EP3206791B1 - Procédé de manipulation de microgouttes incluant des échantillons - Google Patents

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EP3206791B1
EP3206791B1 EP14796828.3A EP14796828A EP3206791B1 EP 3206791 B1 EP3206791 B1 EP 3206791B1 EP 14796828 A EP14796828 A EP 14796828A EP 3206791 B1 EP3206791 B1 EP 3206791B1
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EP
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microdroplets
trapping
cells
oil
microdrops
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Charles Baroud
Gabriel AMSELEM
Sébastien SART
Raphaël TOMASI
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Polytechnique
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Polytechnique
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Publication date
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    • B01L2400/088—Passive control of flow resistance by specific surface properties

Definitions

  • the present invention relates to a microfluidic method for handling samples, in particular biological samples, in hydrogel microdrops.
  • the invention also relates to a device for implementing such a method and to a sample product obtained by implementing such a method.
  • microfluidics for high-throughput biological assays
  • Lab. Chip. 12 2012
  • drops in microfluidic systems can be used to contain chemical or biological reactions.
  • the content of these drops can be tested by observing the fluorescence of the drop as it passes a focused laser.
  • these systems do not make it possible to observe the evolution over time of the contents of these drops without extracting them from the microfluidic device.
  • hydrogel microbeads including cells are made in a first microfluidic system. They are then collected and washed in a bath, before being injected into a second microfluidic system comprising traps making it possible to fix the microdrops.
  • Such a method is however complex, which requires two separate microfluidic systems and three devices in total. Furthermore, it does not allow the samples to be observed continuously. In particular, it does not make it possible to observe the initial moments between the formation of the drops and their capture.
  • the invention provides a method of manipulation in a microfluidic system of microdrops including samples according to claim 1 or claim 2.
  • the microdrops which contain samples of interest - these microdrops are first of all trapped in surface tension traps (or capillary), then some of the microdrops or some of the oil around them are gelled.
  • the gelation of the microdrops or the oil that surrounds them facilitates sorting by increasing the trapping force of the microdrops in the traps. In other words, the gelation step makes it possible to prevent the microdrops of interest from being lost.
  • this gelation makes it possible to prevent microdrops from being able to merge, which would cause the samples of these microdrops to mix.
  • surface tension trap means a trap a zone of the microfluidic system whose geometry, with the interfacial tension of the microdrop, allows the microdrop to be held in position.
  • microfluidic system is understood to mean a system whose parts are manufactured using microfabrication processes. Such a system has conduits, at least one dimension of which is typically less than a millimeter.
  • the shape of the microdrop can be controlled. This control of the shape of the microdrop can be combined with the control of the instant of gelation of the microdrop or of a part of the oil surrounding it, to provide access to different applications, in particular on the manipulation of cells. .
  • cells By cells, is meant eukaryotic cells (for example plant cells, fungi, yeasts, mammalian cells) and prokaryotic cells (for example bacteria).
  • eukaryotic cells for example plant cells, fungi, yeasts, mammalian cells
  • prokaryotic cells for example bacteria.
  • anchor-independent cells e.g. certain blood line cells and highly transformed tumor cells
  • anchor-dependent cells the majority of other cell types
  • spheroids is understood to mean multicellular structures organized in the form of micro-tissues the functionalities of which are similar to those of tissues derived from organs.
  • the invention relates to a device according to claim 15 or claim 16.
  • the gelation means may comprise a device for injecting a chemical agent into the trapping zone.
  • the device may further comprise means for thawing at least some of the gelled hydrogel microdrops or part of the gelled oil, if applicable.
  • the invention also relates to a product of gelled microdrops according to claim 17.
  • This product includes a microdrop trapping zone, in particular a microfluidic chip, and gelled microdrops each including a sample, trapped in the trapping zone, the gelled microdrops being cryo-preserved.
  • the biochemical solution may contain cryo-protection agents (DMSO, glycerol, trehalose etc.) to allow the cryo-preservation of the samples.
  • cryo-protection agents DMSO, glycerol, trehalose etc.
  • the gelled microdrops can also be bathed in a fluid, preferably in an aqueous solution or in an oil, the fluid and the microdrops preferably being cryo-preserved.
  • the invention also relates to a microdrop product according to claim 18.
  • This product comprises a trapping zone, in particular a microfluidic chip, and microdrops each including a sample, trapped in the trapping zone, the microdrops bathed in a gelled oil, the microdrops and the gelled oil preferably being cryo-preserved.
  • the samples can be mammalian cells, preferably mammalian cells excluding human cells, bacteria, yeasts or other cells used in bioprocesses, molecules, beads trapping particles. molecules on the surface.
  • the invention relates to a method of handling hydrogel microdrops including test samples.
  • the aqueous solution is a hydrogel solution
  • the oil not comprising a gelling agent and where the last step above consists in gelling at least part of the microdrops. trapped, without the oil is not gelled.
  • the method can be continued by implementing different steps, depending on the test that one wishes to implement, in particular.
  • the method can in particular be continued with a step consisting in replacing the oil around the gelled microdrops, with an aqueous solution, without displacing the microdrops from the surface tension traps.
  • the aqueous solution may contain a biochemical solution with at least one of nutrients, growth factors, antibodies, drug molecules, and pH and / or salinity buffers.
  • the method allows the control of the three-dimensional shape of hydrogel beads in a microfluidic channel and / or in surface tension traps, with the primary application of the encapsulation of cells in these microdrops.
  • the encapsulation of cells in hydrogel allows their culture or analysis, while perfusing them with biochemical solutions, or by applying physical stimuli such as heat or light, for example.
  • gel is understood to mean a medium composed of a majority of liquid and containing molecules or particles which can be organized to give it a solid appearance, such as, for example, the absence of flow in its stable state.
  • This solution can be handled in a liquid state and can then be "gelled” by chemical or physical means. Gelation can be reversible in some cases. When the liquid is water, we talk about hydrogel.
  • the proposed microfluidic process comprises a first step of forming hydrogel microdrops containing biological cells in an oil.
  • the microdrops (or microspheres) have a diameter of the order of one micrometer, in particular a diameter of between 10 and 1000 micrometers.
  • the hydrogel is for example an aqueous solution comprising a gelling agent.
  • the gelling agent is chosen by the user depending on the application.
  • An example of a gelling agent which can be gelled in a physical manner is agarose, which is liquid at room temperature and which gels at low temperature.
  • a gelling agent which can be chemically gelled is, for example, alginate, liquid in solution and which gels when calcium ions Ca 2+ are supplied.
  • the biochemical and biomechanical properties of the hydrogel can allow cells sensitive to the anchorage to establish specific interactions with the matrix thus formed. These interactions are essential for the survival of anchor-dependent mammalian cells and participate in the regulation of their phenotype.
  • the nature of the matrix may, for example, make it possible to observe cell migration or proteolysis (digestion of the matrix by the cells).
  • Particularly conclusive experiments have been carried out with agarose, alginate, PEG-DA (Polyethylene glycol Diacrylate), but also gelatin, type I collagen or Matrigel ®.
  • hydrogels containing various proteins, glycoaminoglycans and other components of the extracellular matrix e.g.
  • type I collagen, gelatin or Matrigel® have been shown to be able to maintain viability, support proliferation and the ability to migration, as well as to maintain the phenotype of certain populations of anchorage dependent cells. It should be noted here that the gels can be combined, by adding successive microdrops, for example. Each of the hydrogels mentioned has a specific gelation procedure.
  • hydrogels such as PEG-DA
  • PEG-DA can also be functionalized to allow the survival and / or development of cells, by incorporating peptidomimetics (for example hydrogels can be functionalized with RGD-type consensus sequences on which certain types of cells mammals can establish specific interactions or even PRCG [V / N] PD or HEXGHXXGXXH consensus sequences specific to metalloproteases) or the sensor of specific molecules via the incorporation of antibodies or aptamers, for example the in situ capture of cytokines secreted by encapsulated lymphocytes.
  • the mechanical properties of these hydrogels can also be modulated for different applications, for example by varying their degree of crosslinking and / or their concentration.
  • the cells are mixed with the hydrogel, a priori before the formation of the microdrops.
  • the mixing of the hydrogel and the cells can be carried out directly in the microfluidic device, before the formation of the microdrops.
  • the microdrops are conveyed from the zone where they were formed to the trapping zone by microchannels, carried along by an oil flow and / or by slopes or rails. This routing has been found to aid the formation of spheroids in the microdrops.
  • the microdrops are then trapped by surface tension traps placed in the trapping zone, in particular in a microfluidic chip.
  • the trapping zone (or the microfluidic chip 10) is treated by a hydrophobic surface treatment, and filled with an oil containing a surfactant.
  • the use of surfactant allows the stabilization of the microdrops and the reproducibility of their formation.
  • the surfactants also make it possible to prevent the coalescence of the microdrops in the event of contact during their transport from the production device to the traps in the trapping zone.
  • the microfluidic chip 10, as illustrated on figure 1 is composed of a culture chamber, possibly several square centimeters, containing numerous surface tension traps organized in a table or matrix.
  • the tension traps of surface 12 can have various shapes. For example, in the case of cylindrical traps, their diameter can range from a few tens of microns to several hundreds depending on the desired application. For the encapsulation of single or individualized cells in the microdrops, the diameter of the traps may be, for example, 50 microns, which corresponds to a density of about 5000 traps per square centimeter. For the study of large cell aggregates or spheroids, this diameter can increase to 250 microns, which then corresponds to a trap density of the order of 250 traps per square centimeter.
  • the microdrops 14 including the biological cells 16, formed outside the microfluidic chip 10 are entrained in the latter, for example by means of an oil flow illustrated by the arrow 18 so that some of these microdrops are trapped in the surface tension traps 12.
  • microdrops of hydrogels containing biological cells in an oil without precise control of the flow of hydrogel containing the biological cells in the oil. Indeed, only the microdrops having adequate dimensions are subsequently trapped in the trapping zone, so that the latter is occupied by microdrops finally having a great homogeneity of size, shape and concentration of biological cells.
