ES2819055T3

ES2819055T3 - Método para el diagnóstico/pronóstico de cáncer colorrectal

Info

Publication number: ES2819055T3
Application number: ES11780257T
Authority: ES
Inventors: Alvarez José Ignacio Casal; Manchado Rodrigo Barderas; Ingrid Henriette Suzanne Babel
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 2010-05-13
Filing date: 2011-05-13
Publication date: 2021-04-14
Anticipated expiration: 2031-05-13
Also published as: WO2011141612A3; EP2570813A2; EP2570813A4; WO2011141612A2; US20130072400A1; CA2799359C; AU2011251854A1; EP2570813B1; AU2011251854B2; CA2799359A1

Abstract

La presente invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, el pronóstico o la monitorización de la evolución de cáncer colorrectal (CCR), a un método de diagnóstico de CCR, a un método de pronóstico de CCR y a un kit para llevar a cabo dichos métodos.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para el diagnóstico/pronóstico de cáncer colorrectal

Campo de la invención

La presente invención se encuadra dentro del campo de la biomedicina. Específicamente, se refiere a un método para detectar un autoanticuerpo en una muestra y a un kit para llevar a cabo dicho método.

Antecedentes de la invención

El cáncer colorrectal (CCR) es el segundo cáncer más prevalente en el mundo occidental. El desarrollo de la enfermedad se produce durante décadas e implica múltiples sucesos genéticos. A pesar de que el CCR es uno de los tumores sólidos mejor caracterizados desde un punto de vista genético, sigue siendo una de las principales causas de mortalidad en países desarrollados por el diagnóstico tardío de los pacientes debido al tiempo de espera que transcurre para realizar ciertas pruebas diagnósticas, tales como colonoscopia.

Hoy en día, existen pocas proteínas que hayan sido descritas como biomarcadores eficaces de CCR (antígeno carcinoembrionario (C^{e a}), CA19.9 y CA125) (Crawford et al. 2003. Journal of surgical oncology 84 (4), 239-248; Duffy et al. 2007 Eur J Cancer 43 (9), 1348-1360) y no son lo suficientemente específicas como para llevar a cabo cribados clínicos con vistas a detectar CCR (Locker et al. 2006. J Clin Oncol 24 (33), 5313-5327).

Los análisis proteómicos están siendo activamente utilizados para la identificación de nuevos biomarcadores. En diferentes estudios proteómicos previos se han identificado, mediante el uso de micromatrices de anticuerpos y 2D-DIGE, proteínas diferencialmente expresadas en tejido de CCR, incluyendo isoformas y modificaciones postraduccionales responsables de modificaciones en rutas de señalización (Alfonso et al. 2005. Proteomics 5 (10), 2602-2611; Kopf et al. 2005. Proteomics 5(9), 2412-2416; Madoz-Gurpide et al. 2007. Mol Cell Proteomics 6 (12), 2150-2164; Alfonso et al. 2008. Journal of proteome research 7 (10), 4247-4255). Estos dos enfoques han permitido la identificación de una amplia colección de potenciales marcadores tumorales de tejido de CCR que actualmente están siendo investigados.

Sin embargo, la implementación de métodos diagnósticos no invasivos y más simples que permitan la detección temprana del CCR debería basarse en la identificación de proteínas o anticuerpos detectables en suero o plasma (Hanash et al. 2008. Nature 452 (7187), 571-579; Hudson et al. 2007. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104 (44), 17494-17499). La existencia de una respuesta inmunitaria a cáncer en humanos se ha puesto de manifiesto por la presencia de autoanticuerpos en el suero de pacientes con cáncer. Así, diferentes proteínas humanas (autoantígenos) se pueden ver afectadas antes o durante la formación del tumor pudiendo producir una respuesta inmunitaria una vez liberadas (Hudson et al. 2007. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104 (44), 17494-17499; Wang et al. 2005. The New England journal of medicine 353 (12), 1224-1235; Sreekumar et al. 2004. J Natl Cancer Inst 96 (11), 834-843). Dichos autoanticuerpos se pueden detectar en estadios tempranos de la enfermedad e incluso antes de que el cáncer pueda ser detectado mediante otras técnicas indicando su elevado potencial como biomarcadores de la enfermedad. Estas proteínas tumorales pueden verse afectadas por mutaciones puntuales, tener un plegamiento anómalo, sobreexpresarse, glucosilarse de manera anómala, estar truncadas, o bien sufrir una degradación anómala como es el caso de p53, HER2, NY-ESO1 o MUC1, respectivamente (Chen et al.1997. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 94 (5), 1914-1918; Schubert et al. 2000. Nature 404 (6779), 770-774; Ulanet et al. 2003. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100 (21), 12361-12366). De hecho, autoantígenos asociados a tumores (AAT) han sido previamente caracterizados en CCR utilizando distintos enfoques (Scanlan et al. 1998. International Journal of cancer 76 (5), 652-658). Varios autores han descrito algunos paneles de AAT como biomarcadores de CCR, entre los que se encuentra la proteína STK4/MST1 (Tan et al. 2009. Journal 276: 6880-6904; Babel et al. 2009. Molecular and Cellular Proteomics 8: 2382 2395; documento WO 2010/136629). El documento WO2009/008496 divulga que hSULF1 se expresa mucho en cáncer de colon y es un antígeno que se puede usar para la producción de un anticuerpo anti-hSULF1 que inhibe la proliferación celular de una célula cancerosa. No obstante, la validez diagnóstica de los autoanticuerpos asociados con CCR identificados hasta la fecha requiere aún una validación independiente para su uso generalizado en el diagnóstico/pronóstico del CCR.

Existe, por tanto, una necesidad de disponer de biomarcadores que permitan el diagnóstico de CCR, su clasificación en los diferentes estadios de la evolución tumoral, el pronóstico de la evolución de la enfermedad, la evaluación de su respuesta a un determinado tratamiento y la detección de la recurrencia o la diseminación de CCR, mediante un método sencillo, eficaz y no invasivo.

Breve descripción de la invención

La presente divulgación se refiere a un método para la obtención de datos útiles para el diagnóstico, pronóstico o seguimiento de la evolución de cáncer colorrectal (CCR), a un método de diagnóstico de CCR, a un método de pronóstico de CCR y a un kit para llevar a cabo dichos métodos.

La presente divulgación proporciona, por tanto, una respuesta a la necesidad de disponer de biomarcadores que permitan el diagnóstico del CCR, su clasificación en los diferentes estadios de la evolución tumoral, el pronóstico de la evolución de la enfermedad, la evaluación de su respuesta a un determinado tratamiento y la detección de la recurrencia o la diseminación de CCR, mediante un método sencillo, eficaz y no invasivo.

La sangre es normalmente el fluido biológico óptimo en que se basan los métodos no invasivos para el cribado masivo con fines diagnósticos de grandes poblaciones de pacientes. Por un lado, el suero y el plasma son fáciles de obtener y, por otra parte, la circulación sanguínea facilita el contacto de la sangre con todos los tejidos del cuerpo humano, incluyendo, en el caso de pacientes con cáncer, el contacto con tejido tumoral y sus antígenos representativos. La liberación de estos antígenos asociados al tumor probablemente ocurre a muy baja concentración en plasma y probablemente sufren proteólisis en un corto periodo de tiempo. Por el contrario, los anticuerpos son moléculas muy estables que han sido usados durante años en diferentes inmunoensayos clínicos, lo cual facilita la estandarización de los ensayos. El uso de autoanticuerpos es también beneficioso ya que el sistema inmunitario amplifica la respuesta, facilitando su identificación y cuantificación.

En la presente invención se han empleado micromatrices de fagos (en ocasiones identificadas en esta descripción como “fagos-péptidos”) para identificar autoanticuerpos presentes en el suero de pacientes con CCR en distintos estadios.

Se seleccionaron 6 fagos que contenían las secuencias homólogas a las proteínas NHSL1, GRN, MST1, SULF1, SREBF2 y GTF2i. La combinación de las proteínas recombinantes MST1 y SULF1 con las otras 4 secuencias de fagos permitió predecir la enfermedad con un 72% de sensibilidad y un 87% de especificidad, con un área bajo la curva (AUC, por sus siglas en inglés) de 0,83. Si además se tiene en cuenta la edad del paciente, el AUC es de 0,91. Además, estos marcadores permiten agrupar los resultados discriminando, no sólo los individuos enfermos, sino también los distintos estadios de la enfermedad. La detección de este panel de autoanticuerpos en suero es, por tanto, un método sencillo y no invasivo para el diagnóstico/pronóstico de CCR.

En un primer aspecto, la invención se refiere a un método para detectar un autoanticuerpo en una muestra, que comprende:

a) poner en contacto una muestra de un sujeto con una entidad de captura de anticuerpos (ECA), en donde dicha ECA es una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4 o un péptido o proteína que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a SEQ ID NO: 4 y que es reconocido por un autoanticuerpo contra SEQ ID NO: 4;

y

b) detectar la formación de un complejo entre un autoanticuerpo y dicha ECA,

en donde la detección de dicho complejo autoanticuerpo-ECA es indicativa de la presencia de dicho autoanticuerpo en dicha muestra, en donde la muestra es sangre, plasma o suero.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a una entidad de captura de anticuerpos (ECA) que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4, en donde dicha ECA no es la proteína sulfatasa-1 (SULF1). En un tercer aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende una entidad de captura de anticuerpos (ECA) según la invención.

En un cuarto aspecto, la invención se refiere a un kit que comprende una composición según la invención.

En un quinto aspecto, la invención se refiere a un uso in vitro de un kit según la invención para detectar un anticuerpo en una muestra, o para detectar un autoanticuerpo en un sujeto que se sospecha tiene cáncer colorrectal (CCR), o para diagnosticar si un sujeto tiene CCR, o para determinar el riesgo de que un sujeto desarrolle CCR, o para seguir la evolución del CCR en un sujeto, o para evaluar la eficacia de un tratamiento contra CCR, o para predecir la supervivencia de un sujeto que tiene CCR.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra la respuesta de los autoanticuerpos a los seis fagos específicos. Intensidad de la señal de cada fago con los sueros de c Cr y los sueros control. Los resultados muestran los datos después de la normalización y en una escala de unidades arbitrarias (u.a.).

La figura 2 muestra el análisis de competición entre los péptidos de los fagos y sus respectivas proteínas homólogas. A. Se realizó un ensayo de competición de ELISA entre los fagos que presentaban péptidos con homología a SULF1 y MST1 y sus respectivas proteínas recombinantes. Se utilizó GST como control negativo de inhibición. Cantidades crecientes de las proteínas recombinantes se preincubaron con el suero de pacientes y se ensayó su unión al fago respectivo mediante ELISA (Barras verticales: gris claro, proteína recombinante; gris oscuro, GST). Se usó la proteína EBNA1 como control para demostrar que la inhibición era específica de la proteína usada como inhibidor y que no se introdujo ningún error en el ensayo (datos no mostrados). B. Localización esquemática de los péptidos con homología a SULF1 y MST1 dentro de las proteínas recombinantes. La posición del péptido en la proteína aparece marcada en la figura. Las líneas verticales corresponden a potenciales sitios de fosforilación. Los aminoácidos diferentes entre la secuencia del fago y la proteína aparecen en minúsculas.

La figura 3 muestra el análisis de la expresión de SULF1, MST1, GTF2i, NHSL1, GRN y SREBF2 en líneas celulares y tejido de pacientes con CCR. A. Los niveles de expresión génica de las proteínas cuyo péptido se presenta en los fagos T7 se determinó mediante metaanálisis utilizando la base de datos Oncomine. Los valores p se indican en la figura. Se encontraron niveles relativos de expresión génica para NHSL1, SREBF2, GTF2i, SULF1, MST1 y GRN. B. Inmunodetección en membrana de SULF1 y MST1 en líneas celulares de cáncer colorrectal en comparación con líneas celulares control y tejidos emparejados de CCR pertenecientes a estadios I, II y III. Se usó un anticuerpo antitubulina como control de carga. C, Datos de la micromatriz de tejidos para GTF2i y GRN obtenidos del Atlas de Proteínas Humanas (Human Protein Atlas WebPage).

