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Die
vorliegende Erfindung betrifft neue Produkte, die sich aus der Aufnahme
von biologischen Makromolekülen,
insbesondere von DNA, in eine Flüssigkristallphase
aus Amphiphilen ergeben, sowie die Verfahren zum Erhalt dieser Produkte.
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Die
Medizin behandelt bis zum gegenwärtigen
Zeitpunkt eine Krankheit, indem sie ein exogenes Molekül zuführt, das
die vorliegende Funktionsstörung
korrigiert oder zumindest deren Folgen aufhebt oder begrenzt. Leider
ist der Einsatz des im Rahmen dieser Strategie verwendeten aktiven
Moleküls
meistens von unerwünschten
Nebenwirkungen begleitet, welche manchmal dazu führen, daß die Therapie nicht durchgeführt werden
kann. Andererseits können
bestimmte Krankheiten, die mit einem genetischen Mangel oder einem
genetischen Fehler in Zusammenhang stehen, nicht durch einen „chemischen" Ansatz behandelt
werden, entweder weil das aktive Molekül nicht existiert oder weil
es zerstört
wird, bevor es wirken kann, oder weil es in Dosen verabreicht werden
müßte, die
zu hoch sind, oder weil es über
zu lange Zeiträume
hinweg verabreicht werden müßte.
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Die
Gen-Therapie ist ein neuer Ansatz, um diese Unzulänglichkeiten
der klassischen Medizin zu beseitigen. Diese Therapie besteht darin,
ein mangelhaftes Gen zu ersetzen oder ein neues Gen zuzuführen, wodurch
die Behandlung eines pathologischen Zustandes ermöglicht wird.
Mit einer solchen Strategie wird kein Medikament mehr zugeführt, sondern
es werden dem Organismus die Mittel zur Verfügung gestellt, um gegen die
Krankheit zu kämpfen
oder den Mangel, der die Krankheit auslöst, zu korrigieren.
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Diese
Strategie, die durch den Fortschritt der Molekularbiologie möglich gemacht
wurde, welcher die Identifikation und die Synthese der Gene von
Interesse ermöglicht,
muß so
ausgeführt
werden, daß das
nützliche
Gen bis zu seinem zellulären
Ziel zugeführt
werden kann, danach in die Zelle eindringen und sich schließlich exprimieren
kann. Das Gen muß vektorisiert
werden, das heißt,
es muß in
einen Vektor eingeführt
werden, mit dessen Hilfe es die verschiedenen Barrieren überwinden
kann, welche den Organismus und die Zelle vor dem Eindringen von
fremdem genetischem Material schützen.
Der ideale Vektor muß ausreichend
DNA (oder RNA) aufnehmen, diese vor den verschiedenen chemischen
und enzymatischen Angriffen in vivo schützen, in der Lage sein, vorzugsweise
das gesuchte zelluläre
Ziel zu erreichen, in die Zelle zum Beispiel durch Endocytose eindringen,
die DNA vor sehr einschränkenden
Zuständen,
die im Endosom vorliegen, schützen,
das therapeutische Gen bis zum Kern zuführen und es freisetzen, indem
er ihm erlaubt, sich zu exprimieren oder, noch besser, sich in das
Genom der Zelle zu integrieren.
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Viren
sind Vektoren von DNA (oder von RNA für die Retroviren), welche perfekt
auf den Großteil
dieser Einschränkungen
reagieren. Sie wurden eingehend als Gen-Vektoren für die Gen-Therapie untersucht
und sind Gegenstand von zahlreichen klinischen Tests. Sie weisen
dennoch einen wesentlichen Nachteil auf. Abgesehen von den Schwierigkeiten
ihrer Manipulation und Herstellung in großem Umfang, stehen sie im Verdacht,
daß sie
virulent werden und neue unkontrollierbare Pathologien entwickeln
können.
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Umfangreiche
Forschungsarbeiten widmen sich der Entwicklung von synthetischen
Vektoren, welche natürlich
keinerlei Virulenzrisiko aufweisen. In dieser Hinsicht wurden Liposome
sorgfältig
untersucht, wobei diese jedoch an ihren intrinsischen Mängeln leiden:
sehr geringe Stabilität,
große
Schwierigkeiten bei der Herstellung, sehr geringe Einkapselungsfähigkeit
und sehr geringe, sogar nicht vorhandene Fähigkeit, das Gen zu transfizieren.
Eine neue Klasse von Liposomen, die ausgehend von kationischen Lipiden
hergestellt werden, wurde entwickelt, und diese Klasse beseitigt
teilweise die Mängel
der Liposome: bessere Stabilität,
einfache Herstellung und signifikanter Transfektionsgrad, der jedoch
im Vergleich zu den Viren sehr schwach ist. Dabei sind diese Verbindungen
zwischen kationischen Lipiden und Nukleotiden keine Liposome im
eigentlichen Sinne, sondern vielmehr Komplexe zwischen dem negativ
geladenen Nukleotid und dem positiv geladenen Lipid (M. Schmutz
et al, PNAS 96, p. 12293 (1999)).
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Die
internationale Patentanmeldung WO 98/02144 lehrt, daß es möglich ist,
ein Nukleotid in multilamellare Vesikel mit Zwiebelstruktur zu integrieren,
es zu schützen
und zu transportieren und so seine intrazelluläre Transfektion zu ermöglichen.
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Vor
kurzem hat die Patentschrift FR 2 766 706 eingerollte multilamellare
Vesikel auf der Basis von Gemischen aus anionischen und kationischen
Lipiden und deren Anwendung für
die Transfektion von Nukleotiden beschrieben.
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Vektoren
zur Verabreichung von Makromolekülen
in Form von Liposomen oder von Vesikeln sind auch aus WO 9707784,
WO 9509610 und WO9823260 bekannt.
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Die
Verwendung von Liposomen für
die Vektorisierung von DNA oder Genen scheitert unter anderem daran,
daß es
unmöglich
ist, eine ausreichende Menge von Nukleotiden in das Liposom einzuführen. Bei
klassischen Liposomen sowie multilamellaren Liposomen oder Vesikeln
mit Zwiebelstruktur, deren Größe in Mikrometer-Größenordnung
liegt, ist es leicht verständlich,
daß das
DNA-Molekül
Schwierigkeiten haben wird, aufgenommen zu werden, da seine Größe in derselben
Größenordnung
liegt. Es besteht somit ein Bedarf daran, das Molekül zu verdichten,
damit es eine eingeklappte Konformation annimmt, die ihm eine scheinbare
Größe verleiht,
die mit der Einkapselung in lipide Vesikel verträglich ist.
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Da
die DNA negativ geladen ist, wird dieses Verdichten in der Natur
durch Verwendung von Histonen, kationischen Proteinen durchgeführt, welche
die DNA komplexieren und zu Partikeln mit sehr geringer Größe (kleiner
als 100 nm) führen.
In künstlicher
Weise wurden solche Moleküle
sowie andere kationische Moleküle verwendet,
um DNA zu verdichten, um ihr zu erlauben, in lipide Vesikel vom
Typ der Liposome oder in multilamellare Vesikel aufgenommen zu werden.
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Die
Arbeiten in Bezug auf die Einkapselung von DNA durch Liposome auf
der Basis von neutralen Lipiden wurden aufgrund ihres geringen Einkapselungsvermögens (< 5 %) vollständig aufgegeben.
Die aktuellen Arbeiten beschäftigen
sich mit der Verwendung von kationischen Molekülen, entweder Tensiden oder
Polymeren, um Komplexe mit der DNA zu bilden, die geeignet sind,
dieses Molekül
zu schützen
und seine Transfektion zu ermöglichen,
wobei gleichzeitig die Verdichtung des DNA-Moleküls und seine Vektorisierung
erfolgen. Die so erhaltenen Partikel werden oft als kationische
Liposome bezeichnet, obwohl ihre Art der Herstellung und Bildung
sich ziemlich von den klassischen Liposomen unterscheidet.
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Jüngste Arbeiten
(vgl. beispielsweise I Koltover, et al, Science 281, p78 1998; J.O.
Räder,
et al, Science, 275 S. 810 1997; T. Salditt et al. Physical Review
Letters, 79 S. 2582 1997) haben gezeigt, daß in diesen Komplexen die DNA
Phasen mit Flüssigkristallsymmetrie
bildete, welche mit der Flüssigkristallphase
interkalieren, die durch kationische Tenside gebildet wird.
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Mehrere
Symmetrien wurden identifiziert, und Experimente mit der Brechung
von Röntgenstrahlung (Synchrotron)
zeigen deutlich die Übereinanderlagerung
der Brechungsdiagramme von jedem der Tensid- und DNA-Systeme. Mehrere
kationische Lipide wurden verwendet, was zu unterschiedlichen Symmetrien
der Flüssigkristallphase
der Lipide führte.
Die genannten Arbeiten haben die Bedeutung aufgezeigt, die der Rolle
der Ladung der Lipide zukommt, sowie die Bedeutung der Gesamtladung
des Komplexes, die je nach Verhältnis zwischen
kationischen Lipiden und negativer DNA positiv oder negativ sein
kann. Ferner wird vorgeschlagen, daß diese interkalierten Strukturen
aus Flüssigkristallphasen
eine wichtige Rolle bei den in der Transfektion erhaltenen Ergebnissen
spielen.