  • the trapping zone in particular a microfluidic chip 10 contains a hydrogel solution 20 containing biological cells 16.
  • the oil is then injected into the trapping zone (the injection is shown diagrammatically by arrow 18), which pushes the hydrogel solution 20 containing biological cells 16 towards an exit from the trapping zone.
  • the microdrops are then formed directly at the level of the surface tension traps 12, by trapping the hydrogel in these traps of the microfluidic chip, this until a configuration substantially identical to that illustrated on the diagram is obtained. figure 2 .
  • the microdrops are thus formed by spontaneous division (or breakage) of the hydrogel solution containing the biological cells, on the surface tension traps.
  • the traps can be of very different shapes, in particular as a function of the desired application, that is to say in particular as a function of the shape of the trapped microdrops sought.
  • the cavity forming a trap can also be found indifferently on the upper wall, lower wall or one of the side walls of the trapping zone, in particular of the microfluidic chip.
  • the figures 7 to 12 illustrate possible shapes of the surface tension traps 12 of the microfluidic chip 10 and the shape of the microdrops 14 which can be obtained using these surface tension traps 12.
  • the shape of the trap 12 makes it possible to control the shape of the trapped microdrops, according to the geometric parameters of the microfluidic channel in which the trap 12 is formed, and the volume of the trapped microdrops.
  • the figure 7 schematically illustrates the parameters to be taken into account to determine the profile of the microdrop, namely the radius R of the microdrop confined in a channel containing a trap 12, the height h of this channel, less than the radius R of the microdrop in the channel , and the diameter d and the depth p of the trap 12.
  • the microdrop 14 enters as much as possible into the trap 12.
  • the microdrop 14 may or may not have a hemispherical cap, and may or may not have a flat part, confined by the walls. of the canal. So on the figure 8 , the volume of the microdrop 14 is greater than the volume of the trap 12. In this case, the microdrop 14 almost completely fills the trap 12 and has a shape flattened against the walls of the channel and of the trap.
  • the micro-drop 14 has a volume slightly smaller than that of the trap 12, then the micro-drop 14 has two hemispherical caps and only grazes the walls of the channel. Finally, if the microdrop 14 has a volume which is significantly smaller than the volume of the trap 12, as illustrated in figure 10 , then the microdrop 14 (or even several microdrops 14) are fully received in the trap 12.
  • the trap has a diameter d less than twice the height h of the channel.
  • the microdrop 14 remains essentially confined in the channel and only has a small hemispherical cap in the trap 12.
  • the trap 12 is conical and has a diameter d greater than twice the height h of the channel.
  • the microdrop 14 then follows the shape of the wall of the trap 12 to form a hemispherical cap in the trap 12.
  • the cells 16 sediment and settle statistically uniformly at the bottom of the microdrop 14. The cells can then be observed individually, and do not aggregate.
  • the microdrop 14 trapped in a trap 12 has a non-flat bottom, in particular convex, as illustrated in the figures 14 and 15 , then the cells 16 meet the interface of the microdrop 12 during their sedimentation, and find themselves obliged to slide along this interface. The cells 16 thus concentrate at the bottom of the microdrop 14, and can possibly aggregate and form spheroids in the case of certain cells dependent on the anchorage.
  • the microfluidic process proposed here comprises, after the trapping of the microdrops, a step of gelation of these microdrops.
  • the hydrogel contains, preferably is agarose.
  • the gelation of the microdrops is then carried out by cooling the microfluidic chip.
  • the hydrogel contains or, preferably, is alginate, it is possible to bring calcium Ca 2+ ions into the oil in which the microdrops bathe, or else to pre-mix limestone particles with the alginate and saturate the oil in which the microdrops bathe with CO 2 .
  • the alginate is thus acidified and calcium ions are released.
  • other gelling agents can be used, other gelling means can be implemented.
  • this gelation step can be implemented at different times of the handling process.
  • gelation can take place immediately after trapping so as to freeze the cells in place, in the microdrop, and not allow them to sediment. We can then observe the cells independently of each other.
  • gelation is carried out after the cells have sedimented to form spheroids. This makes it possible to observe the behavior of cells that have formed a spheroid.
  • the gelation of the microdrops is implemented only after manipulations of the cells in liquid medium, for example to extract certain cells - those in microdrops. ungelled - selectively. This can be useful for cells such as bacteria or erythrocytes and leukocytes, which are independent of the anchor.
  • aqueous solution containing in particular a biochemical solution comprising biochemical components such as nutrients, growth factors, antibodies, drugs or drug molecules, for example.
  • biochemical components diffuse in the gel and reach the cells. It is thus possible to study the reaction of cells, independent or in the form of spheroids, to these stimuli.
  • the hydrogel thus makes it possible to maintain the cells in a precise location, while allowing their perfusion by an aqueous phase and having previously compartmentalised the biological sample during the encapsulation of the cells in microdrops.
  • the surfactant is preferable to drive the surfactant from the interfaces of the microdrops.
  • the shell formed by the surfactants at the interface of the microdrops can indeed be so effective that it prevents the aqueous phase, which is injected to replace the oil, from filling the microfluidic chip, while retaining the gelled microdrops. in their respective traps.
  • the arrival of the interface of the aqueous phase at the level of a trap results in a force applied to the gelled microdrop which can be driven from the trap if the hydrogel which composes it is sufficiently compressible. This is why it is preferable to promote coalescence by reducing the concentration of surfactant at the level of the interface.
  • the microfluidic chip is perfused before injection of the aqueous phase with oil which, unlike the oil used previously, does not contain any surfactant.
  • concentration of surfactant in the oil of the microfluidic chip decreases, which makes it possible to shift the surfactant adsorption balance at the interface towards desorption.
  • concentrations of surfactant for example of the order of a few percent by mass, it is preferable to perfuse the microfluidic chip with a quantity of oil equivalent to 50 times the volume of the microfluidic chip. This ratio depends on the nature of the surfactant (s) and its / their affinity for the two phases.
  • the shape of the traps can also be optimized to ensure that the gelled microdrops are held in position in the traps.
  • the entry microdrop in the trap will be minimal, resulting in low trapping efficiency. Consequently, there is a limiting speed of the external flow beyond which the microdrops are driven out of the traps.
  • the microdrop when the height of the channel is smaller than the radius of the trap, the microdrop, provided it is large enough, penetrates strongly into the cavity of the trap, resulting in high trapping efficiency. The microdrops remain in place regardless of the speed of the external flow.
  • the shape of the microdrop is very close to its shape in the channel, while in the second case, it locally adopts the shape of the trap.
  • microdrops 14 are gelled agarose microdrops, for example. These agarose microdrops 14 are thawed one by one by heating them locally (the heating being illustrated by the flashes 21), in particular using an infrared laser or electrodes. Heat liquefies the agarose. When the phase surrounding the microdrops 14 is aqueous, the content 16 of the degelled agarose mixes with the aqueous phase.
  • the shape and size of the trap are preferably chosen to allow extraction of the cells. For example, in the case where the cells must remain viable, the trap is sized sufficiently large so that the heating of the hydrogel does not induce the mechanisms of cell death and does not induce the mechanisms of cell death.
  • the shape and the force of the trap are preferably dimensioned so as to allow the extraction of the selected microdrop only, and not of the others. This dimensioning depends in particular on the value of the surface tension between the aqueous phase and the oil, as well as on the rigidity of the gel microdrops and their shape inside the trap.
  • Another alternative is to keep the liquid microdrops for handling cells in suspension, eg bacteria. Gelation is then implemented only for the selective extraction of the microdrops. In this case, we can either gel all the microdrops before extraction and apply the protocol described above, or on the contrary only gel the microdrops which one wishes to keep in the traps.
  • the process presented makes it possible, thanks to slight modifications, to be interested in very varied biological applications.
  • the device can of course also be modified by adjusting the height of the channel in the microfluidic chip and the geometry of the traps.
  • the cells can however be kept encapsulated for a long time in the liquid phase before gelling.
  • a low concentration of cells then makes it possible, for example, to study cells in suspension, independent of the anchoring, such as lymphocytes.
  • the method may also allow the formation of spheroids directly in the chip in a controlled manner.
  • the volume of the microdrops created can be controlled by the microdrop forming device upstream of the microfluidic chip. This volume is preferably adjusted so that the microdrops, once trapped, have a diameter equal to that of the trap and a spherical shape. To do this, the depth of the trap is preferably at least equal to its diameter. The fact that the diameter of the trapped microdrop coincides with that of the trap, makes it possible to ensure high trapping efficiency.
  • the spherical shape favors the formation of spheroids.
  • the microdrops preferably contain cells in suspension in an aqueous phase comprising or consisting of culture medium and hydrogel.
  • the external oil flow is stopped, which stops the recirculations. within the microdrops and promotes cell sedimentation.
  • the spherical shape of the microdrops in the traps then induces a concentration of the cells at their lowest points, until they come into contact. Keeping the chip at rest, in conditions favorable to the survival and proper metabolic functioning of the cells, in particular in temperature, for a period ranging from several hours to several days, allows the reorganization of the cells concentrated at the bottom of the trapped microdrop, in a spheroid.
  • the time required for the formation of spheroids may in particular depend on the cell type used and on the composition of the hydrogel. For H4IIEC3 rat liver cells in a 1% by mass agarose solution diluted in culture medium, it was found that this period is less than 24 hours. Of course, the hydrogel is kept liquid during the time of formation of the spheroids.
  • the size of the spheroids is given by the number of cells encapsulated in each microdrop and therefore by the concentration of the solution of cells injected into the microfluidic chip.
  • the distribution of the number of cells per microdrop, and therefore that of the size of the spheroids formed, is very homogeneous provided that the cells are sufficiently individualized at the time of injection.
  • 98% of the traps were filled with a microdrop of liquid agarose which after 24 hours of incubation contained a well reorganized spheroid.
  • the spheroids obtained in the microfluidic chip can be kept in culture for several days.
  • spheroids of H4IIEC3 cells encapsulated in agarose can be cultured in the chip for a week without significant alteration in their viability while retaining strong functionality (in this example strong and continuous secretion of albumin).
