ES2201059T5 - Regeneracion y reparacion de nervios inducida por morfogenos. - Google Patents
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Abstract
SE PRESENTAN METODOS TERAPEUTICOS DE TRATAMIENTO, COMPOSICIONES Y DISPOSITIVOS PARA MANTENER LOS CAMINOS NEURONALES EN UN MAMIFERO, QUE INCLUYEN LA MEJORA DE LA SUPERVIVENCIA DE LAS NEURONAS CON RIESGO DE MORIR, LA INDUCCION DE REPARACION CELULAR DE NEURONAS DAÑADAS Y DE LOS CAMINOS NEURONALES, Y LA ESTIMULACION DE LAS NEURONAS PARA MANTENER SU FENOTIPO DIFERENCIADO. EN UNA CONFORMACION, LA INVENCION SUMINISTRA MEDIOS PARA ESTIMULAR LA EXPRESION DE CAM EN LAS NEURONAS. LA INVENCION TAMBIEN SUMINISTRA MEDIOS PARA EVALUAR EL ESTADO DEL TEJIDO NERVIOSO, INCLUYENDO MEDIOS PARA DETECTAR Y MONITORIZAR NEUROPATIAS EN UN MAMIFERO. LOS METODOS, DISPOSITIVOS Y COMPOSICIONES INCLUYEN UN AGENTE ESTIMULANTE DE MORFOGENO ADMINISTRADO AL MAMIFERO EN UNA CONCENTRACION TERAPEUTICAMENTE EFECTIVA.
Description
Regeneración y reparación de nervios inducida
por morfógenos.
La presente invención se refiere al uso de
morfógenos como se define en las revindicaciones. La invención
también proporciona un dispositivo.
El sistema nervioso de los mamíferos comprende
un sistema nervioso periférico (SNP) y un sistema nervioso central
(SNC, que comprende el cerebro y la médula espinal), y está
compuesto por dos clases principales de células: neuronas y células
neuroneurogliales. Las células neuroneurogliales rellenan los
espacios entre las neuronas, nutriéndolas y modulando su función.
Ciertas células neuroneurogliales, tales como las células de
Schwann en el SNP y los oligodendrocitos en el SNC, también
proporcionan una vaina mielínica protectora que rodea y protege a
los axones neuronales, que son las prolongaciones que se proyectan
desde el cuerpo de la célula neuronal y a través de las cuales son
conducidos los impulsos eléctricos de la neurona. En el sistema
nervioso periférico, los axones largos de varias neuronas se reúnen
en haces para formar un nervio o fibra nerviosa. A su vez, estas
fibras nerviosas se pueden combinar formando fascículos, en los
cuales las fibras nerviosas forman haces encajados, junto con el
aporte vascular intraneural, en una matriz suelta de colágeno unida
por una vaina multilaminar protectora. En el sistema nervioso
central, los cuerpos celulares neuronales se distinguen visualmente
de sus prolongaciones con envolvente mielínica, y se denominan en la
técnica sustancia gris y sustancia blanca, respectivamente.
Durante el desarrollo, las neuronas que se están
diferenciando en los sistemas nerviosos central y periférico
proyectan axones que deben crecer y hacer contacto con células diana
específicas. En algunos casos, los axones que están creciendo deben
abarcar enormes distancias; algunos crecen en la periferia, mientras
que otros permanecen confinados dentro del sistema nervioso
central. En los mamíferos, esta fase de neurogénesis termina durante
la fase embrionaria de la vida y las células neuronales no se
multiplican una vez que se han diferenciado del todo.
Por consiguiente, las vías neurales de un
mamífero están expuestas a un riesgo particular si las neuronas
sufren traumatismos mecánicos o químicos o una degeneración
neuropática suficiente para poner las neuronas que definen la vía
en riesgo de morir. Hasta la fecha, se han identificado numerosas
neuropatías, algunas de las cuales afectan sólo a una subpoblación
o a un sistema de neuronas dentro de los sistemas nerviosos
periférico o central. Las neuropatías, que pueden afectar a las
propias neuronas o a las células neuroneurogliales asociadas,
pueden ser resultado de una disfunción metabólica celular, una
infección, la exposición a agentes tóxicos, una disfunción del
sistema autoinmune, malnutrición o isquemia. Se cree que en algunos
casos la disfunción celular induce directamente la muerte de la
célula. En otros casos, la neuropatía puede inducir una necrosis
hística suficiente para estimular el sistema inmune/inflamatorio del
cuerpo y entonces son los mecanismos de la respuesta inmune del
cuerpo a la lesión neural inicial los que destruyen las neuronas y
la ruta definida por estas neuronas.
Actualmente, no existe ningún método efectivo
para reparar el daño causado por estas neuropatías, entre las que
se incluyen esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica
(ALS, por sus siglas en inglés), corea de Huntington, enfermedad de
Alzheimer, enfermedad de Parkinson (parkinsonismo) y trastornos de
origen metabólico tales como la encefalopatía hepática. Los
intentos actuales de contrarrestar los efectos de las lesiones
degenerativas neurales o traumáticas graves del cerebro y/o de la
médula espinal se han basado hasta ahora principalmente en la
implantación de neuronas embrionarias para intentar reemplazar
funcionalmente, o si acaso compensar, las neuronas perdidas o
deficientes. Sin embargo, actualmente la investigación de
transplantes de células embrionarias humanas está muy limitada. La
administración de factores neurotróficos tales como factor de
crecimiento nervioso y factor de crecimiento de tipo insulínico
también ha sido sugerida para estimular crecimiento neuronal dentro
del SNC. (Véase, por ejemplo, Lundborg (1987) Acta Orthop.
Scand. 58:145-169 y Patente de EE.UU. Nº
5.093.317). La administración de factores neurotróficos al SNC
requiere traspasar la barrera hematoencefálica. La barrera puede
traspasarse por infusión directa, o por modificación de la molécula
para mejorar su transporte a través de la barrera, ya sea por
modificación química o conjugación, o por truncación de la molécula.
También se han injertado células de Schwann en un sitio de una
lesión del SNC para intentar estimular y mantener el crecimiento de
las prolongaciones neuronales dañadas (Paino et al. (1991)
Exp. Neurology 114(2):254-257.
En los sitios en que la vía neural dañada es el
resultado del daño axonal en el SNC, se han utilizado injertos de
nervios periféricos autólogos para puentear lesiones en el sistema
nervioso central y permitir que los axones retrocedan a su zona
diana normal. A diferencia de las neuronas del SNC, las neuronas del
sistema nervioso periférico pueden extender nuevas prolongaciones
periféricas en respuesta al daño axonal. Esta propiedad regenerativa
de los axones del sistema nervioso periférico se cree que es
suficiente para permitir el injerto de estos segmentos en los
axones del SNC. Sin embargo, el proceso de injerto efectivo parece
estar limitado por diversos factores, entre los que se incluye la
longitud de la lesión axonal del SNC que se intenta puentear, y la
distancia desde los cuerpos de las células neuronales del SNC hasta
los sitios del injerto, ocurriendo injertos efectivos cerca del
cuerpo celular.
Dentro del sistema nervioso periférico, esta
propiedad de regeneración celular de las neuronas tiene una limitada
capacidad de reparar la función de una ruta neuronal dañada.
Específicamente, los nuevos axones se prolongan aleatoriamente, y a
menudo en dirección equivocada, haciendo contacto con dianas
inapropiadas, lo que puede causar una función anómala. Por ejemplo,
si se daña un nervio motor, los axones que están volviendo a crecer
pueden entrar en contacto con los músculos equivocados, dando lugar
a parálisis. Además, cuando las prolongaciones de los nervios
seccionados dan como resultado una separación de más de unos pocos
milímetros, por ejemplo de más de 10 milímetros (mm), no ocurre la
regeneración adecuada del nervio, ya sea porque las prolongaciones
no logran crecer la distancia necesaria, o debido al crecimiento
axonal mal dirigido. Los esfuerzos por reparar el daño nervioso
periférico por medios quirúrgicos se han encontrado con resultados
diversos, en particular cuando el daño se extiende a lo largo de
una distancia importante. En algunos casos, las etapas de sutura
utilizadas para obtener una alineación apropiada de las
terminaciones nerviosas seccionadas estimulan la formación de
tejido cicatrizal que se cree que inhibe la regeneración de los
axones. Incluso cuando se ha reducido la formación de tejido
cicatrizal, como ocurre con el uso de canales de guía de los nervios
u otras prótesis tubulares, por lo general la regeración efectiva
sigue estando limitada al daño nervioso de menos de 10 mm de
separación. Además, la capacidad de reparación de las neuronas
periféricas se inhibe de modo significativo cuando una lesión o
neuropatía afecta al propio cuerpo celular o da como resultado una
amplia degeneración de un axón distal.
Las vías neurales de los mamíferos también están
en riesgo debido al daño causado por las lesiones neoplásicas. Se
han identificado neoplasias tanto de las neuronas como de las
células neuroneurogliales. Las células transformadas de origen
neural generalmente pierden su capacidad de comportarse como células
diferencias normales y pueden destruir las vías neurales por
pérdida de función. Además, los tumores que están proliferando
pueden inducir lesiones al distorsionar la estructura del tejido
nervioso normal, inhibir las rutas por comprimir nervios, inhibir
el flujo de sangre o de líquido cefalorraquídeo y/o estimular la
respuesta inmune del cuerpo. Los tumores metastásicos que son una
causa significativa de lesiones neoplásicas en el cerebro y en la
médula espinal, también pueden dañar de forma similar las vías
neurales e inducir la muerte de las células neuronales.
Un tipo de molécula morforreguladora asociada
con el crecimiento de las células neuronales, su diferenciación y
su desarrollo, lo constituyen las moléculas de adhesión celular
("CAM", por sus siglas en inglés), y muy notablemente
la molécula de adhesión a las células nerviosas
(N-CAM, por sus siglas en inglés). Las
CAM pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas y
median las interacciones intercelulares en los tejidos en fase de
desarrollo y adultos a través de la unión homofílica, es decir unión
CAM-CAM sobre células yuxtapuestas. Se han
identificado diversas CAM diferentes. De ellas, las que se
han estudiado más a fondo hasta la fecha con
N-CAM y L-CAM
(moléculas de adhesión a las células hepáticas), ambas de las cuales
han sido identificadas en todas las células en fases precoces de
desarrollo, así como en diferentes tejidos adultos. En el desarrollo
del tejido neural, la expresión de N-CAM se
cree que es importante en la organización del tejido, en la
migración neuronal, en la adhesión del tejido
nervioso-muscular, en la formación retinal, en la
sinaptogénesis y en la degeneración neural. También se cree que una
expresión disminuida de N-CAM está asociada
con una disfunción nerviosa. Por ejemplo, la expresión de al menos
una forma de N-CAM,
N-CAM-180, está disminuida en un mutante
dismielinante de ratón (Bhat (1988) Brain Res.
452:373-377). Los niveles reducidos de
N-CAM también han sido asociados con
hidrocefalia normotensa (Werdelin (1989) Acta Neurol. Scand.
79:177-181) y con esquizofrenia de tipo II
(Lyons et al., (1988) Biol. Psychiatry
23:769-775). Además, se ha demostrado que los
anticuerpos frente a N-CAM alteran la
recuperación funcional de los nervios lesionados (Remsen (1990)
Exp. Neurobiol. 110:268-273). Otro
objeto es proporcionar un medio para estimular la expresión de CAM,
en particular N-CAM, en una célula.
El documento WO 92/00382 describe un segmento de
ADN que codifica una proteína GDF-1 de mamífero y la
proteína codificada por el mismo.
Jones et al. (1991) Biol. Abstracts No.
19 Ab-444 (abstract No. 106 862) describen estudios
de hibridación in situ de los patrones de expresión de
BMP-4 y VGR-1 en el sistema nervioso
central del ratón.
El documento WO 92/15323 describe proteínas
morfogénicas que pueden inducir morfogénesis de tejidos en
mamíferos.
La presente invención proporciona el uso de un
morfógeno como se define en las reivindicaciones adjuntas y un
dispositivo para mantener las vías neurales en un mamífero in
vivo.
Se puede usar una cantidad terapéuticamente
eficaz de una proteína morfogénica ("morfógeno"), como se
define aquí.
Con fines ilustrativos, los métodos para mejorar
la supervivencia de neuronas en riesgo de morir, incluyen proteger
las neuronas de los efectos destructivos de tejidos asociados con la
respuesta inmune/inflamatoria del cuerpo ante una lesión nerviosa.
Los métodos para estimular las neuronas para que mantengan su
fenotipo diferenciado, incluyen inducir la rediferenciación de las
células transformadas de origen neuronal a una morfología
característica de neuronas no transformadas. Se describen medios
para estimular la producción de moléculas de adhesión celular en
las células, particularmente moléculas de adhesión a las células
nerviosas (N-CAM) en neuronas. La invención también
proporciona dispositivos para estimular la reparación celular de
neuronas y vías neurales dañadas, incluyéndose la regeneración de
axones dañados de los sistemas nerviosos central y periférico.
Como se utiliza aquí, una "vía neural"
describe un circuito nervioso para el paso de las señales eléctricas
desde una fuente hasta un sitio de la célula diana. La ruta incluye
las neuronas a través de las cuales se transporta el impulso
eléctrico, incluyendo grupos de neuronas interconectadas, las fibras
nerviosas formadas por los axones neuronales reunidos en haces, y
las células neuroneurogliales que rodean a las neuronas y están
asociadas a ellas.
Los morfógenos descritos aquí son útiles para
reparar vías neurales dañadas del sistema nervioso periférico. En
particular, los morfógenos son útiles para reparar rutas dañadas,
incluidas fibras nerviosas (nervios) seccionadas transversalmente o
dañadas de otro modo que requieren la regeneración de las
prolongaciones neuronales, particularmente los axones, a lo largo
de grandes distancias para puentear una separación en el propio
nervio, o entre el nervio y una célula
post-sináptica. De modo específico, los morfógenos
como los descritos en las reivindicaciones son capaces de estimular
una regeneración completa del nervio axonal, lo que incluye
vascularización y reformación de la vaina mielínica protectora.
Preferiblemente, el morfógeno es proporcionado en el sitio de la
adhesión dispersado en un material portador biocompatible y
biorresorbible, capaz de mantener al morfógeno en el sitio y, en
caso necesario, medios para dirigir el crecimiento axonal desde el
extremo proximal al extremo distal de una neurona o nervio
seccionado. Por ejemplo, se pueden requerir medios para dirigir el
crecimiento axonal cuando se va a inducir la regeneración del
nervio a lo largo de una gran distancia, tal como más de 10 mm. Se
consideran muchos vehículos capaces de proporcionar estas funciones.
Por ejemplo, entre los vehículos útiles se incluyen materiales
sustancialmente insolubles o soluciones viscosas preparadas como se
ha descrito aquí, que comprenden laminina, ácido hialurónico o
colágeno, u otros materiales polímeros biocompatibles y sintéticos
adecuados tales como poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico) o
poli(ácido butírico) y/o sus copolímeros. El vehículo actualmente
preferido comprende una composición de matriz extracelular, tal como
una descrita aquí derivada, por ejemplo, de células de sarcoma de
ratón. También se consideran como especialmente útiles las matrices
extracelulares derivadas de tejido cerebral.
El morfógeno se puede proporcionar en el sitio
como parte de un dispositivo en el que está dispuesto el morfógeno
en un canal de guía del nervio que cubre la distancia de la ruta
dañada. El canal actúa tanto como cobertura protectora y como medio
físico para guiar el crecimiento de una prolongación neuronal tal
como un axón. Los canales útiles comprenden una membrana o
envolvente biocompatible, que puede tener una estructura tubular,
que tiene una dimensión suficiente para abarcar la separación o
rotura en el nervio que se va a reparar, y que tiene separaciones
destinadas a recibir terminaciones nerviosas seccionadas. La
envolvente o membrana puede estar hecha de cualquier material
biocompatible no irritante tal como silicona o un polímero
biocompatible tal como polietileno o polietileno y acetato de
vinilo. La envolvente también puede estar compuesta de polímeros
biorresorbibles y biocompatibles entre los que se incluyen, por
ejemplo, colágeno, ácido hialurónico, poli(ácido láctico),
poli(ácido butírico) y poli(ácido glicólico). En una realización
aquí preferida, la superficie externa del canal es sustancialmente
impermeable.
El morfógeno puede estar dispuesto en el canal
en asociación con un material portador biocompatible o puede ser
adsorbido o asociado de otro modo a la superficie interna de la
envolvente, tal como se describe en la memoria de Patente de EE.UU.
Nº 5.011.486, siempre que el morfógeno esté accesible para las
terminaciones nerviosas seccionadas. Adicionalmente, aunque los
canales de guía del nervio descritos aquí generalmente tienen forma
tubular, será evidente para los expertos en la técnica que se pueden
emplear varios perfiles alternativos. La luz de los canales de guía
puede ser, por ejemplo, ovalado o incluso cuadrado en corte
transversal. Además, los canales de guía pueden estar construidos
de dos o más piezas que pueden abrazarse entre sí para asegurar los
muñones de los nervios. Las terminaciones nerviosas se pueden
asegurar a los canales de guía del nervio por medio de suturas,
adhesivos biocompatibles tales como pegamento de fibrina, o por
otros medios conocidos en la ciencia médica.
Con fines ilustrativos, los morfógenos descritos
aquí también se consideran útiles en implantes de segmentos de
nervios periféricos autólogos para puentear vías neurales dañadas en
el sistena nervioso central, tal como en la reparación de retinas
dañadas o desprendidas, u otros daños en el nervio óptico. Aquí el
morfógeno se proporciona al sitio de unión para estimular
crecimiento axonal en el sitio del injerto, particularmente cuando
el segmento axonal dañado que va a ser puenteado se encuentra lejos
del cuerpo celular neuronal.
Los morfógenos descritos aquí también son útiles
para mejorar la supervivencia de células neuronales en riesgo de
morir, con lo que se impide, limita o inhibe de otra forma el daño
en las rutas neurales. Las neuronas no mitóticas están en riesgo de
morir como resultado de una neuropatía u otra disfunción celular de
una neurona o célula neuroglial que induce la muerte de la célula,
o tras una lesión química o mecánica en la célula o su tejido
circundante. Las lesiones químicas pueden ser el resultado de
agentes tóxicos conocidos como el plomo, el etanol, el amoníaco, el
formaldehído y otros muchos disolventes orgánicos, así como los
toxinas del humo del tabaco y de los opiáceos. Los aminoácidos
excitadores, tales como el glutamato, también pueden desempeñar un
papel en la patogénesis de la muerte celular neuronal (véase Freese
et al. (1990) Brain Res.
521:254-264). La muerte celular neuronal
también se piensa que es un factor que contribuye en alto grado en
diversas enfermedades neurodegenerativas, entre las que se incluyen
la enfermedad de Alzheimer, el corea de Huntington y la enfermedad
de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica y la esclerosis
múltiple. La etiología de estas neuropatías puede ser metabólica,
como la que se produce por encefalopatía hepática, o bien
infecciosa, tóxica, autoinmune, nutricional o isquémica. Además,
también se ha identificado el alcohol y otras muchas toxinas como
factores significativos que contribuyen a las enfermedades
neurodegenerativas. Los morfógenos descritos aquí se pueden
proporcionar a las células en riesgo de morir para mejorar su
supervivencia y así proteger la integridad de la vía neural. Los
morfógenos se pueden proporcionar directamente al sitio o se pueden
proporcionar sistémicamente. De modo alternativo, con fines
ilustrativos, como se ha descrito antes, se puede administrar al
mamífero un agente capaz de estimular la expresión y/o secreción de
morfógenos endógenos, preferiblemente en células asociadas con el
tejido nervioso de interés.
\newpage
Con fines ilustrativos, el método descrito es
útil para rediferenciar células transformadas, particularmente las
células transformadas de origen neuronal o neuroglial, de modo que
las células tratadas con el morfógeno son inducidas a presentar una
morfología característica de células no transformadas. Cuando las
células transformadas son células de origen neuronal, el
tratamiento con morfógenos preferiblemente induce el redondeo
celular y agregación celular (aglutinación), adhesión
célula-célula, formación y alargamiento de
excrecencias neuríticas y producción de
N-CAM. Se anticipa que los métodos descritos
aquí inhibirán o reducirán sustancialmente la formación y/o
proliferación de tumores celulares neurales en tejido nervioso. Se
anticipa que los métodos de esta invención serán útiles reduciendo
sustancialmente los efectos de diversos carcinomas de origen en
tejido nervioso tales como retinoblastomas, neuroblastomas, y
gliomas o glioblastomas. Además, también se anticipa que el método
ayudará a inhibir lesiones neoplásicas causadas por tejido
metastásico. Los tumores metastásicos son uno de los neoplasmas más
comunes del SNC, ya que pueden alcanzar al compartimiento
intracraneal a través del torrente sanguíneo. Los tumores
metastásicos pueden dañar las vías neurales, por ejemplo,
distorsionando estructuras de tejidos nerviosos normales,
comprimiendo nervios, bloqueando el flujo de líquido cefalorraquídeo
o el suministro de sangre que nutre al tejido cerebral y/o
estimulando la respuesta inmune del cuerpo.
