ES2229347T3 - Purificacion del activador del plasminogeno tisular tpa. - Google Patents
Purificacion del activador del plasminogeno tisular tpa.Info
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Abstract
SE EXPONE UN PROCEDIMIENTO PARA OBTENER ENLACES DE AFINIDAD PARA AISLAR EL ACTIVADOR TISULAR DEL PLASMINOGENO (TPA). SE EXPONEN ENLACES DE UNION TPA CON ALTA ESPECIFICIDAD PARA PH7, Y LIBERANDO TPA PARA PH5 O INFERIOR. SE EXPONEN TAMBIEN PROCEDIMIENTOS EN DONDE ENLACES ADICIONALES CON UNAS CARACTERISTICAS PRESELECCIONADAS DE ENLACES Y LIBERACION (ELUCION) PUEDEN SER AISLADAS, PERMITIENDO EL DESARROLLO DE ENLACES A LA MEDIDA PARA QUE CUMPLAN LOS PROBLEMAS DE PURIFICACION PRESENTADOS POR CUALQUIER FLUJO DE ALIMENTACION CONTENIENDO TPA.
Description
Purificación del activador del plasminógeno
tisular tPA.
La presente invención se refiere al campo de la
purificación de proteínas. Específicamente, la presente invención se
refiere al descubrimiento y aislamiento de ligandos de afinidad
útiles para la purificación del activador de plasminógeno tisular o
tPA.
El activador de plasminógeno de tipo tisular
humano, o tPA, es una enzima proteolítica producida por las células
endoteliales que tiene una afinidad elevada por la fibrina contenida
en los agregados de sangre coagulada (es decir, coágulos o
"trombos"). El tPA también es útil para activar y convertir el
plasminógeno, una proenzima inactiva, en plasmina, una enzima
trombolítica. Dado que el tPA se une a la fibrina en los trombos
donde activa el plasminógeno para disolver los coágulos, el tPA se
ha convertido en un importante fármaco para usar como
trombolítico.
Aunque el tPA se ha convertido en uno de los
principales fármacos en el tratamiento de la trombosis, compite con
otros agentes trombolíticos eficaces, tales como la estreptoquinasa
y la uroquinasa, que probablemente son menos eficaces pero mucho más
baratos. Con el fin de que el tPA se mantenga entre los agentes
trombolíticos más prescritos o que se distribuya a un número todavía
mayor de pacientes deben explorarse formas de producir tPA de un
modo más eficaz o a un menor coste.
Un medio eficaz para eliminar las impurezas tales
como restos celulares, patógenos, proteínas no humanas, etc. de una
corriente de alimentación de producción, es también importante en la
producción de tPA, como también lo es con cualquier producto
proteico pensado, en último término, para la administración
terapéutica a pacientes humanos.
Por tanto, existe una necesidad continua de
desarrollar mejores reactivos, materiales y técnicas para el
aislamiento de tPA de un modo más eficaz y rentable.
La cromatografía de afinidad es una técnica muy
potente para alcanzar incrementos espectaculares de la pureza en una
sola etapa. Por ejemplo, Narayanan (1994) comunicó un incremento de
3000 veces la pureza mediante una única etapa de cromatografía de
afinidad.
Sin embargo, la cromatografía de afinidad no es
una técnica usada con frecuencia en la producción a gran escala de
biomoléculas. El ligando ideal de la cromatografía de afinidad debe,
a un coste aceptable, (1) capturar la biomolécula diana con afinidad
elevada, capacidad elevada, especificidad elevada y selectividad
elevada; (2) o no capturar o permitir la elución diferencial de
otras especies (impurezas); (3) permitir la liberación controlada de
la diana en condiciones que conserven (es decir, que no degraden o
desnaturalicen) la diana; (4) permitir la esterilización y la
reutilización de la matriz de la cromatografía; y (5) permitir la
eliminación o la inactivación de cualquier patógeno. Sin embargo, se
ha probado la dificultad de encontrar ligandos de afinidad elevada y
coste aceptable que puedan tolerar los protocolos de limpieza y
esterilización requeridos en la fabricación farmacéutica (véase,
Knight, 1990).
Se han usado con eficacia anticuerpos
monoclonales (AcMo) murinos como ligandos de afinidad. Por otro
lado, la producción de anticuerpos monoclonales es cara y son
propensos a su lavado y degradación durante los procedimientos de
limpieza y esterilización asociados con la purificación de
biomoléculas, lo que conduce a que las matrices de afinidad con base
de AcMo pierdan actividad con rapidez (véase, Narayanan,
1994; Boschetti, 1994). Además, aunque los AcMo son muy específicos
para una diana, la especificidad a menudo no basta para evitar la
captura de impurezas que están estrechamente relacionadas con la
diana. Además, las características de unión de los AcMo están
determinadas por el repertorio de inmunoglobulinas del animal
inmunizado y, por tanto, los profesionales deben conformarse con las
características de unión proporcionadas por el sistema inmunológico
del animal, es decir, hay pocas oportunidades para optimizar o
seleccionar una unión concreta o las características de elución
usando sólo la tecnología de AcMo. Por último, la masa molecular por
sitio de unión (25 kDa a 75 kDa) de AcMo e incluso de fragmentos de
AcMo es bastante elevada.
Hasta ahora, no se han conocido ligandos de
afinidad adecuados para la purificación de tPA que se acerquen a las
características del ligando de afinidad ideal descrito antes, que no
sólo se unan a la molécula de tPA diana con afinidad elevada sino
que también liberen el tPA en condiciones deseables o seleccionadas,
que sean capaces de discriminar entre el tPA y otros componentes de
la solución en la que se presenta el tPA y/o que sean capaces de
resistir los procedimientos de limpieza y esterilización para
proporcionar matrices cromatográficas regenerables y
reutilizables.
reutilizables.
Tales ligandos de afinidad de tPA y
procedimientos para obtenerlos se proporcionan en el presente
documento.
La presente invención proporciona procedimientos
para obtener ligandos de afinidad para tPA que exhiban propiedades
de unión deseables o seleccionadas y propiedades de liberación. Los
ligandos de afinidad de la presente invención exhiben, no sólo
características de unión favorables para la separación por afinidad
de tPA sino también características de liberación (elución) deseadas
y otras propiedades deseadas tales como estabilidad, resistencia a
la degradación, durabilidad, reutilización y facilidad de
fabricación.
Los ligandos de afinidad por tPA de la presente
invención pueden identificarse inicialmente a partir de una
biblioteca de péptidos, tal como una biblioteca de expresión en
fagos, mediante un procedimiento que comprende:
- (a)
- seleccionar una primera condición de solución (es decir, las condiciones de unión) a la que se desea que un ligando de afinidad se una al tPA;
- (b)
- seleccionar una segunda condición de solución (es decir, las condiciones de liberación) a la que se desea que se disocie un complejo de afinidad entre el tPA y el ligando de afinidad, en la que la segunda condición de solución es diferente de la primera condición de solución;
- (c)
- proporcionar una biblioteca de análogos de un dominio de unión candidato, en la que cada análogo difiere de dicho dominio de unión candidato por la variación de la secuencia de aminoácidos en uno o más posiciones aminoacídicas dentro del dominio;
- (d)
- poner en contacto dicha biblioteca de análogos con tPA en la primera condición de solución durante el tiempo suficiente para permitir que se formen los complejos de unión análogo/tPA;
- (e)
- eliminar los análogos que no se unen en la primera condición de solución;
- (f)
- alterar las condiciones de la solución de la etapa del contacto (e) y convertirlas en la segunda condición de solución; y
- (g)
- recuperar los análogos de unión candidatos liberados en la segunda condición de solución, en la que los análogos recuperados identifican los ligandos aislados de afinidad por tPA.
Después de este procedimiento general, se han
aislado varios ligandos polipeptídicos de afinidad por tPA, como se
describe con más detalle más adelante.
La figura 1 muestra un cromatograma del activador
de plasminógeno tisular (25 \mul de tPA de 1 mg/ml) en una columna
de cromatografía de afinidad que tiene inmovilizado un ligando de
afinidad por tPA (derivado de CMTI nº 109, descrito en el Ejemplo
1), con elución con un gradiente de pH 7-pH 3. Se
estima que el pico a 15 minutos contiene aproximadamente el 90% del
tPA inyectado.
La figura 2 muestra un cromatograma de Estándar
de Coagulación (dilución 10X) sobre una columna de afinidad por tPA
(derivado de CMTI nº 109) con elución como se ha descrito
anteriormente. Se mostró que el pico pequeño a 15,6 minutos era un
artefacto del gradiente.
La figura 3 muestra un cromatograma de una mezcla
compuesto por 25 \mul de Estándar de Coagulación (dilución 10X)
reforzado con 25 \mul de tPA, con elución sobre un gradiente de
pH7-pH3. El pico a 1 minuto es el grupo de proteínas
plasmáticas y el pico a 15,4 minutos es el tPA.
La figura 4 muestra el mismo cromatograma que se
muestra en la figura 3 con escala vertical expandida.
La presente invención hace posible la
purificación eficaz del tPA mediante cromatografía de afinidad.
El tPA puede producirse de cualquier forma
conocida, incluida la síntesis química; la producción en células
huésped transformadas; la secreción en el medio de cultivo por
bacterias, levaduras, hongos, células de insectos y células de
mamíferos naturales o transformadas por recombinación; la secreción
desde microorganismos sometidos a ingeniería genética (por ejemplo,
mamíferos transgénicos); o en fluidos o tejidos biológicos tal como
orina, sangre, leche, etc. La solución que contiene el tPA bruto
como se produce inicialmente (es decir, la solución de producción) a
veces se denominará "corriente de alimentación".