La figura 4 muestra los valores predictivos de las proteínas MST1 y SULF1. A. Media de los valores de absorbancia obtenidos con los sueros de CCR y los controles mediante ELISA indirecto. Los puntos representan el valor individual para cada suero. Las barras de error representan el valor de desviación estándar. Las imágenes de los geles de poliacrilamida corresponden a las proteínas recombinantes usadas en los ensayos de ELISA. B. Ambas proteínas eran capaces de discriminar sueros control de sueros de pacientes con CCR con valores p < 0,0001 y 0,0006, para MST1 y SULF1, respectivamente. El AUC para MST1 fue de 0,75 (IC del 95% = 0,647-0,829) con una sensibilidad y una especificidad del 60,0% y el 82,6 %, respectivamente, utilizando como punto de corte 0,63. Para SULF1 el AUC fue de 0,72 (IC del 95% = 0,617-0,805), con una sensibilidad y una especificidad del 68% y el 67,4%, respectivamente, utilizando como punto de corte 0,36. C y D, Curvas ROC para CEA y la combinación de 4 fagos, 2 proteínas y la variable edad, que arrojaron valores de AUC de 0,81 y 0,89, respectivamente.

La figura 5 muestra el análisis de supervivencia utilizando los autoanticuerpos contra las proteínas MST1 y NHSL1. Las curvas de supervivencia Kaplan-Meier se calcularon utilizando un conjunto independiente de 95 sueros de pacientes con CCR para analizar el efecto de la presencia de autoanticuerpos en la supervivencia absoluta de los pacientes con CCR.

La figura 6 muestra la validación de la combinación de cuatro fagos con las proteínas MST1 y SULF1 en el diagnóstico de cáncer colorrectal. Comportamiento de la combinación de los fagos MST1 y NHSL1 GTF2i, NHSL1, GRN y SREBF2 y las proteínas MST1 y NHSL1 en el ensayo de validación. A. Comportamiento de muestras CCR frente controles sanos. B. Comportamiento de muestras CCR frente a sueros de referencia. C. Comportamiento de sueros sanos frente a sueros de tumores. D. Diagrama de puntos que muestra la probabilidad individual de ser clasificado como paciente CCR para cada uno de los sujetos con diferentes patologías. La mayoría de las muestras fueron clasificadas por debajo del valor de 0,5 de probabilidad (línea vertical discontinua).

Descripción detallada de la invención

Definiciones

Para facilitar su comprensión, a continuación, se indica el significado de algunos términos y expresiones tal como se utilizan en la presente descripción.

El término “anticuerpo”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a moléculas de inmunoglobulinas y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas, es decir, moléculas que contienen un sitio de fijación de antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona) con un antígeno, tal como, por ejemplo, una proteína. Hay 5 isotipos o clases principales de inmunoglobulinas: inmunoglobulina M (IgM), inmunoglobulina D (IgD), inmunoglobulina G (IgG), inmunoglobulina A (IgA) e inmunoglobulina E (IgE).

El término “autoanticuerpo”, tal como aquí se utiliza, se aplica a un anticuerpo que reacciona contra un antígeno presente en el propio organismo de un sujeto, incluso si la reacción ocurre sólo in vitro, y tanto si causa efectos patológicos in vivo como si no los produce.

Tal como se usa en el presente documento, el término “cáncer colorrectal” o “CCR”, también llamado cáncer de colon, incluye cualquier tipo de neoplasias del colon, recto y apéndice, así como cualquier subtipo histológico que aparece típicamente en el cáncer de colon, por ejemplo, células de carcinoma transicional, células de carcinoma escamoso y adenocarcinoma, cualquier subtipo clínico, por ejemplo, superficial, músculo invasivo o cáncer de enfermedad metastásica, o cualquier estadio TNM incluyendo tumores T0-T4, N0-N2 y M0-M1. Los pacientes pueden ser clasificados en diferentes grupos con respecto al estadio del tumor. La clasificación del cáncer de colon es una estimación de la penetración de un cáncer particular. Se lleva a cabo con fines de investigación, diagnóstico y para determinar el mejor método de tratamiento. El sistema para la clasificación del cáncer colorrectal depende del nivel de la invasión local, del grado de nodos linfáticos implicados y de si existe metástasis distante. El sistema más común de clasificación es el sistema TNM (para tumores/ganglios/metástasis), del “American Joint Committee on Cancer” (AJCC). El sistema TNM asigna un número basado en tres categorías. “T” indica el grado de invasión de la pared intestinal, “N” el grado de afectación de ganglios linfáticos y “M” el grado de metástasis. El estadio más amplio del cáncer es normalmente citado como un número I, II, III, IV derivado del valor TNM agrupado por el pronóstico, un número más alto indica un cáncer más avanzado y un peor pronóstico. En la Tabla 1 se indican detalles de la clasificación.

Tabla 1

i m TNM r l l ifi i n R

El término “entidad capturadora de anticuerpo” (ECA), tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una entidad macromolecular que se une específicamente a un anticuerpo (o autoanticuerpo). En una divulgación particular, dicha ECA comprende un péptido o una proteína que se une específicamente a un anticuerpo (o autoanticuerpo). Dicho péptido puede estar inmovilizado sobre un soporte o bien expuesto sobre la superficie de un fago. En una divulgación particular preferida, dicha ECA es un péptido, una proteína o un fago en cuya superficie se expone dicho péptido o dicha proteína. Dicha ECA puede estar, si se desea, inmovilizada sobre un soporte sólido. El término “muestra”, tal como aquí se utiliza, se refiere, pero no se limita, a tejidos y/o fluidos biológicos de un sujeto, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia que sirva para llevar a cabo cualquiera de los métodos proporcionados por la presente divulgación; es decir, dicha muestra biológica debe ser una muestra susceptible de contener anticuerpos, por ejemplo, autoanticuerpos contra las proteínas SULF1, MST1, etc., o contra las ECA que comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO: 1-6, o variantes de las mismas que contienen epítopos reconocibles por autoanticuerpos, etc. A modo ilustrativo, no limitante, dicha muestra biológica puede ser una muestra de sangre, orina, saliva, suero, plasma, un frotis bucal o buco-faríngeo, un espécimen quirúrgico, un espécimen obtenido de una biopsia o autopsia, etc. En una divulgación particular, dicha muestra es un fluido biológico. En una divulgación preferida, para la detección de autoanticuerpos, la muestra del sujeto es sangre, plasma o suero sanguíneo. En otra divulgación particular, dicha muestra es una muestra de tejido. En una divulgación preferida, para la cuantificación del nivel de la proteína SULF1, dicha muestra es, preferentemente, una muestra de tejido colorrectal, o muestra de tejido tumoral, etc., obtenida por métodos convencionales, por ejemplo, mediante una biopsia, una resección, etc.

El término “proteína SULF1”, según se usa en el presente documento, incluye la proteína SULF1 y variantes de la misma; en una divulgación particular, dicha proteína es la proteína cuyo número de acceso en la base de datos NCBI (versión de 1 de mayo de 2011) es EAW86954.1 y su secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 10.

El término “proteína NHSL1”, según se usa en el presente documento, incluye la proteína NHSL1 y variantes de la misma; en una divulgación particular, dicha proteína es la proteína cuyo número de acceso en la base de datos NCBI (versión de 1 de mayo de 2011) es NP_001137532.1 y su secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 7.

El término “proteína GRN”, según se usa en el presente documento, incluye la proteína GRN y variantes de la misma; en una divulgación particular, dicha proteína es la proteína cuyo número de acceso en la base de datos NCBI (versión de 1 de mayo de 2011) es 2JYT y su secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 8.

El término “proteína MST1”, según se usa en el presente documento, incluye la proteína MST1 y variantes de la misma; en una divulgación particular, dicha proteína es la proteína cuyo número de acceso en la base de datos NCBI (versión de 1 de mayo de 2011) es AAA83254.1 y su secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 9.

El término “proteína SREBF2”, según se usa en el presente documento, incluye la proteína SREBF2 y variantes de la misma; en una divulgación particular, dicha proteína es la proteína cuyo número de acceso en la base de datos NCBI (versión de 1 de mayo de 2011) es NP_004590.2 y su secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 11.

El término “proteína GTF2i”, según se usa en el presente documento, incluye la proteína GTF2i y variantes de la misma; en una divulgación particular, dicha proteína es la proteína cuyo número de acceso en la base de datos NCBI (versión de 1 de mayo de 2011) es NP_001157108.1 y su secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 12. El término “variante”, tal como aquí se utiliza, se refiere a una proteína o péptido sustancialmente homólogo a otra proteína o péptido, por ejemplo, a los péptidos cuyas secuencias de aminoácidos se muestran en SEQ ID NO:1 a 6, respecto a las proteínas SULF1, MST1, NHSL1, GRN, SREBF2 o GTF2i, etc. En general, una variante incluye adiciones, deleciones o sustituciones de uno o más aminoácidos. El experto en la materia entenderá que las secuencias de aminoácidos a las que se hace referencia en esta descripción pueden estar modificadas químicamente, por ejemplo, mediante modificaciones químicas que son fisiológicamente relevantes, tales como, fosforilaciones, acetilaciones, glucosilaciones o metilaciones. Dichas variantes, según la presente divulgación, son reconocidas por autoanticuerpos contra la proteína o péptido en cuestión. Variantes de dichos péptidos o proteínas incluyen péptidos o proteínas que muestran al menos un 25%, al menos un 40%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia con respecto a unas secuencias aminoacídicas de péptidos o proteínas determinadas. El grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante algoritmos estándar de alineamiento de secuencias conocidos en el estado de la técnica, tales como, por ejemplo, BLAST (Altschul S.F. et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990; 215(3):403-10).

Método de detección de autoanticuerpos en sujetos con CCR

Se divulga un método para detectar un autoanticuerpo en un sujeto sospechoso de tener cáncer colorrectal (CCR), en adelante primer método de la divulgación, que comprende:

a) poner en contacto una muestra de dicho sujeto con una entidad capturadora de anticuerpo (ECA), en donde dicha ECA se selecciona del grupo que consiste en:

(i) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo;

(ii) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo;

(iii) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo;

(iv) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo, en donde dicha ECA no es la proteína m St 1;

(v) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 5 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo;

(vi) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo; y

(vii) cualquier combinación de dichas ECAs (i)-(vi); y

b) detectar la formación de un complejo autoanticuerpo-ECA,

en donde la detección de dicho complejo autoanticuerpo-ECA es indicativa de la presencia de dicho autoanticuerpo en dicho sujeto.

En general, la muestra será una muestra biológica susceptible de contener anticuerpos, procedente de un sujeto, y puede ser obtenida por métodos convencionales, conocidos por los expertos en la materia, dependiendo de la naturaleza de la muestra. En una divulgación particular, dicha muestra biológica es una muestra de sangre, suero o plasma, que puede obtenerse por cualquier método convencional, por ejemplo, mediante una extracción de sangre, etc. La sangre es normalmente el fluido biológico óptimo a utilizar en métodos no invasivos para el cribado masivo con fines diagnósticos de grandes poblaciones de sujetos. Por un lado, el suero y el plasma son fáciles de obtener, y, por otro lado, la circulación sanguínea facilita el contacto de la sangre con todos los tejidos del cuerpo humano, incluyendo en el caso de pacientes con cáncer el contacto con tejido tumoral y sus antígenos representativos.

El primer método divulgado en el presente documento comprende poner en contacto una muestra de un sujeto sospechoso de padecer CCR con una ECA seleccionada de entre las ECAs (i) a (vi), indicadas en la Tabla 2, y sus combinaciones [etapa a)], en condiciones que permiten la formación de un complejo autoanticuerpo-ECA.

Tabla 2

ECA

(i) ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo.

(ii) ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo.

(iii) ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo.

(iv) ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo; en donde dicha ECA no es la proteína MST1.

(v) ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 5 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo.

(vi) ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo.

Las condiciones adecuadas para que tenga lugar la formación del complejo autoanticuerpo-ECA son conocidas por los expertos en la materia. Si la muestra contiene autoanticuerpos contra a dichas ECAs, entonces se formará el correspondiente complejo autoanticuerpo-ECA; en caso contrario, no se formará dicho complejo.

