CN100447186C - 基质、细胞移植物以及制备和使用它们的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基于生物学相容性聚合物或聚合物混合物的多孔基质，涉及建立在所述基质之上的细胞移植物，以及基于肝细胞和胰岛细胞的细胞混合物的其他细胞移植物。本发明还涉及生产多孔基质的方法，涉及根据所述方法获得的基质，以及获得可用于接种可移植基质的细胞的特定方法。

Description

基质、细胞移植物以及制备和使用它们的方法

发明领域

本发明涉及基于生物耐受性聚合物或聚合物混合物的多孔基质，涉及建立于其上的细胞移植物，涉及基于由肝细胞和胰岛组成的细胞混合物的其它细胞移植物，涉及制备多孔基质的方法和使用该方法获得基质，并涉及获得用于接种可移植基质的细胞的特定方法。

技术背景

组织工程是一个跨学科领域，其将工程和材料科学与医学结合在一起。目标在于恢复受损组织或改善其功能。

组织工程的原理是极其简单的：首先从患者中取出一些细胞，并进行体外繁殖。然后将繁殖的细胞植入到构架物质中，结果形成一个完整的活组织替代物，将其再次移植到患者中。与传统的异体移植相反，传统的异体移植要求合适的供体，而且通常需要终身药物免疫抑制，本方法提供了能使用内源(自体)细胞的极其重要的优点。

所使用的构架物质(其在下文也称之为基质)的性质和构造对于移植物(能)被接纳的和能发挥功能的是特别重要的。除了待用的材料(通常也就是生物可降解聚合物)、孔径、孔隙度和表面之外，就如同孔型那样，孔壁形态以及孔间的连通度，对于被植入构架物质中的细胞的进一步发育、而且最终对于待再生的组织或器官的三维构造，都起到关键的作用。

对生产这种性质的生物基质的方法已经有所描述。因此，来自纺织领域的技术已经用于生产织造和非织造的纤维生物基质。另一种常见方法，是首先将盐晶体引进生物可降解聚合物，然后再溶出，这使得有可能通过盐颗粒的大小来控制孔径，并通过盐/聚合物比率来控制孔隙度(WO98/44027)。在一种修饰的方法中，将溶于溶剂中的生物可降解聚合物施加到称之为致孔材料的物质中，然后将所述致孔材料从复合材料中再次溶出，留下了具有所述致孔材料的负像形状的孔(WO 01/87575 A2)。涂层基质也已经有描述(参见，例如，WO 99/09149 A1)。

不过，迄今使用该法生产的生物基质不是在任何情况下都令人满意，尤其考虑到建立在这些基质上的移植物被接纳和发挥作用的能力。特别是，到目前为止使用肝和胰腺移植物还没有获得可接纳的器官替代物。

发明内容

本发明实现了实施本发明的潜在目的，即通过可使用特定方法获得的特殊生物材料和相应的移植物，提供了这样的功能性移植物。

本发明因此涉及本专利的权利要求中所限定的主题。

孔隙度是以基质总容积的分数％进行的数字描述，其表示为孔容积。

措词“孔”用于指存在于根据本发明的基质中的洞，而且，在本案中，其二维截面是具有多角的形状，尤其是八角形，和/或当从三维角度看时具有倾斜的形状。其形状还优选地以延伸为特征，从而洞的形状可与神经细胞的形状相当。孔径可通过直径描述，其是在二维截面中观察到的孔的最长和最短直径的平均值。

根据本发明的基质具有不同大小的孔，该大小分布(孔径分布)在特定范围内。根据本发明，对于基质来说具有宽的孔径分布是重要的。该分布应从大小范围为大约150μm的孔延伸到大小范围为大约300μm的孔，或比这更宽的范围。因此，根据一个方面，本发明的基质具有大小为150μm或更小的孔。具有大小为140μm或更小的孔的基质是优选的。具有大小为130μm或更小的孔的基质是尤其有利的。根据另一个方面，本发明的基质具有大小为300μm或更大的孔。具有大小为350μm或更大的孔的基质是优选的。具有大小为370μm或更大的孔的基质是尤其有利的。本发明包括既具有大小为150、140或130μm或更小的孔，又具有大小为300、350或370μm或更大的孔的基质。这些值可以任意方式组合以提供孔径分布得以延伸的最小范围，尤其要提及的是150到300、140到350以及130到370μm的范围。尤其优选的是具有150到300μm范围之外的频率最大值的给定孔径分布，即，一个频率最大值是高于300μm的孔径，而另一个频率最大值是低于150μm的孔径。

根据本发明的典型基质具有以下的孔径分布。大约0.5％到6％、优选大约1％到5％、甚至更优选大约2％到4％、尤其是大约3％的孔的平均直径在70到100μm的范围内；大约2％到8％、优选大约3％到7％、甚至更优选大约4％到6％、尤其是大约5％的孔的平均直径在101到115μm的范围内；大约2％到8％、优选大约3％到7％、甚至更优选大约4％到6％、尤其是大约5％的孔的平均直径为116到130μm的范围内；大约1％到7％、优选大约2％到6％、甚至更优选大约3％到5％、尤其是大约4％的孔的平均直径为131到300μm；大约11％到23％、优选大约13％到21％、甚至更优选大约15％到19％、尤其是大约17％的孔的平均直径为301到330μm的范围内；大约4％到10％、优选大约5％到9％、甚至更优选大约6％到8％、尤其是大约7％的孔的平均直径为331到360μm的范围内；大约5％到17％、优选大约7％到15％、甚至更优选大约9％到13％、尤其是大约11％的孔的平均直径为361到390μm的范围内；大约7％到19％、优选大约9％到17％、甚至更优选大约11％到15％、尤其是大约13％的孔的平均直径为391到420μm的范围内；大约3％到9％、优选大约4％到8％、甚至更优选大约5％到7％、尤其是大约6％的孔的平均直径为421到450μm的范围内；大约12％到24％、优选大约14％到22％、甚至更优选大约16％到20％、尤其是大约18％的孔的平均直径为451到480μm的范围内；和大约5％到17％、优选大约7％到15％、甚至更优选大约9％到13％、尤其是大约11％的孔的平均直径为481到510μm的范围内；因此，通常获得具有不止一个最大值的孔径分布，这对应于一组不止一个大小范围的孔。这对于根据本发明的基质的特性是尤其重要的。

