ES2205467T3 - Matrices biodegradables de poros abiertos. - Google Patents

Matrices biodegradables de poros abiertos.

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ES2205467T3 ES98913264T ES98913264T ES2205467T3 ES 2205467 T3 ES2205467 T3 ES 2205467T3 ES 98913264 T ES98913264 T ES 98913264T ES 98913264 T ES98913264 T ES 98913264T ES 2205467 T3 ES2205467 T3 ES 2205467T3
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Lonnie Shea
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Abstract

La invención se refiere a un procedimiento directo para reparar materiales poliméricos porosos mediante una combinación de pasos de formación de espuma con gas y el lixiviado de partículas. La invención también se refiere a la preparación de materiales porosos mediante el procedimiento, particularmente estos materiales tienen una característica relacionada con la estructura porosa, y los procedimientos para empleo de estos materiales porosos, particularmente para ingeniería textil.

Description

Matrices biodegradables de poros abiertos.
La invención está dirigida a un proceso para preparar materiales polímeros porosos por una combinación de pasos de transformación en espuma con gas y lixiviación de material particulado. La invención está dirigida también a un material polímero poroso preparado por el proceso, que tiene particularmente una estructura característica de poros interconectados, y a métodos para utilizar dicho material polímero poroso, en particular para construcción de tejidos.
La falta de tejido autólogo y alogénico adecuado para trasplante ha impulsado el desarrollo del campo de la construcción de tejidos, en el cual se crean nuevos tejidos a partir de células cultivadas y materiales biológicos. Esto es ventajoso debido a que estas células pueden expandirse in vitro y cultivarse para uso por múltiples pacientes. El material biológico sirve como vehículo para localizar las células de interés, como separador físico para crear espacio potencial para desarrollo de tejidos, y como molde-guía de la regeneración de tejidos. Los homopolímeros y copolímeros biodegradables de ácido láctico y ácido glicólico son candidatos atractivos para fabricar matrices de construcción de tejidos debido a sus propiedades físicas flexibles y bien definidas y su biocompatibilidad relativa. Adicionalmente, el producto de degradación de estos polímeros son metabolitos naturales y se eliminan fácilmente del cuerpo.
El documento DE 1.694.599 A expone un proceso para preparar un material polímero poroso para películas plásticas, especialmente películas flexibles permeables al vapor de agua a partir de poli(cloruro de vinilo).
Se han utilizado varias técnicas para fabricar polímeros en forma de matrices porosas para aplicaciones de construcción de tejidos, con inclusión de colada en disolvente/lixiviación de material particulado (SC/PL) (A.G. Mikos, A.J. Thorsen, L.A. Czerwonka, Y. Bao, y R. Langer, "Preparation and characterization of poly(L-lactic acid) foams", Polymer, 35, 1068-1077 (1994)); separación de fases (H. Lo, M.S. Ponticiello, y K.W. Leong, "Fabrication of controlled release biodegradable foams by phase separation", Tissue Engineering, 1, 15-28 (1995)); extrusión de fibras y procesamiento de formación de tela (J.F. Cavallaso, P.D. Kemp y K.H. Kraus, "Collagen Fabrics as Biomaterials", Biotechnology and Bioengineering, 43, p. 781-791 (1994)); y transformación en espuma con gas (D.J. Mooney, D.F. Baldwin, N.P. Suh, J.P. Vacanti, R. Langer, "Novel approach to fabricate porous sponges of poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) without the use of organic solvents", Biomaterials, 17, 1417-1422 (1996)). Los métodos de colada con disolvente/lixiviación de material particulado y de separación de fases requieren el uso de disolventes orgánicos. Los residuos de disolventes orgánicos que pueden quedar en estos polímeros después del procesamiento pueden dañar las células trasplantadas y el tejido próximo, y desactivar muchos factores biológicamente activos (v.g., los factores de crecimiento) cuya incorporación en la matriz de polímero para liberación controlada podría ser deseable. La formación de fibras requiere típicamente temperaturas elevadas (superiores a la temperatura de transición del polímero), y no es aplicable al procesamiento de polímeros amorfos. Las altas temperaturas utilizadas en este proceso desnaturalizarían probablemente cualesquiera moléculas biológicamente activas cuya incorporación en la matriz podría ser deseable.
El método de transformación en espuma con gas (por ejemplo, de Mooney et al., citado anteriormente) proporciona una técnica para fabricar matrices altamente porosas a partir de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) utilizando un gas a alta presión que evita el uso de disolventes orgánicos y temperaturas altas. Sin embargo, la técnica produce típicamente una estructura de poros cerrados, que es desventajosa en muchas aplicaciones de trasplante de células. Adicionalmente, se produce como resultado una piel sólida de polímero en la superficie exterior de la matriz transformada en espuma y esto puede conducir a limitaciones de transporte de masa.
La presente invención se refiere a un proceso para preparar un material polímero poroso que comprende formar poros en un material polímero que contiene un material particulado susceptible de lixiviación por transformación en espuma con gas y lixiviar subsiguientemente el material particulado para formar porosidad adicional, en el cual la formación de los poros por transformación en espuma con gas se realiza sometiendo una mezcla de partículas del polímero y partículas del material particulado a una atmósfera de un gas inerte a presión elevada tal que el gas se disuelve en el polímero y creando luego una inestabilidad termodinámica tal que se produce formación de núcleos y crecimiento de poros de gas y el polímero que contiene el material particulado forma una matriz continua.
Un objeto de esta invención es proporcionar un nuevo proceso para preparar materiales polímeros porosos que son útiles para construcción de tejidos y otras aplicaciones en las cuales la estructura de poros es particularmente ventajosa. Por ejemplo, los polímeros de la invención pueden tener dos tipos de porosidad, el primero formado por procesamiento de transformación en espuma con gas y el segundo formado por la acción de lixiviación del material particulado. La combinación de estos dos tipos de porosidad puede regularse por las condiciones de procesamiento y los materiales utilizados para proporcionar materiales polímeros porosos con una gama de propiedades ventajosas. En una realización preferida, la porosidad procedente de la lixiviación del material particulado da como resultado materiales de estructura de poros interconectados que tienen una estructura de poros abiertos. Otros objetos de la invención incluyen los materiales polímeros porosos preparados por el proceso y métodos de utilización de dichos materiales para construcción de tejidos, por ejemplo.
Después del estudio ulterior de la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, resultarán evidentes objetos y ventajas adicionales de esta invención para los expertos en la técnica.
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De acuerdo con el proceso de la invención, una mezcla de partículas de polímero y un material particulado susceptible de lixiviación moldeado opcionalmente con compresión a un tamaño y forma deseados, se somete a una atmósfera gaseosa a alta presión de tal manera que el gas se disuelve en el polímero; a continuación se crea una inestabilidad termodinámica, por ejemplo por reducción de la presión, de tal modo que el gas disuelto sufre nucleación y forma poros de gas en el interior del polímero; esto causa la expansión de las partículas de polímero, y a medida que las mismas se expanden, se fusionan, creando una matriz de polímero continua que contiene el material particulado; por último, el material particulado se lixivia del polímero con un agente lixiviante creando una porosidad adicional. El proceso proporciona así una nueva combinación de los procesos de transformación en espuma con gas (GF) para formar poros y lixiviación de un material particulado (PL) para formar otro tipo de porosidad. Por consiguiente, el proceso puede denominarse un proceso GF/PL en oposición a los procesos conocidos de colada con disolvente/lixiviación de material particulado (SC/PL).
Los nuevos materiales preparados por el proceso se caracterizan por tener poros formados por transformación en espuma con gas y poros formados por lixiviación de un material particulado, denominándose también los poros formados por lixiviación del material particulado macroporos. Preferiblemente, la porosidad resultante de la lixiviación del material particulado, que puede controlarse por la cantidad y el tamaño del material particulado entre otros factores, es tal que da como resultado interconexiones y, por tanto, una estructura de poros abiertos. Típicamente, las matrices preparadas por el método GF/PL de la invención tendrán una estructura de poros interconectados o abiertos semejante a la estructura demostrada en las fotomicrografías generadas de acuerdo con el Ejemplo 1 y expuestas en el mismo. En una realización que proporciona una mezcla de polímero y material particulado lixiviable en la cual la cantidad de material particulado lixiviable es al menos 50% en volumen se producirá como resultado una estructura de poros parcialmente interconectados o abiertos. Una cantidad mayor de material particulado lixiviable puede utilizarse para obtener una estructura totalmente interconectada.
Si bien los materiales preparados por un proceso SC/PL pueden proporcionar también cierto grado de una matriz de poros interconectados, los autores de la invención han descubierto que los materiales preparados por el proceso GF/PL de la invención exhiben una estructura de poros distinta y propiedades mecánicas notablemente ventajosas sobre los materiales preparados por SC/PL. Esta ventaja se suma a la ventaja de la ausencia de necesidad de disolventes orgánicos y/o temperaturas altas en la preparación del material y la ausencia de residuos de disolvente orgánico en los materiales preparados, ventajas que hacen los materiales aún más útiles para las aplicaciones descritas más adelante. Por ejemplo, los materiales de la invención exhiben propiedades de resistencia mucho mayor, v.g. resistencia a la tracción. Por ejemplo, los materiales de acuerdo con la invención se pueden preparar para maximizar la resistencia a la tracción a fin de proporcionar materiales con un módulo de tracción de, por ejemplo, 850 kPa, particularmente 1110 kPa, o mayor. Sin embargo, dichos materiales de alta resistencia pueden no ser necesarios para todas las aplicaciones, y materiales con un módulo de tracción tan bajo como 100 kPa, por ejemplo, se han encontrado útiles. Adicionalmente, los materiales exhiben una resistencia mejorada a la compresión. Por ejemplo, los materiales de acuerdo con la invención se pueden preparar para maximizar la resistencia a la compresión a fin de proporcionar materiales con un módulo de compresión de, por ejemplo, 250 kPa, particularmente 289 kPa, o mayor. Los materiales comparativos preparados por SC/PL exhiben un módulo de tracción de 334 \pm 52 kPa y un módulo de compresión de 159 \pm 130 kPa.
