ES2231835T3 - Genes biosinteticos ii de biotina. - Google Patents
Genes biosinteticos ii de biotina.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION TRATA DEL PROCEDIMIENTO DE PRODUCCION DE BIOTINA MEDIANTE FERMENTACION, UTILIZANDO UN ORGANISMO OBTENIDO MEDIANTE INGENIERIA GENETICA, Y DE SECUENCIAS DE ADN Y VECTORES PARA SER UTILIZADOS EN DICHO PROCEDIMIENTO.
Description
Genes biosintéticos II de biotina.
La presente invención, se refiere a un
procedimiento de producción de biotina, mediante fermentación,
utilizando un organismo creado por ingeniería genética.
La biotina, es una de las vitaminas esenciales
para la nutrición de animales, plantas y microorganismos, y es muy
importante como aditivo de medicinas o de alimentos.
La biosíntesis de la biotina de la Escherichia
coli, se ha estudiado bien, y se ha clarificado el hecho de que,
la biotina, se sintetiza a partir pimelil CoA, vía el ácido
7-ceto-8-amino-pelargónico
(KAPA), el ácido
7,8-diamino-pelargónico (DAPA) y
destiobiotina (DTB)[Escherichia coli and Salmonella
typhimurium, Cellular and Molecular Biology, 544 (1987).
El análisis de la información genética involucrada en la biosíntesis
de la biotina, ha sido objeto de avance, en Escherichia coli
(J. Biol. Chem., 263 19577, (1988), y Bacillus
sphaericus (Patente estadounidense US nº 5.096.823). Se conoce
que, por lo menos cuatro enzimas, se encuentran involucradas en esta
trayectoria biosintética. Estas cuatro enzimas, se encuentran
codificadas por los genes bioA, bioB, bioD, y bioF. El gen bioF,
codifica para la KAPA sintetasa, la cual cataliza la conversión de
pimelil CoA en KAPA. El gen BioA, codifica para la DAPA sintetasa,
la cual convierte KAPA en DAPA. El gen BioD, codifica para la DTB
sintetasa, la cual convierte la DAPA en DTB. El gen biB, codifica
para la biotina sintetasa, la cual convierte la DTB, en biotina. Se
ha reportado, también, el hecho de que, los genes bioC y bioH, se
encuentran involucrados en la síntesis de pimelil coA, en la
Escherichia coli.
Existen muchos estudios centralizados en la
producción fermentativa de la biotina. Se han utilizado las
Escherichia coli (patente Kokai japonesa nº 149091 / 1986 y
patente Kokai japonesa nº 155081 / 1987), Bacillus sphaericus
(patente Kokai japonesa nº 180174 / 1991), Serratia
marcescens (patente Kokai japonesa nº 27980 / 1990), y
Brevibacterium flavum (patente Kokai japonesa nº 240489 /
1991). Pero, estos procedimientos, no han sido todavía apropiados
para su utilización en un procedimiento inherente a un proceso de
producción industrial, debido al hecho de su reducida productividad.
Además, grandes cantidades de DTB, un precursor de la biotina, se
acumulan en la fermentación de esta bacteria. Así, por lo tanto, se
ha asumido el hecho de que, la última etapa de la trayectoria
biosintética de la biotina, desde la DTB hasta la biotina, es una
etapa limitativa de la tasa limitativa.
Por otro lado, se encontró el hecho de que, una
cepa bacteriana que pertenecía al género Kurthia, producía
DTB, y reducidas cantidades de biotina. También, los mutantes los
cuales producen unas cantidades mucho más grandes de biotina, se
derivaban de cepas del tipo salvaje, del género Kurthia,
mediante la selección de, antimetabolitos acidomicina ((ACM), ácido
5-2(tienil)-valérico (TVA), y
alfa-metil-destiobiotina (MeDTB), de
resistencia a la biotina. No obstante, en vistas a los todavía
reducidos títulos, es deseable el aplicar la ingeniería genética,
con objeto de mejorar la productividad de la biotina, en dichos
mutantes.
La presente invención, se refiere, por lo tanto,
a los fragmentos cromosómicos de DNA, los cuales portan los genes
involucrados en la biosíntesis de la biotina de Kurthia sp.
Los fragmentos cromosómicos de DNA, aislados, portan 8 genes, los
genes bioA, bioB, bioC, bioD, bioF, bioFII, bioH y bioHIII, y
secuencias regulatorias transcripcionales. El gen bioFII, codifica a
una isozima del producto del gen bioF. El gen bioIII, codifica para
una isozima del producto del gen bioH.
La presente invención, se refiere adicionalmente
a cepas de Kurthia sp., en las cuales, se amplifica por lo
menos un gen involucrado en la biosíntesis de la biotina y, también,
al procedimiento de producción de la biotina, mediante esta cepa de
Kurthia sp., obtenida mediante ingeniería genética.
A pesar de que, el fragmento de DNA anteriormente
mencionado, arriba, puede ser de varios orígenes, es preferible el
utilizar las cepas pertenecientes al género Kurthia. Los
ejemplos específicos de tales tipos de cepas, incluyen, por ejemplo,
a la Kurthia sp. 538-6 (DSM Nº 9454) y a sus
cepas mutantes, mediante la selección antimetabolitos de resistencia
a la biotina, tales como la Kurthia sp.
538-KA26 (DSM Nº 10609).
Hablando de una forma general, la presente
invención, se dirige a secuencias de DNA que codifican a
polipéptidos representados por las SEQ ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10, 12,
14 ó 16, y derivados funcionales de estos polipéptidos, los cuales
contienen la adición / inserción / deleción y / o sustitución de uno
o más residuos de aminoácido(s), y un vector que comprende
una o más secuencias de DNA, de una forma específica, un vector, en
donde, las citadas secuencias de DNA, se encuentran funcionalmente
ligadas a una frecuencia o a frecuencias de promotores y,
adicionalmente, a un célula transformadas mediante una o más
secuencias de DNA o vector(es), tal y como se han definido
anteriormente, arriba, y a un procedimiento para la producción de
biotina, el cual comprende el cultivo de la célula, tal y como se ha
definido anteriormente, arriba, en un medio, y el aislamiento de la
biotina resultante, del medio de cultivo, mediante procedimientos
conocidos en el arte especializado de la técnica y, de una forma más
específica, a un procedimiento en donde, el cultivo, se efectúa en
un transcurso de tiempo que va de 1 a 10 días, de una forma
preferible, de 2 a 7 días, a un pH de 5 a 9, de una forma
preferible, de 6 a 8, y a una temperatura comprendida dentro de unos
márgenes que van de 10 a 45ºC, de una forma preferible, de 25 a
30ºC.
Finalmente, la presente invención, se dirige
también a un procedimiento para la preparación de composiciones
farmacéuticas, de alimentos, o de piensos, caracterizado por el
hecho de que, la biotina obtenida mediante tales procedimientos, se
mezcla con uno o más aditivos de los que se utilizan de una forma
generalizada, y con los cuales se encuentra familiarizado el experto
especializado en este arte de la técnica.
Posteriormente, a continuación, se describe un
procedimiento detallado para el aislamiento de fragmentos de DNA que
portan los genes que codifican para las enzimas involucradas en la
biosíntesis de la biotina de estas cepas bacterianas.
Así, por lo tanto, el DNA, puede extraerse de la
cepa Kurthia sp. 538-KA-26,
mediante el conocido procedimiento del fenol. Este DNA, se digiere a
continuación, parcialmente, mediante Sau3AI, y se liga con pBR322,
digerido mediante BamHI, para construir una biblioteca genónica de
Kurthia sp. 538-KA-26.
Los mutantes auxotróficos de biotina que se
encuentran exentos de la capacidad biosintética para producir
biotina, se transforman, con la biblioteca genómica obtenida
anteriormente, arriba, y se seleccionan los transformantes que
muestran prototrofia a la biotina. Los transformantes seleccionados,
tienen los fragmentos genómicos de DNA que complementan los genes
deficientes en los mutantes auxotróficos de biotina. Como mutantes
auxotróficos de biotina, pueden utilizarse los Escherichia
coli R875(bioB^{-}), R877(bioD^{-}),
BM7086(bioH^{-}) y R878(bioC^{-})(J.Bacteriol.,
112, 830-839(1972), J.Bacteriol.,
143, 789-800, (1980). La transformación de
tales tipos de cepas de Escherichia coli, puede llevarse a
cabo en concordancia con un procedimiento convencional, tal como el
procedimiento competente de la célula [Molecular Cloning, Cold
Springer Harbor Laboratory Press, 252, (1982)].
En la presente invención, se obtuvo un plásmido
híbrido, el cual complementa al mutante deficiente en biotina de
Escherichia coli, de la forma descrita anteriormente, arriba.
