JP2007075094A

JP2007075094A - 流路内ゲル作製のための構造および方法

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Publication number: JP2007075094A
Application number: JP2005303636A
Authority: JP
Inventors: Minoru Seki; 実関; Tetsuya Shibanuma; 哲也柴沼; Masumi Yamada; 真澄山田
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2005-09-15
Filing date: 2005-09-15
Publication date: 2007-03-29

Abstract

【課題】定量的なゲルを単純な構成と、簡単な操作のみで作製することができ、また同時に、少数の細胞や少数の分子などを流路内に定量的に固定することができる流路内ゲル作製のための構造および方法を提供する。
【解決手段】入口・出口を少なくとも１つずつ有する流路と、前記流路の流路壁における開口部において接続される突起状分岐構造を有する構造を用いる方法であり、まず、前記流路の入口から液体を導入することによって、前記突起状分岐構造の少なくとも一部分を前記液体で満たし、次に、前記流路に残存する前記液体を取り除くことによって、前記突起状分岐構造内においてある一定の体積の液体秤取を行い、さらに、その秤取した前記液体をゲル化することによって一定量のゲルの作製を可能にする流路内ゲル作製のための構造および方法を利用する。

Description

本発明は流路内ゲル作製のための構造および方法に関する。さらに詳細には、本発明は少数の細胞または、少数の分子の定量的な固定化を行うのに好適な、流路内ゲル作製のための構造および方法に関する。

近年、単一細胞や単一分子を用いた解析に関する研究が盛んである。例えば、単一細胞を用いて化学物質などの刺激が細胞増殖に及ぼす影響を評価することで、複数の細胞からなる集団での解析に比べより正確な解析が可能となる。例えば、酵素分子の一分子ごとの活性の違いを統計的に解析することで、より詳細な分子挙動に関する知見を得る、といったことも可能となる。このような特徴から、単一細胞解析や単一分子解析は重要視されている。

そのため、少数の細胞や少数の分子を定量的に捕捉・選抜する技術の必要性が高まってきており、これまでに特許文献１のような技術が開発されている。この文献では、光ピンセットを用いることで、単一細胞を正確に捕捉・選抜する技術に関して報告されている。しかし、この方法では、単一細胞を得るのに時間がかかり、また、多数の単一細胞を補足・選抜して細胞培養の並列化を図ることが難しい、といった問題があった。
特開２００２−１５３２６０

一方、マイクロチャネルに代表される微小な流路内において、ゲルを作製し固定化することは、細胞や分子の固定化や、その固定化した細胞や分子の更なる解析を行う際に有用である。流路内でゲルの作製を行った例としては非特許文献１のようなものがある。これによると、流路内で細胞懸濁液をゲル化し、ゲルで包括された細胞を培養することが可能であると報告されているが、この例では定量的なゲルの作製が不可能であり、さらに、ゲル作製において精密な液体操作が必要となる、といった問題があった。
「ラボオンアチップ（ＬａｂｏｎａＣｈｉｐ）」（２００５）、５、ｐ．５５３−５５９

したがって本発明では、定量的なゲルを単純な構成と、簡単な操作のみで作製することができ、また同時に、少数の細胞や少数の分子などを流路内に定量的に固定することができる流路内ゲル作製のための構造および方法を提供することを目的とする。

本発明による流路内ゲル作製のための構造および方法の第１の実施態様によれば、入口・出口を少なくとも１つずつ有する流路と、前記流路の流路壁における開口部において接続される突起状分岐構造を有する構造を用い、まず、前記流路の入口から液体を導入することによって、前記突起状分岐構造の少なくとも一部分を前記液体で満たし、次に、前記流路に残存する前記液体を取り除くことによって、前記突起状分岐構造内においてある一定の体積の液体秤取を行い、さらに、その秤取した前記液体をゲル化することによって一定量のゲルの作製が可能となるため、
流路内においてゲルを定量的に作製し、液体に含まれる物質を流路内に固定化することが可能となる。

本発明による流路内ゲル作製のための構造および方法の第２の実施態様によれば、請求項１に記載の流路内ゲル作製のための構造および方法において、前記流路は流路壁に複数の開口部を有し、前記流路の流路壁における複数の開口部においてそれぞれ接続される複数の突起状分岐構造を有する構造を用い、まず、前記流路の入口から液体を導入することによって、複数の前記突起状分岐構造の少なくとも一部分を前記液体で満たし、次に、前記流路に残存する前記液体を取り除くことによって、複数の前記突起状分岐構造内においてある一定の体積の液体秤取を行い、さらに、その秤取した複数の前記液体をゲル化することによって複数の一定量のゲルの作製が可能となるため、
流路内において複数のゲルを定量的にかつ並列的に作製し、液体に含まれる物質を流路内に並列的に固定化することが可能となる。

