JP2019062832A - スフェロイドを製造するためのデバイス、スフェロイドの製造及び回収方法 - Google Patents
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Abstract
Description
一態様において、本発明は、スフェロイドを製造及び回収するためのデバイスであって、スフェロイドを培養するための第一の基板と、前記第一の基板の一方側に対向するように配置された、培養したスフェロイドを回収するための第二の基板と、前記第二の基板へ回収溶液を流入させるための回収溶液流入部と、第二の基板上を流れる、スフェロイドを含有する回収溶液を回収するためのスフェロイド回収部と、を備え、前記第一の基板は、前記第一の基板の他方側の第一面と、前記第一の基板の一方側の第二面と、前記第一面と前記第二面との間を貫通する複数の孔を形成する複数の壁面と、を備え、前記第一の基板の第二面と前記第二の基板間の間隙gが、回収溶液流入部から回収溶液を流入させた際の、前記回収溶液の、第二の基板からの液滴高さGより小さいデバイスを提供する。
図1(a)及び(b)に示すように、本態様のスフェロイド製造及び回収用デバイス100は、第二の基板120を備えることを特徴の1つとする。スフェロイド製造及び回収用デバイス100において、第二の基板120は、第一の基板110の一方側(第二面111側)に対向するように配置されている。第二の基板120は、製造したスフェロイドを回収するためのものである。
続いて、第一の基板について説明する。第一の基板は、第一の基板の他方側の第一面と、第一の基板の一方側の第二面と、第一面と第二面との間を貫通する複数の孔を形成する複数の壁面を備えるものであれば、特に限定されないが、以下のような形態であることが好ましい。
ΔP=Hρ=γL(1/r1+1/r2) …(1)
[式(4)中、Hは培地310の高さを表し、ρは培地310の密度を表し、γLは培地310の表面張力(gf/cm)を表し、r1及びr2は直交する曲率半径を表す。]
以下、接触角θcが−1<cosθc≦0の範囲に含まれる場合について説明する。この場合、一般的に、壁面113の表面の材質が疎水性の材質であるといえる。また、この場合、下向き水面の大きさは接触角θcに影響されない。
F0=体積×比重=V・α …(2)
[式(2)中、Vは下向き水面311の体積(cm3)を表し、αは培地310の比重を表す。]
F1=水圧×面積=p・S …(3)
[式(3)中、pは第二面111の開口部における水圧(gf/cm2)を表し、Sは下向き水面311が形成される第二面111の開口部の面積を表す。]
F1=液上面から液滴までの深さ×液体の密度×面積=HρS
[式(4)中、Hは培地310の上面から下向き水面311の下端までの深さ(cm)を表し、ρは培地310の密度(g/cm3)を表し、Sは下向き水面311が形成される第二面111の開口部の面積を表す。]
F2=外周×液体表面張力×角度=LγLsinθ0 …(5)
[式(5)中、Lは第二面111の開口部の外周の長さ(cm)を表し、γLは培地310の表面張力を表し、θ0は下向き水面311の辺縁部が第二面111となす角度を表す。]
F0+F1<F2 …(6)
F2=LγSLsinθi+LγLsinθ0 …(7)
[式(7)中、θiは壁面113の傾斜角を表し、θ0は下向き水面311の辺縁部が第二面111となす角度を表す。]
Vα+pS<LγSLsinθi+LγLsinθ0 …(8)
F2=LγLsinθ0 …(9)
よって、上記式(6)は、下記式(10)で表すことができる。
Vα+pS<LγLsinθ0 …(10)
F0+F1=F2 …(11)
F0=((4/3)πR3÷2)×α=(2/3)πR3・α …(12)
S=πR2 …(13)
L=2πR …(14)
(2/3)πR3・α+pπR2=2πRLγLsin90° …(12)
ここで、sin90°=1であるため、
(2/3)αR2+pR=2γL …(13)
(2/3)αX2+pX=2γL …(F1)
[式(F1)中、αは培地310の比重を表し、pは第二面111の開口部の水圧(gf/cm2)を表し、γLは培地310の表面張力(gf/cm)を表す。]
以下、接触角θcが0<cosθc<1の範囲に含まれる場合について説明する。この場合、一般的に、壁面113の表面の材質が親水性の材質であるといえる。
γS≦γSL+γLcosθ0 …(14)
γS≦γLcosθc−γS+γLcosθc …(15)
γLcosθc−γS≧0 …(16)
P=Pair+ΔP
=Pair+γL(1/r1+1/r2) …(17)
[式(17)中、r1及びr2は直交する曲率半径を表す。]
P=p=Hρ=γL(1/r1+1/r2) …(18)
[式(18)中、pは第二面111の開口部における水圧(gf/cm2)を表し、Hは培地310の上面から下向き水面311の下端までの深さ(cm)を表し、ρは培地310の密度(g/cm3)を表し、r1及びr2は直交する曲率半径を表す。]
p=γL×(2/r) …(19)
Hρ=γL×(2/r) …(20)
D=2r・sinθ0 …(21)
ここで、(20)より、r=2HργLであるから、
D=4・γL・sinθ0/Hρ …(22)
式(22)に、下向き水面311が第二面111にまわりこみ始める限界、すなわちθ0=θcを代入すると、下向き水面311を保持できる最大直径D(max)は、下記式(23)で表される。
D(max)=4・γL・sinθc/Hρ …(23)
γLcosθc−γS>0 …(F2)
p=γL×(2/R) …(F3)
[式(F2)及び(F3)中、γLは培地310の表面張力(gf/cm)を表し、γSは壁面113の表面の材質の表面張力(gf/cm)を表し、pは第二面111の開口部での水圧(gf/cm2)を表し、Rは孔の第二面111の開口部の面積に相当する円の半径(cm)を表す。]