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Die
Amphiphile, die allgemein als Tenside bezeichnet werden, weisen
die Fähigkeit
auf – wenn
sie in ein Lösemittel,
beispielsweise Wasser, eingeführt
werden – sich
selbst zu verbinden, um strukturierte oder organisierte Phasen zu
bilden. Unter diesen Phasen stechen insbesondere die Flüssigkristallphasen
hervor, die thermodynamisch stabil sind und eine teilweise kristallographische
Ordnung (in eine oder zwei Raumrichtungen) aufweisen, wie die lamellaren
(oder smektischen) Phasen, die eine unidimensionale Ordnung aufweisen, oder
die hexagonalen Phasen, die eine bidimensionale Ordnung aufweisen.
Es existieren auch Phasen, die eine kristalline Ordnung wie die
kubische Phase aufweisen. Diese Phasen werden oft als Lyotrope bezeichnet, weil
ihre Erscheinung und ihre Stabilität von der Konzentration des
Amphiphils im Lösemittel
abhängen.
Sie können
auch thermotrop sein, wenn ihr Existenzbereich temperaturabhängig ist.
Eine Beschreibung dieser Phasen kann auch in C.L. Khetrapol et al,
Nuclear magnetic resonance studies in lyotropic liquid-crystals, 1975,
gefunden werden. In der Folge werden wir den Begriff strukturierte
Phase verwenden, um in allgemeiner Weise diese Phasen zu beschreiben,
außer
in den Fällen,
in denen die Symmetrie der Phase ausdrücklich angegeben ist.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung haben nun entdeckt, daß es möglich war,
Strukturen von interkalierten DNA- und Tensid-Flüssigkristallphasen zu erhalten,
ohne kationische Lipide verwenden zu müssen. Im Gegensatz zu den Angaben
in der Fachliteratur und in völlig überraschender
Weise, kann das Gemisch einer Flüssigkristallphase
aus neutralem Tensid, beispielsweise zwitterionisch, zum Beispiel
einer lamellaren Phase, mit DNA unter bestimmten Bedingungen zur
Bildung einer gemischten Phase führen,
in welcher die Tenside gestapelte Lamellenschichten gemäß einer
smektischen Symmetrie bilden, in deren Innerem die DNA-Moleküle interkaliert
sind, die wiederum selbst gemäß einer
Flüssigkristallsymmetrie
nematischer Art angeordnet sind. Darüber hinaus – wobei dies noch überraschender
ist – werden
diese Ergebnisse ausschließlich erzielt,
wenn man eine große
Menge an DNA in die lamellare Phase einführt, wo es doch schon schwierig
ist, mit guter Leistung eine geringe Menge an DNA in die lamellare
Phase einzuführen.
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Bei
der Fortführung
ihrer Forschungsarbeiten gelang es den Erfindern der vorliegenden
Erfindung, festzuhalten, daß es
ebenfalls möglich
war, unterschiedliche biologische Makromoleküle, insbesondere nukleotide
Makromoleküle,
Proteine oder Polysaccharide in strukturierte Phasen einzuführen und
dies ohne elektrostatische Wechselwirkung zwischen den Makromolekülen und
den Bestandteilen der strukturierten Phase, immer vorausgesetzt,
daß eine
ausreichende Menge dieser Makromoleküle in das Innere dieser strukturierten Phase
eingeführt
wird.
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Unter
den nukleotiden Makromolekülen,
die aus einer Nukleotidverkettung gebildet und oft unter dem allgemeinen
Begriff „Nukleotide" zusammengefaßt werden,
unterscheidet man gemäß der vorliegenden
Erfindung Oligonukleotide, welche im Allgemeinen 10 bis 30 und maximal
100 Basen-Nukleotidgruppierungen umfassen, und Polynukleotide, welche
eine größere Anzahl
an Basen-Nukleotidgruppierungen umfassen, im Allgemeinen mehr als
100 Basenpaare und oft mehr als 1000. Selbst wenn die Erfindung
nicht den Fall von Oligonukleotiden ausschließt, wie zuvor definiert, findet
sie insbesondere bei Makromolekülen
vom Typ der Polynukleotide, wie oben definiert, und insbesondere
bei DNA Anwendung.
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Somit
konnten die Erfinder die Ergebnisse in Bezug auf das Einführen der
DNA in konzentrierter Phase in eine strukturierte Phase auf andere
biologische Polymere ausweiten.
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Somit
hat die Erfindung die Aufnahme von Makromolekülen in eine strukturierte Phase
ermöglicht,
die durch Tensidmembrane gebildet wird, selbst wenn diese Makromoleküle eine
charakteristische Größe aufweisen,
die größer als
der Raum zwischen den amphiphilen Lamellen dieser Tensid-Phase ist.
Das Makromolekül wird
in konzentrierter Form in die neue Struktur der Erfindung eingeführt und
ist somit in starker Konzentration in dem gebildeten Endsystem vorhanden.
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Somit
führt die
Erfindung zu einem strukturierten Gemisch, im Folgenden als strukturierte
Mischphase bezeichnet, die gebildet wird, indem Makromoleküle, deren
charakteristische Größe über der
Größe der Flüssigkristallphase
liegt und deren Masseverhältnis
gegenüber
den Amphiphilen größer als
5 % ist, in eine Flüssigkristallphase
von Amphiphilen aufgenommen werden, ohne daß es zwischen den Makromolekülen und
den Amphiphilen zu einer elektrostatischen Wechselwirkung kommt.
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Es
ist immer möglich,
eine charakteristische Größe des Makromoleküls zu definieren,
wobei dies jedoch von der Natur dieses Makromoleküls abhängt. Allgemein
läßt sich
hier der Drehradius nennen, der zum Beispiel ausgehend von Experimenten
mit der statischen Diffusion von Licht gemessen wird. Genauer gesagt wird
im Fall der Proteine der Drehradius des nicht-denaturierten Proteins
genommen, da die Denaturation im Allgemeinen eine Variation dieses
Radius mit sich bringt. Im Fall von DNA handelt es sich um die Länge des nicht-kondensierten
Moleküls,
und diese wird einfach ausgehend von der charakteristischen Länge eines
Basenpaars (3,4A) erhalten, indem eine Multiplikation mit der Anzahl
der Basenpaare erfolgt.
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Man
kann auch immer eine charakteristische Länge für die Flüssigkristallphase definieren.
Allgemein handelt es sich dabei um die Größe des ein- oder zweidimensionalen
Kristallgitters. Diese ist mit dem Wellenvektor der Brechungsspitzen
der Röntgenstrahlen
verwandt. Genauer und beispielhaft dargelegt, handelt es sich im
Fall der lamellaren Phase um die Periodizität der Stapelung der Lamellen,
im Fall der hexagonalen Phase um den Abstand zwischen Tensid-Tubes.
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Das
Hauptinteresse der Erfindung liegt in der Bereitstellung eines Mittels
zur Ausbildung von konzentrierten Strukturen in biologischen Makromolekülen, ohne – wie dies
auf dem Fachgebiet bekannt ist – auf
eine Aufnahme zurückzugreifen,
bei der die treibende Kraft von elektrostatischer Natur ist. Die
Erfindung ermöglicht es
somit, sich der elektrischen Ladungen zu entledigen, die im Stand
der Technik die biologische Aktivität des gebildeten Komplexes
stören,
wodurch zum Beispiel die Haftung dieser Komplexe an den Zellwänden und
ihr Einfangen durch plasmatische Proteine hervorgerufen wird.
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Darüber hinaus
ermöglicht
die Erfindung – wie
aus der folgenden Beschreibung hervorgehen wird – ausgehend von diesen gemischten
Strukturen auch die Herstellung von multilamellaren Vesikeln, welche
die Makromoleküle
mit Einkapselungsgraden aufnehmen, die sowohl hoch als auch kontrollierbar
sind.
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Somit
betrifft eine der wesentlichen Eigenschaften der vorliegenden Erfindung
eine strukturierte Mischphase, die durch die Aufnahme eines biologischen
Makromoleküls
in eine Flüssigkristallphase
auf der Basis von amphiphilen Verbindungen gebildet wird, in der
das biologische Makromolekül
in der strukturierten Mischphase zu einem Gehalt von mindestens
5 Gew.% bezogen auf die amphiphilen Verbindungen vorhanden ist,
und wobei mindestens eine der zwei Einheiten, die durch das biologische
Makromolekül
einerseits und die Gesamtheit der amphiphilen Verbindungen andererseits
gebildet ist, einen nicht geladenen Charakter aufweist.
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Gemäß einer
besonders vorteilhaften Ausführungsform
der Erfindung ist die Flüssigkristallphase
aus Amphiphilen eine lamellare Flüssigkristallphase.
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Die
strukturierten Mischphasen der vorliegenden Erfindung sind Gemische,
in denen das Makromolekül
in einer Fernordnungs-Form in einer Flüssigkristallphase aus Amphiphilen,
die wiederum selbst ferngeordnet ist, interkaliert wird.
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Unter
Flüssigkristallphase
ist eine Flüssigkristallphase
zu verstehen, die durch das Mischen von Amphiphilen erhalten wird.
Eine solche Phase kann allgemein einerseits durch ihre Zusammensetzung
und andererseits eine charakteristische Abmessung, zum Beispiel
ihren smektischen Schritt, welcher der Abstand zwischen den Lamellen
der Phase im Fall der lamellaren Phase ist, gekennzeichnet sein.
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Unter
nicht geladenem Amphiphil ist ein Molekül zu verstehen, das einen amphiphilen
Charakter aufweist, dessen Gesamtladung jedoch neutral ist. Dies
umfaßt
nicht-ionische Moleküle,
aber auch amphotere Moleküle,
in denen die positiven und negativen Ladungen einander im Inneren
derselben chemischen Struktur kompensieren und nicht aufgrund eines
beweglichen Gegenions.
