JP6460364B2 - 軸外し反射位相顕微鏡システムおよび軸外し位相顕微鏡のための方法 - Google Patents

Description

［連邦政府の支援を受けた研究開発の表示］
この事業は、米国国立衛生研究所の国立研究資源センター（Ｐ４１−ＰＲ０２５９４−１８）、及び、米国国立科学財団（ＤＢＩ−０７５４３３９）の資金援助を受けている。

[関連出願の相互参照]
本願は、２０１１年１月２５日に出願された米国特許出願第６１／４３６，０２６号の優先権を主張している。この出願の内容全体をここに参照として組み込む。

生体マイクロレオロジーは、生体細胞の機械的特徴を定量的に調べる学問である。機械的特徴には、がん細胞の弾性の増加、マラリアに罹患した赤血球細胞の膜剛性の変化、及び、細胞同士の粘着性の変化等の、細胞プロセスの進行状況の内因性の指標である。細胞膜のレオロジー特性の計測は、間接的に細胞の内部構造の情報も提供することができる場合があるため、有用である。生体細胞膜のレオロジー特性を評価する技術は複数存在している。既存の技術には、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）、光ピンセット及び磁気ピンセット、ピペット吸引、電界歪曲（electric field deformation）、全視野透過位相顕微鏡法などが含まれている。これらの方法の多くが、非線形の応答を引き起こす可能性のある、大きな歪曲を利用している。ＡＦＭのような点の計測技術では、１つの細胞膜の大きな表面積を調査するための時間尺度が分単位なので、これより広い表面積において高速で細胞膜のダイナミックスを研究することは難しい。透過位相顕微鏡法は、二次元の二重層の細胞骨格を有する赤血球細胞の膜レオロジー特性を計測するために利用されて、功を奏した。しかし、殆どのタイプの細胞は、複雑な三次元の細胞内部構造を有しており、上述した技術の殆どは、細胞膜の組み合わせ、及び、切り離しが難しい多数の細胞のバルク特性を調査する用途には不適である。

このようなわけで、複雑な生体系及び他の科学及び産業における計測学に対する用途のために、位相顕微鏡分野の向上が望まれている。

本発明は、全視野反射を利用する位相顕微鏡法に関する。本発明のシステム及び方法の好適な実施形態は、小さな特徴部（プラズマ及び核膜のダイナミックスの両方または片方など）を有する構造の計測に関する。たとえば、三次元の細胞骨格によって、これらの細胞は、赤血球細胞よりもずっと剛性が高く、このことは、対応する膜の変動が、透過位相顕微鏡で検知することができないほどずっと小さいことを示している。この点に関しては、反射を利用する光学的な方法を利用すると、透過を利用する光学技術に比べて、２ｎ／Δｎ高い計測感度を提供することが可能である。好適なシステム及び方法では、光源からの光の一部を利用して、計測対象の材料を照明するためにも利用される光と干渉させる。光源からの、選択された光の回折次数は、材料について選択した視野または画像視野の画像とともに二次元検知アレイに連結させる。これにより、材料の全視野のインターフェログラムが提供される。

材料の選択した深さにおける反射信号をサンプリングするためには、コヒーレンスの低い干渉計が利用される。過去には、スペクトル領域及び時間領域の光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）を利用する反射位相顕微鏡の実装は、その用途、有用性に限界があった。以前には、例として、スペクトル領域のＯＣＴ及びラインフィールドの照明を利用する定量的な位相顕微鏡が利用されてきた。ラインフィールドの反射位相顕微鏡は、コヒーレンスの低い照明と、共焦点ゲーティングとを利用することで、サブナノメートルの距離分解能の細胞膜の表面形状を達成した。ラインフィールド法を利用すると、ラインの照明において１００を超えるデータ点で、１ｋＨｚのフレームレートを得ることができることが示された。第１の全視野位相感度のＯＣＴは、掃引ソースのＯＣＴ構成で達成されたことが報告されており、この構成では、ボリューム画像を形成するために１０２４波長の符号化された画像が必要であった。しかし、この取得レート（１つの波長について２５ｍｓの積分時間）は、膜のダイナミックスを観察するには足りなかった。

位相シフトする干渉計を利用する時間領域の反射位相顕微鏡を利用した以前の試みでは、複数の画像を得なければならないことから、時間解像度（１．２５秒）が制約されていた。全視野の位相画像をシングルショットで得るために、低コヒーレンスの光源を持つ、軸外しデジタルホログラフィーの利用が試みられたこともあったが、参照鏡を傾けることで、干渉コントラストが不均一になり、全視野の撮像ができなかった。