本発明による流路内ゲル作製のための構造および方法の第３の実施態様によれば、請求項１または請求項２のいずれか一項に記載の流路内ゲル作製のための構造および方法において、前記液体とは懸濁液であるため、定量的な懸濁液のゲル化が可能となり、オルガネラ、生体高分子などの粒子を流路内に固定化することが可能となる。

本発明による流路内ゲル作製のための構造および方法の第４の実施態様によれば、請求項３に記載の流路内ゲル作製のための構造および方法において、懸濁液に含まれる粒子とは細胞であるため、
特に、細胞を用いた実験系の構築や、単一細胞の挙動解析が可能となる。

本発明による流路内ゲル作製のための構造および方法の第５の実施態様によれば、請求項１〜４のいずれか一項に記載の流路内ゲル作製のための構造および方法において、前記液体をゲル化した後、前記流路から流体を導入することによって、作製したゲルに含まれる物質または粒子と前記流路から導入した前記流体に含まれる物質を反応することができるため、
例えば、固定化した細胞の培養、薬剤スクリーニングなどが可能となる。

本発明による流路内ゲル作製のための構造および方法の第６の実施態様によれば、請求項１〜５のいずれか一項に記載の流路内ゲル作製のための構造および方法において、前記流路および前記突起状分岐構造とは少なくとも一部がマイクロチャネルであるため、
高密度解析、集積化および並列化、操作の自動化、ゲルの微小化、再現性の向上などが可能となる。

本発明による流路内ゲル作製のための構造および方法の第７の実施態様によれば、請求項１〜６のいずれか一項に記載の流路内ゲル作製のための構造および方法において、前記流路および前記突起状分岐構造の少なくとも一部分は空気透過性を有するシリコーンポリマーを基材として形成されたものであるため、
基材を通して空気が抜けやすくなり、ゲル作製の定量性を向上させることが可能となる。

本発明は以上に述べられた特徴を有するため、本発明のような突起状分岐構造を有する構造を用いれば一定量の体積のゲルを定量的に作製することができ、さらに、本発明のように複数の突起状分岐構造を用いれば多数の一定量の体積のゲルを非常に簡便な操作で並列的に作製することができる、という優れた効果を発揮する。

また、本発明は以上に述べられた特徴を有するため、液体中に含まれる酵素分子などの物質や、粒子懸濁液中に含まれる細胞やオルガネラなどをゲル化によって流路内に固定化することができる。さらに、固定化した酵素分子などの物質を利用して化学反応を行うこともでき、また、固定化した細胞の培養を行うことも可能になるため、反応装置や培養装置としての利用が可能になる、という優れた効果を発揮する。

以下、添付の図面を参照しながら、本発明による流路内ゲル作製のための構造および方法を実施するための最良の形態を詳細に説明する。

図１（ａ）、図１（ｂ）および図１（ｃ）には、本発明による流路内ゲル作製のための構造および方法を実施するための基本的な原理が示されている。なお図１（ａ）、図１（ｂ）および図１（ｃ）は紙面に対して垂直方向を深さ方向とする。

断面形状が矩形である直線状流路１０の流路壁１２が、長方形の開口部１１を有し、さらに、開口部１１において接続される直方体状の形状の突起状分岐構造（構造２０００）を有している。（図１（ａ）参照）

まず、流路１０の入口から構造２０００に液体２０を導入する（図１（ｂ）参照）。ここで液体２０とは、細胞、オルガネラ、生体高分子などの粒子懸濁液であってもよい。

この際、構造２０００に導入される液体２０は必ずしも構造２０００の体積すべてを満たさなくてもよい。例えば、構造２０００の内部に空気などが残っていても、構造２０００に導入される液体２０は構造２０００の体積または形状に対応した体積であるため、定量的に液体２０を秤り取ることが可能である。また、流路１０および突起状分岐構造の基材としてポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などの空気透過性を有するシリコーンポリマーを用いれば、空気が基材を通して逃げるため液体２０が構造２０００を満たしやすくなり、より定量的に液体２０を秤り取ることが可能になる。

続いて、空気の圧力によって流路１０内に残留する液体２０を出口へ押し出してとりのぞくことにより（図１（ｃ）参照）、構造２０００内に液体が残留し、一定量の液体を秤り取ることができる。

