EP3218111A1 - Procédé et dispositif de tri sélectif, spécifique et simultané de cellules rares cibles dans un échantillon biologique - Google Patents

Procédé et dispositif de tri sélectif, spécifique et simultané de cellules rares cibles dans un échantillon biologique

Info

Publication number
EP3218111A1
EP3218111A1 EP15816812.0A EP15816812A EP3218111A1 EP 3218111 A1 EP3218111 A1 EP 3218111A1 EP 15816812 A EP15816812 A EP 15816812A EP 3218111 A1 EP3218111 A1 EP 3218111A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
chambers
row
functionalized
rank
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP15816812.0A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Phuong Lan TRAN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of EP3218111A1 publication Critical patent/EP3218111A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/50273—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the means or forces applied to move the fluids
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5025—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures for parallel transport of multiple samples
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502715—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by interfacing components, e.g. fluidic, electrical, optical or mechanical interfaces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L9/00—Supporting devices; Holding devices
    • B01L9/52—Supports specially adapted for flat sample carriers, e.g. for plates, slides, chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/02—Adapting objects or devices to another
    • B01L2200/026—Fluid interfacing between devices or objects, e.g. connectors, inlet details
    • B01L2200/027—Fluid interfacing between devices or objects, e.g. connectors, inlet details for microfluidic devices
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/02—Adapting objects or devices to another
    • B01L2200/028—Modular arrangements
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0621—Control of the sequence of chambers filled or emptied
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0642—Filling fluids into wells by specific techniques
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0689—Sealing
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/02—Identification, exchange or storage of information
    • B01L2300/021—Identification, e.g. bar codes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0636—Integrated biosensor, microarrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0822—Slides
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0848—Specific forms of parts of containers
    • B01L2300/0851—Bottom walls
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/087—Multiple sequential chambers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0874—Three dimensional network
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0877—Flow chambers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0887—Laminated structure
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/12—Specific details about materials