したがい、本発明は、コヒーレンスの低い光源及び軸外し干渉計に基づく、史上初のシングルショットの全視野反射位相顕微鏡を提供する。コヒーレンスの低い光源は、パルスレーザ、スーパルミネッセントダイオード、または、時間及び空間の少なくとも一方においてコヒーレンスの低い光源（たとえば、メタルハライドランプ（コヒーレントではない））であってよい。システムは、参照ビームに波面の傾きを提供して、全視野（または撮像フィールド）においてサンプルビームと干渉させる。シングルショットのインターフェログラムは、計測対象のサンプルから反射して戻るビームの光位相を決定して、ラスタ走査または一次元走査する必要なく、表面形状を提供することができるように処理される。シングルショットのインターフェログラムはサンプル位相をとるために必要なので、細胞から戻る光量及びカメラフレームレートにより、表面撮像の速度が定義される。したがって、本発明は、たとえばＨｅＬａ細胞の熱変動に関する膜運動を観察する等の用途において、１ｋＨｚの全視野撮像を行う。

本発明の好適な実施形態では、対向する（en-face）光コヒーレンストモグラフィーと、軸外しデジタルホログラフィーと、に基づく、定量的な反射位相顕微鏡が提供される。システムは、参照アームに回折格子を利用して、軸外し干渉計のための参照ビームに所望の傾きの角度を提供することができる。全視野照明によって、対象表面の上の複数の点をシングルショットで位相計測することができ、自己位相参照法を利用することができるようになるので、別個の参照アームを利用せざるをえない干渉分光システムで生じがちな共通モードのノイズがなくなる。この全視野反射位相顕微鏡では、自己位相参照により、位相ノイズが２１（ｐｍ／√ＨＺ）にまで低く抑えられるようになった。このような高い位相感度により、システムは、たとえば１００ピコメートルから１５０ナノメートルのオーダであってよい視野内の細胞表面の熱運動を解決することができるようになった。全視野反射位相顕微鏡の用途としては、プラズマまたは膜変動を利用して、細胞膜の機械的特性を推定する、細胞骨格または細胞核の骨格のバルク粘弾性特性を推定する、などが挙げられる。これら様々な細胞の機械的特性は、一般的な種類の細胞の病態生理学を計測するための非侵襲的なバイオマーカとして利用することができる。システムはさらに、細胞の電子移動（electromotility）（１つの哺乳類の細胞の活動電位により駆動される細胞膜の運動を含む）を、全視野で且つ多くの細胞において（multi-cell）撮像することができるようになる。

本発明の好適な実施形態は、小型素子（たとえば集積回路）の製造といった、産業における計測学に関する用途にも応用可能である。

図１Ａ−図１Ｂは、全視野のシングルショット反射位相顕微鏡の概略図を含み、回折格子、空間フィルタ、及び、Ｔｉ：サファイヤ光源（ＳＭＦ：シングルモードファイバ、Ｌｉ：ｉ番目の球形レンズ、ＢＳｉ：ｉ番目のビームスプリッタ、Ｇ：回折格子、Ｓｉ：ｉ番目の空間フィルタである）が利用されている。 サンプルとして平坦な表面を有するインターフェログラムを示している。 図２Ａから図２Ｅ全体で、シングルショット全視野反射位相顕微鏡を利用して計測した、直径４０ミクロンのポリスチレンマイクロスフェアの表面形状を示しており、図２Ａは、原インターフェログラムを示している。 図２Ａから図２Ｅ全体で、シングルショット全視野反射位相顕微鏡を利用して計測した、直径４０ミクロンのポリスチレンマイクロスフェアの表面形状を示しており、図２Ｂは、図２Ａの二次元フーリエ変換の振幅コンポーネントを示している。 図２Ａから図２Ｅ全体で、シングルショット全視野反射位相顕微鏡を利用して計測した、直径４０ミクロンのポリスチレンマイクロスフェアの表面形状を示しており、図２Ｃは、図２Ｂを空間フィルタリングした画像を示している。 図２Ａから図２Ｅ全体で、シングルショット全視野反射位相顕微鏡を利用して計測した、直径４０ミクロンのポリスチレンマイクロスフェアの表面形状を示しており、図２Ｄは、図２Ｃの逆フーリエ変換の位相コンポーネントである。 図２Ａから図２Ｅ全体で、シングルショット全視野反射位相顕微鏡を利用して計測した、直径４０ミクロンのポリスチレンマイクロスフェアの表面形状を示しており、図２Ｅは、図２Ｄから得た、アンラッピングされた位相画像である。 ＦＦ−ＲＰＭの感度を決定するシステム構成を示す。 加えられる電圧の関数として計測された位相変動（ラジアン）を示す（Ｍ_ｉ：ｉ番面の鏡、ＰＺＴ：ジルコン酸チタン鉛である）。 二重パス透過のためのコヒーレンスゲート及び反射位相撮像の位置をそれぞれ示す。 二重パス透過のためのコヒーレンスゲート及び反射位相撮像の位置をそれぞれ示す。 ＨｅＬａ細胞の二重パス透過位相画像を示す。 図４Ｃの、正方形のボックス内の領域のシンブルショット反射位相画像を示す。 図５Ａから図５Ｂ全体として、細胞膜の変動計測のためのシステム及びその結果を示しており、図５Ａは、サンプルをある角度をもって傾けたときのコヒーレンスゲートの位置を示しており、膜の変動を取得しつつも、同時にカバースリップから背景位相をも得ることができている。 図５Ａから図５Ｂ全体として、細胞膜の変動計測のためのシステム及びその結果を示しており、図５Ｂは、青色、ホルマリン固定；緑色、通常；及び、赤、サイトカラシン−Ｄ処理されたＨｅＬａ細胞という３種類の母集団について、周波数の関数として、膜変動の電力スペクトル密度（power spectral density）を示している。 本発明の好適な実施形態における全フレーム反射及び透過顕微鏡法の両方または片方を行う方法を示す。 一例として、メタルハライドランプ等の空間的にコヒーレンスの低い光源を利用する位相顕微鏡システムを示す。 図６Ａのシステムが検知するインターフェログラムを示す。 参照光路において回折格子及び空間フィルタを利用して、空間的にコヒーレンスの低い光源としてメタルハライドランプを用いた反射位相顕微鏡システムを示す。 参照光路において回折格子及び空間フィルタを利用して、空間的にコヒーレンスの低い光源としてメタルハライドランプを用いた反射位相顕微鏡システムを示す。 参照光路において回折格子及び空間フィルタを利用して、空間的にコヒーレンスの低い光源としてメタルハライドランプを用いた反射位相顕微鏡システムを示す。 本発明の好適な実施形態におけるノイズ低減方法を示す。 本発明の好適な実施形態におけるノイズ低減方法を示す。 本発明の好適な実施形態におけるノイズ低減方法を示す。 図９Ａ、図９Ａ（ａ−１）、図９Ａ（ａ−２）全て、空間的にコヒーレンスの低い光源による、ビーズの表面の位相画像を示す。 空間的にコヒーレンスの低い光源による、ビーズの表面の位相画像を示す。 空間的にコヒーレンスの低い光源による、ビーズの表面の位相画像を示す。 システムの安定性の計測を示す。 システムの安定性の計測を示す。