El plásmido hidrído obtenido, se denomina pKB100. El pKB100,
corresponde al plásmido pBR322, el cual porta 5,58 Kb de un
fragmento genómico de DNA, de la Kurthia sp.
538-KA26 y, su mapa de restricción de segmentación,
se muestra en las figuras 1 y 2.
El plásmido híbrido denominado pKB200, el cual
complementa al mutante deficiente en bioD de Escherichia
coli, se obtuvo, también, de la forma que se describe
anteriormente, arriba. El pKB200, corresponde al plásmido pBR322,
que porta un fragmento de DNA de 7,87 Kb, de la Kurthia sp.
538-KA26, y su mapa de restricción de segmentación,
se muestra en las figuras 1 y 3. El fragmento genómico de DNA, en el
pKB200, se solapa de una forma completa, con el fragmento insertado
del pKB100, y porta los genes 4bioF, bioB, bioD, ORF1 y ORF2, y una
parte del gen bioA de Kurthia sp. 538-KA26,
tal y como se muestra en la figura 9-A.
El gen bioA completo de Kurthia
sp.538-KA26, puede aislarse mediante
procedimientos convencionales, tales como el de hibridación de
colonias, utilizando parte de los fragmentos genómicos de DNA en el
pKB200, como una sonda. La totalidad de DNA de Kurthia
sp.538-KA26, se digiere mediante una enzima de
restricción, tal como la HindIII, y se liga con un vector plásmido,
segmentado mediante la misma enzima de restricción. A continuación,
la Escherichia coli, se transforma con los plásmidos de
híbridos que portan fragmentos genómicos de DNA, de Kurthia
sp. 538-KA26, para construir una biblioteca
genómica. Como vector y cepa de Escherichia coli, pueden
utilizarse, respectivamente, los pUC19 [Takara Shuzo Co.
(Higashiira, Higashinotohin, Shimogyo-Mu,
Kyoto-shi, Japón)] y Escherichia coli JM109
(Takara Shuzo Co).
El plásmido híbrido denominado pKB300, el cual
porta un fragmento genómico de DNA de 8,44 Kb de Kurthia sp
538-KA26, se obtuvo mediante hibridación de colonias
y, su mapa de restricción de segmentación, se muestra en la figura
1. El fragmento genómico de DNA, en el PK300, porta dos cúmulos de
genes involucrados en la biosíntesis de la biotina en la Kurthia
sp. 538-KA26, tal y como se muestra en la figura
9-A. Un cúmulo, consiste en los genes ORF1, bioD y
bioA. Otro cúmulo, consiste en los genes ORF2, bioF y biB. Las
secuencias de nucleótidos de los genes bioD y bioA, se muestran en
la SEQ ID No. 1 y la SEQ ID No. 3, respectivamente. Las secuencias
de aminoácidos pronosticadas de los productos de genes bioD y bioA,
se muestran en las SEQ ID N0. 2 y SEQ ID No. 4, respectivamente. El
gen bioD, codifica para un polipéptido de 236 residuos de
aminoácidos, con un peso molecular de 26.642. El gen bioA, codifica
para un polipéptido de 460 residuos de aminoácidos, con un peso
molecular de 51,731. El gen ORF1, codifica para un polipéptido de
194 residuos de aminoácidos, con un peso molecular de 21.516, pero,
la función biológica de este producto de genes, es desconocida.
Las secuencias nucleótidas de los genes bioF y
bioB, se muestran en la SEQ ID No. 5 y la SWQ ID No. 7,
respectivamente. Las secuencias de aminoácidos pronosticadas de los
productos de los genes bioF y bioB, son la SEQ ID No. 6 y la SEQ ID
No. 8, respectivamente. El gen bioF, codifica para la un polipéptido
de 387 residuos de aminoácidos, con un peso molecular de 42.619. El
gen bioB, codifica para la un polipéptido de 338 residuos de
aminoácidos, con un peso molecular de 37,438. El gen ORF2, codifica
para la un polipéptido de 63 residuos de aminoácidos, con un peso
molecular de 7.447, pero, la función biológica de este producto de
genes, es desconocida. Secuencias inversas repetidas, las cuales son
señales transcripcionales de un terminador, se encuentran corriente
debajo de los genes bioA y bioB. Tal y como se muestra en la figura
10, entre los genes ORF1 y ORF2, se encuentran dos secuencias
promotoras de transcripción, las cuales inician transcripciones en
ambas direcciones. Además, hay dos secuencias repetidas inversas
denominadas Box1 y Box 2, involucradas en el control negativo de las
transcripciones entre cada secuencia de promotor y cada codón de
inicio translacional.
Adicionalmente, se obtuvieron dos plásmidos
híbridos, los cuales complementan a los mutantes euxotróficos de
Escherichia coli, de la forma descrita anteriormente, arriba.
El plásmido híbrido denominado pK100, complementa al mutante
deficiente en bioH y, el plásmido híbrido denominado pKC100, al
mutante bioC. El pKH100 (figura 4 y 5) tiene un fragmento genómico
de DNA de 1,91 Kb, de Kurthia sp. 538-KA26,
el cual porta un cúmulo de genes consistente en los genes bioH y
ORF3, tal y como se muestra en la figura 9-B. La
secuencia de nucleótidos del gen bioH y la secuencia pronosticada de
aminoácidos de este producto de genes, se muestran en las SEQ ID
No. 8 y SEQ ID No. 10, respectivamente. El gen bioH, codifica para
un polipéptido de 267 residuos de aminoácidos, con un peso molecular
de 29.423. El gen ORF3, codifica para la un polipéptido de 86
residuos de aminoácidos, con un peso molecular de 9.955, pero, la
función biológica de este producto de genes, es desconocida. Una
secuencia de promotor, se encuentra corriente arriba del gen bioH,
tal y como se muestra en la figura 11, y hay una secuencia
repetitiva inversa, la cual es el terminador transcripcional,
corriente debajo de los genes ORF3. Puesto que, la región promotora,
no tiene secuencias inversas, tales como la Box1 y la Box2, se
espera que, las expresiones de estos genes, no se regulen.
Por otro lado, el pKC100, porta un fragmento
genómico de DNA de 6,76 Kb de Kurthia sp.
538-KA26, tal y como se muestra en las figura 6 y 7.
El fragmento genómico de DNA, en el pK100, porta un cúmulo de genes,
consiste en los genes bioFII, bioHII y bioC, tal y como se muestra
en la figura 9-C. Los genes bioHII y bioFII, son
genes para isozimas de los genes bioH y bioF, respectivamente,
debido al hecho de que, los genes bioHIII y bioFII, complementan a
los mutantes deficientes en bioH y deficientes en bioF, de
Escherichia coli, respectivamente. Las secuencias de
nucleótidos de los genes bioFII, bioHII y bioC, se muestran en las
SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13 y SEQ ID No. 15, respectivamente. Las
secuencias pronosticadas de aminoácidos de los productos de los
genes bioFII, bioHII y bioC, se muestran en las SEQ ID No. 12, SEQ
ID No. 14 y SEQ ID No. 16, respectivamente. El gen bioFII, codifica
para un polipéptido de 398 residuos de aminoácidos, con un peso
molecular de 44.776. El gen bioHII, codifica para un polipéptido de
248 residuos de aminoácidos, con un peso molecular de 28.629. El gen
bioC, codifica para un polipéptido de 276 residuos de aminoácidos,
con un peso molecular de 31.599. Una secuencia de promotor, se
encuentra corriente arriba del gen bioFII, y hay una secuencia
repetitiva inversa, la cual se denomina Box 3, en la región del
promotor, tal y como se muestra en la figura 12. La transcripción de
estos genes, termina en una secuencia repetitiva inversa, la cual
existe corriente abajo del gen bioC. Puesto que, la secuencia de
nucleótidos de Box 3, es significativamente similar a las de los
Box1 y Box2, la expresión de estos genes, se estima que se regula de
una forma similar a los cúmulos de genes de bioA y bioB.
No es necesario mencionar el hecho de que, las
secuencias nucleótidas y las secuencias de aminoácidos de los genes
aislados anteriormente, arriba, se cambian artificialmente, en
algunos casos, por ejemplo, el codón de iniciación GTG o TTG, puede
convertirse en un codón ATG.
