EP1412500A2 - Acides nucleiques codant pour un polypeptide isum2a et utilisation de ces acides nucleiques pour l'obtention de plantes transformees produisant des graines affectees dans le developpement du germe - Google Patents
Acides nucleiques codant pour un polypeptide isum2a et utilisation de ces acides nucleiques pour l'obtention de plantes transformees produisant des graines affectees dans le developpement du germeInfo
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- EP1412500A2 EP1412500A2 EP02760388A EP02760388A EP1412500A2 EP 1412500 A2 EP1412500 A2 EP 1412500A2 EP 02760388 A EP02760388 A EP 02760388A EP 02760388 A EP02760388 A EP 02760388A EP 1412500 A2 EP1412500 A2 EP 1412500A2
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- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
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Definitions
- the present invention relates to the field of improving the agronomic characteristics of plants, with a view to obtaining plant transformation products with improved characteristics for industry, especially for the food industry, for example for the production of starch, vegetable oil or semolina.
- the seed embryo is the seed compartment from which vegetable oil is extracted. It would be advantageous for the industry to obtain plants whose seeds have an overdeveloped embryo rich in oil.
- Starch production for multiple industrial applications today reaches around 1 billion tonnes annually worldwide.
- Starch represents a raw material which is used in industries as diverse as food, pharmacy, paper industries but also in the microbiological field where it can be used as a nutritive substrate.
- starch is obtained from seeds, from cereal crops grown in fields such as wheat, corn and sorghum.
- the seeds are essentially made up of a germ associated with albumen.
- the starch is entirely contained in the endosperm, while the germ is rich in oil.
- the starch preparation processes used in the starch industry necessarily include a step of separation of the germ, rich in oil, from the albumen which contains in abundance the starch constituting the
- the milling process allows the different constituents of the grain to be finely separated in order to meet user requirements. It includes in particular a drying step which must be as gentle as possible to avoid a migration of lipids from the germ to the almond, which is detrimental to the subsequent quality of the semolina, and a degerming step, carried out by fragmentation, which has intended to gently separate the germs to prevent the lipids they contain from being found in the semolina.
- the use in semolina industry of grains with development of germ affected according to the invention therefore has a certain advantage since it facilitates the industrial process (gain in time and in yield) by eliminating this 'contamination' of the kernel by the germ lipids; moreover, it ensures good quality and good shelf life of the products, this being a function of the residual fat content ( ⁇ 0.8% is a standard in the profession for so-called noble products: hominies, gritz, semolina and flours for human food).
- the semolina produced is then used almost exclusively in human food (beers, breakfast cereals, aperitif cookies, polenta, tortilla, corn chips, edible flour ).
- the grains according to the invention can be used for the manufacture of breakfast cereals or 'corn flakes 1 , which constitute a market which has known for 15 years an annual average increase of the order of 20%.
- Two processes are conventionally used: a conventional rolling process from hominys (the largest semolina perfectly degermed and calibrated) or a cooking-extrusion process from semolina of specific particle size.
- hominys the largest semolina perfectly degermed and calibrated
- a cooking-extrusion process from semolina of specific particle size.
- seeds with large embryos, which are sought after in the oil industry can be obtained.
- Corn oil is generally intended for human consumption; it is sometimes used by the pharmaceutical and cosmetic industry.
- the cakes are themselves valued in animal feed either directly, or even remixed with 'corn-gluten feed'.
- mutant plants carrying mutations affecting both the embryo and the seed albumen are known in the state of the art. These mutant plants are conventionally designated as “dek” mutants (for “detective kernel”). On the other hand, there are very few corn mutants affected by a defect in the development of the seed embryo and leaving the albumen intact.
- a first group of mutants includes mutants producing proembryonic structures resembling those produced in wild plants, but the proembryos do not reach later stages of development.
- the mutants emb * -8522 and emb * -8535 are affected by a complete deficit in apical-basal differentiation, while in the mutant emb * -8516 the authors observed structures resembling l embryo that came from the suspensor.
- a co-segregation analysis of the emb * -8516 and emb * -8522 mutations enabled Heckel et al. to determine that the mutant phenotype co-segregated with the presence of a transposon.
- the molecular characterization of the different mutations has not been described.
- the mutation affecting the mutant plant emb * -8516 could not be located on any of the corn chromosomes.
- nucleic acid sequences and polypeptides are provided, the expression of which is essential for the development of the embryo in a plant seed, and of which a deficit in expression leads to the production of affected seeds. in the development of the germ.
- the subject of the invention is a nucleic acid comprising a polynucleotide coding for an ISU 2A polypeptide chosen from sequences having at least 95% amino acid identity with the sequences SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 6, or for a fragment of an ISUM2A polypeptide, as well as a nucleic acid of complementary sequence.
- the nucleic acid coding for the ISUM2A polypeptide, or for a fragment of this polypeptide also comprises a regulatory polynucleotide capable of regulating the synthesis of the ISUM2A polypeptide, the regulatory polynucleotide preferably being sensitive to the action of an inducing signal.
- the regulatory polynucleotide can be either a transcription or translation repressing polynucleotide or, on the contrary, a transcription or translation activating polynucleotide.
- the invention also relates to methods for obtaining a transformed plant capable of producing seeds with development of an affected germ, as well as the parts of such a plant, in particular its seeds.
- the invention also relates to a transformation product of a seed with development of the affected germ produced by said transformed plant, preferably a starch.
- a transformation product of a seed with development of the affected germ produced by said transformed plant preferably a starch.
- Another subject of the invention is the ISUM2A polypeptide, or a fragment of this polypeptide, encoded by a nucleic acid as defined above, as well as antibodies directed against the ISUM2A polypeptide.
- the invention also relates to methods for detecting the presence of the ISU 2A polypeptide in a sample and to methods for detecting the presence of a nucleic acid encoding this polypeptide in a sample.
- a population of 25,000 highly mutagenized plants has been generated by the random insertion, into their genome, of the transposon m ⁇ tator described by Bennetzen, JLPS Springer, AD Cresse, and M. Hendrickx (1993), Chandler, VL and KJ Hardeman (1992).
- the plants were cultured before analysis of their DNA.
- G2422 it has been shown that the insertion of the mutator transposon was localized in the first intron of a particular gene, this gene having been designated isum2A, at a distance of 3 bp from the second exon of this gene.
- the inventors observed a co-segregation between the presence of a “seed without germ” phenotype and the insertion of the mutator transposon in the same isum2A gene.
- the is ⁇ m2A gene includes three exons and two introns.
- the open reading frame begins in the first exon and ends in the third exon of this gene.
- a partial transcript of the isum2A gene was also isolated and characterized, and the structure of a large portion of the ISUM2A protein was deduced from the cDNA corresponding to the gene transcript.
- isum2A gene is expressed in the embryo and the endosperm 12 days after pollination, as well as in the leaf and the root.
- ISUM2A produced seeds essentially consisting of albumen, and having an affected germ development.
- the germ is also called an embryo.
- the applicant has also shown that the seeds which represent a quarter of the seeds produced by heterozygous plants and of which the two copies of the isum2A gene include a mutation do not allow the obtaining of a viable and fertile plant.
- the invention also provides the means for obtaining plants producing seeds affected in the development of the germ, in which the germ is enriched in oil due to early expression or overexpression of the polypeptide.
- the invention relates to nucleotide sequences involved in the development of the embryo and their use in molecular constructions intended to improve the agronomic, food, or industrial quality of a plant, in particular modulating the size of the embryo and / or its size. development.
- an early and specific action on the development of the tissues of the embryo and the endosperm can be sought: 1) According to a first embodiment, it will be possible to obtain seeds or fruits enriched in oil (large embryo), via the use of promoters directing the expression of the nucleic acids according to the invention early in the development of the seed and more particularly in the germ, or in a constitutive manner. 2) According to another embodiment, albumens with development of affected germ could also be obtained according to this model, for industrial applications in starch manufacture and semolina. The invention therefore also relates to methods for modifying the agronomic and / or nutritional qualities of a plant, by a targeted and early action on the development of the embryo, using the transformation of plants with a vector according to the invention.
- she is interested in modifying the size and / or development of the embryo. It also aims at altering the development of the embryo, with a view to producing grains without embryos for cereals in particular, which are of interest for the starch and semolina industries.
- the subject of the invention is also the use of an expression cassette as defined above, for obtaining a transgenic Angiosperm plant having improved agronomic or nutritional qualities.
- the transgenic plant obtained can produce seeds with modified oil contents or with development of an affected germ in comparison with an unprocessed plant.
- the invention also relates to the use of the transgenic plants obtained according to the invention, or parts of these plants, in particular seeds, grains and fruits for the preparation of derived products, in particular food products.
- Also part of the invention are the products obtained, whether seeds, seed flour or grains enriched in oil or seeds with development of affected germ, suitable for the semolina industry.
- the invention also relates to any composition for human or animal food prepared from said products obtained.
- the invention relates to the use of the allelic sequences and variants defined according to the invention in selection programs aimed at producing plants with an embryo modified in size and / or development influencing the starch content / oil.
- selection programs aimed at producing plants with an embryo modified in size and / or development influencing the starch content / oil.
- These sequences can in particular be used in QTL mapping and co-localization experiments for the oil content or the size of the embryo to define the most interesting allelic variants for a selection approach, comprising:
- nucleotide sequence of the isum2A gene comprises, from the 5 ′ end to the 3 ′ end, (i) an upstream non-coding sequence potentially carrying regulatory elements for the transcription and / or translation of the gene, (ii) a coding sequence comprising the three exons and the two introns of the gene and (iii) a non-coding sequence located downstream of the last exon of the gene.
- sequence of the isum2A gene according to the invention is referenced as the sequence SEQ ID No. 1 of the sequence listing.
- An analysis of a population of plants having the wild phenotype and producing seeds containing a normal embryo made it possible to identify at least two variants of the isum2A gene.
- One of the gene variants is characterized by the substitution of the nucleotide G located at position 2234 of the sequence SEQ ID No. 1 by a nucleotide C. This substitution of nucleotide leads to the substitution of the amino acid G (glycine) at position 89 of the sequence of the ISUM2A SEQ ID No. 5 polypeptide by an amino acid R (Asparagine) which is present in the sequence of the ISUM2A polypeptide variant SEQ ID No. 6.
- a first object of the invention consists of a nucleic acid comprising a polynucleotide encoding a polypeptide
- ISUM2A chosen from sequences having at least 95% amino acid identity with the sequences SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 6, or for a fragment of an ISUM2A polypeptide.
- the invention also relates to a nucleic acid of sequence complementary to the nucleic acid as defined above.
- any conventional technique of molecular biology, microbiology and recombinant DNA known to those skilled in the art can be used. Such techniques are described for example by SAMBROOK et al. (1989), GLOVER (1985), GAIT (1984),
- any nucleic acid and any polypeptide according to the invention is in an isolated or purified form.
- isolated in the sense of the present invention designates a biological material which has been removed from its original environment (the environment in which it is naturally located).
- a polynucleotide found naturally in a plant is not isolated.
- the same polynucleotide separated from the adjacent nucleic acids in which it is naturally inserted into the genome of the plant is isolated.
- Such a polynucleotide may be included in a vector and / or such a polynucleotide may be included in a composition and nevertheless remain in an isolated state since the vector or the composition does not constitute its natural environment.
- purified does not require that the material be present in a form of absolute purity, exclusive of the presence of other compounds. Rather, it is a relative definition.
- a polynucleotide or a polypeptide is in the purified state after purification of the starting material or of the natural material of at least one order of magnitude, preferably 2 or 3 and preferably four or five orders of magnitude.
- nucleotide sequence can be used to denote either a polynucleotide or a nucleic acid.
- nucleotide sequence encompasses the genetic material itself and is therefore not limited to information regarding its sequence.
- nucleic acid include RNA, DNA, cDNA sequences or even RNA / DNA hybrid sequences of more than one nucleotide, in single strand form or in duplex form.