図１Ａは、シングルショットの全視野反射位相顕微鏡（ＦＦ−ＲＰＭ）を提供する本発明の好適な実施形態の概略図を示す。モードロックされたＴｉ：サファイヤレーザ（中央波長λ_ｃ＝８００ｎｍ）からの光が、シングルモードファイバ１５に連結され、配光およびスペクトル幅の拡大が行われる。ファイバ出力において、スペクトル半値幅（full-width-half-maximum spectral width）Δλが、５０ｎｍであり、これは、屈折率ｎが１．３３に等しい典型的な培地において往復のコヒーレンス長が４μｍとなる。レンズＬ２、Ｌ３、Ｌ４及び水浸の６０倍の対物レンズＬ５（ＮＡ＝１．２）を通る第１のビームパス１６を通るサンプルビームは、サンプルの表面２４で反射されて、レンズＬ６及びＬ１５を介して、高速ＣＭＯＳカメラの上にサンプルの画像を結像させる。カメラは、画像を処理して、ディスプレイ２６かメモリ２８に（画像処理または画像格納のために）提供することのできるデータプロセッサまたはコンピュータ２２に接続されているピクセル化された撮像検知器（pixelated imaging detector）２０であってよい。コンピュータは、三つの直交する方向にサンプル及び参照鏡の位置、及び、光源からの入射光の方向に対する角度方向を制御することができる並進ステージ２５及び４０に接続することができる。第２の光路１８のレンズＬ７、Ｌ８、Ｌ９、及びＬ１０を通る参照ビームは、ビームスプリッタＢＳ２によって第３の光路１２に方向を変更させられる。ＢＳ２によって来た道を戻る参照光の一部は、空間フィルタＳ１によってさえぎられる。他方で、偏向された光は、レンズＬ１１−Ｌ１４を通り、第４の光路２７の上の戻りサンプル光と、第３のビームスプリッタＢＳ３で結合される。軸外し干渉計では、回折格子Ｇ（５０）が、共役平面のいずれかに導入される。複数の回折された次数のうち、＋１次のみを、レンズＬ１２のフーリエ平面の空間フィルタＳ２（６０）を配置することで選択することができる。この結果、回折された参照ビームは、画像平面のパス２９におけるサンプルビームと特定の角度をもって干渉する。回折格子期間及び回折格子とカメラとの間の倍率によって、軸外し干渉計における参照ビームには所望の角度シフトが提供される。さらに、この方法によって、参照ビームの波面全体に等しいパスの長さが提供され、これは、単に軸外し干渉計の参照鏡の傾きを利用していた先行技術のシステムとは異なる。

言い換えると、回折格子及びカメラがあれば撮像条件としては十分なので、カメラの対応する画素までの回折格子のいずれかの点から計測した光路長は、一定となる。この結果、この条件によって、全視野において均質な縞の可視性が達成される。システムは、二重パス透過モード及び反射モードにおいて定量位相画像を撮ることができるようになり、これは、コヒーレンスゲートをガラススライドまたは細胞膜にそれぞれ配置することで（図４Ａの４００参照）達成される。

