EP2220480A2 - Microscope a plasmon de surface a haute resolution avec interferometre heterodyne en polarisation radiale - Google Patents

Microscope a plasmon de surface a haute resolution avec interferometre heterodyne en polarisation radiale

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Publication number
EP2220480A2
EP2220480A2 EP08865044A EP08865044A EP2220480A2 EP 2220480 A2 EP2220480 A2 EP 2220480A2 EP 08865044 A EP08865044 A EP 08865044A EP 08865044 A EP08865044 A EP 08865044A EP 2220480 A2 EP2220480 A2 EP 2220480A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
metal layer
interferometer
surface plasmon
microscope
medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP08865044A
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German (de)
English (en)
Inventor
Lofti Berguiga
Françoise Argoul
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Normale Superieure de Lyon
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Normale Superieure de Lyon
Ecole Normale Superierure de Lyon
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Ecole Normale Superieure de Lyon, Ecole Normale Superierure de Lyon filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP2220480A2 publication Critical patent/EP2220480A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/55—Specular reflectivity
    • G01N21/552—Attenuated total reflection
    • G01N21/553—Attenuated total reflection and using surface plasmons
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01B—MEASURING LENGTH, THICKNESS OR SIMILAR LINEAR DIMENSIONS; MEASURING ANGLES; MEASURING AREAS; MEASURING IRREGULARITIES OF SURFACES OR CONTOURS
    • G01B9/00—Measuring instruments characterised by the use of optical techniques
    • G01B9/04—Measuring microscopes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y20/00—Nanooptics, e.g. quantum optics or photonic crystals
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y35/00—Methods or apparatus for measurement or analysis of nanostructures
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
    • G01N2201/06—Illumination; Optics
    • G01N2201/067—Electro-optic, magneto-optic, acousto-optic elements

Definitions

  • the present invention relates to a high resolution surface plasmon microscope comprising a heterodyne interferometer and using a radial polarization of the surface plasmon generation beam.
  • the technical field of the invention is that of the design of imaging systems allowing the detection of small variations of refractive index in an observation medium and / or dielectric objects of the order of a few nanometers with no not necessarily remarkable optical properties (fluorescence, luminescence, localized plasmon resonance or Raman resonance) and located near a surface and immersed in any medium of refractive index less than 1.5 and in particular in the air or in a aqueous medium.
  • a surface plasmon is a surface electromagnetic wave that propagates at a metal / dielectric medium interface.
  • the angle ⁇ p (in other words the coupling condition) is very sensitive to the slightest changes in the optical properties at the metal / dielectric medium interface. This sensitivity makes exploitable the surface plasmon for producing images of very small objects located at the metal / dielectric medium interface, said objects modifying the optical properties of the Plasmon surface at this interface which allows to obtain a contrast between the object and its environment.
  • the surface plasmon being an evanescent wave, it makes it possible to overcome the effects of volume within the observation medium.
  • the principle of plasmon excitation in surface plasmon microscopy is very often illustrated in the literature with reference to the so-called Kretschmann-Raether configuration. This provides for the deposition on one side of a glass prism, in contact with a dielectric medium such as air, a metal layer of the order of 50 nanometers thick. When a high intensity light beam passes through the prism and meets the metal layer at the angle of incidence ⁇ p, a surface plasmon then takes birth in the metal and the resulting evanescent wave is confined to a few hundred nanometers at the interface metal / dielectric medium.
  • illumination and detection are based on spatial filtering, at the entrance of the objective, light rays that contribute to plasmon excitation and elimination. of those who do not contribute.
  • 1B and 2A a microscopy device which allows a measurement of the phase but which does not filter the light rays not contributing to the plasmon excitation by eliminating its uninteresting part. Coupling these two technical aspects has the advantage of having a resolution and sensitivity unequaled compared to other techniques known to date
  • FIG. 2B represents the distribution of the intensity of the laser beam at the rear focal plane of the objective after retro-diffusion and ironing by the laser.
  • objective two crescent-shaped rings that correspond to the area of the starting beam that participated in the excitation of the surface plasmon.
  • the zone of the rays concerned has a privileged orientation which is that of the direction of polarization of the light at the entrance of the objective.
  • no ray contributes to the excitation of the surface plasmon in the orthogonal direction (vertical passing through 0 in FIG. 2B) and there is only a fraction of the incident light energy which participates in the excitation of surface plasmon.
  • US 2004/0100636 discloses the possibility of obtaining better image resolutions with a radially polarized excitation beam.
  • this document does not disclose any example of a microscope structure implementing this principle nor any measurement carried out with a radial polarization which makes it possible to validate this mentioned measuring principle. It is an object of the present invention to provide a high resolution surface plasmon microscope which has increased resolution and sensitivity over existing surface plasmon microscopes.
  • Another object of the invention is to provide a surface plasmon microscope which allows the observation of molecules and particles in aqueous dielectric media, and in particular in biological fluids.
  • the object of the invention is in particular to provide a high-resolution surface plasmon microscope that enables the detection and visualization of objects of very small size, of the order of a nanometer, such as biological molecules for example, without having recourse to chemical, optical or radioactive markers of these objects.
  • Another object of the invention is finally to provide a surface plasmon microscope simple to achieve and use.
  • a high-resolution scanning surface plasmon microscope comprising essentially: a) a coherent light source, and b) a coupling medium and a confinement of a surface plasmon having a high numerical aperture objective, an immersion oil and a glass slide, and c) a metal layer covering a surface of the glass plate of the coupling medium which is not in contact with the immersion oil of the latter, the metal layer being able to be brought into contact with a medium of observation containing a sample to be observed and to emit a surface plasmon generated by excitation of at least one light beam coming from the light source, and d) a Twyman-Green interferometer in heterodyne mode capable of dividing a light beam emitted by the light source into at least one reference beam and at least one measuring beam directed to the coupling medium and the metal layer to generate a surface plasmon, the interferometer being positioned between the light source and the lens of
  • the microscope of the invention is characterized in that it comprises, arranged between the light source and the interferometer, at least one linear polarization converter in radial polarization of the light beams emitted by the light source, and allowing the detection of dielectric and metal objects with a diameter of less than 10 nm, without marking said objects.
  • the microscope of the invention differs from the state of the art in that it allows a radial polarization conversion of the surface plasmon generation beam.
  • the invention also relates to a high resolution surface plasmon microscopy method by heterodyne interferometry developed for the implementation of the microscope of the invention. According to this method:
  • a sample to be imaged placed on a metal layer coating a glass plate of a coupling medium and confining a surface plasmon also having a lens (with a large numerical aperture and an immersion oil, and
  • the surface of the metal layer is scanned by means of the measuring beam guided by scanning means, and
  • an interferometric light beam at the output of said Twyman-Green interferometer is detected by detection means, and
  • said interferometric beam is processed and an image of the surface plasmon emitted by the metal surface in contact with the sample to be imaged is formed by means for processing and forming an image
  • This method is characterized according to the invention by the fact that the polarization of the beam of coherent light is polarized by a polarization converter before it enters the interferometer so as to illuminate the sample to be imaged on the metal layer of the coupling medium. using a measuring beam having a radial symmetry with respect to its axis of propagation.
  • the polarization converter is polarized alternately with the coherent light beam in pure mode p (radial polarization) and in pure mode s (azimuthal polarization) and is scanned linearly. alternatively and synchronously the alternative polarization of the coherent light beam the surface of the metal layer by the measuring beam polarized alternately in pure mode p and in pure mode s.
  • FIG. 1A represents the principle of excitation and confinement of the surface plasmon in a microscope of the prior art with a light beam focused at the metal / dielectric medium interface;
  • FIG. 1B shows the principle of excitation and confinement of the surface plasmon in a microscope of the prior art with a defocused light beam in the metal / dielectric medium interface
  • FIG. 1C represents an experimental curve V (z) in water obtained with a surface plasmon microscope of the prior art in linear polarization
  • FIG. 2A represents a high-resolution surface plasmon microscope as known from the prior art implementing an excitation and a confinement of the surface plasmon as represented in FIG. 1B;
  • Figure 2B shows the light distribution profile reflected by the surface plasmon generation metal surface at the exit of the microscope objective of Figure 2A;
  • FIG. 2C represents the impulse response of the microscope of FIG. 2A in linear polarization by numerical calculation of the distribution of the focused light at an interface between a gold metal layer and a dielectric medium formed by water, with a numerical aperture objective equal to 1.65;
  • FIG. 3A schematically shows a high resolution surface plasmon microscope according to the present invention
  • FIG. 3B shows the light distribution profile reflected by the surface plasmon generating metal surface at the exit of the objective of the microscope of the invention shown in FIG. 3A
  • FIG. 3C represents the impulse response of the microscope of FIG. 3A in radial polarization by numerical calculation of the distribution of the focused light at the interface between a gold metal layer and a dielectric medium formed by water, with a numerical aperture objective equal to 1.65;
  • FIGs. 4A and 4B respectively show the image of a 50 nanometer diameter latex particle obtained with the prior art microscope shown in Fig. 2A and with the microscope of the invention shown in Fig. 3A;
  • FIG. 5 schematically represents the polarization conversion effect of the electric field of the surface plasmon generation light beam implemented in the microscope of the present invention;
  • Figure 6 shows in detail a preferred embodiment of the microscope of the present invention, as schematically shown in Figure 3A.
  • the present invention provides a high resolution scanning surface plasmon microscope operating according to the so-called V (z) effect principle which provides that the V response of the microscope varies as a function of the defocus distance z relative to the metal layer interface / dielectric observation medium of the microscope.
