ES2232884T3 - Metodo para la determinacion de la proteina s. - Google Patents
Metodo para la determinacion de la proteina s.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE OCUPA DE UN ENSAYO DE LA PROTEINA LIBRE S, QUE COMPRENDE LA ADICION DE UN LIGANDO ESPECIFICO PARA LA PROTEINA LIBRE S A UNA MUESTRA DE FLUIDO BIOLOGICO PARA FORMAR UN COMPLEJO DE PROTEINA S/LIGANDO, Y LA DETERMINACION SUBSIGUIENTE DE LA CANTIDAD DE DICHO COMPLEJO FORMADO EN LA MUESTRA. EL LIGANDO ESPECIFICO DE LA PROTEINA LIBRE S ESTA FORMADO POR LA PROTEINA DE FIJACION C4B (C4BP) O PARTE DE LA MISMA, O UN COMPUESTO QUE COMPRENDE UNA SECUENCIA DE RESIDUOS DE AMINOACIDOS QUE SE FIJA ESPECIFICAMENTE AL LUGAR DE FIJACION DE LA C4BP EN LA PROTEINA S. LA PRESENTE INVENCION SE OCUPA IGUALMENTE DE ANTICUERPOS ESPECIFICOS PARA LA PROTEINA LIBRE S, QUE PUEDEN UTILIZARSE COMO LIGANDOS EN EL ENSAYO DE LA INVENCION, Y DE POLIPEPTIDOS RELACIONADOS CON LA PROTEINA S, QUE PUEDEN USARSE PARA LA PRODUCCION DE DICHOS ANTICUERPOS. ADEMAS, ESTA INVENCION SE REFIERE A SISTEMAS DE ENSAYOS DIAGNOSTICOS, ADECUADOS EN FORMA DE KITS, QUE INCLUYEN EL PRESENTE LIGANDO Y AL MENOS OTRO REACTIVOMAS EXIGIDO EN EL ENSAYO DE LA PROTEINA LIBRE S.
Description
Método para la determinación de la proteína
S.
El presente invento se refiere a la detección y
determinación de la proteína S en los fluídos biológicos y a los
reactivos para usar ahí. Más específicamente, la proteína S libre se
determina como un complejo receptor/ligando formado entre la
proteína S libre y una molécula que comprende un ligando que se une
específicamente a la proteína S.
La proteína S es un miembro del sistema de
proteína C anticoagulante presente de manera natural (una parte del
sistema de coagulación sanguínea) y actúa como un cofactor para el
estado activado de la proteína C, APC (Proteína C
Activada), siendo el otro cofactor el Factor V intacto. Este
sistema expresa una acción anticoagulante puesto que APC actúa de
modo que degrada los Factores V_{z} y VIII_{a} promotores de la
coagulación.
En el plasma humano, la proteína S circula tanto
como proteína libre como acomplejada con otra proteína plasmática,
la proteína de unión a C4b (C4BP) (Dahlbäck, Thromb. Haemostas,
1991, 66: 49-61). Aproximadamente el 60% de la
proteína S total en plasma está unida a la C4BP y es digno de
mención que esta forma de la proteína S no es funcionalmente activa
como cofactor para APC. Así, la unión de C4BP a la proteína S lleva
a una pérdida de la función cofactora para APC de la proteína S. La
importancia de la proteína S como una proteína anticoagulante es
ilustrada mediante la asociación entre la deficiencia de la proteína
S y trastornos tromboembólicos. La deficiencia homozigótica, que es
extremadamente rara, da una enfermedad neonatal fatal, mientras que
la deficiencia heterozigótica es un factor de riesgo para la
trombosis venosa en la vida adulta. En verdad, la deficiencia en la
proteína C o la deficiencia en la proteína S se encuentra en
aproximadamente 5 a 10% de todos los individuos que exhiben
trombosis venosa.
Así, un individuo que tiene una deficiencia en
proteína S, corre un riesgo aumentado de experimentar eventos
tromboembólicos venosos. Consecuentemente, los métodos para
determinar los niveles de proteína S en sangre o en plasma tienen un
uso clínico potencial. Particularmente, los métodos para medir los
niveles de proteína S libre serían apreciados, puesto que varios
investigadores han mostrado que para el diagnóstico de deficiencia
en proteína S, se debería medir el nivel de proteína S libre, más
que el nivel de proteína S total o la forma unida de la proteína S
(Zöller y otros, Blood, 1995, 85: 3524-3531). La
razón para esto es que una sensibilidad y especificidad más elevadas
respecto al defecto genético que causa la deficiencia de la proteína
S se consiguen con los ensayos de proteína S libre más que con los
ensayos para medir la proteína S total o proteína S unida.
Los métodos conocidos previamente para determinar
la proteína S libre se basan en dos principios de ensayos
diferentes, a saber, las propiedades de precipitación diferencial
del polietilénglicol y el uso de anticuerpos monoclonales,
respectivamente.
Los métodos que usan polietilénglicol (PEG) para
retirar de modo selectivo la proteína S unida a partir de un líquido
que comprende proteína S unida y proteína S libre previo a la medida
de proteína S se basan en el descubrimiento de que la forma de
proteína S unida al complejo (PS:C4BP) precipita ya a un
concentración de PEG de aproximadamente 3,75-5%,
mientras que la mayoría de la proteína S libre permanece en
disolución. Este principio ha sido usado de modo extensivo en
diferentes ensayos de proteína S comercialmente disponibles. Así, en
ensayos para proteína S libre, las muestras en plasma son sometidas
normalmente a precipitación con PEG (3,75-5%) tras
lo cual la proteína S restante en el sobrenadante tras la
centrifugación se mide con métodos inmunológicos, tales como ELISA,
RIA o cohetes de Laurell o electroinmunoensayo. Tales métodos se
describen en Am. J. Clin. Path. 94: 176-186 (1990),
Anal. Biochem., 10: 358-361 (1985) y Blood, 67:
504-508 (1986). Sin embargo, estos métodos adolecen
de algunas desventajas, principalmente debidas al procedimiento de
precipitación de PEG. Así, aún cuando la precipitación del PEG está
altamente estandarizada, este procedimiento está asediado por una
baja reproducibilidad y por su naturaleza trabajosa y larga.
El segundo principio de ensayo mencionado
anteriormente se basa en el uso de anticuerpos monoclonales. Tales
anticuerpos monoclonales son específicos para la forma libre de la
proteína S, es decir, los epítopos para estos anticuerpos están
localizados en o próximos al sitio de unión para C4BP en la molécula
de la proteína S (Amiral y otros, Blood Coag. Fibrinol. 1994, 5:
179-186 y Wolf y otros, Blood Coag. Fibrinol. 1994,
5: 184-192).
C4BP, que como se ha afirmado anteriormente se
une a la proteína S y de ese modo reduce la cantidad de proteína S
libre circulante en la sangre, está compuesta de aproximadamente
siete cadenas \alpha idénticas, cada una de las cuales contiene un
sitio de unión para la proteína C4b del complemento, y una cadena
\beta única. Las cadenas \alpha están unidas entre sí en sus
regiones C-terminales y junto con la cadena \beta
única. Estas siete cadenas \alpha y la cadena \beta única de la
molécula C4BP están ordenadas como los radios de una rueda para
formar una estructura molecular tipo araña (Dahlbäck y Stenflo en
The molecular basis of blood disease, eds Stammatoyannopolous y
otros. WB Saunders 1994, p 599-627). El sitio de
unión de la proteína S se conoce que está localizado en la cadena
\beta única y muy recientemente (Härdig y Dahlbäck, J. Biol. Chem.
1996, Volúmen 172, p.20861-20867) el sitio de unión
de la proteína S entero ha sido localizado en el módulo SCR del
extremo N-terminal (SCR significa Repetición
Consenso Corta, que es un módulo proteico que contiene
aproximadamente 60 residuos aminoacídicos) de la cadena \beta.
Aunque, se ha propuesto previamente que este módulo contiene el
sitio de unión de la proteína S (Fernández y Griffin, J. Biol. Chem.
1994, 269: 2535-2540), no se sabía antes, que el
sitio de unión de la proteína S entero está localizado en este
primer (extremo) módulo SCR de la proteína \beta.
El conocimiento de la formación del complejo
entre la proteína S y C4BP, ha sido usado para
desarrollaranticuerpos, que son específicos para la forma libre de
la proteína S. Así, se han hecho intentos para generar anticuerpos
que se unen específicamente a la región de la proteína S que está
implicada en la unión del C4BP, anticuerpos que obviamente sólo se
unirían a la proteína S libre, puesto que la proteína S en la forma
unida al C4BP, tales sitios de unión en la proteína S, son
específicos para estos anticuerpos, están ya ocupados por C4BP. Un
prerequisito para el desarrollo de anticuerpos con dicha
especificidad es, sin embargo, el conocimiento específico del sitio
de unión a C4BP en la molécula de la proteína S. Mientras que este
sitio de unión no ha sido elucidado en detalle en la técnica
anterior, se ha reivindicado que dos áreas en un módulo grande
C-terminal de la proteína S designada SHBG están
implicadas. El primer documento sugiere que los residuos número
605-614 de la proteína S madura están implicados
(Walker, J. Biol. Chem. 1989, 264: 17645-17648)
mientras que se ha sugerido más recientemente que otra región que
comprende los residuos 413-433 (Fernández y otros,
J. Biol. Chem. 1993, 268: 16788-16794) es importante
para la unión del C4BP a la proteína S.