Aunque dichas ECAs podrían estar juntas en un mismo medio, en la práctica, resulta ventajoso que dichas ECAs estén separadas entre sí. Las ECAs pueden estar en solución o suspensión en un medio apropiado, o, alternativamente, pueden estar depositadas o apoyadas sobre un soporte [por ejemplo, una placa de microtitulación, perlas (magnéticas o no magnéticas), columnas, matrices, membranas, etc.]. Estos materiales se pueden utilizar en las formas convenientes, tales como películas, hojas, placas, etc., o pueden utilizarse para recubrir portadores inertes (por ejemplo, papel, cristal, películas de plástico, etc.). En una divulgación particular, la muestra que se va a analizar se pone en contacto con dichas ECAs, separadas entre sí, y depositadas sobre un soporte adecuado. La detección de dichos autoanticuerpos contra las ECAs mencionadas puede llevarse a cabo por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia. En una divulgación particular, la detección de dichos autoanticuerpos se lleva a cabo mediante un inmunoensayo; ejemplos ilustrativos, no limitantes, de inmunoensayos conocidos en el estado de la técnica incluyen inmunotransferencia, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), inmunoensayo lineal (LIA), radioinmunoensayo (RIA), inmunofluorescencia (IF), inmunohistoquímica (IHQ), micromatrices de proteínas, micromatrices de fagos, etc. El experto en la materia también entenderá que pueden utilizarse otros métodos basados, por ejemplo, en técnicas electroforéticas o cromatográficas, para detectar dichos autoanticuerpos.

En una divulgación particular, la detección de autoanticuerpos contra una o más ECAs se realiza mediante un ELISA. La técnica ELISA se basa en la premisa de que un inmunorreactivo (por ejemplo, un antígeno o un anticuerpo) se inmoviliza sobre un soporte sólido, y, a continuación, ese sistema se pone en contacto con una fase fluida que contiene el reactivo complementario que puede estar unido a un compuesto marcador. Existen diferentes tipos de ELISA, por ejemplo, ELISA directo, ELISA indirecto o ELISA sándwich.

La detección de autoanticuerpos contra una o más ECA(s) mediante un ELISA, por ejemplo, mediante un ELISA indirecto, comprende, en general, las siguientes etapas: (a) recubrir un soporte sólido con una o más ECAs, preferentemente separadas entre sí; (b) incubar el soporte recubierto de la etapa (a) con una muestra, tal como una muestra biológica del sujeto a estudiar, en condiciones que permitan la formación de un complejo autoanticuerpo-ECA; y (c) añadir un anticuerpo secundario, que reconoce al autoanticuerpo contra la(s) ECA(s), conjugado o unido a un compuesto marcador.

En otra divulgación particular, la detección de autoanticuerpos contra una o más ECAs se realiza mediante una micromatriz de proteínas. Una micromatriz de proteínas consiste en una colección de proteínas inmovilizadas sobre un soporte sólido en una disposición regular y prefijada. Existen varios factores importantes a tener en cuenta en el diseño de micromatrices de proteínas, entre los que se encuentran, por ejemplo, la naturaleza del soporte sobre el que inmovilizar las proteínas (o fragmentos apropiados de las mismas), la técnica de inmovilización de las proteínas, el formato de micromatriz, el agente de captura empleado o el método de detección a emplear. Son conocidos en el estado de la técnica diferentes formatos, soportes y técnicas que pueden ser empleados para la realización de este primer método.

La detección de autoanticuerpos contra una o más ECAs mediante una micromatriz de proteínas comprende, en general, las siguientes etapas: (a) recubrir un soporte sólido con dicha(s) ECA(s), preferentemente separadas entre sí; (b) incubar el soporte recubierto de la etapa (a) con una muestra, tal como una muestra biológica del sujeto a estudiar, en condiciones que permitan la formación de un inmunocomplejo del autoanticuerpo contra la(s) ECA(s) presente(s) en dicha muestra con los determinantes antigénicos correspondientes presentes en dichas ECAs; y (c) añadir un anticuerpo secundario, que reconoce al autoanticuerpo contra la(s) ECA(s), conjugado o unido a un compuesto marcador.

En otra divulgación particular, la detección de autoanticuerpos contra una o más ECAs se realiza mediante una micromatriz de fagos. Una micromatriz de fagos consiste en una colección de péptidos expuestos en la superficie de fagos. En una divulgación particular, dichos péptidos están fusionados a la proteína 10B de la cápside de fagos T7. Dichos fagos se inmovilizan sobre un soporte sólido en una disposición regular y prefijada. Existen varios factores importantes a tener en cuenta en el diseño de micromatrices de fagos tales como, por ejemplo, la naturaleza del soporte sobre el cual inmovilizar los fagos, la técnica de inmovilización, el formato de micromatriz o el método de detección a emplear. Son conocidos en el estado de la técnica diferentes formatos, soportes y técnicas que pueden ser empleados para la realización de esta divulgación preferida del método divulgado en el presente documento. La detección de autoanticuerpos contra una o más ECA(s) mediante una micromatriz de fagos comprende, en general, las siguientes etapas: (a) recubrir un soporte sólido con un lisado de fagos, por ejemplo, fagos T7, que presentan expuesta sobre su superficie un péptido o una secuencia de aminoácidos susceptible de ser reconocida por un autoanticuerpo; (b) incubar el soporte recubierto de la etapa (a) con una muestra, tal como una muestra biológica del sujeto a estudiar, en condiciones que permitan la formación de un complejo autoanticuerpo-ECA; y (c) añadir un anticuerpo secundario, que reconoce al autoanticuerpo contra la(s) ECA(s), conjugado o unido a un compuesto marcador. En una divulgación concreta, dicha micromatriz de fagos comprende un fago seleccionado del grupo que consiste en:

(i) un fago que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo, en donde dicha secuencia de aminoácidos está expuesta sobre la superficie del fago;

(ii) un fago que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo, en donde dicha secuencia de aminoácidos está expuesta sobre la superficie del fago;

(iii) un fago que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo, en donde dicha secuencia de aminoácidos está expuesta sobre la superficie del fago;

(iv) un fago que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo, en donde dicha secuencia de aminoácidos está expuesta sobre la superficie del fago;

(v) un fago que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 5 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo, en donde dicha secuencia de aminoácidos está expuesta sobre la superficie del fago;

(vi) un fago que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo, en donde dicha secuencia de aminoácidos está expuesta sobre la superficie del fago; y

(vii) cualquiera de las combinaciones de (i) a (vi).

El marcador unido al anticuerpo secundario al que se hace referencia en estas técnicas, es un compuesto capaz de dar lugar a una señal cromogénica, fluorogénica, radiactiva y/o quimioluminiscente que permita la detección, identificación y, opcionalmente, cuantificación de la cantidad del autoanticuerpo contra la(s) ECA(s) presente(s) en la muestra analizada. En una divulgación particular, dicho compuesto marcador se selecciona del grupo que consiste en radioisótopos, enzimas, fluoróforos o cualquier molécula susceptible de ser conjugada con otra molécula o detectada y/o cuantificada de forma directa. Este compuesto marcador puede unirse al autoanticuerpo directamente, o a través de otro compuesto. Ejemplos ilustrativos, no limitantes, de dichos compuestos marcadores que se unen directamente al autoanticuerpo incluyen enzimas, tales como la fosfatasa alcalina, la peroxidasa, etc., isótopos radiactivos, tales como 32P, 35S, etc., fluorocromos, tales como fluoresceína, etc., o partículas metálicas, para su detección directa mediante colorimetría, autorradiografía, fluorimetría, o metalografía, respectivamente.

La detección de los autoanticuerpos puede llevarse a cabo aplicando una única técnica o bien puede llevarse a cabo aplicando una combinación de dos o más técnicas; a modo ilustrativo, se pueden detectar unos autoanticuerpos mediante un ELISA y otros mediante una micromatriz de proteínas, o bien unos mediante un ELISA y otros mediante una micromatriz de fagos, o bien unos mediante una micromatriz de proteínas y otros mediante una micromatriz de fagos, etc.

En una divulgación particular, la muestra a analizar se pone en contacto con una única ECA seleccionada del grupo de ECAs (i)-(vi) mostradas en la Tabla 2, y sus combinaciones, en condiciones que permiten la formación de un complejo autoanticuerpo-ECA con el fin de identificar autoanticuerpos contra dicha ECA. En otra divulgación particular, dicha muestra biológica se pone en contacto con dos o más de dichas ECAs susceptibles de ser reconocidas por dichos autoanticuerpos, separadas entre sí, opcionalmente depositadas sobre un soporte adecuado, con el fin de identificar autoanticuerpos contra dichas ECAs.

En una divulgación particular, el primer método divulgado en el presente documento comprende la detección de un autoanticuerpo contra una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo, y, además, la detección de un autoanticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: (i) un autoanticuerpo contra una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo; (ii) un autoanticuerpo contra una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo; (iii) un autoanticuerpo contra una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo; (iv) un autoanticuerpo contra una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo; (v) un autoanticuerpo contra una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo; y (vi) cualquier combinación de autoanticuerpos (i) a (v). En una forma más concreta de dicha divulgación particular, dicho primer método de la divulgación comprende la detección de un autoanticuerpo contra una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo, y, además, la detección de 1, 2, 3, 4, o 5 cualesquiera de dichos autoanticuerpos (i) a (v) previamente indicados.

En una divulgación concreta, dicha ECA es la proteína SULF1 o una variante o fragmento de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo, mientras que, en otra divulgación concreta, dicha ECA es un fago que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4, o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo, en donde dicha secuencia de aminoácidos está expuesta sobre la superficie del fago.

En otra divulgación particular, el primer método de la divulgación comprende la detección de un autoanticuerpo contra una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo, y, además, la detección de un autoanticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: (i') un autoanticuerpo contra una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo; (ii') un autoanticuerpo contra una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo; (iii') un autoanticuerpo contra una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo; (iv') un autoanticuerpo contra una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo; (v') un autoanticuerpo contra una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo; y (vi') cualquier combinación de autoanticuerpos (i') a (v'). En una forma más concreta, dicho primer método de la divulgación comprende la detección de un autoanticuerpo contra una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo, y, además, la detección de 1, 2, 3, 4, o 5 cualesquiera de dichos autoanticuerpos (i') a (v') previamente indicados.

La etapa b) del método de detección de autoanticuerpos de la divulgación comprende detectar la formación de un complejo autoanticuerpo-ECA. Esta etapa puede llevarse a cabo por métodos convencionales, conocidos por los expertos en la materia, para la detección de la formación de complejos de anticuerpo-antígeno (en este caso, autoanticuerpo-ECA).

En una divulgación particular, a modo ilustrativo, no limitante, para la detección de dicho complejo, puede añadirse un conjugado que comprende un anticuerpo que reconoce al autoanticuerpo y un marcador (anticuerpo secundario marcado) en condiciones que permiten la formación de un complejo (autoanticuerpo-ECA)-anticuerpo/marcador y detectar la formación de dicho complejo. Si la muestra biológica contiene autoanticuerpos contra una o más de dichas ECAs, entonces se habrá formado previamente el complejo autoanticuerpo-ECA, con lo que, cuando se pone en contacto dicho complejo con dicho conjugado que comprende el anticuerpo y el marcador, en las condiciones adecuadas, se forma el complejo (autoanticuerpo-ECA)-anticuerpo/marcador, que será visualizado mediante la técnica apropiada dependiendo del marcador utilizado, tal como se menciona más adelante; mientras que, en caso contrario, es decir, cuando la muestra biológica no contiene autoanticuerpos contra dicha(s) ECA(s) entonces no se formará dicho complejo (autoanticuerpo-ECA)-anticuerpo/marcador. Las condiciones adecuadas para que tenga lugar la formación de este último complejo son conocidas por los expertos en la materia.

Prácticamente cualquier reactivo indicador que permita detectar dicho complejo (autoanticuerpo-ECA)-anticuerpo/marcador puede ser utilizado en la puesta en práctica de la presente divulgación. A modo ilustrativo, no limitante, dicho marcador puede ser una enzima que cataliza una reacción detectable (por ejemplo, peroxidasa, glucosidasa, fosfatasa alcalina, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, p-galactosidasa, p-glucosidasa, p-glucuronidasa, etc.), un compuesto que genera una señal cuando forma parte de dicho complejo (por ejemplo, un compuesto fluorescente o fluoróforo, tal como fluoresceína, rodamina, etc.; un compuesto (quimio)luminiscente, tal como un dioxetano, un acridinio, un fenantridinio, rutenio, luminol, etc.), un elemento radiactivo (por ejemplo, azufre, yodo, etc.), etc. En una divulgación particular, dicho marcador es una peroxidasa. La selección de un marcador particular no es crítica, siempre y cuando sea capaz de producir una señal por sí mismo o conjuntamente con unas o más sustancias adicionales. De este modo, el complejo (autoanticuerpo-ECA)-anticuerpo/marcador formado puede ser detectado o visualizado por cualquier técnica apropiada, dependiendo del marcador elegido, conocida por los expertos en la materia, utilizando los dispositivos apropiados, por ejemplo, mediante técnicas basadas en métodos colorimétricos, fluorimétricos, (quimio)luminiscentes, radiactivos, etc., todas ellas conocidas por los expertos en la materia.

