ES2226549B1 - Metodo para el diagnostico de esteatohepatitis no alcoholica (nash) mediante el empleo de marcadores moleculares. - Google Patents
Metodo para el diagnostico de esteatohepatitis no alcoholica (nash) mediante el empleo de marcadores moleculares.Info
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Abstract
Método para el diagnóstico de esteatohepatitis no alcohólica (NASH) mediante el empleo de marcadores moleculares. El método comprende detectar y cuantificar in vitro, en una muestra de tejido hepático, los niveles de una proteína útil como marcador molecular de NASH, seleccionada entre apolipoproteína A1, subunidad {be} de la ATPasa mitocondrial, leucotrieno A4 hidrolasa, keratina 18, guanidina acetato N-metiltransferasa, superóxido dismutasa, albúmina, proteína antioxidante 2 (isoforma 1), prohibitina 1, metionina adenosil transferasa, acil CoA deshidrogenasa de cadena larga, proteína de unión al selenio, proteína antioxidante 2 (isoforma 2), y combinaciones de las misma, y comparar los resultados obtenidos con los valores normales de dichas proteínas en tejido hepático sano. Dicho método permite diagnosticar NASH y/o evaluar el riesgo potencial de un sujeto a desarrollar NASH.
Description
Método para el diagnóstico de esteatohepatitis no
alcohólica (NASH) mediante el empleo de marcadores moleculares.
La invención se relaciona, en general, con el
diagnóstico de la esteatohepatitis no alcohólica (NASH), en
particular, con el diagnóstico precoz de la predisposición de un
sujeto a desarrollar dicha enfermedad o con la confirmación de que
un sujeto padece dicha enfermedad, basado en la identificación de
unos marcadores moleculares de dicha enfermedad y/o en el análisis
de los perfiles de expresión en hígado de dichos marcadores
moleculares de NASH.
La esteatohepatitis no alcohólica (NASH) es una
lesión aguda del hígado que se caracteriza por la aparición de
necrosis, inflamación y fibrosis. La NASH y la esteatohepatitis
alcohólica (ASH) son indistinguibles histológicamente y se piensa
que tienen la misma etiología. En la actualidad se considera que la
NASH es una enfermedad progresiva con un 25% de incidencia de
cirrosis y un 10%-15% de incidencia de mortalidad. Además, se cree
que es la causa de enfermedad hepática en la mayoría de los casos
de cirrosis criptogenética (causa desconocida). Por tanto, el
estudio de la NASH se ha convertido en uno de los temas
prioritarios de la hepatología clínica. Una revisión de la NASH, su
epidemiología, características, estrategias de diagnóstico y
tratamiento ha sido elaborada por Andrea E. Reid [Reid A.E.,
Gastroenterology, 2001, 121:710-723].
Para hacerse una idea de la magnitud del
problema, basta con indicar algunos datos epidemiológicos de la
NASH:
- -
- entre el 7% y el 11% de los pacientes que se someten a biopsia hepática en Estados Unidos y Canadá se detecta NASH;
- -
- las mujeres representan entre el 60%-83% de los pacientes con NASH;
- -
- alrededor del 30% de los pacientes obesos tienen NASH;
- -
- la aparición de fibrosis se detecta en el 43% de los pacientes con NASH;
- -
- la incidencia de cirrosis en pacientes con NASH es de aproximadamente el 25%;
- -
- todos los pacientes que desarrollan cirrosis alcohólica (aproximadamente el 50% de todas las cirrosis) han desarrollado previamente ASH; y
- -
- la NASH es frecuente en los pacientes con hepatitis C.
Debido a esta posición prominente de la NASH
entre las enfermedades crónicas y progresivas del hígado, existe un
interés creciente en determinar su patogénesis. Sin embargo, los
mecanismos patofisiológicos que conducen a la aparición de NASH no
han sido aún determinados. Los alcohólicos pueden tener un hígado
moderadamente graso durante muchos años y, sin ningún cambio en sus
hábitos de bebida, desarrollar repentinamente hepatitis alcohólica
aguda. Similarmente, la obesidad, la diabetes tipo 2 y la
hipertrigliceridemia se asocian frecuentemente con la acumulación
hepática de grasa y, aunque esta situación no conduce
invariablemente a la aparición de lesiones necroinflamatorias, estos
pacientes tienen mayor riesgo de desarrollar NASH. Consecuentemente,
se ha propuesto la existencia de factores ambientales o celulares
que actúen como interruptores de una cascada de eventos moleculares
que inducen necrosis, inflamación y fibrosis. Dos de estas posibles
causas son la endotoxemia portal y la peroxidación lipídica.
Asimismo se han identificado alteraciones en la expresión de
diversos genes/proteínas, tales como CYP2E1, CYP4A, UCP2, en la NASH
y en la ASH, pero ninguno de estos genes tiene valor diagnóstico o
predictivo del desarrollo de la enfermedad con el tiempo.
Actualmente, la mayoría de los pacientes con NASH
son evaluados a causa de unos resultados de análisis de la función
hepática elevados y crónicos (e.g., elevación moderada crónica de
aminotransferasas), hepatomegalia o por ambos motivos. La
combinación del historial clínico, examen físico, análisis de
sangre, exámenes radiológicos e histológicos permite excluir otras
causas de enfermedad hepática. El análisis de sangre debe incluir un
perfil hepático completo, incluyendo, por ejemplo, el recuento de
células sanguíneas y la determinación de anticuerpos
anti-HCV, antígeno de superficie de la hepatitis B,
índice de hierro, ceruloplasmina, anticuerpo antinuclear,
\alpha_{1}-antitripsina y anticuerpo
antimitocondrial. El diagnóstico por imagen, por ejemplo, mediante
ultrasonografía hepática, la modalidad de diagnóstico por imagen
preferida, revela la existencia de un hígado "brillante" de
ecogenicidad aumentada. No obstante, la sensibilidad y especificidad
de esta técnica de diagnóstico por imagen es de un 89%-95% y de un
84%-93%, respectivamente, para la esteatosis. La existencia de un
hígado graso también puede ser diagnosticada mediante tomografía
computerizada o mediante resonancia magnética abdominal. A pesar de
todo, los datos clínicos, analíticos y radiológicos no permiten
diferenciar entre NASH y la hepatitis alcohólica ya que ambas
patologías son histológicamente idénticas (presencia de esteatosis
macrovesicular difusa o centrilobular, hepatocitos inflados,
necrosis, infiltrado inflamatorio lobular mixto, con o sin fibrosis,
cuerpos de Mallory, lipogranulomas y núcleos glicogenazos). Por
tanto, el diagnóstico de NASH sólo se confirma en casos de ausencia
de consumo significativo de alcohol (típicamente menos de
20-40 g alcohol/día). Los marcadores moleculares que
se han propuesto hasta la fecha (CYP2E1, CYP4A, UCP2) no tienen
valor diagnóstico o predictivo del desarrollo de la enfermedad con
el tiempo.
Existe, por tanto, la necesidad de disponer de
herramientas que permitan estudiar la progresión de NASH a lo largo
del tiempo e identificar marcadores moleculares asociados con NASH.
Este tipo de herramientas podría ser un modelo animal que permitiera
analizar el perfil de expresión de genes y proteínas en hígado
normal y en hígado con NASH, así como durante la progresión de la
enfermedad con el tiempo. La identificación de dichos marcadores
moleculares, en particular, marcadores moleculares tempranos, con
valor diagnóstico y predictivo de NASH, y el estudio de sus efectos
funcionales, ayudaría en la prevención y/o tratamiento de la NASH
así como en la búsqueda y desarrollo de fármacos útiles para el
tratamiento, preventivo y/o curativo, de NASH. Un buen marcador
molecular de NASH sería aquél que apareciera tempranamente en el
hígado, mucho antes de que se observaran alteraciones histológicas.