Definitions

  • the invention relates to a method and a device for selective, specific and simultaneous sorting of rare target cells in a biological sample.
  • the general field concerned by the invention is the field of detection of rare cells and their heterogeneous subpopulations in a complex biological fluid (blood, bone marrow, or others, etc.).
  • a complex biological fluid blood, bone marrow, or others, etc.
  • target cells present in a sample at a concentration of between 1 and 10 cells per milliliter (mL) of sample comprising 10 * 10 9 cells.
  • the invention relates to the diagnosis / prognosis of cancer in public health.
  • the mortality associated with malignant tumors is mainly due to the presence of locoregional metastases distant from the primary tumor. Control of metastatic spread is an important factor in the prognosis of the disease.
  • the resulting applications include screening high-risk populations, rendering predictive diagnostic information, prognosis, treatment, monitoring disease or response to treatment, and optimizing treatment. or developing a new personalized molecular medicine therapy.
  • Tumor cells contained in peripheral blood (CTC), or in the bone marrow niches (DTCs) of cancer patients, are heterogeneous and composed of subpopulations of cells of epithelial origin and non-epithelial cells: cancer stem cells (CSC), mesenchymal cells, non-hematopoietic endothelial cells (CEC), etc.
  • CSC cancer stem cells
  • CEC mesenchymal cells
  • CEC non-hematopoietic endothelial cells
  • CTC and DTC tumor cells of origin Epithelial cells
  • CSCs tumor cells of non-epithelial origin
  • CECs non-hematopoietic endothelial cells
  • mesenchymal cells etc.
  • the invention is directed to the detection and characterization of various stem cells and fetal cells in the maternal blood for prenatal diagnosis and genetic abnormalities, etc.
  • the invention can be applied to the monitoring of patients at risk of myocardial infarction by detecting and monitoring the alteration of circulating non-haematopoietic endothelial cells (CEC), post-vaccination surveillance, monitoring of autoimmune diseases, etc.
  • CEC non-haematopoietic endothelial cells
  • microfluidic systems comprising: a) microplots of Si grafted with the anti-EpCam antibody by the M Toner team (CTC-chip, Nagrath S. et al., 2007, Herringbone chip, Stott SL et al., 201 0),
  • a cell separation technique according to a size criterion, carried out using filters with pores with a diameter of 8 ⁇ (Wong NS et al., 2006). This approach has no selectivity, given the variability of cell sizes. All tumor cells have varying sizes.
  • Ephesia (Saliba AE et al, 201 0);
  • DEPArray CellSearch-associated dielectrophoresis
  • CTC and DTC epithelial tumor cells
  • EpCAM epithelial adhesion molecule EpCAM epithelial adhesion molecule
  • the invention therefore aims at providing a device and a method for sorting target cells in a biological sample, selective, specific, simultaneous, polyvalent, economical, industrializable, that is to say allowing detection and automatic counting, compatible with both with IF characterization and FISH characterization, requiring a blood volume less than 5 mL, capable of to use a frozen blood sample, allowing for the detection of aggregates, and suitable for use in existing analytical instruments.
  • An objective of the present invention is therefore also to be able to detect populations and cell subpopulations of localized cancer circulating in the blood by targeting their detection by specific antibodies.
  • the subject of the invention is a mesofluidic device for selective, specific and simultaneous sorting of rare target cells in a biological sample at a concentration of between 1 and 10 cells per milliliter (ml) of sample, characterized in that that he understands:
  • a first row of at least two laminar flow fluid chambers each comprising an inlet fluidly connected to a reservoir of a biological solution, and an outlet;
  • At least one collection tank for the solution fluidly connected to each outlet of the second row fluid chambers;
  • At least one pump adapted to circulate a sample of the biological solution in the fluid chambers of the first row and the last row; laminar flow fluid chambers each comprising a surface functionalized by molecules, at least some of which are capable of forming a bond with a receptor molecule carried by the target cells.
  • the functionalized surfaces of the first rank chambers may be provided with molecules capable of selectively binding with one or more different sample cell population (s) of the target cells, and the functionalized surfaces of the last rank chambers and, optionally intermediate rank (s) may be provided with different types of molecules capable of selectively binding with a population (s) of target cells;
  • the fluid chambers of the first row can be connected to the tank by a single liquid supply channel, consisting of as many channel segments as fluidic chambers, the segments of the feed channel being of different sections and more and more small in the flow direction of the liquid, each segment being in fluid communication with an inlet port of a fluid chamber for introducing the liquid into each chamber;
  • each rank may be constituted by a particle sensor of interest comprising:
  • a cover having recesses for forming the chambers, each recess being in fluid communication with a solution inlet, and a solution outlet;
  • a blade removably mounted and hermetic under the hood to form a bottom of the fluidic chambers, and comprising a surface facing the hood, covered with a functionalized area facing each recess;
  • the first-rank particle of interest sensor may comprise a hood provided with a liquid supply channel, intended to be connected to the tank, and consisting of as many channel segments as the hood comprises recesses, the segments the feed channel being of different sections and smaller and smaller in the direction of flow of the liquid, each segment being in fluid communication with an inlet for circulating the liquid in the chambers; • the cover can be transparent;
  • the cover may be of cycloolefin copolymer
  • the entries of the fluid chambers of each rank apart from the second row can be connected to the outlets of the fluid chambers of the preceding row by tubes of length less than 5 cm, preferably less than 3 cm, and an internal diameter of between 0, 5 and 1, 4 millimeters;
  • the device may comprise, with reference to the position of use:
  • At least two functionalized blades each comprising a surface facing the hood covered with a functionalized area opposite each recess, and pierced with as many outlet orifices as there are functionalized zones;
  • At least one spacer intended to be arranged hermetically between two functionalized blades, and comprising as many lights as the upper cover comprises recess, each light defining a chamber;
  • a lower cover having as many outputs as the first cover comprises inputs
  • the functionalized slides can be transparent at wavelengths compatible with blade analysis instruments; and or
  • Each blade may comprise a visual code that can be interpreted by a computer, the code comprising information relating to the molecules of the functionalized zones of the blade.
  • the invention also relates to a method of selective, specific and simultaneous sorting of rare target cells in a biological sample at a concentration of between 1 and 10 cells per milliliter (mL) of sample, comprising the following steps: a) functionalizing slides with molecules capable of selectively binding with one or more cell population (s) on different areas of the blade to each define a bottom of a fluid chamber;
  • step a) may consist of: a) functionalizing the zones of the first row of slides with molecules capable of selectively binding with one or more cell population (s) the one or more more numerous in the sample considered and different from the target cells;
  • each functionalized zone comprising a single type of said molecules.
  • the device and the method according to the invention have the advantage of allowing selective sorting, specific and simultaneous, thanks to the combination of a Positive selection with negative selection of cells and their heterogeneous subpopulations, for example, in peripheral blood and bone marrow.
  • the versatility of the method and the device according to the invention allows the grafting of a broad spectrum of various antibodies allowing in a single step a positive selection and a negative selection of targeted cells, on each rank, constituting a mesofluidic immunosensor equipped with N independent laminar flow chambers (N being an integer advantageously between 4 and ⁇ inclusive), in parallel, for example on a microscopy slide functionalized with silanes.
  • the method and the device according to the invention make it possible to respond to a medical problem of detection of sub-populations of rare cells in oncology, predictive medicine, regenerative medicine, etc.
  • each laminar flow chamber can selectively detect in each laminar flow chamber one to ten rare cells characteristic of a subpopulation, in one milliliter (ml) of blood containing 1 ⁇ 10 9 blood cells.
  • a major advantage of the present invention is that it meets the medical needs in the case of triple negative breast cancer whose circulating tumor cells lack the expression of EpCAM surface antigen.
  • FIG. 1 is a schematic plan view of a first embodiment of a target cell sorting device according to the invention with three stages;
  • Figure 2 is a schematic plan view of a standard functionalized six-zone microscopy slide
  • FIG. 3 is a schematic perspective view of an exemplary embodiment of a first-order particle of interest sensor
  • FIG. 4 is a schematic perspective view of an exemplary embodiment of a sensor of interest of last rank or of intermediate rank
  • Figure 5 is a schematic sectional view of a second embodiment of a target cell sorting device according to the invention with two stages;
  • Figure 6 is a schematic sectional view of the embodiment of a target cell sorting device of Figure 5, with an additional stage;
  • Figure 7 is a schematic sectional view of a third embodiment of a target cell sorting device according to the invention with three stages;
  • Figure 8 a photograph of a visualization of cell markers by immunofluorescence of a negative selection of leukocytes
  • FIGS. 9 and 10 are photographs of a visualization of immunofluorescent cell markers of a positive selection of CTC cells;
  • FIGS. 11 and 12 photographs of immunofluorescence visualization of cell markers of positive selection of CEC cells;
  • Figures 13 to 15 a photograph of a visualization of genomic alterations in CTC cell subpopulations
  • Figure 166 a photograph of an exemplary labeling of living MCF7 breast cancer cells by a control endocytosis probe for mRNA and miRNA labeling
  • FIG. 17 a photograph after 5 days of cell culture with the reservoirless particle of interest sensor according to the invention.
  • Figure 18 is a schematic partial perspective view of the embodiment of a target cell sorting device of Figure 7.
  • FIG. 19 is a diagrammatic sectional view of the embodiment of a target cell sorting device of FIG. 3.
  • FIG. 1 illustrates a sorting device 100 according to the invention, comprising a first row 1 1 0 of fluidic chambers 1 1 1 each provided with an inlet 1 1 2 fluidly connected to a single tank 1 of a solution biological, and an output 1 1 3.
  • this first row comprises four fluid chambers 1 1 1.
  • the fluid chambers 1 1 1 of the first row are connected to the tank by a single liquid supply channel, consisting of as many channel segments as fluidic chambers 1 1 1, the segments of the feed channel being of different sections and smaller and smaller in the liquid flow direction, each segment being in fluid communication with an inlet port of a fluid chamber 1 1 1 to enter the liquid in each chamber.
  • this channel is advantageously carried by a rigid cover.
  • the device 1 00 also comprises a second row 1 20 of fluid chambers 1 21 in number equal to the number of chambers 1 1 1 of the first row 1 1 0.
  • Each fluidic chamber of the second row comprises an inlet fluidly connected to an outlet a first-row room, and an exit.
  • the chambers of two successive ranks are connected in series, that is, that is, they communicate fluidically in the direction of flow of the sample.
  • the device 1 00 also comprises a last row 1 30 of fluid chambers 1 31 in number equal to the number of chambers 1 1 1 of the first row 1 1 0.
  • Each fluidic chamber of the last row comprises a entreel 32 fluidly connected to an outlet a room of the first row. In this embodiment, this fluidic connection is indirect and is via the chambers 1 21 of the second row.
  • the fluid chambers 1 31 of the last row also include an outlet 1 33.
  • the outputs 1 33 of the last row are connected in a fluid manner to a collection tank not shown in the figure.
  • the entries of the fluidic chambers of each rank from the second rank are connected to the outputs of the fluidic chambers of the previous rank by tubes 2 of length less than 5 cm, preferably less than 3 cm, and an internal diameter of between 0.5 and 1, 4 millimeters.
  • the liquid sample circulates in the device from the biological solution tank 1 to the collection tank through the three rows of fluid chambers.
  • This circulation is allowed by a pump (not shown).
  • This pump can be configured to push and / or suck liquid through the rows of fluid chambers.
  • a flow rate is imposed in each chamber by a pump implemented upstream and / or downstream of the fluidic chambers.
  • the pump is a multi-channel peristaltic pump.
  • the fluidic chambers 1 1 1, 1 2 1, 1 3 1 each comprise a surface functionalized by molecules, at least some of which are capable of forming a bond with a receptor molecule carried by the target cells. It may advantageously be antibodies grafted onto surface-binding molecules such as silanes.
  • the chambers have dimensions at the mesofluidic scale and provide a laminar flow (that is to say without turbulence).
  • the mesofluidic scale concerns devices whose dimensions and configurations vary from a few millimeters to one or several centimeters. These devices are distinguished from microfluidic devices of which at least one of the characteristic dimensions is of the order of one micrometer.
  • the functionalized surface 2 1 0 of the fluidic chambers is carried by a glass slide 200, such as a standard microscopy slide of dimensions Lx1 equal to 76x25mm (3 "xl").
  • the arrangement of the chambers is such that a free space is provided at one end of the glass slide to affix a visual code 220 interpretable by a computer, such as a barcode or flashcode.
  • the functionalized blades are advantageously transparent at wavelengths compatible with blade analysis instruments. If the analysis instrument is an optical microscope, then the slides are advantageously made of glass or polymer transparent to the wavelengths visible by a human being.
  • each rank 1 1 0, 1 20, 1 30 is constituted by a particle sensor of interest 1 1 00, 1 200 comprising a cover 1 1 01, 1 201, having recesses 1 1 02, 1 202 for constituting the chambers, each recess being in fluid communication with a solution inlet 1 1 03, 1 203, and an outlet 1 1 04, 1 204 of solution .
  • the recesses have a thickness e (see Figure 4) determining the height of each chamber.
  • this thickness e is chosen equal to about 0.5 mm.