Con fines ilustrativos, los morfógenos descritos
aquí son útiles para proporcionar efectos neuroprotectores que
alivian el daño en las vías neurales asociado con la respuesta
inmune/inflamatoria del cuerpo a una lesión inicial en el tejido
nervioso. Dicha respuesta puede seguir a un traumatismo en el tejido
nervioso, causado, por ejemplo, por una disfunción autoinmune, una
lesión neoplásica, una infección, un traumatismo químico o
mecánico, una enfermedad, por interrupción de la circulación
sanguínea a las neuronas o las células neuroneurogliales, por
ejemplo tras isquemia o hipoxia, o por otro traumatismo en el nervio
o material circundante. Por ejemplo, el daño principal debido a
hipoxia o a reperfusión tras isquemia, después de la oclusión de un
aporte sanguíneo neural, como en una embolia, se cree que es
inmunológico. Además, al menos parte del daño asociado con diversos
tumores cerebrales primarios también parece ser inmunológico. La
aplicación del morfógeno directamente a las células que se van a
tratar, o el aporte del morfógeno al mamífero sistémicamente, por
ejemplo, intravenosamente o indirectamente por administración oral,
se puede utilizar para aliviar y/o inhibir la respuesta inmunológica
a un daño neural. Alternativamente, también se puede utilizar la
administración de un agente capaz de estimular la expresión y/o
secreción in vivo de morfógenos, preferiblemente en el sitio
de la lesión. Cuando se va a inducir el daño, por ejemplo durante
una intervención quirúrgica u otro tratamiento clínico agresivo, el
morfógeno o agente puede ser proporcionado antes de la inducción de
la lesión para aportar un efecto neuroprotector en el tejido
nervioso en riesgo.
Con fines ilustrativos se describen métodos para
sostener el desarrollo y mantenimiento de neuronas diferenciadas,
que incluye inducir a las neuronas a continuar expresando su
fenotipo. Se anticipa que esta actividad será particularmente útil
en el tratamiento de trastornos del tejido nervioso cuya pérdida de
función está causada por una disminución o pérdida de la función
metabólica celular y porque las células se hacen senescentes o
quiescentes, tal como se cree que ocurre en las células que están
envejeciendo y que se manifiestan en la enfermedad de Alzheimer. La
aplicación del morfógeno directamente a las células que se van a
tratar, o su aporte sistémico por administración parenteral u oral
estimula a estas células a continuar expresando su fenotipo,
inhibiendo y/o invirtiendo significativamente los efectos de la
disfunción metabólica celular, por lo que se mantiene la vía neural
en riesgo. Alternativamente, se puede utilizar la administración de
un agente capaz de estimular la expresión y/o secreción in
vivo del morfógeno endógeno.
Con fines ilustrativos se describen métodos para
estimular los niveles de expresión de CAM en una célula,
particularmente la expresión de N-CAM en
neuronas. Las CAM son moléculas definidas como portadoras de
interacciones célula-célula necesarias para la
formación de los tejidos. Se cree que las CAM desempeñan un papel
regulador fundamental en el desarrollo de los tejidos, incluida la
formación de los límites de los tejidos, la inducción y migración
embrionaria y la estabilización y regeneración del tejido. Los
niveles de CAM alterados han sido implicados en numerosos
trastornos de tejidos, incluidos los defectos congénitos, las
neoplasias y las enfermedades degenerativas.
En particular, la expresión de
N-CAM está asociada con el desarrollo y la
diferenciación normal de las células neuronales, lo que incluye la
formación de la retina, la sinaptogénesis y la adhesión de tejido
muscular a nervioso. Se sabe que la inhibición de una o más de las
isoformas de N-CAM impide el desarrollo
adecuado de los tejidos. Los niveles alterados de la expresión de
N-CAM también están asociados con neoplasias,
incluidos los neuroblastomas (véase más adelante), así como con
cierto número de neuropatías, incluida la hidrocefalia normotensa y
la esquizofrenia de tipo II. La aplicación del morfógeno
directamente a las células que se han de tratar, o el aporte del
morfógeno al mamífero sistémicamente, por ejemplo, parenteralmente,
o indirectamente por administración oral, se puede utilizar para
inducir expresión celular de una o más CAM, particularmente
N-CAM. Alternativamente, la administración de
un agente capaz de estimular la expresión y/o secreción de morfógeno
in vivo, preferiblemente en el sitio de la lesión, también
se puede utilizar para inducir la producción de CAM.
Las moléculas CAM según se ha postulado
son también parte de la ruta morforreguladora cuya actividad es
inducida por una molécula no identificada hasta la fecha (véase,
por ejemplo, Edelman, G.M. (1986) Ann. Rev. Cell Biol.
2:81-116). Sin pretender limitarse a ninguna
teoría en particular, los morfógenos descritos aquí pueden actuar
como inductor en esta ruta.
Finalmente, con fines ilustrativos, las
modulaciones de los niveles de morfógeno endógeno pueden vigilarse
como parte de un método de detección de disfunción en el tejido
nervioso. Específicamente, se anticipa que las modulaciones en los
niveles de morfógeno endógeno reflejarán cambios en el estato del
tejido nervioso. La expresión de morfógeno puede vigilarse
directamente en muestras de células biopsiadas, en líquido
cefalorraquídeo o en suero. Alternativamente, se pueden estimar
niveles de morfógeno detectando cambios en los niveles de
anticuerpos endógenos al morfógeno. Por ejemplo, se pueden obtener
muestras de suero de un mamífero y después detectar la
concentración de morfógeno o anticuerpo presente en el líquido por
técnicas clásicas de detección de proteínas, conocidas por los
expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar una proteína
de unión capaz de interaccionar específicamente con el morfógeno de
interés, tal como un anticuerpo anti-morfógeno,
para detectar un morfógeno en un inmunoensayo clásico. Después se
pueden comparar los niveles de morfógeno con un patrón previamente
determinado o con un nivel de referencia, siendo los cambios en los
niveles detectados indicativos del estado del tejido.
Un morfógeno o el agente estimulador de
morfógeno se puede administrar sistémicamente al individuo, por
ejemplo por vía oral o parenteral. Un morfógeno puede ser
proporcionado directamente en el tejido nervioso, por ejemplo por
inyección en el líquido cefalorraquídeo o en un lugar del tejido
nervioso.
La terminología "administración de
morfógeno" se refiere a la administración del morfógeno, ya sea a
solas o en combinación con otras moléculas. Por ejemplo, puede
proporcionarse en la forma madura del morfógeno en asociación con
su dominio "pro" precursor, que se sabe que mejora la
solubilidad de la proteína. Otras moléculas útiles que se sabe que
mejoran la solubilidad de proteínas incluyen la caseína y otros
componentes de la leche, así como diversas proteínas de suero.
Otras moléculas útiles que pueden asociarse con el morfógeno o el
agente estimulador del morfógeno incluyen moléculas que se dirigen
a los tejidos, capaces de dirigir el morfógeno o el agente
estimulador del morfógeno al tejido nervioso. Estas moléculas que se
dirigen a tejidos y que se consideran útiles en los protocolos de
tratamiento de esta invención, incluyen anticuerpos, fragmentos de
anticuerpos u otras proteínas de unión que interaccionan
específicamente con las moléculas de superficie en las células del
tejido nervioso.
Todavía otra molécula útil que se dirige al
tejido es todo o parte del dominio "pro" precursor del
morfógeno, particularmente el de OP-1 o
GDF-1. Estas proteínas están asociadas de forma
natural con el tejido nervioso pero también se pueden sintetizar en
otros tejidos y dirigirse específcamente al tejido nervioso después
de la secreción del tejido de síntesis. Por ejemplo, si bien la
proteína ha demostrado ser activa en tejido óseo, la fuente
principal de síntesis de OP-1 parece ser el tejido
del sistema urógeno (por ejemplo tejido renal y vesicular), dándose
niveles de expresión secundaria en el cerebro, corazón y pulmones
(véase más adelante). Además, la proteína ha sido identificada en
suero, saliva y varias formas de leche. Además, la forma secretada
de la proteína comprende el dímero maduro en asociación con el
dominio pro de la secuencia intacta de morfógeno. Por consiguiente,
los dominios pro de morfógenos asociados pueden actuar para dirigir
morfógenos específicos a diferentes tejidos in vivo.
Las moléculas que mejoran la solubilidad o que
se dirigen a tejido asociado también pueden unirse covalentemente
al morfógeno utilizando técnicas químicas clásicas, entre las que se
incluyen enlaces lábiles en medio ácido, que probablemente se
escindirán preferentemente en el medio ácido de los sitios de
remodelación ósea.
Finalmente, se pueden administrar morfógenos
también en combinación con otras moléculas que se sabe que son
beneficiosas para mantener las rutas neurales, incluidos, por
ejemplo, los factores de crecimiento nervioso y los agentes
anti-inflamatorios.
Cuando el morfógeno está destinado a uso como
agente terapéutico para trastornos del SNC, debe afrontarse un
problema adicional: traspasar la denominada "barrera
hematoencefálica", es decir, la estructura de paredes capilares
del cerebro que filtra eficazmente todas salvo ciertas categorías
seleccionadas de moléculas presentes en la sangre, evitando que
pasen al cerebro. La barrera hematoencefálica puede ser atravesada
eficazmente por infusión directa del morfógeno en el cerebro.
Alternativamente, el morfógeno o de agente estimulador del
morfógeno puede ser modificado para mejorar su transporte a través
de la barrera hematoencefálica. Por ejemplo, las formas truncadas
del morfógeno pueden ser más efectivas. Alternativamente, el
morfógeno se puede modificar para hacerlo más lipofílico, o se
puede conjugar a otra molécula que es transportada de forma natural
a través de la barrera, utilizando técnicas clásicas conocidas por
los expertos en este campo como, por ejemplo, las descritas en
Pardridge, Endocrine Reviews 7:314-330
(1986) y Patente de EE.UU. Nº 4.801. 575.
Por consiguiente, como se utiliza aquí, un
"análogo" funcional de un morfógeno se refiere a una proteína
que tiene actividad biológica morfogénica pero que posee
diferencias estructurales adicionales si se compara con un
morfógeno como se define aquí, por ejemplo, que tiene restos
químicos adicionales que normalmente no son parte de un morfógeno.
Tales restos (introducidos, por ejemplo, por reacciones de
acilación, alquilación, cationización o glicosilación, u otros
medios para conjugar el resto al morfógeno) pueden mejorar la
solubilidad de la molécula, su absorción, semivida biológica o
transporte, por ejemplo, a través de la barrera
hematoencefálica.
Entre los morfógenos útiles en esta invención
están las proteínas identificadas originariamente como proteínas
osteogénicas, tales como las proteínas OP-1,
OP-2 y CBMP2, así como proteínas relacionadas con su
secuencia de aminoácidos tales como DPP (de Drosophila), Vgl (de
Xenopus), Vgr-1 (de ratón, véase la Patente de
EE.UU. 5.011.691 de Opperman et al.), GDF-1
(de ratón, véase Lee (1991) PNAS
88:4250-4254), que se presentan en la Tabla
II y en la Seq. ID Nos. 5-14), y la proteína 60A
identificada recientemente (de Drosophila, Seq. ID No. 24, véase
Wharton et al. (1991) PNAS
88:9214-9218). Los miembros de esta familia,
que incluyen miembros de la superfamilia de proteínas
TGF-\beta comparten una homología sustancial en la
secuencia de aminoácidos en sus regiones
C-terminales. Las proteínas se traducen como un
precursor, teniendo una secuencia de péptido señal
N-terminal, típicamente menor que aproximadamente 30
restos, seguido por un dominio "pro" que se escinde para dar
la secuencia madura. El péptido señal se escinde rápidamente al
traducirlo, en un sitio de escisión que puede predecirse en una
secuencia dada utilizando el método de Von Heijne ((1986) Nucleic
Acids Research 14:4683-4691). La Tabla I
siguiente describe los diversos morfógenos identificados hasta la
fecha, incluyendo su nomenclatura tal como se utiliza aquí, sus
referencias Seq. ID y sus fuentes de publicación para las secuencias
de aminoácidos para las proteínas de longitud completa no incluidas
en el Listado de Secuencias.
Las proteínas OP-2 tienen un
resto de cisteína adicional en esta región (véase, p. ej., el resto
41 de Seq. ID Nos. 7 y 8), además del esqueleto de cisteínas
conservadas en común con las demás proteínas de esta familia. La
proteína GDF-1 tiene un inserto de cuatro
aminoácidos dentro del esqueleto conservado (restos
44-47 de Seq. ID No. 14) pero este inserto
probablemente no interfiere con la relación de las cisteínas en la
estructura plegada. Además, las proteínas CBMP2 tienen un resto de
aminoácido desaparecido dentro del esqueleto de cisteínas.
Los morfógenos son inactivos cuando se reducen,
pero son activos en forma de homodímeros oxidados y cuando se
oxidan en combinación con otros morfógenos de esta invención. Así,
como se define aquí, un morfógeno es una proteína dímera que
comprende un par de cadenas polipeptídicas, en donde cada cadena
polipeptídica comprende al menos el esqueleto con seis cisteínas
C-terminales definido por los restos
43-139 de Seq. ID No. 5, incluyendo disposiciones
funcionalmente equivalentes de estas cisteínas (por ejemplo,
inserciones o deleciones de aminoácidos que alteran la disposición
lineal de las cisteínas en la secuencia pero no su relación en la
estructura plegada), tal que, cuando las cadenas polipeptídicas se
pliegan, la especie de proteína dímera que comprende el par de
cadenas polipeptídicas tiene la estructura tridimensional apropiada,
incluyendo los enlaces disulfuro intra- e
inter-catenarios apropiados tales que la proteína es
capaz de actuar como un morfógeno en el sentido aquí definido. De
modo específico, los morfógenos generalmente son capaces de realizar
todas y cada una de las siguientes funciones biológicas en un medio
permisivo morfogénicamente: estimular la proliferación de células
progenitoras; estimular la diferenciación de células progenitoras;
estimular la proliferación de células diferenciadas y sustentar el
desarrollo y mantenimiento de células diferenciadas. Además, también
se anticipa que estos morfógenos serán capaces de inducir
rediferenciación de células comprometidas en condiciones
medioambientales apropiadas.
Con fines ilustrativos, la Secuencia genérica 1
comprende el esqueleto con seis cisteínas conservadas y la
Secuencia genérica 2 comprende el esqueleto con seis cisteínas
conservadas más la cisteína adicional identificada en
OP-2 (véase resto 36, Seq. ID No. 2). Estas
secuencias pueden comprender además la siguiente secuencia adicional
en su extremo N:
Con fines ilustrativos, las secuencias de
aminoácidos dentro de las secuencias genéricas anteriores incluyen:
Secuencia genérica 3 (Seq. ID No. 3), Secuencia genérica 4 (Seq. ID
No. 4) y Secuencia genérica 5 (Seq. ID No. 30). La Secuencia
genérica 6 (Seq. ID No. 31) se puede usar según la invención. Estas
secuencias genéricas acomodan las homologías compartidas entre los
diversos miembros preferidos de esta familia de morfógenos
identificada en la Tabla II, así como la variación entre ellas de
las secuencias de aminoácidos. Concretamente, las Secuencias
genéricas 3 y 4 son secuencias de aminoácidos compuestas de las
siguientes proteínas presentadas en la Tabla II e identificadas en
Seq. ID Nos. 5-14: OP-1 humana
(hOP-1, Seq. ID Nos. 5 y 16-17),
OP-1 de ratón (mOP-1, Seq. ID Nos.
6 y 18-19), OP-2 humana y de ratón
(Seq. ID Nos. 7, 8 y 20-22), CBMP2A (Seq. ID No. 9),
CBMP2B (Seq. ID No. 10), DPP (de Drosophila, Seq. ID No. 11), Vgl
(de Xenopus, Seq. ID No. 12), Vgr-1 (de ratón, Seq
ID No. 13) y GDF-1 (de ratón, Seq. ID No. 14). Las
secuencias genéricas incluyen tanto la identidad de aminoácidos
compartida por las secuencias en la Tabla II así como restos
alternativos para las posiciones variables dentro de la secuencia.
Nótese que estas secuencias genéricas permiten una cisteína
adicionala en la posición 41 o 46 en las Secuencias genéricas 3 o
4, respectivamente, proporcionando un esqueleto de cisteína
adecuado en el que se pueden formar enlaces disulfuro inter- o
intra-moleculares, y contienen ciertos aminoácidos
críticos que influyen en la estructura terciaria de las
proteínas.
en donde cada Xaa se selecciona
independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos
especificados definidos como sigue: "Res". significa
"resto" y Xaa en res.4 = (Ser, Asp o Glu); Xaa en res.6 = (Arg,
Gln, Ser o Lys); Xaa en res.7 = (Asp o Glu); Xaa en res.8 = (Leu o
Val); Xaa en res.11 = (Gln, Leu, Asp, His o Asn); Xaa en res.12 =
(Asp, Arg o Asn); Xaa en res.14 = (lIe o Val); Xaa en res.15 = (lIe
o Val); Xaa en res.18 = (Glu, Gln, Leu, Lys, Pro o Arg); Xaa en
res.20 = (Tyr o Phe); Xaa en res.21 = (Ala, Ser, Asp, Met, His, Leu
o Gln); Xaa en res.23 = (Tyr, Asn o Phe); Xaa en res.26 = (Glu,
His, Tyr, Asp o Gln); Xaa en res.28 = (Glu, Lys, Asp o Gln); Xaa en
res.30 = (Ala, Ser, Pro o Gln); Xaa en res.31 = (Phe, Leu o Tyr);
Xaa en res.33 = (Leu o Val); Xaa en res.34 = (Asn, Asp, Ala o Thr);
Xaa en res.35 = (Ser, Asp, Glu, Leu o Ala); Xaa en res.36 = (Tyr,
Cys, His, Ser o lIe); Xaa en res.37 = (Mel, Phe, Gly o Leu); Xaa en
res.38 = (Asn o Ser); Xaa en res.39 = (Ala, Ser o Gly); Xaa en
res.40 = (Thr, Leu o Ser); Xaa en res.44 = (lIe o Val); Xaa en
res.45 = (Val o Leu); Xaa en res.46 = (Gln o Arg); Xaa en res.47 =
(Thr, Ala o Ser); Xaa en res.49 = (Val o Met); Xaa en res.50 = (His
o Asn); Xaa en res.51 = (Phe, Leu, Asn, Ser, Ala o Val); Xaa en
res.52 = (lIe, Mel, Asn, Ala o Val); Xaa en res.53 = (Asn, Lys, Ala
o Glu); Xaa en res.54 = (Pro o Ser); Xaa en res.55 = (Glu, Asp, Asn
o Gly); Xaa en res.56 = (Thr, Ala, Val, Lys, Asp, Tyr, Ser o Ala);
Xaa en res.57 = (Val, Ala o lIe); Xaa en res.58 = (Pro o Asp); Xaa
en res.59 = (Lys o Leu); Xaa en res.60 = (Pro o Ala); Xaa en res.63
= (Ala o Val); Xaa en res.65 = (Thr o Ala); Xaa en res.66 = (Gln,
Lys, Arg o Glu); Xaa en res.67 = (Leu, Mel o Val); Xaa en res.68 =
(Asn, Ser o Asp); Xaa en res.69 = (Ala, Pro o Ser); Xaa en res.70 =
(lIe, Thr o Val); Xaa en res.71 = (Ser o Ala); Xaa en res.72 = (Val
o Met); Xaa en res.74 = (Tyr o Phe); Xaa en res.75 = (Phe, Tyr o
Leu); Xaa en res.76 = (Asp o Asn); Xaa en res.77 = (Asp, Glu, Asn o
Ser); Xaa en res.78 = (Ser, Gln, Asn o Tyr); Xaa en res.79 = (Ser,
Asn, Asp o Glu); Xaa en res.80 = (Asn, Thr o Lys); Xaa en res.82 =
(lIe o Val); Xaa en res.84 = (Lys o Arg); Xaa en res.85 = (Lys,
Asn, Gln o His); Xaa en res.86 = (Tyr o His); Xaa en res.87 = (Arg,
Gln o Glu); Xaa en res.88 = (Asn, Glu o Asp); Xaa en res.90 = (Val,
Thr o Ala); Xaa en res.92 = (Arg, Lys, Val, Asp o Glu); Xaa a1
res.93 = (Ala, Gly o Glu); y Xaa en res.97 = (His o
Arg);
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en donde cada Xaa se selecciona
independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos
especificados definidos como sigue: "Res". significa
"resto" y Xaa en res.2 = (Lys o Arg); Xaa en res.3 = (Lys o
Arg); Xaa en res4 = (His o Arg); Xaa en res.5 = (Glu, Ser, His,
Gly, Arg o Pro); Xaa en res.9 = (Ser, Asp o Glu); Xaa en res.11 =
(Arg, Gln, Ser o Lys); Xaa en res.12 = (Asp o Glu); Xaa en res.13 =
(Leu o Val); Xaa en res.16 = (Gln, Leu, Asp, His o Asn); Xaa en
res.17 = (Asp, Arg o Asn); Xaa en res.19 = (lIe o Val); Xaa en
res.20 = (lIe o Val); Xaa en res.23 = (Glu, Gln, Leu, Lys, Pro o
Arg); Xaa en res.25 = (Tyr o Phe); Xaa en res.26 = (Ala, Ser, Asp,
Met, His, Leu o Gln); Xaa en res.28 = (Tyr, Asn o Phe); Xaa en
res.31 = (Glu, His, Tyr, Asp o Gln); Xaa en res.33 = Glu, Lys, Asp
o Gln); Xaa en res.35 = (Ala, Ser o Pro); Xaa en res.36 = (Phe, Leu
o Tyr); Xaa en res.38 = (Leu o Val); Xaa en res.39 = (Asn, Asp, Ala
o Thr); Xaa en res.40 = (Ser, Asp, Glu, Leu o Ala); Xaa en res.41 =
(Tyr, Cys, His, Ser o Ile); Xaa en res.42 = (Met, Phe, Gly o Leu);
Xaa en res.44 = (Ala, Ser o Gly); Xaa en res.45 = (Thr, Leu o Ser);
Xaa en res.49 = (Ile o Val); Xaa en res. 50 = (Val o Leu); Xaa en
res.51 = (Gln o Arg); Xaa en res.52 = (Thr, Ala o Ser); Xaa en
res.54 = (Val o Met); Xaa en res.55 = (His o Asn); Xaa en res.56 =
(Phe, Leu, Asn, Ser, Ala o Val); Xaa en res.57 = (Ile, Met, Asn, Ala
o Val); Xaa en res.58 = (Asn, Lys, Ala o Glu); Xaa en res.59 = (Pro
o Ser); Xaa en res.60 = (Glu, Asp, o Gly); Xaa en res.61 = (Thr,
Ala, Val, Lys, Asp, Tyr, Ser o Ala); Xaa en res.62 = (Val, Ala o
lIe); Xaa en res.63 = (Pro o Asp); Xaa en res.64 = (Lys o Leu); Xaa
en res.65 = (Pro o Ala); Xaa en res.68 = (Ala o Val); Xaa en res.70
= (Thr o Ala); Xaa en res.71 = (Gln, Lys, Arg o Glu); Xaa en res.72
= (Leu, Met o Val); Xaa en res. 73 = (Asn, Ser o Asp); Xaa en
res.74 = (Ala, Pro o Ser); Xaa en res.75 = (tle, Thr o Val); Xaa en
res.76 = (Ser o Ala); Xaa en res.77 = (Val o Met); Xaa en res.79 =
(Tyr o Phe); Xaa en res.80 = (Phe, Tyr o Leu); Xaa en res.81 = (Asp
o Asn); Xaa en res.82 = (Asp, Glu, Asn o Ser); Xaa en res.83 = (Ser,
Gln, Asn o Tyr); Xaa en res.84 = (Ser, Asn, Asp o Glu); Xaa en
res.85 = (Asn, Thr o Lys); Xaa en res.87 = (Ile o Val); Xaa en
res.89 = (Lys o Arg); Xaa en res.90 = (Lys, Asn, Gln o His); Xaa en
res.91 = (Tyr o His); Xaa en res. 92 = (Arg, Gln o Glu); Xaa en
res.93 = (Asn, Glu o Asp); Xaa en res.95 = (Val, Thr o Ala); Xaa en
res.97 = (Arg, Lys, Val, Asp o Glu); Xaa en res.98 = (Ala, Gly o
Glu); y Xaa en res.102 = (His o
Arg).
