ES2237675T3

ES2237675T3 - Metodo para la inactivacion de la tse.

Info

Publication number: ES2237675T3
Application number: ES02726996T
Authority: ES
Inventors: Neil D.H. Health Protection Agency RAVEN
Original assignee: Health Protection Agency
Current assignee: Health Protection Agency
Priority date: 2001-01-08
Filing date: 2002-01-08
Publication date: 2005-08-01
Anticipated expiration: 2022-01-08
Also published as: AU2002219336C1; EP1577382A3; EP1360282B1; WO2002053723A3; AU2002219336B2; DE60203599T2; JP2004516845A; CA2434129A1; EP1360282A2; HK1057062A1; PT1360282E; WO2002053723A2; WO2002053723B1; EP1577382A2; JP4427587B2; ATE292679T1; DE60203599D1; JP4427252B2; JP2008174568A

Abstract

Un método para inactivar un agente de la encefalopatía espongiforme transmisible (TSE), que comprende exponer el agente de TSE a una enzima proteolítica termoestable a una temperatura en el intervalo de 50-120°C, en el que la enzima es térmicamente estable y biológicamente activa a una temperatura en el intervalo de 50-120°C.

Description

Método para la inactivación de la TSE.

El invento está en el campo de métodos y composiciones para la esterilización de materiales y aparatos que puedan haber estado contaminados con agentes infecciosos y para la detección de esos agentes. En particular, el invento se refiere a métodos para la inactivación y detección de agentes de la encefalopatía espongiforme transmisible (TSE; del inglés, transmissible spongiform encephalopathy) y proporciona composiciones para degradar y detectar la TSE localizada sobre, o dentro de, materiales infectados.

Las encefalopatías espongiformes transmisibles (TSEs) son un grupo de enfermedades neurológicas letales que incluyen la enfermedad de Creutzfeld-Jacob (CJD; del inglés, Creutzfeld-Jacob disease) y el kuru en seres humanos, la encefalopatía espongiforme bovina (BSE; del inglés, bovine spongiform encephalopathy) en el ganado vacuno y el escrapie en el ganado ovino. Las TSEs se caracterizan por la conversión de una proteína normal del huésped en una proteína patógena dentro del tejido cerebral de un animal infectado. A la forma patógena de la proteína se hace a menudo referencia como prión y es muy resistente a las degradaciones física y química. Se cree que el prión es el agente transmisor a través del cual la enfermedad TSE pasa de un animal a otro.

En los últimos años ha habido una considerable alarma pública en relación con los riesgos asociados al consumo de productos cárnicos, y especialmente de vaca, potencialmente infectados con BSE, la forma bovina de la TSE. Gran parte de este problema se asocia con la creencia de que, en algunos casos, el prión de la BSE, cuando es comido por un ser humano, puede causar la incurable forma humana de la enfermedad, a la que se hace referencia como variante de CJD (vCJD). Se han adoptado prácticas rigurosas en las industrias de transformación agrícolas y cárnicas para reducir el riesgo de contaminación cruzada entre los esqueletos infectados con BSE y la carne que se destina al consumo humano u otros productos de origen animal, tal como el sebo. Sin embargo, los animales infectados con BSE pueden aún ser involuntariamente procesados en los mataderos, especialmente si el animal está en las fases precoces de la enfermedad y, por lo tanto, no se detecta como un huesped de TSE infectado. Hay también un considerable riesgo en la eliminación de material infectado con BSE conocido, particularmente si el equipo usado en la operación de eliminación es luego reutilizado en prácticas de transformación normales sin una esterilización adecuada.

La esterilización de instrumentos y equipos después de una posible exposición a tejido infectado con TSE es de esencial importancia. En particular, un equipo quirúrgico tal como escalpelos, fórceps y endoscopios debería ser esterilizado a fondo antes de ser usado en pacientes para evitar la transmisión de la enfermedad.

Se ha comunicado que el agente infeccioso de la CJD fue accidentalmente transferido por electrodos quirúrgicos, insertados en el cerebro de un paciente humano con CJD, a otros dos pacientes previamente no infectados [Bernouli et al. (1.977), The Lancet 1: páginas 478-479]. Los electrodos implicados fueron esterilizados con vapor de etanol y formaldehído entre cada procedimiento, condiciones de las que se pensaba previamente que eran suficientes para eliminar casi todos los agentes infecciosos, y, sin embargo, el agente infeccioso de la CJD pudo resisitir dichas condiciones duras e infectar el tejido cerebral de pacientes receptores.

La transmisión de la TSE se observa típicamente en casos en que material infectado es transferido entre animales o implantado a un animal. Como se describió previamente, una esterilización incompleta o inadecuada de instrumentos quirúrgicos puede conducir a dicha transferencia de material infectado entre pacientes. Incluso los procedimientos de limpieza química y esterilización con vapor de agua más enérgicos pueden fallar a la hora de eliminar sangre y tejido de instrumentos quirúrgicos, especialmente en las mordazas o juntas de fórceps y pinzas de forcipresión [Laurenson (1.999), The Lancet, 20 de Noviembre]. Por lo tanto, el riesgo de transferencia involuntaria de TSE puede ser innecesariamente elevado.

Se sabe que los agentes de TSE, o priones, son muy resistentes a la desnaturalización y degradación, más de lo que podría esperarse normalmente para una proteína. Taylor [J. Hosp. Infect. (1.999), 43 (suplemento), páginas S69-76] revisa diversos métodos para inactivar proteínas priónicas.

Los métodos químicos para inactivar proteínas priónicas de TSE incluyen el tratamiento del material infectado con disoluciones de hidróxido sódico o hipoclorito sódico [Taylor et al. (1.994), Arch. Virol. 139, páginas 313-326], aunque se ha mostrado que la infectividad del prión sobrevive a una exposición de hasta dos horas a una disolución 2 M de hidróxido sódico.

Los métodos alternativos para inactivar priones de TSE incluyen el tratamiento en autoclave, pero, de nuevo, se ha mostrado que el agente de la BSE y el escrapie sobrevive a un tratamiento a 134-138ºC durante 18 minutos (Taylor et al., ibídem). De esta manera, se ha propuesto un procedimiento químico/térmico combinado mediante el que los materiales infectados son expuestos a una disolución 1 M de hidróxido sódico y son luego tratados en autoclave a 121ºC durante entre 30 y 60 minutos [Taylor, J. Hosp. Infect. (1.999), 43 (suplemento), páginas S69-76]. Este método combinado ha mostrado que puede lograse la inactivación de agentes infecciosos de la TSE, aunque bajo condiciones muy enérgicas.