  • the principle of surface plasmon excitation in high resolution surface plasmon microscopy is analogous to the so-called Kretschmann configuration. It implements in the first place a coupling medium that replaces the glass prism of the so-called Kretschmann configuration.
  • This coupling medium consists of an O objective with a high numerical aperture, typically at least 1.2 NA, bathed by the surface of one of its diopters on an immersion oil Hi which itself is in contact with a first face of a glass slide Gs.
  • the free face of the glass plate Gs (that is to say that not in contact with the oil) is covered with a metal layer M s of about 45 nm in thickness, for example gold or silver.
  • This analysis medium D can be air, water or an aqueous solution or more generally any dielectric medium having a refractive index less than or equal to 1.5.
  • a light beam L such as a laser beam, represented by the double arrows in FIGS. 1A and 1B, is sent towards the metal layer M 5 through the coupling medium.
  • the rays reaching the metal layer M s and the interface thereof with the dielectric medium D only those which are reflected on the metal layer with an angle of incidence close to the plasmon resonance angle ⁇ p excite the surface plasmon, represented by the solid lines in FIG. 1A, at the interface between the metallic layer Ms and the dielectric observation medium D.
  • the defocusing of the focal plane of the objective O behind the metal surface M s to be observed enables the surface plasmon, excited by the ray Ri to propagate, to reemit, throughout its propagation at the interface of the radii with an angle ⁇ p and only that which passes through O, ie Rp propagates towards the photodetector.
  • This phase delay varies with the defocus distance z along the Z axis in the XOZ mark and the propagation speed of the surface plasmon.
  • a measurement of this phase shift and a scanning on the surface point by point make it possible to probe the local variations of the plasmon resonance and thus make it possible to visualize, with a resolution of the size of the focused light spot, the local variations of the optical properties at the of the interface.
  • the image is then formed point by point.
  • the device comprises a laser source LG whose beam L is divided in two by a beam splitter BS, thus forming an interferometer.
  • a beam expander BE passes through a coupling medium comprising an objective O which allows the excitation of the plasmon due to its very large numerical aperture and which confines the plasmon thanks to its high magnification, an oil to immersion Hi and a glass plate covered on its outer surface with a metal layer M s of gold or silver in contact with an observation dielectric medium D.
  • the beam reflected by the metal layer M s passes through the Objective O and is recombined with the other beam which has been reflected by a mirror M.
  • the two beams generate an interference signal having a temporal modulation generated by a shift of the different optical frequency in each arm of the interferometer.
  • the interferometric signal is collected by an optical detector PD and an electronics demodulates the modulated signal.
  • the signal thus obtained represents the intensity of a pixel of the image.
  • the present invention provides a significant improvement to the prior art, in particular by allowing a uniform light distribution at the objective output of the microscope to be obtained, which provides a greatly improved resolution and sensitivity as will be presented hereinafter. after.
  • a particular embodiment of the microscope of the invention is shown schematically in Figure 3A in which the elements common with the microscope of Figure 2A have the same references.
  • the microscope of the invention similarly to the microscope of FIG. 2A, comprises a coherent LG light source, for example a L.A.S.E.R. source, and in particular a helium-neon gas (He-Ne) laser.
  • a coherent LG light source for example a L.A.S.E.R. source, and in particular a helium-neon gas (He-Ne) laser.
  • He-Ne helium-neon gas
  • a polarizer P supplemented with a beam magnifier BE to expand the laser beam L before entering a Twymann-Green interferometer operating in heterodyne mode which comprises firstly a beam splitter BS to form two laser beams L Re f and L Mes propagating in two distinct arms of the interferometer.
  • a first laser beam L Ref propagates in a first arm, referred to as reference, which comprises a reflection mirror M R e f of this first reference light beam.
  • the second laser beam L M e / which we will call measurement propagates in a second arm, said measuring, towards a coupling and confinement medium of a surface plasmon comprising a lens O with a large numerical aperture, a filter oil. Immersion Hi and a glass slide G 5 .
  • the measuring arm also comprises at least one beam expander BE placed between the beam splitter BS and the coupling medium.
  • each arm of the interferometer at least one AOM Ref acousto-optical modulator
  • AOMM ⁇ S for example consisting of a Bragg cell, capable of introducing an offset of the optical frequency of the light beam L Ref and L Mes reference and measurement respectively.
  • the objective O of the coupling medium has a numerical aperture greater than or equal to 1.2 in the air and at 1.55 in an aqueous solution and a magnification greater than sixty times. These characteristics of the objective O thus ensure good excitation and good confinement of the surface plasmon.
  • An outer surface of the glass plate G s of the coupling medium is covered with a metal layer M s in contact with a dielectric observation medium D of refractive index less than 1.5, for example from air or water, containing a sample to be observed.
  • the measuring beam L Mes is thus directed towards the coupling medium and the metal layer M 5 to generate a surface plasmon at the metal layer / dielectric medium interface D.
  • the measurement beam L Mes reflected from the metal surface M s passes through the objective O and is then recombined with the beam L R ⁇ f reflected by the mirror M Ref in the reference arm.
  • the two beams generate an interferometric signal collected by optical detection means PD such as a photomultiplier or a CCD camera for example or a photon counter, or an avalanche photodiode.
  • This interferometric signal has a temporal modulation generated by an offset of the optical frequency of each light beam reflected in each interferometer arm.
  • the microscope comprises an appropriate demodulation electronics as well as means for processing and forming an image from the interferometric beam essentially consisting of computer processing and visualization means.
  • the microscope of the invention differs from microscopes of the prior art and in particular that of Someck et al. in that it comprises, arranged between the light source LG and the interferometer, at least one linear polarization CP converter in radial polarization of the laser beam L emitted by the light source LG.
  • the passage in radial polarization of the laser beam L emitted by the light source LG makes it possible in fact to illuminate the input of the objective O of the coupling medium with a polarization which presents, as represented in FIG. 5, a radial symmetry by relative to the axis of the beam.
  • the polarization converter CP advantageously makes it possible to modify the polarization and therefore the orientation of all the electric field vectors Eo with respect to the axis of propagation of the beam L so that these vectors are all oriented radially to the axis of propagation so that the contribution to the generation of surface plasmon by the incident wavefront on the metallic surface Ms is uniform and optimal.
  • the distribution of light reflected at the exit of the objective is quite uniform and circular, which can be concluded, by a simple comparison of FIGS. 2B and 3B, that the zone of the beam which contributes to the the excitation of the plasmon is greater and its surface substantially multiplied by two compared with the microscopes of the prior art.
  • the radial polarization operation of the surface plasmon microscope of the invention substantially improves the resolution and sensitivity of the microscope as distinctly shown in FIGS. 2C and 3C which represent the light intensity at the level of the microscope. the interface calculated respectively in linear polarization and in radial polarization.
  • the spot in radial polarization, the spot has only one intense peak which makes it possible, on the one hand, to reconcentrate the light beam and, on the other hand, to improve the impulse response of the microscope. .
  • the intensity of the focused spot obtained with the microscope of the invention is accordingly four times more intense.
  • the microscope of the invention provides an improvement in the profile of the optical response since a single peak is obtained instead of two with the previous microscopes, but also a 3-fold increase in resolution, which passes from 600 nm to 200 nm.
  • the microscope of the invention comprises means for scanning the metal layer using the measuring light beam, in particular piezoelectric means for translational movement of the lamella and or the objective of the coupling medium in two orthogonal directions X, Y in the same plane.
  • the scanning means of the microscope of the invention comprise piezoelectric means for moving the objective in translation along a Z direction normal to the plane of each of the surfaces of the glass slide of the coupling medium. and the metal layer, thus ensuring a knowledge of the distance of the lens with respect to the lamella.
  • Figure 6 shows in detail a surface plasmon microscope in a preferred embodiment according to the invention. It comprises in the first place a light source LG formed by a laser
  • This LG light source emits a laser beam L towards two successive deflection mirrors Ml and M2 with an angle of incidence of approximately 45 °.
  • These two mirrors M1, M2 allow precise adjustment of the height and parallelism of the beam L with respect to a horizontal plane and an axis which will define the centering of all the optical components and in particular the axis of symmetry of the focusing objective. and the direction of normal incidence of the surface of the coverslip.
  • the beam L then passes through a polarizer P which polarizes the beam vertically, then a diaphragm D 0 .
  • the beam L is collimated and enlarged by means of a first telescope Ti composed of an objective Oi and a lens Li. Its magnification factor is 2.3.
  • the beam L then passes through a polarization converter CP which converts the uniform distribution of the initial vertical linear polarization into a spatial distribution of radial symmetry of the polarization with respect to the center of the beam.
  • a polarization converter CP which converts the uniform distribution of the initial vertical linear polarization into a spatial distribution of radial symmetry of the polarization with respect to the center of the beam.
  • the laser beam L passes through a diaphragm Di and then enters a Twyman-Green interferometer in heterodyne mode, the description of which is given below.
  • the positioning of the CP converter before the interferometer is an important criterion because it limits the optical defects of the wavefront, those being subsequently eliminated by the interferometric technique.
  • the interferometer comprises in the first place a separator cube BS through which the beam L passes and is divided into two beams L Me s, L Re f of equal intensities.
  • the first beam L Mes is not deflected and continues its trajectory in a first arm of the interferometer which is called the measuring arm (on the right of the cube in the diagram of Figure 6).
  • the second beam L Ref is deflected 90 ° with respect to the initial beam L. It continues its propagation in a second arm that is called the reference arm (below the cube in the diagram of Figure 6).