Idealmente, para diagnosticar con eficiencia el riesgo a padecer
NASH se debería disponer, más que de un único marcador molecular, de
un conjunto de marcadores moleculares tempranos de la aparición de
NASH, que constituyeran algo así como la "huella molecular"
temprana de la enfermedad.
En esa línea de experimentación, se ha
desarrollado un modelo para el estudio in vivo de NASH. Se
trata de un ratón knockout deficiente en el gen MAT1A, es
decir, en la síntesis de S-adenosilmetionina
(AdoMet) en hígado, un metabolito esencial en las células, al que se
le ha denominado MATO (Lu S.C., et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 2001; 98:5560-5565). Estos ratones MATO
desarrollan espontáneamente, además de NASH, estrés oxidativo y
carcinoma hepatocelular (Martínez-Chantar M.L.,
et al., Faseb J., 2002, 16:1292-1294). El gen
MAT1A se expresa específicamente en el hígado adulto, aunque
se ha demostrado que la expresión de ese gen se encuentra silenciada
en pacientes con cirrosis hepática (tanto de origen alcohólico como
no alcohólico). A los 3 meses de edad, el hígado de los ratones MATO
es normal pero es mucho más susceptible de desarrollar esteatosis
macrovesicular severa (inducida por una dieta deficiente en colina)
y necrosis (inducida por CCl_{4}); a los 8 meses de edad
desarrollan espontáneamente NASH; y a los 14-18
meses de edad tienen un elevado riesgo de desarrollar carcinoma
hepatocelular (más del 80% de los animales desarrollan tumores
hepáticos). Experimentos preliminares de DNA microarray (Lu S.C.,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001;
98:5560-5565) indican que a los 3 meses de edad
(cuando la histología del hígado es aún normal) ya existen cientos
de diferencias en la expresión de genes y proteínas entre los
ratones normales o tipo salvaje (WT) y los ratones MATO. Es decir,
mucho antes de observarse una lesión histológica en el hígado, la
enfermedad hepática ya se ha iniciado a nivel molecular, aunque
muchas de dichas diferencias no se mantienen durante la progresión
de la enfermedad.
Un objetivo de esta invención consiste en el
desarrollo de un método para el diagnóstico de NASH basado en el
análisis de los perfiles de expresión en hígado de unas proteínas
concretas que actúan como marcadores moleculares de dicha
enfermedad.
Para identificar los marcadores moleculares de
NASH y obtener la huella molecular de dicha enfermedad, los
inventores han analizado la expresión diferencial de proteínas
mediante técnicas de proteómica (electroforesis bidimensional e
identificación de las proteínas diferencialmente expresadas
mediante espectrometría de masas) en muestras de hígado de ratones
WT y MATO [ratones mutantes knockout deficientes en el gen
MAT1A (MAT1A-/-) (Lu S.C., et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 2001; 98:5560-5565)] a lo largo del
tiempo (1 y 15 días, 3 y 8 meses de edad) hasta la aparición de
NASH. Dichos ratones mutantes MATO se eligieron porque podían
utilizarse para estudiar la aparición de marcadores moleculares de
NASH antes de que la enfermedad se hiciera evidente a nivel
histológico.
Todos los ratones fueron tratados con una dieta
normal. La aparición y evolución de NASH se siguió mediante control
histológico. El análisis de esta información ha permitido
identificar unas proteínas cuya expresión se encuentra alterada,
bien aumentada o bien disminuida, desde el primer día después del
nacimiento de un sujeto susceptible de desarrollar NASH hasta la
aparición de NASH. Estas proteínas, útiles como marcadores
moleculares de NASH, son las siguientes: apolipoproteína A1,
subunidad \beta de la ATPasa mitocondrial, leucotrieno A4
hidrolasa, keratina 18, guanidina acetato
N-metiltransferasa, superóxido dismutasa, albúmina,
proteína antioxidante 2 (isoforma 1), prohibitina 1, metionina
adenosil transferasa, acil CoA deshidrogenasa de cadena larga,
proteína de unión al selenio y proteína antioxidante 2 (isoforma
2). Las proteínas apolipoproteína A1, subunidad \beta de la
ATPasa mitocondrial, leucotrieno A4 hidrolasa, keratina 18,
guanidina acetato N-metiltransferasa, superóxido
dismutasa, albúmina y proteína antioxidante 2 (isoforma 1),
aumentan su expresión en el hígado, mientras que las proteínas
prohibitina 1, metionina adenosil transferasa, acil CoA
deshidrogenasa de cadena larga, proteína de unión al selenio y
proteína antioxidante 2 (isoforma 2) disminuyen su expresión en el
hígado, meses antes de la aparición de NASH en el hígado de ratones
MATO. Estas proteínas pueden utilizarse como marcadores moleculares
del riesgo a desarrollar la NASH, bien de forma aislada o combinada,
considerando el perfil de expresión de la totalidad o de una parte
de dichas proteínas, para determinar la huella molecular de
NASH.
La apolipoproteína A1 (APA1) es el componente
proteico de una lipoproteína que transporta lípidos en la sangre.
Se han descrito variaciones en los niveles de APA1 asociados a la
fibrosis hepática [Teare J.P., et al., Lancet (North American
Edition), 1993, 342:895-898].
La subunidad \beta de la ATPasa (ATPB)
mitocondrial es un componente de la ATPasa (o ATP sintasa)
mitocondrial, enzima que cataliza la síntesis de ATP a partir de ADP
y fosfato inorgánico en mitocondrias utilizando la energía derivada
de un gradiente de protones.
La leucotrieno A4 hidrolasa o LKHA es una enzima
implicada en la biosíntesis de leucotrienos y es un marcador de la
inflamación en general [Eberhard J., 2002, Virchows Archiv,
440(6):627-634].
Se ha descrito que tanto en la NASH como en la
ASH existe una alteración en la relación keratina 18/keratina 8
[Denk H., et al., Der Pathologe, 2001,
22(6):388-398]. Además, los niveles de
keratina 18 (K1CR) son indicadores de otras enfermedades hepáticas,
tales como el carcinoma hepático, la hepatitis crónica, la hepatitis
alcohólica y la cirrosis criptogénica Caulin C., Journal of Cell
Biology, 2000, 149(1):17-22; Toivola D.M.,
et al., Experimental Cell Research, 2000,
255(2):156-170; Stumptner C., et al.,
Hepatology, 1997, 26(4, parte 2):194A; Ku
Nam-On, et al., Journal of Clinical
Investigation, 1997, 99(1):19-23].
La guanidina acetato
N-metiltransferasa (GAMT) es una proteína implicada
en el último paso de la biosíntesis de creatinina. La superóxido
dismutasa (SODC) es una proteína que destruye radicales tóxicos para
las células. La albúmina (ALBU) es una proteína de bajo peso
molecular soluble en soluciones salinas diluidas y en agua con
capacidad para unir agua, iones (sodio, potasio o calcio), ácidos
grasos, hormonas, etc. La proteína antioxidante 2 (AOP2) protege
frente al daño oxidativo. La metionina adenosil transferasa (MAT)
cataliza la formación de AdoMet a partir de metionina y ATP. La acil
CoA deshidrogenasa de cadena larga (ACDL) es una enzima implicada en
el sistema de la beta-oxidación de los ácidos grasos
mitocondrial. La proteína de unión al selenio (SBP) une selenio y
acetaminofeno.
La prohibitina 1 (PHB1) es una proteina asociada
a la membrana interna de la mitocondria, cuya función se ha
relacionado con el plegamiento y estabilización de proteínas
implicadas en la respiración mitocondrial. La deficiencia en PHB1 se
ha asociado con una alteración de la función de la mitocondria y a
un envejecimiento prematuro. Se ha descrito su relación con el
cáncer de hígado [Seow T.K., et al., Electrophoresis, 2000,
21(9):1787-1813].
No se ha establecido previamente ninguna relación
entre la expresión de dichas proteínas y el desarrollo de NASH, por
lo que ha resultado sorprendente su empleo como marcadores
moleculares de dicha enfermedad y como huella molecular de la
misma.