Si bien no se desea quedar ligados por esta teoría, se supone razonablemente que las propiedades mecánicas mejoradas y la matriz más resistente de los materiales preparados por el proceso GF/PL de los inventores son resultado, al menos en parte, de una mayor uniformidad de la distribución del polímero en los materiales y/o mayor uniformidad en el tamaño y la distribución de la porosidad en los materiales. Los polímeros SC/PL preparados no tendrán una distribución de poros tan uniforme debido a que el disolvente se evapora del polímero de una manera no uniforme y por consiguiente la concentración de polímero cambia en el material de modo no uniforme. Por ejemplo, los materiales SC/PL carecen típicamente de uniformidad dado que, a medida que el disolvente se evapora, la concentración de polímero aumenta en el fondo de la matriz, es decir, el área en la cual la matriz toca el cubreobjetos de vidrio. En contraste, los materiales GF/PL exhiben una estructura de poros muy uniforme que indica que el polímero se transforma en espuma uniformemente en todo el lecho del material particulado durante el paso de transformación en espuma con gas.
Alternativamente, se supone que en el proceso GF/PL las propiedades mecánicas pueden mejorarse por alineación mediante tracción de las cadenas del polímero que puede ocurrir durante la elongación que tiene lugar durante la transformación en espuma. (Principles of Tissue Engineering, Academic Press, p. 264 (1997).
En cualquier caso, es una gran ventaja en la construcción de tejidos y otras aplicaciones que los materiales de la invención pueden prepararse para maximización de la resistencia a la tracción y resistencia a la compresión dado que los mismos puede manejarse y manipularse sin ruptura mecánica más fácilmente y sobreviven mejor en el entorno en el cual se utilizan sin rotura mecánica. Adicionalmente, los materiales de la invención con ambos tipos de porosidad, preferiblemente con porosidad interconectada, proporcionan un material singular y ventajoso para muchas aplicaciones. El proceso puede proporcionar materiales con una porosidad total desde, por ejemplo, mayor que 0 a 97% o superior. Preferiblemente, la porosidad total está comprendida entre 90 y 97%.
Para el proceso, se utiliza una mezcla de polímero y material particulado. La mezcla es preferiblemente lo más uniforme posible y puede proporcionarse por medios convencionales. Preferiblemente, la mezcla se moldea, por ejemplo, por moldeo mediante compresión a la temperatura ambiente u otra temperatura adecuada para efectuar el moldeo, hasta el tamaño y forma que es sustancialmente el mismo que se desea para su uso final.
El polímero y los materiales particulados deberían seleccionarse de tal manera que el material particulado pueda lixiviarse con un agente lixiviante que no disuelva el polímero o produzca cualquier otro tipo de impacto desfavorable sobre el material. Los polímeros y materiales particulados útiles para los procesos SC/PL expuestos en esta memoria son generalmente útiles para el proceso GF/PL de la invención. Materiales útiles adicionales se exponen más adelante.
Cualquier polímero en el cual pueda disolverse un gas y formar poros de este modo y en el cual pueda incorporarse un material particulado y lixiviarse del mismo puede utilizarse en el proceso. Se prefiere, a fin de facilitar la disolución del gas, que el polímero sea un polímero amorfo o predominantemente amorfo. No obstante, si se desea utilizar un polímero cristalino, la cristalinidad puede reducirse hasta un nivel tal que el gas pueda disolverse en el mismo y posteriormente restablecerse la cristalinidad después de la formación de los poros. Dependiendo de la aplicación de los materiales, el polímero puede seleccionarse de modo que sea biodegradable o no biodegradable. Para muchas aplicaciones, tales como la construcción de tejidos, el polímero es preferiblemente biocompatible con el entorno en el cual se utiliza.
Así pues, una realización preferida de la presente invención se refiere a un proceso para preparar un material polímero poroso que comprende formar poros en un material polímero que contiene un material particulado lixiviable por transformación en espuma con gas y lixiviar subsiguientemente el material particulado a fin de formar porosidad adicional, en el cual el polímero es un polímero biocompatible.
Una clase preferida útil de polímeros son homopolímeros y copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico, por ejemplo, ácido poli-L-láctico (PLLA), ácido poli-D,L-láctico (PDLLA), poli(ácido glicólico) (PGA) y copolímeros de D,L-lactida y glicolida (PLGA), particularmente con 50% o más de la lactida en el copolímero. Aunque en muchas condiciones se prefieren los copolímeros a los homopolímeros, en algunas circunstancias pueden ser preferidos los homopolímeros. Otros polímeros útiles, por ejemplo, son poliésteres alifáticos, tales como polihidroxibutirato y poli-\varepsilon-caprolactona. Adicionalmente, pueden utilizarse polianhídridos, polifosfazinas, y polipéptidos.
Adicionalmente, se pueden utilizar mezclas de diferentes polímeros o polímeros que contienen otros agentes, que afecten particularmente a las propiedades mecánicas de la matriz resultante. Por ejemplo, pueden utilizarse mezclas de diferentes polímeros PLGA que tienen propiedades distintas para aprovechar la ventaja de las propiedades de ambos. Asimismo, otros polímeros pueden mezclarse con los polímeros PLGA, en particular para modificar las propiedades mecánicas de los mismos. Por ejemplo, se ha encontrado que una mezcla de un polímero PLGA y un material de alginato proporciona una matriz más resistente con mayor elasticidad y capacidad para resistir una mayor deformación antes de romperse. Así, la misma puede ser útil, dependiendo de la aplicación, para mezclar polímeros que dan como resultado una matriz con mejores flexibilidad y/o resistencia. Mezclas con materiales que actúan como plastificantes, agentes reforzantes o modificadores de otras propiedades son, por consiguiente, útiles en la invención. Estos materiales pueden ser polímeros o agentes de moléculas más pequeñas que pueden actuar de una manera temporal y difundirse luego de la matriz.
La composición y el peso molecular del polímero tienen también un gran efecto sobre la porosidad y las propiedades mecánicas de las matrices tridimensionales. Se ha demostrado que los copolímeros de PLGA se transforman en espuma en mucho mayor proporción que cualquier homopolímero de PGA o PLLA. Este descubrimiento es coherente con informes previos según los cuales los copolímeros amorfos de PLGA forman más espuma que lo hace el polímero PGA cristalino (Mooney et al., Biomaterials, 17, 1417-1422, 1996). Esto es debido probablemente a una disolución incrementada del gas en los polímeros amorfos en comparación con los polímeros cristalinos (D.F. Baldwin et al., J. Eng. Mat. Tech., 117, 62, 1995; y D.W. Van Krevelen, Properties of polymers, Elsevier Publ., 1976). El peso molecular del polímero tiene un gran efecto sobre la porosidad del entramado. Un polímero con un peso molecular alto (gran i.v.) no formaba entramados con una porosidad tal alta como el mismo polímero con un peso molecular inferior. Las cadenas de polímero más largas del polímero de peso molecular alto se enmarañan probablemente en mayor proporción, proporcionando así una mayor resistencia a la expansión que las cadenas de polímero más cortas.
En una realización preferida, puede conseguirse una formación máxima de poros por el uso de un copolímero amorfo de lactida y glicolida de peso molecular bajo. Estas matrices tendrán probablemente gran utilidad en la regeneración de tejidos orales. Las mismas pueden utilizarse solas como una matriz GTR. Pueden utilizarse también para suministrar factores de crecimiento de una manera local y sostenida a fin de promover la regeneración. Adicionalmente, aquéllas podrían utilizarse para trasplantar células directamente a un sitio a fin de promover la regeneración de tejido a partir de estas células y la interacción con las células huésped.
El material particulado lixiviable es cualquier material particulado que pueda lixiviarse de la matriz de polímero con un agente lixiviante. Se prefieren sales solubles en un medio acuoso, preferiblemente agua. Como sales, son materiales particulados útiles NaCl, citrato de Na, tartrato de Na, y KCl. Otros materiales particulados útiles lixiviables por disolución incluyen, por ejemplo, materiales particulados de gelatina, colágeno y alginato. Es también posible utilizar materiales particulados que son lixiviables por disolventes orgánicos en los cuales el disolvente no afecta desfavorablemente al polímero; sin embargo, esto no se prefiere, dado que podría reducir la ventaja de la ausencia de necesidad de un disolvente orgánico y la inexistencia de residuo en el producto. Como se ha expuesto anteriormente, el tamaño del material particulado afectará al tamaño de los poros formados después de la lixiviación del material particulado. Aunque sin carácter limitante de la invención, se prefiere que el material particulado tenga un tamaño medio comprendido entre 10 y 500 micrómetros. Este tamaño corresponderá aproximadamente al tamaño de los poros formados por la lixiviación del mismo.
