ES2201059T5

ES2201059T5 - Regeneracion y reparacion de nervios inducida por morfogenos.

Info

Publication number: ES2201059T5
Application number: ES93918560T
Authority: ES
Inventors: David C. Rueger; Thangavel Kuberasampath; Hermann Oppermann; Engin Ozkaynak; Roy H.L. Pang; Charles M. Cohen
Original assignee: Curis Inc
Current assignee: Curis Inc
Priority date: 1992-07-31
Filing date: 1993-07-29
Publication date: 2007-11-01
Anticipated expiration: 2013-07-29
Also published as: AU4797193A; DE69333040D1; EP0653942B2; WO1994003200A1; DK0653942T3; EP0653942A1; CA2141554A1; ATE242639T1; JPH07509721A; AU681594B2; JP4344012B2; CA2141554C; JP2005287512A; EP0653942B1; JP2009227679A; PT653942E; DE69333040T2; ES2201059T3; DE69333040T3

Abstract

SE PRESENTAN METODOS TERAPEUTICOS DE TRATAMIENTO, COMPOSICIONES Y DISPOSITIVOS PARA MANTENER LOS CAMINOS NEURONALES EN UN MAMIFERO, QUE INCLUYEN LA MEJORA DE LA SUPERVIVENCIA DE LAS NEURONAS CON RIESGO DE MORIR, LA INDUCCION DE REPARACION CELULAR DE NEURONAS DAÑADAS Y DE LOS CAMINOS NEURONALES, Y LA ESTIMULACION DE LAS NEURONAS PARA MANTENER SU FENOTIPO DIFERENCIADO. EN UNA CONFORMACION, LA INVENCION SUMINISTRA MEDIOS PARA ESTIMULAR LA EXPRESION DE CAM EN LAS NEURONAS. LA INVENCION TAMBIEN SUMINISTRA MEDIOS PARA EVALUAR EL ESTADO DEL TEJIDO NERVIOSO, INCLUYENDO MEDIOS PARA DETECTAR Y MONITORIZAR NEUROPATIAS EN UN MAMIFERO. LOS METODOS, DISPOSITIVOS Y COMPOSICIONES INCLUYEN UN AGENTE ESTIMULANTE DE MORFOGENO ADMINISTRADO AL MAMIFERO EN UNA CONCENTRACION TERAPEUTICAMENTE EFECTIVA.

Description

Regeneración y reparación de nervios inducida por morfógenos.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere al uso de morfógenos como se define en las revindicaciones. La invención también proporciona un dispositivo.

El sistema nervioso de los mamíferos comprende un sistema nervioso periférico (SNP) y un sistema nervioso central (SNC, que comprende el cerebro y la médula espinal), y está compuesto por dos clases principales de células: neuronas y células neuroneurogliales. Las células neuroneurogliales rellenan los espacios entre las neuronas, nutriéndolas y modulando su función. Ciertas células neuroneurogliales, tales como las células de Schwann en el SNP y los oligodendrocitos en el SNC, también proporcionan una vaina mielínica protectora que rodea y protege a los axones neuronales, que son las prolongaciones que se proyectan desde el cuerpo de la célula neuronal y a través de las cuales son conducidos los impulsos eléctricos de la neurona. En el sistema nervioso periférico, los axones largos de varias neuronas se reúnen en haces para formar un nervio o fibra nerviosa. A su vez, estas fibras nerviosas se pueden combinar formando fascículos, en los cuales las fibras nerviosas forman haces encajados, junto con el aporte vascular intraneural, en una matriz suelta de colágeno unida por una vaina multilaminar protectora. En el sistema nervioso central, los cuerpos celulares neuronales se distinguen visualmente de sus prolongaciones con envolvente mielínica, y se denominan en la técnica sustancia gris y sustancia blanca, respectivamente.

Durante el desarrollo, las neuronas que se están diferenciando en los sistemas nerviosos central y periférico proyectan axones que deben crecer y hacer contacto con células diana específicas. En algunos casos, los axones que están creciendo deben abarcar enormes distancias; algunos crecen en la periferia, mientras que otros permanecen confinados dentro del sistema nervioso central. En los mamíferos, esta fase de neurogénesis termina durante la fase embrionaria de la vida y las células neuronales no se multiplican una vez que se han diferenciado del todo.

Por consiguiente, las vías neurales de un mamífero están expuestas a un riesgo particular si las neuronas sufren traumatismos mecánicos o químicos o una degeneración neuropática suficiente para poner las neuronas que definen la vía en riesgo de morir. Hasta la fecha, se han identificado numerosas neuropatías, algunas de las cuales afectan sólo a una subpoblación o a un sistema de neuronas dentro de los sistemas nerviosos periférico o central. Las neuropatías, que pueden afectar a las propias neuronas o a las células neuroneurogliales asociadas, pueden ser resultado de una disfunción metabólica celular, una infección, la exposición a agentes tóxicos, una disfunción del sistema autoinmune, malnutrición o isquemia. Se cree que en algunos casos la disfunción celular induce directamente la muerte de la célula. En otros casos, la neuropatía puede inducir una necrosis hística suficiente para estimular el sistema inmune/inflamatorio del cuerpo y entonces son los mecanismos de la respuesta inmune del cuerpo a la lesión neural inicial los que destruyen las neuronas y la ruta definida por estas neuronas.

Actualmente, no existe ningún método efectivo para reparar el daño causado por estas neuropatías, entre las que se incluyen esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica (ALS, por sus siglas en inglés), corea de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson (parkinsonismo) y trastornos de origen metabólico tales como la encefalopatía hepática. Los intentos actuales de contrarrestar los efectos de las lesiones degenerativas neurales o traumáticas graves del cerebro y/o de la médula espinal se han basado hasta ahora principalmente en la implantación de neuronas embrionarias para intentar reemplazar funcionalmente, o si acaso compensar, las neuronas perdidas o deficientes. Sin embargo, actualmente la investigación de transplantes de células embrionarias humanas está muy limitada. La administración de factores neurotróficos tales como factor de crecimiento nervioso y factor de crecimiento de tipo insulínico también ha sido sugerida para estimular crecimiento neuronal dentro del SNC. (Véase, por ejemplo, Lundborg (1987) Acta Orthop. Scand. 58:145-169 y Patente de EE.UU. Nº 5.093.317). La administración de factores neurotróficos al SNC requiere traspasar la barrera hematoencefálica. La barrera puede traspasarse por infusión directa, o por modificación de la molécula para mejorar su transporte a través de la barrera, ya sea por modificación química o conjugación, o por truncación de la molécula. También se han injertado células de Schwann en un sitio de una lesión del SNC para intentar estimular y mantener el crecimiento de las prolongaciones neuronales dañadas (Paino et al. (1991) Exp. Neurology 114(2):254-257.

En los sitios en que la vía neural dañada es el resultado del daño axonal en el SNC, se han utilizado injertos de nervios periféricos autólogos para puentear lesiones en el sistema nervioso central y permitir que los axones retrocedan a su zona diana normal. A diferencia de las neuronas del SNC, las neuronas del sistema nervioso periférico pueden extender nuevas prolongaciones periféricas en respuesta al daño axonal. Esta propiedad regenerativa de los axones del sistema nervioso periférico se cree que es suficiente para permitir el injerto de estos segmentos en los axones del SNC. Sin embargo, el proceso de injerto efectivo parece estar limitado por diversos factores, entre los que se incluye la longitud de la lesión axonal del SNC que se intenta puentear, y la distancia desde los cuerpos de las células neuronales del SNC hasta los sitios del injerto, ocurriendo injertos efectivos cerca del cuerpo celular.

Dentro del sistema nervioso periférico, esta propiedad de regeneración celular de las neuronas tiene una limitada capacidad de reparar la función de una ruta neuronal dañada. Específicamente, los nuevos axones se prolongan aleatoriamente, y a menudo en dirección equivocada, haciendo contacto con dianas inapropiadas, lo que puede causar una función anómala. Por ejemplo, si se daña un nervio motor, los axones que están volviendo a crecer pueden entrar en contacto con los músculos equivocados, dando lugar a parálisis. Además, cuando las prolongaciones de los nervios seccionados dan como resultado una separación de más de unos pocos milímetros, por ejemplo de más de 10 milímetros (mm), no ocurre la regeneración adecuada del nervio, ya sea porque las prolongaciones no logran crecer la distancia necesaria, o debido al crecimiento axonal mal dirigido. Los esfuerzos por reparar el daño nervioso periférico por medios quirúrgicos se han encontrado con resultados diversos, en particular cuando el daño se extiende a lo largo de una distancia importante. En algunos casos, las etapas de sutura utilizadas para obtener una alineación apropiada de las terminaciones nerviosas seccionadas estimulan la formación de tejido cicatrizal que se cree que inhibe la regeneración de los axones. Incluso cuando se ha reducido la formación de tejido cicatrizal, como ocurre con el uso de canales de guía de los nervios u otras prótesis tubulares, por lo general la regeración efectiva sigue estando limitada al daño nervioso de menos de 10 mm de separación. Además, la capacidad de reparación de las neuronas periféricas se inhibe de modo significativo cuando una lesión o neuropatía afecta al propio cuerpo celular o da como resultado una amplia degeneración de un axón distal.

Las vías neurales de los mamíferos también están en riesgo debido al daño causado por las lesiones neoplásicas. Se han identificado neoplasias tanto de las neuronas como de las células neuroneurogliales. Las células transformadas de origen neural generalmente pierden su capacidad de comportarse como células diferencias normales y pueden destruir las vías neurales por pérdida de función. Además, los tumores que están proliferando pueden inducir lesiones al distorsionar la estructura del tejido nervioso normal, inhibir las rutas por comprimir nervios, inhibir el flujo de sangre o de líquido cefalorraquídeo y/o estimular la respuesta inmune del cuerpo. Los tumores metastásicos que son una causa significativa de lesiones neoplásicas en el cerebro y en la médula espinal, también pueden dañar de forma similar las vías neurales e inducir la muerte de las células neuronales.

Un tipo de molécula morforreguladora asociada con el crecimiento de las células neuronales, su diferenciación y su desarrollo, lo constituyen las moléculas de adhesión celular ("CAM", por sus siglas en inglés), y muy notablemente la molécula de adhesión a las células nerviosas (N-CAM, por sus siglas en inglés). Las CAM pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas y median las interacciones intercelulares en los tejidos en fase de desarrollo y adultos a través de la unión homofílica, es decir unión CAM-CAM sobre células yuxtapuestas. Se han identificado diversas CAM diferentes. De ellas, las que se han estudiado más a fondo hasta la fecha con N-CAM y L-CAM (moléculas de adhesión a las células hepáticas), ambas de las cuales han sido identificadas en todas las células en fases precoces de desarrollo, así como en diferentes tejidos adultos. En el desarrollo del tejido neural, la expresión de N-CAM se cree que es importante en la organización del tejido, en la migración neuronal, en la adhesión del tejido nervioso-muscular, en la formación retinal, en la sinaptogénesis y en la degeneración neural. También se cree que una expresión disminuida de N-CAM está asociada con una disfunción nerviosa. Por ejemplo, la expresión de al menos una forma de N-CAM, N-CAM-180, está disminuida en un mutante dismielinante de ratón (Bhat (1988) Brain Res. 452:373-377). Los niveles reducidos de N-CAM también han sido asociados con hidrocefalia normotensa (Werdelin (1989) Acta Neurol. Scand. 79:177-181) y con esquizofrenia de tipo II (Lyons et al., (1988) Biol. Psychiatry 23:769-775). Además, se ha demostrado que los anticuerpos frente a N-CAM alteran la recuperación funcional de los nervios lesionados (Remsen (1990) Exp. Neurobiol. 110:268-273). Otro objeto es proporcionar un medio para estimular la expresión de CAM, en particular N-CAM, en una célula.

El documento WO 92/00382 describe un segmento de ADN que codifica una proteína GDF-1 de mamífero y la proteína codificada por el mismo.

Jones et al. (1991) Biol. Abstracts No. 19 Ab-444 (abstract No. 106 862) describen estudios de hibridación in situ de los patrones de expresión de BMP-4 y VGR-1 en el sistema nervioso central del ratón.

El documento WO 92/15323 describe proteínas morfogénicas que pueden inducir morfogénesis de tejidos en mamíferos.

Compendio de la invención

La presente invención proporciona el uso de un morfógeno como se define en las reivindicaciones adjuntas y un dispositivo para mantener las vías neurales en un mamífero in vivo.

Se puede usar una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína morfogénica ("morfógeno"), como se define aquí.

Con fines ilustrativos, los métodos para mejorar la supervivencia de neuronas en riesgo de morir, incluyen proteger las neuronas de los efectos destructivos de tejidos asociados con la respuesta inmune/inflamatoria del cuerpo ante una lesión nerviosa. Los métodos para estimular las neuronas para que mantengan su fenotipo diferenciado, incluyen inducir la rediferenciación de las células transformadas de origen neuronal a una morfología característica de neuronas no transformadas. Se describen medios para estimular la producción de moléculas de adhesión celular en las células, particularmente moléculas de adhesión a las células nerviosas (N-CAM) en neuronas. La invención también proporciona dispositivos para estimular la reparación celular de neuronas y vías neurales dañadas, incluyéndose la regeneración de axones dañados de los sistemas nerviosos central y periférico.

Como se utiliza aquí, una "vía neural" describe un circuito nervioso para el paso de las señales eléctricas desde una fuente hasta un sitio de la célula diana. La ruta incluye las neuronas a través de las cuales se transporta el impulso eléctrico, incluyendo grupos de neuronas interconectadas, las fibras nerviosas formadas por los axones neuronales reunidos en haces, y las células neuroneurogliales que rodean a las neuronas y están asociadas a ellas.

Los morfógenos descritos aquí son útiles para reparar vías neurales dañadas del sistema nervioso periférico. En particular, los morfógenos son útiles para reparar rutas dañadas, incluidas fibras nerviosas (nervios) seccionadas transversalmente o dañadas de otro modo que requieren la regeneración de las prolongaciones neuronales, particularmente los axones, a lo largo de grandes distancias para puentear una separación en el propio nervio, o entre el nervio y una célula post-sináptica. De modo específico, los morfógenos como los descritos en las reivindicaciones son capaces de estimular una regeneración completa del nervio axonal, lo que incluye vascularización y reformación de la vaina mielínica protectora. Preferiblemente, el morfógeno es proporcionado en el sitio de la adhesión dispersado en un material portador biocompatible y biorresorbible, capaz de mantener al morfógeno en el sitio y, en caso necesario, medios para dirigir el crecimiento axonal desde el extremo proximal al extremo distal de una neurona o nervio seccionado. Por ejemplo, se pueden requerir medios para dirigir el crecimiento axonal cuando se va a inducir la regeneración del nervio a lo largo de una gran distancia, tal como más de 10 mm. Se consideran muchos vehículos capaces de proporcionar estas funciones. Por ejemplo, entre los vehículos útiles se incluyen materiales sustancialmente insolubles o soluciones viscosas preparadas como se ha descrito aquí, que comprenden laminina, ácido hialurónico o colágeno, u otros materiales polímeros biocompatibles y sintéticos adecuados tales como poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico) o poli(ácido butírico) y/o sus copolímeros. El vehículo actualmente preferido comprende una composición de matriz extracelular, tal como una descrita aquí derivada, por ejemplo, de células de sarcoma de ratón. También se consideran como especialmente útiles las matrices extracelulares derivadas de tejido cerebral.

El morfógeno se puede proporcionar en el sitio como parte de un dispositivo en el que está dispuesto el morfógeno en un canal de guía del nervio que cubre la distancia de la ruta dañada. El canal actúa tanto como cobertura protectora y como medio físico para guiar el crecimiento de una prolongación neuronal tal como un axón. Los canales útiles comprenden una membrana o envolvente biocompatible, que puede tener una estructura tubular, que tiene una dimensión suficiente para abarcar la separación o rotura en el nervio que se va a reparar, y que tiene separaciones destinadas a recibir terminaciones nerviosas seccionadas. La envolvente o membrana puede estar hecha de cualquier material biocompatible no irritante tal como silicona o un polímero biocompatible tal como polietileno o polietileno y acetato de vinilo. La envolvente también puede estar compuesta de polímeros biorresorbibles y biocompatibles entre los que se incluyen, por ejemplo, colágeno, ácido hialurónico, poli(ácido láctico), poli(ácido butírico) y poli(ácido glicólico). En una realización aquí preferida, la superficie externa del canal es sustancialmente impermeable.

El morfógeno puede estar dispuesto en el canal en asociación con un material portador biocompatible o puede ser adsorbido o asociado de otro modo a la superficie interna de la envolvente, tal como se describe en la memoria de Patente de EE.UU. Nº 5.011.486, siempre que el morfógeno esté accesible para las terminaciones nerviosas seccionadas. Adicionalmente, aunque los canales de guía del nervio descritos aquí generalmente tienen forma tubular, será evidente para los expertos en la técnica que se pueden emplear varios perfiles alternativos. La luz de los canales de guía puede ser, por ejemplo, ovalado o incluso cuadrado en corte transversal. Además, los canales de guía pueden estar construidos de dos o más piezas que pueden abrazarse entre sí para asegurar los muñones de los nervios. Las terminaciones nerviosas se pueden asegurar a los canales de guía del nervio por medio de suturas, adhesivos biocompatibles tales como pegamento de fibrina, o por otros medios conocidos en la ciencia médica.

Con fines ilustrativos, los morfógenos descritos aquí también se consideran útiles en implantes de segmentos de nervios periféricos autólogos para puentear vías neurales dañadas en el sistena nervioso central, tal como en la reparación de retinas dañadas o desprendidas, u otros daños en el nervio óptico. Aquí el morfógeno se proporciona al sitio de unión para estimular crecimiento axonal en el sitio del injerto, particularmente cuando el segmento axonal dañado que va a ser puenteado se encuentra lejos del cuerpo celular neuronal.

Los morfógenos descritos aquí también son útiles para mejorar la supervivencia de células neuronales en riesgo de morir, con lo que se impide, limita o inhibe de otra forma el daño en las rutas neurales. Las neuronas no mitóticas están en riesgo de morir como resultado de una neuropatía u otra disfunción celular de una neurona o célula neuroglial que induce la muerte de la célula, o tras una lesión química o mecánica en la célula o su tejido circundante. Las lesiones químicas pueden ser el resultado de agentes tóxicos conocidos como el plomo, el etanol, el amoníaco, el formaldehído y otros muchos disolventes orgánicos, así como los toxinas del humo del tabaco y de los opiáceos. Los aminoácidos excitadores, tales como el glutamato, también pueden desempeñar un papel en la patogénesis de la muerte celular neuronal (véase Freese et al. (1990) Brain Res. 521:254-264). La muerte celular neuronal también se piensa que es un factor que contribuye en alto grado en diversas enfermedades neurodegenerativas, entre las que se incluyen la enfermedad de Alzheimer, el corea de Huntington y la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica y la esclerosis múltiple. La etiología de estas neuropatías puede ser metabólica, como la que se produce por encefalopatía hepática, o bien infecciosa, tóxica, autoinmune, nutricional o isquémica. Además, también se ha identificado el alcohol y otras muchas toxinas como factores significativos que contribuyen a las enfermedades neurodegenerativas. Los morfógenos descritos aquí se pueden proporcionar a las células en riesgo de morir para mejorar su supervivencia y así proteger la integridad de la vía neural. Los morfógenos se pueden proporcionar directamente al sitio o se pueden proporcionar sistémicamente. De modo alternativo, con fines ilustrativos, como se ha descrito antes, se puede administrar al mamífero un agente capaz de estimular la expresión y/o secreción de morfógenos endógenos, preferiblemente en células asociadas con el tejido nervioso de interés.

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Con fines ilustrativos, el método descrito es útil para rediferenciar células transformadas, particularmente las células transformadas de origen neuronal o neuroglial, de modo que las células tratadas con el morfógeno son inducidas a presentar una morfología característica de células no transformadas. Cuando las células transformadas son células de origen neuronal, el tratamiento con morfógenos preferiblemente induce el redondeo celular y agregación celular (aglutinación), adhesión célula-célula, formación y alargamiento de excrecencias neuríticas y producción de N-CAM. Se anticipa que los métodos descritos aquí inhibirán o reducirán sustancialmente la formación y/o proliferación de tumores celulares neurales en tejido nervioso. Se anticipa que los métodos de esta invención serán útiles reduciendo sustancialmente los efectos de diversos carcinomas de origen en tejido nervioso tales como retinoblastomas, neuroblastomas, y gliomas o glioblastomas. Además, también se anticipa que el método ayudará a inhibir lesiones neoplásicas causadas por tejido metastásico. Los tumores metastásicos son uno de los neoplasmas más comunes del SNC, ya que pueden alcanzar al compartimiento intracraneal a través del torrente sanguíneo. Los tumores metastásicos pueden dañar las vías neurales, por ejemplo, distorsionando estructuras de tejidos nerviosos normales, comprimiendo nervios, bloqueando el flujo de líquido cefalorraquídeo o el suministro de sangre que nutre al tejido cerebral y/o estimulando la respuesta inmune del cuerpo.

