DE60014703T2

DE60014703T2 - Gemischte strukturen bei aufnahme von biologischen makromolekülen in einer flüssigkristall-phase von amphiphilen

Info

Publication number: DE60014703T2
Application number: DE60014703T
Authority: DE
Inventors: Tanja Pott; Rene Laversanne; Didier Roux
Original assignee: Capsulis SA
Current assignee: Capsulis SA
Priority date: 1999-12-21
Filing date: 2000-12-21
Publication date: 2005-10-13
Anticipated expiration: 2020-12-22
Also published as: WO2001045672A3; US20030003487A1; JP2003518037A; DE60014703D1; WO2001045672A2; AU781511B2; FR2802422B1; ATE278389T1; US7208173B2; EP1239834A2; ES2232522T3; AU2688901A; CA2394822A1; FR2802422A1; EP1239834B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Produkte, die sich aus der Aufnahme von biologischen Makromolekülen, insbesondere von DNA, in eine Flüssigkristallphase aus Amphiphilen ergeben, sowie die Verfahren zum Erhalt dieser Produkte.
Die Medizin behandelt bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt eine Krankheit, indem sie ein exogenes Molekül zuführt, das die vorliegende Funktionsstörung korrigiert oder zumindest deren Folgen aufhebt oder begrenzt. Leider ist der Einsatz des im Rahmen dieser Strategie verwendeten aktiven Moleküls meistens von unerwünschten Nebenwirkungen begleitet, welche manchmal dazu führen, daß die Therapie nicht durchgeführt werden kann. Andererseits können bestimmte Krankheiten, die mit einem genetischen Mangel oder einem genetischen Fehler in Zusammenhang stehen, nicht durch einen „chemischen" Ansatz behandelt werden, entweder weil das aktive Molekül nicht existiert oder weil es zerstört wird, bevor es wirken kann, oder weil es in Dosen verabreicht werden müßte, die zu hoch sind, oder weil es über zu lange Zeiträume hinweg verabreicht werden müßte.
Die Gen-Therapie ist ein neuer Ansatz, um diese Unzulänglichkeiten der klassischen Medizin zu beseitigen. Diese Therapie besteht darin, ein mangelhaftes Gen zu ersetzen oder ein neues Gen zuzuführen, wodurch die Behandlung eines pathologischen Zustandes ermöglicht wird. Mit einer solchen Strategie wird kein Medikament mehr zugeführt, sondern es werden dem Organismus die Mittel zur Verfügung gestellt, um gegen die Krankheit zu kämpfen oder den Mangel, der die Krankheit auslöst, zu korrigieren.
Diese Strategie, die durch den Fortschritt der Molekularbiologie möglich gemacht wurde, welcher die Identifikation und die Synthese der Gene von Interesse ermöglicht, muß so ausgeführt werden, daß das nützliche Gen bis zu seinem zellulären Ziel zugeführt werden kann, danach in die Zelle eindringen und sich schließlich exprimieren kann. Das Gen muß vektorisiert werden, das heißt, es muß in einen Vektor eingeführt werden, mit dessen Hilfe es die verschiedenen Barrieren überwinden kann, welche den Organismus und die Zelle vor dem Eindringen von fremdem genetischem Material schützen. Der ideale Vektor muß ausreichend DNA (oder RNA) aufnehmen, diese vor den verschiedenen chemischen und enzymatischen Angriffen in vivo schützen, in der Lage sein, vorzugsweise das gesuchte zelluläre Ziel zu erreichen, in die Zelle zum Beispiel durch Endocytose eindringen, die DNA vor sehr einschränkenden Zuständen, die im Endosom vorliegen, schützen, das therapeutische Gen bis zum Kern zuführen und es freisetzen, indem er ihm erlaubt, sich zu exprimieren oder, noch besser, sich in das Genom der Zelle zu integrieren.
Viren sind Vektoren von DNA (oder von RNA für die Retroviren), welche perfekt auf den Großteil dieser Einschränkungen reagieren. Sie wurden eingehend als Gen-Vektoren für die Gen-Therapie untersucht und sind Gegenstand von zahlreichen klinischen Tests. Sie weisen dennoch einen wesentlichen Nachteil auf. Abgesehen von den Schwierigkeiten ihrer Manipulation und Herstellung in großem Umfang, stehen sie im Verdacht, daß sie virulent werden und neue unkontrollierbare Pathologien entwickeln können.
Umfangreiche Forschungsarbeiten widmen sich der Entwicklung von synthetischen Vektoren, welche natürlich keinerlei Virulenzrisiko aufweisen. In dieser Hinsicht wurden Liposome sorgfältig untersucht, wobei diese jedoch an ihren intrinsischen Mängeln leiden: sehr geringe Stabilität, große Schwierigkeiten bei der Herstellung, sehr geringe Einkapselungsfähigkeit und sehr geringe, sogar nicht vorhandene Fähigkeit, das Gen zu transfizieren. Eine neue Klasse von Liposomen, die ausgehend von kationischen Lipiden hergestellt werden, wurde entwickelt, und diese Klasse beseitigt teilweise die Mängel der Liposome: bessere Stabilität, einfache Herstellung und signifikanter Transfektionsgrad, der jedoch im Vergleich zu den Viren sehr schwach ist. Dabei sind diese Verbindungen zwischen kationischen Lipiden und Nukleotiden keine Liposome im eigentlichen Sinne, sondern vielmehr Komplexe zwischen dem negativ geladenen Nukleotid und dem positiv geladenen Lipid (M. Schmutz et al, PNAS 96, p. 12293 (1999)).
Die internationale Patentanmeldung WO 98/02144 lehrt, daß es möglich ist, ein Nukleotid in multilamellare Vesikel mit Zwiebelstruktur zu integrieren, es zu schützen und zu transportieren und so seine intrazelluläre Transfektion zu ermöglichen.
Vor kurzem hat die Patentschrift FR 2 766 706 eingerollte multilamellare Vesikel auf der Basis von Gemischen aus anionischen und kationischen Lipiden und deren Anwendung für die Transfektion von Nukleotiden beschrieben.
Vektoren zur Verabreichung von Makromolekülen in Form von Liposomen oder von Vesikeln sind auch aus WO 9707784, WO 9509610 und WO9823260 bekannt.
Die Verwendung von Liposomen für die Vektorisierung von DNA oder Genen scheitert unter anderem daran, daß es unmöglich ist, eine ausreichende Menge von Nukleotiden in das Liposom einzuführen. Bei klassischen Liposomen sowie multilamellaren Liposomen oder Vesikeln mit Zwiebelstruktur, deren Größe in Mikrometer-Größenordnung liegt, ist es leicht verständlich, daß das DNA-Molekül Schwierigkeiten haben wird, aufgenommen zu werden, da seine Größe in derselben Größenordnung liegt. Es besteht somit ein Bedarf daran, das Molekül zu verdichten, damit es eine eingeklappte Konformation annimmt, die ihm eine scheinbare Größe verleiht, die mit der Einkapselung in lipide Vesikel verträglich ist.
Da die DNA negativ geladen ist, wird dieses Verdichten in der Natur durch Verwendung von Histonen, kationischen Proteinen durchgeführt, welche die DNA komplexieren und zu Partikeln mit sehr geringer Größe (kleiner als 100 nm) führen. In künstlicher Weise wurden solche Moleküle sowie andere kationische Moleküle verwendet, um DNA zu verdichten, um ihr zu erlauben, in lipide Vesikel vom Typ der Liposome oder in multilamellare Vesikel aufgenommen zu werden.
Die Arbeiten in Bezug auf die Einkapselung von DNA durch Liposome auf der Basis von neutralen Lipiden wurden aufgrund ihres geringen Einkapselungsvermögens (< 5 %) vollständig aufgegeben. Die aktuellen Arbeiten beschäftigen sich mit der Verwendung von kationischen Molekülen, entweder Tensiden oder Polymeren, um Komplexe mit der DNA zu bilden, die geeignet sind, dieses Molekül zu schützen und seine Transfektion zu ermöglichen, wobei gleichzeitig die Verdichtung des DNA-Moleküls und seine Vektorisierung erfolgen. Die so erhaltenen Partikel werden oft als kationische Liposome bezeichnet, obwohl ihre Art der Herstellung und Bildung sich ziemlich von den klassischen Liposomen unterscheidet.
Jüngste Arbeiten (vgl. beispielsweise I Koltover, et al, Science 281, p78 1998; J.O. Räder, et al, Science, 275 S. 810 1997; T. Salditt et al. Physical Review Letters, 79 S. 2582 1997) haben gezeigt, daß in diesen Komplexen die DNA Phasen mit Flüssigkristallsymmetrie bildete, welche mit der Flüssigkristallphase interkalieren, die durch kationische Tenside gebildet wird.
Mehrere Symmetrien wurden identifiziert, und Experimente mit der Brechung von Röntgenstrahlung (Synchrotron) zeigen deutlich die Übereinanderlagerung der Brechungsdiagramme von jedem der Tensid- und DNA-Systeme. Mehrere kationische Lipide wurden verwendet, was zu unterschiedlichen Symmetrien der Flüssigkristallphase der Lipide führte. Die genannten Arbeiten haben die Bedeutung aufgezeigt, die der Rolle der Ladung der Lipide zukommt, sowie die Bedeutung der Gesamtladung des Komplexes, die je nach Verhältnis zwischen kationischen Lipiden und negativer DNA positiv oder negativ sein kann. Ferner wird vorgeschlagen, daß diese interkalierten Strukturen aus Flüssigkristallphasen eine wichtige Rolle bei den in der Transfektion erhaltenen Ergebnissen spielen.
