъци в белтъците. Фрагментът се изсича с Hindlll и Hpal и се въвевежда в pCDNA3-EEMLK3 изрязан с Hindlll и Hpal. Допълнителен момент на мутация се определя при нуклеотид 1342. За корекция на това, PflMl фрагмент (nt 1093-1418) се изсича от див-тип MLK3 и се използва за заместване на идентичния фрагмент в K144R мутиралата MLK3.
Пример 14: pFB-FLAG-MLK3
За получаване на MLK3 белтък, cDNA се клонира в пръчковидно вирусен експресивен преносител pFB-FLAG. MLK3 се изсича от РТК13.2 чрез разграждане с Ncol, изтънява се с DNA полимераза (Klenow), изрязва се отново с Notl и се лигира в pFB-FLAG разграден със Stul и Notl. От pFB (Life Technologies) се екстрахира pFB-FLAG, който има кодираща последователност за FLAG епитопа (Hopp, et al., Biotechnology,
1988, 6, 1205-1210) с първичен кодон, MDYKDDDDK (Секв. Ид. №:8), прибавен към полисвързваща част в BamHl участъка.
Пример 15: pFB-GST-MLK3(KD)
Пръчковидна вирусна експресивност на киназната област на MLK3 се получава чрез изсичане на MLK3 фрагмента от pGEXKG-MLK3(KD), използвайки EcoRl и Xhol и лигирайки я в pFB преносител, изрязан с EcoRl и Xhol, където кодиращата последователност за глутатион Sтрансфераза (GST) е клонирана в по-горен клон. Това се достига чрез получаване на GST кодиращата последователност и полисвързваща част от pGEXKG преносителя чрез PCR, използвайки преносителя като матрица (Guan, et al., Anal. Bioch., 1991, 192, 262-267). 5' олиго за PCR създава Bgl2 сайт на рестрикция в 5' края на фрагмента. Този изолиран фрагмент след това се разгражда чрез Bgl2 и HinD3 и се лигира в pFB разграден с BamHl и HinD3.
Пример 16: pGEXKG-MLK3(KD)
Фрагмент на cDNA, който включва както MLK3 киназната област, така и част от левцин зигзагообразната киназа (nt 736-1791), се получава чрез PCR, използвайки РТК1 cDNA. Изолираният фрагмент се разгражда чрез ензимите на рестрикция EcoR 1 и Xho 1, сайти, които са включени в PCR олиго и се клонира в pGEX-KG разграден с EcoRl и Xho 1. Този фрагмент в pGEX-KG след това се скъсява чрез PCR, за да се включи само киназната област (nt 736-1638).
Пример 17: pKH3-MLK2, pKH3-MLK2(KA)
MLK2 се клонира, използвайки изроден PCR (Dorow, et al., Eur. J.
Biochem., 1993, 213, 701-710; Dorow, et al., Eur. J. Biochem., 1995, 234,
492-540). Сегменти на cDNA, кодиращи каталитични подобласти на белтък кинази, изразени в епителиалната туморна клетъчна линия Colo се увеличават от RNA чрез обратима транскриптаза PCR. Изродените пмиШ
първични PCR се основават на последователности, кодиращи запазени мотиви в подобластите Vib и VIII на киназни каталитични области на рецепторна фамилия на епидермален растежен фактор. Последователностите на праймерите са както следва: ранен праймер, 5'CGGATCCGTG(A)CACC(A)GT (CG)G(A)ACC(T)T-3' (Секв. Ид. №:9), обратим праймер, 5’-GGAATTCACCA(G)TAA(G)CTCCAG(C)ACATC-3’ (Секв. Ид. №:10). Няколко PCR продукти са клонирани в М13 и с определена последователност, използвайки Т7 Super-Base кит за определяне на последователността (Bresatec). Един 216-bp PCR продукт се използва като проба за изследване на cDNA библиотека на човешкия колон Xgtll (Clontech, каталог #HL 10346)). Фрагментът е случайно първично белязан, хибридизация се извършва при 65°С и филтрите се измиват до образуване на нишка от 0.2Х NaCI/Цитрат (150 mM натриев хлорид, 15 mM натриев цитрат, pH 7.0) и 0.5% SDS при 65°С. Филтрите се авторентгенографират за 16h при -70°С върху филм Kodak XAR-5. Изолират се четири клона и най-дългият, 1.2 kb, се използва за повторно изследване на същата библиотека, използвайки същите условия. Отделят се още четири клона и един от тези клонове представлява 1034 Ьр фрагмент на MLK2. Този клон се използва за изследване библиотеката на човешкия мозък XgtlO. Приблизително 500,000 клона се изследват и се изолира един 3454 Ьр клон, представляващ целия кодиращ район на MLK2.
MLK2 се клонира, от ATG до полиА опашка, в преносител рКНЗ между BamHl и EcoRl сайти на два етапа, като има BamHl сайт в средата на последователността на MLK2. Преносителят рКНЗ се образува чрез въвеждане на три копия на НА епитопен израстък, последвано от BamHl сайт между сайтите на Xbal и EcoRl на полисвързващия pRK7. За да се направи мутагенизираната версия, К125А, MLK2 5' BamHl фрагментът се клонира в Promega pAlter преносител и мутира, както се препоръчва от i
производителя. Фрагментът след това се клонира обратно в MLK2 рКНЗ преносителя.
Пример 18: pcDNA3-HA-JNKl
JNK1 cDNA се получава както е описано (Coso, et al., Cell, 1995, 81,1137-1146). cDNA се получава чрез PCR, използвайки като матрица cDNA на човешки скелетен мускул (Invitrogen) и се клонира в Bgl2/Sall сайти на pcDNA3-HA, модифициран pcDNA3 експресивен плазмид, кодиращ НА епитопа (Wilson, et al., Cell, 1984, 37, 767-778). Тогава това се изсича от pcDNA3, включително НА епитопа и се лигира в pGEX-4T3 (Pharmacia). JNKI cDNA се изсича от конструкцията на pGEX-4T3 като Bgl2 / Sall фрагмент и се лигира в pcDNA3-HA, преносител с НА епитопа, прибавен в HinD3/BamHl сайта на pcDNA3.
Пример 19: pFLAG-DLK
DLK се клонира в експресивния преносител pcDNA3 с FLAG епитопа, прибавен както е описано (Holzman, et al., J. Biol. Chem., 1994, 269, 30808-30817). Фрагмент от cDNA за DLK се изолира чрез изродено PCR клониране на основата на олигонуклеотид. Общата RNA се екстрахира от бъбреците на ембрион на 13.5 дни (32 органа) и от бъбреците на ембрион на 17.5 дни (16 органа), използвайки търговска форма на фенол/гванидин изотиоцианатен реактивен метод, съгласно насоките на производителя (TRIzol Reagent, Life Technologies, Inc.). Последващо разграждане c RNase-свободна DNase I, общата RNA ce транскрибира обратимо c RNase Н-обратима транскриптаза (Superscript, Life Technologies, Inc.) от олиго(сГГ) синтетичен първичен олигонуклеотид до самостоятелна нишковидна cDNA. Изпразнените първични олигонуклеотиди, съответстващи на белтък тирозин киназните каталитични подобласти Vib и IX, определени първоначално от Wilks (Wilks, Proc Natl. Acad Sci USA., 1989, 86, 1603-1607), са модифицирани до 5' EcoRI и Hind\\\ сайти, съответно (567
ATAATTC(GT)GC(TAGC)GCCA(GA)GTC(TAGC)CGGTG-3’ (Секв.
Ид.№:11), 5'ATAAGCTTCC(TC)(AG)T(GC)AAGTGGA(TC)(GC)GC(AGC)CC(CT)GA3') (Секв. Ид. №:12). Четирдесет PCR цикъла се извършват за 1.5 min при 94°С, за 2 min при 37°С и за 3 min при 63°С. Прибавят се свежи реагенти и още 40 цикъла се извършват преди крайното 10-min разширение при 72°С. Получаващият се 200-210-bp DNA разширен продукт се изолира в гел, субклонира се в приготвен pGEM7zf(+) плазмид (Promega) и се трансформира в Escherichia coli. Miniprep плазмидна DNA се приготвя от трансформираната бактерия и една част се разгражда с EcoRI и ЯйкЛП рестрикционни ендонуклеази; клоновете, съдържащи инсерции, се подреждат последователно.
195-bp DLK cDNA фрагментът, получен от изпразнения PCR, се бележи с радиоактивен изотоп и се използва за изследване приблизително на 1 х 106 рекомбинации на Uni-ZAP II (Stratagene, La Jolla, СА), олиго(с1Т)-първична cDNA библиотека на мозък на възрастна мишка (Holzman, et al., Mol Cell Biol, 1990, 10, 5830-5838). Филтрите се хибридизират в буфер, състоящ се от 50% формамид, 5 х SSC, 3 х разтвор на Denhardt, 0.25% SDS, 1 mg/ml полиаденилова киселина и 200 mg/ml DNA от семе на сьомга при 42°С. Филтрите се измиват един път на стайна температура в 2 х SSC, 0.2% SDS и два пъти за 30 min при 65°С. Определят се двадесет и пет еднакви клона, 10 клона се пречистват до хомогенност, in vivo се изсичат съгласно протокола на производителя и картата на рестрикция. Двете най-дълги колони (3401 и 3397 Ьр, съответно, различаващи се само в техния 5' край) се подреждат последователно край нишките по цялата дължина.
Фрагментът с пълна дължина Noil Xhol DLK cDNA (3401 bp) се субклонира в цитомегаловирусен преносител на основата на еукариотен експресивен преносител pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, СА) (определен строеж pcDNA3-DLK). След това, се прави извит строеж (pFLAG-DLK) на NHi-Met FLAG епитоп (DYKDDDDK) (Секв. Ид. №:13). PCR се използва да усили cDNA фрагменти, които кодират 5' Hmd\\\ сайт, DLK Kozak съгласувана последователност, включително стимулиране ATG, FLAG епитопа и DLK cDNA открита четяща рамкова последователност, простираща се от нуклеотид 88 до вътрешен £coRI сайт при нуклеотид 758. (HPLC пречистени синтетични олигонуклеотиди, използвани в еквимоларни количества: 5-ATAAAGCTTCCAGAGGCCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGGCCTGCCTCCATGAAACCCGAACA-3' (Секв. Ид. №:14) за FLAG сензорен праймер и 5'GACAGGGCGGCCGGCTCT-3' (Секв. Ид. №:15) за антисензорния праймер.) Гел пречистени HindSl и EcoRI-разградени усилени фрагменти се субклонират в HindSl-EcoRA, за да се приготви pcDNA3-DLK плазмид. Строежите следват както нишките за осигуряване Taq полимеразната вярност, така и поддържането на четящата рамка.
Пример 20: pcDNA3-MLKl
5' част на MLK1 се получава от EST база данните (достъп # АА 160611). Този клон е смесване между MLKI и друга cDNA с неизвестна идентичност. Тя съдържа непубликувани преди 5' последователност на MLK1 заедно с част от предишна публикувана киназна област на MLK1 (Dorow, et al., Eur. J. Biochem., 1993, 213, 701-710). Последователността на cDNA на MLKI от EST клона е както следва: GAATTCGGCA
CGAGAGGACT | CGCAGGTGTC | CGGCGACGAG | GGCTGGTGGA |
CCGGGCAGCT | GAACCAGCGG | GTGGGCATCT | TCCCCAGCAA |
CTACGTGACC | CCGCGCAGCG | CCTTCTCCAG | CCGCTGCCAG |
CCCGGCGGCG | AGGACCCCAG | TTGCTACCCG | CCCATTCAGT |
TGTTAGAAAT | TGATTTTGCG | GAGCTCACCT | TGGAAGAGAT |
TATTGGCATC | GGGGGCTTTG | GGAAGGTCTA | TCGTGCTTTC |
TGGATAGGGG | ATGAGGTTGC | TGTGAAAGCA | GCTCGCCACG |
ACCCTGATGA | GGACATCAGC | CAGACCATAG | AGAATGTTCG |
CCAAGAGGCC | AAGCTCTTCG | CCATGCTGAA | GCACCCCAAC |
ATCATTGCCC | TAAGAGGGGT | ATGTCTGAAG | GAGCCCAACC |
TCTGCTTGGT TAGAGTGTTA GTGAATTGGG TACATGATGA TAAGTCCAGC NSAREDSQVS RCQPGGEDPS RAFWIGDEVA HPNIIALRGV
CATGGAGTTT
TCTGGGAAAA CTGTGCAGAT GGCAATTGTT AAC (Секв. Ид.
GDEGWWTGQL CYPPIQLLEI VKAARHDPDE CLKEPNLCLV
GCTCGTGGAG
GGATTCCCCC TGCCAGAGGG CCCATCATCC №:16). Това се
NQRVGIFPSN DFAELTLEEI DISQTIENVR MEFARGGPLN
GACCTTTGAA AGACATCCTG ATGAACTACT ACCGCGACCT транслира до:
YVTPRSAFSS IGIGGFGKVY QEAKLFAMLK
RVLSGKRIPP
DILVNWAVQIARGMNYLHDE AIVPIIHRDL KSSN (Секв. Ид. №: 17).
3' частта на MLKI се клонира първоначално чрез разграждане на PCR както е публикувано по-рано (Dorow, et al., Eur. J. Biochem., 1993, 213, 701-710). Протоколът аз клониране на 3' частта на MLK1 е, както се описва по-горе, за MLK2 със следните изключения. От четирите клона, получени чрез повторно изследване на библиотеката с 1.2 kb клона, три от четирите клона представят MLK1. Нито един от клоновете не включва изцяло киназната област, която е получена от PCR.
Фаги от 1 ml аликвотни части на усилени библиотеки (нормален човешки епителни на колон и човешка cDNA на Т84клетъчна линия на карцинома на колона в 1 Uni-ZAPXR (Stratagene, cat #937204) се разтваря чрез суспендиране в 20 ml вода и бързо замръзяване. Проба от 5 ml на лизирания фаг се използва като PCR матрица в две реакции за всяка библиотека. Праймерите, представящи векторите, са взети от нуклеотидните последователности граничещи с клониращите сайти. В случая на Т84 библиотеката на клетъчна линия на колон, се използват редуващите се праймери ТЗ и Т7 (Promega). Във всяка реакция, един праймер е от 3-5' нишка на MLK1 гена, приблизително ЮОЬр от 5' края на известната последователност. Вторият праймер е един от двата векторни праймери. PCR реакции съдържат IX PCR буфер, 2.5 тМ магнезиев хлорид, 1 U Tag полимераза (всичко от Bresatec), 0.2 mM dNTP и 0.4 тМ всеки праймер в общо 50 mL. Реакционните условия са 60s при
95°С, 90s при 52°С, 90s при 72°С за 30 цикъла с 15 min продължителност в крайния цикъл. PCR продукти са клонирани и последователни, както е описано по-горе. Най-дългият клон от изследването на библиотеката и
PCR фрагмент, който включва допълнителна MLK1 последователност, се свързват заедно за създаване на 1.08 kb MLK1 cDNA в pUC 18.
MLK1 клонът от EST база данните се получава в носителя pBluescript (Stratagene). MLK1 cDNA от библиотеката на колона се лигира в EST клона чрез разграждане на предишния с EcoRl, затъпена с Klenow, след това изрязана с Aflll. Този изолиран фрагмент се клонира в MLK1 cDNA от EST данни изрязани с Xhol, затъпени с Klenow и ф изрязани с Aflll. Тази нова конструкция се изсича след това от pBluescript чрез разграждане с Notl и Apal и се свързва в pcDNA3-EE също изрязан с Notl и Apal. Всички съединения на клонирането са последователно проверени.
Пример 21; Е coli експресивност на GST-MLK3kl) pGEXKG-MLK3(KD) се трансформира в щам BL21 на Е. coli чрез електропорация. Бактериите, съдържащи плазмида се инокулират в 15 литров Applikon апарат за ферментация в 10 литра от следната богата среда: 1.95 g/L К2НРО4, 0.9 g/L КН2РО4, 0.1 g/L ампицилин, 0.3 g/L, © (NH4)2SO4, 0.92 g/L MgSO4 7H20, 42.7 mg/L Na цитрат, 21.8 mg/L FeSO4
7H20, 0.5 mL Pichia микрометали (Higgins, et al., Methods Molecular Biology, 1998, 103, 149-177), 20 g/L касаминкиселини, 40 g/L глицерол, 25.5 mg/L СаС12. Бактериите се отглеждат в продължение на една нощ при 800 rpm/68% разтворен кислород/30°С, докато културата достигне OD6oo = 4.4. Произвеждането на рекомбинантен белтък се предизвиква чрез прибавянето на 1 тМ изопропил-р-О-тиогалактозид, с продължена ферментация при 25 °C най-много до 6 часа. След това бактериите се възстановяват чрез центрофугиране и клетъчната маса се замръзява при 20°С до пречистване.
Пример 22: Пречистване на бактериалната GST-MLK3kd
Частично пречистена GST-MLK3 кв се приготвя като 100 gm от бактериалната клетъчна маса се подлагат на звукова енергия в 100 тМ Tris-HCI, 150 тМ NaCI, 1 тМ EDTA, 5 тМ дитиотреитол (DTT), pH 7.5 (буфер А). Разтворът се прави 1 % с Triton Х-100, след това се разбърква върху лед в продължение на 1 час. Супернатантът, след центрофугиране в продължение на 45 минути при 20,000 х g, се смесва в продължение на 1 час върху лед с 10 mL глутатион Sepharose 4В смола (Pharmacia) в състояние на равновесие в буфер А. Утаената смола се измива два пъти с 12.5 х обемен буфер А, след това се отмива с 20 mL 100 mM Tris-HCI, 150 тМ NaCI, 5 тМ DTT (буфер В), съдържащ 20 тМ глутатион, pH 7.5. Белтъкът се подлага на диализа за една нощ в буфер В и се съхранява в аликвотни части при -80°С.
Пример 23: Пръчковидновирусна експресивност на FLAG-MLK3 и
GST-MLK3kd
Рекомбинантни пръчковидни вируси с експресивност на FLAGMLK3 и GST-MLK3rd се получават от съответните им специфични преносители, pFB-FLAG-MLK3 и pFB-GST-MLK3kd, използвайки ВАСТО-ВАС системата (Life Technologies), съгласно инструкцията. Суспензионните култури на Sf21 клетки (Vaughn, et al, In Vitro, 1977, 13, 213-217) се отглеждат при 27°C/120 rpm в прибавена среда на Grace (Hink, Nature, 1970,226, 466-467) c 10% топлинно инактивиран фетален говежди серум (FBS). За получаване на рекомбинантни FLAG-MLK3, Sf21 клетки с плътност 1.5 х 10б клетки/mL прибавена среда на Grace съдържаща 5% FBS се инфектират с мултиплетност на инфекция (MOI) на 3.1 и се събират на 39 час след инфекция. За получаване на рекомбинантни GST-MLK3rd, Sf21 клетки с плътност 1.5 х 106 клетки/mL прибавена среда на Grace съдържаща 5% FBS се инфектират с MOI на 2 и се събират на 41 час след инфекцията. В двата случая, утаените клетки се ресуспендират в буфер, състоящ се от 10 mM HEPES, 50 mM NaCI, 0.5 mM Pefabloc SC, 5 μΜ пепстатин, 10 μμ/mL апротинин, 10 pg/mL левпептин, pH 7.4. Супернантът след центрофугиране в продължение на час при 147,000 xg се довежда до pH 7.4 с 3 М Тге основа и след това се складира при -70°С преди пречистване.
Пример 24: Пречистване на пръчковидновирусна GST-MLK3Kn
Частично пречистена пръчковидновирусна GST-MLK3kd се приготвя чрез хроматография с афинитет към глутатион. За 10 mL клетъчен екстракт (26.6 mg общ белтък), 1 mL от глутатион Sepharose 4В смола (Phatmacia) се довежда до равновесие в 10 mM HEPES, 150 тМ NaCI, pH 7.4 (буфер С) се прибавя и белтъка ес оставя да се свърже в продължение на 45 мин при 4°С. Смолата след това се измива в колона с 30 колонни обема на буфер С, след това се отмива с 5 колонни обема на буфер С, съдържащ 20 тМ глутатион. Извлеченият краен продукт се диализира в продължение на една нощ в буфер С и се съхранява в аликвотни части при -70°С.