Así, por lo tanto, la presente invención, de
dirige también a derivados funcionales de los polipéptidos del
presente caso. Tales tipos de derivados funcionales, se definen en
base a la secuencia de aminoácidos de la presente invención,
mediante la adición, inserción, deleción y / o sustitución de uno o
más residuos de aminoácidos de tales secuencias, en donde, tales
derivados, tienen todavía el mismo tipo de actividad enzimática, que
los polipéptidos correspondientes de la presente invención. Tales
tipos de actividades, pueden medirse mediante cualesquiera ensayos
conocidos en el arte especializado de la técnica o específicamente
descritas aquí. Tales derivados funcionales, pueden realizarse bien
ya sea mediante síntesis química de polipétidos, conocida en el arte
especializado de la técnica, o bien ya sea por medios recombinantes,
en base a las secuencias de DNA, tal y como se discuten aquí,
mediante procedimientos conocidos en el estado actual del arte de
esta técnica especializada, y que se dan a conocer, por ejemplo, por
parte de Sambrook et al. (Molecular Cloning, Cold Spring
Harbour Laboratory Press, New York, USA, segunda edición, 1989). Los
intercambios de aminoácidos en proteínas y péptidos, los cuales, de
una forma general, no alteran la actividad de tales moléculas, son
conocidos en el estado actual del arte correspondiente a la técnica
especializada y se describen, por ejemplo, por parte de H. Neurath y
R.L. Hill en "The Proteins", - Las proteínas -, (Academix
Press, New York, 1979, véase, especialmente, la figura 6, página
14). Los intercambios que acontecen de una forma más común, son:
Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn,
Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile,
Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Glu, Asp/Gly, así como a la inversa.
Adicionalmente, la presente invención, no se
dirige únicamente a las secuencias de DNA, tal como las que se dan a
conocer, por ejemplo, en la lista de secuencias, así como a sus
hebras complementarais, sino que, además, se dirige también a
aquéllas que incluyen estas secuencias de DNA, las cuales hibridan
bajo condiciones standard, con tales tipos de secuencias o
fragmentos de éstas y de DNA, las cuales, debido a la degeneración
del código genético, no hibridan bajo condiciones standard con tales
tipos de secuencias, pero que codifican para polipéptidos, los
cuales tienen exactamente la misma secuencia de aminoácidos.
Las "condiciones standard" para la
hibridación, significan, en este contexto, las condiciones las
cuales se utilizan generalmente por parte de una persona experta en
este arte especializado de la técnica, para detectar señales
específicas de hibridación, y las cuales se describen, por ejemplo,
por parte de Sambrook et al., (ver anteriormente, arriba) o,
de una forma preferible, la denominada de condiciones de hibridación
severa y de lavado no severo o, de una forma más preferible, la
denominada de condiciones de hibridación severa y de lavado severo,
con las cuales se encuentra familiarizada la persona experta en el
arte de la técnica especializada, y las cuales se describen, por
ejemplo, por parte de Sambrook et al. (ver anteriormente,
arriba).
Las secuencias de DNA que se derivan de las
secuencia de DNA de la presente invención, bien ya sea porque éstas
hibridan con tales secuencias de DNA (véase, anteriormente, arriba),
o bien ya sea porque pueden construirse mediante la reacción en
cadena de la polimerasa, mediante la utilización de cebadores
designados en base a tales secuencias de DNA, pueden prepararse bien
ya sea tal y como se indica, a saber, por parte de la reacción PCR,
o mediante mutagénesis dirigida a sitios (véase, por ejemplo, Smith,
Ann, Rev. Genet. 19, 423 (1985) o de forma sintética, tal y
como se describe, por ejemplo, en la patente europea EP 747 483, o
mediante los procedimientos usuales de la clonación molecular, tal y
como se describe, por ejemplo, en Sambrook et al. (ver
anteriormente, arriba).
Como cepa huésped para la expresión y / o
amplificación de las secuencias de DNA de la presente invención,
pueden utilizarse cualesquiera microorganismos, por ejemplo, los que
se identifican en la patente europea EP 635 572, pero es preferible
el uso de las cepas pertenecientes al género Kurthia,
especialmente, Kurthia sp. 538-6 (DSM Nº
9454) y Kurthia sp. 538-51F9 (DSM N0.
10610).
Con objeto de obtener un transformante con una
alta productividad de biotina, las secuencias de DNA de la presente
invención, se utilizan bajo el control de un promotor, el cual es
efectivo en tales células huésped. Las secuencias de DNA de la
presente invención, pueden introducirse en la célula huésped,
mediante la transformación con un plásmido que porte tales
secuencias de DNA, o mediante la integración en el cromosoma de la
célula huésped.
Cuando se utiliza la Kurthia sp.
538-51F9, como célula huésped, la Kurthia sp.
538-51F9, puede transformarse con un plásmido
híbrido, el cual porta por lo menos un gen involucrado en la
síntesis de la biotina, aislado anteriormente, arriba, a partir de
la cepa Kurthia sp. Como vector plásmido para el plásmido
híbrido, pueden utilizarse el pUB110 [J. Bacteriol. 154,
1184-1194, (1983)], el pHP13 (Mol. Gen. Genet. 209,
335-342, 1987), u otros plásmidos que comprendan el
origen de la replicación que funciona en la cepa Kurthia sp.
Como secuencias de DNA para la amplificación y / o la expresión de
Kurthia sp, puede utilizarse cualquier secuencia de DNA de la
presente invención, pero se prefiere la secuencia de DNA
correspondiente a al gen bioB, que codifica para la sintetasa de
biotina. Un ejemplo de tal tipo de plásmido híbrido es el pYK114,
mostrado en la figura 14. En este plásmido, el gen bioB, se
encuentra bajo el control del promotor para el gen bioH, y porta el
origen de replicación para el pUB110.
La cepa Kurthia sp.
538-51F, puede transformarse con el plásmido pYK114,
obtenido de la forma que se ha descrito anteriormente, arriba,
mediante el procedimiento de transformación de protoplastos
[Molecular Biological Methods for Bacillus, 150 (1990)]. No
obstante, puesto que, la cepa Kurthia sp.
538-51F9, tiene una reducida eficiencia de
regeneración a partir de protoplasmas, la eficiencia de
transformación de esta cepa, es muy baja. Así, por lo tanto, se
prefiere utilizar una cepa, la cual tenga una alta eficiencia de
regeneración a partir de protoplastos, debiéndose utilizar, por
ejemplo, la cepa Kurthia sp.
538-51F9-RG21, la cual puede
prepararse de la forma que se describe en el ejemplo 14 del presente
caso.
La presente invención, proporciona también un
procedimiento para la producción de biotina, mediante el cultivo de
los transformantes de esta forma obtenidos, y la separación y
purificación de la biotina producida.
El cultivo de los transformantes utilizados en la
presente invención, puede realizarse mediante procedimientos
conocidos en el arte especializado de la técnica. Puede utilizarse
un medio el cual contenga una fuente de carbono asimilable, una
fuente de nitrógeno digestible, una sal inorgánica, y otros
nutrientes necesarios para el crecimiento del transformante. Como
fuente de carbono, puede emplearse, por ejemplo, glucosa, fructosa,
lactosa, galactosa, sucrosa, maltosa, almidón, dextrina o glicerol.
Como fuente de nitrógeno, puede emplearse, por ejemplo, peptona,
judía de soja en forma de polvo, licor de maíz en remojo, extracto
de carne, sulfato amónico, nitrato amónico, urea, o una mezcla de
estos. Adicionalmente, como sal inorgánica, pueden utilizarse
sulfatos, hidrocloruros o fosfatos de calcio, magnesio, zinc,
manganeso, cobalto y hierro. Y, en caso necesario, pueden también
añadirse factores de nutrientes convencionales, o un agente
antiespumante, tal como un aceite animal, un aceite vegetal o un
aceite mineral. Si el transformante obtenido tiene un marcador
resistente a los antibióticos, el respectivo antibiótico, debe
suplementarse en el medio. El pH del medio de cultivo, debe ser de
un valor comprendido dentro de unos márgenes que van de 5 a 9, de
una forma preferible, de 6 a 8. La temperatura de cultivo, puede ser
de un valor que va de 10 a 45ºC, de una forma preferible, de 25 a
30ºC. El tiempo de restricción, puede ser de 1 a 10 días, de una
forma preferible, de 2 a 7 días.
La biotina producida bajo unas condiciones como
las que se han descrito anteriormente, arriba, puede recuperarse de
una forma fácil, mediante procedimientos conocidos en el arte de la
técnica especializada. Así, por ejemplo, después de que los
materiales sólidos se hayan retirado de la solución, la biotina
existente en el filtrado, se absorbe sobre carbón activo y, a
continuación, se eluye y se purifica adicionalmente con una resina
de intercambio de iones. De una forma alternativa, el filtrado, se
aplica directamente a una resina de intercambio de iones y, después
de la elución, el producto deseado, se recristaliza a partir de una
mezcla de alcohol y agua.
Antes de proceder a exponer en mayor detalle la
presente invención, mediante la referencia a los ejemplos que siguen
a continuación, se facilita una pequeña descripción de las figuras
incluidas, las cuales representan:
Figura 1: Mapas de restricción de los pKB100,
pKB200 y pKB300.
Figura 2: Estructura del pKB100.
Figura 3: Estructura del pKB200.
Figura 4: Mapas de restricción y resultados de
comple-mentación de los pKH100, pKH200 y pKH300.
