ES2232522T3 - Estructuras mixtas resultantes de la incorporacion de una macromolecula biologica en una fase cristal-liquido de anfifilos. - Google Patents
Estructuras mixtas resultantes de la incorporacion de una macromolecula biologica en una fase cristal-liquido de anfifilos.Info
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Abstract
Fase mixta estructurada formada por incorporación de macromoléculas biológicas dispuestas según una estructura cristal-líquido en una fase cristal- líquido de anfífilos, caracterizada por estar presente dicha macromolécula biológica en dicha fase mixta estructurada a razón de al menos un 5% en peso con respecto a los compuestos anfífilos que constituyen dicha fase cristal-líquido y por presentar una al menos de las dos entidades constituidas por la macromolécula biológica por una parte, y el conjunto de los compuestos anfífilos por otra parte, un carácter no cargado.
Description
Estructuras mixtas resultantes de la
incorporación de una macromolécula biológica en una fase
cristal-líquido de anfífilos.
La presente invención se relaciona con nuevos
productos resultantes de la incorporación de macromoléculas
biológicas, en particular de ADN, en una fase
cristal-líquido de anfífilos, así como con los
procedimientos de obtención de estos productos.
La medicina trata hasta el momento presente una
enfermedad aportando una molécula exógena que va a corregir la
disfunción en su causa, o al menos a anular o limitar sus
consecuencias. Desgraciadamente, el empleo de la molécula activa
utilizada en esta estrategia va acompañado, la mayor parte del
tiempo, de efectos secundarios no deseables, que hacen que la
terapia sea a veces inutilizable. Por otra parte, ciertas
enfermedades, ligadas a una deficiencia o a un defecto genético, no
pueden ser tratadas por una aproximación "química", ya sea
porque la molécula activa no existe, ya sea porque es destruida
antes de su acción o porque haría falta administrarla en dosis
demasiado importantes o durante tiempos muy largos.
La terapia génica es una aproximación nueva para
abordar estas insuficiencias de la medicina clásica. Consiste en
reemplazar un gen deficiente o en aportar un nuevo gen que permita
curar un estado patológico. Con una estrategia de este tipo, ya no
se aporta medicamento, sino que se dan al organismos los medios para
luchar contra la enfermedad o para corregir la deficiencia que da
origen a la enfermedad.
Esta estrategia, que ha sido posible gracias a
los progresos de la biología molecular, que han permitido la
identificación y la síntesis de los genes de interés, necesita
poder aportar el gen útil hasta su blanco celular, hacerlo penetrar
después en la célula y finalmente hacerle expresarse. El gen debe
ser vectorizado, es decir, introducido en un vector que va a
hacerle traspasar las diferentes barreras que protegen al organismo
y a la célula de la intrusión de material genético extraño. El
vector ideal debe incorporar suficiente ADN (o ARN), protegerlo de
los diferentes ataques químicos y enzimáticos encontrados in
vivo, ser capaz de alcanzar el preferencialmente el blanco
celular buscado, penetrar en la célula, por ejemplo, por
endocitosis, proteger al ADN de las condiciones muy adversas
encontradas en el endosoma, aportar el gen terapéutico hasta el
núcleo y liberarlo permitiéndole expresarse, o mejor, integrarse en
el genoma de la célula.
Los virus son vectores de ADN (o de ARN para los
retrovirus) que responden perfectamente a la mayoría de estas
constricciones. Están bien estudiados como vectores de genes para
la terapia génica y forman objeto de numerosos ensayos clínicos.
Tienen, sin embargo, un defecto importante, además de sus
dificultades de manipulación y de producción a una escala
importante, que consiste en la sospecha que pesa sobre su
posibilidad de volverse virulentos y de provocar patologías nuevas
incontrolables.
Una importante investigación está consagrada a la
puesta a punto de vectores sintéticos que no presenten evidentemente
ningún riesgo de virulencia. Los liposomas han sido muy estudiados
en este sentido, pero sufren de sus defectos intrínsecos: muy débil
estabilidad, gran dificultad de preparación, muy débil capacidad de
encapsulación y muy débil, incluso inexistente, capacidad para
transfectar el gen. Se ha desarrollado una nueva clase de
liposomas, preparados a partir de lípidos catiónicos, que palia
perfectamente los defectos de los liposomas: mejor estabilidad,
simplicidad de preparación y tasa de transfección significativa,
aunque muy débil con respecto a los virus. Sin embargo, estas
asociaciones entre lípidos catiónicos y nucleótidos no son
liposomas en sentido estricto, sino que son más bien complejos entre
el nucleótido, cargado negativamente, y el lípido, cargado
positivamente (M. Schmutz y col., PNAS 96, p. 12293
(1999)).
La solicitud internacional WO 98/02144 dice que
es posible integrar un nucleótido en vesículas multilamelares con
estructura en cebolla, protegerlo y transportarlo, permitiendo así
su transfección intracelular.
Más recientemente, la patente FR 2.766.706
describió vesículas multilamelares enrolladas, a base de mezclas de
lípidos aniónicos y catiónicos, y su aplicación para transfectar
nucleótidos.
También se conocen vectores de administración de
macromoléculas en forma de liposomas o de vesículas por WO
9.707.784, WO 9.509.610 y WO 9.823.260.
La utilización de liposomas para vectorizar el
ADN o los genes se topa, entre otros, con la imposibilidad de
introducir una cantidad suficiente de nucleótidos en el liposoma.
Para los liposomas clásicos, así como para los liposomas
multilamelares, o bien las vesículas con estructura en cebolla, cuyo
tamaño es del orden del micrómetro, es fácilmente concebible que la
molécula de ADN tenga dificultades para incorporarse, siendo su
tamaño del mismo orden de tamaño. Existe, pues, necesidad de
compactar la molécula para hacerle adoptar una conformación
replegada, que le dé un tamaño aparente compatible con la
encapsulación en estas vesículas lipídicas.
Al estar el ADN cargado negativamente, esta
compactación es realizada en la naturaleza mediante la utilización
de histonas, proteínas catiónicas que acomplejan el ADN y llevan a
partículas de tamaño muy pequeño (inferior a 100 nm). De forma
artificial, tales moléculas, así como otras moléculas catiónicas,
han sido utilizadas para compactar el ADN con el fin de permitirle
incorporarse en vesículas lipídicas de tipo liposoma o vesícula
multilamelar.
Los trabajos sobre la encapsulación del ADN
mediante liposomas a base de lípidos neutros fueron completamente
abandonados a causa de su débil poder de encapsulación (<5%).
Los trabajos actuales se basan en la utilización de moléculas
catiónicas, ya sean tensoactivos, ya sean polímeros, con el fin de
formar complejos con el ADN susceptibles de proteger esta molécula y
de permitir su transfección, realizando a la vez la compactación de
la molécula de ADN y su vectorización. Las partículas así obtenidas
son con frecuencia denominadas liposomas catiónicos, aunque su modo
de preparación y su formulación sean bastante diferentes de los
liposomas clásicos.
Trabajos muy recientes (véanse, por ejemplo, I.
Koltover y col., Science, 281, p. 78, 1998; J.O. Räder y
col., Science, 275, p. 810, 1997; T. Salditt y col.,
Physical Review Letters, 79, p. 2582, 1997) demostraron que,
en estos complejos, el ADN formaba fases de simetría
cristal-líquido, viniendo a intercalarse con la
fase cristal-líquido formada por los tensoactivos
catiónicos.
Se han identificado varias simetrías y las
experiencias de difracción de rayos X (sincrotrón) muestran
claramente la superposición de los diagramas de difracción de cada
uno de los sistemas de tensoactivos y de ADN. Se han utilizado
diversos lípidos catiónicos, que dan lugar a simetrías diferentes de
la fase cristal-líquido de los lípidos. Los
trabajos citados han puesto en evidencia la importancia del papel
de la carga de los lípidos, así como del de la carga total del
complejo, que puede ser positiva o negativa según la proporción
entre lípidos catiónicos y ADN negativo. Además, se sugiere que
estas estructuras de fases cristal-líquido
intercaladas tienen un papel importante en los resultados obtenidos
en transfección.