洞容积进而是孔隙度，可通过孔隙率计以其本身已知的方式来进行测定。

例如，孔径进而是孔径分布，可通过扫描电子显微镜检进行测定。为此，制备待研究基质的薄切片并用金进行涂层。通过测量限定区域内的所有孔，即测定每个孔的最大和最小直径、确定两个值的总和并把该总和除以2，来对扫描电子显微镜照片进行评价。

术语“基质”指三维支持物，其适于为细胞所移殖。就此而言，基质可用作可为细胞或组织所移殖的三维模板。这种移殖可发生在体外或体内。此外，就移植而言，基质可用于定位移植物，而且也可用作逐渐在体内形成的组织的位置固定器。

聚合物原则上可以是能用于医学，尤其是移植医学领域的任何聚合物。因此，被宿主识别为异己、但是其排斥可通过合适的免疫抑制来进行抑制的聚合物也是生物学耐受性的。使用本质上不是生物学可降解的聚合物是可能的。不过，优选要属至少主要地是生物学可降解的聚合物。

术语“生物学可降解的”是指活有机体(或源于活有机体的体液或细胞培养物)能将其转化成代谢产物的材料。例如，生物学可降解聚合物包括可生物再吸收的和/或可生物侵蚀的聚合物。“可生物侵蚀的”指可溶解于或可悬浮于生物学液体中的能力。可生物再吸收指能被活有机体的细胞、组织或液体吸收的能力。

原则上，适于本发明的生物学可降解聚合物，包括可用于医学领域的任何聚合物，例如，除了在组织工程领域已经确立的聚合物之外，其中也包括在活性化合物释放装置如石膏和活性化合物移植物中已经确立的聚合物。

例如，合适的天然聚合物包括多肽，如白蛋白、纤维蛋白原、胶原质和明胶、以及多糖，如几丁质、壳聚糖、藻酸盐和琼脂糖。这些天然聚合物也可以适当地进行修饰，例如，蛋白质如胶原蛋白可以被交联。

例如，合适的合成聚合物包括特定的聚酸酐，尤其是聚(癸二酸-十六烷二酸)、聚(ε-己内酯)、聚(原酸酯)，并且特别是聚(α-羟基酯)如聚(羟基乙酸)、聚(乳酸)和聚(羟基乙酸-乳酸)。因此，根据本发明的基质和移植物优选基于含有式(I)的重复单元的生物学可降解聚合物：

其中，R是羟基或甲基。对于乳酸单元，L型(S对映体)是优选的。要提及的尤其优选的聚合物是聚(羟基乙酸-乳酸)，其中羟基乙酸与乳酸比以mol％计，为99∶1到1∶99，优选10∶90到90∶10，例如15∶85。

由两个或多个聚合物组成的混合物同样是有利的。

除了聚合物的性质，其分子量也决定了所得的基质的特性。一般而言适用的是，随着所采的聚合物的分子量增加，基质的孔隙度降低。这特别地适用于制备基质时材料起泡沫的情况，即在压力下与气体如CO₂一起添加材料，CO₂最初溶解于聚合物中而当压力降低时形成孔的情况。

另外，采用的聚合物的结晶度影响所得基质的性能。在这种情况中，适用的是，随着结晶度降低，所得基质的孔隙度通常增加，由于该原因，非晶态聚合物是优选的，对于高孔隙度的基质尤为如此。当制备基质期间，材料起泡沫的情况下，这方面也是尤其重要的。

本发明更进一步涉及这样的多孔基质，其基于生物学可降解聚合物，而且其特征在于基质的表面涂层有至少一种胞外基质蛋白。

胞外基质蛋白是众所周知的。本发明优选的胞外基质蛋白是胶原蛋白，尤其是I和IV型胶原蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白。这些蛋白质可以其本身已知的方法以纯化形式制备，或商购获得。根据一个实施方案，根据本发明基质的涂层包含纤连蛋白作为胞外基质蛋白。根据另一个实施方案，根据本发明基质的涂层包含I型胶原蛋白、层粘连蛋白和IV型胶原质的混合物作为胞外基质蛋白，在该情况中，优选的当属包含大约相等重量百分比的所述蛋白质的混合物。

根据本发明，尤其优选提供以上述方式进行涂层，并满足至少下述附加标准之一的基质：

-基质的孔表现出上文规定的孔径或孔径分布；

-孔隙度为93到98％；

-孔表现出上文规定的形式；

-生物学可降解聚合物是上文规定的天然或合成聚合物之一，尤其是聚(羟基乙酸-乳酸)，其中乳酸含量为大约85mol％，而羟基乙酸含量为大约15mol％。

例如，以这种方式涂层的基质可这样获得，即通过把未涂层的基质浸没于含有设计用于涂层的蛋白质或蛋白质混合物的溶液中，然后对已用溶液润湿的基质进行干燥。关于这一点，通常的情况是，根据待涂层基质体的尺寸，溶液润湿基质体的外层区域，然而，尤其是相当少的溶液渗入到基质体的内部。这可导致基质表面的整体没有均匀涂层，但是，相反，导致涂层密度从外向内逐步降低。

作为涂层的备选方案，或除涂层之外，生物学活性物质可吸收到聚合物中或甚至与聚合物连接。这些物质包括，例如，合成的活性化合物(无机或有机分子)，蛋白质，多糖和其它糖，脂类以及例如，影响细胞生长、细胞迁移、细胞***、细胞分化和/或组织生长、或具有治疗、预防或诊断作用的核酸。作为举例提及的生物学活性物质为血管活性化合物，神经活性化合物，激素，生长因子，细胞因子，类固醇，抗凝血剂，抗炎活性化合物，免疫调节活性化合物，细胞毒性活性化合物，抗生素和抗病毒活性化合物。

本发明还涉及一种用于制备多孔基质的方法，该多孔基质基于生物学耐受性聚合物或聚合物混合物，而且其特征在于将由具有限定粒径的聚合物颗粒和氯化钠颗粒组成的混合物挤压，然后将氯化钠溶出。