Figura 5: Estructura del pK100.
Figura 6: Mapas de restricción de los pKC100,
pKC101 y pK102.
Figura 7: Estructura del pKC100.
Figura 8: Estructuras de los plásmidos derivados
de los pKB100, pKB101 y pKB102.
Figura 9: Organizaciones de los cúmulos de genes
involucrados en la biosíntesis de biotina de Kurthia sp.
538-KA26.
Figura 10: Secuencia de nucleótidos entre los
genes ORF1 y ORF2 de Kurthia sp.
538-KA26.
Figura 11: Secuencia de nucleótidos de la región
promotora del cúmulo de genes bioH.
Figura 12: Secuencia de nucleótidos de la región
promotora de cúmulo de genes bioFII.
Figura 13: Construcción del vector lanzadera
pYK114.
Figura 14: Construcción del plásmido pYK114 de
expresión de bioB.
Se procedió a cultivar la cepa resistente a la
acidomicina, de Kurthia sp., 538-KA26 (DSM Nº
10609), en 100 ml de caldo de nutriente (Kyokuto Seiyaku Co; Honcho
3-1-Japón) a una temperatura de
30ºC, durante el transcurso de toda la noche y, las células
bacterianas, se recuperaron mediante centrifugación. El DNA en su
totalidad, se extrajo de las células bacterianas mediante el
procedimiento de extracción de fenol [Experimentos con fusiones de
genes], Cold Spring Harbor Laboratory, 137 - 138, (1984), y se
obtuvieron 1,9 mg del DNA íntegro.
El DNA íntegro (10 \mug), se digirió
parcialmente con 1,2 unidades de Sau3AI, a una temperatura de 37ºC,
durante un transcurso de tiempo de 1 hora, para proporcionar
fragmentos con alrededor 10 kb de longitud. Se obtuvieron fragmentos
de DNA de 5 - 15 Kb, mediante electroforesis en gel de agarosa.
El vector pBR322 (Takara Shuzo CO.). se digirió
completamente con Bam HI y, a continuación, se trató con fosfatasa
alcalina, para evitar la autoligadura. Los fragmentos de DNA, se
ligaron con el pBR322, utilizando un equipo, a modo de kit, de
ligadura de DNA (Takara Shuzo Co.), en concordancia con las
instrucciones del fabricante. La mezcla de ligadura, se transfirió a
la Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo Co.), mediante el
apropiado y competente procedimiento de la célula [Molecular
Cloning, - Clonación molecular -, Cold Spring Harbor Laboratory, 252
- 253, (1982)] y, las cepas, se seleccionaron para la resistencia a
la ampicilina (100 \mug/ml), en medio LB sobre placa de agar (1%
de Bacto-triptona, 0,5% de extracto de
Bacto-levadura, 0,5% de NaCl, pH 7,5). Se obtuvieron
aproximadamente 5.000 genes individuales, los cuales tenían los
fragmentos genómicos de DNA, como una biblioteca genómica.
Las cepas ampicilino-resistentes
de la biblioteca genómica de Kurthia sp.
538-KA26, se cultivaron a una temperatura de 37ºC,
durante el transcurso de toda la noche, en 50 ml de medio LB, el
cual contenía 100 \mug/ml de ampicilina y, las células
bacterianas, se recogieron mediante centrifugación. El plásmido de
DNA, se extrajo de las células bacterianas, mediante el
procedimiento de desnaturalización alcalina [Molecular Cloning, -
Clonación molecular -, Cold Springer Harbor Laboratory, 90 - 91,
(1982)].
3. El plásmido de DNA, se transfirió mediante el
procedimiento competente de la célula, al mutante R875, deficiente
en bio-B de Escherichia coli (J. Bacteriol.
112, 830 - 839, 1972), sin una actividad de
biotina-sintetasa. Las células transformadas de
Escherichia coli R875, se lavaron dos veces con 0,85% NaCl y
se agotaron con placas de agar al 1,5% de medio M9CT (0,6% de
Na_{2}HPO_{4}, 0,3% HK_{3}PO_{4}), 0,05% NaClo, 0,1%
NH_{4}Cl, 2 mM MgSO_{4}, 0,1 mM CaCl_{2}, 0,2% glucosa, 0,6%
casaminoácido exento de vitaminas, 1 \mug/ml tiamina), que
contenía 100 \mug/ml de ampicilina y, las placas, se incubaron a
una temperatura de 37ºC, durante un transcurso de tiempo de 40
horas. El transformante, se cultivó en medio LB, que contenía 100
\mug/ml de ampicilina y, el plásmido híbrido, se extrajo de las
células. El plásmido híbrido, porta un inserto de 5,58 kb y se
designó pKB100. El mapa de restricción, se muestra en las figuras 1
y 2.
El pKB100, se transfirió a los mutantes
deficientes en biotina, de Escherichia coli
R875(bioB^{-}), W602(bioA^{-}),
R878(bioC^{-}), R877(bioD^{-}),
R874(bioF^{-}), o BM7086(bioH^{-})[J. Bacteriol.
112, 830 - 839, (1972), y J. Bacteriol., 143,
789-800, (1980)], mediante el método competente de
la célula. Los mutantes transformados, se lavaron tres veces con
0,85% NaCl, y se sometieron a la acción de placas, sobre placas de
agar M9CT, las cuales contenían 100 \mug/ml de ampicilina, 1 ng/ml
de biotina y, las placas, se incubaron a una temperatura de 37ºC,
durante un transcurso de tiempo de 24 horas, para realizar el
análisis de complementación. Tal y como se muestra en la tabla 1, el
pKB100, pudo complementar no únicamente el mutante de bioB, sino
también el mutante de bioF. Como contraste de ello, los mutantes de
bioA, bioD y bioH, no se complementaron con el pKB100. A raíz de
estos resultados, se confirmó que, el pKB100, portaba los genes bioB
y bioF, de Kurthia sp. 538-KA26.
Se procedió a transferir la biblioteca genómica
de Kurthia sp. 538-KA26 del ejemplo
1-1, al mutante de Escherichia coli,
deficiente en bioD, R877 y, los transformantes que tenían un
fenotipo de resistencia a la ampicilina y prototrofia a la biotina,
se seleccionaron de la misma forma que la que se ha descrito en el
ejemplo 1-2. Los transformantes, se cultivaron a una
temperatura de 37ºC, durante el transcurso de toda la noche, en
medio LB, con 100 \mug/ml de ampicilina y, las células
bacterianas, se recolectaron mediante centrifugación. El plásmido
híbrido, se extrajo de las células, mediante el procedimiento de
desnaturalización alcalina. El plásmido híbrido, tenía un fragmento
de inserto de DNA de 7,87 Kb, y se designó como pKB200. Los modelos
patrones de segmentación del pKB200, se analizaron utilizando varias
endonucleasas de restricción (HindIII, NeoI, EcoRI, BglII, SalI, y
PstI) y se compararon con los del pKB100. El análisis de restricción
de endonucleasa, reveló el hecho de que, los dos plásmidos híbridos,
tenían exactamente los mismos sitios de segmentación y que, el
fragmento de DNA de 1,5 Kb, se extendía hacia el lado izquierdo del
pKB100 y, el fragmento de 0,8 KB, se extendía hacia el lado derecho,
en el pKB200 (figuras 1 y 3).
El pKB200, se transfirió a los mutantes
deficientes en biotina, de Escherichia coli,
R875(BioB^{-}), W602(BioA^{-}),
R878(BioC^{-}), R877(bioD^{-}),
R874(bioF^{-}), o BM7086(bioH^{-}). Se realizó un
análisis de complementación, mediante el procedimiento descrito en
el ejemplo 1 - 3. El pKB200, complementaba los mutantes bioD y bioB,
pero no los mutantes bioA, bioC, bioF y bioH, tal y como se muestra
en la Tabla 1. Si bien el pKB200 se solapaba sobre la totalidad de
la longitud del pKB100, el pKB200, no complementaba el mutante
bioF.
Se procedió a transferir la biblioteca genómica
de Kurthia sp 538-KA26 del ejemplo
1-1, al mutante de Escherichia coli,
deficiente en bioH, BM7086. Los transformantes que tenían el clon
bioH, se seleccionaron para la prototrofia a la biotina, de la misma
forma que la que se ha descrito en el ejemplo 1-2.
Los plásmidos híbridos, se extrajeron de las células transformadas
mediante el procedimiento de desnaturalización alcalina y se
analizaron mediante enzimas de restricción. El plásmido híbrido,
tenía un fragmento insertado de DNA, de 1,91 Kb, y se designó
pKH100, Puesto que, la biblioteca genómica utilizada anteriormente,
arriba, tiene 5 - 15 Kb de fragmentos genómicos de DNA, se pensó en
someter a una modificación el fragmento pKH100, tal como deleción,
en la cepa de Escherichia coli. El mapa de restricción del
pKH100, se muestra en las figuras 4 y 5. Los modelos patrón del
pKH100, eran completamente diferentes de los del pKB100 y pKB200.