Por tanto, un aspecto de esta invención lo
constituye un método para la recogida de datos que permita el
diagnóstico precoz de NASH o su confirmación, que comprende
detectar y cuantificar in vitro, en una muestra de tejido
hepático procedente de un sujeto, los niveles (concentración) de
una proteína seleccionada entre apolipoproteína A1, subunidad
\beta de la ATPasa mitocondrial, leucotrieno A4 hidrolasa,
keratina 18, guanidina acetato N-metiltransferasa,
superóxido dismutasa, albúmina, proteína antioxidante 2 (isoforma
1), prohibitina 1, metionina adenosil transferasa, acil CoA
deshidrogenasa de cadena larga, proteína de unión al selenio,
proteína antioxidante 2 (isoforma 2), y combinaciones de las mismas,
y comparar los resultados obtenidos con los valores normales, de
referencia, de dichas proteínas en tejido hepático obtenidos a
partir de hígados sanos. En una realización particular, dicha
proteína se selecciona entre apolipoproteína A1, subunidad \beta
de la ATPasa mitocondrial, leucotrieno A4 hidrolasa, keratina 18,
prohibitina1 y combinaciones de las mismas.
El método proporcionado por esta invención
permite evaluar, de forma sencilla y fiable, el riesgo potencial de
un sujeto a desarrollar NASH. Dicho sujeto puede ser un sujeto al
que no se la ha diagnosticado previamente NASH, o bien un sujeto al
que se le ha diagnosticado NASH pero que se desea confirmar dicho
diagnóstico. Por tanto, en una realización particular dicho método
permite evaluar la predisposición (diagnóstico precoz o pronóstico)
de un sujeto a desarrollar NASH, mientras que en otra realización
particular, dicho método permite confirmar (diagnosticar) la
existencia de NASH en un sujeto.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el
empleo de una proteína seleccionada entre apolipoproteína A1,
subunidad \beta de la ATPasa mitocondrial, leucotrieno A4
hidrolasa, keratina 18, guanidina acetato
N-metiltransferasa, superóxido dismutasa, albúmina,
proteína antioxidante 2 (isoforma 1), prohibitina 1, metionina
adenosil transferasa, acil CoA deshidrogenase de cadena larga,
proteína de unión al selenio, proteína antioxidante 2 (isoforma 2),
y sus combinaciones, en un método in vitro para diagnosticar
NASH, o para evaluar la predisposición de un sujeto a desarrollar
NASH.
La Figura 1 recoge la relación de las proteínas
expresadas de forma diferencial en el hígado de ratones mutantes
MAT1A-/- durante la progresión de NASH. Extractos hepáticos
de ratones WT y MAT1A-/- de 1, 15, 90 y 240 días de edad
fueron analizados mediante electroforesis bidimensional. Las
proteínas expresadas diferencialmente fueron identificadas mediante
espectrometría de masas MALDI TOFF y se agruparon en base a los
procesos biológicos en los que están implicadas según los criterios
de Ontología de Genes: (1) Comunicación celular; (2) Crecimiento
celular y/o mantenimiento; (3) Procesos de desarrollo.
La Figura 2 es un panel que ilustra las
alteraciones metabólicas en el hígado de ratones mutantes
MAT1A-/- durante la progresión de NASH. Las enzimas
metabólicas cuya expresión aumentaba o disminuía en el hígado de
ratones mutantes MAT1A-/- de 1, 15, 90 y 240 días de edad
fueron mapeadas en el panel "Biochemical Pathways" de
Boehringer Mannheim (http://www.expasy.org) utilizando el
programa GARBAN desarrollado en la Universidad de Navarra.
La Figura 3A muestra los resultados de un
análisis Western blot, en concreto, muestra los niveles hepáticos de
PHB1, COX I, COX II, ATPB, en estado estacionario, en el hígado de
ratones WT y MAT1A-/-. Extractos de hígado (15 \mug/calle)
de ratones de 1 a 240 días de edad fueron analizados mediante
Western blot. Para asegurarse de que la carga era la misma se
efectuó una tinción de las membranas con
Rojo-Ponceau. La Figura 3B muestra los resultados de
un análisis Northern blot, en concreto de la expresión de PHB1, COX
II, ATPB, y rRNA 16S en hígados de ratones WT y MAT1A-/-. Las
muestras de RNA de hígado (30 \mug/calle) de ratones de 90 días de
edad fueron analizadas mediante un análisis de hibridación Northern
blot utilizando sondas específicas. Las membranas se hibridaron con
una sonda para rRNA 18S con el fin de comprobar que las cargas eran
iguales. La Figura 3C muestra los resultados de un análisis de
Southern, en concreto de DNA mitocondrial en ratones MAT1A-/-
respecto a ratones WT. DNA total fue aislado de ratones de 3 meses
de edad, escindido con EcoRI y utilizado en un análisis
Southern con una sonda específica para COX II. Cantidades
equivalentes de DNA en cada calle fueron aseguradas mediante tinción
del gel con bromuro de etidio. Se muestran manchas representativas
de 3 experimentos independientes.
La Figura 4 es un diagrama de barras que muestra
el potencial de la membrana interna de la mitocondria. La
funcionalidad de la membrana fue estudiada mediante la medida de
dicho gradiente en un fracción mitocondrial enriquecida de hígados
de ratones WT y MAT1A-/- de 3 meses. El valor del 100% fue
175,51 \pm 6,69 unidades de fluorescencia/mg proteína. Se
representa la media de tres experimentos.
La Figura 5 ilustra la regulación de los niveles
de PHB1 por AdoMet en hepatocitos de rata en cultivo. Los niveles
de PHB1 fueron medidos en hepatocitos de rata en cultivo durante 12
ó 24 horas en presencia o ausencia de metionina 100 \muM, AdoMet
4 mM o cicloleucina 20 mM. Extractos de hígado (15 \mug/calle)
fueron analizados mediante Western blot utilizando anticuerpos
específicos. Para asegurarse de que la carga era la misma se
efectuó una tinción de las membranas con
Rojo-Ponceau. Cada mancha mostrada es
representativa de 3 experimentos independientes.
La Figura 6A muestra los niveles hepáticos de
PHB1, COX I y COX II, en estado estacionario, en el hígado de
ratones WT y ob/ob. Cada mancha mostrada es representativa
de 3 experimentos independientes. La Figura 6B muestra los niveles
hepáticos de PHB1 y COX I, en estado estacionario, en el hígado de
pacientes control y obesos. Extractos de hígado (15 \mug/calle)
fueron analizados mediante Western blot utilizando anticuerpos
específicos. Para asegurarse de que la carga era la misma se efectuó
una tinción de las membranas con Rojo-Ponceau.
En un aspecto, la invención se relaciona con un
método in vitro para diagnosticar NASH, o para evaluar la
predisposición de un sujeto a desarrollar NASH. Un método como el
proporcionado por esta invención permite evaluar la predisposición o
riesgo de un sujeto a desarrollar NASH, es decir, permite
determinar aquéllos sujetos que, dentro de un grupo o población de
sujetos, presentan un mayor riesgo a desarrollar NASH. A modo
ilustrativo, se puede analizar un sujeto al que previamente no se le
ha diagnosticado NASH, o que carece de síntomas, con el fin de
obtener información sobre la posibilidad de que dicho sujeto
desarrolle NASH en un futuro.
Asimismo, dicho método puede utilizarse tanto con
fines de diagnóstico (método de diagnóstico) como con fines de
pronóstico (método de pronóstico). Un método de diagnóstico se
refiere a un ensayo realizado sobre un sujeto que presenta síntomas
que podrían ser de NASH. Un método de pronóstico se refiere a un
método que ayuda a predecir, al menos en parte, el curso de la
enfermedad. En este sentido, se puede analizar un sujeto al que se
le ha diagnosticado previamente NASH para conocer el progreso de la
enfermedad, así como la posibilidad de que responda favorablemente a
un tratamiento terapéutico concreto.