  • the beam enters an acousto-optical modulator AOM Ref consisting for example of a Bragg cell with an incidence angle of 6.95 milliradians.
  • An acoustic wave of frequency ⁇ ref 75 MHz generated and sent into AOM R ⁇ f by a synthesizer S makes it possible to generate a diffraction grating of the beam L Ref .
  • the light undergoes a shift of its optical frequency ⁇ op t of + ⁇ ref .
  • the angle of incidence of the beam is then adjusted to the Bragg angle in order to transfer all the light intensity in the +1 diffraction order.
  • the adjustment makes it possible to obtain 85% of the starting intensity, the rest being distributed in order of decreasing intensity in the orders 0, -1, 2, -2 etc.
  • This adjustment is possible by a rotation plate (not shown) fixed under the modulator AOM Re f and requires a positioning accuracy greater than 0.1 milliradian.
  • the beam passes through a diaphragm D R ⁇ f of 2mm diameter in order to eliminate all the diffracted beams except the order 1, which is shifted in frequency by ⁇ Ref .
  • This beam then arrives at normal incidence on a reference mirror M Ref of maximum optical quality and a flatness of ⁇ / 20, ⁇ being of course the wavelength of the laser beam L.
  • the reflected beam L Ref goes back through the diaphragm D Ref and arrives on the acousto-optical modulator A0M Ref with the same Bragg angle as on the outward direction.
  • the beam is again diffracted and shifted by + ⁇ Ref at the output of the acousto-optical modulator AOM Re f.
  • This beam is shifted in frequency by 2x ⁇ ref with respect to the initial beam, and propagates on the same optical axis as the latter at the output of the separator cube BS. It goes back through the separator cube without deviation and arrives on an optical photodetector PD which has a diaphragm D 2 at its input thus eliminating all diffracted orders different from the order 1.
  • the beam L Me s enters an acousto-optical modulator AOM Mes , also of type Bragg cell.
  • An acoustic wave of frequency ⁇ Me s 75.05 Mhz generated and sent to AOM Mes by the synthesizer S makes it possible to generate therein a diffraction grating of the beam L Mes -
  • At the passage of the beam L Mes in the modulator A0M MeS / la light is shifted by its optical frequency ⁇ op t of + ⁇ M es-
  • the angle of incidence of the beam is adjusted to the Bragg angle in order to transfer all the light intensity in the +1 diffraction order.
  • the adjustment of AOM Mes makes it possible to obtain 85% of the starting intensity, the rest being distributed in order of decreasing intensity in the order 0, -1, 2, -2 etc.
  • the light beams diffracted at the different orders of L Me s pass through a lens O 2 with a magnification of 10 times and a spatial filter F s consisting of a hole of 50 ⁇ m in diameter, placed in the image focal plane of the objective O 2 .
  • the F filter 5 makes it possible firstly to keep only one order diffraction and secondly to clean up the beam L My by spatial filtering.
  • the diverging beam is collimated by a lens L 2 with a focal length of 100 mm.
  • the telescope T 2 thus formed by the objective O 2 and the lens L 2 makes it possible to enlarge the diameter of the beam L Mes by a factor of 6.06.
  • the diameter of the measurement beam L Mes is thus about 19 mm.
  • This beam width makes it possible to cover the entrance pupil of the objective with a distribution of the luminous intensity optimized in the example presented for the operation of the microscope in a liquid medium, in order to observe in particular organic molecules in solution.
  • a 45 nanometer gold metal layer M 5 is deposited on an outer face of the lamella G s used to allow the generation of a surface plasmon at the interface of this metal layer with a dielectric observation medium D .
  • the beam L My penetrating into the objective O M is focused exactly at the interface between the metal layer Ms covering the glass plate Gs and the observation dielectric medium D, chosen in this case for to be a liquid.
  • the light L Mes after passing through the coupling medium is reflected by the metal surface M 5 and back in the opposite direction by the objective OM-
  • the position of the focusing point of the laser beam measurement L Mes relative to the layer of or M s being a fundamental parameter for the contrast of the images obtained by the microscope and that is why this position is controlled by means of a piezoelectric positioning device with a resolution of a few tens of nanometers over a range of 100 microns.
  • the alignment of the axis of the lens O M with the normal of the surface of the strip Gs is for this reason carried out by a positioning system (not shown in FIG. 6) four manual axes on the lens O M and two manual axes controlling the support of the lamella G s .
  • the objective as the plate are further carried on two platens PLi, PL 2 piezoelectric displacement for accuracy in moving in two directions X, Y orthogonal in the same plane and positioning greater than 10 nm.
  • These plates PLi, PL 2 are advantageously controlled by EC electronic control means connected to a computer control and control COMP.
  • the microscope of the invention also comprises piezoelectric means for moving the objective OM in translation in a direction Z normal to the plane of each of the surfaces of the glass plate G s and the metal layer M s covering one of the 'she
  • the beam reflected by the metal layer M s then returns through the spatial filter F 5 , the objective O 2 and the acousto-optic AOM Mes , to be mixed with the reference beam L ref in the separator cube BS.
  • This beam is shifted in frequency of 2x ⁇ Mes relative to the initial beam.
  • a single light beam L v formed of the sum of the reference and measurement beams L R ⁇ f , L M ⁇ S and passes through a diaphragm D 2 is obtained to arrive at an optical detector such as, for example, a PD photodetector.
  • the optical signal V resulting from the detection of the beam L v has a temporal modulation at the sum and at the difference of the optical frequencies of the two beams, ie 2 ⁇ mes + 2 ⁇ re f and 2 ⁇ mes -2 ⁇ r ef.
  • the contrast of these images is based on the technique of defining profiles V (z), obtained by scanning in the direction Oz (normal to the lamella Gs) and whose variations are strongly correlated to the surface plasmon.
  • the microscope 1 of the invention also has the advantage of great versatility of use and configuration.
  • the microscope of the invention makes it possible to perform high-resolution plasmon microscopy imaging in differential mode.
  • the polarization converter CP is used to linearly scan alternately and synchronously with the platens PLi, PL 2 by polarized beams in pure mode p (radial polarization) and in pure mode s (azimuthal polarization). sample that one wishes to observe. We thus gain in contrast images in the measure as well as in dynamics.
  • optical signal obtained from the pure mode polarized beams can also be made for the purpose of servocontrolling the vertical position of the lens relative to the sample to be observed.
  • the analysis of the electrical signals established from the reflected light beams polarized in mode s makes it possible to determine the absolute value of the position of the objective O M , and from this position, it is then possible to correct all mechanical and thermal drifts inherent in high resolution microscopy.
  • Another advantage of the microscope of the present invention is to allow the construction of three-dimensional images of the measured function V (z).
  • the construction of such three-dimensional "maps" of the function V (z) makes it possible to find the optical plane of section where the contrast of the image will be the best. To do this, we perform a post-processing of these 3D images and then by interpolation we determine the Z plane where the contrast is optimum.

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Abstract

La présente invention concerne un microscope à plasmon de surface à balayage à haute résolution comportant une source (LG) de lumière cohérente, et un milieu de couplage et de confinement d'un plasmon de surface comportant un objectif (O, 0M) à grande ouverture numérique, une huile à immersion (Hi) et une lamelle de verre (Gs). Une couche métallique (Ms) recouvre une surface de la lamelle de verre (Gs). le microscope comporte également un interféromètre de Twyman-Green en mode hétérodyne est placé entre la source lumineuse et le milieu de couplage ainsi que des moyens de balayage (PL1, PL2, EC) de la couche métallique à l'aide d'un faisceau lumineux, et des moyens de détection (PD) du faisceau issu de l'interféromètre reliés à des moyens de traitement (S, F, DTec, COMP) et de formation d'une image à partir de ce faisceau. Conformément à l'invention, au moins un convertisseur de polarisation linéaire en polarisation radiale (CP) des faisceaux lumineux (L) émis par la source lumineuse (LG) est disposé entre la source lumineuse et l'interféromètre.

Description

MICROSCOPE A PLASMON DE SURFACE A HAUTE RESOLUTION AVEC INTERFEROMETRE HETERODYNE EN POLARISATION RADIALE
Domaine technique de l'invention
La présente invention concerne un microscope à plasmon de surface à haute résolution comportant un interféromètre hétérodyne et utilisant une polarisation radiale du faisceau de génération du plasmon de surface.
Le domaine technique de l'invention est celui de la conception de systèmes d'imagerie permettant la détection de faibles variations d'indice de réfraction dans un milieu d'observation et/ou d'objets diélectriques de l'ordre de quelques nanomètres ne présentant pas nécessairement des propriétés optiques remarquables (fluorescence, luminescence, résonance plasmonique localisée ou encore résonance Raman) et localisés près d'une surface et immergés dans tout milieu d'indice de réfraction inférieur à 1,5 et notamment dans l'air ou dans un milieu aqueux.
Etat de la technique
Un plasmon de surface est une onde électromagnétique de surface qui se propage au niveau d'une interface métal/ milieu diélectrique d'observation.
La naissance de cet effet, c'est à dire l'excitation du plasmon de surface nécessite des conditions de couplage optique particulières. Il faut en effet un milieu de couplage et une lumière incidente à l'interface métal/milieu diélectrique sous un angle particulier qu'on appelle généralement angle de résonance plasmon θp.
De part les propriétés de résonance des plasmons de surface, l'angle θp (en d'autres termes la condition de couplage) est très sensible aux moindres modifications des propriétés optiques au niveau de l'interface métal/milieu diélectrique. Cette sensibilité rend exploitable le plasmon de surface pour la réalisation d'images d'objets de très petites tailles situés au niveau de l'interface métal/milieu diélectrique, lesdits objets modifiant les propriétés optiques du plasmon de surface au niveau de cette interface ce qui permet d'obtenir un contraste entre l'objet et son milieu.
