FR2941531B1

FR2941531B1 - Dispositif microfluidique, systeme et procede de mise en oeuvre

Info

Publication number: FR2941531B1
Application number: FR0900333A
Authority: FR
Inventors: Phuong Lan TRAN; Gilles Jean Pierre Regnier; Francois Jacques Romain Breton
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Ecole Normale Superieure de Cachan
Current assignee: PHUONG LAN TRAN, FR
Priority date: 2009-01-26
Filing date: 2009-01-26
Publication date: 2019-07-05
Anticipated expiration: 2029-01-26
Also published as: WO2010084273A1; FR2941531A1

Abstract

L'invention propose un dispositif microfluidique de réaction avec des particules d'intérêt (PI) présentes dans un liquide porteur mis en circulation par une pompe depuis un réservoir, permettant une utilisation en routine, selon une cadence d'analyse économique, avec une fiabilité améliorée, et permettant une logistique fiable au sein d'un laboratoire d'analyses. Le dispositif selon l'invention comprend un capot destiné à être disposé hermétiquement sur une lame dont une face est au moins partiellement fonctionnalisée de façon à faire réagir les particules d'intérêt, dans lequel le capot comprend : o un canal d'alimentation en liquide, destiné à être relié au réservoir, et muni de N segments de canal, N étant un entier supérieur ou égal à 2, chaque segment étant en communication fluidique avec au moins une conduite d'admission du liquide pour faire circuler le liquide dans N chambres, le canal d'alimentation étant muni de moyens d'accélération du liquide le long du canal ; et o N conduites de sortie du liquide hors des N chambres.

Description

DISPOSITIF MICROFLUIDIQUE, SYSTÈME ET PROCÉDÉ DE MISE EN ŒUVRE. L’invention se rapporte à un dispositif microfluidique, à un système et à un procédé de mise en œuvre.

Dans de nombreux domaines techniques, il est nécessaire de faire réagir certaines particules d’intérêt présentes dans un liquide complexe, c'est-à-dire présentant de nombreux types de particules.

Par exemple, on peut chercher à détecter des particules dangereuses présentes dans un liquide porteur. A cette fin, on cherche à faire réagir ces particules avec des molécules adaptées, de telle sorte que leur interaction provoque un signal, tel un changement de couleur, par exemple. On peut également chercher à neutraliser certaines particules d’un liquide en les faisant réagir avec des molécules de neutralisation adaptées. On peut enfin chercher à capturer des molécules d’intérêt, à l’aide de moyens de capture, pour les analyser ultérieurement.

Dans la suite de la description, on entend par réaction toute interaction entre une molécule d’intérêt et une molécule adaptée. L’interaction peut être la formation d’une liaison covalente ou non. Cette réaction peut donc permettre une capture, une modification chimique ou une modification stérique des particules d’intérêt.

On entendra par « liquide », dans la suite de la description, le liquide porteur ainsi que les particules qu’il contient, y compris les particules d’intérêt.

Un exemple particulier est la capture de cellules tumorales circulantes (CTC) présentes dans des échantillons sanguins de personnes souffrant d’un cancer.

Ainsi, le cancer du sein est le cancer le plus fréquent chez la femme dont la principale cause de décès est due à l’invasion des métastases. La dissémination des cellules tumorales dans le sang périphérique est un événement précoce dans le processus de tumorigenèse. La détection et la caractérisation de CTC représentent un enjeu primordial pour le diagnostic et le pronostic de cette pathologie.

Trois techniques sont utilisées actuellement pour la détection des CTC : deux méthodes cytométriques : la séparation immunomagnétique et l’ultrafiltration cellulaire, et un dosage de marqueurs multiples utilisant la méthodologie RT-PCR en temps réel.

La séparation immunomagnétique utilise des billes magnétiques (CellServe System, Immunicon-Veridex), tandis que la filtration cellulaire fait appel à une membrane Poretics polycarbonate Track-Etch-type (PCTE) calibrée avec des pores cylindriques de 8 pm.

La complémentarité du dosage RT-PCR et des méthodes cytométriques a été démontrée dans une étude comparative par Ring AE et al (Détection of circulating épithélial cells in the blood of patients with breast cancer : comparaison of three techniques. AE Ring, L Zabaglo, MG Ormerod, IE Smith and M Dowsett. Brit J Cancer (2005) 92,906-912). Néanmoins, l’approche cytométrique offre un avantage par rapport au dosage RT-PCR : l’appréhension d’une cellule tumorale individuelle circulante. Sa caractérisation phénotypique et moléculaire permet, outre une meilleure compréhension de ses caractéristiques lors d’une récidive de la maladie et des mécanismes de résistance au cours du traitement, un ciblage thérapeutique plus approprié. Il y a cependant une nécessité impérative d’améliorer le rendement de capture des CTC.

Une technologie de détection a déjà été développée par la Demanderesse, et décrite dans le brevet FR2872912. Le dispositif, un immunocapteur microfluidique de cellules, comporte une chambre à flux laminaire de circulation des liquides, dont une paroi a été fonctionnalisée par une monocouche organisée de chaînes de silanes auto-assemblés, de façon à fixer des anticorps spécifiques capables de capturer une sous-population de cellules au sein d’un échantillon biologique, mis en circulation dans cette chambre.

Cet immunocapteur est performant mais il nécessite la fabrication d’une platine de microscopie spécialement adaptée.

En outre, la manipulation de cet immunocapteur est satisfaisante pour des expérimentations ponctuelles, mais il est nécessaire de démonter la plaque en verre ou en silicium à chaque nouvelle analyse. Or, pour obtenir des résultats significatifs, il est nécessaire de réaliser plusieurs répétitions de l’analyse, dans les mêmes conditions physico-chimiques et biologiques.

En démontant à chaque fois une plaque utilisée et en remontant une nouvelle plaque, le maintien des mêmes conditions physicochimiques et biologiques est délicat et nécessite beaucoup de précautions.

Cet immunocapteur est donc peu compatible avec la réalisation d’analyses aux cadences pratiquées dans les laboratoires d’analyses.