Con fines ilustrativos, los morfógenos descritos aquí son útiles para proporcionar efectos neuroprotectores que alivian el daño en las vías neurales asociado con la respuesta inmune/inflamatoria del cuerpo a una lesión inicial en el tejido nervioso. Dicha respuesta puede seguir a un traumatismo en el tejido nervioso, causado, por ejemplo, por una disfunción autoinmune, una lesión neoplásica, una infección, un traumatismo químico o mecánico, una enfermedad, por interrupción de la circulación sanguínea a las neuronas o las células neuroneurogliales, por ejemplo tras isquemia o hipoxia, o por otro traumatismo en el nervio o material circundante. Por ejemplo, el daño principal debido a hipoxia o a reperfusión tras isquemia, después de la oclusión de un aporte sanguíneo neural, como en una embolia, se cree que es inmunológico. Además, al menos parte del daño asociado con diversos tumores cerebrales primarios también parece ser inmunológico. La aplicación del morfógeno directamente a las células que se van a tratar, o el aporte del morfógeno al mamífero sistémicamente, por ejemplo, intravenosamente o indirectamente por administración oral, se puede utilizar para aliviar y/o inhibir la respuesta inmunológica a un daño neural. Alternativamente, también se puede utilizar la administración de un agente capaz de estimular la expresión y/o secreción in vivo de morfógenos, preferiblemente en el sitio de la lesión. Cuando se va a inducir el daño, por ejemplo durante una intervención quirúrgica u otro tratamiento clínico agresivo, el morfógeno o agente puede ser proporcionado antes de la inducción de la lesión para aportar un efecto neuroprotector en el tejido nervioso en riesgo.

Con fines ilustrativos se describen métodos para sostener el desarrollo y mantenimiento de neuronas diferenciadas, que incluye inducir a las neuronas a continuar expresando su fenotipo. Se anticipa que esta actividad será particularmente útil en el tratamiento de trastornos del tejido nervioso cuya pérdida de función está causada por una disminución o pérdida de la función metabólica celular y porque las células se hacen senescentes o quiescentes, tal como se cree que ocurre en las células que están envejeciendo y que se manifiestan en la enfermedad de Alzheimer. La aplicación del morfógeno directamente a las células que se van a tratar, o su aporte sistémico por administración parenteral u oral estimula a estas células a continuar expresando su fenotipo, inhibiendo y/o invirtiendo significativamente los efectos de la disfunción metabólica celular, por lo que se mantiene la vía neural en riesgo. Alternativamente, se puede utilizar la administración de un agente capaz de estimular la expresión y/o secreción in vivo del morfógeno endógeno.

Con fines ilustrativos se describen métodos para estimular los niveles de expresión de CAM en una célula, particularmente la expresión de N-CAM en neuronas. Las CAM son moléculas definidas como portadoras de interacciones célula-célula necesarias para la formación de los tejidos. Se cree que las CAM desempeñan un papel regulador fundamental en el desarrollo de los tejidos, incluida la formación de los límites de los tejidos, la inducción y migración embrionaria y la estabilización y regeneración del tejido. Los niveles de CAM alterados han sido implicados en numerosos trastornos de tejidos, incluidos los defectos congénitos, las neoplasias y las enfermedades degenerativas.

En particular, la expresión de N-CAM está asociada con el desarrollo y la diferenciación normal de las células neuronales, lo que incluye la formación de la retina, la sinaptogénesis y la adhesión de tejido muscular a nervioso. Se sabe que la inhibición de una o más de las isoformas de N-CAM impide el desarrollo adecuado de los tejidos. Los niveles alterados de la expresión de N-CAM también están asociados con neoplasias, incluidos los neuroblastomas (véase más adelante), así como con cierto número de neuropatías, incluida la hidrocefalia normotensa y la esquizofrenia de tipo II. La aplicación del morfógeno directamente a las células que se han de tratar, o el aporte del morfógeno al mamífero sistémicamente, por ejemplo, parenteralmente, o indirectamente por administración oral, se puede utilizar para inducir expresión celular de una o más CAM, particularmente N-CAM. Alternativamente, la administración de un agente capaz de estimular la expresión y/o secreción de morfógeno in vivo, preferiblemente en el sitio de la lesión, también se puede utilizar para inducir la producción de CAM.

Las moléculas CAM según se ha postulado son también parte de la ruta morforreguladora cuya actividad es inducida por una molécula no identificada hasta la fecha (véase, por ejemplo, Edelman, G.M. (1986) Ann. Rev. Cell Biol. 2:81-116). Sin pretender limitarse a ninguna teoría en particular, los morfógenos descritos aquí pueden actuar como inductor en esta ruta.

Finalmente, con fines ilustrativos, las modulaciones de los niveles de morfógeno endógeno pueden vigilarse como parte de un método de detección de disfunción en el tejido nervioso. Específicamente, se anticipa que las modulaciones en los niveles de morfógeno endógeno reflejarán cambios en el estato del tejido nervioso. La expresión de morfógeno puede vigilarse directamente en muestras de células biopsiadas, en líquido cefalorraquídeo o en suero. Alternativamente, se pueden estimar niveles de morfógeno detectando cambios en los niveles de anticuerpos endógenos al morfógeno. Por ejemplo, se pueden obtener muestras de suero de un mamífero y después detectar la concentración de morfógeno o anticuerpo presente en el líquido por técnicas clásicas de detección de proteínas, conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar una proteína de unión capaz de interaccionar específicamente con el morfógeno de interés, tal como un anticuerpo anti-morfógeno, para detectar un morfógeno en un inmunoensayo clásico. Después se pueden comparar los niveles de morfógeno con un patrón previamente determinado o con un nivel de referencia, siendo los cambios en los niveles detectados indicativos del estado del tejido.

Un morfógeno o el agente estimulador de morfógeno se puede administrar sistémicamente al individuo, por ejemplo por vía oral o parenteral. Un morfógeno puede ser proporcionado directamente en el tejido nervioso, por ejemplo por inyección en el líquido cefalorraquídeo o en un lugar del tejido nervioso.

La terminología "administración de morfógeno" se refiere a la administración del morfógeno, ya sea a solas o en combinación con otras moléculas. Por ejemplo, puede proporcionarse en la forma madura del morfógeno en asociación con su dominio "pro" precursor, que se sabe que mejora la solubilidad de la proteína. Otras moléculas útiles que se sabe que mejoran la solubilidad de proteínas incluyen la caseína y otros componentes de la leche, así como diversas proteínas de suero. Otras moléculas útiles que pueden asociarse con el morfógeno o el agente estimulador del morfógeno incluyen moléculas que se dirigen a los tejidos, capaces de dirigir el morfógeno o el agente estimulador del morfógeno al tejido nervioso. Estas moléculas que se dirigen a tejidos y que se consideran útiles en los protocolos de tratamiento de esta invención, incluyen anticuerpos, fragmentos de anticuerpos u otras proteínas de unión que interaccionan específicamente con las moléculas de superficie en las células del tejido nervioso.

Todavía otra molécula útil que se dirige al tejido es todo o parte del dominio "pro" precursor del morfógeno, particularmente el de OP-1 o GDF-1. Estas proteínas están asociadas de forma natural con el tejido nervioso pero también se pueden sintetizar en otros tejidos y dirigirse específcamente al tejido nervioso después de la secreción del tejido de síntesis. Por ejemplo, si bien la proteína ha demostrado ser activa en tejido óseo, la fuente principal de síntesis de OP-1 parece ser el tejido del sistema urógeno (por ejemplo tejido renal y vesicular), dándose niveles de expresión secundaria en el cerebro, corazón y pulmones (véase más adelante). Además, la proteína ha sido identificada en suero, saliva y varias formas de leche. Además, la forma secretada de la proteína comprende el dímero maduro en asociación con el dominio pro de la secuencia intacta de morfógeno. Por consiguiente, los dominios pro de morfógenos asociados pueden actuar para dirigir morfógenos específicos a diferentes tejidos in vivo.

Las moléculas que mejoran la solubilidad o que se dirigen a tejido asociado también pueden unirse covalentemente al morfógeno utilizando técnicas químicas clásicas, entre las que se incluyen enlaces lábiles en medio ácido, que probablemente se escindirán preferentemente en el medio ácido de los sitios de remodelación ósea.

Finalmente, se pueden administrar morfógenos también en combinación con otras moléculas que se sabe que son beneficiosas para mantener las rutas neurales, incluidos, por ejemplo, los factores de crecimiento nervioso y los agentes anti-inflamatorios.

Cuando el morfógeno está destinado a uso como agente terapéutico para trastornos del SNC, debe afrontarse un problema adicional: traspasar la denominada "barrera hematoencefálica", es decir, la estructura de paredes capilares del cerebro que filtra eficazmente todas salvo ciertas categorías seleccionadas de moléculas presentes en la sangre, evitando que pasen al cerebro. La barrera hematoencefálica puede ser atravesada eficazmente por infusión directa del morfógeno en el cerebro. Alternativamente, el morfógeno o de agente estimulador del morfógeno puede ser modificado para mejorar su transporte a través de la barrera hematoencefálica. Por ejemplo, las formas truncadas del morfógeno pueden ser más efectivas. Alternativamente, el morfógeno se puede modificar para hacerlo más lipofílico, o se puede conjugar a otra molécula que es transportada de forma natural a través de la barrera, utilizando técnicas clásicas conocidas por los expertos en este campo como, por ejemplo, las descritas en Pardridge, Endocrine Reviews 7:314-330 (1986) y Patente de EE.UU. Nº 4.801. 575.

Por consiguiente, como se utiliza aquí, un "análogo" funcional de un morfógeno se refiere a una proteína que tiene actividad biológica morfogénica pero que posee diferencias estructurales adicionales si se compara con un morfógeno como se define aquí, por ejemplo, que tiene restos químicos adicionales que normalmente no son parte de un morfógeno. Tales restos (introducidos, por ejemplo, por reacciones de acilación, alquilación, cationización o glicosilación, u otros medios para conjugar el resto al morfógeno) pueden mejorar la solubilidad de la molécula, su absorción, semivida biológica o transporte, por ejemplo, a través de la barrera hematoencefálica.

Entre los morfógenos útiles en esta invención están las proteínas identificadas originariamente como proteínas osteogénicas, tales como las proteínas OP-1, OP-2 y CBMP2, así como proteínas relacionadas con su secuencia de aminoácidos tales como DPP (de Drosophila), Vgl (de Xenopus), Vgr-1 (de ratón, véase la Patente de EE.UU. 5.011.691 de Opperman et al.), GDF-1 (de ratón, véase Lee (1991) PNAS 88:4250-4254), que se presentan en la Tabla II y en la Seq. ID Nos. 5-14), y la proteína 60A identificada recientemente (de Drosophila, Seq. ID No. 24, véase Wharton et al. (1991) PNAS 88:9214-9218). Los miembros de esta familia, que incluyen miembros de la superfamilia de proteínas TGF-\beta comparten una homología sustancial en la secuencia de aminoácidos en sus regiones C-terminales. Las proteínas se traducen como un precursor, teniendo una secuencia de péptido señal N-terminal, típicamente menor que aproximadamente 30 restos, seguido por un dominio "pro" que se escinde para dar la secuencia madura. El péptido señal se escinde rápidamente al traducirlo, en un sitio de escisión que puede predecirse en una secuencia dada utilizando el método de Von Heijne ((1986) Nucleic Acids Research 14:4683-4691). La Tabla I siguiente describe los diversos morfógenos identificados hasta la fecha, incluyendo su nomenclatura tal como se utiliza aquí, sus referencias Seq. ID y sus fuentes de publicación para las secuencias de aminoácidos para las proteínas de longitud completa no incluidas en el Listado de Secuencias.

TABLA I

1

2

3

4

Las proteínas OP-2 tienen un resto de cisteína adicional en esta región (véase, p. ej., el resto 41 de Seq. ID Nos. 7 y 8), además del esqueleto de cisteínas conservadas en común con las demás proteínas de esta familia. La proteína GDF-1 tiene un inserto de cuatro aminoácidos dentro del esqueleto conservado (restos 44-47 de Seq. ID No. 14) pero este inserto probablemente no interfiere con la relación de las cisteínas en la estructura plegada. Además, las proteínas CBMP2 tienen un resto de aminoácido desaparecido dentro del esqueleto de cisteínas.

Los morfógenos son inactivos cuando se reducen, pero son activos en forma de homodímeros oxidados y cuando se oxidan en combinación con otros morfógenos de esta invención. Así, como se define aquí, un morfógeno es una proteína dímera que comprende un par de cadenas polipeptídicas, en donde cada cadena polipeptídica comprende al menos el esqueleto con seis cisteínas C-terminales definido por los restos 43-139 de Seq. ID No. 5, incluyendo disposiciones funcionalmente equivalentes de estas cisteínas (por ejemplo, inserciones o deleciones de aminoácidos que alteran la disposición lineal de las cisteínas en la secuencia pero no su relación en la estructura plegada), tal que, cuando las cadenas polipeptídicas se pliegan, la especie de proteína dímera que comprende el par de cadenas polipeptídicas tiene la estructura tridimensional apropiada, incluyendo los enlaces disulfuro intra- e inter-catenarios apropiados tales que la proteína es capaz de actuar como un morfógeno en el sentido aquí definido. De modo específico, los morfógenos generalmente son capaces de realizar todas y cada una de las siguientes funciones biológicas en un medio permisivo morfogénicamente: estimular la proliferación de células progenitoras; estimular la diferenciación de células progenitoras; estimular la proliferación de células diferenciadas y sustentar el desarrollo y mantenimiento de células diferenciadas. Además, también se anticipa que estos morfógenos serán capaces de inducir rediferenciación de células comprometidas en condiciones medioambientales apropiadas.

Con fines ilustrativos, la Secuencia genérica 1 comprende el esqueleto con seis cisteínas conservadas y la Secuencia genérica 2 comprende el esqueleto con seis cisteínas conservadas más la cisteína adicional identificada en OP-2 (véase resto 36, Seq. ID No. 2). Estas secuencias pueden comprender además la siguiente secuencia adicional en su extremo N:

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Con fines ilustrativos, las secuencias de aminoácidos dentro de las secuencias genéricas anteriores incluyen: Secuencia genérica 3 (Seq. ID No. 3), Secuencia genérica 4 (Seq. ID No. 4) y Secuencia genérica 5 (Seq. ID No. 30). La Secuencia genérica 6 (Seq. ID No. 31) se puede usar según la invención. Estas secuencias genéricas acomodan las homologías compartidas entre los diversos miembros preferidos de esta familia de morfógenos identificada en la Tabla II, así como la variación entre ellas de las secuencias de aminoácidos. Concretamente, las Secuencias genéricas 3 y 4 son secuencias de aminoácidos compuestas de las siguientes proteínas presentadas en la Tabla II e identificadas en Seq. ID Nos. 5-14: OP-1 humana (hOP-1, Seq. ID Nos. 5 y 16-17), OP-1 de ratón (mOP-1, Seq. ID Nos. 6 y 18-19), OP-2 humana y de ratón (Seq. ID Nos. 7, 8 y 20-22), CBMP2A (Seq. ID No. 9), CBMP2B (Seq. ID No. 10), DPP (de Drosophila, Seq. ID No. 11), Vgl (de Xenopus, Seq. ID No. 12), Vgr-1 (de ratón, Seq ID No. 13) y GDF-1 (de ratón, Seq. ID No. 14). Las secuencias genéricas incluyen tanto la identidad de aminoácidos compartida por las secuencias en la Tabla II así como restos alternativos para las posiciones variables dentro de la secuencia. Nótese que estas secuencias genéricas permiten una cisteína adicionala en la posición 41 o 46 en las Secuencias genéricas 3 o 4, respectivamente, proporcionando un esqueleto de cisteína adecuado en el que se pueden formar enlaces disulfuro inter- o intra-moleculares, y contienen ciertos aminoácidos críticos que influyen en la estructura terciaria de las proteínas.

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en donde cada Xaa se selecciona independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos especificados definidos como sigue: "Res". significa "resto" y Xaa en res.4 = (Ser, Asp o Glu); Xaa en res.6 = (Arg, Gln, Ser o Lys); Xaa en res.7 = (Asp o Glu); Xaa en res.8 = (Leu o Val); Xaa en res.11 = (Gln, Leu, Asp, His o Asn); Xaa en res.12 = (Asp, Arg o Asn); Xaa en res.14 = (lIe o Val); Xaa en res.15 = (lIe o Val); Xaa en res.18 = (Glu, Gln, Leu, Lys, Pro o Arg); Xaa en res.20 = (Tyr o Phe); Xaa en res.21 = (Ala, Ser, Asp, Met, His, Leu o Gln); Xaa en res.23 = (Tyr, Asn o Phe); Xaa en res.26 = (Glu, His, Tyr, Asp o Gln); Xaa en res.28 = (Glu, Lys, Asp o Gln); Xaa en res.30 = (Ala, Ser, Pro o Gln); Xaa en res.31 = (Phe, Leu o Tyr); Xaa en res.33 = (Leu o Val); Xaa en res.34 = (Asn, Asp, Ala o Thr); Xaa en res.35 = (Ser, Asp, Glu, Leu o Ala); Xaa en res.36 = (Tyr, Cys, His, Ser o lIe); Xaa en res.37 = (Mel, Phe, Gly o Leu); Xaa en res.38 = (Asn o Ser); Xaa en res.39 = (Ala, Ser o Gly); Xaa en res.40 = (Thr, Leu o Ser); Xaa en res.44 = (lIe o Val); Xaa en res.45 = (Val o Leu); Xaa en res.46 = (Gln o Arg); Xaa en res.47 = (Thr, Ala o Ser); Xaa en res.49 = (Val o Met); Xaa en res.50 = (His o Asn); Xaa en res.51 = (Phe, Leu, Asn, Ser, Ala o Val); Xaa en res.52 = (lIe, Mel, Asn, Ala o Val); Xaa en res.53 = (Asn, Lys, Ala o Glu); Xaa en res.54 = (Pro o Ser); Xaa en res.55 = (Glu, Asp, Asn o Gly); Xaa en res.56 = (Thr, Ala, Val, Lys, Asp, Tyr, Ser o Ala); Xaa en res.57 = (Val, Ala o lIe); Xaa en res.58 = (Pro o Asp); Xaa en res.59 = (Lys o Leu); Xaa en res.60 = (Pro o Ala); Xaa en res.63 = (Ala o Val); Xaa en res.65 = (Thr o Ala); Xaa en res.66 = (Gln, Lys, Arg o Glu); Xaa en res.67 = (Leu, Mel o Val); Xaa en res.68 = (Asn, Ser o Asp); Xaa en res.69 = (Ala, Pro o Ser); Xaa en res.70 = (lIe, Thr o Val); Xaa en res.71 = (Ser o Ala); Xaa en res.72 = (Val o Met); Xaa en res.74 = (Tyr o Phe); Xaa en res.75 = (Phe, Tyr o Leu); Xaa en res.76 = (Asp o Asn); Xaa en res.77 = (Asp, Glu, Asn o Ser); Xaa en res.78 = (Ser, Gln, Asn o Tyr); Xaa en res.79 = (Ser, Asn, Asp o Glu); Xaa en res.80 = (Asn, Thr o Lys); Xaa en res.82 = (lIe o Val); Xaa en res.84 = (Lys o Arg); Xaa en res.85 = (Lys, Asn, Gln o His); Xaa en res.86 = (Tyr o His); Xaa en res.87 = (Arg, Gln o Glu); Xaa en res.88 = (Asn, Glu o Asp); Xaa en res.90 = (Val, Thr o Ala); Xaa en res.92 = (Arg, Lys, Val, Asp o Glu); Xaa a1 res.93 = (Ala, Gly o Glu); y Xaa en res.97 = (His o Arg);

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en donde cada Xaa se selecciona independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos especificados definidos como sigue: "Res". significa "resto" y Xaa en res.2 = (Lys o Arg); Xaa en res.3 = (Lys o Arg); Xaa en res4 = (His o Arg); Xaa en res.5 = (Glu, Ser, His, Gly, Arg o Pro); Xaa en res.9 = (Ser, Asp o Glu); Xaa en res.11 = (Arg, Gln, Ser o Lys); Xaa en res.12 = (Asp o Glu); Xaa en res.13 = (Leu o Val); Xaa en res.16 = (Gln, Leu, Asp, His o Asn); Xaa en res.17 = (Asp, Arg o Asn); Xaa en res.19 = (lIe o Val); Xaa en res.20 = (lIe o Val); Xaa en res.23 = (Glu, Gln, Leu, Lys, Pro o Arg); Xaa en res.25 = (Tyr o Phe); Xaa en res.26 = (Ala, Ser, Asp, Met, His, Leu o Gln); Xaa en res.28 = (Tyr, Asn o Phe); Xaa en res.31 = (Glu, His, Tyr, Asp o Gln); Xaa en res.33 = Glu, Lys, Asp o Gln); Xaa en res.35 = (Ala, Ser o Pro); Xaa en res.36 = (Phe, Leu o Tyr); Xaa en res.38 = (Leu o Val); Xaa en res.39 = (Asn, Asp, Ala o Thr); Xaa en res.40 = (Ser, Asp, Glu, Leu o Ala); Xaa en res.41 = (Tyr, Cys, His, Ser o Ile); Xaa en res.42 = (Met, Phe, Gly o Leu); Xaa en res.44 = (Ala, Ser o Gly); Xaa en res.45 = (Thr, Leu o Ser); Xaa en res.49 = (Ile o Val); Xaa en res. 50 = (Val o Leu); Xaa en res.51 = (Gln o Arg); Xaa en res.52 = (Thr, Ala o Ser); Xaa en res.54 = (Val o Met); Xaa en res.55 = (His o Asn); Xaa en res.56 = (Phe, Leu, Asn, Ser, Ala o Val); Xaa en res.57 = (Ile, Met, Asn, Ala o Val); Xaa en res.58 = (Asn, Lys, Ala o Glu); Xaa en res.59 = (Pro o Ser); Xaa en res.60 = (Glu, Asp, o Gly); Xaa en res.61 = (Thr, Ala, Val, Lys, Asp, Tyr, Ser o Ala); Xaa en res.62 = (Val, Ala o lIe); Xaa en res.63 = (Pro o Asp); Xaa en res.64 = (Lys o Leu); Xaa en res.65 = (Pro o Ala); Xaa en res.68 = (Ala o Val); Xaa en res.70 = (Thr o Ala); Xaa en res.71 = (Gln, Lys, Arg o Glu); Xaa en res.72 = (Leu, Met o Val); Xaa en res. 73 = (Asn, Ser o Asp); Xaa en res.74 = (Ala, Pro o Ser); Xaa en res.75 = (tle, Thr o Val); Xaa en res.76 = (Ser o Ala); Xaa en res.77 = (Val o Met); Xaa en res.79 = (Tyr o Phe); Xaa en res.80 = (Phe, Tyr o Leu); Xaa en res.81 = (Asp o Asn); Xaa en res.82 = (Asp, Glu, Asn o Ser); Xaa en res.83 = (Ser, Gln, Asn o Tyr); Xaa en res.84 = (Ser, Asn, Asp o Glu); Xaa en res.85 = (Asn, Thr o Lys); Xaa en res.87 = (Ile o Val); Xaa en res.89 = (Lys o Arg); Xaa en res.90 = (Lys, Asn, Gln o His); Xaa en res.91 = (Tyr o His); Xaa en res. 92 = (Arg, Gln o Glu); Xaa en res.93 = (Asn, Glu o Asp); Xaa en res.95 = (Val, Thr o Ala); Xaa en res.97 = (Arg, Lys, Val, Asp o Glu); Xaa en res.98 = (Ala, Gly o Glu); y Xaa en res.102 = (His o Arg).