Пример 25: Пречистване на пръчковидновирусна FLAG-MLK3
Частично пречистена пръчковидновирусна FLAG-MLK3 се приготвя чрез конюгирана с антитела хроматография. Белтък от 15 mL от екстракта (19.5 mg общ белтък) с допълнителна 0.1М NaCI се свързва върху 0.25 mL колона на M2 моноклонално FLAG белтъчно антитяло, свързано с агарозна смола (Sigma) чрез повторно натоварване (три пъти общо). Смолата се довежда до равновесие с 5 колонно обемно измиване на 50 mM Tris-HCI, 150 тМ NaCI, pH 7.4 (TBS), 3 колонно обемно измиване на 0.1М глицин, pH 3.5, последвано от друго 5 колонно обемно измиване на с TBS, преди хроматографията. Рекомбинантният белтък се отмива първоначално с 5 колонни обеми на 0.2 mM FLAG белтък (N-AspTyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-C) (Секв. Ид. №:18) в TBS. Белтъкът се съхранява в аликвотни части при -80°С преди опита.
Пример 26: Доминантен негативен мутант: Доминантен негативен мутант на фамилията MLK блокира смъртта в диференцираните РС12 клетки след премахване на нервния растежен фактор
PC-12 клетъчна линия, получена от феохромоцитома на плъхове, е широко използвана като модел на нервна клетка за изследване молекулярните моменти, водещи до смърт на неврона (за справка, вж. Troy, et al., Adv. Neurology, 1997, 103-111). Нервният растежен фактор (NGF) предизвиква диференциация на PC-12 клетки в симпатиков невронен фенотип (Greene, Cell Biol., 1978, 78, 747-755). NGF диференцирани PC-12 клетки зависят от NGF за оцеляване и претърпяват морфологично описана апоптозна смърт при отстраняване на NGF от средата на културата. Клетъчна система е развита за определяне ефекта на членовете на фамилия на смесена киназна линия върху PC-12 клетъчна смърт след премахване на NGF. PC-12 клетките претърпяват трансфекция с cDNA кодиране за доминантен негативен (DN) мутант на MLK-З, използвайки Pfx система на мастен носител, както се препоръчва от производителя (Invitrogen, Carlsbad, СА). Постоянен фонд на трансфектант, изразяващ DN-MLK-3, се избира използвайки G418 сулфат (Mediatech Inc., Herndon, VA). Приблизително 30% от клетките в тези фондове изразяват DN MLK3, както е определено чрез имунохистохимия. Клетъчни фондове, постоянно изразяващи мутантната киназа се поставят върху плочки с 96-гнезда, покрити с тъканна култура полиорнитин/ламинин (10 ug/ml всяка във фосфатно буферен серум) при плътност 2 х 104 клетки/гнездо и се обработват с 100 ng/ml NGF в продължение на 7 дни. Средата, съдържаща NGF се отстранява, клетъчният монопласт се измива с фосфатно буферен серум и средата, съдържаща неутрализиращо NGF антитяло (cat. #N6655; Sigma, St. Louis, МО) при крайно разреждане 1:1000, се отстранява за 1-5 дни. Клетъчната жизнеспособност се определя количествено чрез изследване на клетъчната жизнеспособност, използвайки конверсията на тетразолиевата сол, MTS, до цветен формазан, който се отчита при абсорбирането на 570 nm на CytoFluor 2350 (Millipore, Bedford, МА), както се препоръчва от производителя (Promega, Madison, WI).
Постоянни фондове, изразяващи DN-MLK-3 са частично избавени от клетъчна смърт, причинявана от премахване на NGF (Фигура 10).
Пример 27: Анализ за ензимна активност на рекомбинантния MLK белтък
За да се покаже, че MLK белтъкът, изразен било в пръчковидновирусна или бактериална експресивна система, е ензимно активен, могат да бъдат използвани няколко опитни образци. MLK белтъкът може да бъде с пълна дължина или киназна област, изразена или в пръчковиден вирус или в бактериална експресивна система. Опитът може да бъде на основата на антитяло, като например ензимно белязан имуносорбентен анализ (ELISA), съгласувано разделителна флуоресценция (TRF), или флуоресцентна поляризация (FP). Антитялото може да бъде моноклонално или поликлонално с реактивност по отношение на фосфосерин, фосфотреонин или фосфоспецифичен субстрат. Друга възможност е да бъде използван метод, който не е на основата на антитяло, като например радиоактивен анализ на основата на гел (виж Фигура 11), мултискринингов анализ на преципитация на трихлороцетна киселина (ТСА) (Фигура 13), сцинтилационен експресанализ (SPA), метод на изпарителна колона или фосфоцелулозен филтърен опитен образец (Фигура 13). Анализът може да бъде с цел мониториране на директното фосфорилиране на субстрат или свързана система на анализ, използваща кинази от по-долен клон в сигнализиращия път. Субстратът може да бъде специфичен субстрат, такъв като SEK-1, или относително неспецифичен субстрат, такъв като миелинов основен белтък (МВР).
Пример 28: Киназни анализи:
(1) Радиоактивен киназен анализ на основата на гел
Киназната активност на MLK-З се анализира чрез мониториране на включването на Р от [γ- Р]-АТР в субстрат на MLK (напр. безжизнена киназа SEK-1; миелинов основен белтък). Смес на анализа от 50-μ1 съдържа Буфер А (20 mM MOPS, pH 7.2, 25 тМ β-глицерол фосфат, 5 тМ EGTA, 1 тМ натриев ортованадат, 1 тМ дитиотреитол), 15 тМ MgCl2, 100 μΜ ATP, 10 pCi [γ-32Ρ]-ΑΤΡ и 0.1 gg безжизнена киназа SEK1 субстрат (Stressgen, Inc; свързана глутатион Б-трансфераза-БЕК-1 (GSTSEK-1) се освобождава от глутатион-агарозни семена с 10 шМ глутатион, pH 8.0) или 25 pg МВР (Sigma Chemical Co.). Реакцията се започва чрез прибавяне на MLK белтък (киназна област или препарат, съдържащ както пълна дължина, така и киназна област) или контролнен белтък. Сместа се инкубира в продължение на 30 мин при 30°С. На края на реакцията се прибавя 2х редуциращ пробен буфер. Сместа се оставя да кипи 5 min, натоварва се или върху 12% SDS-PAGE гел (използвайки МВР като субстрат), или 8% гел (SEK-1 като субстрат). След електрофореза, гелът се изсушава. Количествено определяне на фосфатното включване в субстрата, SEK-1, се извършва върху Molecular Dynamics Phosphorimager (апарат за изображение на молекулярната динамика на фосфора) (Sunnyvale, СА). Резултатите на експериментите показват ензимната активност на пръчковидновирусно експресивната MLK-3 (FLAG-белязана пълна дължина или GST-белязана киназна област), използвайки безжизнена киназа GST-SEK-1 или МВР като субстрат, са показани във Фигури 11А и 11В.
(2) Western Blot анализ
Киназната активност на пръчковидновирусно експресивната MLK-3 се проверява чрез анализ на имунологично оцветяване. Анализираната смес от 20-μ1 съдържа Буфер А, 15 mM MgCl2, 100 μΜ ATP и 0.1 μg безжизнен киназен SEK-1 субстрат. Реакцията се оставя да протича в продължение на 30 мин при 30°С, след това рязко се охлажда с 10 μΐ 4 пъти с редуциращ пробен буфер. Белтъците се отделят върху 8% Trisглицинов гел и електрофоретично се пренасят към Immobilon PVDF мембрана. Мембраната се инкубира с фосфоспецифично SEK-1 (Thr223) антитяло (New Engln Biolabs, Inc.), последвано от хряново пероксидазно белязан противозаешки IgG от козел (Bio-Rad). Определянето на
имунореактивните ивици се извършва чрез усилена хемолуминисценция (Amersham). Фосфорилирането на безжизнена киназа GST-SEK-1 чрез FLAG-MLK-3 белтък (пръчковидновирусен препарат, съдържащ както цяла дължина, така и киназна област) е показано във Фигура 12.
(3) Множествен анализ на преципитацията на трихлороцетна киселина (ТСА)
Киназната активност на бактериално експресивната GST-MLK-3 киназна област се оценява, използвайки Millipore множествен трихлороцетен (ТСА) анализ в плочка, както е описано от Pitt, et al., J. Biomol. Screening, 1996, 1, 47-51). Анализите се извършват в 96-гнездни множествени плочки с твърди пори (Millipore). Всяка анализирана смес от 50-μ1 съдържа 20 mM Hepes, pH 7.4, 20 тМ MgCI2, 20 тМ МпС12, 2 тМ DTT, 0.1 тМ Na3VO4, 1 pCi [γ-Ρ32] ATP и 30 pg МВР субстрат. Реакцията се започва чрез прибавяне на MLK белтък и се оставя да протича в продължение на 15 мин при 37°С. Реакцията се спира с 25 pl 50% ТСА. Плочките се оставят да се еквилибрират в продължение на 30 мин при 4°С, след това се измиват с ледено студена 25% ТСА. Към плочките се прибавя сцинтилационен коктейл и се определя радиоактивността, използвайки Wallac MicroBeta 1450 PLUS сцинтилационен брояч. Отговорът на белтъчната доза срещу образуването на 32Р-белязан МВР е показан във фигура 13.
(4) Анализ на фосфоцелулозния филтър
Анализът на киназата се извършва в 50-р1 реакционна смес, съдържаща 20 mM Hepes, pH 7.4, 20 mM MgCl2, 20 mM МпС12, 2 тМ
DTT, 0.1 тМ Na3VO4, 1 pCi [γ-Ρ32] ATP и 30 pg МВР. Реакцията се започва чрез прибавяне на MLK белтък и се оставя да протича в продължение на 15 мин при 37°С. Реакцията се спира с 75 μΐ от 75 тМ фосфорна киселина. Аликвотна част от рязко охладения разтвор се натоварва директно върху фосфоцелулозната мембрана (Pierce). Освен това, може да бъде използван 96-гнездна фосфоцелулозна мултискринингова плочка (Millipore). Мембраните се измиват с 75 шМ Н3РО4. Свързаният 32Р-белязан фосфорилиран МВР се отмива в колекторни епруветки чрез прибавяне на 1 М натриев хидроксид. Радиоактивността се определя чрез преброяване на Cerenkov в Beckman сцинтилационен брояч (Somerset, NJ). Образуването на фосфорилиран МВР с нарастваща концентрация на бактериално експресионна GSTMLK-3 киназна област е показано във фигура 13.
Пример 29: Анализ за определяне свързването на съединения към смесена MLK фамилия
К-252а (Съединение Ш-З; виж, Таблица 4), индолокарбазолов метаболит на Nocardia вид, се свързва към различни серин/треонин и тирозин кинази (Angeles, et al., Anal. Biochem ,1996, 236, 49-55; Knight, et al., Anal. Biochem., 1997, 247, 376-381). За анализ на свързването към човешката смесена с пълна дължина MLK-З от сурово приготвяне на пръчковидно вирусни инфектирани клетки се използва тритиум съдържащ К-252а лиганд. [3Н]К-252а е специфично белязана с тритиум на 3 и 9 позиции чрез контакт с NEN Research products (Billerica, МА) и има специфична активност 40 Ci/mmol. Реакциите на свързване се извършват в 1 ml в 96-гнездна плочка. Реакционната смес съдържа 50 mM MOPS буфер, pH 7, 150тМ NaCI, 5 тМ МпС12, 1 mg/ml BSA, 1 % ο
DMSO и 0.25 пМ [ Н]К252а. Пробите се извършват в триплет с концентрация 5 ug/ml сурова пръчковидно вирусна производна MLK-3.
Неспецифичното свързване се определя като свързване в присъствието на небелязана 1.2 иМ К252а и се извежда от общото свързване, за да се получи специфичното свързване. При това разреждане, 12-15 % от общия брой не са специфично свързани с белтък и 75-85 % от тях са специфично свързани с MLK-3 (фигура 14). Всички опити се извършват в продължение на 2 часа при 4°С. [3H]K252a/MLK-3 комплексите се събират върху GF/C Whatman филтри, използвайки Brandel мишки, измити със студен MOPS/NaCI буфер и се преброяват на Wallac Micro Beta брояч. За получаване на Ка за К252а се извършва експеримент за сатурационното свързване. Показан е пример на резултатите от един от тези експерименти (фигура 14). Получен е Ка 0.89 пМ (Доверителни граници: 0.2 до 1.5 пМ).
Пример 30: Анализи на интактни клетки (A) Cos 7 Свръхекспресивна система
Материали
К-252а и производни на това съединение се осигуряват от KyowaHakko Kogyo Co. Ltd. (Tokyo, Japan) (Kaneko et al., 1997). Съединенията се разтварят във фракция на клетъчна култура диметил сулфоксид (DMSO) и се съхранява на тъмно при 4°С. Всички разреждания на съединенията се правят в модифицирана от Dulbecco среда на Eagle (DMEM), съдържаща 1 % говежди серумен албумин. Хемаглутиниращо антитяло (НА) се доставя от BAbCC (Richmond, СА). АР-1 (с jun) субстрат се доставя от Promega (Madison, WI). [γ-32Ρ]ΑΤΡ (6000 Ci/mmol) се доставя от Amersham (Arlington Heights, IL).
Cos7 клетъчна култура
Cos7 клетки от бъбрек на зелена маймуна се получават от АТСС, Rockville Maryland (CRL 1651 ) и се държат в DMEM, съдържащ 10 % говежди серум, 2 тМ глутамин, 1 тМ пируват, 50 U/ml пеницилин/стрептомицин при 37°С в 10% СО2, 90 % атмосферен въздух. Cos7 клетките се отделят за преминаване чрез прибавяне на Q.25 % трипсин.
(1) Свръхекспресивност на членовете на MLK фамилия и JNK1 в Cos7 клетки
Cos7 клетки се поставят при 80% сливане и трансфекция с 2 ug всяка от cDNA конструкции, използвайки липофектамин като препоръчан от доставчика (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Пълна дължина cDNA на човешка MLK-3, MLK-2, или миша DLK или частично човешка MLK-1, както е описано по-горе, и пълна дължина Хемаглутинин с А-краи човешка JNK1, любезно доставени от J. Silvio Gutkind (NIH, Bethesda, MD), са субклонирани в pcDNA3 преносител (Invitrogen, San Diego, СА). След 48 часа трансфекция, клетките се обработват с 0.025% DMSO или 500 пМ от показаните съединения в продължение на 2 часа, последвано от лизиране в 0.4 ml Triton буфер (1 % Тритон X- 100, 50 тМ натриев хлорид, 10 mM Tre (pH 7.6), 0.1 % говежди серумен албумин, 30 иМ натриев пирофосфат, 50 тМ натриев флуорид, 20 ug/ml апротинин, 1 тМ фенилметилсулфонилфлуорид, 1 тМ натриев ванадат). Активността на JNK се оценява от лизата чрез анализ на имунопреципитация/киназа, както е описано по-долу.
(2) Анализ на имунопреципитацията и киназата от цялостни клетки
Лизат от Cos 7 клетки се измерва за концентрация на белтък, използвайки Micro ВСА кит от Pierce (Rockford, IL) и равни количества белтък се подлагат на имунопреципитация с НА антитяло в продължение на 1 час при 4°С. Имунопреципитатите се утаяват чрез центрофугиране в микрофугова центрофуга в продължение на 20 сек, ресуспендират се в Triton буфер, измиват се чрез центрофугиране още 3 пъти, последвано от крайно измиване в киназен буфер (20 mM Hepes pH 7.4, 20 тМ MgCl2, 2 тМ дитиотреитол, 0.1 тМ натриев ванадат). Имунопреципитатът се ресуспендира в киназен буфер, съдържащ 1 μΜ ATP и 5 pCi [γ- Р]АТР и субстрат (1 pg/проба от АР-1) и се инкубира в продължение на 15 мин при 30°С. Киназната реакция се спира чрез прибавяне на редуциращия пробен буфер (Laemmli, Nature 1970:227;680-685). Пробите се нагряват до 80°С в продължение на 5 мин и се натоварват върху 10% SDSполиакриламидни гелове. Белтъците се разделят чрез електрофореза. Телът се изсушава и се извършва количествено определяне на радиоактивността в АР-1 субстрат върху Molecular Dynamics Phosphorimager (Sunnyvale, Са.). Резултатите от опитите, където MLK-3, MLK-2 и DLK са ко-експресивни с HA-JNK1 и са инкубирани при отсъствието или наличието на К-252а, са показани във фигури 15А и 15В. Обратно на това, производно на изходното съединение К-252а, наречено Съединение Ш-З (виж таблица 4), което е по-селективен киназен инхибитор, не взаимодейства с JNK пътя, активиран от друга MAPKICK, по-горен клон на JNK, MEKKI (Фигура 15С).
(Б) Анализ на съобщаването на цялата клетка за MLK активирана JNK
Опити за получаване на клонове, устройствено експресивни по отношение на MLK фамилията, са неуспешни, предполагайки че свръхекспресията на MLK-те може да повлияе клетъчното оцеляване (Bergeron et al., Biochem. Biophys.Res.Commun.,1991,231, 153-155; Nagata, et at., EMBO J.,1998, 17, 149-158). Поради това, при развиване на анализа на цялата клетка за проследяване на биохимични събития, индуцирани от MLK, може да бъде необходима клетъчна линия, съдържаща генетично инженерно индуцираща експресивна система на киназата, която представлява интерес. Например, PC-12 клетъчна линия, заразена с тетрациклин контролиран трансактиватор. Когато по-нататък клетките са заразени с ген, представляващ интерес, извлечен чрез индуциращ промотор tetO, експресивността на този ген е тясно контролирана от тетрациклин в средата (Shocket, et al.. Proc. Natl. AcadSci. USA, 1995, 92, 6522).
За да се определи количествено активирането на MLK, може да се измери фосфорилирането на субстратите в по-долен клон, такива като МЕК4, JNK или c-jun в сложни опитни форми, както са описани по-горе. Друг подход за количествено определяне на активирането на MLK в цялостни клетки, е да се използва съобщаването на ензимната активност, такава като c-jun луциферазна система на съобщаване, която търговски може да се намери чрез PathDetect™ системата (Stratagene, LaJolla, СА). При тази система, тетрациклин индуциращата клетъчна линия е заразена с два плазмида. Един плазмид устройствено изразява сливане на eJun NH2-крайния трансактивиращ участък с GAL4 DNA свързващ участък (cJun-DBD сливащ белтък). Другият плазмид носи кодиращите последователности за луцифераза на светулка, извлечена чрез пет двойни повторения на GAL4 свързваща страна. При активиране на MLK, подолният клон на субстрата на JNK, cJun-DBD сливащ белтък, се фосфорилира, свързва се с GAL4 свързващите места и индуцира транскрипция на луциферазния ген. Луциферазата се анализира лесно в клетъчните лизати чрез прибавяне на неин субстрат (Promega, Madison, WI) и измерване на хемолуминисценцията.
Пример 31 : Връзка между инхибирането на членове на MLK фамилията с мотоневронното и кортикално оцеляване
Оцеляване на култури от гръбначен мозък на плъхове, обогатени с мотоневрони
Извършва се дисекция на гръбначен мозък на зародиши на плъхове Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, Wilmington, МА) на ембрионна възраст (Е) 14.5-15. Клетки само от вентралната част на гръбначния мозък се дисоциират и по-нататък се обогатяват за мотоневрони чрез центрофугиране при градиент на метризамид 6.5% стъпка, както е описано по-горе (Henderson al., 1993) и се анализират за чистота чрез оцветяване с ниско афинитетно невротропно рецепторно антитяло (IgG-192, Boehringer-Mannheim) (данните не са показани). Клетките са посадени върху 96-гнездни плочки, предварително покрити с поли-1-орнитин и ламинин (5 ug/ml всяка една) при плътност 6х104 клетки/cm2 в химично определен серумна среда без N2 (Bottenstein, et al., 1979, supra). За да се отделят ефектите на присъединяване от тези на оцеляване, към културите се прибавят съединения след началния период от 1-3 часа на присъединяване. Оцеляването на невроните се оценява след 4 дни чрез използване на калцеин AM (Molecular Probes, Eugene, OR) в анализ на флуометричната жизнеспособност (Boryczko-Coyne, et al., 1993, supra). Микроскопско преброяване на невроните корелира пряко с относителните стойности на флуоресценция. Накратко, средата на културата се разрежда серийно в DPBS (Dulbeccos фосфатно буферен серум) и след това към всяко 96-гнездо се прибавя крайна концентрация 6 иМ калцеин АМ. Плочките се инкубират в продължение на 30 мин при 37°С, последвано от серийно разреждане на смивове в DPBS. Флуоресцентният сигнал се чете, използвайки флуориметър, четящ плочка от Millipore (Cytofluor 2350) при възбуждане=485 шп и емисия = 538 nm. За всяка плочка средният фон получен от гнездата, получаващи калцеин АМ, но не съдържащи клетки, е извлечен от всички стойности. Линейността на флуоресцентния сигнал се определя точно от концентрацията и времето на инкубация за варирането на клетъчната плътност в тези експерименти. Пример на процентното оцеляване над контрола на мотоневроните в присъствието на изпитвани съединения при 250 пМ е показан в таблица 3.