Or, la réalisation de tests en parallèle à partir d’une seule source de liquide et avec plusieurs immunocapteurs précédents pose des problèmes de circulation des liquides et, notamment, d’homogénéité de distribution des CTC entre les dispositifs.

En effet, des essais ont été réalisés avec des tubes en « Y » utilisés pour répartir du liquide comprenant des CTC entre plusieurs immunocapteurs à partir de la source de liquide. Or, on s’aperçoit que la quantité de liquide d’une part, et la quantité de CTC d’autre part, sont inégalement réparties entre les immunocapteurs (figure 1), et même au sein d’un même immunocapteur. En outre, lorsque l’on renouvelle l’expérience, on s’aperçoit que la distribution du liquide et des CTC est non seulement inégale, mais aussi aléatoire. Autrement dit, si un immunocapteur a reçu beaucoup de liquide et/ou beaucoup de CTC lors d’une première expérience, il peut en recevoir beaucoup moins lors d’une deuxième expérience. La mise en parallèle de plusieurs immunocapteurs avec des tubes en Y implique donc des problèmes de résistance capillaire incompatibles avec une bonne maîtrise de réaction des particules d’intérêt et donc une fiabilité satisfaisante du dispositif. En outre, un tel système nécessite beaucoup de matériels (pompes et conduites) et une quantité importante de liquide, dont une partie non négligeable est inutilisée puisque restant dans les conduites et dans les pompes. Cette quantité non négligeable de liquides définit le volume mort du système.

Pour tenter de résoudre ce problème, et afin d'optimiser la position de la source par rapport aux entrées des chambres en réduisant les volumes morts de liquide, la Demanderesse a réalisé un immunocapteur unique intégrant plusieurs chambres desservies par un canal d’alimentation unique à section constante. Or, un tel système génère également des phénomènes de résistance capillaire, privilégiant, de manière aléatoire, la circulation de liquide dans certaines chambres.

Pour éviter ce problème de mauvaise répartition des particules d’intérêt, une solution consiste à fournir autant de moyens de pompage identiques que de chambres afin de reproduire les expériences simultanément, et dans les mêmes conditions physico-chimiques et biologiques. Or, on s’aperçoit qu’un tel dispositif permet une meilleure répartition du liquide dans les chambres, mais ne permet pas une répartition homogène des particules d’intérêt.

Il ne semble donc actuellement pas possible de réaliser en parallèle plusieurs expériences, identiques ou non, de manière satisfaisante.

On pourrait envisager d’expliquer ce problème de répartition du liquide et des particules qu’il contient par un phénomène de sédimentation des particules dans le canal d’alimentation. En effet, les défauts de répartition dans les différentes chambres se posent pour des liquides, aqueux ou non, contenant des particules d’intérêt en dispersion ou en suspension : par exemple, des cellules, des microorganismes, des macromolécules, etc. Parmi les liquides concernés, on peut citer notamment le sang.

Cependant, compte-tenu des dimensions du dispositif et des vitesses d’écoulement mises en oeuvre dans les applications envisagées du dispositif selon l’invention, il n’est pas possible d’expliquer les différences de répartition par un phénomène de sédimentation des particules contenues dans le liquide, car ces particules n’ont physiquement pas le temps de sédimenter dans les conduites. La sédimentation n’est donc pas significative.

Or, la Demanderesse s’est aperçue que, de manière surprenante, la mauvaise répartition des particules dans les différentes chambres se pose pour certains liquides seulement, dans lesquels le liquide porteur présente une viscosité dynamique comprise entre environ 5.10‘4 Pa.s et environ 3.10-2 Pa.s, les particules d’intérêt présentent un diamètre compris entre environ 1pm (comme, par exemple des bactéries) et 25pm (comme par exemple des cellules, telles que des cellules tumorales), les particules d’intérêt et le liquide porteur présentent une différence de masse volumique, en valeur absolue, comprise entre environ 30 mg/mL et environ 3,5 g/mL.

Les valeurs de viscosité sont données pour une température de 37°C et à pression normale. Ainsi, à cette température, à cette pression et dans les même conditions de mesure de la viscosité dynamique du liquide précité, le sang présente une viscosité dynamique comprise entre environ 4.10'3 Pa.s et 2,5 χ 10'2 Pa.s selon sa composition. Dans ces mêmes conditions, la viscosité dynamique de l’eau a été mesurée à environ 0,7.10-3 Pa.s. et la viscosité dynamique d’un mélange d’eau et de 65% de glycérol a été mesurée à environ 3.10’2 Pa.s. Ce mélange simule un liquide aqueux comprenant une forte concentration de cellules. Cette dernière mesure a été réalisée avec un viscosimètre capillaire British-Standard U-tube de la société Cannon Instrument Company.

Ce problème se pose, plus particulièrement pour les liquides dans lesquels le liquide porteur présente une viscosité d’environ 1.10'3 Pa.s. Un tel liquide peut être un échantillon de sang dilué.

Le problème de répartition des particules se pose, plus spécialement pour les liquides dans lesquels les particules d’intérêt présentent un diamètre compris entre environ 15 pm et environ 25 pm.

Il se pose, plus notamment pour les liquides dans lesquels les particules d’intérêt et le liquide porteur présentent une différence de masse volumique, en valeur absolue, comprise entre environ 2 g/mL et 3 g/mL et, en particulier environ 2,5 g/mL.

La présente invention vise donc à proposer un dispositif permettant une diffusion homogène et reproductible d’un liquide précité dans plusieurs chambres en parallèle, utilisable en routine, selon une cadence rapide et dans des conditions économiques satisfaisantes, avec une fiabilité améliorée en réalisant en parallèle plusieurs expériences identiques ou non sur une grande surface de capture, limitant la quantité de liquide nécessaire, et permettant une logistique fiable au sein d’un laboratoire d’analyses. A cette fin, l’invention a pour objet un dispositif microfluidique de réaction avec des particules d’intérêt présentes dans un liquide mis en circulation par une pompe depuis un réservoir, comprenant un capot destiné à être disposé hermétiquement sur une lame dont une face est au moins partiellement fonctionnalisée de façon à faire réagir les particules d’intérêt présentes dans le liquide, le capot comprenant : o un canal d’alimentation en liquide, destiné à être relié au réservoir, et muni de N segments de canal, N étant un entier supérieur ou égal à 2, chaque segment étant en communication fluidique avec au moins une conduite d’admission du liquide pour faire circuler le liquide dans N chambres, le canal d’alimentation étant muni de moyens d’accélération du liquide le long du canal ; et ο N conduites de sortie du liquide hors des N chambres.