図１Ｂは、サンプルとして平坦な表面を有するインターフェログラムを示している。空間縞は、サンプルが平坦な場合にまっすぐであり、同時に、均等間隔に並んでいる。ＣＭＯＳカメラにおける全計測強度は、以下のように表すことができる。

ここでＩ_Ｒ及びＩ_Ｓ（ｘ，ｙ）は、それぞれ参照ビームの強度分布及びサンプルビームの強度分布である。ｕ及びｖは、ｘ−及びｙ−軸沿いの空間縞の周波数を表しており、φ（ｘ，ｙ）は、研究対象のサンプルに関する、空間的に変化する位相である。さらに、並進ステージ２５を利用してサンプルからコヒーレンスゲートをシフトさせることで、数１のＤＣコンポーネントを表す、縞のない画像が得られる。縞のない画像を、原インターフェログラムから差し引くことで、干渉の項のみが得られる。

図２Ａは、４０ミクロンのマイクロスフェアを用いて、全視野反射位相顕微鏡が記録する二次元のインターフェログラムの干渉部分を示す。縞は、平坦なサンプルについてはまっすぐで、均等間隔をおいて並んでおり、マイクロスフェアから反射したサンプルビームの波面が修正されると、変更される。調査対象のサンプルの形状を抽出するためには、二次元インターフェログラムの干渉部分にヒルベルト変換を行って、戻りのサンプルビームの振幅及び位相を求める。ヒルベルト変換を位相撮像に利用する方法についての詳細は、２００６年３月２４日に出願された米国特許出願第１１／３８９，６７０号明細書に載っており、この内容全体をここに参照として組み込む。過去には、この方法を利用することで、透過型定量位相顕微鏡でサンプル振幅及び位相情報を取得した例がある。透過位相顕微鏡のさらなる詳細については、米国出願第１２／２１８，０２９号（２００８年７月１０日出願）を参照されたく、この内容全体をここに参照として組み込む。

図２Ｂは、図２Ａのインターフェログラムの二次元フーリエ変換の振幅を示す。より詳しくは、１番目及び１次コンポーネントを第１及び第３クワドラントにそれぞれ描いている。第１に、フーリエ画像の１次コンポーネントを切り出し、または選択して、フーリエ平面の中央（図２Ｃ参照）にシフトさせてから、逆フーリエ変換を行う。逆フーリエ変換された画像の位相（図２Ｄ参照）は、サンプルのビーム波面の光位相を提供している。二次元空間位相のアンラッピングを行うことで、図２Ｅに示すように、２πの位相のあいまいさがないサンプルの表面形状が得られる。

生体細胞の内因性の膜変動は、通常、ナノメートル以下のオーダであり、これら小さな膜変動の計測には、高い信号対雑音比（ＳＮＲ）を持つ定量位相顕微鏡の開発が必要である。全視野ＲＰＭの計測感度を、最小検知可能軸方向運動（least detectable axial motion）により示すが、計測感度を計測するための構造を図３Ａに示す。全視野照明によって、並進ステージ２００に搭載されている鏡または反射器Ｍ１及びジルコン酸チタン鉛（ＰＺＴ）アクチュエータ２０２に取り付けられている鏡または反射器Ｍ２の両方が照射される。

サンプルビームパスに対する参照ビームパスの独立した機械的または熱変動により、共通モードのノイズを抑圧するためには、自己位相参照法を利用することができる。全視野照明のすべての点の位相は、同時に取得されるので、視野の各点は、他の点と同じ干渉ノイズを共有する。この方法は、反射器Ｍ１を照らしているビームの一部から計測した位相を参照位相として利用している（これは共通モードのノイズを表している）。この参照位相をＭ２の後続する点の位相から差し引くことで、共通モードのノイズを取り除いて、表面Ｍ２の実際の変動を得る。

共通モードの位相ノイズ除去を表すために、ＰＺＴアクチュエータを４００Ｈｚの周波数で駆動して、一方で、ＰＺＴ駆動電圧の振幅を０．０２−５ボルトの範囲で変化させた。Ｍ１及びＭ２のシングルショット位相画像を同時に、１ミリ秒の間隔で１秒間の間、取得した。時間パワースペクトル密度（ＰＳＤ）を、Ｍ２から計測された位相の時間変動から計算して、４００ＨｚにおけるＰＳＤの平方根を選択して、軸方向運動信号を決定した。図３Ｂは、４００Ｈｚで計測した軸方向運動と、ＰＺＴ駆動電圧との関係を示しており、このグラフは、１４．５ｍｒａｄ／ボルトの線に良好に合致している。図３Ｂはさらに、３９５から４０５ＨｚのＰＳＤの平方根の平均をとることで（４００Ｈｚの周波数を除き）推定されるノイズフロアも示している。最大ノイズは、たった０．４４（ｍｒａｄ／√ＨＺ）である。これは、２１（ｐｍ／√ＨＺ）に対応している、というのも、位相Δφの変化が、軸位置Δｌの変化に対して、以下のように線形に関連しているからである。