Cada procedimiento para producir tPA proporciona
tPA en una corriente de alimentación que además contiene una serie
de impurezas (con respecto a tPA). Un propósito de la presente
invención es producir ligandos y preparaciones de afinidad (tales
como medios para cromatografía), que comprende ligandos tales que
permitan una rápida y muy específica purificación de tPA de
cualquier corriente de alimentación. Los ligandos de afinidad por
tPA obtenidos en el presente documento se ajustan al aislamiento de
tPA de una determinada corriente de alimentación, en condiciones
específicas previamente seleccionadas. Si se usa un procedimiento de
producción alternativo, que produzca una corriente de alimenatción
diferente, puede ser necesario un conjunto distinto de ligandos de
afinidad para alcanzar el mismo nivel de purificación. El nuevo
conjunto de ligandos se puede obtener con facilidad siguiendo los
procedimientos que se indican en el presente documento.
Los ligandos de afinidad por tPA de la invención
se unen al tPA con la exclusión virtual de cualquier otra molécula
en la corriente de alimentación con una elevada afinidad. Además,
los ligandos de afinidad liberan el tPA intacto y en la forma activa
cuando las condiciones de solución varían.
Para aislar nuevos ligandos de afinidad por tPA
se seleccionan dos condiciones de solución, es decir, condiciones de
unión y condiciones de liberación. Las condiciones de unión son un
conjunto de condiciones de solución en las que se desea que un
ligando de afinidad descubierto se una al tPA diana; las condiciones
de liberación son un conjunto de condiciones de solución en las que
se desea que un ligando de afinidad descubierto no se una al tPA.
Las dos condiciones pueden seleccionarse para que satisfagan
cualquiera de los criterios del profesional, tal como la facilidad
de alcanzar las condiciones, la compatibilidad con otras etapas de
purificación, la reducción del coste del cambio entre condiciones en
comparación con otros medios de afinidad, etc. Preferentemente, las
dos condiciones de solución están (a) dentro de las fronteras de la
envolvente de estabilidad para el tPA y (b) muy lejos de al menos un
parámetro de solución. Por ejemplo, si el tPA es estable en un
amplio intervalo de pH, las condiciones de unión favorables podrían
ser pH 7,5, sal 150 mM, 25ºC, y las condiciones de liberación
favorables podrían ser pH3, sal 150 mM, 25ºC. Para una forma
diferente de tPA con un estrecho intervalo de estabilidad de pH (por
ejemplo, pH 6,2 a 7,8) pero estable en un amplio intervalo de
salinidad, dos condiciones útiles podrían ser las condiciones de
unión: pH 7,2, NaCl 3M, 25ºC y condiciones de liberación: pH 7,2,
NaCl 2 mM, 25ºC.
Junto con la selección de condiciones de solución
específicas para la unión y liberación deseadas del tPA se
selecciona un dominio de unión candidato para que sirva como molde
estructural para los ligandos de afinidad sometidos a ingeniería
genética que servirán las capacidades de liberación y de unión
deseada. El dominio de unión puede ser una proteína natural o
sintética o una región o dominio de una proteína. El dominio de
unión candidato puede seleccionarse en función del conocimiento de
una interacción conocida entre el dominio de unión candidato y el
tPA, pero esto no es crucial. De hecho, no es esencial que el
dominio de unión candidato tenga ninguna afinidad por tPA: Su
propósito es proporcionar una estructura a partir de la cual se
pueda generar una multiplicidad (biblioteca) de análogos, en la que
dicha multiplicidad de análogos incluirá uno o más análogos que
exhiban las propiedades de unión y liberación deseadas (y cualquier
otra propiedad para la que se selecciona). Por tanto, las
condiciones de unión y las condiciones de liberación analizadas
infra pueden seleccionarse con conocimiento del polipéptido
exacto que servirá como dominio de unión candidato o con
conocimiento de una clase de proteínas o dominios a los que el
dominio de unión candidato pertenece o completamente de forma
independiente de la elección del dominio de unión candidato. De
igual forma, las condiciones de unión y/o de liberación pueden
seleccionarse con respecto a las interacciones conocidas entre un
dominio de unión y el tPA, por ejemplo, para favorecer la
interacción en una o ambas condiciones de solución, o pueden
seleccionarse sin considerar tales interacciones conocidas.
Asimismo, el dominio de unión candidato puede seleccionarse teniendo
en cuenta o no las condiciones de unión y/o de liberación, aunque se
debe reconocer que si los análogos del dominio de unión son
inestables en las condiciones de unión o de liberación, no se
obtendrán ligandos de afinidad útiles.
Al seleccionar un dominio de unión candidato, el
objeto es proporcionar un molde o una estructura padre a partir de
la cual se pueda generar una biblioteca de dominios análogos de
estructura similar. Preferentemente, la biblioteca de análogos será
una biblioteca sesgada (en oposición a una biblioteca generada de
forma aleatoria), porque la variación del dominio básico para crear
la biblioteca se llevará a cabo de tal forma que favorezca las
propiedades deseadas para los ligandos de afinidad.
La naturaleza del dominio de unión candidato
influye en gran medida las propiedades de las proteínas derivadas
(Análogos) que se probarán frente a la molécula de tPA. Al
seleccionar el dominio de unión candidato, la consideración más
importante es la forma en la que los dominios análogos se
presentarán al tPA, es decir, en qué conformación entrarán en
contacto el tPA y los análogos. Por ejemplo, en las formas de
realización preferidas, los análogos se generarán mediante inserción
de ADN sintético que codifica el análogo en un paquete genético
replicable, lo que tiene como resultado la expresión del dominio en
la superficie de un microorganismo, tal como el fago M13, usando
técnicas como se describe en, por ejemplo, el documento US 5.403.484
(Ladner et al.) y el documento US 5.223.409 (Ladner et
al.)
Los polipéptidos estructurados ofrecen muchas
ventajas como dominios de unión candidatos sobre péptidos no
estructurados. La mutación de residuos de superficie en una proteína
normalmente tendrá poco efecto sobre la estructura global o las
propiedades generales (tales como tamaño, estabilidad, temperatura
de desnaturalización) de la proteína; mientras que al mismo tiempo,
la mutación de residuos de superficie puede afectar profundamente a
las propiedades de unión de la proteína. Esto se ha documentado por
completo, por ejemplo, para los dominios de Kunitz
BPTI-homólogos (véase Ladner, 1995). La
mutación de residuos de superficie en proteínas o dominios
estructurados puede conducir a una diversidad de propiedades para
los análogos mayor que la obtenida mediante la mutación de péptidos
no estructurados, porque la estructura proteica la o la estructura
del dominio contiene los residuos mutados en conformaciones que
difieren de un residuo a otro y de una estructura a otra. Esto es
especialmente importante para los grupos laterales hidrófobos que se
quedarían enterrados a menos que se constriña en una estructura.
Cuanto más estrechamente constreñido esté un segmento peptídico
(dominio), menor es la posibilidad de que se una a cualquier diana
concreta. Sin embargo, si se une, es probable que la unión sea más
estrecha y más específica. Por tanto, se prefiere seleccionar un
dominio de unión candidato y, a su vez, una estructura para los
análogos peptídicos, que esté constreñido dentro de una estructura
con algún grado de rigidez. Como alternativa, se puede seleccionar
más de una estructura de dominio de unión candidato para incrementar
el tamaño de la biblioteca de análogos e introducir otras
estructuras variegadas para la presentación al tPA. A medida que se
aumenta el tamaño de la biblioteca y se preparan más y diversamente
estructurados análogos, la probabilidad de incluir una estructura
útil y grupos funcionales expuestos aumenta hasta el punto en el que
se pueden encontrar ligandos de afinidad elevada para el aislamiento
del tPA desde prácticamente cualquier corriente de alimentación.
El tamaño del dominio de unión candidato es
también una consideración importante. Las proteínas o polipéptidos
pequeños ofrecen varias ventajas sobre las proteínas grandes, tales
como anticuerpos monoclonales (véase Ladner, 1995). En primer lugar
se reduce la masa por sitio de unión. Los dominios proteicos
altamente estables con pesos moleculares bajos, por ejemplo dominios
Kunitz (\sim 7 kDa), dominios del inhibidor de tripsina (CMTI) de
Curcubida maxima (\sim 3,5 kDa) y endotelina (\sim 2
kDa), pueden mostrar una unión por gramo mucho más elevada que la de
los anticuerpos (159 kDa) o los anticuerpos de cadena única (30
kDa).
En segundo lugar se reduce la posibilidad de
unión inespecífica porque hay menos superficie disponible.
En tercer lugar, las proteínas o polipéptidos
pequeños se pueden someter a ingeniería para que tengan sitios de
unión únicos de un modo que sea impracticable para los anticuerpos.
Por ejemplo, las proteínas pequeñas se pueden someter a ingeniería
para que tengan lisinas sólo en los sitios adecuados para la unión
(por ejemplo, para una matriz de cromatografía), aunque esto no es
factible para los anticuerpos. A menudo se encuentra que sólo una
pequeña fracción de anticuerpos inmovilizados está activa,
posiblemente debido a una unión inadecuada al soporte.
La mayoría de las proteínas o polipéptidos
pequeños que se estabilizan mediante puentes disulfuro no contienen
cisteínas que no están implicadas en puentes disulfuro. Esto se debe
a que las condiciones oxidantes que producen la formación de puentes
disulfuro para estabilizar la proteína también conducen a la
formación de puentes disulfuro por otras cisteínas sin emparejar.
Por tanto, las proteínas pequeñas que tienen puentes disulfuros
estabilizantes y un número impar de cisteínas tienden a formar
dímeros unidos por puentes disulfuro (por ejemplo homodímeros o
heterodímeros). Los puentes disulfuro entre los dominios se reducen
con más facilidad que los puentes disulfuros estabilizantes
intradominios. Por tanto, mediante la reducción selectiva es posible
obtener dominios monoméricos estabilizados por puentes disulfuro que
tengan un único tiol libre. Tales tioles pueden usarse para la
inmovilización altamente estable de estos dominios mediante la
formación de un tioéter con yodoacetamida, ácido yodoacético o
grupos de ácido carboxílico \alpha-yodo
similares.