Selon d’autres modes de réalisation : • les moyens d’accélération du liquide peuvent être constitués par au moins deux segments du canal d’alimentation de sections différentes, les sections étant de plus en plus petites dans le sens de circulation du liquide ; • les conduites d’admission peuvent présenter un brusque élargissement de section dans le sens de circulation du liquide ; • le capot peut être transparent ; et/ou • le capot peut être en polymétacrylate de méthyle (PMMA). L’invention se rapporte également à un système de réaction avec des particules d’intérêt présentes dans un liquide provenant d’un réservoir, comprenant : une lame dont une face est au moins partiellement fonctionnalisée de façon à faire réagir les particules d’intérêt présentes dans le liquide ; un joint présentant une partie plane, destinée à être disposée hermétiquement sur la lame, et munie de N ouvertures définissant chacune une chambre à flux laminaire, N étant un entier supérieur ou égal à 2 ; un dispositif précédent, agencé de telle sorte que le capot est disposé hermétiquement sur la lame ; un réservoir de liquide en communication fluidique avec le canal d’alimentation du dispositif ; au moins un tube d’évacuation relié aux conduites de sortie du dispositif ; au moins une pompe contrôlant la circulation du liquide depuis le réservoir jusqu’aux conduites de sortie, via les N chambres du dispositif ; un capteur disposé de manière à permettre une analyse de la lame de verre lorsque le liquide a circulé dans les chambres.

Selon d’autres modes de réalisation : • le système peut comprendre, en outre, au moins un tube de circulation du liquide permettant de recycler le liquide depuis les conduites de sortie vers le réservoir ; • le système peut comprendre, en outre, un carter disposé, de manière hermétique entre le capot et le joint ; • le carter peut être en polyméthacrylate de méthyle (PMMA), en aluminium ou en alliage d’aluminium ; • le carter peut comprendre le réservoir de liquide ; • le joint peut être en polydiméthylsiloxane (PDMS) ; et/ou • le joint peut comprendre, en outre, une tige munie d’une partie tubulaire distale, assurant la liaison étanche entre le réservoir et le canal d’alimentation du capot. L’invention se rapporte également à un procédé de réaction avec des particules d’intérêt présentes dans un liquide provenant d’un réservoir, comprenant les étapes suivantes : - fournir un système de réaction précédent ; générer un écoulement du liquide dans le canal d’alimentation en communication fluidique avec au moins une conduite d’admission du liquide par chambre ; accélérer le liquide le long du canal d’alimentation ; évacuer le liquide hors de chaque chambre.

Selon d’autres modes de réalisation : • le procédé peut comprendre, en outre, une étape d’homogénéisation du liquide dans chaque conduite d’admission ; • le procédé peut comprendre les étapes suivantes : - fonctionnaliser une lame, de façon à faire réagir les particules d’intérêt (PI) présentes dans le liquide ; - fournir un joint présentant une partie plane munie de N ouvertures définissant chacune une chambre à flux laminaire, N étant un entier supérieur ou égal à 2 ; disposer hermétiquement le joint sur la lame, - fournir un capot comprenant un canal d’alimentation en liquide muni de N segments de canal chacun étant en communication fluidique avec au moins une conduite d’admission du liquide dans une chambre ; - disposer hermétiquement le capot sur le joint, - générer un écoulement du liquide dans le canal d’alimentation en communication fluidique avec au moins une conduite d’admission du liquide par chambre ; - accélérer le liquide le long du canal d’alimentation ; récupérer le liquide, à une sortie de chaque chambre ; • l’accélération du liquide peut être réalisée en diminuant la section du canal d’alimentation avant chaque conduite d’admission, les sections étant de plus en plus petites dans le sens de circulation du liquide ; • le liquide porteur peut présenter une viscosité, à 37°C, comprise entre environ ô.lO^Pa.s et environ 3.10'2Pa.s, les particules d’intérêt peuvent présenter un diamètre compris entre environ 1pm et 25pm, les particules d’intérêt et le liquide porteur peuvent présenter une différence de masse volumique, en valeur absolue, comprise entre environ 30 mg/mL et environ 3,5 g/mL ; • le liquide porteur peut présenter une viscosité d’environ 10'3 Pa.s ; • les particules d’intérêt peuvent présenter un diamètre compris entre environ 15 pm et environ 25 pm ; et/ou • les particules d’intérêt et le liquide porteur peuvent présenter une différence de masse volumique, en valeur absolue, comprise entre environ 2 g/mL et 3 g/mL et, en particulier d’environ 2,5 g/mL. D’autres caractéristiques de l’invention seront énoncées dans la description détaillée ci-après, faite en référence aux figures annexées qui représentent, respectivement : la figure 1, une vue schématique de dessus de deux immunocapteurs à chambre unique, mis en parallèle, alimentés par des tubes à dérivation en "Y", après circulation d'un liquide comprenant des cellules de cancer du sein MCF7 ; la figure 2, une vue schématique en coupe longitudinale d’un système selon l’invention pour la détection de particules d’intérêt à l’aide d’un dispositif selon l’invention ; la figure 3, une vue schématique en coupe transversale d’un immunocapteur du dispositif de la figure 2 selon la ligne II-II ; la figure 4, une photo d’une variante de réalisation de l’immunocapteur de la figure 2 démonté ; la figure 5, une vue schématique en coupe transversale vue de côté d’un premier mode de réalisation du canal d’alimentation du capot de l’immunocapteur selon l’invention ; la figure 6, une vue de dessus d’une lame obtenue après circulation d’un liquide comprenant des cellules de cancer du sein MCF7 dans un immunocapteur selon l’invention muni du canal d’alimentation de la figure 5; la figure 7, une vue schématique en coupe d’un deuxième mode de réalisation du canal d’alimentation du capot de l’immunocapteur selon l’invention ; la figure 8, une vue de dessus d'une lame obtenue après circulation d’un liquide comprenant des CTC dans un immunocapteur selon l’invention muni du canal d’alimentation de la figure 7 ; la figure 9, une vue schématique en perspective d’une variante d’un immunocapteur selon l’invention, muni d’un carter ; la figure 10, une vue de dessous de l’immunocapteur de la figure 9 ; la figure 11, une vue schématique en perspective d’un mode de réalisation d’un joint pour un immunocapteur selon l’invention ; la figure 12, une vue schématique partielle en vue de côté du joint de la figure 11 ; la figure 13, une vue schématique en perspective du montage de la lame sous le carter de l’immunocapteur de la figure 9 ; la figure 14, une vue schématique en perspective du montage du capot sur le carter de l’immunocapteur de la figure 9 ; et les figures 15 et 16, deux agrandissements partiels de la figure 14 selon deux angles différents, montrant un moyen de mise en position du capot sur le carter. L’exemple de système selon l’invention décrit en référence aux figures 2 à 16 est un immunocapteur destiné à la capture de CTC dans un échantillon de sang. Plus précisément, les CTC sont des cellules tumorales circulantes dans le sang périphérique d’un patient. L’immunocapteur 1 illustré à la figure 2, comprend une lame 2, de préférence en verre ou en silicium, dont une face 2a est fonctionnalisée au moyen de molécules de reconnaissance 3, adaptées aux particules d’intérêt que l’on souhaite capturer dans le liquide. Dans l’application décrite, la face 2a est modifiée chimiquement par des chaînes de silanes. Ces chaînes sont décrites dans le brevet FR2872912.