El conjugado que comprende dicho anticuerpo que reconoce dicho autoanticuerpo y dicho marcador puede obtenerse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia.

A modo ilustrativo, cuando el marcador es una enzima, la detección del complejo en cuestión puede llevarse a cabo poniendo en contacto dicho complejo con un sustrato apropiado y, opcionalmente, con los activadores y/o agentes de amplificación enzimáticos apropiados. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos sustratos incluyen:

• Para la fosfatasa alcalina:

Cromogénico: sustratos basados en fosfato de p-nitrofenilo (p-NPP), fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo /nitroazul tetrazolio (BCIP/NPT), etc.

Fluorogénico: fosfato de 4-metilumbelifenilo (4-MUP), 2-(5'-cloro-2'-fosforiloxifenil)-6-cloro-4-(3H)-quinazolinona (CPPCQ), difosfato de 3,6-fluoresceína (3,6-FDP), etc.

• Para peroxidasas:

Cromogénico: sustratos basados en ácido 2,2-azinobis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS), ofenilendiamina (OPT), 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB), o-dianisidina, ácido 5-aminosalicílico, ácido 3-dimetilaminobenzoico (DMAB) y 3-metil-2-benzotiazolinhidrazone (MBTH), 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) y tetracloruro de 3,3'-diaminobenzidina (DAB), etc.

Fluorogénico: ácido 4-hidroxi-3-metoxifenilacético, fenoxazinas reducidas y benzotiazinas reducidas, incluyendo el reactivo Amplex® Red, Amplex UltraRed, dihidroxantenos reducidos, etc.

• Para glucosidasas:

Cromogénico: sustratos basados en o-nitrofenil-p-D-galactósido (o-NPG), p-nitrofenil-p-D-galactósido y 4-metilumbelifenil-p-D-galactósido (MUG) para p-D-galactosidasa, etc.

Fluorogénico: resorufin p-D-galactopiranósido, fluoresceín digalactósido (FDG), fluoresceín diglucurónido, 4-metilumbeliferil beta-D-galactopiranósido, carboxiumbeliferil beta-D-galactopiranósido, cumarin beta-D-galactopiranósidos fluorados, etc.

Mediante la puesta en práctica del primer método de la divulgación, es posible detectar y obtener autoanticuerpos contra las ECAs indicadas en la Tabla 2. Adicionalmente, si se desea, se podría determinar el nivel o cantidad (cuantificar) de dichos autoanticuerpos contra dichas ECAs presentes en la muestra en estudio ya que la señal generada por algunos marcadores (por ejemplo, enzimas, etc.) es proporcional a la cantidad de autoanticuerpo presente en dicha muestra.

Opcionalmente, si se desea, se puede aislar el complejo autoanticuerpo-ECA mediante técnicas convencionales, por ejemplo, mediante el empleo de técnicas de inmunoprecipitación, etc., y, posteriormente, secuenciar el autoanticuerpo que se une a la ECA mediante el empleo de métodos de proteómica estándar convencionales, por ejemplo, mediante la determinación de la huella peptídica o análisis MS/MS (Vikas Dhingraa, et al. 2005. International Journal of Pharmaceutics 299 (1-2):1-18; Hanash SM et al. Nature. 3 Abr. 2008;452(7187):571-9).

Según el primer método de la divulgación, la detección del complejo autoanticuerpo-ECA es indicativa de la presencia del correspondiente autoanticuerpo (o autoanticuerpos) específico(s) contra dicha(s) ECA(s) en la muestra analizada y, por tanto, en el sujeto analizado.

En una divulgación particular, la formación de dicho complejo autoanticuerpo-ECA en dicha muestra se puede correlacionar con un diagnóstico de CCR en el sujeto del que procede la muestra analizada, o con el pronóstico de dicha enfermedad, o con el seguimiento de la evolución de dicha enfermedad. En el sentido utilizado en esta descripción, el término “correlacionar” se refiere a comparar la presencia o cantidad del indicador en un sujeto (por ejemplo, un sujeto sospechoso de padecer CCR) con su presencia o cantidad en sujetos que padecen dicha enfermedad (CCR), o que están predispuestos a desarrollarla, o en sujetos libres de dicha enfermedad.

El término “diagnóstico”, tal como aquí se utiliza, se refiere, en general, al proceso por el cual se identifica una enfermedad, entidad nosológica, síndrome, o cualquier estado de salud-enfermedad. En particular, el término “diagnóstico de cáncer colorrectal (o CCR)” se refiere a la capacidad de identificar o detectar la presencia de CCR; esta detección, tal y como la entiende un experto en la materia, no pretende ser correcta en un 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad que es estadísticamente significativa puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas; ejemplos ilustrativos, no limitantes, de dichas herramientas estadísticas incluyen la determinación de intervalos de confianza, la determinación del valor p, la prueba de la t de Student o las funciones discriminantes de Fisher, etc. (véase, por ejemplo, Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York 1983). Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor p es menor de 0,1, de 0,05, de 0,01, de 0,005 o de 0,0001. Ventajosamente, las enseñanzas de la presente divulgación permiten detectar correctamente CCR en al menos el 50%, preferentemente en al menos el 60%, más preferentemente en al menos el 70%, aún más preferentemente en al menos el 80%, o todavía más preferentemente en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizada. En otra divulgación particular, el primer método divulgado en el presente documento comprende comparar la inmunorreactividad de la muestra analizada con la inmunorreactividad de una segunda muestra procedente del mismo sujeto en un periodo de tiempo posterior. De este modo, es posible evaluar la evolución de la enfermedad o bien evaluar la eficacia del tratamiento en caso de que dicha segunda muestra haya sido obtenida después de que el sujeto haya sido tratado para CCR. En el sentido utilizado en esta descripción, el término “inmunorreactividad” se refiere a la presencia o nivel de unión de un anticuerpo o anticuerpos en una muestra a uno o más antígenos diana, por ejemplo, las ECAs de la Tabla 2. Un “patrón de inmunorreactividad” se refiere a un perfil de unión de anticuerpos en una muestra (autoanticuerpos) a una pluralidad de antígenos diana (por ejemplo, las ECAs de la Tabla 2).

En otra divulgación, el primer método divulgado en el presente documento comprende, además, analizar la presencia uno o más marcadores adicionales de CCR, por ejemplo, CEA o autoanticuerpos contra las proteínas Pim1, SRC, MAPKAPK3, FGFR4, STK4 y/o ACVR2B.

Método de detección de autoanticuerpos

Se divulga también un método para detectar un autoanticuerpo en una muestra, que comprende:

(a) poner en contacto una muestra con una entidad capturadora de anticuerpo (ECA), en donde dicha ECA se selecciona del grupo que consiste en:

(iv) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo, en donde dicha ECA no es la proteína MST1;

(vii) cualquier combinación de dichas ECAs (i)-(vi); y

(b) detectar la formación de un complejo autoanticuerpo-ECA,

en donde la detección de dicho complejo autoanticuerpo-ECA es indicativa de la presencia de dicho autoanticuerpo en dicha muestra. La invención se refiere a un método para detectar un autoanticuerpo en una muestra, método de la invención, que comprende:

a) poner en contacto una muestra de un sujeto con una entidad de captura de anticuerpo (ECA), en donde dicha ECA es una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4 o un péptido o proteína que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a SEQ ID NO: 4 y que está reconocida por un autoanticuerpo contra SEQ ID NO: 4;

y

b) detectar la formación de un complejo entre un autoanticuerpo y dicha ECA,

En general, las características de dicha ECA a la que se hace referencia en el método de la invención son las mismas que las características de la ECA a las que se hace referencia en el primer método de la divulgación. Las técnicas para detectar los autoanticuerpos según el método de la invención son las mismas que las mencionadas en relación con el primer método de la divulgación, por lo que se incorporan aquí mediante referencia.

Las divulgaciones particulares del primer método divulgado en el presente documento, así como las definiciones de los términos utilizados son aplicables también al método de la invención, por lo que se incorporan en este método de la invención por referencia.

Este método de la invención permite correlacionar los resultados obtenidos con aquellas patologías en las que se generan respuestas inmunitarias con la consiguiente producción de autoanticuerpos. Ejemplos ilustrativos, no limitantes, de dichas patologías incluyen algunos tipos de cáncer, por ejemplo, CCR, carcinoma hepatocelular (Imai, H et al. Intervirology 35:73-85), cáncer de mama, cáncer de próstata (Wang X et al. N Engl J Med. 2005; 353(12):1224-35), cáncer de pulmón, etc. y enfermedades autoinmunitarias.

En una realización particular del método de la invención, la muestra es una muestra de un sujeto que se sospecha tiene cáncer colorrectal (CCR). Más en particular, el método de la invención comprende además correlacionar la formación del complejo autoanticuerpo-ECA en la muestra del sujeto con un diagnóstico de CCR o comprende además comparar la inmunorreactividad de la muestra con la inmunorreactividad de una segunda muestra del mismo sujeto en un periodo de tiempo posterior. En particular, dicha segunda muestra del sujeto se ha obtenido después de que dicho sujeto haya sido tratado para CCR.

En una realización particular, el método de la invención comprende la detección de un autoanticuerpo contra una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 o una proteína o péptido que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a SEQ ID NO:4 que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo contra SEQ ID NO: 4, y, además, la detección de un autoanticuerpo seleccionado del grupo que consiste en:

(i) un autoanticuerpo contra una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 o una proteína o péptido que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a SEQ ID NO:2 que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo contra SEQ ID NO: 2;

(ii) un autoanticuerpo contra una ^eC^aque comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6 o una proteína o péptido que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a SEQ ID NO:6 que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo contra SEQ ID NO:6;

(iii) un autoanticuerpo contra una eCa que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3 o una proteína o péptido que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a SEQ ID NO:3 que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo contra SEQ ID NO:3;

(iv) un autoanticuerpo contra una ^eC^aque comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 5 o una proteína o péptido que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a SEQ ID NO:5 que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo contra SEQ ID NO:5;

(v) un autoanticuerpo contra una ^eC^aque comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 o una proteína o péptido que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a SEQ ID NO:1 que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo contra SEQ ID NO:1; y

(vi) cualquier combinación de autoanticuerpos (i) a (v).

En otra realización preferida del método de la invención, dicha ECA es sulfatasa 1 (SULF1) o una proteína o péptido que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a SULF1 que contiene un epítopo reconocible contra SULF1,

o alternativamente,

dicha ECA es un fago que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4 o una proteína o péptido que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a SEQ ID NO:4 que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo contra SEQ ID NO:4, en donde dicha secuencia de aminoácidos está expuesta en la superficie del fago.

Se divulga un método que comprende la detección de un autoanticuerpo contra una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo, y, además, la detección de un autoanticuerpo seleccionado del grupo que consiste en:

(i) un autoanticuerpo contra una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo;

(ii) un autoanticuerpo contra una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo;

(iii) un autoanticuerpo contra una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo;

(iv) un autoanticuerpo contra una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo;

(v) un autoanticuerpo contra una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 5 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo; y

(vi) cualquier combinación de autoanticuerpos (i) a (v).

Entidad capturadora de anticuerpos (ECA)

También se divulga una entidad capturadora de anticuerpos (ECA), seleccionada del grupo que consiste en:

(i) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo, en donde dicha ECA no es la proteína SULF1;

(ii) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo, en donde dicha ECA no es la proteína GRN;

(iii) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo, en donde dicha ECA no es la proteína GTF2i; y

(v) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 5 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo, en donde dicha ECA no es la proteína SREBF2;

(vi) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo, en donde dicha ECA no es la proteína NHSL1; y

(vii) cualquier combinación de ECAs (i) a (vi).