Se disuelve un gas en el polímero de la mezcla, preferiblemente moldeada, de polímero y material particulado sometiendo la mezcla a una atmósfera a presión de un gas que es inerte frente al sistema y que se disolverá en el polímero en condiciones adecuadas. Gases y condiciones adecuados son conocidos por otros procesos de transformación en espuma con gas, tal como se expone en el artículo Biomaterials citado arriba, y pueden utilizarse generalmente en esta invención.
Un ejemplo preferido de un gas adecuado es CO_{2}. Una realización preferida de la presente invención es por consiguiente un proceso para preparar un material polímero poroso que comprende formar poros en un material polímero que contiene un material particulado lixiviable por transformación en espuma con gas y lixiviación subsiguiente del material particulado para formar porosidad adicional, en el cual el gas utilizado es CO_{2}.
Ejemplos preferidos adicionales de gases adecuados incluyen CO_{2}, aire, nitrógeno, helio, neón, kriptón, argón, xenón u oxígeno. También pueden utilizarse líquidos volátiles que proporcionan un gas a la temperatura de transformación en espuma con gas, v.g. agua. Sin embargo, pueden utilizarse también otros gases o líquidos volátiles que forman gases conocidos por ser útiles como agentes de soplado. Éstos incluyen, por ejemplo, hidrocarburos fluorados, con inclusión de hidrocarburos perfluorados. Preferidos para éstos son hidrocarburos fluorados alifáticos o cicloalifáticos de hasta 8 átomos de carbono tales como trifluorometano, difluorometano, difluoroetano, tetrafluoroetano, heptafluoroetano, perfluoropropano, perfluorobutano, perfluorociclobutano, perfluoropentano, perfluorohexano, perfluoroheptano, perfluorooctano, perfluorociclopentano, perfluorociclohexano, hexafluoropropano y heptafluoropropano. El hexafluoruro de azufre puede ser también un agente de soplado útil. Otros agentes de soplado conocidos incluyen alcanos tal como propano, butanos y pentanos; cicloalcanos y cicloalquenos tales como ciclobutano, ciclopenteno y ciclohexeno; dialquil-éteres tales como dimetil-éter, metil-etil-éter y dietil-éter; éteres de cicloalquileno tales como furano; cetonas tales como acetona y metil-etil-cetona; y carboxilatos tales como ácido fórmico, ácido acético y ácido propiónico.
La presión se selecciona para facilitar la disolución del gas en el polímero y dependerá, por tanto, del gas utilizado, el polímero utilizado y la temperatura. Presiones de 42-63 bares (600-900 psi) son útiles generalmente para CO_{2} y polímeros PLGA, aunque no son limitantes de la invención. Por ejemplo, pueden utilizarse incluso gases en condiciones super o sub-críticas. Adicionalmente, puede utilizarse un líquido volátil que pueda disolverse en el polímero y forme un gas después de imposición de la inestabilidad termodinámica. Como ejemplo, puede disolverse CO_{2} en una mezcla de polímero poli[ácido D,L-láctico-co-glicólico] y material particulado de NaCl a una presión de 56 bares (80 psi) aplicada durante aproximadamente 48 horas para permitir la saturación.
El gas específico utilizado en la transformación en espuma puede ser una variable crítica en la producción e matrices porosas. La elección del gas utilizado en la transformación en espuma tiene un gran efecto sobre la estructura del entramado final. CO_{2} producía matrices altamente porosas, en tanto que N_{2} y He conducían a una formación de poros inapreciable. Estos resultados son coherentes con varios estudios previos en los cuales se ha utilizado CO_{2} para crear estructuras porosas de polímeros (Mooney et al., Biomaterials, 17, 1417-1422, 1996). Si bien el mecanismo exacto que subyace en este resultado no se conoce, el mayor grado de transformación en espuma experimentado con CO_{2} en comparación tanto con N_{2} como con He puede ser el resultado de una interacción específica entre CO_{2} y los grupos carbonilo de PLGA (Kazarian et al., J. Am. Chem. Soc., 18, 1729-1736, 1996).
El tiempo de equilibración con un gas y la tasa de liberación de la presión afectaban a la porosidad y estabilidad de las matrices, aunque no tan acusadamente como las otras variables.
Con objeto de iniciar la formación de núcleos del gas disuelto y el crecimiento de los poros de gas en el material, se crea una inestabilidad termodinámica. Este fenómeno ha sido descrito por ejemplo por Park, Baldwin y Suh, "Effect of the Pressure Drop Rate on Cell Nucleation in Continuous Processing of Microcellular Polymers", Polymer Engineering and Science, 35, pp. 432-440 (1995). Preferiblemente, esto se hace por reducción de la presión de la atmósfera gaseosa, por ejemplo, hasta la presión atmosférica en un periodo de tiempo breve. El periodo de tiempo puede ser, por ejemplo, desde unos cuantos segundos a aproximadamente 15 minutos. La fase gaseosa se separa del polímero por formación de núcleos de los poros, y el crecimiento de los poros tiene lugar por difusión de gas hacia las áreas adyacentes a los sitios de formación de núcleos. El crecimiento de los poros reduce a su vez la densidad del polímero. Pueden utilizarse otros métodos para crear la inestabilidad, tales como aumento de la temperatura, pero no se prefieren debido a la facilidad de procesamiento. La estructura y el tamaño de los poros de gas formados dependerán, entre otras cosas, del tipo de gas utilizado y la cantidad de gas, que dependerá a su vez de la temperatura y presión inicial y final de la atmósfera de gas aplicada, la solubilidad del gas en el polímero particular, la tasa y tipo de formación de núcleos de los poros y la tasa de difusión del gas a través del polímero hasta los núcleos. Estos y otros factores pueden ajustarse para proporcionar poros gas de un tamaño adecuado. Debería disolverse una cantidad suficiente de gas para causar la formación de una matriz de polímero continua cuando el polímero se expande durante el crecimiento de los poros de gas.
Como resultado de la inestabilidad termodinámica, la formación de núcleos de poros y la formación y expansión de los poros de gas, el polímero que contiene el material particulado forma una fase continua, es decir una matriz, alrededor de los poros de gas.
El material particulado se lixivia del polímero con un agente lixiviante. Como agente lixiviante es útil cualquier agente que de lugar a la lixiviación, v.g., disuelva y elimine, el material particulado del polímero. Como se ha expuesto anteriormente, se prefiere un agente lixiviante de base acuosa, particularmente agua. La lixiviación del material
particulado del polímero forma el tipo de porosidad, distinta de la formada por la transformación en espuma con gas, que como se ha expuesto anteriormente puede proporcionar una estructura de poros interconectados.
La realización siguiente se proporciona como un ejemplo representativo y no limitante de la invención.
Discos constituidos por polímero (v.g., ácido poli[D,L-láctico-co-glicólico]) y partículas de NaCl se moldearon por compresión a la temperatura ambiente, y se dejó subsiguientemente que se equilibraran con CO_{2} gaseoso a alta presión (56 bares, 800 psi). La creación de una inestabilidad termodinámica condujo a la formación de núcleos y el crecimiento de los poros de gas en las partículas de polímero, y la formación de una matriz continua de polímero. Las partículas de NaCl se lixiviaron subsiguientemente para producir macroporos, y una estructura macroporosa. La porosidad global y el nivel de conectividad de los poros se reguló por la relación partículas de polímero:partículas de sal. Tanto el módulo de compresión (159 \pm 130 kPa para SC/PL frente a 289 \pm 25 kPa para GF/PL) como el módulo de tracción (334 \pm 52 kPa para SC/PL frente a 1100 \pm 236 kPa para GF/PL) de las matrices formadas por este método eran significativamente mayores que los obtenidos con un proceso estándar de colada con disolvente/lixiviación del material particulado. El potencial de estas matrices para construir el nuevo tejido se demostró por el descubrimiento de que las células de la musculatura lisa se adherían fácilmente y proliferaban sobre estas matrices, formando nuevos tejidos de alta densidad (3 x 10^{7} células/ml) en cultivo. Este nuevo proceso, una combinación de técnicas de transformación en espuma con gas a alta presión y lixiviación de un material particulado, permite fabricar matrices a partir de polímeros biodegradables con una porosidad y estructura de poros bien controlada.
La presente invención se refiere también a un polímero poroso que comprende una matriz de polímero que contiene poros formados por transformación en espuma con gas y poros formados por lixiviación de un material particulado del polímero, y en el cual el polímero es biocompatible, y a un material polímero que comprende una sección de polímero poroso que comprende una matriz de polímero que contiene poros formados por transformación en espuma con gas y poros formados por lixiviación de un material particulado del polímero y una sección de polímero impermeable conectado integralmente y en el cual el polímero es biocompatible.
Los materiales preparados por el proceso de la invención exhiben una extensa gama de utilidades. Los mismos se pueden aplicar a cualquier uso que requiera un material polímero poroso, particularmente con una estructura de poros abiertos. Adicionalmente, los materiales son particularmente aplicables para usos en los cuales no es tolerable un residuo de disolvente orgánico, v.g. en aplicaciones en las cuales se desea biocompatibilidad. Por ejemplo, los materiales son útiles como matrices en las cuales las células son compatibles y crecen hasta alcanzar su función propuesta, tales como en reemplazamiento de tejidos, reemplazando eventualmente la matriz dependiendo de su biodegradabilidad. Adicionalmente, los materiales pueden utilizarse para proporcionar matrices ya fijadas a células que pueden luego implantarse quirúrgicamente en un cuerpo. Por otra parte, los materiales se pueden utilizar como sistema de suministro de fármacos de liberación sostenida, como materiales matriz para la curación de heridas, como matrices para estudios de cultivo de células in vitro o usos similares a los citados. La estructura estable de los materiales de la invención proporciona condiciones ideales para cultivo de células.