Los dominios polipeptídicos o proteicos pequeños
también pueden sintetizarse químicamente, lo que permite la
incorporación de grupos de inmovilización especiales de tal forma
que no interfieran con la unión al tPA. Por ejemplo, si se
sintetizan químicamente proteínas pequeñas con puentes disulfuro, la
secuencia aminoacídica se puede alterar mediante la adición de un
residuo adicional de cisteína con el tiol bloqueado de un modo
diferente de otras cisteínas de otros lugares de la secuencia. Los
tioles seleccionados se pueden desbloquear y puede permitirse la
formación de puentes disulfuro, después se puede desbloquear la
cisteína añadida y la molécula se puede inmovilizar mediante
reacción con un material adecuado tal como un sustrato que contenga
NH_{2}-CO-CH_{2}I
inmovilizado.
En cuarto lugar, es más probable que una
estructura polipeptídica constreñida retenga su funcionalidad cuando
se transfiera con el dominio estructural intacto de una estructura a
otra. Por ejemplo, es muy probable que la estructura del dominio de
unión sea transferible desde la estructura usada para la
presentación en una biblioteca (por ejemplo, expuesta en un fago) a
una proteína asilada eliminada de la estructura de presentación o
inmovilizada en un sustrato cromatográfico.
Hay muchos dominios proteicos pequeños estables
adecuados para usar como dominios de unión candidatos y para los que
está disponible la siguiente información útil: (1) secuencia de
aminoácidos, (2) secuencias de varios dominios homólogos, (3)
estructura tridimensional y (4) datos de estabilidad en un abanico
de pH, temperatura, salinidad, disolvente orgánico, concentración de
oxidante. Algunos ejemplos son: dominios de Kunitz (58 aminoácidos,
3 puentes disulfuro), dominios de inhibidor de tripsina de
Cucurbida maxima (31 aminoácidos, 3 puentes disulfuro),
dominios relacionados con guanilina (14 aminoácidos, 2 puentes
disulfuro), dominios relacionados con la enterotoxina IA
termoestable de bacterias gramnegativas (18 aminoácidos, 3 puentes
disulfuro), dominios EGF (50 aminoácidos, 3 puentes disulfuro,
dominios kringle (60 aminoácidos, 3 puentes disulfuro, dominios
fúngicos de unión a hidratos de carbono (35 aminoácidos, 2 puentes
disulfuro), dominios de endotelina (18 aminoácidos, 2 puentes
disulfuro) y dominio de unión a IgG de estreptococo G (35
aminoácidos, no hay puentes disulfuro). La mayoría de ellos, aunque
no todos, contiene puentes disulfuro que proporcionan rigidez y
estabilizan la estructura. Las bibliotecas a base de cada uno de
estos dominios, preferentemente expuestos en fagos o en otros
paquetes genéticos, se pueden construir con facilidad y usarse para
la selección de análogos de unión.
Una vez que se ha seleccionado el dominio de
unión candidato, se crea una biblioteca de posibles ligandos de
afinidad para la detección selectiva frente al tPA en las
condiciones de unión y de elución (liberación). La biblioteca se
crea mediante la preparación de una serie de análogos, en la que
cada uno de ellos corresponde al dominio de unión candidato a
excepción de que tiene una o más sustituciones aminoacídicas en la
secuencia del dominio. Cabe esperar que las sustituciones de
aminoácidos alteren las propiedades de unión del dominio sin alterar
de forma significativa su estructura, al menos para la mayoría de
las sustituciones. Se prefiere que las posiciones aminoacídicas que
se seleccionan para variar 8 posiciones aminoacídicas variables sean
posiciones aminoacídicas de superficie, es decir, posiciones en la
secuencia de aminoácidos de los dominios que, cuando el dominio está
en su conformación más estable, aparece en la superficie externa del
dominio (es decir, la superficie expuesta a la solución). Más
preferentemente, las posiciones de aminoácidos que se van a variar
serán adyacentes o estarán muy cerca, de forma que se maximice el
efecto de las sustituciones. Además, en la estructura del dominio de
unión candidato se pueden añadir aminoácidos adicionales. En formas
de realización preferidas, especialmente en las que hay una gran
cantidad de información disponible en relación con las interacciones
del tPA con otras moléculas, en particular el dominio de unión
candidato, esas posiciones aminoacídicas que son esenciales para las
interacciones de unión se determinarán y conservarán en el proceso
de la construcción de la biblioteca de análogos (es decir, los
aminoácidos esenciales para la unión no variarán).
El objeto de crear la biblioteca de análogos es
proporcionar un gran número de posibles ligandos de afinidad para la
reacción con la molécula de tPA y, en general, cuanto mayor es el
número de análogos en la biblioteca mayor es la posibilidad de que
un miembro de la biblioteca se una al tPA y libere en las
condiciones previamente seleccionadas deseadas para la liberación.
Por otro lado, la sustitución aleatoria en sólo seis posiciones en
una secuencia de aminoácidos proporciona alrededor de 60 millones de
análogos, que es un tamaño de biblioteca que comienza a presentar
limitaciones prácticas, incluso cuando se usan técnicas de detección
selectiva tan potentes como la expresión en fagos. Por tanto, se
prefiere crear una biblioteca sesgada, en la que las posiciones
aminoacídicas designadas para la variación se consideran para
maximizar el efecto de la sustitución en las características de
unión del análogo, y los residuos aminoacídicos que se dejan o
planean para usar en sustituciones se limitan a aquellos que es más
probable que causen que el análogo responda a la variación en las
condiciones de solución desde las condiciones de unión a las
condiciones de liberación.
Como se ha indicado anteriormente, las técnicas
analizadas en el documento US 5.223.409 son particularmente útiles
en la preparación de una biblioteca de análogos correspondientes a
un dominio de unión candidato, en la que los análogos se presentarán
en una forma adecuada para la detección selectiva a gran escala de
un número elevado de análogos en relación con una molécula diana de
tPA. El uso de paquetes genéticos replicables, y más preferentemente
La expresión en fagos, es un procedimiento potente de generar nuevas
entidades de unión polipeptídicas que implica la introducción de un
segmento de ADN nuevo en el genoma de un bacteriófago (u otro
paquete genético amplificable) de forma que el polipéptido
codificado por el ADN nuevo aparezca en la superficie del fago.
Cuando el ADN nuevo contiene una diversidad de secuencias, cada fago
receptor exhibe una variante de la secuencia aminoacídica inicial (o
"parental") codificada por el ADN y la población de fagos
(biblioteca) exhibe un gran número de secuencias aminoacídicas
diferentes pero relacionados.
Se ponen en contacto y se deja unir una
biblioteca de fagos a la molécula de tPA y deben separarse los que
se unen de los que no lo hacen. De varias formas, el fago unido se
libera del tPA y se amplifica. Dado que el fago se puede amplificar
mediante la infección de células bacterianas, incluso unos pocos
fagos unidos bastan para revelar la secuencia génica que codifica
una entidad de unión. Usando estas técnicas es posible recuperar un
fago de unión que se encuentre en aproximadamente 1 por 20 millones
de población. Una o más bibliotecas, con 10-20
millones o más posibles polipéptidos de unión cada una, puede
someterse a una detección selectiva para encontrar ligandos de tPA
de afinidad elevada. Cuando el procedimiento de selección funciona,
la diversidad de la población disminuye en cada vuelta/ronda/ciclo
hasta que permanecen sólo las moléculas bien unidas, es decir el
procedimiento converge. Típicamente, una biblioteca de fagos
contendrá varios ligantes estrechamente relacionados (de 10 a 50
ligantes de 10 millones). Entre las indicaciones de convergencia se
incluyen un incremento de la unión (medida por los títulos de fagos)
y la recuperación de secuencias estrechamente relacionadas. Después
de identificar un primer conjunto de polipéptidos de unión, la
información de la secuencia se pude usar para diseñar otras
bibliotecas sesgadas para miembros con propiedades deseadas
adicionales, por ejemplo discriminación entre tPA y fragmentos
concretos.
Tales técnicas posibilitan, no sólo la detección
selectiva de un gran número de análogos sino que hacen práctica la
repetición de ciclos de unión/elución y la construcción de
bibliotecas secundarias sesgadas para la detección selectiva de
paquetes que muestren análogos que cumplan los criterios iniciales.
Por tanto, en la práctica de la presente invención se prefiere (1)
que se prepare una biblioteca de análogos de dominio de unión para
que se muestre en paquetes genéticos replicables, tal como un fago;
(2) que se someta una biblioteca a detección selectiva en busca de
paquetes genéticos que se unan a tPA en los que las condiciones de
unión del procedimiento de selección sean las mismas que las
condiciones de unión previamente seleccionadas para el ligando de
afinidad deseado; (3) que se obtengan y se propaguen paquetes
genéticos mediante elución en las condiciones de liberación
previamente seleccionadas para el ligando de afinidad; (4) que se
obtengan y se propaguen más paquetes genéticos mediante elución en
condiciones altamente perjudiciales (tales como, por ejemplo, pH 2 o
menor, urea 8M o tiocianato de guanidinio saturado, para superar las
asociaciones de afinidad extremadamente elevada entre algunos
análogos de dominio de unión mostrados y el tPA diana); (5) que los
paquetes genéticos propagados obtenidos en (3) o (4) se ciclen por
separado o en combinación en las etapas (2) y (3) o (4) durante uno
o más ciclos adicionales; y (6) que se determine una secuencia
consenso de los ligantes de afinidad elevada para los análogos
expresados en los paquetes genéticos recuperados de tales ciclos;
(7) que se construya una biblioteca sesgada adicional en función de
la estructura original (dominio de unión candidato) y se permita a
la secuencia consenso de afinidad elevada en cada posición
aminoacídica variable y además se permita a otros tipos de
aminoácidos seleccionados que incluyan aminoácidos que se cree que
son particularmente sensibles a las modificaciones entre las
condiciones de unión y las condiciones de liberación; (8) que esta
biblioteca sesgada se someta a detección selectiva en busca de
miembros que (a) se unan estrechamente (es decir, con afinidad
elevada) en las condiciones de unión y (b) se liberen limpiamente
(es decir, que se disocien con facilidad del tPA diana) en las
condiciones de liberación.