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Wie
zuvor dargelegt, ist es in der Tat völlig überraschend, daß es gelungen
ist, in das Innere einer solchen Phase biologische Makromoleküle, welche
charakteristische Abmessungen aufweisen, die deutlich über jenen
der Flüssigkristallphase
liegen, aufzunehmen und dies ohne auf elektrostatische Wechselwirkungen
zurückzugreifen.
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In
der Tat hat die Erfindung das Einführen bedeutender Mengen von
DNA oder allgemeiner von nukleotiden Makromolekülen oder biologischen Makromolekülen in Flüssigkristallphasen
auf der Basis von nicht geladenen Tensiden ermöglicht, das heißt unter
Bedingungen, unter denen – im
Gegensatz zu dem, was im Stand der Technik gemacht wurde – es keine
Wechselwirkung elektrostatischer Art zwischen den Tensiden und den
Makromolekülen
gibt.
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Es
war auch möglich,
im Rahmen der Erfindung nicht geladene Makromoleküle in Flüssigkristallphasen
auf der Basis von Tensiden aufzunehmen, auch in diesem Fall ohne
daß es
zu einer elektrostatischen Wechselwirkung gekommen wäre, die
eine solche Einführung
erklären
hätten
können – und dies
wobei die Makromoleküle
deutlich „stärker" sind als der Abstand
zwischen den Lamellen der Flüssigkristallphase – und ohne merkliche
Verformung der Phase.
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Die
biologischen Makromoleküle,
die durch die vorliegende Erfindung in Betracht gezogen werden, sind
im Wesentlichen, wie zuvor dargelegt, Verkettungen von Nukleotiden
und insbesondere Verkettungen vom Typ „Polynukleotide", so wie zuvor definiert,
in Bezug auf Proteine, Polysaccharide.
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Polynukleotide
sind Makromoleküle,
die durch die Abfolge von Basen gebildet werden, die den genetischen
Code bilden. Es wird in erster Linie zwischen DNA und RNA unterschieden.
Dabei handelt es sich um sehr große Makromoleküle, deren
Länge 10 μm erreichen
kann. Aufgrund ihrer chemischen Struktur tragen die Polynukleotide
immer negative Ladungen, die durch Katione ausgeglichen werden.
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Proteine
sind Makromoleküle,
die durch Zusammenfügen
von Aminosäuren
gebildet werden. Ihre Molarmasse kann bis zu mehr als 200.000 Da
erreichen, wobei der Drehradius mehrere hundert Angström erreichen
kann. Die Proteine können
kationisch, neutral oder anionisch sein, je nach Natur und Anteil
der unterschiedlichen Aminosäuren,
aus denen sich ein Protein zusammensetzt, aber auch in Abhängigkeit
vom pH-Wert, wobei sich die Säure-
und Aminofunktionen in Abhängigkeit
vom pH-Wert protonieren
und deprotonieren. Dennoch ist die Mehrheit der Proteine unter normalen
pH-Bedingungen (nahe bei neutral), anionisch.
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Polysaccharide
werden aus Saccharidketten gebildet, die von einigen Zuckereinheiten
bis zu mehreren Millionen reichen. Die Größen können daher extrem unterschiedlich
sein und beinahe makroskopische Abmessungen erreichen. Je nach Natur
der chemischen Funktionen, welche die Saccharidzyklen ersetzen,
und in Abhängigkeit
vom pH-Wert können
Polysaccharide unterschiedliche elektrische Ladungen aufweisen.
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Selbst
wenn die Erfindung insbesondere biologische Makromoleküle betrifft,
deren Drehradius deutlich größer als
der Abstand zwischen den amphiphilen Lamellen und der Flüssigkristallphase
ist, ist sie keinesfalls auf solche Makromoleküle beschränkt.
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Jedes
Tensid, das in einem Gemisch mit Wasser zum Beispiel, geeignet ist,
eine Flüssigkristallphase zu
bilden, kann in der Erfindung verwendet werden. In den bevorzugten
biologischen Anwendungen wird darauf geachtet, Amphiphile zu verwenden,
die mit der Anwendung verträglich
sind, und insbesondere schwach toxisch sind und gut toleriert werden,
insbesondere auf Zellebene. Die Erfindung ist nicht an ein bestimmtes Tensid
oder eine bestimmte Tensidfamilie gebunden, sondern an eine Eigenschaft,
die organisierten Phasen von Tensiden intrinsisch ist. Die verwendbaren
Amphiphile werden vorteilhafter Weise aus der Gruppe ausgewählt, die
besteht aus:
- – Glycerolipiden, insbesondere
phospholipidischen Glycerolipiden, hydriert oder nicht hydriert,
- – Fettsäuren von
C6 bis C30, gesättigt oder
einfach oder mehrfach ungesättigt,
linear oder verzweigt, ethoxyliert oder nicht ethoxyliert, in Form
einer Säure
oder eines Salzes eines Alkalimetalls, Erdalkalimetalls oder eines
Amins,
- – ethoxylierten
oder nicht ethoxylierten Estern von Saccharose, Sorbitol, Mannitol,
Glycerin, Polyglycerin, das 2 bis 20 Einheiten Glycerin enthält, oder
Glykol mit diesen Fettsäuren,
- – Mono-,
Di- oder Triglyceriden oder Gemischen von Glyceriden dieser Fettsäuren,
- – Fettalkoholen
von C6 bis C30,
gesättigt
oder einfach oder mehrfach ungesättigt,
linear oder verzweigt, ethoxyliert oder nicht ethoxyliert,
- – Cholesterin
und dessen Derivaten, insbesondere geladenen oder neutralen Cholesterinestern,
wie etwa Cholesterinsulfat,
- – weiteren
Derivaten mit Sterolskelett, insbesondere von pflanzlicher Herkunft,
wie etwa Sitosterol oder Stigmasterol,
- – ethoxylierten
oder nicht ethoxylierten Ethern von Saccharose, Sorbitol, Mannitol,
Glycerin, Polyglycerin, das 2 bis 20 Einheiten Glycerin enthält, oder
Glykol mit diesen Fettalkoholen,
- – pflanzlichen Ölen, polyethoxyliert,
hydriert oder nicht hydriert,
- – Blockpolymeren
aus Polyoxyethylen und Polyoxypropylen (Poloxamere),
- – Polyethylenglykolhydroxystearat,
- – Sphingolipiden
und Sphingosinderivaten,
- – Polyalkylglucosiden,
- - Ceramiden,
- – Copolymeren
von Polyethylenglykol und Alkylglykol, zum Beispiel Copolymeren
der Familie der ELFACOS von AKZO NOBEL,
- – Di-
oder Triblock-Copolymeren aus Ethern von Polyethylenglykol und Polyalkyenglykol,
zum Beispiel Copolymeren der Familie der ARLACELL von ICI
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Diese
Amphiphile oder Tenside können
alleine oder im Gemisch verwendet werden. Von diesen Amphiphilen
können
bestimmte selbst eine zum Beispiel lamellare Flüssigkristallphase durch Mischen
mit einem polaren Lösemittel
bilden. Andere werden ausschließlich
in einem Gemisch, in geringerem Anteil, verwendet, um der Flüssigkristallphase
die Eigenschaften der Steifheit oder Elastizität zu verleihen.
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Der
Fachmann wird in der Lage sein, die geeignetsten Moleküle zur Bildung
einer Flüssigkristallphase aus
diesen Molekülen
auszuwählen
und die Bildung der Flüssigkristallphase
durch optische Mikroskopie zu kontrollieren. Es gilt anzumerken,
daß der
Großteil
der oben genannten Tenside nicht geladen ist und somit nicht geeignet
ist, durch eine elektrostatische Wechselwirkung in die Kondensation
des Makromoleküls
einzugreifen, das in die Flüssigkristallphase
eingefügt
werden soll. Solche nicht geladenen Tenside sind somit an das Aufnehmen
von geladenen Makromolekülen,
wie DNA, angepaßt.
In der oben angeführten
Liste sind bestimmte Tenside enthalten, die eine Ladung aufweisen,
dies ist insbesondere bei den Salzen der Fettsäuren oder bestimmten Phospholipiden
oder Sphingosinderivaten der Fall, die für die Aufnahme von nicht geladenen Makromolekülen in die
Mischphasen der Erfindung verwendet werden können.
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Wie
zuvor dargelegt, besteht eine der wesentlichen Eigenschaften der
Erfindung darin, daß sie
es ermöglicht,
konzentrierte Strukturen aus Makromolekülen herzustellen, ohne auf
elektrostatische Kräfte
zurückzugreifen.
Somit werden – wenn
das Makromolekül
einen ionischen Charakter aufweist – gemäß der Erfindung nicht geladene
amphiphile Mittel verwendet. Dennoch ist es gemäß der Erfindung auch möglich, in
die Zusammensetzungen der Erfindung relativ geringe Mengen von Produkten
mit ionischem Charakter einzuführen,
um der Mischstruktur der Erfindung oder den Vesikeln, die durch
Dispersion dieser Mischstruktur erhalten werden (wie aus folgender
Beschreibung hervorgehen wird), besondere Eigenschaften zu verleihen.
In diesem Fall wird das Haupttensid, das keinerlei Ionizität aufweisen
muß, von
dem eventuell ionischen Zusatzstoff unterschieden, der hinzugefügt wird,
um die Eigenschaften, zum Beispiel die Eigenschaften der Haftung
an den Zellwänden,
der gebildeten Struktur zu ändern.