Оцеляване на кортикални неврони
Церебрален кортекс се дисецира от зародиши на плъхове на 18 ембрионни дни и ензимно се разграждат за получаване на единична клетъчна суспензия. Клетките се посаждат при плътност 1.56 х 105/ст върху поли-орнитин/ламинин покрити 96 гнездни плочки на тъканни култури в серумна среда без Neural Basal, съдържаща В27 добавки. Плочките са покрити с разтвор на поли-орнитин/ламинин (8ug/ml всяка една) направени в PBS в продължение на поне 2 часа при 37°С. На 5-7 ден in vitro, кортикалните неврони се излагат на АЬ25-35 (20иМ) или в присъствието, или в отсъствието на изпитваните съединения. АЬ25-35 (Sigma, St. Louis, МО) основни разтвори (1тМ) се приготвят в дейонизирана-дестилирана стерилна Н2О. Относителното невронно оцеляване се определя на 48 часа след присъединяването на белтък, използвайки лактат дехидрогеназно (LDH) отделяне, като индикатор на плазмената мембранна цялостност/клетъчна жизнеспособност. LDH се измерва, използвайки Cytotoxicity Detection Kit (кит за определяне цитотоксичността) (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) в съгласие с инструкциите на производителя. Данните са показани като процентно инхибиране на LDH освобождаването, относно културите, обработвани само с АЬ25-35.
Таблица 3
Кортикални неврони | Мотоневрони | Cos-7 Клетки | Cos-7 Клетки | Cos-7 Клетки | Cos-7 Клетки | ||
Формула | Оцеляване % Контрол при 250 пМ | Оцеляване % Контрол при 250 пМ | % JNK 500 пМ | DLK %JNK Инхиб. @ 500 пМ | MLK3%JNK Инхиб. @ 500 пМ | MLK2%JNK Инхиб. @ 500 пМ | MLK1%JNK Инхиб. @ 500 пМ |
III1 | 46, 56 | 300% | 65% | 63, 73 | 99, 98 | 89, 67 | 97,96 |
III2 | 47,80 | 315% | 88% | 36,22, 42 | 94,94 | 69, 44 | 92,64 |
I3 | 22,54 | 177 | 88% | 20,25 | 94,93 | 0 | 79,29 |
т | 29,39 | 165% | 97% | 58,13, 52,8 | 84,92, 90 | 0 | 63,38 |
Съединението има формула III, където Zb Z2, Ri и R2 са Η; X е СО2СН3; и R е OH.
Съединението има формула III, където Ζι и Ζ2 са Η; X е СО2СН3; Ri и R2 са CH2SCH2CH3; и R е ОН.
Съединението има формула I, където Ab А2, Rb R3, R5 и R6 са Н; В] и В2 заедно представляват О; R2 е СН2СН2ОАс; R4 е СН2СН2(2-Пиридил); и X еСН2.
4Съединението има формула I, където Ab Л2, Ri, R3, Rs и Яб са Н; В! и В2 заедно представляват О; R2 е Н; R4 е СН2СН2 (2-Пиримидинил); и X е
СН2.
Пример 32: Имунопреципитация на ендогенната JNK активност от мотоневронни култури в отсъствието или в присъствието на индолокарбазоли или кондензирани пиролокарбазоли
Пречистените мотоневрони се поставят в плочка с плътност от 6 х 104 клетки/cm2 в гнезда с 16 mm диаметър. Клетките се оставят да се фиксират в продължение на 2 часа преди третирането. Клетките се обработва или с 0.0125 % DMSO, или с 500 пМ съединение в продължение на 2 часа в N2 определена среда. След това клетките се изплакват с ледено студен фосфатно буфериран серум, последвано от лизиране в 0.4 ml Triton буфер, както е описано по-горе в пример 30. Лизатът от мотоневронната култура се нормализира до клетъчно число и имунопреципитира с JNK1 антитяло (cat. # sc-474) доставено от Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, СА). JNK активността от имунопрепипитатите се изследва в присъствието на Р-АТР и c-jun субстрат, както е описано по-горе. Профилът на инхибиторната активност на 4-те изпитвани съединения се сравнява в мотоневроните и в Cos7 клетки, свръхекспресивни по отношение или на DLK, MLK-1, MLK-2, или MLK-З (Таблица 3).
Пример 33: Корелация между инхибирането на MLK3 индуцираната активност на JNK в Cos7 клетки и холинацителтрансферазната активност в първични ембрионни култури
За да определим дали инхибирането на JNK пътя, регулиран от тези кинази, корелира с невротропните съединения, ние оценяваме ефекта на съединението върху JNK активността в Cos7 клетки, свръхекспресивни по отношение на НА-JNK и MLK3. След 48 часов период на трасфекция, клетките се инкубират със съединенията при 500 пМ за 2 часа, последвано от клетъчно лизиране. Лизатът се имунопреципитира и киназната активност се измерва, както е описано по-горе. Резултатите се съобщават като процентно инхибиране на контролната проба, където контрол е JNK активността в присъствието на DMSO. Както може да бъде видяно в Таблица 4, повечето съединения, които са активни в спиналния мозък и/или базално предно мозъчна ChAT активност, са белтъчни инхибитори на MLK-3 активирането на JNK.
Таблица 4
Ефект на индоло- и индено- карбазоли върху JNK активността в Cos7 клетки, свръхекспресивни по отношение на MLK3
Холинацетилтрансферазна активност | % Инхибиране JNK активността (средно) | ||
Съединение | Гръбначен мозък | Базален преден мозък | MLK3 в Cos7 клетки |
ПМ1 | + | + | 84 |
ΪΪΕ? | + | + | 96 |
ПЕЗ3 | + | + | 94 |
Е14 | + | + | 93 |
Е25 | + | + | 85 |
ЕЗ3 | + | + | 93.5 |
Е47 | - | + | 95 |
Е58 | - | + | 97 |
Е69 | - | + | 58 |
Е710 | - | + | 85.5 |
Ш-411 | - | + | 66 |
IIE512 | - | + | 96 |
IIE713 | - | + | 54 |
Е8* | + | - | 89 |
Ш-815 | + | - | 94 |
Ш-916 | + | + | 98.5 |
III-1017 | + | - | 78 |
I-918 | + | - | 88 |
I-1019 | + | - . | 94 |
III-II20 | - | - | 92.5 |
1-1121 | - | + | 33 |
I-1222 | - | - | 11 |
1-132i | - | - | 1 |
’Съединение с формула III, където Ζι и Z2 са Η; X е СО2СН3; R] е NHCONHC2H5; R2 е СН2СН2(2-Пиридил); и R е ОН.
2Съединение с формула III, където Ζι и Z2 са Η; X е СО2СН3; Ri и R2 са СН2ОСН2ОСН2СН3; и R е ОН.
Съединение с формула Ш, където Z} и Z2 са Η; X е СО2СН3; Ri и R2 са CH2SCH2CH3; и R е ОН.
4 Съединение с формула I, където Ab А2, Rb R3 и R4 са Η; Bi и В2 заедно представляват О; R2 е СН2СН2ОН; R5 и R6 са ОСН3; и X е СН2.
5 Съединение с формула I, където Ab А2, Rb R3, R5 и R<, са Н; В! и В2 заедно представляват О; R2 е СН2СН2ОАс; R4 е Вг и X е СН2.
6 Съединение с формула I, където Ab А2; Rb R3, R5 и R6 са Н; В] и В2 заедно представляват О; R2 е СН2СН2ОАс; R4 е СН2СН2(2-Пиридил); и X еСН2.
7 Съединение с формула I, където Ab А2 Rb R3, R4, R5 и R6 са Η; Bi и В2 заедно представляват О; R2 е СН2СН2ОН; и X е СН2.
Q
Съединение с формула I, където Ab А2, Rb R3, R4, R5 и R^ са Η; Bi и В2 заедно представляват О; R2 е СН2СН2СН2ОН; и X е СН2.
9 Съединение с формула I, където Ab А2 Rb R2, R3, R4, R5 и R^ са H; В; и
В2 заедно представляват О; и X е S.
10 Съединение с формула I, където Ab А2, Rb R3, R4, R5 и Re са Η; Bi и В2 заедно представляват О; R2 е CH2CH2CH2NHCO(4-(OH)Ph); и X е СН2.
11 Съединение с формула III, където Zb Z2, Ri и R2 са Η; X е СО2(СН2)4СН3; и R е OH.
Съединение с формула Ш, където Zb Z2 и Ri са Н; R2 е СН2ОН; X е СО2СН3; и R е ОН.
Съединение с формула III, където 7L\ и Z2 заедно образуват =0; Ri и R2 са Br; X е СО2СН3; и R е ОН.
14 Съединение с формула I, където Ab А2, Rb R3, R4, R5 и R6 са Н; Bt и В2 заедно представляват О; R2 е Н; R4 е СН2СН2(2-Пиримидинил); и X е СН2.
15 Съединение с формула III, където Zi и Z2 са Н; Ri е Br; R2 е I; X е СО2СН3; и R е ОН.
16 Съединение с формула III, където Zb Z2, Ri и R2 са Η; X е СО2СН3; и R еОН.
Съединение с формула III, където Zi и Z2 са Н; Ri и R2 са CH2CH2SCH3; X е СО2СН3; и R е ОН.
Съединение с формула I, където Ab А2, Rb R2, R3, R5 и R6 са H; Bt и В2 заедно представляват О; R4 е СН2СН2(2-Пиридазинил); и X е СН2.
19 Съединение с формула I, където Ab А2, Rb R3, R5 и R6 са Н; В} и В2 заедно представляват О; R2 е Н; R4 е СН2СН2(2-Пиридил); и X е СН2.
Съединение с формула III, където Zb Z2, R| и R2 са Η; X е СО2СН3; и R е ОСН3.
Съединение с формула I, където Ab А2, Rb R3, R4, R5 и R6 са Η; Bi и B2 заедно представляват О; R2 е (СН2)3->Ш-С(=О)-3,5-дихидроксифенил; и X е СН2.
Съединение с формула I, където Ab А2, Rb R3, R.b R5 и R6 са Η; Βι и В2 заедно представляват О; R2 е бензоил; и X е СН2.
Съединение с формула I, където Ab А2, Rb R2, R3, R5 и Rf, са Η; Βι и В2 заедно представляват О; R4 е CH=CH-C^N; и X е СН2.
Пример 34: Анализ на гел изместването за MLK активирането:
Активиране на MLK-те може да доведе до индуциране на транскрипция на c-jun, водеща до увеличаване на c-Jun белтък. Увеличеното количество c-Jun белтък може да бъде измерено чрез стандартен анализ, определен като анализ на гел изместването. Gamer, et al., Nucleic Acids Res., 1981, 9, 3047-3060, което е включено тук чрез позоваване в неговата цялост. Радиобелязани двойни DNA олигомери, които кодират c-Jun DNA-свързващата страна, са инкубирани с ядрен клетъчен екстракт, последван от електрофореза на акриламиден гел и количествено определяне на радиобелязаната DNA, изместена към побавната подвижност. Това представлява тази част от DNA, която е свързана c-Jun белтък и е право пропорционална на количеството c-Jun белтък в екстракта.
Активиране на MLK-те може, също така, да индуцира фосфорилиране на c-Jun. Това може да бъде определено, използвайки антитела, които са специфично разпознаващи фосфорилираната форма на белтъка в определящи системи, такива като, например, Western blots или ELISA.
Пример 35: Оцеляване на пилешки ембрионни неврони
Материали
Средата на Leibovitz L15, глюкозата, натриевият бикарбонат, трипсинът и антибиотиците са от Gibco. Екстракт от мускул се приготвя, както е описано, (Henderson, et al., Nature, 1983, 302, 609-611, който е включен тук чрез позоваване в неговата цялост). Всички други реагенти са от Sigma, освен ако не е указано друго.
Клетъчна култура
Мотоневрони (ембрионен ден 5.5) са изолирани с имунологичен метод, съгласно изложената процедура в Bloch-Gallego, et al., Development, 1991, 111, 221-232, което е включени тук чрез позоваване в неговата цялост, с модификации, както е описано в Weng, et al.,
NeuroReport, 1996, 7, 1077-1081, което е включено тук чрез позоваване в неговата цялост. Пречистените мотоневрони се садят върху 35 mm чинийки на тъканни култури (Nunc) предварително покрити с поли-DLорнитин и ламинин (1 gg/ml, Upstate Biotech). Средата на културата е 15 L с натриев бикарбонат (22.5 тМ), глюкоза (20 тМ), прогестерон (2x10' М), натриев селенит (3x10'М), коналбумин (0.1 mg/ml), инсулин (5 pg/ml), пеницилин- стрептомицин и 10% топлинно инактивиран конски серум. Екстрактът от мускул се допълва до 30 gg/ml. Съединение Ш-З се приготвя като 4тМ основен разтвор в DMSO и се съхранява на защитено от светлина място при 4°С. Крайната концентрация на DMSO в обработваната и контролната култура е 0.125%.
Паравертебрален симпатиков ганглий (SG; ембрионална възраст 12 дни (Е 12)), дорзален корен на ганглия (DRG;E9) и цилиарен ганглий (CG;E8) се дисецират от пилешки ембриони на указаната ембрионна възраст, както е описано в Lindsay, et al., Dev. Biol., 1985, 112, 319-328, което е включено тук чрез позоваване в неговата цялост. След трипсинизация и дисоциация, суспензиите на нервните клетки се поставят върху плочки с полиорнитин-ламининово покритие с култури в среда на културата Ham F14, допълнена с 10% конски серум. Непосредствено след поставянето на плочките се прибавят фактори на оцеляване при следните концентрации: Нерв растежен фактор (NGF), 20 ng/ml; ресничест невротропен фактор (CNTF), 10 ng/ml. Културите се поддържат при 37° и 5% СО2 в овлажнена среда.
Клетъчно преброяване
Невроните се поставят в плочки в 35 mm култура с решетки (Nune). Избрани области от всяка чинийка, съдържащи заедно около 10% от изследваната повърхност за наличието на фаза ярки клетки непосредствено след поставянето и отново след 48 часа за оценка процентите на оцеляване. Клетъчното оцеляване се потвърждава чрез живо оцветяване с трипаново синьо (не е показано).
Интактни DRG
Ганглии се поставят в 96 гнездни плочки, които предварително са покрити с поли-1-орнитин и ламинин (5 pg всяка/ml фосфатен буферен серум) в среда на свободен от N2 серум (Bottenstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 514-517, което е включено тук чрез позоваване в неговата цялост), съдържаща 0.05% говежди серумен албумин (BSA) и се поддържа в продължение на 48 часа при 37° и 5% СО2 в овлажнена среда. Обработените ганглии получават или 250 пМ Съединение Ш-З, или 20 ng/ml NGF 2 часа след поставянето им в плочка.
Съединение III 3 подпомага оцеляването на пилешки ембрионни периферни неврони в модел, зависещ от концентрацията
Изтеглянето на NGF от дисоциираните култури на Е9 сензорни неврони от ганглий на дорзален корен (DRG) и Е12 неврони на симпатикови ганглии (SG) ги подлага на PCD в течение на 48 часа. Това се предотвратява чрез прибавяне на Съединение Ш-З към средата на културата по време на изтеглянето на NGF. АТ 1 μΜ, Съединение Ш-З държи 94% от SG невроните и 890% от DRG невроните живи след 48 часа (третирана с NGF контрола: SG 65%, DRG 66%). Подобно на това, Съединение Ш-З спомага оцеляването на 76% от CNTF-зависимите цилиарни ганглиеви (CG) неврони след 24 часа (третирана с CNTF контрола 67%). В присъствието на 10% серум, ефектите на оцеляване на Съединение Ш-З са зивисими от концентрацията, с достигнато плато около 1 μΜ за всичките три невронни популации (Фиг. 16А-С). Оцеляващите неврони показват голямо израстване на аксона с по-дебели и по-извити аксони в сравнение с контролните култури. (Фиг. 17 Е-Н). След четири дни, стимулиращата активност на оцеляването все още е интактна: DRG: Съединение Ш-З 52%, третирана с растежен фактор контрола 41 %; SG: Съединение Ш-З 83%, третирана с NGF контрола 55%; СО:Съединение Ш-З 58%, третирана с CNTF контрола 50%). При
оптимални условия, културите могат да се поддържат със Съединение
Ш-З в продължение на една седмица и повече (не е показано).
Съединение III 3 подпомага оцеляването на пилешки ембрионни мотоневрони в модел, зависещ от концентрацията
Култивирани пилешки мотоневрони могат да оцелеят и да разширят процесите в присъствието на мускулен екстракт, докато те бързо умират в неговото отсъствие. В нашите опити, след 48 часа, 65% от мотоневроните оцеляват в присъствието на мускулен екстракт, за разлика от 14% на нетретираните контроли. В условията без серум, оцеляващият ефект на Съединение Ш-З е максимален при 300 пМ и е малко по-висок (79%) отколкото този, предизвикан от мускулния екстракт. В тази система зависимостта на оцеляващия ефект на Съединение Ш-З от концентрацията е различен от този в периферните неврони, тъй като концентрации на Съединение Ш-З над 300 пМ показват прогресивно намалял ефект (Фиг. 16А). Това може да покаже особена чувствителност на мотоневроните към определена страна на активността на Съединение Ш-З. Морфологично мотоневроните избавени със Съединение Ш-З показват клетъчни тела в ясна фаза и са в състояние да дадат дълги аксони, които изглеждат малко по-дебели от тези, индуцирани от мускулен екстракт (Фиг. 17). След четири дни в културата, 56% от мотоневроните са живи със Съединение Ш-З, в сравнение с 42% с мускулен екстракт. При 300 пМ, третираните със Съединение III неврони оцеляват in vitro за поне една седмица (не е показано).
Съединение III 3 спомага израстването на аксони от интактните ганглии на дорзалния корен
Резултатите от горните опити показват, че Съединение Ш-З не само спомага оцеляването на ембрионните неврони на периферната и централна нервна система, но води също така до силен аксонален растеж. Много от тези израствания се оказват по-дебели от тези извлечени в присъствието на растежни фактори (сравни Фиг. 17 А-D с Фиг. 17 Е-Н).
»ЙЙа
Този ефект е наблюдаван също така при аксоналното израстване, получено от интактни култури на ембрионни дорзални коренчеви ганглии в присъствието на 250 пМ Съединение Ш-З (Фиг. 18С). Аксоните порастват както в отговор на NGF (Фиг. 18В), така и на Съединение Ш-З; тези извлечени чрез NGF са много по-фини и поразклонени от тези, пораснали в присъствието на Съединение Ш-З, които изглеждат дебели и могат да бъдат на снопове.