De manera similar, la Secuencia genérica 5 (Seq. ID No. 30) y la Secuencia genérica 6 (Seq. ID No. 31) acomodan las homologías compartidas entre todos los miembros de la familia de proteína morfógenas identificados en la Tabla II. Concretamente, las Secuencias genéricas 5 y 6 son secuencias de aminoácidos compuestas de OP-1 humana (hOP-1, Seq. ID Nos. 5 y 16-17), OP-1 de ratón (mOP-1, Seq. ID Nos. 6 y 18-19), OP-2 humana y de ratón (Seq. ID Nos. 7, 8 y 20-22), CBMP2A (Seq. ID No. 9), CBMP2B (Seq. ID No. 10), DPP (de Drosophila, Seq. ID No. 11), Vgl (de Xenopus, Seq. ID No. 12), Vgr-1 (de ratón, Seq ID No. 13) y GDF-1 (de ratón, Seq. ID No. 14), BMP3 humano (Seq. ID No. 26), BMP5 humano (Seq. ID No. 27), BMP6 humano (Seq. ID No. 28) y 60A (de Drosophila, Seq. ID Nos. 24-25). Las secuencias genéricas incluyen tanto la identidad de aminoácidos compartida por estas secuencias en el dominio terminal, definido por los esqueletos de seis y siete cisteínas (Secuencias genéricas 5 y 6, respectivamente), así como restos alternativos para las posiciones variables dentro de la secuencia. Como para las Secuencias genéricas 3 y 4, las Secuencias genéricas 5 y 6 permiten una cisteína adicional en la posición 41 (Secuencia genérica 5) o en la posición 46 (Secuencia genérica 6), lo que proporciona un esqueleto de cisteínas apropiado en el que se pueden formar enlaces disulfuro inter- o intra-moleculares, y contienen ciertos aminoácidos críticos que influyen en la estructura terciaria de las proteínas.

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(Secuencia pasa a página siguiente)

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en donde cada Xaa se selecciona independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos especificados definidos como sigue: "Res". significa "resto" y Xaa en res.2 = (Tyr o Lys); Xaa en res.3 = Val o lIe); Xaa en res.4 = (Ser, Asp o Glu); Xaa en res.6 = (Arg, Gln, Ser, Lys o Ala); Xaa en res.7 = (Asp, Glu o Lys); Xaa en res.8 = (Leu, Val o lIe); Xaa en res.11 = (Gln, Leu, Asp, His, Asn o Ser); Xaa en res.12 = (Asp, Arg, Asn o Glu); Xaa en res.14 = (lIe o Val); Xaa en res.15 = (lIe o Val); Xaa en res.16 (Ala o Ser); Xaa en res.18 = (Glu, Gln, Leu, Lys, Pro o Arg); Xaa en res.19 = (Gly o Ser); Xaa en res.20 = (Tyr o Phe); Xaa en res.21 = (Ala, Ser, Asp, Met, His, Gln, Leu o Gly); Xaa en res.23 = (Tyr, Asn o Phe); Xaa en res.26 = (Glu, His, Tyr, Asp, Gln o Ser); Xaa en res.28 = (Glu, Lys, Asp, Gln o Ala); Xaa en res.30 = (Ala, Ser, Pro, Gln o Asn); Xaa en res.31 = (Phe, Leu o Tyr); Xaa en res.33 = (Leu, Valor Met); Xaa en res.34 = (Asn, Asp, Ala, Thr o Pro); Xaa en res.35 = (Ser, Asp, Glu, Leu, Ala o Lys); Xaa en res.36 = (Tyr, Cys, His, Ser o lIe); Xaa en res.37 = (Met, Phe, Gly o Leu); Xaa en res.38 = (Asn, Ser o Lys); Xaa en res.39 = (Ala, Ser, Gly o Pro); Xaa en res.40 = (Thr, Leu o Ser); Xaa en res.44 = (lIe, Val o Thr); Xaa en res.45 = (Val, Leu o lIe); Xaa en res.46 = (Gln o Arg); Xaa en res.47 = (Thr, Ala o Ser); Xaa en res.48 = (Leu o lIe); Xaa en res.49 = (Val o Met); Xaa en res.50 = (His, Asn o Arg); Xaa en res.51 = (Phe, Leu, Asn, Ser, Ala o Val); Xaa en res.52 = (lIe, Met, Asn, Ala, Val o Leu); Xaa en res.53 = (Asn, Lys, Ala, Glu, Gly o Phe); Xaa en res.54 = (Pro, Ser o Val); Xaa en res.55 = (Glu, Asp, Asn, Gly, Val o Lys); Xaa en res.56 = (Thr, Ala, Val, Lys, Asp, Tyr, Ser, Ala, Pro o His); Xaa en res.57 = (Val, Ala o lIe); Xaa en res.58 = (Pro o Asp); Xaa en res.59 = (Lys, Leu o Glu); Xaa en res.60 = (Pro o Ala); Xaa en res.63 = (Ala o Val); Xaa en res.65 = (Thr, Ala o Glu); Xaa en res.66 = (Gln, Lys, Arg o Glu); Xaa en res.67 = (Leu, Met o Val); Xaa en res.68 = (Asn, Ser, Asp o Gly); Xaa en res.69 = (Ala, Pro o Ser); Xaa en res.70 = (lIe, Thr, Val o Leu); Xaa en res.71 = (Ser, Ala o Pro); Xaa en res.72 = (Val, Met o lIe); Xaa en res.74 = (Tyr o Phe); Xaa en res.75 = (Phe, Tyr, Leu o His); Xaa en res.76 = (Asp, Asn o Leu); Xaa en res.77 = (Asp, Glu, Asn o Ser); Xaa en res.78 = (Ser, Gln, Asn, Tyr o Asp); Xaa en res.79 = (Ser, Asn, Asp, Glu o Lys); Xaa en res.80 = (Asn, Thr o Lys); Xaa en res.82 = (lIe, Val o Asn); Xaa en res.84 = (Lys o Arg); Xaa en res.85 = (Lys, Asn, Gln, His o Val); Xaa en res.86 = (Tyr o His); Xaa en res.87 = (Arg, Gln, Glu o Pro);.Xaa en res.88 = (Asn, Glu o Asp); Xaa en res.90 = (Val, Thr, Ala o lIe); Xaa en res.92 = (Arg, Lys, Val, Asp o Glu);
Xaa en res. 93 = (Ala, Gly, Glu o Ser); Xaa en res.95 = (Gly o Ala) y Xaa en res.97 = (His o Arg).

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en donde cada Xaa se selecciona independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos especificados definidos como sigue: "Res". significa "resto" y Xaa en res.2 = (Lys, Arg, Ala o Gln); Xaa en res.3 = (Lys, Arg o Met); Xaa en res.4 = (His, Arg o Gln); Xaa en res.5 = (Glu, Ser, His, Gly, Arg, Pro, Thr o Tyr); Xaa en res.7 = (Tyr o Lys); Xaa en res.8 = (Val o lIe); Xaa en res.9 = (Ser, Asp o Glu); Xaa en res.11 = (Arg, Gln, Ser, Lys o Ala); Xaa en res.12 = (Asp, Glu o Lys); Xaa en res.13 = (Leu, Val o lIe); Xaa en res.16 = (Gln, Leu, Asp, His, Asn o Ser); Xaa en res.17 = (Asp, Arg, Asn o Glu); Xaa en res.19 = (He o Val); Xaa en res.20 = (Ile o Val); Xaa en res.21 = (Ala o Ser); Xaa en res.23 = (Glu, Gln, Leu, Lys, Pro o Arg); Xaa en res.24 = (Gly o Ser); Xaa en res.25 = (Tyr o Phe); Xaa en res.26 = (Ala, Ser, Asp, Met, His, Gln, Leu o Gly); Xaa en res.28 = (Tyr, Asn o Phe); Xaa en res.31 = (Glu, His, Tyr, Asp, Gln o Ser); Xaa en res.33 = (Glu, Lys, Asp, Gln o Ala); Xaa en res.35 = (Ala, Ser, Pro, Gln o Asn); Xaa en res.36 = (Phe, Leu o Tyr); Xaa en res.38 = (Leu, Val o Met); Xaa en res.39 = (Asn, Asp, Ala, Thr o Pro); Xaa en res.40 = (Ser, Asp, Glu, Leu, Ala o Lys); Xaa en res.41 = (Tyr, Cys, His, Ser o lIe); Xaa en res.42 = (Met, Phe, Gly o Leu); Xaa en res.43 = (Asn, Ser o Lys); Xaa en res.44 = (Ala, Ser, Gly o Pro); Xaa en res.45 = (Thr, Leu o Ser); Xaa en res.49 = (lIe, Val o Thr); Xaa en res.50 = (Val, Leu o lIe); Xaa en res.51 = (Gln o Arg); Xaa en res.52 = (Thr, Ala o Ser); Xaa en res.53 = (Leu o lIe); Xaa en res.54 = (Val o Met); Xaa en res.55 = (His, Asn o Arg); Xaa en res.56 = (Phe, Leu, Asn, Ser, Ala o Val); Xaa en res.57 == (lIe, Met, Asn, Ala, Val o Leu); Xaa en res.58 = (Asn, Lys, Ala, Glu, Gly o Phe); Xaa en res.59 = (Pro, Ser o Val); Xaa en res.60 = (Glu, Asp, Gly, Val o Lys); Xaa en res.61 = (Thr, Ala, Val, Lys, Asp, Tyr, Ser, Ala, Pro o His); Xaa en res.62 = (Val, Ala o lIe); Xaa en res.63 = (Pro o Asp); Xaa en res.64 = (Lys, Leu o Glu); Xaa en res.65 = (Pro o Ala); Xaa en res.68 = (Ala o Val); Xaa en res.70 = (Thr, Ala o Glu); Xaa en res.71 = (Gln, Lys, Arg o Glu); Xaa en res.72 = (Leu, Met o Val); Xaa en res.73 = (Asn, Ser, Asp o Gly); Xaa en res.74 = (Ala, Pro o Ser); Xaa en res.75 = (lIe, Thr, Val o Leu); Xaa en res.76 = (Ser, Ala o Pro); Xaa en res.77 = (Val, Met o lIe); Xaa en res.79 = (Tyr o Phe); Xaa en res.80 = (Phe, Tyr, Leu o His); Xaa en res.81 = (Asp, Asn o Leu); Xaa en res.82 = (Asp, Glu, Asn o Ser); Xaa en res.83 = (Ser, Gln, Asn, Tyr o Asp); Xaa en res.84 = (Ser, Asn, Asp, Glu o Lys); Xaa en res.85 = (Asn, Thr o Lys); Xaa en res.87 = (lIe, Val o Asn); Xaa en res.89 = (Lys o Arg); Xaa en res.90 = (Lys, Asn, Gln, His o Val); Xaa en res.91 = (Tyr o His); Xaa en res.92 = (Arg, Gln, Glu o Pro); Xaa en res.93 = (Asn, Glu o Asp); Xaa en res.95 = (Val, Thr, Ala o lIe); Xaa en res.97 = (Arg, Lys, Val, Asp o Glu); Xaa en res.98 = (Ala, Gly, Glu o Ser); Xaa en res.100 = (Gly o Ala); and Xaa en res.102 = (His o Arg).

Las secuencias particularmente útiles para uso como morfógenos en esta invención incluyen los dominios C-terminales, por ejemplo los restos de aminoácidos 96-102 C-terminales de VgI, Vgr-1, DPP, OP-1, OP-2, CBMP-2A, CBMP-2B, GDF-1 (véase la Tabla II siguiente y Seq. ID Nos. 5-14), así como las proteínas que comprenden los dominios C-terminales de 60A, BMP3, BMP5 y BMP6 (véase Seq. ID Nos. 24-28), todos los cuales incluyen al menos el esqueleto conservado de seis o siete cisteínas. Además, las construcciones biosintéticas diseñadas a partir de las secuencias genéricas, tales como COP-1, 3-5, 7, 16, descritas en el documento de Patente de EE.UU. Nº 5.011.691, también son útiles. Se anticipa que éstas incluyen variantes alélicas, variantes de especie y otras variantes de secuencia (por ejemplo, "muteínas" o "proteínas mutantes"), ya sea de origen natural o producidas por biosíntesis, así como miembros nuevos de esta familia morfogénica de proteínas.

Tal como se utiliza aquí, se entiende que la terminología "homología de secuencia de aminoácidos" significa similitud entre secuencias de aminoácidos, y las secuencias homólogas comparten aminoácidos idénticos o similares, en donde los aminoácidos similares son aminoácidos conservados según ha definido Dayoff et al. Atlas of Protein Sequence and Structure, volumen 5, suplemento 3, páginas 345-362 (M.O. Dayoff, ed., Nat'1 BioMed Research Fdn., Washington D.C 1978). Así, una secuencia candidata que comparte el 70% de homología de aminoácidos con una secuencia de referencia requiere que, después de la alineación de la secuencia candidata con la secuencia de referencia, el 70% de los aminoácidos de la secuencia candidata son idénticos a los aminoácidos correspondientes en la secuencia de referencia, o constituyen un cambio conservado de aminoácido para la misma. "Identidad de secuencias de aminoácidos" se entiende que requiere aminoácidos idénticos entre dos secuencias alineadas. Así, una secuencia candidata que comparte 60% de identidad de aminoácidos con una secuencia de referencia requiere que, tras la alineación de la secuencia candidata con la secuencia de referencia, el 60% de los aminoácidos de la secuencia candidata son idénticos a los correspondientes aminoácidos en la secuencia de referencia.

Como se utiliza aquí, todas las homologías e identidades calculadas utilizan OP-1 como secuencia de referencia. También como se utiliza aquí, las secuencias se alinean para los cálculos de homología e identidad utilizando el método de Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453 y las identidades se calculan por el programa Align (DNAstar, Inc.). En todos los casos, las grietas internas y las inserciones de aminoácidos en la secuencia candidata alineadas se ignoran cuando se hacen los cálculos de homología/identidad.

Las secuencias de proteína útiles como morfógenos en esta invención incluyen aquellas que tienen más de 60% de identidad, preferiblemente más de 65% de identidad, con la secuencia de aminoácidos que define el esqueleto con seis cisteínas conservadas de hOP-1 (por ejemplo, restos 43-139 de Seq. ID No. 5). Estas secuencias más preferidas incluyen tanto variantes alélicas como de especie de las proteínas OP-1 y OP-2, incluida la proteína de Drosophila 60A. Por consiguiente, en otro aspecto preferido de la invención, los morfógenos útiles incluyen proteínas activas que comprenden especies de cadenas polipeptídicas que tienen la secuencia de aminoácidos genérica referida aquí como "OPX", que acomoda las homologías entre las diversas especies identificadas de OP-1 y OP-2 (Seq. ID No. 29).

Con fines ilustrativos, los morfógenos útiles incluyen proteínas activas que comprenden cadenas polipeptídicas codificadas por ácidos nucleicos que se hibridan a secuencia de ADN o ARN que codifican la secuencia C-terminal que define el dominio de cisteínas conservadas, por ejemplo, nucleótidos 1036-1341 y nucleótidos 1390-1695 de Seq ID Nos. 16 y 20, respectivamente, de OP1 u OP2 en condiciones estrictas de hibridación. Como se utiliza aquí, condiciones estrictas de hibridación se definen como hibridación en 40% de formamida, 5 X SSPE, 5 X solución de Denhardt y 0,1% de SDS al 37ºC durante una noche, y lavado en 0,1 X SSPE, 0,1% de SDS a 50ºC.

Los morfógenos útiles en los usos y dispositivos de esta invención incluyen proteínas definidas en las reivindicaciones, ya sea aisladas a partir de fuentes naturales, o producidas por ADN recombinante u otras técnicas de síntesis, e incluye variantes alélicas y de especie de estas proteínas, mutantes naturales o biosintéticos de las mismas, así como construcciones truncadas y de fusión diversas. También se considera que los mutantes por deleción o adición son activos, incluyéndose aquellos que pueden alterar el esqueleto conservado de cisteínas C-terminal, siempre que la alteración no altere funcionalmente la relación de estas cisteínas en la estructura plegada. Por consiguiente, tales formas activas se consideran el equivalente de las construcciones descritas específicamente divulgadas aquí. Las proteínas pueden incluir formas con patrones de glicosilación variables, extremos N-terminales variables, una famila de proteínas relacionadas que tiene regiones de homología de secuencia de aminoácidos, y formas truncadas o mutadas activas de proteínas nativas o biosintéticas, producidas por expresión de ADN recombinante en células hospedantes.

Las proteínas morfogénicas se pueden expresar a partir de ANDc intacto o truncado o a partir de ADN sintético en células hospedantes procarióticas o eucarióticas, y se puede purificar, escindir, replegar y dimerizar para formar composiciones morfogénicamente activas. Las células hospedantes actualmente preferidas incluyen las células de E. coli o mamíferos, tales como células CHO, COS o BSC. Una descripción detallada de los morfógenos útiles en los métodos, composiciones y dispositivos de esta invención se describe en las Solicitudes de Patente de EE.UU. co-pendientes N^{os} de Serie 752.774, presentada el 30 de Agosto de 1991 y 667.274, presentada el 11 de Marzo de 1991.

Así, en vista de esta descripción, los expertos en ingeniería genética pueden aislar genes a partir de bancos de ADNc o genómicos de diversas especies diferentes que codifican secuencias de aminoácidos apropiados, o construir ADNs a partir de oligonucleótidos, y después pueden expresarlos en diversos tipos de células hospedantes, ya sea de procariotas como de eucariotas, para producir grandes cantidades de proteínas activas capaces de mantener las vías neurales en un mamífero, incluida la mejora de la supervivencia de las neuronas en riesgo de morir y la estimulación de la regeneración nerviosa y de la reparación de los nervios en diversos mamíferos, incluidos los seres humanos.

Los objetos, características y ventajas anteriores así como otros, de la presente invención, serán más claros a partir de la siguiente descripción detallada de la invención.

Breve descripción de los dibujos

Los anteriores objetos y características así como otros de esta invención, lo mismo que la propia invención, pueden entenderse mejor a partir de la siguiente descripción, cuando se lea junto con los dibujos anexos, en los que:

La Fig. 1(A y B) son fotomicrografías que ilustran la capacidad del morfógeno (OP-1) para inducir a las células de glioma x neuroblastoma (1A) a rediferenciarse dando una morfología característica de neuronas no transformadas (1B);

La Fig. 2A es una cruva dosis-respuesta para la inducción de las isoformas de N-CAM de 180 kDa y 140 kDa en células NG108-15 tratadas con morfógeno;

La Fig. 2B es una fotomicrografía de una transferencia Western de extractos de células completas procedentes de células NG109-15 tratadas con morfógeno con un anticuerpo específico para N-CAM; y

La Fig. 3 es una representación gráfica del número medio de agregados celulares contados en 20 campos seleccionados al azar en función de la concentración de morfógeno;

La Fig. 4 es una fotomicrografía de una inmunotransferencia que demuestra la presencia de OP-1 en suero humano.