Die Amphiphile, die allgemein als Tenside bezeichnet werden, weisen die Fähigkeit auf – wenn sie in ein Lösemittel, beispielsweise Wasser, eingeführt werden – sich selbst zu verbinden, um strukturierte oder organisierte Phasen zu bilden. Unter diesen Phasen stechen insbesondere die Flüssigkristallphasen hervor, die thermodynamisch stabil sind und eine teilweise kristallographische Ordnung (in eine oder zwei Raumrichtungen) aufweisen, wie die lamellaren (oder smektischen) Phasen, die eine unidimensionale Ordnung aufweisen, oder die hexagonalen Phasen, die eine bidimensionale Ordnung aufweisen. Es existieren auch Phasen, die eine kristalline Ordnung wie die kubische Phase aufweisen. Diese Phasen werden oft als Lyotrope bezeichnet, weil ihre Erscheinung und ihre Stabilität von der Konzentration des Amphiphils im Lösemittel abhängen. Sie können auch thermotrop sein, wenn ihr Existenzbereich temperaturabhängig ist. Eine Beschreibung dieser Phasen kann auch in C.L. Khetrapol et al, Nuclear magnetic resonance studies in lyotropic liquid-crystals, 1975, gefunden werden. In der Folge werden wir den Begriff strukturierte Phase verwenden, um in allgemeiner Weise diese Phasen zu beschreiben, außer in den Fällen, in denen die Symmetrie der Phase ausdrücklich angegeben ist.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben nun entdeckt, daß es möglich war, Strukturen von interkalierten DNA- und Tensid-Flüssigkristallphasen zu erhalten, ohne kationische Lipide verwenden zu müssen. Im Gegensatz zu den Angaben in der Fachliteratur und in völlig überraschender Weise, kann das Gemisch einer Flüssigkristallphase aus neutralem Tensid, beispielsweise zwitterionisch, zum Beispiel einer lamellaren Phase, mit DNA unter bestimmten Bedingungen zur Bildung einer gemischten Phase führen, in welcher die Tenside gestapelte Lamellenschichten gemäß einer smektischen Symmetrie bilden, in deren Innerem die DNA-Moleküle interkaliert sind, die wiederum selbst gemäß einer Flüssigkristallsymmetrie nematischer Art angeordnet sind. Darüber hinaus – wobei dies noch überraschender ist – werden diese Ergebnisse ausschließlich erzielt, wenn man eine große Menge an DNA in die lamellare Phase einführt, wo es doch schon schwierig ist, mit guter Leistung eine geringe Menge an DNA in die lamellare Phase einzuführen.
Bei der Fortführung ihrer Forschungsarbeiten gelang es den Erfindern der vorliegenden Erfindung, festzuhalten, daß es ebenfalls möglich war, unterschiedliche biologische Makromoleküle, insbesondere nukleotide Makromoleküle, Proteine oder Polysaccharide in strukturierte Phasen einzuführen und dies ohne elektrostatische Wechselwirkung zwischen den Makromolekülen und den Bestandteilen der strukturierten Phase, immer vorausgesetzt, daß eine ausreichende Menge dieser Makromoleküle in das Innere dieser strukturierten Phase eingeführt wird.
Unter den nukleotiden Makromolekülen, die aus einer Nukleotidverkettung gebildet und oft unter dem allgemeinen Begriff „Nukleotide" zusammengefaßt werden, unterscheidet man gemäß der vorliegenden Erfindung Oligonukleotide, welche im Allgemeinen 10 bis 30 und maximal 100 Basen-Nukleotidgruppierungen umfassen, und Polynukleotide, welche eine größere Anzahl an Basen-Nukleotidgruppierungen umfassen, im Allgemeinen mehr als 100 Basenpaare und oft mehr als 1000. Selbst wenn die Erfindung nicht den Fall von Oligonukleotiden ausschließt, wie zuvor definiert, findet sie insbesondere bei Makromolekülen vom Typ der Polynukleotide, wie oben definiert, und insbesondere bei DNA Anwendung.
Somit konnten die Erfinder die Ergebnisse in Bezug auf das Einführen der DNA in konzentrierter Phase in eine strukturierte Phase auf andere biologische Polymere ausweiten.
Somit hat die Erfindung die Aufnahme von Makromolekülen in eine strukturierte Phase ermöglicht, die durch Tensidmembrane gebildet wird, selbst wenn diese Makromoleküle eine charakteristische Größe aufweisen, die größer als der Raum zwischen den amphiphilen Lamellen dieser Tensid-Phase ist. Das Makromolekül wird in konzentrierter Form in die neue Struktur der Erfindung eingeführt und ist somit in starker Konzentration in dem gebildeten Endsystem vorhanden.
Somit führt die Erfindung zu einem strukturierten Gemisch, im Folgenden als strukturierte Mischphase bezeichnet, die gebildet wird, indem Makromoleküle, deren charakteristische Größe über der Größe der Flüssigkristallphase liegt und deren Masseverhältnis gegenüber den Amphiphilen größer als 5 % ist, in eine Flüssigkristallphase von Amphiphilen aufgenommen werden, ohne daß es zwischen den Makromolekülen und den Amphiphilen zu einer elektrostatischen Wechselwirkung kommt.
Es ist immer möglich, eine charakteristische Größe des Makromoleküls zu definieren, wobei dies jedoch von der Natur dieses Makromoleküls abhängt. Allgemein läßt sich hier der Drehradius nennen, der zum Beispiel ausgehend von Experimenten mit der statischen Diffusion von Licht gemessen wird. Genauer gesagt wird im Fall der Proteine der Drehradius des nicht-denaturierten Proteins genommen, da die Denaturation im Allgemeinen eine Variation dieses Radius mit sich bringt. Im Fall von DNA handelt es sich um die Länge des nicht-kondensierten Moleküls, und diese wird einfach ausgehend von der charakteristischen Länge eines Basenpaars (3,4A) erhalten, indem eine Multiplikation mit der Anzahl der Basenpaare erfolgt.
Man kann auch immer eine charakteristische Länge für die Flüssigkristallphase definieren. Allgemein handelt es sich dabei um die Größe des ein- oder zweidimensionalen Kristallgitters. Diese ist mit dem Wellenvektor der Brechungsspitzen der Röntgenstrahlen verwandt. Genauer und beispielhaft dargelegt, handelt es sich im Fall der lamellaren Phase um die Periodizität der Stapelung der Lamellen, im Fall der hexagonalen Phase um den Abstand zwischen Tensid-Tubes.
Das Hauptinteresse der Erfindung liegt in der Bereitstellung eines Mittels zur Ausbildung von konzentrierten Strukturen in biologischen Makromolekülen, ohne – wie dies auf dem Fachgebiet bekannt ist – auf eine Aufnahme zurückzugreifen, bei der die treibende Kraft von elektrostatischer Natur ist. Die Erfindung ermöglicht es somit, sich der elektrischen Ladungen zu entledigen, die im Stand der Technik die biologische Aktivität des gebildeten Komplexes stören, wodurch zum Beispiel die Haftung dieser Komplexe an den Zellwänden und ihr Einfangen durch plasmatische Proteine hervorgerufen wird.
Darüber hinaus ermöglicht die Erfindung – wie aus der folgenden Beschreibung hervorgehen wird – ausgehend von diesen gemischten Strukturen auch die Herstellung von multilamellaren Vesikeln, welche die Makromoleküle mit Einkapselungsgraden aufnehmen, die sowohl hoch als auch kontrollierbar sind.
Somit betrifft eine der wesentlichen Eigenschaften der vorliegenden Erfindung eine strukturierte Mischphase, die durch die Aufnahme eines biologischen Makromoleküls in eine Flüssigkristallphase auf der Basis von amphiphilen Verbindungen gebildet wird, in der das biologische Makromolekül in der strukturierten Mischphase zu einem Gehalt von mindestens 5 Gew.% bezogen auf die amphiphilen Verbindungen vorhanden ist, und wobei mindestens eine der zwei Einheiten, die durch das biologische Makromolekül einerseits und die Gesamtheit der amphiphilen Verbindungen andererseits gebildet ist, einen nicht geladenen Charakter aufweist.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist die Flüssigkristallphase aus Amphiphilen eine lamellare Flüssigkristallphase.
Die strukturierten Mischphasen der vorliegenden Erfindung sind Gemische, in denen das Makromolekül in einer Fernordnungs-Form in einer Flüssigkristallphase aus Amphiphilen, die wiederum selbst ferngeordnet ist, interkaliert wird.
Unter Flüssigkristallphase ist eine Flüssigkristallphase zu verstehen, die durch das Mischen von Amphiphilen erhalten wird. Eine solche Phase kann allgemein einerseits durch ihre Zusammensetzung und andererseits eine charakteristische Abmessung, zum Beispiel ihren smektischen Schritt, welcher der Abstand zwischen den Lamellen der Phase im Fall der lamellaren Phase ist, gekennzeichnet sein.
Unter nicht geladenem Amphiphil ist ein Molekül zu verstehen, das einen amphiphilen Charakter aufweist, dessen Gesamtladung jedoch neutral ist. Dies umfaßt nicht-ionische Moleküle, aber auch amphotere Moleküle, in denen die positiven und negativen Ladungen einander im Inneren derselben chemischen Struktur kompensieren und nicht aufgrund eines beweglichen Gegenions.
Wie zuvor dargelegt, ist es in der Tat völlig überraschend, daß es gelungen ist, in das Innere einer solchen Phase biologische Makromoleküle, welche charakteristische Abmessungen aufweisen, die deutlich über jenen der Flüssigkristallphase liegen, aufzunehmen und dies ohne auf elektrostatische Wechselwirkungen zurückzugreifen.
In der Tat hat die Erfindung das Einführen bedeutender Mengen von DNA oder allgemeiner von nukleotiden Makromolekülen oder biologischen Makromolekülen in Flüssigkristallphasen auf der Basis von nicht geladenen Tensiden ermöglicht, das heißt unter Bedingungen, unter denen – im Gegensatz zu dem, was im Stand der Technik gemacht wurde – es keine Wechselwirkung elektrostatischer Art zwischen den Tensiden und den Makromolekülen gibt.