Los anfífilos, comúnmente llamados tensoactivos,
tienen la capacidad, cuando se introducen en un solvente, por
ejemplo agua, de autoasociarse para formar fases estructuradas u
organizadas. Entre estas fases, se distinguen, en particular, las
fases cristal-líquido, termodinámicamente estables,
que presentan un orden cristalográfico parcial (en una o dos
direcciones del espacio), como las fases lamelares (o esmécticas),
que tienen un orden unidimensional, o las fases hexagonales, que
presentan un orden bidimensional. Existen también fases que
presentan un orden cristalino como la fase cúbica. Estas fases son
frecuentemente llamadas liotropas, ya que su aparición y su
estabilidad dependen de la concentración del anfífilo en el
solvente. Pueden ser también termotropas si su dominio de existencia
depende de la temperatura. Se puede encontrar una descripción de
estas fases en C.L. Khetrapol y col., Nuclear magnetic resonance
studies in lyotropic liquid-crystals, 1975. A
continuación, utilizaremos el término fase estructurada para
describir de un modo general estas fases, salvo en el caso de que
la simetría de la fase esté explícitamente indicada.
Los inventores de la presente invención han
descubierto ahora que era posible obtener estructuras de fases
cristal-líquido intercaladas de ADN y de
tensoactivos, sin tener necesidad de utilizar lípidos catiónicos.
Contrariamente a lo que se indicaba en la literatura, y de forma
totalmente sorprendente, la mezcla de una fase
cristal-líquido de tensoactivo neutro, por ejemplo
zwitteriónico, por ejemplo de una fase lamelar, con el ADN puede
dar lugar, en determinadas condiciones, a la formación de una fase
mixta, en la cual los tensoactivos forman hojuelas lamelares
apiladas según una simetría esméctica, en el seno de las cuales se
intercalan moléculas de ADN, ellas mismas dispuestas según una
simetría cristal-líquido de tipo nemático. Lo que
es más, y de manera aún más sorprendente, estos resultados son
obtenidos únicamente cuando se introduce una gran cantidad de ADN
en la fase lamelar, incluso aunque sea difícil de introducir con un
buen rendimiento una pequeña cantidad de ADN en la fase
lamelar.
Continuando con sus investigaciones, los
inventores de la presente invención han podido establecer que era de
igual modo posible introducir diferentes macromoléculas biológicas,
en particular macromoléculas nucleotídicas, proteínas o
polisacáridos, en fases estructuradas, y ello sin interacción de
tipo electrostático entre dichas macromoléculas y los componentes
de la fase estructurada, a condición, sin embargo, de introducir
una cantidad suficiente de estas macromoléculas en el seno de esta
fase estructurada.
Entre las macromoléculas nucleotídicas
constituidas por encadenamiento de nucleótidos y muy frecuentemente
designadas bajo el vocablo genérico "nucleótido", se
distinguen, según la presente invención, los oligonucleótidos que
comprenden generalmente de 10 a 30 grupos nucleotídicos de base y
como máximo 100 y los polinucleótidos que comprenden un número más
grande de grupos nucleotídicos de base, generalmente más de 100
pares de base y con frecuencia más de 1.000. Incluso aunque no
excluya el caso de los oligonucleótidos tales como los definidos
anteriormente, la invención se aplica muy en particular a las
macromoléculas de tipo polinucleótido tales como las definidas
anteriormente y, en particular, al ADN.
Así pues, los inventores han podido extender los
resultados concernientes a la introducción del ADN en fase
concentrada en una fase estructurada a otros polímeros
biológicos.
La invención ha hecho así posible la
incorporación de macromoléculas en una fase estructurada formada por
membranas de tensoactivos, incluso aunque estas macromoléculas
presenten un tamaño característico superior al espacio entre las
lamelas anfifílicas de esta fase de tensoactivos. La macromolécula
se halla introducida bajo una forma concentrada en la nueva
estructura de la invención y se encuentra, pues, en una gran
concentración en el sistema final formado.
Así, la invención conduce a una mezcla
estructurada, en adelante llamada fase mixta estructurada, formada
por incorporación en una fase cristal- líquido de anfífilos, de
macromoléculas cuyo tamaño característico es superior al de la fase
cristal-líquido y cuya razón de masa con respecto a
los anfífilos es superior al 5%, sin intervención de interacción
electrostática entre las macromoléculas y los anfífilos.
Es siempre posible definir un tamaño
característico de la macromolécula, pero éste depende de la
naturaleza de esta macromolécula. De forma general, se puede citar
el radio de giro, medido, por ejemplo, a partir de experimentos de
difusión estática de la luz. Más concretamente en el caso de las
proteínas, se tomará el radio de giro de la proteína no
desnaturalizada, acompañándose la desnaturalización, en general, de
una variación de este radio. En el caso del ADN, se trata de la
longitud de la molécula no condensada y se obtiene simplemente a
partir de la longitud característica de un par de bases (3,4 A),
multiplicando por el número de pares de bases.
Se puede también definir siempre una longitud
característica para la fase cristal-líquido. De un
modo general, se tratará del tamaño de la red cristalina, mono- o
bidimensional. Está emparentado con el vector de onda de los picos
de difracción de los rayos X. Más concretamente, y a modo de
ejemplos, en el caso de la fase lamelar, éste será la periodicidad
de apilamiento de las lamelas; en el caso de la fase hexagonal, se
tratará de la distancia entre tubos de tensoactivos.
El principal interés de la invención es que
proporciona un medio para formar estructuras concentradas en
macromoléculas biológicas sin recurrir, como es conocido en la
técnica anterior, a una incorporación en la cual la fuerza motriz
es de naturaleza electrostática. La invención permite, pues,
librarse de las cargas eléctricas que, en la técnica anterior,
vienen a perturbar la actividad biológica del complejo formado,
provocando, por ejemplo, la adhesión de estos compuestos a las
paredes de las células y su captura por proteínas plasmáticas.
Además, como se deduce de la descripción que se
da a continuación, la invención permite también preparar, a partir
de estas estructuras mixtas, vesículas multilamelares que
incorporan dichas macromoléculas con razones de encapsulación a la
vez elevadas y controlables.
Así, según una de sus características esenciales,
la invención se relaciona con una fase mixta estructurada formada
por la incorporación de una macromolécula biológica en una fase
cristal-líquido a base de compuestos anfífilos, en
la cual dicha macromolécula biológica está presente en dicha fase
mixta estructurada a razón de al menos un 5% en peso con respecto a
los compuestos anfífilos y una al menos de las dos entidades
constituidas por la macromolécula biológica por una parte, y el
conjunto de los compuestos anfífilos por otra parte, presenta un
carácter no cargado.
Según una variante particularmente ventajosa de
la invención, la fase cristal-líquido de anfífilos
es una fase cristal-líquido lamelar.
Las fases mixtas estructuradas de la presente
invención son mezclas en las cuales la macromolécula viene a
intercalarse de una forma ordenada a larga distancia en una fase de
anfífilos, a su vez ordenada a larga distancia, de tipo
cristal-líquido.
Por fase cristal-líquido, se
entiende una fase cristal-líquido obtenida por
mezcla de anfífilos. Tal fase puede caracterizarse, en general, por
su composición, por una parte, y por una dimensión característica,
por ejemplo su paso esméctico, que es la distancia entre las
lamelas de dicha fase en el caso de la fase lamelar, por otra
parte.
Por anfífilo no cargado, se entiende una molécula
que presenta un carácter anfífilo, pero cuya carga global es neutra.
Incluye moléculas no iónicas, pero también moléculas anfotéricas en
las cuales las cargas positivas y negativas se compensan en el seno
de la misma estructura química, y no gracias a un contraión
móvil.
Como se ha expuesto con anterioridad, es, en
efecto, del todosorprendente haber conseguido incorporar en el seno
de tal fase macromoléculas biológicas que presentan dimensiones
características muy superiores a las de la fase
cristal-líquido, y ello sin recurrir a interacciones
electrostáticas.
En efecto, la invención ha permitido introducir
cantidades importantes de ADN, o más generalmente de macromoléculas
nucleotídicas o de macromoléculas biológicas en fases
cristal-líquido a base de tensoactivos no cargados,
es decir, en condiciones en las cuales, contrariamente a lo que se
ha hecho en la técnica anterior, no hay ninguna interacción de tipo
electrostático entre los tensoactivos y las macromoléculas.
También ha sido posible, en el marco de la
invención, introducir macromoléculas no cargadas en fases
cristal-liquido a base de tensoactivos, por
consiguiente también, sin que haya interacción electrostática que
permita explicar dicha introducción y ello mientras que dichas
macromoléculas son netamente más "voluminosas" que la distancia
entre las lamelas de la fase cristal-líquido y sin
deformación notable de dicha fase.