- nucleotide designates both natural nucleotides (A, T, G, C) as well as modified nucleotides which comprise at least one modification such as (i) an analog of a purine, (ii) an analog of d 'a pyrimidine, or (iii) a similar sugar, such modified nucleotides being described for example in PCT application No. WO 95/04064.
- a first polynucleotide is considered to be "complementary" to a second polynucleotide when each base of the first nucleotide is paired with the complementary base of the second polynucleotide whose orientation is reversed.
- the complementary bases are A and T (or A and U), and C and G.
- a first nucleic acid having at least 95% identity with a second reference nucleic acid will have at least 95%, preferably at least 96%, 97%, 98%, 98.5%, 99 %, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% or 99.9% identity nucleotides with this second reference polynucleotide, the percentage of identity between two sequences being determined as described below.
- the "percentage of identity" between two nucleotide or amino acid sequences can be determined by comparing two optimally aligned sequences, through a comparison window.
- the part of the nucleotide or polypeptide sequence in the comparison window can thus include additions or deletions (for example "gaps") with respect to the reference sequence (which does not include these additions or these deletions) so as to obtain an optimal alignment of the two sequences.
- the percentage is calculated by determining the number of positions at which an identical nucleic base or amino acid residue is observed for the two sequences (nucleic or peptide) compared, then by dividing the number of positions at which there is identity between the two bases or amino acid residues compared, by the total number of positions in the comparison window, then multiplying the result by one hundred to obtain the percentage of sequence identity.
- the optimal alignment of the sequences for the comparison can be carried out by computer using known algorithms.
- the percentage of sequence identity is determined using the BLAST software (BLAST version 2.06 of September 1998), using exclusively the default parameters.
- a nucleic acid having at least 95% nucleotide identity with a nucleic acid according to the invention includes the "variants" of a nucleic acid according to the invention.
- variant of a nucleic acid according to the invention is meant a nucleic acid which differs from the reference nucleic acid by one or more substitutions, additions or deletions of a nucleotide, relative to the nucleic acid of reference.
- a variant of a nucleic acid according to the invention can be of natural origin, such as an allelic variant which exists naturally. Such a variant nucleic acid can also be an unnatural nucleic acid obtained, for example, by mutagenesis techniques.
- the differences between the reference nucleic acid and the "variant" nucleic acid are reduced so that the reference nucleic acid and the variant nucleic acid have very similar nucleotide sequences and, in many regions , identical.
- the nucleotide modifications present in a variant nucleic acid can be silent, which means that they do not affect the amino acid sequence which can be encoded by this variant nucleic acid.
- Changes in nucleotides in the variant nucleic acid can also result in substitutions, additions or deletions of one or more amino acids in the sequence of the polypeptide which can be encoded by this variant nucleic acid.
- a variant nucleic acid according to the invention comprising an open reading phase, code for a polypeptide which retains the same function or the same biological activity as the polypeptide coded by the reference nucleic acid.
- a variant nucleic acid according to the invention and which comprises an open reading phase codes for a polypeptide which retains the capacity to be recognized by antibodies directed against the polypeptide encoded by the nucleic acid of reference.
- nucleic acids of genes orthologous to ISUM2 included in the genome of plants other than maize, and having a nucleotide identity of at least 95% with a nucleic acid are part of the “variants” of a nucleic acid encoding the ISUM2A polypeptide. encoding the ISUM2A polypeptide.
- fragment of a nucleic acid according to the invention is meant a nucleotide sequence of a reduced length compared to the reference nucleic acid, the nucleic acid fragment having a nucleotide sequence identical to the nucleotide sequence of the reference nucleic acid on the common part.
- fragments of a nucleic acid according to the invention have at least 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300 , 400, 500, 1000, 2000 or 3000 consecutive nucleotides of the reference nucleic acid, the maximum length in nucleotides of a fragment of a nucleic acid according to the invention is of course limited by the maximum length in nucleotides of l reference nucleic acid.
- fragment of an ISU 2A polypeptide according to the invention means a polypeptide fragment of reduced length compared to the reference polypeptide, the polypeptide fragment having an amino acid sequence identical to the amino acid sequence of the polypeptide of reference on the common part.
- fragments of an ISUM2A polypeptide according to the invention have at least 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 130, 135 or 140 amino acids of a reference ISUM2A polypeptide.
- allelic variants of the genomic nucleic acid of the isum2A gene have been characterized according to the invention, the two variant genomic nucleic acids being respectively referenced as the nucleotide sequences SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2 of the sequence listing.
- the subject of the present invention is a nucleic acid coding for an ISUM2A polypeptide, or for a fragment of this polypeptide, said nucleic acid comprising a polynucleotide having at least 95% nucleotide identity with a nucleotide sequence chosen from SEQ ID N ° 1 and SEQ ID N ° 2, or with a fragment of one of the sequences SEQ ID N ° 1 and SEQ ID N ° 2.
- nucleic acid of sequence complementary to the nucleic acid as defined above.
- nucleic acid consisting of a polynucleotide having at least 95% nucleotide identity with a sequence chosen from the sequences SEQ ID No 1 and SEQ ID No 2, or with a fragment of one of the sequences SEQ ID No 1 or SEQ ID No 2, or a nucleic acid of complementary sequence.
- the invention also relates to a nucleic acid comprising at least 12, preferably at least 15 and very preferably at least 20 consecutive nucleotides of the nucleic acid of sequence SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2 , it being understood that such a nucleic acid includes in its definition the "fragments" of a nucleic acid according to the invention as defined in the present description.
- the isum2A gene defined by the sequence SEQ ID No. 1 comprises, from the 5 ′ end to the 3 ′ end, respectively: a) a non-coding sequence potentially carrying regulatory elements for transcription and / or translation of this gene, located upstream of the first exon, from the nucleotide in position 1 to the nucleotide in position 1812 of the sequence SEQ ID No.
- coding region which comprises the three exons and the two introns of the isum2A gene, this coding region being located from the nucleotide at position 1813 to the nucleotide at position 4074 of the sequence SEQ ID No. 1; and c) a non-coding region located downstream of the coding region, from the nucleotide at position 4075 to the nucleotide at position 5620 of the sequence SEQ ID No. 1.
- sequence SEQ ID No. 2 which illustrates a variant of the isum2A gene, does not contain the entire open reading frame coding for an ISU 2A polypeptide.
- the sequence SEQ ID N ° 2 includes a part located on the 3 ′ side of exon n ° 1, as well as all of exons n ° 2 and n ° 3.
- the nucleotide at position 1 of the sequence SEQ ID No. 2 corresponds to the nucleotide at position 2063 of the sequence SEQ ID No. 1.
- the nucleotide at position 2004 of the sequence SEQ ID No. 2 corresponds to the nucleotide at position 4062 of the sequence SEQ ID No. 1.
- sequence SEQ iD No. 2 by those skilled in the art, and its comparison with the sequence SEQ ID No. 1, allows direct access to the entire coding sequence of the isum2A gene defined by the sequence SEQ ID N ° 2, for example by completing the missing bases of exon n ° 1 of the sequence SEQ ID N ° 2 by the corresponding bases of exon n ° 1 of the sequence SEQ ID N ° 1, based on the correspondences given above and also in table 1 below.
- nucleic acid of the isum2A gene for example by isolating, from the information of the sequence SEQ ID No. 1, the equivalent nucleotide regions or else by producing a hybrid nucleic acid, obtained by fusing the nucleic acids of sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 2, on the basis of the correspondences given above and also in table 1 below.
- Such a nucleic acid codes for at least part of the polypeptide encoded by the lsum2A gene and can in particular be inserted into a recombinant vector intended for the expression of the corresponding translation product in a host cell or in a plant transformed with this recombinant vector.
- Such a nucleic acid can also be used for the synthesis of nucleotide probes and primers intended for the detection or the amplification of nucleotide sequences included in the lsum2A gene in a sample, if necessary of gene sequences.
- lsum2A carrying one or more mutations, preferably one or more mutations likely to modify the phenotype of a plant carrying such a mutated lsum2A gene, by causing the production of affected seeds in the development of the germ.
- the invention also relates to a nucleic acid comprising at least 12 consecutive nucleotides of an intronic polynucleotide of the lsum2A gene, such as the polynucleotides 1 and 2 described in table 2 above, which are included in the nucleic acid of sequence SEQ ID N ° 1 and SEQ ID N ° 2.
- a nucleic acid can be used as an oligonucleotide probe or primer to detect the presence of at least one copy of the lsum2A gene in a sample, or even to amplify a determined target sequence within the lsum2A gene.
- Such a nucleic acid can also be used to amplify a specific target sequence within the isum2A gene or to inhibit it by a sense or co-suppression approach, or by the use of double-stranded RNA (Wassenegger et al. 1996; Kooter et al. 1999) for interference.
- Such a nucleic acid can also be used to search for functional allelic variants of the ISUM2 gene, which can be used in a method for selecting plants with an embryo modified in size and / or development.
- the genomic region of the lsum2A gene essentially restricted to the so-called "coding" region comprising the 3 exons and the 2 introns is defined as the sequence starting at the nucleotide at position 1813 and ending at the nucleotide at position 4074 of the sequence SEQ ID No. 1 .
- Part of exon n ° 1, all exons n ° 2 and 3 as well as the two introns of a .variant of the isum2A gene are included in the sequence going from the nucleotide in position 1 to the nucleotide in position 2004 of the sequence SEQ ID N ° 2. It is specified that, on their common region, the sequences
- SEQ ID N ° 1 and SEQ ID N ° 2 have a percentage of nucleotide identity greater than 95%, this percentage being in fact greater than 99%.
- the subject of the invention is also a nucleic acid comprising a polynucleotide having at least 95% nucleotide identity with the nucleotide sequence starting at the nucleotide in position 1813 and ending at the nucleotide in position 4074 of the sequence SEQ ID N ° 1 as well than a nucleic acid of complementary sequence.
- the invention also relates to a nucleic acid having at least 95% nucleotide identity with the nucleotide sequence starting at the nucleotide at position 1813 and ending at the nucleotide at position 4074 of the sequence SEQ ID No. 1, as well as an acid nucleic acid of complementary sequence.
- the subject of the invention is also a nucleic acid comprising the nucleotide sequence starting at the nucleotide at position 1813 and ending at the nucleotide at position 4074 of the sequence SEQ ID No. 1 or a nucleic acid with complementary sequence.
- the invention also relates to a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence starting at the nucleotide at position 1813 and ending at the nucleotide at position 4074 of the sequence SEQ ID No. 1 or a nucleic acid of complementary sequence.
- Another object of the invention consists of a nucleic acid characterized in that it comprises one of the following nucleotide sequences: a) the sequence going from the nucleotide in position 1 to the nucleotide in position 1812 of the sequence SEQ ID N ° 1, or a nucleic acid of complementary sequence; b) the sequence extending from the nucleotide at position 1813 to the nucleotide at position 2099 of the sequence SEQ ID No. 1, or a nucleic acid of complementary sequence; c) the sequence going from the nucleotide at position 2100 to the nucleotide at position 2206 of the sequence SEQ ID No.
- nucleic acid of complementary sequence 1, or a nucleic acid of complementary sequence; d) the sequence going from the nucleotide in position 2207 to the nucleotide in position 2323 of the sequence SEQ ID No. 1, or a nucleic acid of complementary sequence; e) the sequence going from the nucleotide at position 2324 to the nucleotide at position 3645 of the sequence SEQ ID No. 1, or a nucleic acid of complementary sequence; f) the sequence going from the nucleotide at position 3646 to the nucleotide at position 4074 of the sequence SEQ ID No. 1, or a nucleic acid of complementary sequence; and g) the sequence going from the nucleotide at position 4075 to the nucleotide at position 5620 of the sequence SEQ ID No. 1 or a nucleic acid of complementary sequence.