Es war auch möglich, im Rahmen der Erfindung nicht geladene Makromoleküle in Flüssigkristallphasen auf der Basis von Tensiden aufzunehmen, auch in diesem Fall ohne daß es zu einer elektrostatischen Wechselwirkung gekommen wäre, die eine solche Einführung erklären hätten können – und dies wobei die Makromoleküle deutlich „stärker" sind als der Abstand zwischen den Lamellen der Flüssigkristallphase – und ohne merkliche Verformung der Phase.
Die biologischen Makromoleküle, die durch die vorliegende Erfindung in Betracht gezogen werden, sind im Wesentlichen, wie zuvor dargelegt, Verkettungen von Nukleotiden und insbesondere Verkettungen vom Typ „Polynukleotide", so wie zuvor definiert, in Bezug auf Proteine, Polysaccharide.
Polynukleotide sind Makromoleküle, die durch die Abfolge von Basen gebildet werden, die den genetischen Code bilden. Es wird in erster Linie zwischen DNA und RNA unterschieden. Dabei handelt es sich um sehr große Makromoleküle, deren Länge 10 μm erreichen kann. Aufgrund ihrer chemischen Struktur tragen die Polynukleotide immer negative Ladungen, die durch Katione ausgeglichen werden.
Proteine sind Makromoleküle, die durch Zusammenfügen von Aminosäuren gebildet werden. Ihre Molarmasse kann bis zu mehr als 200.000 Da erreichen, wobei der Drehradius mehrere hundert Angström erreichen kann. Die Proteine können kationisch, neutral oder anionisch sein, je nach Natur und Anteil der unterschiedlichen Aminosäuren, aus denen sich ein Protein zusammensetzt, aber auch in Abhängigkeit vom pH-Wert, wobei sich die Säure- und Aminofunktionen in Abhängigkeit vom pH-Wert protonieren und deprotonieren. Dennoch ist die Mehrheit der Proteine unter normalen pH-Bedingungen (nahe bei neutral), anionisch.
Polysaccharide werden aus Saccharidketten gebildet, die von einigen Zuckereinheiten bis zu mehreren Millionen reichen. Die Größen können daher extrem unterschiedlich sein und beinahe makroskopische Abmessungen erreichen. Je nach Natur der chemischen Funktionen, welche die Saccharidzyklen ersetzen, und in Abhängigkeit vom pH-Wert können Polysaccharide unterschiedliche elektrische Ladungen aufweisen.
Selbst wenn die Erfindung insbesondere biologische Makromoleküle betrifft, deren Drehradius deutlich größer als der Abstand zwischen den amphiphilen Lamellen und der Flüssigkristallphase ist, ist sie keinesfalls auf solche Makromoleküle beschränkt.
Jedes Tensid, das in einem Gemisch mit Wasser zum Beispiel, geeignet ist, eine Flüssigkristallphase zu bilden, kann in der Erfindung verwendet werden. In den bevorzugten biologischen Anwendungen wird darauf geachtet, Amphiphile zu verwenden, die mit der Anwendung verträglich sind, und insbesondere schwach toxisch sind und gut toleriert werden, insbesondere auf Zellebene. Die Erfindung ist nicht an ein bestimmtes Tensid oder eine bestimmte Tensidfamilie gebunden, sondern an eine Eigenschaft, die organisierten Phasen von Tensiden intrinsisch ist. Die verwendbaren Amphiphile werden vorteilhafter Weise aus der Gruppe ausgewählt, die besteht aus:

– Glycerolipiden, insbesondere phospholipidischen Glycerolipiden, hydriert oder nicht hydriert,
– Fettsäuren von C₆ bis C₃₀, gesättigt oder einfach oder mehrfach ungesättigt, linear oder verzweigt, ethoxyliert oder nicht ethoxyliert, in Form einer Säure oder eines Salzes eines Alkalimetalls, Erdalkalimetalls oder eines Amins,
– ethoxylierten oder nicht ethoxylierten Estern von Saccharose, Sorbitol, Mannitol, Glycerin, Polyglycerin, das 2 bis 20 Einheiten Glycerin enthält, oder Glykol mit diesen Fettsäuren,
– Mono-, Di- oder Triglyceriden oder Gemischen von Glyceriden dieser Fettsäuren,
– Fettalkoholen von C₆ bis C₃₀, gesättigt oder einfach oder mehrfach ungesättigt, linear oder verzweigt, ethoxyliert oder nicht ethoxyliert,
– Cholesterin und dessen Derivaten, insbesondere geladenen oder neutralen Cholesterinestern, wie etwa Cholesterinsulfat,
– weiteren Derivaten mit Sterolskelett, insbesondere von pflanzlicher Herkunft, wie etwa Sitosterol oder Stigmasterol,
– ethoxylierten oder nicht ethoxylierten Ethern von Saccharose, Sorbitol, Mannitol, Glycerin, Polyglycerin, das 2 bis 20 Einheiten Glycerin enthält, oder Glykol mit diesen Fettalkoholen,
– pflanzlichen Ölen, polyethoxyliert, hydriert oder nicht hydriert,
– Blockpolymeren aus Polyoxyethylen und Polyoxypropylen (Poloxamere),
– Polyethylenglykolhydroxystearat,
– Sphingolipiden und Sphingosinderivaten,
– Polyalkylglucosiden,
- Ceramiden,
– Copolymeren von Polyethylenglykol und Alkylglykol, zum Beispiel Copolymeren der Familie der ELFACOS von AKZO NOBEL,
– Di- oder Triblock-Copolymeren aus Ethern von Polyethylenglykol und Polyalkyenglykol, zum Beispiel Copolymeren der Familie der ARLACELL von ICI

Diese Amphiphile oder Tenside können alleine oder im Gemisch verwendet werden. Von diesen Amphiphilen können bestimmte selbst eine zum Beispiel lamellare Flüssigkristallphase durch Mischen mit einem polaren Lösemittel bilden. Andere werden ausschließlich in einem Gemisch, in geringerem Anteil, verwendet, um der Flüssigkristallphase die Eigenschaften der Steifheit oder Elastizität zu verleihen.
Der Fachmann wird in der Lage sein, die geeignetsten Moleküle zur Bildung einer Flüssigkristallphase aus diesen Molekülen auszuwählen und die Bildung der Flüssigkristallphase durch optische Mikroskopie zu kontrollieren. Es gilt anzumerken, daß der Großteil der oben genannten Tenside nicht geladen ist und somit nicht geeignet ist, durch eine elektrostatische Wechselwirkung in die Kondensation des Makromoleküls einzugreifen, das in die Flüssigkristallphase eingefügt werden soll. Solche nicht geladenen Tenside sind somit an das Aufnehmen von geladenen Makromolekülen, wie DNA, angepaßt. In der oben angeführten Liste sind bestimmte Tenside enthalten, die eine Ladung aufweisen, dies ist insbesondere bei den Salzen der Fettsäuren oder bestimmten Phospholipiden oder Sphingosinderivaten der Fall, die für die Aufnahme von nicht geladenen Makromolekülen in die Mischphasen der Erfindung verwendet werden können.
Wie zuvor dargelegt, besteht eine der wesentlichen Eigenschaften der Erfindung darin, daß sie es ermöglicht, konzentrierte Strukturen aus Makromolekülen herzustellen, ohne auf elektrostatische Kräfte zurückzugreifen. Somit werden – wenn das Makromolekül einen ionischen Charakter aufweist – gemäß der Erfindung nicht geladene amphiphile Mittel verwendet. Dennoch ist es gemäß der Erfindung auch möglich, in die Zusammensetzungen der Erfindung relativ geringe Mengen von Produkten mit ionischem Charakter einzuführen, um der Mischstruktur der Erfindung oder den Vesikeln, die durch Dispersion dieser Mischstruktur erhalten werden (wie aus folgender Beschreibung hervorgehen wird), besondere Eigenschaften zu verleihen. In diesem Fall wird das Haupttensid, das keinerlei Ionizität aufweisen muß, von dem eventuell ionischen Zusatzstoff unterschieden, der hinzugefügt wird, um die Eigenschaften, zum Beispiel die Eigenschaften der Haftung an den Zellwänden, der gebildeten Struktur zu ändern. Diese Unterscheidung ist leicht durchzuführen, weil die Originalstruktur der Erfindung, die durch die Aufnahme einer großen Menge an biologischen Markomolekülen in das Innere einer Flüssigkristallphase erhalten wird, ohne einen Zusatzstoff, aber natürlich nicht ohne das Haupttensid erhalten werden kann.
Es ist somit wichtig, festzuhalten, daß es mehr noch als der Aspekt der relativen Menge zwischen dem Haupttensid und dem Zusatzstoff, die jeweilige Rolle der beiden ist, durch welche sie sich unterscheiden. Der Zusatzstoff, der selbst ein Tensid oder zum Beispiel ein Polymer sein kann, kann ionisch sein. In diesem Fall kann er in der Struktur enthalten, aufgepfropft oder an der Oberfläche adsorbiert sein. Der Zusatzstoff kann somit zum Beispiel eine Oberflächenhaftungseigenschaft verleihen, die interessant ist, um das Einfangen des Gemisches, welches das Makromolekül enthält, durch eine Zelle zu begünstigen.
Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung dieser neuen Strukturen ist jenem der multilamellaren Vesikel von Tensiden sehr ähnlich.
Allgemein umfaßt dieses Verfahren folgende Schritte:

– Herstellung eines homogenen Gemischs, welches die amphiphiten Verbindungen und das Makromolekül enthält, wobei das Makromolekül zu mindestens 5 % Gewichtsanteilen bezogen auf die amphiphiten Verbindungen vorliegt,
– Aufnahme einer angemessenen Menge von wäßrigem oder polarem Medium zur Bildung einer Flüssigkristallphase mit den amphiphiten Verbindungen.