En outre le plasmon de surface étant une onde évanescente, il permet de s'affranchir des effets de volume au sein du milieu d'observation. Le principe d'excitation du plasmon dans la microscopie de plasmon de surface est très souvent illustré dans la littérature en référence à la configuration dite de Kretschmann-Raether. Celle-ci prévoit le dépôt sur une face d'un prisme de verre, en contact avec un milieu diélectrique tel que l'air, d'une couche métallique de l'ordre de 50 nanomètres d'épaisseur. Lorsqu'un faisceau lumineux de forte intensité traverse le prisme et rencontre la couche métallique sous l'angle d'incidence θp un plasmon de surface prend alors naissance dans le métal et l'onde évanescente qui en résulte est confinée sur quelques centaines de nanomètre au niveau de l'interface métal/ milieu diélectrique.
Parmi tous les rayons arrivant à la surface, uniquement ceux qui ont un angle d'incidence suffisamment proche (typiquement inférieur à 2 degrés) de l'angle de résonance plasmon θp excitent le plasmon de surface et contribuent à l'imagerie par plasmon de surface. Les plasmons de surface sont à ce jour essentiellement utilisés comme capteurs chimiques et/ou biologiques, et il existe d'ailleurs des systèmes commerciaux basés sur la configuration de Kretschmann. Cependant, la résolution de ces systèmes, limitée par la propagation latérale du plasmon, est relativement faible, de l'ordre de quelques dizaines de microns seulement dans les longueurs d'onde visibles.
Depuis une dizaine d'années, quelques groupes de recherche fondamentale ont développé une génération de microscopes à plasmons de surface dont la résolution n'est plus limitée, comme auparavant, par la propagation latérale du plasmon, mais simplement par la diffraction.
Ces différents microscopes ont tous pour idée commune de focaliser un faisceau laser avec un objectif à forte ouverture numérique et à fort grossissement au niveau d'une surface qui présente une couche métallique (or, argent, cuivre, aluminium etc) de quelques dizaines de nanomètres d'épaisseur. Ceci permet à la fois d'exciter et de confiner le plasmon de surface de film mince. On peut cependant différencier ces techniques d'une part par le profil d'illumination à l'entrée de l'objectif et d'autre part par le mode de détection du signal.
En effet quand un faisceau arrive à l'entrée de l'objectif du microscope, seul un anneau très fin de lumière contribue à l'excitation du plasmon de surface. La partie du faisceau réfléchi qui contient l'information liée au plasmon de surface est très fine et se retrouve noyée dans le reste du faisceau lumineux. Sans traitement particulier du faisceau, l'imagerie serait quasiment impossible.
Dans certaines publications, notamment dans la demande de brevet japonais JP 2003083886, l'illumination et la détection reposent sur un filtrage spatial, à l'entrée de l'objectif, des rayons lumineux qui contribuent à l'excitation plasmon et sur l'élimination de ceux qui n'y contribuent pas.
Dans certaines autres publications telles que le brevet américain US 6,970,249 Bl ou mieux encore dans l'article de M. G, Somekh, S. G Liu, T. S Velinov and C. W See, « Optical V(z) for high-resolution plasmon microscopy », Optics Letters 25, 823 (2000) et, « High-resolution scanning surface-plasmon microscopy », Applied Optics 39, 6279 (2000), il a été proposé l'utilisation d'un interféromètre. Bien que plus lourde à mettre en œuvre cette méthode apporte cependant une bien meilleure sensibilité. L'article de Somekh et al. propose comme représenté aux figures IB et 2A un dispositif de microscopie qui permet une mesure de la phase mais qui ne filtre pas les rayons lumineux ne contribuant pas à l'excitation plasmon en éliminant sa partie inintéressante. Le couplage de ces deux aspects techniques présente l'avantage d'avoir une résolution et une sensibilité inégalée par rapport aux autres techniques connues à ce jour
Toutefois dans cette forme de mise en œuvre particulière, on constate, comme cela est représenté à la figure 2B qui représente la distribution de l'intensité du faisceau laser au niveau du plan focal arrière de l'objectif après rétro- diffusion et repassage par l'objectif, deux anneaux en forme de croissant qui correspondent à la zone du faisceau de départ qui a participé à l'excitation du plasmon de surface. La zone des rayons concernés présente une orientation privilégiée qui est celle de la direction de polarisation de la lumière à l'entrée de l'objectif. Dans le dispositif proposé par Somekh, aucun rayon ne contribue à l'excitation du plasmon de surface dans la direction orthogonale (verticale passant par 0 dans la figure 2B) et il n'y a qu'une fraction de l'énergie lumineuse incidente qui participe à l'excitation du plasmon de surface. On connaît enfin du document US 2004/0100636 la possibilité d'obtenir de meilleures résolutions d'images avec un faisceau d'excitation polarisé radialement. Toutefois, ce document ne divulgue aucun exemple d'une structure de microscope mettant en œuvre ce principe ni aucune mesure effectuée avec une polarisation radiale qui permette de valider ce principe de mesure évoqué. Un but de la présente invention est de procurer un microscope à plasmon de surface à haute résolution qui présente une résolution et une sensibilité accrue par rapport aux microscopes à plasmon de surface existant.
Un autre but de l'invention est de fournir un microscope à plasmon de surface qui permette l'observation de molécules et particules dans des milieux diélectriques aqueux, et notamment dans des liquides biologiques.
L'invention vise notamment à procurer un microscope à plasmon de surface à haute résolution qui permette la détection et la visualisation d'objets de très faibles tailles, de l'ordre du nanomètre, tels que des molécules biologiques par exemple, sans avoir recours à des marqueurs chimiques, optiques ou radioactifs de ces objets.
Un autre but de l'invention est enfin de fournir un microscope à plasmon de surface simple à réaliser et à utiliser.
Exposé de l'invention Les différents objectifs ainsi définis sont atteints conformément à la présente invention grâce à un microscope à plasmon de surface à balayage à haute résolution comportant essentiellement : a) une source de lumière cohérente, et b) un milieu de couplage et de confinement d'un plasmon de surface comportant un objectif à grande ouverture numérique, une huile à immersion et une lamelle de verre, et c) une couche métallique recouvrant une surface de la lamelle de verre du milieu de couplage qui n'est pas en en contact avec l'huile d'immersion de ce dernier, la couche métallique étant apte à être mise en contact avec un milieu d'observation contenant un échantillon à observer et à émettre un plasmon de surface généré par excitation d'au moins un faisceau lumineux issu de la source de lumière, et d) un interféromètre de Twyman-Green en mode hétérodyne apte à diviser un faisceau lumineux émis par la source de lumière en au moins un faisceau de référence et au moins un faisceau de mesure dirigé vers le milieu de couplage et la couche métallique pour générer un plasmon de surface, l'interféromètre étant positionné entre la source lumineuse et l'objectif du milieu de couplage pour former un faisceau interférométrique entre le faisceau de référence et du faisceau de mesure après réflexion de chacun d'eux respectivement par un miroir et par la couche métallique, et e) des moyens de balayage de la couche métallique à l'aide du faisceau lumineux de mesure, et f) des moyens de détection du faisceau interférométrique issu de l'interféromètre, et g) des moyens de traitement et de formation d'une image à partir du faisceau interférométrique.
Le microscope de l'invention se caractérise par le fait qu'il comporte, disposé entre la source lumineuse et l'interféromètre, au moins un convertisseur de polarisation linéaire en polarisation radiale des faisceaux lumineux émis par la source lumineuse, et permettant la détection d'objets diélectriques et métalliques d'un diamètre inférieur à 10 nm, sans marquage desdits objets.
Ainsi, le microscope de l'invention se distingue par rapport à l'état de la technique en ce qu'il permet une conversion en polarisation radiale du faisceau de génération du plasmon de surface.
L'introduction d'une telle faculté d'illumination par un faisceau polarisé radialement de l'interface couche métallique/milieu diélectrique d'observation procure un progrès significatif par rapport à l'état de la technique parce qu'elle permet, comme il sera présenté par la suite, une amélioration de la résolution des images obtenues d'un facteur 3 et de la sensibilité d'un facteur 4.
L'invention a également pour objet un procédé de microscopie de plasmon de surface à haute résolution par interférométrie hétérodyne développé pour la mise en œuvre du microscope de l'invention. Selon ce procédé :
- on illumine par un faisceau lumineux dit de mesure produit par un faisceau de lumière cohérente introduit dans un interféromètre de Twyman-Green en mode hétérodyne, un échantillon à imager disposé sur une couche métallique revêtant une lamelle de verre d'un milieu de couplage et de confinement d'un plasmon de surface comportant également un objectif (à grande ouverture numérique et une huile à immersion , et
- on balaye la surface de la couche métallique à l'aide du faisceau de mesure guidé par des moyens de balayage, et
- on détecte par des moyens de détection un faisceau lumineux interférométrique en sortie dudit interféromètre de Twyman-Green, et
- on traite ledit faisceau interférométrique et on forme une image du plasmon de surface émis par le surface métallique au contact de l'échantillon à imager par des moyens de traitement et de formation d'une image
Ce procédé se caractérise selon l'invention par le fait que l'on polarise radialement le faisceau de lumière cohérente par un convertisseur de polarisation avant son entrée dans rinterféromètre de manière à illuminer l'échantillon à imager sur la couche métallique du milieu de couplage à l'aide d'un faisceau de mesure présentant une symétrie radiale par rapport à son axe de propagation.