Sin embargo, muchos materiales, tales como plásticos, polímeros y derivados animales no proteicos, no pueden ser expuestos a dichas condiciones extremas sin que ellos mismos resulten destruidos. Los procedimientos químicos y físicos anteriormente descritos sólo son realmente adecuados para esterilizar utensilios quirúrgicos e instrumentos de metal que no tengan un tamaño demasiado grande y que puedan meterse en un autoclave estándar. Los instrumentos más delicados, tal como endoscopios, no pueden ser expuestos a condiciones extremas de alta temperatura sin un riesgo de daño permanente a sus componentes internos.

Además, los procedimientos químicos implican típicamente el uso de agentes cáusticos y/o caotrópicos que son peligrosos de manejar y eliminar. Por lo tanto, sería deseable proporcionar un método para inactivar priones de TSE sin la necesidad de usar grandes cantidades de sustancias peligrosas y que pudiera ser aumentado de escala para usar sobre objetos y zonas más grandes así como sobre objetos más pequeños.

Taylor [Vet. J. (2.000) 159, páginas 10-17] describe ensayos en que se usan enzimas proteolíticas para desactivar proteínas priónicas. Proteasas tales como la tripsina ejercen poco efecto en condiciones no desnaturalizantes [Taylor (2.000), página 14], pero otras proteasas tales como la proteinasa K pueden ejercer un efecto sobre la infectividad de TSE después de periodos de digestión prolongados. Sin embargo, la mayoría de los métodos de inactivación de TSE actuales apuntan a procedimientos de degradación químicos y físicos.

En la Patente de EE.UU. nº 5.234.832 se describe el uso de una enzima proteolítica para limpiar y desinfectar instrumentos médicos.

En la Patente de EE.UU. nº 4.614.549 se describe el uso de una enzima proteolítica para limpiar y desinfectar lentes de contacto.

Por lo tanto, un objeto del invento es proporcionar métodos y medios para inactivar eficazmente agentes infecciosos de TSE bajo unas condiciones que puedan ser fácilmente aplicadas a una diversidad de lugares y situaciones. Un objeto más del invento es reducir la necesidad de condiciones extremas de temperatura muy elevada y agentes desnaturalizantes químicos enérgicos para inactivar agentes de TSE situados en, o dentro de, materiales infectados con TSE.

Un primer aspecto del invento proporciona un método para inactivar un agente de TSE, que comprende exponer el agente de TSE a una enzima proteolítica termoestable a una temperatura en el intervalo de 50-120ºC, en el que la enzima es térmicamente estable y biológicamente activa a una temperatura en el intervalo de 50-120ºC.

Los métodos y composiciones del invento son adecuados para la inactivación del agente de TSE en aparatos y materiales infectados, o de los que se sospecha que están infectados, con el agente de TSE. Además, los métodos y composiciones del invento se usan adecuadamente de un modo profiláctico o preventivo, cuando no se tiene un conocimiento claro de infección. Por ejemplo, el método del invento puede ser fácilmente incorporado a los protocolos de esterilización estándares usados para la preparación de aparatos quirúrgicos antes de su uso en procedimientos quirúrgicos.

Los métodos y composiciones del presente invento son también adecuadamente usados para la inactivación de agentes de TSE en residuos clínicos y material animal desechado potencialmente contaminados. En la actualidad, este material residual es incinerado a 1.000ºC, lo que requiere instalaciones especializadas y resulta caro. Una ventaja del presente invento es que puede llevarse a cabo un procedimiento de inactivación de TSE a temperaturas y en condiciones que no requieren instalaciones muy especializadas, y que las perspectivas de inactivación completa del agente de TSE son comparables a las de los procedimientos de incineración más costosos y energéticamente intensivos.

Con la expresión "agente de la encefalopatía espongiforme transmisible (TSE)" se pretende abarcar todas las enfermedades neurológicas que se transmiten aparentemente a través de una proteína priónica (PrP) patógena intermedia. Dichas TSEs incluyen típicamente las enfermedades humanas: enfermedad de Creutzfeld-Jacob (CJD), variante de la enfermedad de Creutzfeld-Jacob (vCJD), kuru, insomnio familiar letal y síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker. Las TSEs no humanas incluyen la encefalopatía espongiforme bovina (BSE), el escrapie, la encefalopatía espongiforme felina, la enfermedad de emaciación crónica y la encefalopatía transmisible del visón. Dado que actualmente se entiende que la vCJD es una forma humana de la BSE, resulta evidente que ciertos agentes de TSE son capaces de cruzar la barrera entre especies y que, en el futuro, podrían hacerse evidentes nuevas TSEs procedentes de fuentes no bovinas.

La enzima proteolítica del invento es típicamente una proteasa, pero puede ser adecuadamente cualquier molécula polímera biológica capaz de catalizar la escisión de una cadena polipeptídica.

Una característica del invento es que la enzima proteolítica es una enzima termoestable, es decir, que presenta una actividad biológica óptima a temperaturas superiores a la temperatura normal de 37ºC del cuerpo de los mamíferos. En realizaciones del invento, la enzima es térmicamente estable y biológicamente activa, y la inactivación se lleva a cabo a temperaturas en el intervalo de 50ºC a 120ºC y, más preferiblemente, cuando la temperatura es entre 55ºC y 85ºC. En una realización específica del invento, la temperatura es aproximadamente 60ºC. En otra realización específica, la temperatura es aproximadamente 80ºC.

Las enzimas proteolíticas termoestables adecuadas para uso en los métodos y composiciones del invento son obtenibles de diversas fuentes, tales como bacterias termófilas y arqueas. En una realización del presente invento, la enzima proteolítica termoestable es aislada de bacterias termófilas, bacterias hipertermófilas y arqueas. Los organismos adecuados para la extracción de enzimas proteolíticas para uso en el invento incluyen Thermotoga maritima, Thermotoga neopolitana, Thermotoga thermarum, Fervidobacterium islandicum, Fervidobacterium nodosum, Fervidobacterium pennivorans, Thermosipho africanus, Aeropyrum pernix, Thermus flavus, especies de Pyrococcus, Sulfolobus solfataricus, Desulfurococcus, Bacillus thermoproteolyticus, Bacillus stearo-thermophilus, Bacillus especie 11231, Bacillus especie 11276, Bacillus especie 11652, Bacillus especie 12031, Thermus aquaticus, Thermus caldophilus, Thermus especie 16132, Thermus especie 15673 y Thermus especie Rt41A.