さらに、構造２０００に残留する液体１０の体積が構造２０００の体積と一致しなくても、定量的なゲルの作製を行うことは可能である。また、開口部１１の面積を小さくすることによって、流路１０に引き込まれる液体を減らし、秤取液体の体積を構造２０００にほぼ等しい体積にすることができる。

最後に、流路１０から液体２０をゲル化させる成分を含む液体３０を導入し、構造２０００に残留した液体２０と液体３０を接触させることによって液体２０をゲル化する。これにより定量的なゲルを作製することができる。

ここで、構造２０００に残留した液体２０の体積に対応した体積のゲルが生成するのであれば、液体２０をゲル化させた前後で体積に変化があってもよい。例えば、液体２０としてアルギン酸ナトリウム水溶液、液体３０として塩化カルシウム水溶液を用い、アルギン酸カルシウムゲルを作製する場合などでは、脱水反応によってゲル生成が起こるため、わずかではあるが生成したゲルの体積は液体２０の体積に比べ小さくなる。しかし、ゲルの体積はゲル化前の液体２０の体積に対応したものであり作製されたゲルの体積がゲル化前の液体２０の体積とほぼ等しくなるため、定量的にゲルを作製することは可能である。

以下、本発明の流路内ゲル作製のための構造および方法に関する実施例について記載する。

本実施例において用いたのは、シリコーンポリマーの一種であるポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を基材として形成したマイクロチャネルである。ここで言うマイクロチャネルとは、幅、深さ、径、長さなどのスケールのうち少なくとも１つが０．１μｍ〜５０００μｍの範囲で形成されている流路や構造物などのことである。なお、本実施例のマイクロチャネルの基材はＰＤＭＳが基材であるが、他の基材として、ＰＤＭＳとは表面特性が異なるアクリルなどのポリマーやガラスなどの無機材料を用いてもよい。

本実施例におけるマイクロチャネルは、Ｓｉ基板上に流路および突起状分岐構造を含むマイクロチャネルの鋳型を作製し、その型を転写したＰＤＭＳの板（ＰＤＭＳレプリカ）を作製することによって形成した。

なお、本実施例で用いるマイクロチャネルは、上層と下層の２つのＰＤＭＳレプリカを貼り合わせて形成される。しかし、２層のＰＤＭＳレプリカのうち上層のレプリカにおける下面と下層のレプリカにおける上面にそれぞれ流路構造が存在しなくても、ある流路に対して突起状分岐構造が接続されているような構造を作製できればよいため、１つのＰＤＭＳレプリカのみに流路および突起状分岐構造が存在するものと、平板上で流路構造を持たないＰＤＭＳの板を用いてマイクロチャネルを作製してもよい。

本実施例で用いたマイクロチャネルの構造は図２に示すとおりである。下層のＰＤＭＳレプリカにおける流路構造の深さは２５μｍである。また、流路１０ａの幅は２００μｍである。突起状分岐構造の長さＬは７５μｍ、幅Ｗは７５μｍである。同じ形状を有する突起状分岐構造が１００個（構造２００１〜２１００）存在し、それぞれは７５μｍの間隔で流路１０ａに接続されている。上層のＰＤＭＳレプリカにおける流路構造は、深さは１５μｍであり、流路１０ｂの幅は２００μｍである。上層と下層は貼り合わせてあるため、流路１０ａと流路１０ｂは事実上、幅２００μｍ、深さ４０μｍの１つの流路（流路１０）である。流路１０の長さは約２０ｍｍであり、マイクロチャネルへの流体の出入口として、両端に直径１ｍｍの穴が連結されている。

長さ、幅、深さは本実施例で設定されたとおりでなくてもよい。また、突起状分岐構造の体積についても、本実施例ではおよそ１４０ピコリットルであるが、それ以外の体積でもよい。

流路１０は直線状流路構造である必要はなく、曲線や折れ曲がりを持った流路でもよく、また、断面が円管状や三角形の流路等でもよい。

本実施例では、流路１０は１００個の突起状分岐構造を有しているが、必ずしも複数でなくてもよい。さらに、１００個以上の突起状分岐構造を有する流路を用いて、より並列的なゲル化を行ってもよい。

また、流路１０における突起状分岐構造のうち、少なくとも１つは、図２のように流路１０の側面だけではなく、例えば、流路の底面や上面などに存在してもよい。これによって１つの流路へより多くの突起状分岐構造を接続することができ、高密度な固定化が可能になる。また、複数の流路が１つずつ存在する出入口を共有していてもよく、これによって、より多数のゲルの作製が可能となる。