ここで、ｎは、媒体の反射率を示す（通常はｎ＝１．３３である）。

生体細胞の高速定量撮像を示すために、ＨｅＬａ細胞を、計測の２日前にガラス上で二次培養して、標準の培地（ダルベッコ変法イーグル培地）に浸す。前述したように、この設定によって、透過位相画像をとり、且つ、反射位相画像をとることができる。図４Ａ及び図４Ｂは、二重パス透過位相撮像及び全視野反射位相撮像それぞれのコヒーレンスゲート４００、４０２の位置を示している。二重パス透過位相撮像では、照明光が細胞を通り、ガラス表面反射器４０４から反射されて、再度細胞内を通る。計測される透過位相差Δφ_Ｔは、以下の光学的厚さ（ＯＴ）に関している。

ここで、

は、培地と細胞質の間の屈折率の差の平均であり、ｈは、細胞の高さである。図４Ｃは、生きているＨｅＬａ細胞の対応する透過位相画像を示している。細胞の高さは、数２に、

＝０．０３、Δφ＝４を代入することで、大体８．５μｍであるとして推定される。

全視野反射位相撮像では、焦点面及びコヒーレンスゲートを、ゲート４０２をもつ細胞表面４０６に配置する。コヒーレンスゲートからずれた領域からの後方散乱光は、干渉に寄与しないので、コヒーレンスゲート内の細胞表面の全視野位相情報（図４Ｄを参照）は、図４Ｂに示すように収集される。この場合には、反射位相差Δφ_Ｒが、以下に示すように、高さの差Δｈ（ｘ，ｙ）に直接関係している。

ここで、ｎ_ｍは、培地の反射率であり、通常は１．３３５である。

反射モードの撮像の利点は、数３及び数４と比較すると明らかである。たとえば、反射位相画像の１０ミリラジアンの位相変化は、０．５ナノメートルに相当し、透過における同じ位相変化は、２０ナノメートルに相当する。言い換えると、透過および反射モード計測の位相感度が同じであると想定した場合に、反射位相撮像の高さの解像度（または計測感度）は、透過計測のものより、（ｎ_ｍ／Δｎ）の４０倍、良好になる。さらに、反射位相画像は、従来の屈折計で正確に計測することができる媒体の反射率にのみ依存するので、細胞内の反射率の分布に関わらず、細胞表面の形状を明らかにすることができる。

上述したように、膜変動は、細胞の状態全体の内因的な指標であり、膜の機械的特性を、人間の赤血球におけるマラリア罹患の様々なステージとの関連で推定するために利用することができる。しかし、内部構造の複雑な真核細胞においては、この全視野反射位相顕微鏡は、効果的に内部の細胞構造からの貢献を除去することにより、膜の変動を選択的に計測することができる。ＨｅＬａ細胞の膜変動は、様々な細胞の状態において計測することができる。より詳しくは、（ｉ）生きている通常のＨｅＬａ細胞のサンプルと、（ｉｉ）２％のパラホルムアルデヒドで処理した後に、固定されたＨｅＬａ細胞サンプルと、（ｉｉｉ）アクチンの重合化を妨げる８ｎＭのサイトカラシン−Ｄで処理したＨｅＬａ細胞のサンプルを考える。画像取得のフレームレートは、１ｋＨｚに設定して、データは、各細胞について１秒の間記録した。

図５Ａに示すように、試験対象のサンプルは、並進ステージに対して角度５０２で傾けられ、または、回転させられて、膜変動およびカバースリップからの背景位相を同時に取得する。カバースリップ上で観察された背景位相の変化を差し引いて、共通モードの機械的なノイズをなくす。細胞表面の時間変動を計測して、各細胞の膜運動のＰＳＤを算出する。並進ステージも、３つの直交する方向５０４のいずれかにサンプルを移動させることができる。図５Ｂは、各細胞母集団におけるＰＳＤの平均値を示している。この研究で利用された、通常の細胞、固定された細胞、サイトカラシン−Ｄ処理された細胞は、それぞれ、Ｎ＝２２、２０、および３３であった。固定された細胞のＰＳＤは、通常の細胞よりも小さく、平坦であることが計測によりわかり、これは、細胞膜が、化学的固定の後に硬くなったことを意味している。他方で、サイトカラシン−Ｄ処理された細胞のＰＳＤの計測値は、通常の細胞よりも大きく、これは、細胞膜が、アクチンの重合化により阻害されて、柔らかくなったことを示している。

本発明によるサンプルを計測するプロセスシーケンス５００を、図５Ｃに示す。レーザ１４等の光源が、信号（シングルショット）を生成して（５１０）、信号が、サンプルと参照４２とに連結される（５２０）。ステージ４０は、サンプル２４をコヒーレンスゲートに対して配置することができる（５３０）。画像が検知され（５４０）、選択されたフレームレートで（好適には、秒速２０フレーム以上、または、これより動的プロセスが速い、秒速３０フレーム以上でもよい）、記録される（５５０）。画像が処理される（５６０）が、これには、画像データをフーリエ平面に配置することが含まれる（５７０）。画像をアンラッピングして（５８０）、ノイズコンポーネントを取り除き（５９０）、サンプル用の定量データの表示および記録を行えるようにする。