Un joint 4 est disposé sur la lame 2. Il est muni de quatre ouvertures 5 délimitant chacune le contour d’une chambre à flux laminaire.

Bien entendu, le joint s’entend au sens large. Il peut être constitué de plusieurs boucles indépendantes, c'est-à-dire non reliées entre elles, mais délimitant chacune le contour d'une chambre à flux laminaire. Cependant, il est plus pratique que le joint soit constitué d’une seule pièce comprenant plusieurs ouvertures, c'est-à-dire formant plusieurs boucles reliées entre elles.

Un capot 6 est disposé au dessus du joint et comprend un canal d’alimentation 7 pour alimenter chaque chambre en liquide, et des conduites 8 de sortie du liquide hors de chacune des chambres.

Plus particulièrement, le canal d’alimentation 7 est muni d’autant de segments de canal que le joint comprend d’ouvertures. Dans l’exemple illustré, le canal d’alimentation 7 comprend quatre segments de canal 7a, 7b, 7c et 7d. Chaque segment est en communication fluidique avec une conduite d’admission du liquide 9a, 9b, 9c et 9d dans une chambre.

Selon l’invention, le canal d’alimentation 7 est muni de moyens d’accélération du liquide le long du canal. Dans l’exemple de réalisation illustré en figure 2, les moyens d’accélération du liquide sont constitués par quatre segments du canal d’alimentation présentant chacun des sections différentes, les sections étant de plus en plus petites dans le sens de circulation du liquide, selon la flèche F1. Ce moyen d’accélération permet de maintenir sensiblement constante la vitesse du liquide le long du canal d’alimentation 7, et assure une distribution et une circulation homogènes des particules d’intérêt dans chaque chambre (voir figure 8). L’immunocapteur 1 est en communication fluidique avec un réservoir 10 de liquide 11. D’autre part, dans le mode de réalisation illustré en figure 2, chaque conduite de sortie 8 de l’immunocapteur 1 est connectée à une pompe 13 par l’intermédiaire d’une conduite d’évacuation 12. Selon une alternative illustrée en figure 4, chaque conduite de sortie 8 peut être connectée directement à la pompe 13.

On entend par pompe, tout moyen de pompage permettant de faire circuler le liquide dans le système et dans l’immunocapteur. Ainsi, par exemple, une seringue utilisée pour faire circuler le liquide est considérée comme une pompe au sens de la présente invention.

La pompe 13 contrôle la circulation du liquide 11 depuis le réservoir 10 jusqu’aux conduites de sorties 8 via les chambres de l’immunocapteur. La pompe 13 peut-être montée en pression, c’est-à-dire qu’elle pousse le liquide 11 depuis le réservoir 10 vers l’immunocapteur 1, ou en aspiration, c’est-à-dire qu’elle aspire le liquide par les conduites de sorties, ce qui aspire le liquide depuis le réservoir 10 vers l’immunocapteur 1.

Autrement dit, un débit est imposé dans chaque chambre par une pompe mise en oeuvre en amont ou en aval de l’immunocapteur. Selon un mode préféré d’utilisation, la pompe 13 est une pompe péristaltique à multiples canaux placée en aval de l’immunocapteur. Dans ce cas, chaque conduite de sortie de chaque chambre est connectée à un canal de la pompe. Lorsque la pompe est en aval de l’immunocapteur, elle fonctionne en aspiration. Ceci permet une meilleure évacuation des bulles de gaz présentes dans le liquide.

La pompe 13 peut simplement évacuer le liquide selon la flèche F2 ou bien, grâce à un tube de recirculation du liquide 14, recycler le liquide selon la flèche F3 depuis les conduites de sortie 8 vers le réservoir 10.

Un capteur 15 est disposé par rapport à l’immunocapteur de manière à permettre une analyse de la lame 2 lorsque le liquide a circulé dans les chambres. De préférence, le capteur 15 est un capteur optique qui peut être disposé au dessus du capot 6, comme illustré en figure 2, ou en dessous de la lame 2. Pour détecter les particules, la position du capteur peut nécessiter une transparence optique du capot.