De manera similar, la Secuencia genérica 5 (Seq.
ID No. 30) y la Secuencia genérica 6 (Seq. ID No. 31) acomodan las
homologías compartidas entre todos los miembros de la familia de
proteína morfógenas identificados en la Tabla II. Concretamente,
las Secuencias genéricas 5 y 6 son secuencias de aminoácidos
compuestas de OP-1 humana (hOP-1,
Seq. ID Nos. 5 y 16-17), OP-1 de
ratón (mOP-1, Seq. ID Nos. 6 y
18-19), OP-2 humana y de ratón
(Seq. ID Nos. 7, 8 y 20-22), CBMP2A (Seq. ID No. 9),
CBMP2B (Seq. ID No. 10), DPP (de Drosophila, Seq. ID No. 11), Vgl
(de Xenopus, Seq. ID No. 12), Vgr-1 (de ratón, Seq
ID No. 13) y GDF-1 (de ratón, Seq. ID No. 14), BMP3
humano (Seq. ID No. 26), BMP5 humano (Seq. ID No. 27), BMP6 humano
(Seq. ID No. 28) y 60A (de Drosophila, Seq. ID Nos.
24-25). Las secuencias genéricas incluyen tanto la
identidad de aminoácidos compartida por estas secuencias en el
dominio terminal, definido por los esqueletos de seis y siete
cisteínas (Secuencias genéricas 5 y 6, respectivamente), así como
restos alternativos para las posiciones variables dentro de la
secuencia. Como para las Secuencias genéricas 3 y 4, las Secuencias
genéricas 5 y 6 permiten una cisteína adicional en la posición 41
(Secuencia genérica 5) o en la posición 46 (Secuencia genérica 6),
lo que proporciona un esqueleto de cisteínas apropiado en el que se
pueden formar enlaces disulfuro inter- o
intra-moleculares, y contienen ciertos aminoácidos
críticos que influyen en la estructura terciaria de las
proteínas.
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(Secuencia pasa a página
siguiente)
en donde cada Xaa se selecciona
independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos
especificados definidos como sigue: "Res". significa
"resto" y Xaa en res.2 = (Tyr o Lys); Xaa en res.3 = Val o
lIe); Xaa en res.4 = (Ser, Asp o Glu); Xaa en res.6 = (Arg, Gln,
Ser, Lys o Ala); Xaa en res.7 = (Asp, Glu o Lys); Xaa en res.8 =
(Leu, Val o lIe); Xaa en res.11 = (Gln, Leu, Asp, His, Asn o Ser);
Xaa en res.12 = (Asp, Arg, Asn o Glu); Xaa en res.14 = (lIe o Val);
Xaa en res.15 = (lIe o Val); Xaa en res.16 (Ala o Ser); Xaa en
res.18 = (Glu, Gln, Leu, Lys, Pro o Arg); Xaa en res.19 = (Gly o
Ser); Xaa en res.20 = (Tyr o Phe); Xaa en res.21 = (Ala, Ser, Asp,
Met, His, Gln, Leu o Gly); Xaa en res.23 = (Tyr, Asn o Phe); Xaa en
res.26 = (Glu, His, Tyr, Asp, Gln o Ser); Xaa en res.28 = (Glu,
Lys, Asp, Gln o Ala); Xaa en res.30 = (Ala, Ser, Pro, Gln o Asn);
Xaa en res.31 = (Phe, Leu o Tyr); Xaa en res.33 = (Leu, Valor Met);
Xaa en res.34 = (Asn, Asp, Ala, Thr o Pro); Xaa en res.35 = (Ser,
Asp, Glu, Leu, Ala o Lys); Xaa en res.36 = (Tyr, Cys, His, Ser o
lIe); Xaa en res.37 = (Met, Phe, Gly o Leu); Xaa en res.38 = (Asn,
Ser o Lys); Xaa en res.39 = (Ala, Ser, Gly o Pro); Xaa en res.40 =
(Thr, Leu o Ser); Xaa en res.44 = (lIe, Val o Thr); Xaa en res.45 =
(Val, Leu o lIe); Xaa en res.46 = (Gln o Arg); Xaa en res.47 =
(Thr, Ala o Ser); Xaa en res.48 = (Leu o lIe); Xaa en res.49 = (Val
o Met); Xaa en res.50 = (His, Asn o Arg); Xaa en res.51 = (Phe,
Leu, Asn, Ser, Ala o Val); Xaa en res.52 = (lIe, Met, Asn, Ala, Val
o Leu); Xaa en res.53 = (Asn, Lys, Ala, Glu, Gly o Phe); Xaa en
res.54 = (Pro, Ser o Val); Xaa en res.55 = (Glu, Asp, Asn, Gly, Val
o Lys); Xaa en res.56 = (Thr, Ala, Val, Lys, Asp, Tyr, Ser, Ala, Pro
o His); Xaa en res.57 = (Val, Ala o lIe); Xaa en res.58 = (Pro o
Asp); Xaa en res.59 = (Lys, Leu o Glu); Xaa en res.60 = (Pro o
Ala); Xaa en res.63 = (Ala o Val); Xaa en res.65 = (Thr, Ala o Glu);
Xaa en res.66 = (Gln, Lys, Arg o Glu); Xaa en res.67 = (Leu, Met o
Val); Xaa en res.68 = (Asn, Ser, Asp o Gly); Xaa en res.69 = (Ala,
Pro o Ser); Xaa en res.70 = (lIe, Thr, Val o Leu); Xaa en res.71 =
(Ser, Ala o Pro); Xaa en res.72 = (Val, Met o lIe); Xaa en res.74 =
(Tyr o Phe); Xaa en res.75 = (Phe, Tyr, Leu o His); Xaa en res.76 =
(Asp, Asn o Leu); Xaa en res.77 = (Asp, Glu, Asn o Ser); Xaa en
res.78 = (Ser, Gln, Asn, Tyr o Asp); Xaa en res.79 = (Ser, Asn,
Asp, Glu o Lys); Xaa en res.80 = (Asn, Thr o Lys); Xaa en res.82 =
(lIe, Val o Asn); Xaa en res.84 = (Lys o Arg); Xaa en res.85 =
(Lys, Asn, Gln, His o Val); Xaa en res.86 = (Tyr o His); Xaa en
res.87 = (Arg, Gln, Glu o Pro);.Xaa en res.88 = (Asn, Glu o Asp);
Xaa en res.90 = (Val, Thr, Ala o lIe); Xaa en res.92 = (Arg, Lys,
Val, Asp o Glu);
Xaa en res. 93 = (Ala, Gly, Glu o Ser); Xaa en res.95 = (Gly o Ala) y Xaa en res.97 = (His o Arg).
Xaa en res. 93 = (Ala, Gly, Glu o Ser); Xaa en res.95 = (Gly o Ala) y Xaa en res.97 = (His o Arg).
\vskip1.000000\baselineskip
en donde cada Xaa se selecciona
independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos
especificados definidos como sigue: "Res". significa
"resto" y Xaa en res.2 = (Lys, Arg, Ala o Gln); Xaa en res.3 =
(Lys, Arg o Met); Xaa en res.4 = (His, Arg o Gln); Xaa en res.5 =
(Glu, Ser, His, Gly, Arg, Pro, Thr o Tyr); Xaa en res.7 = (Tyr o
Lys); Xaa en res.8 = (Val o lIe); Xaa en res.9 = (Ser, Asp o Glu);
Xaa en res.11 = (Arg, Gln, Ser, Lys o Ala); Xaa en res.12 = (Asp,
Glu o Lys); Xaa en res.13 = (Leu, Val o lIe); Xaa en res.16 = (Gln,
Leu, Asp, His, Asn o Ser); Xaa en res.17 = (Asp, Arg, Asn o Glu);
Xaa en res.19 = (He o Val); Xaa en res.20 = (Ile o Val); Xaa en
res.21 = (Ala o Ser); Xaa en res.23 = (Glu, Gln, Leu, Lys, Pro o
Arg); Xaa en res.24 = (Gly o Ser); Xaa en res.25 = (Tyr o Phe); Xaa
en res.26 = (Ala, Ser, Asp, Met, His, Gln, Leu o Gly); Xaa en res.28
= (Tyr, Asn o Phe); Xaa en res.31 = (Glu, His, Tyr, Asp, Gln o
Ser); Xaa en res.33 = (Glu, Lys, Asp, Gln o Ala); Xaa en res.35 =
(Ala, Ser, Pro, Gln o Asn); Xaa en res.36 = (Phe, Leu o Tyr); Xaa en
res.38 = (Leu, Val o Met); Xaa en res.39 = (Asn, Asp, Ala, Thr o
Pro); Xaa en res.40 = (Ser, Asp, Glu, Leu, Ala o Lys); Xaa en
res.41 = (Tyr, Cys, His, Ser o lIe); Xaa en res.42 = (Met, Phe, Gly
o Leu); Xaa en res.43 = (Asn, Ser o Lys); Xaa en res.44 = (Ala,
Ser, Gly o Pro); Xaa en res.45 = (Thr, Leu o Ser); Xaa en res.49 =
(lIe, Val o Thr); Xaa en res.50 = (Val, Leu o lIe); Xaa en res.51 =
(Gln o Arg); Xaa en res.52 = (Thr, Ala o Ser); Xaa en res.53 = (Leu
o lIe); Xaa en res.54 = (Val o Met); Xaa en res.55 = (His, Asn o
Arg); Xaa en res.56 = (Phe, Leu, Asn, Ser, Ala o Val); Xaa en
res.57 == (lIe, Met, Asn, Ala, Val o Leu); Xaa en res.58 = (Asn,
Lys, Ala, Glu, Gly o Phe); Xaa en res.59 = (Pro, Ser o Val); Xaa en
res.60 = (Glu, Asp, Gly, Val o Lys); Xaa en res.61 = (Thr, Ala,
Val, Lys, Asp, Tyr, Ser, Ala, Pro o His); Xaa en res.62 = (Val, Ala
o lIe); Xaa en res.63 = (Pro o Asp); Xaa en res.64 = (Lys, Leu o
Glu); Xaa en res.65 = (Pro o Ala); Xaa en res.68 = (Ala o Val); Xaa
en res.70 = (Thr, Ala o Glu); Xaa en res.71 = (Gln, Lys, Arg o
Glu); Xaa en res.72 = (Leu, Met o Val); Xaa en res.73 = (Asn, Ser,
Asp o Gly); Xaa en res.74 = (Ala, Pro o Ser); Xaa en res.75 = (lIe,
Thr, Val o Leu); Xaa en res.76 = (Ser, Ala o Pro); Xaa en res.77 =
(Val, Met o lIe); Xaa en res.79 = (Tyr o Phe); Xaa en res.80 =
(Phe, Tyr, Leu o His); Xaa en res.81 = (Asp, Asn o Leu); Xaa en
res.82 = (Asp, Glu, Asn o Ser); Xaa en res.83 = (Ser, Gln, Asn, Tyr
o Asp); Xaa en res.84 = (Ser, Asn, Asp, Glu o Lys); Xaa en res.85 =
(Asn, Thr o Lys); Xaa en res.87 = (lIe, Val o Asn); Xaa en res.89 =
(Lys o Arg); Xaa en res.90 = (Lys, Asn, Gln, His o Val); Xaa en
res.91 = (Tyr o His); Xaa en res.92 = (Arg, Gln, Glu o Pro); Xaa en
res.93 = (Asn, Glu o Asp); Xaa en res.95 = (Val, Thr, Ala o lIe);
Xaa en res.97 = (Arg, Lys, Val, Asp o Glu); Xaa en res.98 = (Ala,
Gly, Glu o Ser); Xaa en res.100 = (Gly o Ala); and Xaa en res.102 =
(His o
Arg).
Las secuencias particularmente útiles para uso
como morfógenos en esta invención incluyen los dominios
C-terminales, por ejemplo los restos de aminoácidos
96-102 C-terminales de VgI,
Vgr-1, DPP, OP-1,
OP-2, CBMP-2A,
CBMP-2B, GDF-1 (véase la Tabla II
siguiente y Seq. ID Nos. 5-14), así como las
proteínas que comprenden los dominios C-terminales
de 60A, BMP3, BMP5 y BMP6 (véase Seq. ID Nos.
24-28), todos los cuales incluyen al menos el
esqueleto conservado de seis o siete cisteínas. Además, las
construcciones biosintéticas diseñadas a partir de las secuencias
genéricas, tales como COP-1, 3-5, 7,
16, descritas en el documento de Patente de EE.UU. Nº 5.011.691,
también son útiles. Se anticipa que éstas incluyen variantes
alélicas, variantes de especie y otras variantes de secuencia (por
ejemplo, "muteínas" o "proteínas mutantes"), ya sea de
origen natural o producidas por biosíntesis, así como miembros
nuevos de esta familia morfogénica de proteínas.
Tal como se utiliza aquí, se entiende que la
terminología "homología de secuencia de aminoácidos" significa
similitud entre secuencias de aminoácidos, y las secuencias
homólogas comparten aminoácidos idénticos o similares, en donde los
aminoácidos similares son aminoácidos conservados según ha definido
Dayoff et al. Atlas of Protein Sequence and Structure,
volumen 5, suplemento 3, páginas 345-362 (M.O.
Dayoff, ed., Nat'1 BioMed Research Fdn., Washington D.C 1978). Así,
una secuencia candidata que comparte el 70% de homología de
aminoácidos con una secuencia de referencia requiere que, después
de la alineación de la secuencia candidata con la secuencia de
referencia, el 70% de los aminoácidos de la secuencia candidata son
idénticos a los aminoácidos correspondientes en la secuencia de
referencia, o constituyen un cambio conservado de aminoácido para la
misma. "Identidad de secuencias de aminoácidos" se entiende
que requiere aminoácidos idénticos entre dos secuencias alineadas.
Así, una secuencia candidata que comparte 60% de identidad de
aminoácidos con una secuencia de referencia requiere que, tras la
alineación de la secuencia candidata con la secuencia de referencia,
el 60% de los aminoácidos de la secuencia candidata son idénticos a
los correspondientes aminoácidos en la secuencia de referencia.
Como se utiliza aquí, todas las homologías e
identidades calculadas utilizan OP-1 como secuencia
de referencia. También como se utiliza aquí, las secuencias se
alinean para los cálculos de homología e identidad utilizando el
método de Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol.
48:443-453 y las identidades se calculan por
el programa Align (DNAstar, Inc.). En todos los casos, las grietas
internas y las inserciones de aminoácidos en la secuencia candidata
alineadas se ignoran cuando se hacen los cálculos de
homología/identidad.
Las secuencias de proteína útiles como
morfógenos en esta invención incluyen aquellas que tienen más de 60%
de identidad, preferiblemente más de 65% de identidad, con la
secuencia de aminoácidos que define el esqueleto con seis cisteínas
conservadas de hOP-1 (por ejemplo, restos
43-139 de Seq. ID No. 5). Estas secuencias más
preferidas incluyen tanto variantes alélicas como de especie de las
proteínas OP-1 y OP-2, incluida la
proteína de Drosophila 60A. Por consiguiente, en otro aspecto
preferido de la invención, los morfógenos útiles incluyen proteínas
activas que comprenden especies de cadenas polipeptídicas que tienen
la secuencia de aminoácidos genérica referida aquí como "OPX",
que acomoda las homologías entre las diversas especies identificadas
de OP-1 y OP-2 (Seq. ID No. 29).
Con fines ilustrativos, los morfógenos útiles
incluyen proteínas activas que comprenden cadenas polipeptídicas
codificadas por ácidos nucleicos que se hibridan a secuencia de ADN
o ARN que codifican la secuencia C-terminal que
define el dominio de cisteínas conservadas, por ejemplo, nucleótidos
1036-1341 y nucleótidos 1390-1695
de Seq ID Nos. 16 y 20, respectivamente, de OP1 u OP2 en condiciones
estrictas de hibridación. Como se utiliza aquí, condiciones
estrictas de hibridación se definen como hibridación en 40% de
formamida, 5 X SSPE, 5 X solución de Denhardt y 0,1% de SDS al 37ºC
durante una noche, y lavado en 0,1 X SSPE, 0,1% de SDS a 50ºC.
Los morfógenos útiles en los usos y dispositivos
de esta invención incluyen proteínas definidas en las
reivindicaciones, ya sea aisladas a partir de fuentes naturales, o
producidas por ADN recombinante u otras técnicas de síntesis, e
incluye variantes alélicas y de especie de estas proteínas, mutantes
naturales o biosintéticos de las mismas, así como construcciones
truncadas y de fusión diversas. También se considera que los
mutantes por deleción o adición son activos, incluyéndose aquellos
que pueden alterar el esqueleto conservado de cisteínas
C-terminal, siempre que la alteración no altere
funcionalmente la relación de estas cisteínas en la estructura
plegada. Por consiguiente, tales formas activas se consideran el
equivalente de las construcciones descritas específicamente
divulgadas aquí. Las proteínas pueden incluir formas con patrones de
glicosilación variables, extremos N-terminales
variables, una famila de proteínas relacionadas que tiene regiones
de homología de secuencia de aminoácidos, y formas truncadas o
mutadas activas de proteínas nativas o biosintéticas, producidas por
expresión de ADN recombinante en células hospedantes.
Las proteínas morfogénicas se pueden expresar a
partir de ANDc intacto o truncado o a partir de ADN sintético en
células hospedantes procarióticas o eucarióticas, y se puede
purificar, escindir, replegar y dimerizar para formar composiciones
morfogénicamente activas. Las células hospedantes actualmente
preferidas incluyen las células de E. coli o mamíferos,
tales como células CHO, COS o BSC. Una descripción detallada de los
morfógenos útiles en los métodos, composiciones y dispositivos de
esta invención se describe en las Solicitudes de Patente de EE.UU.
co-pendientes N^{os} de Serie 752.774, presentada
el 30 de Agosto de 1991 y 667.274, presentada el 11 de Marzo de
1991.
Así, en vista de esta descripción, los expertos
en ingeniería genética pueden aislar genes a partir de bancos de
ADNc o genómicos de diversas especies diferentes que codifican
secuencias de aminoácidos apropiados, o construir ADNs a partir de
oligonucleótidos, y después pueden expresarlos en diversos tipos de
células hospedantes, ya sea de procariotas como de eucariotas, para
producir grandes cantidades de proteínas activas capaces de
mantener las vías neurales en un mamífero, incluida la mejora de la
supervivencia de las neuronas en riesgo de morir y la estimulación
de la regeneración nerviosa y de la reparación de los nervios en
diversos mamíferos, incluidos los seres humanos.
Los objetos, características y ventajas
anteriores así como otros, de la presente invención, serán más
claros a partir de la siguiente descripción detallada de la
invención.
Los anteriores objetos y características así
como otros de esta invención, lo mismo que la propia invención,
pueden entenderse mejor a partir de la siguiente descripción, cuando
se lea junto con los dibujos anexos, en los que:
La Fig. 1(A y B) son fotomicrografías que
ilustran la capacidad del morfógeno (OP-1) para
inducir a las células de glioma x neuroblastoma (1A) a
rediferenciarse dando una morfología característica de neuronas no
transformadas (1B);
La Fig. 2A es una cruva
dosis-respuesta para la inducción de las isoformas
de N-CAM de 180 kDa y 140 kDa en células
NG108-15 tratadas con morfógeno;
La Fig. 2B es una fotomicrografía de una
transferencia Western de extractos de células completas procedentes
de células NG109-15 tratadas con morfógeno con un
anticuerpo específico para N-CAM; y
La Fig. 3 es una representación gráfica del
número medio de agregados celulares contados en 20 campos
seleccionados al azar en función de la concentración de
morfógeno;
La Fig. 4 es una fotomicrografía de una
inmunotransferencia que demuestra la presencia de
OP-1 en suero humano.