Así, por lo tanto, el pKH100, porta un fragmento de DNA del
cromosoma de Kurthia, el cual difiere de los que se
encuentran en el pKB100 y pKB200.
Se realizó un análisis de complementación
mediante el procedimiento descrito en los ejemplos 1 - 3. El pKH100,
se transfirió a los mutantes deficientes en biotina, de
Escherichia coli, R875(BioB^{-}),
W602(BioA^{-}), R878(BioC^{-}),
R877(bioD^{-}), R874(bioF^{-}), o
BM7086(bioH^{-}). El pKH100, complemantaba únicamente al
mutante bioH, pero no a los mutantes bioB, bioA, bioC y bioF, tal y
como se muestra en la Tabla 1. Así, de esta forma, el pKH, porta
el gen bioH.
Se procedió a transferir la biblioteca genómica
de Kurthia sp 538-KA26 del ejemplo
1-1, al mutante de Escherichia coli,
deficiente en bioC, R878. Los transformantes con el clon bioC, se
seleccionaron para la prototrofia a la biotina, de la misma forma
que la que se ha descrito en el ejemplo 1-2. El
plásmido híbrido, se extrajo de las células transformadas mediante
el procedimiento de desnaturalización alcalina y se analizó mediante
enzimas de restricción. El plásmido híbrido, tenía un fragmento
insertado de DNA, de 6,76 Kb, y se designó pKC100. El mapa de
restricción del pKC00, se muestra en las figuras 6 y 7.
Los modelos patrón del pKC100, eran completamente
diferentes de los del pKB100, pKB200 y pKH100. Así, por lo tanto, el
pKC100, porta una diferente región del cromosoma de Kurthia,
con respecto a las de los pKB100, pKB200 y pKH100.
Se realizó un análisis de complementación
mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 1 - 3. El pKC100,
se transfirió a los mutantes deficientes en biotina, de
Escherichia coli, R875(BioB^{-}),
W602(BioA^{-}), R878(BioC^{-}),
R877(bioD^{-}), R874(bioF^{-}), o
BM7086(bioH^{-}). El pKC100, complemantaba a los mutantes
bioC, bioF y bioH, tal y como se muestra en la tabla 1. Puesto que
el fragmento insertado de DNA, en el pKH100, era diferente de los
del pKB100 y pKH100, el pKC100, porta no únicamente el gen bioC,
sino también genes para isozimas del producto del gen de bioF (KAPA
sintetasa) y el producto del gen bioH.
Se procedió a aislar la región izquierda del DNA
cromosómico en el pKB200 procedente de DNA cromosómico de la
Kurthia sp. 538-KA26, mediante el
procedimiento de hibridación. El DNA íntegro de Kurthia sp.
538-KA26, se digirió completamente con HindIII, y se
sometió a electroforesis de gel de agarosa. Los fragmentos de DNA
sobre el gel, se desnaturalizaron y, a continuación, se
transfirieron a una membrana de nylon (Hybond-N,
Amersham), en concordancia con las recomendaciones del
fabricante.
El plásmido pKB200, se digirió completamente con
NcoI y se aisló un fragmento de NcoI de 2,1 Kb, mediante
electroforesis en gel de agarosa (figura 1). El fragmento de NcoI,
se marcó con ^{32}P, mediante el sistema de marcación de DNA
Multiprime (Amersham) y se utilizó como una sonda de hibridación. La
hibridación, se realizó sobre la membrana preparada anteriormente,
arriba, utilizando el "Rapid Hibridation buffer", - tampón de
hibridación rápida -, (Amersham), en concordancia con las
instrucciones del fabricante. La sonda, hibridó fuertemente a un
fragmento de HindIII, de aproximadamente 8,5Kb.
Con objeto de aislar el fragmento de 8,5 kb, El
DNA íntegro de Kurthia sp. 538-KA26, se
digirió completamente con HindIII, y se obtuvieron fragmentos de
DNA, mediante electroforesis de gel de agarosa. El plásmido vector
pUC19 (Takara Shuzo Co.), se digirió completamente con HindIII, se
trató con fosfatasa alcalina, con objeto de evitar la autoligadura.
Los fragmentos de DNA de 7,5 - 9,5 Kb, se ligaron con los del pUC19
segmentado, utilizando un equipo de ligadura, a modo de kit (Takara
Shuzo Co.) y, la mezcla de reacción, se transfirió a Escherichia
coli JM109, mediante el procedimiento competente de la célula.
Se obtuvieron aproximadamente 1.000 clones individuales que portaban
tales tipos de fragmentos genómicos de DNA, como una biblioteca
genómica.
La selección, se llevó a cabo mediante el
procedimiento de hibridación de colonias, en concordancia con el
protocolo descrito por parte de Maniatiset al. [Molecular
Cloning, - Clonación molecular -, Cold Spring Harbor Laboratory, 312
- 328, (1982)]. La colonias que crecieron en placas de agar, se
transfirieron a membranas de nylon (Hybond-N.
Amsersham) y se lisaron mediante álcali. El DNA desnaturalizado, se
inmovilizó sobre las membranas. Los fragmentos de NcoI, marcados con
^{32}P, preparados según se describe anteriormente, arriba, se
utilizaron como una sonda de hibridación y, la hibridación, se
realizó utilizando el sistema "Rapid Hibridation buffer", -
tampón de hibridación rápida -, (Amersham), en concordancia con las
instrucciones del fabricante. Se obtuvieron tres colonias, la cuales
hibridaron con el DNA de la sonda, y se extrajeron plásmidos
híbridos de estas colonias, mediante el procedimiento de
desnaturalización alcalina.
El análisis de la estructura, se realizó con
enzimas de restricción (BAMHI, HindIII, NcoI, EcoRI, BglII, SalI y
PstI). La totalidad de los tres plásmidos híbridos, tenían un
fragmento insertado de DNA, de 8,44 Kb y, los tres plásmidos
híbridos, tenían exactamente los mismos modelos patrón de
segmentación. Estos resultados, indican que, éstos, eran idénticos.
El plásmido híbrido, se designó pKB300. El mapa de restricción de
pKB300, se muestra en la figura 1. Aproximadamente la mitad de la
longitud del fragmento genómico de DNA, en el pKB300, se solapa con
la del pKB200.
El análisis de complementación de Escherichia
coli W602 (bioA^{-}) con pKB300, se realizó mediante el
procedimiento descrito en el ejemplo 1 - 3. Puesto que el pKB300
complementaba la mutación de la bioA (Tabla 1), el pKB300, porta el
gen bioA de Kurthia sp.
Se procedió a digerir completamente el pKB100 con
Hind III, y se aisló un fragmento de HindIII de 3,3 Kb. El fragmento
de 3,3 Kb, se ligó con el vector pUC18 (Takara Shuzo Co.), se
segmentó con HindIII utilizando un equipo a modo de kit, de ligadura
de DNA, para construir los plásmidos híbridos pKB103 y pKB104. En
los pKB103 y pKB104, los fragmentos de 3,3 Kb, se insertaron en
ambas direcciones, relativas al operador del promotor del gen
faltante en pUC18. El mapa de restricción, se muestra en la figura
8.
La complementación de los mutantes de
Escherichia coli deficientes en bioB o bioF, (R875 o R874),
respectivamente, se realizaron de la misma forma que la que se ha
descrito en el ejemplo 1 - 3. El pKB103 y pKB104, complementaban los
mutantes de bioB y bioF (tabla 2).
Puesto que, el pKB200 complementaba la mutación
de biotina y cubría la totalidad de la longitud del pkB100 que porta
los genes bioB y bioF, se construyó una serie de mutaciones de
deleción de pKB200, para localizar de una forma más precisa bioB,
bioD y bioF. Se insertó un fragmento de SalI-HindIII
de 4,0 Kb, de pKB200, en los sitios SalI y HindIII de pUC19, para
proporcionar pKB221 y pKB222, en los cuales, el fragmento
SalI-HindIII, se emplazó en ambas orientaciones.
El pKB200, se digirió completamente con NruI, y
se aisló un fragmento de Nrul de 7,5 Kb, mediante electroforesis en
gel de agarosa. El fragmento de Nrul, se recirculó mediante un
equipo, a modo de kit de ligadura de DNA, y se obtuvo el pKB223.
El pKB200, se digirió completamente con HindIII.
Se aisló un fragmento de HindIII de 4,8 Kb, mediante electroforesis
en gel de agarosa y se clonó en el sitio de HindIII del pUC18, en
ambas direcciones, con objeto de generar pKB224 y pKB225.