Die angemessene Menge von wässerigem Medium kann durch optische oder polare Mikroskopie kontrolliert werden, wodurch es möglich wird, die Bildung der Flüssigkristallphase aufzuzeigen.
Der oben angeführte Wert von 5 % ist ein Mindestwert, um die strukturierte Mischphase der Erfindung zu erhalten. Der Fachmann wird leicht verstehen, daß die optimalen Werte dieses Verhältnisses mit der Natur des Makromoleküls und seinen Abmessungen sowie mit der Natur der verwendeten amphiphilen Mittel variieren. Allgemein hat man festgestellt, daß die Aufnahme des Makromoleküls in die Flüssigkristallphase um so besser erfolgte, je größer die Menge war, in der das Makromolekül zugeführt wurde. Die Grenzwerte, auf die man stoßen kann, haben vielmehr mit praktischen Erwägungen zu tun, insbesondere die maximalen Makromolekülkonzentrationen, die zu Lösungen oder Dispersionen führen, die für eine Manipulation zu flüssig sind, und nicht so sehr mit theoretischen Erwägungen. Man kann sich dennoch leicht vorstellen, daß ein Verhältnis von 1/1 zwischen dem Tensid und dem Makromolekül ein vernünftiger, wenngleich nicht absoluter, Grenzwert ist.
Somit ist im Fall der Herstellung einer strukturierten Mischphase gemäß der Erfindung, welche ein Makromolekül enthält, das aus einer Verkettung von Nukleotidgruppierungen, insbesondere DNA, besteht, das bevorzugte Herstellungsverfahren jenem für multilamellare Vesikel von Tensiden sehr ähnlich. Es besteht darin, eine lamellare Phase ausgehend von einem Tensid oder einem Gemisch aus Tensiden und einer wässerigen Phase herzustellen. Die wässerige Phase enthält mindestens einen ziemlich konzentrierten gelösten Stoff eines solchen Makromoleküls, insbesondere eines DNA- oder RNA-Moleküls.
Das Masseverhältnis ρ zwischen Amphiphilen und Nukleotidmakromolekülen liegt zwischen 20 und 1, vorzugsweise zwischen 5 und 1 (was bedeutet, daß man für 1 g Tensid 0,2 g bis 1 g nukleotides Makromolekül hat).
Das Gemisch zur Herstellung der lamellaren Phase kann in einem einzigen Schritt geschaffen werden, wobei alle Bestandteile getrennt gewogen und gemeinsam hinzugefügt werden. In diesem Fall kann wahlweise, um die Homogenität des Gemisches zu begünstigen, auf einen oder mehrere Gefrier-/Auftauzyklen und/oder einen oder mehrere Gefriertrocknungs- und Rehydrierungszyklen zurückgegriffen werden.
Wenn bestimmte Bestandteile des Gemischs schwer aufzulösen sind (zum Beispiel Cholesterin), kann eventuell auch ein Lösemittel, zum Beispiel ein Alkohol oder ein chlorhaltiges Lösemittel, oder ein Gemisch dieser Lösemittel verwendet werden, um diese Bestandteile aufzulösen und nach dem Verdampfen ein homogenes Gemisch dieser Bestandteile zu erhalten, das durch Hydrierung die – vorzugsweise lamellare – Flüssigkristallphase ergibt.
Das exakte Herstellungsverfahren ist für den Erfolg der Aufnahme nicht kritisch, vorausgesetzt, die – vorzugsweise lamellare – Flüssigkristallphase ist konzentriert und es gibt keinen Überschuß an Lösemittel (wässerige Phase), wobei bestimmte klassische Verfahren, die verwendet werden, um den Einkapselungsgrad eines Produktes in die Liposome oder andere multilamellare Vesikel von Phospholipiden oder anderen nicht geladenen Amphiphilen, zu erhöhen, sehr gut eingesetzt werden können. Dennoch ist darauf zu achten, daß jeglicher Überschuß an Wasser oder wässerigem oder polarem Lösemittel vermieden wird, der direkt zur Bildung von Vesikeln des klassischen Liposomen-Typs führen könnte. Die Menge an Wasser oder wässerigem Medium oder polarem Lösemittel muß in der Tat, wie zuvor angemerkt, der Menge entsprechen, die angemessen ist, um eine Flüssigkristallphase zu bilden, insbesondere eine lamellare Flüssigkristallphase.
Die von den Erfindern der vorliegenden Erfindung durchgeführten Tests haben es ermöglicht, die neuen gebildeten Strukturen deutlich zu charakterisieren, und dies unter Stützung auf Ergebnisse, die bei der Röntgenstrahlenbrechung der Phasen erhalten wurden, die durch ein Gemisch aus Tensiden und Makromolekülen mit unterschiedlichen Konzentrationen erhalten wurden, wobei so das Phasendiagramm des Systems Wasser/Tensid/Makromolekül gezeichnet und die Analyse der elektronischen Dichte durchgeführt werden konnte, die von den Intensitäten der Brechungsspitzen abgeleitet wird.
Die verschiedenen Ergebnisse, die erhalten wurden und aus der Beschreibung und den folgenden Beispielen hervorgehen, werden auch unter Bezugnahme auf 1 bis 5 angeführt, die der Beschreibung beiliegen. Es zeigen:
1A bis 1D: Die Intensität der Röntgenstrahlenbrechung (Synchrotron) der lamellaren Phasen mit 50 % Wasser in Abhängigkeit vom Wellenvektor q (q = 4π sinθ/λ) für verschiedene Massenverhältnisse Lipid/DNA₇p.
1A: ρ = ∞ (Abwesenheit von DNA)
1B: ρ = 80
1C: ρ = 20 und
1D: ρ = 2. In 1D wird die Korrelationsspitze zwischen DNA-Strängen durch einen Pfeil im Einschub angezeigt.
2A: das Profil der elektronischen Dichte entlang der Stapelungsachse der Lipidschichten für die lamellare Phase zu ρ = 2 und 47,4 % H₂O (durchgehende Linie). Zum Vergleich ist das Profil der elektronischen Dichte einer lamellaren Phase in Abwesenheit von DNA ebenfalls dargestellt (punktiert).
2B: eine schematische Darstellung der lamellaren Phase, die organisierte DNA (L^c _a) enthält; der lange horizontale Pfeil zeigt den Abstand der Wiederholung der lamellaren Phase an (ungefähr 80 Å), der kurze vertikale Pfeil den Abstand zwischen DNA-Strängen (30 bis 40A).
3: Einkapselungsgrad (gemessen als die Menge an DNA, die im Inneren eingekapselt ist, bezogen auf die Gesamtmenge der DNA, die in der Formulierung aufgenommen ist) der Vesikel, die ausgehend von einer Phase (L^c _a) mit ρ = 2 erhalten werden, in Abhängigkeit von der Osmolarität (ausgedrückt in Milliosmomol) des Dispersionsmediums.
4: das Profil der Synchrotron-Brechung der Röntgenstrahlen der Vesikel, die ausgehend von der Phase (L^c _a) mit ρ = 2 und 50 % H₂O erhalten werden, die in einem Medium mit 603 (durchgehende Linie) und 1457 (punktiert) mOsm dispergiert sind. Die Pfeile im Einschub zeigten die Korrelationsspitzen zwischen DNA-Strängen auf.
5: das Massenverhältnis Lipid/eingekapselte DNA, ρ*, der Vesikel, enthaltend DNA mit –150 pb (dunkelgrau) oder ein Plasmid mit 5581 pb (hellgrau), bestimmt nach Verdünnung der Vesikel in einem PBS-Puffer mit 300 mOsm in Abhängigkeit vom Masseverhältnis Lipid/DNA, ρ, der lamellaren Phase.
Nachfolgend werden die beobachteten Resultate im Fall von DNA wiedergegeben. Dieses Molekül wurde aus zwei Gründen gewählt. Erstens, weil es praktisch unmöglich ist, in nicht kationische Mikrovesikel nützliche DNA-Mengen einzukapseln. Zweitens, weil von einem demonstrativen Standpunkt aus betrachtet, die DNA aufgrund ihrer sehr großen Länge und besonderen Struktur sicherlich die größte Herausforderung darstellt. Der Fachmann wird verstehen, daß – wenngleich durch dieses Verfahren große Mengen von besonders sperrigen DNA-Molekülen eingekapselt werden können, eine Generalisierung auf andere Makromoleküle wie Proteine oder Polysaccharide, deren Verhalten allgemeiner ist, keine größeren Schwierigkeiten bereitet.
Der wichtigste experimentelle Nachweis für die Aufnahme des nukleotiden Makromoleküls in die lamellare Phase wird durch Röntgenstrahlbrechung erbracht. In der Tat wird die lamellare Phase, wie jede Flüssigkristallphase, die eine Wiederholungsperiode entlang der Stapelungsachse aufweist, ein Röntgenstrahlbrechungssignal abgeben, das als Bragg-Spitze bezeichnet wird. Die Position dieser Brechungsspitze (ausgedrückt als Brechungswinkel oder Wellenvektor q) hängt direkt vom Wiederholungsabstand ab. Zudem sind die Intensitäten der Spitzen mit dem Profil der elektronischen Dichte des Wiederholungsmotivs verbunden.
Die Beobachtungen bei der Röntgenstrahlenbrechung wurden für verschiedene Werte des Massenverhältnisses Lipide/DNA, ρ, und Wasserkonzentrationen der Proben durchgeführt. Vier Brechungsgraphen mit konstanter Hydrierung (50 % Wasser) werden angeführt (siehe 1A bis 1D), in Abwesenheit von DNA, für ρ = 80 (geringe DNA-Ladung), ρ = 20 (mittlere DNA-Ladung) und für ρ = 2 (starke DNA-Ladung).