  • the method presented here and the microfluidic chip obtained by implementing it, constitute an excellent drug screening tool. For example, it is possible to create spheroids from cancer cells and observe whether their viability decreases over time as a function of exposure to a molecule tested. By adding a device to the chip that makes it possible to establish a concentration gradient within the chamber, or by placing parallel chips in place, a whole range of concentrations can be tested in a same system. The high efficiency of the process for forming these spheroids also makes it possible to create a large number of them from very limited samples. 500 spheroids of approximately 70 ⁇ m in diameter can thus be formed with only 100,000 cells.
  • the cells that make up the spheroids can also be of different types to address co-culture themes. These cell types can be homogeneously mixed in solution before injection into the chip or be arranged according to a certain structural organization, in several successive hydrogel layers or simply by adhesion to the hydrogel after having been infused into the aqueous phase. external.
  • fibroblasts and epithelial cells can be combined to form a skin model and test the toxicity of cosmetic products, neurons and astrocytes to model the brain, or even endothelial cells and smooth muscle cells such as in the wall of blood vessel.
  • the method presented here makes it possible to achieve very advanced control of the microenvironment of cells in culture, it is also an excellent tool for the study of stem cell differentiation.
  • the encapsulated cells can in fact be subjected to a whole range of concentrations of differentiation factors and, potentially at the same time, to a whole range of rigidity of the matrix, for example by varying the concentration of the hydrogel.
  • the method can be used to observe embryonic development over time in interaction with physico-chemical factors of the external environment.
  • this method makes it possible to make a medical diagnosis based on the response of the cells to certain markers.
  • cells are captured with a very low rate of loss.
  • the cells can then be subjected to known diagnostic tests for certain diseases, such as characterization of a cancer biopsy.
  • diagnostic tests for certain diseases such as characterization of a cancer biopsy.
  • PCR polymerase chain reactions
  • FISH FISH
  • the method described above offers the possibility of carrying out all the steps of analysis and of cell culture in a microfluidic chip, thanks to the gelation of the cells. microdrops as a result of their trapping in the chip. This makes it possible to use much smaller volumes of reagents than for tests carried out in multi-well plates or in culture dishes. This also makes it possible to follow the responses of cells over time, following different stimuli.
  • the gelling means comprise, for example, a device for injecting a chemical agent into the trapping zone and / or means for regulating the temperature, for example for cooling the microfluidic chip.
  • the device may also include means for thawing at least some of the gelled hydrogel microdrops, for example a laser.
  • the method described above also makes it possible to produce a product of gelled microdrops, comprising a microdrop trapping zone, in particular a microfluidic chip, and gelled microdrops each including one or more cells, trapped in the trapping zone, the microdrops.
  • gelled being cryo-preserved.
  • Cells can be aggregated as clusters or spheroids.
  • the gelled microdrops can be bathed in a fluid, preferably in an aqueous solution or in an oil, the fluid and the microdrops preferably being cryo-preserved. This cryo-preservation makes it possible in particular to maintain the cells under stable conditions for a long period, with a view to transporting them or storing them for a subsequent analysis.
  • the biological cells encapsulated in the microdrops can be bacteria, yeasts, eukaryotic cells, mammalian cells, preferably mammalian cells excluding human cells, more preferably rat cells or other mammals. , or human cells isolated from their natural environment.
  • samples used in addition to cells, can in particular also be molecules, plastic beads functionalized by coupling them to molecules.
  • the trapped microdrops can be merged with other microdrops provided by the flow of aqueous solution.
  • the aqueous solution of which the microdrops are made may contain a biochemical solution, the biochemical solution preferably comprising at least one of lipids (fatty acids, etc.), carbohydrates (in monomeric form or of polysaccharides, etc. ), amino acids and proteins (growth factors, cytokines, antibodies, antigens, etc.), as well as salinity and / or pH buffers.
  • lipids fatty acids, etc.
  • carbohydrates in monomeric form or of polysaccharides, etc.
  • amino acids and proteins growth factors, cytokines, antibodies, antigens, etc.
  • the oil (or oily phase) surrounding the microdrops may contain fluorinated oils (type FC40) or else photo-crosslinkable solutions immiscible with water (type Norland Optical Adhesive), which, once polymerized allow the oil to gel and thus physically and selectively isolate the microdrops. It is thus possible to partition, to isolate in a more robust manner, the microdrops from one another. This is to prevent two microdrops from merging, causing the samples they contain to mix. This also makes it possible to store the samples in a durable manner, the risks of evaporation, in particular, of the microdrops being greatly reduced due to the partitioning of the microdrops by the gelled oil, which forms a solid compartment around the microdrops.
  • fluorinated oils type FC40
  • photo-crosslinkable solutions immiscible with water type Norland Optical Adhesive
  • the microdrops around which the oil has not gelled can be pushed out of the trapping zone. To do this, it is possible to implement a flow of oil or of another fluid in the trapping zone, the flow being strong enough to entrain the microdrops. It is thus possible to keep in the trapping zone only the microdrops around which the oil has been gelled.
  • microdrops can be gelled even in the case where the oil is gelled.
  • the process can of course include, in this case where part of the oil is gelled, a subsequent step of degelling the gelled oil.

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Description

  • La présente invention concerne un procédé microfluidique de manipulation d'échantillons, notamment biologiques, dans des microgouttes d'hydrogel. L'invention se rapporte également à un dispositif pour mettre en œuvre un tel procédé et à un produit d'échantillons obtenu en mettant en œuvre un tel procédé.
  • Il est connu de Guo, Rotem, Heyman, & Weitz, « Droplet microfluidics for high-throughput biological assays », Lab. Chip. 12 (2012), que les gouttes dans des systèmes microfluidiques (ou « microgouttes ») peuvent être utilisées pour contenir des réactions chimiques ou biologiques. Dans ces systèmes, le contenu de ces gouttes peut être testé en observant la fluorescence de la goutte quand elle passe devant un laser focalisé. Cependant, ces systèmes ne permettent pas d'observer l'évolution en fonction du temps du contenu de ces gouttes sans les extraire du dispositif microfluidique.
  • Il est connu aussi, par exemple de Joensson, H. N. & Andersson Svahn, H., « Droplet microfluidics - a tool for single-cell analysis », Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51, 12176-12192 (2012), d'étudier des cellules individualisées dans des microgouttes. Ces microgouttes forment en effet des compartiments bien définis qui permettent d'isoler des échantillons biologiques comme des cellules, par exemple. Ce document enseigne notamment que la localisation des populations de cellules encapsulées peut être contrôlée grâce à l'accumulation des gouttes dans des chambres de culture, dans des canaux allongés, ou encore dans des pièges statiques. Ce document enseigne encore que les cellules peuvent être encapsulées dans des hydrogels fonctionnalisés, entourés d'une phase huileuse.
  • Cependant, l'apport de nutriments ou de manières plus générales de molécules d'intérêt biologique pour les cellules dans de tels dispositifs s'avère limités et les méthodes mises en œuvre (par exemple par électro-fusion ou pico-injection) complexes. En conséquence, ces dispositifs présentent de nombreuses limites pour l'étude du comportement cellulaire, en particulier au niveau temporal.
  • Par ailleurs, il est connu de L. Yu, M. C.W. Chen and K. C. Cheung, « Droplet-based microfluidic system for multicellular tumor spheroid formation and anticancer drug testing », Lab Chip (2010) un procédé pour manipuler des microgouttes d'hydrogel contenant des sphéroïdes multicellulaires. Selon ce procédé, des microbilles d'hydrogels incluant des cellules sont réalisées dans un premier système microfluidique. Elles sont ensuite récupérées et lavées dans un bain, avant d'être injectées dans un deuxième système microfluidique comprenant des pièges permettant de fixer les microgouttes.
  • Un tel procédé est cependant complexe, qui nécessite deux systèmes microfluidiques distincts et trois dispositifs au total. En outre, il ne permet pas d'observer les échantillons en continu. En particulier il ne permet pas d'observer les moments initiaux entre la formation des gouttes et leur capture.
  • Il est également connu de la demande de brevet US 2008/241841 une méthode d'amplification d'ARN messager molécule par molécule comportant les étapes de formation de gouttes contenant un ou plusieurs acide nucléique et un agent gélifiant dispersé sous forme d'émulsion dans une solution d'huile, d'amplification PCR par un dispositif de contrôle de la température et de détection par fluorescence. Une telle méthode d'amplification d'ARN messager nécessite l'utilisation de deux systèmes microfluidiques.
  • Il est aussi connu de la demande de brevet US 2003/0049320 un procédé d'encapsulation d'une émulsion pour proposer un nouveau format de porteur d'agent actif, notamment utile dans le cas de médicaments. Cette demande décrit une dispersion gélifiée contenant une ou plusieurs gouttes d'un solvant aqueux contenant un polymère biocompatible.
  • De plus, il est connu de la demande de brevet US 2017/0015614 un dispositif de tri, amplification, détection et identification d'acides nucléiques qui comprend un générateur de goutelettes, un substrat divisé en cellules, chacune étant destinées à contenir une goutelette, ainsi qu'un moyen d'injection d'un réactif dans lesdites cellules.
  • Il existe donc un besoin pour un procédé de manipulation de microgouttes contenant des échantillons plus simple et permettant cependant une vaste gamme de tests sur les échantillons. Il existe également un besoin pour un procédé de manipulation de microgouttes permettant un tri plus efficace des microgouttes.
  • À cette fin, l'invention propose un procédé de manipulation dans un système microfluidique de microgouttes incluant des échantillons selon la revendication 1 ou la revendication 2.
  • Ainsi, selon l'invention, pour trier les microgouttes d'intérêt - c'est-à-dire les microgouttes qui contiennent des échantillons d'intérêt - ces microgouttes sont tout d'abord piégées dans des pièges de tension de surface (ou piège capillaire), puis certaines des microgouttes ou une partie de l'huile qui les entoure sont gélifiées. La gélification des microgouttes ou de l'huile qui les entoure facilite le tri en accentuant la force de piégeage des microgouttes dans les pièges. En d'autres termes, l'étape de gélification permet d'éviter que des microgouttes d'intérêt soient perdues.