空間的にコヒーレンスの低い光源を持ち、回折格子のない全視野の反射位相顕微鏡（ＦＦ−ＲＰＭ）を、図６Ａに示す。広帯域光源（メタルハライドランプ６００等）を利用することができる。図６Ｂは、円形のパターンをもつ図６Ａのシステムを利用してカメラで撮像した干渉画像を示す。

回折格子７０５および空間フィルタ７０７を持つＦＦ−ＲＰＭを含む本発明の好適な実施形態を、図７Ａに示す。図７Ｂは、図７Ａのシステムを利用してカメラで撮像した干渉画像を示しており、図７Ｃは、Ｌ１−Ｌ６がレンズであり、ＯＬ１およびＯＬ２が対物レンズであり、ＢＳ１−ＢＳ３がビームスプリッタであり、ＩＰ：画像平面であり、ＦＰ：フーリエ平面である、図７Ｂに示す領域の拡大図を示す。メタルハライドランプ７００等の広帯域光源は、中央波長が６００ｎｍであるＸ−Ｃｉｔｅ１２０（カナダのｍｆｒ．ＥＸＦＯ）といった撮像光源を提供し、レーザ光源７０２は、発光波長が６３２ｎｍのダイオードレーザ（Ｅｄｍｕｎｄ ｏｐｔｉｃｓ）である。

空間的にコヒーレントではない光源７００（メタルハライドランプ）からの光は、２つのビームに分割され、サンプル光７５０が、サンプルで反射して、ビームスプリッタ７５２および７５４を通ってカメラ２０に到達する。参照光７６０は、ビームスプリッタ７６２および鏡７６４、７６６を利用して、カメラ２０に向かう。撮像用の空間的および時間的にコヒーレントではない光（たとえばメタルハライドランプ）は、撮像光源を含む。サンプルが反射する光は、Ｌ１とＬ３との間の撮像平面（ＩＰ）に焦合される。ＩＰ上のサンプルの画像は、カメラへと焦合される。

参照鏡が反射した光は、Ｌ２とＬ４との間の回折格子７０５へと焦合される。回折格子の画像は、カメラに焦合されるが、一次回折ビームのみが照射される。

Ｌ２とＬ４との間の回折格子が取り除かれると（図６Ａ参照）、干渉縞の中心部（bulls-eye）のパターンをカメラが撮像する（図６Ｂ）。図７Ａの回折格子７０５および空間フィルタ７０７を挿入することで、回折参照ビームが、角度７１０をもってカメラに入射して、複数の縞を有する干渉画像が、カメラ２０により撮像される（図７Ｂ参照）。図７Ｃは、図７Ｂに示す領域７２０の拡大図である。

図７Ａに示すレーザ７０２（空間的および時間的にコヒーレントな光源）は、システムの機械的ノイズを監視するためのものである。レーザ７０２の機能は、図８Ａから図８Ｃを参照して説明する。複数の縞を有する干渉画像のなかから位相情報を取得するために利用される変換（ヒルベルト変換）は、空間的にコヒーレントな光源との関連で説明したものと同じプロセスを利用することができる。

図８Ａから図８Ｃは、共通モードのノイズを除去するためのシステムを示す。図８Ａは、機械的（共通モード）のノイズを監視するための撮像光およびレーザ光の構成の詳細を示す。図８Ｂは、干渉画像の概略図を示す。図８Ｃは、サンプル構成の側面図である。システムの機械的不安定性により、干渉画像の縞が経時的に移動する。機械的ノイズを補償するために、レーザ光を利用して機械的ノイズを監視する。

レーザ光と撮像光とは、同じ光路を共有する（図８Ａ参照）。しかし、ビームは、５０μｍ程度わずかに横方向にずれる。レーザ光は、撮像光がサンプル（たとえば細胞）の表面で反射されている間に、ガラス（基板）の表面に当たる。したがって、検知器は、サンプル表面からの干渉縞と、同じ画像のガラス基板からの干渉縞を、両方とも見ることができる（図８Ｂ）。図８Ｃは、サンプルの側面図を示す。ガラス基板から反射するレーザ光は、光路の差に関わらず干渉縞を形成する間が、コヒーレンスの低い撮像光源のコヒーレンスゲーティングによって、限られた深さからの反射撮像光のみが干渉縞を形成する。

図９Ａから図９Ｃは、１０μｍのポリスチレンビーズの位相画像を示す。図９Ａは、ワンショット干渉画像を示しており、図９Ａ（ａ−１）および図９Ａ（ａ−２）は、矩形で示す領域にズームインした図である。図９Ｂは、位相画像を示し、疑似色（pseudo-color）が位相（ラジアン）を示している。図９Ｃは、ビーズの表面形状を示す。