Los materiales de la invención preparados por el proceso GF/PL tienen generalmente además aplicaciones similares a las de los materiales preparados por las técnicas SC/PL y de separación de fases, por ejemplo, en una diversidad de aplicaciones de trasplante de células, con inclusión de hepatocitos (D.J. Mooney, P.M. Kaufmann, K. Sano, K.M. McNamara, J.P. Vacanti y R. Langer, "Transplantation of hepatocytes using porous biodegradable sponges", Transplantation Proceedings, 26, 3425-3426 (1994); D.J. Mooney, S. Park, P.M. Kaufmann, K. Sano, K. McNamara, J.B. Vacanti, y R. Langer, "Biodegradable sponges for hepatocyte transplantation", Journal of Biomedical Materials Research, 29, 959-965 (1995)), condrocitos y osteoblastos. S.L. Ishaug, M.J. Yaszemski, R. Biciog, A.G. Mikos: "Osteoblast Function on Synthetic Biodegradable Polymers", J. of Biomed. Mat. Res. 28, p. 1445-1453 (1994). Sin embargo, los materiales de la invención tienen propiedades mecánicas mejores y evitan el problema de los residuos de disolvente orgánico que pueden dañar las células trasplantadas o migrantes y el tejido próximo y/o desactivar factores biológicamente activos.
Las células musculares lisas se adhieren fácilmente al material matriz de la invención y crean tejidos tridimensionales dentro de estas estructuras porosas; así, aquéllas proporcionan un entorno adecuado para la proliferación celular. Experimentos in vitro indican un crecimiento celular concentrado alrededor de la periferia de la matriz. Esto es debido probablemente a limitaciones de difusión de O_{2} a las células en el centro de la matriz debido al espesor de la esponja (3,4 mm).
Adicionalmente, estas matrices tienen un mejor potencial para incorporar factores de crecimiento que las preparadas utilizando disolventes orgánicos. El problema potencial con los disolventes orgánicos es que el residuo que queda en estos polímeros después del procesamiento puede dañar las células trasplantadas y el tejido próximo. Adicionalmente, la exposición a disolventes orgánicos desactivaría muchos factores biológicamente activos. Actualmente, la incorporación de factores de crecimiento con biomateriales se realiza utilizando microesferas. Este método utiliza también disolventes orgánicos durante la fabricación. Esta desventaja puede eliminarse con los materiales matriz de la invención debido a que el factor de crecimiento puede incorporarse directamente en la matriz de polímero para obtener una mejor liberación.
Una manera preferida de incorporar factores de crecimiento en una matriz para construcción de tejidos y/o proliferación de células consiste en proporcionar un factor de crecimiento contenido dentro de una estructura de polímero en forma de partículas, v.g. como microesferas de perlas, o mezclado con otro polímero u otras moléculas, antes de la adición al PLGA para la transformación en espuma. La estructura polímera puede formarse a partir de otro copolímero de PLGA que se degrada a una tasa diferente que el PLGA utilizado para formar el grueso de la matriz o a partir de un material polímero diferente, tal como un material de alginato o alginato modificado. Un sistema de este tipo proporciona un nivel adicional de control sobre la cinética de liberación de moléculas desde las matrices, y control adicional sobre su bioactividad debido a que los factores de crecimiento contenidos dentro de la estructura polímera pueden diseñarse de modo que proporcionen un efecto de liberación controlada a partir de la misma además de la cinética de liberación proporcionada por la matriz. La liberación en esta situación estará controlada probablemente por disociación del factor desde la perla, liberación del PLGA, o ambos. Así pues, se proporciona un alto grado de control sobre la cinética de liberación dentro de una gama potencialmente amplia. Además, pueden incluirse factores múltiples en una matriz (en múltiples tipos de las partículas descritas y/o en un polímero que comprende el grueso de la matriz) que se liberarán en tiempos variables. Esto será útil si se desea una cascada de liberación de factores de crecimiento, u ondas de liberación del mismo factor (v.g., para uso en inmunizaciones). La incorporación de los factores de crecimiento de estas partículas (v.g., perlas de alginato) es también más adecuada para mantener la bioactividad a largo plazo de los factores que sí los mismos estuvieran inmovilizados directamente en el polímero que comprende el grueso de la matriz transformada en espuma.
Matrices altamente porosas, por ejemplo, de PLGA, con una combinación de transformación en espuma con gas y lixiviación de un material particulado pueden prepararse por la invención. El método evita el uso de disolventes orgánicos o temperaturas altas y produce materiales con estructuras de poros deseables. Es posible controlar la porosidad y la estructura de poros de estas matrices variando la relación de polímero particulado y el tamaño de partícula del material particulado, por ejemplo. Estas matrices exhiben propiedades mecánicas mejoradas, y pueden utilizarse para formar tejidos tridimensionales. Este nuevo método de fabricación puede utilizarse, por ejemplo, como un enfoque para la incorporación de fármacos y/o factores de crecimiento en polímeros utilizados como matrices para construcción de tejidos.
Otra aplicación útil para las matrices de polímero de la invención es para regeneración guiada de tejidos (GTR). Esta aplicación está basada en la hipótesis de que en el tejido sano subyacente residen células progenitoras responsables de la regeneración tisular y puede inducirse su migración hasta un defecto y regeneración del tejido perdido. Una característica crítica de las matrices para GTR es el transporte de células al interior de la matriz, propiedad que viene dictada por la distribución de tamaños de poro y la continuidad de los poros, es decir, la interconectividad. La matriz debe permitir que las células deseadas invadan la matriz impidiendo al mismo tiempo el acceso a otros tipos de células.
Los materiales de la invención, en particular como una esponja de polímero hecha de poli(ácido láctico) PLA, poli(ácido glicólico) (PGA), o poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), que tienen una capa impermeable en uno de sus lados, pueden proporcionar esta característica de permeabilidad selectiva. La capa impermeable está compuesta de los mismos polímeros pero sin la extensión de porosidad, y pueden utilizarse una diversidad de métodos para acoplar la capa impermeable a la esponja de polímero.
En una realización particular que es representativa de esta utilidad, la esponja de polímero se crea por molienda de PLGA seguida por tamizado a fin de obtener partículas con un diámetro comprendido entre 108 y 250 micrómetros. Estos materiales polímeros se mezclan con cloruro de sodio y se prensan a su forma definitiva con un troquel a una presión de aproximadamente 105 bares (1500 psi). El sólido polímero/sal se transforma luego en espuma poniendo el sólido en una bomba de presión y exponiéndolo a CO_{2} a una presión de 56 bares (80 psi) durante 48 horas seguido por una reducción relativamente rápida de la presión. Esta reducción de presión produce inestabilidades termodinámicas en la distribución de CO_{2}, causando la formación de poros. El sólido polímero/sal se deja luego en agua durante 24 horas para lixiviar la sal. Téngase en cuenta que el agua debe cambiarse durante el proceso de lixiviación. Este proceso produce una esponja de polímero que tiene una porosidad mayor que 95%. La tasa de degradación de la esponja puede modificarse variando la composición de ácidos láctico y glicólico.
Puede crearse una capa impermeable en un solo lado de la esponja por una de las técnicas siguientes, realizadas preferiblemente antes de la transformación en espuma con gas del material. La esponja puede prensarse a su forma definitiva en una capa de PGA a una temperatura mayor que la temperatura de fusión del PGA. El PGA fundido podrá adherirse a la esponja formando así una capa delgada. Esta capa es impermeable debido a que el proceso de transformación en espuma y el proceso de lixiviación tienen un efecto insignificante sobre el PGA puro. Puede crearse también una capa impermeable de PLGA sobre la esponja prensando la esponja sobre una capa de PLGA. La pulverización de una solución de PLA en cloroformo sobre un lado de la esponja puede crear también una capa impermeable. Adicionalmente, es posible utilizar el mismo material polímero y alterar la cantidad de material particulado lixiviable en cada sección de tal manera que una sección forme una estructura de poros abiertos y otra no lo haga. Asimismo, por utilización de polímeros diferentes, pueden proporcionarse materiales en los cuales una sección está transformada en espuma, y la sección de capa impermeable no lo está. Aunque PLGA se transforma en espuma después de la liberación de la presión desde la bomba, se forma una piel impermeable sobre la capa delgada de PLGA que queda intacta durante el proceso de lixiviación. Alternativamente, después del proceso de transformación en espuma y lixiviación, la esponja polímera puede sumergirse en PGA fundido o en una solución de PLGA en cloroformo. Estos procedimientos pueden utilizarse para crear una esponja que tiene una porosidad mayor que 95% con un lado impermeable.
Pueden aplicarse métodos similares a materiales análogos, como se ha expuesta anteriormente, a fin de proporcionar otros materiales de esponja de acuerdo con la invención útiles para aplicaciones GTR.