Пример 36: Третиране in vivo
Еволюционно регулирана смърт на моторния неврон при пилешки ембрион
Настоящият пример е описан подробно в Glicksman, et al., J. Neurobiol., 1998, 35, 361-370, който е включен тук чрез позоваване в неговата цялост. Върху Е6, се прави прозорец в обвивката на пилешките яйца (Spafas, Preston, СТ) и директно върху васкуларизираната хориоалантоидна мембрана един път дневно от Е6 до Е9 се прибавя или пълнител (5% Solutol™ HS 15, полиетилен гликол 660 хидроксистерат; BASF Aktiengesellschaft, Ludwigshafen, Germany (във фосфатно-буферен серум, pH 7.2)) или специфичната доза на Съединение Ш-З в пълнителя, както е описано в Oppenheim, et al., Science, 1991, 251, 1616-1617, което е включено тук чрез позоваване в неговата цялост). Ембрионите са убити на Е10 и техните гръбначни мозъци са отделени, фиксирани в разтвор на Сатоу (10% ледена оцетна киселина, 60% абсолютен етанол, 30% хлороформ), обработени за серийни парафинови срезове и оцветени с тионин. Всеки 20-ти срез на лумбарните сегменти от 1 до 8 се преброява съгласно предварително описани критерии (Clarke, et al., Methods In Cell Biology: Cell Death, 1995, Schwart & Osborne, Eds., Academic Press, New York, pp.277-321, което е включено тук чрез позоваване в неговата цялост).
Еволюционно регулирана смърт на моторния неврон при новородени плъхове
Бременни плъхове Sprague-Dawley с неопределен срок са получени от Harlan Laboratories (Indianapolis, IN). Женските малки плъхчета са ежедневно инжектирани подкожно (SC) над перинеалните мускули, които са мишена, със Съединение Ш-З в 5% Разтвор™ HS 15 или заедно с пълнител, започвайки на първия ден от раждането (Р1) и продължавайки 5 дни (Р5). На Р10 или Р60, малките се декапитират, кръвта се събира в хепаринизирани капилярни епруветки и областта на гръбначния мозък, съдържаща сексуално диморфно спинално ядро на булбус кавернозус (SNB) и перинеалната област, съдържаща булбус кавернозус (ВС) и елеваторните мускули на ануса (LA) се разрязват след перфузия на животните със серум/формалин. Областта на гръбначния мозък, съдържаща SNB се фиксира след това, залива се с Paraplast, разрязва се на ΙΟμπι и се оцветява с Cresylecht виолетово (Nordeen, et al., Science, 1985, 229, 671-673, което е включено тук чрез позоваване в неговата цялост). Моторните неврони се преброяват при Х500 в последователни срезове от 5 лумбална до 1 сакрална област на гръбначния мозък, както е описано по-горе (Nordeen, et al., supra). Микроскопското номериране се прави върху кодирани срезове от наблюдател, който е “сляп” по отношение обработените групи. Броят на моторните неврони се коригира в зависимост от размера на клетката и дебелината на среза (Konisgsmark, Contemporary Research Methods в Neuroanatomy, Nauta & Ebbesson, Eds., 1970, SpringerVerlag, New York, pp.315-340, което е включено тук чрез позоваване в неговата цялост) и статистическият анализ е едностранен анализ на вариацията (ANOVA). Перинеалната мускулатура се фиксира след това, декалцифицира, залива се с Paraplast, разрязва се на срезове от 10 pm и се оцветява с Milligan's Trichrome. Използвайки ярка микроскопия (Х250), ВС и LA мускулите в нормални женски и женски, обработени със Съединение Ш-З (405 животни/група) били положително идентифицирани както по тяхната локализация, така и по наличието на слоести влакна. Очертанието на мускулната тъкан се проследява от изменените срезове, използвайки прожекционен микроскоп (62.5) и напречният срез се измерва, използвайки дигитализирана подложка и компютърна морфометрична система (Sigmascan, Jandel Scientific). Мускулният обем се изчислява чрез обработване на цялата площ на напречния срез и чрез дебелината на среза и се коригира за процента на стуктурната проба.
Събраната кръв се центрофугира в продължение на 5 мин при стайна температура; след това, плазмата се отделя и замръзява при -20°С. Нивата на серумния тестостерон (6-7 животни/група) се измерват чрез радиоимунен анализ, следвайки изложените процедури в Wingfield, et al., Steroids, 1975, 26, 311-327, което е включено тук чрез позоваване в неговата цялост.
Моторна невронна дедиференциация при възрастни плъхове, предизвикана от аксонотомия
Левият подезичен нерв се отделя в областта на врата на възрастен женски Sprague-Dawley плъх (120-180 g), под анестезия с Neumbutol и 50 μΐ от Съединение Ш-З или неговия пълнител (5% Solutol™ HS 15) се прилагат към парче Gelfoam ™ (AJ Buck, Owings Mills, MD), след това се увиват около проксималния край на прерязания нерв. След 7 дни, животните се упойват и перфузират с 4% параформалдехид в буфер на Sorenson, 0.07 М фосфат, pH 7.2. Стволът на мозъка се отстранява и се правят послойни срезове с дебелина 40- pm върху криостат (Chiu, et al., NeuroReport, 1994, 5, 693-696, което е включено тук чрез позоваване в неговата цялост). Всеки пети сзрез продължава за ChAT имунохистохимия, както е описано по-горе (Chiu, et al., J. Comp. Neurol., 1993, 328, 351-363, което е включено тук чрез позоваване в неговата цялост), използвайки 1:350 разреждане на анти-ChAT моноклонално антитяло, получено от Chemicon. Клетките, които се оцветяват ясно над фона се броят в оцветени срезове; броят на номерираните клетки се изразява като отношението на броя на ChAT-имунореактивни клетки на аксонотомираната страна на ядрото на подезичния нерв към броя на имунореактивните клетки на контролната (ненаранена) страна.
Съединение Ш-З избавя ембрионалните моторни неврони на плъхове от клетъчна смърт чрез апоптоза in vitro и инхибира сигналния механизъм, водещ до JNK1 активиране в тези клетки (Maroney, et al., J.Neurosci., 1998, 18, 104-111, което е включено тук чрез позоваване в неговата цялост). За да се определи възможната активност in vivo, Съединение Ш-З се оценява в два модела на еволюционно регулирана програмирана смърт на моторен неврон и модел на дедиференциация, предизвикана от аксонотомия във възрастовите моторни неврони. При пилета, приблизително 50% от гръбначномозъчните моторни неврони преминават PCD по време на Е5-10 (Hamburger, et al., J. Neurosci., 1982, I, 38- 55; Purves, et al., Body u Brain: A Trophic Theory of Neural Connections, 1988, Harvard University Press, Cambridge, МА и двете са включени тук чрез позоваване в неговата цялост). Прилагане на Съединение Ш-З към хориоалантоидната мембрана по време на този период предотвратява смърта на моторния неврон в зависимост от дозата (Фиг. 19). Четирдесет процента от моторните неврони, които нормално биха загинали, се избавят при двете най-високи изпитвани дози (2.3 и 7 pg/zmeBHo), докато 25 % от моторните неврони се избавят при по-ниски дози (1.2 и 1.8 pg/mieBHo) (Фиг. 19).
По време на ранния перинатален живот на женските плъхове (късен ембрионен стадий до 4 постнатален ден (PN), чрез PCD се елиминират повече от 50% от моторните неврони в SNB (Breedlove, J. Neurobiol., 1986, 17, 157-176, което е включено тук чрез позоваване в неговата цялост). При мъжките, моторните неврони в тези ядра инервират набраздената мускулатура на половия член, включващи половите рефлекси. Тестикуларната секреция на надбъбречни стероиди намалява смърта на SNB моторните неврони при мъжките и предотвратява поголямата част от атрофията на ВС и LA мускули, инервирани от невроните. Прилагането на тестостерон на женските малки води до пълен брой мускулни SNB моторни неврони (Nordeen, et al., supra) и предотвратява ВС и LA мускулна атрофия (Waiman, et al., Endocrinology, 1941, 29, 955-978, което е включено тук чрез позоваване в неговата цялост). Ежедневно подкожно прилагане на Съединение Ш-З (PN 1-5) на женски плъхове значително отслабва смъртта на моторните неврони (Фиг. 20А). Избавянето от смърт на SNB моторните неврони чрез Съединение Ш-З възниква при две дози (0.5 и 1 mg/kg дневно). При максимално ефективни дози от 0.5 и 1 mg/kg дневно, прилагането на Съединение Ш-З води до 70% повишаване на оцеляването на моторните неврони, което се равнява на ефекта от тестостерон (Фиг. 20А). Съединение Ш-З не променя плазмените нива на тестостерона на обработваните женски. Радиоимунно измерване на плазмените нива на тестостерон в групата на 1-mg/kg дневно води до незначима разлика, когато се сравнява с контролната група на пълнителя (съответно 0.016 ± 0.008 ng/mL и 0.029 ± 0.015 ng/ML стандартна грешка от средната стойност (S.E.M.)).
За определяне дали обработването със Съединение Ш-З е ефективно при продължителното поддържане оцеляването на моторните неврони, женските се обработват със Съединение Ш-З (0.5 и 1 mg/kg дневно) за същия период от време PN (1-5) (от първи до пети постнатален ден). Половината от животните в групите на пълнителя и двете обработени групи били умъртвени на десетия постнатален ден (PN10). Останалите животни след това се поддържали без допълнително обработване със Съединение Ш-З, докато били умъртвявани на 60 постнатален ден (PN6O). Както е наблюдавано по-рано (Фиг. 20А), обработване със Съединение Ш-З води до 70% повишаване на оцеляването на моторните неврони (Фиг. 20В). Освен това, 100% от тези спасени моторни неврони могат да бъдат идентифицирани морфологично 55 дни след последната обработка със Съединение Ш-З (Фиг. 20В). Забавянето със Съединение
Ш-З на смъртта на моторните неврони по време на неонаталния период, позволява оцеляването на моторните неврони във възрастовия период.
Независимо от ясното демонстриране и опустошаващи ефекти на загуба на моторните неврони при 25 възрастни човека, такива заболявания като латерална амиотрофична склероза, моторните неврони на възрастен при повечето модели на животини на травма на моторния нерв са животоустойчиви. Обаче, аксоналната травма наистина води до морфологични (Oppenheim, et al., supra) , както и биохимични промени (Oppenheim, et al., supra; Rende, et al., J. Comp. Neurol., 1992, 319, 285298, което е включено тук чрез позоваване в неговата цялост; Chiu, et al.,
J. Comp. Neurol., 1993, 328, 351-363, което е включено тук чрез позоваване в неговата цялост) при мотоневрони на възрастен, което може да наподобава дегенеративна промяна, предшестваща смъртта при заболяване в дегенеративните моторни неврони. Един пример на този вид промяна произлиза от аксонотомия на подезичния нерв, който инервира езика. Едностранно прекъсване на този нерв при възрастен плъх води до загуба на 95% от ChAT-имунореактивните подезични моторни неврони в ипсилатералните ядра след 7 дни (Chiu, er al., NeuroReport, 1994, 5, 693-696, което е включено тук чрез позоваване в неговата цялост). Загубата на ChAT имунореактивност не е постоянна. Четири седмици след аксонотомията, 100% от моторните неврони възстановяват контролните нива на ChAT имунореактивност (Borke, et al., .J. Neurocytol., 1993, 22, 141-153, което е включено тук чрез позоваване в неговата цялост). ChAT имунореактивността в контралатералните подезични моторни неврони не е повлияна (Chiu, et al., supra) (Фиг. 21 и Таблица 5).
Когато се прилага в Gelfoam™ към проксималния край на подезичния нерв, Съединение Ш-З отслабва в зависимост от дозата намаляването на ChAT имунореактивността в ипсилатералните подезични моторни неврони, оценено 7 дни след аксонотомията.
Максималната ефективна доза (50 μg) води до 40% повече ChATимуноре актив ни мотоневрони в сравнение с аксонотомираните необработвани контроли (Фиг. 21В и Таблица 5). Съществува несъразмерна зависимост от дозата както с по-ниски, така и с по-високи дози, водеща до по-голямо оцеляване отколкото в необработената контролан група, но по-малко отколкото това, получено при 50 pg. Както при модела SNB, тук няма свързана с това загуба на тегло, смъртност или разрушаване на голяма тъкан при тези животни при някоя от изпитваните дози.
При три отделни модела in vivo на дегенерация на моторния неврон, Съединение Ш-З показва невропротективно действие: еволюционно регулирана PCD на лумбарния отдел на моторните неврони при ембриони (Фиг. 19), андроген-чувствителна смърт на постнатални SNB моторни неврони (Фиг. 20) и предизвикана от аксонотомия загуба на функционален маркер, ChAT, в подезични моторни неврони на възрастен (Фиг. 21 и Таблица 5). Съединение Ш-З е ефикасно, когато се прилага периферно чрез подкожна инжекция, приложена локално към отрязания край на нерва или директно над пилешката ембрионална хориоалантоидна мембрана. Обратно на изходната молекула К-252а, Съединение Ш-З е приблизително пет пъти по-мощно при посредниченето на оцеляването на култури, обогатени с моторни неврони (данните не са показани) и не показва инхибиторно действие срещу trkA тирозин киназата и няколко серин треонин кинази (Maroney et al., supra, Kaneko, et al., J. Med Chem., 1997, 40, 1863-1869, което e включено тук чрез позоваване в неговата цялост).
Таблица 5
Ефект на съединение Ш-З върху холинацетилтрансферазната имунореактивност в аксонотомирани хипоглосални моторни неврони
ChAT-noложителни моторни неврони | ||||
Лечение | η | Експериментални/ Контролни | % | Средно/Група |
пълнител | 2 | 20/544 | 3.68 | 4.01 |
19/437 | 4.35 | |||
3.6 μg Ш-З | 2 | 55/420 | 13.10 | 12.84* |
72/572 | 12.59 | |||
25 pg Ш-З | 2 | 95/597 | 15.91 | 19.01* |
142/642 | 22.12 | |||
50 pg Ш-З | 2 | 188/484 | 38.84 | 41.34* |
278/637 | 43.85 | |||
100 pg Ш-З | 4 | 465/920 | 50.54 | 32.61* |
235/784 | 29.98 | |||
178/770 | 23.12 | |||
182/679 | 26.80 | |||
200 pg Ш-З | 2 | 99/461 | 21.48 | 24.96* |
159/559 | 28.44 | |||
Симулирано въздействие | 2 | 350/335 | 104.48 | 101.24 |
292/298 | 98.00 |
Към проксималния край на подезичния нерв незабавно след неговото срязване се прибавя в гел пяна Съединение Ш-З или пълнител. Животните се умъртвяват след 7 дни и се правят последователни срезове през подезичните ядра и всеки пети срез се оцветява с имунни антиChAT антитела. Изброяват се ChAT-положителните неврони в
100 ипсилатералната (експерименталната) и контралатералната (контролната) страна на ядрата *р<0.05, статистически значимо в сравнение с контролната група на животните, обработени с пълнител .
Инхибитор на MLK-З пътя показва ефикасност in vivo и блокира фосфорилирането в по-долните MLK-З в МРТР модела
МРТР се прилага в доза (40 mg/kg), която дава загуба на стриаталните допаминергични окончания и клетъчни тела в субстанция нигра. Като маркер за допаминергичните нервни окончания в субстанция нигра се използва тирозин хидроксилаза. Системно прилагане на Съединение Ш-З намалява загубата на тирозин хидроксилазните имунореактивни неврони на субстанция нигра след лезия на МРТР (Фиг. 22а; Saporito et al., 1999). Тъй като Съединение Ш-З е известен инхибитор на MLK3, активирането на по-долен субстрат на MLK3 се измерва в обработена с МРТР мишка. Нивата на фосфорилираната МКК4 се измерват, използвайки фосфо-МКК4 специфично антитяло (New England Biolabs, Beverly, МА), което разпознава монофосфорилираната форма на МКК4 било чрез имунно оцветяване (Фиг. 22Ь), или чрез ELISA (Фиг. 22с). Прилагането на МРТР повишава нивата на фосфорилирана МКК4 в субстанция нигра до 5 пъти над контролните нива (Фиг. 22Ь). Върхови покачвания се появяват 4 часа след прилагането на МРТР и съвпадат с върховите нива на CNS на МРР . МРТР-медиираното фосфорилиране на МКК4 отслабва чрез предварително обработване с 1-депренил, показващо, че тези явления на фосфорилиране се повлияват от МРР+ (Фиг. 22с). Нещо повече, фосфорилирането на МКК4 частично се инхибира от предварително обработване със Съединение Ш-З при доза (1 mg/kg), която дава протекция срещу индуцирана от МРТР допаминергична загуба (Фиг. 22с). Тези данни показват, че МРТР (МРР+) активира МКК4, по-долен субстрат на MLK3. Нещо повече, тези данни показват, че известен
101 инхибитор на MLK3, инхибира активирането на този път на киназата in vivo.
Пример 37: Възпаление
Индуцирането на IL-1 и TNF-a от LPS в ТНР-1 клетки и ефектът на индолокарбазолите и пиролокарбазолите върху тяхното индуциране
Клетките на имунната система са избрани, тъй като много кинази са въвлечени в регулирането на многобройните имунологични функции, напр., индуцирането на синтеза на цитокини и индуцирането на биологичния отговор на цитокини. Едно съобщение (Hambleton, et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1996, 93, 2774-2778, което е включено тук чрез позоваване в неговата цялост) показва, че обработването на моноцито клетъчните производни линии с LPS причиняват бързо активиране на JNK активността. Когато моноцитите встъпят в контакт с бактериални ендотоксини, такива като липополизахарид (LPS), те произвеждат възпалителни цитокини IL и TNF-α. Инхибиране произвеждането на тези два вида цитокини може да е полезно лечение на определени възпалителни заболявания на имунната система. Тези цитокини могат да бъдат лесно измерени чрез търговските ELISA китове. Ние създаваме експерименти за определяне (1) дали индоло- и кондензираните пиролокарбазоли могат да инхибират синтеза на IL-1 и TNF-a в нашата моноцитно клетъчна линия ТНР-1, (2) дали JNK се активира от LPS в ТНР-1 клетки и (3) дали активирането на JNK от LPS може да бъде инхибирано от индоло- и кондензирани пиролокарбазоли.
Експериментални процедури
ТНР-1 клетки се отглеждат в RPMI 1640 среда, допълнена с 10% говежди серум от зародиш. LPS (E.coli серотип 0111.84, ТСА извлечена) се доставя от Sigma и се разтваря в PBS. ELISA китовете за анализ на IL1 и TNF-a се доставят от Boerhinger-Mannheim и анализите се извършват върху ТНР-1 среда на културата, както е указано от производителя. При всеки анализ са получени стандартни криви съгласно насоките.
102
Експериментите се извършват в 12 гнездил плочки на културата с 1 или с 2 ml от ТНР-1 клетки при 4 X 103 клетки/ml. IL-1 и TNF-a се индуцират чрез прибавяне на LPS към средата на културата и средата се събира по различно време след това за анализ на цитокини. Клетките се премахват чрез центрофугиране и супернантите се замръзяват при -70°С до анализа. За намаляване на стойността на експериментите, те се извършват в удвоени култури и удвоените супернанти се екстрахират след центрофугиране. Всеки извлечен супернант се оценява двойно. Основните разтвори на индоло- и кондензираните пиролокарбазоли в 100% DMSO се разреждат до желаните концентрации или в среда, съдържаща 10% говежди серум на зародиш или в среда, съдържаща 0.5 mg/ml BSA. Освен ако не е изрично споменато, съединенията се прибавят към ТНР-1 клетките 1 час преди прибавянето на LPS.
Анализите на JNK активността се извършват след имунопреципитация на JNK белтъка от екстракт на лизирани ТНР-1 клетки. Утаените ТНР-1 клетки се лизират на лед в продължение на 15 минути в 540 μΐ Frac буфер (10 mM Tris-Hcl, pH 7.5, 50 тМ NaCI, 30 μΜ натриев пирофосфат, 1 mg/ml BSA, 1% Triton-X-100). Екстрактът се центрофугира в продължение на 10 минути при 14К и 5 μΐ JNK антитяло (Santa Cruz) се прибавя към супернанта. Екстрактът се върти в продължение на 60 минути при 4°С, прибавят се 75 μΐ от измития белтък A Sepharose (20% w/v във Frac) и екстрактът се върти още 30 мин, за да свърже комплекса на антитялото към белтъка A Sepharose. Белтъкът А Sepharose се измива два пъти с Frac буфер, един път с 20 mM Hepes, pH 7.6, 20 mM MgCl2, 2 тМ DTT, след това се инкубира в продължение на 15 мин при 30°С в 30 μΐ киназен буфер (20 mM hepes, 20 тМ MgCl2, 2 ММ DTT, 1 μβ смесен с jun и 2 μΜ ΑΤΡ-γ-32Ρ, 2 μθ. Реакцията се прекъсва чрез прибавянето на 10 μΐ 4Х SDS гел напълващ буфер, затопля се в продължение на 3 мин при 80°С и белтъците се анализират върху
103
10% SDS гел. Гелът се изсушава, излага се на Phosphorimager плочка и радиоактивните области се анализират на Phosphorimager.