La conversion de polarisation induite par le procédé de l'invention permet une variante tout à fait nouvelle et avantageuse dans le domaine de la microscopie de plasmon de surface à haute résolution qui consiste à réaliser une imagerie en mode différentiel, qui permet d'améliorer encore le contraste et la dynamique des images obtenues. Selon cette variante avantageuse du procédé de l'invention, on polarise alternativement à l'aide du convertisseur de polarisation le faisceau de lumière cohérente en mode pur p (polarisation radiale) et en mode pur s (polarisation azimutale) et l'on balaye linéairement de façon alternative et synchrone de la polarisation alternative du faisceau de lumière cohérente la surface de la couche métallique par le faisceau de mesure polarisé alternativement en mode pur p et en mode pur s.
Description des dessins D'autres caractéristiques et avantages du microscope de l'invention ressortiront mieux à la lecture de la description détaillée qui va suivre, faite en référence aux figures annexées parmi lesquelles :
- la Figure IA représente le principe d'excitation et de confinement du plasmon de surface dans un microscope de l'art antérieur avec un faisceau lumineux focalisé à l'interface métal/milieu diélectrique ;
- la Figure IB représente le principe d'excitation et de confinement du plasmon de surface dans un microscope de l'art antérieur avec un faisceau lumineux défocalisé dans l'interface métal/milieu diélectrique ;
- la Figure IC représente une courbe expérimentale V(z) dans l'eau obtenue avec un microscope à plasmon de surface de l'art antérieur en polarisation linéaire ;
- la Figure 2A représente un microscope à plasmon de surface à haute résolution tel que connu de l'art antérieur mettant en œuvre une excitation et un confinement du plasmon de surface tel que représenté à la Figure IB ; - la Figure 2B représente le profil de distribution de lumière réfléchie par la surface métallique de génération du plasmon de surface à la sortie de l'objectif du microscope de la Figure 2A ;
- la Figure 2C représente la réponse impulsionnelle du microscope de la Figure 2A en polarisation linéaire par calcul numérique de la distribution de la lumière focalisée au niveau d'un l'interface entre une couche métallique d'or et un milieu diélectrique formé par de l'eau, avec un objectif d'ouverture numérique égale à 1.65 ;
- la Figure 3A, représente schématiquement un microscope à plasmon de surface à haute résolution conforme à la présente invention ; - la Figure 3B représente le profil de distribution de lumière réfléchie par la surface métallique de génération du plasmon de surface à la sortie de l'objectif du microscope de l'invention représenté à la Figure 3A ; - la Figure 3C représente la réponse impulsionnelle du microscope de la Figure 3A en polarisation radiale par calcul numérique de la distribution de la lumière focalisée au niveau d'un l'interface entre une couche métallique d'or et un milieu diélectrique formé par de l'eau, avec un objectif d'ouverture numérique égale à 1.65 ;
- les Figures 4A et 4B représentent respectivement l'image d'une particule de Latex de 50 nanomètres de diamètre obtenue avec le microscope de l'art antérieur représenté à la Figure 2A et avec le microscope de l'invention représenté à la Figure 3A ; - la Figure 5 représente schématiquement l'effet de conversion de polarisation du champ électrique du faisceau lumineux de génération du plasmon de surface mis en œuvre dans le microscope de la présente invention
- la Figure 6 représente en détail un mode de réalisation préféré du microscope de la présente invention, tel que représenté schématiquement à la Figure 3A.
Description détaillée de modes de réalisation de l'invention
La présente invention propose un microscope à plasmon de surface à balayage à haute résolution fonctionnant selon le principe de l'effet dit V(z) qui prévoit que la réponse V du microscope varie en fonction de la distance de défocalisation z par rapport à l'interface couche métallique/milieu diélectrique d'observation du microscope.
Les premières expérimentations concluantes d'exploitation de ce principe de l'effet V(z) ont été présentées notamment dans les articles de M. G, Somekh, S. G Uu, T. S Velinov and C. W See, « Optical V(z) for high-resolution 2p plasmon microscopy », Optics Letters 25, 823 (2000) et, « High-resolution scanning surface-plasmon microscopy », Applied Optics 39, 6279 (2000) précédemment cités pour les mesures dans l'air et dans l'article L. Berguiga, S. Zhang, J. Elezgaray and F. Argoul "High resolution Surface Plasmon imaging in air and in liquid: V[z) curve and operating conditions", Optics Letters 32, 509 (2007) pour les mesures dans l'eau. Les éléments essentiels de ces expérimentations sont présentés rapidement ci-après en référence aux Figures IA à 2B et permettent de mieux comprendre l'effet V(z) en microscopie à plasmon de surface à haute résolution ainsi que par la suite le microscope de la présente invention qui sera décrit en référence aux Figures 3A à 6 plus particulièrement.
En référence aux Figures IA et IB, le principe d'excitation du plasmon de surface dans la microscopie de plasmon de surface à haute résolution est analogue à la configuration dite de Kretschmann. Il met en œuvre en premier lieu un milieu de couplage qui remplace le prisme de verre de la configuration dite de Kretschmann. Ce milieu de couplage est constitué d'un objectif O à forte ouverture numérique, typiquement au moins 1.2 NA, baignant par la surface d'un de ses dioptres sur une huile à immersion Hi qui elle-même est en contact avec une première face d'une lamelle de verre Gs. La face libre de la lamelle de verre Gs (c'est-à-dire celle non en contact avec l'huile) est recouverte d'une couche métallique Ms d'environ 45 nm d'épaisseur, par exemple d'or ou d'argent.
Au contact de la couche métallique et s'étendant dans le sens de Taxe Z sur la Figure IA s'étend un milieu diélectrique D d'analyse ou d'observation dans lequel sont immergés les objets que l'on souhaite observer. Ce milieu d'analyse D peut être l'air, l'eau ou une solution aqueuse ou plus généralement tout milieu diélectrique présentant un indice de réfraction inférieur ou égal à 1,5.
Un faisceau lumineux L tel qu'un faisceau laser, représenté par les doubles flèches sur les Figures IA et IB, est envoyé en direction de la couche métallique M5 au travers du milieu de couplage. Parmi tous les rayons atteignant la couche métallique Ms et l'interface de celle-ci avec le milieu diélectrique D, uniquement ceux qui se réfléchissent sur la couche métallique avec un angle d'incidence proche de l'angle de résonance plasmon θp excitent le plasmon de surface, représenté par les rayons en trait plein sur la Figure IA, à l'interface entre la couche métallique Ms et le milieu d'observation diélectrique D.
Comme cela est représenté sur la Figure IA, lorsque que le faisceau lumineux L est focalisé dans le plan de l'interface métal Ms/milieu diélectrique D, tous les rayons lumineux du faisceau incident sont réfléchis et arrivent à un photodétecteur (non représenté) placé à l'infini. Il est alors nécessaire pour exploiter le plasmon de surface et obtenir une image de supprimer tous les rayons réfléchis ne participant pas à la génération du plasmon, c'est-à-dire tous les faisceaux représentés en pointillés sur le Figure IA.
Afin de contourner cette difficulté, grâce à une défocalisation du plan de l'objectif O derrière la surface métallique Ms comme l'indique la figure IB, par construction d'optique géométrique, tous les faisceaux réfléchis qui ne passent pas par le point O n'atteignent pas le photodétecteur placé à l'infini. En l'occurrence seul le faisceau en incidence normale et les rayons qui participent à la naissance du plasmon de surface arrivent au photodétecteur. Sur la Figure IB, la défocalisation du plan focal de l'objectif O derrière la surface métallique Ms à observer permet au plasmon de surface, excité par le rayon Ri de se propager, de réémettre, pendant toute sa propagation à l'interface des rayons avec un angle θp et seul celui qui passe par O, c'est à dire Rp se propage en direction du photodétecteur. Le rayon Rp présente un retard de phase par rapport au rayon Rn, qui est le rayon normal réfléchi dans l'axe de l'objectif. Ce retard de phase qui vaut AΦ =p + 4π noz{L -cosθp), où n0 est l'indice de réfraction du milieu de couplage, est introduit par la propagation du plasmon de la surface à l'intérieur du spot de focalisation. Ce retard de phase varie avec la distance de défocalisation z selon l'axe Z dans le repère XOZ et la vitesse de propagation du plasmon de surface. En fixant la distance de défocalisation z, ce déphasage entre les rayons Rn et Rp est en conséquence uniquement lié à la condition de couplage, en d'autres termes à l'angle θp.
Une mesure de ce déphasage et un balayage sur la surface point par point permettent de sonder les variations locales de la résonance plasmon et permettent donc de visualiser, avec une résolution de la taille du spot de lumière focalisée, les variations locales des propriétés optiques au niveau de l'interface. L'image est alors formée point par point.