La invención se define en las reivindicaciones
adjuntas.
A continuación se proporcionan descripciones
detalladas de morfógenos adecuados y útiles en los usos y
dispositivos de esta invención, así como métodos de ejemplo gpara
su administración y aplicación, y numerosos ejemplos no limitantes
que 1) ilustran la adecuabilidad de los morfógenos y de los agentes
estimuladores de morfógenos que se describen aquí como agentes
terapéuticos para mantener vías neurales en un mamífero y mejorar la
supervivencia de células neuronales en riesgo de morir; y 2)
proporcionan ensayos con los que someter a prueba morfógenos
candidatos y agentes estimuladores de morfógenos en busca de su
eficacia.
En las reivindicaciones adjuntas se definen
morfógenos útiles. Tal como se define aquí, una proteína es
morfogénica si es capaz de inducir la cascada congénita de
episodios celulares y moleculares que culminan en la formación de
un nuevo tejido específico de un órgano y comprende al menos el
esqueleto conservado con seis cisteínas C-terminal
o su equivalente funcional (véase supra). Concretamente, los
morfógenos generalmente son capaces de desarrollar todas las
funciones biológicas siguientes en un medio morfogénicamente
permisivo: estimular la proliferación de células progenitoras;
estimula la diferenciación de células progenitoras; estimular la
proliferación de células diferenciadas; y sustentar el desarrollo y
mantenimiento de células diferenciadas. Los detalles de cómo los
morfógenos útiles en la invención fueron identificados por primera
vez, así como una descripción sobre cómo hacer, usar y ensayar
dichos morfógenos en busca de su actividad morfogénica, se
describen en la Solicitud Internacional US92/01968 (documento WO
92/15323). Como se describe aquí, los morfógenos se pueden
purificar a partir de material natural o producido recombinantemente
a partir de células hospedantes procarióticas o eucarióticas,
utilizando las secuencias genéticas descritas allí.
Alternativamente, se pueden identificar nuevas secuencias
morfogénicas siguiendo los procedimientos allí descritos.
Las proteínas particularmente útiles incluyen
aquellas que comprenden las secuencias de origen natural descritas
en la Tabla II. Otras secuencias útiles incluyen construcciones
biosintéticas tales como las descritas en el documento de Patente
de EE.UU. 5.011.691, cuya descripción se incorpora aquí como
referencia (p. ej., COP-1, COP-3,
COP-4, COP-5, COP-7
y COP-16).
Los morfógenos útiles en la invención también se
pueden describir por 6 secuencias (las Secuencias genéricas 1, 2,
3, 4 y 5 se describen con fines ilustrativos solamente y caen fuera
del alcance de la presente invención). Las Secuencias genéricas 1 y
2 también incluir al menos en su extremo N, la secuencia
La Tabla II, expuesta más adelante, compara las
secuencias de aminoácidos de las regiones activas de proteínas
nativas que han sido identificadas como morfógenos, incluyendo
OP-1 humana (hOP-1, Seq. ID Nos. 5 y
16-17), OP-1 de ratón
(mOP-1, Seq. ID Nos. 6 y 18-19),
OP-2 humana y de ratón (Seq. ID Nos. 7, 8 y
20-23), CBMP2A (Seq. ID No. 9), CBMP2B (Seq. ID No.
10), BMP3 (Seq. ID No. 26), DPP (de Drosophila, Seq. ID No. 11), Vgl
(de Xenopus, Seq. ID No. 12), Vgr-1 (de ratón, Seq
ID No. 13), GDF-1 (de ratón, Seq. ID Nos. 14, 32 y
33), proteína 60A (de Drosophila, Seq. ID Nos. 24 y 25), BMP5 (Seq.
ID No. 27) y BMP6 (Seq. ID No. 28). Las secuencias se alinean
esencialmente siguiendo el método de Needleman et al. (1970)
J. Mol. Biol. 48:443-453, calculado
usando el programa Align (DNAstar, Inc.). En la Tabla, tres puntos
seguidos indican que el aminoácido en esa posición es el mismo que
el aminoácido en hOP-1. Tres guiones seguidos
indican que no hay presente ningún aminoácido en esa posición, y se
incluyen con el fin de ilustrar las homologías. Por ejemplo, el
resto de aminoácido 60 de CBMP-2A y
CBMP-2B es "inexistente". Por supuesto, estas
dos secuencias de aminoácidos en esta región comprenden
Asn-Ser (restos 58, 59), comprendiendo seguidamente
la CBMP-2A Lys e Ile, mientras que la
CBMP-2B comprende Ser e Ile.
Como es evidente a partir de las comparaciones
de las anteriores secuencias de aminoácidos, se pueden hacer
cambios significativos de aminoácidos dentro de las secuencias
genéricas si bien siguen reteniendo la actividad morfogénica. Por
ejemplo, mientras que la secuencia proteica de GDF-1
representada en la Tabla II comparte sólo alrededor del 50% de la
identidad de aminoácidos con la secuencia hOP-1
descrita allí, la secuencia GDF-1 comparte más del
70% de homología (o "similitud") en la secuencia de aminoácidos
con la secuencia hOP-1, en donde "homología" o
"similitud" incluye cambios de aminoácidos conservativos dentro
de la secuencia, según define Dayoff et al. Atlas of Protein
Sequence and Structure, vol. 5, suplemento 3, páginas
345-362 (M.O. Dayoff, ed., Nat'1 BioMed. Res. Fd'n,
Washington, D.C. 1978).
La secuencias proteicas útiles como morfógenos
en esta invención incluyen las que tienen más de 60% de identidad,
preferiblemente más de 65% de identidad, definiendo la secuencia de
aminoácidos el esqueleto conservado con seis cisteínas de
hOP-1 (p. ej., restos 43-139 de Seq.
ID No. 5). Estas secuencias incluyen variantes tanto alélicas como
de especie de las proteínas OP-1 y
OP-2, incluida la proteína 60A de Drosophila. La
invención incluye morfógenos que comprenden especies de cadenas
polipeptídicas que tienen la secuencia de aminoácidos genérica
referida aquí como "OPX", que define el esqueleto con siete
cisteínas y acomoda las identidades entre las diversas proteínas
OP-1 y OP-2 de ratón y humanas
identificadas. OPX se presenta en Seq. ID No. 29. Como se describe
allí, cada Xaa en una posición dada se selecciona independiente de
los restos que ocurren en la posición correspondiente en la
secuencia C-terminal de OP-1 u
OP-2 de ratón o humana (véanse Seq. ID Nos.
5-8 y/o Seq. ID Nos. 16-23).
Con fines ilustrativos, los morfógenos pueden
ser proporcionados a un individuo por cualquier medio adecuado,
preferiblemente de forma directa (p. ej., localmente, por ejemplo
por inyección a un locus del tejido nervioso) o sistémicamente (p.
ej., por vía parenteral u oral). Cuando el morfógeno se va a
proporcionar parenteralmente, por ejemplo por vía intravenosa,
subcutánea, intramuscular, intraorbital, oftálmica,
intraventricular, intracraneal, intracapsular, intraespinal,
intracisternal, intraperitoneal, bucal, rectal, vaginal, intranasal
o por administración por aerosol, el morfógeno preferiblemente
comprende parte de una solución acuosa. La solución es
fisiológicamente aceptable de modo que además de administrar el
morfógeno deseado al paciente, la solución no afecta de modo
adverso al balance electrolítico y volumínico del paciente. El medio
acuoso para el morfógeno puede comprender pues solución salina
fisiológica normal (NaCl al 9,85%, 0,15 M), pH
7-7,4. La solución acuosa que contiene el morfógeno
se puede hacer, disolviendo la proteína en etanol al 50% que
contiene acetonitrilo en ácido trifluoroacético al 0,1% (TFA) o HCl
al 0,1%, o disolventes equivalentes. Un volumen de la solución
resultante se añade luego, por ejemplo, a 10 volúmenes de solución
salina tamponada con fosfato (PBS), que puede incluir además
seroalbúmina humana al 0,1-0,2% (HSA). La solución
resultante preferiblemente se somete a vórtice extensamente. Si se
desea, un morfógeno dado se puede hacer más soluble asociándolo con
una molécula adecuada. Por ejemplo, la asociación del dímero maduro
con el dominio pro del morfógeno incrementa la solubilidad de la
proteína significativamente (véase la sección 11.1, más adelante).
En efecto, se piensa que la proteína endógena es transportada en
esta forma. Otra molécula capaz de intensificar la solubilidad y
particularmente útil para administraciones orales es la caseína.
Por ejemplo, la adición de caseína al 0,2% eleva la solubilidad de
la forma activa madura de OP-1 en un 80%. Otros
componentes que se encuentran en la leche y/o diversas proteínas de
suero también pueden ser útiles.
Las soluciones útiles para administración
parenteral se pueden preparar por cualquiera de los métodos bien
conocidos en la técnica farmacéutica, descritos, por ejemplo, en
Remington's Pharmaceutical Sciences (Gennaro, A., ed.), Mack
Pub., 1980. Las formulaciones pueden incluir, por ejemplo,
polialquilenglicoles tales como polietilenglicol, aceites de origen
vegetal, naftalenos hidrogenados, y similares. Las formulaciones
para administración directa, en particular, pueden incluir glicerol
y otras composiciones de alta viscosidad. Polímeros biocompatibles,
preferiblemente biorresorbibles, que incluyen, por ejemplo, ácido
hialurónico, colágeno, polibutirato, fosfato tricálcico, láctido y
copolímeros de láctido/glicólido, pueden ser excipientes útiles para
controlar la liberación del morfógeno in vivo. Otros
sistemas de administración parenterales potencialmente útiles para
estos morfógenos incluyen partículas de copolímero de
etileno-acetato de vinilo, bombas osmóticas,
sistemas de infusión implantables y liposomas. Las formulaciones
para administración por inhalación contienen como excipientes, por
ejemplo, lactosa, o pueden ser soluciones acuosas que contienen, por
ejemplo,
polioxietilen-9-lauril-éter,
glicocolato y desoxicolato, o soluciones oleosas para administración
en forma de gotas nasales, o como gel para aplicar intranasalmente.
Las formulaciones para administración parenteral también incluyen
glicocolato para administración bucal, metoxisalicilato para
administración rectal o ácido cútrico para administración
vaginal.
Alternativamente, los morfógenos descritos aquí
se pueden administrar por vía oral. La administración oral de
proteínas como agentes terapéuticos generalmente no se pone en
práctica ya que la mayoría de las proteínas se degradan fácilmente
por las enzimas y los ácidos digestivos en el tracto digestivo de
los mamíferos antes de poder ser adsorbidas en la circulación
sanguínea. Sin embargo, los morfógenos aquí descritos típicamente
son estables en medio ácido y resistentes a las proteasas (véase, p.
ej., Patente de EE.UU. Nº 4.968.590). Además, se ha identificado al
menos un morfógeno OP-1 en extracto de glándula
mamaria, calostro y leche de 57 días. Además, la
OP-1 purificada de extracto glandular mamario es
morfogénicamente activa. Específicamente, esta proteína induce la
formación de hueso endocondrial en mamíferos cuando se implanta
subcutáneamente en combinación con un material adecuado como
matriz, utilizando un ensayo de hueso in vivo clásico, tal
como se describe en el documento de Patente de EE.UU. Nº 4.968.590.
Además, también se detecta el morfógeno en la circulación sanguínea
(véase el Ejemplo 9 siguiente). Finalmente, el morfógeno en forma
soluble, por ejemplo morfógeno maduro asociado con el dominio pro,
es capaz de mantener las vías neurales en un mamífero (véanse los
Ejemplos 4 y 6 siguientes). Estos hallazgos indican que la
administración oral y parenteral son medios viables para
administrar morfógenos a un individuo. Además, aunque las formas
maduras de ciertos morfógenos descritos aquí típicamente son poco
solubles, la forma de morfógeno encontrada en la leche (y en el
extracto glandular mamario y el calostro) es fácilmente soluble,
probablemente por asociación de la forma morfogénicamente activa,
madura, con parte o todo el dominio pro de la secuencia intacta y/o
por asociación con uno o más componentes de la leche. Por
consiguiente, los compuestos proporcionados aquí también se puede
asociar con moléculas capaces de intensificar su solubilidad in
vitro o in vivo.
Los compuestos proporcionados aquí también se
pueden asociar con moléculas capaces de dirigir específicamente el
morfógeno o el agente estimulador del morfógeno al tejido nervioso.
Por ejemplo, se puede utilizar un anticuerpo, fragmento de
anticuerpo, u otra proteína de unión que interaccione
específicamente con una molécula de superficie sobre las células de
tejido nervioso, incluidas las células neuronales o
neuroneurogliales. Se pueden utilizar moléculas guiadoras útiles,
por ejemplo, utilizando la tecnología del sitio de unión a una
cadena individual, descrito, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. Nº
5.091.513.
Como se ha descrito anteriormente, los
morfógenos proporcionados aquí comparten una homología de secuencias
significativa en los dominios activos del extremo
C-terminal. Por el contrario, las secuencias
típicamente divergen significativamente en las secuencias que
definen el dominio pro. En consecuencia, se cree que el dominio pro
es específico del morfógeno. Como se ha descrito anteriormente, se
sabe también que los diversos morfógenos identificados hasta la
fecha se expresan de forma diferenciada en los diferentes tejidos.
Por consiguiente, sin limitarse a ninguna teoría en particular, es
probable que, en las condiciones naturales del cuerpo, morfógenos
seleccionados actúen típicamente sobre un tejido dado. En
consecuencia, parte o la totalidad de los dominios pro que han sido
identificados en asociación con la forma activa del morfógeno en
solución, pueden servir como moléculas guiadoras para los
morfógenos descritos aquí. Por ejemplo, los dominios pro pueden
interaccionar específicamente con una o más moléculas en el tejido
diana para dirigir el morfógeno asociado con el dominio pro a ese
tejido. En consecuencia, otra molécula guiadora útil para dirigir el
morfógeno al tejido nervioso es parte o la totalidad de un dominio
pro de morfógeno, particularmente parte o la totalidad de los
dominios pro de OP-1 o GDF-1,
proteínas ambas que se encuentran asociadas de forma natural con el
tejido nervioso.
Finalmente, los morfógenos descritos aquí se
pueden administrar a solas o en combinación con otras moléculas que
se sabe que son beneficiosas para mantener las rutas neurales,
incluidos los factores de crecimiento nervioso y los agentes
anti-inflamatorios.
Con fines ilustrativos, los compuestos
proporcionados aquí se pueden formular en composiciones
farmacéuticas por mezcla con excipientes y vehículos no tóxicos y
farmacéuticamente aceptables. Como se ha indicado anteriormente,
tales composiciones se pueden preparar para administración
parenteral, particularmente en forma de soluciones o suspensiones
líquidas; para administración oral, particularmente en forma de
comprimidos o cápsulas; o intranasalmente, en particular en forma de
polvos, gotas nasales o aerosoles.
Las composiciones se pueden formular para
administración parenteral u oral a seres humanos u otros mamíferos
en cantidades terapéuticamente eficaces, por ejemplo, cantidades que
proporcionan concentraciones apropiadas durante un tiempo
suficiente para eliminar o reducir la condición patológica del
paciente, para proporcionar terapia para las enfermedades
neurológicas y trastornos descritos anteriormente y cantidades
eficaces para mejorar la supervivencia de las células neurales y/o
proteger las neuronas y las vías neurales antes de establecerse la
lesión en el tejido nervioso.
Como apreciarán los expertos en la técnica, la
concentración de los compuestos descritos aquí en una composición
terapéutica variará dependiendo de diversos factores, entre los que
se incluyen la dosificación de fármaco que se va a administrar, las
características químicas (por ejemplo hidrofobia) de los compuestos
empleados y la ruta de administración. La dosificación preferida
del fármaco que se va a administrar probablemente también dependerá
de variables tales como el tipo y grado de progresión de la
enfermedad neurológica, el estado general de salud del paciente
particular, la eficacia biológica relativa del compuesto
seleccionado, la formulación de los excipientes del compuesto, y su
ruta de administración. En términos generales, los compuestos de
esta invención se pueden proporcionar en una solución tampón
fisiológica acuosa que contiene alrededor de 0,1 a 10% p/v de
compuesto para administración parenteral. Los intervalos de
dosificación típicos son de aproximadamente 10 ng/kg a
aproximadamente 1 g/kg de peso corporal al día; un intervalo de
dosis preferido es de aproximadamente 0,1 \mug/kg a 100 mg/kg de
peso corporal al día. Óptimamente, la dosificación de morfógeno dada
en todos los casos está entre 2 y 20 \mug de proteína por kg de
peso de paciente al día. No se induce ninguna lesión patológica
inducida por OP-1 obvia cuando se administra
morfógeno maduro (por ejemplo OP-1, 20 \mug)
diariamente a ratas en fase de desarrollo normales durante 21 días
consecutivos. Además, inyecciones sistémicas de 10 \mug de
morfógeno (p. ej., OP-1) inyectada diariamente
durante 10 días en ratones recién nacidos normales no producen
ninguna anomalía voluminosa.
Como la capacidad de las proteínas y de los
fragmentos proteicos de penetrar en la barrera hematoencefálica
puede estar relacionada con su tamaño, lipofilia o su carga iónica
neta, se pueden formular modificaciones adecuadas de los morfógenos
(p. ej., sustitución de fenilalanina por pentafluorofenilalanina, o
conjugación con una proteína cationizada tal como albúmina) para
incrementar su transportabilidad a través de la barrera, utilizando
metodologías clásicas conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo,
Kastin et al., Pharmac. Biochem. Behav. (1979)
11:713-716; Rapport et al., Science
(1980) 207:84-86; Pardridge et al.,
(1987) Biochem. Biophys. Res. Commun.
146:307-313; Riekkinen et al., (1987)
Peptides 8:261-265. La eficacia de
estos análogos funcionales se puede estimar, por ejemplo, evaluando
la capacidad de estos compuestos para inducir la rediferenciación
de las células transformadas o intensificar la supervivencia de las
neuronas en riesgo de morir como se describe en los Ejemplos
proporcionados aquí.
Cuando se van a administrar los morfógenos
sistémicamente en los métodos de la presente invención,
preferiblemente se utiliza una dosis de carga muy voluminosa al
comienzo del tratamiento. Después el tratamiento se continúa con
una dosis de mantenimiento. La administración adicional puede ser
determinada vigilando a intervalos los niveles del morfógeno en la
sangre.
Cuando se induce lesión en las neuronas de una
vía neural deliberadamente como parte de, por ejemplo, una
intervención quirúrgica, preferiblemente el morfógeno se proporciona
justo antes de inducir el traumatismo o al mismo tiempo que éste.
Preferiblemente, el morfógeno se administra profilácticamente en un
marco quirúrgico. Óptimamente, la dosificación del morfógeno dada
en todos los casos está entre 2 y 20 \mug de proteína por kg de
peso del paciente.
Cuando el morfógeno se va a proporcionar en un
sitio para estimular la regeneración de un axón, preferiblemente el
morfógeno se proporciona en el sitio en asociación con un vehículo
biocompatible, preferiblemente biorresorbible, adecuado para
mantener una proteína en un sitio in vivo, y a través del
cual se pueda regenerar una prolongación neural. Un vehículo aquí
preferido también comprende suficiente estructura para facilitar la
dirección del crecimiento axonal. Los vehículos preferidos aquí
incluyen moléculas estructurales tales como colágeno, ácido
hialurónico o laminina, y/o polímeros o copolímeros sintéticos de,
por ejemplo, poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico) o
poli(ácido butírico). Los más preferidos actualmente son vehículos
que comprenden matriz extracelular de tejido. Éstos se pueden
obtener comercialmente. Además, una matriz extracelular derivada de
tejido cerebral se puede preparar como se describe en la Solicitud
Internacional US92/01969 (documento WO 92/15323) y/o por otros
medios conocidos en la técnica.
Los medios actualmente preferidos para reparar
roturas en rutas neurales, particularmente rutas del sistema
nervioso periférico, incluyen proporcionar el morfógeno en el sitio
como parte de un dispositivo que incluye una membrana o envolvente
biocompatible de una dimensión suficiente para abarcar la rotura y
con unas aberturas destinadas a recibir las terminaciones nerviosas
seccionadas. El morfógeno se dispone dentro de la envolvente,
preferiblemente dispersado a lo largo de un vehículo adecuado, y es
accesible a las terminaciones nerviosas seccionadas.
Alternativamente, el morfógeno se puede absorber sobre la superficie
interior de la envolvente, o también asociarse con ella. Además,
las envolventes actualmente preferidas tienen una superficie
exterior impermeable. La envolvente actúa como canal de guía del
nervio, facilitando el direccionamiento del crecimiento axonal.
Además, la envolvente también protege el nervio dañado
inmunológicamente de agentes que pueden ayudar a la formación de
tejido cicatrizal. Materiales adecuados para canales o envolventes
incluyen silicona o materiales biorresorbibles tales como colágeno,
ácido hialurónico, laminina, poli(ácido láctico), poli(ácido
glicólico), poli(ácido butírico) y similares. Adicionalmente,
aunque los canales de guía de nervios descritos aquí generalmente
tienen forma tubular, será evidente para los expertos en la técnica
que se pueden emplear diversas formas alternativas. La luz de los
canales de guía puede ser, por ejemplo, ovalada o incluso cuadrada
en lo que se refiere a su sección transversal. Por otro lado, los
canales de guía se pueden construir de dos o más piezas que se
pueden abrazar entre sí para afianzar los muñones de los nervios.