Diese Unterscheidung ist leicht durchzuführen, weil die Originalstruktur
der Erfindung, die durch die Aufnahme einer großen Menge an biologischen Markomolekülen in das Innere
einer Flüssigkristallphase
erhalten wird, ohne einen Zusatzstoff, aber natürlich nicht ohne das Haupttensid
erhalten werden kann.
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Es
ist somit wichtig, festzuhalten, daß es mehr noch als der Aspekt
der relativen Menge zwischen dem Haupttensid und dem Zusatzstoff,
die jeweilige Rolle der beiden ist, durch welche sie sich unterscheiden.
Der Zusatzstoff, der selbst ein Tensid oder zum Beispiel ein Polymer
sein kann, kann ionisch sein. In diesem Fall kann er in der Struktur
enthalten, aufgepfropft oder an der Oberfläche adsorbiert sein. Der Zusatzstoff
kann somit zum Beispiel eine Oberflächenhaftungseigenschaft verleihen,
die interessant ist, um das Einfangen des Gemisches, welches das
Makromolekül
enthält,
durch eine Zelle zu begünstigen.
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Das
bevorzugte Verfahren zur Herstellung dieser neuen Strukturen ist
jenem der multilamellaren Vesikel von Tensiden sehr ähnlich.
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Allgemein
umfaßt
dieses Verfahren folgende Schritte:
- – Herstellung
eines homogenen Gemischs, welches die amphiphiten Verbindungen und
das Makromolekül enthält, wobei
das Makromolekül
zu mindestens 5 % Gewichtsanteilen bezogen auf die amphiphiten Verbindungen
vorliegt,
- – Aufnahme
einer angemessenen Menge von wäßrigem oder
polarem Medium zur Bildung einer Flüssigkristallphase mit den amphiphiten
Verbindungen.
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Die
angemessene Menge von wässerigem
Medium kann durch optische oder polare Mikroskopie kontrolliert
werden, wodurch es möglich
wird, die Bildung der Flüssigkristallphase
aufzuzeigen.
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Der
oben angeführte
Wert von 5 % ist ein Mindestwert, um die strukturierte Mischphase
der Erfindung zu erhalten. Der Fachmann wird leicht verstehen, daß die optimalen
Werte dieses Verhältnisses
mit der Natur des Makromoleküls
und seinen Abmessungen sowie mit der Natur der verwendeten amphiphilen
Mittel variieren. Allgemein hat man festgestellt, daß die Aufnahme
des Makromoleküls
in die Flüssigkristallphase
um so besser erfolgte, je größer die
Menge war, in der das Makromolekül
zugeführt
wurde. Die Grenzwerte, auf die man stoßen kann, haben vielmehr mit
praktischen Erwägungen
zu tun, insbesondere die maximalen Makromolekülkonzentrationen, die zu Lösungen oder
Dispersionen führen,
die für
eine Manipulation zu flüssig
sind, und nicht so sehr mit theoretischen Erwägungen. Man kann sich dennoch
leicht vorstellen, daß ein
Verhältnis von
1/1 zwischen dem Tensid und dem Makromolekül ein vernünftiger, wenngleich nicht absoluter,
Grenzwert ist.
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Somit
ist im Fall der Herstellung einer strukturierten Mischphase gemäß der Erfindung,
welche ein Makromolekül
enthält,
das aus einer Verkettung von Nukleotidgruppierungen, insbesondere
DNA, besteht, das bevorzugte Herstellungsverfahren jenem für multilamellare
Vesikel von Tensiden sehr ähnlich.
Es besteht darin, eine lamellare Phase ausgehend von einem Tensid
oder einem Gemisch aus Tensiden und einer wässerigen Phase herzustellen.
Die wässerige
Phase enthält
mindestens einen ziemlich konzentrierten gelösten Stoff eines solchen Makromoleküls, insbesondere
eines DNA- oder RNA-Moleküls.
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Das
Masseverhältnis ρ zwischen
Amphiphilen und Nukleotidmakromolekülen liegt zwischen 20 und 1, vorzugsweise
zwischen 5 und 1 (was bedeutet, daß man für 1 g Tensid 0,2 g bis 1 g
nukleotides Makromolekül hat).
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Das
Gemisch zur Herstellung der lamellaren Phase kann in einem einzigen
Schritt geschaffen werden, wobei alle Bestandteile getrennt gewogen
und gemeinsam hinzugefügt
werden. In diesem Fall kann wahlweise, um die Homogenität des Gemisches
zu begünstigen,
auf einen oder mehrere Gefrier-/Auftauzyklen und/oder einen oder
mehrere Gefriertrocknungs- und Rehydrierungszyklen zurückgegriffen
werden.
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Wenn
bestimmte Bestandteile des Gemischs schwer aufzulösen sind
(zum Beispiel Cholesterin), kann eventuell auch ein Lösemittel,
zum Beispiel ein Alkohol oder ein chlorhaltiges Lösemittel,
oder ein Gemisch dieser Lösemittel
verwendet werden, um diese Bestandteile aufzulösen und nach dem Verdampfen
ein homogenes Gemisch dieser Bestandteile zu erhalten, das durch
Hydrierung die – vorzugsweise
lamellare – Flüssigkristallphase
ergibt.
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Das
exakte Herstellungsverfahren ist für den Erfolg der Aufnahme nicht
kritisch, vorausgesetzt, die – vorzugsweise
lamellare – Flüssigkristallphase
ist konzentriert und es gibt keinen Überschuß an Lösemittel (wässerige Phase), wobei bestimmte
klassische Verfahren, die verwendet werden, um den Einkapselungsgrad eines
Produktes in die Liposome oder andere multilamellare Vesikel von
Phospholipiden oder anderen nicht geladenen Amphiphilen, zu erhöhen, sehr
gut eingesetzt werden können.
Dennoch ist darauf zu achten, daß jeglicher Überschuß an Wasser
oder wässerigem
oder polarem Lösemittel
vermieden wird, der direkt zur Bildung von Vesikeln des klassischen
Liposomen-Typs führen
könnte.
Die Menge an Wasser oder wässerigem Medium
oder polarem Lösemittel
muß in
der Tat, wie zuvor angemerkt, der Menge entsprechen, die angemessen
ist, um eine Flüssigkristallphase
zu bilden, insbesondere eine lamellare Flüssigkristallphase.
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Die
von den Erfindern der vorliegenden Erfindung durchgeführten Tests
haben es ermöglicht,
die neuen gebildeten Strukturen deutlich zu charakterisieren, und
dies unter Stützung
auf Ergebnisse, die bei der Röntgenstrahlenbrechung
der Phasen erhalten wurden, die durch ein Gemisch aus Tensiden und
Makromolekülen
mit unterschiedlichen Konzentrationen erhalten wurden, wobei so
das Phasendiagramm des Systems Wasser/Tensid/Makromolekül gezeichnet
und die Analyse der elektronischen Dichte durchgeführt werden konnte,
die von den Intensitäten
der Brechungsspitzen abgeleitet wird.
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Die
verschiedenen Ergebnisse, die erhalten wurden und aus der Beschreibung
und den folgenden Beispielen hervorgehen, werden auch unter Bezugnahme
auf 1 bis 5 angeführt, die der Beschreibung beiliegen.
Es zeigen:
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1A bis 1D:
Die Intensität
der Röntgenstrahlenbrechung
(Synchrotron) der lamellaren Phasen mit 50 % Wasser in Abhängigkeit
vom Wellenvektor q (q = 4π sinθ/λ) für verschiedene
Massenverhältnisse Lipid/DNA7p.
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1A: ρ = ∞ (Abwesenheit
von DNA)
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1B: ρ = 80
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1C: ρ = 20 und
-
1D: ρ = 2. In 1D wird
die Korrelationsspitze zwischen DNA-Strängen durch einen Pfeil im Einschub
angezeigt.
-
2A:
das Profil der elektronischen Dichte entlang der Stapelungsachse
der Lipidschichten für
die lamellare Phase zu ρ =
2 und 47,4 % H2O (durchgehende Linie). Zum
Vergleich ist das Profil der elektronischen Dichte einer lamellaren
Phase in Abwesenheit von DNA ebenfalls dargestellt (punktiert).
-
2B:
eine schematische Darstellung der lamellaren Phase, die organisierte
DNA (Lc a) enthält; der lange
horizontale Pfeil zeigt den Abstand der Wiederholung der lamellaren
Phase an (ungefähr
80 Å),
der kurze vertikale Pfeil den Abstand zwischen DNA-Strängen (30
bis 40A).
-
3:
Einkapselungsgrad (gemessen als die Menge an DNA, die im Inneren
eingekapselt ist, bezogen auf die Gesamtmenge der DNA, die in der
Formulierung aufgenommen ist) der Vesikel, die ausgehend von einer
Phase (Lc a) mit ρ = 2 erhalten
werden, in Abhängigkeit
von der Osmolarität
(ausgedrückt
in Milliosmomol) des Dispersionsmediums.
-
4:
das Profil der Synchrotron-Brechung der Röntgenstrahlen der Vesikel,
die ausgehend von der Phase (Lc a)
mit ρ =
2 und 50 % H2O erhalten werden, die in einem
Medium mit 603 (durchgehende Linie) und 1457 (punktiert) mOsm dispergiert
sind. Die Pfeile im Einschub zeigten die Korrelationsspitzen zwischen DNA-Strängen auf.