Una ECA, tal como se ha definido previamente, es una entidad macromolecular, por ejemplo, un péptido, una proteína o un fago, que se une específicamente a un anticuerpo (o autoanticuerpo). En una divulgación particular, dicha ECA comprende un péptido o una proteína que se une específicamente a un anticuerpo (o autoanticuerpo). Dicho péptido puede estar inmovilizado sobre un soporte o bien expuesto sobre la superficie de un fago. En una divulgación particular preferida, dicha ECA es un péptido, una proteína o un fago en cuya superficie se expone dicho péptido o dicha proteína. Dicha ECA puede estar, si se desea, inmovilizada sobre un soporte sólido.

La invención se refiere a una entidad de captura de anticuerpos (ECA) que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4, en donde dicha ECA no es la proteína sulfatasa-1 (SULF1). En una realización preferida de la entidad de captura de anticuerpos (ECA) según la invención, dicha ECA es un fago que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4, en donde dicha secuencia de aminoácidos está expuesta en la superficie del fago.

En una divulgación particular, la ECA se selecciona del grupo que consiste en:

(i) un fago que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo, en donde dicha secuencia de aminoácidos está expuesta sobre la superficie del fago;

(iii) un fago que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo, en donde dicha secuencia de aminoácidos está expuesta sobre la superficie del fago;

(iv) un fago que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo, en donde dicha secuencia de aminoácidos está expuesta sobre la superficie del fago;

(vi) un fago que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo, en donde dicha secuencia de aminoácidos está expuesta sobre la superficie del fago; y

(vii) cualquiera de las combinaciones de (i) a (vi).

Dichos fagos pueden ser obtenidos por métodos convencionales, conocidos por los expertos en la materia, y, de forma más concreta, mediante el procedimiento descrito en el Ejemplo 1.

Las ECAs divulgadas en el presente documento pueden ser utilizadas en la detección de anticuerpos o autoanticuerpos contra dichas ECAs en una muestra, en particular, contra las secuencias aminoacídicas identificadas como SEQ ID NO: 1-6 presentes en dichas ECAs, y la presencia de dichos autoanticuerpos en dicha muestra puede ser correlacionada con el diagnóstico, pronóstico, seguimiento de la evolución, o eficacia del tratamiento, de una enfermedad, para la que dichos autoanticuerpos sean marcadores, por ejemplo, CCR.

Composición de la invención

También se divulga la composición 1 de la divulgación, que comprende una ECA divulgada en el documento. Como se ha indicado previamente, en una divulgación particular, dicha ECA puede ser un péptido, una proteína o un fago. En una divulgación particular, la composición 1 de la divulgación comprende, al menos, una ECA divulgada en el presente documento. En otra divulgación particular, la composición 1 de la divulgación comprende al menos 2 ECAs de la divulgación, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o incluso las 6 ECAs de la divulgación.

En otra divulgación particular, la composición 1 comprende una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo, y, además, al menos una ECA seleccionada del grupo que consiste en:

(i) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo;

(ii) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo;

(iii) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo;

(iv) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 5 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo;

(v) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo; y

(vi) cualquier combinación de ECAs (i) a (v).

En otra divulgación particular, la composición 1 de la divulgación comprende una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo, y, además, al menos una ECA seleccionada del grupo que consiste en:

(ii) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo;

(iii) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo;

(v) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo; y

(vi) cualquier combinación de ECAs (i) a (v).

En otra divulgación particular, la composición 1 de la divulgación comprende, al menos, una ECA divulgada en el presente documento y, al menos, una proteína seleccionada del grupo que consiste en la proteína SULF1 o una variante de la misma, la proteína MST1 o una variante de la misma, y sus combinaciones. El experto en la materia apreciará que es posible usar proteínas SULF1 o MST1 de distintas especies; no obstante, en una divulgación preferida, la composición 1 de la divulgación incluye proteínas SULF1 o MST1 de origen humano, tal como la proteína SULF1 humana, cuyo número de acceso en la base de datos NCBI (versión de 1 de mayo de 2011) es EAW86954.1 y su secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 10, y la proteína MST1 humana cuyo número de acceso en la base de datos NCBI (versión de 1 de mayo de 2011) es AAA83254.1 y su secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 9. El término “variante” ya ha sido definido previamente en el apartado “Definiciones”.

En otra divulgación particular, la composición 1 de la divulgación comprende:

a) una ECA seleccionada del grupo que consiste en:

(i) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo,

(ii) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo;

(iii) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo;

(iv) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo;

(v) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo;

(vi) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo; y

(vii) cualquier combinación de ECAs (i) a (vi); y

b) una proteína seleccionada del grupo formado por la proteína SULF1 o una variante de la misma, la proteína MST1 o una variante de la misma, y sus combinaciones.

En una divulgación preferida, dicha composición 1 de la divulgación comprende:

a) una ECA seleccionada del grupo que consiste en:

(i) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo,

(ii) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo;

(iii) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo;

(iv) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo; y

(v) cualquier combinación de ECAs (i) a (iv); y

La composición de la invención comprende una entidad de captura de anticuerpo (ECA) según la invención, composición 1 de la invención. La composición 1 de la divulgación ha proporcionado unos buenos resultados en el diagnóstico de CCR [Ejemplo 4].

En una realización preferida, la composición de la invención comprende además al menos una ECA según la invención, y al menos una proteína seleccionada del grupo que consiste en la proteína sulfatasa 1 (SULF1) o una proteína o péptido que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a SULF1 y reconocible por un autoanticuerpo contra SULF1, la proteína MST1 o una proteína o péptido que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a MST1 y reconocible por un autoanticuerpo contra MST1, y sus combinaciones.

También se divulga la composición 2 de la divulgación, que comprende la proteína SULF1 o una variante de la misma y la proteína MST1 o una variante de la misma. Las características de dichas proteínas SULF1 y MST1, y de sus variantes, han sido mencionadas previamente.

En una divulgación particular, la composición 2 de la divulgación comprende, además, al menos, una ECA de la divulgación. En otra divulgación particular, la composición 2 de la divulgación comprende al menos 2 ECAs de la divulgación.

En otra divulgación particular, dicha composición 2 de la divulgación comprende:

a) la proteína SULF1 o una variante de la misma;

b) la proteína MST1 o una variante de la misma; y

c) una ECA seleccionada del grupo que consiste en:

(i) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo,

(iii) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 5 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo;

(iv) una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 o una variante de la misma que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo; y

(v) cualquier combinación de ECAs (i) a (iv).

La invención también se refiere a una composición, composición 2 de la invención que comprende proteína sulfatasa 1 (SULF1) o una proteína o péptido que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a SULF1 y reconocible por un autoanticuerpo contra SULF1 y proteína MST1 o una proteína o péptido que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a MST1 y reconocible por un autoanticuerpo contra MST1 y una entidad de captura de anticuerpo (ECA) según la invención.

En una realización particular, tanto la composición 1 de la invención como la composición 2 de la invención están apoyadas sobre un soporte sólido.

Kit de la invención y aplicaciones

En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit, en adelante kit 1 de la invención, que comprende una composición de la invención. En una realización particular, dicha composición de la invención es la composición 1 de la invención. En otra realización particular, dicha composición de la invención es la composición 2 de la invención. En otro aspecto, la invención se refiere al uso in vitro del kit 1 de la invención para:

- detectar un anticuerpo en una muestra,

- detectar un autoanticuerpo en un sujeto sospechoso de padecer cáncer colorrectal (CCR),

- diagnosticar si un sujeto padece CCR,

- determinar el riesgo de un sujeto a desarrollar CCR,

- seguir la evolución de CCR en un sujeto,

- evaluar la eficacia de un tratamiento contra CCR, o

- predecir la supervivencia de un sujeto que padece CCR.

Para dichas aplicaciones, el kit 1 de la invención incluirá los reactivos necesarios para detectar autoanticuerpos contra, al menos, una ECA de la Tabla 2.

En una realización particular, el kit 1 de la invención comprende una ECA de la invención. En otra realización particular, el kit de la invención comprende la composición 1 de la invención. En otra realización particular, el kit de la invención comprende la composición 2 de la invención. Se divulga un kit 1 que comprende una proteína seleccionada del grupo formado por la proteína SULF1 o una variante de la misma, la proteína MST1 o una variante de la misma, y sus combinaciones.

En otro aspecto, la invención se refiere a un kit, en adelante kit 2 de la invención, que comprende un reactivo para detectar la proteína SULF1 o una proteína o péptido que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a SULF1 y reconocible por un autoanticuerpo contra SULF1. En una realización particular, dicho kit 2 de la invención comprende, además, un reactivo para detectar la proteína MST1 o una proteína o péptido que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a MST1 y reconocible por un autoanticuerpo contra MST1. En otra realización particular, el kit 2 de la invención comprende una ECA seleccionada del grupo de ECAs mencionadas en la Tabla 2.

El kit 2 de la invención puede ser utilizado en las mismas aplicaciones que el kit 1 de la invención.

Tanto el kit 1 de la invención como el kit 2 de la invención pueden contener, además, todos aquellos reactivos necesarios para detectar la cantidad de autoanticuerpos contra las ECAs definidas anteriormente, o contra las proteínas SULF1, MST1 o sus variantes, como, por ejemplo, pero sin limitarse, a

- anticuerpos secundarios marcados con un marcador que reconocen específicamente los complejos autoanticuerpo-ECA;

- sustratos para los marcadores presentes en dichos anticuerpos secundarios marcados; y

- controles positivos y/o negativos.

Asimismo, dichos kits 1 y 2 de la invención pueden, además, incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de proteínas, etc. Por otro lado, el kit de la invención puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en práctica y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además instrucciones para su utilización.

Método de diagnóstico de CCR

Adicionalmente, los autores de la presente invención han encontrado que la sobreexpresión de la proteína SULF1 se correlaciona con CCR, tal como se muestra en la Figura 3.

Por tanto, también se divulga un método para diagnosticar si un sujeto padece cáncer colorrectal (CCR), que comprende determinar el nivel de la proteína SULF1 en una muestra de dicho sujeto, en donde si el nivel de dicha proteína SULF1 es mayor que el nivel de la proteína SULF1 de una muestra de referencia, es indicativo de que el sujeto padece CCR.

Para la puesta en práctica de este método divulgado en el presente documento, la muestra puede ser, preferentemente, una muestra de tejido, tal como una muestra de tejido de colon o tumoral.

El término “diagnóstico” ya ha sido definido previamente.

Los métodos para la determinación del nivel (concentración) de una proteína son bien conocidos por un experto en la materia e incluyen numerosas alternativas. Prácticamente cualquier método que permita la determinación del nivel (cuantificación) de la proteína SULF1 puede ser utilizado en la puesta en práctica del método divulgado en el presente documento.

En una divulgación particular, el nivel de la proteína SULF1 es cuantificado mediante un método convencional que permite detectar y cuantificar dicha proteína en una muestra a estudiar, tal como una muestra de un sujeto. La determinación del nivel de dicha proteína SULF1 se puede realizar, a modo ilustrativo, no limitante, mediante un inmunoensayo, por ejemplo, ELISA, etc., mediante resonancia magnética nuclear (RMN) o mediante cualquier otra técnica apropiada conocida en el estado de la técnica. En una divulgación preferida, la determinación del nivel de proteínas se realiza mediante un inmunoensayo. En una realización particular preferida, dicho inmunoensayo es una inmunotransferencia (transferencia Western o inmunodetección en membrana). Para ello, brevemente, se obtiene un extracto de proteínas de una muestra biológica aislada de un sujeto y se separa la proteína mediante electroforesis en un medio soporte capaz de retenerla. Una vez separadas las proteínas se transfieren a un soporte diferente o membrana donde pueden ser detectadas mediante el uso de anticuerpos específicos que reconocen a la proteína en cuestión (SULF1). Dicha membrana se hibrida con un primer anticuerpo específico (o anticuerpo primario) que reconoce la proteína SULF1. A continuación, la membrana se hibrida con un segundo anticuerpo (o anticuerpo secundario) que reconoce de manera específica al anticuerpo primario y que se encuentra conjugado o unido con un compuesto marcador. En una divulgación alternativa, el anticuerpo que reconoce a la proteína SULF1 está conjugado o unido a un compuesto marcador, y no es necesario el uso de un anticuerpo secundario. Se conocen diferentes formatos, soportes y técnicas que pueden ser empleados para la realización de esta divulgación preferida del método divulgado en el presente documento.