Ainsi, grâce au dispositif de détection de particules d’intérêt précédent, et en particulier grâce à l’immunocapteur 1 selon l’invention, on génère un écoulement de liquide dans le canal d’alimentation de l’immunocapteur et on accélère le liquide le long de ce canal, de préférence avant qu’il n’entre dans chaque chambre, pour maintenir sa vitesse sensiblement constante le long du canal.

Grâce à ce procédé, la distribution du liquide et des particules d’intérêt qu’il contient est homogène dans chaque chambre. Autrement dit, l’invention permet de réaliser simultanément plusieurs expériences de capture, identiques ou non, de particules d’intérêt avec les mêmes conditions physico-chimiques et biologiques pour chaque répétition.

Le nombre N de chambres, et donc le nombre de répétitions, est un entier supérieur ou égal à 2.

Selon un mode de réalisation préféré, la lame 2 présente une taille standard de lame de microscopie, c’est-à-dire une taille de 76x25mm (3”x1”). Avec une lame de cette dimension, on réalise, de préférence, quatre chambres individuelles à flux laminaire présentant une forme oblongue circonscrite par un rectangle de longueur 16 mm et de largeur 6 mm.

Selon le mode de réalisation, illustré en figure 3, le joint 4 présente une partie plane 4a munie d’ouvertures 5 (une seule est visible sur la figure 3) définissant chacune une chambre à flux laminaire et des moyens 4c, 4d de maintien hermétique du capot 6 et de la lame 2. L’épaisseur « e » de la partie plane 4a du joint 4 détermine la hauteur de chaque chambre. De préférence, cette épaisseur e est choisie égale à environ 0,5 mm. Avec une lame de microscopie 2 de taille standard et présentant quatre chambres de 16 mm de long et de 6 mm de large, on obtient un immunocapteur présentant des chambres à flux laminaire de 48 mm3 chacune.

Le faible volume de chacune de ces chambres permet, néanmoins, un flux laminaire et une réaction des particules d’intérêt avec peu de liquide.

Le dispositif selon l’invention réalise donc une miniaturisation permettant de mener plusieurs analyses simultanément, avec un seul échantillon de liquide en petite quantité.

La figure 4 illustre une variante de réalisation de l’immunocapteur des figures 2 et 3 démonté.

Le joint 4 présente deux parties en C 4b entre lesquelles s’étend la partie plane 4a du joint.

Celle-ci est munie de cinq ouvertures 5 définissant chacune une chambre à flux laminaire.

Le joint présente ainsi deux rainures longitudinales 4c dans lesquelles le capot 6 doit être glissé, et deux rainure 4d dans lesquelles la lame 2 doit être glissée.

Le joint est en matière souple, telle que du polydiméthylsiloxane (PDMS). Les dimensions des rainures du joint sont calculées pour que le joint soit lui-même serré entre le capot et la lame une fois le système monté, de façon à assurer l’étanchéité de chaque chambre à flux laminaire.

Autrement dit, l’étanchéité des chambres à flux laminaire est assurée par le joint dont l’écrasement par le capot 6 et la lame 2 rend chaque chambre hermétique.

La lame 2 illustrée à la figure 4 présente cinq surfaces 2b fonctionnalisées de façon à fixer les particules d’intérêt 3 présentes dans le liquide. Par exemple, si l’on souhaite capturer des cellules tumorales de cancer du sein en culture, MCF7, on recouvre ces surfaces 2b, modifiées chimiquement par des chaînes de silanes, avec des anticorps anti-molécules d'adhérence de cellule épithéliale 3 reconnaissant l’antigène humain EpCAM exprimé à la surface des cellules MCF7.

Chaque surface 2b fonctionnalisée par les anticorps est destinée à être en regard de chaque ouverture 5 du joint 4.

Dans un mode de réalisation non illustré, il est possible que toute la face 2a de la lame 2 soit chimiquement modifiée par des chaînes de silane et fonctionnalisée par des anticorps. Cependant, les parties en contact avec le joint 4, c'est-à-dire toutes les parties du joint autres que les ouvertures 5, ne serviront pas à la capture des particules d’intérêt.

Le capot 6 présente cinq conduites 8 de sortie du liquide hors des chambres. Chaque conduite 8 est destinée à être connectée directement à une pompe 13. Selon une alternative illustrée en figure 2, chaque conduite de sortie 8 peut être connectée à la pompe 13 par l’intermédiaire d’une conduite d’évacuation 12.

Le capot 6 peut présenter des butées 6a pour positionner avec précision le capot dans les rainures 4c du joint 4.

Les moyens d’accélération (non visibles) du liquide le long du canal 7 permettent d’obtenir une répartition homogène des particules d’intérêt dans chaque chambre et sensiblement identique entre les chambres.

Un exemple d’un premier mode de réalisation d’un canal d’alimentation présentant de tels moyens d’accélération est illustré en figure 5. Le canal 7, présente quatre segments de canal 7a, 7b, 7c et 7d. Les segments 7a à 7c ont des sections identiques. Le segment 7d, le plus en aval par rapport au sens d’écoulement du liquide selon la flèche F4, présente une section inférieure à celle des segments 7a à 7c. Dans l’exemple illustré, ces derniers ont une section de 2 mm de diamètre, alors que le segment 7d a une section de 1 mm de diamètre. Ces dimensions sont choisies pour pouvoir appliquer un débit de 90 pL par minute par chambre avec une vitesse moyenne dans le canal de 19 mm par seconde. Chaque segment 7a à 7d est en communication fluidique avec une conduite, respectivement 9a, 9b, 9c et 9d, d’admission du liquide dans une chambre.

De préférence, comme illustré en figure 5, les conduites d’admission 9a, 9b, 9c et 9d présentent un brusque élargissement 15 de section dans le sens de circulation du liquide selon la flèche F5. Dans l’exemple illustré, les conduites d'admission présentent une section amont de 0,4 mm de diamètre, et une section aval de 0,8 mm de diamètre.

Ce brusque élargissement 15 perturbe l’écoulement dans les conduites d’admission des chambres et homogénéise la concentration des particules (PI ou CTC) dans ces conduites. Ceci est illustré dans la figure 6 qui représente une vue de dessus d'une lame obtenue après circulation d’un liquide comprenant des particules d’intérêt dans un immunocapteur muni du canal d’alimentation de la figure 5.