Descripción detallada de la invención

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

A continuación se proporcionan descripciones detalladas de morfógenos adecuados y útiles en los usos y dispositivos de esta invención, así como métodos de ejemplo gpara su administración y aplicación, y numerosos ejemplos no limitantes que 1) ilustran la adecuabilidad de los morfógenos y de los agentes estimuladores de morfógenos que se describen aquí como agentes terapéuticos para mantener vías neurales en un mamífero y mejorar la supervivencia de células neuronales en riesgo de morir; y 2) proporcionan ensayos con los que someter a prueba morfógenos candidatos y agentes estimuladores de morfógenos en busca de su eficacia.

I. Morfógenos útiles

En las reivindicaciones adjuntas se definen morfógenos útiles. Tal como se define aquí, una proteína es morfogénica si es capaz de inducir la cascada congénita de episodios celulares y moleculares que culminan en la formación de un nuevo tejido específico de un órgano y comprende al menos el esqueleto conservado con seis cisteínas C-terminal o su equivalente funcional (véase supra). Concretamente, los morfógenos generalmente son capaces de desarrollar todas las funciones biológicas siguientes en un medio morfogénicamente permisivo: estimular la proliferación de células progenitoras; estimula la diferenciación de células progenitoras; estimular la proliferación de células diferenciadas; y sustentar el desarrollo y mantenimiento de células diferenciadas. Los detalles de cómo los morfógenos útiles en la invención fueron identificados por primera vez, así como una descripción sobre cómo hacer, usar y ensayar dichos morfógenos en busca de su actividad morfogénica, se describen en la Solicitud Internacional US92/01968 (documento WO 92/15323). Como se describe aquí, los morfógenos se pueden purificar a partir de material natural o producido recombinantemente a partir de células hospedantes procarióticas o eucarióticas, utilizando las secuencias genéticas descritas allí. Alternativamente, se pueden identificar nuevas secuencias morfogénicas siguiendo los procedimientos allí descritos.

Las proteínas particularmente útiles incluyen aquellas que comprenden las secuencias de origen natural descritas en la Tabla II. Otras secuencias útiles incluyen construcciones biosintéticas tales como las descritas en el documento de Patente de EE.UU. 5.011.691, cuya descripción se incorpora aquí como referencia (p. ej., COP-1, COP-3, COP-4, COP-5, COP-7 y COP-16).

Los morfógenos útiles en la invención también se pueden describir por 6 secuencias (las Secuencias genéricas 1, 2, 3, 4 y 5 se describen con fines ilustrativos solamente y caen fuera del alcance de la presente invención). Las Secuencias genéricas 1 y 2 también incluir al menos en su extremo N, la secuencia

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La Tabla II, expuesta más adelante, compara las secuencias de aminoácidos de las regiones activas de proteínas nativas que han sido identificadas como morfógenos, incluyendo OP-1 humana (hOP-1, Seq. ID Nos. 5 y 16-17), OP-1 de ratón (mOP-1, Seq. ID Nos. 6 y 18-19), OP-2 humana y de ratón (Seq. ID Nos. 7, 8 y 20-23), CBMP2A (Seq. ID No. 9), CBMP2B (Seq. ID No. 10), BMP3 (Seq. ID No. 26), DPP (de Drosophila, Seq. ID No. 11), Vgl (de Xenopus, Seq. ID No. 12), Vgr-1 (de ratón, Seq ID No. 13), GDF-1 (de ratón, Seq. ID Nos. 14, 32 y 33), proteína 60A (de Drosophila, Seq. ID Nos. 24 y 25), BMP5 (Seq. ID No. 27) y BMP6 (Seq. ID No. 28). Las secuencias se alinean esencialmente siguiendo el método de Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453, calculado usando el programa Align (DNAstar, Inc.). En la Tabla, tres puntos seguidos indican que el aminoácido en esa posición es el mismo que el aminoácido en hOP-1. Tres guiones seguidos indican que no hay presente ningún aminoácido en esa posición, y se incluyen con el fin de ilustrar las homologías. Por ejemplo, el resto de aminoácido 60 de CBMP-2A y CBMP-2B es "inexistente". Por supuesto, estas dos secuencias de aminoácidos en esta región comprenden Asn-Ser (restos 58, 59), comprendiendo seguidamente la CBMP-2A Lys e Ile, mientras que la CBMP-2B comprende Ser e Ile.

TABLA II

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Como es evidente a partir de las comparaciones de las anteriores secuencias de aminoácidos, se pueden hacer cambios significativos de aminoácidos dentro de las secuencias genéricas si bien siguen reteniendo la actividad morfogénica. Por ejemplo, mientras que la secuencia proteica de GDF-1 representada en la Tabla II comparte sólo alrededor del 50% de la identidad de aminoácidos con la secuencia hOP-1 descrita allí, la secuencia GDF-1 comparte más del 70% de homología (o "similitud") en la secuencia de aminoácidos con la secuencia hOP-1, en donde "homología" o "similitud" incluye cambios de aminoácidos conservativos dentro de la secuencia, según define Dayoff et al. Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, suplemento 3, páginas 345-362 (M.O. Dayoff, ed., Nat'1 BioMed. Res. Fd'n, Washington, D.C. 1978).

La secuencias proteicas útiles como morfógenos en esta invención incluyen las que tienen más de 60% de identidad, preferiblemente más de 65% de identidad, definiendo la secuencia de aminoácidos el esqueleto conservado con seis cisteínas de hOP-1 (p. ej., restos 43-139 de Seq. ID No. 5). Estas secuencias incluyen variantes tanto alélicas como de especie de las proteínas OP-1 y OP-2, incluida la proteína 60A de Drosophila. La invención incluye morfógenos que comprenden especies de cadenas polipeptídicas que tienen la secuencia de aminoácidos genérica referida aquí como "OPX", que define el esqueleto con siete cisteínas y acomoda las identidades entre las diversas proteínas OP-1 y OP-2 de ratón y humanas identificadas. OPX se presenta en Seq. ID No. 29. Como se describe allí, cada Xaa en una posición dada se selecciona independiente de los restos que ocurren en la posición correspondiente en la secuencia C-terminal de OP-1 u OP-2 de ratón o humana (véanse Seq. ID Nos. 5-8 y/o Seq. ID Nos. 16-23).

II. Formulaciones y métodos para administrar agentes terapéuticos

Con fines ilustrativos, los morfógenos pueden ser proporcionados a un individuo por cualquier medio adecuado, preferiblemente de forma directa (p. ej., localmente, por ejemplo por inyección a un locus del tejido nervioso) o sistémicamente (p. ej., por vía parenteral u oral). Cuando el morfógeno se va a proporcionar parenteralmente, por ejemplo por vía intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraorbital, oftálmica, intraventricular, intracraneal, intracapsular, intraespinal, intracisternal, intraperitoneal, bucal, rectal, vaginal, intranasal o por administración por aerosol, el morfógeno preferiblemente comprende parte de una solución acuosa. La solución es fisiológicamente aceptable de modo que además de administrar el morfógeno deseado al paciente, la solución no afecta de modo adverso al balance electrolítico y volumínico del paciente. El medio acuoso para el morfógeno puede comprender pues solución salina fisiológica normal (NaCl al 9,85%, 0,15 M), pH 7-7,4. La solución acuosa que contiene el morfógeno se puede hacer, disolviendo la proteína en etanol al 50% que contiene acetonitrilo en ácido trifluoroacético al 0,1% (TFA) o HCl al 0,1%, o disolventes equivalentes. Un volumen de la solución resultante se añade luego, por ejemplo, a 10 volúmenes de solución salina tamponada con fosfato (PBS), que puede incluir además seroalbúmina humana al 0,1-0,2% (HSA). La solución resultante preferiblemente se somete a vórtice extensamente. Si se desea, un morfógeno dado se puede hacer más soluble asociándolo con una molécula adecuada. Por ejemplo, la asociación del dímero maduro con el dominio pro del morfógeno incrementa la solubilidad de la proteína significativamente (véase la sección 11.1, más adelante). En efecto, se piensa que la proteína endógena es transportada en esta forma. Otra molécula capaz de intensificar la solubilidad y particularmente útil para administraciones orales es la caseína. Por ejemplo, la adición de caseína al 0,2% eleva la solubilidad de la forma activa madura de OP-1 en un 80%. Otros componentes que se encuentran en la leche y/o diversas proteínas de suero también pueden ser útiles.

Las soluciones útiles para administración parenteral se pueden preparar por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica, descritos, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences (Gennaro, A., ed.), Mack Pub., 1980. Las formulaciones pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, naftalenos hidrogenados, y similares. Las formulaciones para administración directa, en particular, pueden incluir glicerol y otras composiciones de alta viscosidad. Polímeros biocompatibles, preferiblemente biorresorbibles, que incluyen, por ejemplo, ácido hialurónico, colágeno, polibutirato, fosfato tricálcico, láctido y copolímeros de láctido/glicólido, pueden ser excipientes útiles para controlar la liberación del morfógeno in vivo. Otros sistemas de administración parenterales potencialmente útiles para estos morfógenos incluyen partículas de copolímero de etileno-acetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables y liposomas. Las formulaciones para administración por inhalación contienen como excipientes, por ejemplo, lactosa, o pueden ser soluciones acuosas que contienen, por ejemplo, polioxietilen-9-lauril-éter, glicocolato y desoxicolato, o soluciones oleosas para administración en forma de gotas nasales, o como gel para aplicar intranasalmente. Las formulaciones para administración parenteral también incluyen glicocolato para administración bucal, metoxisalicilato para administración rectal o ácido cútrico para administración vaginal.

Alternativamente, los morfógenos descritos aquí se pueden administrar por vía oral. La administración oral de proteínas como agentes terapéuticos generalmente no se pone en práctica ya que la mayoría de las proteínas se degradan fácilmente por las enzimas y los ácidos digestivos en el tracto digestivo de los mamíferos antes de poder ser adsorbidas en la circulación sanguínea. Sin embargo, los morfógenos aquí descritos típicamente son estables en medio ácido y resistentes a las proteasas (véase, p. ej., Patente de EE.UU. Nº 4.968.590). Además, se ha identificado al menos un morfógeno OP-1 en extracto de glándula mamaria, calostro y leche de 57 días. Además, la OP-1 purificada de extracto glandular mamario es morfogénicamente activa. Específicamente, esta proteína induce la formación de hueso endocondrial en mamíferos cuando se implanta subcutáneamente en combinación con un material adecuado como matriz, utilizando un ensayo de hueso in vivo clásico, tal como se describe en el documento de Patente de EE.UU. Nº 4.968.590. Además, también se detecta el morfógeno en la circulación sanguínea (véase el Ejemplo 9 siguiente). Finalmente, el morfógeno en forma soluble, por ejemplo morfógeno maduro asociado con el dominio pro, es capaz de mantener las vías neurales en un mamífero (véanse los Ejemplos 4 y 6 siguientes). Estos hallazgos indican que la administración oral y parenteral son medios viables para administrar morfógenos a un individuo. Además, aunque las formas maduras de ciertos morfógenos descritos aquí típicamente son poco solubles, la forma de morfógeno encontrada en la leche (y en el extracto glandular mamario y el calostro) es fácilmente soluble, probablemente por asociación de la forma morfogénicamente activa, madura, con parte o todo el dominio pro de la secuencia intacta y/o por asociación con uno o más componentes de la leche. Por consiguiente, los compuestos proporcionados aquí también se puede asociar con moléculas capaces de intensificar su solubilidad in vitro o in vivo.

Los compuestos proporcionados aquí también se pueden asociar con moléculas capaces de dirigir específicamente el morfógeno o el agente estimulador del morfógeno al tejido nervioso. Por ejemplo, se puede utilizar un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, u otra proteína de unión que interaccione específicamente con una molécula de superficie sobre las células de tejido nervioso, incluidas las células neuronales o neuroneurogliales. Se pueden utilizar moléculas guiadoras útiles, por ejemplo, utilizando la tecnología del sitio de unión a una cadena individual, descrito, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. Nº 5.091.513.

Como se ha descrito anteriormente, los morfógenos proporcionados aquí comparten una homología de secuencias significativa en los dominios activos del extremo C-terminal. Por el contrario, las secuencias típicamente divergen significativamente en las secuencias que definen el dominio pro. En consecuencia, se cree que el dominio pro es específico del morfógeno. Como se ha descrito anteriormente, se sabe también que los diversos morfógenos identificados hasta la fecha se expresan de forma diferenciada en los diferentes tejidos. Por consiguiente, sin limitarse a ninguna teoría en particular, es probable que, en las condiciones naturales del cuerpo, morfógenos seleccionados actúen típicamente sobre un tejido dado. En consecuencia, parte o la totalidad de los dominios pro que han sido identificados en asociación con la forma activa del morfógeno en solución, pueden servir como moléculas guiadoras para los morfógenos descritos aquí. Por ejemplo, los dominios pro pueden interaccionar específicamente con una o más moléculas en el tejido diana para dirigir el morfógeno asociado con el dominio pro a ese tejido. En consecuencia, otra molécula guiadora útil para dirigir el morfógeno al tejido nervioso es parte o la totalidad de un dominio pro de morfógeno, particularmente parte o la totalidad de los dominios pro de OP-1 o GDF-1, proteínas ambas que se encuentran asociadas de forma natural con el tejido nervioso.

Finalmente, los morfógenos descritos aquí se pueden administrar a solas o en combinación con otras moléculas que se sabe que son beneficiosas para mantener las rutas neurales, incluidos los factores de crecimiento nervioso y los agentes anti-inflamatorios.

Con fines ilustrativos, los compuestos proporcionados aquí se pueden formular en composiciones farmacéuticas por mezcla con excipientes y vehículos no tóxicos y farmacéuticamente aceptables. Como se ha indicado anteriormente, tales composiciones se pueden preparar para administración parenteral, particularmente en forma de soluciones o suspensiones líquidas; para administración oral, particularmente en forma de comprimidos o cápsulas; o intranasalmente, en particular en forma de polvos, gotas nasales o aerosoles.

Las composiciones se pueden formular para administración parenteral u oral a seres humanos u otros mamíferos en cantidades terapéuticamente eficaces, por ejemplo, cantidades que proporcionan concentraciones apropiadas durante un tiempo suficiente para eliminar o reducir la condición patológica del paciente, para proporcionar terapia para las enfermedades neurológicas y trastornos descritos anteriormente y cantidades eficaces para mejorar la supervivencia de las células neurales y/o proteger las neuronas y las vías neurales antes de establecerse la lesión en el tejido nervioso.

Como apreciarán los expertos en la técnica, la concentración de los compuestos descritos aquí en una composición terapéutica variará dependiendo de diversos factores, entre los que se incluyen la dosificación de fármaco que se va a administrar, las características químicas (por ejemplo hidrofobia) de los compuestos empleados y la ruta de administración. La dosificación preferida del fármaco que se va a administrar probablemente también dependerá de variables tales como el tipo y grado de progresión de la enfermedad neurológica, el estado general de salud del paciente particular, la eficacia biológica relativa del compuesto seleccionado, la formulación de los excipientes del compuesto, y su ruta de administración. En términos generales, los compuestos de esta invención se pueden proporcionar en una solución tampón fisiológica acuosa que contiene alrededor de 0,1 a 10% p/v de compuesto para administración parenteral. Los intervalos de dosificación típicos son de aproximadamente 10 ng/kg a aproximadamente 1 g/kg de peso corporal al día; un intervalo de dosis preferido es de aproximadamente 0,1 \mug/kg a 100 mg/kg de peso corporal al día. Óptimamente, la dosificación de morfógeno dada en todos los casos está entre 2 y 20 \mug de proteína por kg de peso de paciente al día. No se induce ninguna lesión patológica inducida por OP-1 obvia cuando se administra morfógeno maduro (por ejemplo OP-1, 20 \mug) diariamente a ratas en fase de desarrollo normales durante 21 días consecutivos. Además, inyecciones sistémicas de 10 \mug de morfógeno (p. ej., OP-1) inyectada diariamente durante 10 días en ratones recién nacidos normales no producen ninguna anomalía voluminosa.

Como la capacidad de las proteínas y de los fragmentos proteicos de penetrar en la barrera hematoencefálica puede estar relacionada con su tamaño, lipofilia o su carga iónica neta, se pueden formular modificaciones adecuadas de los morfógenos (p. ej., sustitución de fenilalanina por pentafluorofenilalanina, o conjugación con una proteína cationizada tal como albúmina) para incrementar su transportabilidad a través de la barrera, utilizando metodologías clásicas conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Kastin et al., Pharmac. Biochem. Behav. (1979) 11:713-716; Rapport et al., Science (1980) 207:84-86; Pardridge et al., (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 146:307-313; Riekkinen et al., (1987) Peptides 8:261-265. La eficacia de estos análogos funcionales se puede estimar, por ejemplo, evaluando la capacidad de estos compuestos para inducir la rediferenciación de las células transformadas o intensificar la supervivencia de las neuronas en riesgo de morir como se describe en los Ejemplos proporcionados aquí.

Cuando se van a administrar los morfógenos sistémicamente en los métodos de la presente invención, preferiblemente se utiliza una dosis de carga muy voluminosa al comienzo del tratamiento. Después el tratamiento se continúa con una dosis de mantenimiento. La administración adicional puede ser determinada vigilando a intervalos los niveles del morfógeno en la sangre.

Cuando se induce lesión en las neuronas de una vía neural deliberadamente como parte de, por ejemplo, una intervención quirúrgica, preferiblemente el morfógeno se proporciona justo antes de inducir el traumatismo o al mismo tiempo que éste. Preferiblemente, el morfógeno se administra profilácticamente en un marco quirúrgico. Óptimamente, la dosificación del morfógeno dada en todos los casos está entre 2 y 20 \mug de proteína por kg de peso del paciente.

Cuando el morfógeno se va a proporcionar en un sitio para estimular la regeneración de un axón, preferiblemente el morfógeno se proporciona en el sitio en asociación con un vehículo biocompatible, preferiblemente biorresorbible, adecuado para mantener una proteína en un sitio in vivo, y a través del cual se pueda regenerar una prolongación neural. Un vehículo aquí preferido también comprende suficiente estructura para facilitar la dirección del crecimiento axonal. Los vehículos preferidos aquí incluyen moléculas estructurales tales como colágeno, ácido hialurónico o laminina, y/o polímeros o copolímeros sintéticos de, por ejemplo, poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico) o poli(ácido butírico). Los más preferidos actualmente son vehículos que comprenden matriz extracelular de tejido. Éstos se pueden obtener comercialmente. Además, una matriz extracelular derivada de tejido cerebral se puede preparar como se describe en la Solicitud Internacional US92/01969 (documento WO 92/15323) y/o por otros medios conocidos en la técnica.

Los medios actualmente preferidos para reparar roturas en rutas neurales, particularmente rutas del sistema nervioso periférico, incluyen proporcionar el morfógeno en el sitio como parte de un dispositivo que incluye una membrana o envolvente biocompatible de una dimensión suficiente para abarcar la rotura y con unas aberturas destinadas a recibir las terminaciones nerviosas seccionadas. El morfógeno se dispone dentro de la envolvente, preferiblemente dispersado a lo largo de un vehículo adecuado, y es accesible a las terminaciones nerviosas seccionadas. Alternativamente, el morfógeno se puede absorber sobre la superficie interior de la envolvente, o también asociarse con ella. Además, las envolventes actualmente preferidas tienen una superficie exterior impermeable. La envolvente actúa como canal de guía del nervio, facilitando el direccionamiento del crecimiento axonal. Además, la envolvente también protege el nervio dañado inmunológicamente de agentes que pueden ayudar a la formación de tejido cicatrizal. Materiales adecuados para canales o envolventes incluyen silicona o materiales biorresorbibles tales como colágeno, ácido hialurónico, laminina, poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), poli(ácido butírico) y similares. Adicionalmente, aunque los canales de guía de nervios descritos aquí generalmente tienen forma tubular, será evidente para los expertos en la técnica que se pueden emplear diversas formas alternativas. La luz de los canales de guía puede ser, por ejemplo, ovalada o incluso cuadrada en lo que se refiere a su sección transversal. Por otro lado, los canales de guía se pueden construir de dos o más piezas que se pueden abrazar entre sí para afianzar los muñones de los nervios. Las terminaciones nerviosas se pueden asegurar en los canales de guía de nervios por medio de suturas, adhesivos biocompatibles tales como pegamento de fibrina u otros materiales conocidos en el campo de la medicina.