En otra divulgación particular preferida, el inmunoensayo comprende un ensayo inmunohistoquímico. Las técnicas de inmunohistoquímica permiten la identificación, en muestras tisulares o citológicas, de determinantes antigénicos característicos. El análisis mediante inmunohistoquímica (IHQ) se realiza sobre cortes de tejido, ya sea congelado o incluido en parafina, procedente de una muestra biológica aislada de un sujeto. Estos cortes se hibridan con un anticuerpo específico o anticuerpo primario que reconoce a anticuerpos específicos que reconocen a la proteína SULF1. A continuación, los cortes se hibridan con un anticuerpo secundario capaz de reconocer de manera específica el anticuerpo primario y que se encuentra conjugado o unido con un compuesto marcador. En una divulgación alternativa, el anticuerpo que reconoce a la proteína SULF1 está conjugado o unido a un compuesto marcador, y no es necesario el uso de un anticuerpo secundario.

A modo ilustrativo, no limitante, el “nivel de la proteína SULF1”, se refiere, pero no se limita, a la cantidad cuantificable, semicuantificable, o relativa de dicha proteína SULF1, así como a cualquier otro valor o parámetro relacionado con dicha proteína o que pueda derivarse de la misma. Dichos valores o parámetros comprenden valores de intensidad de la señal obtenidos a partir de cualquiera de las propiedades físicas o químicas de dicha proteína obtenidos bien mediante medida directa, por ejemplo, valores de intensidad de espectroscopía de masas, resonancia magnética nuclear, etc., o bien mediante medida indirecta, por ejemplo, mediante cualquiera de los sistemas de medida descritos en este documento, por ejemplo, mediante la medida obtenida de un componente secundario o un sistema de medida biológica (por ejemplo, la medida de respuestas celulares, ligandos, “etiquetas” o productos de reacción enzimática). El nivel de la proteína SULF1, determinado en una muestra, tal como una muestra biológica procedente del sujeto sometido a estudio, se dice que es “mayor” que el nivel de referencia de dicha proteína SULF1 cuando, según la divulgación, el nivel de dicha proteína en la muestra a analizar es de, al menos 1,5 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso más, con respecto al nivel de referencia de dicha proteína.

El término “nivel de referencia”, tal como aquí se utiliza, se refiere, en general, al nivel de un producto, por ejemplo, la proteína SULF1, presente en sujetos control. En una divulgación particular, dichos sujetos control son sujetos que no padecen una determinada enfermedad (por ejemplo, CCR), mientras que en otra divulgación particular, dicho sujeto control es el propio sujeto en estudio, lo que resulta particularmente útil para evaluar el seguimiento de una enfermedad (por ejemplo, CCR) o para evaluar la eficacia de un tratamiento contra dicha enfermedad (por ejemplo, CCR), etc., para lo cual el nivel de referencia de un producto dado puede ser el nivel de dicho producto determinado en una muestra del mismo sujeto en estudio pero tomada unos días, semanas, meses o incluso años antes con el fin de evaluar el seguimiento de la enfermedad, o bien tomada un antes de, por ejemplo, la aplicación al sujeto de un tratamiento contra dicha enfermedad con el fin de evaluar su eficacia.

Debido a la variabilidad que pueda producirse entre los diferentes sujetos en cuanto a la producción de proteína SULF1, el nivel de referencia podría obtenerse a partir de un conjunto de muestras procedente de una población de sujetos sanos (por ejemplo, sujetos que no padecen CCR) y calculando el nivel medio del producto en cuestión (proteína SULF1) en dicha población de sujetos sanos.

El nivel de referencia de un determinado producto, por ejemplo, la proteína SULF1, puede ser determinado a partir de una muestra de referencia que puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra a analizar (muestra problema). Generalmente, el nivel de referencia puede derivarse de los límites de distribución normal de una cantidad fisiológica encontrada en una población de sujetos control. Dicha cantidad fisiológica puede ser determinada por varias técnicas bien conocidas, tal como se describe en esta descripción. Dicho nivel de referencia, según la presente divulgación, permite discriminar la presencia de CCR y, por tanto, puede ser utilizado en el diagnóstico, pronóstico o seguimiento de la evolución de CCR.

Los marcadores y métodos proporcionados por la presente divulgación son adecuados para diagnosticar CCR, así como para predecir el desarrollo de CCR, seguir la evolución de CCR y/o evaluar la eficacia del tratamiento administrado a un sujeto que padece CCR.

Ensayos realizados por los inventores han puesto de manifiesto que los fagos identificados como MST1, SULF1, NHSL1, SREBF2, GRN y GTF2i permiten discriminar entre sueros tumorales (CCR) y sueros controles por ELISA. Aunque la sensibilidad era relativamente baja para los fagos individuales, oscilando entre el 46% y el 60%, la especificidad era mayor, entre el 50% y el 73,9%, y, además, la combinación de los 6 fagos como predictor de CCR proporcionó un AUC de 0,82 con una sensibilidad y una especificidad del 70% y el 73,9% [Ejemplo 4].

Por otra parte, la combinación de las proteínas recombinantes SULF1 y MST1 junto con los fagos NHSL1, GRN, SREBF2 y GTF2i permitió predecir la enfermedad (CCR) con una sensibilidad del 72% y una especificidad del 87%, con un AUC de 0,83. Si además se tiene en cuenta la edad del paciente, el AUC es de 0,91. Además, estos marcadores permiten agrupar los resultados discriminando, no sólo los individuos enfermos, sino también los distintos estadios de la enfermedad. Asimismo, los autoanticuerpos contra MST1 y NHSL1 están asociados con el pronóstico clínico de los pacientes con CCR. Por tanto, la detección de este panel de autoanticuerpos en el suero es, por tanto, un método sencillo y no invasivo para el diagnóstico/pronóstico del CCR.

Adicionalmente, se ha observado que la sobreexpresión de la proteína SULF1 está correlacionada con el diagnóstico de CCR [Figura 3].

Ejemplos

A continuación, se ilustrará la invención mediante ensayos realizados por los inventores, que muestran claramente la especificidad y eficacia del método para el diagnóstico/pronóstico de CCR basado en la detección en suero de anticuerpos contra los autoantígenos tumorales descritos.

Ejemplo 1

Análisis de sueros de pacientes con CCR con micromatrices impresas con fagos T7

I. MATERIALES Y MÉTODOS

Sueros de CCR y de referencia

Los sueros usados en los análisis de micromatrices y de supervivencia se obtuvieron de pacientes de1Hospital Universitario de Bellvitge, Instituto Catalán de Oncología de Barcelona, Hospital Puerta de Hierro de Madrid y Hospital de Cabueñes de Gijón, tras obtener el consentimiento escrito de todos los pacientes incluidos en el estudio. Para la selección de las genotecas de fagos T7 específicos de CCR se usaron 3 sueros de pacientes con CCR de estadio B de Duke, 3 de estadio C y 6 de estadio D (3 con metástasis en hígado y 3 con metástasis en pulmón). Para el cribado mediante micromatrices se seleccionaron 15 sueros de pacientes con CCR de diferentes estadios, con una edad media de 66,3 años (intervalo de edad 54-82) y 15 sueros de individuos control con similar edad media y la misma proporción de sexos que los pacientes con CCR.

Para el análisis de supervivencia, se ensayó otro panel de 95 sueros de CCR con más de 10 años de seguimiento. La mediana de la edad era 66,2 años (intervalo entre 23-90 años). Los datos clínicos de todos los pacientes se recogen en la Tabla 3. Todas las muestras se manejaron de forma anónima de acuerdo a las normas éticas y jurídicas del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC).

Tabla 3. Información clínico-patológica de los pacientes cuyo suero fue utilizado para la identificación y validación de los autoanticuerpos.

Pacientes con CCR (n) 160 Donantes sanos (n) 61

Media de edad (años) 67,7 Media de edad (años) 61,7

Intervalo de edad (años) 23-91 Intervalo de edad (años) 34-89

Sexo: Sexo:

Hombre 65,6% Hombre 60,7%

Mujer 34,4% Mujer 39,3%

Estadio de Duke:

I 40,6%

II 19,4%

III 15,6%

IV 24,4%

Pronóstico:

Muerto 33,1%

Vivo 60%

Desconocido 6,9%

Tiempo medio de

supervivencia (meses) ^57,5

Para la validación, se usó un grupo independiente de sueros; 50 sueros de CCR representativos de todos los estadios de Duke (A-D), 46 sueros controles, 10 pacientes asintomáticos con antecedentes familiares, 2 con pólipos hiperplásicos, 2 con colitis ulcerosa y 43 sueros de otros tipos de cáncer (vejiga, mama, pulmón, páncreas y estómago).

Los sueros utilizados se procesaron de la misma manera en los diferentes hospitales; las muestras de sangre se dejaron a temperatura ambiente durante al menos 30 min (y un máximo de 60 min) para permitir la formación del coágulo. Posteriormente, las muestras se centrifugaron a 3.000 g a 4°C durante 10 min. Los sueros se congelaron y almacenaron a -80°C hasta su utilización.

Síntesis de la genoteca de ADNc en fagos T7 y rondas de selección

El ARN total de 3 tejidos tumorales de pacientes con CCR en estadios de Duke A (muestras A) y 3 de estadio C (muestras C), se aisló mediante el reactivo Trizol (Invitrogen). Se utilizaron 4 microgramos de cada ARN, mezclando por separado las muestras A y las muestras C, para la síntesis del ADNc. Las genotecas de ADNc de CCR en fagos T7 se construyeron utilizando el sistema de síntesis y clonación de ADNc OrientExpress (Novagen) según las instrucciones del fabricante. El ADNc se sintetizó mediante RT-PCR usando el oligonucleótido oligo(dT). La clonación se realizó indistintamente en los vectores T7Select 415-1 y T7Select 10-3b que difieren en el tamaño de inserto que admiten. El crecimiento de los fagos se obtuvo en las cepas BL21 y BLT 5403 de E. coli, respectivamente. Las cuatro genotecas T7 se titularon haciendo diluciones seriadas de los fagos T7 en placas Petri. Los tamaños de las genotecas fueron superiores a 106 ufp/ml en todos los casos. Las rondas de selección de los fagos se realizaron usando por un lado la combinación de las 2 genotecas construidas con el vector T7Select 415-1 y por otro la combinación de las 2 genotecas construidas con el vector T7Select 10-3b.

En primer lugar, se realizó una selección negativa. Para ello, se incubaron partículas magnéticas acopladas a proteína A/G (Invitrogen) con una mezcla de 8 sueros controles (120 pl de mezcla de sueros controles, diluido 1:50, a 4° C toda la noche) para unir las IgG de los sujetos control. Posteriormente, se incubaron los fagos con dichas partículas magnéticas para eliminar aquellos fagos unidos a las IgG de los sueros control. En segundo lugar se incubaron 4 mezclas de sueros (mezcla estadio B: de 3 pacientes con CCR de estadio de Duke B, mezcla estadio C: de 3 pacientes de estadio de Duke C, mezcla estadio D-H: de 3 pacientes con estadio de Duke D y metástasis a hígado y mezcla estadio D-P: de 3 pacientes con estadio de Duke D y metástasis a pulmón) con partículas magnéticas acopladas a proteína A/G para enriquecer las genotecas de fagos en fagos específicos de CCR. Los fagos no retenidos en la selección negativa se incubaron con las partículas magnéticas previamente incubadas con las diferentes mezclas de sueros de pacientes con CCR. Los fagos unidos a dichas partículas magnéticas se eluyeron con 100 pl de SDS al 1% y se amplificaron en BLT5406 o BL21 de E. coli. En total se hicieron 4 rondas de selección para enriquecer las genotecas de fagos T7 en fagos específicos de CCR. Finalmente, se amplificaron clones individuales de las 8 selecciones que se imprimieron en micromatrices de nitrocelulosa.

Micromatrices de fagos

Tras la amplificación de los fagos monoclonales, los lisados de bacterias se centrifugaron y los sobrenadantes que contenían los fagos se diluyeron 1:2 en PBS con Tween 20 al 0,1% (PBST) para su impresión por duplicado en micromatrices de nitrocelulosa (Whatman/Schleicher & Schuell's) con el robot OmniGrid Spotter (GeneMachines, San Carlos, CA). Los controles negativos empleados en la impresión fueron BSA (Sigma Aldrich), tampón de impresión o huecos vacíos. La proteína T7 e IgG humana (Sigma-Aldrich) se imprimieron como controles positivos para verificar la calidad de la matriz.