- nucleic acid of sequence SEQ ID No. 1 is shown in FIG. 1, in which the positions of the various exons and introns of the lsum2A gene are also detailed.
- the lsum2A gene is transcribed in the form of a messenger RNA.
- This messenger RNA includes an open reading frame coding for the protein ISUM2A
- the part of the cDNA of the lsum2A gene comprising the open reading frame coding for the polypeptide ISUM2A of sequence SEQ ID No. 5 has a length of 833 nucleotides and is referenced like the sequence SEQ ID N ° 3 of the sequence listing.
- the cDNA of sequence SEQ ID No. 3 is derived from the wild plant variant designated HD5xHD7. This cDNA is shown in Figure 2.
- the part of the cDNA of the lsum2A gene comprising a part of the open reading frame coding for the ISUM2A polypeptide of sequence SEQ ID No. 6 has a length of 621 nucleotides and is referenced as the sequence SEQ ID No. 4 of the sequence listing .
- Sequence cDNA SEQ ID No. 4 is derived from the wild plant variant designated A188. This partial cDNA is shown in Figure 3.
- nucleic acids of sequences SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 4 show similarities to an EST sequence referenced in the GENBANK database under the access number AI001298 and designated “ISUM2”. This is the reason why the designation “isum2A” has been attributed to the newly discovered gene according to the invention.
- sequence of EST N ° AI001298 has a degree of nucleotide identity of 94% and 95% with the sequences SEQ ID N ° 3 and SEQ ID N ° 4, respectively. No open reading frame is described for this EST.
- sequences SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 4 also exhibit similarities with an EST sequence referenced in the GENBANK database under the access number AI374506. This sequence was obtained from the same clone “EST6-D3” as the sequence AI 001298.
- sequence of EST n ° AI374506 has a degree of nucleotide identity of 92% and 98% with the sequences SEQ ID N ° 3 and SEQ ID N ° 4, respectively. No open reading frame is described for this EST.
- Another subject of the invention consists of a nucleic acid comprising a polynucleotide coding for an ISUM2A polypeptide and having at least 99% nucleotide identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 3 or SEQ ID No. 4, or with a fragment of this nucleotide sequence as well as a nucleic acid of sequence complementary to these nucleic acids.
- the invention also relates to a nucleic acid coding for an ISUM2A polypeptide and having at least 99% nucleotide identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 3 or SEQ ID No. 4 or a fragment of this nucleotide sequence as well as 'a nucleic acid of sequence complementary to these nucleic acids.
- the subject of the invention is also a nucleic acid characterized in that it comprises the nucleotide sequence SEQ ID No. 3 or SEQ ID No. 4 or a nucleic acid of complementary sequence. Also part of the invention is a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence SEQ ID No. 3 or SEQ ID No. 4, or a nucleic acid of complementary sequence.
- the lsum2A gene codes for a polypeptide of 143 amino acids in length, of which two allelic variants have been identified according to the invention, the variant polypeptides of sequence SEQ respectively.
- the invention also relates to a nucleic acid coding for a polypeptide having at least 95% identity in amino acids with the sequence SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. 6.
- the invention also relates to a nucleic acid characterized in that it codes for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. 6. Also part of the invention is a nucleic acid encoding a "fragment" of a polypeptide having at least 95% nucleotide identity with a polypeptide of amino acid sequence SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. 6.
- the invention also relates to a nucleic acid coding for a fragment of a polypeptide with an amino acid sequence SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. 6.
- a polypeptide having at least 95% amino acid identity with a reference polypeptide comprises at least 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99, 4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% or 99.9% of amino acid identity with the reference polypeptide.
- variant polypeptides are included in the definition of a polypeptide having at least 95% amino acid identity with a reference polypeptide according to the invention, the so-called "variant” polypeptides.
- the term “variant” of a polypeptide according to the invention means a polypeptide whose amino acid sequence comprises one or more substitutions, additions or deletions of at least one amino acid residue, relative to the sequence of amino acids of the reference polypeptide, it being understood that the amino acid substitutions can be of a conservative or non-conservative nature.
- a variant of a reference polypeptide according to the invention consists of a polypeptide which retains the biological function or activity of the reference polypeptide and / or which is recognized by antibodies directed against the reference polypeptide. These polypeptide variants can result from allelic variations characterized by differences in the nucleotide sequences of the gene coding for these polypeptides. Such polypeptide variants can also result from alternative splicing or from post-translational modifications.
- fragment of a reference polypeptide according to the invention is meant a polypeptide having at least 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 135 or 140 consecutive amino acids of a polypeptide as defined in the present description.
- nucleic acids according to the invention and in particular the nucleotide sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 4, their fragments of at least 12 nucleotides, the sequences having at least 95% identity in nucleotides with at least part of the sequences SEQ ID N ° 1 to SEQ ID N ° 4, as well as the nucleic acids of complementary sequence, are useful for detecting the presence of at least one copy of a nucleotide sequence of the lsum2A gene or else d 'a fragment or an allelic variant of the latter in a sample.
- nucleotide probes and primers which hybridize, under high stringency hybridization conditions, with a nucleic acid chosen from the sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 4.
- hybridization conditions below are implemented for the hybridization of a nucleic acid, probe or primer, 20 bases in length.
- the level and specificity of hybridization depends on various parameters, such as: a) the purity of the preparation of the nucleic acid on which the probe or the primer is to hybridize; b) the base composition of the probe or the primer, the GC base pairs having greater thermal stability than the A-T or AU base pairs; c) the length of the sequence of homologous bases between the probe or the primer and the nucleic acid; d) ionic strength: the rate of hybridization increases with increasing ionic strength and the duration of the incubation time; e) the incubation temperature; f) the concentration of the nucleic acid on which the probe or the primer is to hybridize; g) the presence of denaturing agents such as agents promoting the breaking of hydrogen bonds, such as formamide or urea, which increase the stringency of the hybridization; h) the incubation time, the rate of hybridization increasing with the duration of the incubation; i) the presence of bulk exclusion agents, such as dextran or dextran sulfate, which
- the parameters defining the stringency conditions depend on the temperature at which 50% of the paired strands separate (Tm).
- Tm is defined by the relation:
- Tm 81.5 + 0.41 (% G + C) +16.6 Log (cation concentration) - 0.63 (% formamide) - (600 / number of bases) (SAMBROOK et al., (1989) , pages 9.54-9.62).
- the hybridization temperature is approximately 5 to 30 ° C, preferably 5 to 10 ° C below Tm.
- high stringency hybridization conditions hybridization conditions such that one places oneself at a hybridization temperature of 5 ° C. below the Tm.
- hybridization conditions described above can be adapted as a function of the length and of the base composition of the nucleic acid whose hybridization is sought or of the type of labeling chosen, according to techniques known to those skilled in the art. job.
- hybridization conditions used for a nucleic acid 200 bases in length are as follows: Prehybridization: same conditions as for hybridization duration: 1 night.
- the nucleotide probes or primers according to the invention comprise at least 12 consecutive nucleotides of a nucleic acid according to the invention, in particular of a nucleic acid of sequences SEQ ID N ° 1 to 4 or of its complementary sequence, a nucleic acid having 95% nucleotide identity with a sequence chosen from sequences SEQ ID No. 1 to 4 or. of its complementary sequence or also of a nucleic acid hybridizing under hybridization conditions of high stringency with a sequence chosen from sequences SEQ ID No. 1 to 4 or of its complementary sequence.
- nucleotide probes or primers according to the invention will have a length of at least 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 100, 150, 200, 300, 400, 500 , 1000, 2000 or 3000 consecutive nucleotides of a nucleic acid according to the invention.
- a probe or a nucleotide primer according to the invention will consist and / or include fragments with a length of 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 or 3000 consecutive nucleotides of a nucleic acid according to the invention.
- primers and of pairs of primers making it possible to amplify a nucleic acid fragment of the lsum2A gene of sequence SEQ ID No 1 or SEQ ID No 2 are for example primers SEQ ID No 10 to 13 and 17 to 23.
- a primer or a nucleotide probe according to the invention can be prepared by any suitable method well known to those skilled in the art, including by cloning and action of restriction enzymes or also by direct chemical synthesis according to techniques such as the method to the phosphodiester of NARANG et al. (1979) or BROWN et al. (1979), the diethylphosphoramidite method of BEAUCAGE et al. (1980) or the solid support technique described in European patent No. EP 0 707 592.
- Each of the nucleic acids according to the invention can be labeled, if desired, by incorporating a detectable molecule, that is to say a detectable marker, by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or even chemical means.
- markers can consist of radioactive isotopes ( 32 P 3 H, 35 S), fluorescent molecules (5-bromodeoxyuridine, fluorescein, acetylaminofluorene) or also ligands such as biotin.
- the labeling of the probes is preferably done by incorporating labeled molecules within the polynucleotides by extension of primers, or else by adding to the 5 ′ or 3 ′ ends.
- oligonucleotide probes according to the invention can be used in particular in Southern type hybridizations to the genomic DNA of the lsum2A gene or else in hybridizations to messenger RNA of this gene when the expression of the corresponding transcript is sought in a sample.
- the probes according to the invention can also be used for the detection of PCR amplification products or even for the detection of mismatches.
- Nucleotide probes or primers according to the invention can be immobilized on a solid support.
- Such solid supports are well known to those skilled in the art and comprise surfaces of the wells of microtitration plates, polystyrene beads, magnetic beads, nitrocellulose strips or even microparticles such as latex particles.
- the subject of the invention is also a nucleic acid which can be used as a nucleotide probe or primer, characterized in that it comprises at least 12 consecutive nucleotides of a nucleic acid as defined above, in particular of a nucleic acid with nucleotide sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 4.
- the invention also relates to a nucleic acid which can be used as a nucleotide probe or primer, characterized in that it consists of a polynucleotide of at least 12 consecutive nucleotides of a nucleic acid according to the invention, quite favorite of a nucleic acid of sequences chosen from the nucleotide sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 4.
- nucleic acid can further be characterized in that it is labeled with a detectable molecule.
- a nucleic acid which can be used as a nucleotide probe or primer for the detection or amplification of a genomic sequence, of the mRNA or of the cDNA of the lsum2A gene can also be characterized in that it is chosen from following sequences: a) the nucleotide sequences hybridizing, under high stringency hybridization conditions, with a nucleic acid of sequence
- the present invention also relates to a method for detecting the presence of a nucleic acid of the lsum2A gene in a sample, said method comprising the steps of:
- the oligonucleotide probe (s) are immobilized on a support.
- the oligonucleotide probes include a detectable marker.
- the invention further relates to a kit or kit for detecting the presence of a nucleic acid according to the invention in a sample, said kit comprising: a) one or more nucleotide probes as described above; b) where appropriate, the reagents necessary for the hybridization reaction.
- the detection kit or kit is characterized in that the probe or probes are immobilized on a support.
- the detection kit or kit is characterized in that the oligonucleotide probes comprise a detectable marker.
- such a kit will comprise a plurality of oligonucleotide probes according to the invention which will be used to detect target sequences of interest of the lsum2A gene or alternatively to detect mutations in coding regions or non-coding regions of the lsum2A gene, more particularly nucleic acids of sequence SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 4 or nucleic acids of complementary sequence.
- target sequence within the meaning of the invention means a nucleotide sequence included in a nucleic acid, said nucleotide sequence hybridizing, under the hybridization conditions specified in the description, with a probe or a nucleotide primer of the invention .
- a target sequence can for example be a sequence included in a nucleic acid regulating the lsum2A gene or else a sequence included in a genomic coding region or of the cDNA of this gene.
- nucleotide primers according to the invention can be used to amplify any nucleotide fragment (gDNA,
- CDNA, mRNA of the lsum2A gene, and more particularly all or part of a nucleic acid of sequence SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 4, or else a fragment or a variant of these sequences.