Los susodichos organismos no son las únicas fuentes de proteasas termoestables. En realidad, ciertos organismos que no son considerados realmente termófilos pueden también expresar enzimas proteolíticas termoestables. Dichos organismos son comúnmente denominados termodurables ya que, aunque no eligen vivir en condiciones de alta temperatura, pueden resistir altas temperaturas durante periodos limitados. Diversas especies de Bacillus entran en la categoría de termodurabilidad, y de ellas se sabe que producen proteasas termoestables del tipo subtilisina.

El pH en que se lleva a cabo la inactivación puede variar de ácido a alcalino, pero está típicamente en la región de 8-13, preferiblemente es superior a 9 y más preferiblemente está próximo a 12. Similarmente, la proteasa termoestable es activa en un intervalo de pH de ácido a alcalino, pero típicamente es óptimamente activa en la región de pH de 8-13, y el pH es preferiblemente superior a 9 y más preferiblemente próximo a 12.

En un ejemplo del invento en uso, la enzima proteolítica es extraída de un cultivo de las bacterias termófilas o las arqueas. El cultivo es adecuadamente mantenido bajo las condiciones óptimas para el organismo, típicamente en un biorreactor. De esta manera puede mantenerse una fuente continua del organismo, lo que permite obtener enzima proteolítica siempre que se necesite.

Alternativamente, en un ejemplo del invento en uso que se describe con mayor detalle más adelante, el gen que codifica una enzima proteolítica termoestable es aislado del organismo fuente, Bacillus thermoproteolyticus. El gen se utiliza para generar una construcción de expresión recombinante, típicamente un plásmido, que transforma un organismo huésped, Escherichia coli. La E. coli transformada es cultivada en un biorreactor y, cuando se alcanza una densidad celular apropiada, se inicia la expresión de la construcción plasmídica y se recoge la enzima proteolítica usando métodos estándares. La ruta de expresión recombinante permite la producción del producto, la enzima proteolítica, bajo condiciones de temperatura menos extremas que las que se requerirían para el organismo fuente original.

La ruta recombinante es además ventajosa ya que permite la manipulación genética de genes recombinantes de proteasas termoestables con objeto de aumentar la estabilidad térmica o la actividad biológica, o para algún otro fin. De esta manera, la actividad de una enzima proteolítica termoestable puede ser rápidamente optimizada para uso en los métodos y composiciones del invento.

En un segundo aspecto del invento se usa el método para esterilizar un aparato, que comprende la operación de exponer el aparato a una disolución que comprende una enzima proteolítica termoestable.

Se entiende comúnmente que el término "esterilización" significa el procedimiento mediante el cual se eliminan o destruyen organismos vivos de un sustrato, tal como una pieza de un equipo o una disolución. En el caso presente, no se considera técnicamente que el agente de TSE, o prión, sea un organismo vivo, en el sentido en que lo es una bacteria o un virus, porque aparentemente no contiene material genético alguno. Sin embargo, la transmisión del agente patógeno de TSE entre animales origina una enfermedad. Por lo tanto, como se usa aquí, el término "esterilización" se aplica al procedimiento mediante el cual tanto agentes patógenos (tales como agentes de TSE) como organismos vivos dejan de ser infectivos o se eliminan o destruyen de un sustrato.

En una realización preferida, el método del invento comprende mantener la disolución esterilizante a una temperatura inferior a 100ºC, preferiblemente de al menos 45ºC y más preferiblemente de entre 45ºC y 85ºC. El pH de la disolución esterilizante puede variar de ácido a alcalino, pero está típicamente en la región de 8-13, es al menos 9 y, más preferiblemente, está próximo a 12. Similarmente, la proteasa termoestable es activa en un intervalo de pH de ácido a alcalino, pero típicamente es óptimamente activa en la región de pH de 8-13, y el pH es al menos 9 y, más preferiblemente, próximo a 12.

En realizaciones específicas del invento, la disolución esterilizante se aplica al aparato en forma de pulverización. La ventaja de este modo de aplicación es que pueden tratarse áreas superficiales más grandes del aparato, mesas de trabajo o incluso paredes de habitaciones (por ejemplo, en mataderos) con la disolución esterilizante del invento. Típicamente, la disolución será calentada a una temperatura óptima, por ejemplo, de entre 60ºC y 80ºC, antes de ser pulverizada sobre la superficie que se va a esterilizar, superficie que es opcionalmente calentada de antemano.

Alternativamente, el aparato es sumergido en la disolución esterilizante durante un periodo de tiempo predeterminado. De nuevo, la temperatura de la disolución es típicamente optimizada antes de la inmersión del aparato contaminado. Es opcional la inclusión de medios de ultrasonicación en el baño de inmersión para permitir que tenga lugar una limpieza ultrasónica al mismo tiempo que el tratamiento con la disolución esterilizante del invento.

En un tercer aspecto, el invento proporciona un método para esterilizar material, que comprende exponer dicho material a una primera disolución que comprende una enzima proteolítica termoestable y luego exponer el aparato a al menos una segunda disolución que comprende una segunda enzima proteolítica termoestable. En uso, el material es típicamente un aparato, un equipo quirúrgico o de transformación cárnica, o residuos biológicos infectados con TSE.

Al dividir el método de esterilización en al menos dos, y opcionalmente más, operaciones sucesivas, las condiciones de cada operación pueden ser optimizadas para asegurar la máxima inactivación de todo agente de TSE presente. De esta manera, las temperaturas y/o pHs de las operaciones sucesivas pueden ser diferentes. En realizaciones específicas del invento, las enzimas proteolíticas de las disoluciones primera y segunda (y opcionalmente más) son iguales o son diferentes.

En un cuarto aspecto, en el invento se usa una composición para inactivar un agente de TSE, que comprende una enzima proteolítica termoestable.

Típicamente, la composición del invento comprende además un agente tampón. En una realización específica del invento, el agente tampón tiene un pK_{a} de entre 8 y 13. Los tampones alcalinos adecuados para uso en el método del invento incluyen el ácido 4-ciclohexilamino-1-butanosulfónico (CABS), que tiene un pK_{a} de 10,7 a 25ºC, y el ácido 3-ciclohexilamino-1-propanosulfónico (CAPS), que tiene un pK_{a} de 10,4 a 25ºC.