Cette technique a été mise en œuvre dans le microscope proposé dans la publication précédemment présentée, et dont le schéma est reproduit à la Figure 2A. Comme le montre cette figure, le dispositif comporte une source laser LG dont le faisceau L est divisé en deux par un séparateur de faisceau BS, formant ainsi un interféromètre. Un des deux faisceaux après agrandissement par un élargisseur de faisceau BE passe par un milieu de couplage comprenant un objectif O qui permet l'excitation du plasmon grâce à sa très grande ouverture numérique et qui confine le plasmon grâce à son fort grossissement, une huile à immersion Hi et une lame de verre recouverte sur sa surface externe d'une couche métallique Ms d'or ou d'argent au contact d'un milieu diélectrique d'observation D. Le faisceau réfléchi par la couche métallique Ms repasse par l'objectif O et est recombiné avec l'autre faisceau qui a été réfléchi par un miroir M. Les deux faisceaux génèrent un signal d'interférence présentant une modulation temporelle générée par un décalage de la fréquence optique différent dans chaque bras de l'interféromètre. Le signal interférométrique est collecté par un détecteur optique PD et une électronique démodule le signal modulé. Le signal ainsi obtenu représente l'intensité d'un pixel de l'image. En déplaçant le faisceau incident sur la surface métallique M5 on peut ainsi réaliser un balayage complet de l'interface couche métallique Ms/milieu d'observation D et reconstituer une image complète.
Toutefois, comme le montre la Figure 2B, la distribution de lumière réfléchie par la surface métallique à la sortie de l'objectif du microscope n'est pas uniforme et seul deux croissants latéraux participent à la génération du plasmon de surface. Ceci présente l'inconvénient de procurer un microscope dont la réponse impulsionnelle se compose de deux lobes distincts de lumière. Alors, dans le cas d'observation de molécules uniques ou d'objets de taille inférieure à celle du faisceau lors du passage de celui-ci sur l'objet, chaque lobe passe sur l'objet, générant ainsi une image dédoublée de l'objet comme cela est par exemple représenté sur la Figure 2C.
La présente invention apporte un perfectionnement significatif à la technique antérieure, notamment en permettant l'obtention d'une distribution de lumière uniforme en sortie d'objectif du microscope, ce qui procure une résolution et une sensibilité grandement améliorée comme il va être présenté ci-après. Un exemple particulier de réalisation du microscope de l'invention est présenté schématiquement à la Figure 3A dans lequel les éléments communs avec le microscope de la Figure 2A portent les mêmes références.
Le microscope de l'invention, de façon similaire au microscope de la Figure 2A, comporte une source de lumière cohérente LG, par exemple une source de type L.A.S.E.R., et notamment un laser à gaz hélium-néon (He-Ne).
À la sortie du laser se trouve un polariseur P complété d'un agrandisseur de faisceau BE pour élargir le faisceau laser L avant son entrée dans un interféromètre de Twymann-Green fonctionnant en mode hétérodyne qui comprend en premier lieu un diviseur de faisceau BS pour former deux faisceaux lasers LRef et LMes se propageant dans deux bras distincts de l'interféromètre.
Un premier faisceau laser LRef se propage dans un premier bras, dit de référence, qui comporte un miroir de réflexion MRef de ce premier faisceau lumineux de référence. Le second faisceau laser LMes/ que nous appellerons de mesure se propage dans un second bras, dit de mesure, vers un milieu de couplage et de confinement d'un plasmon de surface comportant un objectif O à grande ouverture numérique, une huile à immersion Hi et une lamelle de verre G5.
De façon préférée, le bras de mesure comporte également au moins un agrandisseur de faisceau BE placé entre le séparateur de faisceau BS et le milieu de couplage.
De plus, il est également préférable et avantageux de prévoir dans chaque bras de l'interféromètre au moins un modulateur acousto-optique AOMRef,
AOMMΘS, par exemple constitué d'une cellule de Bragg, apte à introduire un décalage de la fréquence optique des faisceau lumineux LRef et LMes de référence et de mesure respectivement.
De façon privilégiée, l'objectif O du milieu de couplage présente une ouverture numérique supérieure ou égale à 1.2 dans l'air et à 1.55 dans une solution aqueuse et un grossissement supérieur à soixante fois. Ces caractéristiques de l'objectif O assurent ainsi une bonne excitation et un bon confinement du plasmon de surface. Une surface extérieure de la lame de verre Gs du milieu de couplage est recouverte d'une couche métallique Ms au contact d'un milieu d'observation diélectrique D d'indice de réfraction inférieur à 1,5, par exemple de l'air ou de l'eau, contenant un échantillon à observer. Le faisceau de mesure LMes est ainsi dirigé vers le milieu de couplage et la couche métallique M5 pour générer un plasmon de surface à l'interface couche métallique/milieu diélectrique D.
Le faisceau de mesure LMes réfléchi par la surface métallique Ms repasse par l'objectif O et est ensuite recombiné avec le faisceau LRβf réfléchi par le miroir MRef dans le bras de référence. Les deux faisceaux génèrent un signal interférométrique collecté par des moyens de détection optique PD tel qu'un photomultiplicateur ou une caméra CCD par exemple ou encore un compteur de photons, ou une photodiode à avalanche.
Ce signal interférométrique présente une modulation temporelle générée par un décalage de la fréquence optique de chaque faisceau lumineux réfléchi dans chaque bras de rinterféromètre.
Pour démoduler ce signal et l'exploiter, le microscope comporte une électronique de démodulation appropriée ainsi que des moyens de traitement et de formation d'une image à partir du faisceau interférométrique essentiellement constitués de moyens informatiques de traitement et de visualisation.
Conformément à une caractéristique essentielle, le microscope de l'invention se distingue des microscopes de l'art antérieur et notamment de celui de Someck et al. en ce qu'il comporte, disposé entre la source lumineuse LG et l'interféromètre, au moins un convertisseur CP de polarisation linéaire en polarisation radiale du faisceau laser L émis par la source lumineuse LG.
Le passage en polarisation radiale du faisceau laser L émis par la source lumineuse LG permet en effet d'illuminer l'entrée de l'objectif O du milieu de couplage avec une polarisation qui présente, comme représenté à la Figure 5, une symétrie radiale par rapport à l'axe du faisceau. Le convertisseur de polarisation CP permet avantageusement de modifier la polarisation, et donc l'orientation de tous les vecteurs champ électrique Eo par rapport à l'axe de propagation du faisceau L de sorte que ces vecteurs soient tous orientés radialement à l'axe de propagation afin que la contribution à la génération des plasmon de surfaces par les front d'ondes incidents sur la surface métallique Ms soit uniforme et optimale.
Ainsi, comme le représente la Figure 3B, la distribution de lumière réfléchie à la sortie de l'objectif est bien uniforme et circulaire, ce dont on peut conclure, par simple comparaison des Figures 2B et 3B, que la zone du faisceau qui contribue à l'excitation du plasmon est plus importante et sa surface sensiblement multipliée par deux par rapport aux microscopes de l'art antérieur.
En outre, le fonctionnement en polarisation radiale du microscope de plasmon de surface de l'invention permet d'améliorer de façon sensible la résolution et la sensibilité du microscope comme cela apparaît distinctement des Figures 2C et 3C qui représentent l'intensité lumineuse au niveau de l'interface calculée respectivement en polarisation linéaire et en polarisation radiale.
Comme cela ressort de la Figure 2C7 en polarisation linéaire, la distribution en intensité lumineuse au niveau de la surface du spot focalisé est constituée de deux pics intenses. En conséquence la réponse impulsionnelle du microscope d'un objet nanométrique individuel est donnée par deux pics brillants de part et d'autre de l'objet.
Par opposition, comme cela ressort de la Figure 3C, en polarisation radiale, le spot ne présente qu'un seul pic intense qui permet d'une part de reconcentrer le faisceau de lumière et d'autre part d'améliorer la réponse impulsionnelle du microscope. L'intensité du spot focalisé obtenue avec le microscope de l'invention est en conséquence quatre fois plus intense.
On constate par cette expérimentation que le microscope de l'invention procure une amélioration du profil de la réponse optique puisque l'on obtient un seul pic au lieu de deux avec les microscopes antérieures, mais également une augmentation par 3 de la résolution, qui passe de 600 nm à 200 nm.
Les profils d'intensité lumineuse calculés numériquement dans les Figures 2C et 3C ont été confirmés expérimentalement par l'imagerie plasmon de nanoparticules de Latex (50 nm) illustrées dans les Figures 4A et 4B pour des polarisations linéaire et radiale respectivement. Afin de pouvoir réaliser des images complètes du plasmon de surface, le microscope de l'invention comporte des moyens de balayage de la couche métallique à l'aide du faisceau lumineux de mesure, notamment des moyens piézoélectriques de déplacement en translation de la lamelle et/ou de l'objectif du milieu de couplage selon deux directions X, Y orthogonales dans un même plan.
Afin de garantir le contraste des images, les moyens de balayages du microscope de l'invention comprennent des moyens piézoélectriques de déplacement de l'objectif en translation selon une direction Z normale au plan de chacune des surfaces de la lamelle de verre du milieu de couplage et de la couche métallique, assurant ainsi une connaissance de la distance de l'objectif par rapport à la lamelle.
Pour compléter plus précisément la description du microscope de la présente invention, la Figure 6 représente en détail un microscope à plasmon de surface dans un mode préféré de réalisation conforme à l'invention. II comporte en premier lieu une source de lumière LG formée par un laser
He-Ne de longueur d'onde de 633 nm non polarisé, de puissance 5mW et d'une longueur de cohérence d'une vingtaine de centimètres.