Las terminaciones nerviosas se pueden asegurar en los canales de
guía de nervios por medio de suturas, adhesivos biocompatibles tales
como pegamento de fibrina u otros materiales conocidos en el campo
de la medicina.
Con fines ilustrativos, una forma de morfógeno
útil en formulaciones terapéuticas, que tiene solubilidad mejorada
en soluciones acuosas y que consta esencialmente de aminoácidos, es
una proteína morfogénica dímera que comprende al menos la secuencia
peptídica de 100 aminoácidos que tiene el patrón de siete o más
restos de cisteína característicos de la familia del morfógeno
complejada con un péptido que comprende parte o la totalidad de una
región pro de un miembro de la familia del morfógeno, o una
variante alélica de especie o de otro tipo de la misma.
Preferiblemente, la proteína morfogénica dímera se compleja con dos
péptidos. También, la proteína morfogénica dímera preferiblemente
no se compleja covalentemente con el péptido o péptidos de la región
pro. Los péptidos de la región pro también comprenden
preferiblemente al menos los 18 aminoácidos
N-terminales que definen una región pro de morfógeno
dada. En una realización más preferida, los péptidos que definen
sustancialmente la región pro de longitud completa son los que se
utilizan.
Otras forrmas solubles de morfógenos incluyen
dímeros de las formas pro no escindidas de estas proteínas, así
como "hemidímeros" en donde la subunidad del dímero es una
forma no escindida de la proteína, y la otra subunidad comprende la
forma madura de la proteína, incluidas sus formas truncadas,
preferiblemente no asociadas covalentemente con un péptido del
domino pro escindido.
Con fines ilustrativos, como se ha descrito
anteriormente, los dominios pro útiles incluyen las regiones pro de
longitud completa, así como varias formas truncadas de la misma,
particularmente formas truncadas escindidas en los sitios de
escisión proteolíticos
Arg-Xaa-Xaa-Arg. Por
ejemplo, en OP-1 las posibles secuencias pro
incluyen secuencias definidas por los restos 30-292
(forma de longitud completa); 48-292 y
158-292. La estabilidad del complejo de
OP-1 soluble se intensifica cuando la región pro
comprende la forma de longitud completa en vez de una forma
truncada, tal como la forma truncada 48-292, ya que
los restos 30-47 presentan homología de secuencias
en las porciones N-terminales de otros morfógenos, y
se cree que tienen utilidad particular mejorando la estabilidad del
complejo para todos los morfógenos. Por consiguiente, las secuencias
pro actualmente preferidas son aquellas que codifican la forma de
longitud completa de la región pro para un morfógeno dado. Otras
secuencias pro que se piensa que tienen utilidad incluyen las
secuencias pro biosintéticas, particularmente aquellas que
incorporan una secuencia derivada de la zona
N-terminal de una o más secuencias pro de
morfógeno.
Como será evidente para los expertos en la
técnica, se pueden obtener secuencias útiles que codifican la región
pro a partir de secuencias genéticas que codifican morfógenos
conocidos. Alternativamente, se pueden construir regiones pro
quiméricas a partir de las secuencias de uno o más morfógenos
conocidos. Todavía otra opción es crear una variante de secuencia
sintética de una o más secuencias de región pro conocidas.
Los péptidos de región pro útiles incluyen las
cadenas polipeptídicas que comprenden una secuencia de aminoácidos
codificada por un ácido nucleico que se hibrida en condiciones
estrictas con una secuencia de ADN o ARN que codifica al menos los
18 aminoácidos N-terminales de la secuencia de la
región pro para OP-1 u OP-2, por
ejemplos los nucleótidos 136-192 y
152-211 de Seq. ID Nos. 16 y 19,
respectivamente.
Los morfógenos se expresan a partir de células
de mamíferos como complejos solubles. Sin embargo, típicamente el
complejo se disocia durante la purificación, generalmente al
exponerse a agentes desnaturalizantes añadidos frecuentemente a las
soluciones de purificación, tales como detergentes, alcoholes,
disolventes orgánicos, agentes caotrópicos y compuestos que se
añaden para rebajar el pH de la solución. A continuación se
proporciona un protocolo actualmente preferido para purificar las
proteínas solubles de medios acondicionados (u, opcionalmente, un
líquido corporal tal como suero, líquido cefalorraquídeo o líquido
peritoneal), en condiciones no desnaturalizantes. El método es
rápido, reproducible y forma complejos de morfógenos solubles
aislados en forma sustancialmente pura.
Los complejos de morfógenos solubles se pueden
asilar a partir de medios acondicionados utilizando un sencillo
protocolo cromatográfico que consta de tres etapas, realizado en
ausencia de desnaturalizantes. El protocolo implica aplicar el
medio (o líquido corporal) a una columna de afinidad, seguida de
cromatografías de intercambio iónico y filtración en gel. La
columna de afinidad descrita más adelante es una columna de
Zn-IMAC. El presente protocolo tiene aplicabilidad
general para la purificación de muy diversos morfógenos,
anticipándose que todos ellos serán aislables utilizando
modificaciones mínimas del protocolo descrito a continuación. Como
protocolo alternativo también se considera que tendrá utilidad una
columna de inmunoafinidad, creada utilizando procedimientos
clásicos y, por ejemplo, utilizando anticuerpos específicos para un
dominio pro de un morfógeno dado (complejado, por ejemplo, a una
columna de Sepharose conjugada con proteína A). Los protocolos para
desarrollar columnas de inmunoafinidad están bien descritos en la
técnica (véase, por ejemplo, Guide to Protein Purification,
M. Deutscher, ed., Academic Press, San Diego, 1990, particularmente
las secciones VII y XI).
En este experimento se expresó
OP-1 en células CHO de mamífero (ovario de hámster
chino) como se describe en la técnica (véase, por ejemplo, la
Solicitud Internacional US90/05903 (documento WO 91/05802)). El
medio acondicionado para células CHO que contenía 0,5% de FBS se
purificó inicialmente utilizando cromatografía de afinidad con
iones metálicos inmovilizados (IMAC). El complejo
OP-1 soluble del medio acondicionado se une muy
selectivamente a la restina Zn-IMAC y se requiere
una alta concentración de imidazol (imidazol 50 mM, pH 8) para la
elución eficaz del complejo unido. La etapa Zn-IMAC
separa el OP-1 soluble del conjunto de proteínas
séricas contaminantes que eluyen en el flujo directo y fracciones de
lavado con imidazol 35 mM. A continuación se aplica la
OP-1 soluble purificada por Zn-IMAC
a una columna de intercambio catiónico de
S-Sepharose equilibrada en NaPO_{4} 20 mM (pH 7,0)
con NaCl 50 mM. Esta etapa con S-Sepharose sirve
para purificar además y concentrar el complejo de
OP-1 soluble como preparación para la siguiente
etapa de filtración en gel. La proteína se aplicó a una columna de
Sephacryl S-200HR equilibrada en TBS. Utilizando
sustancialmente el mismo protocolo, los morfógenos solubles también
se pueden
aislar a partir de uno o más líquidos corporales, incluidos el suero, el líquido cefalorraquídeo o el líquido peritoneal.
aislar a partir de uno o más líquidos corporales, incluidos el suero, el líquido cefalorraquídeo o el líquido peritoneal.
La IMAC se realizó utilizando
Chelating-Sepharose (Pharmacia) que había sido
cargada con 3 volúmenes de columna de Zn-SO_{4}
0,2 M. El medio acondicionado se tituló a pH 7,0 y se aplicó
directamente a la resina de Zn-IMAC equilibrada en
HEPES 20 mM, pH 7,0 con NaCl 500 mM. La resina de
Zn-IMAC se cargó con 80 ml de medio acondicionado
inicial por ml de resina. Después de la carga, la columna se lavó
con tampón de equilibración y la mayoría de las proteínas
contaminantes se eluyeron con imidazol 35 mM (pH, 7,0) en tampón de
equilibración. El complejo de OP-1 soluble se eluye
después con imidazol 50 mM (pH 8,0) en HEPES 20 mM y NaCl 500
mM.
El eluato de imidazol 50 mM que contiene el
complejo de OP-1 soluble se diluyó con 9 volúmenes
de NaPO_{4} 20 mM (pH 7,0) y se aplicó a una columna de
S-Sepharose (Pharmacia) equilibrada en NaPO_{4} 20
mM (pH 7,0) con NaCl 50 mM. La resina de
S-Sepharose se cargó con un equivalente de 800 ml de
medio acondicionado inicial por ml de resina. Después de cargar, la
columna de S-Sepharose se lavó con tampón de
equilibración y se eluyó con NaCl 100 mM seguido de NaCl 300 mM y
500 mM en NaPO_{4} 20 mM (pH 7,0). La fracción de NaCl 300 mM se
purificó adicionalmente utilizando cromatografía de filtración en
gel. Se aplicaron 50 ml del eluato de NaCl 300 mM a una columna
Sephacryl S-200HR (Pharmacia) de 5,0 x 90 cm,
equilibrada en solución salina tamponada con Tris (TBS), Tris 50
mM, NaCl 150 mM (pH 7,4). La columna se eluyó a un caudal de 5 ml
por minuto recogiéndose fracciones de 10 ml. El peso molecular
aparente de la OP-1 soluble se determinó por
comparación con patrones de peso molecular de proteínas
(alcohol-deshidrogenasa (ADH, 150 kDa), seroalbúmina
bovina (BSA, 68 kDa), anhidrasa carbónica (CA, 30 kDa) y citocromo
C (cyt C, 12,5 kDa)). La pureza de las fracciones de la columna
S-200 se determinó por separación en geles de SDS
con 15% de poliacrilamida clásicos teñidos con azul coomasi. La
identidad de la OP-1 madura y el dominio pro se
determinó por análisis de secuencia N-terminal
después de la separación de OP-1 madura del dominio
pro utilizando HPLC C18 en fase inversa clásica.
El complejo de OP-1 soluble
eluye con un peso molecular aparente de 110 kDa. Esto concuerda
pefectamente con la composición predicha del complejo de
OP-1 soluble con un dímero de OP-1
madura (35-36 kDa) asociado con dos dominios pro
(39 kDa cada uno). La pureza del complejo final se puede verificar
probando la fracción apropiada en un gel de poliacrilamida al 15%
reducido.
Los componentes del complejo se pueden verificar
aplicando la fracción que contiene el complejo de las columnas
S-200 o S-200HR sobre una columna de
HPLC C18 en fase inversa y eluyendo con un gradiente de acetonitrilo
(TFA al 0,1%), utilizando procedimientos clásicos. El complejo se
disocia en esta etapa, y el dominio pro y la especie madura eluyen
como especies separadas. Esta especie separada se puede someter
después a secuenciación N-terminal utilizando
procedimientos clásicos (véase, por ejemplo, Guide to Protein
Purification, M. Deutscher, ed., Academic Press, San Diego,
1990, particularmente las páginas 602-613) y la
identidad de las proteínas aisladas de 36 kDa y 30 kDa se puede
confirmar como morfógeno maduro y dominio pro escincido, aislado,
respectivamente. La secuenciación N-terminal del
dominio pro aislado de OP-1 producida en células de
mamíferos reveló dos formas de la región pro, la forma intacta (que
empieza en el resto 30 de Seq. ID No. 16) y la forma truncada (que
empieza en el resto 48 de Seq. ID No. 16). La secuenciación
N-terminal de la subunidad polipeptídica de la
especie madura aislada revela una gama de extremos
N-terminales para la secuencia madura, que empieza
en los restos 293, 300, 313, 315, 316 y 318 de Seq. ID No. 16,
todos los cuales son activos como se demuestra por el ensayo de
inducción ósea clásica.
Como alternativa a la purificación de complejos
solubles a partir de medios de cultivo o de un líquido corporal,
los complejos solubles se pueden formular a partir de dominios pro
purificados y especies dímeras maduras. La formación efectiva del
complejo aparentemente requiere la asociación de los componentes en
condiciones desnaturalizantes suficientes para relajar la
estructura plegada de estas moléculas, sin afectar a los enlaces
disulfuro. Preferiblemente, las condiciones desnaturalizantes
simulan el entorno de una vesícula intracelular en la medida
suficiente para que el dominio pro escindido tenga la oportunidad de
asociarse con la especie dímera madura en condiciones de
plegamiento relajado. La concentración del agente desnaturalizante
en la solución se rebaja después de manera controlada,
preferiblemente gradual, de modo que se permita un replegamiento
conveniente de las regiones dimérica y pro mientras que se mantiene
la asociación del dominio pro con el dímero. Agentes
desnaturalizantes útiles incluyen urea 4-6 M o
hidrocloruro de guanidina (Gu-HCl), en soluciones
tamponadas de pH 4-10, preferiblemente
6-8. Después, el complejo soluble se forma por
diálisis controlada o dilución en una solución con una
concentración final de agente desnaturalizante de urea o
Gu-HCl menor que 0,1-2 M,
preferiblemente urea o Gu-HCl 1-2 M,
que después, preferiblemente, puede diluirse en tampón fisilógico.
Los procedimientos de purificación/renaturalización de proteínas y
las consideraciones correspondientes están bien descritas en la
técnica y los detalles para desarrollar un protocolo renaturalizante
adecuado se pueden determinar fácilmente por un experto en la
técnica. Un texto útil sobre la materia es Guide to Protein
Purification, M. Deutscher, ed., Academic Press, San Diego,
1990, particularmente la sección V. La formación de complejos
también puede facilitarse por adición de una o más proteínas de
chaperona.
La estabilidad del complejo de morfógeno soluble
altamente purificado en un tampón fisiológico, por ejemplo solución
salina tamponada con Tris (TBS) y solución salina tamponada con
fosfato (PBS), se pueden mejorar por diversas técnicas. Actualmente
se prefiere hacerlo por medio de una región pro que comprende al
menos los 18 primeros aminoácidos de la secuencia pro (por ejemplo
los restos 30-47 de Seq. ID No. 16 para
OP-1), y preferiblemente es la región pro de
longitud completa. Los restos 30-47 muestran
homología de secuencia con la zona N-terminal de
otros morfógenos y se cree que tienen utilidad particular para
mejorar la estabilidad del complejo para todos los morfógenos.
Otros medios útiles para mejorar la estabilidad de complejos de
morfógenos solubles incluyen tres clases de aditivos. Estos
aditivos incluyen aminoácidos básicos (p. ej.,
L-arginina, lisina y betaína); detergentes no
iónicos (p. ej., Tween 80 o Nonldet P-120); y
proteínas portadoras (p. ej., seroalbúmina y caseína).
Concentraciones útiles de estos aditivos incluyen:
1-100 mM, preferiblemente 10-70 mM,
incluyéndose 50 mM; aminoácido básico, 0,01-1,0%,
preferiblemente 0,05-0,2%, incluido 0,1% (v/v) de
detergente no iónico; y 0,0,1-1.0%, preferiblemente
0,05-0,2%, incluido 0,1% (p/v) de proteína
portadora.
La determinación de la distribución de
morfógenos en tejidos se puede utilizar para identificar diferentes
morfógenos expresados en un tejido dado, así como para identificar
nuevos morfógenos relacionados. La distribución en tejido también
se puede utilizar para identificar un tejido útil productor de
morfógeno para uso en la detección precoz e identificación de
agentes estimuladores de morfógenos candidatos. Los morfógenos (o
sus transcritos de ARNm) se identifican fácilmente en diferentes
tejidos utilizando metodologías clásicas y modificaciones
minoritarias de los mismos en tejidos en que la expresión puede ser
baja. Por ejemplo, se puede determinar la distribución de proteínas
utilizando un análisis de transferencia Western o técnicas
inmunofluorescentes clásicas, y anticuerpos específicos para el
morfógeno o los morfógenos de interés. De modo similar, la
distribución de transcritos de morfógenos se puede determinar
utilizando protocolos de hibridación Northern clásicos y sondas
específicas para los
transcritos.
transcritos.
Se puede utilizar cualquier sonda capaz de
hibridarse específicamente a un transcrito y de distinguir el
transcrito de interés de otros transcritos relacionados. Como los
morfógenos descritos aquí comparten alta homología de secuencias en
sus dominios C-terminales activos, la distribución
de un transcrito de morfógeno específico en tejido puede
determinarse en el mejor de los casos utilizando una sonda
específica para la región pro de la proteína inmadura y/o la región
N-terminal de la proteína madura. Otra secuencia
útil es la región 3' no codificante que flanquea y va justo detrás
del codón de parada. Estas porciones de la secuencia varían
sustancialmente entre los morfógenos de esta invención y, por
consiguiente, son específicos para cada proteína. Por ejemplo, una
secuencia de sonda específica para Vgr-1
particularmente útil es el fragmento PvuII-ScaI, un
fragmento de 265 pares de bases (pb) que codifica tanto una zona de
la región pro no traducida como el extremo N de la secuencia madura
(véase Lyons et al. (1989) PNAS
86:4554-4558 para una descripción de la
secuencia de ADNc). De modo similar, las secuencias de sondas
específicas para mOP-1 particularmente útiles son el
fragmento BstX1-BgII, una secuencia de 0,68 kb que
abarca aproximadamente dos tercios de la región pro de
mOP-1; un fragmento StuI-StuI, una
secuencia de 0,2 kb inmediatamente curso arriba del dominio con
siete cisteínas; y el fragmentio Earl-Pstl, de 0,3
kb, que contiene una zona de la secuencia 3' no traducida (véase
Seq. ID No. 18, en donde la región pro se define esencialmente por
los restos 30-291). Se pueden utilizar estrategias
similares, por ejemplo, con hOP-1 (Seq ID No. 16) o
con OP-2 humana o de ratón
(Seq. ID Nos. 20 y 22).
(Seq. ID Nos. 20 y 22).
Usando estas sondas específicas de morfógenos,
que se pueden construir por ingeniería genética u obtener a partir
de secuencias clonadas, se pueden identificar transcritos de
morfógenos en tejidos de mamíferos, utilizando metodologías
clásicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Brevemente,
se prepara ARN total a partir de varios tejidos murinos adultos
(por ejemplo hígado, riñón, testículos, corazón, cerebro, timo y
estómago) por una metodología clásica tal como el método de
Chomczyaski et al. ((1987) Anal. Biochem
162:156-159) y descrito más adelante. Se prepara
ARN Poli(A)+ utilizando cromatografía en
oligo(dT)-celulosa (por ejemplo, Tipo 7, de
Pharmacia LKB Biotechnology, Inc.). El ARN Poli(A)+
(generalmente 15 \mug de cada tejido se fracciona en un gel de
agarosa al 1% en formaldehído y se transfiere a una membrana de
Nytran (Schleicher & Schuell). Tras la transferencia, la
membrana se calienta en estufa a 80ºC y el ARN se reticula bajo la
luz ultravioleta (generalmente 30 segundos a 1 mW/cm^{2}). Antes
de la hibridación, la sonda apropiada se desnaturaliza por calor.
La hibridación se lleva a cabo en un recipiente cilíndrico de lucita
que rota en un aparato de frascos rodadores a aproximadamente 1 rpm
durante aproximadamente 15 horas a 37ºC utilizando una mezcla de
hibridación de formamida al 40%, 5 X Denhardts, 5 X SSPE y SDS al
0,1%. Después de la hibridación, los recuentos no específicos se
separan por lavado de los filtros en 0,1 X SSPE, SDS al 0,1% a
50ºC.
Los ejemplos que demuestran la distribución de
tejido de varios morfógenos, incluidos Vgr-1,
OP-1, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, GDF-1
y OP-2 en tejido en desarrollo y adulto están
descritos en la Solicitud Internacional US92/01968 (documento WO
92/15323) y en Ozkaynak et al., (1991) Biochem. Biophys.
Res. Commn. 179:116-123, y Ozkaynak
et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:
25220-25227. Utilizando la metodología general de
sondas que se describe aquí, las hibridaciones por transferencia
Northern utilizando sondas específicas para estos morfógenos para
sondear tejido de cerebro, bazo, pulmón, corazón, hígado y riñón
indican que el tejido renal parece ser la principal fuente de
expresión de OP-1, siendo los tejidos de cerebro,
corazón y pulmón fuentes secundarias. El tejido de pulmón parece
ser la principal fuente de expresión en tejido para
Vgr-1, BMP5, BMP4 y BMP3. También se observan
niveles inferiores de Vgr-1 en tejido de riñón y
corazón, mientras que el hígado parece ser una fuente de expresión
secundaria para BMP5, y el bazo parece ser una fuente de expresión
secundaria para BMP4. GDF-1 parece expresarse
principalmente en tejido cerebral. Hasta la fehca,
OP-2 parece estar expresado principalmente en
tejido embriónico precoz. Concretamente, las transferencias Northern
de embriones murinos y de animales de 6 días de vida presenta
abundante expresión de OP2 en embriones de 8 días de vida. La
expresión se reduce significativamente en embriones de 17 días y no
se detecta en animales post-natales.
\newpage
Se han identificado morfógenos en tejido de
médula espinal y cerebro de ratas en fase de desarrollo y adultas,
como se determinó tanto por hibridación por transferencia Northern
de sondas específicas de morfógenos a extractos de ARNm de tejido
nervioso adulto en fase de desarrollo (véase el Ejemplo 1 anterior)
como por estudios de inmunolocalización. Por ejemplo, el análisis
por transferencia Northern de tejido de rata en desarrollo ha
identificado significativa expresión del transcrito de ARNm de
OP-1 en el SNC, Solicitud Internacional US92/01968
(documento WO 92/15323) y Ozkaynak et al., (1991) Biochem.