Después de aislar una o más bibliotecas que se
unan a un tPA con la afinidad deseada en las condiciones de unión y
de liberarlas de un tPA según se desee en las condiciones de
liberación, se puede conseguir el aislamiento de los ligandos de
afinidad mediante formas conocidas. Si, por ejemplo, la biblioteca
de análogos está compuesta por ligandos de afinidad prospectivos
expresados en fagos, el fago liberado se puede recuperar, propagar,
aislar y amplificar el inserto de ADN que codifica el análogo,
analizar la secuencia de ADN y preparar cualquier cantidad deseada
del ligando, por ejemplo mediante síntesis directa del polipéptido o
la expresión recombinante del ADN aislado o una secuencia
codificadora equivalente.
Del mismo modo que se introdujeron en el ligando
las propiedades de liberación mediante ingeniería genética se pueden
introducir mediante ingeniería genética otras propiedades
adicionales deseadas en un ligando análogo, siguiendo etapas
similares a las descritas anteriormente.
Los ligandos de afinidad aislados de este modo
será extremadamente útiles para el aislamiento de tPA por medio de
procedimientos de cromatografía de afinidad. Se puede emplear
cualquier procedimiento de cromatografía convencional.
Preferentemente, se inmovilizará un ligando de afinidad de la
invención sobre un soporte sólido adecuado, por ejemplo, para
rellenar una columna de cromatografía. A continuación, el ligando de
afinidad inmovilizado se puede cargar poner en contacto con una
corriente de alimentación en condiciones favorables a la formación
de complejos ligando/tPA, los materiales que no se han unido se
pueden eliminar mediante lavados y, después, el tPA se puede eluir
en condiciones que favorezcan la liberación de la molécula de tPA
del complejo ligando/tPA. Como alternativa, se puede llevar a cabo
una cromatografía de masa mediante la adición en un vaso de reacción
de una corriente de alimentación y un ligando de afinidad marcado
adecuadamente, después aislar los complejos formados por tPA y
ligando mediante el uso del marcador (por ejemplo, un marcador de
afinidad poliHis, que se puede usar para unir el ligando después de
que se han formado los complejos) y, por último, liberar el tPA del
complejo después de que se han eliminado los materiales que no se
han unido.
Debe observarse que aunque las propiedades
exactas de unión y liberación se introducen mediante ingeniería en
los ligandos de afinidad, el posterior uso en la purificación de
afinidad puede revelar más condiciones óptimas de unión y de
liberación en las que el mismo ligando de afinidad aislado
funcionará. Por tanto, no es crucial que el ligando de afinidad,
después del aislamiento según esta invención, siempre se use sólo en
las condiciones de unión y liberación que condujeron a su separación
de la biblioteca.
Por último, debe tenerse en cuenta que el ligando
de afinidad más elevada no necesariamente es el mejor para la
recuperación controlable o rentable de una molécula de tPA. El
procedimiento de la invención permite la selección de ligandos con
una variedad de características deseables importantes para el
profesional en busca del aislamiento de tPA a partir de una
corriente de alimentación concreta, tal como la unión específica del
tPA acoplado a una liberación limpia, predecible y controlada del
tPA, una capacidad de carga útil, una elución completa aceptable,
reutilización/reciclabilidad, etc.
El aislamiento de ligandos de afinidad por tPA de
acuerdo con esta invención se ilustrará más adelante. Con los
parámetros específicos incluidos en los siguientes ejemplos se
pretende ilustrar la práctica de la invención y no se presentan para
limitar, de ningún modo, el alcance de la invención.
Las técnicas descritas anteriormente se usaron
para aislar los ligandos de afinidad activador de plaminógeno de
tipo de tejido humano (tPA). El procedimiento de crear ligandos de
afinidad por tPA implicó tres etapas generales: (1) detección
selectiva de aproximadamente 11 millones de variantes de un dominio
proteico parental estable para la unión a tPA, (2) la producción de
cantidades pequeñas de los ligandos más interesantes y (3) la
realización de análisis cromatográficos de un ligando unido a perlas
activadas para la purificación por afinidad de tPA de una muestra
reforzada de plasma.
Para este trabajo el tPA se obtuvo de CalBiochem
(nº 612200 y se inmovilizó en perlas de agarosa
Reacti-Gel™ de Pierce Chemical Company mediante los
procedimientos descritos en Markland y col. (1996). Aproximadamente
200 \mug de tPA se acoplaron a 200 \mul de pasta
Reacti-Gel™.
Del procedimiento de detección selectiva se
escogieron cuatro bibliotecas de proteínas expresadas en fagos. Tres
se basaban en el primer dominio de Kunitz de inhibidor de
coagulación asociado a lipoproteínas (LACI-K1),
denominados Bib. nº 1, Bib. nº 3 y Bib. nº 5, y una se basaba en el
inhibidor I de tripsina de Cucurbida maxima
(CMTI-I). El CMTI-I es una proteína
que se encuentra en las semillas de calabacín y es capaz de aguantar
las condiciones ácidas y proteolíticas del intestino. Cada una de
estas proteínas tiene tres puentes disulfuro, lo que las constriñe
mucho y las estabiliza. Se ha mostrado que miembros de estas
familias de proteínas poseen una estabilidad térmica sobresaliente
(>80ºC sin pérdida de actividad), una estabilidad al pH
sobresaliente (no hay pérdida de actividad en la incubación durante
la noche a pH 2 y 37ºC o 1 hora de exposición a pH 12 a 37ºC) y una
sobresaliente estabilidad a la oxidación. El número de potenciales
secuencias de aminoácidos en cada biblioteca figura en la Tabla 1 a
continuación:
En este trabajo se ha estimado que la diversidad
total de las bibliotecas expresadas en fagos seleccionadas frente a
tPA es de aproximadamente 11 millones. El dominio de Kunitz y el
dominio CMTI podría expresar una diversidad mucho mayor mediante la
variación de otras partes de sus superficies.
Se usaron dos protocolos de detección selectiva:
"detección selectiva lenta" y "detección selectiva
rápida". En una detección selectiva lenta, los fagos de cada
ciclo se amplificaron en E. coli antes del siguiente ciclo.
En una detección selectiva rápida, los fagos recuperados del tPA en
un ciclo sirvieron como entrada para el siguiente ciclo, sin
amplificar. En una detección selectiva rápida, tanto la entrada como
el número recuperado de fagos disminuyeron con rapidez en varios
ciclos. En una detección selectiva lenta, el nivel de entrada se
puede mantener constante. La entrada constante en una detección
selectiva lenta permite la realización de comparaciones entre
ciclos, que pueden indicar la selección o su ausencia, pero los
ciclos de detecciones selectivas rápidas son difíciles de
interpretar. La detección selectiva rápida aumenta la posibilidad de
que los fagos se seleccionen según la unión en lugar de según otras
propiedades irrelevantes (por ejemplo, infectividad o tasas de
crecimiento).
Las bibliotecas de fagos descritas se
seleccionaron según la unión a tPA en cuatro ciclos. En el primer
ciclo, las bibliotecas de fagos se mezclaron en reacciones distintas
con tPA en perlas de agarosa a pH7 en suero salino tamponado con
fosfato (PBS). Se añadió seroalbúmina bovina (BSA) al 0,1% para
reducir la unión inespecífica. Los fagos sin unir se eliminaron
mediante lavados a pH7 y los fagos unidos eluyeron a pH 2 sólo
durante la primera detección selectiva. Las siguientes tres
detecciones selectivas tuvieron un protocolo de elución diferente y
usaron cantidades acumuladas de la primera detección selectiva. La
reserva A consistió en las cantidades combinadas procedentes de las
bibliotecas CMTI y Bib. Nº 1, y la Reserva B consistió en las
cantidades combinadas de las bibliotecas Bib. Nº 3 u Bib. Nº 5. La
unión de las bibliotecas acumuladas se llevó a cabo a pH 7, sin
embargo, la primera elución para eliminar los fagos unidos se llevó
a cabo a pH 5 y se realizó una elución posterior a pH 2 para eluir
los fagos que se liberan en el intervalo de pH 5 a pH 2. Esto se
repitió dos veces más durante un total de 4 ciclos de selección.
Los títulos de fagos de los últimos tres ciclos
de detección selectiva se muestran a continuación en la Tabla 2. La
cantidad obtenida de un ciclo fue la usada para el siguiente.
De los títulos de fagos se deduce que parece que
la Reserva A converge y contiene ligantes fuertes, mientras que la
Reserva B no tenía ni convergencia significativa ni ligantes
fuertes.
De los seleccionados de cada reserva procedente
del tercer ciclo de detección selectiva rápida se seleccionaron
cuarenta clones de fagos para su posterior análisis, 20 de la
reserva a pH 5 y 20 de la reserva a pH 2. El ADN de los fagos se
amplificó usando PCR para determinar si había fragmentos génicos
derivados de CMTI o de
LACI.
LACI.
Se encontraron constructos derivados de CMTI en
38 de 40 aislamientos de fagos de la detección selectiva rápida de
la reserva A. Los aislamientos restantes no proporcionaron un
producto de PCR, lo que indica la existencia de una deleción. Sólo
10 de los 40 aislamientos de fagos de la detección selectiva rápida
de la Reserva B contenían el constructo adecuado, otra indicación de
que la búsqueda no había tenido éxito.
Un signo de que una determinada proteína
expresada en fagos tiene una afinidad elevada por la molécula de tPA
es que se encuentra de forma repetida. De los 18 aislamientos de
fagos derivados de CMTI que se liberan a pH 2, una secuencia se
encontró cinco veces, una segunda, cuatro veces y dos de las
restantes se produjeron tres
veces.
veces.
Las 18 secuencias formaron una familia
estrechamente relacionada de moléculas seleccionadas, un signo más
de que la búsqueda había convergido con éxito.