En el documento de patente WO 93/01209, se
describen anticuerpos monoclonales dirigidos a regiones específicas
de la proteína S madura, que se contempla que están implicados en la
unión al C4BP; anticuerpos que son útiles en métodos diagnósticos y
sistemas para purificar o detectar proteína S libre. Se describen
también polipéptidos de la proteína S que comprenden estas regiones
específicas. Estas regiones difieren, sin embargo, de las regiones
de unión de C4BP descritas a continuación.
La solicitud de patente europea No EP 0 271 810
A2 describe métodos para la determinación inmunológica de proteína S
humana libre o un complejo de proteína S humana y C4BP en una
muestra de ensayo. El documento EP 0 271 810 A2 describe un método
para determinar la proteína S libre usando un anticuerpo específico
para la proteína S libre que no se une sustancialmente a los
complejos proteína S-C4BP. El documento EP 0 271 810
A2 también describe un método para determinar los complejos proteína
S-C4BP usando un anticuerpo específico para el
complejo que no se une sustancialmente a la proteína S libre. Los
dos anticuerpos usados en sus métodos se unen a diferentes epítopos
en la proteína S humana libre. El anticuerpo monoclonal que se une
sólo a la proteína S libre fue generado contra un antígeno que
comprende la proteína S libre y que no está, por tanto, ni bien
definido ni bien caracterizado.
El documento de patente norteamericana No
5.405.946 describe variantes de proteína S que contienen una o más
mutaciones en la región entre los residuos aminoacídicos 425 y 432.
Las variantes de la proteína S exhiben una reducida o
significativamente eliminada capacidad para unirse a C4BP. Además,
el documento de patente norteamericana No. 5.405.946 describe
péptidos de proteína S sintéticos que tienen los residuos
aminoacídicos 420 a 434 de la proteína S salvaje que contienen una o
más mutaciones entre los residuos 420 a 434. Tales péptidos de la
proteína S sintéticos no se unen a C4BP en absoluto.
Por otro lado, los ensayos para la proteína S
libre basados en anticuerpos monoclonales inmovilizados dirigidos a
la proteína S libre, que se usan como anticuerpos inmovilizados en
ELISA (Ensayo inmunoadsorbente unido a enzima) estándar para
capturar proteína S libre en plasma, han sido descritos en la
literatura y están también comercialmente disponibles de Stago
(Amiral y otros, Blood Coag. Fibrinol. 1994, 5:
179-186, y Wolf y otros, Blood Coag. Fibrinol. 1994,
5: 187-192). En tales ensayos, las diluciones
plasmáticas en tampones que contienen calcio son incubadas en placas
micrométricas que contienen anticuerpos monoclonales específicos
para la proteína S libre, y subsiguiente a las etapas de lavado, la
proteína S unida a los anticuerpos monoclonales puede ser detectada
con el uso de un segundo anticuerpo mono- o policlonal dirigido a la
proteína S. Sin embargo, tales ensayos son extremadamente caros.
Adicionalmente, los anticuerpos usados en estos ensayos no están
bien caracterizados y no han sido generados específicamente contra
ninguna región de la proteína S que se haya sugerido que esté
implicada en la unión de C4BP a la proteína S. Más bien, estos
anticuerpos han sido generados contra la molécula de la proteína S
entera, tras lo cual los anticuerpos que tienen especificidad por la
proteína S libre han sido seleccionados.
Es un objeto del presente invento proporcionar un
ensayo simple y fiable para la determinación de la proteína S libre
en fluídos biológicos. Según el presente invento, este objeto se
logra con un ensayo en el que un ligando que se une específicamente
a la proteína S libre es añadido a un fluído biológico que comprende
la proteína S para formar un complejo proteína S/ligando tras lo
cual el nivel de proteína S libre se mide como el complejo proteína
S/ligando formado en dicho fluído, y en el que dicho ligando está
comprendido de al menos el módulo SCR del extremo
N-terminal de la cadena \beta de la proteína de
unión a C4b (C4BP) o una variante de la misma que tiene una
secuencia aminoacídica homóloga y que tiene esencialmente las mismas
propiedades de unión a la proteína S como a C4BP.
Más específicamente, el presente invento tiene
que ver con un método como se define en la reivindicación 1.
De acuerdo con una realización adecuada del
presente invento, dicha unión del ligando a la proteína se deriva de
C4BP per se y comprende tanto la proteína entera como un
fragmento (poli)peptídico de la misma que tienen una
capacidad de unión a la proteína S apropiada. De manera adecuada,
este fragmento comprende el sitio de unión a la proteína S a C4BP
entero, o sustancialmente entero.
Aunque, es bien conocido que el C4BP es un
ligando natural que se une a la proteína S, previo al presente
invento nadie había sugerido el uso de C4BP per se, o un
fragmento del mismo, como una herramienta para medir en una muestra
de fluído biológico, el nivel de proteína S libre en presencia de la
proteína S unida com PS:C4BP en un ensayo principalmente basado sólo
en la formación de un complejo entre la proteína S libre y C4BP a un
fragmento del mismo apropiado.
Según el presente invento se ha descubierto, sin
embargo, de modo bastante inesperado, que el C4BP puede ser usado
como un componente reactivo en un ensayo como se describe aquí para
determinar la proteína S libre, puesto que, a diferencia de la
mayoría de las proteínas, C4BP es bastante estable a lo largo del
tiempo y es comparativamente insensible al calor. Por otro lado, la
velocidad de disociación del complejo formado es suficientemente
lenta para permitir la medida de la misma, tanto cualitativamente
como cuantitativamente.
En conexión con el presente invento, el término
"ligando" se usa para designar una estructura molecular que
comprende una secuencia aminoacídica que se une a una secuencia
aminoacídica de una molécula receptora, por ejemplo, una proteína,
un péptido, un polipéptido o similares, para formar un complejo
molecular. En el presente caso, el receptor está comprendido de la
proteína S libre. Así, un ligando del presente invento puede estar
comprendido de un paratopo de un anticuerpo o de una molécula que
comprende una secuencia aminoacídica que define un paratopo de un
anticuerpo, siendo dicha molécula por ejemplo un anticuerpo o un
fragmento del mismo.
Según una realización del invento, la molécula de
C4BP entera, se usa per se de forma adecuada en la forma
purificada, como un ligando para formar un complejo con proteína S
libre, tras lo cual el complejo formado, es decir, PS:C4BP, es
medido según la técnica bien conocida. Es por supuesto necesario que
este complejo PS:C4BP formado en el ensayo pueda ser distinguido del
complejo PS:C4BP presente de manera natural en la sangre. Esto se
puede conseguir, por ejemplo, marcando y/o fijando el C4BP usado
como ligando en el ensayo como bien se conoce y será además descrito
más en detalle más adelante.
Otras realizaciones de este invento se basan en
el conocimiento de la localización exacta del sitio de unión de la
proteína S en la molécula C4BP. Contrario a documentos anteriores,
se ha encontrado recientemente que este sitio de unión está presente
en el módulo SCR del extremo N-terminal de la cadena
\beta de la molécula C4BP.
Así, según el presente invento, fragmentos, es
decir, polipéptidos cortos de la molécula C4BP que comprenden el
sitio de unión de la proteína S de la molécula C4BP pueden ser
usados como ligandos de unión a la proteína S para el mismo
propósito que la molécula C4BP entera con uso de los mismos formatos
de ensayo. Como es bien conocido, tales fragmentos pueden derivarse
de C4BP, por ejemplo, mediante digestión enzimática de la misma.
Tras la determinación de la correspondiente secuencia aminoacídica
tales fragmentos o polipéptidos puede ser producidos
convenientemente con el uso de método sintéticos convencionales,
tales como una síntesis tipo Merrifiel en fase sólida. También
pueden ser usados los métodos basados en tecnología
recombinante.
Basados en el conocimiento de la localización del
sitio de unión a C4BP en la proteína S nativa, los polipéptidos de
la proteína S que comprenden dicho sitio de unión pueden ser
obtenidos y usados para generar anticuerpos, monoclonales o
policlonales, que son específicos para este sitio de unión y, por
tanto, para la proteína S libre. Obviamente, tales anticuerpos
pueden ser usados para determinar la proteína S libre en presencia
de la proteína S unida a C4BP puesto que tales anticuerpos no se
unirán a la proteína S acomplejada con C4BP, estando el
correspondiente determinante antigénico o epítopo en la proteína S
acomplejada ya ocupado por la molécula C4BP.
Los polipéptidos de la proteína S (polipéptidos
PS) que comprenden las región de unión a C4BP de la proteína S
nativa y con los anticuerpos anti polipéptidos PS específicos para
estas regiones, inhiben la interacción de unión entre C4BP y PS.
Tales anticuerpos policlonales o monoclonales inmunoreaccionarían
con la proteína S libre y tendrán, por tanto, un uso potencial tanto
como reactivos diagnósticos como agentes terapéuticos.
Dichos anticuerpos pueden ser usados para
preparar composiciones terapéuticas que comprenden dichos
anticuerpos, que se unen a la proteína S libre y, así, impedir la
inactivación de la proteína S a través de la formación del complejo
PS:C4BP. El presente invento se refiere también a la composición
terapéutica que comprende un polipéptido o un anticuerpo monoclonal
del presente invento en una cantidad suficiente para inhibir la
unión de la proteína S libre a C4BP, polipéptido o anticuerpo
monoclonal que se une a y bloquea los sitios de unión para la
proteína S libre comprendidos en C4BP, y un vehículo, excipiente o
diluyente farmacéuticamente aceptables.