Las matrices de PLGA pueden proporcionar también un sustrato adecuado para formación de hueso. Una característica crítica de una matriz para reemplazamiento de tejidos óseos es su capacidad para proporcionar un entorno apropiado para el desarrollo de tejido y la mineralización de la matriz. La capacidad de las matrices GF/PL para permitir la adhesión celular y la formación de tejido se evaluó in vitro por siembra y cultivo de células MC3T3-E1, una línea de células osteogénica, sobre entramados de PLGA con técnicas optimizadas previamente para otros tipos de células (Kim et al., Biotech. Bioeng., 57, p. 46-54, 1998). Las células adheridas a la matriz GC/PL proliferaron, y comenzaron a secretar proteínas de la matriz extracelular, y al cabo de 4 semanas de cultivo pudieron observarse parches de mineralización. Se formó un nuevo tejido con grandes áreas de mineralización al cabo de 6 semanas. A lo largo de este periodo de tiempo no se observó cambio alguno en el tamaño y la forma de las matrices, lo que sugiere que las mismas tenían propiedades mecánicas suficientes para controlar la formación global de tejido óseo construido.
Una característica crítica de la matriz para uso en la regeneración guiada de tejido es la capacidad de las células para migrar hacia el interior de la matriz. Experimentos preliminares confirman que las células migraban fácilmente hacia dentro y a lo largo de la matriz in vitro. Esto era de esperar, dado que estudios previos con estos tipos de matrices demostraron crecimiento fibrovascular interno in vivo a una tasa de 0,1-0,3 mm/día (Mooney et al., 1994, supra).
Otra aplicación potencial de estos materiales de esponja para GTR se refiere al tratamiento de una enfermedad periodontal. La enfermedad periodontal se caracteriza por la pérdida de fijación del ligamento periodontal al hueso alveolar. Las células epiteliales de la encía comienzan a crecer hacia el interior del sitio en el que estaba fijado el ligamento periodontal. Una esponja del material matriz de acuerdo con la invención con un lado impermeable podría utilizarse para prevenir el crecimiento hacia abajo de células epiteliales en tanto que permitiría que las células apropiadas ocuparan la esponja porosa regenerando de este modo el ligamento periodontal. Orientaciones adicionales en cuanto a dicha aplicación han sido proporcionadas por Shea et al., Tissue Engineering: Fundamentals and Concepts, Capítulo III.6, "Biodegradable Polymer Matrices in Dental Tissue Engineering".
Para otras aplicaciones en las cuales se siembran o se incorporan de otro modo células y crecen dentro de las matrices de la invención, la incorporación y el crecimiento de las células pueden facilitarse de una manera conocida en la técnica. Ejemplos de tales métodos se proporcionan en las patentes U.S. Núms. 5.041.138; 5.567.612; 5.696.175 y 5.709.854.
Se cree que, sin más explicación, un experto en la técnica puede, utilizando la descripción que antecede, utilizar la presente invención en su más plena extensión. Las realizaciones específicas preferidas siguientes deben interpretarse, por consiguiente, como meramente ilustrativas, y no limitantes del resto de la exposición en modo alguno.
Información adicional en relación con la utilización de la presente invención puede encontrarse en la Solicitud Provisional U.S. No. 60/042.198, presentada el 31 de marzo de 1997.
En lo que antecede y en los ejemplos siguientes, todas las temperaturas se indican en grados Celsius sin corregir y, a no ser que se indique otra cosa, todas las partes y porcentajes se expresan en peso.
Ejemplos Ejemplo 1 Procesamiento de la matriz
Pelets de un copolímero 85:15 de D,L-lactida y glicolida (PLGA) se adquirieron de Boehringer Ingelheim (Henley, Montvale, NJ, EE.UU.), y se utilizaron para fabricar las matrices de polímero en todos los experimentos. La viscosidad intrínseca del polímero era aproximadamente 1,3-1,7. Los pelets de polímero se molieron utilizando un molino Tekmar (Bel-Art Products, Pequannock, NJ, EE.UU.) y se tamizaron para obtener partículas de tamaños comprendidos entre 106 y 250 \mum. En ciertos experimentos, la matrices de polímero se mezclaron con partículas de cloruro de sodio (Mallinckrodt, Paris, KY, EE.UU.). Las partículas de sal se tamizaron para proporcionar una gama de tamaños, y la relación en peso de las masas NaCl:PLGA estaba comprendida entre 0 y 50. En todos los casos, la masa total de PLGA y NaCl se mantenía constante en 0,8 g. Las mezclas de PLGA y NaCl se cargaron a una matriz de KBr (1,35 cm de diámetro; Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, EE.UU.), y se comprimieron a 105 bares (1500 psi) durante 1 minuto, utilizando una Prensa de Laboratorio Carver (Fred S. Carver, Inc., Menominee Falls, WI, EE.UU.) para producir discos sólidos (espesor = 3,4 mm). Las muestras se expusieron luego a CO_{2} gaseoso a alta presión (56 bares; 800 psi) durante 48 horas a fin de saturar el polímero con gas. Se creo luego una inestabilidad termodinámica por reducción de la presión de gas hasta la presión atmosférica. Esto condujo a la formulación de núcleos y el crecimiento de poros de CO_{2} dentro de las matrices de polímero. Las partículas de NaCl se eliminaron subsiguientemente de las matrices por lixiviación de éstas en ddH_{2}O durante 48 horas. Todos los pasos del proceso se realizaron a la temperatura ambiente.
Se fabricaron también esponjas porosas utilizando una técnica de colada con disolvente-lixiviación de material particulado descrita previamente (A.G. Mikos, A.J. Thorsen, L.A. Czerwonka, Y. Bao, y R. Langer, "Preparation and characterization of poly(L-lactic acid) foams", Polymer, 35, 1068-1077 (1994)). En este proceso, se disolvió PLGA en cloroformo (Mallincrodt; Paris, KY, EE.UU.) para producir una solución de 10% (p/v), y se cargaron 0,12 ml de esta solución en cilindros de Teflón (diámetro 0,5 cm; Cole Parmer) compactados con 0,4 g de partículas de cloruro de sodio tamizadas a un tamaño comprendido entre 250 y 500 \mum. Después de la evaporación del disolvente, las películas de polímero con partículas de sal atrapadas (3 mm de espesor) se retiraron cuidadosamente de los moldes. La sal se eliminó por inmersión de las películas en agua destilada durante 48 horas.
Caracterización
La porosidad de las muestras se determinó inicialmente por medidas y pesos en bruto después del procesamiento utilizando la ecuación siguiente:
Ecu. 1:
Porosidad(%) = 1-[(peso/volumen)/(\text{densidad de polímero})] \ x \ 100
Las muestras se sometieron a obtención de imagen utilizando un microscopio electrónico de exploración (ISI-DS 130, Topcon Technologies, Pleasanton, CA, EE.UU.). Las muestras se recubrieron con oro utilizando un equipo Sputter Coater (Desk II, Denton Vacuum, Cherry Hill, NJ, EE.UU.), y el microscopio se hizo operar a 10 kV para obtener las imágenes de las muestras. Se utilizó película Polaroid 55 para las fotomicrografías.
Se realizaron ensayos de compresión y tracción en un equipo MTS Bionics 100 (, Research Triangle Park, NC, EE.UU.). Las muestras se cortaron en cuadrados de 1 x 1 cm para el ensayo de compresión. Para el ensayo de tracción, las muestras (1 x 1 cm) se fijaron a cartulina utilizando una cola epoxídica. Se cortó una ranura de 1,7 mm en el centro de la cartulina y se centró la muestra, después de lo cual se encoló para normalizar la longitud de referencia. Los ensayos de compresión y tracción se realizaron con una tasa de deformación constante (1 mm/min). Los módulos se determinaron a partir de las pendientes en la porción elástica del diagrama esfuerzo-deformación.
Se utilizó análisis termogravimétrico para determinar la cantidad de residuo de sal que quedaba en la esponja después de la lixiviación. Las matrices se calentaron desde 150ºC a 300ºC a una tasa constante de 10ºC/min, y se observó la masa residual.
Estudios de células
Se utilizaron en todos los experimentos células musculares lisas (SMC). Las SMCs se aislaron y cultivaron utilizando una modificación de las técnicas descritas en Rothman et al. (A. Rothman, T.J. Kulik, M.B. Taubman, B.C. Berk, C.W.J. Smith y B. Nadal-Ginard, "Development and characterization of a cloned rat pulmonary arterial smooth muscle cell line that maintains differentiated properties through multiple subcultures", Circulation, 86, 1977-1986 (1992)). En resumen, las células se aislaron de aortas de ratas macho Lewis adultas de 300-350 g (Charles River Laboratories, Wilmington, MA, EE.UU.) utilizando una disociación enzimática. Después de ello, los tejidos adventicios, y los tejidos conectivos que rodeaban las arterias se eliminaron por disección directa, se cortó el tejido SM en múltiples piezas pequeñas y se puso en un frasco de centrífuga que contenía un tampón de disociación enzimática a 37ºC. Este tampón contiene 0,125 mg/ml de elastasa (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU.), 1,0 mg/ml de colagenasa (CLS tipo I, 204 unidades/mg, Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ, EE.UU.), 0,250 mg/ml de inhibidor de tripsina de soja (tipo 1-S, Sigma), y 2,0 mg/ml de seroalbúmina bovina cristalizada (BSA, Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD; EE.UU.). Después de 90 minutos de incubación, la suspensión se filtró a través de un filtro Nitex de 100 \mum (Tetko, Inc., Briarcliff Manor, NY) y se centrifugó a 200 g durante 5 minutos. El sedimento se resuspendió en Medio 199 (Sigma) complementado con 20% (v/v) de suero de bovino fetal (FBS, Gibco), L-glutamina 2 mM (Gibco), y 50 unidades/ml de penicilina-estreptomicina (Gibco). Las células se cultivaron sobre un plástico de cultivo de tejidos en una atmósfera humidificada con 5% de CO_{2} con el medio (Medio 199, 10% (v/v) de suero de bovino fetal, 50 unidades/ml de penicilina-estreptomicina) cambiado cada dos días. En estos experimentos se utilizaron células sometidas a 17 pasadas.