- Another subject of the invention relates to a method for the amplification of a nucleic acid according to the invention, and more particularly of a nucleic acid of sequence SEQ ID No. 1 to SEQ
- said method comprising the steps of: a) contacting the sample in which the presence of the target nucleic acid is suspected with a pair of nucleotide primers whose hybridization position is localized respectively on the 5 ′ side and on the 3 ′ side of the target nucleic acid region of the gene lsum2A whose amplification is sought, in the presence of the reagents necessary for the amplification reaction; and b) detection of the optionally amplified nucleic acid.
- the subject of the invention is also a kit or kit for the amplification of a nucleic acid according to the invention, and more particularly all or part of a nucleic acid of sequences SEQ ID No. 1 to 4, said kit or kit comprising: a) a pair of nucleotide primers according to the invention, the hybridization position of which is located respectively on the 5 ′ and 3 ′ side of the target nucleic acid of the lsum2A gene, the amplification of which is sought ; b) where appropriate, the reagents necessary for the amplification reaction.
- primers according to the invention comprise all or part of a polynucleotide chosen from the nucleotide sequences SEQ ID Nos. 10 to 13 and 17 to 23.
- said cell carries at least one non-functional isum2A allele. Most preferably, said cell carries the two non-functional isum2A alleles.
- Nucleic acid constructs have been developed according to the invention making it possible to obtain a controlled expression of at least one functional copy of a nucleic acid coding for an ISUM2A polypeptide in a cellular host, particularly in a plant cell.
- the subject of the invention is also a nucleic acid comprising a polynucleotide coding for an ISUM2A polypeptide as defined in the present description, or for a fragment of this polypeptide, said nucleic acid further comprising a regulatory polynucleotide capable of regulating the transcription or translation of the polynucleotide encoding the ISUM2A polypeptide, or the fragment of this polypeptide.
- nucleic acid of sequence complementary to the nucleic acid as defined above.
- a nucleic acid construct comprising a polynucleotide coding for an ISUM2A polypeptide as well as a regulatory polynucleotide is also designated “expression cassette” in the present description.
- an expression cassette according to the invention will comprise at least one polynucleotide coding for an ISUM2A polypeptide, the other functional elements allowing the expression of the ISUM2A polypeptide can be carried by a vector in which the expression cassette can be inserted.
- An expression cassette according to the invention can also contain, in a nonlimiting manner, in addition to a regulatory polynucleotide, also other functional elements such as leader sequences or a terminator sequence or alternatively initiation and termination sequences of the transcription.
- the above regulatory nucleic acids can be used to overexpress the polynucleotide coding for the ISUM2A polypeptide or a fragment of the ISUM2A polypeptide, in particular when obtaining plants having seeds with large oil-rich embryos are sought.
- the invention also relates to a nucleic acid coding for an ISUM2A polypeptide or for a fragment of an ISUM2A polypeptide as defined above and comprising a regulatory polynucleotide regulating the transcription and / or translation of the coding sequence, in which the regulatory polynucleotide allows a high level of transcription of the corresponding mRNA and / or a high level of translation of the corresponding polypeptide in the host organism, including host cell or plant, in which it is expressed.
- the invention also relates to the use of a nucleic acid as defined above, of a recombinant vector comprising this nucleic acid or also of a host cell transfected or transformed with this nucleic acid for obtaining '' a transformed plant capable of producing oil-rich seeds.
- a controlled expression of the polynucleotide coding for the ISUM2A polypeptide is sought, especially when the production of seeds with development of affected germ is sought.
- a defect in the expression of the isum2A gene causes the production of seeds without germ, these seeds being not fertile and not allowing the multiplication of the plants mutated in the isum2A gene.
- isum2A gene appears to be necessary for normal plant growth before pollination.
- Pollination is the time when mature pollen comes into contact with a receptive silk.
- obtaining a production of seeds with development of a germ affected by a plant involves: a) normal expression of at least one functional copy of a nucleic acid coding for an ISUM2A polypeptide from the germination stage from seed to pollination of the plant; and b) an absence of the transcription or of the translation of this nucleic acid as soon as the plant is pollinated, in order to produce seeds affected in the development of the germ.
- nucleic acid constructs in which the polynucleotide coding for a polypeptide
- ISUM2A is placed under the control of a regulatory polynucleotide whose activity can be controlled over time.
- the invention therefore also relates to a nucleic acid comprising a polynucleotide coding for an ISUM2A polypeptide chosen from sequences having at least 95% amino acid identity with the sequences SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 6 and which also comprises a regulatory polynucleotide sensitive to the action, direct or indirect, of an inducing signal, also designated as an inducible regulatory polynucleotide.
- the regulatory polynucleotide is a “repressor” polynucleotide of transcription or translation.
- repressor regulatory polynucleotide is meant, according to the invention, a regulatory sequence whose constitutive activity can be blocked by an external signal.
- an external signal may be the absence of binding of a transcription factor recognized by the repressor regulatory polynucleotide. The absence of binding of the transcription factor can be induced under the effect of the repressor inducing signal to which the repressor regulatory polynucleotide is sensitive.
- the expression of the sequence coding for an ISUM2A polypeptide is constitutive in the selected cellular host, in the absence of the repressor inducing signal to which the repressor regulatory polynucleotide is directly or indirectly sensitive.
- the contact of the cellular host with the repressor inducing signal has the effect, thanks to a direct or indirect action on the repressor regulatory polynucleotide, to inhibit and / or block the expression of the polynucleotide coding for the polypeptide ISUM2A.
- the regulatory polynucleotide is a polynucleotide which activates transcription or translation.
- the regulatory polynucleotide activating transcription or translation is sensitive, directly or indirectly, to the action of an activating inducing signal. It is then a polynucleotide "inducible activator" within the meaning of the invention.
- a regulatory polynucleotide of the “inducible activator” type is a regulatory sequence which is only activated in the presence of an external signal.
- an external signal can be the binding of a transcription factor, the binding of a transcription factor being able to be induced under the effect of the activating inducing signal to which the regulatory polynucleotide is directly or indirectly sensitive.
- the expression of the polynucleotide coding for an ISUM2A polypeptide according to the invention can be induced by bringing the transformed cellular host into contact with the activating inducing signal to which the polynucleotide activator regulator is directly or indirectly sensitive.
- Table 3 Examples of ISUM2A inducible expression systems.
- a isum 2A7isum2A " homozygous for a non-functional copy of the isum2A gene, for example a mutation.
- b lsum 2A + / lsum2A + homozygote carrying two functional copies of the isum2A gene.
- the inducible expression system I of Table 3 constitutes an illustration of a construction of nucleic acids in which the regulatory polynucleotide is an “inducible activator” polynucleotide of transcription and / or translation, according to the second embodiment defined above.
- the expression system I comprises: (i) a first expression cassette comprising a nucleic acid coding for an ISUM2A polypeptide placed under the control of a promoter whose activity is induced only in the presence of an activating compound, when this activating compound, generally a transcription factor, is linked to an inducing compound. (ii) a second expression cassette comprising a nucleic acid coding for the activating compound, for example the transcription factor above, placed under the control of a promoter allowing the constitutive expression of the activating compound.
- the transcription or translation of the sequence coding for an ISUM2A polypeptide is induced only when the activating compound is complexed with the inducing compound.
- the complex between the activating compound and the inducing compound binds to the promoter controlling the expression of the nucleic acid coding for an ISUM2A polypeptide, and activates the expression of the latter.
- An example of the system I is illustrated in example 3, in which the system comprises:
- a nucleic acid coding for an ISUM2A polypeptide placed under the control of a promoter containing the UAS sequence, which is recognized by the activating compound GVG.
- the activator compound GVG is a fusion protein between the DNA binding domain of the GAL4 protein, the activator domain of the VP16 gene and the rat glucocorticoid receptor (GR).
- the GVG fusion protein is expressed constitutively in the plant, but does not activate the promoter controlling the expression of the ISUM2A polypeptide, in the absence of a glucocorticoid.
- the glucocorticoid is fixed on the fusion protein GVG, and the complex thus formed between the activating inducing compound (glucocorticoid) and the activating compound (the protein of GVG fusion) will bind to the UAS sequence of the promoter controlling the expression of an ISUM2A polypeptide, which activates the promoter containing the UAS sequence and induces the synthesis of the ISUM2A polypeptide.
- the glucocorticoid constitutes the inducing compound.
- the activating inducing signal is the binding of the activating compound / inducing compound complex (GVG / glucocorticoid fusion polypeptide) to the activating regulatory polynucleotide (promoter containing the UAS sequence).
- the expression system I will preferably be used in a plant cell host or in a plant in which the two copies of the isum2A gene are non-functional, for example in which the two copies of the isum2A gene are mutated.
- the inducible expression system II is an illustration of the embodiment of a nucleic acid construction according to the invention, according to the first embodiment described above, in which the polynucleotide coding for an ISUM2A polypeptide is placed under the control of a "repressor" regulatory polynucleotide.
- the expression system contains two expression cassettes, respectively:
- a first expression cassette comprising a nucleic acid coding for an ISUM2A polypeptide, placed under the control of a regulatory region whose activity is constitutive because it is induced in the presence of an activating compound produced so constitutive;
- a second expression cassette comprising a nucleic acid coding for the activating compound active on the regulatory region of the expression cassette (i) above, said nucleic acid coding for the activator compound being placed under the control of a constitutive promoter, preferably a strong constitutive promoter, or else a promoter active specifically in the cells of the seed embryo.
- the activating compound loses its function of activating the regulatory region controlling the expression of the nucleic acid coding for an ISUM2A polypeptide, when this activating compound is placed in the presence of a specific iigand, which is here designated repressor inducing compound.
- a specific iigand which is here designated repressor inducing compound.
- the activating compound when the activating compound is placed in the presence of the repressor inducing compound with which it binds, the activating compound is deactivated and no longer binds to the regulatory region controlling the expression of the nucleic acid coding for an ISUM2A polypeptide. In this situation, the ISUM2A polypeptide is no longer expressed.
- Example 2 illustrates a particular embodiment of a system II as defined above.
- the system II presented in Example 2 comprises respectively:
- a first expression cassette comprising a nucleic acid coding for the activating compound tTA, placed under the control of a strong constitutive promoter, the promoter of the rice actin 1 gene;
- a second expression cassette comprising a nucleic acid coding for an ISUM2A polypeptide placed under the control of a promoter containing a TRE motif, the promoter being activated when the tTA activator binds to the TRE element.
- the activating compound tTA is produced constitutively and activates the promoter controlling the sequence coding for an ISUM2A polypeptide.
- the tTA activator is deactivated and no longer binds to the TRE motif of the promoter controlling the nucleic acid encoding a 1SUM2A polypeptide.
- the ISUM2A polypeptide is no longer expressed.
- the repressor inducing signal is the absence of binding of the activator compound / repressor inducer compound complex (tTA tetracycline activator) on the repressor regulatory polynucleotide (promoter containing the TRE motif).
- an expression system II as defined above will be used in a plant cell host or in a plant for which the two copies of the isum2A gene are mutated or inactivated.
- the expression system III which is summarized in Table 3, is very similar, with regard to the elements for regulating the expression of the expression cassettes which it contains, to the expression system I above.
- an antisense polynucleotide capable of inhibiting the production of an ISUM2A polypeptide in a plant comprising at least one functional copy of the lsum2A gene, preferably in a plant comprising both copies of the functional isum2A gene.
- the expression system III comprises two expression cassettes, respectively:
- an expression cassette comprising a nucleic acid coding for the activator compound, this nucleic acid being placed under the control of a promoter constituting or specific for the embryo, preferably a strong promoter.
- a promoter constituting or specific for the embryo, preferably a strong promoter.
- the activated activating compound binds to the promoter controlling the expression of the antisense polynucleotide isum2A which activates the expression of the antisense polynucleotide resulting in inhibition of translation of the isum2A gene.
- the expression system III Thanks to the expression system III, the synthesis of the ISUM2A polypeptide is therefore inhibited in the presence of the inducing compound activating the activating compound.