\newpage
El pKB200, se digirió parcialmente con NcoI, y se
aisló un fragmento de NcoI de 3,1 Kb, mediante electroforesis en gel
de agarosa. Los finales del fragmento de NcoI, se convirtieron en
despuntados, mediante un fragmento de Klenow de la DNA polimerasa I
(Takara Shuzo Co.) y se ligaron con engarces de HindIII (Talara
Shuzo Co.). El fragmento de HindIII, de 3,1 Kb, se obtuvo mediante
tratamiento con HindIII y se clonó en el sitio de Hind del pUC19, en
ambas direcciones, para proporcionar pKB228 y pKB229.
De la misma forma, ambos finales del fragmento de
NcoI de 2,1 Kb, de pKB200, se convirtieron en sitios HindIII,
mediante tratamiento con fragmento de Klenow y adición de engarces
de HindIII. A continuación, el fragmento de HindIII obtenido, se
insertó en el sitio de HindIII de pUC19, en ambas direcciones, para
proporcionar pKB230 y pKB231.
El pKB2345 y el PkB235, se generaron mediante la
inserción de un fragmento HindIII-NruI de pKB230, de
1,6 Kb, en los sitios HindIII y SmalI de pUC19 y pUC18,
respectivamente.
Los mapas de restricción del los derivados de
pKB200, se muestran en la figura 8.
Se realizaron análisis de complementación con los
derivados de pKB200, de la misma forma que la que se ha descrito en
el ejemplo 1 - 3. Los resultados de complementación, se recopilan en
la tabla 2. El mutante deficiente en bioB, se complementó mediante
pkB221, pKB222, pKB224, pKB225, pero no con pKB223, pKB228, pKB229,
pKB230, pKB231, pKB234 y pKB235. El mutante deficiente en bioF, se
complementó mediante pKB223, pKB224, pKB225, pKB228 y pKB229, pero
no mediante pKB221, pKB222, pKB230, pKB231, pKB234 y pKB235. Por
otro lado, el muntante deficiente en bioD, se complementó mediante
pKB223, pKB224 y pKB225, pero no con pKB221 y pKB222.
Conjuntamente con el análisis de complementación
con pKB103 y pKB104, estos resultados apoyan el hecho de que, el gen
bioF, se encuentra presente en el lado izquierdo del primer sitio de
NruI, sobre el pKB103, mientras que, el gen bioB, se encuentra
localizado en el lado derecho del mismo sitio de NruI, con un
soporte solapado hacia la izquierda, y que, el gen bioD, se
encuentra presente sobre, como mucho, la región del lado izquierdo
de 1,5 Kb, del pKB200. Así, de este modo, los resultados de
complementación con varios derivados de pKB100 y pKB200, mostraban
el hecho de que, los genes bioD, bioF y bioB, yacen, a su vez, sobre
la región de 4,4 Kb, de lado izquierdo del sitio HindIII de
pKB200.
Con objeto de determinar la localización del gen
bioA, se construyó el derivado del pKB300. El pKB361, se generó
mediante la inserción de un fragmento de BamHI-SalI
de 2,8 Kb, de pKB300, en los sitios de BamHI y SalI de uUC19 (figura
8).
El pKB361, se transfirió al mutante deficiente en
bioA de Escherichia coli (W602), y se realizó un análisis de
complementación, de la misma forma que la que se ha descrito en el
ejemplo 1 - 3. El mutante de bioA, se complementó mediante pKB361
(tabla 2), sugiriendo la presencia del gen bioA, en la región de 2,8
Kb, entre los sitios BamHI y SalI de pKB300.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Se procedió a digerir completamente el pKB100 con
BamIII, y se recirculó con un equipo, a modo de kit, de ligadura de
DNA, para generar pKH101, el cual, era un producto de deleción a
partir del pKH100 (figura 4). EL pKH102, se construyó a partir del
pKH100, mediante tratamiento con HindIII, seguido mediante
recirculación con un equipo a modo de kit de ligadura de DNA. El
pKH102, carecía de un fragmento de HindIII de 1,07 kb, en el pKH100
(figura 4).
El análisis de complementación del mutante de
bioH (R878), de Escherichia coli, se realizó con pKH101 y
pKH102, de la misma forma que en el ejemplo 1 - 3. El pKH101,
complementó el mutante de bioH, pero no el pKH102 (figura 4). Los
resultados, indicaban que, el gen bioH, se encuentra localizado en
la región izquierda (1,16 Kb) del sitio de BamHI, sobre el
pKH100.
El pKB100, se digirió completamente con BamHI, y
se aisló un fragmento de BamHI de 1,81 Kb, mediante electroforesis
en gel de agarosa. El fragmento de BamHI, se ligó con pBR322,
tratado con BamHI y el fragmento de Klenow, mediante un equipo, a
modo de kit de ligadura de DNA. Finalmente, se obtuvieron el pKC101
y pKC102, en los cuales, el fragmento de BamHI, se insertó en ambas
direcciones (figura 6).
El pKC101 y pKC102, se transfirieron al mutante
bioC R878 de Escherichia coli, y se llevó a cabo un análisis
de complementación, de la misma forma que en el ejemplo 1 - 3. El
mutante bioC, se complementó con pKC01 y pKC102 y, el gen bioC, se
confirmó que yacía en el fragmento de BamHI de 1,81 kb.
Para el análisis de secuenciación de los
fragmentos de DNA insertados de los pKB100, pKB200 y pKB300, se
construyeron varios subclones que se solapaban mutuamente,
utilizando pUC18, pUC19, M13mp18 y M13mp19 (Takara Shuzo Co.) y se
obtuvo una serie de derivados de deleción de los subclones, mediante
el equipo a modo de kit de deleción de secuenciación, del tipo
Kilo-Secuencing Deletion kit (Takara Shuzo Co.). A
continuación, se procedió a llevar a cabo un análisis de
secuenciación de nucleótidos de los derivados de deleción, mediante
la técnica de terminación de la cadena didedoxi (Versión del kit de
secuenciación de DNA, correspondiente el modelo Sequenase version
2,0, utilizando 4-deaza-dGTP, United
States Biochemical Co.). Los resultados, se analizaron mediante el
programa de computadora (GENETYX), de la firma Software Development
Co.
El análisis computerizado de esta secuencia,
reveló el hecho de que, el fragmento clonado de DNA, tenía la
capacidad de codificar para seis estructuras de lectura abierta (ORF
- del inglés, open reading frames -). Este gen operón, tiene dos
cúmulos de genes procedentes de ambas direcciones (Fig.
9-A).
La primera ORF en el cúmulo de genes izquierdo,
se inicia con el codón TTG, precedido mediante un sitio de enlace
ribosómico (RBS, del inglés - ribosomal binding site -), con
homología al final 3' del Bacillus subtitilis 16S rRNA, y
codifica para una proteína de 194 residuos de aminoácidos, la cual
tiene un peso molecular de 21.561. No fue posible el determinar la
función del producto de genes, mediante el análisis de
complementación y, en concordancia con ello, esta ORF, se denominó
ORF1.
La secuencia de nucleótidos de la segunda ORF, en
el cúmulo de genes izquierdo, se muestra en la SEQ ID No. 1. Este
gen, codifica para una proteína de 236 residuos de aminoácidos, con
un peso molecular de 26,642. La secuencia de aminoácidos
pronosticada de este producto de genes, se muestra en la SEQ ID No.
2. Se encuentra un RBS putativo, corriente arriba del codón de
iniciación de ATG. El análisis de complementación (Ejemplo 6 - 3),
mostró que, esta ORF, es el gen bioD.
La tercera ORF, en el cúmulo de genes izquierdo,
tiene un RBS putativo corriente arriba del codón de iniciación ATG
y, la secuencia de nucleótidos de este gen, se muestra en la SEQ ID
No. 3. Este gen, codifica para una proteína de 460 residuos de
aminoácidos, con un peso molecular de 51.731. La secuencia de
aminoácidos pronosticada de este producto de genes, se muestra en la
SEQ ID No. 4. Se confirmó el hecho de que, esta OEF, correspondía al
gen bioA (Ejemplo 6 - 3). Se encontró que, una secuencia inversa, se
encontraba localizada aproximadamente 3 pb corriente debajo del
codón de terminación. Esta estructura, puede actuar como un
terminador transcripcional.
La primera ORF, en el cúmulo de genes derecho,
denominada ORF2, se inicia en el codón ATG, precedido por un RBS
putativo. Este producto de genes, es una proteína consistente en
residuos de 63 aminoácidos y, el peso molecular calculado, es de
7.477. No pudimos identificar la función de este producto de genes,
mediante el análisis de complementación, y la búsqueda de homología
de la secuencia de aminoácidos. En concordancia con ello, esta ORF,
se denominó ORF2.