El término "sujeto" tal como se utiliza en
la presente invención incluye seres humanos y animales, por
ejemplo, mamíferos. En una realización particular dichos sujetos
son seres humanos, hembras o machos, de cualquier edad o raza.
El término "esteatohepatitis no alcohólica"
o "NASH" se utiliza en el sentido actualmente admitido por la
comunidad científica.
De forma más concreta, la invención proporciona
un método que comprende:
- a)
- recoger una muestra de tejido hepático de un sujeto;
- b)
- detectar y cuantificar en dicha muestra de tejido hepático el nivel de una proteína seleccionada entre apolipoproteína A1 (APA1), subunidad \beta de la ATPasa mitocondrial (ATPB), leucotrieno A4 hidrolasa (LKHA), keratina 18 (K1CR), guanidina acetato N-metiltransferasa (GAMT), superóxido dismutasa (SODC), albúmina (ALBU), proteína antioxidante 2 (AOP2) (isoformas 1 y 2), prohibitina 1 (PHB1), metionina adenosil transferasa (MAT), acil CoA deshidrogenasa de cadena larga (ACDL), proteína de unión al selenio (SBP), y combinaciones de las mismas; y
- c)
- comparar los resultados obtenidos en la etapa b) con los valores normales, de referencia, para dichas proteínas en tejido hepático.
La muestra de tejido hepático a analizar puede
ser una muestra de tejido hepático de cualquier parte del hígado del
sujeto cuya predisposición a desarrollar NASH, o diagnosticar NASH,
se desea conocer. Dicha muestra de tejido hepático procedente de
dicho sujeto puede ser obtenida por cualquier método convencional,
por ejemplo, mediante biopsia.
La detección y cuantificación en una muestra de
tejido hepático de los niveles (concentración) de dichas proteínas
APA1, ATPB, LKHA, K1CR, GAMT, SODC, ALBU, AOP2 (isoforma 1), AOP2
(isoforma 2), PHB1, MAT, ACDL y/o SBP puede realizarse mediante el
empleo de anticuerpos específicos frente a dichas proteínas,
mediante técnicas de ELISA o Western blot. Alternativamente, dichas
proteínas pueden detectarse y cuantificarse mediante el empleo de
dispositivos de tipo biochip o microarray de proteínas que incluyan
anticuerpos específicos frente a las proteínas a detectar, por
ejemplo, microarrays de detección, que permiten la detección de
proteínas diana y su cuantificación (Huang, RP. Detection of
multiple proteins in an antibody-based protein
microarray system. Journal of Immunological Methods 225 (2001):
1-13). El término "anticuerpo" tal como aquí
se utiliza incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos
policlonales, fragmentos recombinantes de anticuerpos, combibodies,
fragmentos Fab y scFv de anticuerpos, así como los dominios de
unión a ligando.
Aunque, en principio, bastaría con detectar y
cuantificar el nivel de una de dichas proteínas, en la práctica, es
preferible, detectar y cuantificar el nivel de dos o más de dichas
proteínas, con el fin de obtener la huella molecular del sujeto en
lo relativo a su predisposición a desarrollar NASH o a confirmar un
diagnóstico de NASH.
Los resultados obtenidos en la etapa b),
relativos a la detección y cuantificación de las proteínas APA1,
ATPB, LKHA, KICR, GAMT, SODC, ALBU, AOP2 (isoforma 1), AOP2
(isoforma 2), PHB1, MAT, ACDL y/o SBP, en la muestra de tejido
hepático, se comparan con los valores normales, de referencia, para
dichas proteínas en tejido hepático procedente de hígados sanos.
Dichos valores normales, de referencia, de dichas proteínas en
tejido hepático pueden obtenerse mediante el análisis y
cuantificación de dichas proteínas en muestras de tejido hepático
procedentes de hígados normales, es decir, de hígados procedentes
de sujetos que no han desarrollado NASH ni ninguna otra enfermedad
hepática que pudiera dar lugar a unos valores de referencia
inadecuados para dichas proteínas. En general, los incrementos o
disminuciones en los niveles de las proteínas marcadoras se estiman
mediante la comparación de los resultados obtenidos de los análisis
de las muestras correspondientes a los sujetos del ensayo con los
resultados de las muestras controles, que se analizan en paralelo.
En cada ensayo, cada sujeto se comparará con muestras controles
validadas previamente.
Cuando la comparación de los resultados obtenidos
en la etapa b) con los valores normales, de referencia, indica
que:
- (i)
- el nivel (concentración) de, al menos, una de las proteínas APA1, ATPB, LKHA, K1CR, GAMT, SODC, ALBU o AOP2 (isoforma 1), es superior al límite superior de los valores normales, de referencia, para dichas proteínas en tejido hepático; y/o
- (ii)
- el nivel (concentración) de, al menos, una de las proteínas PHB1, AOP2 (isoforma 2), MAT, ACDL o SBP es inferior al límite inferior de los valores normales, de referencia, para dichas proteínas en tejido hepático,
entonces, dichos resultados son
indicativos de la existencia de NASH en el sujeto cuya muestra de
tejido hepático ha sido ensayada o bien de la existencia de una
predisposición o riesgo elevado de dicho sujeto a desarrollar NASH
en un
futuro.
Un método como el descrito previamente permite
obtener datos que permiten el diagnóstico precoz de NASH o su
confirmación.
En una realización particular y preferida del
método proporcionado por esta invención, la proteína marcadora de
NASH se selecciona entre APA1, ATPB, LKHA, K1CR, PHB1 y
combinaciones de las mismas. En este caso, un nivel (concentración)
de, al menos, una de las proteínas APA1, ATPB, LKHA o K1CR, superior
al límite superior de los valores normales, de referencia, para
dichas proteínas en tejido hepático, y/o un nivel (concentración) de
PHB1 inferior al límite inferior de los valores normales, de
referencia, para dicha proteína en tejido hepático, es indicativo de
la existencia de NASH en el sujeto cuya muestra de tejido hepático
ha sido ensayada o bien de la existencia de una predisposición o
riesgo elevado de dicho sujeto a desarrollar NASH en un futuro.
Aunque, en principio, bastaría con detectar y cuantificar el nivel
de una de dichas proteínas, en la práctica es recomendable detectar
y cuantificar el nivel de, al menos, dos de ellas, preferentemente,
tres, más preferentemente, cuatro y, aún más preferentemente, los
niveles de las cinco proteínas mencionadas ya que ello permitiría
obtener la huella molecular del sujeto en lo relativo a su
predisposición a desarrollar NASH o a confirmar un diagnóstico de
NASH.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el
empleo de una proteína seleccionada entre APA1, ATPB, LKHA, K1CR,
GAMT, SODC, ALBU, AOP2 (isoforma 1), AOP2 (isoforma 2), PHB1, MAT,
ACDL, SBP y/o sus combinaciones, preferentemente, entre APA1, ATPB,
LKHA, K1CR, PHB1, y/o sus combinaciones, en un método in
vitro para diagnosticar NASH, o para evaluar la predisposición
de un sujeto a desarrollar NASH.
El siguiente Ejemplo sirve para ilustrar la
invención y no debe ser considerado en sentido limitativo de la
misma.
Se han investigado los mecanismos moleculares
implicados en la progresión de NASH en el hígado de ratones
MAT1A-/- mediante una aproximación proteómica de alto
rendimiento.
Los anticuerpos anti-citocromo c
oxidasa subunidades I y II eran de Molecular Probes. El anticuerpo
anti-prohibitina 1 era de Calbiochem. El anticuerpo
anti-subunidad \beta de la ATP sintasa de
mitocondria era de Molecular Probes. Los reactivos de electroforesis
eran de Bio-Rad. La tripsina, de Promega; la urea y
la colagenasa, de Gibco BRL; y la tiourea, de Merck. El resto de
los reactivos químicos era de Sigma.