II.1 Complejos de morfógenos solubles

Con fines ilustrativos, una forma de morfógeno útil en formulaciones terapéuticas, que tiene solubilidad mejorada en soluciones acuosas y que consta esencialmente de aminoácidos, es una proteína morfogénica dímera que comprende al menos la secuencia peptídica de 100 aminoácidos que tiene el patrón de siete o más restos de cisteína característicos de la familia del morfógeno complejada con un péptido que comprende parte o la totalidad de una región pro de un miembro de la familia del morfógeno, o una variante alélica de especie o de otro tipo de la misma. Preferiblemente, la proteína morfogénica dímera se compleja con dos péptidos. También, la proteína morfogénica dímera preferiblemente no se compleja covalentemente con el péptido o péptidos de la región pro. Los péptidos de la región pro también comprenden preferiblemente al menos los 18 aminoácidos N-terminales que definen una región pro de morfógeno dada. En una realización más preferida, los péptidos que definen sustancialmente la región pro de longitud completa son los que se utilizan.

Otras forrmas solubles de morfógenos incluyen dímeros de las formas pro no escindidas de estas proteínas, así como "hemidímeros" en donde la subunidad del dímero es una forma no escindida de la proteína, y la otra subunidad comprende la forma madura de la proteína, incluidas sus formas truncadas, preferiblemente no asociadas covalentemente con un péptido del domino pro escindido.

Con fines ilustrativos, como se ha descrito anteriormente, los dominios pro útiles incluyen las regiones pro de longitud completa, así como varias formas truncadas de la misma, particularmente formas truncadas escindidas en los sitios de escisión proteolíticos Arg-Xaa-Xaa-Arg. Por ejemplo, en OP-1 las posibles secuencias pro incluyen secuencias definidas por los restos 30-292 (forma de longitud completa); 48-292 y 158-292. La estabilidad del complejo de OP-1 soluble se intensifica cuando la región pro comprende la forma de longitud completa en vez de una forma truncada, tal como la forma truncada 48-292, ya que los restos 30-47 presentan homología de secuencias en las porciones N-terminales de otros morfógenos, y se cree que tienen utilidad particular mejorando la estabilidad del complejo para todos los morfógenos. Por consiguiente, las secuencias pro actualmente preferidas son aquellas que codifican la forma de longitud completa de la región pro para un morfógeno dado. Otras secuencias pro que se piensa que tienen utilidad incluyen las secuencias pro biosintéticas, particularmente aquellas que incorporan una secuencia derivada de la zona N-terminal de una o más secuencias pro de morfógeno.

Como será evidente para los expertos en la técnica, se pueden obtener secuencias útiles que codifican la región pro a partir de secuencias genéticas que codifican morfógenos conocidos. Alternativamente, se pueden construir regiones pro quiméricas a partir de las secuencias de uno o más morfógenos conocidos. Todavía otra opción es crear una variante de secuencia sintética de una o más secuencias de región pro conocidas.

Los péptidos de región pro útiles incluyen las cadenas polipeptídicas que comprenden una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que se hibrida en condiciones estrictas con una secuencia de ADN o ARN que codifica al menos los 18 aminoácidos N-terminales de la secuencia de la región pro para OP-1 u OP-2, por ejemplos los nucleótidos 136-192 y 152-211 de Seq. ID Nos. 16 y 19, respectivamente.

A. Aislamiento de complejo de morfógeno soluble a partir de un medio acondicionado o líquido corporal

Los morfógenos se expresan a partir de células de mamíferos como complejos solubles. Sin embargo, típicamente el complejo se disocia durante la purificación, generalmente al exponerse a agentes desnaturalizantes añadidos frecuentemente a las soluciones de purificación, tales como detergentes, alcoholes, disolventes orgánicos, agentes caotrópicos y compuestos que se añaden para rebajar el pH de la solución. A continuación se proporciona un protocolo actualmente preferido para purificar las proteínas solubles de medios acondicionados (u, opcionalmente, un líquido corporal tal como suero, líquido cefalorraquídeo o líquido peritoneal), en condiciones no desnaturalizantes. El método es rápido, reproducible y forma complejos de morfógenos solubles aislados en forma sustancialmente pura.

Los complejos de morfógenos solubles se pueden asilar a partir de medios acondicionados utilizando un sencillo protocolo cromatográfico que consta de tres etapas, realizado en ausencia de desnaturalizantes. El protocolo implica aplicar el medio (o líquido corporal) a una columna de afinidad, seguida de cromatografías de intercambio iónico y filtración en gel. La columna de afinidad descrita más adelante es una columna de Zn-IMAC. El presente protocolo tiene aplicabilidad general para la purificación de muy diversos morfógenos, anticipándose que todos ellos serán aislables utilizando modificaciones mínimas del protocolo descrito a continuación. Como protocolo alternativo también se considera que tendrá utilidad una columna de inmunoafinidad, creada utilizando procedimientos clásicos y, por ejemplo, utilizando anticuerpos específicos para un dominio pro de un morfógeno dado (complejado, por ejemplo, a una columna de Sepharose conjugada con proteína A). Los protocolos para desarrollar columnas de inmunoafinidad están bien descritos en la técnica (véase, por ejemplo, Guide to Protein Purification, M. Deutscher, ed., Academic Press, San Diego, 1990, particularmente las secciones VII y XI).

En este experimento se expresó OP-1 en células CHO de mamífero (ovario de hámster chino) como se describe en la técnica (véase, por ejemplo, la Solicitud Internacional US90/05903 (documento WO 91/05802)). El medio acondicionado para células CHO que contenía 0,5% de FBS se purificó inicialmente utilizando cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados (IMAC). El complejo OP-1 soluble del medio acondicionado se une muy selectivamente a la restina Zn-IMAC y se requiere una alta concentración de imidazol (imidazol 50 mM, pH 8) para la elución eficaz del complejo unido. La etapa Zn-IMAC separa el OP-1 soluble del conjunto de proteínas séricas contaminantes que eluyen en el flujo directo y fracciones de lavado con imidazol 35 mM. A continuación se aplica la OP-1 soluble purificada por Zn-IMAC a una columna de intercambio catiónico de S-Sepharose equilibrada en NaPO_{4} 20 mM (pH 7,0) con NaCl 50 mM. Esta etapa con S-Sepharose sirve para purificar además y concentrar el complejo de OP-1 soluble como preparación para la siguiente etapa de filtración en gel. La proteína se aplicó a una columna de Sephacryl S-200HR equilibrada en TBS. Utilizando sustancialmente el mismo protocolo, los morfógenos solubles también se pueden
aislar a partir de uno o más líquidos corporales, incluidos el suero, el líquido cefalorraquídeo o el líquido peritoneal.

La IMAC se realizó utilizando Chelating-Sepharose (Pharmacia) que había sido cargada con 3 volúmenes de columna de Zn-SO_{4} 0,2 M. El medio acondicionado se tituló a pH 7,0 y se aplicó directamente a la resina de Zn-IMAC equilibrada en HEPES 20 mM, pH 7,0 con NaCl 500 mM. La resina de Zn-IMAC se cargó con 80 ml de medio acondicionado inicial por ml de resina. Después de la carga, la columna se lavó con tampón de equilibración y la mayoría de las proteínas contaminantes se eluyeron con imidazol 35 mM (pH, 7,0) en tampón de equilibración. El complejo de OP-1 soluble se eluye después con imidazol 50 mM (pH 8,0) en HEPES 20 mM y NaCl 500 mM.

El eluato de imidazol 50 mM que contiene el complejo de OP-1 soluble se diluyó con 9 volúmenes de NaPO_{4} 20 mM (pH 7,0) y se aplicó a una columna de S-Sepharose (Pharmacia) equilibrada en NaPO_{4} 20 mM (pH 7,0) con NaCl 50 mM. La resina de S-Sepharose se cargó con un equivalente de 800 ml de medio acondicionado inicial por ml de resina. Después de cargar, la columna de S-Sepharose se lavó con tampón de equilibración y se eluyó con NaCl 100 mM seguido de NaCl 300 mM y 500 mM en NaPO_{4} 20 mM (pH 7,0). La fracción de NaCl 300 mM se purificó adicionalmente utilizando cromatografía de filtración en gel. Se aplicaron 50 ml del eluato de NaCl 300 mM a una columna Sephacryl S-200HR (Pharmacia) de 5,0 x 90 cm, equilibrada en solución salina tamponada con Tris (TBS), Tris 50 mM, NaCl 150 mM (pH 7,4). La columna se eluyó a un caudal de 5 ml por minuto recogiéndose fracciones de 10 ml. El peso molecular aparente de la OP-1 soluble se determinó por comparación con patrones de peso molecular de proteínas (alcohol-deshidrogenasa (ADH, 150 kDa), seroalbúmina bovina (BSA, 68 kDa), anhidrasa carbónica (CA, 30 kDa) y citocromo C (cyt C, 12,5 kDa)). La pureza de las fracciones de la columna S-200 se determinó por separación en geles de SDS con 15% de poliacrilamida clásicos teñidos con azul coomasi. La identidad de la OP-1 madura y el dominio pro se determinó por análisis de secuencia N-terminal después de la separación de OP-1 madura del dominio pro utilizando HPLC C18 en fase inversa clásica.

El complejo de OP-1 soluble eluye con un peso molecular aparente de 110 kDa. Esto concuerda pefectamente con la composición predicha del complejo de OP-1 soluble con un dímero de OP-1 madura (35-36 kDa) asociado con dos dominios pro (39 kDa cada uno). La pureza del complejo final se puede verificar probando la fracción apropiada en un gel de poliacrilamida al 15% reducido.

Los componentes del complejo se pueden verificar aplicando la fracción que contiene el complejo de las columnas S-200 o S-200HR sobre una columna de HPLC C18 en fase inversa y eluyendo con un gradiente de acetonitrilo (TFA al 0,1%), utilizando procedimientos clásicos. El complejo se disocia en esta etapa, y el dominio pro y la especie madura eluyen como especies separadas. Esta especie separada se puede someter después a secuenciación N-terminal utilizando procedimientos clásicos (véase, por ejemplo, Guide to Protein Purification, M. Deutscher, ed., Academic Press, San Diego, 1990, particularmente las páginas 602-613) y la identidad de las proteínas aisladas de 36 kDa y 30 kDa se puede confirmar como morfógeno maduro y dominio pro escincido, aislado, respectivamente. La secuenciación N-terminal del dominio pro aislado de OP-1 producida en células de mamíferos reveló dos formas de la región pro, la forma intacta (que empieza en el resto 30 de Seq. ID No. 16) y la forma truncada (que empieza en el resto 48 de Seq. ID No. 16). La secuenciación N-terminal de la subunidad polipeptídica de la especie madura aislada revela una gama de extremos N-terminales para la secuencia madura, que empieza en los restos 293, 300, 313, 315, 316 y 318 de Seq. ID No. 16, todos los cuales son activos como se demuestra por el ensayo de inducción ósea clásica.

B. Formación del complejo de morfógeno soluble in vitro

Como alternativa a la purificación de complejos solubles a partir de medios de cultivo o de un líquido corporal, los complejos solubles se pueden formular a partir de dominios pro purificados y especies dímeras maduras. La formación efectiva del complejo aparentemente requiere la asociación de los componentes en condiciones desnaturalizantes suficientes para relajar la estructura plegada de estas moléculas, sin afectar a los enlaces disulfuro. Preferiblemente, las condiciones desnaturalizantes simulan el entorno de una vesícula intracelular en la medida suficiente para que el dominio pro escindido tenga la oportunidad de asociarse con la especie dímera madura en condiciones de plegamiento relajado. La concentración del agente desnaturalizante en la solución se rebaja después de manera controlada, preferiblemente gradual, de modo que se permita un replegamiento conveniente de las regiones dimérica y pro mientras que se mantiene la asociación del dominio pro con el dímero. Agentes desnaturalizantes útiles incluyen urea 4-6 M o hidrocloruro de guanidina (Gu-HCl), en soluciones tamponadas de pH 4-10, preferiblemente 6-8. Después, el complejo soluble se forma por diálisis controlada o dilución en una solución con una concentración final de agente desnaturalizante de urea o Gu-HCl menor que 0,1-2 M, preferiblemente urea o Gu-HCl 1-2 M, que después, preferiblemente, puede diluirse en tampón fisilógico. Los procedimientos de purificación/renaturalización de proteínas y las consideraciones correspondientes están bien descritas en la técnica y los detalles para desarrollar un protocolo renaturalizante adecuado se pueden determinar fácilmente por un experto en la técnica. Un texto útil sobre la materia es Guide to Protein Purification, M. Deutscher, ed., Academic Press, San Diego, 1990, particularmente la sección V. La formación de complejos también puede facilitarse por adición de una o más proteínas de chaperona.

C. Estabilidad de complejos de morfógenos solubles

La estabilidad del complejo de morfógeno soluble altamente purificado en un tampón fisiológico, por ejemplo solución salina tamponada con Tris (TBS) y solución salina tamponada con fosfato (PBS), se pueden mejorar por diversas técnicas. Actualmente se prefiere hacerlo por medio de una región pro que comprende al menos los 18 primeros aminoácidos de la secuencia pro (por ejemplo los restos 30-47 de Seq. ID No. 16 para OP-1), y preferiblemente es la región pro de longitud completa. Los restos 30-47 muestran homología de secuencia con la zona N-terminal de otros morfógenos y se cree que tienen utilidad particular para mejorar la estabilidad del complejo para todos los morfógenos. Otros medios útiles para mejorar la estabilidad de complejos de morfógenos solubles incluyen tres clases de aditivos. Estos aditivos incluyen aminoácidos básicos (p. ej., L-arginina, lisina y betaína); detergentes no iónicos (p. ej., Tween 80 o Nonldet P-120); y proteínas portadoras (p. ej., seroalbúmina y caseína). Concentraciones útiles de estos aditivos incluyen: 1-100 mM, preferiblemente 10-70 mM, incluyéndose 50 mM; aminoácido básico, 0,01-1,0%, preferiblemente 0,05-0,2%, incluido 0,1% (v/v) de detergente no iónico; y 0,0,1-1.0%, preferiblemente 0,05-0,2%, incluido 0,1% (p/v) de proteína portadora.

III. Ejemplos Ejemplo 1 Identificación de tejido que expresa el morfógeno (Ejemplo de referencia)

La determinación de la distribución de morfógenos en tejidos se puede utilizar para identificar diferentes morfógenos expresados en un tejido dado, así como para identificar nuevos morfógenos relacionados. La distribución en tejido también se puede utilizar para identificar un tejido útil productor de morfógeno para uso en la detección precoz e identificación de agentes estimuladores de morfógenos candidatos. Los morfógenos (o sus transcritos de ARNm) se identifican fácilmente en diferentes tejidos utilizando metodologías clásicas y modificaciones minoritarias de los mismos en tejidos en que la expresión puede ser baja. Por ejemplo, se puede determinar la distribución de proteínas utilizando un análisis de transferencia Western o técnicas inmunofluorescentes clásicas, y anticuerpos específicos para el morfógeno o los morfógenos de interés. De modo similar, la distribución de transcritos de morfógenos se puede determinar utilizando protocolos de hibridación Northern clásicos y sondas específicas para los
transcritos.

Se puede utilizar cualquier sonda capaz de hibridarse específicamente a un transcrito y de distinguir el transcrito de interés de otros transcritos relacionados. Como los morfógenos descritos aquí comparten alta homología de secuencias en sus dominios C-terminales activos, la distribución de un transcrito de morfógeno específico en tejido puede determinarse en el mejor de los casos utilizando una sonda específica para la región pro de la proteína inmadura y/o la región N-terminal de la proteína madura. Otra secuencia útil es la región 3' no codificante que flanquea y va justo detrás del codón de parada. Estas porciones de la secuencia varían sustancialmente entre los morfógenos de esta invención y, por consiguiente, son específicos para cada proteína. Por ejemplo, una secuencia de sonda específica para Vgr-1 particularmente útil es el fragmento PvuII-ScaI, un fragmento de 265 pares de bases (pb) que codifica tanto una zona de la región pro no traducida como el extremo N de la secuencia madura (véase Lyons et al. (1989) PNAS 86:4554-4558 para una descripción de la secuencia de ADNc). De modo similar, las secuencias de sondas específicas para mOP-1 particularmente útiles son el fragmento BstX1-BgII, una secuencia de 0,68 kb que abarca aproximadamente dos tercios de la región pro de mOP-1; un fragmento StuI-StuI, una secuencia de 0,2 kb inmediatamente curso arriba del dominio con siete cisteínas; y el fragmentio Earl-Pstl, de 0,3 kb, que contiene una zona de la secuencia 3' no traducida (véase Seq. ID No. 18, en donde la región pro se define esencialmente por los restos 30-291). Se pueden utilizar estrategias similares, por ejemplo, con hOP-1 (Seq ID No. 16) o con OP-2 humana o de ratón
(Seq. ID Nos. 20 y 22).

Usando estas sondas específicas de morfógenos, que se pueden construir por ingeniería genética u obtener a partir de secuencias clonadas, se pueden identificar transcritos de morfógenos en tejidos de mamíferos, utilizando metodologías clásicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Brevemente, se prepara ARN total a partir de varios tejidos murinos adultos (por ejemplo hígado, riñón, testículos, corazón, cerebro, timo y estómago) por una metodología clásica tal como el método de Chomczyaski et al. ((1987) Anal. Biochem 162:156-159) y descrito más adelante. Se prepara ARN Poli(A)+ utilizando cromatografía en oligo(dT)-celulosa (por ejemplo, Tipo 7, de Pharmacia LKB Biotechnology, Inc.). El ARN Poli(A)+ (generalmente 15 \mug de cada tejido se fracciona en un gel de agarosa al 1% en formaldehído y se transfiere a una membrana de Nytran (Schleicher & Schuell). Tras la transferencia, la membrana se calienta en estufa a 80ºC y el ARN se reticula bajo la luz ultravioleta (generalmente 30 segundos a 1 mW/cm^{2}). Antes de la hibridación, la sonda apropiada se desnaturaliza por calor. La hibridación se lleva a cabo en un recipiente cilíndrico de lucita que rota en un aparato de frascos rodadores a aproximadamente 1 rpm durante aproximadamente 15 horas a 37ºC utilizando una mezcla de hibridación de formamida al 40%, 5 X Denhardts, 5 X SSPE y SDS al 0,1%. Después de la hibridación, los recuentos no específicos se separan por lavado de los filtros en 0,1 X SSPE, SDS al 0,1% a 50ºC.

Los ejemplos que demuestran la distribución de tejido de varios morfógenos, incluidos Vgr-1, OP-1, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, GDF-1 y OP-2 en tejido en desarrollo y adulto están descritos en la Solicitud Internacional US92/01968 (documento WO 92/15323) y en Ozkaynak et al., (1991) Biochem. Biophys. Res. Commn. 179:116-123, y Ozkaynak et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 25220-25227. Utilizando la metodología general de sondas que se describe aquí, las hibridaciones por transferencia Northern utilizando sondas específicas para estos morfógenos para sondear tejido de cerebro, bazo, pulmón, corazón, hígado y riñón indican que el tejido renal parece ser la principal fuente de expresión de OP-1, siendo los tejidos de cerebro, corazón y pulmón fuentes secundarias. El tejido de pulmón parece ser la principal fuente de expresión en tejido para Vgr-1, BMP5, BMP4 y BMP3. También se observan niveles inferiores de Vgr-1 en tejido de riñón y corazón, mientras que el hígado parece ser una fuente de expresión secundaria para BMP5, y el bazo parece ser una fuente de expresión secundaria para BMP4. GDF-1 parece expresarse principalmente en tejido cerebral. Hasta la fehca, OP-2 parece estar expresado principalmente en tejido embriónico precoz. Concretamente, las transferencias Northern de embriones murinos y de animales de 6 días de vida presenta abundante expresión de OP2 en embriones de 8 días de vida. La expresión se reduce significativamente en embriones de 17 días y no se detecta en animales post-natales.

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Ejemplo 2 Localización del morfógeno en el tejido nervioso (Ejemplo de referencia)

Se han identificado morfógenos en tejido de médula espinal y cerebro de ratas en fase de desarrollo y adultas, como se determinó tanto por hibridación por transferencia Northern de sondas específicas de morfógenos a extractos de ARNm de tejido nervioso adulto en fase de desarrollo (véase el Ejemplo 1 anterior) como por estudios de inmunolocalización. Por ejemplo, el análisis por transferencia Northern de tejido de rata en desarrollo ha identificado significativa expresión del transcrito de ARNm de OP-1 en el SNC, Solicitud Internacional US92/01968 (documento WO 92/15323) y Ozkaynak et al., (1991) Biochem. Biophys. Res. Commn. 179:11623, y Ozkaynak et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 25220-25227. El ARNm de GDF-1 parece expresarse principalmente en tejido nervioso en desarrollo y adulto, concretamente en el cerebro, incluido el cerebelo y el tallo cerebral, la médula espinal y los nervios periféricos (Lee, S. (1991) PNAS 88: 4250-4254). También se ha dado a conocer que los transcritos de BMP2B (también llamado en la técnica BMP4) y Vgr-1 se expresan en tejido nervioso (Jones et al. (1991) Development 111:531-542), aunque el tejido nervioso no parece ser el principal tejido de expresión para estos genes (Ozkaynak et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 25220-25227). Concretamente, se dan a conocer transcritos de CBMP2 en la región del diencéfalo asociada con el desarrollo pituitario, y se dan a conocer transcritos de Vgr-1 en el eje anteroposterior del SNC, incluyéndose la placa de techo del tubo neural en fase de desarrollo así como las células inmediatamente adyacentes a la placa de piso del tubo neural en fase de desarrollo. En ratas mayores, se han descrito transcritos de Vgr-1 en tejido de hipocampo en desarrollo. Además, los genes que codifican OP-1 y BMP2 fueron identificados en un principio por sondeo de bancos de ADNc de hipocampo humano.