La tabla 3 muestra la variabilidad de las
secuencias observadas como una función de la variabilidad permitida
y la selección de pH. La biblioteca CMTI se construyó mediante la
introducción de una diversidad de secuencias combinatorias en
codones que especifiquen un bucle expuesto en la superficie formado
entre las cisteínas 3 y 10 de la proteína CMTI parental. Las
cisteínas no habían variado porque forman una parte importante de
la
estructura.
estructura.
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La tabla 3 muestra la secuencia de ADN de la
biblioteca CMTI. Los residuos F15 e Y14 corresponden a los residuos
14 y 15 de la secuencia señal del M13mp18 del que el fago receptor
se obtuvo mediante ingeniería. Se supone que la escisión por la
Señal peptidasa I (SP-I) se produce entre A_{1} y
R_{1}. Los residuos denominados 100-113
constituyen un ligador entre las variantes de CMTI y el II maduro,
que comienza con el residuo A_{201}.La secuencia de aminoácidos
Y_{103}1IEGRIV debería permitir la escisión específica del ligador
con el Factor X_{a} Bovino entre R_{108} e I_{109}. El fago
relacionado con M13 en el que se construyó esta biblioteca lleva un
gen de resistencia a ampicilina (Ap^{R}), de forma que las
células infectadas por el fago de la biblioteca se convierten en
resistentes a la Ap. En cada posición variable de un aminoácido, el
residuo aminoacídico salvaje se muestra subrayado. La secuencia de
aminoácidos que se muestra en la Tabla 3 se denomina ID SEC Nº 2; la
secuencia de nucleótidos que se muestra en la Tabla 3 se denomina
SEC DI Nº 3.
Los aislamientos obtenidos del procedimiento de
selección a pH 5 exhibieron una mayor diversidad de secuencia que
los seleccionados a pH 2 (Tabla 4). A pesar de la mayor variabilidad
de secuencia, los seleccionados a pH 5 comprendieron una familia de
secuencias proteicas estrechamente relacionadas. La formación de
todas las combinaciones de los tipos de aminoácidos observados en
cada posición sólo proporciona 13.400 (=2x4x3x4x7x5x4), que es el
0,15% de la población original. En las 20 secuencias determinadas,
había cuatro secuencias que se produjeron más de una vez, lo que
sugiere que la diversidad real es menor de 13.400. Aunque la familia
de secuencias seleccionadas a pH5 está claramente relacionada con la
familia seleccionada a pH 2, se observó un ejemplo de igualdad de
secuencia entre dos poblaciones de secuencia.
En las posiciones 6 y 7, la mayoría (12 de 15) de
los tipos de aminoácidos permitidos se rechazaron en los
seleccionados a pH 2. De las secuencias seleccionadas, no está claro
si los aminoácidos seleccionados en las posiciones 6 y 7
contribuyeron a la unión o simplemente representan la eliminación de
posibilidades inaceptables en estas posiciones.
La potente convergencia del procedimiento de
selección es particularmente evidente para los seleccionados a pH 2
en las posiciones 2, 4 y 8, donde, aunque podría haber muchos tipos
de aminoácidos sólo se encontró un tipo de aminoácido. Estos es una
fuerte indicación que este aminoácido específico es crucial para la
unión. En cada una de estas posiciones, el tipo exclusivamente
seleccionado de la población de pH 2 también era el tipo más
habitual en esa posición en la población de pH 5. La obtención de
todos los tipos de aminoácidos observados en cada posición de la
reserva de pH 2 sólo proporciona 36 secuencias, el 0,0004% de la
población inicial. El hecho de que varias secuencias aparecían más
de una vez sugiere que el número de secuencias diferentes presentes
en la reserva de pH 2 no es mayor de 36.
La tabla 5 muestra las secuencias de aminoácidos
de la región variegada (posiciones aminoacídicas
1-12) para los 38 análogos secuenciados de
CMTI-I. La aparición de residuos de metionina en una
posición que no está designada para variar (posición 11) indica un
error en la síntesis de ADN en la formación de la biblioteca.
En la tabla 5, los análogos que tenían las
secuencias designadas 101-120 se obtuvieron mediante
elución a pH 5 y los análogos con las secuencias
221-238 se obtuvieron mediante fraccionamiento a pH
2.
La especificidad de los candidatos a ligando
unidos a los fagos se probó mediante la determinación de su afinidad
por otras proteínas inmovilizadas. Las proteínas unidas a los fagos
no mostraron afinidad alguna por las proteasas séricas humanas
relacionadas plasmina y trombina unidas a las perlas (los datos no
se muestran). Además, se llevaron a cabo experimentos en los
aislamientos de los fagos para determinar la afinidad relativa y las
características de liberación del tPA inmovilizado.
En el caso de los aislamientos de fagos de
liberación a pH 5, la mayoría de los fagos se liberan a pH 5 y al
disminuir el pH a 2 se liberan en un orden de magnitud menor. Esto
indica ligandos de afinidad adecuados con una liberación
relativamente limpia tras la disminución del pH a 5. En el caso de
aislamientos de liberación a pH 2, sólo el aislamiento nº 232 dio
una unión verdaderamente selectiva a pH 5 y después liberación a pH
2.
Después se sintetizaron polipéptidos libres
derivados de CMTI usando la información de la secuencia determinada
a partir del ADN de los aislamientos de los fagos. Aunque los
derivados de CMTI (análogos) podrían haberse sintetizado
químicamente con facilidad, se decidió expresar los polipéptidos en
levaduras. Uno de los aislamientos de liberación a pH 5, el nº 109
(tabla 5; ref. ID SEC Nº 12), y uno de los aislamientos de
liberación a pH 2, nº 232 (Tabla 5; ref. ID SEC Nº 35), se
seleccionaron para la expresión en Pichia pastoris. En las
posiciones 4 y 8, el aislamiento nº 109 tiene los mismos tipos de
aminoácidos que se observan en los seleccionados a pH 2; en la
posición 2, el aislamiento nº 109 difiere de los seleccionados a pH
2.
Los constructos génicos adecuados se sintetizaron
en insertaron en el sistema de expresión de Pichia pastoris (Vedvick
y col., 1991 y Wagner y col., 1992) para crear cepas de producción.
Fermentaciones de cinco litros de cada cepa tuvieron como resultado
un nivel elevado de expresión. Se estimó que las proteínas se
secretaban en el caldo de fermentación en un exceso de 1 g/l. Las
suspensiones brutas de fermentación se aclararon mediante
centrifugación y en etapas de microfiltración de 0,2 \mu. Los
filtrados de 0,2 \mu se purificaron mediante ultrafiltración
usando casetes de PTTK con un corte NMWL a 30 kDa. Los ligandos se
purificaron de los filtrados de ultrafiltración mediante
cromatografía de intercambio catiónico con soporte de intercambio
catiónico Macro-Prep High S (BioRad), seguido por
dos separaciones de fase inversa. Las separaciones de fase inversa
usaron un gradiente lineal comenzando con agua con TFA al 0,1% y con
incrementos de acetonitrilo (que contiene TFA al 0,1%) que se
aumentó hasta el 50% a los 90 minutos. La proteína resultante
presentaba una pureza mayor del 95%, medida mediante análisis de
espectro PDA en una columna de fase inversa de 5 \mum.
El ligando candidato se inmovilizó en un soporte
de copolímeros de bis-acrilamida/azlactona con
diaminopropilamina inmovilizada (Emphaze Ultralink™; Pierce Chemical
Co.) según las instrucciones del fabricante. Aproximadamente 30 mg
de análogo de CMTI nº 109 se acoplaron a 1 ml del soporte de
cromatografía activada.
Una minicolumna Waters AP de dimensiones
nominales 5,0 cm x 0,5 cm se modificó mediante la adición de un
segundo adaptador de flujo que permitió reducir la longitud de la
columna a 2,5 cm. Esta columna se rellenó con perlas de nº109
Emphaze Ultralink™ usando el protocolo recomendado y se lavó con una
serie de lavados de concentración creciente de NaCl a pH 7, para
terminar con un lavado a 1M.
En una primera prueba con la columna de afinidad
nº 109, el activador de plasminógeno de tipo tisular obtenido de
CalBiochem se preparó según las descripciones del fabricante para
proporcionar una solución de 1 mg/ml de tPA. El plasma humano
liofilizado del Estándar de Coagulación (Nivel 1 de Control de la
Coagulación de Sigma Diagnostics, nº de catálogo
C-7916) se reconstituyó según las instrucciones del
fabricante, después se diluyó 10 veces y se añadió el tPA. Esta
muestra se cargó en la columna y se eluyó en presencia de NaCl 1M en
todos los tampones, lo que bastó para suprimir la unión inespecífica
de la proteína a la columna y para permitir la unión controlada por
pH y liberación de tPA. Se observaron dos picos distintos: el
primero contenía las proteínas del plasma (que no quedaron retenidas
en la columna); el segundo, obtenido tras la disminución del pH,
contenía el tPA sin que estuviera contaminado por componentes del
plasma. Los resultados se confirmaron mediante gel marcado con plata
(no mostrado).Se recuperó el 90% del producto tPA.
Se preparó una segunda columna de afinidad con el
análogo de CMTI nº 109 usando perlas de agarosa en EAH Sefarosa 4B™
(Pharmacia; Upsala SE) como soporte de la cromatografía. La
separación se llevó a cabo en un sistema HPLC fabricado por Waters
Inc. (Milford, MA). El sistema comprendía un Autoinyector modelo
718, un sistema de liberación de disolvente modelo 600 con cabezales
capaces de liberar 20 ml/minuto y un fotodiodo detector de modelo
996. Todo el equipo se instaló según las descripciones del
fabricante. El sistema se controló con un ordenador Pentium 133
compatible con IBM suministrado por Dell Corp. El ordenador estaba
equipado con un disco duro de 1 gigabite, 16 megabites de RAM y un
monitor en color, en el que se cargó el software Millenium
suministrado por Waters Inc.