已经证实，粒径范围为大约20到950μm、有利地范围为大约20到760μm、而且尤其是范围为大约108到250μm的聚合物颗粒，和粒径范围为大约90到670μm、有利地范围为大约110到520μm、而且尤其是范围为大约250到425μm的氯化钠颗粒，对于确立所需的孔径或孔径分布是有利的。而且，已经证实，聚合物颗粒与氯化钠颗粒的重量比率范围为1∶100到1∶10、有利地范围为1∶50到1∶15、而且尤其是范围为1∶20到1∶18，对于确立所需的孔隙度是有利的。

更进一步证实了使用具有特定粒径分布的盐和聚合物是有利的。就用于制备基质的氯化钠而言，有利的是粒径为250到320μm的盐的含量为大约15％到50％，有利地为大约18％到42％，并优选为大约22％到28％；粒径为330μm到380μm的盐的含量为大约20％到65％，有利地为大约30％到52％，并优选为大约42％到46％；而粒径为390μm到425μm的盐的含量为大约15％到62％，有利地为大约25％到42％，并优选为大约29％到33％，其中百分值指的是用于制备的盐的总重量。这并不因此排除粒径高于和/或低于该指定范围的级分。

根据一个具体的实施方案，已经证实有利的是粒径为108μm到140μm的氯化钠颗粒的重量含量为1到15％重量，优选4到12％重量，尤其为7到9％重量，粒径为145μm到180μm的盐的含量为1到11％重量，优选3到9％重量，尤其为5到7％重量，粒径为185μm到220μm的盐的含量为3到21％重量，优选7到17％重量，尤其为10到14％重量，粒径为225μm到250μm的盐的含量为1到11％重量，优选3到9％重量，尤其为5到7％重量，粒径为250μm到320μm的盐的含量为15到50％重量，优选18到42％重量，尤其为22到28％重量，粒径为330μm到380μm的盐的含量为15到50％重量，优选18到42％重量，尤其为22到28％重量，粒径为390μm到425μm的盐的含量为5到29％重量，优选10到24％重量，尤其为15到19％重量。

就用于制备基质的聚合物而言，有利的是粒径为108μm到140μm的聚合物的含量为大约5％到50％，有利地为大约10％到30％，并且优选地为大约14％到18％；粒径为145μm到180μm的聚合物的含量为大约10％到55％，有利地为大约15％到40％，并且优选地为大约20％到24％；粒径为185μm到220μm的聚合物的含量为大约18％到88％，有利地为大约32％到76％，并且优选地为大约43％到49％，而粒径为225μm到250μm的聚合物的含量为大约5％到45％，有利地为大约10％到28％，并且优选地为大约14％到18％，其中百分值指的是用于制备的聚合物的总重量。

为了获得所需粒径分布的盐和/或聚合物颗粒，通常有利的是首先粉碎商业可获得的产品。这可在传统用于该目的的装置如挤压***或研磨机中实现。不过，对于所需粒径分布起决定性作用的是使用传统的分析筛选进行的后续筛选。

挤压优选通过压力的作用来实现。为此，聚合物/氯化钠混合物可在常规水压下以大约780psi到1450psi，有利地以大约840psi到大约1230psi，尤其是900psi到1100psi的冲压进行挤压。已经证实有利的是允许该压力作用大约10s到360s，有利地为大约40s到180s，尤其是大约50s到70s，温度在18℃到25℃的范围内。

例如，使用水或水溶液，将氯化钠溶出。首先，被挤压的混合物(基质坯)可以浸泡大约12h到80h，有利地为大约12h到62h，尤其是大约36h到60h。

更有利的是在将氯化钠溶出之前，将被挤压的混合物最初贮存于CO₂气体中。因此，例如，已经证实被挤压的混合物在大约140psi到1650psi，有利地大约360psi到1120psi，尤其是800psi到900psi的CO₂压力下进行充气，进行时间为大约1h到180h，有利地大约3h到60h，尤其是大约12h到36h，在这点上是有利的。之后减小压力，其中压力降低的速度对孔的形成有影响。虽然优选使用CO₂，其它的气体，如空气、氮气、氦气、氖气、氪气、氩气、氙气或氧气同样是合适的。随后，为了干燥起见，将水或水溶液以其本身已知的方法除去。为了达到该目的，基质可例如置于吸水纸上。

根据一个优选的实施方案，将聚合物溶液添加到由聚合物颗粒和氯化钠颗粒组成的混合物中，在进行挤压之前，除去溶剂。关于这一点，聚合物颗粒和聚合物溶液可基于相同的聚合物。不过，聚合物也可以是不同的聚合物，尤其是具有不同生物学可降解性的聚合物。使用所述聚合物溶液的优点是，能有效支撑支柱的物质在基质中是直立的，这使得改善基质的机械性能成为可能。尤其，这种性质的基质表现出了较低的破碎倾向。

使用的溶剂应当溶解聚合物而不是盐。这确保了盐的致孔特性不受影响，或者仅仅可忽略不计地受影响。例如，丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、六氟异丙醇、氯代及氟代的脂肪烃和芳香烃、四氢呋喃、乙基甲基酮、二乙基甲酮及其混合物，适于溶解上述聚合物。氯仿尤其适于溶解聚(羟基乙酸)，聚(乳酸)或聚(羟基乙酸-乳酸)，而且从医学应用的角度而言也是适合的。

混合聚合物溶液与聚合物颗粒/盐颗粒混合物，最初形成了流动的糊状物，然后随着溶剂的去除迅速变成为固体。一方面，选择溶液中聚合物的浓度，从而聚合物能完全被溶解是有利的，另一方面，可以迅速地除去溶剂，而聚合物颗粒没开始任何显著程度的溶解。

已经证实聚合物与溶解的聚合物重量比为10∶1到1∶100，有利的为2∶1到1∶25，尤其是为1∶1到1∶10是有益的。

就聚合物颗粒与氯化钠颗粒的重量比而言，在该实施方案的环境下，有可能选择就氯化钠而言较高的重量比，即高达1∶200，1∶500或1∶1000，而总聚合物与氯化钠的重量比仍然高于1∶100。这样，有可能获得高于98％的孔隙度。