Treinta sueros (15 de pacientes con CCR y 15 de individuos normales) se incubaron con las micromatrices de fagos como se describió previamente (Chaterjee, M et al. 2006. Cancer Res. 66:1181-1190). Brevemente, los portaobjetos fueron equilibrados con PBS a temperatura ambiente durante 5 min y bloqueados con leche desnatada al 3% en PBS (MPBS 3%) durante 1h a temperatura ambiente con agitación. Posteriormente, las matrices se incubaron con 6,6 |jl de suero humano (dilución 1:300), 120 |jg de lisado de E. coli y 0,3 |jg de anticuerpo monoclonal anti-etiqueta T7 (Novagen) diluidos en 2 ml de MPBS 3% durante 90 min a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron 3 veces con PBST durante 10 min para eliminar la unión inespecífica y se incubaron con un anticuerpo anti-IgG humana conjugado a AlexaFluor 647 (Invitrogen) diluido 1:2.000 y un anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado a AlexaFluor 555 (Invitrogen) diluido 1:40.000 en MPBS 3% para detectar los anticuerpos humanos unidos a los fagos T7 y los fagos T7, respectivamente. Posteriormente, las micromatrices se lavaron 3 veces con PBST, una vez con PBS y se secaron mediante centrifugación a 1.200 rpm durante 3 min. Finalmente, los portaobjetos se escanearon en un ScanArrayTM5000 (Packard BioChip Technologies). Para la cuantificación de la intensidad de los puntos se utilizó el programa de análisis de imagen Genepix Pro 7 (Axon Laboratories).

Análisis estadístico

Los datos de micromatrices se normalizaron y procesaron usando las aplicaciones Asterias (http://asterias.bioinfo.cnio.es/), interfaz para el uso de paquetes informáticos, Limma y marrayNorm de Bioconductor. Tras aplicar una corrección de ruido de fondo y la normalización global de loess (http://dnmad.bioinfo.cnio.es/), los datos se procesaron para filtrar los valores que faltaban o los puntos con una varianza demasiada alta, para combinar duplicados y luego obtener un valor único para cada fago transformado en logaritmo en base 2 (http://prep.bioinfo.cnio.es/). Los grupos de pacientes con CCR e individuos sanos se compararon realizando una prueba de la t con el programa Pomelo II (http://pomelo2.bioinfo.cnio.es/), donde los valores p se obtuvieron mediante 200000 permutaciones. El programa Pomelo II generó un gráfico mostrando los fagos con un valor de tasa de falsos resultados positivos (FDR) por debajo de 0,15 y un valor p no ajustado por debajo de 0,05.

Los análisis de remuestreo se ajustaron mediante un modelo de regresión logística donde se modeló la probabilidad de ser tumoral contra la de ser normal como una función de las variables (fagos y proteínas). En el modelo también se incluyeron la edad y el sexo de los pacientes para corregir los posibles efectos de estas variables. Para evaluar la capacidad predictiva de los modelos se calculó el área debajo de la curva ROC (AUC). El AUC calculado directamente con el modelo original y el conjunto completo de datos está sesgado hacia los valores altos. Así, para obtener un AUC corregido, no sesgado hacia valores altos, que dé una estimación del AUC que se podría obtener con una validación futura independiente se utilizó el remuestreo con 1.000 muestras replicadas (Efron B. J. Am. Stat Assoc. 1983;78:316-331). Los modelos se ajustaron utilizando la genoteca de diseño de Harrell (Harrel F. Springer.

2001) con el sistema de computación estadístico R (Team RDC, 2009).

II. RESULTADOS

El ARN de tejido de CCR de 6 pacientes (tres con estadio de Duke A y tres con estadio de Duke C) se utilizó para construir genotecas de fagos t 7 que contenían fragmentos de ADNc en 2 vectores (T7Select 415-1 o T7select 10-3b). Tras realizar la selección de fagos específicos de CCR se obtuvieron 8 genotecas distintas enriquecidas en fagos específicos de tumor, dependiendo del vector y de la mezcla de sueros (B, C, H y P) usados durante la selección. Un total de 1.536 fagos individuales se amplificaron (192 fagos individuales de cada selección) y se imprimieron en duplicado en matrices de nitrocelulosa. Como control de la cantidad de fago impreso en la matriz se utilizó un anticuerpo anti-T7 que permitió observar la presencia de una señal homogénea en la matriz. Con el fin de determinar la reproducibilidad intra e inter matriz, se representó la intensidad de los 2 puntos correspondientes al mismo fago dentro de una misma matriz y entre dos matrices diferentes. Se determinó que la reproducibilidad intra e inter matriz era buena con unos valores de R2 de 0,9703 y 0,9091, respectivamente.

Para evaluar la respuesta inmune en pacientes con CCR, se incubaron las matrices con 30 sueros (15 de pacientes con diferentes estadios de CCR y 15 de controles sanos). Tras la cuantificación de las imágenes y la normalización de los datos, se comparó la señal de los sueros tumorales con los sueros sanos usando una prueba de la t con 200.000 permutaciones. 128 fagos mostraron reactividades diferentes entre los 2 grupos, con un FDR < 0,22. Entre ellos, 78 fagos mostraron una reactividad aumentada en CCR mientras que 50 tenían una reactividad disminuida en sueros con CCR. La representación del análisis supervisado de los 45 fagos con el FDR más bajo (<0.15) mostró una clara separación entre los pacientes con CCR y los individuos sanos.

Ejemplo 2

Identificación de las secuencias presentadas en fagos

I. MATERIALES Y MÉTODOS

Secuenciación y análisis de las secuencias internas mediante BLASTp

El ADN insertado en el genoma del fago se amplificó mediante PCR usando el cebador directo T7_up2: 5'-TGCTAAGGACAACGTTATCGG-3' (SEQ ID NO:13) y el cebador inverso T7_down2: 5'-TTGATACCGGACGTTCAC-3' (SEQ ID NO:14). Los productos de PCR se precipitaron con etanol y se secuenciaron directamente con el cebador directo T7_up2.

Con el fin de encontrar homología de secuencia para cada péptido desplegado en la superficie de los fagos seleccionados se realizó una búsqueda en la base de datos NCBI con el software BLASTp.

Proteínas, anticuerpos y líneas celulares

Las proteínas recombinantes humanas MST1/STK4 y SULF1 se expresaron en E. coli. El ADNc de MST1 se subclonó en el vector pET28a (Novagen). El ADNc de SULF1 se clonó en el vector pDONR221 y posteriormente en el vector de expresión pDEST17. Las 2 proteínas de fusión 6xHis-MST1 y 6xHis-SULF1 se expresaron en la cepa BL21 (DE3) de E. coli y se purificaron a homogeneidad mediante cromatografía de afinidad en una columna HisTrap (GE Healthcare). Por último, las proteínas se dializaron frente PBS y se concentraron. La proteína EBNA1 utilizada como control positivo en ensayos de ELISA se compró a la empresa Tebu-Bio.

Los anticuerpos contra MST1/STK4, SULF1 y tubulina usados en la inmunodetección en membrana se compraron a las compañías Atlas antibodies, Santa Cruz Biotechnology y Sigma, respectivamente. El anticuerpo anti-IgG de conejo TrueBlot conjugado a la peroxidasa se compró a la compañía eBioscence y los anticuerpos anti-IgG de ratón y anti-IgG humana conjugado a peroxidasa a DakoCytomation.

Las líneas celulares de cáncer colorrectal RKO, Caco2, Hct15, Hct116, Colo320, SW480, SW48, KM12C, KM12SM, HT29, Colo205 y las líneas celulares de referencia (HEK293 y MOLT4) se cultivaron según protocolos establecidos. Los linfocitos de sangre periférica (LSP) y los monocitos se aislaron de un donante sano.

Análisis por inmunotransferencia

La preparación de los extractos de tejido emparejados y de líneas celulares se realizó según el siguiente protocolo. Las células y los tejidos se lavaron 2 veces con PBS antes de su lisado con 500 pl de SDS al 0,5% con inhibidores de proteasas (Roche Applied Science). La concentración de los extractos se determinó mediante el kit 2D-Quant (GE Healthcare) después de clarificar la muestra mediante centrifugación a 12.000 g durante 15 min a 4°C.

25 pg de extracto proteico se separaron en un gel SDS-PAGE al 10% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Hybond-C Extra) según protocolos establecidos (Babel et al. Mol. Cell Proteomics 2009; 8:2382-95). La membrana se bloqueó con MPBS 3% y se incubó toda la noche a 4°C con los anticuerpos contra MST1 (dilución 1:1.000), SULF1 (dilución 1:3.000) o tubulina (dilución 1:5.000). La inmunodetección se realizó usando un anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado a HRP (dilución 1:5.000) o un anticuerpo anti-IgG de conejo conjugado a HRP (dilución 1:5.000). Finalmente, la unión del anticuerpo se detectó utilizando ECL (GE Healthcare) o SuperSignal Femto (Pierce).

ELISA

Las placas de ELISA para capturar fagos T7 (Novagen) se bloquearon 2 h a 37°C con MPBS 3% y se incubaron toda la noche con 100 pl del lisado bacteriano de los fagos diluido en MPBS 3%. Tras lavar 3 veces con PBST, las placas se bloquearon con MPBS 3% 1h a 37°C y se incubaron con 100 pl de suero humano (dilución 1:50 en MPBS 3%) 1 h a 37°C. Después de 3 lavados adicionales, se añadió el anticuerpo anti-IgG humana marcado con peroxidasa (1:3.000 en MPBS 3%) durante 2 h a temperatura ambiente. La señal se detectó con el sustrato 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (Sigma) durante 10 min, parando la reacción con HCl 1 M y midiendo la señal a 450 nm.

El ensayo de competición entre los péptidos presentados en la superficie de los fagos y las proteínas recombinantes se realizó usando las placas de captura de fago T7 (Novagen) siguiendo el protocolo anterior, exceptuando que los sueros humanos se preincubaron toda la noche a 4°C con diluciones seriadas de las proteínas MST1, SULF1 o GST. Los sueros así preincubados se ensayaron contra EBNA1 en placas de ELISA (Maxisorp, Nunc) como control positivo para verificar que la competición para las IgG entre el fago y su respectiva proteína recombinante era específica.

Los ELISA con las proteínas MST1, SULF1 y EBNA1 se realizaron como se ha descrito previamente (Babel et al. Mol. Cell Proteomics 2009; 8:2382-95). La concentración de CEA en los sueros de los pacientes con CCR y los sueros control se determinó mediante un ensayo inmunológico específico siguiendo las recomendaciones del fabricante (MP Biomedicals).

Análisis estadístico

Los datos de ELISA para cada marcador individual (fago o proteína de longitud completa) se evaluaron calculando una curva ROC (curva de eficacia diagnóstica). El área debajo de la curva correspondiente (AUC) se calculó usando el programa JMP7 (SAS). La media y la desviación estándar de los resultados de inmunohistoquímica se calcularon utilizando el programa Microsoft Office Excel 2007. La prueba de la t de Student unilateral se llevó a cabo utilizando los resultados de inmunohistoquímica, asumiendo que las varianzas no iguales para determinar las medias de los grupos normales y tumorales eran significativamente diferentes entre ellos.

II. RESULTADOS

Se obtuvieron 43 secuencias de aminoácidos únicas fusionadas a la proteína 10B de la cápside del fago T7 entre los 78 fagos que mostraban una reactividad aumentada en sueros de pacientes con CCR.

De los 43 fagos únicos, se seleccionaron para verificar los resultados aquellos que contenían entre 8 y 20 residuos con una elevada homología con secuencias de proteínas conocidas, los que aparecían un mayor número de veces con la misma secuencia de aminoácidos y los que tenían un valor p bajo. Se identificaron secuencias homólogas a las proteínas MST1/STK4, SULF1, NHSL1, SREBF2, GRN y GTF2i. Todas ellas tenían una señal en las micromatrices significativamente mayor con el suero de pacientes con CCR que con los sueros control (Figura 1). Los fagos fueron identificados por el nombre de la proteína con la que se identificaron secuencias homólogas. La proteína MST1/STK4 se identificó previamente como un antígeno asociado a tumor en CCR usando micromatrices de proteínas comerciales (Babel et al. Mol. Cell Proteomics 2009;8:2382-95) y el gen SULF1 se describió como sobre expresado en un análisis transcriptonómico de CCR (Madoz-Gurpide et al. Mol Cell Proteomics, 2006;5:1471-83).