Los sistemas diagnósticos, adecuados en forma de
kit,para ensayar de acuerdo con el presente método, proteína S
libre en un fluído biológico, pueden comprender como reactivos
empaquetados por separado, un ligando del presente invento y al
menos un reactivo adicional, tal como medios indicadores, tampón,
etc, requerido para realizar el ensayo. De modo adecuado, estos
sistemas comprenden todos los reactivos necesarios para realizar el
ensayo. Normalmente, las instrucciones para usar los reactivos
empaquetados están incluidas en estos sistemas.
El presente método para medir la proteína S libre
puede diseñarse en una variedad de formatos usados de modo
convencional, preferiblemente como inmunoensayos directos, estando
tales ensayos basados en las interacciones de uniones específicas
entre la región de unión al C4BP de la proteína S por un lado, y
C4BP o fragmentos del mismo o polipéptidos que comprenden una
secuencia aminoacídica homóloga o análoga al sitio de unión de la
proteína S de C4BP, o los presentes paratopos de anticuerpos anti
polipéptido PS por el otro.
El método puede ser también usado para purificar
proteína S libre a partir de muestras fluidas. Por ejemplo, una
composición para purificar proteína S libre de una disolución acuosa
puede incluir un ligando como se describe anteriormente, unido
operativamente a un vehículo sólido que puede ser usado en un método
para purificar la proteína S libre de una disolución acuosa poniendo
en contacto dicha disolución con dicha composición para formar un
complejo proteína S/ligando unida al vehículo sólido, separando
dicho complejo de dicha disolución y liberando la proteína S de
dicho complejo.
A continuación, se describirá el invento con más
detalle con referencia a realizaciones adecuadas de la misma. Aún
cuando, el presente invento tiene que ver principalmente con la
proteína S de origen humano, el invento podría ser también aplicado
a la proteína S de otro origen, por ejemplo, bovino.
Como se afirma anteriormente, la presente
solicitud se refiere principalmente a las interacciones de unión
entre la proteína S y C4BP. Más específicamente, la presente
solicitud describe el uso de ligandos específicos para proteína S
libre para capturar la proteína S libre, por ejemplo en ensayos para
proteína S libre, siendo usada la expresión "proteína S libre"
como una distinción de la proteína S circulante en el cuerpo vivo en
forma de un complejo con C4BP. Mientas que una realización del
invento está puramente basada en el uso de la proteína C4BP per
se presente de manera natural, otras realizaciones del presente
invento se refieren al conocimiento detallado de tales
interacciones, es decir, el conocimiento específico de la
localización y/o de la secuencia aminoacídica específica de cada una
de los sitios de unión interactivos de la proteína S y C4BP, que
están implicados en la formación del complejo entre la proteína S y
C4BP. Así, el invento tiene que ver con el uso de ligandos
relacionados con C4BP, así como el uso de anticuerpos o fragmentos
de los mismos que se unen a la proteína S libre.
Con respecto a los ligandos que comprenden al
menos parte del sitio entero de C4BP que se unen a la proteína S
nativa, aunque el uso de la molécula C4BP entera es conveniente y
constituye una realización adecuada del presente invento, se puede
también esperar que se consigan ventajas mediante el uso de
fragmentos de C4BP, fragmentos que comprenden la secuencia
aminoacídica específica, o al menos parte de la misma, que se unan a
la proteína S. Se ha demostrado recientemente (loc. cit.) que en
C4BP, el sitio de unión de la proteína S nativa aparece en el
(primer) módulo SCR del extremo de la cadena \alpha de la molécula
C4BP. Así, los fragmentos que podrían ser usados como ligando de
acuerdo con el presente invento podrían estar comprendidos de la
cadena \beta intacta de la molécula C4BP o fragmentos de esta
cadena, que comprenden o consisten esencialmente en dicho módulo SCR
del N-terminal. El uso de tales fragmentos
polipeptídicos en vez de la proteína entera podría ser ventajoso con
respecto al caso de preparación del ligando y podría conseguirse una
afinidad mejorada si tales fragmentos fueran usados como ligandos en
presencia del método para medir la proteína S libre.
Como se menciona anteriormente, tales fragmentos
podrían ser preparados por medio de síntesis peptídica convencional
o por métodos basados en tecnología recombinante, mientras que el
uso de C4BP per se comprende normalmente el aislamiento de
C4BP a partir de plasma en la forma de complejo PS:C4BP, separación
de C4BP a partir de proteína S y purificación adicional. Los
fragmentos apropiados de C4BP, podrían también derivarse a partir de
sangre, por ejemplo mediante ruptura enzimática de C4BP obtenida a
partir de sangre, como se describe anteriormente.
Por otro lado, el uso de tecnología recombinante
abre posibilidades para diseñar ligandos tipo C4BP que tienen
propiedades, que hacen a tales ligandos específicamente útiles como
ligandos para atrapar la proteína S libre. Así, con el uso de la
tecnología recombinante, se ha producido una molécula hibrida entre
los dos tipos de cadenas, es decir, la cadena \alpha y la cadena
\beta, del C4BP. En esta construcción, el SCR del extremo
N-terminal de la cadena \beta está reemplazando el
módulo correspondiente de la cadena \alpha. El producto
recombinante obtenido es una molécula tipo C4BP que tiene múltiples
subunidades unidas por puente disulfuro, cada una de las cuales
contiene un sitio de unión a la proteína S.
Aún cuando es posible diseñar moléculas tipo C4BP
que podrían ser muy eficaces como ligandos atrapadores en ensayos
para proteína S libre, realizaciones adecuadas del invento se basan
en el uso de la molécula C4BP, o más bien, especies de C4BP que
comprenden la cadena \beta, es decir, C4BP\beta, como ligandos
en tales ensayos. Puesto que el sitio de unión en C4BP\beta une la
proteína S con muy alta afinidad (K_{D}= 0,1 nM) en presencia de
concentraciones fisiológicas de calcio, siendo alta la constante de
velocidad de disociación en presencia de iones calcio (casi 10^{5}
M^{-1} s^{-1}) y siendo baja la constante de velocidad de
disociación (aproximadamente 5 x 10^{-4} s^{-1}), C4BP\beta
(que contiene un sitio de unión a la proteína S sin ocupar en la
cadena \beta) es un ligando altamente específico y eficaz para la
proteína S y es capaz de unirse específicamente a la proteína S
libre en una disolución que contiene tanto la proteína S libre como
los complejos PS:C4BP.
Es, por supuesto, esencial que el C4BP usado como
ligando en el presente ensayo esté comprendido sustancialmente de
especies de C4BP que contienen la cadena \beta y, por tanto, el
sitio de unión de la proteína S. Esto quiere decir que la C4BP usada
en el presente método está sustancialmente comprendida de su
isoforma principal C4BP\beta que tiene siete cadenas \alpha y
una cadena \beta como se afirma anteriormente, y que su isoforma
secundaria que carece de la cadena \beta está ausente o presente
en una baja proporción.
De acuerdo con la realización adecuada de un
ensayo para la proteína S libre del presente invento, el C4BP\beta
se inmoviliza en un vehículo, por ejemplo, una placa de
microvaloración, y se pone en contacto, es decir, se incuba, con una
disolución que contiene tanto proteína S libre como el complejo
PS:C4BP para unirse específicamente a y, por tanto extraer, la
proteína S libre de dicha disolución, tras lo cual la proteína S,
que se une al ligando inmovilizado, puede detectarse con anticuerpos
mono- o policlonales específicos para la proteína S.
La elevada constante de la velocidad de
asociación en presencia de calcio permite períodos muy cortos de
incubación para ser usados para esta primera captura. De modo
adecuado, se realizan unas cuantas etapas de lavado previo a la
incubación con dichos anticuerpos mono- o policlonales. En
principio, se puede usar cualquier anticuerpo específico para la
proteína S. Sin embargo, según una realización adecuada del presente
método se usa un anticuerpo monoclonal, que tiene algunas
propiedades únicas, que lo hacen el más adecuado. Este anticuerpo,
que se designa como HPS54, ha sido caracterizado (Dahlbäck y otros,
J. Biol. Chem. 1990, 265:8127-8135) y posee
inusualmente alta afinidad por la proteína S. Su epítopo está
localizado en el primer dominio tipo EGF de la proteína S, es decir,
es distinto del sitio de unión para C4BP\beta, que está localizado
en la región SHBG, y se requiere calcio para conseguir la alta
afinidad de la unión de dicho anticuerpo a la proteína S. Estas
propiedades únicas hacen de este anticuerpo un reactivo adecuado
para detectar la proteína S, que ha sido retenida mediante el
C4BP\beta inmovilizado. Para permitir la detección de la proteína
S unida al ligando inmovilizado, complejos proteína S/ligando que
llevan unido el anticuerpo monoclonal HPS54, el HPS54 está marcado o
bien directamente para permitir la detección del mismo o bien para
ser detectado con etapas secundarias, tales como anticuerpos
secundarios contra este anticuerpo monoclonal.
El método descrito anteriormente que usa C4BP
como un ligando se da solamente para ilustrar el invento. El invento
no se limita a esta realización sino que hay un número casi
ilimitado de posibles modos para usar el principio descrito para
medir la proteína S libre y son posibles un número de diseños
diferentes del principio de ensayo. Así, las modificaciones y
realizaciones adicionales del invento son obvias para el profesional
experto.
Según el presente invento, los ligandos usados
para capturar proteína S libre pueden estar también comprendidos de
anticuerpos específicos para la proteína S libre. Así, el presente
invento se refiere a tales anticuerpos que han sido generados
directamente contra una región de la proteína S, que se ha
encontrado que está implicada en las interacciones de unión entre
proteína S y C4BP.