Las macromoléculas biológicas contempladas por la
presente invención son esencialmente, como se ha expuesto
anteriormente, encadenamientos de nucleótidos y, en particular,
encadenamientos de tipo "polinucleotídico" tales como los
definidos anteriormente, de proteínas o de polisacáridos.
Los polinucleótidos son macromoléculas formadas
por la sucesión de las bases constitutivas del código genético. Se
distinguen principalmente el ADN y el ARN. Se trata de
macromoléculas de tamaño muy grande, cuya longitud puede alcanzar
los 10 \mum. Por su estructura química, los polinucleótidos llevan
siempre cargas negativas, contrarrestadas por cationes.
Las proteínas son macromoléculas formadas por el
ensamblaje de aminoácidos. Su masa molar puede ir hasta más de
200.000 Da, con radios de giro que pueden alcanzar varios cientos
de Angströms. Las proteínas pueden ser catiónicas, neutras o
aniónicas según la naturaleza y la proporción de los diferentes
aminoácidos que las componen, pero también en función del pH,
protonándose y desprotonándose las funciones ácido y amina en
función del pH. Sin embargo, la mayoría de las proteínas, en
condiciones normales de pH (próximas a la neutralidad), son
aniónicas.
Los polisacáridos están formados por cadenas
sacarídicas, que van de varias unidades de azúcar a varios millones.
Los tamaños pueden ser así extremadamente variados y alcanzar
dimensiones cuasi macroscópicas. Según la naturaleza de las
funciones químicas que substituyen a los núcleos sacarídicos, y en
función del pH, los polisacáridos pueden presentar diferentes cargas
eléctricas.
Incluso aunque la invención presente un interés
muy particular en el caso de las macromoléculas biológicas cuyo
radio de giro es muy netamente superior a la distancia entre las
lamelas anfifílicas de la fase cristal-líquido, no
se limita, sin embargo, a tales macromoléculas.
Cualquier tensoactivo susceptible, en mezcla, por
ejemplo, con agua, de formar una fase
cristal-líquido puede ser utilizado en la invención.
En las aplicaciones biológicas preferidas, se tendrá cuidado de
utilizar anfífilos compatibles con la aplicación, y en particular
débilmente tóxicos y bien tolerados, en particular a nivel celular.
La invención no se restringe a un tensoactivo particular o a una
familia particular de tensoactivos, sino a una propiedad intrínseca
de las fases organizadas de tensoactivos. Los anfífilos utilizables
son ventajosamente seleccionados entre el grupo constituido
por:
- \blacklozenge
- glicerolípidos, en particular glicerolípidos fosfolipídicos, hidrogenados o no;
- \blacklozenge
- ácidos grasos C_{6} a C_{30}, saturados o mono- o polinsaturados, lineales o ramificados, etoxilados o no, en forma de ácido o de sal de un metal alcalino o alcalinotérreo o de una amina;
- \blacklozenge
- ésteres etoxilados o no de sacarosa, o de sorbitol, o de manitol, o de glicerol, o de poliglicerol que contienen de 2 a 20 unidades de glicerol o de glicol de estos mismos ácidos grasos;
- \blacklozenge
- mono-, di- o triglicéridos o mezclas de glicéridos de estos mismos ácidos grasos;
- \blacklozenge
- alcoholes grasos C_{6} a C_{30}, saturados o mono- o poliinsaturados, lineales o ramificados, etoxilados o no;
- \blacklozenge
- colesterol y sus derivados, en particular los ésteres de colesterol cargados o neutros, como el sulfato de colesterol;
- \blacklozenge
- otros derivados con esqueleto de esterol, en particular los de origen vegetal, tales como el sitosterol o el sigmasterol;
- \blacklozenge
- éteres, etoxilados o no, de sacarosa, o de sorbitol, o de manitol, o de glicerol, o de poliglicerol que contienen de 2 a 20 unidades de glicerol o de glicol y de estos mismos alcoholes grasos;
- \blacklozenge
- aceites vegetales polietoxilados, hidrogenados o no hidrogenados;
- \blacklozenge
- polímeros secuenciados de polioxietileno y de polioxipropileno (poloxámeros);
- \blacklozenge
- hidroxiestearato de polietilenglicol;
- \blacklozenge
- esfingolípidos y derivados de la esfingosina;
- \blacklozenge
- polialquilglucósidos;
- \blacklozenge
- ceramidas;
- \blacklozenge
- copolímeros de polietilenglicol y de alquilglicol, por ejemplo, los copolímeros de la familia de los ELFACOS de AKZO NOBEL, y
- \blacklozenge
- copolímeros de di- o tribloques de éteres de polietilenglicol y de polialquilenglicol, por ejemplo los copolímeros de la familia de los ARLACELL de ICI.
Estos anfífilos o tensoactivos pueden ser
utilizados solos o en mezcla. Entre estos anfífilos, algunos pueden
formar por sí mismos una fase cristal-líquido, por
ejemplo lamelar, por mezcla con un solvente polar. Otros son
utilizados únicamente en mezcla, en proporción más débil, para
aportar propiedades de rigidez o de elasticidad a la fase
cristal-líquido.
El experto en la técnica sabrá escoger las
moléculas con mayor probabilidad de formar una fase
cristal-líquido entre estas moléculas y controlar
la formación de dicha fase cristal-líquido por
microscopía óptica. Se hará notar que la mayor parte de los
tensoactivos antes citados no están cargados y no son, pues,
susceptibles de intervenir por una interacción electrostática en la
condensación de la macromolécula que se desea insertar en la fase
cristal-líquido. Tales tensoactivos no cargados
están, pues, adaptados a la incorporación de macromoléculas
cargadas, tales como el ADN. En la lista dada anteriormente,
algunos tensoactivos presentan una carga; es el caso, en
particular, de las sales de ácidos grasos o de ciertos fosfolípidos
o de los derivados de la esfingosina, que podrán ser utilizados para
la incorporación de macromoléculas no cargadas en las fases mixtas
de la invención.
Como se ha expuesto anteriormente, una de las
características esenciales de la invención es que permite hacer
estructuras concentradas en macromoléculas sin tener que recurrir a
fuerzas electrostáticas. Así, cuando la macromolécula presente un
carácter iónico, se utilizarán, según la invención, agentes
anfífilos no cargados. Sin embargo, se podrá admitir también según
la invención la introducción en las composiciones de la invención
de cantidades relativamente bajas de productos con carácter iónico
para conferir, por ejemplo, propiedades particulares a la
estructura mixta de la invención o a las vesículas obtenidas por
dispersión de esta estructura mixta (como se deduce de la
descripción que se da a continuación). En este caso, se distinguirá
el tensoactivo principal, que no tiene necesidad de presentar una
ionicidad cualquiera, del aditivo eventualmente iónico añadido con
el fin de modificar las propiedades, por ejemplo las propiedades de
adhesión a las paredes celulares, de la estructura formada. Esta
distinción es fácil de realizar, ya que la estructura original de
la invención, obtenida por incorporación de una gran cantidad de
macromolécula biológica en el seno de una fase
cristal-líquido, puede ser obtenida en ausencia del
aditivo, pero evidentemente no en ausencia del tensoactivo
principal.
Es, pues, importante observar que, más que la
noción de cantidad relativa entre el tensoactivo principal y el
aditivo, es el papel respectivo de cada uno lo que los distingue.
El aditivo, que podrá ser a su vez un tensoactivo o bien un
polímero, por ejemplo, podrá ser iónico. En este caso, podrá ser o
bien incluido en la estructura, o bien injertado o adsorbido en la
superficie. El aditivo podrá así aportar, por ejemplo, una
propiedad de adhesión de superficie interesante para favorecer la
captura de la mezcla que incluye la macromolécula por una
célula.
El modo de preparación preferido de estas nuevas
estructuras es muy similar al de las vesículas multilamelares de
tensoactivos.
De forma general, este procedimiento comprende
las siguientes etapas:
- -
- preparación de una mezcla homogénea que contiene los compuestos anfífilos y la macromolécula, estando presente dicha macromolécula en proporciones ponderales de al menos un 5% con respecto a dichos compuestos anfífilos;
- -
- incorporación de una cantidad adecuada de medio acuoso o polar para formar una fase cristal-líquido con dichos compuestos anfífilos.
La cantidad adecuada de medio acuoso podrá ser
controlada por microscopía óptica o polar, que permite poner en
evidencia la formación de la fase
cristal-líquido.