Los animales [ratones tipo salvaje (WT) y
mutantes knockout deficientes en el gen MAT1A
(MAT1A-/-) o ratones MATO (Lu S.C., et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 2001; 98:5560-5565)]
procedían de la colonia endogámica de los propios solicitantes y
fueron tratados de forma humanitaria de acuerdo con las guías
institucionales de los solicitantes. Los ratones ob/ob se
adquirieron a Jackson Laboratories (Bar Harbor, MI). Las muestras
humanas fueron obtenidas en el Hospital Príncipe de Asturias, cuyo
comité para la supervisión de investigación humana aprobó este
estudio.
Las muestras de hígado fueron homogeneizadas en
20 volúmenes de tampón de lisis que contenía urea 7 M, tiourea 2 M,
CHAPS 4%, DTT 1% y 3-10 anfolitos
Bio-Lyte 0,5%. Los homogeneizados fueron
centrifugados a 100,000 x g durante 45 minutos a 15°C. La
concentración de proteína fue determinada en los sobrenadantes
mediante el empleo del kit de ensayo Bradford
(Bio-Rad) utilizando albúmina diluida en tampón de
ruptura como patrón. La primera separación, por isoelectroenfoque,
se realizó en una célula Protean IEF (Bio-Rad)
utilizando tiras de 17 cm ReadyStrips IPG con diferentes intervalos
de pH. Las muestras (300-700 \mug de proteína) se
cargaron y se realizó una rehidratación activa durante 12 h a 50 V
y 20°C. Los geles se corrieron a 60.000 Vh utilizando un protocolo
de aumento progresivo desarrollado por el fabricante. Las tiras IPG
fueron equilibradas en Tris/HC1 50 mM, pH 7,5, urea 6 M, glicerol
30%, SDS 2% y DTT 2% e incubadas en el mismo tampón conteniendo
2,5% de yodoacetamida y azul bromofenol, en ausencia de DTT. La
tiras IPG fueron cargadas directamente en geles de poliacrilamida
al 12,5% (18 cm x 20 cm x 1 mm) y sellados con agarosa de bajo
punto de fusión. Los geles de la segunda separación, por
SDS-PAGE, se corrieron dirante 15 h. Los geles
fueron teñidos con Phastgel Blue R preparado en agua (65%), etanol
(25%) y ácido acético (10%). Alternativamente, se tiñeron con plata
utilizando el kit de tinción con plata de Amersham. Las imágenes
fueron digitalizadas con un "Imaging Densitometer" de
Bio-Rad y analizadas utilizando el programa
PDQuest. Se detectaron diferencias cualitativas y cuantitativas pero
únicamente fueron aceptadas cuando eran confirmadas, al menos, dos
veces, en 5 experimentos independientes. Las manchas de los geles
correspondientes a proteínas expresadas de forma diferencial se
recogieron de forma manual y se procesaron en una estación MassPrep
de Micromass. Los especímenes del gel se destiñeron con bicarbonato
amónico 50 mM y acetonitrilo 50% (geles teñidos con Coomasie) o con
ferricianuro potásico 15 mM y tiosulfato sódico 50 mM (geles
teñidos con plata). A continuación, las proteínas se redujeron con
DTT 10 mM en bicarbonato amónico 100 mM y fueron alquiladas con
yodoacetamida 55 mM en el mismo tampón. Posteriormente se realizó
una digestión de las proteínas en el mismo gel con tripsina 6
ng/\mul en bicarbonato amónico 50 mM, durante 5 h a 37°C. Los
péptidos resultantes se extrajeron con ácido fórmico 1% y
acetonitrilo 2%. Finalmente, 2 \mul de muestra se mezclaron con
2\mul de una disolución saturada de ácido
\alpha-ciano-4-hidroxi-transcinámico
en TFA al 0,1%, acetonitrilo al 50% y, a continuación, fueron
depositados en una placa diana MALDI. Los fragmentos de la digestión
con tripsina fueron analizados en un espectrómetro de masas MALDI
TOFF GL-REF de Micromass. El procesamiento de los
datos se llevó a cabo con MassLynx y las bases de datos de búsqueda
(SWISSPROT, TREMBL, ENSEMBL) para identificar las proteínas de
interés a partir de su huella dactilar peptídica se realizó con
ProteinLynx Global Server (Micromass). El análisis de datos y su
agrupamiento se realizó con GARBAN (no publicado).
Los hepatocitos fueron aislados de ratas Wistar
masculinas (200-250 g) mediante perfusión con
colagenasas, tal como se ha descrito previamente (Avila, M.A., et
al., Gastroenterology, 1998, 114:364-371). Una
vez aislados, los hepatocitos se cultivaron de acuerdo con
García-Trevijano y col.
(García-Trevijano, E.R., et al., Faseb J,
2000, 14:2511-2518) en presencia o ausencia de
metionina 100 \muM, AdoMet 4 mM o cicloleucina (CL) 20 mM durante
los períodos indicados de tiempo. La viabilidad celular fue medida
mediante exclusión de azul de tripano, no observándose diferencias
significativas en ningún momento entre los controles y ninguno de
los diversos tratamientos llevados a cabo en este estudio.
Se obtuvo una fracción mitocondrial enriquecida a
partir de 100 mg de especímenes de hígado con el kit de aislamiento
de mitocondrias (Mitochondria Isolation Kit) de Sigma. El gradiente
electroquímico de protón (\Delta\psi) de la membrana interna
mitocondrial fue analizado midiendo la captación del colorante
fluorescente carbocianina JC-1 en el interior de la
mitocondria, siguiendo el procedimiento indicado por el fabricante.
Las mediciones de fluorescencia se hicieron utilizando un
espectrofluorimetro Perkin Elmer LS 50 B.
El RNA de hígado total fue aislado mediante el
empleo del método del tiocianato de guanidinio
(García-Trevijano, E.R., et al., Faseb J,
2000, 14:2511-2518). La concentración de RNA fue
determinada espectrofotométricamente antes de su uso, y su
integridad se comprobó mediante electroforesis con posterior tinción
con bromuro de etidio. La electroforesis y la transferencia al gel
se realizaron siguiendo un protocolo descrito previamente (Lu,
S.C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001;
98:5560-5565). El cDNA de la prohibitina 1 fue
donado mediante transcripción inversa-reacción en
cadena de la polimerasa a partir de hígado de ratón. Se utilizaron
el sistema de preamplificación
Superscript (Life Technologies), la enzima Taq Long plus (Stratagene) y los iniciadores sentido 5'-atggctgccaaagtgttt
gagtc-3' y antisentido 5'-tcactggggaagctggagaagc-3'. Se han descrito sondas para la subunidad (3 de la ATPasa y para las subunidades 1 y II de la citocromo oxidasa (Izquierdo & Cuezva, Mol. Cell. Biob, 1997, 17:5255-5268; Otero, G., et al., Carcinogenesis, 1997, 18:1569-1575). Los análisis de hibridación Northern fueron realizados sobre RNA total utilizando procedimientos convencionales (Lu S.C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001; 98:5560-5565). Todas las sondas fueron marcadas con [^{32}P]dCTP utilizando el sistema Rediprime DNA Labeling System de Amersham. Para asegurar la carga igual de las muestras de RNA, las membranas también fueron hibridazas con una sonda marcada con ^{32}P rRNA 8S. Se utilizaron autoradiografia y densitometria para cuantificar el RNA relativo. Los resultados del análisis Northern blot se normalizaron a 18S rRNA.
Superscript (Life Technologies), la enzima Taq Long plus (Stratagene) y los iniciadores sentido 5'-atggctgccaaagtgttt
gagtc-3' y antisentido 5'-tcactggggaagctggagaagc-3'. Se han descrito sondas para la subunidad (3 de la ATPasa y para las subunidades 1 y II de la citocromo oxidasa (Izquierdo & Cuezva, Mol. Cell. Biob, 1997, 17:5255-5268; Otero, G., et al., Carcinogenesis, 1997, 18:1569-1575). Los análisis de hibridación Northern fueron realizados sobre RNA total utilizando procedimientos convencionales (Lu S.C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001; 98:5560-5565). Todas las sondas fueron marcadas con [^{32}P]dCTP utilizando el sistema Rediprime DNA Labeling System de Amersham. Para asegurar la carga igual de las muestras de RNA, las membranas también fueron hibridazas con una sonda marcada con ^{32}P rRNA 8S. Se utilizaron autoradiografia y densitometria para cuantificar el RNA relativo. Los resultados del análisis Northern blot se normalizaron a 18S rRNA.