-
5:
das Massenverhältnis
Lipid/eingekapselte DNA, ρ*,
der Vesikel, enthaltend DNA mit –150 pb (dunkelgrau) oder ein
Plasmid mit 5581 pb (hellgrau), bestimmt nach Verdünnung der
Vesikel in einem PBS-Puffer mit 300 mOsm in Abhängigkeit vom Masseverhältnis Lipid/DNA, ρ, der lamellaren
Phase.
-
Nachfolgend
werden die beobachteten Resultate im Fall von DNA wiedergegeben.
Dieses Molekül wurde
aus zwei Gründen
gewählt.
Erstens, weil es praktisch unmöglich
ist, in nicht kationische Mikrovesikel nützliche DNA-Mengen einzukapseln.
Zweitens, weil von einem demonstrativen Standpunkt aus betrachtet, die DNA
aufgrund ihrer sehr großen
Länge und
besonderen Struktur sicherlich die größte Herausforderung darstellt.
Der Fachmann wird verstehen, daß – wenngleich
durch dieses Verfahren große
Mengen von besonders sperrigen DNA-Molekülen eingekapselt werden können, eine
Generalisierung auf andere Makromoleküle wie Proteine oder Polysaccharide,
deren Verhalten allgemeiner ist, keine größeren Schwierigkeiten bereitet.
-
Der
wichtigste experimentelle Nachweis für die Aufnahme des nukleotiden
Makromoleküls
in die lamellare Phase wird durch Röntgenstrahlbrechung erbracht.
In der Tat wird die lamellare Phase, wie jede Flüssigkristallphase, die eine
Wiederholungsperiode entlang der Stapelungsachse aufweist, ein Röntgenstrahlbrechungssignal
abgeben, das als Bragg-Spitze bezeichnet wird. Die Position dieser
Brechungsspitze (ausgedrückt
als Brechungswinkel oder Wellenvektor q) hängt direkt vom Wiederholungsabstand
ab. Zudem sind die Intensitäten
der Spitzen mit dem Profil der elektronischen Dichte des Wiederholungsmotivs
verbunden.
-
Die
Beobachtungen bei der Röntgenstrahlenbrechung
wurden für
verschiedene Werte des Massenverhältnisses Lipide/DNA, ρ, und Wasserkonzentrationen
der Proben durchgeführt.
Vier Brechungsgraphen mit konstanter Hydrierung (50 % Wasser) werden
angeführt
(siehe 1A bis 1D), in
Abwesenheit von DNA, für ρ = 80 (geringe
DNA-Ladung), ρ =
20 (mittlere DNA-Ladung) und für ρ = 2 (starke
DNA-Ladung).
-
Für das System
in Abwesenheit von DNA und im Fall von geringen DNA-Mengen werden Bragg-Spitzen
beobachtet, die für
eine lamellare Phase (siehe 1A und 1B)
charakteristisch sind. Der Wiederholungsabstand mit ρ = 80 (≅ 59 Å) ist bezogen
auf das System in Abwesenheit von DNA (≅ 63 Å) leicht verringert, wahrscheinlich
aufgrund einer teilweisen Dehydrierung der lamellaren Phase aufgrund
der Gegenwart von nicht aufgenommener DNA.
-
Bei ρ = 20 wird
eine Koexistenz von zwei Brechungssystemen beobachtet, was die Koexistenz
von zwei lamellaren Phasen (siehe 1C) belegt,
wobei eine davon keine DNA und einen geringeren Wiederholungsabstand
(≅ 53 Å) aufweist
als die lamellare Phase in Abwesenheit von DNA, während die
andere, die mit DNA angereichert ist, eine sehr starke Zunahme des
Wiederholungsabstandes (≅ 129 Å) aufweist.
-
Bei ρ = 2 wird
die Existenz eines einzigen lamellaren Systems mit einem erhöhten Wiederholungsabstand
(≅ 77 Å) bezogen
auf die lamellare Phase, die keine DNA enthält (siehe 1D ),
beobachtet. Ferner wird eine Korrelationsspitze zwischen den DNA-Strängen (≅ 32 Å) beobachtet.
Diese Spitze verschiebt sich bei dem Wechsel der Menge an DNA in
der lamellaren Phase, ein Beleg dafür, daß die DNA tatsächlich in
die lamellare Phase von Lipiden in geordneter Form aufgenommen wird.
Ferner ist beobachtet worden, daß in Folge des Varüerens der
Wasserkonzentration eines solchen Systems die zwei Wiederholungsabstände, jener der
lamellaren Phase und jener des Korrelationsabstandes zwischen den
DNA-Molekülen, auf
dieselbe Weise variierten. Daraus läßt sich die überraschende
Existenz einer hohen DNA-Konzentration (das Phänomen ist für ρ < 6 zu beobachten) eines DNA-Netzes
ableiten, das zwischen den Schichten des Lipidnetzes interkaliert ist.
-
Ein
anderer Beleg für
die Existenz dieses gemischten Systems von interkalierten Netzen
der lamellaren Lipidphase und organisierten DNA-Phase läßt sich
aus der Analyse der elektronischen Dichte ausgehend von den Intensitäten der
Brechungsspitzen ableiten. Das Profil der elektronischen Dichte
einer lamellaren Lipidphase/DNA/Wasser (ρ = 2) entlang der Stapelungsachse
der Lipidschichten ist in 2 dargestellt.
Zum Vergleich ist auch ein Profil der elektronischen Dichte einer
lamellaren Phase in Abwesenheit von DNA in der Figur punktiert dargestellt.
Der wesentliche Unterschied zwischen diesen beiden Profilen liegt
in der Gegenwart einer Erhöhung
mit starker elektronischer Dichte mit ungefähr 40 Å des Zentrums der Lipid-Doppelschicht und
einer Breite auf mittlerer Höhe
in der Nähe
von 10 Å.
Dies ist mit der Gegenwart von interkalierten DNA-Molekülen in der
wässerigen
Phase zwischen den Lipid-Doppelschichten kompatibel. Im Folgenden
wird diese lamellare Phase, die organisierte DNA enthält, als
(Lc a) bezeichnet.
-
Diese
Beobachtungen sind jenen ganz ähnlich,
die bei kationischen Lipiden gemacht wurden (vgl. I Koltover, et
al, Science, 281, p78 1998: J.O. Räder, et al., Science, 275 S.
810, 1997: T. Salditt et al. Physical Review Letters, 79 p, 2582,
199/), wobei dieses Phänomen
jedoch völlig
unerwartet bei Phasen von nicht geladenen Tensiden beobachtet wird.
-
Dieses
Ergebnis ist überraschend,
weil die Erklärungen,
die von den Autoren der Arbeiten über die Aufnahme von DNA in
lamellare Phasen von kationischen Lipiden gegeben wurden, an die
Gegenwart von starken ionischen Wechselwirkungen zwischen den Lipiden
und dem Nukleotid gebunden waren. Im Fall der vorliegenden Erfindung
existieren solche Wechselwirkungen nicht, so daß die Erklärung, die dem Fachmann bekannt
ist, hier nicht gilt. Ohne daß dies
ein Beweis wäre,
noch eine Erklärung
für das
beobachtete Phänomen,
läßt sich
sagen, daß im
Fall der Erfindung die thermodynamische Stabilität des Gebildes (Mischnetz aus Lipiden
und DNA), das ausschließlich
mit starker DNA-Konzentration erhalten wurde, mit dem im Vergleich
zu einem weniger konzentrierten System, bei dem dieser entrope Term
nicht so wirksam wäre,
geringen Entropie-Verlust eines solchen Systems in Zusammenhang
stehen könnte,
bei dem die zwei Untereinheiten geordnet sind.
-
Die
neuen Strukturen, die im Rahmen der vorliegenden, oben beschriebenen
Erfindung dargelegt werden, erweisen sich insbesondere aufgrund
der Möglichkeit
als interessant, diese neuen Strukturen durch Dispersion in multilamellare
Vesikel mit Zwiebelstruktur zu verwandeln, die in ihrem Inneren
die Makromoleküle mit
bis dato noch nie beobachteten Konzentrationen aufnehmen.
-
Somit
betrifft gemäß eines
anderen dieser Aspekte die vorliegende Erfindung Vesikel, die ausgehend von
den Mischmedien der Erfindung durch einfache Dispersion dieses Mediums
erhalten werden, sowie ein Verfahren, um diese Vesikel herzustellen
und insbesondere, um mit dem Einkapselungsgrad der Makromoleküle im Inneren
der Vesikel zu spielen.
-
Die
durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung durchgeführten Tests
haben es in der Tat ermöglicht, die
effektive Gegenwart der Makromoleküle in der lamellaren Phase
deutlich zu machen, selbst nach Dispersion dieser in wässerigem
Medium, das heißt
unter Bedingungen, bei denen die Phase (Lc a) thermodynamisch instabil ist.
-
Ferner
haben die von den Erfindern der vorliegenden Erfindung durchgeführten Tests
es ermöglicht, zu
zeigen, wie durch das Spielen mit der ionischen Kraft des Dispersionsmediums
ein Spielen mit dem Einkapselungsgrad des Makromoleküls im Inneren
der Vesikel ermöglicht
wurde.
-
Nachstehend
werden die Ergebnisse angeführt,
die mit der DNA erzielt wurden. Wie zuvor angeführt, bereitet die Generalisierung
auf andere biologische Makromoleküle keine Schwierigkeiten, da
das Verhalten dieser Makromoleküle
immer einfacher als jenes der DNA ist. Die Betrachtungen im Hinblick
auf den Einfluß der ionischen
Kraft auf die Schwankung des Einkapselungsgrades sind direkt auf
diese Makromoleküle übertragbar,
wobei das Phänomen
mehr mit dem osmotischen Druck zu tun hat, der durch diese Unterschiede
bei der ionischen Kraft entsteht, und mit ihren Konsequenzen auf
die Integrität
der Vesikel, als mit dem Einfluß der ionischen
Kraft auf die Konformation des Makromoleküls.