Tales anticuerpos se obtienen con el uso de los
polipéptidos PS presentes que comprenden dichas regiones
específicas, siendo dichos polipéptidos usados para preparar un
inóculo, que se usa para obtener los anticuerpos que tienen la
especificidad deseada, por ejemplo mediante la administración
(inmunización) de un animal apropiado.
Estos polipéptidos PS comprenden regiones de la
proteína S madura que difieren de tales regiones de la proteína S,
que en la técnica anterior se ha sugerido que están implicadas en la
unión de C4BP.
De acuerdo con el presente invento, las regiones
de la proteína S, que se ha encontrado que están implicadas en la
unión del C4BP, y que, por tanto, cuando están presentes en un
antígeno, por ejemplo, un polipéptido, son potencialmente útiles
como inmunógenos o antígenos para generar anticuerpos específicos
para la proteína S libre, incluyen todas los residuos aminoacídicos
447-460 de la proteína S madura, representeada
mediante la fórmula SGIAQFHIDYNNVS.
En términos generales, el presente invento tiene
que ver, por tanto, con los polipéptidos PS, dichos polipéptidos
comprenden al menos los residuos aminoacídicos
447-460 de la proteína S madura. Opcionalmente,
dichos polipéptidos pueden comprender aminoácidos
N-terminales y/o C-terminales
adicionales que difieren de los correspondientes residuos
flanqueantes de la proteína S. Los polipéptidos PS podrían también
comprender una parte N-terminal o
C-terminal de la secuencia aminoacídica
447-460 y resp., residuos flanqueantes
N-terminal o C-terminal adicionales
correspondientes a los de la proteína S madura, o podrían comprender
la secuencia aminoacídica 447-460 entera con
residuos flanqueantes adicionales a ambos extremos, residuos
flanqueantes que corresponden a los de la proteína S madura.
Ilustrativos de tales polipéptidos PS son los polipéptidos que
comprenden los residuos aminoacídicos 439-460,
447-468, y 435-468, resp., (Tabla
1). Los inventores han demostrado que los polipéptidos sintéticos
correspondientes a las secuencias anteriores son capaces de inhibir
la interacción proteína S-C4BP, mientras que los
polipéptidos sintéticos que corresponden a los residuos
405-437 y 595-628 (Tabla 1), que en
la técnica anterior se había sugerido que estaban implicados en la
unión del C4BP, no mostraron ningún efecto inhibitorio, ni siquiera
si eran usados en exceso (2000 X) por encima de la proteína S. Así,
los presentes polipéptidos comprenden una secuencia de residuos
aminoacídicos que corresponden a los residuos aminoacídicos
447-460 de la proteína S madura y opcionalmente
residuos adicionales de proteínas maduras en uno o ambos extremos
pero de modo adecuado no se extienden más allá del residuo
aminoacídico 438 de la proteína S madura en su extremo
N-terminal o el residuo aminoacídico 526 de la
proteína S madura en su extremo C- terminal. Aparte de ser derivados
de la proteína S, los presentes polipéptidos pueden también ser
preparados con síntesis polipeptídica convencional.
La numeración aminoacídica anterior de la
proteína S corresponde a la numeración convencional usada por
ejemplo, en Lundwall, A. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.
83, p. 6716-6720 (proteína humana S) y Dahlbäck, B,
y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 83, p.
4199-4203 (proteína S bovina), referencias que
describen el cADN y la secuencia aminoacídica de la proteína S.
Consecuentemente, una realización adecuada del
presente invento está dirigida a anticuerpos, policlonales o,
preferiblemente, monoclonales, que han sido generados contra los
polipéptidos PS anteriores y, así, son capaces de inmunoreaccionar
con las secuencias de residuos aminoacídicos de la proteína S
anteriores, que se ha encontrado que están implicadas en la unión de
alta afinida de C4BP a la proteína S libre. Como se explica
anteriormente, tales anticuerpos serán específicos para la proteína
S libre y no se unirán a la proteína S acomplejada con C4BP.
Se hace referencia a los presentes anticuerpos
como anticuerpos anti-PS y se caracterizan por la
inmuno-especificidad por la proteína S libre.
Además, se puede esperar que sean capaces de inhibir la unión de la
proteína S a C4BP y, así, ser útiles como un fármaco para potenciar
la cantidad de proteína S libre en sangre.
Los anticuerpos anti-PS adecuados
del presente invento son capaces de inmunoreaccionar con un
polipéptido que comprende los residuos aminoacídicos
447-460 de la proteína S madura, dichos anticuerpos
también inmuno-reaccionan con la misma secuencia
aminoacídica en la proteína S libre.
Los presentes anticuerpos pueden ser producidos
según métodos comúnmente conocidos con uso de protocolos
comercialmente disponibles. Generalmente, un animal, preferiblemente
un mamífero, es inoculado, por ejemplo, inyectado, con un
polipéptido PS del presente invento que comprende los residuos
aminoacídicos 447-460 de la proteína S madura y
usados en una cantidad suficiente para inducir la producción de
anticuerpos en dicho animal. Subsiguientemente, los anticuerpos
producidos de ese modo son recogidos del animal, de modo adecuado en
suero, ascitos o algún otro fluído corporal, o un órgano productor
de anticuerpos, tal como el bazo, usados para producir anticuerpos
con la técnica recombinante.
Esos anticuerpos, que tienen la
inmunoespecificidad deseada son aislados preferiblemente de por
ejemplo, el fluído corporal, de modo adecuado mediante cromatografía
de inmunoafinidad, o con otras técnicas bien conocidas. Si se usa la
cromatografía de inmunoafinidad, que comprende el polipéptido
inmunizante unido a la fase sólida para purificar los anticuerpos,
su especificidad podría ser potenciada. Tal cromatografía de
inmunoafinidad comprende poner en contacto los anticuerpos con el
polipéptido inmunizante unido a la fase sólida, se forma un
inmunocomplejo unido a la fase sólida y, una subsiguiente separación
de los anticuerpos a partir de este inmunocomplejo.
Puesto que los polipéptidos PS usados para
inmunizar al animal son polipéptidos cortos, se incluyen
preferiblemente en el inóculo unidos a un vehículo para formar un
conjugado. El uso de tales conjugados son preferidos para péptidos
que comprenden alrededor de 35 aminoácidos o menos. Los vehículos
adecuados son bien conocidos en la técnica y comprenden hemocianina
extraída de la lapa californiana (KLH), hemocianina del cangrejo
herradura (Limulus polyphemus), edestina, tiroglobulina,
albúminas y similares.
Para ayudar en la unión del polipéptido al
vehículo, el polipéptido puede comprender residuos aminoacídicos
adicionales añadidos a los extremos amino- o carboxilo terminales
del polipéptido. De modo adecuado, los residuos de cisteína son
añadidos y se usa un vehículo que comprende residuos de cisteína
libre de modo que se obtiene un conjugado polipéptido/vehículo
mediante la formación de puentes disulfuro. Tales residuos de
cisteína añadidos pueden también ayudar para realizar la
purificación de inmunoafinidad anterior, por ejemplo, uniendo el
polipéptido inmunizante que comprende los residuos de cisteína
añadidos a una matriz de afinidad que comprende residuos de cisteína
libre, por ejemplo ThiolSepharose® de Pharmacia Fine Chemicals.
Los presentes anticuerpos pueden ser policlonales
o monoclonales, siendo normalmente preferidos los anticuerpos
monoclonales. La expresión "anticuerpo" pretende hacer
referencia no sólo al anticuerpo entero sino también a los
fragmentos apropiados del mismo. Los anticuerpos monoclonales
contienen sólo una especie única del sitio de combinación del
anticuerpo, o paratopo, capaz de inmunoreaccionar con un epítopo
particular. Sin embargo, un anticuerpo monoclonal puede comprender
más de un sitio de combinación del anticuerpo específico, siendo
tales anticuerpos poliespecíficos, por ejemplo, biespecíficos. De
modo adecuado los anticuerpos monoclonales son
mono-específicos y comprenden un paratopo único
específico para los presentes polipéptidos PS y son, así, también
específicos para la proteína S libre.
La preparación de anticuerpos monoclonales es
bien conocida en la técnica y fue descrita por primera vez por
Koehler y Milstein, Nature, 256: 495-497, 1975. Como
se describe en esta referencia, los anticuerpos monoclonales son
producidos por clones de una célula única designada hibridoma. Estos
hibridomas están formados por la fusión de una célula productora de
anticuerpos, normalmente linfocitos, con un mieloma u otra línea
celular auto perpetuante y secretan anticuerpos al sobrenadante del
cultivo celular del hibridoma. Para producir los presente
hibridomas, se usan linfocitos, que han sido recogidos de un animal
previamente hiperinmunizado con el presente polipéptido PS como
antígeno. El presente invento también se refiere a las células
hibridomas y los cultivos celulares que contienen tales células
hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal del presente
invento.
Preferiblemente, los anticuerpos policlonales o
monoclonales del presente invento inmunoreaccionan con los presentes
polipéptidos PS descritos en la parte experimental de esta
descripción, y, así, inmunoreaccionan con la proteína S libre con
alta afinidad.
De acuerdo con una realización adecuada del
presente invento tales anticuerpos pueden ser usados en un sistema
de ensayo, por ejemplo, un kit diagnóstico, que se pretende que se
use en un formato ELISA para detectar la cantidad de proteína S
libre en una muestra fluida, tal como sangre, suero, o plasma, en el
que este anticuerpo está unido a una fase sólida y se usa un
conjugado enzima-antígeno para detectar y
cuantificar la cantidad de antígeno, es decir, de proteína S libre,
en una muestra.