  • each of these chambers allows, nevertheless, a laminar flow and a reaction of the particles of interest with little liquid.
  • a blade is removably and hermetically mounted under the hood January 01, January 201 to form a bottom of the fluidic chambers, the blade comprising a surface facing the hood and covered with a functionalized area facing each recess.
  • the particle of interest sensor of Figure 3 is a sensor adapted to be placed in the first row. It directly integrates a solution tank 1. It comprises a hood 1 1 01 provided with a liquid supply channel 1 1 05 connected to the tank 1, and consisting of as many channel segments as the cover comprises recesses 1 1 02.
  • the segments of the channel of The feeds are of different sections and smaller and smaller in the liquid flow direction, each segment being in fluid communication with an inlet port 1103 for circulating the liquid in the chambers.
  • Such an arrangement allows diffusion and a homogeneous distribution of the liquid sample in each of the fluid chambers of the first row.
  • FIG. 3 A sectional view of the exemplary embodiment of FIG. 3 is illustrated in FIG.
  • the particle sensor 1 1 00 comprises a blade 1 1 06, preferably made of glass or silicon, one side of which is functionalized by means of recognition molecules, adapted to the particles that it is desired to capture in the liquid.
  • the particles captured at rank 1 are not the particles of interest, but other particles, the rank 1 at least serving to capture the uninteresting particles to "filter” the sample for, in somehow purify it and allow the capture of the particles of interest in the last row (see from a previous rank, according to the number of ranks).
  • a seal January 07 is disposed on the blade January 1 06. It is provided with four openings each delimiting the contour of a laminar flow chamber January 1 02.
  • the cover January 01 is disposed above the seal January 1 07 and comprises a feed channel 1 1 05 to feed each chamber 1 1 02 in liquid, and lines 1 1 04 of liquid outlet (not shown on the Figure 1 9) out of each of the chambers.
  • the feed channel 110 is provided with as many channel segments as the seal comprises apertures.
  • the feed channel 110 comprises four channel segments 1105a, 110b, 110c, 1105d.
  • the feed channel 110 is provided with liquid acceleration means along the channel.
  • the acceleration means consist of
  • the four segments 1 1 05a, 1 1 05b, 1 1 05c, 1 1 05d of the feed channel each having different sections, the sections being smaller and smaller in the direction of flow of the liquid, according to the arrow F l .
  • These different sections are a means of acceleration of the liquid to maintain substantially constant speed of the liquid along the feed channel 1 1 05, which ensures a homogeneous distribution and circulation of the particles of interest in each chamber.
  • the supply channel comprises means for accelerating the fluid so that the average velocities of the fluid, upstream and downstream of a liquid intake duct in a given chamber. , remain substantially constant. This allows a homogeneous distribution of the particles between the chambers and within the same chamber and ensures the reproducibility of the experimental conditions between the different chambers of the same mesofluidic device.
  • each inlet pipe is disposed plumb with each section narrowing.
  • the sections are reduced from 1 nth of S to each channel segment.
  • the cover is transparent, and preferably consists of cycloolefin copolymer such as TOPAS® COC marketed by TOPAS Advanced Polymers.
  • the particle of interest sensor of Figure 4 is a sensor adapted to be placed from the second row to the last row.
  • FIG. 5 illustrates a second embodiment of a sorting device according to the invention, making it possible to stack the ranks of fluidic chambers and to reduce the length of the fluid connections between the different ranks.
  • the device 300 comprises, with reference to the position of use:
  • a lower cover 350 having as many outputs 35 1 as the first cover 3 1 0 comprises inputs 3 1 3.
  • the recesses 31 2 and the spacer 340 have a thickness e determining the height of each chamber.
  • this thickness e is chosen equal to about 0.5 mm.
  • Such a device is compact and easy to implement.
  • the device 300 comprises an additional spacer 340, and an additional functionalized blade 360.
  • the upper and lower cowlings 350, as well as the spacers 340 comprise shoulders, respectively 3 1 4, 35 1, 341 and 342 allowing the blades 320, 330 to be wedged laterally. and 360.
  • a holding means may be provided to hold the assembly in position so that the spaces between the blades, the spacers and the covers are sealed.
  • FIG. 7 A simpler embodiment is illustrated in Figures 7 and 18, wherein the spacers are seals 400 arranged between the functionalized areas of the blades to define the fluid chambers.
  • the seal has a broad meaning. It may consist of several independent loops, that is to say not connected to each other, but each defining the contour of a laminar flow chamber. However, it is more practical that the seal consists of a single piece comprising several openings, that is to say forming several loops connected together.
  • This second Embodiment is illustrated in FIG. 8. In this FIG. 18, covers 311 and 350 are not illustrated.
  • the functionalized blades may advantageously be made of polymer to allow drilling holes 322-332.
  • a device makes it possible to implement a method of selective, specific and simultaneous sorting of target cells in a biological sample, comprising the following steps:
  • step a) consists of:
  • the functionalized surfaces of the first-rank chambers are provided with molecules capable of selectively binding with one or more different cell population (s) of the sample of the target cells;
  • the functionalized surfaces of the chambers of the last row and, optionally of the intermediate row or rows, are provided with different types of molecules capable of selectively binding with a population (s) of target cells.
  • the first rank can be advantageously functionalized with antibodies having an affinity with leukocytes to rid the sample of this type of cells.
  • the positive selection can be done for example in the second row, by functionalizing the N fluidic chambers with antibodies having an affinity for different types of rare cells to trap.
  • a negative selection according to the invention makes it possible to "clean" the sample before making a positive selection.
  • a negative and positive selection can be made in a single operation, that is to say in a single passage of the sample in the device.
  • the surface functionalized by the GPTS is perfectly hydrophilic and retains 1) its properties of physical stability in shear and temperature, 2) its properties of chemical resistance to UV and hydrolysis at pH 7.4, and 3) the preservation of biological properties of protein ligands grafted onto GPTS chains.
  • Antibodies are coupled directly to the self-assembled monomolecular layer of GPTS silanes. The native properties of the specific antibodies are fully conserved on the GPTS silane monolayer.
  • the leucocytes are eliminated, by negative selection, by capture at rank 1 on the microscopy slide by means of an anti-CD45 antibody grafted onto the surface functionalized by the GPTS (Multiplex distributor I with a reservoir, Ch 1 to Ch 4: FIG. 3, Table I).
  • each laminar flow chamber at rank 2 composing the particle of interest sensor is grafted with specific antibodies according to each subpopulation as follows (FIG. 4, Table 2):
  • Chamber 1 the anti-EpCAM antibody to selectively and specifically select cells of epithelial origin (CTC), Chamber 2) anti-N cadherin antibody to select, selectively and specifically, non-epithelial mesenchymal cells,
  • Chamber 3 anti-CD133 antibody to selectively and specifically select for cancer stem cells (CSCs), for example in colon cancer,
  • Chamber 4 and anti-CD44 antibody to select, selectively and specifically, cancer stem cells (CSCs), for example in colon cancer.
  • CSCs cancer stem cells
  • Ch (l) antibody anti-N-cadherin to selectively and specifically select non-epithelial mesenchymal cells
  • CTC epithelial origin
  • CSC cancer stem cells
  • Ch4 cancer stem cells
  • anti-CD133 antibody to select, selectively and specific cancer stem cells (CSCs), for example in colon cancer.
  • Circulating endothelial cells are biomarkers of vascular damage in inflammatory, immune, infectious, neoplastic and cardiovascular diseases.
  • An example of a method for detecting rare cell subpopulations includes cells of epithelial origin (CTC), non-epithelial mesenchymal cells, cancer stem cells (CSCs), and circulating endothelial cells (CEC).
  • the respective grafted antibodies are: anti-EpCAM for the epithelial tumor cell subpopulation (CTC), anti N Cadherin for the mesenchymal cell subpopulation, anti-CD1333 for the stem cell subpopulation cancer (CSC), and CD1 46 for the non-hematopoietic cell subpopulation (CEC) (Tables 4 and 5).
  • This series connection of the particles of interest sensors with a reservoir (rank 1, see FIG. 3), and particle-less interest sensors (see FIG. 4) allows, in a well-defined manner by the user, target four sub- populations of interest in a selective and specific and simultaneous way.
  • the device according to the invention overcomes the insufficiency of known detection methods using a single anti-EpCAM antibody.
  • a conventional detection with a single anti-EpCAM antibody can not under any circumstances detect at the same time the non-epithelial mesenchymal cells, neither the cancer stem cells nor the non-hematopoietic endothelial cells.
  • Two examples of selective and specific detection and simultaneous 1) a subpopulation of CTC of epithelial origin, and 2) a subpopulation of non-hematopoietic cells (circulating endothelial cells) by cellular protein markers in metastatic cancers. colon and prostate.
  • Negative selection leukocyte filtration
  • Anti-leukocyte anti-CD45 antibody targets the majority of leukocytes in the blood.
  • Figure 8 shows the high leucocyte population. Leukocytes are labeled with the DAPI nuclear marker.
  • the EpCAM antigen is a cell adhesion molecule expressed on the surface of the tumor cell of epithelial origin.
  • the CTCs are then identified by a cell marker expressing cytokeratin, the anti-pan cytokeratin antibody, in a buffer phosphate (PBS), containing 0.1% bovine serum albumin (BSA).
  • the characterization is performed by immunofluorescence to confirm the epithelial origin of the detected cell.
  • FIGS. 9 and 10 show a CTC 500, captured by the anti-EpCAM antibody (green fluorescence), originating either from a metastatic cancer of the colon (FIG. 9) or from a metastatic prostate cancer (FIG. 0).
  • the nuclear marker is DAPI (blue).
  • Non-hematopoietic cells circulating endothelial cell (CEC)
  • MCAM is a glycoprotein expressed on the surface of the endothelial cell.
  • anti-CD146 anti-CD146
  • GPTS phosphate buffer
  • Trehalose Trehalose
  • CECs are then identified by anti-CD144 antibody to VE-cadherin (Vascular Endothelial) in phosphate buffer (PBS), containing 0.1% bovine serum albumin (BSA).
  • BSA bovine serum albumin
  • Figures 1 1 and 1 2 show a CEC 10 from a metastatic cancer of the colon ( Figure 1 1) and a CEC of a metastatic prostate cancer ( Figure 1 2).
  • CECs are characterized by immunofluorescence by anti-CD114 antibody (violet fluorescence).
  • the nuclear marker is DAPI (blue).
  • Tumor cell (breast cancer, HER2
  • CSCs cancer stem cells
  • Tumor type Marker used for isolation of
  • Another major and user-friendly technical advantage of the device according to the invention relates to the unique development of the characterization of the cells of interest accompanied by a series of successive molecular analyzes.
  • the molecular characterization flow consists of a multi-step identification procedure on the same glass slide and the same cell, 1) using a fluorescent protein marker (antibody), 2) by analyzing the alterations genomic (gene amplifications, deletions, and rearrangements) by fluorescence in situ hybridization (FISH) using DNA specific probes, 3) in situ characterization of mRNAs by specific RNA probes and microRNAs (miRNAs) ) by nanoprobes.
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • EXAMPLE 3 VISUALIZATION OF GENOMIC ALTERATIONS IN CTP SUBPOLULATIONS BY IN FLUORESCENCE HYBRIDIZATION (FISH): GENE AMPLIFICATIONS, DELETIONS, REARRANGEMENTS, USING SPECIFIC DNA PROBES.
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • Figure 13 shows the nucleus 520 of a CTC of epithelial origin of a metastatic colon cancer showing gene amplification (round dashes 521) revealed by a probe targeting the EGFR gene (Kreatech, Holland).
  • Figure 14 shows the nucleus of an epithelial CTC 530 of metastatic prostate cancer showing gene amplification (53 1 round dots) revealed by PTEN probe (Kreatech, Holland). ).
  • Figure 15 shows the nucleus of a CTC 540 of epithelial origin of metastatic prostate cancer showing gene amplification (541, dashed 542 and gray 543 rounds) revealed by probe targeting the TMPRSS2-ERG fusion gene (Kreatech, Holland).
  • the device according to the invention can also be used for two particularly interesting applications:
  • the capture of living and unique cells by the device according to the invention and, in particular, the particles of interest sensors with and without a reservoir, is an asset for a simultaneous multiplex analysis of mRNA by means of nanoparticles functionalized with multiple nucleotide sequences and functioning as direct hybridization probes (Smart Flares, Merck-Millipore), each probe being coupled to a chromophore.
  • the second advantage is its application to the analysis of miRNAs in a single living cell (Smart Flares, Merck-Millipore).
  • MiRNAs are biomarkers of tumor progression.
  • FIG. 16 illustrates an exemplary labeling of MCF7 breast cancer living cells 560 by an endocytosis control probe for mRNA and miRNA labeling (Smart Flares, Merck-Millipore).
  • MCF7 breast cancer cells 560 are captured on a GPTS functionalized microscopy slide and grafted with the anti-EpCAM antibody. They are then labeled with a probe for endocytosis of the nanoparticles and incubated at 37 ° C. and 5% CO 2 for 12 hours.
  • the reservoirless particle of interest particle and its GPTS functionalized plate are sterilized in absolute ethanol for 3 minutes. After drying, the floor of each chamber is grafted with the anti-EpCAM antibody for the capture of MCF7 breast cancer cells.
  • the reservoirless particle of interest particle is then placed in a sterile Petri dish and incubated in an incubator at 37 ° C and 5% CO2 for 5 days. After 5 days, 570 clusters of MCF7 breast cancer cells developed ( Figure 17).
  • the great advantage of the method and of the device according to the invention is its capacity for selective and specific sorting, and simultaneous of all the heterogeneous subpopulations of circulating rare cells, whatever the stage of the disease (localized cancer or metastatic).
  • the user-friendliness of the device according to the invention allows 1) antibody grafts addressed to each sub-population of cells of interest, 2) high-performance molecular analyzes of the cells of interest thanks to the support of the glass slide resistant to multiple experimental manipulations, user friendly and low cost compared to Si supports.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