-
Es
wurden Experimente durchgeführt,
um die effektive Gegenwart von DNA in der lamellaren Phase zu prüfen, selbst
nach der Dispersion derselben in wässerigem Medium, das heißt unter
Bedingungen, unter denen die Phase (Lc a) thermodynamisch instabil ist. Es wurde
gezeigt, daß es
unter Berücksichtigung
der sehr starken DNA-Konzentration
in der lamellaren Lipidphase, die eine bedeutende Osmolarität mit sich
bringt, unerläßlich ist,
die lamellare Phase, welche DNA enthält, in einem wässerigen
Medium mit ausreichender ionischer Kraft zu dispergieren. Dies wurde
durch Verwendung eines wässerigen
Puffers als Dispersionsmedium erreicht. Das Ergebnis wird auf der
Kurve wiedergegeben, die in 3 dargestellt
ist, wo die Einkapselungsleistung (gemessen als DNA-Menge, die im
Inneren eingekapselt ist, bezogen auf die Gesamtmenge der DNA, die
in der Formulierung aufgenommen ist) in Abhängigkeit von der Osmolarität des Dispersionsmediums
aufgetragen ist. Im Folgenden wird als Einheit für die Osmolarität Milliosmomol
(mOsm) verwendet, wobei dies die Einheit ist, die auf biologischem
Gebiet häufig
verwendet wird. Diese Einheit ist mit Pascal durch eine lineare
Beziehung verbunden: 100 mOsm = 2,4777 103 Pa.
-
Es
läßt sich
feststellen, daß für eine Osmolarität von mehr
als ≅ 500
Milliosmol die Einkapselungsleistung konstant um 70 % herum liegt,
wobei anzumerken ist, daß ein
guter Einkapselungsgrad von ungefähr 60 % bereits bei 300 mOsm
(physiologisches Medium) erreicht wird.
-
Ferner
haben wir ein überraschendes
Phänomen
belegt. Es ist möglich,
die Vesikel der Erfindung mit einer Osmolarität zu dispergieren, die über jener
des physiologischen Mediums liegt, um den Einkapselungsgrad von
DNA zu optimieren, und sie in der Folge in einem physiologischen
Medium ohne Verlust von eingekapselter DNA zu verdünnen. Wir
haben zudem gezeigt, daß die
DNA, die in den Vesikeln gemäß der Erfindung
auf der Basis von neutralen Lipiden eingekapselt ist, in der Tat
davor geschützt
wird, durch die DNase verschlechtert zu werden und daß die Dispersionen
eine sehr gute Stabilität
aufweisen (Verringerung des Einkapselungsgrades von ungefähr 70 %
auf ungefähr
60 % nach einem Monat).
-
Allgemeiner
gesagt, können
die Dispersionen der Vesikel der Erfindung in einem Verfahren erhalten werden,
das folgende Schritte aufweist:
- – Dispersion
in einem Medium von gleicher Osmolarität wie das interne Medium,
- – Veränderung
der Osmolarität
des externen Mediums durch Zugabe von Salz oder Wasser oder durch
Dialyse zum Erhalt der gewünschten
Osmolarität.
-
Die
Integrität
der Phase (Lc a)
nach der Dispersion in Form der Vesikel wurde auch durch Röntgenstrahlenbrechung
verifiziert. Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt.
Es kann festgehalten werden, daß die
Korrelationsspitze zwischen DNA-Strängen noch
beobachtbar ist. Der Wiederholungsabstand der Lipid-Doppelschichten
und der DNA wird in Abhängigkeit
vom osmotischen Druck des dispergierenden Mediums geändert. Dies
belegt deutlich, daß die
molekulare Anordnung beibehalten wird, selbst zum Zeitpunkt der
Dispersion.
-
In 5 ist
für zwei
DNA-Typen die Entwicklung des Massenverhältnisses Lipid/DNA dargestellt,
eingekapselt in den Vesikeln gemäß der Erfindung,
die im physiologischen Medium, ρ*,
dispergiert sind, in Abhängigkeit
vom Massenverhältnis
Lipid/DNA der Phase (Lc a)
vor Dispersion. Die Darstellung der Einkapselungskraft durch ρ* anstatt
durch den Prozentsatz des Einkapselungsgrades ist deshalb klüger, da
dies direkt der Menge an DNA in dem Vektor entspricht. Für kurze
DNA (≈ 150
p.b.) sowie für
das Plasmid (5581p.b.) verringert sich ρ* (die Menge von DNA im Vektor
steigt) mit der Verringerung von ρ der
Phase (Lc a). Die
Einkapselungskraft der Vesikel der Erfindung auf der Basis von neutralem
Lipid ist für
das große
Plasmid geringer als für
die kurze DNA, wobei jedoch trotzdem ein ρ*-Wert in der Größenordnung
von 6 erzielt wird, also eine Einkapselung von bedeutsamen Plasmidmengen.
-
Die
Anwendungen dieser Technik sind auf dem Gebiet der Vektorisierung
von Genen für
die Gen-Therapie sehr wichtig. In der Tat ist der Umstand, eine
große
Menge an nukleotiden Makromolekülen
mit einer sehr guten Einkapselungsleistung aufnehmen zu können, eine
wichtige Bedingung für
den Erfolg solcher Ansätze. Ferner
erlaubt der Umstand, daß es
nicht notwendig ist, kationische Lipide zu verwenden, die Verwendung
solcher Systeme in vivo, wo Katione schnell durch Proteine eingefangen
werden und somit ineffizient sind. Ferner weisen die neutralen Lipide
eine wesentlich geringere Cytotoxizität als kationische Lipide auf.
-
Diese
Erwägungen
in Bezug auf das Einfangen durch zirkulierende Proteine, der Haftung
an den Zellwänden
und der Cytotoxizität
sind offensichtlich unabhängig
von der Natur des Makromoleküls,
das in dem Vesikel aufgenommen ist.
-
Beispiele:
-
Produkt:
-
Folgende
Rohstoffe wurden in den Beispielen verwendet:
-
-
Die
Kalbsthymus-DNA wurde mit Ultraschall behandelt, um Doppelstrangfragmente
mit der Persistenzlänge
der DNA zu erhalten. Die Größe dieser
Fragmente wurde als nahe bei 150 Basenpaaren (pb) durch Elektrophorese
auf Agarose-Gel ermittelt.
-
In
allen Beispielen sind die Prozentsätze als Masseprozentsätze angegeben.
-
Mischung der amphiphilen
Bestandteile:
-
Die
unterschiedlichen lamellaren Phasen wurden wie folgt hergestellt:
-
Um
die Herstellung zu vereinfachen, ist es möglich, zuvor eine Stamm-Mischung aus den
unterschiedlichen Tensiden herzustellen, die in der Formulierung
verwendet werden. Diese Stamm-Mischung kann direkt entweder bei
Umgebungstemperatur hergestellt werden, oder – um die Mischung zu beschleunigen – unter leichtem
Erhitzen. Es ist auch möglich,
die verschiedenen Tenside in einem Lösemittel (Alkohol und/oder
chlorhaltiges Lösemittel
zum Beispiel) aufzulösen,
um sie in guten Verhältnissen
zu vermischen, danach das Lösemittel
unter Vakuum zu verdampfen, um die Starnm-Mischung der Tenside zu
erhalten. Dieses Verfahren ermöglicht
es auch, die Lösung
zu filtrieren, um sie erforderlichenfalls zu sterilisieren.
-
Die
Stamm-Mischung kann bei –18 °C für eine weitere
Verwendung gelagert werden.
-
Herstellung von lamellaren
Phasen, die DNA enthalten:
-
Die
Menge an DAIA zum Erhalten des gewünschten Masseverhältnisses
Lipid/DNA wird zur trockenen und homogenen Mischung der Lipide hinzugefügt. Die
Zugabe erfolgt am einfachsten, indem die wässerige DNA-Lösung gemäß der gewünschten
Menge hinzugefügt
wird. Das System wird gemischt und ruhen gelassen, damit es homogenisieren
kann. Die Zeit, die für
das Erreichen des Gleichgewichts notwendig ist, hängt von
der Hydrierung und dem Gehalt an DNA des Systems (im Durchschnitt
einige Tage) ab. Die homogene lamellare Phase kann danach im Dunkeln
bei –20 °C über Monate
hinweg gelagert werden, ohne daß sie
ihre Eigenschaften verliert und ohne daß eine chemische Verschlechterung
der Bestandteile eintritt.
-
Herstellung der Vesikel
ausgehend von der Phase Lc a:
-
Die
Dispersion der lamellaren Phase in einem Puffer mit gewünschter
Osmolarität
ergibt die Vesikelphase. Ein leichtes Rühren während einiger Stunden, ermöglicht es,
die Vesikel einfach zu dispergieren. Die Homogenität der Dispersion
wird punktuell durch Phasen-Kontrastmikroskopie kontrolliert.
-
Wenn
man eine kessere Größenhomogenität erreichen
möchte,
kann man auch ein Scheren der strukturierten Phase zwischen zwei
entsprechenden Glasklingen durchführen. Die Kontrollle der Scherung
erfolgt durch optische Mikroskopie zwischen gekreuzten Polarisatoren.