Il est également avantageux que le canal d’alimentation 7 se termine à l’aplomb de la dernière conduite d’admission, ici la conduite 9d. L’extrémité du canal d’alimentation 7 présente, avantageusement, un angle a d’environ 60° par rapport à l’axe du canal.

Un exemple du mode de réalisation du canal d’alimentation 7 des figures 2 et 3 est illustré en figure 7.

Le canal 7, présente quatre segments de canal 7a à 7d, chacun de sections différentes, les sections étant de plus en plus petites dans le sens de circulation du liquide selon la flèche F4. Dans l’exemple illustré, le segment 7a présente une section de 2 mm de diamètre, le segment 7b présente une section de 1,7 mm de diamètre, le segment 7c présente une section de 1,4 mm de diamètre et le segment 7d présente une section de 1 mm de diamètre, le débit, en utilisation, étant d’environ 90 pL/min.

La diminution de section le long du canal permet, en réponse à la diminution importante de débit dans le canal, de maintenir une vitesse de liquide quasi-constante. C’est en ce sens que l’on parle de « moyen d’accélération du liquide le long du canal ». Ceci est illustré dans la figure 8 qui représente une vue de dessus d’une lame obtenue après circulation d’un liquide comprenant des particules d’intérêt dans un immunocapteur muni du canal d’alimentation de la figure 7.

Des zones blanches W, sans capture cellulaire, illustrées à titre d’exemple, peuvent être la conséquence d’une fonctionnalisation non homogène de la surface de la lame.

Il est préférable que le joint 4 soit à usage unique pour éviter les fuites et obtenir des résultats précis.

Selon une variante de l’invention illustrée en figure 9, un immunocapteur 20 selon l’invention peut être muni d'un carter 21.

Dans cet exemple de réalisation, le carter 21 comprend un corps 210 muni d’un réservoir 211 et de moyens de maintien 212 d’un capot 6. Le carter comprend également des ouvertures 213 en nombre égal au nombre de chambres, ici quatre.

La figure 10 montre une vue de dessous de la variante de la figure 9. Le carter 21 comprend des moyens de maintien 214 d’une lame 2 fonctionnalisée.

De préférence, en face inférieure, le carter présente un épaulement 215 au niveau du bord des ouvertures 213 et entre les ouvertures.

Cet épaulement 215 est destiné à recevoir un joint 300 illustré en figure 11. Ce joint peut être réalisé par injection en surmoulage du carter, le rendant solidaire de ce dernier.

Celui-ci présente une partie plane 301 comprenant quatre boucles reliées entre elles et définissant quatre ouvertures 302. Le joint comprend, de manière optionnelle, une tige 303 munie d’une partie tubulaire distale 304, destinée à assurer la liaison étanche entre le réservoir 211 et le canal d’alimentation 7 du capot 6.

Le joint 300 présente une lèvre inférieure écrasable 305 (figure 12) destinée à entrer en contact avec la lame de verre pour assurer l’étanchéité entre la lame et le joint 300.

La face supérieure 306 du joint 300 est destinée à entrer en contact avec le carter 20 par l’épaulement 215.

Dans une première variante, non illustrée, le capot 6 présente une surface inférieure plane, destinée à être appliqué sur le carter 20. Cependant, dans cette variante, il est nécessaire de s’assurer que l’application entre le capot et le carter soit étanche. A cette fin, on peut prévoir un second joint adapté.

Dans une deuxième variante, plus avantageuse, le capot présente des contre-formes 6b (voir figure 14) adaptées aux ouvertures 213 du carter 20. En outre, les contre-formes ont une hauteur légèrement supérieure à l’épaisseur du carter de telle sorte que lorsque le capot 6 est positionné sur le carter 20, les contre-formes passent par les ouvertures 213 et écrasent les bords du joint 300.

Ainsi, le plancher des chambres à écoulement laminaire est constitué par la surface supérieure de la lame 2 modifiée chimiquement par des chaînes de silane, et fonctionnalisée par des anticorps, le mur des chambres est constitué par le bord des ouvertures 302 du joint, et le plafond des chambres est constitué par la surface des contre-formes du capot 6. L’ensemble est étanche grâce à l’écrasement du joint entre les contre-formes du capot 6, le carter 20 et la plaque de verre 2. D’autre part, le même joint 300 peut également assurer l’étanchéité entre le réservoir 211 et le canal d’alimentation 7 du capot 6 grâce à la partie tubulaire distale 304.

Le montage de l’immunocapteur de la figure 9 est illustré aux figures 13 à 16.

Ainsi, on positionne le joint 300 de telle sorte que sa partie plane 301 se trouve sous le carter 20. Lorsque le joint 300 comprend une tige 303, on passe la tige dans l’ouverture de passage (non représentée) de manière à positionner la partie tubulaire distale 304 contre l’ouverture 211a (figure 15) du réservoir 211.

Puis on insère, selon la flèche F6, la lame 2 de telle sorte que la face au moins partiellement fonctionnalisée soit en contact avec le joint 300. La lame 2 est maintenue en position grâce aux moyens élastiques 214.

Ensuite, on positionne le capot 6 sur le carter 20.

De préférence, le capot 6 et le carter 20 présentent des moyens de positionnement de type détrompeur pour éviter les erreurs d'assemblage. Dans l’exemple illustré aux figures 14 à 16, le capot 6 présente un téton 6c et le carter 20 présente une encoche 216 de forme complémentaire au téton 6c.

Ainsi, on engage le capot 6 sur le carter 20 selon la flèche F7 de manière à connecter le téton 6c et l’encoche 216. Puis on plaque le capot 6 sur le carter 20 selon la flèche F8 de manière à bloquer le capot 6 avec les moyens de blocage 212.

La capture de particules d’intérêt (PI) présentes dans le liquide 11 provenant du réservoir 211, nécessite, ensuite, de générer un écoulement du liquide dans le canal d’alimentation puis dans les conduites d’admission vers chaque chambre et, enfin de récupérer le liquide, à une sortie de chaque chambre.