Estudios de inmunolocalización, realizados utilizando metodologías clásicas conocidas en la técnica y descritos en la Solicitud Internacional US92/01968 (documento WO 92/15323), localizaron la expresión de OP-1 en áreas particulares de tejido de médula espinal y cerebro de rata en fase de desarrollo y adultas. Concretamente, se estimó expresión de la proteína OP-1 en tejido nervioso embriónico de ratón de 5 o 6 días de edad y adultos (2-3 meses de edad) utilizando antisueros específicos para los morfógenos, clásicos, específicamente antisuero anti-OP-1 de conejo, preparado utilizando los protocolos clásicos de anticuerpos conocidos en la técnica y preferiblemente purificados en una columna de afinidad de OP-1. El propio anticuerpo se marcó utilizando técnicas de marcación fluorescente clásicas, o se utilizó una molécula anti-IgG de conejo marcada para visualizar el anticuerpo frente a OP-1 unido.

La tinción por inmunofluorescencia demuestra la presencia de OP-1 en sistema nervioso central (SNC) de rata adulta. Se observa una tinción similar y extensa tanto en cerebro (1A) como en médula espinal (1B). La OP-1 parece localizarse predominantemente en la matriz extracelular de la sustancia gris (cuerpos de células neuronales) presentes de forma característica en todas las áreas excepto en los propios cuerpos celulares. En la sustancia blanca, formada principalmente por fibras nerviosas mielinizadas, la tinción parece estar confinada a los astrocitos (células neuroneurogliales). Se observa también un patrón de tinción similar en secciones de cerebro de rata recién nacida (10 días de vida).

Además, se ha localizado específicamente OP-1 en la sustancia negra, que está compuesta principalmente por ganglios basales estriatales, un sistema de neuronas motoras auxiliares que funcionan en asociación con la corteza cerebral y el sistema corticoespinal. Las disfunciones en esta subpoblación o sistema de neuronas están asociadas con diversas neuropatías, entre las que se incluyen en corea de Huntington y la enfermedad de Parkinson.

OP1 también está localizada en las células neuroneurogliales de adendema, que se sabe que secretan factores en el líquido cefalorraquídeo y que se encuentran alrededor de la válvula intraventricular, la fisura coroide y el canal central del cerebro tanto en rata adulto como en fase de desarrollo.

Finalmente, la inhibición de morfógenos en embriones en fase de desarrollo inhibe el desarrollo del tejido nervioso. Concretamente, células embrionarias de ratón de 9 días de vida, cultivadas in vitro en condiciones de cultivo clásicas, se incubaron en presencia y ausencia de un anticuerpo monoclonal específico para OP-1 utilizando OP-1 madura purificada, producido por técnicas recombinantes, y el inmunógeno. El anticuerpo se preparó utilizando medios clásicos de producción de anticuerpos, bien conocidos en la técnica, y descritos de forma general en el Ejemplo 13. Después de 2 días, el efecto del anticuerpo sobre el embrión en fase de desarrollo se evaluó por histología. Como se determinó por el examen histológico, el anticuerpo específico para OP-1 inhibe específicamente la formación del óvulo ocular en el embrión en desarrollo. En particular, no se desarrolla la excrecencia del diencéfalo. Además, el corazón se malforma. Por otro lado, en estudios de inmunolocalización separados sobre secciones de embriones con anticuerpos específicos para OP-1, el anticuerpo específico para OP-1 se localiza en el epitelio neural.

Los morfógenos endógenos que actúan sobre las células neuronales se pueden expresar y secretar por las células del tejido nervioso, por ejemplo por neuronas y/o células neuroneurogliales asociadas con las neuronas y/o se pueden transportar a las neuronas por el líquido cefalorraquídeo y/o la circulación sanguínea. Recientemente, se ha identificado OP-1 en la sangre humana (véase el Ejemplo 9 siguiente). Además, recientemente se ha demostrado que las células de Schwann trasplantadas estimulan la formación de fibras nerviosas en la médula espinal de ratas, lo que incluye la inducción de vascularización y la formación de la envolvente mielínica en torno a algunos de las nuevas prolongaciones neuronales (Bunge (1991) Exp. Neurology 114:254-257). La propiedad regenerativa de estas células se puede mediar por la secreción de un morfógeno por las células de Schwann.

Ejemplo 3 Mejora de la supervivencia de las células neuronales por los morfógenos

Los morfógenos descritos aquí mejoran la supervivencia celular, particularmente de las células neuronales en riesgo de morir. Por ejemplo, las neuronas completamente diferenciadas son no mitóticas y mueren in vitro cuando se cultivan en condiciones clásicas de cultivo de células en mamíferos, utilizando un medio químicamente definido o bajo en suero conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Chamess (1986) J. Biol. Chem. 26:3164-3169 y Freese et al. (1990) Brain Res. 521:254-264). Sin embargo, si un cultivo principal de células neuronales no mitóticas se trata con un morfógeno, la supervivencia de estas células se intensifica significativamente. Por ejemplo, se preparó un cultivo principal de ganglios basales estriatales aislados de la sustancia negra de cerebro de rata adulta utilizando procedimientos clásicos, por ejemplo por disociación, por trituración con una pipeta Pasteur de tejido de sustancia negra, utilizando protocolos de cultivo de tejidos clásicos, y hechos crecer en un medio bajo en suero, por ejemplo que contiene DMEM al 50% (medio Eagle modificado por Dulbecco), medio F-12 al 50%, suero de caballo inactivado por calor enriquecido con penicilina/estreptomicina y 4 g/l de glucosa. Bajo condiciones clásicas de cultivo, estas células están experimentando muerte celular significativa en 3 semanas cuando se cultivan en un medio sin suero. La muerte celular se evidencia morfológicamente por la incapacidad de las células de permanecer adherentes y por los cambios en sus características ultraestructurales, por ejemplo por agrupación de cromatina y desintegración de los orgánulos.

En este Ejemplo, los ganglios basales cultivados se trataron con medio químicamente definido acondicionado con 0,1-100 ng/ml de OP-1. El medio acondicionado con morfógeno, de nueva aportación, se proporcionó a las células cada 3 o 4 días. La supervivencia celular se mejoró significativamente y era dependiente de la dosis ante el nivel de OP-1 añadido: la muerte celular disminuía significativamente a medida que se aumentaba la concentración de OP-1 en los cultivos de células. Concretamente, las células permanecían adherentes y continuaban manteniendo la morfología de las neuronas diferenciadas viables. En ausencia de tratamiento con morfógeno, la mayoría de las células cultivadas se disociaban y experimentaban necrosis celular.

Las disfunciones en los ganglios basales de la sustancia negra están asociados con el parkinsonismo in vivo. La capacidad de los morfógenos definidos aquí de mejorar la supervivencia de las neuronas indica que estos morfógenos serán útiles como parte de una terapia dirigida a intensificar la supervivencia de las células neuronales en riesgo de morir in vivo debido, por ejemplo, a neuropatía o traumatismo químico o mecánico. Se anticipa en particular que estos morfógenos proporcionarán un agente terapéutico útil para tratar neuropatías que afecten a los ganglios basales estriatales, incluida la enfermedad de Parkinson. Para aplicaciones clínicas, se puede administrar el morfógeno.

Ejemplo 4 Rediferenciación de células transformadas inducida por morfógenos (Ejemplo de referencia)

Los morfógenos descritos aquí también inducen rediferenciación de células transformadas a una morfología característica de células no transformadas. En particular, los morfógenos son capaces de inducir rediferenciación de células transformadas de origen neuronal a una morfología característica de neuronas no transformadas. El Ejemplo proporcionado más adelante detalla la rediferenciación inducida por morfógenos de una línea celular humana transformada de origen neuronal, NG108-15. También se ha observado rediferenciación inducida por morfógenos de células transformadas en células de neuroblastoma de ratón (N1E-115) y en células de carinoma embrionario humano (véase Solicitud Internacional US92/01968 (documento WO 92/15323)).

NG108-15 es una línea celular híbrida transformada producida fusionando células de neuroblastoma x glioma (obtenidas a partir de la America Type Tissue Culture, Rockville, MD) y que presenta una morfología característica de neuronas embrionarias transformadas, por ejemplo tienen morfología fibroblástica. Concretamente, las células tienen cuerpos celulares poligonales, prolongaciones cortas, como espinas, y hacen pocos contactos con las células vecinas (véase la Figura 1A). La incubación de células NG108-15, cultivadas en un medio libre de suero, definido químicamente, con 0,1 a 300 ng/ml de OP-1 durante 4 horas induce un cambio ordenado y dependiente de la dosis en la morfología celular.

En el experimento, se subcultivaron células NG108-15 en placas de 6 pocillos revestidas de poli-L-lisina. Cada pocillo contenía 40-50.000 células en 2,5 ml de medio químicamente definido. El tercer día, se añadieron 2,5 \mul de OP-1 en etanol al 60% que contenía ácido trifluoroacético al 0,025% a cada pocillo. Se ensayaron concentraciones de OP-1 de 0 a 300 ng/ml. Típicamente, el medio se cambió diariamente con nuevas alícuotas de OP-1, aunque se puede inducir morfogénesis por una sola incubación durante 4 horas con OP-1. Además, las concentraciones de OP-1 de 10 ng/ml fueron suficientes para inducir rediferenciación. Al cabo de un día, las células tratadas con hOP-1 experimentan un cambio significativo en su ultraestructura celular, incluyéndose el redondeo del soma, un aumento en el brillo de la fase y la extensión de las prolongaciones cortas de las neuritas. Después de dos días, las células tratadas con OP-1 empiezan a formar láminas epitelioides, que constituyen la base para el crecimiento de agregados de capas múltiples en el post-tratamiento de tres días. En cuatro días, la gran mayoría de células tratadas con OP-1 se asocian en agregados firmemente empaquetados y de capas múltiples (Figura 1B). La Figura 2 representa el número medio de agregados con capas múltiples o agrupaciones celulares identificadas en campos seleccionados al azar a partir de seis independientes, en función de la concentración de morfógeno. Cuarenta ng/ml de OP-1 son suficientes para una inducción semimáxima de agregación celular.

La rediferenciación inducida por los morfógenos ocurre sin ningún cambio asociado en la síntesis de ADN, la división celular o la viabilidad celular, haciendo improbable que los cambios morfológicos sean secundarios a diferenciación celular o a un efecto tóxico de bOP-1. Además, la morfogénesis inducida por OP-1 no inhibe la división celular, según se determina por captación de ^{3}H-timidina, a diferencia de otras moléculas que se ha observado que estimulan la diferenciación de células transformadas, tales como butirato, DMSO, ácido retanoico o Foskolin. Los datos indican que OP-1 puede mantener la estabilidad y viabilidad celular después de inducir rediferenciación. Además, los efectos son específicos del morfógeno, y no se induce rediferenciación cuando las células NG108-15 son incubadas con 0,1-40 ng/ml de TGF-\beta.

Los experimentos también han sido realizados con morfógeno soluble altamente purificado (por ejemplo OP-1 maduro asociado con su dominio pro) que también indujeron específicamente la rediferenciación de células MG108-15.

Los morfógenos descritos aquí proporcionan, por consiguiente, agentes terapéuticos útiles para el tratamiento de neoplasias y lesiones neoplásicas del sistema nervioso, particularmente en el tratamiento de neuroblastomas, incluidos retinoblastomas y gliomas. Pueden administrarse los propios morfógenos o, alternativamente, un agente estimulador de morfógenos.

Ejemplo 5 Protección del tejido nervioso contra traumatismos químicos

La capacidad de los morfógenos descritos aquí para mejorar la supervivencia de células neuronales e inducir la agregación celular y la adhesión célula-célula en células rediferenciadas, indica que los morfógenos serán útiles como agentes terapéuticos para mantener las vías neurales al proteger a las células que definen la ruta contra los daños causados por traumatismos clínicos. En particular, los morfógenos pueden proteger a las neuronas, incluyéndose las neuronas en desarrollo, de los efectos de las toxinas que se sabe que inhiben la proliferación y migración de neuronas y que interfieren con la adhesión célula-célula. Ejemplos de estas toxinas incluyen etanol, una o más de las toxinas presentes en el humo del tabaco, y diversos opiáceos. Los efectos tóxicos del etanol sobre las neuronas que se están desarrollando inducen el daño neurológico manifestado en el síndrome de alcoholismo fetal. Los morfógenos también pueden proteger a las neuronas de los efectos citotóxicos asociados con los aminoácidos excitatorios tales como el glutamato.

Por ejemplo, el etanol inhibe los efectos de adhesión célula-célula inducidos en células NG108-15 tratadas con morfógenos cuando se suministra estas células a una concentración de 25-50 mM. Se puede conseguir una inhibición semimáxima con etanol 5-10 mM, que corresponde a la concentración de alcohol en sangre en una persona adulta después de ingerir una sola bebida alcohólica. Probablemente el etanol interfiere con la unión homofílica de CAMS entre células, en vez de su inducción, ya que los niveles de N-CAM inducidos por morfógenos no se ven afectados por el etanol. Además, el efecto inhibidor es inversamente proporcional a la concentración de morfógenos. Por consiguiente, se considera que la administración de un morfógeno o de un agente estimulador de morfógenos a las neuronas, particularmente neuronas en desarrollo, en riesgo de daño por exposición a toxinas tales como etanol, puede proteger a estas células ante el daño en tejido nervioso superando los efectos inhibidores de las toxinas. Con fines ilustrativos, los morfógenos descritos aquí también son útiles en terapias para tratar vías neurales dañadas a consecuencia de neuropatía inducida por exposición a estas toxinas.

Ejemplo 6 Expresión de CAM inducida por morfógenos

Los morfógenos descritos aquí inducen expresión de CAM, particularmente expresión de N-CAM, como parte de su indución de morfogénesis. CAM son moléculas morforreguladoras identificadas en todos los tejidos como una etapa esencial en el desarrollo del tejido. N-CAM, que comprende al menos tres isoformas (N-CAM-180, N-CAM-140 y N-CAM-120, en donde "180", "140" y "120" indican los pesos moleculares aparentes de las isoformas según se midieron por electroforesis en gel de poliacrilamida), se expresa al menos pasajeramente en tejidos en desarrollo, y permanentemente en tejido nervioso. Tanto las isoformas N-CAM-180 como N-CAM-140 se expresan en tejido en desarrollo y adulto. La isoforma N-CAM-120 se encuentra sólo en tejido adulto. Otra CAM neural es L1.

Las N-CAM están implicadas en el desarrollo neural apropiado, incluyéndose la neuralización apropiada, la migración neuronal, la fasciculación y la sinaptogénesis. La inhibición de la producción de N-CAM, por ejemplo por complejación de la molécula con un anticuerpo específico para N-CAM, inhibe la organización de la retina, incluyéndose la migración de axones retinales, y la regeneración de axones en el sistema nervioso periférico, así como la sinapsis de axones con células de músculos diana. Además, hay indicios significativos de que el traumatismo físico o químico en las neuronas, en la transformación oncogénica y algunos trastornos neurológicos genéticos están acompañados por cambios en la expresión de CAM, que alteran el comportamiento adhesivo o migratorio de estas células. Específicamente, se describen niveles elevados de N-CAM en cuerpo estriado con enfermedad de Huntington (por ejemplo ganglios basales estriados) y se nota adhesión disminuida en la enfermedad de
Alzheimer.

Los morfógenos descritos aquí pueden estimular la producción de CAM, en particular la producción de L1 y N-CAM, incluidas las tres isoformas de la molécula de N-CAM. Por ejemplo, la expresión de N-CAM es estimula significativamente en células NG108-15 tratadas con morfógenos. Las células NG108-15 no tratadas presentan una morfología fibroblástica, o mínimamente diferenciada, y expresan sólo las isoformas 180 y 140 de N-CAM normalmente asociadas con una células en fase de desarrollo. Después del tratamiento con morfógenos, estas células presentan una morfología características de las neuronas adultas y expresan niveles más altos de las tres isoformas de N-CAM. Utilizando un protocolo similar al descrito en el Ejemplo siguiente, el tratamiento de las células NG108-15 con morfógenos también indujo expresión de L1.

En este Ejemplo, se cultivaron células NG108-15 durante 4 días en presencia de concentraciones crecientes de OP-1 y se realizaron transferencias Western clásicas en todos los extractos celulares. Se detectaron isoformas de N-CAM con un anticuerpo que reacciona cruzadamente con las tres isoformas, anticuerpo monoclonal H28.123, obtenido de Sigma Chemical Co., St. Louis, siendo distinguibles las diferentes isoformas por sus diferentes movilidades en un gel de electroforesis. Las células NG108-15 testigo (no tratadas) expresan tanto las isoformas de 140 kDa como de 180 kDa, pero no la de 120 kDa, según se determinó por análisis de transferencia Western utilizando hasta 100 \mug de proteína. El tratamiento de las células NG108-15 con OP-1 dio como resultado un incremento dependiente de la dosis en la expresión de las isoformas de 180 kDa y 140 kDa, así como la inducción de la isoforma de 120 kDa. Véase la Figura 2A y la Figura 2B. La Figura 2B es una transferencia Western de extractos celulares de NG108-15 tratados con OP-1, sondeados con anticuerpo monoclonal H28.123, que muestran la inducción de las tres isoformas. La Figura 2A es una curva de dosis-respuesta de la inducción de N-CAM-180 y N-CAM-140 en función de la concentración de morfógeno. N-CAM-120 no se muestra en la gráfica ya que no se pudo cuantificar en células testigo. Sin embago, como es claramente evidente de la transferencia Western en la Figura 2A, N-CAM-120 es inducida en respuesta a tratamiento con morfógeno. La inducción diferencial de las isoformas N-CAM 180 y 140 observada puede deberse a la expresión constitutiva de la isoforma 140 que es casi máxima.

El incremento en la expresión de N-CAM se correspondió de manera dependiente de la dosis con la inducción de agregados multicelulares por morfógenos. Compárense la Figura 2A y la Figura 3. La Figura 3 representa gráficamente el número medio de agregados de capas múltiples (agrupaciones) contados por 20 campos seleccionados aleatoriamente en 6 experimentos independientes, frente a la concentración de morfógeno. La inducción de la isoforma 120 también indica que la rediferenciación de células transformadas inducida por morfógenos estimula no sólo la rediferenciación de estas células a partir de un fenotipo transformado, sino también la diferenciación a un fenotipo correspondiente a una célula desarrollada. Los estudios clásicos de inmunolocalización realizados con el anticuerpo monoclonal H28.13 sobre células tratadas con morfógenos indican la formación de agregados de N-CAM asociados con la periferia y las prolongaciones de células tratadas y ninguna reactividad en las células no tratadas. Además, el tratamiento con morfógenos no parece que inhiba la división celular según se determinó por el rcuento de células o la captación de ^{3}H-timidina. Finalmente, agentes diferenciadores químicos conocidos, tales como Forskolin y dimetilsulfóxido, no inducen producción de N-CAM.

Además, los efectos de la agregación celular de OP-1 sobre las células NG108-15 se puede inhibir con anticuerpos anti-N-CAM u oligonucleótidos antisentido N-CAM. Los oligonucleótidos antisentido se pueden preparar por síntesis en un sintetizaro de nucleótidos, utilizando medios clásicos conocidos en la técnica. Preferiblemente, se preparan oligonucleótidos de fósforotioato ("S-oligos") para mejorar el transporte de los nucleótidos a través de las membranas celulares. Las concentraciones de tanto anticuerpos anti-N-CAM como oligonucleótidos antisentido de N-CAM suficientes para inhibir la inducción de N-CAM también inhibieron la formación de agregados de células de capas múltiples. Concretamente, la incubación de las células NG108-115 tratadas con morfógenos con S-oligos antisentido de N-CAM en concentración 0,3-3 \muM, S-oligos antisentido de N-CAM no modificados 5-500 \muM o anticuerpos monoclonales H28.123 en concentración de 10 \mug/ml inhibe significativamente la agregación celular. Es probable que el tratamiento con morfógenos también estimule otras CAM, ya que la inhibición no es completa.

También se han realizado experimentos con morfógenos solubles (p. ej., OP-1 de ratón asociado con su dominio pro) que también indujeron específicamente la expresión de CAM.

Con fines ilustrativos, los morfógenos descritos aquí son útiles como agentes terapéuticos para tratar trastornos neurológicos asociados con niveles alterados de CAM, particularmente niveles de N-CAM, tales como corea de Huntington y enfermedad de Alzheimer, y similares. En aplicaciones químicas, se pueden administrar los propios morfógenos.