Biophys. Res. Commn. 179:11623, y Ozkaynak et al.
(1992) J. Biol. Chem. 267:
25220-25227. El ARNm de GDF-1 parece
expresarse principalmente en tejido nervioso en desarrollo y
adulto, concretamente en el cerebro, incluido el cerebelo y el tallo
cerebral, la médula espinal y los nervios periféricos (Lee, S.
(1991) PNAS 88: 4250-4254). También se
ha dado a conocer que los transcritos de BMP2B (también llamado en
la técnica BMP4) y Vgr-1 se expresan en tejido
nervioso (Jones et al. (1991) Development
111:531-542), aunque el tejido nervioso no
parece ser el principal tejido de expresión para estos genes
(Ozkaynak et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:
25220-25227). Concretamente, se dan a conocer
transcritos de CBMP2 en la región del diencéfalo asociada con el
desarrollo pituitario, y se dan a conocer transcritos de
Vgr-1 en el eje anteroposterior del SNC,
incluyéndose la placa de techo del tubo neural en fase de desarrollo
así como las células inmediatamente adyacentes a la placa de piso
del tubo neural en fase de desarrollo. En ratas mayores, se han
descrito transcritos de Vgr-1 en tejido de hipocampo
en desarrollo. Además, los genes que codifican OP-1
y BMP2 fueron identificados en un principio por sondeo de bancos de
ADNc de hipocampo humano.
Estudios de inmunolocalización, realizados
utilizando metodologías clásicas conocidas en la técnica y descritos
en la Solicitud Internacional US92/01968 (documento WO 92/15323),
localizaron la expresión de OP-1 en áreas
particulares de tejido de médula espinal y cerebro de rata en fase
de desarrollo y adultas. Concretamente, se estimó expresión de la
proteína OP-1 en tejido nervioso embriónico de ratón
de 5 o 6 días de edad y adultos (2-3 meses de edad)
utilizando antisueros específicos para los morfógenos, clásicos,
específicamente antisuero anti-OP-1
de conejo, preparado utilizando los protocolos clásicos de
anticuerpos conocidos en la técnica y preferiblemente purificados
en una columna de afinidad de OP-1. El propio
anticuerpo se marcó utilizando técnicas de marcación fluorescente
clásicas, o se utilizó una molécula anti-IgG de
conejo marcada para visualizar el anticuerpo frente a
OP-1 unido.
La tinción por inmunofluorescencia demuestra la
presencia de OP-1 en sistema nervioso central (SNC)
de rata adulta. Se observa una tinción similar y extensa tanto en
cerebro (1A) como en médula espinal (1B). La OP-1
parece localizarse predominantemente en la matriz extracelular de la
sustancia gris (cuerpos de células neuronales) presentes de forma
característica en todas las áreas excepto en los propios cuerpos
celulares. En la sustancia blanca, formada principalmente por
fibras nerviosas mielinizadas, la tinción parece estar confinada a
los astrocitos (células neuroneurogliales). Se observa también un
patrón de tinción similar en secciones de cerebro de rata recién
nacida (10 días de vida).
Además, se ha localizado específicamente
OP-1 en la sustancia negra, que está compuesta
principalmente por ganglios basales estriatales, un sistema de
neuronas motoras auxiliares que funcionan en asociación con la
corteza cerebral y el sistema corticoespinal. Las disfunciones en
esta subpoblación o sistema de neuronas están asociadas con
diversas neuropatías, entre las que se incluyen en corea de
Huntington y la enfermedad de Parkinson.
OP1 también está localizada en las células
neuroneurogliales de adendema, que se sabe que secretan factores en
el líquido cefalorraquídeo y que se encuentran alrededor de la
válvula intraventricular, la fisura coroide y el canal central del
cerebro tanto en rata adulto como en fase de desarrollo.
Finalmente, la inhibición de morfógenos en
embriones en fase de desarrollo inhibe el desarrollo del tejido
nervioso. Concretamente, células embrionarias de ratón de 9 días de
vida, cultivadas in vitro en condiciones de cultivo
clásicas, se incubaron en presencia y ausencia de un anticuerpo
monoclonal específico para OP-1 utilizando
OP-1 madura purificada, producido por técnicas
recombinantes, y el inmunógeno. El anticuerpo se preparó utilizando
medios clásicos de producción de anticuerpos, bien conocidos en la
técnica, y descritos de forma general en el Ejemplo 13. Después de
2 días, el efecto del anticuerpo sobre el embrión en fase de
desarrollo se evaluó por histología. Como se determinó por el examen
histológico, el anticuerpo específico para OP-1
inhibe específicamente la formación del óvulo ocular en el embrión
en desarrollo. En particular, no se desarrolla la excrecencia del
diencéfalo. Además, el corazón se malforma. Por otro lado, en
estudios de inmunolocalización separados sobre secciones de
embriones con anticuerpos específicos para OP-1, el
anticuerpo específico para OP-1 se localiza en el
epitelio neural.
Los morfógenos endógenos que actúan sobre las
células neuronales se pueden expresar y secretar por las células
del tejido nervioso, por ejemplo por neuronas y/o células
neuroneurogliales asociadas con las neuronas y/o se pueden
transportar a las neuronas por el líquido cefalorraquídeo y/o la
circulación sanguínea. Recientemente, se ha identificado
OP-1 en la sangre humana (véase el Ejemplo 9
siguiente). Además, recientemente se ha demostrado que las células
de Schwann trasplantadas estimulan la formación de fibras nerviosas
en la médula espinal de ratas, lo que incluye la inducción de
vascularización y la formación de la envolvente mielínica en torno a
algunos de las nuevas prolongaciones neuronales (Bunge (1991)
Exp. Neurology 114:254-257). La
propiedad regenerativa de estas células se puede mediar por la
secreción de un morfógeno por las células de Schwann.
Los morfógenos descritos aquí mejoran la
supervivencia celular, particularmente de las células neuronales en
riesgo de morir. Por ejemplo, las neuronas completamente
diferenciadas son no mitóticas y mueren in vitro cuando se
cultivan en condiciones clásicas de cultivo de células en mamíferos,
utilizando un medio químicamente definido o bajo en suero conocido
en la técnica (véase, por ejemplo, Chamess (1986) J. Biol.
Chem. 26:3164-3169 y Freese et
al. (1990) Brain Res.
521:254-264). Sin embargo, si un cultivo
principal de células neuronales no mitóticas se trata con un
morfógeno, la supervivencia de estas células se intensifica
significativamente. Por ejemplo, se preparó un cultivo principal de
ganglios basales estriatales aislados de la sustancia negra de
cerebro de rata adulta utilizando procedimientos clásicos, por
ejemplo por disociación, por trituración con una pipeta Pasteur de
tejido de sustancia negra, utilizando protocolos de cultivo de
tejidos clásicos, y hechos crecer en un medio bajo en suero, por
ejemplo que contiene DMEM al 50% (medio Eagle modificado por
Dulbecco), medio F-12 al 50%, suero de caballo
inactivado por calor enriquecido con penicilina/estreptomicina y 4
g/l de glucosa. Bajo condiciones clásicas de cultivo, estas células
están experimentando muerte celular significativa en 3 semanas
cuando se cultivan en un medio sin suero. La muerte celular se
evidencia morfológicamente por la incapacidad de las células de
permanecer adherentes y por los cambios en sus características
ultraestructurales, por ejemplo por agrupación de cromatina y
desintegración de los orgánulos.
En este Ejemplo, los ganglios basales cultivados
se trataron con medio químicamente definido acondicionado con
0,1-100 ng/ml de OP-1. El medio
acondicionado con morfógeno, de nueva aportación, se proporcionó a
las células cada 3 o 4 días. La supervivencia celular se mejoró
significativamente y era dependiente de la dosis ante el nivel de
OP-1 añadido: la muerte celular disminuía
significativamente a medida que se aumentaba la concentración de
OP-1 en los cultivos de células. Concretamente, las
células permanecían adherentes y continuaban manteniendo la
morfología de las neuronas diferenciadas viables. En ausencia de
tratamiento con morfógeno, la mayoría de las células cultivadas se
disociaban y experimentaban necrosis celular.
Las disfunciones en los ganglios basales de la
sustancia negra están asociados con el parkinsonismo in vivo.
La capacidad de los morfógenos definidos aquí de mejorar la
supervivencia de las neuronas indica que estos morfógenos serán
útiles como parte de una terapia dirigida a intensificar la
supervivencia de las células neuronales en riesgo de morir in
vivo debido, por ejemplo, a neuropatía o traumatismo químico o
mecánico. Se anticipa en particular que estos morfógenos
proporcionarán un agente terapéutico útil para tratar neuropatías
que afecten a los ganglios basales estriatales, incluida la
enfermedad de Parkinson. Para aplicaciones clínicas, se puede
administrar el morfógeno.
Los morfógenos descritos aquí también inducen
rediferenciación de células transformadas a una morfología
característica de células no transformadas. En particular, los
morfógenos son capaces de inducir rediferenciación de células
transformadas de origen neuronal a una morfología característica de
neuronas no transformadas. El Ejemplo proporcionado más adelante
detalla la rediferenciación inducida por morfógenos de una línea
celular humana transformada de origen neuronal,
NG108-15. También se ha observado rediferenciación
inducida por morfógenos de células transformadas en células de
neuroblastoma de ratón (N1E-115) y en células de
carinoma embrionario humano (véase Solicitud Internacional
US92/01968 (documento WO 92/15323)).
NG108-15 es una línea celular
híbrida transformada producida fusionando células de neuroblastoma x
glioma (obtenidas a partir de la America Type Tissue Culture,
Rockville, MD) y que presenta una morfología característica de
neuronas embrionarias transformadas, por ejemplo tienen morfología
fibroblástica. Concretamente, las células tienen cuerpos celulares
poligonales, prolongaciones cortas, como espinas, y hacen pocos
contactos con las células vecinas (véase la Figura 1A). La
incubación de células NG108-15, cultivadas en un
medio libre de suero, definido químicamente, con 0,1 a 300 ng/ml de
OP-1 durante 4 horas induce un cambio ordenado y
dependiente de la dosis en la morfología celular.
En el experimento, se subcultivaron células
NG108-15 en placas de 6 pocillos revestidas de
poli-L-lisina. Cada pocillo
contenía 40-50.000 células en 2,5 ml de medio
químicamente definido. El tercer día, se añadieron 2,5 \mul de
OP-1 en etanol al 60% que contenía ácido
trifluoroacético al 0,025% a cada pocillo. Se ensayaron
concentraciones de OP-1 de 0 a 300 ng/ml.
Típicamente, el medio se cambió diariamente con nuevas alícuotas de
OP-1, aunque se puede inducir morfogénesis por una
sola incubación durante 4 horas con OP-1. Además,
las concentraciones de OP-1 de 10 ng/ml fueron
suficientes para inducir rediferenciación. Al cabo de un día, las
células tratadas con hOP-1 experimentan un cambio
significativo en su ultraestructura celular, incluyéndose el
redondeo del soma, un aumento en el brillo de la fase y la extensión
de las prolongaciones cortas de las neuritas. Después de dos días,
las células tratadas con OP-1 empiezan a formar
láminas epitelioides, que constituyen la base para el crecimiento
de agregados de capas múltiples en el
post-tratamiento de tres días. En cuatro días, la
gran mayoría de células tratadas con OP-1 se asocian
en agregados firmemente empaquetados y de capas múltiples (Figura
1B). La Figura 2 representa el número medio de agregados con capas
múltiples o agrupaciones celulares identificadas en campos
seleccionados al azar a partir de seis independientes, en función de
la concentración de morfógeno. Cuarenta ng/ml de
OP-1 son suficientes para una inducción semimáxima
de agregación celular.
La rediferenciación inducida por los morfógenos
ocurre sin ningún cambio asociado en la síntesis de ADN, la
división celular o la viabilidad celular, haciendo improbable que
los cambios morfológicos sean secundarios a diferenciación celular
o a un efecto tóxico de bOP-1. Además, la
morfogénesis inducida por OP-1 no inhibe la
división celular, según se determina por captación de
^{3}H-timidina, a diferencia de otras moléculas
que se ha observado que estimulan la diferenciación de células
transformadas, tales como butirato, DMSO, ácido retanoico o
Foskolin. Los datos indican que OP-1 puede mantener
la estabilidad y viabilidad celular después de inducir
rediferenciación. Además, los efectos son específicos del morfógeno,
y no se induce rediferenciación cuando las células
NG108-15 son incubadas con 0,1-40
ng/ml de TGF-\beta.
Los experimentos también han sido realizados con
morfógeno soluble altamente purificado (por ejemplo
OP-1 maduro asociado con su dominio pro) que
también indujeron específicamente la rediferenciación de células
MG108-15.
Los morfógenos descritos aquí proporcionan, por
consiguiente, agentes terapéuticos útiles para el tratamiento de
neoplasias y lesiones neoplásicas del sistema nervioso,
particularmente en el tratamiento de neuroblastomas, incluidos
retinoblastomas y gliomas. Pueden administrarse los propios
morfógenos o, alternativamente, un agente estimulador de
morfógenos.
La capacidad de los morfógenos descritos aquí
para mejorar la supervivencia de células neuronales e inducir la
agregación celular y la adhesión célula-célula en
células rediferenciadas, indica que los morfógenos serán útiles
como agentes terapéuticos para mantener las vías neurales al
proteger a las células que definen la ruta contra los daños
causados por traumatismos clínicos. En particular, los morfógenos
pueden proteger a las neuronas, incluyéndose las neuronas en
desarrollo, de los efectos de las toxinas que se sabe que inhiben
la proliferación y migración de neuronas y que interfieren con la
adhesión célula-célula. Ejemplos de estas toxinas
incluyen etanol, una o más de las toxinas presentes en el humo del
tabaco, y diversos opiáceos. Los efectos tóxicos del etanol sobre
las neuronas que se están desarrollando inducen el daño neurológico
manifestado en el síndrome de alcoholismo fetal. Los morfógenos
también pueden proteger a las neuronas de los efectos citotóxicos
asociados con los aminoácidos excitatorios tales como el
glutamato.
Por ejemplo, el etanol inhibe los efectos de
adhesión célula-célula inducidos en células
NG108-15 tratadas con morfógenos cuando se
suministra estas células a una concentración de
25-50 mM. Se puede conseguir una inhibición
semimáxima con etanol 5-10 mM, que corresponde a la
concentración de alcohol en sangre en una persona adulta después de
ingerir una sola bebida alcohólica. Probablemente el etanol
interfiere con la unión homofílica de CAMS entre células, en vez de
su inducción, ya que los niveles de N-CAM inducidos
por morfógenos no se ven afectados por el etanol. Además, el efecto
inhibidor es inversamente proporcional a la concentración de
morfógenos. Por consiguiente, se considera que la administración de
un morfógeno o de un agente estimulador de morfógenos a las
neuronas, particularmente neuronas en desarrollo, en riesgo de daño
por exposición a toxinas tales como etanol, puede proteger a estas
células ante el daño en tejido nervioso superando los efectos
inhibidores de las toxinas. Con fines ilustrativos, los morfógenos
descritos aquí también son útiles en terapias para tratar vías
neurales dañadas a consecuencia de neuropatía inducida por
exposición a estas toxinas.
Los morfógenos descritos aquí inducen expresión
de CAM, particularmente expresión de N-CAM, como
parte de su indución de morfogénesis. CAM son moléculas
morforreguladoras identificadas en todos los tejidos como una etapa
esencial en el desarrollo del tejido. N-CAM, que
comprende al menos tres isoformas
(N-CAM-180,
N-CAM-140 y
N-CAM-120, en donde "180",
"140" y "120" indican los pesos moleculares aparentes de
las isoformas según se midieron por electroforesis en gel de
poliacrilamida), se expresa al menos pasajeramente en tejidos en
desarrollo, y permanentemente en tejido nervioso. Tanto las
isoformas N-CAM-180 como
N-CAM-140 se expresan en tejido en
desarrollo y adulto. La isoforma
N-CAM-120 se encuentra sólo en
tejido adulto. Otra CAM neural es L1.
Las N-CAM están implicadas en el
desarrollo neural apropiado, incluyéndose la neuralización
apropiada, la migración neuronal, la fasciculación y la
sinaptogénesis. La inhibición de la producción de
N-CAM, por ejemplo por complejación de la molécula
con un anticuerpo específico para N-CAM, inhibe la
organización de la retina, incluyéndose la migración de axones
retinales, y la regeneración de axones en el sistema nervioso
periférico, así como la sinapsis de axones con células de músculos
diana. Además, hay indicios significativos de que el traumatismo
físico o químico en las neuronas, en la transformación oncogénica y
algunos trastornos neurológicos genéticos están acompañados por
cambios en la expresión de CAM, que alteran el comportamiento
adhesivo o migratorio de estas células. Específicamente, se
describen niveles elevados de N-CAM en cuerpo
estriado con enfermedad de Huntington (por ejemplo ganglios basales
estriados) y se nota adhesión disminuida en la enfermedad de
Alzheimer.
Alzheimer.
Los morfógenos descritos aquí pueden estimular
la producción de CAM, en particular la producción de L1 y
N-CAM, incluidas las tres isoformas de la molécula
de N-CAM. Por ejemplo, la expresión de
N-CAM es estimula significativamente en células
NG108-15 tratadas con morfógenos. Las células
NG108-15 no tratadas presentan una morfología
fibroblástica, o mínimamente diferenciada, y expresan sólo las
isoformas 180 y 140 de N-CAM normalmente asociadas
con una células en fase de desarrollo. Después del tratamiento con
morfógenos, estas células presentan una morfología características
de las neuronas adultas y expresan niveles más altos de las tres
isoformas de N-CAM. Utilizando un protocolo similar
al descrito en el Ejemplo siguiente, el tratamiento de las células
NG108-15 con morfógenos también indujo expresión de
L1.
En este Ejemplo, se cultivaron células
NG108-15 durante 4 días en presencia de
concentraciones crecientes de OP-1 y se realizaron
transferencias Western clásicas en todos los extractos celulares. Se
detectaron isoformas de N-CAM con un anticuerpo que
reacciona cruzadamente con las tres isoformas, anticuerpo monoclonal
H28.123, obtenido de Sigma Chemical Co., St. Louis, siendo
distinguibles las diferentes isoformas por sus diferentes
movilidades en un gel de electroforesis. Las células
NG108-15 testigo (no tratadas) expresan tanto las
isoformas de 140 kDa como de 180 kDa, pero no la de 120 kDa, según
se determinó por análisis de transferencia Western utilizando hasta
100 \mug de proteína. El tratamiento de las células
NG108-15 con OP-1 dio como resultado
un incremento dependiente de la dosis en la expresión de las
isoformas de 180 kDa y 140 kDa, así como la inducción de la
isoforma de 120 kDa. Véase la Figura 2A y la Figura 2B. La Figura 2B
es una transferencia Western de extractos celulares de
NG108-15 tratados con OP-1,
sondeados con anticuerpo monoclonal H28.123, que muestran la
inducción de las tres isoformas. La Figura 2A es una curva de
dosis-respuesta de la inducción de
N-CAM-180 y
N-CAM-140 en función de la
concentración de morfógeno.
N-CAM-120 no se muestra en la
gráfica ya que no se pudo cuantificar en células testigo. Sin
embago, como es claramente evidente de la transferencia Western en
la Figura 2A, N-CAM-120 es inducida
en respuesta a tratamiento con morfógeno. La inducción diferencial
de las isoformas N-CAM 180 y 140 observada puede
deberse a la expresión constitutiva de la isoforma 140 que es casi
máxima.
El incremento en la expresión de
N-CAM se correspondió de manera dependiente de la
dosis con la inducción de agregados multicelulares por morfógenos.
Compárense la Figura 2A y la Figura 3. La Figura 3 representa
gráficamente el número medio de agregados de capas múltiples
(agrupaciones) contados por 20 campos seleccionados aleatoriamente
en 6 experimentos independientes, frente a la concentración de
morfógeno. La inducción de la isoforma 120 también indica que la
rediferenciación de células transformadas inducida por morfógenos
estimula no sólo la rediferenciación de estas células a partir de
un fenotipo transformado, sino también la diferenciación a un
fenotipo correspondiente a una célula desarrollada. Los estudios
clásicos de inmunolocalización realizados con el anticuerpo
monoclonal H28.13 sobre células tratadas con morfógenos indican la
formación de agregados de N-CAM asociados con la
periferia y las prolongaciones de células tratadas y ninguna
reactividad en las células no tratadas. Además, el tratamiento con
morfógenos no parece que inhiba la división celular según se
determinó por el rcuento de células o la captación de
^{3}H-timidina. Finalmente, agentes
diferenciadores químicos conocidos, tales como Forskolin y
dimetilsulfóxido, no inducen producción de
N-CAM.
Además, los efectos de la agregación celular de
OP-1 sobre las células NG108-15 se
puede inhibir con anticuerpos
anti-N-CAM u oligonucleótidos
antisentido N-CAM. Los oligonucleótidos antisentido
se pueden preparar por síntesis en un sintetizaro de nucleótidos,
utilizando medios clásicos conocidos en la técnica. Preferiblemente,
se preparan oligonucleótidos de fósforotioato
("S-oligos") para mejorar el transporte de los
nucleótidos a través de las membranas celulares. Las
concentraciones de tanto anticuerpos
anti-N-CAM como oligonucleótidos
antisentido de N-CAM suficientes para inhibir la
inducción de N-CAM también inhibieron la formación
de agregados de células de capas múltiples. Concretamente, la
incubación de las células NG108-115 tratadas con
morfógenos con S-oligos antisentido de
N-CAM en concentración 0,3-3 \muM,
S-oligos antisentido de N-CAM no
modificados 5-500 \muM o anticuerpos monoclonales
H28.123 en concentración de 10 \mug/ml inhibe significativamente
la agregación celular. Es probable que el tratamiento con
morfógenos también estimule otras CAM, ya que la inhibición no es
completa.