一態様において、本発明は、スフェロイドの製造及び回収方法であって、上述したスフェロイド製造及び回収用デバイスの第一の基板の第一面に細胞を播種する工程1と、工程1により第二面に形成される下向き水面上でスフェロイドを培養する工程2と、回収溶液流入部から回収溶液を、第二の基板からの液滴高さがGになるように流入させる工程3と、回収溶液が、下向き水面と、回収溶液流入部側からスフェロイド回収部側へ接触していくことにより、下向き水面上のスフェロイドが、第二の基板に移動し、更に、スフェロイド回収部へ移動する工程4と、を含む、製造及び回収方法を提供する。
実施例1のスフェロイド製造及び回収用デバイスを作製した。図1(a)に作製したスフェロイド製造及び回収用デバイスの写真を示す。第一の基板110における孔、孔の第一面111の開口部、孔の第二面112の開口部、壁面113の形状は図14(a)〜(d)に示す形状とした。図14(a)は作製したスフェロイド製造及び回収用デバイスの第一の基板を第二面112側から観察した光学顕微鏡写真であり、第二面112付近に焦点を合わせたものである。図14(b)は図14(a)と同視野の光学顕微鏡写真であるが、第一面111付近に焦点を合わせたものである。図14(c)は作製したスフェロイド製造及び回収用デバイスの第一の基板の第二面112側を撮影した走査型電子顕微鏡(SEM)写真である。図14(d)は作製したスフェロイド製造及び回収用デバイスの第一の基板を孔の軸線方向に切断した断面SEM写真である。
実施例1のスフェロイド製造及び回収用デバイス100を用いてスフェロイドを培養し、回収した。培地として、10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したDMEM/F12を用いた。なお、この培地と純水は、接触角θcについて近傍の値を示すものであった。
Claims (8)
- スフェロイドを製造及び回収するためのデバイスであって、
スフェロイドを培養するための第一の基板と、前記第一の基板の一方側に対向するように配置された、培養したスフェロイドを回収するための第二の基板と、前記第二の基板へ回収溶液を流入させるための回収溶液流入部と、第二の基板上を流れる、スフェロイドを含有する回収溶液を回収するためのスフェロイド回収部と、を備え、
前記第一の基板は、
前記第一の基板の他方側の第一面と、
前記第一の基板の一方側の第二面と、
前記第一面と前記第二面との間を貫通する複数の孔を形成する複数の壁面と、を備え、
前記第一の基板の第二面と前記第二の基板間の間隙gが、回収溶液流入部から回収溶液を流入させた際の、前記回収溶液の、第二の基板からの液滴高さGより小さいデバイス。 - 第二の基板の水に対する接触角が50°〜120°である、請求項1に記載のデバイス。
- 少なくとも一部の材質が、ガラス、金属、シリコンウェハ、ポリジメチルシロキサン、ポリアミド系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリオレフィン系樹脂、ポリウレタン系樹脂、アセタール樹脂、アクリル系樹脂、エポキシ系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリスチレン系樹脂、ポリカーボネート系樹脂又はポリプロピレン系樹脂である、請求項1又は2に記載のデバイス。
- 前記孔は、前記第二面の開口部の面積に相当する円の直径が200μmから1cmの範囲である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のデバイス。
- 複数の前記壁面のそれぞれの少なくとも一部分は、前記第二面に対して1°より大きく、90°より小さい角度の傾斜を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記孔に、前記第一面から、前記壁面を構成する材質の表面との接触角θcが−1<cosθc≦0である培地が注入された場合に、前記孔の前記第二面の開口部の面積に相当する円の半径R(cm)が、下記式(F1)で定義される変数Xの値以下である、請求項1〜5のいずれか一項に記載のデバイス。
(2/3)αX2+pX=2γL …(F1)
[式(F1)中、αは前記培地の比重を表し、pは前記第二面の開口部の水圧(gf/cm2)を表し、γLは前記培地の表面張力(gf/cm)を表す。] - 前記孔に、前記第一面から、前記壁面を構成する材質の表面との接触角θcが0<cosθc<1である培地が注入された場合に、下記式(F2)及び(F3)が満たされる、請求項1〜6のいずれか一項に記載のデバイス。
γLcosθc−γS>0 …(F2)
p=γL×(2/R) …(F3)
[式(F2)及び(F3)中、γLは前記培地の表面張力(gf/cm)を表し、γSは前記材質の表面張力(gf/cm)を表し、pは前記第二面の開口部での水圧(gf/cm2)を表し、Rは前記孔の前記第二面の開口部の面積に相当する円の半径(cm)を表す。] - スフェロイドの製造及び回収方法であって、
請求項1〜7のいずれか一項に記載のデバイスの前記第一の基板の第一面に細胞を播種する工程1と、
前記工程1により前記第二面に形成される下向き水面上でスフェロイドを培養する工程2と、
前記回収溶液流入部から前記回収溶液を前記第二の基板からの液滴高さがGになるように流入させる工程3と、
前記回収溶液が、前記下向き水面と、回収溶液流入部側からスフェロイド回収部側へ接触していくことにより、前記下向き水面上のスフェロイドが、前記第二の基板に移動し、更に、前記スフェロイド回収部へ移動する工程4と、
を含む、製造及び回収方法。
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