Las matrices se sembraron con SMCs poniendo una suspensión de células de 40 ml que contenía 3,14 x 10^{7} células/ml encima de cada matriz y dejando que la suspensión de células se absorbiera en la matriz. Las matrices estaban alojadas en cápsulas de cultivo de tejidos y se incubaron a 37ºC durante aproximadamente 36 horas. A continuación, se cultivaron las matrices de polímero durante 2 semanas y se pusieron en un frasco de centrífuga (100 ml, Bellco Glass, Inc., Vineland, NJ, EE.UU.) agitado a 40 RPM. El número de células en las matrices se determinó midiendo el contenido de DNA en muestras triplicadas digeridas con enzima utilizando colorante Hoechst 33258 y un fluorómetro (Hoefer DyNA Quant 200, Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) como se ha descrito previamente. Para el examen al microscopio electrónico de exploración, las muestras se fijaron en aldehído glutárico al 1% y formaldehído al 0,1% durante 30 minutos y 24 horas, respectivamente, se deshidrataron en una serie graduada de soluciones etanol/agua, se secaron, y se recubrieron luego por pulverización catódica con oro. Para obtener las imágenes de las muestras se utilizó un microscopio electrónico de exploración (ISI-DS 130, Topcon Technologies) que operaba a 10 kV. Se prepararon secciones histológicas por fijación de matrices célula-polímero (10% formalina), deshidratación, incrustación, corte en secciones y tinción con hematoxilina y eosina o Verhoef's utilizando técnicas estándar.
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Integridad y porosidad/estructura de poros de las matrices transformadas en espuma
Las fotomicrografías demostraron que la transformación en espuma con gas, por sí sola, de los discos sólidos de polímero conducía a la formación de matrices altamente porosas. Sin embargo, estas matrices tenían una piel no porosa en las superficies externas y los poros estaban en gran parte cerrados, como era de esperar por los estudios previos. (D.J. Mooney, D.F. Baldwin, N.P. Suh, J.P. Vacanti, y R. Langer, "Novel approach to fabricate porous sponges of poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) without the use of organic solvents", Biomaterials, 17, 1417-1422 (1996)). En contraste, la transformación en espuma con gas y lixiviación subsiguiente de discos que contenían un alto porcentaje (95%) de partículas grandes (250 < d < 425 \mum) de NaCl, de acuerdo con la invención, conducía a la formación de matrices altamente porosas de poros abiertos sin evidencia alguna de piel externa no porosa. La estructura de poros observada en las secciones transversales de estas matrices era similar a la observada en las secciones transversales de las matrices formadas con una técnica SC/PL. Sin embargo, la estructura de poros de las matrices formadas a partir del proceso SC/PL carece a menudo de uniformidad en toda la matriz debido a la evaporación del disolvente orgánico y el aumento subsiguiente en la concentración de polímero de la solución restante atrapada dentro del lecho de sal. Por ejemplo, se muestra en las fotomicrografías que la superficie de estas matrices que es adyacente al cubreobjetos de vidrio durante el procesamiento que es típicamente menos porosa que el resto de la matriz. En contraste, la estructura de poros de las matrices transformadas en espuma con gas-lixiviadas del material particulado (GF/PL) era uniforme en toda la matriz y en las superficies exteriores. El análisis TGA de las matrices indicaba que quedaban cantidades insignificantes de NaCl después de la lixiviación. En la cápsula quedaban trazas de un residuo blanco. Para confirmar que la transformación en espuma con gas era responsable de la formación de matrices estables, se moldearon por compresión muestras de control, pero no se transformaron en espuma. La lixiviación del NaCl de estas matrices condujo a la rotura completa de las matrices.
La relación de NaCl:PLGA y el tamaño de las partículas de NaCl en las matrices GF/PL se variaron a continuación para determinar la gama de porosidad y estructura de poros que podría obtenerse con este proceso (Tabla I). La porosidad global de estas matrices aumentaba desde 85,1% \pm 2,3 a 96,5% \pm 0,5 a medida que aumentaba análogamente la relación de NaCl:PLGA. Para NaCl constante (95%), el aumento en el diámetro de las partículas de sal tenía muy poco efecto sobre la porosidad global. Sin embargo, las fotomicrografías demostraban que a medida que se incrementaba el diámetro de la sal, aumentaba paralelamente el tamaño de poro.
A continuación se evaluó la estabilidad de las matrices utilizando ensayos mecánicos de compresión y tracción. En general, las matrices GF/PL exhibían propiedades mecánicas mejoradas en comparación con las matrices SC/PL (véase Figura 1). Los módulos de compresión medios eran 159 \pm 130 kPa y 289 \pm 25 kPa para las matrices SC/PL y GF/PL, respectivamente. Los módulos de tracción medios eran 334 \pm 52 kPa para las matrices SC/PL y 1100 \pm 236 kPa para las matrices GF/PL (Tabla II). Estos datos representan un aumento de 80% en resistencia a la compresión y un aumento de 300% en resistencia a la tracción.
Desarrollo de tejido sobre las matrices sintéticas
Se evaluó seguidamente la capacidad de las matrices GF/PL para permitir la adhesión celular y la formación de tejidos en un estudio in vitro. Las fotomicrografías demuestran que las SMCs se adherían a la matriz GF/PL y cubrían la superficie disponible después de la siembra. Se demostró un aumento significativo en el número de células después de 2 semanas de cultivo. La densidad media de células era 1,71 x 10^{7} células/ml y 3,05 x 10^{7} células/ml a las 0 y 2 semanas, respectivamente. Esto representa un aumento del 43,8% en la densidad de células. Las células llenaban los poros de la matriz y creaban un nuevo tejido tridimensional en el interior de la matriz sintética. Sin embargo, la mayor parte del crecimiento de las células tenía lugar alrededor de la periferia de la matriz de una manera relativamente uniforme, y se observaba una baja concentración de células en el centro de las matrices a las 2 semanas. No se observó cambio alguno en el tamaño y la forma de las matrices a lo largo de este periodo de tiempo.
TABLA I Porosidad global de las esponjas
Concentración de NaCl Diámetro (\mum)
(%)
106-250 250-425 >425
80 - - - 85,1 \pm 2,3 - - -
90 87,3 \pm 1,9 91,5 \pm 1,4 - - -
95 93,9 \pm 0,9 94,6 \pm 0,9 95,0 \pm 0,8
97 - - - 96,5 \pm 0,5 - - -
TABLA II Propiedades mecánicas
Resistencia a la tracción
Método Módulo de compresión Módulo Alargamiento de
(kPa) (kPa) rotura (%)
Disolvente/lixiviación 159 \pm 130 334 \pm 52 17,5 \pm 1,9
Espuma/lixiviación 289 \pm 25 1100 \pm 236 12,0 \pm 1,3
Ejemplo 2 Liberación de factores de crecimiento a partir de la matriz transformada en espuma Método
Se añadió primeramente factor de crecimiento endotelial vascular marcado con ^{125}I (VEGF) a una solución de alginato de sodio al 1%, y se gelificaron luego perlas de esta solución por inyección de gotitas en una solución acuosa que contenía cloruro de calcio. Las perlas de alginato (de aproximadamente 3 mm de diámetro) se recogieron, enjuagaron, y liofilizaron. Las perlas liofilizadas se mezclaron con 85:15 PLGA y partículas de NaCl, y la mezcla se moldeó por compresión y se transformó conforme al proceso de transformación en espuma con gas/lixiviación de material particulado como se ha descrito previamente. Después de lixiviación de la sal y secado, las matrices pusieron en medio de cultivo de tejidos exento de suero y se mantuvieron a 37ºC. Se tomaron periódicamente muestras del medio, y se analizaron en cuanto al contenido de ^{125}I-VEGF (liberado de las matrices de PFGA). El factor de crecimiento liberado se normalizó para el total de factor de crecimiento incorporado.
Resultados
Se observó en el primer día un aumento brusco inicial de aproximadamente 20% del factor de crecimiento incorporado, y se anotó una liberación sostenida de factor de crecimiento durante los 20 días restantes del experimento (véase la Figura 2).
Ejemplo 3 Liberación de factores de crecimiento
Un elemento que puede facilitar el desarrollo de tejidos sobre las matrices es el suministro de factores de crecimiento en el entorno local. La incorporación y liberación de factores de crecimiento a partir de estas matrices se evaluó in vitro utilizando factor del crecimiento endotelial vascular marcado con ^{125}I (VEGF). Una fracción sustancial del fármaco se liberó durante el proceso de lixiviación de las partículas; sin embargo, el fármaco restante se liberó de una manera sostenida durante los 21 días del experimento (Fig. 4).