図９Ａは、ワンショット干渉画像を示している。ビーズ表面のコヒーレンスゲーティングを調節する。ビーズ表面からの撮像光の反射による干渉縞と（図９Ａ（ａ−２）を参照）と、ガラス基板からのレーザ光の反射による干渉縞と（図９Ａ（ａ−１）を参照）を得る。ヒルベルト変換によって、図９Ｂに示すような全視野位相画像が得られる。ビーズの画像は、切り出されて、処理されて、二次元位相のアンラッピングが行われることで、ビーズの表面形状が得られる。

共通モードのノイズ除去の結果を図１０Ａに示し、この図には、レーザによりガラス基板９６０上で、ビーズ表面９５０で観察された位相変動と、除去後９７０に、システムにより観察されるビーズ表面の真の位相変動とが示されている。

図１０Ｂは、ビーズの真の位相変動にズームインした図である。これは、尺度が詳細になっている図１０Ａのライン９７０と同じプロットである。

これらは、共通モードのノイズ除去の結果を示している。この例では、干渉画像が、３３ミリ秒の間隔（３０Ｈｚ）で１２秒間記録されて、位相画像のタイムシリーズデータが取得される。位相の原データは、ビーズの表面およびガラスの表面の両方で３ラジアンの間変動した。しかし、ビーズの表面とガラスの表面とにおける変動の傾向は、この変動の源がサンプルアームおよび参照アームのパス長の変動全体であるために、互いに類似している。ビーズの変動からガラスの変動を差し引くことで、ビーズの位相の非常に安定したタイムシリーズが得られている。残りの不安定な要素は、５２ミリラジアン（標準偏差）であり、これは、高さの解像度の１．８ナノメートルに相当する。ガラスの表面運動を、ビーズの１つから差し引くときに、撮像光とレーザ光との間の波長を考慮に入れる点に留意されたい。比率は１．０５であり、ガラスの位相変動を、１．０５の係数で乗算したものを、ビーズの位相変動から差し引いた。

したがって、本発明の好適な実施形態により、空間的にコヒーレントではない光源を持つＦＦ−ＲＰＭが実装され、サンプルの表面形状が、ｚ方向にナノメートルの解像度で得られた。空間的にコヒーレントな光源を持つシステムに対する、空間的にコヒーレントではない光源を持つシステムの利点は、画像にスぺックルノイズがなくなることである。

本発明を特定の方法および装置の観点から記載してきたが、記載は、均等物である装置および方法の例示であり、請求項に記載した本発明の範囲を制限するものではないことを理解されたい。

Claims (32)