Cette source lumineuse LG émet un faisceau laser L en direction de deux miroirs de renvoi successifs Ml et M2 avec un angle d'incidence de 45° environ. Ces deux miroirs Ml, M2 permettent un ajustement précis de la hauteur et du parallélisme du faisceau L par rapport à un plan horizontal et un axe qui définira le centrage de tous les composants optiques et notamment l'axe de symétrie de l'objectif de focalisation et la direction de l'incidence normale de la surface de la lamelle. Le faisceau L passe ensuite par un polariseur P qui polarise le faisceau verticalement, puis un diaphragme D0. Le faisceau L est collimaté et agrandi au moyen d'un premier télescope Ti composé d'un objectif Oi et d'une lentille Li. Son facteur de grandissement est de 2,3. Le faisceau L passe ensuite au travers d'un convertisseur de polarisation CP qui convertit la distribution uniforme de la polarisation linéaire verticale initiale en une distribution spatiale de symétrie radiale de la polarisation par rapport au centre du faisceau. II existe différentes techniques de conversion. A titre d'exemple, un système composé de trois couches de cristaux liquides a été choisi pour le microscope de l'invention car il présente l'avantage d'être compact. Cette solution technique n'est toutefois pas exclusive et d'autres types de convertisseurs peuvent être employés pour autant qu'ils permettent une conversion radiale du faisceau laser d'excitation.
En sortie de convertisseur CP, le faisceau laser L passe par un diaphragme Di puis entre dans un interféromètre de type Twyman-Green en mode hétérodyne dont la description est donnée ci-dessous. Le positionnement du convertisseur CP avant l'interféromètre est un critère important parce qu'il limite les défauts optiques du front d'onde, ceux ci étant éliminés par la suite par la technique interférométrique.
L'interféromètre comporte en premier lieu un cube séparateur BS par lequel le faisceau L passe et est divisé en deux faisceaux LMes, LRef d'égales intensités. Le premier faisceau LMes n'est pas dévié et continue sa trajectoire dans un premier bras de l'interféromètre que l'on nomme le bras de mesure (à droite du cube sur le schéma de la Figure 6). Le deuxième faisceau LRef est dévié de 90° par rapport au faisceau initial L. Il continue sa propagation dans un second bras que l'on nomme le bras de référence (en dessous du cube sur le schéma de la Figure 6).
Dans le bras de référence, le faisceau entre dans un modulateur acousto- optique AOMRef constitué par exemple d'une cellule de Bragg avec un angle d'incidence de 6,95 milliradians. Une onde acoustique de fréquence Ωref = 75 MHz générée et envoyée dans AOMRβf par un synthétiseur S permet d'y générer un réseau de diffraction du faisceau LRef. Ainsi, au passage du faisceau LRβf dans AOMRef, la lumière subit un décalage de sa fréquence optique ωopt de +Ωref. L'angle d'incidence du faisceau est alors ajusté à l'angle de Bragg afin de transférer toute l'intensité lumineuse dans l'ordre +1 de diffraction. L'ajustement permet d'obtenir 85% de l'intensité de départ, le reste étant distribué par ordre d'intensité décroissante dans les ordres 0,-1, 2,-2 etc. Cet ajustement est possible par une platine de rotation (non représentée) fixée sous le modulateur AOMRef et nécessite une précision de positionnement supérieure à 0.1 milliradian. A la sortie d'AOMRef, Le faisceau passe par un diaphragme DRβf de 2mm diamètre afin d'éliminer tous les faisceaux diffractés excepté l'ordre 1, qui est décalé en fréquence de ΩRef. Ce faisceau arrive ensuite en incidence normale sur un miroir de référence MRef de qualité optique maximale et d'une planéité de λ /20, λ étant bien entendu la longueur d'onde du faisceau laser L.
Le faisceau LRef réfléchi repasse par le diaphragme DRef et arrive sur le modulateur acousto-optique A0MRef avec le même angle de Bragg qu'à l'aller. Le faisceau est à nouveau diffracté et décalé de +ΩRef à la sortie du modulateur acousto-optique AOMRef. Ce faisceau est donc décalé en fréquence de 2xΩref par rapport au faisceau initial, et se propage sur le même axe optique que celui-ci à la sortie du cube séparateur BS. Il repasse par le cube séparateur sans déviation et arrive sur un photodétecteur optique PD qui présente un diaphragme D2 à son entrée éliminant ainsi tous les ordres diffractés différents de l'ordre 1.
Dans le bras de mesure, le faisceau LMes entre dans un modulateur acousto-optique AOM Mes, également de type cellule de Bragg. Une onde acoustique de fréquence ΩMes=75,05 Mhz générée et envoyée dans AOM Mes par le synthétiseur S permet d'y générer un réseau de diffraction du faisceau LMes- Au passage du faisceau LMes dans le modulateur A0MMeS/ la lumière subit un décalage de sa fréquence optique ωopt de +ωMes- L'angle d'incidence du faisceau est ajusté à l'angle de Bragg afin de transférer toute l'intensité lumineuse dans l'ordre +1 de diffraction. A nouveau l'ajustement de AOMMes permet d'obtenir 85% de l'intensité de départ, le reste étant distribué par ordre d'intensité décroissante dans les ordre 0,-1, 2, -2 etc.
Cet ajustement est possible par une platine de rotation fixée sous le modulateur et non représentée sur la Figure 6.
Ici le principe de sélection de l'ordre 1 est différent de celui du bras de référence, pour des raisons d'encombrement et pour préserver un équilibrage des longueurs des deux bras (mesure et référence).
Les faisceaux lumineux diffractés aux différents ordres de LMes passent par un objectif O2 d'un grossissement de 10 fois et un filtre spatial Fs constitué d'un trou de 50 μm de diamètre, placé dans le plan focal image de l'objectif O2. Le filtre F5 permet d'une part de ne garder que l'ordre 1 de diffraction et d'autre part de nettoyer le faisceau LMes par un filtrage spatial. Le faisceau divergent est collimaté par une lentille L2 de focale 100 mm. Le télescope T2 ainsi formé par l'objectif O2 et la lentille L2 permet un agrandissement du diamètre du faisceau LMes d'un facteur 6,06.
A l'entrée de l'objectif du microscope OM le diamètre du faisceau de mesure LMes est ainsi de 19 mm environ. Cette largeur de faisceau permet de recouvrir la pupille d'entrée de l'objectif avec une distribution de l'intensité lumineuse optimisée dans l'exemple présenté pour le fonctionnement du microscope en milieu liquide, afin d'observer notamment des molécules organiques en solution.
L'objectif de microscope OM choisi pour un fonctionnement en liquide possède une ouverture numérique de 1.65. Il s'agit d'un objectif particulier qui nécessite l'emploi de lamelles Gs de microscope d'indice de réfraction n= 1.78450 à 633 nm, supérieur au verre optique standard. Pour avoir le meilleur ajustement possible entre l'indice des lamelles Gs et celui de l'huile à immersion Hi nécessaire à la réalisation du milieu de couplage du microscope, une huile à immersion Hi telle que l'huile commerciale GEM refractometer liquid n(5893A)=1.81 ±0.005 de Cargille Laboratories est de préférence utilisée. Une couche métallique M5 d'or de 45 nanomètres est déposée sur une face externe de la lamelle Gs utilisée afin de permettre la génération d'un plasmon de surface à l'interface de cette couche métallique avec un milieu diélectrique d'observation D.
Dans ces conditions, le faisceau LMes pénétrant dans l'objectif OM est focalisé exactement au niveau de l'interface entre la couche métallique Ms recouvrant la lamelle de verre Gs et le milieu diélectrique d'observation D, choisi en l'espèce pour être un liquide.
La lumière LMes après avoir traversé le milieu de couplage est réfléchie par la surface métallique M5 et repasse en sens inverse par l'objectif OM- La position du point de focalisation du faisceau laser de mesure LMes par rapport à la couche d'or Ms étant un paramètre fondamental pour le contraste des images obtenues par le microscope et c'est pourquoi cette position est contrôlée au moyen d'un dispositif de positionnement piézo-électrique avec une résolution de quelques dizaines de nanomètres sur une gamme de 100 μm.
L'alignement de l'axe de l'objectif OM avec la normale de la surface de la lamelle Gs est réalisé pour cette raison par un système de positionnement (non représenté sur la figure 6) quatre axes manuels sur l'objectif OM et deux axes manuels contrôlant le support de la lamelle Gs.
L'objectif comme la platine sont en outre portés sur deux platines PLi, PL2 de déplacement piézoélectrique permettant une précision dans le déplacement selon deux directions X, Y orthogonales dans un même plan et en positionnement supérieure à 10 nm. Ces platines PLi, PL2 sont avantageusement commandées par des moyens de pilotage électroniques EC reliés à un ordinateur de commande et de contrôle COMP.
Le microscope de l'invention comporte également des moyens piézoélectriques de déplacement de l'objectif OM en translation selon une direction Z normale au plan de chacune des surfaces de la lamelle de verre Gs et de la couche métallique Ms recouvrant l'une d'elle
Si l'alignement est correct, le faisceau réfléchi par la couche métallique Ms revient alors par le filtre spatial F5, l'objectif O2 et l'acousto-optique AOM Mes, pour être mélangé avec le faisceau de référence Lref dans le cube séparateur BS. Ce faisceau est décalé en fréquence de 2xΩMes par rapport au faisceau initial.
En sortie de rinterféromètre on obtient un faisceau lumineux Lv unique formé de la somme les faisceaux de référence et de mesure LRθf, LMθS et passe par un diaphragme D2 pour arriver sur un détecteur optique tel que par exemple un photodétecteur PD. Le signal optique V résultant de la détection du faisceau Lv présente une modulation temporelle à la somme et à la différence des fréquences optiques des deux faisceaux, c'est à dire 2Ωmes+2Ωref et 2Ωmes-2Ωref.