Резултатите от началните експерименти показват, че LPS при 2 pg/ml дава максимално получаване на IL-1 и тази концентрация на LPS се използва във всички последващи експерименти. Минималното време след прибавянето на LPS за максимално получаване на цитокини се определя чрез вземане на аликвотни части от средата за анализ по различно време след прибавянето на LPS. Първият експеримент показа, че и двете IL-1 и TNF-a отслабват максималното получаване най-малко 5 часа след прибавянето на LPS. Тъй като най-ранното време на събиране в първия експеримент е 2.4 часа, вторият ексепримент се извършва в събрани среди, започвайки 15 мин след събирането на LPS. Резултатите от този експеримент, където се анализира само TNF-a, показват, че той отслабва максималното получаване 3 часа след прибавянето на LPS. В средата не е установен значителен TNF-α до 90 мин след прибавянето на LPS.
Бързото достигане на максимален добив показва много тясно регулиране на синтеза на 2 цитокина - бърз синтез и бързо обратно регулиране. Културите на клетките се обработват в продължение на 30 мин преди прибавянето на LPS или с Actinomycin D, RNA синтезен инхибитор или циклохексимид, инхибитор на белтъчния синтез. Средата се събира 3 часа след прибавянето на LPS и се анализира TNF-a. И новата RNA, и новият белтъчен синтез са необходими за индуцирането на TNF-a, къй като в средата на клетките обработени с един от инхибиторите, не се открива TNF-a. Следващите експерименти се извършват за определяне дали Съединение Ш-З би инхибирало индуцирането на IL-I и TNF-a. Съединение Ш-З инхибира индуцирането и на IL-1, и на TNF-a с IC50 стойности, съответно, 267 пМ и 139 пМ. Резултатите от тези експерименти са получени с клетки в среда, съдържаща 10% говежди серум от ембрион. Тъй като анализите на тъканта на гръбначния мозък и тъканта на базалния преден мозък за
104
невротропна активност на съединенията се извършват в среда без серум (500 gg/ml BSA), определянето на IC50 стойности за инхибирането на IL1 и TNF-a среда без серум представлява интерес. Когато ТНР-1 клетки се обработят със Съединение Ш-З в среда без серум (500 gg/ml BSA) IC50 се намалява 10 пъти от 269 пМ до 23 пМ. Освен ако не е указано друго, всички експерименти извършени след това се извършват в среда без серум. Инхибирането от Съединение Ш-З на индукцията на IL-1 и TNF-a в ТНР-1 клетки предполага, че Съединение Ш-З може да бъде използвано като терапевтично при лекуването на патологични състояния, причинени от произвеждането на тези цитокини в количества по-големи от нормалните. Септичният шок е такова състояние. Септичният шок е причинен от нарастването на грам отрицателни бактерии в кръвообращението, което от своя страна води до освобождаването на големи количества ендотоксин, LPS. След това LPS стимулира първоначално моноцити и макрофаги за произвеждането на големи количества IL-1 и TNF-a, което причинява след това масивно тъканно разрушаване и в много случаи смърт.
Няколко съединения са изпробвани по отношение тяхната способност да инхибират TNF-а и се сравняват със способността да инхибират JNK. Резултатите са показани в Таблица 6.
Таблица 6
ТНР-1 Клетки | Свръхекспресивност на MLK3 в Cos 7 клетки | ||
Съединение | TNF-a IC50 пМ | JNK % инх. 500 пМ | JNK % инх. 500 пМ |
III-1 | 49.5 | 93.5 | 83.8 |
Ш-З | 29 | 93 | 94 |
1-2 | >5000 | 78.5 | 85 |
1-3 | 366 | 80.5 | 93.7 |
105
1-4 | 75.5 | 79.5 | 95 |
1-5 | 514 | 89 | 97.2 |
1-6 | 817.5 | 77.5 | 57.8 |
1-7 | 1009 | 74 | 85.5 |
Ш-4 | 462.5 | 81 | 66 |
Ш-5 | 4 | 84.5 | 96 |
Ш-7 | 590.5 | 11.5 | 54 |
Ш-8 | 11.5 | 51 | 94 |
III-10 | 4298 | 48 | 78 |
1-10 | 4500 | 62 | 94 |
III-11 | 686 | 51 | 92.5 |
Ефект на Съединение III-З върху индукцията на IL-2 в Jurkat клетки Експерименти са извършени за определяне дали Съединение Ш-З инхибира индукцията на IL-2 в Jurkat клетки.
Експериментални процедури
Jurkat клетки се отглеждат в RPMI 1640 среда, допълнена с 10%
говежди серум от зародиш. TNF-α е от Promega и анти CD3 и анти CD28 антителата са от Pharmigen. Jurkat експериментите се правят в 200 μΐ в 96 гнездна плочка. IL-2 се измерва с ELISA кит, доставен от Boehringer Mannheim. Антителата към CD3 и CD28 се оставят да се свържат с пластичната маса на 96 гнездната плочка (18 часа в PBS) преди прибавяне на Jurkat клетките. Клетките се обработват със съединение 1 час преди прибавяне към плочката, покрита с антитяло. Антителата към CD3 и CD28 са използвани, за да активират Т клетъчния рецептор и да индуцират IL-2. IL-2 се освобождава от Jurkat клетките между 6 и 24 часа след началото на индукцията (Фиг. 23А). След това се оценява ефекта на Съединение Ш-З (обработване със Съединение III- 3 1 час преди индукцията) върху индукцията на Ш-2(Фиг.23В). Концентрацията на Съединение Ш-З 500 пМ инхибира индукцията на IL-2 с повече от 80%
106 (Фиг.23В). Извършва се по-обширен експеримент на зависим от дозата отговор със Съединение Ш-З и със Съединение 1-4, който даде 1С50 стойности за Съединение Ш-З 139пМ и за Съединение 1-4 207пМ (Фиг. 23С).
Претендира се, че всеки пациент, приложение и напечатана публикация, споменати в този патент, са включени тук чрез позоваване в тяхната цялост.
Специалистите в областта ще оценят, че могат да бъдат направени многобройните промени и модификации към предпочитаните аспекти на изобретението без отдалечаване от същността на изобретението. Претендира се, че всички такива варианти попадат в обхвата на настоящето изобретение.
Claims (4)
1. Метод за идентификация на съединение, което модулира активност на сложна линия киназни белтъци и спомага за клетъчното оцеляване, характеризиращ се с това, че се състои от етапите на:
а) контактуване на дадена клетка, съдържаща сложна линия киназен белтък, с дадено съединение;
б) определяне дали дадено съединение намалява активността на сложна линия киназен белтък;
в) определяне дали дадено съединение спомага клетъчното оцеляване.
2. Метод от патентна претенция 1, характеризиращ се с това, че даден белтък е избран от групата, съдържаща сложна линия киназа 1, сложна линия киназа 2, сложна линия киназа 3, левцин зигзагообразна киназа, двойна левцин зигзагообразна киназа и сложна линия киназа 6.
3. Метод от патентна претенция 2, характеризиращ се с това, че дадена клетка контактува in vitro.
4. Метод от патентна претенция 2, характеризиращ се с това, че дадена клетка контактува in vivo.
5. Метод от патентна претенция 2, характеризиращ се с това, че активността на даден белтък се определя чрез измерване активността или етапа на фосфорилиране на субстрат на даден белтък.
6. Метод от патентна претенция 5, характеризиращ се с това, че даден субстрат е избран от групата, съдържаща JNK1, JNK2, JNK3, ERK1, ERK2, ρ38α, ρ38β, ρ38γ, ρ38δ, МЕК1, MEK2, МККЗ, MKK4 (SEK1), MEK5, MKK6, MKK7, jun, ATF2, ELK1 и хомолога на бозайник АЕХ-3.
7. Метод от патентна претенция 2, характеризиращ се с това, че активността на даден белтък се определя чрез измерване активността на субстрат на даден белтък, количеството на субстрат на даден белтък, или mRNA кодираща даден субстрат на даден белтък.
8. Метод от патентна претенция 2, характеризиращ се с това, че активността на даден белтък може да бъде определена чрез in vitro киназен тест или свързващ тест.
9. Метод от патентна претенция 2, характеризиращ се с това, че дадено спомагане на клетъчното оцеляване се определя чрез използване на клетки, за които съществува риск да умрат и сравняване на количеството живи клетки, които са били в контакт с дадено съединение, с количеството живи клетки, които не са били в контакт с дадено съединение.
Ю.Метод от патентна претенция 9, характеризиращ се с това, че дадени клетки са първични ембрионни клетки от мотоневрони.
11. Метод от патентна претенция 9, характеризиращ се с това, че дадени клетки са свръхекспресивни по отношение на даден белтък от сложна киназна линия.
12. Метод от патентна претенция 2, характеризиращ се с това, че дадено подпомагане на клетъчното оцеляване се определя чрез наблюдаване намаляването на апоптозата.
13. Метод от патентна претенция 2, характеризиращ се с това, че дадена клетка е невронна клетка.
14. Метод от патентна претенция 2, характеризиращ се с това, че дадена клетка е въвлечена в невродегенеративно заболяване.
15. Метод за идентификация на съединение, което модулира активност на сложна линия киназни белтъци и спомага за клетъчното оцеляване, характеризиращ се с това, че се състои от етапи на:
а) контактуване на дадена клетка, съдържаща сложна линия киназен белтък с дадено съединение;
б) определяне дали дадено съединение увеличава активността на дадена сложна линия киназен белтък; и
в) определяйки дали дадено съединение спомага клетъчната смърт.
16. Метод от патентна претенция 15, характеризиращ се с това, че даден белтък е избран от групата, съдържаща сложна линия киназа 1, мм сложна линия киназа 2, сложна линия киназа 3, левцин зигзагообразна киназа, двойна левцин зигзагообразна киназа и сложна линия киназа 6.
17. Метод от патентна претенция 16, характеризиращ се с това, че дадена клетка контактува in vitro.
18. Метод от патентна претенция 16, характеризиращ се с това, че дадена клетка контактува in vivo.
19. Метод от патентна претенция 16, характеризиращ се с това, че активността на даден белтък се определя чрез измерване активността на субстрат на даден белтък.
20. Метод от патентна претенция 19, характеризиращ се с това, че даден субстрат е избран от групата, съдържаща JNK1, JNK2, JNK3, ERK1, ERK2, ρ38α, ρ38β, ρ38γ, ρ38δ, МЕК1, MEK2, МККЗ, MKK4 (SEK1), MEK5, MKK6, MKK7, jun, ATF2, ELK1 и хомолога на бозайник АЕХ-3.
21. Метод от патентна претенция 16, характеризиращ се с това, че активността на даден белтък се определя чрез измерване активността на субстрат на даден белтък, количеството на даден белтък, или mRNA кодираща даден белтък.
22. Метод от патентна претенция 16, характеризиращ се с това, че активността на даден белтък може да бъде определена чрез in vitro киназен тест или свързващ тест.
23. Метод от патентна претенция 16, характеризиращ се с това, че дадено спомагане на клетъчното оцеляване се определя чрез използване на клетки, за които съществува риск да умрат и сравняване на количеството живи клетки, които са били в контакт с дадено съединение с количеството живи клетки, които не са били в контакт с дадено съединение.
24. Метод от патентна претенция 23, характеризиращ се с това, че дадени клетки са първични ембрионни клетки от мотоневрони.
25. Метод от патентна претенция 23, характеризиращ се с това, че дадени клетки са свръхекспресивни по отношение на даден белтък от сложна киназна линия.
26. Метод от патентна претенция 16, характеризиращ се с това, че дадено спомагане на клетъчното оцеляване се определя чрез наблюдаване увеличаването на апоптозата.
27. Метод от патентна претенция 16, характеризиращ се с това, че дадена клетка е невронна клетка.
28. Метод от патентна претенция 16, характеризиращ се с това, че дадена клетка е въвлечена в невродегенеративно заболяване.
29, Метод за модулиране активността на сложна линия киназен белтък, състоящ се от контактуване на даден белтък или клетка, съдържаща даден белтък, със съединение с формула:
характеризираща се с това, че:
пръстен В и пръстен F, независимо и всеки заедно с въглеродните атоми, към които те са прикрепени, са избрани от групата, състояща се от:
а) ненаситен 6-членен карбоцикличен ароматен пръстен, където от 1 до 3 въглеродни атома могат да бъдат заменени от азотни атоми;
б) ненаситен 5-членен карбоцикличен ароматен пръстен; и
в) ненаситен 5-членен карбоцикличен ароматен пръстен, където или
1) един въглероден атом е заменен с кислороден, азотен или серен атом;
2) два въглеродни атома са заменени със серен и азотен атом, кислороден и азотен атом или два азотни атома; и
3) три въглеродни атома са заменени с три азотни атома;
R1 е избран от групата, съдържаща:
a) Н, заместен или незаместен алкил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома, заместен или незаместен арил, заместен или незаместен арилалкил, заместен или незаместен хетероарил или заместен или незаместен хетероарилалкил;
ф 6)-C(=O)R9, където R9 е избран от групата, съдържаща алкил, арил и хетероарил;
b) -CR10, където R10 е избран от групата, съдържаща Н и алкил, имащ от 1 до 4 въглерода;
r)-C(=O)NH2, -NRnR12, -(CH2)pNRnR12, -(CH2)POR10, O(CH2)POR10 и -O(CH2)pNRnR12, където p е от 1 до 4; и където или
1) Rn и R12 са всеки независимо избран от групата, съдържаща Н и алкил, имащ от 1 до 4 въглерода; или
2) Rn и R12 заедно образуват свързваща група с формула -(СН^-Х^СНгЬ-, където X1 е избран от групата, съдържаща - • 0-,-S-и-СН2.;
R2 е избран от групата, съдържаща Н, алкил, имащ от 1 до 4 въглерода, -ОН, алкокси, имащ от 1 до 4 въглерода, -OC(=O)R9, OC(=O)NRnR12, -O(CH2)PNR11R12, -O(CH2)pOR10, заместен или незаместен арилалкил, имащ от 6 до 10 въглерода и заместен или незаместен хетероарилалкил;
R3, R4, R5 и R6 са всеки независимо избран от групата, съдържаща: а)Н, арил, хетероарил, F, Cl, Br, I, -CN, CF3, -ΝΟ2-, -OH, OR9, -O(CH2)pNRnR12, -OC(=O)R9, -OC(=O)NR2R7, -OC(=O)NRnR12, O(CH2)pOR10, -CH2OR10, -NRnR12, -NR10S(=O)2R9, -NR10C(=O)R9;
6)-CH2OR14, където R14 е остатък на аминокиселина след като хидроксилната група на карбоксилната група е премахната;
b)-NR10C(=O)NR11R12, -CO2R2, -C(=O)R2, -C(=O)NRnR12, CH=NOR2, -CH=NR9, -(CH2)pNR11R12, -(CH2)PNHR14 или -CH=NNR2R2A,
2 a 2 където R е същия, както R ;
r) -S(O)YR2-(CH2)PS(O)YR9, -CH2S(O)7R14, където у e 0, 1 или
2;
д)алкил, имащ от 1 до 8 въглерода, алкенил, имащ от 2 до 8 въглерода и алкинил, имащ от 2 до 8 въглерода, където
1) всяка алкидна, алкенилна или алкинилна група е незаместена; или
2) всяка алкидна, алкенилна или алкинилна група е заместена с от 1 до 3 групи, избрани от групата, съдържаща арил, имащ от 6 до 10 въглерода, хетероарил, арилалкокси, хетероциклоалкокси, хидроксиалкокси, алкилокси-алкокси, хидроксиалкилтио, алкоксиалкилтио, F, Cl, Br, I, -CN, -NO2, -OH, -OR9, -X2(CH2)pNRnR12, X2(CH2)pC(=O)NR11R12, -X2(CH2)pOC(=O)NRnR12, -X2(CH2)PCO2R9, X2CH2S(O)YR9, -X2(CH2)pNR10C(=O)NR11R12, -OC(=O)R9, -OCONHR2,
-О-теграхидропиранил, -NRnR12, -NR10C(=O)R9,
NR10CO2R9, -NR10C(=O)NRnR12, -NHC(=NH)NH2, NR10S(O)2R9, -S(O)YR9,
-CO2R9,-C(=O)NRnR12, -C(=O)R2, -CH2OR10, -CH=NNR2R2A, -CH=NOR2, -CH=NR9, -CH=NNHCH(N==NH)NH2, -S(=O)2NR2R2A, P(=O)(OR10)2, -OR14 и монозахарид, имащ от 5 до 7 въглерода, където всяка хидроксилна група на монозахарида е независимо или незаместена или 3 заменена от Н, алкил, имащ от 1 до 4 въглерода, алкилкарбонилокси, имащ от 2 до 5 въглерода, или алкокси, имащ от 1 до 4 въглерода;
X2 е 0, S или NR10;
R и R са всеки независимо избран от групата, съдържаща Н, алкил, имащ от 1 до 4 въглерода, алкокси, имащ от 1 до 4 въглерода, заместен
МШШМ1 ан или незаместен арилалкил, имащ от 6 до 10 въглерода, заместен или незаместен хетероарилалкил, -(CH2)POR1(), -(CH2)POC(=O)NR11R12 и (CH2)pNRhR12, или R7 и R8 заедно образуват свързваща група с формула СН2-Х3-СН2-, където X3 е X2 или връзка;
m и η са независимо 0, 1 или 2;
Υ е избран от групата, съдържаща -0-, -S-, -N(R10)-, -N+(O')(R10)-, N(OR10)-и-СН2-;
Z е избран от групата, съдържаща връзка, -0-, -СН=СН-, -S-, С(=О)-, -CH(OR10), -N(R10)-, -N(OR10)-, -CH(NRnR12)-, -C(=O)N(R17)-, N(R17)C(=O)-, -N(S(O)yR9)-, -N(S(O)yNR!1R12)-, -N(C(=O)R17)-, -C(R15R16)-, -N+(O')(R10)-, -CH(OH)-CH(OH)- и CH(O(C=O)R9)CH(OC(=O)R9A)-5 където R9a е същия, както R9;
R15 и R16 са независимо избрани от групата, съдържаща Н, -ОН, C(=O)R10, -O(C=O)R9, хидроксиалкил и -CO2R10;
R17 е избран от групата, съдържаща Н, алкил, арил и хетероарил;
А1 и А2 са независимо избрани от групата, съдържаща Η, Η; Н, OR2; Н, -SR2; Н, N(R2)2; и група, където А1 и А2 взети заедно образуват единица, избрана от групата, съдържаща =0, =S и =NR ;
В1 и В2 са избрани от групата, съдържаща Η, Η; Н, -OR2; Н, SR2, Н, N(R2)2; и група, където В1 и В2 заедно образуват единица, избрана от групата, съдържаща =0, =S и =NR ;
12 12 при условие, че поне една от двойките А и А , или В и В , образуват =0.
ЗО.Методи за модулиране активността на сложна линия киназен белтък, състоящи се от контактуване на даден белтък или клетка, съдържаща даден белтък, със съединение с формула:
inHnwac характеризираща се с това, че:
Zi е Н и Z2 е Н или Zi и Z2 заедно образуват =0;
Ri е избран от групата, състояща се от Н, Cl, CH2SO2C2H5, Br, CH2S(CH2)2NH2, CH2S(CH2)2N(CH3)2, CH2S(CH2)2NH2, П-С4Н9, nhconhc6h5, nhconhc2h5, CH2SC2H5, CH2SC6H5, N(CH3)2, ch3, CH2OCONHC2H5, NHCO2CH3, CH2OC2H5, CH2N(CH3)2, OH, О-п-пропил CH=NNH-C(=NH)NH2, CH=N-N(CH3)2, CH2S(CH2)2NH-n-C4H9, CH2OCH2OCH2CH3, СН28[3-(1,2,4-триазин)], CH2CH2SCH3;
CH=N— / \4CH3
R2 е избран от групата, състояща се от Н, Br, Cl, I, CH2S(CH2)2N(CH3)2, NHCONHC2H5, CH2SC2H5, СН2ОСН2ОСН2СН3, СН28[3-(1,2,4-триазин)], CH2CH2SCH3 и СН2ОН;
X е избран от групата, състояща се от Н, СН2ОН, СН21ЧН-СеринН, СО2СН3, CONHC6H5, ch2nhco2c6h5, CH2NHCO2CH3, ch2n3, CONHC2H5, СН2ХГН-Глицин, CON(CH3)2, -CH2NHCO2-, CONH2, CONHC3H7, CH2NH-CepnH, CH2SOCH3, CH=NOH, СН2ХН-Г1ролин, СН2СН2(2-Пиридил), CH=NNHC(=NH)NH2, CONH(CH2)2OH, CH=NNHCONH2, CH2OCOCH3, -CH2OC(CH3)2O-, ch2sc6h5, CH2SOC6H5, СО2п-хексил, CONHCH3 и CO2(CH2)4CH3; и
R е избран от групата, състояща се от ОН и ОСН3.