  • En outre, cette gélification permet d'éviter que des microgouttes ne puissent fusionner, ce qui provoquerait un mélange des échantillons de ces microgouttes.
  • Par piège de tension de surface, on entend un piège une zone du système microfluidique dont la géométrie, avec la tension interfaciale de la microgoutte, permet le maintien en position de la microgoutte.
  • Toutes les étapes du procédé sont réalisées dans un système microfluidique unique. Par système microfluidique, on entend un système dont les pièces sont fabriquées selon des procédés de microfabrication. Un tel système présente des conduits dont au moins une dimension est typiquement inférieure au millimètre.
  • La forme de la microgoutte peut être contrôlée. Ce contrôle de la forme de la microgoutte peut être combiné avec le contrôle de l'instant de gélification de la microgoutte ou d'une partie de l'huile l'entourant, pour donner accès à des applications différentes, notamment sur la manipulation de cellules.
  • Par cellules, on entend les cellules eucaryotes (par exemple cellules végétales, champignons, levures, cellules mammifères) et les cellules procaryotes (par exemple bactéries). Pour les cellules de mammifères, on distingue les cellules indépendantes à l'ancrage (par exemple certaines cellules de la lignée sanguine et les cellules tumorales hautement transformées) et les cellules dépendantes à l'ancrage (la majorité des autres types cellulaires), dont certains sous-types peuvent s'organiser sous forme de sphéroïdes. On entend par sphéroïdes, des structures multicellulaires organisées sous formes de micro-tissus dont les fonctionnalités sont similaires à celles de tissus dérivés d'organes.
  • Selon des modes de réalisation préférés, le procédé selon l'invention comporte une ou plusieurs des caractéristiques suivantes, prises seules ou en combinaison :
    • l'étape iii) consiste à gélifier au moins une partie de l'huile de la zone de piégeage, à l'exclusion des microgouttes ;
    • l'étape iii) consiste à gélifier au moins une partie des microgouttes, à l'exclusion de l'huile entourant les microgouttes dans la zone de piégeage ;
    • l'échantillon est l'un parmi une ou des cellules, notamment un sphéroïde de cellules, un ou plusieurs billes piégeant des molécules, les billes étant notamment en matière plastique, une ou des molécules ;
    • l'étape iii) est réalisée après sédimentation des échantillons, notamment des cellules, dans les microgouttes piégées, en particulier après formation de sphéroïdes ;
    • l'étape iii) est réalisée avant sédimentation des échantillons dans les microgouttes piégées ;
    • le procédé comprend en outre l'étape consistant à :
      iv) remplacer l'huile entourant les microgouttes gélifiées par une solution aqueuse ;
    • la solution aqueuse remplaçant l'huile contient une solution biochimique, la solution biochimique comportant de préférence au moins l'un parmi un ou des tampons de pH ou de salinité, un ou des nutriments, un ou des facteurs de croissance, des cytokines, un ou des anticorps, un ou des antigènes, une ou des molécules, notamment de médicament, une ou des cellules, des lipides, des glucides, notamment sous forme monomérique ou de polysaccharides, des acides aminés et/ou des protéines ;
    • la zone de piégeage est formée par une puce microfluidique comprenant les pièges de tension de surface ;
    • l'étape i) consiste à :
      1. a) injecter dans une zone, en amont de la zone de piégeage, une solution aqueuse contenant des échantillons et un agent gélifiant, le cas échéant,
      2. b) injecter de l'huile, contenant un agent gélifiant, le cas échéant, dans la zone en amont de la zone de piégeage pour pousser la solution aqueuse contenant des échantillons vers une sortie de la zone de piégeage, l'injection d'huile étant réalisée de manière à former des microgouttes contenant des échantillons, puis
      3. c) déplacer les microgouttes jusqu'au niveau de la zone de piégeage et piéger les microgouttes dans la zone de piégeage ;
    • les étapes i) et ii) sont réalisées simultanément dans la zone de piégeage, en réalisant les actions consistant à :
      • remplir la zone de piégeage de solution aqueuse contenant des échantillons et un agent gélifiant, le cas échéant, puis à
      • injecter de l'huile, contenant un agent gélifiant, le cas échéant, dans la zone de piégeage pour pousser la solution aqueuse contenant des échantillons vers une sortie de la zone de piégeage, les pièges de tension de surface étant conformés pour permettre la cassure des microgouttes contenant des échantillons au niveau des pièges de tension de surface ;
    • l'étape iii) consiste en au moins l'un parmi :
      • refroidir ou chauffer des microgouttes et/ou l'huile,
      • injecter une solution contenant un agent chimique de gélification,
      • soumettre les microgouttes et/ou l'huile à une lumière provoquant la gélification, notamment une lumière UV.
    • l'huile contient un agent surfactant, le procédé comprenant de préférence une étape de lavage de l'agent surfactant avant l'étape iv) ;
    • le procédé comprend une étape, préalable à l'étape i), de choix de la forme des pièges de tension de surface en fonction de la forme désirée des microgouttes ;
    • la zone de piégeage et les pièges sont choisis pour :
      • former des microgouttes piégées avec un fond plat, ou
      • former des microgouttes piégées avec un fond non-plat, notamment incurvé, de préférence convexe ;
    • le procédé comprend une étape v) postérieure à l'étape iii), et de préférence postérieure à l'étape iv), consistant à dégélifier au moins certaines des microgouttes gélifiées à l'étape iii) ;
    • le procédé comprend une étape vi), postérieure à l'étape v), consistant à évacuer les microgouttes dégélifiées et/ou les échantillons contenus dans ces microgouttes dégélifiées hors de la zone de piégeage ;
    • le procédé comprend une étape d'application d'un stimulus aux échantillons contenus dans au moins une partie des microgouttes piégées, gélifiées ou non ; et
    • le procédé comprend une étape postérieure à l'étape iii) consistant à pousser hors de la zone de piégeage les microgouttes autour desquelles l'huile n'a pas été gélifiée, pour ne garder dans la zone de piégeage que les microgouttes autour desquelles l'huile a été gélifiée.
  • Selon un autre aspect, l'invention se rapporte à un dispositif selon la revendication 15 ou la revendication 16.
  • Le dispositif comprend:
    • des moyens pour former des microgouttes contenant des échantillons,
    • une zone de piégeage, notamment une puce microfluidique, pour piéger les microgouttes à des endroits prédéterminés, et
    • des moyens de gélification d'une partie au moins des microgouttes piégées ou de l'huile.
  • Les moyens de gélification peuvent comprendre un dispositif d'injection d'un agent chimique dans la zone de piégeage.
  • Le dispositif peut en outre comprendre des moyens de dégélifier au moins certaines des microgouttes d'hydrogel gélifiées ou d'une partie de l'huile gélifiée, le cas échéant.
  • L'invention vise également un produit de microgouttes gélifiées selon la revendication 17.
  • Ce produit comprend
    une zone de piégeage de microgouttes, en particulier une puce microfluidique, et des microgouttes gélifiées incluant chacune un échantillon, piégées dans la zone de piégeage, les microgouttes gélifiées étant cryo-préservées.
  • Pour ce faire, et en vue du stockage et/ou de la distribution de ce produit de microgouttes, la solution biochimique peut contenir des agents de cryo-protection (DMSO, glycérol, tréhalose etc.) pour permettre la cryo-préservation des échantillons.
  • Les microgouttes gélifiées peuvent également baigner dans un fluide, de préférence dans une solution aqueuse ou dans une huile, le fluide et les microgouttes étant de préférence cryo-préservées.
  • L'invention se rapporte aussi à un produit de microgouttes selon la revendication 18.
  • Ce produit comprend une zone de piégeage, notamment une puce microfluidique, et des microgouttes incluant chacune un échantillon, piégées dans la zone de piégeage, les microgouttes baignant dans une huile gélifiée, les microgouttes et l'huile gélifiée étant de préférence cryo-préservées.
  • Les échantillons peuvent être des cellules de mammifères, de préférence des cellules de mammifères à l'exclusion de cellules humaines, des bactéries, des levures ou d'autres cellules utilisées dans des bioprocédés, des molécules, des billes piégeant des molécules en surface.
  • L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre d'exemples de mise en œuvre de l'invention, en regard des dessins ci-annexés sur lesquels :
    • La figure 1 représente schématiquement une puce microfluidique,
    • La figure 2 représente schématiquement la puce microfluidique de la figure 1 où des pièges sont occupés par une microgoutte d'hydrogel contenant des échantillons,
    • La figure 3 représente schématiquement la puce microfluidique de la figure 1 contenant un mélange d'hydrogel et d'échantillons à tester,
    • Les figures 4 à 6 illustrent schématiquement un moyen d'évacuer une partie des échantillons contenus dans des microgouttes d'hydrogel piégées dans une puce microfluidique, hors de cette puce microfluidique,
    • Les figures 7 à 12 illustrent schématiquement des exemples de géométries de pièges à tension de surface et les formes de microgouttes qu'ils permettent d'obtenir, et
    • Les figures 13 à 15 illustrent schématiquement des exemples de sédimentation d'échantillons dans des microgouttes d'hydrogel.
  • L'invention se rapporte à un procédé de manipulation de microgouttes d'hydrogel incluant des échantillons à tester.
  • Dans la suite, on s'intéresse plus particulièrement à des échantillons sous forme de cellules, mais d'autres types d'échantillons peuvent bien entendu être mis en œuvre.
  • Le procédé comprend essentiellement trois étapes, toutes mises en œuvre dans un unique système microfluidique, les trois étapes consistant à :
    • former dans une huile, des microgouttes de solution aqueuse, liquide, contenant une ou des cellules, l'huile ou la solution aqueuse comprenant un agent gélifiant,
    • piéger les microgouttes, liquides, au moyen de pièges de tension de surface prédisposés dans une zone de piégeage, et
    • gélifier l'huile ou au moins une partie des microgouttes piégées, le cas échéant.