Ejemplo 4 Fabricación de las matrices
Se obtuvieron pelets de ácido poli(L-láctico) [PLLA], un copolímero 50:50 de D,L-lactida y glicolida (50:50 PLGA) con viscosidad intrínseca (i.v. de 0,2 dl/g), un copolímero 75:25 PLGA (i.v. = 1,3) y un copolímero 85:15 PLGA (i.v. = 1,4) de Boehringer Ingelheim (Henley, Montvale, NJ, EE.UU.). Se adquirieron PGA, 50:50 PLGA (i.v. = 0,8) y 85:15 PLGA (i.v. = 0,63) de Medisorb (Cincinnati, OH, EE.UU.). Se obtuvo 85:15 PLGA (i.v. = 3,63) de Purasorb (Lincolnshire, IL, EE.UU.).
El polímero sólido (PLLA, PLGA, PGA) se molió (después de congelación con nitrógeno líquido) utilizando un equipo Scienceware Micro-Mill (Bel-Art Products, Pequannock, NJ, EE.UU.) y se tamizó hasta un diámetro de 106-250 \mum. El NaCl, obtenido de Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, EE.UU.) se tamizó a un diámetro de 250-425 \mum para uso en ciertos experimentos. Se conformaron discos sólidos de polímero por introducción de 150 mg de polímero (PGA, 50:50 PLGA, 75:25 PLGA, 85:15 PLGA, y PLLA) en una matriz redonda de acero inoxidable-KBr que tenía un diámetro de 1,35 cm (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, EE.UU.) y compresión durante 60 segundos a 105 bares (1500 psi) en una Prensa de Laboratorio Carver (Fred S. Carver, Inc., Menominee Falls, WI, EE.UU.). Este método produce discos sólidos para transformación en espuma. Todas las muestras se fabricaron por triplicado.
Los discos se transformaron en espuma en un recipiente de alta presión utilizando CO_{2}, N_{2}, o He a 59,5 bares (850 psi).
Después que los discos se hubieron equilibrado (1-48 horas) con el gas, se redujo la presión a la atmosférica. La inestabilidad termodinámica resultante causó la formación de núcleos y el crecimiento de poros de gas dentro de la matriz de polímero. Discos sólidos de polímero 85:15 (i.v. = 1,4) se convirtieron en espuma durante 1 hora en CO_{2} y la presión se liberó a tasas diferentes (1, 2,5, 5, 10 minutos) para determinar si la tasa de liberación de la presión afecta a la estructura final de las esponjas. Todos los pasos del proceso se realizaron a la temperatura ambiente.
Se fabricaron discos de polímero/NaCl de manera similar utilizando 40 mg de polímero y 760 mg de NaCl, comprimidos en discos. Después de la conversión en espuma, los discos se pusieron en agua destilada a fin de eliminar el NaCl. Esta solución de lixiviación se cambió varias veces a lo largo del transcurso de aproximadamente 18 horas. Se consideró que los discos se habían lixiviado por completo cuando la solución se lixiviación no daba un precipitado con AgNO_{3}. Si está presente en la solución Cl^{-}, precipita con Ag^{+} para formar un precipitado blanco. La ausencia de formación de este precipitado indicaba que el NaCl se había eliminado por completo de los entramados. Los discos se secaron luego al aire durante una noche, se midieron y se pesaron, después de lo cual se guardaron a vacío en un desecador. Los discos de polímero se midieron y pesaron inmediatamente después de la transformación en espuma, y se guardaron luego a vacío en un desecador.
Caracterización
Con objeto de calcular la porosidad de los discos transformados en espuma, se utilizó un calibrador Boley para medir el diámetro y espesor de cada disco. Los discos se pesaron en una balanza Mettler y se utilizó la ecuación siguiente: (d = densidad de polímero, g = peso de disco, cm^{3} = volumen calculado del disco):
porosidad = 100 [1 - (g/cm^{3})/d]
Se obtuvieron imágenes de varias de las muestras utilizando un microscopio electrónico de exploración (ISI-DS 130, Topcon Technologies, Pleasanton, CA, EE.UU.). Las muestras se recubrieron de oro utilizando un instrumento Sputter Coater (Desk II, Denton Vacuum, Cherry Hill, NJ, EE.UU.) y el microscopio se operó a 10 kV para obtener la imagen de las muestras. Para las fotomicrografías se utilizó película Polaroid 55.
El ensayo de compresión se realizó en un equipo MTS Bionix 100 (Syntech, Research Triangle Park, NC, EE.UU.). Se utilizaron exclusivamente discos de polímero/NaCl en los ensayos de compresión debido a que los discos de polímero sólido se transformaban en espuma con formas irregulares. Se utilizó una tasa de deformación constante de 1 mm/min, y se determinaron los módulos a partir de las curvas esfuerzo-deformación.
Resultados Transformación en espuma de los discos sólidos de polímero
En la primera serie de experimentos, discos sólidos de polímero se transformaron en espuma para investigar el papel del tipo de gas, la tasa de liberación de la presión, y la composición y el peso molecular del polímero en la porosidad de las matrices de polímero. Matrices 85:15 de PLGA se transformaron en espuma durante 1 hora con varios gases diferentes (CO_{2}, N_{2}, He). Se obtuvo una porosidad significativa como resultado de la transformación en espuma con CO_{2} en comparación con N_{2} y He. La porosidad "de preespuma" hace referencia a la porosidad calculada después de la preparación del disco, pero antes de la equilibración de la presión (Figura 4). La visualización de las matrices transformadas en espuma con CO_{2} reveló una matriz altamente porosa, constituida en gran parte por poros cerrados.
En el estudio inmediatamente siguiente, se varió la tasa de liberación de la presión desde 1 a 10 minutos de tiempo total. La porosidad de las matrices era relativamente constante con indiferencia de la tasa de liberación de la presión, excepto en el caso de una liberación muy rápida, cuando el gas se congelaba dentro de la cámara. Esto condujo a una pequeña disminución en la porosidad de la matriz (Figura 2).
Se investigó el efecto de la composición de polímero utilizando relaciones de copolímero diferentes de PLGA (PGA puro, 50:50, 75:25, 85:15 PLGA y PLLA puro). Ni PGA ni PLLA se transformaban en espuma apreciablemente. Los copolímeros se transformaban todos ellos en espuma para dar una porosidad mayor que 90% (Figura 6). De hecho, el copolímero 75:25 se transformaba en espuma tan fuertemente que no mantenía su integridad en la fase de liberación de presión/expansión del gas y se desintegró literalmente. Por tanto, no pudo calcularse valor alguno de porosidad para dicha muestra.
Con objeto de estudiar el efecto del peso molecular del polímero sobre la formación de poros, discos de 85:15 PLGA con viscosidad intrínseca (i.v.) comprendida entre 0,63 y 3,59 dl/g, se transformaron en espuma en CO_{2} a 59,5 bares (850 psi) durante 24 horas con una liberación de presión de 2,5 minutos. El PLGA de alta i.v. condujo a matrices con porosidad relativamente baja, mientras que el PLGA de menor i.v. dio como resultado una porosidad mucho mayor (Figura 7).
Transformación en espuma de discos polímero/NaCl
En la segunda serie de experimentos, se incorporó NaCl en el disco de polímero para el propósito de crear una estructura de poros abiertos. Se estudiaron diferentes variables (tiempo de equilibración y composición del polímero) a fin de determinar sus efectos sobre la estructura y estabilidad de los entramados. Los resultados de la primera serie de experimentos condujeron a los autores a utilizar CO_{2} como el gas empleado para la transformación en espuma, y un tiempo de liberación de la presión de 2,5 minutos en esta serie de experimentos. El examen de una matriz típica formada por transformación en espuma de 85:15 PLGA con NaCl en CO_{2}, muestra una estructura muy porosa con poros interconectados en gran parte abiertos.
En el primer estudio, el tiempo de equilibración se varió de 1 a 48 horas. La porosidad de las matrices era relativamente constante para tiempos de equilibración mayores que 6 horas, pero decrecía para tiempos de equilibración inferiores a 6 horas (Fig. 8a). Las matrices fabricadas con diversos tiempos de equilibración se ensayaron subsiguientemente para determinar si el tiempo de equilibración afectaba a sus propiedades mecánicas. Aun cuando la porosidad máxima se alcanzó con 6 horas de equilibración con gas, se producía un entramado más resistente con tiempos de equilibración mayores (Figura 8b).
Se varió a continuación la composición del polímero para determinar si podrían obtenerse resultados similares a los de la primera serie de experimentos. Los copolímeros de PLGA conducían a una porosidad mucho mayor que lo hacían los homopolímeros de PGA y PLLA (Figura 9a). Tanto los discos de PLLA como los de PGA se desintegraban en el proceso de lixiviación, indicando que se había producido poca transformación en espuma, en todo caso. Aun cuando todos los polímeros de PLGA conducían a matrices con porosidades similares, las matrices fabricadas a partir de PLGA con mayor contenido de ácido láctico eran más rígidas (Figura 9b).
Los ejemplos que anteceden pueden repetirse con éxito similar empleando las sustancias reaccionantes y/o las condiciones de operación de esta invención descritas genérica o específicamente en sustitución de las utilizadas en los ejemplos que anteceden.
Breve descripción de los dibujos
Diversos otros objetos, características y ventajas concomitantes de la presente invención se apreciarán más plenamente a medida que la misma se entienda mejor cuando se considere en asociación con los dibujos adjuntos, en los cuales los caracteres de referencia iguales designan las mismas o similares partes a todo lo largo de las diversas vistas.
Figura 1: Un gráfico que compara las propiedades mecánicas (resistencia a la tracción) de matrices SC/PL y GF/PL.