Como se afirma anteriormente, los presentes
anticuerpos y los ligandos relacionados con C4BP pueden ser usados
en un sistema diagnóstico para ensayar proteína S libre. De acuerdo
con el presente invento, tales sistemas normalmente también incluyen
medios indicadores para facilitar la determinación, cualitativa o
cuantitativa, del complejo receptor/ligando formado en el ensayo del
presente invento. Tales medios indicadores pueden ser usados junto
con la fijación del ligando al sustrato, o como una alternativa que
permita ensayos de dicho complejo en la forma libre, es decir, no
unida a un vehículo sólido, matriz, o similar.
Tales medios o marcas indicadoras están
comprendidas de átomos o moléculas únicas, que pueden unirse a o ser
incorporados en el presente ligando, o usadas por separado, y que
están implicadas, bien de modo directo o indirecto en la producción
de una señal detectable para indicar la formación del presente
complejo receptor/ligando. Reactivos adicionales pueden ser
requeridos, por ejemplo en conexión con marcas enzimáticas, siendo
requerido el correspondiente sustrato para visualizar la señal. Los
medios o marcas indicadoras útiles son bien conocidos dentro de este
campo de la técnica e incluyen por ejemplo, marcas cromogénicas,
fluorogénicas y quimioluminogénicas, marcas fluorogénicas adecuadas
tales como isocianato de fluoresceína (FIC). Otras marcas, que
pueden ser usadas, son enzimas, tales como peroxidasa de rábano
(HRP), e isótopos radioactivos, tales como ^{125}I.
De modo adecuado, el presente ligando se une, por
ejemplo, mediante absorción, a una matriz sólida. Las matrices
sólidas útiles son bien conocidas en la técnica y se componen de
materiales insolubles en agua, tales como dextranos entrecruzados
disponibles bajo la marca registrada Sephadex de Pharmacia Fine
Chemicals; agarosa; bolas de poliestireno que tienen un diámetro de
alrededor de 1 mm hasta alrededor de 5 mm y disponibles de Abbott
Laboratories de Chicago del Norte, IL; cloruro de polivinilo,
poliestireno, poliacrilamida entrecruzada, redes a base de
nitrocelulosa o nilón, tales como hojas, bandas o almohadillas; o
tubos, placas o los pocillos de una placa de microvaloración, tales
como las hechas a partir de poliestireno o cloruro de
polivinilo.
Los componentes reactivos del sistema diagnóstico
descritos aquí pueden ser proporcionados en disolución o como una
dispersión líquida. Sin embargo, se proporcionan de modo adecuado,
como un polvo sustancialmente seco, preferiblemente en forma
liofilizada. Si se usa una enzima como medio indicador, el sustrato
correspondiente puede también ser proporcionado en un paquete del
sistema separado. Un soporte sólido, tal como una placa de
microvaloración como se menciona anteriormente y uno o más tampones
pueden también incluirse como elementos empaquetados por separado en
presencia del sistema diagnóstico.
Las realizaciones adecuadas del presente invento
se explican en más detalle en los ejemplos ilustrativos y con
referencia a los dibujos que se acompañan.
La Fig. 1 muestra una curva patrón obtenida con
diluciones plasmáticas normales (1:40-1:640). Los
valores de absorbancia a 490 nm (A_{490}) se representan frente a
los valores logarítmicos de las diluciones. Como una alternativa,
los valores A_{490} se representan frente al nivel (%) de proteína
S libre (eje x inferior).
La Fig. 2 muestra los resultados de un análisis
de regresión lineal. Los valores (%) obtenidos con el ensayo del
Ejemplo 2 se representan (en el eje y) frente a los valores (%)
obtenidos con un RIA interno (en el eje x).
Las Fig. 3 y Fig. 4 muestran la correlación entre
los valores obtenidos con el ensayo en el Ejemplo 2 (eje y) y (en el
eje x) los valores obtenidos con el ELISA comercial según Stago
(Fig. 3) y con un RIA interno (Fig. 4).
Las Fig. 5A y 5B muestran la inhibición peptídica
de las interacciones proteína S/C4BP en un ensayo de unión en
equilibrio (Fig. 5A) y en un ensayo de resonancia de plasmón
superficial (Fig. 5B).
En estos ejemplos, se describe un ensayo
específico para la proteína S libre de acuerdo con el presente
invento, mientras que el C4BP se usa como un ligando, inmovilizado
sobre un soporte sólido, para atrapar la proteína S libre en una
muestra plasmática. Como soportes sólidos, se usaron placas de
microvaloración.
Como ligando, una especie de C4BP que contiene la
cadena \beta de unión de la proteína S y se designa C4BP\beta
fue inmovilizada en pocillos en placas de microvaloración (Maxisorb
de NUNC, Dinamarca) usando el siguiente procedimiento estándar: 10
\mug/ml de C4BP purificado en 50 mM de tampón carbonato, pH 9,6,
50 \mul/pocillo- incubación toda la noche. Los pocillos fueron
lavados tres veces con Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,15 M,
pH 7,5 (TBS), que contenía Tween 0,1% (TBS-tampón de
lavado) y después incubados a temperatura ambiente durante 30
minutos con albúmina de suero bovina 1% (BSA) diluída en TBS. Las
placas fueron después lavadas con TBS-tampón de
lavado y almacenadas en el refrigerador. En estas condiciones, se
encontró que el rendimiento de las placas en el ensayo de proteína S
libre era aceptable durante al menos 5 semanas.
El C4BP\beta fue primero aislado a partir de
plasma humano en forma de complejo proteína S-C4BP.
A partir de entonces, este complejo fue disociado y el C4BP\beta
fue separado de la proteína S mediante cromatografía de filtración
en gel en 3M de guanidinio-HCl y el C4BP\beta fue
purificado adicionalmente en un proceso de cromatografía de afinidad
de anticuerpo monoclonal. De acuerdo con este proceso, el producto
obtenido es predominantemente C4BP\beta aunque una proporción
menor de especies C4BP que carecen de la cadena \beta podrían ser
separadas junto con C4BP\beta. El aislamiento de C4BP ha sido
previamente descrito (Dahlbäck, Biochem. J. 1983, 209:
847-856 y modificada en Hillarp y Dahlbäck, J. Biol.
Chem. 1988 263: 12759-12764).
Una cantidad de plasma humano normal con citrato
(de aproximadamente 40 donantes) fue usada para construir la curva
patrón. El plasma fue diluido 1:40-1:640 en el mismo
tampón que fue usado para las muestras de pacientes y manipulado del
mismo modo que las muestras de pacientes.
El plasma humano normal (20 ml que fue
anticoagulado con citrato trisódico en una manera estándar) fue
mezclado con una matriz de afinidad para la proteína S, siendo la
matriz 15 ml de HPS54-Sefarosa (la Sefarosa contiene
el anticuerpo HPS54 inmovilizado), e incubado durante 2 horas a 4ºC
durante una mezcla suave. El plasma deplecionado de proteína S fue
recogido mediante centrifugación y almacenado a -70ºC.
El siguiente procedimiento de ensayo fue usado
para determinar la proteína S libre en muestras de diluciones de
plasma normal para construir una curva estándar. El mismo
procedimiento se usa para el ensayo de muestras de plasma de
pacientes.
Procedimiento de
ensayo
Las alícuotas (50 \mul) de la muestra para ser
analizada (normalmente para plasma de pacientes diluciones 1:100 de
plasma, siendo el tampón para las diluciones TBS que contiene BSA
1%, cloruro cálcico 1 mM y benzamidina 1mM) fueron añadidas a los
pocillos de placas de microvaloración-C4BP e
incubadas a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los pocillos
fueron después lavados con TBS-tampón de lavado y se
añadió el anticuerpo monoclonal HPS54 biotinilado (diluído 1:1000,
correspondiendo a alrededor de 0,1-1 \mug/ml, en
TBS que contiene BSA 1%, cloruro cálcico 2 mM). El HPS54 sin unir
fue eliminado mediante lavado con 3xTBS-tampón de
lavado. La peroxidasa conjugada con estreptavidina (de Dakoparts AS
y preparada según las instrucciones del fabricante y diluida 1:2500)
(50 \mul/pocillo) fue añadida e incubada 15 minutos a temperatura
ambiente antes de que los complejos sin unir fueran eliminados
mediante lavado con 3xTBS-tampón de lavado. Las
alícuotas (100 \mul/pocillo) del sustrato de peroxidasa OPD
(1,2-orto-fenilendiamina en forma de
tabletas de 2 mg de Dakopatts A/S) a 1,5 mg/ml en tampón fosfato-
ácido cítrico 0,1 M, pH 5,0 (preparado según las instrucciones de
Dakopatts) fue añadido junto con H_{2}O_{2} (0,015%). Después de
exactamente 5 minutos, la reacción fue parada mediante 100
\mul/pocillo de H_{2}SO_{4} 1 M y la absorbancia fue medida a
490 nm.
Para establecer una curva patrón, los valores de
absorbancia obtenidos anteriormente para las muestras de diluciones
plasmáticas se representaron en el eje y frente a las diluciones
plasmáticas (1:40-1:640) en un eje x logarítmico en
una forma estándar (Fig. 1). Las muestras de pacientes fueron
ensayadas a una dilución 1:100 y la absorbancia obtenida fue usada
para calcular la cantidad de proteína S libre. Los valores fueron
expresados como % de la proteína S libre en el plasma normal. Los
valores en % de la proteína S libre pueden ser leídos directamente
en el eje x alternativo (inferior) en la Fig. 1. Los ensayos pueden
también ser calibrados frente a un patrón internacional que tiene un
nivel de proteína S asignado o frente a un patrón de proteína S
purificada.