Alternativamente, la composición comprende suficiente hidróxido sódico u otro agente alcalino para ajustar el pH de la composición a un valor alcalino, preferiblemente a al menos 9 y más preferiblemente próximo a 12. La adición de una disolución 1 M de hidróxido sódico a la composición del invento, utilizando una sonda de pH calibrada usando patrones Universal, es generalmente suficiente para fijar el pH de la composición en aproximadamente 12.

Otros aspectos del invento proporcionan usos de las susodichas composiciones para la inactivación de agentes de TSE.

Una ventaja del invento es su uso en la degradación de agentes de TSE y agentes similares, y, en la aplicación de realizaciones concretas del invento, se ha hallado que el material contaminado con TSE es exitosamente descontaminado al usar una combinación de temperatura elevada, de aproximadamente 50ºC a 70ºC, y pH alcalino, de aproximadamente 9 a 12, con una enzima proteolítica alcalófila y termoestable. Aunque de vez en cuando es posible conseguir cierta descontaminación sólo mediante una temperatura muy elevada, es significativamente beneficioso el poder inactivar la TSE mientras se evitan condiciones extremas, tales como temperaturas extremas, que conducen a daños al equipo que se está descontaminando.

El invento también proporciona la eliminación del dímero usando una degradación con proteasas que es opcionalmente potenciada mediante condiciones ambientales [temperatura elevada, pHs extremos y/o uso de detergentes (por ejemplo, dodecilsulfato sódico)]. Así como se usan tratamientos con una sola enzima, pueden usarse combinaciones de proteasas y/o otras enzimas. Por ejemplo, puede alcanzarse una mejor degradación del agente infectivo mediante la adición de lipasas, peptidasas, glicosilasas, nucleasas y otras enzimas.

Para confirmar la eliminación del dímero, puede usarse un anticuerpo que presente reactividad cruzada con el dímero junto con un sistema de detección adecuado, del que un ejemplo es un sensible sistema de detección in vitro actualmente asequible de Invitrogen, al que se hace referencia como Western Breeze, para confirmar la eliminación antes de ulteriores bioensayos en ratón.

En un ejemplo posterior, usando el sistema de detección por transferencia Western, el monómero es aparentemente eliminado completamente mediante digestión con proteasa. Sin embargo, bajo estas condiciones, muestras que fueron posteriormente usadas in vivo no evitaron la infección y pudieron incluso haber potenciado su inicio. Por lo tanto, debe haber otra fuente de infección distinta al monómero. Puesto que el monómero puede ser eliminado (o, en el peor de los casos, puede reducirse drásticamente su concentración), esto indica un papel esencial del dímero, sea solo o sea en combinación con el monómero, en la infectividad.

Los métodos y las composiciones de realizaciones específicas del invento se describen con mayor detalle más adelante y se ilustran mediante los dibujos adjuntos, en los que:

La figura 1 muestra el efecto de la temperatura sobre una digestión de producto de homogeneización de cerebro de ratón (mbh; del inglés, mouse brain homogenate) con proteasa M;

La figura 2 muestra el efecto del pH sobre una digestión de mbh con proteasa M;

La figura 3 muestra una digestión de mbh por Bacillus thermoproteolyticus Rokko;

La figura 4 muestra el efecto del dodecilsulfato sódico (SDS; del inglés, sodium dodecylsulfate) sobre una digestión de mbh por Rokko;

La figura 5 muestra una electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE; del inglés, polyacrylamide gel electro-
phoresis)-SDS, de mbh;

La figura 6 muestra una inmunotransferencia de mbh;

La figura 7 muestra una digestión de mbh con proteasas G, R y C;

La figura 8 muestra una inmunotransferencia de la digestión de la figura 7; y

Las figuras 9 a 12 muestran transferencias de producto de homogeneización de cerebro de ratón infectado con BSE (301V), para ilustrar la correlación de la infectividad con dímero priónico, como se explica adicionalmente en los ejemplos siguientes:

Ejemplos Colonia de ratones VM e incubación con agente de BSE (301V)

El estudio sobre la inactivación del agente de TSE, cepa de BSE (301V), requirió el establecimiento de una colonia de reproducción de ratones para la generación de producto de homogeneización de cerebro (mbh) tanto infeccioso como no infeccioso y sus subsiguientes titulación y bioensayo. La raza de ratón VM seleccionada para uso en el estudio fue obtenida del Dr. David Taylor (Institute of Animal Health, Edinburgo, Gran Bretaña). Se introdujeron seis parejas en un cuarto específico situado dentro de una instalación para animales. Se examinaron los ratones en cuanto a su estado de salud y se inició un programa de reproducción.

Se preparó cerebro de ratón infeccioso para BSE (301V) (IAH, Edinburgo, Gran Bretaña), para inoculación, mediante homogeneización del producto crudo seguida del paso continuo, arriba y abajo, de los cerebros a través de agujas de calibre cada vez más fino (de 21G-27G) y cierre Luer, entre una jeringa de seguridad soportada y un vial cerrado y rematado con un septo. Este procedimiento fue llevado a cabo en una cámara de seguridad validada situada dentro de un laboratorio con nivel 3 de confinamiento (CL3; del inglés, containment level 3), inmediatamente antes de la inoculación intracerebral a los ratones VM. Se inocularon intracerebralmente 20 \mul de la preparación de producto de homogeneización de cerebro de ratón, por medio de agujas de calibre 26, a los ratones anestesiados (alfadolona/alfaxalona). Cuarenta y nueve de cincuenta ratones sobrevivieron a este procedimiento. Estos fueron retenidos para permitir la incubación del agente y la generación de la necesaria cantidad de material infeccioso de alto título.

Producción de biomasa

Se escogió una gran variedad de organismos para la producción de biomasa con objeto de conseguir una selección de enzimas proteolíticas termoestables lo más amplia posible. Los organismos seleccionados variaban entre aquellos que se desarrollaban óptimamente a temperaturas moderadamente termófilas (50ºC) y aquellos que lo hacían a temperaturas sumamente termófilas (100ºC), e incluían miembros tanto del dominio Arquea como del dominio Bacteria. Se seleccionaron también organismos termófilos para cubrir una gran variedad de pHs de crecimiento, que abarcaba pHs óptimos de 2,5 a 11,5. La mayoría de los organismos se desarrollaron en cultivo discontinuo; sin embargo, se usó cultivo continuo cuando los requisitos de desarrollo del organismo eran particularmente delicados [Raven y Sharp (1.997), Applied Microbial Physiology: A Practical Approach, Capítulo 2, compilado por Stanbury y Rhodes, OUP, páginas 23-52]. Dependiendo de la producción de biomasa del organismo que se desarrollaba, se emplearon volúmenes de cultivo discontinuo de entre 20 l y 120 l para conseguir la cantidad deseada de pasta celular. En el sistema de cultivo continuo se utilizaba un biorreactor con elevación de gas y un volumen de trabajo de 2 ó 5 l, hecho totalmente de vidrio y PTFE. Los organismos más prolíficos, tales como especies de Bacillus y especies de Thermus, fueron previamente explorados para seleccionar aquellos con niveles elevados de actividad proteasa antes de su cultivo a mayor escala. Con este fin, para permitir una exploración de alta eficacia, se adoptó un ensayo fluorométrico rápido y sensible para proteasas en que se utilizaban placas de microtitulación (EnzChek™, Molecular Probes, Leiden, Holanda).