L'invention propose un dispositif et un procédé de tri sélectif, spécifique et simultané de cellules cibles rares dans un échantillon biologique, polyvalent et économique. À cette fin, le dispositif selon l'invention comprend : • Un premier rang (110) d'au moins deux chambres fluidiques (111) à flux laminaire comprenant chacune une entrée (112) connectée à un réservoir (1) d'une solution biologique, et une sortie (113); • Un dernier rang (130) de chambres fluidiques (131) à flux laminaire en nombre égal au nombre de chambres (111) du premier rang (110), chaque chambre fluidique (131) du dernier rang (130) comprenant : - une entrée (132) reliée à une sortie (113) d'une chambre (111) du premier rang (110); et - une sortie (133); • un réservoir de collecte de la solution, relié à chaque sortie (133) des chambres fluidiques du deuxième rang; • Au moins une pompe adaptée pour faire circuler un échantillon de la solution biologique dans les chambres fluidiques du premier rang puis du dernier rang; les chambres fluidiques à flux laminaire comprenant chacune une surface fonctionnalisée par des molécules dont au moins certaines sont aptes à former une liaison avec une molécule réceptrice portée par les cellules cibles.

Description

PROCÉDÉ ET DISPOSITIF DE TRI SÉLECTIF, SPÉCIFIQUE ET SIMULTANÉ DE CELLULES RARES CIBLES DANS UN ÉCHANTILLON BIOLOGIQUE.
L'invention concerne un procédé et un dispositif de tri sélectif, spécifique et simultané de cellules rares cibles dans un échantillon biologique.
Le domaine général concerné par l'invention est le domaine de la détection de cellules rares et leurs sous-populations hétérogènes dans un liquide biologique complexe (sang, moelle osseuse, ou autres, etc.). On entend par cellules « rares » des cellules cibles présentes dans un échantillon à une concentration comprise entre 1 et 1 0 cellules par millilitre (mL) d'échantillon comprenant 1 0* 1 09 cellules.
Plus spécifiquement, l'invention concerne le diagnostic/pronostic du cancer en Santé publique.
La mortalité associée aux tumeurs malignes est principalement due à la présence de métastases locorégionales distantes de la tumeur primitive. Le contrôle de la dissémination métastatique est un facteur important pour le pronostic de la maladie. Les applications qui en découlent comprennent le dépistage de populations à haut risque, le rendu d'informations prédictives de diagnostic, du pronostic, le traitement, la surveillance de la maladie ou de la réponse à un traitement, et l'optimisation d'un traitement ou développement d'une nouvelle thérapie en médecine moléculaire personnalisée.
Les cellules tumorales contenues dans le sang périphérique (CTC), ou dans les niches de moelle osseuse (DTC) de patients atteints d'un cancer, sont hétérogènes et composées de sous-populations de cellules d'origine épithéliale et de cellules non épithéliales : les cellules souches cancéreuses (CSC), les cellules mésenchymateuses, les cellules endothéliales non hématopoïétiques (CEC), etc.
La capacité à isoler, dénombrer et effectuer la caractérisation moléculaire des cellules tumorales disséminées dont les cellules tumorales d'origine épithéliale (CTC et DTC), les cellules tumorales d'origine non-épithéliales (cellules souches cancéreuses (CSC), cellules endothéliales non hématopoïétique (CEC), et les cellules mésenchymateuses, etc., contribuerait à l'amélioration de la prise en charge clinique des patients atteints de cancer pour le diagnostic précoce, l'évaluation du processus tumoral, et la réponse thérapeutique, y compris la résistance au traitement.
D'autres applications en médecine prédictive ciblent les mêmes besoins où, dans les mêmes conditions de fréquence cellulaire, l'invention s'adresse à la détection et la caractérisation des cellules souches diverses et des cellules foetales dans le sang maternel pour le diagnostic anténatal et les anomalies génétiques, etc.
En veille médicale, l'invention peut s'appliquer à la surveillance de patients à risque d'infarctus du myocarde par la détection et le suivi de l'altération des cellules endothéliales circulantes non hématopoïétique (CEC), à la surveillance post-vaccinale, au suivi de maladies auto-immunes, etc.
Parmi les technologies proposées et publiées, on en distingue deux types :
I. Les méthodes de détection des cellules rares en une seule étape, avec ou sans l'apport d'un anticorps unique de détection ;
II. Les méthodes de détection des cellules rares en deux étapes associant des billes magnétiques (CellSearch).
Parmi les méthodes en une seule étape (I) il existe : l-i) une technique d'immuno-sélection par des billes magnétiques greffées avec un anticorps unique de reconnaissance cellulaire, CellSearch, développée par Veridex, Pohnson & Johnson), et validée par la Foods and Drugs Administration (FDA) (Cristofanilli, M et al. 2004). Toutes les études sont faites à l'aide d'un anticorps unique dirigé contre la molécule d'adhérence des cellules épithéliales (anticorps anti-EpCAM) ;
l-ii) des systèmes microfluidiques comprenant : a) des microplots de Si greffés avec l'anticorps anti-EpCam par l'équipe de M Toner (CTC-chip, Nagrath S. et al. 2007 ; Herringbone chip, Stott SL et al. 201 0),
b) un dispositif associant les billes magnétiques et la microfluidique pour trier les cellules (CTC-iChip, Ozkumur E et al. 201 3).
l-iii) une technique de séparation cellulaire, d'après un critère de taille, effectuée à l'aide de filtres avec des pores de diamètre 8 μηη (Wong NS et al. 2006). Cette démarche ne présente aucune sélectivité, étant donné la variabilité des tailles des cellules. Toutes les cellules tumorales ont des tailles variables.
I- iv) une plate-forme microfluidique avec une na no-structure d'oxide de graphène fonctionnalisée avec l'anticorps anti-EpCAM (Yoon HJ et al. 201 3).
Parmi les méthodes en deux étapes (II) il existe :
II- i) MagSweaper, une dérivation de la méthode de CellSearch utilisant des billes magnétiques greffées avec l'anticorps anti-EpCam (Talasaz AH et al. 2009) ;
ll-ii) un microsystème basé sur les propriétés rhéologiques des cellules (Tang SJ et al. 2009) ;
ll-iii) un dispositif microfluidique associant des colonnes de billes magnétiques nommé Ephesia (Saliba AE et al, 201 0) ;
ll-iv) une combinaison de la leukaphérèse avec le système CellSearch (Fischer
JC et al. 201 3) ;
ll-v) l'utilisation de la diélectrophorèse associée à CellSearch, appelée DEPArray (Peeters DJE et al. 201 3).
La limitation technique majeure de ces méthodes réside dans une détection unique et la caractérisation moléculaire d'une seule sous-population de cellules tumorales d'origine épithéliale (CTC et DTC), exprimant la molécule d'adhérence épithéliale EpCAM. De ce fait, aucune ne peut apporter une solution aux besoins médicaux pour la détection et la caractérisation moléculaire de multiples sous- populations hétérogènes de cellules d'origine épithéliales (CTC et DTC) et de cellules non épithéliales (CSC, cellules mésenchymateuses, CEC, etc.) .
En outre, aucune des techniques précédentes n'est compatible à la fois avec une caractérisation IF (immunofluorescence) suivie d'une caractérisation FISH (fluorescence in situ hybridization en anglais ; hybridation in situ en fluorescence).
De plus, toutes ces techniques nécessitent un volume de sang traité compris entre 5 et 1 0 mL, et aucune ne peut être utilisée avec un échantillon de sang congelé, de sorte qu'elles sont toutes très contraignantes en utilisation.
Enfin, seule la technique par filtration permet une détection d'agrégats.
Cependant ces techniques par filtration, de même que les billes magnétiques, sont peu sensibles à la détection de cellules tumorales circulantes d'un cancer localisé en raison de leur très faible concentration sanguine, quand elles sont inférieures à 30 CTC dans 7,5 mL de sang (méthode CellSearch, Veridex) . Seules les cellules circulantes de cancers métastasés peuvent être détectées par les techniques de filtration car leur concentration sanguine est très importante. Ces techniques souffrent donc d'une trop faible capacité de détection (environs une cellule pour 5 milliards de cellules), alors que le procédé selon l'invention permet une détection d'une cellule parmi 1 0 milliards de cellules. En vue des stratégies de médecine personnalisée, il est important que chaque sous-population de cellules rares soit caractérisée en fonction des critères de ciblage thérapeutique et de la réponse au traitement.
L'invention vise donc à proposer un dispositif et un procédé de tri de cellules cibles dans un échantillon biologique, sélectif, spécifique, simultané, polyvalent, économique, industrialisable c'est-à-dire permettant une détection et un comptage automatique, compatible à la fois avec une caractérisation IF et une caractérisation FISH, nécessitant un volume de sang inférieur à 5 mL, capable d'utiliser un échantillon de sang congelé, permettant une détection d'agrégats, et apte à être utilisé dans des instruments d'analyse existants.
Un objectif de la présente invention est donc également de pouvoir détecter des populations et des sous-populations cellulaires de cancers localisés circulant dans le sang grâce au ciblage de leur détection par des anticorps spécifiques.
À cette fin, l'invention a pour objet un dispositif mésofluidique de tri sélectif, spécifique et simultané de cellules cibles rares dans un échantillon biologique à une concentration comprise entre 1 et 1 0 cellules par millilitre (mL) d'échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend :
• Un premier rang d'au moins deux chambres fluidiques à flux laminaire comprenant chacune une entrée connectée de manière fluidique à un réservoir d'une solution biologique, et une sortie ;
• Un dernier rang de chambres fluidiques à flux laminaire en nombre égal au nombre de chambres du premier rang, chaque chambre fluidique du dernier rang comprenant :
- une entrée reliée de manière fluidique à une sortie d'une chambre du premier rang ; et
- une sortie ;
• Au moins un réservoir de collecte de la solution, relié de manière fluidique à chaque sortie des chambres fluidiques du deuxième rang ;
• Au moins une pompe adaptée pour faire circuler un échantillon de la solution biologique dans les chambres fluidiques du premier rang puis du dernier rang ; les chambres fluidiques à flux laminaire comprenant chacune une surface fonctionnalisée par des molécules dont au moins certaines sont aptes à former une liaison avec une molécule réceptrice portée par les cellules cibles.
Selon d'autres modes de réalisation les surface fonctionnalisées des chambres du premier rang peuvent être munies de molécules capables de se fixer sélectivement avec une ou plusieurs population(s) cellulaire(s) de l'échantillon différentes des cellules cibles, et les surfaces fonctionnalisées des chambres du dernier rang et, éventuellement du ou des rangs intermédiaires, peuvent être munies de différents types de molécules capables de se fixer sélectivement avec une population(s) de cellules cibles ;
les chambres fluidiques du premier rang peuvent être reliées au réservoir par un canal d'alimentation en liquide unique, constitué d'autant de segments de canal que de chambres fluidiques, les segments du canal d'alimentation étant de sections différentes et de plus en plus petites dans le sens de circulation du liquide, chaque segment étant en communication fluidique avec un orifice d'entrée d'une chambre fluidique pour faire entrer le liquide dans chaque chambre ;
chaque rang peut être constitué par un capteur de particules d'intérêt comprenant :
- un capot comportant des renfoncements pour constituer les chambres, chaque renfoncement étant en communication fluidique avec un orifice d'entrée de solution, et un orifice de sortie de solution ;
- une lame montée de manière amovible et hermétique sous le capot pour constituer un fond des chambres fluidiques, et comprenant une surface, tournée vers le capot, recouverte d'une zone fonctionnalisée en regard de chaque renfoncement ;
le capteur de particules d'intérêt du premier rang peut comprendre un capot muni d'un canal d'alimentation en liquide, destiné à être relié au réservoir, et constitué d'autant de segments de canal que le capot comprend de renfoncements, les segments du canal d'alimentation étant de sections différentes et de plus en plus petites dans le sens de circulation du liquide, chaque segment étant en communication fluidique avec un orifice d'entrée pour faire circuler le liquide dans les chambres ; • le capot peut être transparent ;
• le capot peut être en copolymère cyclo-oléfine ;
• les entrées des chambres fluidiques de chaque rang à part du deuxième rang peuvent être reliées aux sorties des chambres fluidiques du rang précédent par des tubes de longueur inférieure à 5 cm, de préférence inférieure à 3 cm, et un diamètre interne compris entre 0,5 et 1 ,4 millimètre ;
• le dispositif peut comprendre, par référence à la position d'utilisation :
- un capot supérieur comportant un rebord plat et des renfoncements pour constituer les chambres du premier rang, chaque renfoncement étant en communication fluidique avec un orifice d'entrée de solution ;
- au moins deux lames fonctionnalisées, comprenant chacune une surface tournée vers le capot recouverte d'une zone fonctionnalisée en regard de chaque renfoncement, et percées d'autant d'orifices de sortie qu'il y a de zones fonctionnalisées ;
- au moins une entretoise destinée à être disposée hermétiquement entre deux lames fonctionnalisées, et comprenant autant de lumières que le capot supérieur comprend de renfoncement, chaque lumière définissant une chambre ;
- un capot inférieur comportant autant de sorties que le premier capot comprend d'entrées ;
• les lames fonctionnalisées peuvent être transparentes aux longueurs d'onde compatibles avec des instruments d'analyse des lames ; et/ou
• chaque lame peut comporter un code visuel interprétable par un ordinateur, le code comportant une information relative aux molécules des zones fonctionnalisée de la lame.
L'invention a également pour objet un procédé de tri sélectif, spécifique et simultané de cellules cibles rares dans un échantillon biologique à une concentration comprise entre 1 et 1 0 cellules par millilitre (mL) d'échantillon, comprenant les étapes suivantes : a) fonctionnaliser des lames avec des molécules capables de se fixer sélectivement avec une ou plusieurs population(s) cellulaire(s) sur différentes zones de la lame destinées à définir chacune un fond d'une chambre fluidique ;
b) équiper un dispositif précédent selon l'invention avec les lames ainsi fonctionnalisées ;
c) relier l'entrée des chambres du premier rang à un réservoir de solution contenant les cellules cible à trier, et la sortie des chambres du dernier rang à un réservoir de récupération ;
d) apparier de manière fluidique la sortie des chambres d'un rang avec l'entrée des chambres d'un autre rang jusqu'à ce que toutes les chambres soient reliées en série entre elles d'un rang à l'autre,