- Such an expression system makes it possible to precisely control the moment when it is desired to block the synthesis of the ISUM2A polypeptide, by bringing the deactivated activating compound into contact with the inducing compound activating the activating compound, for example from the start of pollination.
- An illustrative example of an expression system III can be directly derived from that described in Example 3, when the nucleic acid coding for an ISUM2A polypeptide is replaced by a nucleic acid coding for an antisense polynucleotide inhibiting the translation of the ISUM2A polypeptide or any other method of inhibiting endogenous genes using a transgene and known to those skilled in the art (co-suppression, ribozyme, double-stranded RNA, etc.).
- the inducible expression systems of an ISUM2A polypeptide comprise several expression cassettes which can either be included in a single expression vector, or on the contrary in distinct expression vectors.
- An inducible expression system such as systems I, Il and
- the selection marker gene is carried by the vector comprising the expression cassette or cassettes constituting the inducible expression system.
- the selection marker gene is carried by a vector distinct from a vector comprising the expression cassette or cassettes constituting the inducible expression system.
- an inducible activating regulator polynucleotide chosen from those described below will be used.
- the regulatory sequence capable of controlling the nucleic acid coding for an ISUM2A polypeptide according to the invention can be a regulatory sequence inducible by a particular metabolite, such as:
- - a regulatory sequence inducible by tetracycline such as that sold by the company CLONTECH. - a promoter sequence inducible by a pathogen or by a metabolite produced by a pathogen.
- the nucleic acid allowing the synthesis of the ISUM2A polypeptide can also contain one or more other sequences containing regulatory signals for the expression of the region coding for ISUM2A, or alternatively be placed under the control of such regulatory sequences.
- the other sequences containing regulatory signals include 5 ′ untranslated “leader” sequences.
- leader sequences.
- Such sequences can increase the translation of mRNA encoding ISUM2A.
- EMCV ElectrophaloMyoCarditis VIRUS 5 'non coding region
- the nucleic acid allowing the synthesis of the ISUM2A polypeptide, or the vector into which this nucleic acid is inserted can also comprise so-called "terminator" sequences.
- the expression cassette according to the invention can comprise a polynucleotide coding for an ISUM2A polypeptide fused to a gene regulatory sequence of fragment GR type receptor for glucocorticoids (Aoyma et al. 1997), said polynucleotide being placed under the control of a promoter sequence of the ISUM2 native promoter or constitutive promoter type. In the presence of the hormone, the resulting hybrid protein is no longer retained in the cytoplasm and can therefore enter the chloroplast and integrate into the ribosome.
- a nucleic acid allowing the synthesis of the ISUM2A polypeptide can be inserted into an appropriate vector.
- vector in the sense of the present invention, is meant a circular or linear DNA or RNA molecule which is either in single strand or double strand form.
- a recombinant vector according to the invention is preferably an expression vector, or more specifically an insertion vector, a transformation vector or an integration vector.
- It may especially be a vector of bacterial or viral origin.
- the nucleic acid allowing the synthesis of the ISUM2A polypeptide is placed under the control of one or more sequences containing signals for regulating its expression in the plant considered, that is to say that the regulatory signals are all contained in the nucleic acid encoding ISUM2A, as is the case in the nucleic acid constructs described in the previous section, either that one, more of them, or all of the regulatory signals are contained in the recipient vector into which the nucleic acid encoding ISUM2A has been inserted.
- a recombinant vector according to the invention advantageously comprises appropriate sequences for initiating and stopping transcription.
- the recombinant vectors according to the invention may include one or more origins of functional replication in the host cells in which their expression is sought, as well as, where appropriate, nucleotide selection marker sequences.
- the recombinant vectors according to the invention can also include one or more of the expression regulation signals as defined above in the description.
- the preferred bacterial vectors according to the invention are for example the vectors pBR322 (ATCC No. 37 017) or also the vectors such as pAA223-3 (Pharmacia, Uppsala, Sweden) and pGEM1 (Promega Biotech, Madison, Wl, United States ). Mention may also be made of other commercial vectors such as the vectors pQE70, pQE60, pQE9 (Quiagen), psiX174, pBluescript SA, pNH8A, pMH16A, pMH18A, pMH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI and pSG (Stratagene).
- They may also be vectors of the Baculovirus type such as the vector pVL1392 / 1393 (Pharmingen) used to transfect the cells of the line Sf9 (ATCC No. CRL 1711) derived from Spodoptera frugiperda.
- vectors of the Baculovirus type such as the vector pVL1392 / 1393 (Pharmingen) used to transfect the cells of the line Sf9 (ATCC No. CRL 1711) derived from Spodoptera frugiperda.
- vectors pRDP ⁇ and pRDP4 described in Example 2 are also included in the invention.
- nucleic acid coding for an ISUM2A polypeptide according to the invention placed under the control of an appropriate regulatory sequence, the nucleic acids or the recombinant vectors defined in the present description must be introduced into a host cell.
- the introduction of the polynucleotides according to the invention into a host cell can be carried out in vitro, according to techniques well known to those skilled in the art.
- Such a transformed host cell is preferably of bacterial, fungal or vegetable origin.
- bacteria cells of different strains of Escherichia coli or of Agrobacterium tumefaciens can in particular be used.
- the transformed host cell is a plant cell or even a plant protoplast.
- cells capable of being transformed according to the process of the invention mention may be made, by way of examples, of cells from plants of large crops (corn, wheat, rapeseed, sunflower, peas, soybeans, barley, etc.).
- plants known for contain large reserves protein, carbohydrate and lipid), especially cereal plants or oil plants.
- the hybrid plants obtained by crossing plants according to the invention also form part of the invention.
- it is a cell or a protoplast of a cereal plant.
- the cell or protoplast is preferably native to corn, wheat, barley, sorghum, millet, rye or rice.
- the subject of the invention is also the use of a nucleic acid comprising a polynucleotide coding for an ISUM2A polypeptide, where appropriate in the form of a nucleic acid construct as defined above, for manufacturing a transformed plant capable of producing seeds with development of the affected germ.
- the invention also relates to the use of a recombinant vector as defined in the present description for manufacturing a transformed plant capable of producing seeds with development of the affected germ.
- the invention also relates to the use of a cellular host transformed with a nucleic acid comprising a polynucleotide coding for an ISUM2A polypeptide, where appropriate in the form of a nucleic acid construct or expression cassette as defined above. above, to make a transformed plant capable of producing seeds with development of the affected germ.
- the invention also relates to a transformed plant comprising a plurality of host cells as defined above.
- the invention also relates to a transformed multicellular plant organism, characterized in that it comprises a transformed host cell or a plurality of host cells transformed by an acid.
- nucleic acid comprising a polynucleotide encoding the ISUM2A polypeptide as defined in the present description or also by a recombinant vector comprising such a nucleic acid.
- the subject of the invention is also a transformed plant comprising, in a form artificially integrated into its genome, a nucleic acid allowing the synthesis of the ISUM2-A polypeptide, as defined in the present description.
- the transformed plant may contain a plurality of copies of a nucleic acid encoding the ISUM2A polypeptide, in situations in which overexpression of the ISUM2A polypeptide is sought.
- An overexpression of the ISUM2A polypeptide is sought in particular when it is desired to obtain plants producing seeds whose germ has a significantly larger size than in "wild" plants and which is enriched in oil.
- the overexpression of the ISUM2A polypeptide can be obtained by transforming a host cell or a plant with a nucleic acid coding for the ISUM2A polypeptide and in which the polynucleotide comprising the open reading frame is placed under the control of an acid. regulatory nucleic acid allowing a high level of transcription of the corresponding mRNA or a high level of translation of the ISUM2A polypeptide in the host cell or in the plant.
- the invention therefore also relates to a transformed plane as defined above, the seeds of which are rich in oil.
- It also relates to a process for obtaining such a transformed plant.
- field crops preferably corn, wheat, rapeseed, sunflower, peas, soybeans and barley.
- the preferred plants according to the invention are those of which the seeds have a high starch content or a high amount of starch and most preferably corn, wheat, barley, sorghum, millet, rye or rice.
- Hybrid plants obtained by crossing transformed plants according to the invention also form part of the invention.
- the invention also relates to any part of a transformed plant as defined in the present description, such as the root, but also the aerial parts such as the stem, the leaf, the flower and especially the seed.
- the subject of the invention is also a seed or a seed of a plant produced by a transformed plant as defined above.
- a transformed seed or such a transformed grain comprises one or more cells comprising in their genome one or more copies of a nucleic acid allowing the synthesis of the ISUM2A polypeptide, if necessary in a controlled and inducible manner.
- the seeds or seeds of plants are enriched in oil.
- the invention therefore also relates to seeds and grains enriched in oil, prepared or obtained from a transformed plant overexpressing the ISUM2A polypeptide.
- Oil rich seeds are used for seed preparation or oil enriched seed meal for use in agriculture and the food industry.
- a transformed plant it is sought to express in a controlled manner the ISUM2A polypeptide, which implies that the transformed plant does not contain, as a functional copy of a polynucleotide encoding the polypeptide ISUM2A, only the copy or copies which have been artificially introduced into their cells, and preferably into their genome, while the sequences of the isum2A gene found naturally in the wild plant carry at least one mutation causing a defect in the expression of the isum2A gene .
- Such plants mutated in the isum2A gene are, for example, the mutant plants G2422 or the mutant plants emb * - 8516 described by HECKEL et al. (1999).
- a person skilled in the art can, thanks to the invention, produce other plants mutated in the isum2A gene, for example by random insertion of the Mutator transposon in a population of plants of wild phenotype (lsum2A7lsum2A + ), then by detecting in the mutants obtained, those of these mutants which no longer express the isum2A gene, for example using the probes or nucleotide primers described in the examples.
- the transformed plant according to the invention is characterized in that it derives from a plant in which the two copies of the isum2A gene each carry at least one mutation causing a defect in its expression, at the transcriptional level or translational.
- a second preferred embodiment according to the invention it is sought to inhibit in a controlled manner the synthesis of the ISUM2A polypeptide, for example through the expression of an antisense polynucleotide.
- the transformed plant comprises at least one functional copy of the isum2A gene and preferably the two copies of the isum2A gene are functional.
- the invention also relates to a process for obtaining a transformed plant capable of producing seeds affected in the development of the germ, characterized in that it comprises the following stages: a) transformation of at least one cell vegetable; - with a nucleic acid comprising a polynucleotide coding for an ISUM2A polypeptide chosen from sequences having at least 95% amino acid identity with the sequences SEQ ID No. 5 and SEQ ID No.
- nucleic acid also comprising a polynucleotide regulator as defined in the present description; or - by a recombinant vector comprising such a nucleic acid; b) selection of the cells transformed in step a) having integrated into their genome at least one copy of a nucleic acid coding for the polypeptide ISUM2A. c) regeneration of a transformed plant from the transformed cells obtained in step b);
- seeds affected in the development of the germ is meant according to the invention seeds whose development of the germ is “abnormal”, that is to say significantly different from the germ of a seed of a plant called “wild” .
- the development of the germ can be affected so that its size is significantly larger than that of the germ found in the seeds of “wild” plants not affected in the expression of the isum2A gene.
- a significantly larger size of the germ can be obtained by overexpressing the ISUM2A polypeptide, for example either by introducing a plurality of copies of a nucleic acid encoding this polypeptide into a host cell or in a plant, or by placing a copy of the isum2A gene or its cDNA under the control of a regulatory polynucleotide allowing the overexpression of the ISUM2A polypeptide in the host cell or in the plant.