Selon l’invention, le liquide est accéléré le long du canal d'alimentation, de préférence avant qu’il n’entre dans chaque conduite d’admission. L’accélération du liquide est réalisée, de préférence, en diminuant la section du canal d’alimentation avant chaque conduite d’admission, les sections étant de plus en plus petites dans le sens de circulation du liquide.

Le liquide peut également subir une étape d’homogénéisation dans chaque conduite d’admission.

Ainsi, l’immunocapteur selon l’invention présente une structure le rendant facilement manipulable, car il est rapide à monter et démonter. En outre, il est possible de le réaliser dans des dimensions standard pour une utilisation en routine, selon une cadence d’analyse rapide et dans des conditions économiques satisfaisantes. D’autre part, grâce aux multiples chambres et à la bonne homogénéité de distribution du liquide entre elles, l’immunocapteur selon l’invention permet de réaliser en parallèle plusieurs expériences, identiques ou non, de façon simultanée et dans des conditions physico-chimiques et biologiques identiques. La fiabilité des analyses est donc améliorée.

Enfin, l’ensemble peut porter des moyens d’identification lisibles par une machine, tels qu’un code barre ou une puce RFID. Ceci permet une logistique fiable au sein d’un laboratoire d’analyses. L’immunocapteur selon l’invention est particulièrement bien adapté à la détection de cellules tumorales circulantes (CTC) présentes dans un échantillon de sang.

Des tests ont permis de montrer que l’échantillon de sang pouvait comprendre jusqu’à cent millions de cellules nucléées sans que le fonctionnement de l’immunocapteur ne soit affecté.

Bien entendu, il conviendra d’adapter, en fonction des applications, les dimensions des segments du canal d’alimentation, des conduites d’admission et de l’ensemble des conduites de liquide en fonction du liquide utilisé, des particules d’intérêt à détecter et de leur concentration.

Les dispositifs de l’invention peuvent être utilisés dans toutes sortes d’applications, notamment pour faire du criblage haut débit et haut contenu de réactifs ;

En chimie, ils peuvent être utilisés pour faire des réactions, notamment pour mettre en œuvre des procédés de chimie combinatoire, des séparations, des extractions liquide-liquide, des tests de cristallisation et de solubilisation de molécules/particules minérales ou organiques.

Ils offrent la possibilité de synthétiser et de transporter des molécules organiques mais aussi des micro ou des nano particules organiques, minérales ou métalliques in situ (comme des latex ou des pigments colorés pour la cosmétique ou la peinture jusqu’à des nano particules fluorescentes).

Une autre application importante est la mise en œuvre de protocoles d’aide à la formulation (optimisation de mélanges chimiques pour accéder à une propriété physique et ou chimique donnée).

Ils peuvent être utilisés pour la construction de puces à ADN et de puces à protéines.

En biologie, ils permettent de faire des tests sur des cellules à l’intérieur d’un dispositif de l’invention. Ils peuvent servir à la détection de cellules rares dans un liquide biologique : - détection de CTC pour le diagnostic et le suivi thérapeutique ; - détection et purge de contaminants par les CTC dans les cellules souches ; - détection de cellules fœtales dans le sang maternel pour le diagnostic prénatal (facteur Rhésus, trisomie, anomalies génétiques ...).

Ils peuvent également servir à la détection de l’évolution de cellules pathologiques pour le diagnostic de maladies auto-immunes.

Ils peuvent aussi servir à la détection de l’évolution de cellules spécifiques post-vaccinales.

Ils peuvent aussi avoir des applications en microbiologie clinique, alimentaire ou environnementale comme la détection de pathogènes à partir d’échantillons variés (sang, aliments, eau...).

La sélection cellulaire par une surface fonctionnalisée dans un microsystème fluidique s’adresse particulièrement aux industries pharmaceutiques impliquées dans les domaines de diagnostic clinique à partir d’un prélèvement sanguin ou d’un liquide biologique.

Les dispositifs de l’invention peuvent aussi être utilisés pour l’étude des produits extraits/utilisés dans l’exploitation des gisements pétroliers (brut, liquides de forage, boues), des peintures, des crèmes cosmétiques ou encore des formulations alimentaires (contrôle qualité).

Le dispositif précédent est généralement utilisé dans un agencement tel que le canal d’alimentation et les conduites d’admission soient disposés à une hauteur supérieure par rapport aux chambres. Cet agencement est préférentiellement utilisé lorsque les particules d’intérêt présentent une masse volumique supérieure à celle du liquide porteur, dans les gammes de valeurs précédemment décrites.

Le système peut également fonctionner « retourné » : l’agencement est alors tel que le canal d’alimentation et les conduites d’admission soient disposés à une hauteur inférieure par rapport aux chambres. Dans ce cas, le liquide est aspiré vers le haut, c'est-à-dire vers les chambres. Cet agencement est préférentiellement utilisé lorsque le liquide porteur présente une masse volumique supérieure à celle des particules d’intérêt (les particules ont tendance à flotter sur le liquide), dans les gammes de valeurs précédemment décrites.

De nombreuses variantes et alternatives peuvent être apportées sans pour cela sortir de l’invention et notamment : • Les matériaux de réalisation du capot et du carter peuvent être de tous types pourvu qu’ils soient non cytotoxiques, et biocompatibles. Si une transparence optique est nécessaire pour permettre la détection optique des particules ou un confort de manipulation, un choix plus restreint de matériaux sera possible. Selon le mode de réalisation choisi, le capot est en polyméthacrylate de méthyle (PMMA) et le carter en polyméthacrylate de méthyle (PMMA), en aluminium ou en alliage d'aluminium. Le PMMA présente l’avantage de réduire la résistance capillaire du canal d’alimentation par rapport à un matériau tel que le PDMS. • le dispositif selon l’invention est également adapté pour faire réagir des particules d’intérêt différentes des CTC. Dans ce cas, la fonctionnalisation partielle ou totale d’une des faces de la lame doit être adaptée en fonction des particules d’intérêt et de la réaction que l’on souhaite obtenir : capture, réaction chimique ou stérique.