e) faire circuler l'échantillon biologique dans les chambres, depuis le premier rang jusqu'au dernier rang de manière à fixer des cellules cibles sur les molécules capables de se fixer sélectivement à ces cellules ;
f) analyser les surfaces fonctionnalisées des lames contenant les cellules cibles fixées à l'étape e).
Selon un autre mode de réalisation, l'étape a) peut consister à : a l ) fonctionnaliser les zones de la lame du premier rang avec des molécules capables de se fixer sélectivement avec une ou plusieurs population(s) cellulaire(s) la ou les plus nombreuse(s) dans l'échantillon considéré et différentes des cellules cibles ;
a2) fonctionnaliser les zone de la lame du ou des rang(s) suivant(s) avec différents types de molécules capables de se fixer sélectivement avec une population(s) de cellules cibles, chaque zone fonctionnalisée comportant un seul type desdites molécules.
Le dispositif et le procédé selon l'invention ont l'avantage de permettre un tri sélectif, spécifique et simultané, grâce à la combinaison d'une sélection positive avec une sélection négative des cellules et leurs sous-populations hétérogènes, par exemple, dans le sang périphérique et dans la moelle osseuse.
La versatilité du procédé et du dispositif selon l'invention permet le greffage d'un large spectre d'anticorps divers permettant en une seule étape une sélection positive et une sélection négative de cellules ciblées, sur chaque rang, constituant un immunocapteur mésofluidique muni de N chambres à flux laminaire indépendantes (N étant un entier avantageusement compris entre 4 et ό inclus), mises en parallèle, par exemple sur une lame de microscopie fonctionnalisée par des silanes.
Le procédé et le dispositif selon l'invention permettent de répondre à une problématique médicale de détection de sous-populations de cellules rares en oncologie, en médecine prédictive, en médecine régénérative, etc.
Ils permettent de détecter sélectivement dans chaque chambre à flux laminaire une à dix cellules rares caractéristiques d'une sous-population, dans un millilitre (mL) de sang contenant 1 0x1 09 cellules sanguines.
Les applications sont multiples : oncologie des tumeurs solides, hémopathies malignes etc.
Un intérêt majeur de la présente invention est qu'elle permet de répondre aux besoins médicaux dans le cas du cancer du sein triple négatif dont les cellules tumorales circulantes sont dépourvues de l'expression de l'antigène de surface EpCAM.
D'autres caractéristiques de l'invention seront énoncées dans la description détaillée ci-après, faite en référence aux dessins annexés, qui représentent, respectivement :
- la figure 1 , une vue schématique en plan d'un premier mode de réalisation d'un dispositif de tri de cellules cibles selon l'invention à trois étages ;
la figure 2, une vue schématique en plan d'une lame standard de microscopie à six zones fonctionnalisées ;
la figure 3, une vue schématique en perspective d'un exemple de réalisation d'un capteur de particules d'intérêt de premier rang ; la figure 4, une vue schématique en perspective d'un exemple de réalisation d'un capteur de particules d'intérêt de dernier rang ou de rang intermédiaire ; la figure 5, une vue schématique en coupe d'un deuxième mode de réalisation d'un dispositif de tri de cellules cibles selon l'invention à deux étages ;
la figure 6, une vue schématique en coupe du mode de réalisation d'un dispositif de tri de cellules cibles de la figure 5, avec un étage supplémentaire ;
la figure 7, une vue schématique en coupe d'un troisième mode de réalisation d'un dispositif de tri de cellules cibles selon l'invention à trois étages ;
la figure 8, une photographie d'une visualisation des marqueurs cellulaires par immunofluorescence d'une sélection négative de leucocytes ;
les figures 9 et 1 0, des photographies d'une visualisation des marqueurs cellulaires par immunofluorescence d'une sélection positive de cellules CTC ; les figures 1 1 et 1 2, des photographies d'une visualisation des marqueurs cellulaires par immunofluorescence d'une sélection positive de cellules CEC ; les figures 1 3 à 1 5, une photographie d'une visualisation des altérations génomiques dans des sous-populations de cellules CTC
la figure 1 6, une photographie d'un exemple de marquage de cellules vivantes du cancer du sein MCF7 par une sonde témoin d'endocytose en vue des marquages d'ARNm et de miARN ;
la figure 1 7, une photographie après 5 jours de culture cellulaire avec le capteur de particules d'intérêt sans réservoir selon l'invention ;
la figure 1 8, une vue schématique en perspective partielle du mode de réalisation d'un dispositif de tri de cellules cibles de la figure 7 ; et
la figure 1 9, une vue schématique en coupe du mode de réalisation d'un dispositif de tri de cellules cibles de la figure 3.
La figure 1 illustre un dispositif 1 00 de tri selon l'invention, comprenant un premier rang 1 1 0 de chambres fluidiques 1 1 1 munies chacune d'une entrée 1 1 2 connectée de manière fluidique à un unique réservoir 1 d'une solution biologique, et une sortie 1 1 3. Dans cet exemple de réalisation, ce premier rang comporte quatre chambres fluidiques 1 1 1 . Avantageusement, les chambres fluidiques 1 1 1 du premier rang sont reliées au réservoir par un canal d'alimentation en liquide unique, constitué d'autant de segments de canal que de chambres fluidiques 1 1 1 , les segments du canal d'alimentation étant de sections différentes et de plus en plus petites dans le sens de circulation du liquide, chaque segment étant en communication fluidique avec un orifice d'entrée d'une chambre fluidique 1 1 1 pour faire entrer le liquide dans chaque chambre. Comme ce sera décrit en relation avec les figures 3 et 1 9, ce canal est avantageusement porté par un capot rigide.
Le dispositif 1 00 comprend également, un deuxième rang 1 20 de chambres fluidiques 1 21 en nombre égal au nombre de chambres 1 1 1 du premier rang 1 1 0. Chaque chambre fluidique du deuxième rang comprend une entrée reliée de manière fluidique à une sortie d'une chambre du premier rang, et une sortie. En d'autres termes, si les chambres d'un même rang sont montées en parallèle, c'est-à- dire qu'elles ne communiquent pas entre elles, les chambres de deux rangs successifs sont montées en série, c'est-à-dire qu'elles communiquent de manière fluidique dans le sens de circulation de l'échantillon.
Le dispositif 1 00 comprend également un dernier rang 1 30 de chambres fluidiques 1 31 en nombre égal au nombre de chambres 1 1 1 du premier rang 1 1 0. Chaque chambre fluidique du dernier rang comprend une entréel 32 reliée de manière fluidique à une sortie d'une chambre du premier rang. Dans ce mode de réalisation, cette liaison fluidique est indirecte et se fait par l'intermédiaire des chambres 1 21 du deuxième rang.
Dans un mode de réalisation alternatif dans lequel il n'y aurait pas de rang intermédiaire (ici le deuxième rang), la liaison fluidique entre le dernier rang et le premier rang serait directe.
Les chambres fluidiques 1 31 du dernier rang comprennent également une sortie 1 33. Les sorties 1 33 du dernier rang sont reliées de manière fluidique à un réservoir de collecte non illustré sur la figure.
Les entrées des chambres fluidiques de chaque rang à partir du deuxième rang sont reliées aux sorties des chambres fluidiques du rang précédent par des tubes 2 de longueur inférieure à 5 cm, de préférence inférieure à 3 cm, et un diamètre interne compris entre 0,5 et 1 ,4 millimètres.
Ces dimensions diminuent le volume mort d'échantillon (partie de l'échantillon restant dans les tuyaux) ce qui permet de limiter les risques que des cellules rares restent dans les tuyaux et ne soient pas captées par les chambres fluidiques.
L'échantillon de liquide circule dans le dispositif depuis le réservoir de solution biologique 1 vers le réservoir de collecte en passant par les trois rangs de chambres fluidiques. Cette circulation est permise par une pompe (non illustrée). Cette pompe peut être configurée pour pousser et/ou pour aspirer le liquide à travers les rangs de chambres fluidiques.
Autrement dit, un débit est imposé dans chaque chambre par une pompe mise en oeuvre en amont et/ou en aval des chambres fluidiques. Selon un mode de réalisation préféré, la pompe est une pompe péristaltique à multiples canaux.
Les chambres fluidiques 1 1 1 , 1 2 1 , 1 3 1 comprennent chacune une surface fonctionnalisée par des molécules dont au moins certaines sont aptes à former une liaison avec une molécule réceptrice portée par les cellules cibles. Il peut avantageusement s'agir d'anticorps greffés sur des molécules de liaison avec la surface telles que des silanes.
Selon l'invention, les chambres présentent des dimensions à l'échelle mésofluidique et assurent un flux laminaire (c'est-à-dire sans turbulence).
L'échelle mésofluidique concerne des dispositifs dont les dimensions et configurations varient de quelques millimètres à un ou plusieurs centimètres. Ces dispositifs se distinguent des dispositifs microfluidiques dont au moins l'une des dimensions caractéristiques est de l'ordre du micromètre.
Le choix de cette échelle mésofluidique, grâce aux chambres à flux laminaire, permet de réduire les phénomènes rhéologiques encore mal maîtrisés en microfluidique. Un flux laminaire induit moins de contraintes sur les cellules qui peuvent être fragiles, et permet un recouvrement homogène de la surface fonctionnalisée par l'échantillon, une immobilisation douce des cellules, et une augmentation du rendement de capture de cellules.
Selon un mode de réalisation préféré illustré en figure 2, la surface fonctionnalisée 2 1 0 des chambres fluidiques est portée par une lame de verre 200, telle qu'une lame de microscopie standard de dimensions Lxl égale à 76x25mm (3"xl ").
Avec une lame 200 de cette dimension, on réalise, de préférence, quatre à six zones fonctionnalisées 2 1 0 (correspondant à quatre à six chambres fluidiques) présentant une forme oblongue circonscrite par un rectangle de longueur 1 ό mm et de largeur ό mm.
De préférence, l'agencement des chambres est tel qu'un espace libre est ménagé à l'une des extrémités de la lame de verre pour y apposer un code visuel 220 interprétable par un ordinateur, tel qu'un code-barres ou flashcode.
D'une manière générale, les lames fonctionnalisées sont avantageusement transparentes aux longueurs d'onde compatibles avec des instruments d'analyse des lames. Si l'instrument d'analyse est un microscope optique, alors les lames sont avantageusement en verre ou en polymère transparent aux longueurs d'ondes visible par un être humain.
Selon un mode de réalisation préféré illustré par exemple aux figures 3 et 4, chaque rang 1 1 0, 1 20, 1 30 est constitué par un capteur de particules d'intérêt 1 1 00, 1 200 comprenant un capot 1 1 01 , 1 201 , comportant des renfoncements 1 1 02, 1 202 pour constituer les chambres, chaque renfoncement étant en communication fluidique avec un orifice d'entrée de solution 1 1 03, 1 203, et un orifice de sortie 1 1 04, 1 204 de solution.
Les renfoncements présentent une épaisseur e (voir figure 4) déterminant la hauteur de chaque chambre. De préférence, cette épaisseur e est choisie égale à environ 0,5 mm. Avec une lame de microscopie 2 de taille standard et présentant quatre chambres de 1 6 mm de long et de ό mm de large, on obtient un capteur de particules d'intérêt présentant des chambres à flux laminaire de 48 mm3 chacune.
Le faible volume de chacune de ces chambres permet, néanmoins, un flux laminaire et une réaction des particules d'intérêt avec peu de liquide.
Une lame est montée de manière amovible et hermétique sous le capot 1 1 01 , 1 201 pour constituer un fond des chambres fluidiques, la lame comprenant une surface tournée vers le capot et recouverte d'une zone fonctionnalisée en regard de chaque renfoncement.
Le capteur de particules d'intérêt de la figure 3 est un capteur adapté à être placé au premier rang. Il intègre directement un réservoir de solution 1 . Il comprend un capot 1 1 01 muni d'un canal d'alimentation en liquide 1 1 05 relié au réservoir 1 , et constitué d'autant de segments de canal que le capot comprend de renfoncements 1 1 02. Les segments du canal d'alimentation sont de sections différentes et de plus en plus petites dans le sens de circulation du liquide, chaque segment étant en communication fluidique avec un orifice d'entrée 1 1 03 pour faire circuler le liquide dans les chambres. Un tel arrangement permet une diffusion et une répartition homogène de l'échantillon de liquide dans chacune des chambres fluidiques du premier rang.
Une vue en coupe de l'exemple de réalisation de la figure 3 est illustré en figure 1 9.
Le capteur de particules 1 1 00, comprend une lame 1 1 06, de préférence en verre ou en silicium, dont une face est fonctionnalisée au moyen de molécules de reconnaissance, adaptées aux particules que l'on souhaite capturer dans le liquide. Avantageusement, selon l'invention, les particules capturées au rang 1 ne sont pas les particules d'intérêt, mais d'autres particules, le rang 1 au moins servant à capturer les particules inintéressantes afin de « filtrer » l'échantillon pour, en quelque sorte le purifier et permettre la capture des particules d'intérêt au dernier rang (voir à partir d'un rang précédent, selon le nombre de rangs). Un joint 1 1 07 est disposé sur la lame 1 1 06. Il est muni de quatre ouvertures délimitant chacune le contour d'une chambre à flux laminaire 1 1 02.
Le capot 1 1 01 est disposé au-dessus du joint 1 1 07 et comprend un canal d'alimentation 1 1 05 pour alimenter chaque chambre 1 1 02 en liquide, et des conduites 1 1 04 de sortie du liquide (non illustrées sur la figure 1 9) hors de chacune des chambres.
Le canal d'alimentation 1 1 05 est muni d'autant de segments de canal que le joint comprend d'ouvertures. Dans l'exemple illustré, le canal d'alimentation 1 1 05 comprend quatre segments de canal 1 1 05a, 1 1 05b, 1 1 05c, 1 1 05d.
Le canal d'alimentation 1 1 05 est muni de moyens d'accélération du liquide le long du canal. Dans l'exemple de réalisation illustré en figure 1 9, les moyens d'accélération sont constitués par
Les quatre segments 1 1 05a, 1 1 05b, 1 1 05c, 1 1 05d du canal d'alimentation présentant chacun des sections différentes, les sections étant de plus en plus petites dans le sens de circulation du liquide, selon la flèche F l . Ces sections différentes constituent un moyen d'accélération du liquide permettant de maintenir sensiblement constante la vitesse du liquide le long du canal d'alimentation 1 1 05, ce qui assure une distribution et une circulation homogènes des particules d'intérêt dans chaque chambre.
Dans l'exemple de la figure 1 9, le canal d'alimentation comprend un moyen d'accélération du fluide de sorte que les vitesses moyennes du fluide, en amont et en aval d'une conduite d'admission du liquide dans une chambre donnée, restent sensiblement constantes. Ceci permet une répartition homogène des particules entre les chambres et au sein d'une même chambre et assure la reproductibilité des conditions expérimentales entre les différentes chambres d'un même dispositif mésofluidique.