- the invention also relates to a particular embodiment of the above process for obtaining a transformed plant capable of producing seeds with development of the affected germ in which at least one plant cell is transformed in step a ) by Agrobacterium tumefaciens containing: - a nucleic acid comprising a polynucleotide coding for an ISUM2A polypeptide chosen from sequences having at least 95% amino acid identity with the sequences SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 6 and comprising a regulatory polynucleotide as defined in the present description; or - a recombinant vector comprising such a nucleic acid;
- Each of the methods for obtaining a transformed plant according to the invention can comprise the following additional steps: d) crossing of a plant selected in step c) with a heterozygous plant comprising a functional copy of the isum2A gene and a copy isum2A gene inactive; e) selection of the plants resulting from the crossing of step d) which are homozygous and carry two inactive copies of the isum2A gene.
- the regulatory polynucleotide is sensitive to the action of an inducing signal; it is also said that the regulatory polynucleotide is inducible.
- the inducible regulatory polynucleotide consists of a regulatory "repressor" polynucleotide as defined in the present description.
- the inducible regulatory polynucleotide is a regulatory polynucleotide "activator" of transcription or translation as defined in the present description.
- the present invention also relates to a transformed plant, as obtained by one of the production methods defined above.
- the invention also relates to a hybrid transgenic plant obtained by crossing a transformed plant as defined above.
- the invention also relates to a part of a plant transformed according to the invention.
- the subject of the invention is also a process for obtaining grains of plants with development of the affected germ, characterized in that it comprises the following stages: a) cultivating, until pollination, a plant of which the two copies of the isum2A gene carry at least one mutation causing a defect in the production of the ISUM2A polypeptide and in the genome of which a nucleic acid has been artificially introduced comprising:
- the development of the germ can be affected in such a way that its size is significantly reduced compared to that of seeds from wild plants, or even nonexistent, as has been shown when the plant has a non-functional isum2A gene or when we introduce a nucleic acid coding for the ISUM2A polypeptide under the control of a regulatory polynucleotide making it possible to block transcription or translation in a controlled manner in order to affect the development of the germ.
- the present invention also relates to a process for obtaining grains of plants with development of the affected germ, characterized in that it comprises the following stages: a) cultivating, until pollination, a plant of which the two copies of the isum2A gene each carry at least one mutation causing a defect in the production of the ISUM2A polypeptide and in the genome of which a nucleic acid has been artificially introduced comprising:
- the invention also relates to a seed with development of the affected germ as it is obtained according to one of the methods defined above.
- the invention also relates to a developing seed of the affected germ, characterized in that each of its constituent cells comprises, in a form artificially integrated into their genome, a nucleic acid comprising: - a polynucleotide coding for an ISUM2A polypeptide chosen from sequences having at least 95% amino acid identity with the sequences SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 6; and
- the regulatory polynucleotide consists of an inducible regulatory polynucleotide of the repressor type.
- the regulatory polynucleotide consists of a regulatory polynucleotide of the inducible activator type. Also part of the invention is any transformation product of a seed as defined in the present description, in particular a seed or an oil.
- the transformation product is a starch.
- starch from a seed developing the affected germ according to the invention the skilled person will advantageously use the techniques described in the book "Handbuch der Starke” (vol. I; Max Ullmann ( ed.), Paul Varey Verlag, Berlin) or in the article by Morrison and Karkalas (Methods in Plant Biochemistry, 1990, vol. 2: 323-352, Académie Press Ltd; London).
- the starch obtained from seeds with development of the affected germ according to the invention can be used by the food industry, the pharmaceutical industry, the paper industry or even in the microbiological field, where it can be used. as a nutrient substrate.
- the transformation of plant cells can be carried out by techniques known to those skilled in the art.
- direct gene transfer methods such as direct microinjection into plant embryoids (NEUHAUS et al, 1987), vacuum infiltration (BECHTOLD et al., 1993) or electroporation (CHUPEAU et al , 1989) or direct precipitation by means of PEG (SCHOCHER et al, 1986) or the bombardment by cannon of particles covered with the plasmid DNA of interest (FROMM M. e
- the plant cells are transformed by a vector according to the invention, said cell host being capable of infecting said plant cells by allowing the integration into the genome of these latter, sequences Nucleotides of interest initially contained in the DNA of the above-mentioned vector.
- the above-mentioned cell host used is Agrobacterium tumefaciens, in particular according to the method described in the article by AN et al, (1986), or else Agrobacterium rhizogenes, in particular according to the method described in the article by GUERCHE et al, (1987) or in PCT application No. WO OO 22.148.
- the transformation of plant cells can be carried out by the transfer of the T region of the extrachromosomal circular plasmid inducing Ti tumors of Agrobacterium tumefaciens, using a binary system (WATSON et al. 1994).
- a binary system WATSON et al. 1994.
- two vectors are constructed. In one of these vectors, the T region has been deleted, with the exception of the right and left borders, between them the gene of interest, as well as a marker gene are inserted to allow selection in cells of plants.
- the other partner of the binary system is a helper Ti plasmid, a modified plasmid which no longer has a T region but still contains the vir virulence genes, necessary for the transformation of the plant cell.
- the method described by ISHIDA et al. Can be used. (1996) for the transformation of Monocotyledons.
- the transformation is carried out according to the method described by FINER et al. (1992) using the tungsten or gold particle gun.
- a person skilled in the art is capable of implementing numerous methods of the state of the art in order to obtain plants transformed with a nucleic acid allowing the synthesis of the ISUM2A polypeptide.
- transgenic plant according to the invention can be obtained by biolistic techniques such as those described by FINER et al. (1992) or those described by VAIN et al. (1993).
- the isum2A gene codes for a polypeptide having a length of 143 amino acids, for which at least two variant polypeptides have been observed.
- the first variant polypeptide encoded by the isum2A gene has the amino acid sequence SEQ ID No. 5 and is encoded by the isum2A gene present in the genome of the corn plant designated HD5x HD7.
- the second variant ISUM2A polypeptide is encoded by the isum2A gene present in the genome of the corn plant designated A188.
- the ISUM2A polypeptides of sequences SEQ ID No 5 and SEQ ID No 6 differ only by the substitution of an amino acid residue, the polypeptide of sequence SEQ ID No 5 having a residue glycine at position 89 and the polypeptide of sequence SEQ ID No. 6 having an amino acid residue asparagine at this position.
- ISUM2A leads in all cases to the expression of a wild phenotype in the plant, said plant producing mature and fertile grains comprising a fully developed embryo.
- No. 5 has a calculated molecular weight of 15,112 daltons, a calculated isoelectric point of 11.75 and a charge at pH 7 of 28.19.
- the ISUM2A polypeptide of sequence SEQ ID No. 5 has 40 charged amino acid residues (R, K, H, Y, C, D, E), 3 acidic amino acid residues (D, E), 31 residues d basic amino acids (K, R), 31 polar amino acid residues (N, C, Q, S, T, Y) and 55 hydrophobic amino acid residues (A, I, L, F, W, V ).
- the ISUM2A polypeptide of sequence SEQ ID No. 6 has characteristics very similar to those described below above for the ISUM2A polypeptide of sequence SEQ ID No. 5.
- a subject of the invention is therefore also the polypeptide comprising the amino acid sequence SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. 6 as well as a polypeptide having at least 95% amino acid identity with the sequence SEQ ID N ° 5 or SEQ ID No. 6, or a fragment or variant thereof.
- a fragment of an ISUM2A polypeptide according to the invention comprises at least 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 130, 135 or 140 consecutive amino acids of a polypeptide of sequence SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. 6.
- polypeptide comprising
- the invention also relates to a polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 95% amino acid identity with the sequence of an ISUM2A polypeptide of sequence
- polypeptides according to the present invention are in an isolated or purified form.
- Another subject of the invention consists of a polypeptide comprising amino acid modifications of 1, 2, 3, 4 or 5 substitutions, additions or deletions of an amino acid with respect to the amino acid sequence of a polypeptide of sequence SEQ ID No. 5 or
- SEQ ID N ° 6 or a fragment or a variant thereof.
- a polypeptide according to the invention can be obtained by genetic recombination according to techniques well known to those skilled in the art, for example techniques described in AUSUBEL
- a polypeptide according to the invention can also be prepared by conventional techniques of chemical synthesis, either in homogeneous solution or in solid phase.
- a polypeptide according to the invention may be prepared by the technique in homogeneous solution described by HOUBEN WEIL (1974) or also by the solid phase synthesis technique described by MERRIFIELD (1965a; 1965b).
- variant polypeptides of a polypeptide according to the invention retain their ability to be recognized by antibodies directed against the polypeptides of sequences SEQ ID No. 5 or 6.
- a polypeptide encoded by the lsum2A gene according to the invention such as a polypeptide of amino acid sequence SEQ ID No. 5 or 6, or a variant or a peptide fragment of the latter is useful in particular for the preparation of antibodies intended for the detection of presence and / or expression of a polypeptide of sequences SEQ ID No. 5 or 6 or of a peptide fragment of the latter in a sample.
- antibodies directed against these polypeptides are used to quantify the synthesis of a polypeptide of sequences SEQ ID No. 5 or 6, for example in cells of a plant, and thus determine the development of the embryo.
- antibody within the meaning of the present invention, is meant in particular polyclonal or monoclonal antibodies or fragments (for example the fragments F (ab) ' 2 , F (ab)) or any polypeptide comprising a domain of the antibody initial recognizing the polypeptide or the fragment of target polypeptide according to the invention.
- Monoclonal antibodies can be prepared from hybridomas using the technique described by KOHLER and MILSTEIN (1975)
- the present invention also relates to antibodies directed against a polypeptide as described above or a fragment or a variant thereof, as produced in the trioma technique or also the hybridoma technique described by KOZBOR et al. (1983).
- the invention also relates to fragments of single chain Fv antibody (ScFv) as described in US Patent No. 4,946,778 or by MARTINEAU et al. (1998).
- the antibodies according to the invention also comprise fragments of antibodies obtained using phage libraries as described by RIDDER et al. (1995) or humanized antibodies as described by REINMANN et al. (1997) and LEGER et al. (1997).
- the antibody preparations according to the invention are useful in immunological detection tests intended for the identification of the presence and / or of the quantity of a polypeptide of sequences SEQ ID No. 5 or 6, or of a fragment peptide thereof, present in a sample.
- an antibody according to the invention may also comprise an isotopic or non-isotopic detectable marker, for example fluorescent, or else be coupled to a molecule such as biotin, according to techniques well known to those skilled in the art.
- the subject of the invention is also a method for detecting the presence of a polypeptide in accordance with the invention in a sample, said method comprising the steps of: a) bringing the sample to be tested into contact with an antibody such as described above; b) detecting the antigen / antibody complex formed.
- the invention also relates to a kit or diagnostic kit for detecting the presence of a polypeptide according to the invention in a sample, said kit comprising: a) an antibody as defined above; b) where appropriate, one or more reagents necessary for the detection of the antigen / antibody complex formed.
- Another subject of the invention consists in the use of a nucleic acid or an allelic variant of a nucleic acid as defined above in selection programs for obtaining plants with an embryo modified in size. and / or development influencing the starch and / or oil content.
- the invention also relates to a method for selecting plants with an embryo modified in size and / or in development, comprising the steps of: a) genotyping plants (individuals) by means of nucleotide probes or primers obtained from nucleic acids as defined previously or variants of these nucleic acids; b) select, among these plants (individuals), those which include a high frequency of favorable alleles associated with the size and / or development of the embryo.
- FIG. 1 illustrates the genomic nucleotide sequence of the isum2A gene present in the corn plant designated HD5 x HD7 referenced as the sequence SEQ ID No. 1 of the sequence listing.
- the three exons of the isum2A gene are represented in the form of boxes, under the corresponding nucleotide sequence.
- the different sites of recognition for restriction endonucleases are indicated, above the corresponding nucleotide sequence.
- sequences derived from the three exons of the gene are represented by boxes located under the corresponding nucleotide sequence.
- the deduced amino acid sequence is shown below the boxes representing the exons.
- the box designated “RL35 domain” corresponds to the part of the sequence of the ISUM2A polypeptide which is homologous with certain proteins of the chloroplast.