El protocolo final del ensayo del Ejemplo 2 fue
determinado después de un ensayo cuidadoso de las condiciones para
las diversas etapas. En realidad, cada etapa fue evaluada con el fin
de encontrar el ensayo más rápido sin comprometer la exactitud del
ensayo. Así, el procedimiento descrito anteriormente fue el
resultado de una evaluación integrada de la influencia de diversas
diluciones, temperaturas y tiempos de incubación y representa sólo
una de las muchas posibles combinaciones que dan un procedimiento de
ensayo satisfactorio. Las condiciones preferidas actualmente y otras
condiciones adecuadas son obvias a partir de lo siguiente.
La temperatura ambiente permitió una unión más
rápida de la proteína S libre al C4BP inmovililzado y fue por lo
tanto usada más que la incubación en el refrigerador. Tres
diluciones plasmáticas diferentes (1:60, 1:120, y 1:240) fueron
incubadas entre 30 minutos y 5 horas antes de que el resto de ensayo
fuera completado. La disolución 1:60 dio la máxima respuesta (alta
absorbancia) ya después de 1 hora, la dilución 1:120 después de 2
horas y la dilución 1:240 alcanzó su máximo después de
4-5 horas. Para propósitos prácticos, se prefieren
30 minutos de incubación y una dilución de plasma de pacientes
1:100.
Las diluciones del anticuerpo monoclonal
biotinilado (1:500-1:4000) fueron incubadas durante
15 y 30 minutos en el ensayo. Las diluciones más altas dieron
valores de absorbancia casi tan altos como las diluciones más bajas.
Una dilución 1:1000 y 15 minutos de incubación fueron, por tanto,
preferidos.
De manera similar a la descrita anteriormente, se
estableció que el tiempo de incubación y el factor de dilución para
la enzima sería preferiblemente una dilución 1:2500 y 15 minutos de
tiempo de incubación. El tiempo de conversión del sustrato sería
preferiblemente de 5 minutos.
El presente ensayo realizado esencialmente como
se describe en el Ejemplo 2 es un ensayo fiable, que es fácil de
realizar. La velocidad de acoplamiento para la proteína S a su sitio
de unión en C4BP permite tiempos de incubación cortos. La lenta
velocidad de desacoplamiento de la proteína S del C4BP permite una
realización de los procedimientos de lavado y subsiguientes etapas
que incluyen la adición de anticuerpo monoclonal dirigido contra la
proteína S unida, además de la enzima conjugada y finalmente el
sustrato para la enzima. Por otro lado, la velocidad de activación
se ha encontrado que es más rápida que la velocidad de inactivación
más lenta en presencia de calcio. Por esta razón, el tampón usado en
el ensayo contiene preferiblemente calcio. Esto es probablemente un
factor importante que contribuye al excelente rendimiento del
ensayo. Adicionalmente, optimizando cada etapa, es posible reducir
el tiempo requerido para realizar el ensayo. Así, es posible diseñar
un ensayo rápido, que puede ser realizado en 2 horas. Además, el
ensayo es adecuado para automatización y permite el procesamiento de
un gran número de muestras.
Para ensayar la especificidad del ensayo para la
proteína S libre, se realizaron dos experimentos diferentes. En el
primer experimento, el plasma deplecionado de la proteína S fue
ensayado de acuerdo con el presente ensayo y se encontró que
contenía niveles indetectables de proteína S libre. Esto indicó que
el ensayo no estaba detectando ningún otro componente del plasma. En
experimentos de reconstitución, es decir, después de reintroducir la
proteína S en el plasma deplecionado de proteína S, la recuperación
de proteína S fue de entre 80% y 90%. Así, la adición de tres
concentraciones de proteína S altamente purificada al plasma
deplecionado de proteína S (20, 10, y 5 \mug/ml) dio en el ensayo
aproximadamente 17,5, 8,5 y 3 \mug/ml, respectivamente, siempre
que el 100% del nivel normal de plasma corresponda a 10 \mug/ml de
proteína S libre, que se ha sugerido en la literatura (Malm y otros
"Changes in the plasma levels of vitamin
K-dependent protein C and S and
C4b-binding protein during pregnancy and oral
contraception", Brit. J. Haematol. (1988) 68:
437-443). Así, dentro del error experimental, este
experimento apoya la conclusión de que el ensayo es específico para
la proteína S y sugiere que es también específico para la forma
libre de la proteína S. Para demostrar este último punto, se añadió
C4BP al plasma humano (en cantidades que darían teóricamente
relaciones molares 1:1, 2:1 y 10:1 de C4BP a proteína S libre en
plasma- asumiendo de nuevo una cantidad de 10 \mug/ml de proteína
S libre en el plasma normal) e incubada durante 1 hora a 37ºC. La
idea con este experimento fue que C4BP puede unir proteína S libre y
que esto llevaría a una caída en la cantidad medida de proteína S
libre. Se encontró que también este era el caso, ya que la adición
de un exceso de dos veces molar de C4BP comparado con la proteína S
libre resultó en una caída del 90% en proteína S libre. La
especificidad del ensayo para la proteína S libre fue también
después demostrada mediante comparación del resultado del presente
ensayo con los obtenidos con dos ensayo de la técnica anterior para
la proteína S libre. Esta comparación está descrita en más detalle
en el Ejemplo 4. El coeficiente de variación del ensayo se encontró
que era del 8,5% para determinaciones de interensayos (n=15) y 7% o
de intraensayos (n=20).
Cuando se realizó el ensayo según el protocolo
descrito en el Ejemplo 2, la dilución 1:100 representó el 100% que
corresponde a aproximadamente 100 ng/ml de proteína S
libre(asumiendo una cantidad de 10 \mug/ml de proteína S
libre en plasma sin diluir). El ensayo permitió una cuantificación
precisa de los niveles de proteína S libre entre 15 y 250% (cuando
se usa una dilución plasmática de 1:100) que corresponde a
15-250 ng/ml de proteína S libre. Usando otra
dilución plasmática, por ejemplo 1:5 ó 1:10, el ensayo puede ser aún
más sensible y medir niveles tan bajos como 1%, que puede ser de
interés en ciertas situaciones, por ejemplo, en diagnóstico prenatal
para determinar si un niño es deficiente en homocigosis en proteína
S.
La realización del presente ensayo para la
proteína S libre según el protocolo del Ejemplo 2 fue comparado con
los de otros dos ensayos para proteína S libre. El ensayo 1 fue un
radioinmuno ensayo (RIA) casero que está bien caracterizado y que ha
sido a veces considerado en evaluaciones internacionales como un
patrón de oro. El ensayo está previamente descrito por Malm y otros
"Changes in the plasma levels of vitamin
K-dependent protein C and S and
C4b-binding protein during pregnancy and oral
contraception" Brit. J. Haematol. (1988) 68:
437-443. En este ensayo, la proteína S total y libre
se mide con un procedimiento RIA estándar que incluye una proteína S
radiomarcada y un antisuero policlonal para la proteína S. La
proteína S se mide directamente en diluciones plasmáticas, mientras
que la proteína S libre se mide después de la precipitación de los
complejos proteína S-C4BP en plasma con 5% de
polietilénglicol (PEG) 6000. El ensayo es largo (normalmente más de
dos días) y laborioso. El segundo ensayo, que se ha usado para
comparación es un ELISA disponible comercialmente que usa dos
anticuerpos monoclonales, uno de los cuales es específico para la
proteína S libre y se usa como anticuerpo atrapador (es decir, para
el mismo propósito que el C4BP en el ensayo del Ejemplo 2). El
ensayo está disponible de Stago y está descrito en una publicación
por Amiral y colegas, "New direct assay of free protein S antigen
using two distinct monoclonal antibodies specific for the free
form". Blood Coagulation and Fibrinolysis (1994) 5:
179-186.
1. Muestras de plasma (n=220) del Laboratorio de
Coagulación en el Hospital Universitario en Malmö que habían sido
analizadas con el RIA para evaluación de sus niveles de proteína S.
Los pacientes fueron principalmente pacientes con una historia de
trombosis de vena profunda.
2. Miembros de familias deficientes en proteína
S. Un número de familias deficientes en la proteína S han sido
evaluadas con el RIA en el laboratorio de Coagulación mencionado
anteriormente y los resultados han sido publicados por Zöller y
colegas, "Evaluation of the relationship between protein S and
C4b-binding protein isoforms in hereditary protein S
deficiency demonstrating type I and type III deficiencies to be
phenotypic variants of the same genetic disease", Blood (1995)
85: 3524-3531. De estas familias, 150 muestras de
plasma fueron elegidas al azar y ensayadas con el ensayo del Ejemplo
2 así como con el ensayo de Asserachrome para la proteína S de
Diagnostica Stago. Además, los resultados fueron comparados con los
resultados obtenidos con el RIA interno.
3. Muestras de plasma de pacientes (con o sin
deficiencia en proteína S) que reciben tratamiento anticoagulante
oral a largo plazo con antagonistas de la vitamina K (warfarina); 61
muestras de pacientes con episodios trombóticos fueron incluidas, 23
de los pacientes eran de familias con deficiencia en proteína S.
1. Los valores obtenidos con el ensayo para la
proteína S libre descritos en el Ejemplo 2 fueron comparados con los
resultados obtenidos con el RIA interno para la proteína S libre.