在上文所述的方法中，氯化钠用作致孔材料，作为定义，其应理解为是固体的、或至少是半固体的材料，该材料最初与形成基质的聚合物混合以产生混合物，然后从混合物中除去，导致洞(孔)的形成。为此，有利的是致孔材料能溶于至少一种溶剂，而且基本上不溶于至少一种另外的溶剂。尤其是在处理条件下，即通常在18℃到25℃的温度范围下，在大气压下，当低于30％重量，优选低于20％重量，尤其低于10％重量，例如，低于5、4、3、2和1％重量可溶时，该材料基本上是不溶的。

所得基质的结构和特性，基本上是由制备它们的致孔材料决定的。关于这一点，不仅致孔材料的性质是重要的，而且，特别地，致孔颗粒的粒径分布也是重要的。因此，通常适用的是，不仅孔径，而且连通度，即彼此连接的洞的网络，都随着粒径增大而增大。该网络，其也被称之为大型结构或大孔结构，应当与通过起泡沫形成的孔区别开来，后者通常是封闭的孔，并因此形成命名为微型结构或微孔结构的结构。

本发明因此也涉及用于制备基于生物学耐受性聚合物或聚合物混合物的多孔基质的方法，其特征在于挤压由聚合物颗粒、致孔材料颗粒和聚合物溶液组成的混合物，然后使致孔材料溶出。

该方法原则上不限于前面所述的特征。因此，聚合物可选自聚酸酐，聚(原酸酯)，聚(α-羟基酯)，聚(酯酰胺)，聚酰胺，聚醚酯，聚碳酸酯，聚亚烷基，聚亚烷基二醇，聚环氧烷，聚对苯二甲酸乙二醇酯，聚乙烯醇，聚乙烯醚，聚乙烯酯，聚卤乙烯，聚乙烯吡咯烷酮，聚硅氧烷，聚苯乙烯，聚氨基甲酸酯，衍生的纤维素和(甲基)丙烯酸聚合物以及共聚物。而致孔材料优选选自水溶性盐，例如氯化钠，氯化钾，氟化钠，氟化钾，碘化钠，碘化钾，硝酸钠，硫酸钠，柠檬酸钠，酒石酸钠，糖(例如，蔗糖，果糖和葡萄糖)及其混合物，所述材料也可选自蜡质物质如石蜡，蜂蜡等等。原则上，聚合物、致孔材料和用于形成溶液的溶剂应当彼此匹配，从而所述溶液含有溶解形式的聚合物和固体形式的聚合物颗粒，以及基本上保持不溶解的致孔材料。

使用上述方法可获得的基质同样也是本发明的主题部分。

本发明还涉及包含至少一种上述基质和至少一种细胞的移植物。关于这一点，根据移植物的目的，细胞尤其可选自肝细胞，胰腺细胞，脂肪细胞，肠细胞，皮肤细胞，血管细胞，神经细胞，肌肉细胞，甲状腺细胞和牙根细胞。根据本发明移植物的具体实施方案涉及肝细胞和胰腺细胞。

本发明进一步涉及包含至少一种基于生物学耐受性聚合物和至少两种细胞类型的细胞的移植物，其中第一种细胞类型的细胞是肝细胞，而第二种细胞类型的细胞是胰岛细胞。该主题不局限于上述基质，也即基于根据本发明基质的移植物。

根据移植物的目的，也即，尤其是要实现的功能，肝细胞与胰岛细胞的特定比例是有利的。因此，本发明的一个实施方案涉及这样的移植物，其在移植后，表现出等效胰腺器官的内分泌特性。已经证实，肝细胞与胰岛细胞的比例大约为10⁶∶3000对于此目的是有利的。本发明的另一个实施方案涉及这样的移植物，其在移植后，执行肝脏的代谢功能。已经证实，肝细胞与胰岛细胞的比例为大约10⁶∶3-200，有利地为10⁶∶10-200，特别地为10⁶∶20-80，尤其优选大约10⁶∶35-45，对于此目的是有利的。

应当注意，这种移植物通常含有除肝细胞和胰岛细胞以外的其它细胞，具体地也就是，与细胞分离相关的相伴增长的其它肝细胞和胰腺细胞。

用于移殖根据本发明基质的细胞或细胞混合物，可由其本身已知的方法获得。为了产生自体同源的移植物的目的，细胞优选得自待***移植物的个体。因此，合适的组织，例如肝或胰腺的部分，通常取自该个体，并以合适的方式制备，用于体外接种和培养基质。关于这一点，细胞表现出尽可能高的活力比例是重要的。

如果肝细胞是从肝组织获得的，应该考虑肝细胞被一层厚的***层包围的事实，尤其是在肝硬化的情况中。根据本发明，使用具有确定成分的溶液，以便能分离含有尽可能高比例的活力细胞的肝细胞。

本发明因此涉及一种含水组合物A，其含有NaCl、KCl和HEPES，而且pH为大约7.4，并且涉及其用于灌注肝或胰腺部分的用途。特别地，1000ml这种溶液含有大约8.3g NaCl，0.5g KCl和2.38g HEPES。优选以大约37℃的温度，大约30ml/min的流速进行灌注。几分钟，尤其是大约5到10分钟，例如大约7分钟，对于以上述流速充分灌输组织部分是足够的。

可选择地，也有可能使用含有乙二醇四乙酸(EGTA)的含水组合物A’用于灌注肝或胰腺部分。

本发明更进一步涉及含水组合物B，其pH为大约7.3到7.4，优选大约7.35，而且含有NaCl、KCl、HEPES、CaCl₂、胶原酶和胰蛋白酶抑制剂，还涉及它用于灌注肝或胰腺部分的应用。1000ml的这种溶液优选含有8.3g NaCl，0.5g KCl和2.38g HEPES，0.7g CaCl₂×2H₂O，500mg胶原酶H和7.5mg胰蛋白酶抑制剂。在该情况中，以大约37℃和大约30ml/min的流速进行灌输也证实是有利的。几分钟，尤其是大约5到10分钟，例如大约6到7分钟，对于充分灌输组织部分是足够的。