De préférence, chaque conduite d'admission est disposée à l'aplomb de chaque rétrécissement de section. Ainsi, pour un dispositif mésofluidique selon l'invention à n chambres devant présenter un débit q dans chaque conduite d'admission de liquide dans une chambre, de section initiale S en amont des chambres, les sections sont réduites de 1 nième de S à chaque segment de canal.
Par exemple, pour le dispositif mésrofluidique à quatre chambres de la figure 1 9, le canal d'alimentation 1 1 05 présente un premier segment 1 1 05a de section S I , un deuxième segment 1 1 05b de section S2=3/4 de S I , un troisième segment 1 1 05c de section S3= 1 /2 de S I , et un quatrième segment 1 1 05d de section S4= l /4 de S I .
Grâce à ce changement de section particulier, la vitesse du fluide dans chaque segment reste sensiblement constante.
Avantageusement, le capot est transparent, et constitué, de préférence, en copolymère cyclo-oléfine tel que le TOPAS® COC commercialisé par la société TOPAS Advanced Polymers.
Le capteur de particules d'intérêt de la figure 4 est un capteur adapté à être placé à partir du deuxième rang jusqu'au dernier rang.
La figure 5 illustre un deuxième mode de réalisation d'un dispositif de tri selon l'invention, permettant un empilement des rangs de chambres fluidiques et une diminution de la longueur des connexions fluidiques entre les différents rangs.
Le dispositif 300 comprend, par référence à la position d'utilisation :
• un capot supérieur 31 0 comportant un rebord plat 31 1 et des renfoncements 31 2 pour constituer les chambres du premier rang, chaque renfoncement 31 2 étant en communication fluidique avec un orifice d'entrée de solution 31 3 ;
• deux lames fonctionnalisées 320-330, comprenant chacune une surface 321 - 331 tournée vers le capot recouverte d'une zone fonctionnalisée en regard de chaque renfoncement, et percées d'autant d'orifices de sortie 322-332 qu'il y a de zones fonctionnalisées. Ces orifices permettent la liaison fluidique entre les différents rangs de chambre et jouent le rôle des tubes 2 du mode de réalisation de la figure 1 ; • une entretoise 340 destinée à être disposée hermétiquement entre les deux lames fonctionnalisées 320-330, et comprenant autant de lumières que le capot supérieur comprend de renfoncement, chaque lumière définissant une chambre ; et
• un capot inférieur 350 comportant autant de sorties 35 1 que le premier capot 3 1 0 comprend d'entrées 3 1 3.
Les renfoncements 31 2 et l'entretoise 340 présentent une épaisseur e déterminant la hauteur de chaque chambre. De préférence, cette épaisseur e est choisie égale à environ 0,5 mm.
Un tel dispositif est peu encombrant et facile à mettre en oeuvre.
En outre, il est polyvalent car on peut facilement rajouter un étage de chambres fluidiques, comme cela est illustré en figure 6. Dans cette figure, le dispositif 300 comprend une entretoise 340 supplémentaire, et une lame fonctionnalisée 360 supplémentaire.
Dans les modes de réalisations des figures 5 et 6, les capots supérieurs 3 1 0 et inférieur 350, ainsi que les entretoises 340 comportent des épaulements, respectivement 3 1 4, 35 1 , 341 et 342 permettant de caler latéralement les lames 320, 330 et 360.
Un moyen de maintien peut être prévu pour maintenir l'ensemble en position de sorte que les espaces entre les lames, les entretoises et les capots soient étanches.
Un mode de réalisation plus simple est illustré en figures 7 et 1 8, dans lequel les entretoises sont des joints 400 agencés entre les zones fonctionnalisées des lames pour définir les chambres fluidiques.
Bien entendu, le joint s'entend au sens large. Il peut être constitué de plusieurs boucles indépendantes, c'est-à-dire non reliées entre elles, mais délimitant chacune le contour d'une chambre à flux laminaire. Cependant, il est plus pratique que le joint soit constitué d'une seule pièce comprenant plusieurs ouvertures, c'est-à-dire formant plusieurs boucles reliées entre elles. Ce deuxième mode de réalisation est illustré en figure 1 8. Sur cette figure 1 8, les capots 3 1 0 et 350 ne sont pas illustrés.
Pour la mise en oeuvre de ces modes de réalisation, les lames fonctionnalisées peuvent avantageusement être en polymère pour permettre le perçage des orifices 322-332. Par exemple, le polymère peut être un polymère en "silicone fonctionnalisée" (type PDMS = polydimethylsiloxane fonctionnalisé), du PMMA, etc., en gardant le GPTS comme agent de couplage pour des protéines (anticorps, etc.).
Un dispositif selon l'invention permet de mettre en oeuvre un procédé de tri sélectif, spécifique et simultané de cellules cibles dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes :
a) fonctionnaliser des lames avec des anticorps sur différentes zones de la lame destinées à définir chacune un fond d'une chambre fluidique ;
b) équiper un dispositif selon l'invention avec les lames ainsi fonctionnalisées ;
c) relier l'entrée des chambres du premier rang à un réservoir de solution contenant les cellules cible à trier, et la sortie des chambres du dernier rang à un réservoir de récupération ;
d) apparier de manière fluidique la sortie des chambres d'un rang avec l'entrée des chambres d'un autre rang jusqu'à ce que toutes les chambres soient reliées en série entre elles d'un rang à l'autre ;
e) faire circuler l'échantillon biologique dans les chambres, depuis le premier rang jusqu'au dernier rang ;
f) analyser les surface fonctionnalisées des lames contenant les cellules cibles rares.
Avantageusement, l'étape a) consiste à :
a l ) fonctionnaliser les zones de la lame du premier rang avec des molécules capables de se fixer sélectivement avec une ou plusieurs population(s) cellulaire(s) la ou les plus nombreuse(s) dans l'échantillon considéré et différentes des cellules cibles ; α2) fonctionnaliser les zone de la lame du ou des rang(s) suivant(s) avec différents types de molécules capables de se fixer sélectivement avec une population(s) de cellules cibles, chaque zone fonctionnalisée comportant un seul type desdites molécules.
On obtient ainsi un dispositif dans lequel :
• les surface fonctionnalisées des chambres du premier rang sont munies de molécules capables de se fixer sélectivement avec une ou plusieurs population(s) cellulaire(s) de l'échantillon différentes des cellules cibles ;
· les surfaces fonctionnalisées des chambres du dernier rang et, éventuellement du ou des rangs intermédiaires, sont munies de différents types de molécules capables de se fixer sélectivement avec une population(s) de cellules cibles.
De cette manière, on réalise une sélection négative au premier rang, c'est-à-dire une sélection de cellules différentes de celles que l'on souhaite trier in fine. Par exemple, s'il s'agit d'un échantillon sanguin, le premier rang peut être avantageusement fonctionnalisé avec des anticorps ayant une affinité avec les leucocytes pour débarrasser l'échantillon de ce type de cellules.
La sélection positive peut se faire par exemple au deuxième rang, en fonctionnalisant les N chambres fluidiques avec des anticorps ayant une affinité pour différents types de cellules rares à piéger.
Plus généralement, une sélection négative selon l'invention permet de « nettoyer » l'échantillon avant d'opérer une sélection positive.
Si plusieurs types de cellules doivent être éliminés par une sélection négative, il est possible de prévoir une fonctionnalisation adaptée des p premiers rangs. Ensuite, les rangs suivants sont fonctionnalisés pour opérer une sélection positive des cellules rares à piéger.
Grâce au dispositif selon l'invention, une sélection négative et positive peut être faite en une seule opération, c'est-à-dire en un seul passage de l'échantillon dans le dispositif.
Plusieurs exemples d'applications sont décrits ci-après : Une surface constituée d'une couche monomoléculaire autoassemblée de silanes à chaînes courtes et à terminaison époxyde, 3- glycidoxypropyl-trimethoxysilane (GPTS), est utilisée pour fonctionnaliser les lames standard de microscopie. La surface fonctionnalisée par le GPTS est parfaitement hydrophile et conserve 1 ) ses propriétés de stabilité physique en cisaillement et en température, 2) ses propriétés de résistance chimique aux UV et à l'hydrolyse à pH 7,4, et 3) la préservation des propriétés biologiques des ligands protéiques greffés sur les chaînes GPTS. Les anticorps sont couplés directement sur la couche monomoléculaire auto-assemblée de silanes GPTS. Les propriétés natives des anticorps spécifiques sont intégralement conservées sur la monocouche de silanes GPTS.
EXEMPLE 1 : GREFFAGE DES ANTICORPS EN SÉLECTION NÉGATIVE ET POSITIVE
Les leucocytes sont éliminés, en sélection négative, par capture au rang 1 sur la lame de microscopie au moyen d'un anticorps anti-CD45 greffé sur la surface fonctionnalisée par le GPTS (distributeur Multiplex I avec un réservoir, Ch l à Ch4 : Figure 3, Tableau I).
En sélection positive, sélective et spécifique, et simultanée, des sous- populations rares, chaque chambre à flux laminaire au rang 2 composant le capteur de particules d'intérêt est greffé au moyen d'anticorps spécifiques selon chaque sous- population comme suit (figure 4, Tableau 2) :
• Chambre 1 ) l'anticorps anti-EpCAM pour sélectionner, de façon sélective et spécifique, les cellules d'origine épithéliale (CTC), Chambre 2) l'anticorps anti-N cadhérine pour sélectionner, de façon sélective et spécifique, les cellules non épithéliales mésenchymateuses,
Chambre 3) l'anticorps anti-CD 1 33 pour sélectionner, de façon sélective et spécifique, les cellules souches cancéreuses (CSC), par exemple dans le cancer du côlon,
Chambre 4) et l'anticorps anti-CD44 pour sélectionner, de façon sélective et spécifique, les cellules souches cancéreuses (CSC), par exemple dans le cancer du côlon.
La même sélection positive, sélective et spécifique et simultanée des mêmes sous-populations peut être répétée au rang 3, identique au rang 2, pour renforcer la statistique de capture cellulaire (Tableau 2).
Alternativement, au rang 3, le greffage des anticorps dans le capteur de particules d'intérêt peut être interverti comme suit (Tableau 3) :
> Ch l ) l'anticorps, anti-N cadhérine pour sélectionner, de façon sélective et spécifique, les cellules non épithéliales mésenchymateuses,
> Ch2) l'anticorps, anti-EpCAM pour sélectionner, de façon sélective et spécifique, les cellules d'origine épithéliale (CTC), Ch3) l'anticorps, anti-CD44 pour sélectionner, de façon sélective et spécifique les cellules souches cancéreuses (CSC), par exemple dans le cancer du côlon, Ch4) et l'anticorps anti-CD l 33 pour sélectionner, de façon sélective et spécifique les cellules souches cancéreuses (CSC), par exemple dans le cancer du côlon.
VARIANTE
Des sous-populations rares, non hématopoïétiques, dans le sang périphérique présentent également un intérêt dans leur détection. Les cellules endothéliales circulantes (CEC) sont des biomarqueurs de dommages vasculaires dans les pathologies inflammatoires, immunes, infectieuses, néoplasiques et cardiovasculaires.
Un exemple de procédé de détection des sous-populations de cellules rares comprenant les cellules d'origine épithéliale (CTC), les cellules non épithéliales mésenchymateuses, les cellules souches cancéreuses (CSC), et les cellules endothéliales circulantes (CEC) . Les anticorps respectifs greffés sont : anti- EpCAM pour la sous-population des cellules tumorales d'origine épithéliale (CTC), anti N Cadhérine pour la sous-population des cellules mésenchymateuses, anti- CD l 33 pour la sous-population des cellules souches cancéreuses (CSC), et anti- CD1 46 pour la sous-population des cellules non hématopoïétiques (CEC) (Tableaux 4 et 5).
Ce montage en série des capteurs de particules d'intérêt avec un réservoir (rang 1 ; voir figure 3), et des capteurs de particules d'intérêt sans réservoir (voir figure 4) permet, de façon bien définie par l'utilisateur, de cibler quatre sous- populations d'intérêt de façon sélective et spécifique et simultanée. Le dispositif selon l'invention permet de pallier l'insuffisance des méthodes de détection connues utilisant un anticorps unique anti-EpCAM.
En effet, une détection classique avec un anticorps unique anti- EpCAM ne peut en aucun cas détecter en même temps les cellules non épithéliales mésenchymateuses, ni les cellules souches cancéreuses ni les cellules non hématopoïétiques endothéliales.
EXEMPLE 2 : VISUALISATION DES MARQUEURS CELLULAIRES PAR IMMUNOFLUORESCENCE
Deux exemples de détection sélective et spécifique et simultanée : 1 ) une sous-population de CTC d'origine épithéliale, et 2) une sous-population de cellules non hématopoïétiques CEC (cellules endothéliales circulantes) par des marqueurs protéiques cellulaires dans les cancers métastatiques du côlon et de la prostate.
1 . Sélection négative : filtration leucocytaire
L'anticorps anti-leucocytaire anti-CD45 cible la majorité des leucocytes dans le sang.
La Figure 8 visualise la forte population leucocytaire Le. Les leucocytes sont marqués par le marqueur nucléaire DAPI.
2. Sélection positive
A. CTC d'origine épithéliale
L'antigène EpCAM est une molécule d'adhérence cellulaire exprimée à la surface de la cellule tumorale d'origine épithéliale. Le greffage de l'anticorps anti-EpCAM sur une lame de microscopie standard fonctionnalisée par le GPTS (3-glycidoxypropyl-trimethoxysilane), dans un tampon phosphate (PBS), pH 7,4, contenant 0,5% Tréhalose (Sigma), permet de cibler l'identification des CTC d'origine épithéliale. Les CTC sont ensuite identifiées par un marqueur cellulaire exprimant la cytokératine, l'anticorps anti-pan cytokératine, dans un tampon phosphate (PBS), contenant 0, 1 % d'albumine du sérum bovin (BSA) . La caractérisation est réalisée par immunofluorescence pour confirmer l'origine épithéliale de la cellule détectée.
Les figures 9 et 1 0 montrent une CTC 500, capturée par l'anticorps anti-EpCAM (fluorescence verte), provenant soit d'un cancer métastatique du côlon (Figure 9), soit d'un cancer métastatique de la prostate (Figure 1 0). Le marqueur nucléaire est le DAPI (bleu).
B. Cellules non hématopoïétiques : cellule endothéliale circulante (CEC)
MCAM est une glycoprotéine exprimée à la surface de la cellule endothéliale. Le greffage de l'anticorps anti-MCAM (anti-CD 1 46) sur une lame de microscopie standard, fonctionnalisée par le GPTS (3-glycidoxypropyl- trimethoxysilane), dans un tampon phosphate (PBS), pH 7,4, contenant 0,5% Tréhalose (Sigma), permet de cibler leur identification et leur capture. Les CEC sont ensuite identifiées par l'anticorps anti-CD 1 44 dirigé contre la VE-cadhérine (Vascular Endothelial) dans un tampon phosphate (PBS), contenant 0, 1 % d'albumine du sérum bovin (BSA) . La caractérisation est réalisée par immunofluorescence pour confirmer la cellule endothéliale.
Les figures 1 1 et 1 2 montrent une CEC 5 1 0 provenant d'un cancer métastatique du côlon (Figure 1 1 ) et une CEC d'un cancer métastatique de la prostate (Figure 1 2). Les CEC sont caractérisées par immunofluorescence par l'anticorps anti-CD 1 44 (fluorescence violette). Le marqueur nucléaire est le DAPI (bleu).