- the ISUM2A polypeptide represented in FIG. 2 is referenced as the sequence SEQ ID No. 5 of the sequence listing.
- FIG. 3 illustrates a partial cDNA sequence corresponding to the messenger RNA found in the corn plant designated A188, this nucleotide sequence being referenced as the sequence SEQ ID No. 4 of the sequence listing.
- the deduced sequence of the protein encoded by the cDNA is represented below the corresponding nucleotide sequence, and is referenced as the sequence SEQ ID No. 6 of the sequence listing.
- the boxes located below the peptide sequence represent the three exons derived from the isum2A gene found in the A188 corn line.
- the box designated “RL35 domain” corresponds to the part of the ISUM2A polypeptide having homology with chloroplast proteins.
- FIG. 4 illustrates the structure in exons and introns of the isum2A gene, the boxes representing the exons of the gene.
- the A base of the ATG codon is the nucleotide at position 51 of the first exon and the T base of the TGA codon of translation stop and the nucleotide at position 76 of the third exon.
- the boxes below the gene structure isum2A represent the different genomic DNA clones used in the examples.
- the boxes above the structure of the isum2A gene represent the different cDNA clones used in the examples.
- Figure 5 illustrates a map of plasmid pRDP5.
- FIG. ⁇ illustrates the map of the plasmid pTRE sold by the company CLONTECH LABORATORIES Inc. and the structure of which is accessible in the GENBANK database under the access number U89931.
- FIG. 7 illustrates the map of the plasmid pDM302 described by CAO et al. (1992).
- FIG. 8 illustrates the map of the plasmid pTet-Off sold by the company CLONTECH (catalog reference year 2000: K1620-A).
- Figure 9 illustrates the map of plasmid pRDP4.
- FIG. 10 illustrates the map of the plasmid pTA7001 described by
- Figure 11 illustrates the map of plasmid pRDP2.
- FIG. 13 illustrates the operating principle of the expression system 11 summarized in table 3 and subject of example 2.
- FIG. 13A illustrates the constitutive expression of the ISUM2A polypeptide under the effect of the activation of the promoter containing the TRE sequence by the activator tTA, which is itself constitutively expressed.
- FIG. 13B illustrates the repression of the synthesis of the ISUM2A polypeptide when the activator tTA is brought into contact with tetracycline, which deactivates it and prevents it from activating the promoter containing the TRE sequence.
- FIG. 14 illustrates a diagram of the operation of an expression system I summarized in table 3 and subject of example 3.
- FIG. 14A illustrates the synthesis of the ISUM2A polypeptide when the promoter containing the UAS sequence is activated by the fusion protein GVG, in the presence of a glucocorticoid.
- FIG. 14B illustrates the absence of production of ISUM2A polypeptide in a situation in which the GVG fusion protein is produced in the absence of a glucocorticoid and does not activate the UAS sequence of the promoter controlling the expression of the isum2A gene.
- EXAMPLES EXAMPLE 1: Cloning of the genomic sequence of the isum2A gene.
- the plants were grown either in a climatic chamber, with a lighting period of 16 h (100 Wm-2), a relative humidity of 80% and an alternation of 24 ° C / 19 ° C (day / night), or in greenhouse under the same conditions but without humidity control, either in the open field in Lyon. All plants were pollinated by hand.
- RNAse A The DNA pellet was rinsed with 1 ml 70% ethanol, dried and taken up in 50 ⁇ l TE10.01 (Tris-HCI pH8 10 mM, EDTA pH8 0.1 mM) supplemented with 20 ⁇ g / ml of RNAse A. A4. PCR on genomic DNA
- the genomic DNA was diluted 10 times and 2 ⁇ l were used in a 20 ⁇ l reaction containing each primer 1 ⁇ M, dNTP 100 ⁇ M and 1 u Taq polymerase in the buffer provided with the enzyme (Pharmacia).
- the reaction was carried out in a Perkin Elmer DNA Thermal Cycler 2400 or 9700 PCR amplifier as follows: after denaturing the DNA 2 min at 94 ° C, the samples underwent 30 cycles of 30 s denaturation at 94 ° C / 45 s of hybridization at 60 ° C / 1 min elongation at 72 ° C. All primers had Tm between 60 ° and 62 ° C.
- the plasmid DNA was prepared according to the alkaline lysis protocol described by Sambrook et al. (1989). Digests of genomic DNA, plasmid DNA or phada lambda DNA by restriction enzymes were carried out according to the advice of the manufacturers (Gibco, Boehringer Mannhein, Promega). The digestion or PCR amplification products were separated by agarose gel electrophoresis in TAE buffer (Sambrook et al., 1989).
- the restriction fragments were ligated into the vector pBluescript and the PCR products into pGEM-T-easy, using the T4-DNA ligase following the advice of the supplier (Promega), using 50 ng of vector, and a insert / vector molar ratio of the order of 3/1. These constructs were introduced into the bacterial strain DH5- ⁇ by transformation by thermal shock, according to the protocol of Hanahan (1983).
- Membranes for DNA hybridization were obtained either by transfer of restriction fragments of agarose gels onto Hybond N + membranes (Amersham) by capillary action, in the presence of 0.4 N sodium hydroxide, or by transfer of lysis plaques from lambda phage on Hybond N membranes (Amersham).
- the membranes were prehybridized according to the supplier's advice, for 4 to 12 hours at 65 ° C in the presence of 5 x SSPE (20 x SSPE contains 3.6 M NaCl, 0.2 M sodium phosphate, EDTA pH 7.7 ; 0.02 M). Then they were hybridized for 16 h under the same conditions.
- the probes used for the hybridization were radioactively labeled with 50 ⁇ Ci of ⁇ 32 P-dCTP, using the Ready-To-GO TM DNA labeling beads kit (Amersham). After hybridization, the membranes were subjected to four rinses, at 65 ° C. in 0.1% solutions of SDS and SSC concentrations of 2 x, 1 x, 0.5 x and 0.1 x (SSC 20 x contains 3 M NaCl, 0.3 M Na 3 -citrate) and were exposed to film for autoradiography (X-OMAT Kodak).
- RNAs were extracted from 50 mg of ground tissue in liquid nitrogen with the TRIZOL TM reagent according to the protocol of the supplier (Gibco).
- RNA 6 ⁇ g of purified RNA were “reverse” transcribed by MuLV reverse transcriptase (Gibco) in a total volume of 20 ⁇ l as advised by the supplier, with a polyT primer at a final concentration of 2.5 ⁇ M. After inactivation of the reverse transcriptase by heating at 95 ° C for 5 min, 2 ⁇ l of the reverse transcription reaction were amplified by Taq polymerase as described above.
- sequencing was carried out by the company Génome Express in Grenoble (France). Sequencher 3.1.1 (Gene Codes Corporation) and DNAstar (Laser Gene) software were used to analyze and assemble the sequences obtained.
- an AIMS product of 107 bp was obtained with the primers Mu 16 (SEQ ID No. 8) and adapMsel (SEQ ID No. 9).
- This "AIMS product" (see FIG. 4) contains 70 bp of the flanking sequence between the two primers, which does not show significant homology with the sequences referenced in the databases.
- Genomic walk (Devic et al, 1997) was used on the genomic DNA of genotype A188. With the primers “nested” GW4 (SEQ ID N ° 12) and GW4b (SEQ ID No. 13) and cleavage by Sspl, a product of 244 bp was obtained (clone L223a, FIG. 4), which contained an additional 153 bp of the flanking sequence.
- the 1532 bp product (clone L223c, Fig. 4) contained 1463 bp of additional flanking sequence.
- the sequence of the clone L223c showed homology in the databases with an EST of corn. Two sequences of the same cDNA are found in Genebank: a sequence from the 5 'end in the accession AI001298, and a sequence from the 3' end in the accession AI374506. This EST bears the name Isum2 without explanation of this acronym. The homology was strong but limited to a small part of L223c. A PCR reaction was carried out on genomic DNA with the primers Isum2b (SEQ ID No. 18) and Isum2e (SEQ ID No. 20), which are located on either side of the suspected intron.
- the amplification product was cloned and sequenced.
- the sequence of this clone L157a (fig. 4) showed that the sequence present in the AIMS product, in L223a and in a part of L223c corresponded to an intron of isl2.
- a population of 25,000 plants highly mutagenized with the transposon mutator was screened by PCR for insertion into lsum2. The plants were planted in 10 blocks of 50 x 50 plants.
- DNA pools of 500 rows and 500 columns were analyzed by PCR for the presence of an amplification with the OMuA primer (SEQ ID # 24 in mutator) in combination with a primer in an exon of isl2.
- the four primers Isum2b (SEQ ID N ° 18), Isum2c (SEQ ID N ° 19), Isum2k (SEQ ID N ° 21) and 8516g (SEQ ID N ° 23) specific to lsum2 were tested. Positive results were obtained with the primers Isum2b and Isum2k.
- the plants in question were identified and the amplification was confirmed on individual plant DNA. Then their descendants were analyzed to distinguish somatic insertions (absent in the gametes) from germinative insertions (present in the gametes). Of all the insertions, only one was found in the next generation.
- the sequencing of the PCR amplification products showed that it was an insertion into intron 1 of lum2A at 3 bp upstream of exon 2, found in a
- lsum2A gene For the lsum2A gene, a first genomic sequence was obtained by screening a genomic library of plants of the genotype
- the sequence of the HD5 x HD7 genotype (Fig. 1) emanates from the two subclones L211c1 (Xhol fragment of 9 kb) and L211c2 (Xhol fragment of 6 kb).
- genotype A188 comes from clones L157a (PCR with the primers Isum2b (SEQ ID No 18) and Isum2e (SEQ ID No 20)), L223a (genomic alk, see above) and L223c (genomic walk, see above).
- the partial cDNA sequence of the A188 genotype comes from clones L158a and L254 (fig. 4). The first was obtained by RT-PCR on embryos ⁇ ⁇ T2 ⁇ AP TM av ⁇ c1 ⁇ s ⁇ m ⁇ r ⁇ sTsljm2 ⁇ î (SEQ ID N ° 18) and Isum 2c (SEQ ID N ° 19), the second by RT-PCR on albumen of 7JAP with primers Isum2a (SEQ ID N ° 17) and Isum2l (SEQ ID N ° 22).
- the cDNA sequence of the HD5 x HD7 genotype (SEQ ID No. 3, fig. 2) was obtained from the genomic sequence (SEQ ID No. 1) using the EST Isum2 (above) to determine the limit 5 'of the first exon and the limit 3' of the last exon.
- Construction of a vector comprising a polynucleotide coding for an ISUM2A polypeptide placed under the control of an inducible regulatory polynucleotide of the repressor type.
- This expression system involves the construction of two vectors, respectively:
- the vector pTRE marketed by the CLONTECH Company
- the pTRE vector is cleaved by the BamHI restriction endonuclease, at nucleotides 471 and 483 of the vector, the DNA fragment located between the two aforementioned BamHI sites then being excised.
- Amplification of the isum2A gene described in Example 1 is then carried out, more specifically of the genomic region going from the ATG codon at the end of the reading frame and also comprising a terminator sequence, by PCR amplification.
- the isum2A gene amplification product is ligated into the open pTRE vector in order to construct the pRDP ⁇ vector illustrated in FIG. 5.
- the isum2A gene is placed under the control of the prTRE promoter, which is recognized by the tTA activator.
- the vector pRDP4 contains the gene for the activator tTA under the control of the actinel promoter of rice.
- the pTet-Off vector sold by the company CLONTECH Laboratories Inc. (catalog reference No. K 1620-A, year 2000), which is illustrated in FIG. 8, is used to amplify the sequence of the tTA gene by PCR.
- the amplification product of the tTA gene is ligated at the open SmaI site of the plasmid pDM302 in order to construct the plasmid pRDP4 illustrated in FIG. 9.
- the plasmid pRDP4 comprises the tTA gene under the control of the actinel promoter of rice.