可选择地，有可能使用含有胶原酶和透明质酸酶的含水组合物B’，用于灌输肝或胰腺部分。1000ml的该溶液优选含有5到10U的胶原酶/ml以及5到10U的透明质酸酶/ml。

如果组织部分最初用组合物A处理，然后用组合物B进行处理，那么对于分离有活力的细胞是有利的。可选择地，有可能最初使用组合物A’，然后使用组合物B’。

继灌输开始之后，则可以对组织部分进行切割，并小心地在合适的培养基，例如Willams培养基E中进行振荡(培养)。如果得到的细胞悬液仍然含有相对大粒的细胞碎片，可由其本身已知的方法，例如通过尼龙网(200μm)过滤细胞悬液，来除去该细胞碎片。然后小心沉淀滤液中的细胞，就此而言于4℃以50g离心3分钟证实是有利的。

将分离的细胞以其本身已知的方法装载到基质上。通常，把细胞作为含有细胞的溶液装载到基质上，然后通常在细胞培养条件下，对细胞和基质进行孵育，直到细胞附着到基质上。如果不止一种细胞类型例如肝细胞和胰岛细胞被装载到基质上，原则上不同的细胞类型可以一起装载，否则就相继进行装载。根据一个具体的实施方案，首先装载胰岛细胞，接着装载肝细胞，在每种情况中，装载之后都进行孵育，直到至少一部分细胞附着到基质上。

根据本发明的基质和移植物显示了至关重要的优点。因此，该内部尺寸使基质能有效地为细胞所移殖。一方面，基质可自由地模压，而另一方面，其提供了足够经受外科移植操作和抵抗作用于移植位点的机械应力的稳定性和刚性。移植之后开始的最初的细胞破坏是有限的，而且，短时间之后，移植组织能呈现预期的功用。移植之后不久，血管或血管丰富的肉芽组织，以及神经组织，开始增殖到移植物中。可以不必使用生理学有毒的溶剂，例如甲醛，来制备根据本发明的基质，这意味着不需要特殊的方法来消除溶剂，而且没有这些残量溶剂的残留的危险。

根据本发明的基质和移植物具有许多不同的可能用途。尤其可提及的是用于医学领域的用途。本发明因此也涉及用于治疗用途的根据本发明的基质和移植物。

本领域的特殊用途是合成组织(组织工程)。在该情况中，根据本发明的基质多多少少地可用作细胞迁移到其中和/或细胞附着于其上的支架。

为此，例如，基质可在体外接种所需的细胞，即用含细胞的溶液进行处理，并进行孵育直到细胞已经附着于基质上。然后可以对这种基质连同附着于其上的细胞(这里称为移植物)，进行进一步的操作步骤，例如，进行进一步培养(适当的时候在活性化合物的影响下培养，例如，为了进一步扩增细胞或修饰它们的特性)，和/或贮存(例如贮存于冰上或标准条件下的生物流反应器(bioflow reactor)中)直到以合适的方法进行移植。在该用途的环境下，有利的是最初分离，而且，适当的时候，也能体外扩增旨在用于移植的细胞。特别地，这因此使得有可能把不同的细胞类型，如上面所述的肝细胞以及胰岛细胞一起施用于基质。

作为体外接种的代替，另一种可能性是移植基质(没有任何事先的细胞附着)，其目标是引入前体细胞，该前体细胞能进行组织再生，以迁移到受伤的组织中并在已经丧失组织的地方再生组织。为此，基质必须进行设置，以便所需的细胞，而不是不想要的细胞，能迁移到基质中。这种用途通常描述为引导组织再生(GTR)。

因此，根据本发明的基质或根据本发明的移植物可用于治疗人类或动物体。为此，通过外科干预，将一种或多种基质，或一个或多个移植物，引入到待治疗的机体中。如果移植物包含具有器官功能的细胞，或者如果具有器官功能的细胞，将会迁移到基质中，例如，正如肝细胞或胰岛细胞的情况，则可以例如将基质或移植物移植到待治疗个体的肠系膜、皮下组织、腹膜后、腹膜前空间(properitoneal space)或肌肉空间。

原则上，需要合适的组织替换的任何个体，都可用根据本发明的基质或移植物进行治疗。这些个体通常是正患有特定的紊乱或疾病的个体，该紊乱或疾病的病程涉及功能性组织的丧失。这有可能潜在地影响整个器官，例如肝或胰腺。因此，本发明尤其涉及治疗导致慢性肝或胰腺衰竭的疾病。这些疾病包括，例如，成人的慢性肝炎和胆硬化，以及儿童的胆硬变和先天性代谢缺陷。肝移植也适于肝癌的情况。另一方面，胰腺移植尤其适于所有形式的糖尿病，尤其是I型或II糖尿病的情况。

本发明因此也涉及根据本发明的基质或根据本发明的移植物使得对个体进行移植的治疗剂可获得的用途，在这点上，尤其是用于治疗正经受至少部分丧失将要被移植物代替的功能性组织的个体。

下面的实施例是为了解释本发明的目的，而不是为了限制其范围。

实施例1

制备基质

a)无聚合物溶液

聚合物颗粒(RG 858，获自Boehringer，Ingelheim)，冷冻于液氮中，并在冷冻状态下进行破碎(

挤压***；12000rpm，2min)。对破碎的聚合物颗粒进行筛选。大小为108μm到250μm的颗粒用于制备基质。在这点上，采用的16％重量的聚合物，颗粒大小为108μm到140μm之间，而采用的22％重量的聚合物，颗粒大小为145μm到180μm之间，采用的46％重量的聚合物，颗粒大小为185μm到220μm之间，而且采用的16％重量的聚合物，颗粒大小为225μm到250μm之间。筛选氯化钠(普通盐)，粒径为250μm到425μm的氯化钠颗粒用于制备基质。在这点上，采用的25％重量的盐，颗粒大小为250μm到320μm之间，采用的44％重量的盐，颗粒大小为330μm到380μm之间，采用的31％重量的盐，颗粒大小为390μm到425μm之间。760mg氯化钠颗粒和40mg聚合物颗粒彼此进行混合。把混合物引入到冲孔冲模中，并用水压机以1000psi的冲压，冲压1分钟。之后，将基质坯置于聚四氟乙烯(Teflon)平板上，并在CO₂气中(850psi)充气24小时。然后把坯浸泡24小时以便溶出包含的盐粒。最后，将基质在吸水纸上干燥12小时。