Une liste non exhaustive des marqueurs pouvant être utilisés pour cibler les sous-populations cellulaires d'origine épithéliales et non épithéliales pour leurs caractérisations et leurs identifications est donnée ci-après :
Type cellulaire Marqueur(s) utilisé(s) pour l'isolement de sous-populations Épithélial EpCAM, BerEP4, MUC 1 ,
Mésenchymateux N Cadhérine, Cadhérine 1 1
Endothélial MCAM (CD 1 46), VE-cadhérine
(CD 1 44)
Leucocyte CD45
Lymphocyte T CD3
Lymphocyte B CD20
Cellule souche hématopoïétique CD34
Cellule souche mésenchymateuse CD44, CD45, CD90, CD 1 50, CD299
Cellule tumorale (cancer du sein, HER2
de la prostate)
Une liste des marqueurs pouvant être utilisés pour cibler les sous- populations de cellules souches cancéreuses (CSC) pour leurs caractérisations et leurs identifications est donnée ci-après :
Type de tumeur Marqueur(s) utilisé(s) pour l'isolement de
CSC
Hémopathies malignes CD34+, CD38-
Côlon CD 1 33+, CD44+, Lin-
Sein CD44+, CD24-/low
Mélanome Transporteur ABCB5
Prostate CD44+, CD 1 33+, α2β1
Pancréas CD44+, CD24+, CD 1 33+
Glioblastome CD 1 33+ Foie CD 1 33+, CD44+, CD90+
Poumon CD 1 33+
VADS CD44+
Un autre avantage technique majeur et convivial du dispositif selon l'invention porte sur le développement unique de la caractérisation des cellules d'intérêt accompagnée par une suite d'analyses moléculaires successives.
Le flux de caractérisation moléculaire consiste en une procédure d'identification, en plusieurs étapes, sur la même lame de verre et la même cellule, 1 ) au moyen d'un marqueur protéique fluorescent (anticorps), 2) par l'analyse des altérations génomiques (amplifications géniques, délétions, et réarrangements) par hybridation in situ en fluorescence (FISH) au moyen de sondes spécifiques d'ADN, 3) la caractérisation in situ des ARNm par des sondes spécifiques d'ARN et des micro-ARN (miARN) par des nanosondes.
EXEMPLE 3 : - VISUALISATION DES ALTÉRATIONS GÉNOMIQUES DANS LES SOUS- POPULATIONS DE CTC PAR HYBRIDATION IN SITU EN FLUORESCENCE (FISH) : AMPLIFICATIONS GÉNIQUES, DÉLÉTIONS, RÉARRANGEMENTS, AU MOYEN DE SONDES SPÉCIFIQUES D'ADN.
La valeur ajoutée de la lame de microscopie standard, fonctionnalisée pour la détection des sous-populations de CTC d'origine épithéliale et non épithéliale, est sa remarquable capacité de pouvoir subir de multiples traitements successifs comme :
1 ) le marquage des cellules d'intérêt par des marqueurs protéiques cellulaires fluorescents et son identification sous microscope,
2) un traitement spécifique est appliqué pour éliminer le bruit de fonds fluorescent, puis un reconditionnement des cellules d'intérêt détectées par le marquage des noyaux par des sondes nucléiques par hybridation in situ en fluorescence (FISH) pour identifier leurs altérations génomiques.
La figure 1 3 montre le noyau 520 d'une CTC d'origine épithéliale d'un cancer métastatique du côlon montrant une amplification génique (ronds en tirets 521 ) révélée au moyen d'une sonde ciblant le gène EGFR (Kreatech, Holland).
La figure 1 4 montre le noyau d'une CTC 530 d'origine épithéliale d'un cancer métastatique de la prostate montrant une amplification génique (ronds en tirets 53 1 ) révélée au moyen d'une sonde ciblant le gène PTEN (Kreatech, Holland).
La figure 1 5 montre le noyau d'une CTC 540 d'origine épithéliale d'un cancer métastatique de la prostate montrant une amplification génique (ronds en trait plein 541 , en tirets 542 et en grisé 543) révélée au moyen d'une sonde ciblant le gène de fusion TMPRSS2-ERG (Kreatech, Holland).
Le dispositif selon l'invention peut également être utilisé pour deux applications particulièrement intéressantes :
EXEMPLE 4 : L'ANALYSE SUR CELLULES VIVANTES DES ARNm ET DES miARN.
La capture de cellules vivantes et uniques par le dispositif selon l'invention et, en particulier, les capteurs de particules d'intérêt avec et sans réservoir, est un atout pour une analyse multiplex simultanée d'ARNm au moyen de nanoparticules fonctionnalisées par de multiples séquences de nucléotides et fonctionnant comme des sondes d'hybridation directes (Smart Flares, Merck- Millipore), chaque sonde étant couplée à un chromophore.
D'autre part, le deuxième atout est son application à destination de l'analyse des miARN dans une cellule vivante et unique (Smart Flares, Merck- Millipore). Les miARN sont des biomarqueurs de la progression tumorale.
Ce sont de nouveaux outils d'analyse pour compléter un diagnostic précoce, anticiper la progression de la maladie, identifier les patients à haut risque, prédire la récurrence après le traitement et surveiller la réponse du patient au traitement. La figure 1 6 illustre un exemple de marquage des cellules vivantes 560 du cancer du sein MCF7 par une sonde témoin d'endocytose en vue des marquages d'ARNm et de miARN (Smart Flares, Merck-Millipore). Les cellules 560 du cancer du sein MCF7 sont capturées sur une lame de microscopie fonctionnalisée par le GPTS et greffée avec l'anticorps anti-EpCAM. Elles sont ensuite marquées par une sonde témoin de l'endocytose des nanoparticules et incubées à 37°C et sous 5% de C02 pendant 1 2 heures.
EXEMPLE 5 : CULTURE CELLULAIRE AVEC LE CAPTEUR DE PARTICULES D'INTÉRÊT SANS RÉSERVOIR
Pour la mise en culture des cellules, le capteur de particules d'intérêt sans réservoir et sa lame fonctionnalisée GPTS sont stérilisés en éthanol absolu pendant 3 minutes. Après séchage, le plancher de chaque chambre est greffé avec l'anticorps anti-EpCAM pour la capture des cellules du cancer du sein MCF7. Le capteur de particules d'intérêt sans réservoir est ensuite mis dans une boîte de Pétri stérile et incubée dans un incubateur à 37°C et 5% C02 pendant 5 jours. Après 5 jours, des amas 570 de cellules du cancer du sein MCF7 se sont développés (Figure 1 7).
En résumé, le grand avantage du procédé et du dispositif selon l'invention est sa capacité de tri sélectif et spécifique, et simultané de toutes les sous- populations hétérogènes des cellules rares circulantes, quel que soit le stade de la maladie (cancer localisé ou métastatique). En outre, la convivialité du dispositif selon l'invention autorise 1 ) des greffages d'anticorps s'adressant à chaque sous- population de cellules d'intérêt, 2) des analyses moléculaires très performantes des cellules d'intérêt grâce au support de la lame de verre résistante aux multiples manipulations expérimentales, convivial et à faible coût par rapport à des supports en Si.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Dispositif (1 00) mésofluidique de tri sélectif, spécifique et simultané de cellules cibles rares dans un échantillon biologique à une concentration comprise entre 1 et 1 0 cellules par millilitre d'échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend :
• Un premier rang (1 1 0) d'au moins deux chambres fluidiques (1 1 1 ) à flux laminaire comprenant chacune une entrée ( 1 1 2) connectée de manière fluidique à un réservoir (1 ) d'une solution biologique, et une sortie (1 1 3) ;
• Un dernier rang ( 1 30) de chambres fluidiques (1 3 1 ) à flux laminaire en nombre égal au nombre de chambres (1 1 1 ) du premier rang (1 1 0), chaque chambre fluidique (1 3 1 ) du dernier rang (1 30) comprenant :
- une entrée ( 1 32) reliée de manière fluidique à une sortie (1 1 3) d'une chambre (1 1 1 ) du premier rang (1 1 0) ; et
- une sortie (1 33) ;
• Au moins un réservoir de collecte de la solution, relié de manière fluidique à chaque sortie (1 33) des chambres fluidiques du deuxième rang ;
• Au moins une pompe adaptée pour faire circuler un échantillon de la solution biologique dans les chambres fluidiques du premier rang puis du dernier rang ; les chambres fluidiques à flux laminaire comprenant chacune une surface fonctionnalisée par des molécules dont au moins certaines sont aptes à former une liaison avec une molécule réceptrice portée par les cellules cibles.
2. Dispositif selon la revendication 1 , comprenant au moins un rang intermédiaire (1 20) de chambres fluidiques (1 21 ) en nombre égal au nombre de chambres (1 1 1 ) du premier rang (1 1 0), chaque chambre fluidique (1 2 1 ) d'un rang intermédiaire (1 20) comprenant une entrée (1 22) reliée de manière fluidique à une sortie (1 1 3) d'une chambre du premier rang (1 1 0), et une sortie (1 23).
3. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel :
• les surface fonctionnalisées des chambres du premier rang sont munies de molécules capables de se fixer sélectivement avec une ou plusieurs population(s) cellulaire(s) de l'échantillon différentes des cellules cibles ; • les surfaces fonctionnalisées des chambres du dernier rang et, éventuellement du ou des rangs intermédiaires, sont munies de différents types de molécules capables de se fixer sélectivement avec une population(s) de cellules cibles.
4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel les chambres fluidiques (1 1 1 ) du premier rang sont reliées au réservoir par un canal d'alimentation en liquide unique, constitué d'autant de segments de canal que de chambres fluidiques (1 1 1 ), les segments du canal d'alimentation étant de sections différentes et de plus en plus petites dans le sens de circulation du liquide, chaque segment étant en communication fluidique avec un orifice d'entrée d'une chambre fluidique ( 1 1 1 ) pour faire entrer le liquide dans chaque chambre.
5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel chaque rang est constitué par un capteur de particules d'intérêt (1 1 00, 1 200) comprenant :
• un capot (1 1 01 , 1 201 ) comportant des renfoncements (1 1 02, 1 202) pour constituer les chambres, chaque renfoncement étant en communication fluidique avec un orifice d'entrée de solution ( 1 1 03, 1 203), et un orifice de sortie ( 1 1 04, 1 204) de solution ;
• une lame montée de manière amovible et hermétique sous le capot pour constituer un fond des chambres fluidiques, et comprenant une surface, tournée vers le capot, recouverte d'une zone fonctionnalisée en regard de chaque renfoncement.
6. Dispositif selon la revendication 5, dans lequel le capteur de particules d'intérêt (1 1 00) du premier rang comprend un capot muni d'un canal d'alimentation en liquide, destiné à être relié au réservoir, et constitué d'autant de segments de canal que le capot comprend de renfoncements, les segments du canal d'alimentation étant de sections différentes et de plus en plus petites dans le sens de circulation du liquide, chaque segment étant en communication fluidique avec un orifice d'entrée pour faire circuler le liquide dans les chambres.
7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6, dans lequel le capot est transparent.
8. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, dans lequel le capot est en copolymère cyclo-oléfine.
9. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel les entrées des chambres fluidiques de chaque rang à part du deuxième rang sont reliées aux sorties des chambres fluidiques du rang précédent par des tubes de longueur inférieure à 5 cm, de préférence inférieure à 3 cm, et un diamètre interne compris entre 0,5 et 1 ,4 millimètre.
1 0. Dispositif (300) selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant, par référence à la position d'utilisation :
• un capot supérieur (3 1 0) comportant un rebord plat (3 1 1 ) et des renfoncements (3 1 2) pour constituer les chambres du premier rang, chaque renfoncement étant en communication fluidique avec un orifice d'entrée (31 3) de solution ;
• au moins deux lames fonctionnalisées (320-330), comprenant chacune une surface (321 -33 1 ) tournée vers le capot recouverte d'une zone fonctionnalisée en regard de chaque renfoncement, et percées d'autant d'orifices de sortie (322- 332) qu'il y a de zones fonctionnalisées ;
· au moins une entretoise (340) destinée à être disposée hermétiquement entre deux lames fonctionnalisées (320-330), et comprenant autant de lumières que le capot supérieur comprend de renfoncement, chaque lumière définissant une chambre ;
• un capot inférieur (350) comportant autant de sorties (35 1 ) que le premier capot (3 1 0) comprend d'entrées (3 1 3).
1 1 . Dispositif selon la revendication 1 0, dans lequel les lames fonctionnalisées sont transparentes aux longueurs d'onde compatibles avec des instruments d'analyse des lames.
1 2. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 5 à 1 1 , dans lequel chaque lame comporte un code visuel (220) interprétable par un ordinateur, le code comportant une information relative aux molécules des zones fonctionnalisée de la lame.
1 3. Procédé de tri sélectif, spécifique et simultané de cellules cibles rares dans un échantillon biologique à une concentration comprise entre 1 et 1 0 cellules par millilitre (mL) d'échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) fonctionnaliser des lames avec des molécules capables de se fixer sélectivement avec une ou plusieurs population(s) cellulaire(s) sur différentes zones de la lame destinées à définir chacune un fond d'une chambre fluidique ;
b) équiper un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 1 2 avec les lames ainsi fonctionnalisées ;
c) relier l'entrée des chambres du premier rang à un réservoir de solution contenant les cellules cible à trier, et la sortie des chambres du dernier rang à un réservoir de récupération ;
d) apparier de manière fluidique la sortie des chambres d'un rang avec l'entrée des chambres d'un autre rang jusqu'à ce que toutes les chambres soient reliées en série entre elles d'un rang à l'autre,
e) faire circuler l'échantillon biologique dans les chambres, depuis le premier rang jusqu'au dernier rang de manière à fixer des cellules cibles sur les molécules capables de se fixer sélectivement à ces cellules ;
f) analyser les surfaces fonctionnalisées des lames contenant les cellules cibles fixées à l'étape e) .
Procédé selon la revendication 1 3, dans lequel l'étape a) consiste à :
a l ) fonctionnaliser les zones de la lame du premier rang avec des molécules capables de se fixer sélectivement avec une ou plusieurs population(s) cellulaire(s) la ou les plus nombreuse(s) dans l'échantillon considéré et différentes des cellules cibles ;
a2) fonctionnaliser les zone de la lame du ou des rang(s) suivant(s) avec différents types de molécules capables de se fixer sélectivement avec une population(s) de cellules cibles, chaque zone fonctionnalisée comportant un seul type desdites molécules.
EP15816812.0A 2014-11-12 2015-11-10 Procédé et dispositif de tri sélectif, spécifique et simultané de cellules rares cibles dans un échantillon biologique Withdrawn EP3218111A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1460912A FR3028318A1 (fr) 2014-11-12 2014-11-12 Procede et dispositif de tri selectif, specifique et simultane de cellules rares cibles dans un echantillon biologique
PCT/FR2015/053051 WO2016075410A1 (fr) 2014-11-12 2015-11-10 Procédé et dispositif de tri sélectif, spécifique et simultané de cellules rares cibles dans un échantillon biologique