El valor del 5% dado anteriormente es un valor
mínimo para obtener la fase mixta estructurada de la invención. El
experto en la técnica comprenderá fácilmente que los valores óptimos
de esta razón varían con la naturaleza de la macromolécula y sus
dimensiones, así como con la naturaleza de los agentes anfífilos
utilizados. De forma general, se ha constatado que la incorporación
de la macromolécula en la fase cristal-líquido se
hacía tanto mejor cuanto mayor era la cantidad de macromolécula
introducida. Los valores límite que se pueden encontrar están más
ligados a consideraciones de orden práctico, en particular las
concentraciones máximas de macromolécula que conducen a soluciones
o dispersiones bastante fluidas para ser manipuladas, que a
consideraciones teóricas. Se puede, sin embargo, imaginar fácilmente
que una razón 1/1 entre tensoactivo y macromolécula es un límite
razonable, si no es absoluto.
Así, en el caso de la preparación de una fase
mixta estructurada según la invención que contiene una macromolécula
constituida por un encadenamiento de grupos nucleotídicos, en
particular de ADN, el modo de preparación preferido es muy similar
al de las vesículas multilamelares de tensoactivos. Consiste en
preparar una fase lamelar a partir de un tensoactivo o de una mezcla
de tensoactivos y de una fase acuosa. La fase acuosa contiene al
menos un soluto bastante concentrado de dicha macromolécula, en
particular de una molécula de ADN o de ARN.
La razón \rho en masa entre anfífilos y
macromoléculas nucleotídicas está comprendida entre 20 y 1,
preferiblemente entre 5 y 1 (lo que significa que, para 1 g de
tensoactivo, se tienen de 0,2 g a 1 g de macromolécula
nucleotídica).
La mezcla para preparar la fase lamelar puede
hacerse en una sola etapa, pesando todos los componentes por
separado y añadiéndolos conjuntamente. En este caso, se puede
proceder opcionalmente, con el fin de favorecer la homogeneidad de
la mezcla, a uno o varios ciclos de congelación/descongelación y/o
uno o varios ciclos de liofilización y rehidratación.
Si determinados componentes de la mezcla son
difíciles de solubilizar (por ejemplo, el colesterol), se puede
utilizar también eventualmente un solvente, por ejemplo un alcohol
o un solvente clorado, o una mezcla de estos solventes, con el fin
de disolver estos componentes y luego, tras la evaporación, obtener
una mezcla homogénea de estos componentes, que dará, por
hidratación, la fase cristal- líquido, preferiblemente lamelar.
El método exacto de preparación no es crítico
para el éxito en la incorporación, a condición de que la fase
cristal-líquido, preferiblemente lamelar, esté
concentrada y de que no haya exceso de solvente (fase acuosa) y se
pueden utilizar determinados métodos clásicos utilizados para
aumentar la tasa de encapsulación de un producto en los liposomas u
otras vesículas multilamelares de fosfolípidos o de otros anfífilos
no cargados. Se verá de evitar, sin embargo, cualquier exceso de
agua o de solvente acuoso o polar, que podría conducir directamente
a la formación de vesículas de tipo liposoma clásico. La cantidad
de agua o de medio acuoso o de solvente polar deberá
corresponderse, en efecto, como se ha indicado anteriormente, a la
cantidad adecuada para formar una fase
cristal-líquido, en particular una fase
cristal-líquido lamelar.
Los ensayos realizados por los inventores de la
presente invención han permitido caracterizar claramente las nuevas
estructuras formadas, y ello apoyándose en los resultados obtenidos
en la difracción de rayos X de las fases obtenidas por mezcla de
tensoactivos y de macromoléculas a diferentes concentraciones,
trazando así el diagrama de fase del sistema
agua/tensoactivo/macro-molécula, así como en el
análisis de la densidad electrónica deducida de las intensidades de
los picos de difracción.
Los diferentes resultados obtenidos resultantes
de la descripción y de los ejemplos que siguen son dados igualmente
en relación a las figuras 1 a 5 adjuntas, que representan,
respectivamente:
Figuras 1A a 1D: La intensidad de difracción de
rayos X (sincrotrón) de las fases lamelares con un 50% de agua en
función del vector de onda q (q=4\pi sin\theta/\lambda) para
diferentes razones de masa lípido/ADN, p.
- Figura 1A: \rho = \infty (ausencia de
ADN).
- Figura 1B: \rho = 80,
- Figura 1C: \rho = 20 y
- Figura 1D: \rho = 2. En la Figura 1D, el pico
de correlación entre las hebras de ADN está indicado mediante una
flecha en la inserción.
Figura 2A: El perfil de densidad electrónica a lo
largo del eje de apilamiento de las capas de lípidos para la fase
lamelar a \rho = 2 y 47,4% de H_{2}O (línea continua). Para la
comparación, se muestra igualmente (línea de puntos) el perfil de
densidad electrónica de una fase lamelar en ausencia de ADN.
Figura 2B: Una representación esquemática de la
fase lamelar que contiene el ADN organizado (L^{c}_{\alpha}). La
flecha larga horizontal indica la distancia de repetición de la
fase lamelar (alrededor de 80\ring{A}) y la flecha corta vertical
indica la distancia entre hebras de ADN (30 a 40\ring{A}).
Figura 3: La tasa de encapsulación (medida como
la cantidad de ADN encapsulado en el interior con respecto a la
cantidad total de ADN incorporado en la formulación) de las
vesículas obtenidas a partir de una fase L^{c}_{\alpha} con
\rho = 2, en función de la osmolaridad (expresada en
miliosmomoles) del medio de dispersión.
Figura 4: El perfil de difracción sincrotrón de
rayos X de las vesículas obtenidas a partir de la fase
L^{c}_{\alpha} a \rho = 2 y 50% de H_{2}O, dispersadas en
un medio a 603 (línea continua) y 1.457 (línea de puntos) mOsm. Las
flechas de la inserción indican los picos de correlación entre
hebras de ADN.
Figura 5: La razón de masa lípido/ADN
encapsulado, \rho*, de las vesículas que contienen ADN a \cong
150 pb (gris obscuro) o un plásmido de 5.581 pb (gris claro)
determinada tras la dilución de las vesículas en un tampón PBS a 300
mOsm en función de la razón de masa lípido/ADN, \rho, de la fase
lamelar.
A continuación, se dan los resultados obtenidos
en el caso del ADN. Esta molécula fue seleccionada por dos razones.
La primera, porque existía una imposibilidad cierta de encapsular en
microvesículas no catiónicas cantidades útiles de ADN. La segunda,
porque, desde un punto de vista demostrativo, el ADN, por su muy
gran longitud y su estructura particular, es ciertamente el reto más
difícil de resolver. El experto en la técnica comprenderá que, si
se pueden encapsular por este método grandes cantidades de ADN,
molécula particularmente embarazosa, la generalización a las otras
macromoléculas, como las proteínas o los polisacáridos, cuyo
comportamiento es más común, no presenta dificultades mayores.
La principal prueba experimental de la
incorporación de la macromolécula nucleotídica en la fase lamelar es
obtenida por difracción de rayos X. En efecto, la fase lamelar,
como toda fase cristal-líquido, que presenta un
período de repetición a lo largo del eje de apilamiento, va a dar
una señal en la difracción de rayos X, llamada pico de Bragg. La
posición de este pico de difracción (expresada en ángulo de
difracción, o en vector de onda q) depende directamente de la
distancia de repetición. Además, las intensidades de los picos están
ligadas al perfil de densidad electrónica de la unidad
repetitiva.
Las observaciones en difracción de rayos X fueron
efectuadas para diferentes valores de la razón de masa lípidos/ADN,
\rho, y de concentración de agua de las muestras. Se dan cuatro
gráficos de difracción con hidratación constante (50% de agua)
(véanse las Figuras 1A a 1D): en ausencia de ADN, para \rho = 80
(débil carga de ADN), \rho = 20 (carga media de ADN) y \rho = 2
(fuerte carga de ADN).
Para el sistema en ausencia de ADN, o para bajas
cantidades de ADN, se observan picos de Bragg característicos de una
fase lamelar (véanse las Figuras 1A y 1B). La distancia de
repetición a \rho = 80 (\cong 59\ring{A}) está ligeramente
reducida con respecto al sistema en ausencia de ADN (\cong
63\ring{A}), probablemente a causa de una deshidratación parcial
de la fase lamelar debida a la presencia de ADN no incorporado.