Los datos del espectro en el intervalo de 200 nm
a 300 nm se recogieron con una resolución de 1,2 nm. Las figuras 1,
2, 3 y 4 se recogieron a 280 nm. Las fases móviles del trabajo
cromatográfico fueron Tampón A y Tampón B: el tampón A consistía en
fosfato potásico 25 mM; arginina 50 mM y NaCl 125 mM, tamponado
hasta pH 7 con hidróxido potásico. El tampón B consistía en fosfato
potásico 50 mM y NaCl 150 nM tamponado hasta pH 3 con ácido
fosfórico. En todos los casos, las muestras se inyectaron en 100% de
tampón A, seguido por lavado con 100% de tampón A desde t= 0 hasta
t= 2 minutos. Desde t= 2 minutos hasta t= 8 minutos la elución se
realizó con tampón B al 100%. Después de t= 8 minutos, la elución
fue con Tampón A al 100%. El volumen de retraso del gradiente del
sistema de HPLC fue de aproximadamente 4 ml y el caudal fue de 0,5
ml/min.
Se preparó tPA de otra fuente comercial según las
descripciones del fabricante, para proporcionar una solución de 1
mg/ml. El Estándar de Coagulación (Nivel 1 de Control de la
Coagulación de Sigma Diagnostics, nº de catálogo
C-7196), plasma humano liofilizado, se reconstituyó
según las instrucciones del fabricante. Esta solución se diluyó a
10:1 para obtener una solución que tenga aproximadamente 10 veces
la absorbancia de la solución de tPA.
En la prueba que se muestra en la Figura 1, se
introdujo una muestra de tPA puro (25 \mul de tPA 1 mg/ml) en una
columna con el derivado de CMTI nº 109 y se eluyó como se ha
descrito anteriormente. El cromatograma muestra una elución aguda de
aproximadamente el 90% del material tPA después de aproximadamente
15 minutos. En la prueba que se muestra en la figura 2, se introdujo
una muestra de Estándar de Coagulación /dilución de 10 veces) en una
columna que contenía el derivado CMTI nº 109 con condiciones de
elución como se han descrito antes. Virtualmente todo el material
eluido inmediatamente de la columna (no retenido). En la separación
de la prueba que se muestra en las figuras 3 y 4, en la columna se
cargó una muestra que contenía tPA añadido al estándar de plasma
humano y se eluyó como se ha descrito antes. Como se puede observar
en las figuras 3 y 4, el tPA quedó retenido y las proteínas
plasmáticas eluyeron en el volumen hueco. El tPA unido se liberó a
aproximadamente 15,4 minutos. Se estimó que el tPA se liberó a
aproximadamente un pH de 4. Se recogió el pico de tPA y se estudió
usando un gel reductor de SDS-poliacrilamida marcado
con plata y, cuando se comparó con el material de partida, se
encontró que tenía una pureza> 95%.
Los ligandos de afinidad por tPA aislados de la
biblioteca CMTI se examinaron posteriormente para diseñar dominios
adicionales candidatos que también podrían unirse al tPA.
Como se ha indicado anteriormente, casi toda la
variegación de las posiciones aminoacídicas usada en la construcción
de la biblioteca CMTI se produjo entre dos cisteínas en las
posiciones 3 y 10 de CMTI-I (véase la Tabla 3). En
la proteína de CMTI parental, estas cisteínas forman puentes
disulfuro con otros residuos de cisteína en cualquier otro lugar de
la proteína (Véase la ID SEC Nº 1), sin embargo, con el aislamiento
satisfactorio de los ligandos de afinidad de la biblioteca CMTI, se
conceptualizó una biblioteca secundaria basada en la variación de un
segmento truncado de 15 aminoácidos del aislamiento nº 109 (véase
aminoácidos 1-15 de la ID SEC Nº 12). Si las
cisteínas de C_{1} y C_{19} de estos miembros formaran un puente
disulfuro, se podría obtener un bucle constreñido con las
propiedades de unión a tPA. En estudios iniciales con el segmento de
15 aminoácidos derivados del aislamiento del ligando de afinidad nº
109 unido a un soporte cromatográfico se indicó la formación del
bucle C1-C10 formado y la inmovilización del bucle
unido al tPA.
Los siguientes experimentos señalan en la
dirección de dos nuevas familias de ligandos de afinidad por tPA
aislados de acuerdo con esta invención, que comprende polipéptidos
con las secuencias:
Arg-X_{1}-Cys-X_{2}-X_{3}-X_{4}-X_{5}-X_{6}-X_{7}-Cys-X_{8}-Lys-Asp-Ser-Asp-Cys-Leu-Ala-Glu-Cys-Val-Cys-Leu-Glu-His-Gly-Tyr-
Cys-Gly
Cys-Gly
\hskip0,3cm(SEC ID Nº: 42) y
Arg-X_{1}-Cys-X_{2}-X_{3}-X_{4}-X_{5}-X_{6}-X_{7}-Cys-X_{8}
\hskip0,3cm(SEC ID Nº: 43),
En las que X1 es Trp o Leu; X 2 es
Pro, Ser, Thr o Ile; X3 es Arg, Lys o Thr; X4 es Ser, Tyr, Thr o
Ala, X5 es Ser, Tyr, Aspa, Val, Pro, Ala, His, Asn o Thr; X6 es Leu,
Met, Gln, Arg o Lys; X7 es Glu, Gly o Arg y X8 es al menos Lys o
Met. Dado que la presencia de residuos de Met en la posición 11 de
la secuencia no estaba planeada pero se descubrió que favorecía la
unión a tPA, es muy probable que otros aminoácidos, por ejemplo
otros aminoácidos apolares tales como Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro o
Trp, sustituidos en la posición 11 proporcionarán análogos
adicionales de unión a
tPA.
Tras la descripción anterior, la característica
importante para la separación de tPA de cualquier corriente de
alimentación se puede introducir mediante ingeniería en los dominios
de unión de una biblioteca designada, de forma que el procedimiento
de esta invención conduce, invariablemente, a varios candidatos de
ligando de afinidad adecuados para la separación de tPA en
condiciones deseables de unión y liberación. Según la presente
invención se puede alcanzar un elevado rendimiento del tPA sin la
inactivación o alteración del producto, con una pureza elevada, con
la eliminación de impurezas incluso muy estrechamente relacionadas,
a un coste aceptable y con materiales reciclables o reutilizables.
Del estudio de la descripción anterior serán evidentes formas
adicionales de realización de la invención y procedimientos
alternativos adaptados a una forma concreta de tPA o de corriente de
alimentación. Todas estas formas de realización y alternativas debe
interpretarse que están dentro del alcance de esta invención, como
se define en las siguientes reivindicaciones.
Boschetti E., J. Chromatography, A
658: 207-236 (1994).
Ladner, R. C., "Constrained peptides as
binding entities"Trends in Biotecnology, 13 (10).
426-430 (1995).
Markland, W., Roberts, B. L.
Ladner, R. C. "Selection for Protease Inhibitors Using
Bacteriophage display". Methods in Enzymology, 267:
28-51 (1996).
Narayanan. S. R., "Preparative affinity
cromatography of proteins", J. Chrom. A, 658:
237-258, (1994).
Knight, P., Bio/Technology, 8: 200
(1990).
Vedvick, T., Buckholtz, R. G.,
Engel, M., Urcam, M., Kinney, S.,
Provow, S., Siegel, R. S. y Thill, G. P.
"High level secretion of biologically active aprotinin from the
yeast Pichia pastoris", J. Industrial Microbiol., 7:
197-202 (1991).
Wagner, S. L., siegel R. S.,
Vedvick, T. S., Raschke, W. C. y Van Nostrand,
W. E., "High level expression, purification and characterization
of the Kunitz-type protease inhibitro domain of
protease Nexin-2/amyloid
\beta-protein precursor", Biochem. Biophys.
Res. Comm., 186: 1138-1145 (1992).