Für das System in Abwesenheit von DNA und im Fall von geringen DNA-Mengen werden Bragg-Spitzen beobachtet, die für eine lamellare Phase (siehe 1A und 1B) charakteristisch sind. Der Wiederholungsabstand mit ρ = 80 (≅ 59 Å) ist bezogen auf das System in Abwesenheit von DNA (≅ 63 Å) leicht verringert, wahrscheinlich aufgrund einer teilweisen Dehydrierung der lamellaren Phase aufgrund der Gegenwart von nicht aufgenommener DNA.
Bei ρ = 20 wird eine Koexistenz von zwei Brechungssystemen beobachtet, was die Koexistenz von zwei lamellaren Phasen (siehe 1C) belegt, wobei eine davon keine DNA und einen geringeren Wiederholungsabstand (≅ 53 Å) aufweist als die lamellare Phase in Abwesenheit von DNA, während die andere, die mit DNA angereichert ist, eine sehr starke Zunahme des Wiederholungsabstandes (≅ 129 Å) aufweist.
Bei ρ = 2 wird die Existenz eines einzigen lamellaren Systems mit einem erhöhten Wiederholungsabstand (≅ 77 Å) bezogen auf die lamellare Phase, die keine DNA enthält (siehe 1D ), beobachtet. Ferner wird eine Korrelationsspitze zwischen den DNA-Strängen (≅ 32 Å) beobachtet. Diese Spitze verschiebt sich bei dem Wechsel der Menge an DNA in der lamellaren Phase, ein Beleg dafür, daß die DNA tatsächlich in die lamellare Phase von Lipiden in geordneter Form aufgenommen wird. Ferner ist beobachtet worden, daß in Folge des Varüerens der Wasserkonzentration eines solchen Systems die zwei Wiederholungsabstände, jener der lamellaren Phase und jener des Korrelationsabstandes zwischen den DNA-Molekülen, auf dieselbe Weise variierten. Daraus läßt sich die überraschende Existenz einer hohen DNA-Konzentration (das Phänomen ist für ρ < 6 zu beobachten) eines DNA-Netzes ableiten, das zwischen den Schichten des Lipidnetzes interkaliert ist.
Ein anderer Beleg für die Existenz dieses gemischten Systems von interkalierten Netzen der lamellaren Lipidphase und organisierten DNA-Phase läßt sich aus der Analyse der elektronischen Dichte ausgehend von den Intensitäten der Brechungsspitzen ableiten. Das Profil der elektronischen Dichte einer lamellaren Lipidphase/DNA/Wasser (ρ = 2) entlang der Stapelungsachse der Lipidschichten ist in 2 dargestellt. Zum Vergleich ist auch ein Profil der elektronischen Dichte einer lamellaren Phase in Abwesenheit von DNA in der Figur punktiert dargestellt. Der wesentliche Unterschied zwischen diesen beiden Profilen liegt in der Gegenwart einer Erhöhung mit starker elektronischer Dichte mit ungefähr 40 Å des Zentrums der Lipid-Doppelschicht und einer Breite auf mittlerer Höhe in der Nähe von 10 Å. Dies ist mit der Gegenwart von interkalierten DNA-Molekülen in der wässerigen Phase zwischen den Lipid-Doppelschichten kompatibel. Im Folgenden wird diese lamellare Phase, die organisierte DNA enthält, als (L^c _a) bezeichnet.
Diese Beobachtungen sind jenen ganz ähnlich, die bei kationischen Lipiden gemacht wurden (vgl. I Koltover, et al, Science, 281, p78 1998: J.O. Räder, et al., Science, 275 S. 810, 1997: T. Salditt et al. Physical Review Letters, 79 p, 2582, 199/), wobei dieses Phänomen jedoch völlig unerwartet bei Phasen von nicht geladenen Tensiden beobachtet wird.
Dieses Ergebnis ist überraschend, weil die Erklärungen, die von den Autoren der Arbeiten über die Aufnahme von DNA in lamellare Phasen von kationischen Lipiden gegeben wurden, an die Gegenwart von starken ionischen Wechselwirkungen zwischen den Lipiden und dem Nukleotid gebunden waren. Im Fall der vorliegenden Erfindung existieren solche Wechselwirkungen nicht, so daß die Erklärung, die dem Fachmann bekannt ist, hier nicht gilt. Ohne daß dies ein Beweis wäre, noch eine Erklärung für das beobachtete Phänomen, läßt sich sagen, daß im Fall der Erfindung die thermodynamische Stabilität des Gebildes (Mischnetz aus Lipiden und DNA), das ausschließlich mit starker DNA-Konzentration erhalten wurde, mit dem im Vergleich zu einem weniger konzentrierten System, bei dem dieser entrope Term nicht so wirksam wäre, geringen Entropie-Verlust eines solchen Systems in Zusammenhang stehen könnte, bei dem die zwei Untereinheiten geordnet sind.
Die neuen Strukturen, die im Rahmen der vorliegenden, oben beschriebenen Erfindung dargelegt werden, erweisen sich insbesondere aufgrund der Möglichkeit als interessant, diese neuen Strukturen durch Dispersion in multilamellare Vesikel mit Zwiebelstruktur zu verwandeln, die in ihrem Inneren die Makromoleküle mit bis dato noch nie beobachteten Konzentrationen aufnehmen.
Somit betrifft gemäß eines anderen dieser Aspekte die vorliegende Erfindung Vesikel, die ausgehend von den Mischmedien der Erfindung durch einfache Dispersion dieses Mediums erhalten werden, sowie ein Verfahren, um diese Vesikel herzustellen und insbesondere, um mit dem Einkapselungsgrad der Makromoleküle im Inneren der Vesikel zu spielen.
Die durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung durchgeführten Tests haben es in der Tat ermöglicht, die effektive Gegenwart der Makromoleküle in der lamellaren Phase deutlich zu machen, selbst nach Dispersion dieser in wässerigem Medium, das heißt unter Bedingungen, bei denen die Phase (L^c _a) thermodynamisch instabil ist.
Ferner haben die von den Erfindern der vorliegenden Erfindung durchgeführten Tests es ermöglicht, zu zeigen, wie durch das Spielen mit der ionischen Kraft des Dispersionsmediums ein Spielen mit dem Einkapselungsgrad des Makromoleküls im Inneren der Vesikel ermöglicht wurde.
Nachstehend werden die Ergebnisse angeführt, die mit der DNA erzielt wurden. Wie zuvor angeführt, bereitet die Generalisierung auf andere biologische Makromoleküle keine Schwierigkeiten, da das Verhalten dieser Makromoleküle immer einfacher als jenes der DNA ist. Die Betrachtungen im Hinblick auf den Einfluß der ionischen Kraft auf die Schwankung des Einkapselungsgrades sind direkt auf diese Makromoleküle übertragbar, wobei das Phänomen mehr mit dem osmotischen Druck zu tun hat, der durch diese Unterschiede bei der ionischen Kraft entsteht, und mit ihren Konsequenzen auf die Integrität der Vesikel, als mit dem Einfluß der ionischen Kraft auf die Konformation des Makromoleküls.
Es wurden Experimente durchgeführt, um die effektive Gegenwart von DNA in der lamellaren Phase zu prüfen, selbst nach der Dispersion derselben in wässerigem Medium, das heißt unter Bedingungen, unter denen die Phase (L^c _a) thermodynamisch instabil ist. Es wurde gezeigt, daß es unter Berücksichtigung der sehr starken DNA-Konzentration in der lamellaren Lipidphase, die eine bedeutende Osmolarität mit sich bringt, unerläßlich ist, die lamellare Phase, welche DNA enthält, in einem wässerigen Medium mit ausreichender ionischer Kraft zu dispergieren. Dies wurde durch Verwendung eines wässerigen Puffers als Dispersionsmedium erreicht. Das Ergebnis wird auf der Kurve wiedergegeben, die in 3 dargestellt ist, wo die Einkapselungsleistung (gemessen als DNA-Menge, die im Inneren eingekapselt ist, bezogen auf die Gesamtmenge der DNA, die in der Formulierung aufgenommen ist) in Abhängigkeit von der Osmolarität des Dispersionsmediums aufgetragen ist. Im Folgenden wird als Einheit für die Osmolarität Milliosmomol (mOsm) verwendet, wobei dies die Einheit ist, die auf biologischem Gebiet häufig verwendet wird. Diese Einheit ist mit Pascal durch eine lineare Beziehung verbunden: 100 mOsm = 2,4777 10³ Pa.
Es läßt sich feststellen, daß für eine Osmolarität von mehr als ≅ 500 Milliosmol die Einkapselungsleistung konstant um 70 % herum liegt, wobei anzumerken ist, daß ein guter Einkapselungsgrad von ungefähr 60 % bereits bei 300 mOsm (physiologisches Medium) erreicht wird.
Ferner haben wir ein überraschendes Phänomen belegt. Es ist möglich, die Vesikel der Erfindung mit einer Osmolarität zu dispergieren, die über jener des physiologischen Mediums liegt, um den Einkapselungsgrad von DNA zu optimieren, und sie in der Folge in einem physiologischen Medium ohne Verlust von eingekapselter DNA zu verdünnen. Wir haben zudem gezeigt, daß die DNA, die in den Vesikeln gemäß der Erfindung auf der Basis von neutralen Lipiden eingekapselt ist, in der Tat davor geschützt wird, durch die DNase verschlechtert zu werden und daß die Dispersionen eine sehr gute Stabilität aufweisen (Verringerung des Einkapselungsgrades von ungefähr 70 % auf ungefähr 60 % nach einem Monat).