得到的聚合物基质的孔隙度为95±2％，和250μm±120μm的确定孔径，这是通过扫描电子显微镜检确定的。

b)有聚合物溶液

对氯化钠(分析纯)进行研磨(

挤压***；12000rpm，2min)，然后进行筛选，并利用粒径为108到425μm的氯化钠颗粒制备基质。在这点上，采用的8％重量的盐，颗粒大小为108μm到140μm之间，而采用的6％重量的盐，颗粒大小为145μm到180μm之间，采用的12％重量的盐，颗粒大小为185μm到220μm之间，采用的6％重量的盐，颗粒大小为225μm到250μm之间，采用的重量为25％的盐，颗粒大小为250μm到320μm之间，采用的重量为26％的盐，颗粒大小为330μm到380μm之间，采用的重量为17％的盐，颗粒大小为390μm到425μm之间。将96g氯化钠颗粒与1g聚合物颗粒(实施例1a中描述的)进行混合，然后用100ml含有4g溶解形式的聚合物的氯仿溶液进行处理。以这种方式获得的混合物，于45℃到65℃加热，导致氯仿在大约25分钟内蒸发。剩余的盐/聚合物混合物然后用水压机以1000psi的冲压进行冲压1分钟，接着浸泡24小时以便溶出包含的盐粒。如上所述，然后对基质进行充气，最后在吸水纸上干燥12小时。

得到的聚合物基质的孔隙度为96％。

如果将98.5g盐颗粒与0.5g聚合物颗粒进行混合，且混合物用100ml含有1g聚合物的氯仿溶液进行处理，则可获得孔隙度为99％的基质。

如果将99.2g盐颗粒与0.1g聚合物颗粒进行混合，且该混合物用含有大约0.9g聚合物的氯仿溶液进行处理，则可获得孔隙度为99％的聚合物基质。

实施例2

a)用纤连蛋白对基质进行涂层

将来自实施例1的基质浸没于碳酸盐缓冲溶液中，其含有3μg人血浆来源的纤连蛋白(Sigma)/ml，而且其pH为9.4。大约60s之后，把基质从溶液中取出来，冻干并进行γ射线灭菌。

实施例3

细胞分离

以其本身已知的方法，从待移植的个体取出一部分肝。取出的肝部分首先于37℃以30ml/min的流速用溶液(8.3g NaCl；0.5g KCl；2.38gHEPES；用蒸馏水补至1000ml，pH 7.4)灌注7分钟。肝部分然后于37℃以30ml/min的流速用胶原酶/胰蛋白酶抑制剂溶液(8.3g NaCl；0.5gKCl；2.38g HEPES；0.7g CaCl₂×2H₂O；500mg胶原酶(胶原酶H，Boehringer Mannheim，曼海姆，德国)；7.5mg胰蛋白酶抑制剂(ICN，Eschwege，德国)；用蒸馏水补至1000ml，pH 7.35)灌注另外的6到7分钟。灌输结束之后，对肝部分进行切割，并在Willams培养基E中小心震荡培养。过滤细胞悬液(尼龙网，200μm)，然后用Willams培养基E进行洗涤。之后，细胞于4℃50g离心3分钟。细胞的活力为95％，这是使用锥虫蓝(Tryptan Blue)测定的。

以同样的方法从胰腺部分分离胰岛细胞。

实施例4

细胞移殖

第一步，将在实施例2中涂层的基质，与如实施例3中所述的分离的胰岛细胞一起孵育。

为此，将3000个胰岛细胞/ml悬浮于由M199和FCS组成的溶液混合物(体积比为19∶1)中。通过在倒置的Olympus显微镜下，在0.25mm计数管中，对细胞进行计数来确定细胞数。然后使用移液管将8ml到10ml的这种溶液施加于基质中。弃去未保留在基质中的过量溶液。然后将业已由这种方式处理过的基质置于细胞培养孵育器中4小时，以允许细胞粘附。然后将由Williams培养基E组成的溶液施加到基质中，其每ml含有包含大约5.0×10⁷活肝细胞和大约1.0×10⁶非实质(non-perenchymatous)肝细胞的未纯化肝细胞悬液。使用移液管装载8ml到12ml的溶液，弃去未被基质吸收的过量溶液。在移植之前，基质可以在冰上保持大约1.5小时。如果计划稍后的时间进行移植，基质可在标准条件下，在生物流反应器(bioflow reactor)中贮存长达5天。

实施例5

肝细胞的分泌活性和增殖速率

Lewis大鼠用实施例4中所述的移殖了细胞的基质进行移植。在不同的时间从该动物中再次取出移植物，并进行形态测量学检测。表现出直径为15mm、厚度为2mm的圆盘形状的移植物中的细胞数，在移植后1、6、12个月分别是94×10³、140×10³和146×10³。来自移植后1个月取出的移植物的肝细胞，表现出白蛋白的正常表达。在所有的制备物中都发现了正在增殖中的肝细胞，而在增殖速率方面不存在任何病理学增大。业已根据本发明移植的肝细胞，与标准的肝制备物相比，表现出BrdU的掺入增强3倍。

实施例6

血管形成

对实施例4中所述的基质进行的进一步研究表明，这些基质在移植后仅仅一个月，就已显著良好地形成了血管。血管肉眼可见地延伸到基质，而且作为充分毛细管形成的结果，移植的肝细胞和胰岛细胞实现了与移植受体的心脏血管***的接触。

可进一步地观察到，共移植的胰岛细胞在受体中没有引起任何的低血糖症。这些细胞的内分泌性能，以及受体自身的胰岛细胞的内分泌性能，据推测受到反馈机制的调节。

实施例7

肝功能的过继

Gunn大鼠认为是人类Grigler-Najar(克纳二氏)综合症的动物模型，这是因为，作为特定先天性代谢酶缺陷的结果，它们的肝不能充分地结合胆红素。结果，未结合的胆红素的毒性血浆水平，作为重大的间接损害而导致死亡。