La eficacia de los morfógenos descritos aquí para influir en la expresión de N-CAM se evaluar in vitro utilizando una línea celular adecuada y los métodos descritos aquí. Además de una línea celular transformada, la expresión de N-CAM se puede ensayar en un cultivo celular primario de células neurales o neuroneurogliales, siguiendo los procedimientos descritos aquí. La eficacia del tratamiento con morfógenos sobre la expresión de N-CAM in vivo se puede evaluar por biopsia de tejidos como se describe en el Ejemplo 9 siguiente, y detectando moléculas N-CAM con un anticuerpo específico para N-CAM, tal como el anticuerpo monoclonal H28.123, o utilizando el modelo animal experimental descrito en el Ejemplo 11.

Alternativamente, también se puede detectar el nivel de proteínas N-CAM, o fragmentos proteicos de la misma, presentes en el líquido cefalorraquídeo o suero, para evaluar el efecto del tratamiento con morfógenos. Se sabe que las moléculas de N-CAM se desprenden de las superficies celulares y han sido detectadas tanto en suero como en líquido cefalorraquídeo. Además, los niveles alterados de la forma soluble de N-CAM están asociados con hidrocefalia normotensa y con esquizofrenia de Tipo II. Los niveles de N-CAM en los líquidos se pueden detectar siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 9 y utilizando un anticuerpo específico para N-CAM, tal como el anticuerpo monoclonal H.28.123.

Ejemplo 7 Reparación de separaciones en los nervios (PNS) inducida por morfógenos

Los morfógenos descritos aquí también estimulan el crecimiento axonal del sistema nervioso periférico a lo largo de largas distancias permitiendo la reparación y regeneración de vías neurales dañadas. Si bien las neuronas del sistema nervioso periférico pueden hacer brotar nuevas prolongaciones después de una lesión, estos brotes sin guía típicamente no lograrán conectarse apropiadamente y morirán. Cuando la rotura es grande, por ejemplo de más de 5 o 10 mm, la regeración es deficiente o inexistente.

En este Ejemplo se estimó la estimulación de regeneración nerviosa por morfógenos utilizando el modelo del nervio ciático de rata. El nervio ciático de la rata se puede regenerar espontáneamente a través de una grieta de 5 mm y ocasionalmente a través de una grieta de 10 mm, siempre que los extremos seccionados sean insertados en el canal de guía del nervio relleno de solución salina. En este experimento, se ensayó la regeneración del nervio a través de una grieta de 12 mm.

Se anestesiaron ratas hembras adultas Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, Inc.), de 230-250 g de peso, con inyecciones intraperitoneales de pentobarbital sódico (35 mg/kg de peso corporal). Se hizo una incisión en la piel paralela y justo posterior al fémur. Se penetró en el plano intermuscular avascular entre los músculos vastolateral e isquiotibiales y se siguió hasta el tejido fibroaerolar laxo que rodea al nervio ciático. El tejido laxo se dividió longitudinalmente, lo que dejó expuesto el nervio ciático en toda su longitud sin desvascularizar ninguna zona. Bajo el microscopio quirúrgico, se transeccionaron los nervios ciáticos con microtijeras en la parte media del muslo y se injertaron con un injerto de gel de OP-1 que separaban los muñones de los nervios en 12 mm. La región del injerto se envolvió con un tubo de silicona de 20 mm de longitud y un diámetro interno de 1,5 mm, cuyo interior estaba relleno de una solución de morfógeno. Concretamente, la zona de 12 mm centrales del tubo consistía en un gel de OP-1 preparado mezclando 1 a 5 \mug de OP-1 recombinante producido por CHO sustancialmente puro con aproximadamente 100 \mul de MATRIGEL^{TM} (de Collaborative Research, Inc., Bedford, MA), y extracto de matriz extracelular obtenido a partir de tejido de sarcoma de ratón, y que contenía membrana basal de tejido solubilizado, que incluía laminina, colágeno de Tipo IV, sulfato de heparina, proteoglicano y entactina, en solución salina tamponada con fosfato. El tubo relleno de OP-1 se implantó directamente en el sitio del defecto, dejando 4 mm por cada lado para insertar los muñones del nervio. Cada muñón se incrustó contra el gel de OP-1 y se aseguró en el tubo de silicona con tres puntos de nylon 10-0 quirúrgico disponible en el mercado a través del epineurio, la vaina protectora del fascículo.

Además de los injertos de gel de OP-1, como testigos se injertaron tubos de silicona vacíos, tubos de silicona rellenos sólo de gel y autoinjertos "inversos" en donde los segmentos transeccionados de 12 mm del nervio ciático del animal se rotaron 180º antes de la sutura. Todos los experimentos se realizaron por cuadruplicado. Todas las heridas se cerraron con grapas para heridas que se retiraron después de 10 días. Se hicieron injertos en ambas patas de todas las ratas. A las 3 semanas, los animales fueron sacrificados y se extirparon los segmentos injertados y se congelaron inmediatamente en hielo seco. Las secciones congeladas se cortaron luego a lo largo del sitio del injerto, y se examinaron para evaluar la regeneración axonal por tinción inmunofluorescente utilizando anticuerpos anti-neurofilamento marcados con fluoresceína (obtenida de Sigma Chemical Co., St. Louis).

La regeneración del nervio ciático ocurrió a lo largo de toda la distancia de 12 mm en todos los sitios de injerto en los que la grieta se había rellenado con el gel OP-1. En cambio, los tubos de silicona vacíos y los autoinjertos inversos no presentaron regeneración del nervio y sólo un sitio de injerto que contenía el gel a solas presentó regeneración del axón.

Ejemplo 8 Reparación de grietas en los nervios (SNC) inducida por morfógenos

Después del daño axonal in vivo, las neuronas del SNC son incapaces de experimentar procesos de rebrote. Por consiguiente, el tramo en el tejido nervioso del SNC, incluida la médula espinal, el nervio óptico y la retina, daña gravemente o destruye las vías neurales definidas por estas células. Se han utilizado injertos de nervios periféricos para intentar puentear el daño axonal en el SNC. La reparación efectiva con injertos autólogos hasta la fecha aparentemente requiere que el sitio del injerto esté situado cerca del cuerpo de la célula neuronal del SNC y un resultado principal de la axotomia del SNC es la muerte de la célula neuronal. La eficacia de los morfógenos descritos aquí sobre la reparación de los nervios del SNC se puede evaluar utilizando un modelo de nervio óptico contuso de rata tal como el descrito por Bignami et al., (1979) Exp. Eve Res. 28: 63-69, cuya descripción se incorpora aquí como referencia. Brevemente, y como se describe en ese artículo, se anestesian ratas de laboratorio (p. ej., de Charles River Laboratories, Wilmington, MA) utilizando procedimientos quirúrgicos clásicos, y se contusiona el nervio óptico empujando el ojo suavemente fuera de la órbita, insertando un forcex de relojero detrás del globo ocular y estrujando el nervio óptico con los forcex durante 15 segundos, seguido de un intervalo de 30 segundos de descanso y un intervalo de estrujamiento de 15 segundos. Las ratas se sacrifican a intervalos diferentes de tiempo, por ejemplo a las 48 horas, y 3, 44, 11, 15 y 18 días después de la operación. El efecto del morfógeno sobre la reparación del nervio óptico se puede estimar realizando el experimento por duplicado y proporcionando morfógeno o PBS (p. ej., 25 \mul de solución y 25 \mug de morfógeno) al nervio óptico, por ejemplo justo antes de la operación, al mismo tiempo de la operación o en momentos específicos después de la operación.

En ausencia de terapia, la cirugía induce cicatrización neuroglial del nervio contusionado, como se determina por tinción con inmunofluorescencia para proteína ácida fibrilar neuroglial (GFA), una proteína marcadora de cicatrización neuroglial, y por histiología. Se describen inmunofluorescencia indirecta o secciones criostáticas secadas al aire en Bignami et al. (1974) J. Comp. Neur. 153: 27-38, que utilizan anticuerpos disponibles en el mercado para GFA (p. ej., Sigma Chemical Co., St. Louis). Se anticipan niveles reducidos de GFA en animales tratados con el morfógeno, lo que indica la capacidad de los morfógenos de inhibir la formación de cicatrices neuroneurogliales y de estimular la regeneración del nervio óptico.

Ejemplo 9 Diagnóstico de los tejidos nerviosos (Ejemplo de referencia)

Se puede utilizar la localización de morfógenos en tejido nervioso como parte de un método para diagnosticar un trastorno neurológico o neuropatía. El método puede ser particularmente ventajoso para diagnosticar neuropatías de tejido cerebral. Concretamente, se realiza una biopsia de tejido cerebral en un paciente en riesgo, utilizando procedimientos clásicos conocidos en el campo de la medicina. Después se estima la expresión de morfógenos asociada con el tejido biopsiado utilizando metodologías clásicas, por ejemplo por inmunolocalización utilizando técnicas de inmunofluorescencia clásicas en concierto con antisueros específicos de morfógeno o anticuerpos monoclonales. Concretamente, se hacen finos cortes de tejido biopsiado utilzando metodologías clásicas conocidas en la técnica y se incuban con el tejido anticuerpos marcados por fluoresencia (o por otros medios detectables), en condiciones suficientes para permitir la formación del complejo específico antígeno-anticuerpo. La presencia y cantidad de complejo formado se detecta y compara después con un patrón predeterminado o valor de referencia. La detección de niveles alterados de morfógeno presentes en el tejido puede utilizarse después como indicador de disfunción del tejido. Alternativamente, la fluctuación en los niveles de morfógeno se puede estimar vigilando los niveles de transcripción de morfógeno, ya sea por análisis mediante transferencia Northern clásica o por hibridación in situ, utilizando una sonda marcada capaz de hibridarse específicamente al ARN del morfógeno y protocolos de hibridación al ARN clásicos bien conocidos en la técnica.

También se pueden utilizar las fluctuaciones en los niveles de morfógenos presentes en el líquido cefalorraquídeo o en la circulación sanguínea para evaluar la viabilidad del tejido nervioso. Por ejemplo, se detectan morfógenos asociados con células de adendema que se sabe que secretan factores en el líquido cefalorraquídeo, y se localizan generalmente asociados con células neuroneurogliales, y en la matriz extracelular, pero no en los cuerpos de las células neuronales. Por consiguiente, el líquido cefalorraquídeo puede ser un medio natural de transporte de morfógenos. Alternativamente, se pueden liberar morfógenos a partir de las células que mueren en el líquido cefalorraquídeo. Además, recientemente se ha identificado OP-1 en la sangre humana, que también puede ser un medio de transporte de morfógenos y/o un repositorio para el contenido de células que mueren.

El líquido cefalorraquídeo se puede obtener de un individuo por punción lumbar clásica, utilizando metodologías clásicas conocidas en el campo de la medicina. De modo similar, se pueden obtener muestras de suero por venipunción clásica y el suero se puede preparar por centrifugación a 3.000 rpm durante 10 minutos. La presencia de morfógeno en suero o líquido cefalorraquídeo puede estimarse luego por procedimientos clásicos de transferencia Western (inmunotransferencia), ELISA o RIA. Brevemente, por ejemplo, con la técnica ELISA, las muestras se pueden diluir en un tampón apropiado, tal como solución salina tamponada con fosfato, y se dejan absorber alícuotas de 50 \mul en los pocillos de fondo plano de placas de microtítulo previamente revestidas con anticuerpo específico para el morfógeno, y se dejan incubar durante 18 horas a 4ºC. Después las placas se pueden lavar con tampón clásico e incubar con alícuotas de 50 \mul de un segundo anticuerpo específico para el morfógeno, conjugado con un agente de detección, por ejemplo biotina, en un tampón apropiado, durante 90 minutos a temperatura ambiente. Después se pueden detectar los complejos morfógeno-anticuerpo utilizando procedimientos clásicos.

Alternativamente, se puede crear una columna de afinidad específica para el morfógeno utilizando, por ejemplo, anticuerpos específicos para el morfógeno absorbidos en una matriz de columna, y haciendo pasar la muestra líquida a través de la matriz para extraer selectivamente el morfógeno de interés. Después se eluye el morfógeno. Se puede determinar un tampón de elución adecuado empíricamente determinando condiciones apropiadas de unión y elución primero con un testigo (p. ej., morfógeno producido recombinantemente y purificado). Después las fracciones se ensayan en busca de la presencia del morfógeno por inmunotransferencia clásica, y se confirma por secuenciación N-terminal. Las concentraciones de morfógeno en muestras de suero u otras muestras líquidas se puede determinar utilizando técnicas de cuantificación clásicas para proteínas, incluyendo absorbancia espectrofotométrica o cuantificación por ensayos con anticuerpos ELISA o RIA. Utilizando este procedimiento, se ha identificado OP-1 en suero.

Se detectó OP-1 en suero humano utilizando el ensayo siguiente. Un anticuerpo monoclonal generado contra OP-1 producida recombinantemente, de mamíferos, utilizando técnicas de inmunología clásica bien conocidas en este campo y descritas de modo general en el Ejemplo 13, se inmovilizó haciendo pasar el anticuerpo por un gel de agarosa activada (p. ej., Affi-Gel^{TM}, de Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, preparado siguiendo las instrucciones del fabricante), y se utilizó para puriricar OP-1 a partir de suero. Después el suero humano se hizo pasar por la columna y se eluyó con K-tiocianato 3 M. Las fracciones de K-tiocianato se dializaron después en urea 6 M, PO_{4} 20 mM, pH 7,0, se aplicaron a una columna de HPLC C8 y se eluyeron con un gradiente de 25-50% de acetonitrilo/0,1% de TFA, durante 20 minutos. Los homodímeros de OP-1 producidos recombinantemente y maduros eluyen entre 20-22 minutos. Las fracciones se recogieron seguidamente y se ensayaron en busca de la presencia de OP-1 por inmunotransferencia clásica. La Figura 4 es una inmunotransferencia que muestra OP-1 en sueros humanos en condiciones reductoras y oxidadas. En la Figura, las calles 1 y 4 son patrones de OP-1, eluidos en condiciones oxidadas (calle 1) y reducidas (calle 2). La calle 5 muestra marcadores de peso molecular en 17, 27 y 30 kDa. Las calles 2 y 3 son OP-1 de suero humano eluidas en condiciones oxidadas (calle 2) y reducida (calle 3).

Los morfógenos se pueden utilizar en aplicaciones de diagnóstico comparando la cantidad de morfógeno presente en la muestra de líquido corporal con un valor de referencia predeterminado, indicando las fluctuaciones en los niveles de morfógenos del líquido un cambio en el estatus del tejido nervioso. Alternativamente, por este método se pueden detectar fluctuaciones en el nivel de anticuerpos frente a morfógenos endógenos, lo más probablemente en suero, utilizando un anticuerpo u otra proteína de unión capaz de interaccionar específicamente con el anticuerpo frente al morfógeno endógeno. Las fluctuaciones detectadas en los niveles del anticuerpo endógeno se pueden utilizar como indicadores de un cambio en el estatus del tejido.

Ejemplo 10 Alivio del daño en tejido nervioso mediado por la respuesta inmune

Los morfógenos descritos aquí se pueden utilizar para aliviar el daño inmunológico en el tejido nervioso. Los detalles de este daño y el uso de los morfógenos para aliviar esta lesión se describen en la Solicitud Internacional US92/07358 (documento WO 93/04692). Una fuente principal de dicho daño en el tejido nervioso se produce tras hipoxia o isquemia-reperfusión de un suministro de sangre a una vía neural, tal como puede suceder tras un ataque cerebral embólico, o puede ser inducida durante una operación quirúrgica. Como se describe en la Solicitud Internacional US92/07358 (documento WO 93/04692), se ha demostrado que los morfógenos alivian el daño en el tejido miocárdico tras isquemia-reperfusión del suministro sanguíneo al tejido. El efecto de los morfógenos sobre el alivio de un daño inmunológico en el tejido nervioso se puede estimar utilizando metodologías y modelos conocidos por los expertos en la técnica y descritos más adelante.

Por ejemplo, el modelo de embolia cerebral de conejo proporciona un método útil para evaluar el efecto de los morfógenos sobre la lesión en tejido tras una isquemia-reperfusión cerebral. El protocolo descrito más adelante es esencialmente el de Phillips et al. (1989) Annals of Neurology 25:281-285, cuya descripción se incopora aquí como referencia. Brevemente, se anestesian conejos New England blancos (2-3 kg) y se ponen en un respirador. Después se cateteriza selectivamente la circulación intracraneal por la técnica de Seldinger. Luego se realiza una angiografía cerebral basal empleando una unidad de substracción digital. A continuación se emboliza selectivamente la arteria carótida interna distal con 0,035 ml de un trombo autólogo de 18 horas de vida. La oclusión arterial se documenta por repetida angiografía inmediatamente después de la embolización. Después de un tiempo suficiente para inducir infartos cerebrales (aproximadamente 15 minutos o 90 minutos), se induce la reperfusión por administración de un bolo de un agente de reperfusión tal como el análogo de TPA FB-FB-CF (p. ej., 0,8 mg/kg a lo largo de 2
minutos).

El efecto del morfógeno sobre los infartos cerebrales se puede estimar por administración de concentraciones variables de morfógenos, por ejemplo OP-1, a diferentes tiempos tras la embolización y/o reperfusión. Los conejos son sacrificados 3-14 días después de la embolización y sus cerebros se preparan para el examen neuropatológico fijándolos por inmersión en formación tamponada neutra al 10% durante al menos 2 semanas. Después los cerebros se seccionan en un plano coronal a intervalos de 2-3 mm, se enumeran y se someten a procesamiento histológico clásico en parafina, y se determina visualmente el grado de necrosis de tejido nervioso. Se anticipa que los animales tratados con morfógenos reducirán o inhibirán significativamente las necrosis en los tejidos nerviosos después de la isquemia cerebral-reperfusión en los animales de ensayo, según se determina mediante una comparación histológica con animales no tratados.

Ejemplo 11 Modelo animal para estimar la eficacia de morfógenos in vivo

Las actividades in vivo de los morfógenos descritos aquí también se estiman fácilmente en un modelo animal como el descrito aquí. Un animal adecuado, preferiblemente que presenta daño en tejido nervioso, por ejemplo inducido genéticamente o ambientalmente, se inyecta intracerebralmente con una cantidad eficaz de un morfógeno en una formulación terapéutica adecuada, tal como solución salina tamponada con fosfato, pH 7. Preferiblemente, el morfógeno se inyecta dentro del área de las neuronas afectadas. El tejido afectado se extirpa en un punto de tiempo subsiguiente y el tejido se evalúa morfológicamente y/o por evaluación de un marcador bioquímico adecuado, por ejemplo por localización de morfógeno o N-CAM; o por medición del efecto dependiente de la dosis sobre un marcador bioquímico de actividad neurotrófica del SNC o de daño en tejido del SNC, utilizando, por ejemplo, proteína ácida fibrilar neuroglial como marcador. La dosificación y el tiempo de incubación variarán dependiendo del animal que se ensaya. Los intervalos de dosificación adecuados para diferentes especies se pueden determinar por comparación con modelos experimentales establecidos. La presentación siguiente es un protocolo ilustrativo para un modelo de perforación de cerebro de rata.

Brevemente, se anestesian ratas Long Evans machos, obtenidas de fuentes comerciales clásicas, y se prepara el área de la cabeza para cirugía. Se expone la bóveda craneal utilizando procedimientos quirúrgicos clásicos y se taladra un agujero hacia el centro de cada lóbulo utilizando un alambre de 0,035 K, perforando justo la bóveda craneal. Después se proporciona en cada uno de los agujeros soluciones de 25 \mul que contienen o bien el morfógeno (p. ej., OP-1, 25 \mug) o PBS, utilizando una jeringuilla Hamilton. Las soluciones se administran a una profundidad de aproximadamente 3 mm por debajo de la superficie, en la corteza subyacente, el cuerpo calloso y el hipocampo. Después se sutura la piel y se deja recuperar el animal.

Tres días después de la operación, se sacrifican las ratas por decapitación y se procesan sus cerebros para hacer cortes. La formación de tejido cicatrizal se evalúa por tinción con inmunofluorescencia de la proteína ácida fibrilar neuroglial, una proteína marcadora para cicatrización neuroglial, para determinar cualitativamente el grado de formación de cicatriz. Los anticuerpos para la proteína ácida fibrilar neuroglial están disponibles en el mercado, por ejemplo a partir de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. También se sondean secciones con anticuerpos anti-OP-1 para determinar la presencia de OP-1. Se anticipan niveles reducidos de proteína ácida fibrilar neuroglial en los cortes de tejido de animales tratados con el morfógeno, poniendo de manifiesto la capacidad de los morfógenos para inhibir la formación de cicatrices neuroneurogliales y estimular la regeneración de los nervios.

Ejemplo 12 Modelo in vitro para evaluar transporte de especies de morfógenos a través de la barrera hematoencefálica

A continuación se describe un método in vitro para evaluar la facilidad con la que la especie seleccionada de morfógeno probablemente atravesará la barrera hematoencefálica. Audus et al. (1987) Ann. N.Y. Acad. Sci. 507:9-18 proporcionan una descripción detallada del modelo y del protocolo, cuya descripción se incorpora aquí como referencia.