1. 低コヒーレンスの光源と、
   前記光源に光学的に連結された第１の光路沿いに配置された計測対象の材料と、
   前記材料に対してコヒーレンスゲートを配置させるように、レンズと前記材料との間の相対位置を制御するための、移動可能な並進ステージであって、前記コヒーレンスゲートは、撮像される前記材料の一部を規定し、これにより、前記材料の表面領域が撮像され、または、前記コヒーレンスゲートの前記材料内の深さ方向への移動の後に前記移動されたコヒーレンスゲートにより画像が検知される、前記並進ステージと、
   前記光源に光学的に連結され、参照光路に配置された参照反射器と、
   前記参照反射器により反射された光の回折次数を選択する光学系と、
   前記材料からの反射された光と、前記参照反射器からの前記選択された光の回折次数とを検知する撮像検知器と
   を備え、
   前記材料からの前記光は、前記参照反射器から受けた前記光とは異なる角度で、前記撮像検知器に入射する
   軸外し反射位相顕微鏡システム。
2. 前記光源からの光は、反射器へ前記材料を透過する又は前記材料の表面で反射される、請求項１に記載の軸外し反射位相顕微鏡システム。
3. 前記並進ステージは、アクチュエータと、前記並進ステージ上の第１の鏡と、前記アクチュエータ上の第２の鏡とをさらに備える、請求項１又は２に記載の軸外し反射位相顕微鏡システム。
4. 低いコヒーレンスの前記光源は、レーザを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の軸外し反射位相顕微鏡システム。
5. 前記光源は、広帯域光源を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の軸外し反射位相顕微鏡システム。
6. 参照光路は、前記材料から前記撮像検知器の表面に入射する光に対して特定の角度で前記撮像検知器の前記表面に入射する、請求項１から５のいずれか一項に記載の軸外し反射位相顕微鏡システム。
7. 前記光学系は、回折格子から受けた光の１つの次数を透過する空間フィルタを有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の軸外し反射位相顕微鏡システム。
8. 前記参照光路は、反射する前記光の回折次数を分離し、シングルライトパルスに応じた前記材料の全視野画像の各点は、参照ビームにわたって等しいパスの長さを有する、請求項６に記載の軸外し反射位相顕微鏡システム。
9. 前記撮像検知器に接続されたデータプロセッサと画像データを格納するためのメモリとをさらに備える、請求項１から８のいずれか一項に記載の軸外し反射位相顕微鏡システム。
10. 前記材料の定量位相画像を表示するディスプレイをさらに備える、請求項９に記載の軸外し反射位相顕微鏡システム。
11. 前記材料をある角度で傾けるために、前記光源と撮像対象の前記材料とを相対運動させるアクチュエータをさらに備える、請求項１から１０のいずれか一項に記載の軸外し反射位相顕微鏡システム。
12. 前記並進ステージは、入射光軸に対して斜めの角度に前記材料を配向する、請求項１１に記載の軸外し反射位相顕微鏡システム。
13. 前記材料は光を反射する、及び／又は前記材料は反射面に位置している、請求項１、３から１２のいずれか一項に記載の軸外し反射位相顕微鏡システム。
14. 前記参照光路は、反射器を有する、請求項６に記載の軸外し反射位相顕微鏡システム。
15. ビームスプリッタは、前記参照光路と前記第１の光路とに対する光を分離させる、請求項１に記載の軸外し反射位相顕微鏡システム。
16. 前記コヒーレンスゲートは、前記材料の透過画像を提供すべく又は前記材料の反射画像を提供すべく、前記材料に対して配置される、請求項１に記載の軸外し反射位相顕微鏡システム。
17. 軸外し位相顕微鏡のための方法であって、
    コヒーレンスの低い光源に光学的に連結された第１の光路沿いに配置された計測対象の材料に対して、前記光源から光を提供する段階と、
    前記材料の表面領域に対してコヒーレンスゲートを配置させるように、撮像レンズと前記材料との相対位置を調節する段階と、
    前記光源に光学的に連結された反射する参照に対して、レンズを通して光を提供する段階と、
    前記反射する参照から受けた光の回折次数を分離する段階と、
    撮像検知器で光を検知する段階と
    を備え、
    検知された前記光は、第１軸沿いに方向づけられた前記材料の前記表面領域からの反射された光と、前記撮像検知器において干渉パターンを形成して前記表面領域の画像を取得するべく、前記第１軸に対して異なる角度で配向された第２軸沿いに方向づけられた前記分離された回折次数の光とを含み、
    前記方法は、前記コヒーレンスゲートを前記材料の更なるサンプル領域へ移動させ、前記材料の前記更なるサンプル領域の画像を取得すべく、前記提供する段階、前記分離する段階、および前記検知する段階を繰り返す段階を備える
    軸外し位相顕微鏡のための方法。
18. 前記光源からの光を前記材料に透過させる段階、又は前記光源からの光を、前記材料の表面で反射させる段階をさらに備える、請求項１７に記載の方法。
19. 並進ステージを利用して前記材料に対して前記コヒーレンスゲートを配置させる段階をさらに備える、請求項１７又は１８に記載の方法。
20. 前記コヒーレンスの低い光源は、レーザを含む、又は前記光源は広帯域光源を含む、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 参照光路は、前記材料から前記撮像検知器の表面に入射する光に対して特定の角度で前記撮像検知器の前記表面に入射する、請求項１７から２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 空間フィルタを利用して、回折格子から受けた光の１つの次数を透過する段階をさらに備える、請求項１７から２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記撮像検知器から画像データを受け取るデータプロセッサで画像データを処理する段階、ディスプレイに画像データを表示する段階、及び画像データをメモリに格納する段階をさらに備える、請求項１７から２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 画像データをヒルベルト変換して位相画像を提供する段階をさらに備える、請求項１７から２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記材料を、入射光軸に対して特定の角度で配向する段階をさらに備える、請求項１７から２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 移動する細胞構造または膜のような生体サンプルを、撮像する段階をさらに備える、請求項１７から２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記軸外し反射位相顕微鏡システムは、入射光に対して特定の角度で傾けることのできる反射器の上に、前記材料が配置されるように、又は前記光源からの光が前記材料を透過して、材料支持表面で反射され、前記材料を通って撮像されるように、軸外し干渉を実行する、請求項１から１６のいずれか一項に記載の軸外し反射位相顕微鏡システム。
28. 前記光学系は、前記材料が反射した光に干渉させるために光の第１の回折次数を利用する、請求項１から１６，２７のいずれか一項に記載の軸外し反射位相顕微鏡システム。
29. 前記光学系は、フーリエ画像のコンポーネントの第１の回折次数を選択して、フーリエ平面で前記コンポーネントをずらす、及び前記軸外し反射位相顕微鏡システムは、画像の逆フーリエ変換を得る、請求項１から１６、２７、２８のいずれか一項に記載の軸外し反射位相顕微鏡システム。
30. 画像の位相をアンラッピングするデータプロセッサをさらに備える、及び／又は前記画像は、全視野定量位相画像を含む、請求項１から１６、２７から２９のいずれか一項に記載の軸外し反射位相顕微鏡システム。
31. 前記並進ステージに搭載された第１の鏡と、画像からノイズを取り除くように前記アクチュエータに連結された第２の鏡とをさらに備える、請求項１１に記載の軸外し反射位相顕微鏡システム。
32. 画像から共通モード位相ノイズを除去する、及び／又は前記軸外し反射位相顕微鏡システムは、前記材料の電力スペクトル密度を決定する、請求項１から１６、２７から３１のいずれか一項に記載の軸外し反射位相顕微鏡システム。

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