31. Метод от патентна претенция 30, характеризиращ се с това, че Z] и Z2 са Η, X е СО2СН3, Ri е NHCONHC2H5, R2 е СН2СН2(2-Пиридил) и R еОН.
32. Метод от патентна претенция 30, характеризиращ се с това, че Ζι и Ζ2 са Η, X е СО2СН3, Ri и R2 са СН2ОСН2ОСН2СН3 и R е ОН.
33. Метод от патентна претенция 30, характеризиращ се с това, че Z, и Z2 са Η, X е СО2СН3, Ri и R2 са CH2SCH2CH3 и R е ОН.
34. Метод от патентна претенция 30, характеризиращ се с това, че Zb Z2, Ri и R2 са Η, X е СО2СН3; и R е ОН.
35. Метод от патентна претенция 30, характеризиращ се с това, че Zb Z2, Ri и R2 са Η, X е СО2(СН2)4СН3 и R е ОН.
36. Метод от патентна претенция 30, характеризиращ се с това, че Ζι, Ζ2 и Ri, са Н, R2 е СН2ОН, X е СО2СН3 и R е ОН.
37. Метод от патентна претенция 30, характеризиращ се с това, че Ζι и Z2 саН, Ri и R2 са H2S(3-( 1,2,4-триазин)), X е СО2СН3 и R е ОН.
38. Метод от патентна претенция 30, характеризиращ се с това, че Zj и Z2 са Н, Ri е Br, R2 е I, X е СО2СН3; и R е ОН.
39. Метод от патентна претенция 30, характеризиращ се с това, че Zj и Z2 са Н, Ri и R2 са CH2CH2SCH3, X е СО2СН3 и R е ОН.
40. Метод от патентна претенция 30, характеризиращ се с това, че Zb Z2, Rj и R2 са Η, X е СО2СН3 и R е ОСН3.
41. Метод от патентна претенция 30, характеризиращ се с това, че Ζι и Z2 заедно образуват =0, Rj и R2 са Br, X е СО2СН3 и R е ОН.
42. Методи за модулиране активността на сложна линия киназен белтък, състоящ се от контактуване на даден белтък или клетка, съдържаща даден белтък, със съединение с формула:
А» А* характеризираща се с това, че:
Zi е Н и Z2 е Н или Ζι и Ζ2 заедно образуват =О;
Ri е Н или Вг;
R2 е Н;
R3 е Н, СН2СН=СН2, СН2СН2СН2ОН или СН2СН2СН2 — __О
R4 е Н, СН2СН=СН2 или СН2СН2СН2ОН.
43. Метод от патентна претенция 42, характеризиращ се с това, че Ri, R2, R4, Ζι и Z2 са Н и R3 е СН2СН=СН2.
44. Метод от патентна претенция 42, характеризиращ се с това, че Rj е Вг и R2, R3 R4, Ζι и Ζ2 са Η.
45. Метод от патентна претенция 42, характеризиращ се с това, че Ri, R2, Ζι и Z2 са Н и R3 и R4 са СН2СН=СН2.
46. Метод от патентна претенция 42, характеризиращ се с това, че Ri, R2, R3, Ζι и Z2 са Н и R4 е СН2СН=СН2.
47. Метод от патентна претенция 42, характеризиращ се с това, че Ri, R2, Ζι и Z2 са Н и R3 и R, са СН2СН2СН2ОН; или Rb R2, R4, Ζι и Ζ2 са /—\
Н и R3 е СН2СН2СН2—__О
48. Метод за идентифициране на съединение, което може да бъде използвано при лечение на невродегенеративно нарушение, включващ контактуване на клетка или клетъчен екстракт, съдържащ сложна линия киназен белтък със съединението и определяне дали съединението намалява активността на сложна линия киназен белтък.
49. Метод от патентна претенция 48, характеризиращ се с това, че даден белтък е избран от групата, съдържаща сложна линия киназа 1, сложна линия киназа 2, сложна линия киназа 3, левцин зигзагообразна киназа, двойна левцин зигзагообразна киназа и сложна линия киназа 6.
50. Метод от патентна претенция 49, характеризиращ се с това, че дадена клетка контактува in vitro.
51. Метод от патентна претенция 49, характеризиращ се с това, че дадена клетка контактува in vivo.
52. Метод от патентна претенция 49, характеризиращ се с това, че активността на даден белтък се определя чрез измерване активността или етапа на фосфорилиране на субстрат на даден белтък.
53. Метод от патентна претенция 52, характеризиращ се с това, че даден субстрат е избран от групата, съдържаща JNK1, JNK2, JNK3, ERK1, ERK2, ρ38α, ρ38β, ρ38γ, ρ38δ, МЕК1, MEK2, МККЗ, MKK4 (SEK1), MEK5, MKK6, MKK7, jun, ATF2, ELK1 и хомолога на бозайник АЕХ-3.
54. Метод от патентна претенция 49, характеризиращ се с това, че активността на даден белтък се определя чрез измерване активността на субстрат на даден белтък, количеството на субстрат на даден белтък, или mRNA кодираща даден субстрат на даден белтък.
55. Метод от патентна претенция 49, характеризиращ се с това, че активността на даден белтък може да бъде определена чрез in vitro киназен тест или свързващ тест.
56. Метод от патентна претенция 49, характеризиращ се с това, че дадени клетки са първични ембрионни клетки от мотоневрони.
57. Метод от патентна претенция 49, характеризиращ се с това, че дадени клетки са свръхекспресивни по отношение на даден белтък от сложна киназна линия.
58. Метод от патентна претенция 49, характеризиращ се с това, че дадена клетка е невронна клетка.
59. Метод от патентна претенция 49, характеризиращ се с това, че дадена клетка е въвлечена в невродегенеративно заболяване.
60. Метод за идентифициране на съединение, които може да бъде използвано при лечение на възпаление, включващ контактуване на клетка или клетъчен екстракт, съдържащ сложна линия киназен белтък със съединението и определяне дали съединението намалява активността на сложна линия киназен белтък.
61. Метод от патентна претенция 60, характеризиращ се с това, че даден белтък е избран от групата, съдържаща сложна линия киназа 1, сложна линия киназа 2, сложна линия киназа 3, левцин зигзагообразна киназа, двойна левцин зигзагообразна киназа и сложна линия киназа 6.
62. Метод от патентна претенция 61, характеризиращ се с това, че дадена клетка контактува in vitro.
63. Метод от патентна претенция 61, характеризиращ се с това, че дадена клетка контактува in vivo.
64. Метод от патентна претенция 61, характеризиращ се с това, че активността на даден белтък се определя чрез измерване активността или етапа на фосфорилиране на субстрат на даден белтък.
65. Метод от патентна претенция 64, характеризиращ се с това, че даден субстрат е избран от групата, съдържаща JNK1, JNK2, JNK3, ERK1, ERK2, ρ38α, ρ38β, ρ38γ, ρ38δ, МЕК1, MEK2, МККЗ, MKK4 (SEK1), MEK5, MKK6, MKK7, jun, ATF2, ELK1 и хомолога на бозайник АЕХ-3.
66. Метод от патентна претенция 61, характеризиращ се с това, че активността на даден белтък се определя чрез измерване активността на субстрат на даден белтък, количеството на субстрат на даден белтък, или mRNA кодираща даден субстрат на даден белтък.
67. Метод от патентна претенция 61, характеризиращ се с това, че активността на даден белтък може да бъде определена чрез in vitro киназен тест или свързващ тест.
68.Метод от патентна претенция 61, характеризиращ се с това, че дадени клетки са първични ембрионни клетки от мотоневрони.
69. Метод от патентна претенция 61, характеризиращ се с това, че дадени клетки са свръхекспресивни по отношение на даден белтък от сложна киназна линия.
70. Метод от патентна претенция 61, характеризиращ се с това, че дадена клетка е невронна клетка.
71. Метод от патентна претенция 61, характеризиращ се с това, че дадена клетка е въвлечена във възпаление.
72.Метод за лечение на бозайници, които имат невродегенеративно нарушение, включващ въвеждане на бозайника на съединение, което инхибира сложна линия киназен белтък, във фармацевтично приемлива сол или разредител.
73.Метод от патентна претенция 72, характеризиращ се с това, че дадено съединение има формула където
Е1 и Е2, независимо и всеки заедно с въглеродните атоми, към които те са прикрепени, образуват или ненаситен 6-членен карбоцикличен ароматен пръстен, при който от един до три въглеродни атома могат да бъдат заменени от азотен(и) атом(и); или ненаситен 5-членен карбоцикличен ароматен пръстен; при който или един въглероден атом е заменен от кислороден, азотен или серен атом;
или два въглеродни атома са заменени от серен и азотен атом, или кислороден и азотен атом;
А1 и А2 заедно представляват О и В1 и В2 заедно представляват О;
R1 е Н, алкил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома (включително), арил, арилалкил, хетероарил и хетероарилалкил; COR9, където R9 е алкил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома (включително) или арил, за предпочитане фенил или нафтил; -OR10, където R10 е алкил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома; -CONH2, -NR7R8, -(CH2)nNR7R8, където η е цяло число от 1 до 4 (включително); или -O(CH2)nNR R и или
R и R независимо са Н или алкил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома (включително), или
R7 и R8 са свързани заедно да образуват свързваща група с обща формула -(СН2)2-Х1-(СН2)2-, където X1 е О, S или СН2;
R2 е Н, -SO2R9; -CO2R9, -COR9, алкил, имащ от 1 до 8 въглеродни атома (включително), за предпочитане алкил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома (включително), алкенил, имащ от 1 до 8 въглеродни атома (включително), за предпочитане алкенил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома (включително), или алкинил, имащ от 1 до 8 въглеродни атома (включително), за предпочитане алкинил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома (включително), или монозахарид, имащ от 5 до 7 въглеродни атома (включително), където всяка хидроксилна група на монозахарида е независимо или незаместена, или заменена от Н, алкил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома (включително), алкилкарбонилокси, имащ от 2 до 5 въглеродни атома (включително) или алкокси група, имаща от 1 до 4 въглеродни атома (включително), и или всеки алкил, имащ от 1 до 8 въглеродни атома (включително), алкенил, имащ от 1 до 8 въглеродни атома (включително), или алкинил, имащ от 1 до 8 въглеродни атома (включително), е незаместен; или всеки алкил, имащ от 1 до 8 въглеродни атома (включително), алкенил, имащ от 1 до 8 въглеродни атома (включително), или алкинил, имащ от 1 до 8 въглеродни атома (включително), е независимо заместен с 1-3 арил, имащ от 6 до 10 въглеродни атома (включително), за предпочитане фенил или нафтил, хетероарил, F, Cl, Br, I, -CN, -NO2, OH, -OR9, -O(CH2)nNR7R8, -OCOR9, -OCONHR9, О-тетрахидропиранил, NH2, -NR7R8, -NR10COR9; -NR10CO2R9, -NR10CONR7R8, -NHC(=NH)NH2, -NR10SO2R9, -S(O)yR, където R11 е H или алкил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома, арил, имащ от 6 до 10 въглеродни атома, за предпочитане фенил или нафтил или хетероарил и у е 1 или 2; -SR11, CO2R9 , -CONR7R8, -СНО, COR9, -CH2OR7, -CH=NNRnR12, -CH=NORn, -CH=NR9, -CH=NNHCH(N=NH)NH2, -SO2NR12R13, -PO(ORn)2 или OR14, където R14 е остатък на аминокиселина, след като хидроксилната група на карбоксилната група е заменена, и или
R12 и R13 са всеки независимо Н, алкил, имащ от 1 до 4 въглерода (включително), арил, имащ от 6 до 10 въглеродни атома, за предпочитане фенил или нафтил, или хетероарил; или
R12 и R13 заедно образуват свързваща група, за предпочитане -(СН2)2-Х1-(СН2)2;
всеки R3, R4, R5 и R6 е независимо Н, арил, за предпочитане арил, имащ от 6 до 10 ваглеродни атома (включително), по-за предпочитане фенил или нафтил; хетероарил, F, Cl, Br, I, -CN, CF3, -NO2, OH, -OR9, O(CH2)„NR7R8, -OCOR9, -OCONHR9, NH2, -CH2OH, -CH2OR14, -NR7R8, NR10COR9, -NR10CONR7R8, -SR11, -S(O)yRu, където у е 1 или 2; -CO2R9, COR9, -CONR7R8, -CHO, -CH=NORn, -CH=NR9, -CH=NNRnR12, (CH2)nSR9, където n е цяло число от 1 до 4 (включително), (CH2)nS(O)y,R9, -CH2SR15, където R15 е алкил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома (включително); -CH2S(O)yR14, -(CH2)NR7R8, -(CH2)nNHR14, алкил, имащ от 1 до 8 въглеродни атома (включително), за предпочитане алкил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома (включително); алкенил, имащ от 1 до 8 въглеродни атома (включително), за предпочитане алкенил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома (включително); алкинил, имащ от 1 до 8 въглеродни атома (включително); за предпочитане алкинил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома (включително); и или всеки алкил, имащ от 1 до 8 въглерода (включително), алкенил, имащ от 1 до 8 въглерода (включително) или алкинил, имащ от 1 до 8 въглерода (включително), е незаместен; или всеки алкил, имащ от 1 до 8 въглерода (включително), алкенил, имащ от 1 до 8 въглерода (включително) или алкинил, имащ от 1 до 8 въглерода (включително), е заместен, както е описано в г)2), по-горе;
X е или незаместен алкилен, имащ от 1 до 3 въглерода (включително); или
X е алкилен, имащ от 1 до 3 въглерода (включително), заместен с една R2 група, за предпочитане OR10, -SR10, R15, където R15 е алкил, имащ от 1 до 4 въглерода (включително); фенил, нафтил, арилалкил, имащ от 7 до 14 въглерода (включително), за предпочитане бензил; или
X е -СН=СН-, -СН(ОН)-СН(ОН)-, -0-, -S-, -S(=0)-, S(=0)2-, -CR10)2-,-C(=O)-, -C(=NOR11)-, -C(ORn)(Rn)-, -C(=O)CHR15)-, CHR15)C(=O)-, -C(=NORh)CHR15)-, -CHR15)C(=NORh)-, -ch2z-, -z-ch2, -CH2ZCH2-, където Z е, C (ORn)(Rn), 0, S, C(=0), C(=NORn), или NR11;
или
А1 и А2 заедно са всеки независимо Η, Η; Η, -OR11; Η, -SR11; Η, NRnR12; иди заедно представляват =S или =NRn; В1 и В2 заедно представляват О; и всеки R1, R2, R3, R4, R5, R6 и X е както е определено по-горе във в), г), д) и е), или
А и А заедно представляват О и В и В заедно са всеки независимо Η, Η; Н, -OR11, Н, -SR11, Н, -NRHR12, или заедно представляват =S или =NRn; и всеки R1, R2, R3, R4, R5, R6 и X са както са определени по-горе във в), г), д) и е).
74. Метод от патентна претенция 73, характеризиращ се с това, че Ац А2, Rb R3 и R4 са Η; Bi и В2 заедно представляват О; R2 е СН2СН2ОН; RsnReca ОСН3;иХеСН2.
75. Метод от патентна претенция 73, характеризиращ се с това, че Аь А2, Ri, R3, R5 и Re са Н; В[ и В2 заедно представляват О; R2 е СН2СН2ОАс; R4 е Вг и X е СН2.
76. Метод от патентна претенция 73, характеризиращ се с това, че А], А2, Ri, R3, R, и R6 са Н; В] и В2 заедно представляват О; R2 е СН2СН2ОАс; R4 е СН2СН2(2-Руг); и X е СН2.
77.Метод от патентна претенция 73, характеризиращ се с това, че Аь Л2, Ri, R3, R5 и Re са Η; Bi и В2 заедно представляват О; R2 е Н; R4 е СН2СН2(2-Пиримидинил); и X е СН2.
78. Метод от патентна претенция 73, характеризиращ се с това, че Аь А2, Rb R3, R5 и Re са Н; В] и В2 заедно представляват О; R2 е Н; R4 е СН2СН2(2-Руг); и X е СН2.
79. Метод от патентна претенция 73, характеризиращ се с това, че Аь А2, Rb R2, R3, R5 и Re са Н; Bi и B2 заедно представляват О; R4 е СН2СН2(2- Пиридазинил); и X е СН2.
80. Метод от патентна претенция 73, характеризиращ се с това, че Аь А2, Rb R3, R4, R5 и Re са Η; Bi и В2 заедно представляват О; R2 е СН2СН2ОН; и X е СН2.
81. Метод от патентна претенция 73, характеризиращ се с това, че Аь А2, Rb R3, R4, R5 и Re са Н; Bi и В2 заедно представляват О; R2 е СН2СН2СН2ОН; и X е СН2.
82. Метод от патентна претенция 73, характеризиращ се с това, че Аь А2, Rb R2, R3, R4, R5 и Re са H; Bi и В2 заедно представляват О; и X е S.
83. Метод от патентна претенция 73, характеризиращ се с това, че Аь А2, Rb R3, R4, R5 и R6 са Η; Bi и В2 заедно представляват О; R2 е CH2CH2CH2NHCO(4-(OH)Ph); и X е СН2.
84. Метод от патентна претенция 73 характеризиращ се с това, че Аь А2, Rb R3, R4, R5 и Re са Η; Bi и В2 заедно представляват О; R2 е СН2СН2ОН; и X е СН2.