Con el fin de confirmar que los péptidos presentados en los fagos cuya secuencia homóloga pertenecía a las proteínas SULF1 y MST1, se realizó un ensayo de competición de IgG entre los fagos y las proteínas recombinantes humanas SULF1 y MST1. La unión de las inmunoglobulinas presentes en los sueros humanos a los 2 fagos se inhibió de una manera dependiente de la dosis con las proteínas recombinantes MST1 y SULF1 (Figura 2A). GST no afectó a la unión de las IgG a los fagos (control negativo). Como control de inhibición específica, se observó que la unión de los anticuerpos de los pacientes contra la proteína EBNA no se vio afectada por la incubación con las proteínas MST1 o SULF1.

Por otra parte, se determinó que las secuencias de los péptidos presentados en los fagos se localizaban en la región C-terminal de MST1 y en el N-terminal de SULF1 (Figura 2b ).

Todos estos resultados confirman que los péptidos presentados corresponden a epítopos inmunodominantes de las proteínas MST1 y SULF1.

Ejemplo 3

Las proteínas identificadas están sobreexpresadas en cáncer colorrectal

Los antígenos asociados a tumores reconocidos por autoanticuerpos se encuentran generalmente sobreexpresados en líneas celulares y en tejidos tumorales. Se realizó un metaanálisis de los niveles de expresión del ARNm de las proteínas homólogas correspondientes a los 6 fagos seleccionados [MST1/STK4, SULF1, NHSL1, SREBF2, GRN y GTF2i] con la base de datos de micromatrices Oncomine (Rhodes et al. Neoplasia 2004;6:1-6) (Figura 3A). Se encontró que SULF1 era el gen más sobreexpresado en cáncer de colon, seguido por GTF2i, MST1, GRN, NHSL1 y SREBF2. Por otra parte, se realizó una inmunodetección en membrana con los anticuerpos contra MST1 y SULF1 usando 11 líneas celulares de CCR y tejidos tumorales de pacientes con CCR representando los diferentes estadios de evolución de la enfermedad (Figura 3b ). Se encontró que las proteínas MST1 y SULF1 estaban expresadas en la mayor parte de las líneas celulares de cáncer de colon. La mayor expresión de SULF1 se observó en líneas celulares metastásicas (SW48, HT29 y COLO205) y en tejido tumoral de CCR de estadios tardíos.

Los patrones de expresión celular de las proteínas seleccionadas se caracterizaron mediante inmunohistoquímica (TMA) usando tumores de CCR independientes dispuestos en micromatrices o mediante metaanálisis de datos de micromatrices de tejidos obtenidos del atlas humano de proteínas (Berglund et al. Mol Cell Proteomics. 2008;7:2019-27) (Figura 3C). En todos los casos, se detectó una expresión más abundante de la proteína estudiada en tejidos tumorales.

Por tanto, existe una buena correlación entre la presencia de autoanticuerpos, la abundancia de las proteínas y la expresión génica.

Ejemplo 4

Validación del predictor formado por péptidos presentados en fagos y sus proteínas homólogas

Se utilizó un conjunto independiente de 96 muestras séricas (50 de cáncer colorrectal con 19 muestras de estadios tempranos (A+B) y 46 controles sanos) para la validación de los resultados. Se ensayaron los fagos MST1, SULF1, NHSL1, SREBF2, GRN y GTF2i para su capacidad para discriminar entre sueros tumorales y sueros controles por ELISA. Se construyeron las curvas ROC para cada uno los marcadores con los resultados de ELISA. Mientras que la sensibilidad era relativamente baja para los fagos individuales, oscilando entre el 46% y el 60%, la especificidad era mayor, entre el 50% y el 73,9%. Para investigar si diferentes combinaciones de fagos tenían una mayor precisión en discriminar individuos sanos de pacientes con cáncer, se ajustaron los datos a una curva logística, realizando regresiones lineales y produciendo diferentes modelos con diferentes combinaciones de fagos. Así, el resultado de la combinación de los 6 fagos como predictor de CCR da un AUC de 0,82 con una sensibilidad y una especificidad del 70% y el 73,9%, respectivamente (Tabla 4).

Tabla 4. Datos de las curvas ROC obtenidas de los valores de ELISA de la validación tanto de los fagos individuales como de los fa os combinados.

El siguiente paso consistió en ver si el reemplazamiento de los fagos por sus proteínas recombinantes MST1 y SULF1 mejoraría el poder discriminante del modelo (Figura 4). Los resultados confirmaron una mejora significativa de la predicción utilizando las proteínas recombinantes, con AUC de 0,71 y 0,74 para las proteínas SULF1 y MST1 frente a 0,63 y 0,58 de los respectivos fagos (Tabla 2). Combinando las dos proteínas (SULF1 y MST1) y los cuatro fagos (NHSL1, SREBF2, GRN y GTF2i), el AUC aumentó hasta 0,86 con una sensibilidad del 82,6% y una especificidad del 70% (Figura 6A). Los valores de CEA eran menores (AUC 0,81) y combinados con el resto de las predicciones apenas mejoraban el modelo (AUC 0,89). Además, en la etapa de validación, se realizaron diferentes estimaciones de AUC para comparar no sólo CRC frente a sano, sino también CRC frente a los sueros de referencia y sano frente a otros tumores (Figura 6). El resultado más relevante fue la capacidad del modelo de discriminar no sólo CRC de sueros sanos (AUC 0,86) (Figura 6A), sino también CRC de todos los sueros de referencia, que incluía otras patologías relacionadas con colon (AUC 0,85) (Figura 6B). Notablemente, el panel parecía no discriminar adecuadamente controles sanos de otros tumores (AUC 0,63) (Figura 6C). Además, el panel parecía discriminar significativamente controles sanos de pacientes asintomáticos con historia familiar de CRC (AUC 0,78).

Análisis de remuestreo

También se realizó un remuetreo para obtener las AUC corregidas. El modelo inicial incluía términos lineales para todos los fagos y proteínas, junto con otras dos variables: sexo y edad de los pacientes. Con este modelo, el valor del AUC corregido fue 0,83.

Este modelo probablemente era más complejo de lo necesario. Por eso, se realizó una selección de variables con el criterio de información de Akaike como punto final. El modelo final únicamente retuvo 3 proteínas (GRN, MST1 y SULF1), además de la edad de los pacientes (Tabla 5). Sin embargo, para evitar una sobreestimación de la capacidad predictiva del modelo, se obtuvieron valores corregidos estimados de AUC, mediante remuestreo del proceso completo de la selección de variables (es decir, por cada muestra de remuestreo, se realizó el modelo completo con 8 variables y se utilizó el criterio de información de Akaike). El AUC corregido fue 0,84. El remuestreo también proporcionó información sobre la estabilidad del proceso de selección; la mayoría de los modelos de remuestreo contenían cuatro, cinco, seis o siete variables. Algunas de las variables aparecían en la mayoría de los modelos; el fago GRN en 976, la proteína SULF1 en 954, la edad en 952 y la proteína MST1 en 833.

Además, se utilizó este modelo para predecir la probabilidad de ser CRC del grupo de 57 sueros que comprendían diversas patologías. Se generó una gráfica de puntos (Figura 6D), en donde se muestra la probabilidad individual para cada sujeto. Se observó una gran variabilidad en probabilidad dentro de cada grupo, pero la mediana se encontraba bastante por debajo de 0,5, indicando una probabilidad baja de padecer CRC.

Tabla 5. Modelo final con remuestreo después del modelo de selección.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar un autoanticuerpo en una muestra, que comprende:

a) poner en contacto una muestra de un sujeto con una entidad capturadora de anticuerpo (ECA), en donde dicha ECA es una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4 o un péptido o proteína que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a SEQ ID NO: 4 y que es reconocida por un autoanticuerpo contra SEQ ID NO: 4;

y

b) detectar la formación de un complejo autoanticuerpo-ECA,

2. Un método según la reivindicación 1, en donde la muestra es una muestra de un sujeto que se sospecha tiene cáncer colorrectal (CCR).

3. El método según la reivindicación 1 o 2, que comprende la detección de un autoanticuerpo contra una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 o una proteína o péptido que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a SEQ ID NO: 4 que tiene un epítopo que es reconocible por un autoanticuerpo contra SEQ ID NO: 4 y, además, la detección de un autoanticuerpo seleccionado del grupo que consiste en:

(i) un autoanticuerpo contra una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 o una proteína o péptido que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a SEQ ID NO: 2 que contiene un epítopo que es reconocible por un autoanticuerpo contra SEQ ID NO: 2;

(ii) un autoanticuerpo contra una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6 o una proteína o péptido que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a SEQ ID NO: 6 que contiene un epítopo que es reconocible por un autoanticuerpo contra SEQ ID NO:6;

(iii) un autoanticuerpo contra una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3 o una proteína o péptido que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a SEQ ID NO: 3 que contiene un epítopo que es reconocible por un autoanticuerpo contra SEQ ID NO:3;

(iv) un autoanticuerpo contra una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 5 o una proteína o péptido que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a SEQ ID NO: 5 que contiene un epítopo que es reconocible por un autoanticuerpo contra SEQ ID NO:5;

(v) un autoanticuerpo contra una ECA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 o una proteína o péptido que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a SEQ ID NO: 1 que contiene un epítopo que es reconocible por un autoanticuerpo contra SEQ ID NO:1; y

(vi) cualquier combinación de autoanticuerpos (i) a (v).

4. El método según la reivindicación 1o 2, en donde dicha ECA es sulfatasa 1 (SULF1) o una proteína o péptido que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a SULF1 que contiene un epítopo reconocible por un autoanticuerpo contra SULF1,

o alternativamente

en donde dicha ECA es un fago que comprende la secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO: 4 o una proteína o péptido que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a SEQ ID NO: 4 que contiene un epítopo reconocible por autoanticuerpo contra SEQ ID NO: 4, en donde dicha secuencia de aminoácidos está expuesta en la superficie del fago.

5. El método según la reivindicación 2, que comprende además correlacionar la formación del complejo autoanticuerpo-ECA en la muestra del sujeto con un diagnóstico de CCR.

6. El método según la reivindicación 2, que comprende además comparar la inmunorreactividad de la muestra con la inmunorreactividad de una segunda muestra del mismo sujeto en un periodo de tiempo posterior.

7. El método según la reivindicación 6, en donde dicha segunda muestra del sujeto se ha obtenido después de que dicho sujeto se haya tratado para CCR.

8. Una entidad capturadora de anticuerpos (ECA) que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4, en donde dicha ECA no es la proteína sulfatasa-1 (SULF1).

9. La entidad capturadora de anticuerpos (ECA) según la reivindicación 8, en donde dicha ECA es un fago que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, en donde dicha secuencia de aminoácidos está expuesta en la superficie del fago.

10. Una composición que comprende una entidad capturadora de anticuerpo (ECA) según la reivindicación 8.

11. La composición según la reivindicación 10, que comprende, al menos, una ECA según la reivindicación 8, y, al menos, una proteína seleccionada del grupo que consiste en la proteína sulfatasa 1 (SULF1) o una proteína o péptido que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a SULF1 y reconocible por un autoanticuerpo contra SULF1, la proteína MST1 o una proteína o péptido que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a MST1 y reconocible por un autoanticuerpo contra MST1, y sus combinaciones.

12. Una composición que comprende la proteína sulfatasa 1 (SULF1) o una proteína o péptido que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a SULF1 y reconocible por un autoanticuerpo contra SULF1 y la proteína MST1 o una proteína o péptido que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a MST1 y reconocible por un autoanticuerpo contra MST1 y una entidad capturadora de anticuerpo (ECA) según la reivindicación 8.

13. Un kit que comprende una composición según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.

14. Un uso in vitro de un kit según la reivindicación 13 para detectar un anticuerpo en una muestra, o para detectar un autoanticuerpo en un sujeto que se sospecha tiene cáncer colorrectal (CCR), o para diagnosticar si un sujeto tiene CCR, o para determinar el riesgo de que un sujeto desarrolle CCR, o para seguir la evolución de CCR en un sujeto, o para evaluar la eficacia de un tratamiento contra CCR, o para predecir la supervivencia de un sujeto que tiene c Cr .