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: DYAX CORP
\vskip0.800000\baselineskip
- (h)
- SOLICITANTE E INVENTOR: MACLENNAN, John M
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE E INVENTOR:LADNER, Robert C
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Ingeniería de ligandos de afinidad para macromoléculas
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 48
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Banner & Witcoff, Ltd.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 75 State Street
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Boston
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Massachusetts
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 02109
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: DISQUETE, 3,5, MEMORIA DE 1,44 Mb
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Microsoft word 6.0
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 20 de marzo de 1997
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/619.885
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 20 de marzo de 1996
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL AGENTE/ABOGADO
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: YANKWICH, Leon R
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 30.237
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/REGISTRO: DYX-1 PCT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 617-345-9100
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 617-345-9111
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 209 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Val Cys Pro Arg Ile Leu Met Glu Cys Lys
Lys Asp Ser Asp Gys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2)INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 2
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 150 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: fragmento de ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTCTATTCCG GAGCCCGTNN GTGTNNTANA NNTNNTNNGR RGTGTAAGAA
\hfill50
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGATTCTGAT TGCTTAGCAG AATGCGTTTG CCTCGAGCAT GGTTATTGTG
\hfill100
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGCCGGTCC TTCATACATT GAAGGTCGTA TTGTCGGTAG CGCCGCTGAA
\hfill150
\vskip1.000000\baselineskip
(2)INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Pro Lys Thr Ser Leu Gly Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2)INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Leu Cys Pro Lys Thr Tyr Leu Gly Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Ser Thr Tyr Ser Leu Gly Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Ser Thr Tyr Ser Leu Gly Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Leu Cys Pro Lys Thr Ser Leu Glu Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Ser Thr Tyr Ser Leu Gly Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 10
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Leu Cys Pro Lys Thr Ser Leu Glu Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 11
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Ser Lys Ser Ser Leu Glu Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 12
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Leu Cys Pro Lys Thr Asp Leu Gly Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 13
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Pro Lys Ser Ser Met Gly Cys Lys
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 14
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Pro Arg Thr Val Gln Glu Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 15
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 15
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Pro Thr Ala Pro Leu Glu Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2)INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 16
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 16
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Leu Cys Pro Lys Thr Asp Leu Gly Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 17
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 17
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Pro Lys Ser Ala Leu Asp Cys Lys
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 18
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 18
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Thr Lys Thr Ser Arg Glu Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 19
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 19
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Ile Arg Thr Asp Leu Gly Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 20
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 20
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Pro Lys Thr Ser Leu Gly Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 21
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 21
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Pro Arg Thr Val Arg Arg Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 22
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 22
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Pro Lys Thr His Lys Glu Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 23
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 23
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Pro Lys Thr Ser Leu Glu Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 24
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 24
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Pro Lys Ser Thr Leu Gly Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 25
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 25
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Pro Lys Ser Thr Leu Gly Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 26
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 26
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Pro Lys Tyr Thr Leu Glu Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 27
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 27
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Pro Arg Ser Ser Leu Glu Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 28
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 28
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Pro Lys Tyr Thr Leu Glu Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 29
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 29
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Pro Arg Ser Asn Leu Glu Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 30
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 30
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Pro Arg Ser Asn Leu Glu Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 31
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 31
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Pro Lys Tyr Thr Leu Glu Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 32
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 32
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Pro Lys Tyr Thr Leu Glu Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 33
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 33
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Pro Lys Tyr Thr Leu Glu Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu ALa Clu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 34
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 34
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Pro Arg Ser Thr Leu Glu Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 35
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 35
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Pro Lys Thr Ser Leu Gly Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(4) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 36
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 36
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Pro Lys Tyr Thr Leu Glu Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(5) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 37
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 37
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Pro Arg Ser Ser Leu Glu Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(6) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 38
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 38
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Pro Lys Ser Thr Leu Gly Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(7) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 39
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 39
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Pro Arg Ser Ser Leu Glu Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(8) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 40
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 40
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Pro Arg Ser Asn Leu Glu Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(9) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 41
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 41
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Cys Pro Arg Ser Asn Leu Glu Cys Met
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(10) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 42
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 42
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa
Lys Asp Ser Asp Cys}
\sac{Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(11) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 43
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 43
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys
Xaa}
Claims (13)
1. Un ligando de afinidad adecuado para aislar
tPA de una solución que lo contiene, que comprende un polipéptido
que incluye la secuencia de aminoácidos:
Arg-X_{1}-Cys-X_{2}-X_{3}-X_{4}-X_{5}-X_{6}-X_{7}-Cys-X_{8},
en la que X_{1} es Trp o Leu;
X_{2} es Pro, Ser, Thr o Ile; T_{3} es Arg, Lys o Thr; T_{4}
es Ser, Tyr, Thr o Ala; X_{5} es Ser, Tyr, Asp, Val, Pro, Ala,
His, Asn o Thr; X_{6} es Leu, Met, Gln, Arg o Lys; X_{7} es Glu,
Gly o Arg; y X_{8} es Lys, Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro o
Trp.
2. Un ligando de afinidad adecuado para aislar
tPA de una solución que lo contiene, que comprende un polipéptido
que incluye la secuencia de aminoácidos:
Arg-X_{1}-Cys-X_{2}-X_{3}-X_{4}-X_{5}-X_{6}-X_{7}-Cys-X_{8}-Lys-Asp-Ser-Asp-Cys-Leu-Ala-Glu-Cys-Val-Cys-Leu-Glu-His-Gly-Tyr-
Cys-Gly,
Cys-Gly,
en la que X_{1} es Trp o Leu;
X_{2} es Pro, Ser, Thr o Ile; X_{3} es Arg, Lys o Thr; X_{4}
es Ser, Tyr, Thr o Ala; X_{5} es Ser, Tyr, Asp, Val, Pro, Ala,
His, Asn o Thr; X_{6} es Leu, Met, Gln, Arg o Lys; X_{7} es Glu,
Gly o Arg; y X_{8} es Lys, Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro o
Trp.
3. Un ligando de afinidad adecuado para aislar
tPA de una solución que lo contiene, que tiene una secuencia de
aminoácidos que incluye la secuencia de aminoácidos seleccionada del
grupo compuesto por:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
4. Un ligando de afinidad capaz de unirse a tPA
en una solución a pH 7 y de disociarse de tPA a un pH de 5 o
inferior, que incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada del
grupo compuesto por:
Arg-X_{1}-Cys-X_{2}-X_{3}-X_{4}-X_{5}-X_{6}-X_{7}-Cys-X_{8},
en la que X_{1} es Trp o Leu;
X_{2} es Pro, Ser, Thr o Ile; X_{3} es Arg, Lys o Thr; X_{4}
es Ser, Tyr, Thr o Ala; X_{5} es Ser, Tyr, Asp, Val, Pro, Ala,
His, Asn o Thr; X_{6} es Leu, Met, Gln, Arg o Lys; X_{7} es Glu,
Gly o Arg; y X_{8} es Lys, Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro o
Trp;
y
Arg-X_{1}-Cys-X_{2}-X_{3}-X_{4}-X_{5}-X_{6}-X_{7}-Cys-X_{8}-Lys-Asp-Ser-Asp-Cys-Leu-Ala-Glu-Cys-Val-Cys-Leu-Glu-His-Gly-Tyr-
Cys-Gly,
Cys-Gly,
en la que X_{1} es Tyr o Leu;
X_{2} es Pro, Ser, Thr o Ile; X_{3} es Arg, Lys o Thr; X_{4}
es Ser, Tyr, Thr o Ala; X_{5} es Ser, Tyr, Asp, Val, Pro, Ala,
His, Asn o Thr; X_{6} es Leu, Met, Gln, Arg o Lys; X_{7} es Glu,
Gly o Arg; y X_{8} es Lys, Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro o
Trp.
5. Un ligando de afinidad según la reivindicación
3, en el que el ligando de afinidad tiene una secuencia de
aminoácidos que incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada
del grupo compuesto por:
6. Un ligando de afinidad según la reivindicación
3, que incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo
compuesto por:
7. Un procedimiento para aislar un ligando de
afinidad adecuado para separar tPA de una solución que lo contiene,
comprendiendo el procedimiento:
- (a)
- seleccionar una primera condición de solución a la que el ligando de afinidad se unirá al tPA;
- (b)
- seleccionar una segunda condición de solución a la que se disociará un complejo de afinidad entre el tPA y el ligando de afinidad, en el que la segunda condición de solución es diferente de la primera condición de solución;
- (c)
- proporcionar una biblioteca de análogos de un dominio de unión a tPA candidato, en la que cada análogo difiere de dicho dominio de unión a tPA candidato en la variación de la secuencia de aminoácidos en una o más posiciones aminoacídicas dentro del dominio;
- (d)
- poner en contacto dicha biblioteca de análogos con tPA a la primera condición de solución durante el tiempo suficiente para permitir la formación de complejos de unión análogo/tPA.
- (e)
- eliminar los análogos que no se unen en la primera condición de solución;
- (f)
- alterar las condiciones de la solución de contacto de la etapa (e) y convertirla en la segunda condición de solución; y
- (g)
- recuperar los análogos de unión candidatos liberados en la segunda condición de solución, en el que los análogos recuperados identifican los ligandos de afinidad por tPA aislados.
8. Un procedimiento para aislar un ligando de
afinidad adecuado para separar tPA de una solución que lo contiene
según la reivindicación 7, en el que la etapa (c) la biblioteca de
análogos de un dominio de unión a tPA candidato es una biblioteca de
análogos del inhibidor-I de tripsina (ID SEC Nº 1)
de Curcubida maxima preparada mediante la preparación de sustitutos
aminoacídicos en las posiciones aminoacídicas 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y
11; en la etapa (d) la biblioteca de análogos se pone en contacto
con tPA inmovilizado en las condiciones que permiten la formación de
complejos de unión análogo/tPA y a pH 7 o superior; en la etapa (f)
las condiciones de la etapa de contacto se alteran mediante la
disminución del pH hasta pH 5 o inferior; y en la etapa (g) los
análogos de unión candidatos son los que se liberan a pH 5 o
menor.
9. Un procedimiento para purificar tPA de una
solución que contiene tPA, que comprende:
- (a)
- inmovilizar en un soporte cromatográfico un polipéptido que incluye la secuencia de aminoácidos ID SEC Nº 42;
- (b)
- poner en contacto con dicho soporte una solución que contiene tPA a pH 7 o superior;
- (c)
- eliminar otros componentes de dicha solución del contacto de dicho soporte;
- (d)
- recuperar el tPA de dicho soporte a pH 5 o inferior.
10. Un procedimiento para purificar tPA de una
solución que contiene tPA, que comprende:
- (a)
- inmovilizar en un soporte cromatográfico un ligando de afinidad según la reivindicación 2;
- (b)
- poner en contacto con dicho soporte una solución que contiene tPA a pH 7 o superior;
- (c)
- eliminar otros componentes de dicha solución del contacto con dicho soporte;
- (d)
- recuperar el tPA de dicho soporte a pH 5 o inferior.