85.Метод от патентна претенция 72, характеризиращ се с това, че дадено съединение има формулата където пръстен В и пръстен F, независимо и всеки заедно с въглеродните атоми, към които те са прикрепени, са избрани от групата, състояща се от:
а) ненаситен 6-членен карбоцикличен ароматен пръстен, където от 1 до 3 въглеродни атома могат да бъдат заменени от азотни атоми;
б) ненаситен 5-членен карбоцикличен ароматен пръстен; и
в) ненаситен 5-членен карбоцикличен ароматен пръстен, където или
1) един въглероден атом е заменен с кислороден, азотен или серен атом;
2) два въглеродни атома са заменени със серен и азотен атом, кислороден и азотен атом или два азотни атома; или
3) три въглеродни атома са заменени с три азотни атома;
R1 е избран от групата, съдържаща:
а)Н, заместен или незаместен алкил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома, заместен или незаместен арил, заместен или незаместен арилалкил, заместен или незаместен хетероарил или заместен или незаместен хетероарилалкил;
6)-C(=O)R9, където R9 е избран от групата, съдържаща алкил, арил и хетероарил;
b)-OR10, където R10 е избран от групата, съдържаща Н и алкил, имащ от 1 до 4 въглерода;
r)-C(=O)NH2, -NRHR12, -(CH2)pNRnR12, -(CH2)POR10, O(CH2)POR10 и -O(CH2)pNRnR12, където p е от 1 до 4; и където или
1) Rn и R12 са всеки независимо избран от групата, съдържаща Н и алкил, имащ от 1 до 4 въглерода; или
2) Rn и R12 заедно образуват свързваща група с формула -(СН2)2-Х'-(СН2)2-, където X1 е избран от групата, съдържаща 0-, -S- и -СН2-;
R2 е избран от групата, съдържаща Н, алкил, имащ от 1 до 4 въглерода, -ОН, алкокси, имащ от 1 до 4 въглерода, -OC(=O)R9, OC(=O)NRnR12, -O(CH2)pNRnR12, -O(CH2)POR10, заместен или незаместен арилалкил, имащ от 6 до 10 въглерода и заместен или незаместен хетероарилалкил;
R3, R4, R5 и R6 са всеки независимо избран от групата, съдържаща:
а) Н, арил, хетероарил, F, Cl, Br, I, -CN, CF3, -ΝΟ2-, -OH, OR9, -O(CH2)pNRnR12, -OC(=O)R9, -OC(=O)NR2R7, -OC(=O)NRnR12, O(CH2)POR10, -CH2OR10, -NRnR12, -NR10S(=O)2R9, -NR10C(=O)R9;
б) -CH2OR14, където R14 е остатък на аминокиселина след като хидроксилната група на карбоксилната група е премахната;
B)-NR10C(=O)NRnR12, -CO2R2, -C(=O)R2, -C(=O)NRnR12, CH=NOR2, -CH=NR9, -(CH2)pNRnR12, -(CH2)PNHR14 или -CH=NNR2R2A, 2A. 2 където R е същия както R ;
r) -S(O)yR2-(CH2)pS(O)yR9, -CH2S(O)yR14, където у e 0, 1 или 2;
д)алкил, имащ от 1 до 8 въглерода, алкенил, имащ от 2 до 8 въглерода и алкинил, имащ от 2 до 8 въглерода, където
1)всяка алкилна, алкенилна или алкинилна група е незаместена; или
2)всяка алкилна, алкенилна или алкинилна група е заместена с от 1 до 3 групи, избрани от групата, съдържаща арил, имащ от 6 до 10 въглерода, хетероарил, арилалкокси, хетероциклоалкокси, хидроксиалкокси, алкилокси-алкокси, хидроксиалкилтио, алкоксиалкилтио, F, Cl, Br, I, -CN, -NO2, -OH, -OR9, -X2(CH2)pNRnR12, X2(CH2)pC(=O)NR1,R12, -X2(CH2)pOC(=O)NRnR12, -X2(CH2)pCO2R9, X2(CH2)pS(O)yR9, -X2(CH2)pNR10C(=O)NR11R12, -OC(=O)R9, -OCONHR2, -О-тетрахидропиранил, -NRnR12, -NR10C(=O)R9, -NR10CO2R9, NR10C(=O)NRnR12, -NHC(=NH)NH2, NR10S(O)2R9, -S(O)yR9,
-CO2R9, -C(=O)NRnR12, -C(=O)R2, -CH2OR10, -CH=NNR2R2A, CH=NOR2, -CH=NR9, -CH=NNHCH(N=NH)NH2, -S(=O)2NR2R2A, P(=O)(OR10)2, -OR14 и монозахарид, имащ от 5 до 7 въглерода, където всяка хидроксилна група на монозахарида е независимо или незаместена, или е заменена от Н, алкил, имащ от 1 до 4 въглерода, алкилкарбонилокси, имащ от 2 до 5 въглерода, или алкокси, имащ от 1 до 4 въглерода;
X2 е О, S или NR10;
R7 и R8 са всеки независимо избран от групата, съдържаща Н, алкил, имащ от 1 до 4 въглерода, алкокси, имащ от 1 до 4 въглерода, заместен или незаместен арилалкил, имащ от 6 до 10 въглерода, заместен или незаместен хетероарилалкил, -(CH2)pOR10, (CH2)pOC(=O)NR11R12 и -(CH2)pNRnR12, или R7 и R8 заедно образуват свързваща група с формула -СН2-Х -СН2-, където X е X или връзка;
m и η са независимо 0, 1 или 2;
Υ е избран от групата, съдържаща -0-, -S-, -N(R10)-, -N+(O')(R10)-, N(OR10)- и -СН2-;
Z е избран от групата, съдържаща връзка, -0-, -СН=СН-, -S-, С(=О)-, -CH(OR10), -N(R10)-, -N(OR10)-, -CH(NRUR12)-, -C(=O)N(R17)-, N(R17)C(=O)-, -N(S(O)yR9)-, -N(S(O)yNRnR12)-, -N(C(=O)R17)-, C(R15R16)-, -N+(O )(R10)-, -CH(OH)-CH(OH)- и CH(O(C=O)R9)CH(OC(=O)R9A)-, където R9A е същия като R9;
R15 и R16 са независимо избрани от групата, съдържаща Н, -ОН, C(=O)R10, -O(C:=O)R9, хидроксиалкил и -CO2R10;
R17 е избран от групата, съдържаща Н, алкил, арил и хетероарил;
А1 и А2 са независимо избрани от групата, съдържаща Η, Н; Н, OR2; Н, -SR2; Н, N(R2)2; и група, където А1 и А2 взети заедно образуват единица, избрана от групата, съдържаща =0, =S и =NR ;
В1 и В2 са избрани от групата, съдържаща Η, Η; Н, -OR2; Н, SR2, Н, -N(R2)2; и група, където В1 и В2 заедно образуват единица, избрана от групата, съдържаща =0, =S и =NR ;
12 12 при условие, че поне една от двойките А и А , или В и В , образуват =0.
86. Метод от патентна претенция 72, характеризиращ се с това, че дадено съединение има формулата където
Zi е Н и Z2 е Н или Z\ и Z2 заедно образуват =0;
Ri е избран от групата, състояща се от Н, Cl, CH2SO2C2H5, Вг,
CH2S(CH2)2NH2, CH2S(CH2)2N(CH3)2, CH2S(CH2)2NH2, П-С4Н9, NHCONHC6H5, NHCONHC2Hs, CH2SC2H5, CH2SC6H5, N(CH3)2, СНз, CH2OCONHC2H5, NHCO2CH3, CH2OC2H5, CH2N(CH3)2, OH, 0 п-пропил, CH=NNH-C(=NH)NH2, CH=N-N(CH3)2, CH2S(CH2)2NH-n-C4H9, CH2OCH2OCH2CH3, СН28[3-(1,2,4-триазин)], CH2CH2SCH3> /~Ά Ν Ο
C№=N—
ΛΑ
CH—Ν—Ν NCH3 \_7
И
R2 е избран от групата, състояща се от Н, Br, Cl, I, CH2S(CH2)2N(CH3)2, NHCONHC2H5, CH2SC2H5, СН2ОСН2ОСН2СН3, СН28(3-(1,2,4-триазин)), CH2CH2SCH3 и СН2ОН;
X е избран от групата, състояща се от Н, СН2ОН, СН2Ь1Н-СеринН, СО2СН3, CONHC6H5, ch2nhco2c6h5, ch2nhco2ch3, ch2n3, CONHC2H5, СН^Н-Глицин, CON(CH3)2, -CH2NHCO2-, conh2, CONHC3H7, CH2NH-CepHH, CH2SOCH3, CH=NOH, CH2NH-11ролин, СН2СН2(2-Пиридил), CH=NNHC(=NH)NH2, CONH(CH2)2OH, CH=NNHCONH2, CH2OCOCH3, -CH2OC(CH3)2O-, ch2sc6h5, CH2SOC6H5, СО2п-хексил, CONHCH3 и CO2(CH2)4CH3;
и
R е избран от групата, състояща се от ОН и ОСН3.
87. Метод от патентна претенция 86, характеризиращ се с това, че Ζι и Z2 са Η; X е СО2СН3; Ri е NHCONHC2H5; R2 е СН2СН2(2-Пиридил); и R еОН.
88. Метод от патентна претенция 86, характеризиращ се с това, че Ζι и Z2 са Η; X е СО2СН3; Ri и R2 са СН2ОСН2ОСН2СН3; и R е ОН.
89. Метод от патентна претенция 86, характеризиращ се с това, че Ζι и Ζ2 са Η; X е СО2СН3; Ri и R2 са CH2SCH2CH3; и R е ОН.
90. Метод от патентна претенция 86, характеризиращ се с това, че Zb Z2, Ri и R2 са Η; X е СО2СН3 и R е ОН.
91. Метод от патентна претенция 86, характеризиращ се с това, че Zb Z2, Ri и R2, са Η; X е СО2(СН2)4СН3; и R е ОН.
92. Метод от патентна претенция 86, характеризиращ се с това, че Zb Z2 и Rb са Н; R2 е СН2ОН; X е СО2СН3; и R е ОН.
93. Метод от патентна претенция 86, характеризиращ се с това, че Ζι и Ζ2 са Н; Ri и R2, са Н28(3-(1,2,4-триазин)); X е СО2СН3; и R е ОН.
94. Метод от патентна претенция 86, характеризиращ се с това, че Ζι и Ζ2 са Н; Rj е Br; R2 е I; X е СО2СН3; и R е ОН.
95. Метод от патентна претенция 86, характеризиращ се с това, че Ζι и Ζ2 са Н; Ri и R2 са CH2CH2SCH3; X е СО2СН3; и R е ОН.
96.Метод от патентна претенция 86, характеризиращ се с това, че Zb Z2, Ri и R2 са Η; X е СО2СН3; и R е ОСН3.
97.Метод от патентна претенция 86, характеризиращ се с това, че Ζ] и
Ζ2 заедно образуват О; Rj и R2, са Вг; X е СО2СН3; и R е ОН.
98.Метод от патентна претенция 72, характеризиращ се с това, че дадено съединение има формулата където:
Zi е Н и Z2 е Н или Ζι и Z2 заедно образуват =0;
Ri е Н или Вг;
R2eH; j__
R3 е Н, СН2СН=СН2, СН2СН2СН2ОН, или СН2СН2СН2 — __О и
R4 е Н, СН2СН=СН2 или СН2СН2СН2ОН.
99,Метод от патентна претенция 98, характеризиращ се с това, че Rb R2, R4, Zj и Z2 са Н и R3 е СН2СН=СН2.
ЮО.Метод от патентна претенция 98, характеризиращ се с това, че Ri е Вг и R2, R3 R4, Ζι и Z2 са Η.
ϊ
101.Метод от патентна претенция 98, характеризиращ се с това, че Rb R2, Ζι и Z2 са Н и R3 и R4 са СН2СН=СН2.
102.Метод от патентна претенция 98, характеризиращ се с това, че Ri,
R2, R3, Zj и Z2 са Н и R4 е СН2СН=СН2.
103.Метод от патентна претенция 98, характеризиращ се с това, че Ri, R2, Zi и Z2 са Н, и R3 и R4 са СН2СН2СНОН; или Rb R2, R4, Ζι и Z2 са Η,
СН2СН2СН2—__D
104.Метод за лечение на бозайници, които имат възпаление, включващ прилагане върху бозайника на съединение, което инхибира сложна линия киназен белтък, във фармацевтично приемлива сол или разредител.
105.Метод от патентна претенция 104, характеризиращ се с това, че дадено съединение има формулата където
Е1 и Е2, независимо и всеки заедно с въглеродните атоми, към които те са прикрепени, образуват или ненаситен 6-членен карбоцикличен ароматен пръстен, при който от един до три въглеродни атома могат да бъдат заменени от азотен(и) атом(и); или ненаситен 5-членен карбоцикличен ароматен пръстен; при който или един въглероден атом е заменен от кислороден, азотен или серен атом;
или два въглеродни атома са заменени от серен и азотен атом, или кислороден и азотен атом;
А1 и А2 заедно представляват 0 и В1 и В2 заедно представляват 0;
R1 е Н, алкил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома (включително), арил, арилалкил, хетероарил и хетероарилалкил; COR9, където R9 е алкил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома (включително) или арил, за предпочитане фенил или нафтил; -OR10, където R10 е Н или алкил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома (включително); -CONH2, -NR R, (CH2)nNR7R8, където n е цяло число от 1 до 4 (включително); или O(CH2)„NR7R8 и или
R7 и R8 независимо са Н или алкил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома (включително), или
R7 и R8 са свързани заедно да образуват свързваща група с обща формула -(СНг^-ХЦсН^-, където X1 е О, S или СН2;
R2 е Н, -SO2R9; -CO2R9, -COR9, алкил, имащ от 1 до 8 въглеродни атома (включително), за предпочитане алкил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома (включително), алкенил, имащ от 1 до 8 въглеродни атома (включително), за предпочитане алкенил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома (включително), или алкинил, имащ от 1 до 8 въглеродни атома (включително), за предпочитане алкинил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома (включително), или монозахарид, имащ от 5 до 7 въглеродни атома (включително), където всяка хидроксилна група на монозахарида независимо е или незаместена, или заменена от Н, алкил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома (включително), алкилкарбонилокси, имащ от 2 до 5 въглеродни атома (включително) или алкокси група, имаща от 1 до 4 въглеродни атома (включително), и или всеки алкил, имащ от 1 до 8 въглеродни атома (включително), алкенил, имащ от 1 до 8 въглеродни атома (включително), или алкинил, имащ от 1 до 8 въглеродни атома (включително), е незаместен; или всеки алкил, имащ от 1 до 8 въглеродни атома (включително), алкенил, имащ от 1 до 8 въглеродни атома (включително), или алкинил, имащ от 1 до 8 въглеродни атома (включително), е независимо заместен с 1-3 арил, имащ от 6 до 10 въглеродни атома (включително), за предпочитане фенил или нафтил, хетероарил, F, Cl, Br, I, -CN, -NO2, OH, -OR9, -O(CH2)nNR7R8, -OCOR9, -OCONHR9, О-тетрахидропиранил, NH2, -NR7R8, -NR10COR9; -NR10CO2R9, -NR10CONR7R8, -NHC(=NH)NH2, - NR10SO2R9, -S(O)yRn, където R11 е H или алкил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома, арил, имащ от 6 до 10 въглеродни атома, за предпочитане фенил или нафтил или хетероарил и у е 1 или 2; -SR11, CO2R9, -CONR7R8, -СНО, COR9, -CH2OR7, -CH=NNRnR12, -CH=NORn, -CH=NR9, -CH=NNHCH(N=NH)NH2, -SO2NR12R13, -PO(ORn)2 или OR14, където R14 е остатък на аминокиселина след като хидроксилната група на карбоксилната група е заменена, и или
R12 и R13 са всеки независимо Н, алкил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома (включително), арил, имащ от 6 до 10 въглеродни атома, за предпочитане фенил или нафтил, или хетероарил; или
R12 и R13 заедно образуват свързваща група, за предпочитане -(СН2)2-Х1-(СН2)2;
всеки R3, R4, R5 и R6 е независимо Н, арил, за предпочитане арил, имащ от 6 до 10 въглеродни атома (включително), по-за предпочитане фенил или нафтил; хетероарил, F, Cl, Br, I, -CN, CF3, -NO2, OH, -OR9, O(CH2)nNR7R8, -OCOR9, -OCONHR9, NH2, -CH2OH, -CH2OR14, -NR7R8, NR10COR9, -NR10CONR7R8, -SR11, -S^R11, където у е 1 или 2; -CO2R9, COR9, -CONR7R8, -CHO, -CH=NORn, -CH=NR9, -CH=NNRnR12, (CH2)nSR9, където n е цяло число от 1 до 4 (включително), (CH2)nS(O)y,R9, -CH2SR15, където R15 е алкил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома (включително); -CH2S(O)yR14, -(CH2)NR7R8, -(CH2)nNHR14, алкил, имащ от 1 до 8 въглеродни атома (включително), за предпочитане алкил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома (включително); алкенил, имащ от 1 до 8 въглеродни атома (включително), за предпочитане алкенил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома (включително); алкинил, имащ от 1 до
8 въглеродни атома (включително); за предпочитане алкинил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома (включително); и или всеки алкил, имащ от 1 до 8 въглеродни атома (включително), алкенил, имащ от 1 до 8 въглеродни атома (включително) или алкинил, имащ от 1 до 8 въглеродни атома (включително), е незаместен; или всеки алкил, имащ от 1 до 8 въглеродни атома (включително), алкенил, имащ от 1 до 8 въглеродни атома (включително) или алкинил, имащ от 1 до 8 въглеродни атома (включително), е заместен, както е описано в г)2), по-горе;
X е или незаместен алкилен, имащ от 1 до 3 въглеродни атома (включително); или
X е алкилен, имащ от 1 до 3 въглеродни атома (включително), заместен с една R2 група, за предпочитане OR10, -SR10, R15, където R15 е алкил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома (включително); фенил, нафтил, арилалкил, имащ от 7 до 14 въглеродни атома (включително), за предпочитане бензил; или
X е -СН=СН-, -СН(ОН)-СН(ОН)-, -0-, -S-, -S(=0)-, S(=0)2-, -CR10)2-, -С(=0)-, -C(=NORn)-, -C(OR11)(R11)-, -C(=O)CHR15)-, CHRI5)C(=O)-, -C(=NORn)CHR15)-, -CHR15)C(=NOR11)-, -CH2Z-, -Z-CH2, -CH2ZCH2-, където Z e C(ORn)(Rn), 0, S, C(-0), C(=NORn), или NR11;
или
А1 и А2 заедно са всеки независимо Η, Η; Η, -OR11; Η, -SR11; Η, NRnR12; или заедно представляват =S или =NRn; В1 и В2 заедно представляват О; и всеки R1, R2, R3, R4, R5, R6 и X е както е определено по-горе във в), г), д) и е) или
А1 и А2 заедно представляват О и В1 и В2 заедно са всеки независимо Η, Η; Н, -OR11, Н, -SR11, Н, -NRnR12, или заедно представляват =S или =NRn; и всеки R1, R2, R3, R4, R5, R6 и X са както са определени по-горе във в), г), д) и е).
Юб.Метод от патентна претенция 105, характеризиращ се с това, че Ац А2, Ri, R3 и R4 са Η; Bi и В2 заедно представляват О; R2 е СН2СН2ОН; R5 и R<s са ОСН3; и X е СН2.
Ю7.Метод от патентна претенция 105, характеризиращ се с това, че Аь А2, R], R3, R5 и R6 са Н; В, и В2 заедно представляват О; R2 е СН2СН2ОАс; R4 е Вг; и X е СН2.
108.Метод от патентна претенция 105, характеризиращ се с това, че Аь А2, Rb R3, R> и R6 са Η; Bi и B2 заедно представляват О; R2 е СН2СН2ОАс; R4 е СН2СН2(2-Руг); и X е СН2.
109,Метод от патентна претенция 105, характеризиращ се с това, че А,, А2, Rb R3, R5 и Re са Н; Bj и B2 заедно представляват О; R2 е Н; R4 е СН2СН2(2-Пиримидинил); и X е СН2.
ПО.Метод от патентна претенция 105, характеризиращ се с това, че Аь А2, Rb R3, R5 и R6 са Η; Bi и B2 заедно представляват О; R2 е Н; R4 е СН2СН2(2-Руг); и X е СН2.
111.Метод от патентна претенция 105, характеризиращ се с това, че Аь А2, Rb R2, R3, R5 и R6 са Н; Bj и B2 заедно представляват О; R4 е СН2СН2(2-Пиридазинил); и X е СН2.
112.Метод от патентна претенция 105, характеризиращ се с това, че Аь А2, Ri, R3, R4, R5 и Re са Η; Bi и В2 заедно представляват О; R2 е СН2СН2ОН; и X е СН2.
ПЗ.Метод от патентна претенция 105, характеризиращ се с това, че Аь А2, Rb R3, R4, R5 и Re са Н; Bt и В2 заедно представляват О; R2 е СН2СН2СН2ОН; и X е СН2.
И4.Метод от патентна претенция 105, характеризиращ се с това, че Аь А2, Rb R2, R3, R4, R5 и Re са H; Bj и В2 заедно представляват О; и X е S.
115. Метод от патентна претенция 105, характеризиращ се с това, че Аь А2, Rb R3, R4, R5 и Re са Η; Bi и В2 заедно представляват О; R2 е CH2CH2CH2NHCO(4-(OH)Ph); и X е СН2.
116. Метод от патентна претенция 105, характеризиращ се с това, че Аь А2, Rb R3, R4, R5 и Re са Н; Bi и В2 заедно представляват О; R2 е СН2СН2ОН; и X е СН2.