El DNA total fue extraído a partir de hígados de
ratones de 3 meses de edad WT y MAT1A-/-, tal como se ha
descrito previamente (34). El DNA celular total (20 \mug) fue
digerido con EcoRI. El DNA digerido fue resuelto sobre gel de
agarosa al 1%, transferido y fijado a membranas de nylon. Las
membranas fueron incubadas con una sonda de COX II marcada con
[^{32}P ]dCTP. Las condiciones para la hibridación y lavado de la
membrana fueron las descritas anteriormente (Otero, G., et
al., Carcinogenesis, 1997, 18:1569-1575).
La extracción de proteína y el análisis
"western blotting" se realizaron tal como se ha descrito
anteriormente (Avila, M.A., et al., Oncogene, 1995,
10:963-971; Ruiz, F., et al., Hepatology,
1998, 28:1051-1057). Brevemente, cantidades iguales
de proteína (15 \mug) fueron resueltas en geles
SDS-poliacrilamida al 12,5%. Las proteínas fueron
transferidas electroforéticamente a membranas de nitrocelulosa. Las
membranas fueron sondeadas con anti-MAT (Ruiz, F.,
et al., Hepatology, 1998, 28:1051-1057),
anti-PHB1, anti-ATPasa \beta y
anti-COX I y II. Se utilizó un anticuerpo secundario
conjugado a peroxidasa de rábano. Los blots fueron revelados
mediante quimioluminiscencia (Dupont).
Se han investigado los mecanismos moleculares
implicados en la progresión de NASH en el hígado de ratones
MAT1A-/- mediante una aproximación proteómica de alto
rendimiento. Se han obtenido patrones de expresión de proteínas
mediante análisis bidimensional de extractos de hígado de ratones
WT y MAT1A-/- de 1, 15, 90 y 240 días de edad. Se realizaron
cinco experimentos independientes utilizando extractos de hígado de
distintos animales. En base a los resultados del análisis de imagen
con PDQuest (BioRad), se visualizaron una media de 1.500 a 2.000
manchas dependiendo del procedimiento de tinción del gel. Las
imágenes de los geles de los ratones WT y MAT1A-/- fueron
comparadas para determinar las diferencias en la expresión de
proteínas, aceptándose únicamente aquéllos cambios en los que se
confirmaba un aumento del doble, o una reducción a la mitad, en los
5 experimentos.
El análisis reveló que tan solo 1 día después del
nacimiento, ya se habían inducido 140 diferencias en el hígado de
los ratones MAT1A-/- y que los cambios se acumulaban con la
edad (242, 259 y 297 cambios a los 15, 90 y 240 días
respectivamente). La distribución entre las proteínas que aumentan
su expresión y las proteínas que disminuyen su expresión se
mantiene hasta 3 meses, el 53%-70% de las proteínas aumentaron su
expresión y el 30%-47% disminuyeron su expresión. En contraste, este
perfil cambia en hígados de ratones mutantes MAT1A-/- de 8
meses de edad, cuando el NASH ya está desarrollado, en donde el 27%
eran proteínas que aumentaban su expresión y el 73% proteínas que
disminuían su expresión. De todos los cambios iniciales, sólo las
proteínas más abundantes representadas en las bases de datos fueron
identificadas mediante huella dactilar de masa de péptidos, dando
como resultado 117 proteínas identificadas con éxito.
Se ha encontrado una correlación lineal entre
M_{r} y pI calculados a partir de la secuencia de las proteínas
identificadas y el Rf experimental de la mancha correspondiente,
calculada a partir de los geles bidimensionales (datos no
mostrados). Este descubrimiento valida aún más la identidad de las
manchas analizadas. Se observaron algunas desviaciones del pI
respecto a la linealidad, lo que es probablemente debido a
modificaciones post-traducción.
El perfil de expresión proteica específico de
hígados de ratones MAT1A-/- proporciona una huella proteómica
de NASH. Las proteínas de expresión aumentada o disminuida fueron
clasificadas según los procesos biológicos en los que están
implicadas de acuerdo con los criterios de Ontología Genética (Gene
Ontology) y fueron representadas tal como se muestra en la Figura
1. La mayoría de las proteínas expresadas de forma diferencial en el
hígado de los ratones mutantes MAT1A-/- se agrupaban en tres
procesos biológicos: comunicación celular (grupo 1), crecimiento
celular y/o mantenimiento (grupo 2) y procesos de desarrollo (grupo
3) (Figura 1). Algunas de las proteínas identificadas en estos
grupos están implicadas en la embriogénesis, morfogénesis y
envejecimiento, tales como la cadena 6 de la tubulina \alpha, la
cadena 5 de la tubulina \alpha, la actina y la prohibitina 1
(PHB1), que controla la síntesis de DNA y regula la proliferación
celular. Asimismo, proteínas implicadas en respuestas a estrés,
tales como la hidrolasa leucotrieno A4 (LKHA), aumentaban su
expresión. También se identificaron cambios en el perfil de
expresión de proteínas implicadas en el estrés oxidativo, por
ejemplo, glutatión peroxidasa, proteínas antioxidantes 1 y 2 (AOP2)
o superóxido dismutasa Cu^{++}/Zn^{++} (SODC). Finalmente, de 5
acuerdo con la amplia actividad metabólica del hígado, el 80% de las
proteínas cuya expresión cambia en ratones mutantes
MAT1A-/-, corresponde a proteínas metabólicas. La mayoría de
las alteraciones afectan al metabolismo de carbohidratos y
aminoácidos. Por ejemplo, la fructosa
1,6-bifosfatasa (aumentaba su expresión) y la
glicerol 3 fosfato deshidrogenasa (disminuía su expresión), enzimas
clave en la gluconeogenesis y glucolisis respectivamente. La acil
CoA deshidrogenasa de cadena larga específica (ACDL) y la delta 3,5
delta 2,4 dienoil CoA isomerasa (ambas disminuían su expresión)
están implicadas en la beta-oxidación de ácidos
grasos. La apolipoproteína A1 (APA1) (aumentaba su expresión) y la
farnesil pirofosfato sintetasa (disminuía su expresión) participan
en el transporte y biosíntesis de colesterol, respectivamente; y la
malato deshidrogenasa e isocitrato deshidrogenasa (ambas disminuían
su expresión) catalizan dos etapas del ciclo del citrato. Asimismo,
se identificaron diferencias importantes que afectan al metabolismo
de aminoácidos ramificados, aromáticos y con azufre (Figura 2).
Un grupo de 12 proteínas cambiaron su perfil de
expresión tan solo 1 día después del nacimiento y mantuvieron esa
alteración a lo largo de la progresión de NASH en hígado de ratones
MAT1A-/- (Figura 1). Estas proteínas, que pueden ser
consideradas como marcadores tempranos de NASH, fueron identificadas
como APA1, LKHA, proteína de unión a selenio (SBP), AOP2, MAT,
keratina 18 tipo 1 citoesquelética (K1CR), guanidinoacetato
metiltransferasa (GAMT), PHB1, SODC, albúmina, ACDL y la subunidad
\beta de la ATPasa mitocondrial (ATPB). La mayoría de estas
proteínas son enzimas matabólicas o participan en la respuesta
antioxidante de los hepatocito de los ratones mutantes
MAT1A-/-. De forma interesante, la PHB1 y ATPB son proteínas
mitocondriales, por lo que cambios en su expresión pueden
comprometer la función mitocondrial.