La biomasa de cultivo fue recogida por centrifugación continua (Contifuge Stratos™, Kendro Laboratory Products, Bishop Stortford, Reino Unido) y fue guardada a -80ºC. Los sobrenadantes de cultivo fueron concentrados mediante un filtro de flujo tangencial que tenía un corte de exclusión de 10 kDa (filtración Pall, Portsmouth, Reino Unido). Las proteínas fueron precipitadas con sulfato amónico (saturación al 90%) y fueron guardadas a -80ºC.

Purificación de proteínas

Se requería una rápida técnica de exploración y purificación de proteasas para procesar todas las preparaciones proteicas crudas después de la fase de producción de biomasa. Para este fin se utilizó un sistema de cromatografía de afinidad de colorante-ligando (PIKSI M™, Affinity Chromatography Ltd., Isla de Man, Reino Unido). Inicialmente, cada precipitado crudo en sulfato amónico fue disuelto en tampón y hecho pasar a través de una columna de desalación. Cada muestra fue luego cargada en el sistema de ensayo PIKSI M, que contenía 10 diferentes ligandos de afinidad. Las fracciones fueron luego analizadas en cuanto a actividad proteasa para determinar la matriz más adecuada para la purificación de la proteasa, fuera por unión positiva de la molécula diana y luego elución o fuera por unión negativa de contaminantes. Luego se aumentó la escala de la purificación usando la misma matriz de afinidad junto con un sistema de cromatografía rápida de proteínas en fase líquida (Amersham-Pharmacia Biotech, Amersham, Reino Unido). Al combinar esta técnica con el ensayo fluorométrico de proteasas, pudo emprenderse la exploración rápida de muchas fracciones.

En el ensayo fluorométrico de proteasas se utilizan derivados de caseína que son intensamente marcados con BODIPY FL fluorescente verde, en el que la fluorescencia de los productos de conjugación está casi totalmente sofocada. La hidrólisis catalizada por proteasas libera el marcador muy fluorescente, y la fluorescencia resultante puede medirse mediante un aparato lector fluorométrico de microplacas (Labsystems Fluoroscan II™). El aumento de fluorescencia es proporcional a la actividad proteasa y se compara con el de una proteasa patrón (Proteasa X, Sigma-Aldrich, Poole, Reino Unido).

Caracterización de proteasas

Se analizó una diversidad de proteasas termoestables (véase la Tabla 1). Se llevó a cabo una caracterización directa de la actividad usando el más próximo producto no infeccioso análogo al producto de homogeneización de cerebro de ratón infeccioso para BSE (301V), asequible como sustrato, es decir, producto de homogeneización de cerebro de ratón VM normal. Las digestiones iniciales del producto de homogeneización de cerebro de ratón (mbh) total no infectado se llevaron a cabo durante treinta minutos a 60ºC y un pH de 7,0. Las muestras fueron luego sometidas a ebullición bajo condiciones reductoras y fueron analizadas por SDS-PAGE en geles premoldeados NuPage 4-12% Bis-Tris (Novex™, San Diego, EE.UU.). Los geles fueron fijados utilizando procedimientos estándares y las proteínas fueron visualizadas usando el sistema de tinción azul coloidal Novex. Los resultados mostraron tanto los niveles de actividad de las proteasas frente al sustrato mbh bajo estas condiciones como el nivel de pureza de las proteasas individuales. Las concentraciones de proteasa usadas en los ensayos se basaban en la concentración total de proteína; por lo tanto, se observó una gran variedad de actividades, desde digestión limitada hasta completa.

Luego se obtuvieron para cada enzima los perfiles de actividad que muestran el efecto completo del pH y la temperatura sobre la digestión del mbh. Varias enzimas mostraron una amplia actividad a lo largo del intervalo completo de condiciones (pH de 2-12, y 50-100ºC). Sin embargo, en general, la digestión completa del mbh sólo se alcanzó a lo largo de un intervalo más estrecho, indicativo del pH y la temperatura óptimos de las enzimas. Las figuras 1 y 2 muestran los perfiles de actividad de una proteasa de muestra, la proteasa M de Bacillus. Como puede verse, la enzima es moderadamente termófila y proporciona la digestión completa a temperaturas de hasta 70ºC. Similarmente, el perfil de pH indica una preferencia por condiciones neutras o alcalinas.

Ensayo de proteasas

Diversas enzimas no proporcionaron la digestión completa de mbh ni siquiera cuando los tiempos de incubación se aumentaron a 24 horas. Esto puede haber sido debido simplemente a una baja actividad proteasa; sin embargo, incluso diversas enzimas muy purificadas y concentradas sólo produjeron digestiones parciales. En estas reacciones, parecía que tenía lugar poca interacción de enzima-sustrato. Se consideró que esto podía ser debido a un material no proteico, por ejemplo, lípidos, que rodeara el sustrato y evitara la interacción; sin embargo, un pretratamiento con lipasas y otras enzimas no produjo efecto observable alguno (datos no mostrados). Una segunda posibilidad considerada fue el efecto de cargas superficiales repulsivas entre las proteasas y el sustrato. En particular, una enzima purificada de Bacillus thermoproteolyticus Rokko produjo inequívocamente una escasa digestión de mbh incluso en concentraciones elevadas. Se supo que esta enzima permanecía activa en presencia de elevados niveles de detergentes; por lo tanto, se llevaron las digestiones a cabo con la adición de SDS en un intento para solventar este efecto. Las figuras 3 y 4 muestran digestiones de mbh por B. thermoproteolyticus Rokko en ausencia y presencia de SDS. La figura 3 indica claramente que, bajo condiciones estándares, hay poca diferencia en la digestión incluso cuando la concentración de proteasa se aumenta a 20 mg\cdotml^{-1}. Tras la adición de SDS (carriles 2-5), no son visibles bandas de proteínas, salvo la de la propia proteasa, que indiquen una digestión completa. Por lo tanto, las proteasas ensayadas pudieron ser simplemente divididas en tres categorías: (i) aquéllas capaces de proporcionar la digestión total de mbh en ausencia de detergente, (ii) aquéllas capaces de proporcionar la digestión total de mbh en presencia de SDS, y (iii) aquéllas incapaces de digerir totalmente el sustrato. Se seleccionaron las proteasas de las categorías (i) y (ii) para un inmediato estudio más, mientras que se rechazaron las de la categoría (iii) o se supuso que se requerían en mayor cantidad y/o mayor pureza.