Para \rho = 20, se observa la coexistencia de
dos sistemas de difracción, que revela la coexistencia de dos fases
lamelares (véase la Figura 1C), una desprovista de ADN, con una
distancia de repetición más débil (\cong 53\ring{A}) que la
fase lamelar en ausencia de ADN, y la otra enriquecida en ADN, que
muestra un aumento muy grande de la distancia de repetición (\cong
129\ring{A}).
Para \rho = 2, se observa la existencia de un
solo sistema lamelar, con una distancia de repetición aumentada
(\cong 77\ring{A}) con respecto a la fase lamelar que no
contiene ADN (véase la Figura 1D). Además, se observa un pico de
correlación entre hebras de ADN (\cong 32\ring{A}). Este pico
se desplaza al cambiar la cantidad de ADN en la fase lamelar,
demostrando que el ADN se incorpora efectivamente en la fase lamelar
de lípidos en forma ordenada. Además, se ha observado que, haciendo
variar la concentración de agua de tal sistema, las dos distancias
de repetición, la de la fase lamelar y la de la distancia de
correlación entre moléculas de ADN, variaban de la misma manera. Se
deduce de ello la existencia, sorprendente, a alta concentración de
ADN (el fenómeno es observable para \rho < 6), de una red de
ADN intercalada entre las capas de la red de lípidos.
Se deduce otra prueba de la existencia de este
sistema mixto de redes intercaladas de fase lamelar de lípido y de
fase organizada de ADN del análisis de la densidad electrónica, a
partir de las intensidades de los picos de difracción. En la Figura
2, se da el perfil de densidad electrónica de una fase lamelar
lípido/ADN/agua (\rho = 2) a lo largo del eje de apilamiento de
las capas de lípidos. Con fines comparativos, se muestra también en
la figura mediante línea de puntos un perfil de densidad
electrónica de una fase lamelar en ausencia de ADN. La diferencia
mayor entre estos dos perfiles es la presencia de un hombro de
fuerte densidad electrónica a aproximadamente 40\ring{A} del
centro de la bicapa lipídica y de una anchura a media altura próxima
a 10\ring{A}. Esto es compatible con la presencia de moléculas de
ADN intercaladas en la fase acuosa entre las bicapas de lípidos. A
continuación, se llamará a esta fase lamelar que contiene ADN
organizado L^{c}_{\alpha}.
Estas observaciones son del todo similares a las
que se habían hecho con los lípidos catiónicos (véanse I. Koltover y
col., Science, 281, p. 78, 1998; J.O. Räder y col., Science,
275, p. 810, 1997; T. Salditt y col., Physical Review
Letters, 79, p. 2582, 1997), pero, de forma totalmente inesperada,
este fenómeno es obtenido para fases de tensoactivos no
cargados.
Este resultado es sorprendente, ya que las
explicaciones avanzadas por los autores de los trabajos sobre la
incorporación de ADN en fases lamelares de lípidos catiónicos
estaban ligadas a la presencia de fuertes interacciones iónicas
entre los lípidos y el nucleótido. En el caso de la invención, tales
interacciones no existen y la explicación conocida por el experto en
la técnica no es, por lo tanto, válida. Sin que eso constituya una
prueba, ni una explicación del fenómeno observado, se puede avanzar
que, en el caso de la invención, la estabilidad termodinámica de la
construcción obtenida (red mixta de lípidos y de ADN) únicamente a
fuerte concentración de ADN podría estar ligada a la baja pérdida
de entropía de un sistema de este tipo, en donde los dos
subconjuntos están ordenados, con respecto a un sistema menos
concentrado, en donde este término entrópico no sería tan
eficaz.
Las nuevas estructuras puestas en evidencia en el
marco de la presente invención antes descritas se revelan como
particularmente interesantes por la posibilidad de transformar estas
nuevas estructuras, por dispersión, en vesículas multilamelares con
estructura en cebolla, que incorporan en su seno dichas
macromoléculas a concentraciones nunca observadas hasta la
fecha.
Así, según otro de sus aspectos, la invención se
relaciona con vesículas obtenidas a partir de los medios mixtos de
la invención, por simple dispersión de este medio, así como con un
procedimiento para preparar estas vesículas y, en particular, para
manipular la tasa de encapsulación de las macromoléculas en el seno
de dichas vesículas.
Los ensayos realizados por los inventores de la
presente invención han permitido, en efecto, evidenciar claramente
la presencia efectiva de las macromoléculas en la fase lamelar,
incluso tras la dispersión de ésta en medio acuoso, es decir, en
condiciones en las que la fase L^{c}_{\alpha} es
termodinámicamente inestable.
Además, los ensayos realizados por los inventores
de la presente invención han permitido mostrar como, actuando sobre
la fuerza iónica del medio de dispersión, se podía actuar sobre la
tasa de encapsulación de dicha macromolécula en el seno de dichas
vesículas.
Se dan a continuación los resultados obtenidos
con el ADN. Como se ha indicado anteriormente, la generalización a
las otras macromoléculas biológicas no presenta dificultades,
siendo el comportamiento de estas macromoléculas siempre más simple
que el del ADN. Las consideraciones de influencia de la fuerza
iónica sobre la variación de la tasa de encapsulación son
directamente extrapolables a estas macromoléculas, estando el
fenómeno más ligado a las presiones osmóticas engendradas por las
diferencias de fuerza iónica y a sus consecuencias sobre la
integridad de las vesículas que a la influencia de ésta sobre la
conformación de la macromolécula.
También se realizaron experimentos para verificar
la presencia efectiva del ADN en la fase lamelar, incluso tras la
dispersión de ésta en medio acuoso, es decir, en condiciones en las
que la fase L^{c}_{\alpha} es termodinámicamente inestable. Se
mostró que, teniendo en cuenta la muy elevada concentración de ADN
en la fase lamelar de lípido, que conlleva una osmolaridad
importante, es indispensable dispersar la fase lamelar que contiene
el ADN en un medio acuoso de fuerza iónica suficiente. Se obtuvo
esto por utilización de un tampón acuoso como medio de dispersión.
Se da el resultado en la curva representada en la Figura 3, donde
se da el rendimiento de encapsulación (medido como la cantidad de
ADN encapsulada en el interior con respecto a la cantidad total de
ADN incorporada a la formulación) en función de la osmolaridad del
medio de dispersión. A continuación, la unidad utilizada para la
osmolaridad es el miliosmomol (mOsm), unidad habitualmente
utilizada en el ámbito biológico. Esta unidad está ligada al pascal
por una relación lineal: 100 mOsm = 2,4777.10^{5} Pa.
Se observa que, para una osmolaridad superior a
\cong 500 miliosmomoles, el rendimiento de encapsulación es
constante a alrededor del 70%, pero se observará igualmente que ya
se obtiene una buena tasa de encapsulación de aproximadamente el
60% a 300 mOsm (medio fisiológico).
Además, hemos demostrado un fenómeno
sorprendente. Es posible dispersar las vesículas de la invención a
una osmolaridad superior a la del medio fisiológico con el fin de
optimizar la tasa de encapsulación del ADN y diluirlas luego en un
medio fisiológico sin pérdida del ADN encapsulado. Hemos demostrado,
además, que el ADN encapsulado en las vesículas según la invención a
base de lípidos neutros está, en efecto, protegido contra su
degradación por la ADNasa y que estas dispersiones tienen una muy
buena estabilidad (disminución de la tasa de encapsulación de
aproximadamente un 70% a aproximadamente un 60% después de un
mes).
De un modo más general, las dispersiones de
vesículas de la invención pueden ser obtenidas en un procedimiento
que comprende las siguientes etapas:
- -
- dispersión en un medio de la misma osmolaridad que el medio interno y
- -
- modificación de la osmolaridad del medio externo por adición de sal o de agua o por diálisis con el fin de obtener la osmolaridad deseada.
La integridad de la fase L^{c}_{\alpha} tras
la dispersión en forma de vesículas fue igualmente verificada por
difracción de rayos X. Los resultados aparecen en la Figura 4. Se
puede notar que el pico de correlación entre hebras de ADN es aún
observable. La distancia de repetición de las bicapas lipídicas y
del ADN se modifica en función de la presión osmótica del medio
dispersante. Esto demuestra claramente que la distribución
molecular se conserva incluso después de la dispersión.