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP3218111A1 true EP3218111A1 (fr) 2017-09-20

Family

ID=52423892

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP15816812.0A Withdrawn EP3218111A1 (fr) 2014-11-12 2015-11-10 Procédé et dispositif de tri sélectif, spécifique et simultané de cellules rares cibles dans un échantillon biologique

Country Status (4)

Country Link
US (1) US10717082B2 (fr)
EP (1) EP3218111A1 (fr)
FR (1) FR3028318A1 (fr)
WO (1) WO2016075410A1 (fr)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112996928A (zh) * 2018-09-11 2021-06-18 总医院公司 用于检测肝脏疾病的方法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3859425B1 (fr) 2015-09-17 2024-04-17 S.D. Sight Diagnostics Ltd. Méthodes et appareil de détection d'entité dans un échantillon corporel
CA3018536A1 (fr) 2016-03-30 2017-10-05 S.D. Sight Diagnostics Ltd Distinction entre les composants d'un echantillon de sang
EP3455610B1 (fr) 2016-05-11 2023-01-04 S.D. Sight Diagnostics Ltd. Porte-échantillon pour mesures optiques
EP3710810B1 (fr) * 2017-11-14 2023-09-06 S.D. Sight Diagnostics Ltd. Porte-échantillon pour mesures optiques
JP2023536737A (ja) 2020-08-04 2023-08-29 アボット・ラピッド・ダイアグノスティクス・インターナショナル・アンリミテッド・カンパニー Ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２を検出するためのアッセイ
WO2024011134A1 (fr) * 2022-07-05 2024-01-11 IsoPlexis Corporation Systèmes, dispositifs et procédés d'analyse multiplexée

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5637469A (en) * 1992-05-01 1997-06-10 Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and apparatus for the detection of an analyte utilizing mesoscale flow systems

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE0004351D0 (sv) * 2000-11-27 2000-11-27 Helen Andersson System och metod för tidstyrd vätskehantering för reaktioner och processer i ett mikrofluidiskt flödescellsystem
US20050009101A1 (en) * 2001-05-17 2005-01-13 Motorola, Inc. Microfluidic devices comprising biochannels
US20030235520A1 (en) * 2002-06-21 2003-12-25 Shea Laurence R. Array assay devices and methods of using the same
US7442342B2 (en) * 2002-06-26 2008-10-28 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Biochip holder and method of collecting fluid
DE10336849A1 (de) * 2003-08-11 2005-03-10 Thinxxs Gmbh Flusszelle
DE102005062377A1 (de) * 2005-12-23 2007-06-28 Bayer Technology Services Gmbh Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis von Mykotoxinen
WO2010111265A1 (fr) * 2009-03-24 2010-09-30 University Of Chicago Dispositif et procédés de puce coulissante
JP1628115S (fr) * 2012-10-24 2019-04-01

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5637469A (en) * 1992-05-01 1997-06-10 Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and apparatus for the detection of an analyte utilizing mesoscale flow systems

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112996928A (zh) * 2018-09-11 2021-06-18 总医院公司 用于检测肝脏疾病的方法

Also Published As

Publication number Publication date
FR3028318A1 (fr) 2016-05-13
US20180297024A1 (en) 2018-10-18
US10717082B2 (en) 2020-07-21
WO2016075410A1 (fr) 2016-05-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3218111A1 (fr) Procédé et dispositif de tri sélectif, spécifique et simultané de cellules rares cibles dans un échantillon biologique
Wang et al. Towards microfluidic-based exosome isolation and detection for tumor therapy
US11480575B2 (en) Methods, compositions and systems for microfluidic assays
US10018632B2 (en) Microfluidic devices for the capture of biological sample components
Zou et al. Advances in isolation and detection of circulating tumor cells based on microfluidics
CN105242004B (zh) 整体决策液份分级
US20110070581A1 (en) Separation of Leukocytes
US20130255361A1 (en) Methods and Devices for Multi-Dimensional Separation, Isolation and Characterization of Circulating Tumour Cells
CN112105912A (zh) 用于单生物纳米颗粒分析的方法和设备
CN111295578A (zh) 颗粒分离***和方法
US20150118728A1 (en) Apparatus and method for separating a biological entity from a sample volume
EP3207373A1 (fr) Procédé d'analyse du contenu de gouttes et appareil associé
JP2011163830A (ja) サイズ選択マイクロキャビティアレイを用いた循環腫瘍細胞の検出
CA3020964C (fr) Procede de detection et/ou de caracterisation de cellules tumorales et appareil associe
EP3210022B1 (fr) Procédé de détection d'organismes dans un échantillon dilué
EP1963859A1 (fr) Methode de discrimination d'au moins deux populations cellulaires et application
Onukwugha et al. Emerging micro-nanotechnologies for extracellular vesicles in immuno-oncology: From target specific isolations to immunomodulation
WO2022197253A1 (fr) Procédé de profilage d'activation de cellule sans marqueur à l'aide d'une cytométrie d'impédance microfluidique
Briones et al. The future of microfluidics in immune checkpoint blockade
EP3209792B1 (fr) Méthode de traitement d'échantillons biologiques, notamment d'échantillons alimentaires
Breton et al. A mesofluidic multiplex immunosensor for detection of circulating cytokeratin-positive cells in the blood of breast cancer patients
FR2941531B1 (fr) Dispositif microfluidique, systeme et procede de mise en oeuvre
Undvall Isolation of Circulating Tumor Cells with Acoustophoresis: Towards a biomarker assay for prostate cancer
Lee et al. Enrichment of circulating tumor cells using a centrifugal affinity plate system
Choi et al. Microfluidic Capture Device for Simple, Cell Surface Marker-Based Quantification of Senescent CD8+ T Cells

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20170512

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: BA ME

DAV Request for validation of the european patent (deleted)
DAX Request for extension of the european patent (deleted)
17Q First examination report despatched

Effective date: 20180718

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20200603