Ambos ensayo expresaron la proteína S libre como el % del nivel
normal de proteína S libre. A partir de un análisis de regresión
lineal (Fig. 2), fue obvio que los dos ensayos midieron el mismo
parámetro y que correlacionaban bien. La ecuación de regresión
lineal fue y= 0,984x +1,62; R^{2}= 0,88 (R= 0,94) P=0,0001. No
hubo desviaciones.
2. Las muestras de plasma (n=155) de individuos
que pertenecían a familias con deficiencia en proteína S conocida
fueron ensayadas con los tres ensayos, es decir, el presente ensayo
del Ejemplo 2, el ensayo Stago y el RIA interno. Como se ilustra en
las Fig. 3 y 4, las correlaciones fueron excelentes con valores de
R^{2} próximos a 0,95. Los tres ensayos midieron el mismo parámero
y fueron igualmente eficientes en identificar individuos con
sospechada deficiencia en proteína S. Cuando se comparó con el
ensayo de Stago, la ecuación de regresión fue y=
1,218x-16,42 (el presente ensayo en el eje x) que
indica una curva de dosis-respuesta más inclinada
con el presente ensayo. Por otro lado, el presente ensayo fue más
preciso para valores bajos y dio resultados tan bajos como próximos
a 0%, mientras que en el ensayo Stago, ninguna de las muestras dio
valores por debajo del 5%. Hubo un intercepto negativo de -16,42.
Cuando el presente ensayo se comparó en cambio con el RIA interno,
el intercepto fue positivo (+9,526) (ecuación de regresión y=
1,024x+ 9,526). En esta comparación, la pendiente estuvo próxima a
1.
3. Las correlaciones obtenidas con las muestras
plasmáticas de pacientes que reciben anticoagulación oral fueron
aceptables. En ensayos que implicaban la comparación con el RIA, la
ecuación de regresión fue y= 0,88x-2. R^{2}=0,86 e
y denota valores de RIA.
De los ejemplos anteriores 1-4,
es obvio que el C4BP es factible como un ligando atrapador en
ensayos para la proteína S libre, teniendo dicho ensayo una
precisión al menos tan alta como ensayos de la técnica anterior. Por
otro lado, el presente ensayo implica que C4BP es menos largo y es
fácil para realizar de modo rutinario.
El siguiente Ejemplo 5 se refiere a realizaciones
del presente invento usando anticuerpos como ligandos atrapadores,
anticuerpos que inmunoreaccionan de modo específico con el sitio de
unión para C4BP en la proteína S y también con los polipéptidos
relacionados con la proteína S del presente invento. En el Ejemplo
5, la unión de los presentes polipéptidos a C4BP y su capacidad para
inhibir la unión de C4BP a la proteína S y, por tanto, las
interacciones proteína S/C4BP, son investigadas y comparadas con
polipéptidos fuera del alcance del presente invento (inclusive de
algunos polipéptidos de la técnica anterior). Los presentes
polipéptidos, que tienen las propiedades anteriormente mencionadas,
serán viables como inmunógenos o antígenos para producir los
presentes anticuerpos, que pueden ser usados como ligandos
atrapadores en ensayos del presente invento.
Los péptidos lineales relacionados con la
proteína S listados en la Tabla 1 fueron sintetizados en un
sintetizador MilliGen 950 Plus como una "síntesis peptídica de
flujo contínuo" usando química Fmoc con ésteres activos, es
decir, pentafluorofenil ésteres. Los péptidos son de aquí en
adelante referidos por sus designaciones polipeptídicas como se
listan en la Tabla 1. También están listados en la Tabla 1 los
residuos aminoacídicos de cada péptido y los correspondientes
números de identificación de la secuencia aminoacídica de la
proteína S madura. El primer aminoácido en la síntesis (el
aminoácido C-terminal) fue acoplado a la resina
PEG-PS Support TM de Millipore (polietilén glicol
poliestireno). Después de la síntesis, la resina fue lavada y
secada. El péptido fue liberado de la resina mediante corte durante
2 horas en N_{2}-gas en oscuridad usando TFA
92-95% que contenía diferentes sustancias
eliminadoras dependiendo de la composición aminoacídica del péptido.
La resina fue eliminada mediante filtración y lavada con TFA
concentrado. Después de la concentración, el péptido fue precipitado
y lavado 4 veces en dietiléter frío. El éter fue evaporado y el
péptido fue disuelto en TFA/H_{2}O 0,1% (o en ácido acético
50-75% para los péptidos SL1, SLl2, SL4, SL6 y SL7
que fueron difíciles de disolver en TFA 0,1%). El péptido fue
purificado en un HPLC (Waters 600E System Controller, Waters 486
Tunable Absorbance Detector en una columna C8 (Kromasil 5, 100A C8,
250 mm x 21,2 mm) usando un gradiente lineal de A) TFA 0,1%
/H_{2}O y B) TFA 0,1%/acetonitrilo 80%/H_{2}O. El péptido fue
concentrado mediante centrifugación al vacío con un speedvac y
liofilización.
| Designación Secuencia de residuos aminoacídicos | nº.id. | |
| sec. hPS | ||
| BD4 | LDGCIRSWNLMKQGASGIKEIIQEKQNKHCLVT | 405-437 |
| BD6 | YNGCMEVNINGVQLDLDEAISKHNDIRAHSCPSV | 595-628 |
| SL1 | KPENGLLETKVYFAGFPRK | 374-392 |
| SL2 | EKGSYYPGSGIAQFHIDYNNVS | 439-460 |
| SL3 | SDQQSHLEFRVNNLEKSTPLK | 527-550 |
| SL4 | DKAMKAKVATYLGGLPDVPFSAT | 567-589 |
| SL5 | LVTVEKGSYYPGSGIAQ | 435-451 |
| SL6 | SGIAQFHIDYNNVSSAEGWHVN | 447-468 |
| SL7 | LVTVEKGSYYPGSGIAQFHIDYNNVSSAEGWHVN | 435-468 |
Los péptidos BD4 y BD6 fueron reducidos (en Tris
0,1M pH 8,3 con DTT 0,1M y guanidinio 6M-HCl,
durante 2 horas a temperatura ambiente a una concentración peptídica
de 10 mg/ml) previo a la purificación por HPLC (como se describe
anteriormente). Después de la purificación se plegaron para formar
un enlace por puente disulfuro entre las dos cisteínas en cada
péptido (en Tris 0,1M pH 8,3 con EDTA 1 mM, cisteína 3
mM-HCl y cistina 0,3 mM en N_{2} gas durante 16
horas a temperatura ambiente a una concentración peptídica de 0,1
mg/ml). Los péptidos fueron sometidos a una segunda purificación
por HPLC (como se describe anteriormente) tras el plegamiento.
Todos los agentes químicos fueron de la mayor
pureza disponible comercialmente. Los tampones y las demás
disoluciones fueron autoclavadas o filtradas para esterilidad previo
a su uso. El material de laboratorio esterilizado fue usado a lo
largo de todo el proceso. Las siguientes abreviaturas para los
tampones autoclavados fueron usadas en este Ejemplo: TBS= Tris 50
mM, NaCl 0,15 M, CaCl_{2} 2 mM, pH establecido a 7,5 con HCl;
TBS/Tween = TBS con adición de Tween 0,5%; TBS/NaN_{3} = TBS con
adición de NaN_{3} 0,02%; HC= Hepes 10 mM, NaCl 0,15 M, EDTA 3,4,
Tween 20 0,005%, pH 7,4; PBS= tampón fosfato sódico 0,1 M, pH 7,0
con NaCl 0,15 M. Los chips sensoriales CM5 y el kit de acoplamiento
de aminas que contenía N-hidroxisuccinimida (NHS),
N-etil-N'-(3-dietilaminopropil)-carboxidiimida
(EDC) e hidrocloruro de etanolamina fueron de Pharmacia Biosensor
AB (Uppsala, Suecia). El tensioactivo Tween 20 fue de Riedel de
Haen. El kit de NHS-LC-biotinilación
fue de Pierce (Rockford, Illinois). Los agentes químicos para la
síntesis peptídica fueron de Millipore.
Las placas de microvaloración fueron recubiertas
con C4BP, 50 \mul/pocillo, 10 \mug/ml en tampón carbonato sódico
0,075 M, pH 9,6. Las placas fueron incubadas durante toda la noche a
4ºC y después lavadas con TBS, pH 7,5, que contenía Tween 20 0,1%.
Después del apagamiento (TBS, pH 8,0 que contenía Tween 20 0,05%,
gelatina de pescado 3% y NaN_{3} 0,02%, 100 \mul/pocillo, 30
minutos) y lavado, se añadieron concentraciones crecientes de los
péptidos (0,1-3000 mM) o de la proteína S humana
purificada de plasma (0,13-1333 mM) en TBS que
contenía EDTA 10 mM junto con una cantidad traza de proteína S
marcada con I^{125} en un volumen final de 50 \mul y se dejó a
4ºC durante toda la noche. Los pocillos fueron lavados después y la
cantidad de la proteína S unida detectada usando un contador
\gamma.