En la Figura 5, se representa la evolución de la
razón de masa lípido/ADN encapsulado en las vesículas según la
invención dispersas en medio fisiológico, \rho*, en función de la
razón de masa lípido/ADN de la fase L^{c}_{\alpha} antes de la
dispersión, \rho, para dos tipos de ADN. La representación del
poder de encapsulación por \rho*, más que por el porcentaje de
tasa de encapsulación es más astuta, ya que esto corresponde
directamente a la cantidad de ADN en el vector. Para el ADN corto
(\approx150 p.b.), así como para el plásmido (5.581 p.b.), \rho*
disminuye (la cantidad de ADN en el vector aumenta) con la
disminución de \rho de la fase L^{c}_{\alpha}. El poder de
encapsulación de las vesículas de la invención a base de lípido
neutro es menor para el plásmido grande que para el ADN corto, pero
se esperan, no obstante, \rho* del orden de 6 y, por lo tanto, la
encapsulación de cantidades importantes de plásmido.
Las aplicaciones de esta técnica son muy
importantes en el campo de la vectorización de genes para la terapia
génica. En efecto, el hecho de poder incorporar una gran cantidad
de macromoléculas nucleotídicas con un muy buen rendimiento de
encapsulación es una condición importante del éxito de tales
aproximaciones. Pero, además, el hecho de no tener que utilizar
lípidos catiónicos permite la utilización de tales sistemas in
vivo, donde los catiónicos son rápidamente captados por las
proteínas y, por lo tanto, resultan ineficaces. Además, los lípidos
neutros tienen una citotoxicidad mucho más débil que los lípidos
catiónicos.
Estas consideraciones de captura por las
proteínas circulantes, de adhesión a las paredes celulares y de
citotoxicidad son evidentemente independientes de la naturaleza de
la macromolécula incorporada a la vesícula.
Las materias primas utilizadas en los ejemplos
son las siguientes:
| 1,2-Diacilglicerofosfatidilcolina de soja | (Avanti Polar Lipid) |
| Alcohol láurico etoxilado con 4 óxidos de etileno | (C12E4) (SEPPIC) |
| 1-Monooleil-rac-glicerol (monooleína) | (Sigma) |
| Yoduro de YOYO-1 | (Molecular Probes) |
| ADNasa tipo 1 | (Amersham France) |
| ADN altamente polimerizado de timo de ternera | (Sigma) |
| Plásmido pCMV LUCIFERASI | (Qiagen GmbH) |
El ADN de timo de ternera fue tratado con
ultrasonidos para obtener fragmentos de dobles hebras de la longitud
de persistencia del ADN. El tamaño de estos fragmentos fue
verificado como próximo a 150 pares de bases (pb) por
electroforesis en gel de agarosa.
En todos los ejemplos, los porcentajes son en
masa.
Se prepararon las diferentes fases lamelares como
sigue:
Con el fin de simplificar la preparación, es
posible preparar previamente una mezcla stock de los diferentes
tensoactivos utilizados en la formulación. Esta mezcla stock puede
ser preparada directamente, ya sea a temperatura ambiente, ya sea
para acelerar la mezcla calentando ligeramente. Es también posible
disolver los diferentes tensoactivos en un solvente (alcohol y/o un
solvente clorado, por ejemplo) para mezclarlos en buenas
proporciones y evaporar luego el solvente a vacío para obtener la
mezcla stock de tensoactivos. Este método permite también filtrar
la solución para esterilizarla, si es necesario.
La mezcla stock puede ser conservada a -18ºC para
una utilización ulterior.
Se añade la cantidad de ADN para obtener la razón
de masa lípido/ADN deseada a la mezcla seca y homogénea de los
lípidos. Se hace la adición más simplemente añadiendo la solución
acuosa de ADN según la cantidad deseada. Se mezcla el sistema y se
deja en reposo para permitir su homogeneización. El tiempo
necesario para alcanzar el equilibrio depende de la hidratación y
del contenido en ADN del sistema (varios días como media). Se puede
guardar luego la fase lamelar homogénea en obscuridad a -20ºC
durante meses sin que pierda sus características y sin que haya
degradación química de los constituyentes.
La dispersión de la fase lamelar en un tampón a
la osmolaridad deseada da lugar a la fase de vesículas. Una
agitación suave durante varias horas permite dispersar fácilmente
las vesículas. La homogeneidad de la dispersión es controlada de
manera puntual por microscopía de contraste de fases.
Si se quiere obtener una mayor homogeneidad de
tamaño, se puede proceder también por cizallamiento de la fase
estructurada entre dos láminas de vidrio limpias. El control del
cizallamiento es realizado por microscopía óptica entre
polarizadores cruzados.
En el caso de la fase L^{c}_{\alpha} que
contiene el plásmido, la integridad del plásmido tras el
cizallamiento y la dispersión fue verificada por electroforesis en
gel de agarosa.
Se estimó la presión osmótica en el interior de
las vesículas que contenían el ADN a partir de las medidas de la
presión osmótica de las soluciones acuosas de ADN de 150 pb en un
osmómetro clínico de tipo 13 DR-Autocal. La presión
osmótica de la solución acuosa de ADN evoluciona de una forma no
lineal con la concentración de ADN, comportamiento clásico para
macromoléculas. Las estimaciones muestran que la presión osmótica
de la fase L^{c}_{\alpha} a \rho = 2 y 50% de agua (en masa)
es del orden de 500 miliosmomoles, lo que corresponde a una
salinidad de aproximadamente 0,28 M. La presión osmótica de los
diferentes tampones utilizados fue ajustada añadiendo NaCl y
verificada por medición experimental.
Se incubaron vesículas que contenían ADN, así
como ADN control no encapsulado, con ADNasa de tipo I en presencia
de Mg^{2+}. La ADNasa de tipo I es una endonucleasa que cataliza
la degradación de hebras sencillas y dobles de ADN y produce
oligonucleótidos 5'-P terminales. Necesita la
presencia de cationes divalentes para funcionar. La degradación por
la ADNasa fue detenida a diferentes tiempos por adición de EDTA y
el ADN fue analizado por electroforesis en gel. Incluso mucho tiempo
después de haberse destruido por completo el ADN control, el ADN
encapsulado no muestra ningún signo de degradación.
Para la difracción de rayos X, se transfieren las
muestras a capilares de vidrio de 1 mm o a soportes planos (espesor
transversal 1 mm) y se sellan. Los experimentos de difracción de
rayos X fueron realizados en un generador con ánodo giratorio (Cu
K\alpha \lambda=1,5405\ring{A}) o en un sincrotrón
(\lambda=1,0A, línea de haz ID2, ESRF, Grenoble) con un detector
2D y distancias de muestra-detector variables (500
mm a 1.000 mm).
Después de la reagrupación, se obtuvieron las
posiciones exactas de los picos, así como su intensidad, por
parametraje gaussiano de los picos tras restar el fondo. En caso de
obtener varios picos por fase, se determinaron las distancias de
repetición, d, por un parametraje por los mínimos cuadrados
de la pendiente de (h^{2} + k^{2} +
l^{2})^{1/2} para los índices hkl (con
l y k = 0 para una fase lamelar) en función de los
espaciamientos recíprocos.
Se corrigieron las intensidades, correspondientes
al cuadrado de factores de estructura, para el factor de Lorentz y
se sometieron a la normalización de Blaurock. Se obtuvieron los
signos de los factores de estructura por el método clásico del
hinchamiento. Los perfiles de densidad electrónica de la fase
L^{c}_{\alpha} fueron luego obtenidos por transformación de
Fourier inversa de los factores de estructura (véase, por ejemplo:
Franks, N.P. & Levine, W.R., 1981, en Membrane Spectroscopy
(Springer Verlag, Heidelberg, 437-487).
Se hicieron experimentos de difracción de rayos X
sobre fases lamelares que contenían entre un 25 y un 70% de agua (en
masa), es decir, en la región de las fases concentradas, con \rho
entre \infty y 1, y sobre mezclas PC/C12E4 y PC/monooleína (95:5
en masa). La elección del cotensoactivo no parece tener ninguna
influencia sobre el diagrama de fases ternario del sistema
ADN/lípido neutro/agua. Por en contrario, las distancias de
repetición son ligeramente más importantes para los sistemas que
contienen C12E4 y el límite de hinchamiento está ligeramente
decalado hacia las concentraciones más altas de agua. El ADN
utilizado para establecer el diagrama de fases está previamente
tratado con ultrasonidos y tiene una longitud de aproximadamente
500\ring{A} (\cong 150 pb).