Brevemente, se aíslan células endoteliales de microvasos a partir de la sustencia gris cerebral de cerebros bovinos recientes. Los cerebros se obtienen a partir de un matadero local y se transportan al labroatorio en medio esencial (MEM) enfriado en hielo que contiene antibióticos. En condiciones estériles, se extirpan los vasos sanguíneos superficiales grandes y las meninges utilizando procedimientos clásicos de disección. La sustancia gris cortical se retira por aspiración, después se trozea en cubos de aproximadamente 1 mm. Luego la sustancia gris cortada se incuba con dispasa al 0,5% (BMB, Indianapolis, IN) durante 3 horas a 37ºC en un baño de agua con agitación. Después de 3 horas de digestión, la mezcla se concentra por centrifugación (1.000 x g durante 10 minutos), después se resuspende en dextrano al 13% y se centrifuga durante 10 minutos a 5.800 x g. La grasa sobrenadante, el desecho de células y la mielina se desechan y el sedimento de microvasos crudo se resuspende en 1 mg/ml de colagenasa/dispasa y se incuba en un baño de agua con agitación durante 5 horas a 37ºC. Después de 5 horas de digestión, la suspensión de microvasos se aplica a un gradiente de Percoll al 50% pre-establecido y se centrifuga durante 10 minutos a 1.000 x g. La banda que contiene células endoteliales purificadas (segunda banda de la parte superior del gradiente) se retira y se lava dos veces con medio de cultivo (p. ej., 50% de MEM/50% de mezclas de nutrientes F-12). Se congelan las células (-80ºC) en medio que contiene 20% de DMSO y 10% de suero equino para uso posterior.

Después del aislamiento, se cultivan aproximadamente 5 x 10^{5} células/cm^{2} en placas de cultivo o en filtros de policarbonato con un tamaño de poros de 5-12 \mum que se revisten con colágeno de rata y fibronectina. 10-12 días después de sembrar las células, se inspeccionan las monocapas de células para ver si hay confluencia por examen microscópico.

La caracterización de las propiedades morfológicas histoquímicas y bioquímicas de estas células ha demostrado que estas células poseen muchas de las características salientes de la barrera hematoencefálica. Estas características incluyen uniones intercelulares firmes, falta de fenestraciones de las membranas, bajos niveles de actividad pinocitótica y presencia de gamma-glutamil-transpeptidasa, fosfatasa alcalina y actividades de antígeno de Factor VIII.

Las células cultivadas se pueden utilizar en una amplia gama de experimentos cuando se requiere un modelo para unión polarizada o transporte. Al cultivar las células en placas de pocillos múltiples, se puede efectuar la unión a receptores y no receptores de moléculas tanto grandes como pequeñas. Con el fin de efectuar mediciones de flujo celular transendotelial, las células se cultivan sobre filtros de membrana de policarbonato porosos (p. ej., de Nucleopore, Pleasanton, CA). Se utilizan filtros de gran tamaño de poro (5-12 \mum) para evitar la posibilidad de que el filtro llegue a ser la barrera limitante de la velocidad para el flujo molecular. El uso de estos filtros de tamaño de poro grande no permite el crecimiento celular en el filtro y permite la inspección visual de la monocapa celular.

Una vez que las células alcanzan confluencia, se colocan en un aparato de célula de difusión lado con lado (p. ej., de Crown Glass, Sommerville, NJ). Para las mediciones de flujo, la cámara donadora de la célula de difusión se pulsa con una sustancia de ensayo, después en varias ocaciones después del pulso se retira una alícuota de la cámara receptora para el análisis. Las sustancias radiactivas o marcadas fluorescentemente permiten una cuantificación fidedigna del flujo molecular. Simultáneamente, se mide la integridad de la monocapa por adición de una sustancia de ensayo no transportable tal como sacarosa o inulina y se miden replicados de al menos 4 determinaciones con el fin de garantizar un significado estadístico.

Ejemplo 13 Ensayo de detección para compuestos candidatos que alteran los niveles de morfógenos endógenos (Ejemplo de referencia)

El o los compuestos candidatos que se pueden administrar para influir sobre el nivel de un morfógeno dado se pueden encontrar utilizando el siguiente ensayo de detección, en el que se determina el nivel de producción de morfógeno por un tipo de célula que produce niveles medibles del morfógeno, con y sin incubación de la célula en cultivo con el compuesto, con el fin de estimar los efectos del compuesto sobre la células. Esto se puede conseguir por detección del morfógeno ya sea a nivel de proteína o de ARN. Una descripción más detallada también puede encontrarse en la Solicitud Internacional US92/07359 (documento WO 92/05172).

13.1 Crecimiento de células en cultivo

Se pueden preparar cultivos de células de riñón, glándulas suprarrenales, vejiga de la orina, cerebro u otros órganos como se describe extensamente en la bigliografía. Por ejemplo, se pueden explantar riñones de roedores neonatales o recién nacidos o jóvenes o adultos (ratones o ratas) y utilizarse en un cultivo de órganos como órganos enteros o en forma de cortes de tejidos (1-4 mm). Se pueden establecer cultivos de tejidos primarios y líneas celulares establecidas, también derivadas de riñón, glándulas suprarrenales, vejiga de la orina, cerebro, glándulas mamarias u otros tejidos en placas de pocillos múltiples (6 pocillos o 24 pocillos) siguiendo técnicas convencionales de cultivo de células y se cultivan en ausencia o presencia de suero durante un período de tiempo de 1 a 7 días. Se pueden cultivar células, por ejemplo, en medio de Eagle modificado con Dulbecco (Gibco, Long Island, NY) que cotiene suero (p. ej., suero vacuno fetal al 1%-10%, Gibco) o en medio privado de suero, como se desee, o en medio definido (p. ej., que contiene insulina, transferrina, glucosa, albúmina u otros factores de crecimiento).

Las muestras para ensayar el nivel de producción de morfógeno incluyen sobrenadantes de cultivo lisados de células, recogidos periódicamente y evaluados para determinar la producción de OP-1 por análisis de inumotransferencia (Sambrook et al., eds., 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY), o una zona del propio cultivo de células, recogido periódicamente y usado para preparar Poli(A)+ ARN para el análisis de ARN. Para vigilar la síntesis de OP-1 de novo, algunos cultivos se marcan de acuerdo con procedimientos convencionales con una mezcla de ^{35}S-metionina/^{35}S-cisteína durante 6-24 horas y después se evalúa para determinar la síntesis de OP-1 por métodos de inmunoprecipitación convencionales.

13.2 Determinación del nivel de proteína morfogénica

Con objeto de cuantificar la producción de una proteína morfogénica por un tipo de célula, se puede realizar un inumunoensayo para detectar el morfógeno utilizando un anticuerpo monoclonal o policlonal específico para esa proteína. Por ejemplo, OP-1 se puede detectar utilizando un anticuerpo policlonal específico para OP-1 en un ELISA, como sigue.

Se añade 1 \mug/100 \mul de IgG de conejo policlonal purificada por afinidad específica para OP-1 en cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se incuba a 37ºC durante una hora. Los pocillos se lavan cuatro veces con tampón borato sódico 0,167 M con NaCl 0,15 M (BSB), pH 8,2 que contiene Tween 20 al 0,1%. Para minimizar la unión no específica, los pocillos se bloquean llenándolos completamente con seroalbúmina bovina (BSA) al 1% en BSB e incubando durante 1 hora a 37ºC. Después los pocillos se lavan cuatro veces con BSB que contiene Tween 20 al 0,1%. Se añade una alícuota de 100 \mul de una dilución apropiada de cada una de las muestras de ensayo del sobrenadante de cultivo celular a cada pocillo por triplicado y se incuba a 37ºC durante 30 minutos. Después de la incubación, se añaden 100 \mul de anti-suero de OP-1 de conejo biotinilado (la solución madre tiene una concentración de aproximadamente 1 mg/ml y se diluye 1:400 en BSB que contiene BSA al 1% antes de su uso) en cada pocillo y se incuban a 37ºC durante 30 minutos. Después los pocillos se lavan cuatro veces con BSB que contiene Tween 20 al 0,1%. Se añaden 100 \mul de estreptavidina alcalina (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, Alabama, diluido 1:2.000 en BSB que contiene Tween 20 al 0,1% antes de su uso) en cada pocillo y se incuba a 37ºC durante 30 minutos. Las placas se lavan cuatro veces con solución salina tamponada con Tris 0,5 M (TBS), pH 7,2. Se añaden 50 \mul de sustrato (kit de sistema de amplifación ELISA, Life Technologies, Inc., Bethesda, MD) en cada pocillo y se incuban a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después, se añaden 50 \mul de amplificador (del mismo kit de sistema de amplificación) y se incuba durante otros 15 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detiene por adición de 50 \mul de ácido sulfúrico 0,3 M. Se registra la D.O. a 490 nm de la solución en cada pocillo. Para cuantificar OP-1 en el medio de cultivo, se traza una curva patrón de OP-1 en paralelo con las muestras de ensayo.

El anticuerpo policlonal se puede preparar como sigue. Cada conejo recibe una primera inmunización con 100 \mug/500 \mul de monómero OP-1 producido en E. coli (aminoácidos 328-431 en SEQ ID NO.5) en SDS al 0,1% mezclado con 500 \mul de adyuvante completo de Freund. El antígeno se inyecta subcutáneamente en diversos sitios en la espalda y los costados del animal. El conejo recibe recuerdos después de un mes de la misma manera utilizando adyuvante incompleto de Freund. Se toman muestras de sangre para ensayar de la vena del oído siete días después. Se realizan dos recuerdos adicionales y se extrae sangre para ensayo a intervalos de un mes hasta que se detecta anticuerpo contra OP-1 en el suero utilizando un ensayo ELISA. Después, el conejo recibe recuerdos mensualmente con 100 \mug de antígeno y se toman muestras de sangre (15 ml cada vez) los días siete y diez después del recuerdo.

Un anticuerpo monoclonal específico para un morfógeno dado se puede preparar como sigue. Se administran a un ratón dos inyecciones de monómero OP-1 producido por E. coli. La primera inyección contiene 100 \mug de OP-1 en adyuvante completo de Freund y se administra subcutáneamente. La segunda inyección contiene 50 \mug de OP-1 en adyuvante incompleto de Freund y se administra intraperitonealmente. Después, el ratón recibe un total de 230 \mug de OP-1 (aminoácidos 307-431 en SEQ ID NO:5) en cuatro inyecciones intraperitoneales en varios momentos a lo largo de un período de ocho meses. Una semana antes de la infusión, ambos ratones reciben recuerdos intraperitonealmente con 100 \mug de OP-1 (307-431) y 30 \mug del péptido N-terminal (Ser_{293}-Asn_{309}-Cys) conjugado a través de la cisteína añadida a seroalbúmina bovina con agente reticulante SMCC. Este recuerdo se repitió cinco días (IP), cuatro días (IP), tres días (IP) y un día (IV) antes de la fusión. Las células de bazo de ratón se fusionan después a células de mieloma (p. ej., 653) en una relación de 1:1 utilizando PEG 1500 (Boehringer Mannheim) y la fusión de células se cultiva y escruta para encontrar anticuerpos específicos para OP-1 utilizando OP-1 (307-431) como antígeno. La fusión celular y el escrutinio monoclonal se hacen de acuerdo con procedimientos clásicos bien descritos en textos típicos disponibles en la técnica.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: CREATIVE BIOMOLECULES, INC.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 35 SOUTH STREET

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: HOPKINTON

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: MASSACHUSETTS

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 01748

\vskip0.500000\baselineskip

(G): TELÉFONO: 1-508-435-9001

\vskip0.500000\baselineskip

(H): TELEFAX: 1-508-435-0454

\vskip0.500000\baselineskip

(I): TELEX:

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: REGENERACIÓN Y REPARACIÓN DE NERVIOS, INDUCIDA POR MORFÓGENOS

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 33

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: CREATIVE BIOMOLECULES, INC.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 35 SOUTH STREET

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: HOPKINTON

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: MASSACHUSETTS

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F): ZIP: 01748

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): PROGRAMA INFORMÁTICO: Patentin Release #1.0, Versión #1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN ACERCA DEL ABOGADO/AGENTE

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: KELLEY; ROBIN D.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 34.637

\vskip0.500000\baselineskip

(C): REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: CRP-070

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN ACERCA DE TELECOMUNICACIÓN

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: 617/248-7000

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: 617/248-7100

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 97 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..97

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= SECUENCIA GENÉRICA 1 /nota= "EN DONDE CADA XAA INDICA INDEPENDIENTEMENTE UNO DE LOS 20 ISÓMEROS L DE ALFA-AMINOÁCIDOS NATURALES, O UNO DE SUS DERIVADOS"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 97 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..97

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= SECUENCIA GENÉRICA 2 /nota= "EN DONDE CADA XAA INDICA INDEPENDIENTEMENTE UNO DE LOS 20 ISÓMEROS L DE ALFA-AMINOÁCIDOS NATURALES, O UNO DE SUS DERIVADOS"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 97 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..97

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= SECUENCIA GENÉRICA 3 /nota= "EN DONDE CADA XAA SE SELECCIONA INDEPENDIENTEMENTE DE UN GRUPO DE UNO O MÁS AMINOÁCIDOS ESPECIFICADOS COMO SE DEFINE EN LA MEMORIA DESCRIPTIVA"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 102 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..102

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= SECUENCIA GENÉRICA 4 /nota= "EN DONDE CADA XAA SE SELECCIONA INDEPENDIENTEMENTE DE UN GRUPO DE UNO O MÁS AMINOÁCIDOS ESPECIFICADOS COMO SE DEFINE EN LA MEMORIA DESCRIPTIVA"

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 139 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO DE TEJIDO: HIPOCAMPO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..139

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= hOP1-MADURA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

23

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 139 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: MÚRIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO DE TEJIDO: EMBRIONARIO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..139

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= MOP1-MADURA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 139 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: HOMO SAPIENS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO DE TEJIDO: HIPOCAMPO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..139

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= HOP2-MADURA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 139 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: MÚRIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO DE TEJIDO: EMBRIONARIO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..139

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= MOP2-MADURA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 101 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: bovinos

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..101

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= CBMP-2A-FX

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 101 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: HOMO SAPIENS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO DE TEJIDO: hipocampo

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..101

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= CBMP-2B-FX

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 102 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: DROSOPHILA MALANOGASTER

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..101

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= DPP-FX

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 102 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: XENOPUS

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..102

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= VGL-FX

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

\vskip1.000000\baselineskip

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 102 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: MÚRIDOS

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..102

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= VGR-1-FX

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 106 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO DE TEJIDO: cerebral

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..106

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "GDF-1 (fx)"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1822 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: HOMO SAPIENS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO DE TEJIDO: HIPOCAMPO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 49..1341

\vskip0.500000\baselineskip

(C): MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /función: PROTEÍNA OSTOGÉNICA'' /producto= "OP1" /evidencia= EXPERIMENTAL /nombre_clásico= "OP1"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:

\vskip1.000000\baselineskip

38

39

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 431 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:

41

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1873 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: MÚRIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO DE TEJIDO: EMBRIONARIO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 104..1393

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /función: PROTEÍNA OSTOGÉNICA'' /producto= "MOP1" /nota= "MOP1 (CDNA)"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:

44

45

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 430 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:

\vskip1.000000\baselineskip

47

48

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1723 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO DE TEJIDO: HIPOCAMPO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 490..1696

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /función: PROTEÍNA OSTOGÉNICA'' /producto= "hOP2-PP" /nota= "hOP2 (ADNc)"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:

\vskip1.000000\baselineskip

50

51

52

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 402 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21:

\vskip1.000000\baselineskip

54

55

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1926 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: MÚRIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO DE TEJIDO: EMBRIONARIO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 83..1289

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /función: PROTEÍNA OSTOGÉNICA'' /producto= "mOP2-PP" /nota= "mOP2 (ADNc)"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22:

\vskip1.000000\baselineskip

56

57

58

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 399 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23:

59

60

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1368 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..1368

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24:

61

62

63

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 455 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25:

\vskip1.000000\baselineskip

64

65

66

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 104 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..104

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "BMP3"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:26:

67

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 102 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: HOMO SAPIENS

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..102

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "BMP5"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:27:

\vskip1.000000\baselineskip

68

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 102 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: HOMO SAPIENS

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..102

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "BMP6"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:28:

69

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 102 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..102

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= OPX/nota= "EN DONDE CADA XAA SE SELECCIONA INDEPENDIENTEMENTE DE UN GRUPO DE UNO O MÁS AMINOÁCIDOS ESPECIFICADOS COMO SE DEFINE EN LA MEMORIA DESCRIPTIVA (SECCIÓN II.B.2)"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:29:

70

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 97 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..97

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= SECUENCIA GENÉRICA 5/nota= "EN DONDE CADA XAA SE SELECCIONA INDEPENDIENTEMENTE DE UN GRUPO DE UNO O MÁS AMINOÁCIDOS ESPECIFICADOS COMO SE DEFINE EN LA MEMORIA DESCRIPTIVA"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:30:

\vskip1.000000\baselineskip

71

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 102 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..102

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= SECUENCIA GENÉRICA 6/nota= "EN DONDE CADA XAA SE SELECCIONA INDEPENDIENTEMENTE DE UN GRUPO DE UNO O MÁS AMINOÁCIDOS ESPECIFICADOS COMO SE DEFINE EN LA MEMORIA DESCRIPTIVA"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:31:

73

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1247 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: HOMO SAPIENS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO DE TEJIDO: CEREBRAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 84..1199

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto= "GDF-1" /nota= "GDF-1 ADNc"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:32:

75

76

77

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 372 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:33:

\vskip1.000000\baselineskip

78

79

Claims

1. Uso de un morfógeno en la fabricación de un medicamento para (i) tratar esclerosis lateral amiotrófica, (ii) para tratar una lesión en la médula espinal, (iii) para tratar la enfermedad de Parkinson, o (iv) para estimular la reparación de la rotura de un nervio, en el que el morfógeno comprende una proteína dímera que tiene una secuencia de aminoácidos, que comprende:

(a) una secuencia definida por la Secuencia Genérica 6, Seq ID nº 31; o

(b) una secuencia que tiene más de 60% de identidad de aminoácidos con el dominio C-terminal con seis cisteínas de OP-1 humano, restos 43-139 de Seq ID nº 5; o

(c) una secuencia definida por OPX, Seq. ID nº 29;

en donde dicho morfógeno estimula la producción de N-CAM o isoforma L1 por una célula NG108-15 in vitro.

2. Un dispositivo que comprende una envolvente tubular biocompatible que comprende una superficie exterior y una superficie interior, definiendo dicha superficie interior un canal a través del cual se puede regenerar una prolongación neural, teniendo dicho dispositivo una forma y unas dimensiones suficientes para cubrir una rotura en una vía neural, y teniendo unas aberturas destinadas a recibir las terminaciones del nervio seccionado, comprendiendo además dicho dispositivo un morfógeno dispuesto dentro de dicho canal, en donde el morfógeno comprende una proteína dímera que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende:

(a) una secuencia definida por la Secuencia Genérica 6, Seq ID nº 31; o

(c) una secuencia definida por OPX, Seq. ID nº 29;

en donde dicho morfógeno estimula la producción de N-CAM o isoforma L1 por una célula NG108-15 in vitro; y opcionalmente la envolvente es sustancialmente impermeable.

3. Uso o dispositivo según la reivindicación 1 ó 2, en el que la secuencia de aminoácidos de cada uno de dichos polipéptidos morfogénicos se selecciona entre:

(a) una secuencia que tiene más de 65% de identidad en la secuencia de aminoácidos con el dominio C-terminal con seis cisteínas de OP-1 humano, restos 43-139 de Seq. ID nº 5; y

(b) el dominio C-terminal con siete cisteínas de OP-1 humano, restos 38-139 de Seq. ID nº 5.

4. Uso o dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho morfógeno está complejado con al menos un péptido del dominio pro del morfógeno.

5. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 ó 4, en el que dicho morfógeno está asociado con una molécula que mejora el transporte de dicho morfógeno a través de la barrera hematoencefálica.

6. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho medicamento comprende además un vehículo biocompatible, biorresorbible in vivo, adecuado para mantener una proteína en un sitio in vivo, y opcionalmente, o bien

(i) dicho vehículo es estructuralmente suficiente para facilitar la dirección de crecimiento axonal; y/o

(ii) dicho vehículo comprende un material polímero, laminina, colágeno, o componentes de la matriz extracelular derivados de tejido cerebral.

7. Uso según la reivindicación 1, en el que el morfógeno se selecciona del grupo que consiste en OP-1 humano, OP-1 de ratón, OP-2 humano, OP-2 de ratón, 60A, GDF-1, BMP2A, BMP2B, DPP, Vgl, Vgr-1, BMP3, BMP5 y BMP6.

8. Uso según la reivindicación 1, en el que el medicamento se dispersa en un vehículo polimérico biocompatible, y opcionalmente, o bien

(i) el vehículo es estructuralmente suficiente para facilitar la dirección de crecimiento axonal; y/o

(ii) el vehículo comprende un material polímero, laminina, colágeno, o componentes de la matriz extracelular derivados de tejido cerebral.