Allgemeiner gesagt, können die Dispersionen der Vesikel der Erfindung in einem Verfahren erhalten werden, das folgende Schritte aufweist:

– Dispersion in einem Medium von gleicher Osmolarität wie das interne Medium,
– Veränderung der Osmolarität des externen Mediums durch Zugabe von Salz oder Wasser oder durch Dialyse zum Erhalt der gewünschten Osmolarität.

Die Integrität der Phase (L^c _a) nach der Dispersion in Form der Vesikel wurde auch durch Röntgenstrahlenbrechung verifiziert. Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt. Es kann festgehalten werden, daß die Korrelationsspitze zwischen DNA-Strängen noch beobachtbar ist. Der Wiederholungsabstand der Lipid-Doppelschichten und der DNA wird in Abhängigkeit vom osmotischen Druck des dispergierenden Mediums geändert. Dies belegt deutlich, daß die molekulare Anordnung beibehalten wird, selbst zum Zeitpunkt der Dispersion.
In 5 ist für zwei DNA-Typen die Entwicklung des Massenverhältnisses Lipid/DNA dargestellt, eingekapselt in den Vesikeln gemäß der Erfindung, die im physiologischen Medium, ρ*, dispergiert sind, in Abhängigkeit vom Massenverhältnis Lipid/DNA der Phase (L^c _a) vor Dispersion. Die Darstellung der Einkapselungskraft durch ρ* anstatt durch den Prozentsatz des Einkapselungsgrades ist deshalb klüger, da dies direkt der Menge an DNA in dem Vektor entspricht. Für kurze DNA (≈ 150 p.b.) sowie für das Plasmid (5581p.b.) verringert sich ρ* (die Menge von DNA im Vektor steigt) mit der Verringerung von ρ der Phase (L^c _a). Die Einkapselungskraft der Vesikel der Erfindung auf der Basis von neutralem Lipid ist für das große Plasmid geringer als für die kurze DNA, wobei jedoch trotzdem ein ρ*-Wert in der Größenordnung von 6 erzielt wird, also eine Einkapselung von bedeutsamen Plasmidmengen.
Die Anwendungen dieser Technik sind auf dem Gebiet der Vektorisierung von Genen für die Gen-Therapie sehr wichtig. In der Tat ist der Umstand, eine große Menge an nukleotiden Makromolekülen mit einer sehr guten Einkapselungsleistung aufnehmen zu können, eine wichtige Bedingung für den Erfolg solcher Ansätze. Ferner erlaubt der Umstand, daß es nicht notwendig ist, kationische Lipide zu verwenden, die Verwendung solcher Systeme in vivo, wo Katione schnell durch Proteine eingefangen werden und somit ineffizient sind. Ferner weisen die neutralen Lipide eine wesentlich geringere Cytotoxizität als kationische Lipide auf.
Diese Erwägungen in Bezug auf das Einfangen durch zirkulierende Proteine, der Haftung an den Zellwänden und der Cytotoxizität sind offensichtlich unabhängig von der Natur des Makromoleküls, das in dem Vesikel aufgenommen ist.
Beispiele:
Produkt:
Folgende Rohstoffe wurden in den Beispielen verwendet:
Die Kalbsthymus-DNA wurde mit Ultraschall behandelt, um Doppelstrangfragmente mit der Persistenzlänge der DNA zu erhalten. Die Größe dieser Fragmente wurde als nahe bei 150 Basenpaaren (pb) durch Elektrophorese auf Agarose-Gel ermittelt.
In allen Beispielen sind die Prozentsätze als Masseprozentsätze angegeben.
Mischung der amphiphilen Bestandteile:
Die unterschiedlichen lamellaren Phasen wurden wie folgt hergestellt:
Um die Herstellung zu vereinfachen, ist es möglich, zuvor eine Stamm-Mischung aus den unterschiedlichen Tensiden herzustellen, die in der Formulierung verwendet werden. Diese Stamm-Mischung kann direkt entweder bei Umgebungstemperatur hergestellt werden, oder – um die Mischung zu beschleunigen – unter leichtem Erhitzen. Es ist auch möglich, die verschiedenen Tenside in einem Lösemittel (Alkohol und/oder chlorhaltiges Lösemittel zum Beispiel) aufzulösen, um sie in guten Verhältnissen zu vermischen, danach das Lösemittel unter Vakuum zu verdampfen, um die Starnm-Mischung der Tenside zu erhalten. Dieses Verfahren ermöglicht es auch, die Lösung zu filtrieren, um sie erforderlichenfalls zu sterilisieren.
Die Stamm-Mischung kann bei –18 °C für eine weitere Verwendung gelagert werden.
Herstellung von lamellaren Phasen, die DNA enthalten:
Die Menge an DAIA zum Erhalten des gewünschten Masseverhältnisses Lipid/DNA wird zur trockenen und homogenen Mischung der Lipide hinzugefügt. Die Zugabe erfolgt am einfachsten, indem die wässerige DNA-Lösung gemäß der gewünschten Menge hinzugefügt wird. Das System wird gemischt und ruhen gelassen, damit es homogenisieren kann. Die Zeit, die für das Erreichen des Gleichgewichts notwendig ist, hängt von der Hydrierung und dem Gehalt an DNA des Systems (im Durchschnitt einige Tage) ab. Die homogene lamellare Phase kann danach im Dunkeln bei –20 °C über Monate hinweg gelagert werden, ohne daß sie ihre Eigenschaften verliert und ohne daß eine chemische Verschlechterung der Bestandteile eintritt.
Herstellung der Vesikel ausgehend von der Phase L^c _a:
Die Dispersion der lamellaren Phase in einem Puffer mit gewünschter Osmolarität ergibt die Vesikelphase. Ein leichtes Rühren während einiger Stunden, ermöglicht es, die Vesikel einfach zu dispergieren. Die Homogenität der Dispersion wird punktuell durch Phasen-Kontrastmikroskopie kontrolliert.
Wenn man eine kessere Größenhomogenität erreichen möchte, kann man auch ein Scheren der strukturierten Phase zwischen zwei entsprechenden Glasklingen durchführen. Die Kontrollle der Scherung erfolgt durch optische Mikroskopie zwischen gekreuzten Polarisatoren.
Im Fall der Phase (L^c _a), welche das Plasmid enthält, wurde die Integrität des Plasmides nach der Scherung und der Dispersion durch Elektrophorese auf Agarose-Gel überprüft.
Messung des osmotischen Drucks:
Der osmotische Druck im Inneren der Vesikel, welche die DNA enthalten, wurde ausgehend von Messungen des osmotischen Drucks der wässerigen DNA-Lösungen mit 150 pb auf einem klinischen Osmometer vom Typ 13 DR-Autocal gemessen. Der osmotische Druck der wässerigen DNA-Lösung entwickelt sich in nicht linearer Weise mit der DNA-Konzentration, wobei dies ein klassisches Verhalten für Makromoleküle ist. Die Schätzungen zeigen, daß der osmotische Druck der Phase (L^c _a) mit ρ = 2 und 50 % Wasser (in der Masse) in der Größenordnung von 500 Milliosmomol liegt, was einem Salzgehalt von ungefähr 0,28 M entspricht. Der osmotische Druck der unterschiedlichen verwendeten Puffer wurde durch Zugabe von NaCl angepaßt und durch experimentelle Messung überprüft.
Schutz der DNA in den Vesikeln vor einer Einwirkung der DNase:
Vesikel, welche DNA sowie nicht eingekapselte Referenz-DNA enthielten, wurden mit der DNase vom Typ 1 in Gegenwart von Mg²⁺ inkubiert. Die DNase vom Typ 1 ist eine Endonuklease, welche die Verschlechterung der einfachen und doppelten DNA-Stränge katalysiert und Oligonukleotide mit 5'-P-Endungen erzeugt. Sie erfordert, um ausgeführt werden zu können, die Gegenwart von zweiwertigen Kationen. Die Verschlechterung durch die DNase wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten durch die Zugabe von EDTA und DNA gestoppt, die durch Elektrophorese auf Gel analysiert wurde. Selbst lange nach der vollständigen Zerstörung der Referenz-DNA weist die eingekapselte DNA keinerlei Anzeichen einer Verschlechterung auf.
Röntgenstrahlenbrechung:
Für die Brechung der Röntgenstrahlung werden die Proben in Glaskapillaren von 1 mm oder in flache Träger (gekreuzte Dicke 1 mm) transferiert und versiegelt. Die Experimente der Röntgenstrahlenbrechung wurden entweder auf einem Generator mit Drehanode (Cu Kα λ = 1,5405 Å) oder auf einem Synchrotron (λ = 1,0A Beamline ID2, ESRF, Grenoble) mit einem 2D-Detektor und variablen Abständen zwischen der Probe und dem Detektor (500 mm bis 1000 mm) durchgeführt.
Nach der Umgruppierung wurden die exakten Positionen der Spitzen sowie ihre Intensität durch Gauss'sche Parametrierung der Spitzen nach Abzug des Bodens erhalten. In den Fällen, in denen mehrere Spitzen pro Phase erhalten wurden, wurden die Wiederholungsabstände, d, durch eine Parametrierung durch die kleinsten Quadrate der Neigung von (h² + k² + I²)^½ für die Indizes hkl (wobei I und k = 0 für eine lamellare Phase) in Abhängigkeit der gegenseitigen Beabstandungen bestimmt.
Die Intensitäten, die dem Quadrat von Strukturfaktoren entsprechen, wurden für den Lorentz-Faktor korrigiert und einer Blaurock-Normalisierung unterzogen. Die Zeichen der Strukturfaktoren wurden durch das klassische Schwellverfahren erhalten. Die Profile der elektronischen Dichte der Phase (L^c _a) wurden im Anschluß durch umgekehrte Fourier-Transformation der Strukturfaktoren erhalten (vgl. zum Beispiel Franks, N.P. & Levine, W.R. 1981, in Membrane Spectroscopy (Springer Verlag, Heidelberg, 437–487).