También se han realizado experimentos con
morfógenos solubles (p. ej., OP-1 de ratón asociado
con su dominio pro) que también indujeron específicamente la
expresión de CAM.
Con fines ilustrativos, los morfógenos descritos
aquí son útiles como agentes terapéuticos para tratar trastornos
neurológicos asociados con niveles alterados de CAM, particularmente
niveles de N-CAM, tales como corea de Huntington y
enfermedad de Alzheimer, y similares. En aplicaciones químicas, se
pueden administrar los propios morfógenos.
La eficacia de los morfógenos descritos aquí
para influir en la expresión de N-CAM se evaluar
in vitro utilizando una línea celular adecuada y los métodos
descritos aquí. Además de una línea celular transformada, la
expresión de N-CAM se puede ensayar en un cultivo
celular primario de células neurales o neuroneurogliales, siguiendo
los procedimientos descritos aquí. La eficacia del tratamiento con
morfógenos sobre la expresión de N-CAM in
vivo se puede evaluar por biopsia de tejidos como se describe en
el Ejemplo 9 siguiente, y detectando moléculas
N-CAM con un anticuerpo específico para
N-CAM, tal como el anticuerpo monoclonal H28.123, o
utilizando el modelo animal experimental descrito en el Ejemplo
11.
Alternativamente, también se puede detectar el
nivel de proteínas N-CAM, o fragmentos proteicos de
la misma, presentes en el líquido cefalorraquídeo o suero, para
evaluar el efecto del tratamiento con morfógenos. Se sabe que las
moléculas de N-CAM se desprenden de las superficies
celulares y han sido detectadas tanto en suero como en líquido
cefalorraquídeo. Además, los niveles alterados de la forma soluble
de N-CAM están asociados con hidrocefalia
normotensa y con esquizofrenia de Tipo II. Los niveles de
N-CAM en los líquidos se pueden detectar siguiendo
el procedimiento descrito en el Ejemplo 9 y utilizando un anticuerpo
específico para N-CAM, tal como el anticuerpo
monoclonal H.28.123.
Los morfógenos descritos aquí también estimulan
el crecimiento axonal del sistema nervioso periférico a lo largo de
largas distancias permitiendo la reparación y regeneración de vías
neurales dañadas. Si bien las neuronas del sistema nervioso
periférico pueden hacer brotar nuevas prolongaciones después de una
lesión, estos brotes sin guía típicamente no lograrán conectarse
apropiadamente y morirán. Cuando la rotura es grande, por ejemplo de
más de 5 o 10 mm, la regeración es deficiente o inexistente.
En este Ejemplo se estimó la estimulación de
regeneración nerviosa por morfógenos utilizando el modelo del
nervio ciático de rata. El nervio ciático de la rata se puede
regenerar espontáneamente a través de una grieta de 5 mm y
ocasionalmente a través de una grieta de 10 mm, siempre que los
extremos seccionados sean insertados en el canal de guía del nervio
relleno de solución salina. En este experimento, se ensayó la
regeneración del nervio a través de una grieta de 12 mm.
Se anestesiaron ratas hembras adultas
Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, Inc.),
de 230-250 g de peso, con inyecciones
intraperitoneales de pentobarbital sódico (35 mg/kg de peso
corporal). Se hizo una incisión en la piel paralela y justo
posterior al fémur. Se penetró en el plano intermuscular avascular
entre los músculos vastolateral e isquiotibiales y se siguió hasta
el tejido fibroaerolar laxo que rodea al nervio ciático. El tejido
laxo se dividió longitudinalmente, lo que dejó expuesto el nervio
ciático en toda su longitud sin desvascularizar ninguna zona. Bajo
el microscopio quirúrgico, se transeccionaron los nervios ciáticos
con microtijeras en la parte media del muslo y se injertaron con un
injerto de gel de OP-1 que separaban los muñones de
los nervios en 12 mm. La región del injerto se envolvió con un tubo
de silicona de 20 mm de longitud y un diámetro interno de 1,5 mm,
cuyo interior estaba relleno de una solución de morfógeno.
Concretamente, la zona de 12 mm centrales del tubo consistía en un
gel de OP-1 preparado mezclando 1 a 5 \mug de
OP-1 recombinante producido por CHO sustancialmente
puro con aproximadamente 100 \mul de MATRIGEL^{TM} (de
Collaborative Research, Inc., Bedford, MA), y extracto de matriz
extracelular obtenido a partir de tejido de sarcoma de ratón, y que
contenía membrana basal de tejido solubilizado, que incluía
laminina, colágeno de Tipo IV, sulfato de heparina, proteoglicano y
entactina, en solución salina tamponada con fosfato. El tubo relleno
de OP-1 se implantó directamente en el sitio del
defecto, dejando 4 mm por cada lado para insertar los muñones del
nervio. Cada muñón se incrustó contra el gel de
OP-1 y se aseguró en el tubo de silicona con tres
puntos de nylon 10-0 quirúrgico disponible en el
mercado a través del epineurio, la vaina protectora del
fascículo.
Además de los injertos de gel de
OP-1, como testigos se injertaron tubos de silicona
vacíos, tubos de silicona rellenos sólo de gel y autoinjertos
"inversos" en donde los segmentos transeccionados de 12 mm del
nervio ciático del animal se rotaron 180º antes de la sutura. Todos
los experimentos se realizaron por cuadruplicado. Todas las heridas
se cerraron con grapas para heridas que se retiraron después de 10
días. Se hicieron injertos en ambas patas de todas las ratas. A las
3 semanas, los animales fueron sacrificados y se extirparon los
segmentos injertados y se congelaron inmediatamente en hielo seco.
Las secciones congeladas se cortaron luego a lo largo del sitio del
injerto, y se examinaron para evaluar la regeneración axonal por
tinción inmunofluorescente utilizando anticuerpos
anti-neurofilamento marcados con fluoresceína
(obtenida de Sigma Chemical Co., St. Louis).
La regeneración del nervio ciático ocurrió a lo
largo de toda la distancia de 12 mm en todos los sitios de injerto
en los que la grieta se había rellenado con el gel
OP-1. En cambio, los tubos de silicona vacíos y los
autoinjertos inversos no presentaron regeneración del nervio y sólo
un sitio de injerto que contenía el gel a solas presentó
regeneración del axón.
Después del daño axonal in vivo, las
neuronas del SNC son incapaces de experimentar procesos de rebrote.
Por consiguiente, el tramo en el tejido nervioso del SNC, incluida
la médula espinal, el nervio óptico y la retina, daña gravemente o
destruye las vías neurales definidas por estas células. Se han
utilizado injertos de nervios periféricos para intentar puentear el
daño axonal en el SNC. La reparación efectiva con injertos autólogos
hasta la fecha aparentemente requiere que el sitio del injerto esté
situado cerca del cuerpo de la célula neuronal del SNC y un
resultado principal de la axotomia del SNC es la muerte de la célula
neuronal. La eficacia de los morfógenos descritos aquí sobre la
reparación de los nervios del SNC se puede evaluar utilizando un
modelo de nervio óptico contuso de rata tal como el descrito por
Bignami et al., (1979) Exp. Eve Res. 28:
63-69, cuya descripción se incorpora aquí como
referencia. Brevemente, y como se describe en ese artículo, se
anestesian ratas de laboratorio (p. ej., de Charles River
Laboratories, Wilmington, MA) utilizando procedimientos quirúrgicos
clásicos, y se contusiona el nervio óptico empujando el ojo
suavemente fuera de la órbita, insertando un forcex de relojero
detrás del globo ocular y estrujando el nervio óptico con los forcex
durante 15 segundos, seguido de un intervalo de 30 segundos de
descanso y un intervalo de estrujamiento de 15 segundos. Las ratas
se sacrifican a intervalos diferentes de tiempo, por ejemplo a las
48 horas, y 3, 44, 11, 15 y 18 días después de la operación. El
efecto del morfógeno sobre la reparación del nervio óptico se puede
estimar realizando el experimento por duplicado y proporcionando
morfógeno o PBS (p. ej., 25 \mul de solución y 25 \mug de
morfógeno) al nervio óptico, por ejemplo justo antes de la
operación, al mismo tiempo de la operación o en momentos específicos
después de la operación.
En ausencia de terapia, la cirugía induce
cicatrización neuroglial del nervio contusionado, como se determina
por tinción con inmunofluorescencia para proteína ácida fibrilar
neuroglial (GFA), una proteína marcadora de cicatrización
neuroglial, y por histiología. Se describen inmunofluorescencia
indirecta o secciones criostáticas secadas al aire en Bignami et
al. (1974) J. Comp. Neur. 153:
27-38, que utilizan anticuerpos disponibles en el
mercado para GFA (p. ej., Sigma Chemical Co., St. Louis). Se
anticipan niveles reducidos de GFA en animales tratados con el
morfógeno, lo que indica la capacidad de los morfógenos de inhibir
la formación de cicatrices neuroneurogliales y de estimular la
regeneración del nervio óptico.
Se puede utilizar la localización de morfógenos
en tejido nervioso como parte de un método para diagnosticar un
trastorno neurológico o neuropatía. El método puede ser
particularmente ventajoso para diagnosticar neuropatías de tejido
cerebral. Concretamente, se realiza una biopsia de tejido cerebral
en un paciente en riesgo, utilizando procedimientos clásicos
conocidos en el campo de la medicina. Después se estima la expresión
de morfógenos asociada con el tejido biopsiado utilizando
metodologías clásicas, por ejemplo por inmunolocalización utilizando
técnicas de inmunofluorescencia clásicas en concierto con
antisueros específicos de morfógeno o anticuerpos monoclonales.
Concretamente, se hacen finos cortes de tejido biopsiado utilzando
metodologías clásicas conocidas en la técnica y se incuban con el
tejido anticuerpos marcados por fluoresencia (o por otros medios
detectables), en condiciones suficientes para permitir la formación
del complejo específico antígeno-anticuerpo. La
presencia y cantidad de complejo formado se detecta y compara
después con un patrón predeterminado o valor de referencia. La
detección de niveles alterados de morfógeno presentes en el tejido
puede utilizarse después como indicador de disfunción del tejido.
Alternativamente, la fluctuación en los niveles de morfógeno se
puede estimar vigilando los niveles de transcripción de morfógeno,
ya sea por análisis mediante transferencia Northern clásica o por
hibridación in situ, utilizando una sonda marcada capaz de
hibridarse específicamente al ARN del morfógeno y protocolos de
hibridación al ARN clásicos bien conocidos en la técnica.
También se pueden utilizar las fluctuaciones en
los niveles de morfógenos presentes en el líquido cefalorraquídeo o
en la circulación sanguínea para evaluar la viabilidad del tejido
nervioso. Por ejemplo, se detectan morfógenos asociados con células
de adendema que se sabe que secretan factores en el líquido
cefalorraquídeo, y se localizan generalmente asociados con células
neuroneurogliales, y en la matriz extracelular, pero no en los
cuerpos de las células neuronales. Por consiguiente, el líquido
cefalorraquídeo puede ser un medio natural de transporte de
morfógenos. Alternativamente, se pueden liberar morfógenos a partir
de las células que mueren en el líquido cefalorraquídeo. Además,
recientemente se ha identificado OP-1 en la sangre
humana, que también puede ser un medio de transporte de morfógenos
y/o un repositorio para el contenido de células que mueren.
El líquido cefalorraquídeo se puede obtener de
un individuo por punción lumbar clásica, utilizando metodologías
clásicas conocidas en el campo de la medicina. De modo similar, se
pueden obtener muestras de suero por venipunción clásica y el suero
se puede preparar por centrifugación a 3.000 rpm durante 10 minutos.
La presencia de morfógeno en suero o líquido cefalorraquídeo puede
estimarse luego por procedimientos clásicos de transferencia Western
(inmunotransferencia), ELISA o RIA. Brevemente, por ejemplo, con la
técnica ELISA, las muestras se pueden diluir en un tampón
apropiado, tal como solución salina tamponada con fosfato, y se
dejan absorber alícuotas de 50 \mul en los pocillos de fondo
plano de placas de microtítulo previamente revestidas con anticuerpo
específico para el morfógeno, y se dejan incubar durante 18 horas a
4ºC. Después las placas se pueden lavar con tampón clásico e
incubar con alícuotas de 50 \mul de un segundo anticuerpo
específico para el morfógeno, conjugado con un agente de detección,
por ejemplo biotina, en un tampón apropiado, durante 90 minutos a
temperatura ambiente. Después se pueden detectar los complejos
morfógeno-anticuerpo utilizando procedimientos
clásicos.
Alternativamente, se puede crear una columna de
afinidad específica para el morfógeno utilizando, por ejemplo,
anticuerpos específicos para el morfógeno absorbidos en una matriz
de columna, y haciendo pasar la muestra líquida a través de la
matriz para extraer selectivamente el morfógeno de interés. Después
se eluye el morfógeno. Se puede determinar un tampón de elución
adecuado empíricamente determinando condiciones apropiadas de unión
y elución primero con un testigo (p. ej., morfógeno producido
recombinantemente y purificado). Después las fracciones se ensayan
en busca de la presencia del morfógeno por inmunotransferencia
clásica, y se confirma por secuenciación
N-terminal. Las concentraciones de morfógeno en
muestras de suero u otras muestras líquidas se puede determinar
utilizando técnicas de cuantificación clásicas para proteínas,
incluyendo absorbancia espectrofotométrica o cuantificación por
ensayos con anticuerpos ELISA o RIA. Utilizando este procedimiento,
se ha identificado OP-1 en suero.
Se detectó OP-1 en suero humano
utilizando el ensayo siguiente. Un anticuerpo monoclonal generado
contra OP-1 producida recombinantemente, de
mamíferos, utilizando técnicas de inmunología clásica bien conocidas
en este campo y descritas de modo general en el Ejemplo 13, se
inmovilizó haciendo pasar el anticuerpo por un gel de agarosa
activada (p. ej., Affi-Gel^{TM}, de
Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, preparado
siguiendo las instrucciones del fabricante), y se utilizó para
puriricar OP-1 a partir de suero. Después el suero
humano se hizo pasar por la columna y se eluyó con
K-tiocianato 3 M. Las fracciones de
K-tiocianato se dializaron después en urea 6 M,
PO_{4} 20 mM, pH 7,0, se aplicaron a una columna de HPLC C8 y se
eluyeron con un gradiente de 25-50% de
acetonitrilo/0,1% de TFA, durante 20 minutos. Los homodímeros de
OP-1 producidos recombinantemente y maduros eluyen
entre 20-22 minutos. Las fracciones se recogieron
seguidamente y se ensayaron en busca de la presencia de
OP-1 por inmunotransferencia clásica. La Figura 4 es
una inmunotransferencia que muestra OP-1 en sueros
humanos en condiciones reductoras y oxidadas. En la Figura, las
calles 1 y 4 son patrones de OP-1, eluidos en
condiciones oxidadas (calle 1) y reducidas (calle 2). La calle 5
muestra marcadores de peso molecular en 17, 27 y 30 kDa. Las calles
2 y 3 son OP-1 de suero humano eluidas en
condiciones oxidadas (calle 2) y reducida (calle 3).
Los morfógenos se pueden utilizar en
aplicaciones de diagnóstico comparando la cantidad de morfógeno
presente en la muestra de líquido corporal con un valor de
referencia predeterminado, indicando las fluctuaciones en los
niveles de morfógenos del líquido un cambio en el estatus del tejido
nervioso. Alternativamente, por este método se pueden detectar
fluctuaciones en el nivel de anticuerpos frente a morfógenos
endógenos, lo más probablemente en suero, utilizando un anticuerpo
u otra proteína de unión capaz de interaccionar específicamente con
el anticuerpo frente al morfógeno endógeno. Las fluctuaciones
detectadas en los niveles del anticuerpo endógeno se pueden utilizar
como indicadores de un cambio en el estatus del tejido.
Los morfógenos descritos aquí se pueden utilizar
para aliviar el daño inmunológico en el tejido nervioso. Los
detalles de este daño y el uso de los morfógenos para aliviar esta
lesión se describen en la Solicitud Internacional US92/07358
(documento WO 93/04692). Una fuente principal de dicho daño en el
tejido nervioso se produce tras hipoxia o
isquemia-reperfusión de un suministro de sangre a
una vía neural, tal como puede suceder tras un ataque cerebral
embólico, o puede ser inducida durante una operación quirúrgica.
Como se describe en la Solicitud Internacional US92/07358
(documento WO 93/04692), se ha demostrado que los morfógenos alivian
el daño en el tejido miocárdico tras
isquemia-reperfusión del suministro sanguíneo al
tejido. El efecto de los morfógenos sobre el alivio de un daño
inmunológico en el tejido nervioso se puede estimar utilizando
metodologías y modelos conocidos por los expertos en la técnica y
descritos más adelante.
Por ejemplo, el modelo de embolia cerebral de
conejo proporciona un método útil para evaluar el efecto de los
morfógenos sobre la lesión en tejido tras una
isquemia-reperfusión cerebral. El protocolo descrito
más adelante es esencialmente el de Phillips et al. (1989)
Annals of Neurology 25:281-285, cuya
descripción se incopora aquí como referencia. Brevemente, se
anestesian conejos New England blancos (2-3 kg) y se
ponen en un respirador. Después se cateteriza selectivamente la
circulación intracraneal por la técnica de Seldinger. Luego se
realiza una angiografía cerebral basal empleando una unidad de
substracción digital. A continuación se emboliza selectivamente la
arteria carótida interna distal con 0,035 ml de un trombo autólogo
de 18 horas de vida. La oclusión arterial se documenta por repetida
angiografía inmediatamente después de la embolización. Después de
un tiempo suficiente para inducir infartos cerebrales
(aproximadamente 15 minutos o 90 minutos), se induce la reperfusión
por administración de un bolo de un agente de reperfusión tal como
el análogo de TPA FB-FB-CF (p. ej.,
0,8 mg/kg a lo largo de 2
minutos).
minutos).
El efecto del morfógeno sobre los infartos
cerebrales se puede estimar por administración de concentraciones
variables de morfógenos, por ejemplo OP-1, a
diferentes tiempos tras la embolización y/o reperfusión. Los
conejos son sacrificados 3-14 días después de la
embolización y sus cerebros se preparan para el examen
neuropatológico fijándolos por inmersión en formación tamponada
neutra al 10% durante al menos 2 semanas. Después los cerebros se
seccionan en un plano coronal a intervalos de 2-3
mm, se enumeran y se someten a procesamiento histológico clásico en
parafina, y se determina visualmente el grado de necrosis de tejido
nervioso. Se anticipa que los animales tratados con morfógenos
reducirán o inhibirán significativamente las necrosis en los tejidos
nerviosos después de la isquemia
cerebral-reperfusión en los animales de ensayo,
según se determina mediante una comparación histológica con animales
no tratados.
Las actividades in vivo de los morfógenos
descritos aquí también se estiman fácilmente en un modelo animal
como el descrito aquí. Un animal adecuado, preferiblemente que
presenta daño en tejido nervioso, por ejemplo inducido
genéticamente o ambientalmente, se inyecta intracerebralmente con
una cantidad eficaz de un morfógeno en una formulación terapéutica
adecuada, tal como solución salina tamponada con fosfato, pH 7.
Preferiblemente, el morfógeno se inyecta dentro del área de las
neuronas afectadas. El tejido afectado se extirpa en un punto de
tiempo subsiguiente y el tejido se evalúa morfológicamente y/o por
evaluación de un marcador bioquímico adecuado, por ejemplo por
localización de morfógeno o N-CAM; o por medición
del efecto dependiente de la dosis sobre un marcador bioquímico de
actividad neurotrófica del SNC o de daño en tejido del SNC,
utilizando, por ejemplo, proteína ácida fibrilar neuroglial como
marcador. La dosificación y el tiempo de incubación variarán
dependiendo del animal que se ensaya. Los intervalos de dosificación
adecuados para diferentes especies se pueden determinar por
comparación con modelos experimentales establecidos. La presentación
siguiente es un protocolo ilustrativo para un modelo de perforación
de cerebro de rata.
Brevemente, se anestesian ratas Long Evans
machos, obtenidas de fuentes comerciales clásicas, y se prepara el
área de la cabeza para cirugía. Se expone la bóveda craneal
utilizando procedimientos quirúrgicos clásicos y se taladra un
agujero hacia el centro de cada lóbulo utilizando un alambre de
0,035 K, perforando justo la bóveda craneal. Después se proporciona
en cada uno de los agujeros soluciones de 25 \mul que contienen o
bien el morfógeno (p. ej., OP-1, 25 \mug) o PBS,
utilizando una jeringuilla Hamilton. Las soluciones se administran
a una profundidad de aproximadamente 3 mm por debajo de la
superficie, en la corteza subyacente, el cuerpo calloso y el
hipocampo. Después se sutura la piel y se deja recuperar el
animal.
Tres días después de la operación, se sacrifican
las ratas por decapitación y se procesan sus cerebros para hacer
cortes. La formación de tejido cicatrizal se evalúa por tinción con
inmunofluorescencia de la proteína ácida fibrilar neuroglial, una
proteína marcadora para cicatrización neuroglial, para determinar
cualitativamente el grado de formación de cicatriz. Los anticuerpos
para la proteína ácida fibrilar neuroglial están disponibles en el
mercado, por ejemplo a partir de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.