3只Gunn大鼠用实施例4中所述的移殖了细胞的基质进行移植。基质的外面积总计为10cm²。

实验动物的胆红素水平在移植之后仅仅4周就降低了。胆红素从现在开始被结合。在所有的3种情况中，使用胆管探针，可以检测仍然存在的肝脏胆管中结合的胆红素。结果，基质中结合的胆红素，造血性地到达肝，而且可以通过胆管***自肝中消除。

实施例8

人类患者

将如实施例4中所述的移殖了细胞的基质移植到正患有明显的肝硬化患者的腹腔中。下表1总结了移植之前的患者实验调查结果。

表1

参数	患者1
		GOT	27
GPT	35
		gGt	89
血清白蛋白	2421
		CHE	24.1

给予患者1(乙基毒性肝硬化，以前代谢失调过数次，现在不是活跃的)4个基质(每例为124mm×45mm×5mm)。

下表2分别概括了移植后3、10和20周的肝值。

表2

Claims (37)

1、一种基于生物学耐受性聚合物或聚合物混合物的多孔基质，其特征在于该基质具有大小为130μm或更小的孔，以及大小为370μm或更大的孔，而且孔隙度为93到98％，其中所述基质通过挤压聚合物颗粒和氯化钠颗粒的混合物，然后将氯化钠溶出而获得。

2、如权利要求1所述的基质，其特征在于所述基质中0.5％到6％的孔的平均直径范围为70到100μm；2％到8％的孔的平均直径范围为101到115μm；2％到8％的孔的平均直径范围为116到130μm；1％到7％的孔的平均直径范围为131到300μm；11％到23％的孔的平均直径范围为301到330μm；4％到10％的孔的平均直径范围为331到360μm；5％到17％的孔的平均直径范围为361到390μm；7％到19％的孔的平均直径范围为391到420μm；3％到9％的孔的平均直径范围为421到450μm；12％到24％的孔的平均直径范围为451到480μm；且5％到17％的孔的平均直径范围为481到510μm。

3、如权利要求1所述的基质，其特征在于所述基质中1％到5％的孔的平均直径范围为70到100μm；3％到7％的孔的平均直径范围为101到115μm；3％到7％的孔的平均直径范围为116到130μm；2％到6％的孔的平均直径范围为131到300μm；13％到21％的孔的平均直径范围为301到330μm；5％到9％的孔的平均直径范围为331到360μm；7％到15％的孔的平均直径范围为361到390μm；9％到17％的孔的平均直径范围为391到420μm；4％到8％的孔的平均直径范围为421到450μm；14％到22％的孔的平均直径范围为451到480μm；且7％到15％的孔的平均直径范围为481到510μm。

4、如权利要求1所述的基质，其特征在于所述基质中2％到4％的孔的平均直径范围为70到100μm；4％到6％的孔的平均直径范围为101到115μm；4％到6％的孔的平均直径范围为116到130μm；3％到5％的孔的平均直径范围为131到300μm；15％到19％的孔的平均直径范围为301到330μm；6％到8％的孔的平均直径范围为331到360μm；9％到13％的孔的平均直径范围为361到390μm；11％到15％的孔的平均直径范围为391到420μm；5％到7％的孔的平均直径范围为421到450μm；16％到20％的孔的平均直径范围为451到480μm；且9％到13％的孔的平均直径范围为481到510μm。

5、如权利要求1所述的基质，其特征在于所述基质中3％的孔的平均直径范围为70到100μm；5％的孔的平均直径范围为101到115μm；5％的孔的平均直径范围为116到130μm；4％的孔的平均直径范围为131到300μm；17％的孔的平均直径范围为301到330μm；7％的孔的平均直径范围为331到360μm；11％的孔的平均直径范围为361到390μm；13％的孔的平均直径范围为391到420μm；6％的孔的平均直径范围为421到450μm；18％的孔的平均直径范围为451到480μm；且11％的孔的平均直径范围为481到510μm。

6、如权利要求1至5中任一项所述的基质，其特征在于所述生物学耐受性聚合物为选自如下的生物学可降解聚合物：天然聚合物以及合成聚合物。

7、如权利要求6所述的基质，其特征在于所述生物学可降解聚合物选自白蛋白、纤维蛋白原、胶原蛋白、明胶、几丁质、壳聚糖、琼脂糖、藻酸盐。

8、如权利要求6所述的基质，其特征在于所述生物学可降解聚合物选自聚酸酐、聚(ε-己内酯)和聚(α-羟基酯)。

9、如权利要求6所述的基质，其特征在于该生物学可降解聚合物是乳酸含量为85mol％，羟基乙酸含量为15mol％的聚(羟基乙酸-乳酸)。

10、如权利要求1至5中任一项所述的多孔基质，其特征在于所述基质的表面用至少一种选自如下的胞外基质蛋白进行涂层：胶原蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白。

11、如权利要求10所述的基质，其特征在于所述涂层含有I型胶原蛋白、层粘连蛋白和IV型胶原蛋白的混合物。

12、一种制备如权利要求1至11中任一项所定义的基于生物学可降解聚合物或聚合物混合物的多孔基质的方法，其特征在于将聚合物颗粒的混合物与氯化钠颗粒的混合物挤压，然后将氯化钠溶出，其中所述氯化钠颗粒混合物包含重量为15到50％的粒径为250μm到320μm的颗粒，重量为20到65％的粒径为330到380μm的颗粒，以及重量为15到62％的粒径为390μm到425μm的颗粒；或者所述氯化钠颗粒混合物包含重量为1到15％的粒径为108μm到140μm的颗粒，重量为1到11％的粒径为145μm到180μm的颗粒，重量为3到21％的粒径为185μm到220μm的颗粒，重量为1到11％的粒径为225μm到250μm的颗粒，重量为15到50％的粒径为250μm到320μm的颗粒，重量为15到50％的粒径为330μm到380μm的颗粒，以及重量为5到29％的粒径为390μm到425μm的颗粒；而聚合物颗粒混合物包含重量为5到50％的粒径为108μm到140μm的颗粒，重量为10到55％的粒径为145μm到180μm的颗粒，重量为18到88％的粒径为185μm到220μm的颗粒，以及重量为5到45％的粒径为225μm到250μm的颗粒。