  • Dans la suite, on s'intéresse plus particulièrement au cas où la solution aqueuse est une solution d'hydrogel, l'huile ne comprenant pas d'agent gélifiant et où la dernière étape ci-dessus consiste à gélifier au moins une partie des microgouttes piégées, sans que l'huile ne soit elle gélifiée. Dans ce cas, suite aux trois étapes mentionnées ci-dessus, le procédé peut se poursuivre en mettant en œuvre différentes étapes, en fonction du test que l'on souhaite mettre en œuvre, notamment.
  • Le procédé peut notamment se poursuivre par une étape consistant à remplacer l'huile autour des microgouttes gélifiées, par une solution aqueuse, sans déplacer les microgouttes des pièges de tension de surface. La solution aqueuse peut contenir une solution biochimique avec au moins l'un parmi des nutriments, des facteurs de croissance, des anticorps, des molécules de médicament et des tampons de pH et/ou de salinité.
  • Selon un autre aspect, le procédé permet le contrôle de la forme tridimensionnelle de billes d'hydrogel dans un canal microfluidique et/ou dans des pièges de tension de surface, avec pour application première l'encapsulation de cellules dans ces microgouttes. Ainsi, selon la forme des microgouttes et la concentration de cellules par microgoutte, l'encapsulation des cellules dans de l'hydrogel permet leur culture ou leur analyse, tout en les perfusant avec des solutions biochimiques, ou en leur appliquant des stimuli physiques tels que de la chaleur ou de la lumière, par exemple.
  • Par gel, on entend un milieu composé d'une majorité de liquide et contenant des molécules ou des particules pouvant s'organiser pour lui conférer un aspect solide, comme par exemple l'absence d'écoulement à son état stable. Cette solution peut être manipulée à l'état liquide et peut ensuite être « gélifiée » par des moyens chimiques ou physiques. La gélification peut être réversible dans certains cas. Quand le liquide est l'eau, on parle d'hydrogel.
  • Comme indiqué ci-avant, le procédé microfluidique proposé comporte une première étape de formation de microgouttes d'hydrogel contenant des cellules biologiques dans une huile.
  • Ici, les microgouttes (ou microbilles) présentent un diamètre de l'ordre du micromètre, notamment un diamètre compris entre 10 et 1000 micromètres.
  • L'hydrogel est par exemple une solution aqueuse comprenant un agent gélifiant. L'agent gélifiant est choisi par l'utilisateur en fonction de l'application. Un exemple d'agent gélifiant pouvant être gélifié de manière physique est l'agarose, liquide à température ambiante et qui gélifie à basse température. Un agent gélifiant pouvant être gélifié de manière chimique est par exemple l'alginate, liquide en solution et qui gélifie en cas d'apport d'ions calcium Ca2+.
  • Au niveau biologique, les propriétés biochimiques et biomécaniques de l'hydrogel peuvent permettre aux cellules sensibles à l'ancrage d'établir des interactions spécifiques avec la matrice ainsi formée. Ces interactions sont essentielles pour la survie des cellules mammifères dépendantes de l'ancrage et participent à la régulation de leur phénotype. La nature de la matrice peut par exemple permettre d'observer la migration cellulaire ou protéolyse (digestion de la matrice par les cellules). Des expériences particulièrement concluantes ont été menées avec de l'agarose, de l'alginate, du PEG-DA (Polyéthylène glycol Diacrylate), mais aussi de la gélatine, du collagène de type I ou du Matrigel ®. Par exemple, les hydrogels contenant diverses protéines, glycoaminoglycans et autres composants de la matrice extracellulaire (par exemple le collagène de type I, la gélatine ou le Matrigel®) ont démontré leur capacité à maintenir la viabilité, à soutenir la prolifération et la capacité de migration, ainsi qu'à maintenir le phénotype de certaines populations de cellules dépendantes à l'ancrage. Il est à noter ici que les gels peuvent être combinés, par apport de microgouttes successives, par exemple. À chacun des hydrogels mentionnés correspond une procédure de gélification spécifique. Certains hydrogels, tel le PEG-DA, peuvent en outre être fonctionnalisés pour permettre la survie et/ou le développement des cellules, en incorporant des peptidomimetiques (par exemple les hydrogels peuvent être fonctionnalisés avec des séquences consensus type RGD sur lesquelles certains types de cellules mammifères peuvent établirent des interactions spécifiques ou encore des séquences consensus PRCG[V/N]PD ou HEXGHXXGXXH spécifiques aux métallo protéases) ou le capteur de molécules spécifiques via l'incorporation d'anticorps ou d'aptamères, par exemple la capture in situ de cytokines sécrétées par des lymphocytes encapsulés. Les propriétés mécaniques de ces hydrogels peuvent aussi être modulées pour différentes applications, en faisant par exemple varier leur taux de réticulation et/ou leur concentration. L'ensemble de ces propriétés physico-chimiques peuvent être différentes d'un piège à l'autre au sein de la zone de piégeage. L'instauration d'un gradient de rigidité au sein des microgouttes d'hydrogels piégées permet par exemple la différenciation contrôlée de cellules souches en différents types cellulaires. Enfin, plusieurs hydrogels peuvent coexister dans une même microgoutte suite à un mélange ou à la formation successive de plusieurs couches autour du cœur gélifié dans le piège.
  • Les cellules sont mélangées à l'hydrogel, a priori avant la formation des microgouttes. Cependant, le mélange de l'hydrogel et des cellules peut être réalisé directement dans le dispositif microfluidique, avant la formation des microgouttes.
  • De nombreux procédés ont déjà été proposés pour former de telles microgouttes dans une phase mobile tel que de l'huile. On peut par exemple citer les exemples de procédé :
    • procédé dit de « flow-focusing » décrit par exemple dans S.L. Anna, N. Bontoux et H.A. Stone, « Formation of dispersions using 'Flow-Focusing' in microchannels », Appl. Phys. Lett. 82, 364 (2003),
    • procédé dit à «jonction en T » décrit par exemple dans « Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device » par T. Thorsen, R. W. Roberts, F. H. Arnold et S. R. Quake, Phys. Rev. Lett. 86, 4163-4166 (2001), ou bien
    • procédé dit « à gradient de confinement» décrit par exemple dans la demande FR-A-2 958 186 .
  • Ces procédés permettent de former des microgouttes de dimensions sensiblement égales.
  • Après formation de ces microgouttes, les microgouttes sont acheminées depuis la zone où elles ont été formées jusqu'à la zone de piégeage par des microcanaux, entraînées par un flux d'huile et/ou par des pentes ou des rails. Il a été constaté que cet acheminement aide à la formation de sphéroïdes dans les microgouttes. Les microgouttes sont ensuite piégées par des pièges de tension de surface disposés dans la zone de piégeage, notamment dans une puce microfluidique. La zone de piégeage (ou la puce microfluidique 10) est traitée par un traitement de surface hydrophobe, et remplie d'une huile contenant un surfactant. L'utilisation de surfactant permet la stabilisation des microgouttes et la reproductibilité de leur formation. Les surfactants permettent de plus d'empêcher la coalescence des microgouttes en cas de contact pendant leur acheminement du dispositif de production aux pièges de la zone de piégeage.
  • La puce microfluidique 10, telle qu'illustrée sur la figure 1, est composée d'une chambre de culture, possiblement de plusieurs centimètres carrés, contenant de nombreux pièges de tension de surface organisés en tableau ou matrice. Les pièges de tension de surface 12 peuvent avoir des formes variées. Par exemple, dans le cas de pièges cylindriques, leur diamètre peut s'étendre de quelques dizaines de microns à plusieurs centaines en fonction de l'application souhaitée. Pour l'encapsulation de cellules uniques ou individualisées dans les microgouttes, le diamètre des pièges peut être par exemple de 50 microns, ce qui correspond à une densité d'environ 5000 pièges par centimètre carré. Pour l'étude de larges agrégats cellulaires ou de sphéroïdes, ce diamètre peut passer à 250 microns, ce qui correspond alors à une densité de pièges de l'ordre de 250 pièges par centimètre carré.
  • Comme illustré à la figure 1, les microgouttes 14 incluant les cellules biologiques 16, formées à l'extérieur de la puce microfluidique 10, sont entraînées dans cette dernière, par exemple à l'aide d'un flux d'huile illustré par la flèche 18 de telle sorte que certaines de ces microgouttes sont piégées dans les pièges de tension de surface 12.
  • En variante cependant, il est proposé ici de former des microgouttes d'hydrogels contenant des cellules biologiques, dans une huile, sans contrôle précis de l'écoulement d'hydrogel contenant les cellules biologiques dans l'huile. En effet, seules les microgouttes présentant des dimensions adéquates sont par la suite piégées dans la zone de piégeage, de sorte que cette dernière est occupée par des microgouttes présentant finalement une grande homogénéité de dimension, de forme et de concentration en cellules biologiques.
  • Selon une autre variante, illustrée à la figure 3, la zone de piégeage, notamment une puce microfluidique 10, contient une solution d'hydrogel 20 contenant des cellules biologiques 16. On injecte alors dans la zone de piégeage de l'huile (l'injection est schématisée par la flèche 18), qui pousse la solution d'hydrogel 20 contenant des cellules biologiques 16 vers une sortie de la zone de piégeage. Les microgouttes se forment alors directement au niveau des pièges de tension de surface 12, par piégeage de l'hydrogel dans ces pièges de la puce microfluidique, ceci jusqu'à obtenir une configuration sensiblement identique à celle illustrée sur la figure 2. Les microgouttes se forment ainsi par division spontanée (ou cassure) de la solution d'hydrogel contenant les cellules biologiques, sur les pièges de tension de surface. Ici aussi, un contrôle précis des écoulements n'est pas nécessaire et il est même possible de pousser les seringues à la main, sans avoir recours à des instruments sophistiqués. Dans ce cas, on préfère des pièges de tension de surface profonds pour permettre la cassure des microgouttes (c'est-à-dire leur formation) au niveau des pièges de tension de surface. De tels pièges seront décrits ultérieurement.
  • Il est à noter ici que les pièges peuvent être de formes très différentes, notamment en fonction de l'application recherchée, c'est-à-dire en particulier en fonction de la forme des microgouttes piégées recherchée. La cavité formant piège peut aussi se trouver indifféremment sur la paroi supérieure, inférieure ou une des parois latérales de la zone de piégeage, notamment de la puce microfluidique.