Figura 2: Muestra el perfil de liberación del factor de crecimiento radiomarcado de la matriz de polímero de acuerdo con el Ejemplo 2.
Figura 3: Muestra la liberación acumulada de VEGF a lo largo del tiempo para la matriz de acuerdo con el Ejemplo 3.
Figura 4: El efecto del tipo de gas sobre la porosidad de las matrices. Se equilibraron discos de 85:15 PLGA (i.v. = 1,4 dl/g) durante 1 hora en gas a 59,5 bares (850 psi) antes de la liberación de la presión. El tiempo para liberación de la presión fue 2,5 minutos.
Figura 5: El efecto de la tasa de liberación de la presión sobre la porosidad de las matrices PLGA. Se transformaron en espuma discos de 85:15 PLGA (i.v. = 1,4) durante 1 hora en CO_{2}, con un tiempo de liberación de la presión de 1 a 10 minutos.
Figura 6: Porosidad de las matrices fabricadas a partir de diferentes polímeros. Se expusieron los polímeros a 59,5 bares (850 psi) de CO_{2} durante 24 horas con liberación de la presión durante 2,5 minutos.
Figura 7: El efecto del peso molecular sobre la porosidad de las matrices de PLGA. Matrices de 85:15 PLGA con viscosidad intrínseca variable se transformaron en espuma durante 24 horas en CO_{2} a 59,5 bares (850 psi) con un tiempo de liberación de la presión de 2,5 minutos.
Figura 8a: Porosidad de las matrices con tiempos de equilibración variables. Se transformaron en espuma discos de 85:15 PLGA (i.v. = 1,4) y NaCl en CO_{2} a 59,5 bares (850 psi) durante un tiempo comprendido entre 1 y 48 horas. El tiempo de liberación de la presión fue 2,5 minutos.
Figura 8b: El módulo elástico de los entramados polímero/NaCl fabricados con tiempos de equilibración diferentes. Discos de 85:15 PLGA (i.v. = 1,4)/NaCl se transformaron en espuma en CO_{2} a 59,5 bares (850 psi) durante 1-12 horas con liberación de la presión durante 2,5 minutos.
Figura 9a: El efecto de la composición del polímero sobre la porosidad de los entramados polímero/NaCl. Diferentes copolímeros de PLGA, PGA, y PLLA con NaCl se transformaron en espuma durante 24 horas en CO_{2} a 59,5 bares (850 psi) con un tiempo de liberación de la presión de 2,5 minutos.
Figura 9b: El módulo elástico de las matrices formadas con diferentes composiciones de polímero. Relaciones de copolímero diferentes de PLGA con NaCl se transformaron en espuma durante 24 horas en CO_{2} a 59,5 bares (850 psi) con liberación de la presión durante 2,5 minutos.

Claims (43)

1. Un proceso para preparar un material polímero poroso que comprende formar poros en un material polímero que contiene un material particulado susceptible de lixiviación por transformación en espuma con gas y lixiviar subsiguientemente el material particulado para formar porosidad adicional, en el cual la formación de los poros por transformación en espuma con gas se realiza sometiendo una mezcla de partículas del polímero y partículas del material particulado a una atmósfera de un gas inerte a presión elevada tal que el gas se disuelve en el polímero y creando luego una inestabilidad termodinámica tal que se produce formación de núcleos y crecimiento de poros de gas y el polímero que contiene el material particulado forma una matriz continua.
2. El proceso de la reivindicación 1, en el cual la mezcla de partículas del polímero y partículas del material particulado se moldea por compresión a un tamaño y forma seleccionados antes de la formación de los poros de gas.
3. El proceso de la reivindicación 1, en el cual la inestabilidad termodinámica se crea por reducción de la presión de la atmósfera.
4. El proceso de la reivindicación 1, en el cual el gas es CO_{2}.
5. El proceso de la reivindicación 1, en el cual el polímero es un polímero biocompatible.
6. El proceso de la reivindicación 1, en el cual el polímero es un polímero biocompatible y biodegradable.
7. El proceso de la reivindicación 1, en el cual el polímero es un homopolímero o copolímero de ácido láctico y/o ácido glicólico.
8. El proceso de la reivindicación 1, en el cual el polímero es PLGA.
9. El proceso de la reivindicación 1, en el cual el polímero es una mezcla de un homopolímero o copolímero de ácido láctico y/o ácido glicólico con otro polímero.
10. El proceso de la reivindicación 9, en el cual el polímero es una mezcla de un homopolímero o copolímero de ácido láctico y/o ácido glicólico con un polímero de alginato.
11. El proceso de la reivindicación 1, en el cual el material particulado es un material particulado soluble en agua.
12. El proceso de la reivindicación 1, en el cual el material particulado es una sal.
13. El proceso de la reivindicación 1, en el cual el material particulado es NaCl.
14. El proceso de la reivindicación 1, en el cual el tamaño y la cantidad del material particulado se seleccionan de tal manera que se forma una estructura de poros interconectada en el material polímero poroso.
15. El proceso de la reivindicación 12, en el cual la cantidad de material particulado es al menos 50% en volumen de la mezcla de partículas del polímero y partículas del material particulado.
16. El proceso de la reivindicación 12, en el cual el tamaño medio de partícula del material particulado es de 10 a 500 micrómetros.
17. Un proceso para preparar un material polímero poroso que comprende formar poros en un material polímero que contiene un material particulado lixiviable por transformación en espuma con gas y lixiviación subsiguiente del material particulado para formar porosidad adicional, en el cual el gas utilizado es CO_{2}.
18. Un proceso para preparar un material polímero poroso que comprende formar poros en un material polímero que contiene un material particulado lixiviable por transformación en espuma con gas y lixiviación subsiguiente del material particulado para formar porosidad adicional, en el cual el polímero es un polímero biocompatible.
19. El proceso de la reivindicación 18, en el cual el polímero es un polímero biocompatible y biodegradable.
20. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en el cual la formación de los poros por transformación en espuma con gas se realiza sometiendo una mezcla de partículas del polímero y partículas del material particulado a una atmósfera de alta presión de un gas inerte de tal manera que el gas se disuelve en el polímero, y creando luego una inestabilidad termodinámica tal que tiene lugar formación de núcleos y crecimiento de los poros de gas, y el polímero que contiene el material particulado forma una matriz continua.
21. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, en el cual el polímero es un homopolímero o copolímero de ácido láctico y/o ácido glicólico.
22. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, en el cual el polímero es PLGA.
23. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, en el cual el polímero es una mezcla de un homopolímero o copolímero de ácido láctico y/o ácido glicólico con otro polímero.
24. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, en el cual el polímero es una mezcla de un homopolímero o copolímero de ácido láctico y/o ácido glicólico con un polímero de alginato.
25. Un polímero poroso que comprende una matriz de polímero que contiene poros formados por transformación en espuma con gas y poros formados por lixiviación de un material particulado a partir del polímero, y en el cual el polímero es biocompatible.
26. El polímero de la reivindicación 25, en el cual la matriz de polímero es un polímero biocompatible y biodegradable.
27. El polímero de la reivindicación 25, en el cual la matriz de polímero es un homopolímero o copolímero de ácido láctico y/o ácido glicólico.
28. El polímero de la reivindicación 25, en el cual la matriz de polímero es PLGA.
29. El polímero de la reivindicación 25, en el cual el polímero tiene una estructura de poros interconectada.
30. El polímero de la reivindicación 25, en el cual la combinación de poros proporciona una estructura uniforme de poros abiertos.
31. El polímero de la reivindicación 25, en el cual el polímero exhibe un módulo de tracción de 850 kPa o mayor.
32. Un método para suministro de fármacos que comprende introducir un fármaco contenido dentro de un polímero poroso de la reivindicación 25.
33. Un método para suministro de fármacos de acuerdo con la reivindicación 32, en el cual el fármaco es un factor de crecimiento contenido dentro de la estructura polímera de una perla de polímero que está contenida en el interior del polímero poroso.
34. Un método para construcción de tejidos que comprende introducir como una matriz para el tejido un polímero poroso de la reivindicación 25.
35. Un método para trasplante de células que comprende administrar una combinación de un polímero poroso de la reivindicación 25 y células para trasplante.
36. Un método para cultivo de células que comprende cultivar células en los poros de un polímero poroso de la reivindicación 25.
37. Un material polímero que comprende una sección de polímero poroso que comprende una matriz de polímero que contiene poros formados con transformación en espuma con gas y poros formados por lixiviación de un material particulado a partir del polímero y una sección de polímero impermeable conectada integralmente y en el cual el polímero es biocompatible.
38. El material polímero de la reivindicación 37, en el cual el polímero poroso tiene una estructura uniforme de poros abiertos y el polímero impermeable es del mismo material polímero pero sin una estructura de poros abiertos.
39. Un método para regeneración guiada de tejidos que comprende introducir en el lugar que requiere regeneración de tejido un material polímero de acuerdo con la reivindicación 37.
40. El material polímero de la reivindicación 37, en el cual el polímero poroso y el polímero impermeable son de material polímero diferente.
41. El polímero de la reivindicación 25 ó 37, que comprende adicionalmente un fármaco contenido en el interior de los poros del polímero poroso.
42. El polímero de la reivindicación 25 ó 37, que comprende adicionalmente células viables dentro de los poros del polímero poroso.
\newpage
43. El material polímero de la reivindicación 25 ó 37, que comprende adicionalmente células viables para regeneración de tejidos dentro de los poros de la sección de polímero poroso.
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