Transferencia Western de producto de homogeneización de cerebro de ratón

Las proteínas de mbh fueron transferidas a nitrocelulosa y fueron bloqueadas durante la noche en disolución salina tamponada con fosfato (PBS; del inglés, phosphate buffered saline)-Tween (PBST) + polvo de leche desnatada al 3%. La membrana fue lavada (x3 en PBST) y fue incubada durante 1 hora con anticuerpo monoclonal 6H4 anti-PrP recombinante humana (Prionics, Zurich, Suiza). Después de una segunda operación de lavado, se añadió el producto de conjugación de anti-ratón y peróxidasa de rábano picante (HRP; del inglés, horseradish peroxidase) y se incubó la membrana durante 1 hora. Se repitió el lavado y se visualizó la reacción del anticuerpo mediante la adición de tetrametilbencidina (TMB) [Harlow y Lane (1.988), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press].

Las figuras 5 y 6 muestran una SDS-PAGE y una inmunotransferencia, respectivamente, de mbh no digerido. Aunque hay cierto fondo inespecífico, en el esperado peso molecular (\sim 33-35 kDa) pueden verse claramente bandas oscuras que indican la presencia de prión de ratón. Son también visibles bandas definidas a \sim 66-70 kDa, que pueden corresponder a dímeros priónicos previamente descritos [Safar et al. (1.990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, páginas 6.373-6.377].

Se usaron la transferencia Western y la inmunotransferencia para confirmar que no quedaba fragmento inmunorreactivo alguno de PrP^{C} de ratón después de la digestión. La figura 7 muestra mbh digerido hasta la compleción con tres enzimas proteolíticas termoestables estrechamente relacionadas (Proteasas G, R y C), según se valoró por SDS-PAGE. En la inmunotrasferencia correspondiente (figura 8), sólo son visibles 2 bandas, ambas con un peso molecular aparente de \sim 23 kDa. La banda intensa del carril 9 corresponde a PrP recombinante de ratón (testigo positivo), mientras que parece que la banda débil del carril 4 es debida a una ligera reacción con la preparación enzimática muy cargada. En este caso, es aún evidente la completa pérdida de inmunorreactividad hacia PrP^{C} ya que no es observable banda alguna en el carril 3.

Preparación y titulación de producto de homogeneización de cerebro de ratón infeccioso

A partir del octogésimo día después de la estimulación, los ratones fueron sometidos a una calificación clínica diaria para detectar los ratones clínicamente afectados lo más pronto posible. Un solo ratón murió por causa desconocida antes de este periodo. Los restantes presentaban el esperado progreso de la enfermedad y fueron sacrificados entre 110 y 130 días después de la estimulación. Se extrajeron asépticamente los cerebros y se guardaron congelados hasta ser requeridos. Se homogeneizaron cuarenta y ocho cerebros de ratón VM infecciosos para BSE (301V) en cuatro volúmenes de PBS dentro de un homogeneizador soportado y luego se hicieron pasar sucesivamente a través de agujas de calibre cada vez más fino (21G a 26G) hasta fluencia libre. Se preparó una muestra con una dilución adicional al doble (cerebro de ratón:PBS = 1:9) para la titulación de la infectividad. Se prepararon más de 800x0,1 ml partes alícuotas de producto de homogeneización de cerebro de ratón infeccioso para BSE (301V). Estos procedimientos fueron de nuevo llevados a cabo bajo riguroso confinamiento de clase III, incluyendo el llevar respiradores de presión positiva.

Grupos de 25 ratones VM de ocho semanas de edad recibieron dosis de titulación de la preparación de producto de homogeneización de cerebro de ratón infeccioso en diluciones al décuplo, de 10^{-1} a 10^{-8}. Otro grupo de 25 ratones fue estimulado con producto de homogeneización de cerebro de ratón no infeccioso, como un testigo. Todos los ratones fueron inoculados bajo anestesia utilizando agujas de 26Gx0,95 cm con manguitos de plástico de protección cortados 2 mm por debajo del bisel, en una cámara de Clase 2 con el uso de una protección para inyecciones. Luego se dejó que los ratones incubaran el agente de BSE (301V) durante periodos prolongados, algo superiores a un año. El título inicial de la preparación de producto de homogeneización de cerebro de ratón infeccioso fue establecido retrospectivamente una vez que se completaron todas las incubaciones (verificación clínica a partir del octogésimo día en adelante).

Detección del dímero en cerebro digerido de ratón

Se sometió producto de homogeneización de cerebro de ratón infectado con BSE (301V) a digestión con proteasa a pH neutro y 60ºC durante 30 minutos. Los productos de digestión proteica totales fueron desarrollados en SDS-PAGE y transferidos a membranas de nitrocelulosa por transferencia Western. Las membranas fueron cortadas en tiras y fueron sondadas con anticuerpos CAMR anti-prión (producidos en conejos). Se conjugó un segundo anticuerpo genérico (anti-conejo, de cabra) con peroxidasa de rábano picante y se usó con detección mediante el sustrato colorimétrico TMB.

En el momento, el resultado esperado era que los resultados fueran iguales que los de la transferencia testigo (número 7), en que se utiliza el anticuerpo monoclonal 6H4 anti-prión (de Prionics, Suiza). En esta transferencia testigo, se ve el típico patrón de tres bandas (estados de glicosilación) para la proteína priónica de conformación infecciosa y digerida con proteasa (PrP^{Sc}).

Sin embargo, las transferencias de este ejemplo no mostraron este patrón. En la transferencia 1 se usa un anticuerpo policlonal generado contra un péptido, conjugado con PPD, que corresponde a una región N-terminal de la molécula priónica. No se ve nada en los carriles. Esta sección de la proteína es susceptible de proteolisis, por lo que no es sorprendente no ver nada en los carriles (2 y 3); véase la figura 9, transferencia 1 del lado izquierdo. El carril 1 es un marcador de pesos moleculares.