なお、少なくとも突起状分岐構造は図２のような四角形型（直方体型）ではなく、例えば、図３に示すような三角形型（三角柱型）や半円型（半円柱型）のような形状でもよく、例えば、ゲルの定量性を向上させる場合や、任意の形のゲルを作製する場合に任意に選択することができる。

実際の操作としては、モデルとして酵母細胞の固定化を行った。まず、流路１０の入口から、空気の圧力を用いて酵母細胞を含む１ｗｔ％アルギン酸ナトリウム水溶液を導入し、構造２００１〜２１００を懸濁液で満たした。

なお、固定化を行う物質としては、酵母細胞に限らず、目的に応じて他の細胞やオルガネラ、生体高分子などを用いることができる。また、アルギン酸カルシウムゲルに限らず、ゲル化を行うことのできる物質を含む溶液を懸濁液として用いることができる。

また、液体を導入する方法としては、本実施例のような空気の圧力を利用した方法以外にも、毛細管引力を利用して懸濁液を導入する方法などを用いることができる。

また、液体または懸濁液の導入の際、突起状分岐構造はその体積すべてが液体で満たされる必要はない。例えば、一部分に気体が残っていても、定量的に懸濁液のゲル化が可能であればよい。

次に、流路１０内の酵母懸濁液を取り除くため、入口から流路１０に空気を導入した。この操作によって、流路１０から懸濁液が取り除かれ、構造２００１〜２１００に酵母細胞を含むアルギン酸ナトリウム水溶液が残留した。したがって、懸濁液を突起状分岐構造内において一定量の体積で秤取することができた。

なお、流路１０から懸濁液を取り除く際に、入口から空気を導入して懸濁液を取り除く方法を用い、さらに前記のように懸濁液を導入する際にも空気の圧力を用いれば、導入および液体を取り除く操作を簡便に行うことが可能であるが、他の方法を用いてもよく、例えば、出口から液体を吸引して流路１０から液体を取り除くといった方法でもよい。

また、突起状分岐構造に残留する懸濁液が、微小液体の秤取などにおいて、確率的に粒子を含まないことがあってもかまわない。つまり、構造２００１〜２１００のうち、少なくとも１つが、粒子を１つも含んでいない液体であっても、構造２００１〜２１００のそれぞれの粒子数を統計的に推測することが可能であればよい。なお、導入する懸濁液の細胞濃度などの条件を適切に設定することで、構造２００１〜２１００のうち少なくとも１つに単一細胞を残留させ固定化することが可能となり、それによって、単一細胞の挙動の解析などを行うことが可能となる。なお、単一細胞に限らず単一分子でも同様なことが可能である。

さらに、突起状分岐構造に残留する懸濁液または液体の体積は、必ずしも突起状分岐構造の体積と一致しなくても、定量的なゲルの作製を行うことは可能である。

なお、１００個の突起状分岐構造の体積をすべて同じ体積ではなく、さまざまな体積のものにすることによって、さまざまな体積のゲルの作製を並列的に行うことが可能となる。

次に、構造２００１〜２１００に残留した液体をゲル化するため、５ｗｔ％塩化カルシウム水溶液を入口から導入し、マイクロチャネル内で構造２００１〜２１００に秤取した１ｗｔ％アルギン酸ナトリウムを含む懸濁液と接触させ、アルギン酸カルシウムゲルとしてマイクロチャネル内への細胞の固定化を行った。

この際、突起状分岐構造中に秤取された懸濁液の全体をゲル化させなくても、塩化カルシウムと接触した部分のみをゲル化すれば、懸濁液または液体に含まれる物質を突起状分岐構造内に定量的に固定化することが可能である。

なお、固定化に用いるゲルおよびゲル化方法については、液体として例えば、アガロース水溶液などの液体を用い、ゲル化しない程度の温度を保ちながら、突起状分岐構造に導入し、流路１０からその液体を取り除き、残留した液体の温度を下げることによりゲル化を行う方法でもよいし、また、液体として特定の波長の光を照射するとゲル化が起こるような液体を用い、前述のようにその液体を構造２００１〜２１００に残留させた後、特定の波長の光を照射してゲル化させる方法などでもよく、これらによって、さまざまなゲルの定量的な作製が可能となる。

最後に、固定化した細胞を増殖させるため、水１Ｌあたりグルコース４０ｇ、ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、リン酸二水素カリウム５ｇ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇを含む培養液を、入口から流量１０μＬ／ｍｉｎで導入した。

本実施例では、細胞として酵母細胞を用いたが、他の細胞を用いてもよい。その際、当然であるが、培養液も本実施例とは異なる成分のものを用いてかまわない。さらに、酵母の培養液として上記と異なる成分の培養液を用いてもよい。