Die Experimente mit der Röntgenstrahlenbrechung wurden auf lamellaren Phasen durchgeführt, die zwischen 25 und 70 % (Masseprozent) Wasser enthielten, das heißt im Bereich der konzentrierten Phasen mit ρ zwischen ∞ und 1, und auf Mischungen PC/C12E4 und PC/Monoolein (95:5, in Masse). Die Wahl des Co-Tensids scheint keinerlei Einfluß auf das Diagramm der ternären Phasen des Systems DNA/neutrales Lipid/Wasser zu haben. Im Gegenteil, die Wiederholungsabstände sind etwas höher für die Systeme, die C12E4 enthalten, und die Schwellgrenze ist zu den stärkeren Wasserkonzentrationen hin leicht abgesetzt. Die DNA, die verwendet wird, um das Phasendiagramm zu erstellen, wird zuvor mit Ultraschall und einer Länge von ungefähr 500 Å (≅ 150 pb) behandelt.
In optischer Hinsicht läßt sich ein Wasserüberschuß für die lamellare Phase ab 50 % Wasser beobachten. Im Fall von Proben, die DNA enthalten, liegt der beobachtete Wasserüberschuß zwischen 55 und 60 % in Abhängigkeit vom DNA-Gehalt. Die teilweise Bestimmung des Diagramms von Phasen durch Röntgenstrahlenbrechung ermöglicht es, zudem drei Regime zu unterscheiden: (i) die schwachen DNA-Konzentrationen (p groß), wo die d schwächer sind als bei der lamellaren Phase ohne DNA (siehe 1B); (ii) die mittleren Konzentrationen (p mittel), wo die Koexistenz von zwei lamellaren Phasen im Gleichgewicht (vgl. 1C) beobachtet wird, und (iii) die starken DNA-Konzentrationen (p klein), wo eine einzige lamellare Phase erfaßt wird, die einen d-Wert aufweist, der größer als jener der lamellaren Phase in Abwesenheit von DNA ist (vgl. 1D). Die Verringerung von d um einige Å im Fall eines geringen DNA-Gehalts (i) läßt sich nur erklären, wenn man berücksichtigt, daß mindestens ein Teil der DNA nicht in die lamellare Phase aufgenommen ist und eine teilweise Dehydrierung letzterer herbeiführt. Für die mittleren Werte von ρ (ii) ähnelt die Gegenwart einer Zweiphasenanordnung lamellarlamellar dem, was im Fall von gemischten Systemen Tensid/Polymer/Wasser beobachtet wurde (Nallet. F. et al., 1994, J. Phys. II France, 4,1477–1499). Die DNA befindet sich im Wesentlichen in der Phase mit hohem ρ-Wert (ungefähr 110 bis 130 Å), wobei die Phase mit geringem d-Wert (ungefähr 50 Å) keine DNA aufweist und leicht dehydriert ist. Für ρ ≤ 6, (iii), ist die einzige vorhandene lamellare Phase durch d-Werte gekennzeichnet, die im Vergleich zur lamellaren Phase in Abwesenheit von DNA um 15 bis 20 Å erhöht sind. Dies zeigt deutlich, daß die DNA zwischen den Lipidlamellen begrenzt ist. Im Gegensatz zum System kationisches Lipid/DNA ist hier die Begrenzung sterisch, da es keine elektrostatischen Wechselwirkungen gibt.
Zusätzlich zu den Spitzen der lamellaren Phase wird eine Spitze beobachtet, die sich zwischen q ≅ 0,15 und 0,2 In Abhängigkeit von der lamellaren Phase befindet (siehe Einschub in 1D). Diese Spitze existiert nicht für die Proben mit ρ > 6 und wurde der Korrelation zwischen DNA-Strängen zugeschrieben, wie dies für die Systeme kationische Lipide/DNA beobachtet wurde (J.O. Räder, et al, Science, 275 S. 810 1997; T. Salditt et al, Physical Review Letters, 79 S. 2582 1997). Der Abstand zwischen DNA-Strängen variiert in der Tat mit ρ zwischen ≈ 30 und 42 Å mit konstanter Hydrierung. Diese Abstände sind für eine nematische Organisation der DNA in Wasser (Durand, D. et al., 1992, J. Phys, 11 France 2, S. 1769–1783) charakteristisch. Wir haben somit eine lamellare Phase (L^c _a), wo die DNA zwischen den smektischen Doppelschichten interkaliert und in nematisch-2D (siehe auch 1B) organisiert ist. Es ist ebenfalls zu beobachten, daß der Abstand zwischen DNA-Strängen sich mit der Verringerung der Hydrierung bei konstantem ρ-Wert verringert. Dies ist auf die Einschränkung des Wobbling (der Schwingungen) der Doppelstränge der DNA zurückzuführen, wenn sich der interstitielle Raum verringert.
Die Brechung von Röntgenstrahlen auf Vesikeln, welche eingekapselte DNA enthalten, die in Puffer dispergiert ist, wurde ebenfalls durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden die Vesikel in einem großen Pufferüberschuß dispergiert und im Anschluß daran konzentriert. Dieser Verdünnungsschritt, gefolgt von einer Konzentration, beseitigt beinahe die Gesamtheit der nicht eingekapselten DNA. Ergebnisse, die mit diesen Zubereitungen erzielt wurden, sind in 4 dargestellt. Das Brechungsprofil ist für eine lamellare Phase charakteristisch und belegt den multilamellaren Charakter der Vesikel. Der interlamellare Abstand d hängt, wie erwartet, von dem osmotischen Druck des dispergierenden Puffers ab und steigt im Vergleich zu den Vesikeln, die keine DNA enthalten, um 15 bis 20 Å. Darüber hinaus läßt sich leicht die Gegenwart einer Spitze der Korrelation zwischen DNA-Strängen erfassen, die sich in Abhängigkeit von der DNA-Menge in den Vesikeln und in Abhängigkeit vom osmotischen Druck des dispergierenden Mediums verschiebt. All dies steht in vollkommener Übereinstimmung mit den Erkenntnissen in Zusammenhang mit den konzentrierten Phasen und beweist somit, daß die Struktur aus der Phase (L^c _a) in den Vesikeln beibehalten wird.
Es wurden auch Experimente der Röntgenstrahlenbrechung durchgeführt, um den Übergang von einem hyperosmotischen dispergierenden Medium zu einem hypoosmotischen Medium auf den Vesikeln zu untersuchen, welche DNA enthalten (siehe weiter unten). In diesem Fall wurden die Vesikel in einem großen Lösemittelüberschuß mit 900 mOsm (hyperosmotisch) dispergiert. In der Folge haben wir einen Lösemittelaustausch durchgeführt, indem wir auf 300 mOsm übergegangen sind (physiologisches Medium; hypoosmotisch für die Phase (L^c _a)). Es läßt sich feststellen, daß die lamellare Struktur selbst nach dem Übergang in das hypoosmotische Medium intakt bleibt. Der d-Wert geht von ungefähr 78 Å bei 900 mOsm auf ungefähr 88 Å bei 300 mOsm über, das heißt, daß die d-Werte großteils größer bleiben als im Fall der Vesikel, die keine DNA enthalten (≅ 63Å).
Ferner wurden Profile elektronischer Dichte der Phase (L^c _a) ausgehend von den Intensitäten der Bragg-Spitzen der smektischen Anordnung rekonstruiert. Das in 2A dargestellte Profil zeigt eine deutliche Erhöhung der elektronischen Dichte auf ungefähr 40 Å des Zentrums der Lipid-Doppelschicht und ist mit der Gegenwart von DNA in dem wässerigen Teil der lamellaren Phase kohärent.
Bestimmung von DNA-Einkapselungsgraden in den Vesikeln:
Der Einkapselungsgrad wurde durch Spektrofluorimetrie bestimmt, wobei als Fluorophor YOYO (λ_cx = 491 nm, λ_cm = 509 nm) verwendet wurde. Sofern nicht anders angegeben, wurden die unten genannten Ergebnisse mit DNA erhalten, die durch Ultraschall von ≈ 150 pb behandelt wurde.
Die nicht eingekapselte DNA wird durch Zugabe von YOYO zu den wässerigen Dispersionen der Vesikel (I_D) gemessen. Die Gesamt-DNA wird nach der Zerstörung der Vesikel durch Triton (I_T) dosiert. Der Einkapselungsgrad wird wie folgt ermittelt: = 100 (I_T-I_D)/(I_T-I_D), wobei I₀ = Intensität von YOYO alleine. Die Umwandlung in Massenverhältnis Lipid/eingekapselte DNA geschieht wie folgt: ρ* = 100 p/Einkapselungsgrad.
Es wurden Messungen des Einkapselungsgrads der DNA in Vesikeln in Abhängigkeit vom osmotischen Druck des Puffers durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden die Vesikel ausgehend von einer Phase (L^c _a) mit ρ = 2 und mit 55 % Hydrierung hergestellt. Der osmotische Druck im Inneren der Vesikel wurde in der Größenordnung von 500 mOsm geschätzt. In 3 ist zu sehen, daß der Einkapselungsgrad progressiv bis zu einem osmotischen Druck von ungefähr 600 mOsm steigt und für stärkere osmotische Drucke konstant bleibt, was die Bedeutung des osmotischen Drucks für die Optimierung des Einkapselungsgrades belegt. Diese Ergebnisse deuten ebenfalls darauf hin, daß der osmotische Druck im Inneren der Vesikel wahrscheinlich etwas stärker als die Schätzungen ist, die ausgehend von den wässerigen DNA-Lösungen erfolgten. Dies ist wahrscheinlich auf die Gegenwart von Salzen in dem Phospholipid natürlichen Ursprungs zurückzuführen.