Ópticamente, se observa un exceso de agua para la
fase lamelar a partir del 50% de agua. En el caso de las muestras
que contienen ADN, se observa el exceso de agua entre el 55 y el
60% en función del contenido en ADN. La determinación parcial del
diagrama de fases por difracción de los rayos X permite distinguir
además tres regímenes: (i) las bajas concentraciones de ADN
(gran \rho), donde las d son más bajas que la de la fase
lamelar sin ADN (véase la Figura 1B); (ii) las
concentraciones intermedias (\rho medio), donde se observa la
coexistencia de dos fases lamelares en equilibrio (véase la Figura
1C), y (iii) las grandes concentraciones de ADN (\rho
pequeño), donde se detecta una sola fase lamelar que tiene una
d mayor que la de la fase lamelar en ausencia de ADN (véase
la Figura 1D). La disminución de d de varios \ring{A} en
el caso de bajo contenido en ADN (i) puede explicarse
únicamente si se considera que al menos una parte del ADN no se
incorpora a la fase lamelar e induce una deshidratación parcial de
esta última. Para los valores medios de \rho (ii), la
presencia de un bifásico lamelar-lamelar se parece a
lo observado en el caso de los sistemas mixtos de
tensoactivo/polímero/agua (Nallet, F. y col., 1994, J. Phys. II
France, 4, 1477-1499). El ADN se encuentra
esencialmente en la fase de gran d (aproximadamente 110 a
130\ring{A}) y la fase con baja d (alrededor de 50
\ring{A}) está desprovista de ADN y ligeramente deshidratada. Para
\rho\leq6, (iii), la única fase lamelar presente se
caracteriza por d aumentadas de 15 a 20\ring{A} con
respecto a la fase lamelar en ausencia de ADN. Esto demuestra
claramente que el ADN está confinado entre las lamelas lipídicas.
Contrariamente al sistema lípido catiónico/ADN, el confinamiento
aquí es estérico, ya que no hay interacciones electrostáticas.
Además de los picos de la fase lamelar, se
observa un pico grande situado entre q \cong 0,15 y 0,2 en función
de la composición de la fase lamelar (véase la inserción de la
Figura 1D). Este pico no existe para muestras con \rho > 6 y
se atribuyó a la correlación entre hebras de ADN, como se ha
observado para los sistemas de lípidos catiónicos/ADN (J.O. Räder y
col., Science, 275, p. 810, 1997; T. Salditt y col.,
Physical Review Letters, 79, p. 2582, 1997). La distancia
entre hebras de ADN varía, en efecto, con \rho entre \approx30
y 42\ring{A} a hidratación constante. Estas distancias son
características de una organización nemática del ADN en agua
(Durand, D. y col., 1992, J. Phys. II France 2,
1769-1783). Tenemos, pues, una fase lamelar
L^{c}_{\alpha} donde el ADN se intercala entre las bicapas
esmécticas y se organiza en nemática-2D (véase
también la Figura 1B). Se observa igualmente que la distancia entre
hebras de ADN disminuye con la disminución de la hidratación a
\rho constante. Esto es debido a la restricción del
"wobbling" (de las oscilaciones) de las dobles hebras de ADN
cuando disminuye el espacio intersticial.
También se realizó la difracción de rayos X sobre
vesículas que contienen ADN encapsulado y dispersas en tampón. Para
ello, se dispersaron las vesículas en un gran exceso de tampón y se
concentraron después. Esta etapa de dilución, seguida de
concentración, elimina la casi totalidad del ADN no encapsulado. En
la Figura 4, se muestran resultados obtenidos con estas
preparaciones. El perfil de difracción es característico de una fase
lamelar y demuestra el carácter multilamelar de las vesículas. La
distancia interlamelar d depende, como se espera, de la presión
osmótica del tampón dispersante y aumenta de 15 a 20\ring{A} con
respecto a las vesículas que no contienen ADN. Además, se detecta
fácilmente la presencia de un pico de correlación entre hebras de
ADN que se desplaza en función de la cantidad de ADN en las
vesículas y en función de la presión osmótica del medio dispersante.
Todo ello está en perfecto acuerdo con lo que se había visto para
las fases concentradas y demuestra, pues, que la estructura en fase
L^{c}_{\alpha} se conserva en las vesículas.
También se realizaron experimentos de difracción
de rayos X con el fin de estudiar el paso de un medio dispersante
hiperosmótico a un medio hipoosmótico sobre vesículas que contienen
ADN (véase más adelante). En este caso, las vesículas fueron
dispersadas en un gran exceso de solvente a 900 mOsm
(hiperosmótico). Luego procedimos a un cambio del solvente pasando
a 300 mOsm (medio fisiológico; hipoosmótico para la fase
L^{c}_{\alpha}). Se constata que la estructura lamelar
permanece intacta incluso tras el paso al medio hipoosmótico. La
d pasa de aproximadamente 78\ring{A} a 900 mOsm a
aproximadamente 88\ring{A} a 300 mOsm, es decir, que las d
permanecen con mucho más grandes que en el caso de las vesículas
que no contienen ADN (\cong63\ring{A}).
Se reconstruyeron además los perfiles de densidad
electrónica de la fase L^{c}_{\alpha} a partir de las
intensidades de los picos de Bragg de la distribución esméctica. El
perfil presentado en la Figura 2A muestra un hombro de densidad
electrónica importante a aproximadamente 40\ring{A} del centro de
la bicapa lipídica y es coherente con la presencia de ADN en la
parte acuosa de la fase lamelar.
La tasa de encapsulación fue determinada por
espectrofluorimetría utilizando como fluoróforo el YOYO
(\lambda_{ex} = 491 nm, \lambda_{em} = 509 nm). Salvo
indicación en contrario, los resultados citados a continuación
fueron obtenidos con el ADN tratado con ultrasonidos de \approx
150 pb.
Se mide el ADN no encapsulado por adición de YOYO
a las dispersiones acuosas de las vesículas (I_{D}). El ADN total
es medido después de la destrucción de las vesículas mediante
Tritón (I_{T}). Se obtiene la tasa de encapsulación por: % =
100\cdot(I_{T}-I_{D})/(I_{T}-I_{0}),
siendo I_{0} = intensidad del YOYO solo. Se obtiene la conversión
en razón de masas lípido/ADN encapsulado por: \rho* =
100\cdot\rho/tasa de encapsulación.
Se realizaron mediciones de la tasa de
encapsulación de ADN en las vesículas en función de la presión
osmótica del tampón. Para ello, se prepararon las vesículas a
partir de una fase L^{c}_{\alpha} a \rho = 2 y a un 55% de
hidratación. Se estimó que la presión osmótica en el interior de las
vesículas era del orden de 500 mOsm. En la Figura 3, se ve que la
tasa de encapsulación aumenta progresivamente hasta presiones
osmóticas de aproximadamente 600 mOsm y permanece constante para
presiones osmóticas mayores, lo que demuestra la importancia de la
presión osmótica para la optimización de la tasa de encapsulación.
Estos resultados sugieren igualmente que la presión osmótica en el
interior de las vesículas es probablemente ligeramente superior a
las estimaciones obtenidas a partir de las soluciones acuosas de
ADN. Ello es probablemente debido a la presencia de sales en el
fosfolípido de origen natural.
Se observará, no obstante, que el óptimo de tasa
de encapsulación del ADN se sitúa a presiones osmóticas superiores a
las del medio fisiológico (300 mOsm). Estudiamos, pues, luego la
dilución de las vesículas (fase L^{c}_{\alpha}: \rho = 2, 55%
de agua) preparadas en un medio hiperosmótico (900 mOsm), en un
medio a 300 mOsm e hipoosmótico par ala fase L^{c}_{\alpha}. En
este caso, se observa que, de un modo totalmente sorprendente, la
tasa de encapsulación no desciende a la de las vesículas preparadas
a 300 mOsm, sino que permanece idéntica a la obtenida a 900 mOsm.
Es, pues, posible preparar vesículas que contienen ADN a gran
presión osmótica y diluirlas en un medio fisiológico en el momento
de la aplicación sin que haya pérdida del ADN encapsulado.
El estudio de la estabilidad de estos vectores de
ADN en función del tiempo muestra que se obtiene la mejor
estabilidad en un medio hiperosmótico, donde no se observa más que
una ligera bajada de la razón de encapsulación de un \cong70 a un
\cong60% en el curso de 30 días.