なお、本実施例は細胞の固定と培養を行った例であるが、細胞の代わりに酵素や金属粒子の触媒などを流路内に固定化し、入口から基質や反応物などを流すことによって化学反応を行うことも可能である。

さらに、流路の出入口は、流路１つに対してそれぞれ複数存在してもよい。例えば、図４に示すように入口が２つ、出口が５つ存在する構造を用いて、各々の突起状分岐構造内に細胞の固定化を行った後に、入口４０ａから培養液を導入し、入口４０ｂからは入口４０ａとは異なる成分の培養液を導入することによって、それぞれの入口から導入された培養液が合流する場所において、成分の濃度勾配を形成し、それぞれの流路の突起状分岐構造に濃度条件の異なる液体を導入することができる。これを利用すれば、２種類の液体の混合比が細胞の増殖へおよぼす影響についての評価を並列的に行うといったことも可能となる。

また、図５に示すように、１つのマイクロデバイスに、流路構造が複数存在してもよい。このような構造を用いることで、それぞれの流路の突起状分岐構造に細胞を固定化し、それぞれの入口から異なる液体を導入し、多条件での培養を並列的に行うことも可能である。

本発明による流路内ゲル作製のための構造および方法の原理図を示し、図１（ａ）（ｂ）（ｃ）は最も簡単な原理図である。本発明による流路内ゲル作製のための構造および方法の実施形態を備えたマイクロデバイスを示した図である。（ｂ）は（ａ）における突起状分岐構造の拡大図である。本発明による流路内ゲル作製のための構造および方法における、突起状分岐構造の例を示した図である。本発明による流路内ゲル作製のための構造および方法の実施形態を備えたマイクロデバイスを示した図である。本発明による流路内ゲル作製のための構造および方法の実施形態を備えたマイクロデバイスを示した図である。

符号の説明

１０流路
１０ａ流路
１０ｂ流路
１１開口部
１２流路壁
２０液体
２１液体
３０基板
３１基板
４０ａ流路入口
４０ｂ流路入口
５０マイクロデバイス
５１マイクロデバイス
５２マイクロデバイス
２０００突起状分岐構造
２００１〜２１００突起状分岐構造

Claims

入口・出口を少なくとも１つずつ有する流路と、前記流路の流路壁における開口部において接続される突起状分岐構造
を有する構造を用い、
まず、前記流路の入口から液体を導入することによって、前記突起状分岐構造の少なくとも一部分を前記液体で満たし、次に、前記流路に残存する前記液体を取り除くことによって、前記突起状分岐構造内においてある一定の体積の液体秤取を行い、さらに、その秤取した前記液体をゲル化することによって
一定量のゲルの作製を可能にする
流路内ゲル作製のための構造および方法。
請求項１に記載の流路内ゲル作製のための構造および方法において、
前記流路は流路壁に複数の開口部を有し、
前記流路の流路壁における複数の開口部においてそれぞれ接続される複数の突起状分岐構造
を有する構造を用い、
まず、前記流路の入口から液体を導入することによって、複数の前記突起状分岐構造の少なくとも一部分を前記液体で満たし、次に、前記流路に残存する前記液体を取り除くことによって、複数の前記突起状分岐構造内においてある一定の体積の液体秤取を行い、さらに、その秤取した複数の前記液体をゲル化することによって
複数の一定量のゲルの作製を可能にする
流路内ゲル作製のための構造および方法。
請求項１または請求項２のいずれか一項に記載の流路内ゲル作製のための構造および方法において、
前記液体とは懸濁液である
流路内ゲル作製のための構造および方法。
請求項３に記載の流路内ゲル作製のための構造および方法において、
懸濁液に含まれる粒子とは細胞である
流路内ゲル作製のための構造および方法。
請求項１〜４のいずれか一項に記載の流路内ゲル作製のための構造および方法において、
前記液体をゲル化した後、前記流路から流体を導入することによって、作製したゲルに含まれる物質または粒子と前記流路から導入した前記流体に含まれる物質を反応することのできる
流路内ゲル作製のための構造および方法。
請求項１〜５のいずれか一項に記載の流路内ゲル作製のための構造および方法において、
前記流路および前記突起状分岐構造とは少なくとも一部がマイクロチャネルである
流路内ゲル作製のための構造および方法。
請求項１〜６のいずれか一項に記載の流路内ゲル作製のための構造および方法において、
前記流路および前記突起状分岐構造とは少なくとも一部分が空気透過性を有するシリコーンポリマーを基材として形成されたものである
流路内ゲル作製のための構造および方法。