117.Метод от патентна претенция 104 характеризиращ се с това, че дадено съединение има формулата
Ял
I където:
пръстен В и пръстен F, независимо и всеки заедно с въглеродните атоми, към които те са прикрепени, са избрани от групата, състояща се от:
а) ненаситен 6-членен карбоцикличен ароматен пръстен, където от 1 до 3 въглеродни атома могат да бъдат заменени от азотни атоми;
б) ненаситен 5-членен карбоцикличен ароматен пръстен; и
в) ненаситен 5-членен карбоцикличен ароматен пръстен, където или
1) един въглероден атом е заменен с кислороден, азотен или серен атом;
2) два въглеродни атома са заменени със серен и азотен атом, кислороден и азотен атом или два азотни атома; и
3) три въглеродни атома са заменени с три азотни атома;
R1 е избран от групата, съдържаща:
a) Н, заместен или незаместен алкил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома, заместен или незаместен арил, заместен или незаместен арилалкил, заместен или незаместен хетероарил или заместен или незаместен хетероарилалкил;
6)-C(=O)R9, където R9 е избран от групата, съдържаща алкил, арил и хетероарил;
b) -OR10, където R10 е избран от групата, съдържаща Н и алкил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома;
r)-C(=O)NH2, -NRnR12, -(CH2)pNRnR12, -(CH2)POR10, O(CH2)pOR10 и -O(CH2)pNRnR12, където p е от 1 до 4; и където или
1) Rn и R12 са всеки независимо избран от групата, съдържаща Н и алкил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома; или
2) RH и R12 заедно образуват свързваща група с формула -(СН2)2-Х1-(СН2)2-, където X1 е избран от групата, съдържаща 0-, -S- и -СН2_;
R2 е избран от групата, съдържаща Н, алкил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома, -ОН, алкокси, имащ от 1 до 4 въглеродни атома, 33
OC(=O)R9, -OC(=O)NRnR12, -O(CH2)pNRnRi2, -O(CH2)POR10, заместен или незаместен арилалкил, имащ от 6 до 10 въглеродни атома и заместен или незаместен хетероарилалкил;
R3, R4, R5 и R6 са всеки независимо избран от групата, съдържаща:
a) Н, арил, хетероарил, F, Cl, Br, I, -CN, CF3, -ΝΟ2-, -OH, OR9, -O(CH2)pNRnR12, -OC(=O)R9, -OC(=O)NR2R7, -OC(=O)NRnR12, O(CH2)POR10, -CH2OR10, -NRnR12, -NR10S(=O)2R9, -NR10C(=O)R9;
6)-CH2OR14, където R14 е остатък на аминокиселина след като хидроксилната група на карбоксилната група е премахната;
b) -NR10C(=O)NRhR12, -CO2R2, -C(=O)R2, -C(=O)NRnR12, CH=NOR2, -CH=NR9, -(CH2)pNR' 'r'2, -(CH2)pNHR14 или -CH=NNR2R2A, където R2a е същия както R2;
r) -S(O)yR2-(CH2)pS(O)yR9, -CH2S(O)yR14, където у e 0, 1 или 2;
д)алкил, имащ от 1 до 8 въглеродни атома, алкенил, имащ от 2 до 8 въглеродни атома и алкинил, имащ от 2 до 8 въглеродни атома, където
1) всяка алкилна, алкенилна или алкинилна група е незаместена; или
2) всяка алкилна, алкенилна или алкинилна група е заместена с от 1 до 3 групи, избрани от групата, съдържаща арил, имащ от 6 до 10 въглерода, хетероарил, арилалкокси, хетероциклоалкокси, хидроксиалкокси, алкилокси-алкокси, хидроксиалкилтио, алкоксиалкилтио, F, Cl, Вг, I, -CN, -NO2, -OH, -OR9, -X2(CH2)pNRnR12, X2(CH2)pC(=O)NRnR12, -X2(CH2)pOC(=O)NRnR12, -X2(CH2)PCO2R9, X2(CH2)pS(O)yR9, -X2(CH2)pNR10C(=O)NR11R12, -OC(=O)R9, -OCONHR2, О-тетрахидропиранил, -NRnR12, -NR10C(=O)R9, -NR10CO2R9,
NR10C(=O)NRnR12, -NHC(=NH)NH2, NR10S(O)2R9, -S(O)yR9, -CO2R9,C(=O)NRnR12, -C(=O)R2, -CH2OR10, -CH=NNR2R2A, -CH=NOR2, CH=NR9, -CH=NNHCH(N=NH)NH2, -S(=O)2NR2R2A, -P(=O)(OR10)2, OR14 и монозахарид, имащ от 5 до 7 въглеродни атома, където всяка хидроксилна група на монозахарида е независимо или незаместена или 3 заменена от Н, алкил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома, алкилкарбонилокси, имащ от 2 до 5 въглеродни атома, или алкокси, имащ от 1 до 4 въглерода;
X2 е О, S или NR10;
R7 и R8 са всеки независимо избран от групата, съдържаща Н, алкил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома, алкокси, имащ от 1 до 4 въглеродни атома, заместен или незаместен арилалкил, имащ от 6 до 10 въглеродни атома, заместен или незаместен хетероарилалкил, (CH2)pOR10, -(CH2)pOC(=O)NR11R12 и -(CH^pNR11^2, или R7 и R8 заедно образуват свързваща група с формула -СН2-Х -СН2-, където X е X или връзка;
ш и η са независимо 0, 1 или 2;
Υ е избран от групата, съдържаща -0-, -S-, -N(R10)-, -N+(O')(R10)-, N(OR10)- и -СН2-;
Z е избран от групата, съдържаща връзка, -0-, -СН=СН-, -S-, С(=О)-, -CH(OR10), -N(R10)-, -N(OR10)-, -CH(NRnR12)-, -C(0)N(R17)-. N(R17)C(=O)-, -N(S(O)yR9)-, -N(S(O)yNRnR12)-, -N(C(=O)R17)-, C(R15R16)-, -N+(O‘)(R10)-, -CH(OH)-CH(OH)- и CH(O(C=O)R9)CH(OC(=O)R9A)-, където R9A е същия както R9;
R15 и R16 са независимо избрани от групата, съдържаща Н, -ОН, C(=O)R10, -O(C-O)R9, хидроксиалкил и -CO2R10;
R17 е избран от групата, съдържаща Н, алкил, арил и хетероарил;
А1 и А2 са независимо избрани от групата, съдържаща Η, Η; Н, OR2; Н, -SR2; Н, -N(R2)2; и група, където А1 и А2 взети заедно образуват единица, избрана от групата, съдържаща =0, =S и =NR ;
12 2 2
В и В са избрани от групата, съдържаща Η, Η; Н, -OR ; Н, -SR ,
9 1 о
Н, -N(R )2; и група, където В и В заедно образуват единица, избрана от групата, съдържаща =0, =S и =NR ;
12 12 при условие, че поне една от двойките А и А , или В и В , образуват =0.
И8.Метод от патентна претенция 104, характеризиращ се с това, че дадено съединение има формулата където
Z] е Н и Z2 е Н или Ζι и Ζ2 заедно образуват =0;
Ri е избран от групата, състояща се от Н, Cl, CH2SO2C2H5, Br, CH2S(CH2)2NH2, CH2S(CH2)2N(CH3)2, CH2S(CH2)2NH2, П-С4Н9, nhconhc6h5, nhconhc2h5, CH2SC2H5, CH2SC6H5, N(CH3)2, ch3, CH2OCONHC2H5, NHCO2CH3, CH2OC2H5, CH2N(CH3)2, OH, Ο п-пропил, CH=NNH-C(=NH)NH2, CH=N-N(CH3)2, CH2S(CH2)2NH-n-C4H9, CH2OCH2OCH2CH3, CH2S(3-( 1,2,4-триазин)), CH2CH2SCH3, / \
CH—: N— Q
Γ~\
CH=N—N NCHj w
R2 е избран от групата, състояща се от Н, Br, Cl, I, CH2S(CH2)2N(CH3)2, NHCONHC2H5, CH2SC2H5, СН2ОСН2ОСН2СН3, СН28(3-(1,2,4-триазин)), CH2CH2SCH3 и СН2ОН;
X е избран от групата, състояща се от Н, СН2ОН, СН2КН-СеринН, СО2СН3, CONHC6H5, CH2NHCO2C6H5, ch2nhco2ch3, ch2n3, CONHC2H5, СН^Н-Глицин, CON(CH3)2, -CH2NHCO2-, conh2, CONHC3H7, СН2М1-Серин, CH2SOCH3, CH=NOH, СН2ЕШ-Пролин, СН2СН2(2-Пиридил), CH=NNHC(=NH)NH2, CONH(CH2)2OH, CH=NNHCONH2, CH2OCOCH3, -CH2OC(CH3)2O-, ch2sc6h5, CH2SOC6H5, СО2п-хексил, CONHCH3, CO2(CH2)4CH3;
и
R е избран от групата, състояща се от ОН и ОСН3.
119.Метод от патентна претенция 118, характеризиращ се с това, че Zj и
Z2 са Η; X е СО2СН3; Ri е NHCONHC2H5; R2 е СН2СН2(2-Пиридил); и R еОН.
120. Метод от патентна претенция 118, характеризиращ се с това, че Ζι и Z2 са Η; X е СО2СН3; R! и R2 са СН2ОСН2ОСН2СН3; и R е ОН.
121. Метод от патентна претенция 118, характеризиращ се с това, че Ζι и Z2 са Η; X е СО2СН3; Rj и R2 са CH2SCH2CH3; и R е ОН.
122. Метод от патентна претенция 118, характеризиращ се с това, че Zb Z2, Ri и R2 са Η; X е СО2СН3; и R е ОН.
123. Метод от патентна претенция 118, характеризиращ се с това, че Zb Z2, Rj и R2 са Η; X е СО2(СН2)4СН3; и R е ОН.
124. Метод от патентна претенция 118, характеризиращ се с това, че Zb Z2 и Rb са Н; R2 е СН2ОН; X е СО2СН3; и R е ОН.
125. Метод от патентна претенция 118, характеризиращ се с това, че Zj и Z2 са Н; Ri и R2 са Н28(3-(1,2,4-триазин)); X е СО2СН3; и R е ОН.
126. Метод от патентна претенция 118, характеризиращ се с това, че Zt и • Z2 са Н; Ri е Br; R2 е I; X е СО2СН3; и R е ОН.
127. Метод от патентна претенция 118, характеризиращ се с това, че Ζι и Ζ2 са Н; Ri и R2 са CH2CH2SCH3; X е СО2СН3; и R е ОН.
128.Метод от патентна претенция 118, характеризиращ се с това, че Zb Z2, Ri и R2 са Η; X е СО2СН3; и R е ОСН3.
129.Метод от патентна претенция 118, характеризиращ се с това, че Ζ, и Ζ2 заедно образуват =0; Ri и R2 са Br; X е СО2СН3; и R е ОН.
130.Метод от патентна претенция
104, характеризиращ се с това, че дадено съединение има формулата където: е Н и Z2 е Н или Ζι и Ζ2 заедно образуват =0;
Ri е Н или Вг
R2eH;
R3 е H, СН2СН=СН2, СН2СН2СН2ОН или СН2СН2СН2-—
R4 е Н, СН2СН=СН2 или СН2СН2СН2ОН.
131.Метод от патентна претенция 130, характеризиращ се с това, че Rb R2, R4, Zi и Z2 са Н и R3 е СН2СН=СН2.
132.Метод от патентна претенция 130, характеризиращ се с това, че Ri е Вг и R2, R3, R4, Zi и Z2 са Η.
133.Метод от патентна претенция 130, характеризиращ се с това, че Rb R2, Zi и Z2 са Н, и R3 и R4 са СН2СН=СН2.
134.Метод от патентна претенция 130, характеризиращ се с това, че Rb R2, R3, Zi и Z2 са Н, и R4 е СН2СН=СН2.
135.Метод от патентна претенция 130, характеризиращ се с това, че Rb R2, Zi и Z2 са Н, и R3 и R4 са СН2СН2СН2ОН; или Rb R2, R4, Ζχ и Ζ2 са
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US9798098P | 1998-08-26 | 1998-08-26 | |
PCT/US1999/018864 WO2000013015A1 (en) | 1998-08-26 | 1999-08-18 | Modulating multiple lineage kinase proteins |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
BG105360A true BG105360A (bg) | 2001-10-31 |
Family
ID=22266038
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
BG105360A BG105360A (bg) | 1998-08-26 | 2001-03-19 | Модулиране на сложна линия киназни белтъци |
Country Status (25)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1105728B1 (bg) |
JP (1) | JP2002523780A (bg) |
KR (1) | KR100700028B1 (bg) |
CN (3) | CN1206535C (bg) |
AT (1) | ATE293254T1 (bg) |
AU (1) | AU765637B2 (bg) |
BG (1) | BG105360A (bg) |
BR (1) | BR9913190A (bg) |
CA (1) | CA2339539A1 (bg) |
CZ (1) | CZ2001701A3 (bg) |
DE (1) | DE69924738T2 (bg) |
DK (1) | DK1105728T3 (bg) |
EA (2) | EA200500934A1 (bg) |
ES (1) | ES2241316T3 (bg) |
HK (1) | HK1037722A1 (bg) |
HU (1) | HUP0103079A3 (bg) |
NO (1) | NO20010389L (bg) |
NZ (1) | NZ509612A (bg) |
PL (1) | PL346246A1 (bg) |
PT (1) | PT1105728E (bg) |
SK (1) | SK2542001A3 (bg) |
TR (2) | TR200400635T2 (bg) |
UA (1) | UA74772C2 (bg) |
WO (1) | WO2000013015A1 (bg) |
ZA (1) | ZA200100835B (bg) |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6811992B1 (en) | 1998-05-14 | 2004-11-02 | Ya Fang Liu | Method for identifying MLK inhibitors for the treatment of neurological conditions |
US6841567B1 (en) | 1999-02-12 | 2005-01-11 | Cephalon, Inc. | Cyclic substituted fused pyrrolocarbazoles and isoindolones |
US7122679B2 (en) * | 2000-05-09 | 2006-10-17 | Cephalon, Inc. | Multicyclic compounds and the use thereof |
IL154311A0 (en) * | 2000-08-11 | 2003-09-17 | Cephalon Inc | Modulating multiple lineage kinase proteins |
AR035971A1 (es) | 2001-05-16 | 2004-07-28 | Cephalon Inc | Metodos para el tratamiento y la prevencion del dolor |
FR2826653B1 (fr) | 2001-06-29 | 2005-10-14 | Servier Lab | Nouveaux derives de pyrido-pyrido-pyrrolo[3,2-g]pyrrolo [3,4-e]-indole et pyrido-pyrrolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c] carbazole, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent |
JP2003052395A (ja) * | 2001-08-09 | 2003-02-25 | Japan Tissue Engineering:Kk | 移植適正判定方法 |
TWI580694B (zh) | 2007-11-30 | 2017-05-01 | 建南德克公司 | 抗-vegf抗體 |
WO2009098196A2 (en) * | 2008-02-04 | 2009-08-13 | Biofocus Dpi B.V. | Molecular targets and compounds, methods to identify the same, useful in the treatment of neurodegenerative diseases. |
US20100056609A1 (en) * | 2008-08-26 | 2010-03-04 | Washington University | Methods and compositions for inhibition of axonal degeneration by modulation of the dlk/jnk pathway |
AU2015202365B2 (en) * | 2008-10-22 | 2016-11-24 | Genentech, Inc. | Modulation of axon degeneration |
JP5851838B2 (ja) * | 2008-10-22 | 2016-02-03 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 軸索変性の調節 |
AU2010310589A1 (en) * | 2009-10-22 | 2012-05-10 | Genentech, Inc. | Modulation of axon degeneration |
ES2385157B1 (es) * | 2010-02-25 | 2013-07-08 | Universidad Del País Vasco | Compuestos para el tratamiento de alzheimer. |
WO2013177367A2 (en) | 2012-05-23 | 2013-11-28 | The Johns Hopkins University | Compounds and methods of use thereof for treating neurodegenerative disorders |
CN109060472A (zh) * | 2018-07-20 | 2018-12-21 | 上海市农业科学院 | 一种适于荧光染色的草菇菌褶组织切片的制备方法 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5756494A (en) * | 1992-07-24 | 1998-05-26 | Cephalon, Inc. | Protein kinase inhibitors for treatment of neurological disorders |
US5705511A (en) * | 1994-10-14 | 1998-01-06 | Cephalon, Inc. | Fused pyrrolocarbazoles |
US5475110A (en) * | 1994-10-14 | 1995-12-12 | Cephalon, Inc. | Fused Pyrrolocarbazoles |
US6811992B1 (en) * | 1998-05-14 | 2004-11-02 | Ya Fang Liu | Method for identifying MLK inhibitors for the treatment of neurological conditions |
-
1999
- 1999-08-18 BR BR9913190-0A patent/BR9913190A/pt not_active Application Discontinuation
- 1999-08-18 TR TR2004/00635T patent/TR200400635T2/xx unknown
- 1999-08-18 CN CNB998101354A patent/CN1206535C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-08-18 WO PCT/US1999/018864 patent/WO2000013015A1/en active IP Right Grant
- 1999-08-18 AU AU56793/99A patent/AU765637B2/en not_active Ceased
- 1999-08-18 EA EA200500934A patent/EA200500934A1/ru unknown
- 1999-08-18 NZ NZ509612A patent/NZ509612A/en not_active IP Right Cessation
- 1999-08-18 PT PT99943759T patent/PT1105728E/pt unknown
- 1999-08-18 DK DK99943759T patent/DK1105728T3/da active
- 1999-08-18 ES ES99943759T patent/ES2241316T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-18 PL PL99346246A patent/PL346246A1/xx not_active Application Discontinuation
- 1999-08-18 CA CA002339539A patent/CA2339539A1/en not_active Abandoned
- 1999-08-18 CZ CZ2001701A patent/CZ2001701A3/cs unknown
- 1999-08-18 CN CNA2004100491086A patent/CN1589788A/zh active Pending
- 1999-08-18 HU HU0103079A patent/HUP0103079A3/hu unknown
- 1999-08-18 DE DE69924738T patent/DE69924738T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-18 EP EP99943759A patent/EP1105728B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-18 SK SK254-2001A patent/SK2542001A3/sk unknown
- 1999-08-18 JP JP2000567949A patent/JP2002523780A/ja active Pending
- 1999-08-18 CN CNA200610099703XA patent/CN1879617A/zh active Pending
- 1999-08-18 UA UA2001031963A patent/UA74772C2/uk unknown
- 1999-08-18 TR TR2001/00589T patent/TR200100589T2/xx unknown
- 1999-08-18 AT AT99943759T patent/ATE293254T1/de active
- 1999-08-18 EA EA200100278A patent/EA006648B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-08-18 KR KR1020017002385A patent/KR100700028B1/ko active IP Right Grant
-
2001
- 2001-01-23 NO NO20010389A patent/NO20010389L/no not_active Application Discontinuation
- 2001-01-30 ZA ZA2001/00835A patent/ZA200100835B/en unknown
- 2001-03-19 BG BG105360A patent/BG105360A/bg unknown
- 2001-11-23 HK HK01108292A patent/HK1037722A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
BG105360A (bg) | Модулиране на сложна линия киназни белтъци | |
Ge et al. | Glutaminolysis promotes collagen translation and stability via α-ketoglutarate–mediated mTOR activation and proline hydroxylation | |
JP4481493B2 (ja) | 架橋インデノピロロカルバゾール | |
PL212956B1 (pl) | Zastosowanie zwiazku o wzorze I lub II, zwiazek o wzorze II, oraz kompozycja farmaceutyczna zawierajaca zwiazek o wzorze II | |
KR101964954B1 (ko) | 뉴로트로핀 수용체의 효현제 및 약제로서의 이의 용도 | |
JP2010536367A5 (bg) | ||
Ding et al. | TROY signals through JAK1-STAT3 to promote glioblastoma cell migration and resistance | |
AU2001283179B2 (en) | Modulating multiple lineage kinase proteins | |
AU2001283179A1 (en) | Modulating multiple lineage kinase proteins | |
WO2019167973A1 (en) | Cell cycle progression inhibitor | |
MXPA01002020A (en) | Modulating multiple lineage kinase proteins | |
Lal et al. | Calmodulin-dependent cyclic nucleotide phosphodiesterase in human cerebral cortex and glioblastoma multiforme | |
CN114887064A (zh) | Aars1抑制剂在制备治疗或预防癌症的药物中的用途 | |
WO2005106473A1 (ja) | 神経変性疾患治療薬のスクリーニング方法 |