  • Les figures 7 à 12 illustrent des formes envisageables des pièges de tension de surface 12 de la puce microfluidique 10 et la forme des microgouttes 14 qui peut être obtenue à l'aide de ces pièges de tension de surface 12.
  • En particulier, la forme du piège 12 permet de contrôler la forme des microgouttes piégées, selon les paramètres géométriques du canal microfluidique dans lequel est formé le piège 12, et le volume des microgouttes piégées. La figure 7 illustre schématiquement les paramètres à prendre en compte pour déterminer le profil de la microgoutte, à savoir le rayon R de la microgoutte confinée dans un canal contenant un piège 12, la hauteur h de ce canal, inférieure au rayon R de la microgoutte dans le canal, et le diamètre d et la profondeur p du piège 12.
  • Quand le piège 12 est cylindrique et a un diamètre d supérieur à deux fois la hauteur h du canal, comme illustré aux figures 8 à 10, alors la microgoutte 14 rentre autant que possible dans le piège 12. Selon les volumes relatifs du piège 12 et de la microgoutte 14, la microgoutte 14 peut présenter ou non une calotte hémisphérique, et avoir ou non une partie plate, confinée par les parois du canal. Ainsi, sur la figure 8, le volume de la microgoutte 14 est supérieur au volume du piège 12. Dans ce cas, la microgoutte 14 remplit presque totalement le piège 12 et présente une forme aplatie contre les parois du canal et du piège. Sur la figure 9, la microgoutte 14 présente un volume légèrement plus faible que celui du piège 12, alors la microgoutte 14 présente deux calottes hémisphériques et ne fait qu'effleurer les parois du canal. Enfin, si la microgoutte 14 présente un volume nettement plus faible que le volume du piège 12, comme cela est illustré sur la figure 10, alors la microgoutte 14 (voire plusieurs microgouttes 14) sont entièrement reçu dans le piège 12.
  • Dans le cas de la figure 11, par contre, le piège a un diamètre d inférieur à deux fois la hauteur h du canal. Par suite, la microgoutte 14 reste essentiellement confinée dans le canal et ne présente qu'une petite calotte hémisphérique dans le piège 12.
  • Enfin, dans le cas de la figure 12, le piège 12 est conique et a un diamètre d supérieur à deux fois la hauteur h du canal. La microgoutte 14 épouse alors la forme de la paroi du piège 12 pour former une calotte hémisphérique dans le piège 12.
  • Par ailleurs, comme illustré sur la figure 13, si la microgoutte 14 piégée dans un piège 12 a un fond plat, les cellules 16 sédimentent et se déposent de manière statistiquement uniforme au fond de la microgoutte 14. Les cellules peuvent alors être observées individuellement, et ne s'agrègent pas. Au contraire, si la microgoutte 14 piégée dans un piège 12 a un fond non plat, notamment convexe, comme illustré sur les figures 14 et 15, alors les cellules 16 rencontrent l'interface de la microgoutte 12 lors de leur sédimentation, et se retrouvent obligées de glisser le long de cette interface. Les cellules 16 se concentrent ainsi au fond de la microgoutte 14, et peuvent éventuellement s'agréger et former des sphéroïdes dans le cas de certaines cellules dépendantes de l'ancrage.
  • Le procédé microfluidique proposé ici comprend, après le piégeage des microgouttes, une étape de gélification de ces microgouttes.
  • Cette étape peut être réalisée de manières variées, en fonction notamment de l'agent gélifiant de l'hydrogel utilisé. Ainsi, selon un premier exemple, l'hydrogel contient, de préférence est de l'agarose. La gélification des microgouttes est alors réalisée en refroidissant la puce microfluidique. Lorsque l'hydrogel contient ou, de préférence, est de l'alginate, il est possible d'amener des ions calcium Ca2+ dans l'huile dans laquelle baignent les microgouttes, ou bien de pré-mélanger des particules calcaires avec l'alginate et de saturer en CO2 l'huile dans laquelle baignent les microgouttes. On acidifie ainsi l'alginate et on libère des ions calcium. Bien entendu, d'autres agents gélifiants pouvant être utilisés, d'autres moyens de gélification peuvent être mis en œuvre.
  • Par ailleurs, en fonction de l'application recherchée, cette étape de gélification peut être mise en œuvre à des instants différents du procédé de manipulation. En particulier, la gélification peut se faire immédiatement après le piégeage de façon à figer les cellules sur place, dans la microgoutte, et ne pas leur permettre de sédimenter. On peut alors observer les cellules indépendamment les unes des autres. Alternativement, la gélification est réalisée après la sédimentation des cellules pour former des sphéroïdes. Ceci permet d'observer le comportement des cellules ayant formé un sphéroïde. Selon une autre alternative, la gélification des microgouttes n'est mise en œuvre qu'après des manipulations des cellules en milieu liquide, par exemple pour extraire certaines cellules - celles dans des microgouttes non gélifiées - de façon sélective. Ceci peut être utile pour des cellules comme des bactéries ou des érythrocytes et leucocytes, qui sont indépendantes de l'ancrage.
  • Après gélification, il est possible de remplacer l'huile dans laquelle baignent les microgouttes par une solution aqueuse contenant notamment une solution biochimique comportant des composants biochimiques tels que des nutriments, des facteurs de croissance, des anticorps, des drogues ou des molécules de médicament, par exemples. Ces composants biochimiques diffusent dans le gel et atteignent les cellules. Il est ainsi possible d'étudier la réaction des cellules, indépendantes ou sous forme de sphéroïdes, à ces stimuli. L'hydrogel permet ainsi de maintenir les cellules dans un emplacement précis, tout en permettant leur perfusion par une phase aqueuse et en ayant préalablement compartimenté l'échantillon biologique lors de l'encapsulation des cellules dans des microgouttes.
  • Pour réaliser cette opération avec succès, il est préférable de chasser le surfactant des interfaces des microgouttes. La coque que forment les surfactants au niveau de l'interface des microgouttes peut en effet être si efficace qu'elle empêche la phase aqueuse, que l'on injecte pour remplacer l'huile, de remplir la puce microfluidique, en conservant les microgouttes gélifiées dans leurs pièges respectifs. Comme la coalescence est combattue par la présence de surfactant, l'arrivée de l'interface de la phase aqueuse au niveau d'un piège résulte en une force appliquée sur la microgoutte gélifiée qui peut être chassée du piège si l'hydrogel qui la compose est suffisamment compressible. C'est pourquoi il est préférable de favoriser la coalescence en diminuant la concentration de surfactant au niveau de l'interface. Pour ce faire, la puce microfluidique est perfusée avant injection de la phase aqueuse par de l'huile qui, à la différence de l'huile utilisée précédemment, ne contient pas de surfactant. La concentration de surfactant dans l'huile de la puce microfluidique diminue, ce qui permet de déplacer l'équilibre d'adsorption de surfactant à l'interface vers la désorption. Pour des concentrations élevées de surfactant, par exemple de l'ordre de quelques pourcents en masse, il est préférable de perfuser la puce microfluidique avec une quantité d'huile équivalente à 50 fois le volume de la puce microfluidique. Ce ratio dépend de la nature du ou des surfactants et de son/leur affinité pour les deux phases.
  • La forme des pièges peut également être optimisée pour assurer le maintien en position des microgouttes gélifiées dans les pièges. Ainsi, dans le cas d'un piège cylindrique suffisamment profond, si la hauteur du canal est plus grande que le rayon du piège, l'entrée de la microgoutte dans le piège va être minime, résultant en une faible efficacité de piégeage. Par suite, il existe une vitesse limite du flux extérieur au-delà de laquelle les microgouttes sont chassées des pièges. À l'inverse, quand la hauteur du canal est plus petite que le rayon du piège, la microgoutte, à condition qu'elle soit suffisamment grande, pénètre fortement dans la cavité du piège, résultant en une forte efficacité de piégeage. Les microgouttes restent en place indépendamment de la vitesse du flux extérieur. Dans le premier cas, la forme de la microgoutte est très proche de sa forme dans le canal alors que dans le deuxième cas, elle adopte localement la forme du piège.
  • Lorsque l'agent gélifiant de l'hydrogel choisi est réversible, il est possible de dégélifier les microgouttes puis d'évacuer leur contenu hors de la puce microfluidique, comme illustré aux figures 4 à 6. Dans le cas de ces figures 4 à 6, les microgouttes 14 sont des microgouttes d'agarose gélifiées, par exemple. Ces microgouttes 14 d'agarose sont dégélifiées une par une en les chauffant localement (le chauffage étant illustré par les éclairs 21), notamment à l'aide d'un laser infra-rouge ou d'électrodes. La chaleur liquéfie l'agarose. Lorsque la phase entourant les microgouttes 14 est aqueuse, le contenu 16 de l'agarose dégélifié se mélange avec la phase aqueuse. Il est alors possible d'entraîner ce contenu par le flux 22 de la phase aqueuse, éventuellement pour le récupérer. Il est également possible d'éliminer ainsi les cellules jugées non intéressantes de la puce microfluidique 10. De nouveau, la forme et la taille du piège sont de préférence choisies pour permettre l'extraction des cellules. Par exemple, dans le cas où les cellules doivent rester viables, le piège est dimensionné suffisamment grand pour que le chauffage de l'hydrogel n'induise pas les mécanismes de mort cellulaire n'induise pas les mécanismes de mort cellulaire.
  • Alternativement, lorsque la phase entourant les microgouttes est huileuse, un flux d'huile peut être imposé pour déloger la microgoutte liquide du piège. Dans ce cas, la forme et la force du piège sont de préférence dimensionnées de façon à permettre l'extraction de la microgoutte choisie uniquement, et non pas des autres. Ce dimensionnement dépend notamment de la valeur de la tension de surface entre la phase aqueuse et l'huile, ainsi que de la rigidité des microgouttes de gel et leur forme à l'intérieur du piège.