La secuencia de nucleótidos de la segunda ORF, en
el cúmulo derecho de genes, se muestra en la SEQ ID No. 5. Este gen,
tiene tres codones ATG potenciales de iniciación, correspondientes a
los residuos de aminoácidos primero, vigésimo sexto y trigésimo
segundo. El análisis de complementación (Ejemplo 6 - 3), mostró el
hecho de que, esta ORF, corresponde al gen bioF. La secuencia de
aminoácidos pronosticada de este productos de genes, se muestra en
la SEQ ID No. 6. El peso molecular de la proteína pronosticada, con
387 residuos de aminoácidos, se calculó que era de 42.619,
iniciándose desde el primer codón de iniciación.
La tercera ORF, en el cúmulo de genes derecho,
tal y como se muestra en la SEQ ID No. 7, tiene tres codones
potenciales de iniciación, dos codones ATG (los residuos de
aminoácidos primero y décimo octavo) y un codón GTG (el décimo
segundo residuo de aminoácido). La secuencia de aminoácidos
pronosticada de este producto de genes, se muestra en la SEQ ID
No.8. El peso molecular de la proteína pronosticada, con 338
residuos de aminoácidos, trasladada desde el primer codón de
iniciación, se calculó que era el de 37.438. El análisis de
complementación (Ejemplo
6 - 3), mostró el hecho de que, esta ORF, correspondía al gen bioB. La presencia de una secuencia de repetitiva inversa, de 16 pb, corriente debajo del codón de terminación, es característica de un terminador transcripcional.
6 - 3), mostró el hecho de que, esta ORF, correspondía al gen bioB. La presencia de una secuencia de repetitiva inversa, de 16 pb, corriente debajo del codón de terminación, es característica de un terminador transcripcional.
Existían dos posibles secuencias promotoras que
formaban promotores frente a frente, entre las ORF1 y ORF2, tal y
como se muestra en la figura 10. Las transcripciones, procedieron
hacia la izquierda, hacia el interior del cúmulo de genes de ORF1,
bioD y bioA, y hacia la derecha, hacia el interior del cúmulo de
genes, de ORF2, bioF y bioB. Adicionalmente a lo anteriormente
expuesto, se encontraban localizadas dos terminadores
trascripcionales, corriente abajo de los codones de terminación de
los genes bioA y bioB. Así, por lo tanto, las transcripciones, en
ambas direcciones, generaron dos mRNAs diferentes.
Se encontraron dos componentes, en las secuencias
repetitivas inversas, Box1 y Box2, entre el sitio de iniciación de
los genes ORF1 y ORF2 (figura 10). La homología en su totalidad,
para el Box1 y Box2, era del 82,5%. La comparación del Box1 o Box2
con el operón de biotina de Escherichia coli [Nature,
276, 689-694, (1978)], mostraba el hecho de
que, existe un alto nivel de conservación (54% de homología, para
ambos). Las similitudes entre dos secuencias repetitivas inversas
del operador de biotina de Escherichia coli, sugieren el
hecho de que, el Box1 y Box2, deben encontrarse involucrados en el
control negativo de la síntesis de biotina mediante biotina.
El análisis de la secuencia de nucleótidos en el
fragmento insertado de DNA, de pKH100, se realizó de la misma forma
que la que se ha descrito en el ejemplo 9. Se encontró un cúmulo de
genes que contenía dos ORFs, sobre el fragmento insertado de DNA
(Figura 9 - B). Adicionalmente a ello, se confirmó el hecho de que,
una parte del plásmido vector pBR322, y el fragmento de DNA habían
sido objeto de deleción.
La primera ORF, tal y como se muestra en la SEQ
ID No.9, codifica para una proteína de 267 residuos de aminoácidos
y, el peso molecular calculado, era de 29.423. La secuencia de
aminoácidos seleccionada, de este producto de genes, se muestra en
la SEQ ID No. 10. Un RBS putativo, se encuentra localizado a 6 pb
corriente arriba del codón de iniciación ATG. El análisis de
complementación, tal y como se muestra en la figura 7, indicaba que,
esta ORF, correspondía al gen bioH.
La segunda ORF, con un RBS potencial, se encontró
corriente abajo del gen bioH. La ORF, codifica para una proteína de
86 residuos de aminoácidos, con un peso molecular de 9.955. La
proteína, codificada por la ORF, no mostraba homología con los
productos de genes de biotina de Escherichia coli y
Bacillus sphaericus. La ORF, se denominó ORF3.
Se encontró una posible secuencia promotora,
corriente arriba del codón de iniciación del gen bioH, tal y como se
muestra en la Figura 11. Puesto que no se encontró una secuencia
repetitiva inversa, tal como Box1 y Box2, en la región no
codificante 5' del gen bioH, la transcripción de este cúmulo de
genes, no debe ser regulada. Además, existe una secuencia repetitiva
inversa, solapando con el codón de terminación de ORF3. Puesto que
esta estructura es capaz de actuar como un terminador
transcripcional, el promotor bioH putativo, permitiría, por lo
tanto, la transcripción de los genes bioH y ORF3.
El análisis de la secuencia de nucleótidos del
fragmento insertado de DNA, se realizó de la misma forma que la que
se ha descrito en el ejemplo 9. Se encontró un cúmulo de genes
consistente en tres ORFs, en el fragmento insertado de DNA (figura
9-C).
La tercera ORF, tiene un RBS putativo, corriente
arriba del codón de iniciación y, la secuencia de nucleótidos de
este gen, se muestra en la SEQ ID No. 15. Este gen, codifica para
una proteína de 276 residuos de aminoácidos y, el peso molecular
calculado, es de 31,599. La secuencia de aminoácidos pronosticada de
este producto de genes, se muestra en la SEQ ID No. 16. El análisis
de complementación, se muestra en el ejemplo 8, indicando que, esta
ORF, corresponde al gen bioC.
La primera ORF, tal y como se muestra en la SEQ
ID No. 11, codifica para una proteína de 398 residuos de
aminoácidos, con un peso molecular de 44.776. Se encuentra
localizado un RBS putativo, corriente arriba del codón de
iniciación. La secuencia de nucleótidos pronosticada, de este gen,
tal y como se muestra en la SEQ ID No. 12, tiene un 43% de homología
con la del producto de genes de Kurthia sp.
538-KA26 en el ejemplo 9. Además, el pKC100,
complementaba al mutante bioF de Escherichia coli, tal y como
se muestra en la figura 4. Así, por lo tanto, se concluyó que, esta
ORF, era un gen para una isozima del producto de genes bioF, KAPA
sintetasa. Así, por lo tanto, esta ORF, se denominó gen bioFII.
La segunda ORF, tal y como se muestra en la SEQ
ID No. 13, tiene un RBS putativo, corriente arriba del codón de
iniciación. Este gen, codifica para una proteína de 248 residuos de
aminoácidos, con un peso molecular de 28.629. La secuencia de
aminoácidos pronosticada de este producto de genes, tal y como se
muestra en la SEQ ID No. 14, tiene un 24,2% de homología con la del
producto de genes de Kurthia sp. 538-KA26 en
el ejemplo 10. Tal y como se muestra en la figura 4, el pKC100,
complementaba también al mutante bioH de Escherichia coli.
Estos resultados, mostraban que, esta ORF, es un gen para una
isozima del producto de genes bioH y, por lo tanto, esta ORF, se
denominó gen bioHII.
Una posible secuencia de promotor, se encontró
corriente arriba del codón de iniciación del gen bioFII, tal y como
se muestra en la figura 12. Se encuentra localizada una secuencia
inversa entre la secuencia de promotor y el RBS del gen bioFII. Esa
secuencia de repetición inversa, designada como Box3, se comparó con
la Box1 y Box2, localizadas entre los genes ORF1 Y la ORF2 (ejemplo
9). Los Box1, Box2 y Box3, eran extremadamente similares el uno con
el otro (la homología de Box1 y Box3, era de un 80,0% y, la del Box2
y Box3, era del 77,5%. Así, por lo tanto, el cúmulo del gen bioC,
debe regularizarse mediante un control negativo, de una forma
similar al cúmulo de bioA y el cúmulo de bioB. Adicionalmente a
ello, existe una secuencia repetitiva inversa de 254 pb, corriente
abajo del codón de terminación del gen bioC. La estructura, se cree
que actúa como un terminador transcripcional.