También se sondean secciones con anticuerpos
anti-OP-1 para determinar la
presencia de OP-1. Se anticipan niveles reducidos de
proteína ácida fibrilar neuroglial en los cortes de tejido de
animales tratados con el morfógeno, poniendo de manifiesto la
capacidad de los morfógenos para inhibir la formación de cicatrices
neuroneurogliales y estimular la regeneración de los nervios.
A continuación se describe un método in
vitro para evaluar la facilidad con la que la especie
seleccionada de morfógeno probablemente atravesará la barrera
hematoencefálica. Audus et al. (1987) Ann. N.Y. Acad.
Sci. 507:9-18 proporcionan una
descripción detallada del modelo y del protocolo, cuya descripción
se incorpora aquí como referencia.
Brevemente, se aíslan células endoteliales de
microvasos a partir de la sustencia gris cerebral de cerebros
bovinos recientes. Los cerebros se obtienen a partir de un matadero
local y se transportan al labroatorio en medio esencial (MEM)
enfriado en hielo que contiene antibióticos. En condiciones
estériles, se extirpan los vasos sanguíneos superficiales grandes y
las meninges utilizando procedimientos clásicos de disección. La
sustancia gris cortical se retira por aspiración, después se trozea
en cubos de aproximadamente 1 mm. Luego la sustancia gris cortada
se incuba con dispasa al 0,5% (BMB, Indianapolis, IN) durante 3
horas a 37ºC en un baño de agua con agitación. Después de 3 horas
de digestión, la mezcla se concentra por centrifugación (1.000 x g
durante 10 minutos), después se resuspende en dextrano al 13% y se
centrifuga durante 10 minutos a 5.800 x g. La grasa sobrenadante,
el desecho de células y la mielina se desechan y el sedimento de
microvasos crudo se resuspende en 1 mg/ml de colagenasa/dispasa y
se incuba en un baño de agua con agitación durante 5 horas a 37ºC.
Después de 5 horas de digestión, la suspensión de microvasos se
aplica a un gradiente de Percoll al 50%
pre-establecido y se centrifuga durante 10 minutos a
1.000 x g. La banda que contiene células endoteliales purificadas
(segunda banda de la parte superior del gradiente) se retira y se
lava dos veces con medio de cultivo (p. ej., 50% de MEM/50% de
mezclas de nutrientes F-12). Se congelan las células
(-80ºC) en medio que contiene 20% de DMSO y 10% de suero equino para
uso posterior.
Después del aislamiento, se cultivan
aproximadamente 5 x 10^{5} células/cm^{2} en placas de cultivo o
en filtros de policarbonato con un tamaño de poros de
5-12 \mum que se revisten con colágeno de rata y
fibronectina. 10-12 días después de sembrar las
células, se inspeccionan las monocapas de células para ver si hay
confluencia por examen microscópico.
La caracterización de las propiedades
morfológicas histoquímicas y bioquímicas de estas células ha
demostrado que estas células poseen muchas de las características
salientes de la barrera hematoencefálica. Estas características
incluyen uniones intercelulares firmes, falta de fenestraciones de
las membranas, bajos niveles de actividad pinocitótica y presencia
de gamma-glutamil-transpeptidasa,
fosfatasa alcalina y actividades de antígeno de Factor VIII.
Las células cultivadas se pueden utilizar en una
amplia gama de experimentos cuando se requiere un modelo para unión
polarizada o transporte. Al cultivar las células en placas de
pocillos múltiples, se puede efectuar la unión a receptores y no
receptores de moléculas tanto grandes como pequeñas. Con el fin de
efectuar mediciones de flujo celular transendotelial, las células
se cultivan sobre filtros de membrana de policarbonato porosos (p.
ej., de Nucleopore, Pleasanton, CA). Se utilizan filtros de gran
tamaño de poro (5-12 \mum) para evitar la
posibilidad de que el filtro llegue a ser la barrera limitante de la
velocidad para el flujo molecular. El uso de estos filtros de
tamaño de poro grande no permite el crecimiento celular en el filtro
y permite la inspección visual de la monocapa celular.
Una vez que las células alcanzan confluencia, se
colocan en un aparato de célula de difusión lado con lado (p. ej.,
de Crown Glass, Sommerville, NJ). Para las mediciones de flujo, la
cámara donadora de la célula de difusión se pulsa con una sustancia
de ensayo, después en varias ocaciones después del pulso se retira
una alícuota de la cámara receptora para el análisis. Las
sustancias radiactivas o marcadas fluorescentemente permiten una
cuantificación fidedigna del flujo molecular. Simultáneamente, se
mide la integridad de la monocapa por adición de una sustancia de
ensayo no transportable tal como sacarosa o inulina y se miden
replicados de al menos 4 determinaciones con el fin de garantizar un
significado estadístico.
El o los compuestos candidatos que se pueden
administrar para influir sobre el nivel de un morfógeno dado se
pueden encontrar utilizando el siguiente ensayo de detección, en el
que se determina el nivel de producción de morfógeno por un tipo de
célula que produce niveles medibles del morfógeno, con y sin
incubación de la célula en cultivo con el compuesto, con el fin de
estimar los efectos del compuesto sobre la células. Esto se puede
conseguir por detección del morfógeno ya sea a nivel de proteína o
de ARN. Una descripción más detallada también puede encontrarse en
la Solicitud Internacional US92/07359 (documento WO 92/05172).
Se pueden preparar cultivos de células de riñón,
glándulas suprarrenales, vejiga de la orina, cerebro u otros
órganos como se describe extensamente en la bigliografía. Por
ejemplo, se pueden explantar riñones de roedores neonatales o
recién nacidos o jóvenes o adultos (ratones o ratas) y utilizarse en
un cultivo de órganos como órganos enteros o en forma de cortes de
tejidos (1-4 mm). Se pueden establecer cultivos de
tejidos primarios y líneas celulares establecidas, también
derivadas de riñón, glándulas suprarrenales, vejiga de la orina,
cerebro, glándulas mamarias u otros tejidos en placas de pocillos
múltiples (6 pocillos o 24 pocillos) siguiendo técnicas
convencionales de cultivo de células y se cultivan en ausencia o
presencia de suero durante un período de tiempo de 1 a 7 días. Se
pueden cultivar células, por ejemplo, en medio de Eagle modificado
con Dulbecco (Gibco, Long Island, NY) que cotiene suero (p. ej.,
suero vacuno fetal al 1%-10%, Gibco) o en medio privado de suero,
como se desee, o en medio definido (p. ej., que contiene insulina,
transferrina, glucosa, albúmina u otros factores de
crecimiento).
Las muestras para ensayar el nivel de producción
de morfógeno incluyen sobrenadantes de cultivo lisados de células,
recogidos periódicamente y evaluados para determinar la producción
de OP-1 por análisis de inumotransferencia
(Sambrook et al., eds., 1989, Molecular Cloning, Cold Spring
Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY), o una zona del propio
cultivo de células, recogido periódicamente y usado para preparar
Poli(A)+ ARN para el análisis de ARN. Para vigilar la
síntesis de OP-1 de novo, algunos cultivos se
marcan de acuerdo con procedimientos convencionales con una mezcla
de
^{35}S-metionina/^{35}S-cisteína
durante 6-24 horas y después se evalúa para
determinar la síntesis de OP-1 por métodos de
inmunoprecipitación convencionales.
Con objeto de cuantificar la producción de una
proteína morfogénica por un tipo de célula, se puede realizar un
inumunoensayo para detectar el morfógeno utilizando un anticuerpo
monoclonal o policlonal específico para esa proteína. Por ejemplo,
OP-1 se puede detectar utilizando un anticuerpo
policlonal específico para OP-1 en un ELISA, como
sigue.
Se añade 1 \mug/100 \mul de IgG de conejo
policlonal purificada por afinidad específica para
OP-1 en cada pocillo de una placa de 96 pocillos y
se incuba a 37ºC durante una hora. Los pocillos se lavan cuatro
veces con tampón borato sódico 0,167 M con NaCl 0,15 M (BSB), pH
8,2 que contiene Tween 20 al 0,1%. Para minimizar la unión no
específica, los pocillos se bloquean llenándolos completamente con
seroalbúmina bovina (BSA) al 1% en BSB e incubando durante 1 hora a
37ºC. Después los pocillos se lavan cuatro veces con BSB que
contiene Tween 20 al 0,1%. Se añade una alícuota de 100 \mul de
una dilución apropiada de cada una de las muestras de ensayo del
sobrenadante de cultivo celular a cada pocillo por triplicado y se
incuba a 37ºC durante 30 minutos. Después de la incubación, se
añaden 100 \mul de anti-suero de
OP-1 de conejo biotinilado (la solución madre tiene
una concentración de aproximadamente 1 mg/ml y se diluye 1:400 en
BSB que contiene BSA al 1% antes de su uso) en cada pocillo y se
incuban a 37ºC durante 30 minutos. Después los pocillos se lavan
cuatro veces con BSB que contiene Tween 20 al 0,1%. Se añaden 100
\mul de estreptavidina alcalina (Southern Biotechnology
Associates, Inc., Birmingham, Alabama, diluido 1:2.000 en BSB que
contiene Tween 20 al 0,1% antes de su uso) en cada pocillo y se
incuba a 37ºC durante 30 minutos. Las placas se lavan cuatro veces
con solución salina tamponada con Tris 0,5 M (TBS), pH 7,2. Se
añaden 50 \mul de sustrato (kit de sistema de amplifación ELISA,
Life Technologies, Inc., Bethesda, MD) en cada pocillo y se incuban
a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después, se añaden 50
\mul de amplificador (del mismo kit de sistema de amplificación) y
se incuba durante otros 15 minutos a temperatura ambiente. La
reacción se detiene por adición de 50 \mul de ácido sulfúrico 0,3
M. Se registra la D.O. a 490 nm de la solución en cada pocillo. Para
cuantificar OP-1 en el medio de cultivo, se traza
una curva patrón de OP-1 en paralelo con las
muestras de ensayo.
El anticuerpo policlonal se puede preparar como
sigue. Cada conejo recibe una primera inmunización con 100
\mug/500 \mul de monómero OP-1 producido en
E. coli (aminoácidos 328-431 en SEQ ID NO.5)
en SDS al 0,1% mezclado con 500 \mul de adyuvante completo de
Freund. El antígeno se inyecta subcutáneamente en diversos sitios
en la espalda y los costados del animal. El conejo recibe recuerdos
después de un mes de la misma manera utilizando adyuvante
incompleto de Freund. Se toman muestras de sangre para ensayar de la
vena del oído siete días después. Se realizan dos recuerdos
adicionales y se extrae sangre para ensayo a intervalos de un mes
hasta que se detecta anticuerpo contra OP-1 en el
suero utilizando un ensayo ELISA. Después, el conejo recibe
recuerdos mensualmente con 100 \mug de antígeno y se toman
muestras de sangre (15 ml cada vez) los días siete y diez después
del recuerdo.
Un anticuerpo monoclonal específico para un
morfógeno dado se puede preparar como sigue. Se administran a un
ratón dos inyecciones de monómero OP-1 producido por
E. coli. La primera inyección contiene 100 \mug de
OP-1 en adyuvante completo de Freund y se administra
subcutáneamente. La segunda inyección contiene 50 \mug de
OP-1 en adyuvante incompleto de Freund y se
administra intraperitonealmente. Después, el ratón recibe un total
de 230 \mug de OP-1 (aminoácidos
307-431 en SEQ ID NO:5) en cuatro inyecciones
intraperitoneales en varios momentos a lo largo de un período de
ocho meses. Una semana antes de la infusión, ambos ratones reciben
recuerdos intraperitonealmente con 100 \mug de
OP-1 (307-431) y 30 \mug del
péptido N-terminal
(Ser_{293}-Asn_{309}-Cys)
conjugado a través de la cisteína añadida a seroalbúmina bovina con
agente reticulante SMCC. Este recuerdo se repitió cinco días (IP),
cuatro días (IP), tres días (IP) y un día (IV) antes de la fusión.
Las células de bazo de ratón se fusionan después a células de
mieloma (p. ej., 653) en una relación de 1:1 utilizando PEG 1500
(Boehringer Mannheim) y la fusión de células se cultiva y escruta
para encontrar anticuerpos específicos para OP-1
utilizando OP-1 (307-431) como
antígeno. La fusión celular y el escrutinio monoclonal se hacen de
acuerdo con procedimientos clásicos bien descritos en textos típicos
disponibles en la técnica.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: CREATIVE BIOMOLECULES, INC.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 35 SOUTH STREET
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: HOPKINTON
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: MASSACHUSETTS
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 01748
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 1-508-435-9001
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 1-508-435-0454
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- TELEX:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: REGENERACIÓN Y REPARACIÓN DE NERVIOS, INDUCIDA POR MORFÓGENOS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 33
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: CREATIVE BIOMOLECULES, INC.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 35 SOUTH STREET
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: HOPKINTON
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: MASSACHUSETTS
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 01748
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA INFORMÁTICO: Patentin Release #1.0, Versión #1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN ACERCA DEL ABOGADO/AGENTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: KELLEY; ROBIN D.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 34.637
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: CRP-070
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN ACERCA DE TELECOMUNICACIÓN
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 617/248-7000
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 617/248-7100
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 97 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..97
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= SECUENCIA GENÉRICA 1 /nota= "EN DONDE CADA XAA INDICA INDEPENDIENTEMENTE UNO DE LOS 20 ISÓMEROS L DE ALFA-AMINOÁCIDOS NATURALES, O UNO DE SUS DERIVADOS"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 97 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..97
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= SECUENCIA GENÉRICA 2 /nota= "EN DONDE CADA XAA INDICA INDEPENDIENTEMENTE UNO DE LOS 20 ISÓMEROS L DE ALFA-AMINOÁCIDOS NATURALES, O UNO DE SUS DERIVADOS"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 97 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..97
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= SECUENCIA GENÉRICA 3 /nota= "EN DONDE CADA XAA SE SELECCIONA INDEPENDIENTEMENTE DE UN GRUPO DE UNO O MÁS AMINOÁCIDOS ESPECIFICADOS COMO SE DEFINE EN LA MEMORIA DESCRIPTIVA"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 102 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..102
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= SECUENCIA GENÉRICA 4 /nota= "EN DONDE CADA XAA SE SELECCIONA INDEPENDIENTEMENTE DE UN GRUPO DE UNO O MÁS AMINOÁCIDOS ESPECIFICADOS COMO SE DEFINE EN LA MEMORIA DESCRIPTIVA"
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 139 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE TEJIDO: HIPOCAMPO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..139
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= hOP1-MADURA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 139 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: MÚRIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE TEJIDO: EMBRIONARIO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..139
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= MOP1-MADURA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 139 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: HOMO SAPIENS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE TEJIDO: HIPOCAMPO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..139
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= HOP2-MADURA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 139 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: MÚRIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE TEJIDO: EMBRIONARIO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..139
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= MOP2-MADURA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 101 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: bovinos
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..101
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= CBMP-2A-FX
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 101 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: HOMO SAPIENS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE TEJIDO: hipocampo
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..101
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= CBMP-2B-FX
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 102 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: DROSOPHILA MALANOGASTER
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..101
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= DPP-FX
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 102 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: XENOPUS
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..102
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= VGL-FX
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 102 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: MÚRIDOS
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..102
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= VGR-1-FX
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 106 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE TEJIDO: cerebral
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..106
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "GDF-1 (fx)"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1822 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: HOMO SAPIENS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE TEJIDO: HIPOCAMPO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 49..1341
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función: PROTEÍNA OSTOGÉNICA'' /producto= "OP1" /evidencia= EXPERIMENTAL /nombre_clásico= "OP1"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 431 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1873 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: MÚRIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE TEJIDO: EMBRIONARIO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 104..1393
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función: PROTEÍNA OSTOGÉNICA'' /producto= "MOP1" /nota= "MOP1 (CDNA)"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 430 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1723 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE TEJIDO: HIPOCAMPO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 490..1696
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función: PROTEÍNA OSTOGÉNICA'' /producto= "hOP2-PP" /nota= "hOP2 (ADNc)"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 402 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1926 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: MÚRIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE TEJIDO: EMBRIONARIO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 83..1289
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función: PROTEÍNA OSTOGÉNICA'' /producto= "mOP2-PP" /nota= "mOP2 (ADNc)"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 399 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1368 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..1368
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 455 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 104 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..104
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "BMP3"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:26:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 102 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: HOMO SAPIENS
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..102
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "BMP5"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 102 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: HOMO SAPIENS
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..102
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "BMP6"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:28:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 102 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..102
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= OPX/nota= "EN DONDE CADA XAA SE SELECCIONA INDEPENDIENTEMENTE DE UN GRUPO DE UNO O MÁS AMINOÁCIDOS ESPECIFICADOS COMO SE DEFINE EN LA MEMORIA DESCRIPTIVA (SECCIÓN II.B.2)"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:29:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 97 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..97
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= SECUENCIA GENÉRICA 5/nota= "EN DONDE CADA XAA SE SELECCIONA INDEPENDIENTEMENTE DE UN GRUPO DE UNO O MÁS AMINOÁCIDOS ESPECIFICADOS COMO SE DEFINE EN LA MEMORIA DESCRIPTIVA"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 102 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..102
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= SECUENCIA GENÉRICA 6/nota= "EN DONDE CADA XAA SE SELECCIONA INDEPENDIENTEMENTE DE UN GRUPO DE UNO O MÁS AMINOÁCIDOS ESPECIFICADOS COMO SE DEFINE EN LA MEMORIA DESCRIPTIVA"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:31:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1247 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: HOMO SAPIENS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE TEJIDO: CEREBRAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 84..1199
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto= "GDF-1" /nota= "GDF-1 ADNc"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:32:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 372 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:33:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (8)
1. Uso de un morfógeno en la fabricación de un
medicamento para (i) tratar esclerosis lateral amiotrófica, (ii)
para tratar una lesión en la médula espinal, (iii) para tratar la
enfermedad de Parkinson, o (iv) para estimular la reparación de la
rotura de un nervio, en el que el morfógeno comprende una proteína
dímera que tiene una secuencia de aminoácidos, que comprende:
(a) una secuencia definida por la Secuencia
Genérica 6, Seq ID nº 31; o
(b) una secuencia que tiene más de 60% de
identidad de aminoácidos con el dominio C-terminal
con seis cisteínas de OP-1 humano, restos
43-139 de Seq ID nº 5; o
(c) una secuencia definida por OPX, Seq. ID nº
29;
en donde dicho morfógeno estimula la producción
de N-CAM o isoforma L1 por una célula
NG108-15 in vitro.
2. Un dispositivo que comprende una envolvente
tubular biocompatible que comprende una superficie exterior y una
superficie interior, definiendo dicha superficie interior un canal a
través del cual se puede regenerar una prolongación neural, teniendo
dicho dispositivo una forma y unas dimensiones suficientes para
cubrir una rotura en una vía neural, y teniendo unas aberturas
destinadas a recibir las terminaciones del nervio seccionado,
comprendiendo además dicho dispositivo un morfógeno dispuesto dentro
de dicho canal, en donde el morfógeno comprende una proteína dímera
que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende:
(a) una secuencia definida por la Secuencia
Genérica 6, Seq ID nº 31; o
(b) una secuencia que tiene más de 60% de
identidad de aminoácidos con el dominio C-terminal
con seis cisteínas de OP-1 humano, restos
43-139 de Seq ID nº 5; o
(c) una secuencia definida por OPX, Seq. ID nº
29;
en donde dicho morfógeno estimula la producción
de N-CAM o isoforma L1 por una célula
NG108-15 in vitro; y opcionalmente la
envolvente es sustancialmente impermeable.
3. Uso o dispositivo según la reivindicación 1 ó
2, en el que la secuencia de aminoácidos de cada uno de dichos
polipéptidos morfogénicos se selecciona entre:
(a) una secuencia que tiene más de 65% de
identidad en la secuencia de aminoácidos con el dominio
C-terminal con seis cisteínas de
OP-1 humano, restos 43-139 de Seq.
ID nº 5; y
(b) el dominio C-terminal con
siete cisteínas de OP-1 humano, restos
38-139 de Seq. ID nº 5.
4. Uso o dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en el que dicho morfógeno está
complejado con al menos un péptido del dominio pro del
morfógeno.
5. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1, 3 ó 4, en el que dicho morfógeno está asociado
con una molécula que mejora el transporte de dicho morfógeno a
través de la barrera hematoencefálica.
6. Uso según la reivindicación 1, en el que
dicho medicamento comprende además un vehículo biocompatible,
biorresorbible in vivo, adecuado para mantener una proteína
en un sitio in vivo, y opcionalmente, o bien
(i) dicho vehículo es estructuralmente
suficiente para facilitar la dirección de crecimiento axonal;
y/o
(ii) dicho vehículo comprende un material
polímero, laminina, colágeno, o componentes de la matriz
extracelular derivados de tejido cerebral.
7. Uso según la reivindicación 1, en el que el
morfógeno se selecciona del grupo que consiste en
OP-1 humano, OP-1 de ratón,
OP-2 humano, OP-2 de ratón, 60A,
GDF-1, BMP2A, BMP2B, DPP, Vgl,
Vgr-1, BMP3, BMP5 y BMP6.
8. Uso según la reivindicación 1, en el que el
medicamento se dispersa en un vehículo polimérico biocompatible, y
opcionalmente, o bien
(i) el vehículo es estructuralmente suficiente
para facilitar la dirección de crecimiento axonal; y/o
(ii) el vehículo comprende un material polímero,
laminina, colágeno, o componentes de la matriz extracelular
derivados de tejido cerebral.
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