Para el estudio de la optimización en función de
la composición de la fase L^{c}_{\alpha} que sirve para la
fabricación de las vesículas, se prepararon los vectores en un
tampón hiperosmótico y se midió la tasa de encapsulación tras su
dilución en un tampón fisiológico.
Haciendo variar el contenido en agua de la fase
L^{c}_{\alpha} entre el 40 y el 70% a \rho constante e igual
a 2, se ve un máximo de tasa de encapsulación a una hidratación
correspondiente al límite de hinchamiento de la fase
L^{c}_{\alpha} (55% de agua). Para las hidrataciones por encima
del 55%, la disminución de la encapsulación se explica por el hecho
de que el ADN, soluble en el solvente, se reparte entre la fase
L^{c}_{\alpha} y el exceso de solvente y está, pues, cada vez
menos presente en el interior de la fase L^{c}_{\alpha}. Por
debajo del 55%, la disminución de la tasa de encapsulación cuando
la hidratación baja resulta probablemente de la débil hidratación y
del aumento de la viscosidad que han obstaculizado la obtención de
las vesículas.
Conservando una razón de hidratación del 50%, que
corresponde a una encapsulación máxima, estudiamos la influencia del
\rho de la fase L^{c}_{\alpha} sobre la tasa de
encapsulación. Los resultados muestran que, de un modo general, la
encapsulación resulta facilitada por la abundancia de lípidos (70%
para \rho = 4 contra un 45% para \rho = 1). Es, no obstante,
importante darse cuenta de que este resultado en % de ADN
encapsulado no da ninguna indicación sobre la evolución de la
cantidad de ADN encapsulada. Los resultados convertidos en razón de
masas lípido/ADN encapsulado, \rho*, están representados en la
Figura 5, donde se ve que, para \rho = 4, a pesar de una tasa de
encapsulación elevada (70%), la cantidad total de ADN en las
vesículas es inferior a la encapsulada para \rho = 1. En cuanto a
la optimización de la encapsulación, aparecen, pues, dos puntos de
vista: (i) o bien se introduce una gran cantidad de ADN (\rho
baja), y la cantidad encapsulada es elevada, pero se observa
también mucho ADN en el medio exterior; (ii) o bien se introduce una
pequeña cantidad de ADN (\rho elevada), que estará en su mayor
parte encapsulada, pero se tendrá globalmente menos ADN en las
vesículas.
La influencia de la \rho de la fase lamelar fue
también estudiada para las vesículas que contenían plásmido. En este
caso, las tasas de encapsulación permanecen aproximadamente
constantes a alrededor del 40% entre \rho = 4 y 2, es decir, más
bajas que para el ADN corto. La conversión en \rho* en función de
\rho muestra, sin embargo, que los dos sistemas evolucionan de un
modo comparable (véase la Figura 5). Este resultado permite
extrapolar al plásmido las conclusiones obtenidas a partir del
sistema que contiene el ADN a 150 p.b.
Claims (13)
1. Fase mixta estructurada formada por
incorporación de macromoléculas biológicas dispuestas según una
estructura cristal-líquido en una fase
cristal-líquido de anfífilos, caracterizada
por estar presente dicha macromolécula biológica en dicha fase
mixta estructurada a razón de al menos un 5% en peso con respecto a
los compuestos anfífilos que constituyen dicha fase
cristal-líquido y por presentar una al menos de las
dos entidades constituidas por la macromolécula biológica por una
parte, y el conjunto de los compuestos anfífilos por otra parte, un
carácter no cargado.
2. Fase mixta estructurada según la
reivindicación 1, caracterizada por el hecho de que dicha
fase cristal-líquido de anfífilos es una fase
cristal-líquido lamelar.
3. Fase mixta estructurada según la
reivindicación 2, caracterizada por presentar dicha
macromolécula biológica un radio de giro superior a la distancia
entre las lamelas anfífilas de dicha fase
cristal-líquido.
4. Fase mixta estructurada según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por seleccionar dicha
macromolécula biológica entre el grupo constituido por
polinucleótidos, proteínas y polisacáridos.
5. Fase mixta estructurada según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizada por el hecho de que
dicha macromolécula es un polinucleótido, preferiblemente ADN o
ARN.
6. Fase mixta estructurada según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizada por seleccionar dichos
compuestos anfífilos constituyentes de la fase estructurada de
anfífilos entre el grupo constituido por:
- \blacklozenge
- glicerolípidos, en particular glicerolípidos fosfolipídicos, hidrogenados o no;
- \blacklozenge
- ácidos grasos C_{6} a C_{30}, saturados o mono- o polinsaturados, lineales o ramificados, etoxilados o no, en forma de ácido o de sal de un metal alcalino o alcalinotérreo o de una amina;
- \blacklozenge
- ésteres etoxilados o no de sacarosa, o de sorbitol, o de manitol, o de glicerol, o de poliglicerol que contienen de 2 a 20 unidades de glicerol o de glicol de estos mismos ácidos grasos;
- \blacklozenge
- mono-, di- o triglicéridos o mezclas de glicéridos de estos mismos ácidos grasos;
- \blacklozenge
- alcoholes grasos C_{6} a C_{30}, saturados o mono- o poliinsaturados, lineales o ramificados, etoxilados o no;
- \blacklozenge
- colesterol y sus derivados, en particular los ésteres de colesterol cargados o neutros, como el sulfato de colesterol;
- \blacklozenge
- otros derivados con esqueleto de esterol, en particular los de origen vegetal, tales como el sitosterol o el sigmasterol;
- \blacklozenge
- éteres, etoxilados o no, de sacarosa, o de sorbitol, o de manitol, o de glicerol, o de poliglicerol que contienen de 2 a 20 unidades de glicerol o de glicol y de estos mismos alcoholes grasos;
- \blacklozenge
- aceites vegetales polietoxilados, hidrogenados o no hidrogenados;
- \blacklozenge
- polímeros secuenciados de polioxietileno y de polioxipropileno (poloxámeros);
- \blacklozenge
- hidroxiestearato de polietilenglicol;
- \blacklozenge
- esfingolípidos y derivados de la esfingosina;
- \blacklozenge
- polialquilglucósidos;
- \blacklozenge
- ceramidas;
- \blacklozenge
- copolímeros de polietilenglicol y de alquilglicol, y
- \blacklozenge
- copolímeros de di- o tribloques de éteres de polietilenglicol y de polialquilenglicol.
7. Fase mixta estructurada según una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizada por contener además al
menos un aditivo destinado a conferir propiedades específicas, por
ejemplo un aditivo destinado a conferir una propiedad de adhesión
de superficie a dicha fase mixta estructurada.
8. Fase mixta estructurada según la
reivindicación 7, caracterizada por ser dicho aditivo un
tensoactivo o un polímero.
9. Procedimiento de preparación de una fase mixta
estructurada según una de las reivindicaciones 1 a 8,
caracterizada por consistir en las siguientes etapas:
- -
- preparación de una mezcla homogénea que contiene los compuestos anfífilos y la macromolécula, estando presente dicha macromolécula en proporciones ponderales de al menos un 5% con respecto a dichos compuestos anfífilos;
- -
- incorporación de una cantidad de medio acuoso o polar adecuada para formar una fase cristal-líquido de anfífilos con dichos compuestos anfífilos.
10. Procedimiento de preparación de vesículas,
caracterizado por incluir una etapa de dispersión de una fase
mixta estructurada tal como se ha definido en una de las
reivindicaciones 1 a 8 u obtenida según el procedimiento de la
reivindicación 9.
11. Vesículas susceptibles de ser obtenidas por
dispersión de una fase mixta estructurada tal como se ha definido en
una de las reivindicaciones 1 a 8 u obtenida según el procedimiento
de la reivindicación 9.
12. Dispersión de vesículas según la
reivindicación 11, caracterizada por el hecho de que el medio
en el que se hallan dispersas dichas vesículas presenta una
osmolaridad diferente de la del medio interno de la fase mixta
estructurada de anfífilos.
13. Procedimiento de preparación de una
dispersión según la reivindicación 12, caracterizado por
consistir en las siguientes etapas:
- -
- dispersión en un medio de la misma osmolaridad que el medio interno y
- -
- modificación de la osmolaridad del medio externo por adición de sal o de agua o por diálisis, con el fin de alcanzar la osmolaridad deseada.
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