La transferencia 2 tiene un segundo anticuerpo generado contra una secuencia peptídica más de la molécula priónica. Ésta muestra al menos 9 bandas de intensidad variable, aproximadamente equidistantes, con un peso molecular que corresponde al de un dímero priónico con diversos estados de glicosilación; véase la transferencia 2 de la figura 9.

El anticuerpo de la transferencia 3 muestra un perfil similar. También se muestra la transferencia 4, pero sus resultados son de una calidad demasiado baja para sacar conclusiones; véanse las transferencias 3 y 4 de la figura 9.

Las transferencias 5 y 6, mostradas en la figura 10 con la transferencia testigo 7, muestran de nuevo el patrón de múltiples bandas.

Detección del dímero en cerebro digerido de ratón

Se repitió el ejemplo anterior y se muestran los resultados en las figuras 11 y 12.

La transferencia 1 muestra marcadores de pesos moleculares en los carriles 1 y 5. El carril 2 es PrP murina recombinante que muestra oligómeros de PrP murina recombinante. El carril 3 muestra falta de respuesta de anticuerpos al producto de homogeneización de cerebro de ratón infeccioso, digerido con proteasa. El carril 4 es la respuesta de anticuerpos en el testigo no digerido.

La transferencia 2 es como antes, pero muestra el patrón de formación de bandas previo en la muestra digerida con proteasa.

La transferencia 3 muestra la respuesta del anticuerpo 3. Aquí hay cierta respuesta a la PrP murina recombinante (carril 2). El carril 3 muestra no sólo el patrón de formación de múltiples bandas (PrP dímero) sino también cierta respuesta a PrP monómera.

La transferencia 7 es el testigo de anticuerpo monoclonal 6H4. Aquí hay una buena detección de oligómeros de PrP murina recombinante (carril 2). El carril 3 muestra la forma muy diglicosilada de PrP^{Sc} limitadamente tratada con proteasa, más las más secundarias formas monoglicosilada y no glicosilada típicas de la cepa de BSE (301V). Es evidente que no hay detección de "dímero".

Preparación de anticuerpos que incluyen anticuerpo preferente del dímero

En los ejemplos, se usaron 6 anticuerpos policlonales. De estos, tres sólo detectan el dímero y no se unen al monómero, mientras que uno reacciona cruzadamente tanto con el monómero como con el dímero.

Los sueros policlonales se produjeron por inmunización de conejos con péptidos sintetizados imitativos de prión. Estos péptidos se crearon basándose en regiones de alta homología entre secuencias de aminoácidos de proteínas priónicas de ser humano, ratón y bovino.

Las secuencias que produjeron los anticuerpos reactivos con el dímero eran las siguientes:

: CGGWGQPHGGC (Péptido 2)

: CGGYMLGSAMSRPIIHFGNDYEC (Péptido 3)

: CVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDC (Péptido 5)

: CITQYQRESQAYYQRGASC (Péptido 6)

Los péptidos fueron sintetizados con una cisteína en ambos extremos (véase más atrás) y con una cisteína en un solo extremo. Este método fue usado con objeto de presentar tanto la forma lineal como una estructura en bucle del antígeno sobre la superficie de la proteína portadora.

Los péptidos fueron sintetizados comercialmente y fueron copulados a la proteína portadora PPD (derivado proteico purificado; del inglés, purified protein derivative), procedente de una cepa atenuada de la bacteria Mycobacterium bovis, que está liofilizada y se usa para conjugar al péptido por medio de un conector.

Se produjeron anticuerpos policlonales anti-prión del modo siguiente:

Se recogió una muestra de suero preinmune (\sim 1 ml) de cada conejo de un grupo de conejos Dutch.

Se inyectó vacuna del bacilo de Calmette-Guerin (BCG) para uso intradérmico, liofilizada y reconstituida, a los conejos. Se administró una dosis de 0,1 ml de vacuna BCG reconstituida en dos sitios del cogote del conejo.

Después de 4 semanas, se pesaron 0,6 mg de cada producto de conjugación de péptido-PPD (0,3 mg de cada una de las versiones con 1 cisteína y 2 cisteínas) y se disolvieron en 1 ml de disolución salina estéril al 0,9%.

Se añadió un volumen igual de adyuvante incompleto de Freund y se inyectaron intramuscularmente partes alícuotas de 0,75 ml de la emulsión resultante en cada pata trasera y partes alícuotas de 0,25 ml en dos sitios del cogote por conejo.

Después de 4 semanas, se administró una inyección de refuerzo que comprendía los productos de conjugación de péptido-PPD preparados como en las operaciones 3 y 4. Las inyecciones de refuerzo consistían en cuatro inyecciones de 0,25 ml en el cogote de cada conejo.

7-14 días después de las primeras inyecciones de refuerzo, se realizaron extracciones de ensayo de 4 ml de sangre y se evaluó el título de anticuerpos de los sueros mediante un ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA; del inglés, enzyme-linked immunosorption assay).

Se administró una segunda inyección de refuerzo 4-6 semanas después de la primera.

Se administró una tercera inyección de refuerzo 4-6 semanas más tarde.

Se realizó una extracción de ensayo de 4 ml de sangre 6-8 semanas después de la tercera inyección de refuerzo y se determinó el título de anticuerpos por ELISA.

Se administró una cuarta inyección de refuerzo.

Se realizó una extracción de ensayo de 4 ml de sangre 7-14 días después de la cuarta inyección de refuerzo y se determinó el título de anticuerpos por ELISA.

Se llevó a cabo un drenaje sanguíneo terminal y se recogió la sangre. El suero fue separado por centrifugación y fue guardado a -20ºC.

El análisis del título de anticuerpos se llevó a cabo usando un ELISA. La placa del inmunoensayo fue revestida con los mismos péptidos conjugados con una diferente proteína portadora (KLH) con objeto de diferenciar la respuesta al péptido de la respuesta a la proteína portadora.

Tres de los anticuerpos producidos por inmunización con las secuencias peptídicas sintéticas descritas se unen preferentemente a la forma dímera de la molécula.

Pueden usarse también operaciones análogas para preparar un anticuerpo monoclonal. Esto podría lograrse usando un método tal como el descrito en Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow y David Lane, 1.988 (Cold Spring Harbor Laboratory).