Los estudios de resonancia de plasmón superficial
fueron realizados usando un aparato BIAcore^{TM} de Pharmacia
Biosensor AB. La inmovilización de C4BP a la superficie de oro de un
chip sensorial recubierta con dextrano fue realizada a un caudal de
5 \mul/min, usando HC como tampón fluído. Volúmenes iguales de NHS
0,1 M y EDC 0,1 M fueron primero mezclados, después de lo cual 30
\mul de la mezcla se hicieron fluir sobre la superficie del chip
sensorial para activar el dextrano carboximetilado. El C4BP fue
después inyectado sobre el chip sensorial (40 \mul de una
disolución de 60 \mug/ml en NaOAc 10 mM a pH 4,75), tras lo cual
los grupos NHS-éster sin reaccionar fueron bloqueados mediante 15
\mul de etanolamina 1M (pH 8,5). El sistema fue regenerado
mediante la adición de 15 \mul de HCl 0,1M, que elimina todas las
moléculas unidas de modo no covalente. La cantidad inmovilizada de
C4BP fue de 8000 RU. La asociación de la proteína S fue monitorizada
con 50 nM de proteína S humana en tampón HC en un flujo contínuo de
1 \mul por minuto durante 45 minutos. La capacidad de cada péptido
para inhibir la unión de la proteína S fue estudiada siguiendo la
asociación a C4BP por mezclas de proteína S y péptido. En
BIAcore^{TM}, la cantidad total de material unido se mide, y los
péptidos son 25 veces más pequeños que la proteína S, la inhibición
de la unión de la proteína S mediante la unión del péptido
disminuirá drásticamente la respuesta observada durante la fase de
asociación. El porcentaje de proteína S unida, X, fue calculado
como
X =
(S-0,04S_{max})/0,96
S_{max}
En la que S es la respuesta medida y S_{max} es
la respuesta obtenida en ausencia del péptido.
Como se describe en la sección D, los péptidos
sintéticos fueron ensayados en lo que respecta a su capacidad para
desplazar la unión de una proteína S trazadora marcada con I^{125}
al C4BP inmovilizado (Fig. 5A). Se encontró que SL2, SL6 y SL7, es
decir, los péptidos del presente invento, inhiben completamente la
unión de la proteína S trazadora al C4BP, mientras que ninguno de
los otros péptidos tuvieron ningún efecto en la interacción de la
proteína S/C4BP. La mitad de la inhibición máxima se observó a
100-200 \muM de los tres péptidos inhibidores
comparado con aproximadamente 2 \muM para la proteína S plasmática
humana purificada.
Como se describe en la Sección E, la capacidad de
los péptidos sintéticos para inhibir la unión de la proteína S
humana al C4BP fue también estudiada usando una resonancia de
plasmón superficial en un sistema BIA-core^{TM}.
Para seis de los péptidos (SL1, SL3, SL4, SL5, BD4 y BD6), se
observó la misma respuesta que con la proteína S sola, aún cuando
los péptidos estaban en un exceso 2000 veces por encima de la
proteína S (péptido 100 \muM, proteína S 50 nM). Sin embargo, los
tres péptidos, SL2, SL6 y SL7, es decir, los péptidos del presente
invento, impiden la unión de la proteína S a C4BP con la mitad de la
inhibición máxima a una concentración del péptido
30-120 \muM (Fig. 5B).
Así, los residuos 447-460 están
presentes en los tres péptidos con acción inhibitoria, es decir, los
péptidos del presente invento, pero están ausentes en los péptidos
que carecen de acción inhibitoria en los ensayos anteriores.
Los resultados experimentales anteriores se
muestran en la Fig. 5A y 5B. En estas figuras, la inhibición
peptídica de la interacción proteína S-C4BP se
muestra como la cantidad de proteína S unida (relativa a la cantidad
unida en ausencia del péptido) frente a la concentración de los
nueve péptidos listados en la Tabla 1: (\medcirc) SL1,
(\blacklozenge) SL2, (\Box) SL3, (+) SL4, (\diamondsuit) SL5,
(*) SL6, (\blacktriangledown) SL7, (\Delta) BD4 &
(\nabla) BD6. En la Fig. 5A, se muestra el resultado de un ensayo
de unión en equilibrio usando C4BP inmovilizado en placas de
microvaloración y proteína S humana marcada radioactivamente. Este
panel también muestra datos con proteína S sin marcar en competición
con la proteína S marcada radioactivamente (\blacktriangle). En la
Fig. 5B, se muestra el resultado del ensayo de resonancia de plasmón
superficial en un chip sensorial BIAcore^{TM}. La cantidad de
proteína S unida, X, fue calculada a partir de la intensidad de
señal observada, S, comparada con la intensidad de señal máxima en
ausencia del péptido S_{max} como X =
(S-0,04)/0,96 S_{max}.
De los resultados anteriores, es obvio que sólo
los péptidos del presente invento, es decir, los péptidos que
comprenden los residuos 447-460 son capaces de
inhibir la interacción proteína S-C4BP (SL2=
439-460, SL6 = 447-468 y
SL7=435-468). La valoración de la polarización de
la fluorescencia (resultados no mostrados) sugiere que estos
péptidos interaccionan directamente con C4BP con una constante de
disociación K_{D} \leq1 \muM. La constante de disociación del
complejo péptido-C4BP es, por tanto, al menos 130
veces superior que la constante de disociación del complejo de
Ca^{2+}-proteína S libre y C4BP (K_{D}= 6,5 nM,
He y otros, 1996) -un resultado razonable en vista de los
experimentos de inhibición en pocillos de microvaloración
(realizados en ausencia de calcio, en tampón que contiene EDTA)
requiriendo 50-100 veces más péptido que proteína S
para producir la mitad de la inhibición máxima de la unión de la
proteína S marcada radioactivamente a C4BP. La diferencia en la
K_{D} observada para el péptido y la proteína podría, en parte,
ser debida a la modificación postraduccional de la proteína.
Por otro lado, aún cuando los péptidos del
presente invento comprenden una secuencia de residuos aminoacídicos
correspondientes a una secuencia aminoacídica de la proteína S
madura, que está próxima a las secuencias documentadas en la técnica
anterior como localizaciones probables del sitio de unión de C4BP,
tales secuencias de la técnica anterior (BD4, residuos
405-437, y BD6, residuos 595-628),
cuando se sintetizaron y ensayaron en lo que se refiere a la
inhibición de la interacción de la proteína S-C4BP
en los ensayo anteriores, no dieron efecto inhibitorio aún cuando se
emplearon en 2000 veces en exceso sobre la proteína S.
Claims (9)
1. Un método para determinar el nivel de proteína
S libre en un fluído biológico, tal como sangre, plasma o suero,
comprendiendo dicho método las etapas de
a) poner en contacto un ligando, que se une
específicamente a la proteína S libre, con dicho fluído biológico
para formar una mezcla de reacción que comprende al menos una fase
líquida;
b) mantener dicha mezcla de reacción durante un
período de tiempo suficiente para que dicho ligando se una a la
proteína S libre en dicho fluído y de ese modo forme un complejo
proteína S/ligando; y
c) determinar el nivel del complejo formado en la
etapa (b) y de ese modo el nivel de proteína S libre en dicho
fluído, método en el que el ligando de la etapa (a) comprende (i) al
menos el módulo SCR en el extremo N-terminal de la
cadena \beta de la proteína de unión al C4B (C4BP); o (ii) una
variante del mismo que tiene una secuencia de residuos aminoacídicos
homóloga y esencialmente las mismas propiedades de unión de la
proteína S.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
dicho ligando de la etapa (a) está unido operativamente a un
vehículo sólido, comprendiendo la mezcla de reacción formada en la
etapa (a) una fase líquida y una fase sólida y el complejo formado
en la etapa (b) en la fase sólida unido al vehículo.
3. El método de la reivindicación 1, en el que la
mezcla de reacción formada en la etapa (a) comprende una fase, que
es una fase líquida.
4. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2 y 3, en el que un medio indicador es añadido a
la mezcla de la etapa (a), siendo dichos medios indicadores añadidos
por separado o en una forma en la que estén unidos operativamente a
o incorporados en el ligando y siendo dichos medios indicadores
capaces de producir, directa o indirectamente, una señal detectable
en la formación del complejo en la etapa (b), y en la que el
complejo formado en la etapa (b) comprende los medios indicadores y
la determinación en la etapa (c) comprende medir la cantidad de
medios indicadores en dicho complejo.
5. El método de la reivindicación 2, en el que la
determinación en la etapa (c) comprende poner en contacto el
complejo que contiene la proteína S unida al vehículo formado en la
etapa (b) con un anticuerpo específico para la proteína S para
formar una mezcla de inmunoreacción que tiene una fase líquida y una
fase sólida y durante un tiempo suficiente para que dicho anticuerpo
inmunoreaccione con dicho complejo para formar un producto de
inmunoreacción unido a la fase sólida; y determinar la cantidad de
dicho anticuerpo presente en dicho producto de inmunoreacción, y de
ese modo la cantidad de dicho complejo que contiene la proteína S
formada en la etapa (b).
6. El método de la reivindicación 5, en el que el
anticuerpo específico para la proteína S es un anticuerpo que tiene
alta afinidad por la proteína S, que se designa HPS54 y se une a un
sitio en la proteína S que es distinto del sitio de unión para C4BP
en la proteína S, llevando dicho anticuerpo opcionalmente un medio
indicador que permite la determinación de la cantidad del mismo
unido a la proteína S en el complejo proteína S/ligando.
7. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, en el que el ligando usado en
la etapa (a) comprende de C4BP.
8. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, en el que el ligando usado en
la etapa (a) comprende al menos un fragmento de C4BP, comprendiendo
dicho fragmento al menos el módulo SCR del extremo
N-terminal de la cadena \beta de la molécula C4BP;
o una molécula hibrida que comprende dichos fragmentos C4BP.
9. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1-8, en el que las etapas (a) y (b)
se realizan en presencia de iones Ca^{++}.
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