La alteración de la función mitocondrial puede
ser un factor clave en la progresión de NASH en ratones
MAT1A-/-. El aumento en la expresión (450%) de la ATPB y la
disminución en la expresión (53%) de PHB1 fueron confirmados
mediante análisis "western blot" utilizando anticuerpos
específicos (Figura 3A). Asimismo, los niveles de estado
estacionario de las subunidades I y II de la citocromo c oxidasa
(COX) fueron también reducidos en hígado de ratones mutantes
MAT1A-/- (55% y 53% respectivamente). Estas alteraciones no
fueron observadas en otros tejidos (no mostrados). La expresión de
genes codificantes de estas proteínas también fue investigada
mediante análisis Northern blot. El nivel de mRNA de la ATPB
aumenta el doble en hígado de ratones MAT1A-/- (Figura 3B).
Por el contrario, los niveles de mRNA de PHB1 y COX II, así como de
rRNA 16S, fueron similares a los encontrados en los animales WT
(Figura 3B). Estas observaciones indican que la disminución de la
expresión de las subunidades PHB1 y COX mediante AdoMet implica
mecanismos post-traducción. Mientras que PHB1 es el
producto de un gen nuclear, las subunidades COX están codificadas
por genes mitocondriales. Adicionalmente, no se observaron cambios
en el contenido de DNA mitocondrial en hígado de ratones
MAT1A-/- (Figura 3C). Cambios en el perfil de expresión de
las proteínas PHB1, COX y ATPB sugieren una deficiencia en la
respiración mitocondrial.
El potencial de la membrana interna mitocondrial
fue medido en una fracción mitocondrial enriquecida purificada a
partir de extractos de hígado de ratones WT y MAT1A-/-. Se
observó una reducción de un 40% en el gradiente electroquímico de
protón en los extractos de hígado de los ratones mutantes
MAT1A-/- (Figura 4), indicando una deficiencia en la
integridad de la membrana interna mitocondrial.
Se ha investigado si AdoMet regula los niveles de
PHB1 en hepatocitos de rata cultivados. En presencia de metionina o
AdoMet en medios de cultivo, no se detectó ningún efecto en los
niveles de proteína PHB1 después de 24 h de incubación bajo
condiciones estándar (Figura 5). Sin embargo, se apreció una
disminución de la síntesis de AdoMet mediante restricción de
metionina o adición al medio de cultivo de CL, un conocido
inhibidor de la actividad MAT, dando como resultado una disminución
en la expresión de PHB1 (53% y 55% respectivamente) (Figura 5). La
restauración del conjunto intracelular del hepatocito de AdoMet
mediante adición exógena de este compuesto después de 12 h de
cultivo en ausencia de metionina evitó la caída de PHB1.
\newpage
Para poder evaluar si las alteraciones observadas
en ratones MAT1A-/- proporcionan nuevos mecanismos por los
que NASH puede ser inducido, se investigaron los niveles de estado
estacionario de PHB1 y COX en muestras de hígado de ratones
ob/ob y pacientes obesos, dos condiciones propensas a
desarrollar NASH. Análisis westem blot revelaron que PHB1 y COX I,
II reducen su expresión en hígado de ratones ob/ob (76% y 81%
y 70% respectivamente). La disminución en la expresión de PHB1
(53%) y COX I(82%) también fue confirmada en el hígado de
pacientes obesos aunque el nivel de COX II era similar al
encontrado en hígado de control (Figura 6). De forma similar a la de
los ratones MAT1A-/-, los niveles de mRNA de PHB y COX I y
II en ratones ob/ob y en paciente obesos se correlaciona con
los niveles encontrados en animales de control (no mostrado).
AdoMet ha sido generalmente considerado como un
metabolito intermediario central implicado en la síntesis de
homocisteína y poliaminas así como es el principal donador del
grupo metilo celular. Sin embargo, recientes evidencias indican que,
además de esta función metabólica central, AdoMet es en el hígado
un interruptor de control celular que regula funciones esenciales
de hepatocitos tales como proliferación, diferenciación y muerte
(Mato, J.M. et al., Faseb J, 2002, 16:15-26).
Para comprender mejor los mecanismos por los que estas funciones no
tradicionales de AdoMet tienen lugar, se ha estudiado la
patogénesis de NASH en ratones mutantes MAT1A-/- deficientes
en síntesis hepática de AdoMet utilizando un aproximación
proteómica de alto rendimiento.
El análisis de los diferentes perfiles de
expresión de proteínas en ratones MAT1A-/- y WT indica que
una deficiencia crónica en la síntesis de AdoMet tiene un efecto
pleiotrópico en el hígado que altera funciones hepáticas esenciales.
Se han identificado 117 proteínas que se expresan de forma
diferencial en el hígado de ratones MAT1A-/- durante la
progresión de NASH. El análisis global de las diferencias observadas
indica un aumento en la expresión de proteínas antioxidantes (SODC,
catalasa, glutatión peroxidasa) en el hígado de ratones
MAT1A-/- que puede reflejar un mecanismo de adaptación para
disipar el estrés oxidativo generado por genes oxidantes.
Alteraciones metabólicas importantes también se encontraron en el
nivel de expresión de proteínas en el hígado de ratones mutantes
MAT1A-/-. El metabolismo de lípidos, carbohidratos y
aminoácidos está dañado en ratones MAT1A-/- desde el
nacimiento, aunque las diferencias se acumulan durante la
progresión de NASH. Estas proteínas que aumentan o disminuyen su
expresión proporcionan un perfil proteómico específico que podría
explicar algunas de las alteraciones metabólicas reminiscentes a
las encontradas en obesidad y otras condiciones asociadas con NASH,
que conducen al desarrollo de cirrosis y HCC (Ried, A.E.,
Gastroenterology, 2001, 121:710-723; Ángulo, P., N.
Engl. J. Med., 2002, 346:1221-1231; Clark, J.M.,
et al., Gastroenterolgy, 2002,
122:1649-1657).
El análisis de las 117 proteínas que se expresan
de manera diferencial en el hígado de ratones MAT1A-/-
reveló que la mayoría de los cambios detectados 1 día después del
nacimiento no se mantienen durante la progresión de NASH. Estas
diferencias dependientes del tiempo pueden reflejar la adaptación
del hepatocito a realizar su función biológica normal bajo una
deficiencia crónica de AdoMet llevando a la acumulación de
alteraciones que condicionan el desarrollo de la enfermedad. Sin
embargo, 12 proteínas cambian su patrón de expresión después del
nacimiento, cuando MAT1A-/- se activa en ratones WT, y esta
alteración se mantiene hasta la aparición de lesiones histológicas.
Entre estos cambios tempranos están, el aumento de expresión de las
proteínas SODC y AOP2, que ha sido deducido a partir de los geles
bidimensionales de acuerdo con evidencias anteriores (Rabilloud,
T., et al., J. Biol. Chem., 2002,
277:19396-19401), así como la disminución de la
expresión de ACDL y el aumento de la expresión de APA1. Estas
alteraciones están de acuerdo con la implicación de estrés
oxidativo y metabolismo lípidico anormal en la patogénesis de la
enfermedad de hígado graso. Es interesante que 4 proteínas
implicadas en la función mitocondrial también han sido
identificadas, la ATPB, COX I, COX II y PHB1. El aumento en la
expresión de la ATPB ha sido implicado en la maduración
mitocondrial y en la transformación neoplásica celular, que es
consistente con el estado proliferativo y rediferenciado de
hepatocitos MAT1A-/-. La disminución en la expresión de COX
indica una transferencia deficiente de electrones al oxígeno, la
última etapa de la cadena mitocondrial de transferencia de
electrones y por ello proporciona una explicación molecular para el
estrés oxidativo encontrado en hígados MAT1A-/-. La caída de
los niveles de estado estacionario de PHB1 puede explicar la
disminución en la expresión de COX. PHB1 es el producto de un gen
nuclear que está asociado a la membrana interna mitocondrial. Se ha
propuesto recientemente que PBH1 es una proteína tipo caperona que
participa en el correcto plegamiento y acoplamiento de algunos de
los componentes de la cadena respiratoria mitocondrial. De acuerdo
con esta hipótesis, una deficiencia en PHB1 puede perjudicar la
organización nativa y funcional de proteínas respiratorias que son
posteriormente degradadas por proteasas mitocondriales,
comprometiendo la funcionalidad mitocondrial. Por ello, el descenso
de PHB1 puede inducir una reducción de COX con la pérdida
concomitante de la función mitocondrial en hepatocitos
MAT1A-/-.