11. Un procedimiento según la reivindicación 8,
en el que dicho ligando de afinidad tiene una secuencia de
aminoácidos que incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada
del grupo compuesto por:
12. Un procedimiento según la reivindicación 9,
en el que dicho ligando de afinidad tiene una secuencia de
aminoácidos que incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada
del grupo compuesto por:
13. Un procedimiento según la reivindicación 9,
en el que dicho ligando de afinidad tiene una secuencia de
aminoácidos que incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada
del grupo compuesto por:
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| US6197526B1 (en) * | 1999-01-04 | 2001-03-06 | Dyax Corp. | Polypeptides for binding human factor VIII and fragments of human factor VIII |
| US7112438B2 (en) | 1999-01-04 | 2006-09-26 | Dyax Corp. | Binding molecules for human factor VIII and factor VIII-like proteins |
| DE60029029T2 (de) * | 1999-03-26 | 2007-06-14 | City Of Hope, Duarte | Screenen nach FXR-Rezeptormodulatoren |
| US6733451B2 (en) | 1999-10-05 | 2004-05-11 | Omnisonics Medical Technologies, Inc. | Apparatus and method for an ultrasonic probe used with a pharmacological agent |
| US20040097996A1 (en) | 1999-10-05 | 2004-05-20 | Omnisonics Medical Technologies, Inc. | Apparatus and method of removing occlusions using an ultrasonic medical device operating in a transverse mode |
| GB0002660D0 (en) * | 2000-02-04 | 2000-03-29 | Biomade B V | Method of stabilizing a hydrophobin-containing solution and a method of coatinga surface with a hydrophobin |
| PL357939A1 (en) | 2000-04-11 | 2004-08-09 | Genentech, Inc. | Multivalent antibodies and uses therefor |
| ES2317924T3 (es) | 2000-07-27 | 2009-05-01 | Genentech, Inc. | Administracion secuencial de cpt-11 y polipeptido apo-2l. |
| JP5109003B2 (ja) * | 2000-10-13 | 2012-12-26 | 岡野 光夫 | 刺激応答型アフィニティクロマトグラフィー材料等の分離材料および分離精製方法 |
| AU2002303384A1 (en) | 2001-04-17 | 2002-10-28 | William J. Dower | Epitope-captured antibody display |
| US20070160576A1 (en) | 2001-06-05 | 2007-07-12 | Genentech, Inc. | IL-17A/F heterologous polypeptides and therapeutic uses thereof |
| WO2003000113A2 (en) | 2001-06-20 | 2003-01-03 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor |
| JP2005536439A (ja) | 2001-09-18 | 2005-12-02 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 腫瘍の診断及び治療のための組成物と方法 |
| WO2003088808A2 (en) | 2002-04-16 | 2003-10-30 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor |
| NZ556415A (en) | 2002-01-02 | 2009-02-28 | Genentech Inc | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of glioma tumor |
| JP4753578B2 (ja) | 2002-06-03 | 2011-08-24 | ジェネンテック， インコーポレイテッド | 合成抗体ファージライブラリー |
| NZ544317A (en) | 2003-07-08 | 2009-05-31 | Genentech Inc | IL-17 A/F heterologous polypeptides and therapeutic uses thereof |
| CA2747871C (en) | 2003-11-17 | 2018-04-10 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin |
| US7794414B2 (en) | 2004-02-09 | 2010-09-14 | Emigrant Bank, N.A. | Apparatus and method for an ultrasonic medical device operating in torsional and transverse modes |
| US7785903B2 (en) | 2004-04-09 | 2010-08-31 | Genentech, Inc. | Variable domain library and uses |
| CN101175769A (zh) | 2005-03-10 | 2008-05-07 | 健泰科生物技术公司 | 用于调控血管完整性的方法和组合物 |
| EP2614839A3 (en) | 2006-04-05 | 2015-01-28 | Genentech, Inc. | Method for using BOC/CDO to modulate hedgehog signaling |
| AU2007284651B2 (en) | 2006-08-09 | 2014-03-20 | Institute For Systems Biology | Organ-specific proteins and methods of their use |
| WO2008032833A1 (fr) | 2006-09-14 | 2008-03-20 | Medical & Biological Laboratories Co., Ltd. | Anticorps présentant une activité adcc accrue et son procédé de production |
| JP5761915B2 (ja) | 2007-02-22 | 2015-08-12 | ジェネンテック， インコーポレイテッド | 炎症性腸疾患の検出方法 |
| CA2728473A1 (en) | 2008-06-20 | 2009-12-23 | National University Corporation Okayama University | Antibody against oxidized ldl/.beta.2gpi complex and use of the same |
| US9182406B2 (en) | 2008-08-04 | 2015-11-10 | Biodesy, Inc. | Nonlinear optical detection of molecules comprising an unnatural amino acid possessing a hyperpolarizability |
| WO2011050194A1 (en) | 2009-10-22 | 2011-04-28 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for modulating hepsin activation of macrophage-stimulating protein |
| MX2012006072A (es) | 2009-11-30 | 2012-07-23 | Genentech Inc | Composiciones y metodos para el diagnostico y el tratamiento de tumores. |
| KR20130004579A (ko) | 2010-02-23 | 2013-01-11 | 제넨테크, 인크. | 종양의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법 |
| BR112012028010A2 (pt) | 2010-05-03 | 2017-09-26 | Genentech Inc | anticorpo isolado, célula, ácido nucleíco isolado, método de identificação de um primeiro anticorpo que se liga a um epítopo antigênico tat425 ligado or um anticorpo, métodos de inibir o crescimento de uma célula, de tratamento terapêutico de determinação da presença de uma proteína de tat425 e de diagnóstico da presença de um tumor em um mamífero |
| US9428789B2 (en) | 2011-03-21 | 2016-08-30 | Biodesy, Inc. | Classification of kinase inhibitors using nonlinear optical techniques |
| EP2756300A1 (en) | 2011-09-15 | 2014-07-23 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Methods of promoting differentiation |
| US9358250B2 (en) | 2011-10-15 | 2016-06-07 | Genentech, Inc. | Methods of using SCD1 antagonists |
| MX2014008699A (es) | 2012-01-18 | 2014-11-21 | Genentech Inc | Metodos para utilizar moduladores de fgf19. |
| BR112014019741A2 (pt) | 2012-02-11 | 2020-12-22 | Genentech, Inc | Usos de um antagonista da via wnt, uso de uma terapia anticâncer, método de identificação de um indivíduo com câncer, métodos para prever, método de inibição da proliferação de uma célula de câncer, uso de um antagonista da translocação de r-spondina e antagonista da translocação de r-spondina isolado |
| JP2015511598A (ja) | 2012-03-16 | 2015-04-20 | エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | Ｐａｋ１阻害剤を用いて黒色腫を治療する方法 |
| US9139863B2 (en) | 2012-03-16 | 2015-09-22 | Genentech, Inc. | Engineered conformationally-stabilized proteins |
| MX2014010943A (es) | 2012-03-16 | 2014-11-26 | Genentech Inc | Proteinas estabilizadas conformacionalmente de ingenieria. |
| EP2841951B1 (en) | 2012-04-25 | 2019-12-11 | Biodesy, Inc. | Methods for detecting allosteric modulators of proteins |
| WO2013170191A1 (en) | 2012-05-11 | 2013-11-14 | Genentech, Inc. | Methods of using antagonists of nad biosynthesis from nicotinamide |
| EP3633377A1 (en) | 2013-03-15 | 2020-04-08 | F. Hoffmann-La Roche AG | Biomarkers and methods of treating pd-1 and pd-l1 related conditions |
| WO2015116902A1 (en) | 2014-01-31 | 2015-08-06 | Genentech, Inc. | G-protein coupled receptors in hedgehog signaling |
| CA2944717A1 (en) | 2014-05-23 | 2015-11-26 | Genentech, Inc. | Mit biomarkers and methods using the same |
| WO2015196070A1 (en) | 2014-06-20 | 2015-12-23 | Genentech, Inc. | Chagasin-based scaffold compositions, methods, and uses |
| EP3237906B8 (en) | 2014-12-23 | 2020-10-28 | Bluelight Therapeutics, Inc. | Attachment of proteins to interfaces for use in nonlinear optical detection |
| WO2016146174A1 (en) * | 2015-03-17 | 2016-09-22 | Biontech Ag | Compositions and methods for diagnosis and treatment of cancer |
| CA2980189A1 (en) | 2015-04-24 | 2016-10-27 | Genentech, Inc. | Multispecific antigen-binding proteins |
| JP2019534858A (ja) | 2016-09-09 | 2019-12-05 | ジェネンテック， インコーポレイテッド | Ｆｒｉｚｚｌｅｄの選択的ペプチド阻害剤 |
| FR3056753B1 (fr) | 2016-09-23 | 2021-01-01 | Plant Advanced Tech Pat | Procede de determination de l’affinite entre des ligands et une cible |
| WO2018152496A1 (en) | 2017-02-17 | 2018-08-23 | The Usa, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of zika virus infection |
| EP4230649A3 (en) | 2017-04-25 | 2023-10-25 | The U.S.A. As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Antibodies and methods for the diagnosis and treatment of epstein barr virus infection |
| EP3655430A1 (en) | 2017-07-19 | 2020-05-27 | The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Antibodies and methods for the diagnosis and treatment of hepatitis b virus infection |
| BR112021008878A2 (pt) * | 2018-11-08 | 2021-08-31 | Unilever Ip Holdings B.V. | Método de tratamento de uma superfície e uso de uma lactama |
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| AR122263A1 (es) | 2019-05-09 | 2022-08-31 | Genentech Inc | Métodos para producir anticuerpos |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3382389D1 (de) * | 1982-12-14 | 1991-10-02 | South African Inventions | Plasminogenaktivator. |
| JPS6119485A (ja) * | 1984-07-06 | 1986-01-28 | Nippon Kayaku Co Ltd | プロテア−ゼ吸着体 |
| US4898825A (en) * | 1986-05-07 | 1990-02-06 | Mitsui Toatsu Chemicals, Incorporated | Methods for purification of single-chain and double-chain tissue plasminogen activator |
| US5133866A (en) * | 1988-03-24 | 1992-07-28 | Terrapin Technologies, Inc. | Method to identify analyte-bending ligands |
| CA1341598C (en) * | 1988-07-15 | 2009-09-29 | Central Sydney Area Health Service | Acid-labile sub-unit (als) of insulin-like growth factor binding proteincomplex |
| US5223409A (en) * | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
| US5216128A (en) * | 1989-06-01 | 1993-06-01 | Yeda Research And Development Co., Ltd. | IFN-β2/IL-6 receptor its preparation and pharmaceutical compositions containing it |
| US5227297A (en) * | 1990-04-17 | 1993-07-13 | Smithkline Beecham Corporation | Affinity purification ligands |
| US5141862A (en) * | 1990-04-17 | 1992-08-25 | Smithkline Beecham Corporation | Method of purifying tpa or plasminogen activator using a tripeptide of the formula: -X-Y-argininal wherein X and Y are selected from the group consisting of pro,phe,trp and tyr |
| JP2661790B2 (ja) * | 1990-11-27 | 1997-10-08 | 電気化学工業株式会社 | 入尿トリプシンインヒビターの精製方法 |
| EP0907887A4 (en) * | 1996-03-20 | 2002-10-30 | Dyax Corp | Affinity ligands for macromolecules obtained through genetic manipulation |
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