  • Une autre alternative est de maintenir les microgouttes liquides pour la manipulation de cellules en suspension, par exemple des bactéries. La gélification est alors mise en œuvre uniquement pour l'extraction sélective des microgouttes. Dans ce cas, on peut soit gélifier toutes les microgouttes avant extraction et appliquer le protocole décrit ci-avant, soit au contraire gélifier uniquement les microgouttes qu'on souhaite conserver dans les pièges.
  • Le procédé présenté permet grâce à de légères modifications de s'intéresser à des applications biologiques très variées. Dans chaque cas, le dispositif peut bien sûr aussi être modifié en ajustant la hauteur du canal dans la puce microfluidique et la géométrie des pièges.
  • Ainsi, par exemple, une gélification rapide avec une faible concentration de cellules permet d'individualiser quelques cellules uniques dans chaque microgoutte en essayant de limiter leurs interactions directes. Ces cellules peuvent par exemple être des bactéries, des levures ou des cellules de mammifères.
  • Alternativement, une forte concentration en cellules avec toujours une gélification rapide, permet d'obtenir un grand nombre de cellules toujours individualisées mais proches les unes des autres. On peut alors s'intéresser par exemple aux interactions entre cellules, possiblement en co-culture, via des secrétions paracrines.
  • Les cellules peuvent cependant être maintenues encapsulées longtemps en phase liquide avant gélification. Une faible concentration en cellules permet alors, par exemple, d'étudier des cellules en suspension, indépendantes de l'ancrage, comme les lymphocytes. Une forte concentration en cellules et une forme des microgouttes piégées permettant la sédimentation des cellules, permet de mettre en contact les cellules qui vont pouvoir se réorganiser en sphéroïdes.
  • Le procédé peut également permettre de former des sphéroïdes directement dans la puce de manière contrôlée. Le volume des microgouttes créées peut être contrôlé par le dispositif de formation de microgouttes en amont de la puce microfluidique. Ce volume est de préférence réglé de manière que les microgouttes, une fois piégées, aient un diamètre égal à celui du piège et une forme sphérique. Pour ce faire, la profondeur du piège est de préférence au moins égale à son diamètre. Le fait que le diamètre de la microgoutte piégée coïncide avec celui du piège, permet d'assurer une efficacité de piégeage importante. La forme sphérique favorise la formation de sphéroïdes. Pour cette application particulière, les microgouttes contiennent de préférence des cellules en suspension dans une phase aqueuse comprenant ou constituée de milieu de culture et d'hydrogel. Une fois les pièges remplis par une telle microgoutte, le flux d'huile extérieur est arrêté, ce qui stoppe les recirculations au sein des microgouttes et favorise la sédimentation des cellules. La forme sphérique des microgouttes dans les pièges induit alors une concentration des cellules en leur points le plus bas, jusqu'à ce qu'elles entrent en contact. Garder alors la puce au repos, dans des conditions favorables à la survie et au bon fonctionnement métabolique des cellules, notamment en température, pendant une durée allant de plusieurs heures à plusieurs jours, permet la réorganisation des cellules concentrées au fond de la microgoutte piégée, en sphéroïde.
  • La durée nécessaire à la formation de sphéroïdes peut notamment dépendre du type cellulaire utilisé et de la composition de l'hydrogel. Pour des cellules hépatiques de rat H4IIEC3 dans une solution d'agarose à 1% en masse dilué dans du milieu de culture, il a été constaté que cette durée est inférieure à 24 heures. Bien entendu, l'hydrogel est maintenu liquide pendant le temps de formation des sphéroïdes.
  • Ce procédé permet de former rapidement un grand nombre de sphéroïdes de tailles très homogènes. En effet, la taille des sphéroïdes est donnée par le nombre de cellules encapsulées dans chaque microgoutte et donc par la concentration de la solution de cellules injectée dans la puce microfluidique. La distribution du nombre de cellules par microgoutte, et donc celle de la taille des sphéroïdes formés, est très homogène à condition que les cellules soient suffisamment individualisées au moment de l'injection. En moyenne, dans les expériences menées par les inventeurs, 98% des pièges ont été remplis avec une microgoutte d'agarose liquide qui après 24 heures d'incubation contenait un sphéroïde bien réorganisé.
  • Les sphéroïdes obtenus dans la puce microfluidique peuvent être gardés en culture plusieurs jours. Par exemple, des sphéroïdes de cellules H4IIEC3 encapsulés dans l'agarose peuvent être mis en culture dans la puce pendant une semaine sans altération significative de leur viabilité tout en conservant une fonctionnalité forte (dans cet exemple une sécrétion d'albumine forte et continue).
  • Le procédé présenté ici et la puce microfluidique obtenue en le mettant en œuvre, constituent un excellent outil de criblage de médicaments. On peut par exemple créer des sphéroïdes de cellules cancéreuses et observer si leur viabilité décroit au cours du temps en fonction de l'exposition à une molécule testée. En ajoutant à la puce un dispositif qui permet d'instaurer un gradient de concentration au sein de la chambre, ou bien en mettant en place des puces parallèles, on peut tester tout une gamme de concentrations dans un même système. La grande efficacité du procédé de formation de ces sphéroïdes permet aussi d'en créer un grand nombre à partir d'échantillons très limités. 500 sphéroïdes d'environ 70 µm de diamètre peuvent ainsi être formés avec seulement 100 000 cellules.
  • Les cellules qui composent les sphéroïdes peuvent aussi être de différents types pour aborder des thématiques de co-culture. Ces types cellulaires peuvent être mélangés de manière homogène en solution avant l'injection dans la puce ou être agencés selon une certaine organisation structurelle, dans plusieurs couches d'hydrogels successives ou simplement par adhésion à l'hydrogel après avoir été perfusées dans la phase aqueuse externe. On peut par exemple associer des fibroblastes et des cellules épithéliales pour former un modèle de peau et tester la toxicité de produits cosmétiques, des neurones et des astrocytes pour modéliser le cerveau, ou encore des cellules endothéliales et des cellules musculaires lisses comme dans la paroi des vaisseau sanguins.
  • Comme le procédé présenté ici permet d'atteindre un contrôle très poussé du microenvironnement des cellules en culture, il est aussi un excellent outil pour l'étude de la différenciation de cellules souches. Les cellules encapsulées peuvent en effet être soumises à toute une gamme de concentration de facteurs de différenciation et, potentiellement en même temps, à toute une gamme de rigidité de la matrice en jouant par exemple sur la concentration de l'hydrogel. De la même manière, le procédé peut être utilisé pour observer le développement embryonnaire au cours du temps en interaction avec les facteurs physico-chimiques du milieu extérieur.
  • Dans le cas de cellules primaires, issues d'un patient, ce procédé permet de faire un diagnostic médical basé sur la réponse des cellules à certains marqueurs. Dans ce cas, les cellules sont capturées avec un très faible taux de pertes. On peut alors soumettre les cellules à des tests connus de diagnostic de certaines maladies, comme une caractérisation d'une biopsie cancéreuse. Par exemple, on peut tester la présence d'une mutation dans le génome des cellules encapsulée, par exemple par réactions en chaîne par polymérase (PCR, pour l'anglais « Polymerase Chain Reaction ») in situ, ou par la méthode FISH. On peut encore détecter l'expression de protéines spécifiques par des méthodes de marquages, par exemple en apportant des anticorps pour l'immuno-marquage ou pour une méthode immuno-enzymatique ELISA (de l'anglais « Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ») in situ.
  • Le procédé décrit ci-avant offre la possibilité d'effectuer toutes les étapes d'analyse et de culture de cellules dans une puce microfluidique, grâce à la gélification des microgouttes suite à leur piégeage dans la puce. Ceci permet d'utiliser des volumes de réactifs beaucoup moins importants que pour des tests réalisés en plaques multi-puits ou en boîtes de cultures. Ceci permet également de suivre les réponses de cellules au cours du temps, suite à différents stimuli.
  • Le procédé décrit ci-avant peut être mis en œuvre facilement dans un dispositif comprenant :
    • des moyens pour former des microgouttes d'hydrogel contenant des cellules,
    • une zone de piégeage, notamment une puce microfluidique, pour piéger les microgouttes d'hydrogel à des endroits prédéterminés, et
    • des moyens de gélification d'une partie au moins des microgouttes piégées.
  • Les moyens de gélification comprennent par exemple un dispositif d'injection d'un agent chimique dans la zone de piégeage et/ou des moyens de régulation de la température, par exemple pour refroidir la puce microfluidique.
  • Le dispositif peut également comprendre des moyens de dégélifier au moins certaines des microgouttes d'hydrogel gélifiées, par exemple un laser.
  • Le procédé décrit ci-avant permet également de réaliser un produit de microgouttes gélifiées, comprenant une zone de piégeage de microgouttes, en particulier une puce microfluidique, et des microgouttes gélifiées incluant chacune une ou des cellules, piégées dans la zone de piégeage, les microgouttes gélifiées étant cryo-préservées. Les cellules peuvent être agrégées sous forme d'amas ou de sphéroïdes. Les microgouttes gélifiées peuvent baigner dans un fluide, de préférence dans une solution aqueuse ou dans une huile, le fluide et les microgouttes étant de préférence cryo-préservés. Cette cryo-préservation permet notamment le maintien des cellules dans des conditions stables durant une longue période, en vue de les transporter ou de les stocker pour une analyse ultérieure.
  • Les cellules biologiques encapsulées dans les microgouttes peuvent être des bactéries, des levures, des cellules eucaryotes, des cellules de mammifères, de préférence des cellules de mammifères à l'exclusion de cellules humaines, de préférence encore des cellules de rat ou d'autres mammifères, ou des cellules humaines isolées de leur environnement naturel.
  • Bien entendu, l'invention ne se limite pas aux seuls exemples décrits ci-avant mais est, au contraire, susceptible de nombreuses variantes accessibles à l'homme de l'art, dans le cadre du jeu de revendications ci-joint.
  • En particulier, les échantillons mis en œuvre, outre des cellules, peuvent notamment être également des molécules, des billes de plastiques fonctionnalisées en les couplant à des molécules.