13、如权利要求12所述的方法，其特征在于所述氯化钠颗粒混合物包含重量为18到42％的粒径为250μm到320μm的颗粒，重量为30到52％的粒径为330到380μm的颗粒，以及重量为25到42％的粒径为390μm到425μm的颗粒；或者所述氯化钠颗粒混合物包含重量为4到12％的粒径为108μm到140μm的颗粒，重量为3到9％的粒径为145μm到180μm的颗粒，重量为7到17％的粒径为185μm到220μm的颗粒，重量为3到9％的粒径为225μm到250μm的颗粒，重量为18到42％的粒径为250μm到320μm的颗粒，重量为18到42％的粒径为330μm到380μm的颗粒，以及重量为10到24％的粒径为390μm到425μm的颗粒；而聚合物颗粒混合物包含重量为10到30％的粒径为108μm到140μm的颗粒，重量为15到40％的粒径为145μm到180μm的颗粒，重量为32到76％的粒径为185μm到220μm的颗粒，以及重量为10到28％的粒径为225μm到250μm的颗粒。

14、如权利要求12所述的方法，其特征在于所述氯化钠颗粒混合物包含重量为22到28％的粒径为250μm到320μm的颗粒，重量为42到46％的粒径为330到380μm的颗粒，以及重量为29到33％的粒径为390μm到425μm的颗粒；或者所述氯化钠颗粒混合物包含重量为7到9％的粒径为108μm到140μm的颗粒，重量为5到7％的粒径为145μm到180μm的颗粒，重量为10到14％的粒径为185μm到220μm的颗粒，重量为5到7％的粒径为225μm到250μm的颗粒，重量为22到28％的粒径为250μm到320μm的颗粒，重量为22到28％的粒径为330μm到380μm的颗粒，以及重量为15到19％的粒径为390μm到425μm的颗粒；而聚合物颗粒混合物包含重量为14到18％的粒径为108μm到140μm的颗粒，重量为20到24％的粒径为145μm到180μm的颗粒，重量为43到49％的粒径为185μm到220μm的颗粒，以及重量为14到18％的粒径为225μm到250μm的颗粒。

15、如权利要求12至14中任一项所述的方法，其特征在于聚合物颗粒与氯化钠颗粒的重量比为1∶20到1∶18。

16、如权利要求12所述的方法，其特征在于将聚合物溶液添加到由聚合物颗粒与氯化钠颗粒组成的混合物中，并在挤压之前除去溶剂。

17、如权利要求16所述的方法，其特征在于所述溶剂溶解聚合物但不能溶解盐。

18、如权利要求17所述的方法，其特征在于所述溶剂选自丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、六氟异丙醇、氯代及氟代的脂肪烃和芳香烃、四氢呋喃、乙基甲基酮、二乙基甲酮及其混合物。

19、如权利要求18所述的方法，其特征在于聚合物是聚(羟基乙酸)、聚(乳酸)或聚(羟基乙酸-乳酸)，而溶剂为氯仿。

20、如权利要求16所述的方法，其特征在于聚合物颗粒与溶解的聚合物的重量比为1∶1到1∶10。

21、如权利要求12所述的方法，其特征在于挤压通过压力作用实现。

22、如权利要求12所述的方法，其特征在于为了溶出氯化钠的目的，令水作用于被挤压的混合物。

23、如权利要求22所述的方法，其特征在于再次除去水。

24、如权利要求12所述的方法，其特征在于首先将被挤压的混合物贮存于CO₂气体中，而随后将氯化钠溶出。

25、如权利要求12-14或16-24中任一项所述的方法，其特征在于将由聚合物颗粒、氯化钠颗粒和聚合物溶液组成的混合物进行挤压，然后将氯化钠溶出。

26、如权利要求25所述的方法，其特征在于所述聚合物选自聚酸酐、聚(原酸酯)、聚(α-羟基酯)、聚(酯酰胺)、聚酰胺、聚醚酯、聚碳酸酯、聚亚烷基、聚亚烷基二醇、聚环氧烷、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚卤乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚硅氧烷、聚苯乙烯、聚氨基甲酸酯、衍生的纤维素和(甲基)丙烯酸聚合物以及共聚物。

27、如权利要求25所述的方法，其特征在于所述溶液含有溶解形式的聚合物和固体形式的聚合物颗粒。

28、如权利要求25所述的方法，其特征在于所述溶液不能溶解氯化钠。

29.如权利要求15所述的方法，其特征在于将由聚合物颗粒、氯化钠颗粒和聚合物溶液组成的混合物进行挤压，然后将氯化钠溶出。

30、如权利要求29所述的方法，其特征在于所述聚合物选自聚酸酐、聚(原酸酯)、聚(α-羟基酯)、聚(酯酰胺)、聚酰胺、聚醚酯、聚碳酸酯、聚亚烷基、聚亚烷基二醇、聚环氧烷、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚卤乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚硅氧烷、聚苯乙烯、聚氨基甲酸酯、衍生的纤维素和(甲基)丙烯酸聚合物以及共聚物。

31、如权利要求29所述的方法，其特征在于所述溶液含有溶解形式的聚合物和固体形式的聚合物颗粒。

32、如权利要求29所述的方法，其特征在于所述溶液不能溶解氯化钠。

33、一种能够使用权利要求12至32中任一项的方法获得的基质。

34、一种移植物，其含有如权利要求1至11或33中任一项所述的基质，和至少一种细胞。

35、如权利要求34所述的移植物，其含有基于生物学耐受性聚合物的基质，和至少两种细胞类型的细胞，其特征在于第一种细胞类型的细胞是肝细胞，而第二种细胞类型的细胞是胰岛细胞。

36、如权利要求35所述的移植物，其特征在于肝细胞与胰岛细胞的比例为10⁶∶3000。

37、如权利要求35所述的移植物，其特征在于肝细胞与胰岛细胞的比例为10⁶∶3-200。