La correlación entre una deficiencia en la
síntesis de AdoMet y la disminución en la expresión de PHB1
encontrada en ratones MAT1A-/- fue confirmada mediante
experimentos in vitro sobre hepatocitos de rata aislados. La
reducción de la síntesis de AdoMet utilizando un medio de cultivo
sin metionina o en presencia de CL, un inhibidor de la actividad
MAT, da como resultado una disminución en la expresión de PHB1. La
recuperación del contenido de AdoMet en el hepatocito evitaba la
caída de PHB1.
Los niveles del estado estacionario de PHB1
también disminuían en el hígado de ratones ob/ob y en
pacientes obesos, los cuales están predipuestos a desarrollar NASH.
NASH es un desorden crónico con una prevalencia en aumento en la
población por lo que se está convirtiendo en una de las prioridades
de la hepatología clínica. Aunque la patogénesis de NASH se conoce
poco, la presente evidencia apoya la existencia de alteraciones
mitocondriales que se correlacionan con el estrés oxidativo como uno
de los factores importantes. La disminución en la expresión de PHB1
y COX inducida por una deficiencia crónica en AdoMet puede
proporcionar un nuevo mecanismo molecular implicado en la
patogénesis de NASH. Los resultados obtenidos con ratones
MAT1A-/- indican que los niveles de PHB1 y COX caían bastante
tiempo antes de que se manifestara ningún síntoma histológico de la
enfermedad y, por tanto, pueden ser útiles en el diagnostico precoz
y en el tratamiento de NASH.
En resumen, los resultados obtenidos proporcionan
un nuevo mecanismo mediante el cual una deficiencia en AdoMet afecta
adversamente a la función mitocondrial y genera un estrés oxidativo
en el hígado. La caída en los niveles de PHB1 bajo una deficiencia
crónica en AdoMet que conduce a un fallo mitocondrial y a un
metabolismo anormal de lípidos, hidratos de carbono y aminoácidos
puede explicar, al menos en parte, la patogénesis de NASH.
Claims (14)
1. Un método in vitro para diagnosticar
NASH, o para evaluar la predisposición de un sujeto a desarrollar
NASH, que comprende:
- a)
- recoger una muestra de tejido hepático de un sujeto;
- b)
- detectar y cuantificar en dicha muestra de tejido hepático el nivel de una proteína seleccionada entre apolipoproteína Al (APA1), subunidad \beta de la ATPasa mitocondrial (ATPB), leucotrieno A4 hidrolasa (LKHA), keratina 18 (K1CR), guanidina acetato N-metiltransferasa (GAMT), superóxido dismutasa (SODC), albúmina (ALBU), proteína antioxidante 2 (AOP2) (isoformas 1 y 2), prohibitina 1 (PHB1), metionina adenosil transferasa (MAT), acil CoA deshidrogenasa de cadena larga (ACDL), proteína de unión al selenio (SBP), y combinaciones de las mismas; y
- c)
- comparar los resultados obtenidos en la etapa b) con los valores normales, de referencia, para dichas proteínas en tejido hepático.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho sujeto es un ser humano.
3. Método según la reivindicación 1, en el que la
detección y cuantificación de dicha proteína seleccionada entre
APA1, ATPB, LKHA, K1CR, GAMT, SODC, ALBU, AOP2 (isoforma 1), AOP2
(isoforma 2), PHB1, MAT, ACDL y/o SBP se realiza mediante el empleo
de anticuerpos específicos frente a dichas proteínas.
4. Método según la reivindicación 3, en el que
dichos anticuerpos comprenden anticuerpos monoclonales,
policlonales, fragmentos recombinantes de anticuerpos, combibodies
y fragmentos Fab o scFv de anticuerpos específicos frente a dichas
proteínas.
5. Método según la reivindicación 1, en el que la
detección y cuantificación de dicha proteína seleccionada entre
APA1, ATPB, LKHA, K1CR, GAMT, SODC, ALBU, AOP2 (isoforma 1), AOP2
(isoforma 2), PHB1, MAT, ACDL y/o SBP se realiza mediante técnicas
de ELISA o Western blot, o mediante el empleo de dispositivos de
tipo biochip o microarray de proteínas que incluyan anticuerpos
específicos frente a las proteínas a detectar.
6. Método según la reivindicación 1, que
comprende detectar y cuantificar el nivel de una proteína
seleccionada entre APA1, ATPB, LKHA, K1CR, GAMT, SODC, ALBU, AOP2
(isoforma 1), AOP2 (isoforma 2), PHB1, MAT, ACDL y SBP.
7. Método según la reivindicación 1, que
comprende detectar y cuantificar el nivel de dos o más proteínas
seleccionadas entre APA1, ATPB, LKHA, K1CR, GAMT, SODC, ALBU, AOP2
(isoforma 1), AOP2 (isoforma 2), PHB1, MAT, ACDL y SBP.
8. Método según la reivindicación 1, en el que
cuando la comparación de los resultados obtenidos en la etapa b)
con los valores normales, de referencia, indica que:
- (i)
- la concentración de, al menos, una de las proteínas APA1, ATPB, LKHA, K1CR, GAMT, SODC, ALBU o AOP2 (isoforma 1), es superior al límite superior de los valores normales, de referencia, para dichas proteínas en tejido hepático; y/o
- (ii)
- la concentración de, al menos, una de las proteínas PHB1, AOP2 (isoforma 2), MAT, ACDL o SBP es inferior al límite inferior de los valores normales, de referencia, para dichas proteínas en tejido hepático,
entonces, dichos resultados son
indicativos de la existencia de NASH en el sujeto cuya muestra de
tejido hepático ha sido ensayada o bien de la existencia de una
predisposición de dicho sujeto a desarrollar NASH en un
futuro.
9. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha proteína a detectar y cuantificar se selecciona entre APA1,
ATPB, LKHA, K1CR, PHB1 y sus combinaciones.
10. Método según la reivindicación 9, que
comprende detectar y cuantificar el nivel de una proteína
seleccionada entre APA1, ATPB, LKHA, keratina 18 y PHB1.
11. Método según la reivindicación 9, que
comprende detectar y cuantificar los 5 niveles de, al menos, dos
proteínas seleccionadas entre APA1, ATPB, LKHA, K1CR y PHB1.
12. Método según la reivindicación 9, que
comprende detectar y cuantificar los niveles de tres o cuatro
proteínas seleccionadas entre APA1, ATPB, LKHA, K1CR y PHB1.
13. Método según la reivindicación 9, que
comprende detectar y cuantificar los niveles de las proteínas APA1,
ATPB, LKHA, K1CR y PHB1.
14. Empleo de una proteína seleccionada entre
apolipoproteína A1 (APA1), subunidad \beta de la ATPasa
mitocondrial (ATPB), leucotrieno A4 hidrolasa (LKHA), keratina 18
(K1CR), guanidina acetato N-metiltransferasa
(GAMT), superóxido dismutasa (SODC), albúmina (ALBU), proteína
antioxidante 2 (AOP2) (isoformas 1 y 2), prohibitina 1 (PHB1),
metionina adenosil transferasa (MAT), acil CoA deshidrogenara de
cadena larga (ACDL), proteína de unión al selenio (SBP), y
combinaciones de las mismas, en un método in vitro para
diagnosticar NASH, o para evaluar la predisposición de un sujeto a
desarrollar NASH.
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