  • Par ailleurs, les microgouttes piégées peuvent être fusionnées avec d'autres microgouttes apportées par le flux de solution aqueuse.
  • Également, la solution aqueuse dont sont constituées les microgouttes, peut contenir une solution biochimique, la solution biochimique comportant de préférence au moins l'un parmi des lipides (acides gras, etc.), des glucides (sous forme monomérique ou de polysaccharides etc.), des acides aminés et protéines (facteurs de croissances, cytokines, anticorps, antigènes etc.), ainsi que des tampons de salinité et/ou de pH.
  • Enfin, selon une variante, l'huile (ou phase huileuse) entourant les microgouttes peut contenir des huiles fluorées (type FC40) ou encore des solutions photo-réticulables non miscibles à l'eau (type Norland Optical Adhesive), qui, une fois polymérisées permettent de gélifier l'huile et d'ainsi isoler physiquement et sélectivement les microgouttes. On peut ainsi cloisonner, isoler de manière plus robuste, les microgouttes les unes par rapport aux autres. Ceci permet d'éviter que deux microgouttes ne fusionnent, provoquant un mélange des échantillons qu'elles contiennent. Ceci permet également de stocker de manière durable les échantillons, les risques d'évaporation, notamment, des microgouttes étant fortement diminués du fait du cloisonnement des microgouttes par l'huile gélifiée, qui forme un compartiment solide autour des microgouttes.
  • Une fois qu'une partie de l'huile a été gélifiée, on peut pousser hors de la zone de piégeage les microgouttes autour desquelles l'huile n'a pas été gélifiée. Pour ce faire, on peut mettre en œuvre un flux d'huile ou d'un autre fluide dans la zone de piégeage, le flux étant suffisamment fort pour entraîner les microgouttes. On peut ainsi ne garder dans la zone de piégeage que les microgouttes autour desquelles l'huile a été gélifiée.
  • Il est à noter ici que des microgouttes peuvent être gélifiées même dans le cas où l'huile est gélifiée. En outre, le procédé peut bien entendu comporter dans ce cas où une partie de l'huile est gélifiée, une étape postérieure de dégélification de l'huile gélifiée.

Claims (18)

  1. Procédé de manipulation dans un système microfluidique de microgouttes (14) incluant des échantillons (16), comprenant les étapes consistant à :
    i) former dans une huile des microgouttes (14) d'une solution aqueuse contenant un échantillon (16), la solution aqueuse contenant un échantillon (16) comprenant un agent gélifiant,
    ii) piéger les microgouttes (14) au moyen de pièges de tension de surface (12) prédisposés dans une zone de piégeage (10), et
    iii) gélifier au moins une partie des microgouttes (14) piégées,
    les étapes du procédé étant réalisées dans un unique système microfluidique.
  2. Procédé de manipulation dans un système microfluidique de microgouttes (14) incluant des échantillons (16), comprenant les étapes consistant à :
    i) former dans une huile des microgouttes (14) d'une solution aqueuse contenant un échantillon (16), l'huile comprenant un agent gélifiant,
    ii) piéger les microgouttes (14) au moyen de pièges de tension de surface (12) prédisposés dans une zone de piégeage (10), et
    iii) gélifier au moins une partie de l'huile dans la zone de piégeage (10).
  3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'étape iii) consiste à gélifier au moins une partie des microgouttes, le procédé comprenant en outre l'étape consistant à :
    iv) remplacer l'huile entourant les microgouttes (14) gélifiées par une solution aqueuse,
    la solution aqueuse remplaçant l'huile contenant de préférence une solution biochimique, la solution biochimique comportant de préférence au moins l'un parmi un ou des tampons de pH ou de salinité, un ou des nutriments, un ou des facteurs de croissance, des cytokines, un ou des anticorps, un ou des antigènes, une ou des molécules, notamment de médicament, une ou des cellules, des lipides, des glucides, notamment sous forme monomérique ou de polysaccharides, des acides aminés et/ou des protéines.
  4. Procédé selon la revendication 1 ou 3, comprenant une étape v) postérieure à l'étape iii), et de préférence postérieure à l'étape iv), consistant à dégélifier au moins certaines des microgouttes (14) gélifiées à l'étape iii), le procédé comprenant de préférence une étape vi), postérieure à l'étape v), consistant à évacuer les microgouttes (14) dégélifiées et/ou les échantillons (16) contenus dans ces microgouttes (14) dégélifiées hors de la zone de piégeage (10).
  5. Procédé selon la revendication 2, comprenant une étape postérieure à l'étape iii) consistant à pousser hors de la zone de piégeage les microgouttes autour desquelles l'huile n'a pas été gélifiée
  6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'échantillon (16) est l'un parmi une ou des cellules, notamment un sphéroïde de cellules, un ou plusieurs billes piégeant des molécules, les billes étant notamment en matière plastique, une ou des molécules.
  7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape iii) est réalisée après sédimentation des échantillons (16), notamment des cellules, dans les microgouttes (14) piégées, en particulier après formation de sphéroïdes ou dans lequel l'étape iii) est réalisée avant sédimentation des échantillons (16) dans les microgouttes (14) piégées.
  8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la zone de piégeage est formée par une puce microfluidique (10) comprenant les pièges de tension de surface (12).
  9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape i) consiste à :
    a) injecter dans une zone, en amont de la zone de piégeage (10), une solution aqueuse contenant des échantillons (16) et un agent gélifiant, le cas échéant,
    b) injecter de l'huile, contenant un agent gélifiant, le cas échéant, dans la zone en amont de la zone de piégeage pour pousser la solution aqueuse contenant des échantillons (16) vers une sortie de la zone de piégeage (10), l'injection d'huile étant réalisée de manière à former des microgouttes (14) contenant des échantillons (16), puis
    c) déplacer les microgouttes (14) jusqu'au niveau de la zone de piégeage (10).
  10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel les étapes i) et ii) sont réalisées simultanément dans la zone de piégeage (10), en réalisant les actions consistant à :
    - remplir la zone de piégeage (10) de solution aqueuse contenant des échantillons (16) et un agent gélifiant, le cas échéant, puis à
    - injecter de l'huile, contenant un agent gélifiant, le cas échéant, dans la zone de piégeage (10) pour pousser la solution aqueuse contenant des échantillons (16) vers une sortie de la zone de piégeage (10), les pièges de tension de surface (12) étant conformés pour permettre la cassure des microgouttes (14) contenant des échantillons (16) au niveau des pièges de tension de surface (12).
  11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape iii) consiste en au moins l'un parmi :
    - refroidir ou chauffer des microgouttes (14) et/ou l'huile,
    - injecter une solution contenant un agent chimique de gélification dans la zone de piégeage,
    - soumettre les microgouttes (14) et/ou l'huile à une lumière provoquant la gélification, notamment une lumière UV.
  12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l'huile contient un agent surfactant, le procédé comprenant de préférence une étape de lavage de l'agent surfactant avant l'étape iv).
  13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant une étape, préalable à l'étape i), de choix de la forme des pièges de tension de surface (12) en fonction de la forme désirée des microgouttes (14), de préférence la zone de piégeage et les pièges étant choisis pour :
    - former des microgouttes (14) piégées avec un fond plat, ou
    - former des microgouttes (14) piégées avec un fond non-plat, notamment incurvé, de préférence convexe..
  14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant une étape d'application d'un stimulus aux échantillons (16) contenus dans au moins une partie des microgouttes (14) piégées, gélifiées ou non.
  15. Dispositif pour mettre en œuvre un procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 3 et 4 ou l'une quelconque des revendications 6 à 13 en combinaison avec au moins la revendication 1, comprenant :
    - une solution d'hydrogel contenant des échantillons (16),
    - des moyens pour former des microgouttes (14) de solution d'hydrogel contenant des échantillons (16),
    - une zone de piégeage, notamment une puce microfluidique, pour piéger les microgouttes (14) à des endroits prédéterminés,
    - des moyens de gélification d'une partie au moins des microgouttes (14) piégées, les moyens de gélification comprenant de préférence un dispositif d'injection d'un agent chimique dans la zone de piégeage (10), et
    - optionnellement des moyens de dégélifier au moins certaines des microgouttes (14) d'hydrogel gélifiées.
  16. Dispositif pour mettre en œuvre un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 5 ou l'une quelconque des revendications 6 à 13 en combinaison avec au moins la revendication 2, comprenant :
    - des moyens pour former des microgouttes (14) contenant des échantillons (16),
    - une zone de piégeage, notamment une puce microfluidique, pour piéger les microgouttes (14) à des endroits prédéterminés, la zone de piégeage contenant une huile comprenant un agent gélifiant,
    - des moyens de gélification de l'huile, les moyens de gélification comprenant de préférence un dispositif d'injection d'un agent chimique dans la zone de piégeage (10), et
    - optionnellement des moyens de dégélifier au moins d'une partie de l'huile gélifiée.
  17. Produit de microgouttes gélifiées, comprenant une zone de piégeage de microgouttes, en particulier une puce microfluidique (10), et des microgouttes (14) gélifiées incluant chacune un échantillon (16), piégées dans la zone de piégeage (10),
    les microgouttes (14) gélifiées étant cryo-préservées, les échantillons (16) étant de préférence des cellules de mammifères, par exemple des cellules de mammifères à l'exclusion de cellules humaines, des bactéries, des levures ou d'autres cellules utilisées dans des bioprocédés, des molécules, des billes piégeant des molécules en surface.
  18. Produit de microgouttes comprenant une zone de piégeage de microgouttes présentant une pluralité de pièges de tensions de surface (12), en particulier une puce microfluidique (10), et des microgouttes (14) incluant chacune un échantillon (16), piégées dans les pièges de tensions de surface (10),
    les microgouttes (14) baignant dans une huile gélifiée, les microgouttes (14) et l'huile gélifiée étant de préférence cryo-préservées,
    les échantillons (16) étant de préférence des cellules de mammifères, par exemple des cellules de mammifères à l'exclusion de cellules humaines, des bactéries, des levures ou d'autres cellules utilisées dans des bioprocédés, des molécules, des billes piégeant des molécules en surface.
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