-
Im
Fall der Phase (Lc a),
welche das Plasmid enthält,
wurde die Integrität
des Plasmides nach der Scherung und der Dispersion durch Elektrophorese
auf Agarose-Gel überprüft.
-
Messung des osmotischen
Drucks:
-
Der
osmotische Druck im Inneren der Vesikel, welche die DNA enthalten,
wurde ausgehend von Messungen des osmotischen Drucks der wässerigen
DNA-Lösungen mit
150 pb auf einem klinischen Osmometer vom Typ 13 DR-Autocal gemessen.
Der osmotische Druck der wässerigen
DNA-Lösung
entwickelt sich in nicht linearer Weise mit der DNA-Konzentration,
wobei dies ein klassisches Verhalten für Makromoleküle ist.
Die Schätzungen
zeigen, daß der
osmotische Druck der Phase (Lc a)
mit ρ =
2 und 50 % Wasser (in der Masse) in der Größenordnung von 500 Milliosmomol
liegt, was einem Salzgehalt von ungefähr 0,28 M entspricht. Der osmotische
Druck der unterschiedlichen verwendeten Puffer wurde durch Zugabe
von NaCl angepaßt
und durch experimentelle Messung überprüft.
-
Schutz der DNA in den
Vesikeln vor einer Einwirkung der DNase:
-
Vesikel,
welche DNA sowie nicht eingekapselte Referenz-DNA enthielten, wurden
mit der DNase vom Typ 1 in Gegenwart von Mg2+ inkubiert.
Die DNase vom Typ 1 ist eine Endonuklease, welche die Verschlechterung
der einfachen und doppelten DNA-Stränge katalysiert und Oligonukleotide
mit 5'-P-Endungen
erzeugt. Sie erfordert, um ausgeführt werden zu können, die
Gegenwart von zweiwertigen Kationen. Die Verschlechterung durch
die DNase wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten durch die Zugabe
von EDTA und DNA gestoppt, die durch Elektrophorese auf Gel analysiert
wurde. Selbst lange nach der vollständigen Zerstörung der
Referenz-DNA weist die eingekapselte DNA keinerlei Anzeichen einer
Verschlechterung auf.
-
Röntgenstrahlenbrechung:
-
Für die Brechung
der Röntgenstrahlung
werden die Proben in Glaskapillaren von 1 mm oder in flache Träger (gekreuzte
Dicke 1 mm) transferiert und versiegelt. Die Experimente der Röntgenstrahlenbrechung
wurden entweder auf einem Generator mit Drehanode (Cu Kα λ = 1,5405 Å) oder
auf einem Synchrotron (λ =
1,0A Beamline ID2, ESRF, Grenoble) mit einem 2D-Detektor und variablen
Abständen
zwischen der Probe und dem Detektor (500 mm bis 1000 mm) durchgeführt.
-
Nach
der Umgruppierung wurden die exakten Positionen der Spitzen sowie
ihre Intensität
durch Gauss'sche
Parametrierung der Spitzen nach Abzug des Bodens erhalten. In den
Fällen,
in denen mehrere Spitzen pro Phase erhalten wurden, wurden die Wiederholungsabstände, d,
durch eine Parametrierung durch die kleinsten Quadrate der Neigung
von (h2 + k2 + I2)½ für die Indizes hkl (wobei I
und k = 0 für
eine lamellare Phase) in Abhängigkeit
der gegenseitigen Beabstandungen bestimmt.
-
Die
Intensitäten,
die dem Quadrat von Strukturfaktoren entsprechen, wurden für den Lorentz-Faktor korrigiert
und einer Blaurock-Normalisierung unterzogen. Die Zeichen der Strukturfaktoren
wurden durch das klassische Schwellverfahren erhalten. Die Profile
der elektronischen Dichte der Phase (Lc a) wurden im Anschluß durch umgekehrte Fourier-Transformation
der Strukturfaktoren erhalten (vgl. zum Beispiel Franks, N.P. & Levine, W.R.
1981, in Membrane Spectroscopy (Springer Verlag, Heidelberg, 437–487).
-
Die
Experimente mit der Röntgenstrahlenbrechung
wurden auf lamellaren Phasen durchgeführt, die zwischen 25 und 70
% (Masseprozent) Wasser enthielten, das heißt im Bereich der konzentrierten
Phasen mit ρ zwischen ∞ und 1,
und auf Mischungen PC/C12E4 und PC/Monoolein (95:5, in Masse). Die
Wahl des Co-Tensids scheint keinerlei Einfluß auf das Diagramm der ternären Phasen
des Systems DNA/neutrales Lipid/Wasser zu haben. Im Gegenteil, die
Wiederholungsabstände
sind etwas höher
für die
Systeme, die C12E4 enthalten, und die Schwellgrenze ist zu den stärkeren Wasserkonzentrationen
hin leicht abgesetzt. Die DNA, die verwendet wird, um das Phasendiagramm
zu erstellen, wird zuvor mit Ultraschall und einer Länge von
ungefähr 500 Å (≅ 150 pb)
behandelt.
-
In
optischer Hinsicht läßt sich
ein Wasserüberschuß für die lamellare
Phase ab 50 % Wasser beobachten. Im Fall von Proben, die DNA enthalten,
liegt der beobachtete Wasserüberschuß zwischen
55 und 60 % in Abhängigkeit
vom DNA-Gehalt.
Die teilweise Bestimmung des Diagramms von Phasen durch Röntgenstrahlenbrechung
ermöglicht
es, zudem drei Regime zu unterscheiden: (i) die schwachen DNA-Konzentrationen
(p groß),
wo die d schwächer
sind als bei der lamellaren Phase ohne DNA (siehe 1B);
(ii) die mittleren Konzentrationen (p mittel), wo die Koexistenz
von zwei lamellaren Phasen im Gleichgewicht (vgl. 1C)
beobachtet wird, und (iii) die starken DNA-Konzentrationen (p klein),
wo eine einzige lamellare Phase erfaßt wird, die einen d-Wert aufweist,
der größer als
jener der lamellaren Phase in Abwesenheit von DNA ist (vgl. 1D). Die
Verringerung von d um einige Å im
Fall eines geringen DNA-Gehalts (i) läßt sich nur erklären, wenn
man berücksichtigt,
daß mindestens
ein Teil der DNA nicht in die lamellare Phase aufgenommen ist und
eine teilweise Dehydrierung letzterer herbeiführt. Für die mittleren Werte von ρ (ii) ähnelt die
Gegenwart einer Zweiphasenanordnung lamellarlamellar dem, was im
Fall von gemischten Systemen Tensid/Polymer/Wasser beobachtet wurde
(Nallet. F. et al., 1994, J. Phys. II France, 4,1477–1499).
Die DNA befindet sich im Wesentlichen in der Phase mit hohem ρ-Wert (ungefähr 110 bis
130 Å),
wobei die Phase mit geringem d-Wert (ungefähr 50 Å) keine DNA aufweist und leicht
dehydriert ist. Für ρ ≤ 6, (iii),
ist die einzige vorhandene lamellare Phase durch d-Werte gekennzeichnet,
die im Vergleich zur lamellaren Phase in Abwesenheit von DNA um
15 bis 20 Å erhöht sind.
Dies zeigt deutlich, daß die
DNA zwischen den Lipidlamellen begrenzt ist. Im Gegensatz zum System
kationisches Lipid/DNA ist hier die Begrenzung sterisch, da es keine
elektrostatischen Wechselwirkungen gibt.
-
Zusätzlich zu
den Spitzen der lamellaren Phase wird eine Spitze beobachtet, die
sich zwischen q ≅ 0,15
und 0,2 In Abhängigkeit
von der lamellaren Phase befindet (siehe Einschub in 1D).
Diese Spitze existiert nicht für
die Proben mit ρ > 6 und wurde der Korrelation
zwischen DNA-Strängen
zugeschrieben, wie dies für
die Systeme kationische Lipide/DNA beobachtet wurde (J.O. Räder, et
al, Science, 275 S. 810 1997; T. Salditt et al, Physical Review
Letters, 79 S. 2582 1997). Der Abstand zwischen DNA-Strängen variiert
in der Tat mit ρ zwischen ≈ 30 und 42 Å mit konstanter
Hydrierung. Diese Abstände
sind für
eine nematische Organisation der DNA in Wasser (Durand, D. et al.,
1992, J. Phys, 11 France 2, S. 1769–1783) charakteristisch. Wir haben
somit eine lamellare Phase (Lc a),
wo die DNA zwischen den smektischen Doppelschichten interkaliert und
in nematisch-2D (siehe auch 1B) organisiert
ist. Es ist ebenfalls zu beobachten, daß der Abstand zwischen DNA-Strängen sich
mit der Verringerung der Hydrierung bei konstantem ρ-Wert verringert.
Dies ist auf die Einschränkung
des Wobbling (der Schwingungen) der Doppelstränge der DNA zurückzuführen, wenn
sich der interstitielle Raum verringert.
-
Die
Brechung von Röntgenstrahlen
auf Vesikeln, welche eingekapselte DNA enthalten, die in Puffer dispergiert
ist, wurde ebenfalls durchgeführt.
Zu diesem Zweck wurden die Vesikel in einem großen Pufferüberschuß dispergiert und im Anschluß daran
konzentriert. Dieser Verdünnungsschritt,
gefolgt von einer Konzentration, beseitigt beinahe die Gesamtheit
der nicht eingekapselten DNA. Ergebnisse, die mit diesen Zubereitungen
erzielt wurden, sind in 4 dargestellt. Das Brechungsprofil
ist für
eine lamellare Phase charakteristisch und belegt den multilamellaren
Charakter der Vesikel. Der interlamellare Abstand d hängt, wie
erwartet, von dem osmotischen Druck des dispergierenden Puffers
ab und steigt im Vergleich zu den Vesikeln, die keine DNA enthalten,
um 15 bis 20 Å.