Dennoch ist festzustellen, daß das Optimum des Einkapselungsgrades der DNA sich bei einem osmotischen Druck befindet, der über jenem des physiologischen Mediums liegt (300 mOsm). Wir haben daher in der Folge die Verdünnung der Vesikel (Phase (L^c _a): ρ = 2, 55 % Wasser), die in einem hyperosmotischen (900 mOsm) Medium hergestellt werden, in einem Medium, das 300 mOsm aufweist und für die Phase (L^c _a) hypoosmotisch ist, untersucht. In diesem Fall läßt sich völlig überraschend beobachten, daß der Einkapselungsgrad nicht auf jenen der Vesikel sinkt, die mit 300 mOsm hergestellt wurden, sondern sich mit jenem deckt, der mit 900 mOsm erhalten wurde. Es ist somit möglich, DNA enthaltende Vesikel mit starkem osmotischem Druck herzustellen und diese in einem physiologischen Medium zum Zeitpunkt der Anwendung zu verdünnen, ohne daß es zu einem Verlust von eingekapselter DNA kommt.
Die Untersuchung der Stabilität dieser DNA-Vektoren in Abhängigkeit von der Zeit zeigt, daß die beste Stabilität in einem hyperosmotischen Medium erhalten wird, wo man nur einen leichten Rückgang des Einkapselungsgrades von ≅ 70 bis ≅ 60 % im Laufe von 30 Tagen feststellt.
Für die Untersuchung der Optimierung in Abhängigkeit von der Zusammensetzung der Phase (L^c _a), die zur Herstellung der Vesikel dient, wurden die Vektoren in einem hyperosmotoischen Puffer hergestellt und der Einkapselungsgrad nach ihrer Verdünnung in einem physiologischen Puffer gemessen.
Indem der Wassergehalt der Phase (L^c _a) zwischen 40 und 70 % bei konstantem ρ-Wert von gleich 2 variiert wird, ergibt sich ein Maximum des Einkapselungsgrades bei einer Hydrierung, welche der Schwellgrenze der Phase (L^c _a) (55 % Wasser) entspricht. Bei Hydrierungen von mehr als 55 % erklärt sich der Rückgang der Einkapselung durch den Umstand, daß sich die im Lösemittel lösliche DNA zwischen der Phase (L^c _a) und dem Lösemittelüberschuß aufteilt und somit immer weniger im Inneren der Phase (L^c _a) vorhanden ist. Unterhalb von 55 % ergibt sich die Verringerung des Einkapselungsgrades, wenn die Hydrierung sinkt, wahrscheinlich aus der geringen Hydrierung und der Zunahme der Viskosität, welche das Erhalten der Vesikel behindert haben.
Indem wir einen Hydrierungsgrad von 50 % beibehalten haben, der einer maximalen Einkapselung entspricht, haben wir den Einfluß des ρ-Wertes der Phase (L^c _a) auf den Einkapselungsgrad untersucht. Die Ergebnisse zeigen, daß im Allgemeinen die Einkapselung durch einen Überfluß von Lipiden (70 % für ρ = 4 gegenüber 45 für ρ = 1) erleichtert wird. Es ist dennoch wichtig anzumerken, daß dieses Ergebnis in Prozent von eingekapselter DNA keinerlei Angaben zur Entwicklung der Menge eingekapselter DNA macht. Die Ergebnisse, die in Masseverhältnis Lipd/eingekapselte DNA ρ* umgewandelt wurden, sind in 5 dargestellt, wo man sieht, daß für ρ = 4, trotz eines erhöhten Einkapselungsgrades (70 %), die Gesamtmenge an DNA in den Vesikeln geringer als die eingekapselte für ρ = 1 ist. Was die Optimierung der Einkapselung betrifft, ergeben sich somit zwei Standpunkte: (i) entweder es wird eine große DNA-Menge (p schwach) eingeführt, die eingekapselte Menge ist hoch, aber gleichzeitig wird viel DNA im externen Medium beobachtet, (ii) oder es wird eine geringe DNA-Menge eingeführt (p hoch), die großteils eingekapselt wird, wobei aber insgesamt betrachtet weniger DNA in den Vesikeln vorhanden sein wird.
Der Einfluß des ρ-Wertes der lamellaren Phase wurde ebenso für die Vesikel untersucht, die Plasmid enthalten. In diesem Fall bleibt der Einkapselungsgrad ungefähr konstant bei 40 % zwischen ρ = 4 und 2, das heißt, schwächer als für die kurze DNA. Die Umwandlung in ρ* in Abhängigkeit des ρ-Wertes zeigt dennoch, daß sich die zwei Systeme in vergleichbarer Weise entwickeln (siehe 5). Dieses Ergebnis erlaubt es, auf das Plasmid dieselben Schlußfolgerungen zu übertragen, zu denen wir ausgehend von dem System gelangt sind, welches DNA mit 150 p.b. enthält.

Claims

Strukturierte Mischphase, die durch Aufnahme von biologischen Makromolekülen, welche in Flüssigkristallstruktur angeordnet sind, in eine Flüssigkristallphase aus Amphiphilen gebildet wird, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Makromolekül in der strukturierten Mischphase zu einem Gehalt von mindestens 5 Gew.% bezogen auf die die Kristallphase bildenden Amphiphile vorliegt, und mindestens eine der zwei Einheiten, die durch das biologische Makromolekül einerseits und die Gesamtheit der Amphiphilen andererseits begründet werden, einen nicht-geladenen Charakter aufweist.
Strukturierte Mischphase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Flüssigkristallphase aus Amphiphilen eine lamellare Flüssigkristallphase ist.
Strukturierte Mischphase nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Makromolekül einen Drehradius aufweist, der größer ist als der Abstand zwischen den amphiphilen Lamellen der Flüssigkristallphase.
Strukturierte Mischphase nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Makromolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polynukleotiden, Proteinen, Polysacchariden.
Strukturierte Mischphase nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Makromolekül ein Polynukleotid, vorzugsweise DNA oder RNA ist.
Strukturierte Mischphase nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die die strukturierte Phase aus Amphiphilen bildenden amphiphilen Verbindungen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: – Glycerolipiden, insbesondere phospholipidischen Glycerolipiden, hydriert oder nicht hydriert, – Fettsäuren von C₆ bis C₃₀, gesättigt oder einfach oder mehrfach ungesättigt, linear oder verzweigt, ethoxyliert oder nicht ethoxyliert, in Form einer Säure oder eines Salzes eines Alkalimetalls, Erdalkalimetalls oder eines Amins, – ethoxylierten oder nicht ethoxylierten Estern von Saccharose, Sorbitol, Mannitol, Glycerin, Polyglycerin, das 2–20 Einheiten Glycerin enthält, oder Glykol mit diesen Fettsäuren, – Mono-, Di- oder Triglyceriden oder Gemischen von Glyceriden dieser Fettsäuren, – Fettalkoholen von C₆ bis C₃₀, gesättigt oder einfach oder mehrfach ungesättigt, linear oder verzweigt, ethoxyliert oder nicht ethoxyliert, – Cholesterin und dessen Derivaten, insbesondere geladenen oder neutralen Cholesterinestern, wie etwa Cholesterinsulfat, – weiteren Derivaten mit Sterolskelett, insbesondere von pflanzlicher Herkunft, wie etwa Sitosterol oder Stigmasterol, – ethoxylierten oder nicht ethoxylierten Ethern von Saccharose, Sorbitol, Mannitol, Glycerin, Polyglycerin, das 2–20 Einheiten Glycerin enthält, oder Glykol mit diesen Fettalkoholen, – pflanzlichen Ölen, polyethoxyliert, hydriert oder nicht hydriert, – Blockpolymeren aus Polyoxyethylen und Polyoxypropylen (Poloxamere), – Polyethylenglykolhydroxystearat, – Sphingolipiden und Sphingosinderivaten, – Polyalkylglucosiden, – Ceramiden, – Copolymeren von Polyethylenglykol und Alkylglykol, – Di- oder Triblock Copolymeren aus Ethern von Polyethylenglykol und Polyalkylenglykol.
Strukturierte Mischphase nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie ferner mindestens einen Zusatzstoff enthält, der dazu vorgesehen ist, spezifische Eigenschaften zu vermitteln, beispielsweise einen Zusatzstoff, der dazu vorgesehen ist, der strukturierten Mischphase eine Oberflächenadhäsionseigenschaft zu verleihen.
Strukturierte Mischphase nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Zusatzstoff ein Tensid oder ein Polymer ist.
Verfahren zur Herstellung einer strukturierten Mischphase nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es die Schritte: – Herstellung eines homogenen Gemischs, welches die amphiphilen Verbindungen und das Makromolekül enthält, wobei das Makromolekül zu mindestens 5 % Gewichtanteilen bezogen auf die amphiphilen Verbindungen vorliegt, – Aufnahme einer angemessenen Menge von wäßrigem oder polarem Medium zur Bildung einer Flüssigkristallphase aus Amphiphilen mit den amphiphilen Verbindungen, umfaßt.
Verfahren zur Herstellung von Vesikeln, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Schritt der Dispersion einer strukturierten Mischphase, wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 beschrieben oder nach dem Verfahren aus Anspruch 9 erhalten, umfaßt.
Vesikel erhältlich durch Dispersion einer strukturellen Mischphase, wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 beschrieben oder nach dem Verfahren nach Anspruch 9 erhalten.
Vesikeldispersion nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium, in dem die Vesikel dispergiert sind, eine Osmolarität aufweist, die sich von jener des internen Mediums der strukturierten Mischphase aus Amphiphilen unterscheidet.
Verfahren zur Herstellung einer Dispersion nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es die Schritte: – Dispersion in einem Medium von gleicher Osmolarität wie das interne Medium, – Veränderung der Osmolarität des externen Mediums durch Zugabe von Salz oder Wasser oder durch Dialyse zum Erhalt der gewünschten Osmolarität, umfaßt.