Claims

REVENDICATIONS

1. Dispositif microfluidique de réaction avec des particules d’intérêt (PI) présentes dans un liquide porteur mis en circulation par une pompe depuis un réservoir, comprenant un capot destiné à être disposé hermétiquement sur une lame dont une face est au moins partiellement fonctionnalisée de façon à faire réagir les particules d’intérêt présentes dans le liquide, caractérisé en ce que le capot comprend : o un canal d’alimentation en liquide, destiné à être relié au réservoir, et muni de N segments de canal, N étant un entier supérieur ou égal à 2, chaque segment étant en communication fluidique avec au moins une conduite d’admission du liquide pour faire circuler le liquide dans N chambres, le canal d’alimentation étant muni de moyens d’accélération du liquide tels que la vitesse du liquide le long du canal d’alimentation est maintenue sensiblement constante le long du canal ; et ο N conduites de sortie du liquide hors des N chambres.
2. Dispositif microfluidique selon la revendication 1, dans lequel les moyens d’accélération du liquide sont constitués par au moins deux segments du canal d’alimentation de sections différentes, les sections étant de plus en plus petites dans le sens de circulation du liquide.
3. Dispositif microfluidique selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel les conduites d’admission présentent un brusque élargissement de section dans le sens de circulation du liquide.
4. Dispositif microfluidique selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le capot est transparent.
5. Dispositif microfluidique selon la revendication 4, dans lequel le capot est en polymétacrylate de méthyle (PMMA).
6. Système de réaction avec des particules d’intérêt (PI) présentes dans un liquide provenant d’un réservoir, comprenant : - une lame dont une face est au moins partiellement fonctionnalisée de façon à faire réagir les particules d’intérêt présentes dans le liquide ; - un joint présentant une partie plane, destinée à être disposée hermétiquement sur la lame, et munie de N ouvertures définissant chacune une chambre à flux laminaire, N étant un entier supérieur ou égal à 2 ; un dispositif selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, agencé de telle sorte que le capot est disposé hermétiquement sur la lame ; un réservoir de liquide en communication fluidique avec le canal d’alimentation du dispositif ; au moins un tube d’évacuation relié aux conduites de sortie du dispositif ; au moins une pompe contrôlant la circulation du liquide depuis le réservoir jusqu’aux conduites de sortie, via les N chambres du dispositif ; un capteur disposé de manière à permettre une analyse de la lame de verre lorsque le liquide a circulé dans les chambres.
7. Système selon la revendication 6, comprenant, en outre, au moins un tube de circulation du liquide permettant de recycler le liquide depuis les conduites de sortie vers le réservoir.
8. Système selon l’une quelconque des revendications 6 ou 7, comprenant, en outre, un carter disposé, de manière hermétique entre le capot et le joint.
9. Système selon la revendication 8, dans lequel le carter est en polyméthacrylate de méthyle (PMMA), en aluminium ou en alliage d’aluminium.
10. Système selon l’une quelconque des revendications 8 ou 9, dans lequel le carter comprend le réservoir de liquide.
12. Système selon l’une quelconque des revendications 6 à 11, dans lequel le joint comprend, en outre, une tige munie d’une partie tubulaire distale, assurant la liaison étanche entre le réservoir et le canal d’alimentation du capot.
13. Procédé de réaction avec des particules d’intérêt (PI) présentes dans un liquide provenant d’un réservoir, comprenant les étapes suivantes : - fournir un système de réaction selon l’une quelconque des revendications 6 à 12 ; - générer un écoulement du liquide dans le canal d’alimentation en communication fluidique avec au moins une conduite d’admission du liquide par chambre ; - accélérer le liquide le long du canal d’alimentation de sorte que la vitesse du liquide le long du canal d’alimentation est maintenue sensiblement constante le long du canal ; - évacuer le liquide hors de chaque chambre.
14. Procédé selon la revendication 13, comprenant, en outre, une étape d’homogénéisation du liquide dans chaque conduite d’admission.
15. Procédé selon l’une quelconque des revendications 13 ou 14, comprenant les étapes suivantes : - fonctionnaliser une lame, de façon à faire réagir les particules d’intérêt (PI) présentes dans le liquide ; - fournir un joint présentant une partie plane munie de N ouvertures définissant chacune une chambre à flux laminaire, N étant un entier supérieur ou égal à 2 ; - disposer hermétiquement le joint sur la lame, - fournir un capot comprenant un canal d’alimentation en liquide muni de N segments de canal chacun étant en communication fluidique avec au moins une conduite d’admission du liquide dans une chambre ; - disposer hermétiquement le capot sur le joint, - générer un écoulement du liquide dans le canal d’alimentation en communication fluidique avec au moins une conduite d’admission du liquide par chambre ; accélérer le liquide le long du canal d’alimentation ; récupérer le liquide, à une sortie de chaque chambre.
16. Procédé selon la revendication 15, dans lequel l’accélération du liquide est réalisée en diminuant la section du canal d’alimentation avant chaque conduite d’admission, les sections étant de plus en plus petites dans le sens de circulation du liquide.
17. Procédé selon l’une quelconque des revendications 13 à 16, dans lequel le liquide porteur présente une viscosité, à 37°C, comprise entre environ 5.10'4Pa.s et environ 3.10'2Pa.s, les particules d’intérêt présentent un diamètre compris entre environ 1pm et 25pm, les particules d’intérêt et le liquide porteur présentent une différence de masse volumique, en valeur absolue, comprise entre environ 30 mg/mL et environ 3,5 g/mL.
18. Procédé selon la revendication 17, dans lequel le liquide porteur présente une viscosité d’environ 10'3 Pa.s.
19. Procédé selon l’une quelconque des revendications 17 ou 18, dans lequel les particules d’intérêt présentent un diamètre compris entre environ 15 pm et environ 25 pm.
20. Procédé selon l’une quelconque des revendications 17 à 19, dans lequel les particules d’intérêt et le liquide porteur présentent une différence de masse volumique, en valeur absolue, comprise entre environ 2 g/mL et 3 g/mL et, en particulier d’environ 2,5 g/mL.