Darüber
hinaus läßt sich
leicht die Gegenwart einer Spitze der Korrelation zwischen DNA-Strängen erfassen,
die sich in Abhängigkeit
von der DNA-Menge in den Vesikeln und in Abhängigkeit vom osmotischen Druck
des dispergierenden Mediums verschiebt. All dies steht in vollkommener Übereinstimmung
mit den Erkenntnissen in Zusammenhang mit den konzentrierten Phasen
und beweist somit, daß die
Struktur aus der Phase (Lc a)
in den Vesikeln beibehalten wird.
-
Es
wurden auch Experimente der Röntgenstrahlenbrechung
durchgeführt,
um den Übergang
von einem hyperosmotischen dispergierenden Medium zu einem hypoosmotischen
Medium auf den Vesikeln zu untersuchen, welche DNA enthalten (siehe
weiter unten). In diesem Fall wurden die Vesikel in einem großen Lösemittelüberschuß mit 900
mOsm (hyperosmotisch) dispergiert. In der Folge haben wir einen
Lösemittelaustausch
durchgeführt,
indem wir auf 300 mOsm übergegangen
sind (physiologisches Medium; hypoosmotisch für die Phase (Lc a)). Es läßt sich
feststellen, daß die
lamellare Struktur selbst nach dem Übergang in das hypoosmotische
Medium intakt bleibt. Der d-Wert geht von ungefähr 78 Å bei 900 mOsm auf ungefähr 88 Å bei 300
mOsm über,
das heißt,
daß die
d-Werte großteils
größer bleiben
als im Fall der Vesikel, die keine DNA enthalten (≅ 63Å).
-
Ferner
wurden Profile elektronischer Dichte der Phase (Lc a) ausgehend von den Intensitäten der Bragg-Spitzen
der smektischen Anordnung rekonstruiert. Das in 2A dargestellte
Profil zeigt eine deutliche Erhöhung
der elektronischen Dichte auf ungefähr 40 Å des Zentrums der Lipid-Doppelschicht
und ist mit der Gegenwart von DNA in dem wässerigen Teil der lamellaren
Phase kohärent.
-
Bestimmung
von DNA-Einkapselungsgraden in den Vesikeln:
-
Der
Einkapselungsgrad wurde durch Spektrofluorimetrie bestimmt, wobei
als Fluorophor YOYO (λcx = 491 nm, λcm =
509 nm) verwendet wurde. Sofern nicht anders angegeben, wurden die
unten genannten Ergebnisse mit DNA erhalten, die durch Ultraschall
von ≈ 150
pb behandelt wurde.
-
Die
nicht eingekapselte DNA wird durch Zugabe von YOYO zu den wässerigen
Dispersionen der Vesikel (ID) gemessen.
Die Gesamt-DNA wird nach der Zerstörung der Vesikel durch Triton
(IT) dosiert. Der Einkapselungsgrad wird
wie folgt ermittelt: = 100 (IT-ID)/(IT-ID),
wobei I0 = Intensität von YOYO alleine. Die Umwandlung
in Massenverhältnis
Lipid/eingekapselte DNA geschieht wie folgt: ρ* = 100 p/Einkapselungsgrad.
-
Es
wurden Messungen des Einkapselungsgrads der DNA in Vesikeln in Abhängigkeit
vom osmotischen Druck des Puffers durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden
die Vesikel ausgehend von einer Phase (Lc a) mit ρ =
2 und mit 55 % Hydrierung hergestellt. Der osmotische Druck im Inneren
der Vesikel wurde in der Größenordnung
von 500 mOsm geschätzt.
In 3 ist zu sehen, daß der Einkapselungsgrad progressiv
bis zu einem osmotischen Druck von ungefähr 600 mOsm steigt und für stärkere osmotische
Drucke konstant bleibt, was die Bedeutung des osmotischen Drucks
für die
Optimierung des Einkapselungsgrades belegt. Diese Ergebnisse deuten
ebenfalls darauf hin, daß der
osmotische Druck im Inneren der Vesikel wahrscheinlich etwas stärker als
die Schätzungen
ist, die ausgehend von den wässerigen
DNA-Lösungen erfolgten.
Dies ist wahrscheinlich auf die Gegenwart von Salzen in dem Phospholipid
natürlichen
Ursprungs zurückzuführen.
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Dennoch
ist festzustellen, daß das
Optimum des Einkapselungsgrades der DNA sich bei einem osmotischen
Druck befindet, der über
jenem des physiologischen Mediums liegt (300 mOsm). Wir haben daher
in der Folge die Verdünnung
der Vesikel (Phase (Lc a): ρ = 2, 55
% Wasser), die in einem hyperosmotischen (900 mOsm) Medium hergestellt
werden, in einem Medium, das 300 mOsm aufweist und für die Phase
(Lc a) hypoosmotisch
ist, untersucht. In diesem Fall läßt sich völlig überraschend beobachten, daß der Einkapselungsgrad nicht
auf jenen der Vesikel sinkt, die mit 300 mOsm hergestellt wurden,
sondern sich mit jenem deckt, der mit 900 mOsm erhalten wurde. Es
ist somit möglich,
DNA enthaltende Vesikel mit starkem osmotischem Druck herzustellen
und diese in einem physiologischen Medium zum Zeitpunkt der Anwendung
zu verdünnen,
ohne daß es
zu einem Verlust von eingekapselter DNA kommt.
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Die
Untersuchung der Stabilität
dieser DNA-Vektoren in Abhängigkeit
von der Zeit zeigt, daß die
beste Stabilität
in einem hyperosmotischen Medium erhalten wird, wo man nur einen
leichten Rückgang
des Einkapselungsgrades von ≅ 70
bis ≅ 60
% im Laufe von 30 Tagen feststellt.
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Für die Untersuchung
der Optimierung in Abhängigkeit
von der Zusammensetzung der Phase (Lc a), die zur Herstellung der Vesikel dient,
wurden die Vektoren in einem hyperosmotoischen Puffer hergestellt
und der Einkapselungsgrad nach ihrer Verdünnung in einem physiologischen
Puffer gemessen.
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Indem
der Wassergehalt der Phase (Lc a)
zwischen 40 und 70 % bei konstantem ρ-Wert von gleich 2 variiert
wird, ergibt sich ein Maximum des Einkapselungsgrades bei einer
Hydrierung, welche der Schwellgrenze der Phase (Lc a) (55 % Wasser) entspricht. Bei Hydrierungen
von mehr als 55 % erklärt
sich der Rückgang der
Einkapselung durch den Umstand, daß sich die im Lösemittel
lösliche
DNA zwischen der Phase (Lc a)
und dem Lösemittelüberschuß aufteilt
und somit immer weniger im Inneren der Phase (Lc a) vorhanden ist. Unterhalb von 55 % ergibt
sich die Verringerung des Einkapselungsgrades, wenn die Hydrierung
sinkt, wahrscheinlich aus der geringen Hydrierung und der Zunahme
der Viskosität,
welche das Erhalten der Vesikel behindert haben.
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Indem
wir einen Hydrierungsgrad von 50 % beibehalten haben, der einer
maximalen Einkapselung entspricht, haben wir den Einfluß des ρ-Wertes der
Phase (Lc a) auf
den Einkapselungsgrad untersucht. Die Ergebnisse zeigen, daß im Allgemeinen
die Einkapselung durch einen Überfluß von Lipiden
(70 % für ρ = 4 gegenüber 45 für ρ = 1) erleichtert
wird. Es ist dennoch wichtig anzumerken, daß dieses Ergebnis in Prozent
von eingekapselter DNA keinerlei Angaben zur Entwicklung der Menge
eingekapselter DNA macht. Die Ergebnisse, die in Masseverhältnis Lipd/eingekapselte
DNA ρ* umgewandelt
wurden, sind in 5 dargestellt, wo man sieht,
daß für ρ = 4, trotz
eines erhöhten
Einkapselungsgrades (70 %), die Gesamtmenge an DNA in den Vesikeln
geringer als die eingekapselte für ρ = 1 ist.
Was die Optimierung der Einkapselung betrifft, ergeben sich somit
zwei Standpunkte: (i) entweder es wird eine große DNA-Menge (p schwach) eingeführt, die
eingekapselte Menge ist hoch, aber gleichzeitig wird viel DNA im
externen Medium beobachtet, (ii) oder es wird eine geringe DNA-Menge
eingeführt
(p hoch), die großteils
eingekapselt wird, wobei aber insgesamt betrachtet weniger DNA in
den Vesikeln vorhanden sein wird.
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Der
Einfluß des ρ-Wertes der
lamellaren Phase wurde ebenso für
die Vesikel untersucht, die Plasmid enthalten. In diesem Fall bleibt
der Einkapselungsgrad ungefähr
konstant bei 40 % zwischen ρ =
4 und 2, das heißt,
schwächer
als für
die kurze DNA. Die Umwandlung in ρ*
in Abhängigkeit
des ρ-Wertes
zeigt dennoch, daß sich
die zwei Systeme in vergleichbarer Weise entwickeln (siehe 5).
Dieses Ergebnis erlaubt es, auf das Plasmid dieselben Schlußfolgerungen
zu übertragen,
zu denen wir ausgehend von dem System gelangt sind, welches DNA
mit 150 p.b. enthält.