Se procedió a construir un vector lanzadera para
Escherichia coli y Kurthia sp., mediante la estrategia
que se muestra en la figura 13. El plásmido Staphiloccus aureus
pUB110 (Bacillus Genetic Stock Center; The Ohio State University,
Department of Biochemistry, 484 West Twelfh Avenue, Columbus, Ohio
43210, USA), se digirió completamente con EcoRI y PvuII. Se aisló un
fragmento de EcoRI-PvuII, que contiene el origen de
replicación de Kurthia sp. y, el gen resistente a la
kanamicina, se aisló mediante electroforesis en gel de agarosa. El
pUC19, se digirió completamente con EcoRI y DraI y, el fragmento de
EcoRI-DraI de 1,2 Kb, que tenía el origen de
replicación de Escherichia coli, se aisló mediante
electroforesis en gel de agarosa. Así, de esta forma, estos
fragmentos, se ligaron con un equipo, a modo de kit, de ligadura de
DNA, para generar el vector lanzadera pYK1. El pK1, puede replicar
en Escherichia coli y Kurthia sp. y Escherichia
coli o Kurthia sp., transformada mediante pYK1, muestra
resistencia a la Kanamicina.
El YK114, en el cual, el gen bioB de
Kurthia, se insertó corriente abajo del promotor del gen bioH
de Kurthia, se construyó mediante la estrategia tal como se
muestra en la figura 14. El pKH101 del ejemplo 7, se digirió
completamente con BanII y, los finales de los fragmentos de BamII,
se embotaron con el fragmento de Klenow de la DNA polimerasa. A
continuación, los fragmentos de BamII, se trataron con EcoRI, y se
aisló un fragmento embotado de EcoRI de 0,6 Kb, que contenía el
promotor bioH, mediante electroforesis en gel de agarosa. El pKB104
del ejemplo 6, se digirió completamente con KpnI y, los finales del
KpnI, se cambiaron a finales embotados, mediante tratamiento con el
fragmento de Klenow. Después de la digestión con HindIII, se aisló
un fragmento despuntado de HindIII, de 1,3 Kb, que portaba el gen
bioB, mediante electroforesis en gel de agarosa. Los fragmentos
embotados de EcoRI, y de HindIII despuntado, se ligaron con pYK1,
digerido con EcoRI y HindIII, para construir pYK11. El gen bioB, se
expresa, de una forma constructiva, bajo el promotor bioH procedente
de pYK114.
Se procedió a cultivar la Kurthia sp.
538-51F9 (DSM No. 10610), a una temperatura de 28ºC,
en 50 ml de caldo de soja Tripticasa (Becton Dickinson), hasta una
densidad óptica, a 600 nm (OD_{600}) de 1,0. Se recolectaron las
células crecidas, mediante centrifugación, y se suspendieron en SMM
(0,5 M sucrosa, 0,02 M maleato sódico, 0,02 M MgCl_{2} 6H_{2}O;
Ph 6,5) a OD_{600} 16. A continuación, se añadió lisozima (Sigma),
a la suspensión de células, a 200 \mug/ml y, la suspensión, se
incubó a una temperatura de 30ºC, durante un transcurso de tiempo de
90 minutos, para formar protoplastos. Después de que los
protoplastos se hubieran lavado con SMM, dos veces, éstos se
suspendieron en 0,5 ml de SMM. Se añadió una solución de 1,5 ml de
PEG (30%, peso / volumen, polietilenglicol 400 en SMM), a la
suspensión de protoplasto y, la suspensión, se incubó durante un
transcurso de tiempo de 2 minutos, en hielo. A continuación, se
añadieron 6 ml de SMM y, los protoplastos, se recolectaron mediante
centrifugación. Los protoplastos recolectados, se suspendieron en
SMM, y se incubaron a una temperatura de30ºC, durante un transcurso
de tiempo de 90 minutos. Se añadió medio DM3 (0,5 M succinato sódico
pH 7,3, 0,5% peso / volumen casaminoácido, 0,5% peso / volumen
extracto de levadura, 0,3% peso / volumen de KH_{2}PO_{4}, 0,7%
peso / volumen de K_{2}HPO_{4}, 0,5%
\hbox{peso /}volumen glucosa, 0,02 M MgCl_{2} 6H_{2}O, 0,01% peso / volumen de albúmina de célula bobina), con un contenido de un 0,6% de agarosa (Sigma; tipo VII), a la suspensión de protoplasto y, la suspensión, se sobrepuso sobre placas de agar de medio DM3. Las placas, se incubaron a una temperatura de 30ºC, durante un transcurso de tiempo de 3 días. En total, se obtuvieron 65 colonias, regeneradas sobre las placas de DM3.
La eficiencia de transformación de las cepas
regeneradas, se investigó con pYK1 del ejemplo 12. Como resultado de
ello, se seleccionaron 40 cepas, y se cultivaron a una temperatura
de 28ºC, en 50 ml de caldo se soja tripticasa, hasta que el
OD_{600}, era 1,0. Se recolectaron células crecidas, mediante
suspensión en SMM, a OD_{600}16. A continuación, las células, se
trataron con lisozima, mediante el procedimiento descrito
anteriormente, arriba, y se obtuvieron los protoplastos. Los
protoplastos, se suspendieron en 0,5 ml de SMM, y se añadió pYK1 (1
\mug), a las suspensiones de protoplasto. Después de la adición de
1,5 ml de una solución de PEG, las suspensiones, se incubaron
durante un transcurso de tiempo de 2 minutos, en hielo, se añadieron
6 ml de SMM y, a continuación, los protoplatos, se recolectaron
mediante centrifugación. A continuación, los protoplastos, se
suspendieron en SMM, y se incubaron a una temperatura de 30ºC,
durante un transcurso de tiempo de 30 minutos. El medio DM3, con un
contenido del 0,6% de agarosa, se añadió a las suspensiones de
protoplastos y, las suspensiones, se sobrepusieron en placas de
agar, del medio DM3. Las placas, se incubaron a una temperatura de
30ºC, durante un transcurso de tiempo de 3 días. La
DM3-agarosa, incluyendo las colonias regeneradas
sobre las placas, se recolectaron y se diseminaron sobre las placas
de agar del caldo nutriente, con 5 \mug/ml de kanamicina, para
seleccionar los transformantes. Las placas, se incubaron durante el
transcurso de toda la noche, a una temperatura de 30ºC. Finalmente,
se obtuvo la cepa derivada, Kurthia sp.
538-51F9-RG21, caracterizada por una
alta eficiencia de transformación (2.000 transformantes por \mug
de DNA).
El plásmido de expresión del gen bioB de la cepa
Kurthia, pYK114, se construyó de la forma que se describe en el
ejemplo 13. La Kurthia sp.
538-51F9-RG21, se transformó con
pYK114 y, el plásmido vector pYK1, tal y como se describe en el
ejemplo 14. La Kurthia sp
538-51F9-RG21, que portaba el PYK1 o
el pYK114, se denominó Kurthia
sp.538-51F9-RG21 (pYK1) o
Kurthia sp. 538-51F9-RG21
(pYK114), respectivamente.
Se procedió a inocular Kurthia
sp.538-51F9-RG21 (pYK1) y
Kurthia sp. 538-51F9-RG21
(pYK114), en 50 ml del medio de producción (6% de glicerol, 4,5% de
proteasa peptona, 0,1% KH_{2}PO_{4}, 0,05% MgSO_{4} 7H_{2}O,
0,05% FeSO_{4} 7H_{2}O, 0,001% MnSO_{4}5H_{2}O; pH 7,0), con
un contenido de 5 \mug/ml de kanamicina. Como control, se aisló
Kurthia sp. 538-51F9-RG21, en
50 ml del medio de producción. El cultivo, se llevó a cabo a una
temperatura de 28ºC, durante 120 horas.
Después del cultivo, se centrifugaron 2 ml del
caldo de cultivo, para retirar las células bacterianas, y se obtuvo
el sobrenadante. Se procedió a someter a tets de ensayo la
producción de biotina en el sobrenadante, mediante el test de ensayo
microbiológico, utilizando Lactobacillus Plantarum (ATCC 8014). Las
cantidades de biotina producida, se proporcionan en la tabla 3.
Cepa de Kurthia sp. | Producción de biotina (mg/l) |
51F9-RG21 | 15,4 |
51F9-RG21 (pYK1) | 14,3 |
51F9-RG21 (pYK114) | 39,1 |
Claims (6)
1. Una secuencia de DNA que codifica a un
polipéptido representado mediante las SEQ ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10,
12, 14 ó 16.
2. Una secuencia de DNA, que comprende una
secuencia de DNA seleccionada entre el grupo consistente en la SEQ
ID No. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 y 15.
3. Un vector que comprende una o más secuencias
de DNA, tal y como se define en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2.
4. Un vector tal y como se define en la
reivindicación 3, en donde, las citadas secuencias de DNA, se
encuentran funcionalmente enlazadas a secuencia(s) de
promotores.
5. Una célula transformada mediante una o más
secuencias de DNA, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2,
o vector(es), tal y como se define en las reivindicaciones 3
ó 4.
6. Un procedimiento para la producción de
biotina, el cual comprende el cultivar la célula, tal y como se
define en la reivindicación 5, en un medio, y aislar la biotina
resultante, a partir del medio de cultivo, mediante procedimientos
conocidos en el arte de la técnica especializada.
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