Étant donnée la réponse temporelle du détecteur PD seule la composante du signal V dont la fréquence correspond à la différence 2Ωmes-2Ωref, dont la valeur vaut 100 kHz dans la configuration choisie est utilisée. Le signal de sortie V du photodétecteur PD est filtré par un filtre approprié
(non représenté) est ensuite démodulé par des moyens de détection synchrone Dtec qui reçoivent également le signal de référence de la détection synchrone VRef, issu du mélange en fréquence et du filtrage des deux signaux modulant les acousto-optiques A0MRef et AOM Mes par le mélangeur et filtre passe-bas F. Le signal démodulé Vd est envoyé pour conversion numérique-analogique sur le micro-ordinateur COMP lequel permet alors de former les images. Celles-ci sont construites point par point en balayant la position dans un plan parallèle à celui de la lamelle Gs par rapport à l'objectif 0M au moyen des platines PLi7 PL2.
Le contraste de ces images s'appuie sur la technique de définition de profils V(z), obtenus par un balayage dans la direction Oz (normale à la lamelle Gs) et dont les variations sont fortement corrélées au plasmon de surface.
Le balayage se faisant à une position z fixe, il est ainsi possible d'obtenir des images du type de celle de la Figure 4B de particules de quelques dizaines de nanomètres, comme par exemple une particule de Latex de 50 nm de diamètre sur la Figure 4B, avec une résolution de l'ordre de 200 nm. Le microscope 1 de l'invention présente en outre l'avantage d'une grande versatilité d'utilisation et de configuration.
En particulier, le microscope de l'invention permet de réaliser une imagerie en microscopie plasmon à haute résolution en mode différentiel. Pour ce faire, on utilise le convertisseur de polarisation CP pour scanner linéairement de façon alternative et synchrone avec les platines PLi, PL2 par des faisceaux polarisés en mode pur p (polarisation radiale) et en mode pur s (polarisation azimutale), l'échantillon que l'on souhaite observer. On gagne ainsi en contraste des images dans la mesure ainsi qu'en dynamique.
Une autre utilisation du signal optique obtenu des faisceaux polarisés en mode pur s peut également être faite aux fins d'asservissement de la position verticale de l'objectif par rapport à l'échantillon à observer. En effet, l'analyse des signaux électriques établis à partir des faisceaux de lumière réfléchis polarisés en mode s permet de déterminer la valeur absolue de la position de l'objectif OM, et à partir de cette position, il est ensuite possible de corriger tous les drifts mécaniques et thermiques inhérents à une microscopie de haute résolution.
Une telle technique de correction de la position de l'objectif du microscope n'est pas en soit totalement nouvelle en microscopie cependant, avec le microscope de l'invention la particularité réside dans le fait que c'est le système d'imagerie lui même qui permet de faire la correction et non un système rapporté en parallèle au système d'imagerie. De ce fait, on ne complexifie point le microscope ni n'augmente de façon importante son coût d'ajustement, le tout sans perturber la mesure optique de plasmon. De plus, une telle faculté d'asservissement de la position de l'objectif OM par rapport à l'échantillon observé permet d'avoir une plus grande précision dans les mesures d'intensité de la fonction V(z).
Un autre avantage du microscope de la présente invention est de permettre la construction d'images en trois dimensions de la fonction V(z) mesurée. La construction de telles "cartes" tridimensionnelles de la fonction V(z) permet de trouver le plan optique de coupe où le contraste de l'image sera le meilleur. Pour ce faire, on réalise un post-traitement de ces images 3D puis par interpolation on détermine le plan Z où le contraste est optimum.

Claims

REVENDICATIONS
1. Microscope à plasmon de surface à balayage à haute résolution comportant : a) une source (LG) de lumière cohérente, et b) un milieu de couplage et de confinement d'un plasmon de surface comportant un objectif (O, OM) à grande ouverture numérique, une huile à immersion (Hi) et une lamelle de verre (Gs), et c) une couche métallique (M5) recouvrant une surface de la lamelle de verre (Gs) du milieu de couplage qui n'est pas en en contact avec l'huile d'immersion de ce dernier, la couche métallique étant apte à être mise en contact avec un milieu d'observation (D) contenant un échantillon à observer et à émettre un plasmon de surface généré par excitation d'au moins un faisceau lumineux (L) issu de la source de lumière (LG), et d) un interféromètre de Twyman-Green en mode hétérodyne apte à diviser un faisceau lumineux émis par la source de lumière en au moins un faisceau de référence (LRef) et au moins un faisceau de mesure (LMes) dirigé vers le milieu de couplage et la couche métallique (Ms) pour générer un plasmon de surface, l'interféromètre étant positionné entre la source lumineuse et l'objectif du milieu de couplage pour former un faisceau interférométrique (Lv) entre un faisceau de référence et un faisceau de mesure après réflexion de chacun d'eux respectivement par un miroir (M) et par la couche métallique (Ms), et e) des moyens de balayage (PLi, PL2, EC) de la couche métallique à l'aide du faisceau lumineux de mesure, et f) des moyens de détection (PD) du faisceau interférométrique issu de l'interféromètre, et g) des moyens de traitement (S, F, DTeϋ COMP) et de formation d'une image à partir du faisceau interférométrique, caractérisé en ce qu'il comporte, disposé entre la source lumineuse et l'interféromètre, au moins un convertisseur de polarisation linéaire en polarisation radiale (CP) des faisceaux lumineux (L) émis par la source lumineuse (LG), permettant ainsi la détection d'objets diélectriques ou métalliques de diamètre inférieur à 10 nm sans marquage.
2. Microscope selon la revendication 1, caractérisé en ce que un premier bras de l'interféromètre, dit de référence, comporte un miroir (MRef) de réflexion du faisceau lumineux de référence (LRef) et un second bras, dit de mesure, dans lequel se propage le faisceau de mesure (LMes) comporte le milieu de couplage (O, OM ; Hi ; M5) et la couche métallique (Ms) recouvrant une surface de la lame de verre (Gs) de ce dernier.
3. Microscope selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que chaque bras de l'interféromètre comporte au moins un modulateur acousto-optique
(AOMRef, A0MMes) apte à introduire un décalage de la fréquence optique du faisceau lumineux de référence (LRef) et du faisceau de mesure (LMes) respectivement.
4. Microscope selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les moyens de détection (PD) du faisceau interférométrique (Lv) comportent au moins un des éléments du groupe suivant : photomultiplicateur, caméra CCD, compteur de photons, photodiode à avalanche.
5. Microscope selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comporte au moins un agrandisseur de faisceau (BE) placé entre la source de lumière (LG) et l'interféromètre et entre l'interféromètre et le milieu de couplage (O, OM ; Hi ; M5).
6. Microscope selon Tune des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le milieu d'observation (D) est un milieu diélectrique dont l'indice de réfraction est inférieur à 1,5.
7. Microscope selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'objectif (O, OM) du milieu de couplage présente une ouverture numérique supérieure ou égale à 1.2 dans l'air et à 1.55 dans une solution aqueuse et un grossissement supérieur à soixante fois.
8. Microscope selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les moyens de balayage de la couche métallique (Ms) à l'aide du faisceau lumineux de mesure (LMes) comportent des moyens piézoélectriques de déplacement en translation (PLi, PL2) de la lamelle (GS) et/ou de l'objectif (O, OM) du milieu de couplage selon deux directions X, Y orthogonales dans un même plan.
9. Microscope selon Tune des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens piézoélectriques de déplacement de l'objectif (O, 0M) en translation selon une direction Z normale au plan de chacune des surfaces de la lamelle de verre (Gs) et de la couche métallique (Ms) recouvrant l'une d'elle.
10. Microscope selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la source de lumière cohérente (LG) est une source de type L.A.S.E.R., et notamment un laser à gaz hélium-néon (He-Ne).
11. Procédé de microscopie de plasmon de surface à haute résolution par interférométrie hétérodyne, dans lequel :
- on illumine par un faisceau lumineux dit de mesure (LMes) produit par un faisceau de lumière cohérente (LG) introduit dans un interféromètre de Twyman- Green en mode hétérodyne, un échantillon à imager disposé sur une couche métallique (Ms) revêtant une lamelle de verre (Gs) d'un milieu de couplage et de confinement d'un plasmon de surface comportant également un objectif (O, OM) à grande ouverture numérique et une huile à immersion (Hi), et
- on balaye la surface de la couche métallique à l'aide du faisceau de mesure guidé par des moyens de balayage (PLx, PL2, EC), et - on détecte par des moyens de détection (PD) un faisceau lumineux interférométrique en sortie dudit interféromètre de Twyman-Green, et
- on traite ledit faisceau interférométrique et on forme une image du plasmon de surface émis par le surface métallique au contact de l'échantillon à imager par des moyens de traitement (S, F, DTθc, COMP) et de formation d'une image, caractérisé en ce que l'on polarise radialement le faisceau de lumière cohérente (LG) par un convertisseur de polarisation (CP) avant son entrée dans l'interféromètre de manière à illuminer l'échantillon à imager sur la couche métallique (M5) du milieu de couplage à l'aide d'un faisceau de mesure (LMes) présentant une symétrie radiale par rapport à son axe de propagation.
12. Procédé de microscopie de plasmon de surface à haute résolution par interférométrie hétérodyne selon la revendication 11, dans lequel on réalise une imagerie en mode différentiel d'un dit échantillon positionné sur la couche métallique du milieu de couplage, caractérisé en ce qu'on polarise alternativement à l'aide du convertisseur de polarisation (CP) le faisceau de lumière cohérente (LG) en mode pur p et en mode pur s et l'on balaye linéairement de façon alternative et synchrone de la polarisation alternative du faisceau de lumière cohérente la surface de la couche métallique par le faisceau de mesure (I-Mes) polarisé alternativement en mode pur p et en mode pur s.
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