El invento proporciona así la detección y degradación de la infectividad de la TSE.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

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1

<110> Autoridad de Investigación Microbiológica Raven, Neil

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<120> DEGRADACIÓN Y DETECCIÓN DE INFECTIVIDAD DE TSE

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<130> GWS/22516

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<150> GB 0104696.0

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<151> 26-02-2001

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<150> GB 0100420.9

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<151> 08-01-2001

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<160> 4

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<170> PatentIn, versión 3.1

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<210> 1

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<211> 11

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<212> PRT

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<213> sintético

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<400> 1

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\sa{Cys Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Cys}

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<210> 2

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<211> 23

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<212> PRT

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<213> sintético

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<400> 2

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\sa{Cys Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Ile Ile His Phe Gly Asn}

\sac{Asp Tyr Glu Cys}

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<210> 3

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<211> 25

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<212> PRT

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<213> sintético

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<400> 3

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\sa{Cys Val Asn Ile Thr Ile Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn}

\sac{Phe Thr Glu Thr Asp Cys}

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<210> 4

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> sintético

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<400> 4

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\sa{Cys Ile Thr Gln Tyr Gln Arg Glu Ser Gln Ala Tyr Tyr Gln Arg Gly Ala Ser Cys}

Claims

1. Un método para inactivar un agente de la encefalopatía espongiforme transmisible (TSE), que comprende exponer el agente de TSE a una enzima proteolítica termoestable a una temperatura en el intervalo de 50-120ºC, en el que la enzima es térmicamente estable y biológicamente activa a una temperatura en el intervalo de 50-120ºC.

2. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que la enzima es térmicamente estable y biológicamente activa a una temperatura entre 55ºC y 85ºC.

3. Un método de acuerdo con la Reivindicación 2, en el que la enzima es térmicamente estable y biológicamente activa a una temperatura de aproximadamente 60ºC.

4. Un método de acuerdo con la Reivindicación 2, en el que la enzima es térmicamente estable y biológicamente activa a una temperatura de aproximadamente 80ºC.

5. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-4, que comprende exponer el agente de TSE a la enzima a una temperatura de entre 55 y 85ºC.

6. Un método de acuerdo con la Reivindicación 5, que comprende exponer el agente de TSE a la enzima a una temperatura de aproximadamente 60ºC.

7. Un método de acuerdo con la Reivindicación 5, que comprende exponer el agente de TSE a la enzima a una temperatura de aproximadamente 80ºC.

8. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-7, que comprende exponer el agente de TSE a la enzima a un pH alcalino.

9. Un método de acuerdo con la Reivindicación 8, en el que el pH es entre 8 y 13.

10. Un método de acuerdo con la Reivindicación 8, en el que el pH es superior a 9.

11. Un método de acuerdo con la Reivindicación 8, en el que el pH es aproximadamente 12.

12. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación previa, en el que el agente de TSE es un prión.

13. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación previa, en el que la TSE es seleccionada del grupo que consiste en enfermedad de Creutzfeld-Jacob, variante de la enfermedad de Creutzfeld-Jacob, kuru, insomnio familiar letal, síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker, encefalopatía espongiforme bovina, escrapie, encefalopatía espongiforme felina, enfermedad de emaciación crónica y encefalopatía transmisible del visón.

14. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación previa, en el que la enzima proteolítica es obtenida de un organismo termófilo.

15. Un método de acuerdo con la Reivindicación 14, en el que el organismo termófilo es seleccionado del grupo que consiste en arqueas, bacterias hipertermófilas y bacterias termófilas.

16. Un método de acuerdo con la Reivindicación 14, en el que el organismo termófilo es seleccionado del grupo que consiste en Thermotoga maritima, Thermotoga neopolitana, Thermotoga thermarum, Fervidobacterium islandicum, Fervidobacterium nodosum, Fervidobacterium pennivorans, Thermosipho africanus, Aeropyrum pernix, Thermus flavus, especies de Pyrococcus, Sulfolobus solfataricus, Desulfurococcus, Bacillus thermoproteolyticus, Bacillus stearo-thermophilus, Bacillus especie 11231, Bacillus especie 11276, Bacillus especie 11652, Bacillus especie 12031, Thermus aquaticus, Thermus caldophilus, Thermus especie 16132, Thermus especie 15673 y Thermus especie Rt41A.

17. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación previa para la inactivación de agentes de TSE en residuos clínicos.

18. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación previa para la inactivación de agentes de TSE en material animal desechado.

19. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación previa, que comprende exponer el agente de TSE a la enzima a una temperatura en el intervalo de 50-120ºC, y en el que el pH es superior a 9.

20. Un método para esterilizar un aparato, que comprende un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 19.

21. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-20, en el que la enzima proteolítica termoestable está en disolución.

22. Un método de acuerdo con la Reivindicación 21, en el que la temperatura de la disolución es mantenida por debajo de 100ºC.

23. Un método de acuerdo con la Reivindicación 21 ó 22, en el que la disolución es aplicada en forma de pulverización.

24. Un método de acuerdo con la Reivindicación 21 ó 22, en el que el aparato contaminado es sumergido en la disolución.

25. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-24, en el que el agente de TSE es expuesto a una primera disolución que comprende una enzima proteolítica que es térmicamente estable y biológicamente activa en el intervalo de 50-120ºC, y es luego expuesto a una segunda disolución que comprende una enzima proteolítica que es térmicamente estable y biológicamente activa en el intervalo de 50-120ºC.

26. Un método de acuerdo con la Reivindicación 25, en el que las enzimas proteolíticas primera y segunda son la misma.

27. Un método de acuerdo con la Reivindicación 25, en el que la enzima proteolítica primera es diferente a la enzima proteolítica segunda.

28. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 25-27, en el que el pH de la primera disolución es diferente al pH de la segunda disolución.

29. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 25-28, en el que la temperatura de la primera disolución es diferente a la temperatura de la segunda disolución.

30. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 29, que comprende además confirmar la inactivación de la TSE al confirmar la eliminación del dímero priónico.

31. Un método de acuerdo con la Reivindicación 30, que comprende sondar con un anticuerpo específico para el dímero priónico.

32. Uso de una composición que comprende una enzima proteolítica termoestable que es térmicamente estable y biológicamente activa a una temperatura en el intervalo de 50-120ºC, para esterilizar material contaminado con un agente de TSE.

33. Uso de una enzima proteolítica termoestable que es térmicamente estable y biológicamente activa a una temperatura en el intervalo de 50-120ºC, en la fabricación de una composición para inactivar un agente de TSE.