- FIG. 13 A diagram of the operation of the inducible expression system described in the present example is shown in FIG. 13, either in the absence of tetracycline (FIG. 13A), or in the presence of tetracycline (FIG. 13B).
- FIG. 13A A diagram of the operation of the inducible expression system described in the present example is shown in FIG. 13, either in the absence of tetracycline (FIG. 13A), or in the presence of tetracycline (FIG. 13B).
- FIG. 13A A diagram of the operation of the inducible expression system described in the present example is shown in FIG. 13, either in the absence of tetracycline (FIG. 13A), or in the presence of tetracycline (FIG. 13B).
- Tables 5 to 8 A summary of the characteristics of the various vectors used or prepared according to Example 2 is presented in Tables 5 to 8 below.
- Construction of a vector comprising a polynucleotide encoding an ISUM2A polypeptide placed under the control of a regulatory polynucleotide of the inducible activator type.
- the expression system according to Example 3 constitutes an illustration of the expression system I summarized in Table 3, and which is commented on in the description.
- the expression system according to Example 3 comprises two expression cassettes, respectively:
- an expression cassette comprising the isum2A gene placed under the control of a promoter containing the UAS sequence recognized by the GVG activator; and (ii) an expression cassette coding for the GVG activator, placed under the control of the actinel rice promoter, which is a strong and constitutive promoter in monocots.
- the starting vector is the plasmid pTA7001 described by AOYAMA et al. (1997) and which is shown in Figure 10.
- the vector pTA7001 is subjected to digestion with the enzymes Sse8387l and Pmel in order to excise the promoter 35S of the mosaic virus of the cauliflower.
- the rice actinel promoter is amplified by PCR, from the plasmid pDM302 illustrated in FIG. 7.
- the amplification product of the rice actinel promoter is ligated into the vector pTA7001 previously digested, to construct the plasmid pRDP2 illustrated in FIG. 11.
- the starting vector is the vector pRDP2 constructed according to the above protocol.
- the vector pRDP2 is first subjected to digestion using the restriction endonucleases Xhol and Spel.
- the vector pRDP3 contains two expression cassettes, respectively:
- the GVG gene codes for a fusion protein between the DNA binding domain of the GAL4 protein, the activator domain of the VP16 gene and the rat glucocorticoid receptor (GR).
- FIG. 14 A diagram of the functioning of the inducible expression system described in the present example is shown in FIG. 14, either in the presence of a glucocorticoid (FIG. 14A), or in the absence of a glucocorticoid (FIG. 14B).
- the hybrid transcription factor GVG is transported in the nucleus and strongly activates all the promoters containing the UAS sequence ( Figure 14B).
- Tables 9 to 11 below present a summary of the main characteristics of the different vectors used or prepared according to example 3.
- Transformation of a plant in order to obtain a stable expression of the polynucleotide of interest in the transformed plant is necessary to ensure a lasting modification of the corn kernel. Tests are carried out with a construction of vectors described in Examples 2 and 3.
- Target cells are undifferentiated cells in rapid divisions which have retained the ability to regenerate whole plants. This type of cell makes up the embryogenic callus (called type II) of corn. These calluses are obtained from immature Hill genotype embryos according to the method and on the media described by ARMSTRONG (1994) MAIZE HANDBOOK; 1994, M. FREELING, V. WALBOT EDS .; PP 665-671.
- Fragments of such calluses with an area of 10 to 20 mm 2 were placed, 4 h before bombardment, at the rate of 16 fragments per dish in the center of a Petri dish containing a culture medium identical to the initiation medium , supplemented with 0.2 M mannitol + 0.2 M sorbitol.
- the plasmids described in the previous examples and carrying the genes to be introduced are purified on a Qiagen R column according to the manufacturer's instructions. They are then precipitated on tungsten particles (M 10) following the protocol described by KLEIN (1987). The particles thus coated are projected towards the target cells using the cannon and according to the protocol described by J. FINER (1992).
- the callus boxes thus bombarded are then sealed using Scellofrais R and then grown in the dark at 27 ° C.
- the first subculture takes place 24 hours later, then every fortnight for 3 months on medium identical to the initiation medium added with a selective agent.
- Calls are obtained after 3 months or sometimes earlier, calluses whose growth is not inhibited by the selective agent, usually and mainly composed of cells resulting from the division of a cell having integrated into its genetic heritage one or more copies of the selection gene.
- the frequency of obtaining such calluses is approximately 0.8 cal per bombarded box.
- Agrobacterium tumefaciens according to the protocol described by ISHIDA et al. (1996), in particular from immature embryos 10 days after fertilization. All the media used are referenced in the cited reference.
- the transformation begins with a coculture phase where the immature embryos of the corn plants are brought into contact for at least 5 min with Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 containing the superbinary vectors.
- the superbinary plasmid is the result of a homologous recombination between an intermediate vector carrying the T-DNA containing the gene of interest and / or the selection marker derived from the plasmids described in the preceding examples, and the vector pSB1 from Japan.
- Tobacco (EP 672 752) which contains: the virB and virG genes of the plasmid pTiBo542 present in the supervirulent strain A281 of Agrobacterium tumefaciens (ATCC 37349) and a homologous region found in the intermediate vector allowing this homologous recombination.
- the embryos are then placed on LSAs medium for 3 days in the dark and at 25 ° C.
- the second selection step is carried out by transfer of the embryos which have developed on LSD5 medium, on LSD10 medium (phosphinotricin at 10 mg / l) in the presence of cefotaxime, for 3 weeks under the same conditions as above.
- the third selection step consists in excising the type I calluses which remain white (fragments of 1 to 2 mm) and in transferring them 3 weeks in the dark and at 25 ° C on LSD 10 medium in the presence of cefotaxime.
- the regeneration of the seedlings is carried out by excising the type I calluses which have proliferated and by transferring them to LSZ medium in the presence of phosphinotricin at 5 mg / l and cefotaxime for 2 weeks at 22 ° C. and under continuous light.
- the plants which have regenerated are transferred to RM + G2 medium containing 100 mg / l of Augmentin for 2 weeks at 22 ° C. and under continuous illumination for the development stage.
- the plants obtained are then transferred to the phytotron for their acclimatization.
- Biochemical analyzes were carried out on maize seeds obtained after self-fertilization of heterozygous plants carrying the emb8516 mutation.
- the offspring is composed of seeds with wild phenotype, with embryo (either wild homozygotes, or heterozygotes) or with mutant phenotype without embryo (mutant homozygotes). These seeds were sorted manually (visual sorting according to the phenotype) to separate those with a mutant phenotype from those with a wild phenotype.
- EWERS starch (Ewers starch (2)): 3rd European Community directive with JOCE corrigendum of 11/27/80. Determination of starch, polarimetric method.
- amino acids amino acids
- HORSCH R.B Commercialization of genetically engineered crops. The production and uses of genetically transformed plants. Chapman 1 Hall LTD. London UK 19947, 99-103.
- ISHIDA ET AL. (1996), Nature Biotechnology, vol. 14: 745-750. • JEFFERSON, 1987, Plant Molecular Biology Reporter, vol.5: 387-405.
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Abstract
Il est fourni selon l'invention des séquences d'acides nucléiques et des polypeptides dont l'expression est essentielle pour le développement de l'embryon dans une graine de plante, et dont un déficit dans l'expression conduit à la production de graines affectées dans le développement du germe.
Description
Acides nucléiques codant pour un polypeptide ISUM2A et utilisation de ces acides nucléiques pour l'obtention de plantes transformées produisant des graines affectées dans le développement du germe
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine de l'amélioration des caractéristiques agronomiques des plantes, en vue de l'obtention de produits de transformation des plantes à caractéristiques améliorées pour l'industrie, tout particulièrement pour les industries agroalimentaires, par exemple pour la production d'amidon, d'huile végétale ou de semoule.
ETAT DE LA TECHNIQUE
De manière générale, il existe un besoin dans l'état de la technique d'améliorer les qualités agronomiques, alimentaires ou industrielles des graines, en particulier pour les industries de production d'amidon, d'huile végétale ou de semoule. L'embryon de la graine est le compartiment de la graine à partir duquel est extraite l'huile végétale. Il serait avantageux pour l'industrie d'obtenir des plantes dont les graines possèdent un embryon surdéveloppé riche en huile.
Inversement, des embryons sous-développés seraient particulièrement avantageux pour la production de semoule.
Il serait également avantageux pour l'industrie de l'amidon d'obtenir des plantes dont les graines sont dépourvues de germes, ces graines étant constituées essentiellement de l'albumen riche en amidon. De manière générale, il existe un besoin dans l'état de la technique pour l'isolement et la caractérisation de séquences régulatrices permettant l'expression spécifique d'un acide nucléique d'intérêt dans l'embryon et/ou l'albumen, et ceci de manière précoce
dans le cours du développement de la plante, afin de moduler les qualités agronomiques de la graine mature.
La production d'amidon pour de multiples applications industrielles atteint aujourd'hui environ 1 milliard de tonnes annuelles dans le monde. L'amidon représente une matière première qui est utilisée dans des industries aussi diverses que l'alimentation, la pharmacie, les industries du papier mais aussi dans le domaine microbiologique où il peut être mis en oeuvre en tant que substrat nutritif.
Classiquement, l'amidon est obtenu à partir des graines, de plantes céréalières de grande culture telles que le blé, le maïs et le sorgho.
Les graines sont essentiellement constituées d'un germe associé à l'albumen. L'amidon est entièrement contenu dans l'albumen, alors que le germe est riche en huile. Il en résulte que les procédés de préparation d'amidon utilisés dans l'industrie de l'amidonnerie comprennent obligatoirement une étape de séparation du germe, riche en huile, de l'albumen qui contient en abondance l'amidon constituant la
-matière-première d'intérêt • ---
Il serait donc particulièrement avantageux techniquement d'éliminer l'étape de séparation du germe de l'albumen dans les procédés de purification de l'amidon, ce qui permettrait de simplifier significativement ces procédés, et les rendre également plus rapides et moins coûteux .
Il existe aussi un besoin dans l'état de la technique d'améliorer les qualités agronomiques des grains utilisés dans les procédés de transformation de la partie vitreuse du grain de maïs (amande) en semoule. Le process de la mouture permet de séparer finement les différents constituants du grain en vue de satisfaire les exigences des utilisateurs. Il comprend notamment une étape de séchage qui doit être le plus doux possible pour éviter une migration des lipides du germe vers l'amande, ce qui est préjudiciable à la qualité ultérieure des semoules, et une étape de dégermage, réalisée par fragmentation, qui a pour but de séparer délicatement les germes pour éviter que les lipides qu'ils contiennent ne se retrouvent dans les semoules.
L'utilisation en industrie semoulière des grains à développement de germe affecté selon l'invention, présente donc un avantage certain puisqu'elle facilite le process industriel (gain en temps et en rendement) en éliminant cette 'contamination' de l'amande par les lipides du germe; de plus elle assure une bonne qualité et une bonne durée de vie des produits, celle-ci étant fonction du résiduel de matière grasse (<0.8% est une norme dans la profession pour les produits dits nobles: hominies, gritz, semoules et farines pour l'alimentation humaine).
Les semoules fabriquées sont ensuite utilisées presque exclusivement en alimentation humaine (bières, céréales petit déjeuner, biscuits apéritifs, polenta, tortilla, corn chips, farines alimentaires...).
A titre d'exemples, les grains selon l'invention peuvent être utilisés pour la fabrication de céréales pour petit-déjeuner ou 'corn flakes1, qui constituent un marché qui connaît depuis 15 ans une augmentation moyenne annuelle de l'ordre de 20%. Deux procédés sont classiquement utilisés: un procédé classique de laminage à partir des hominys (semoules les plus grosses parfaitement dégermées et calibrées) ou un procédé par cuisson-extrusion à partir des semoules de granulométrie spécifique. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, on peut obtenir des graines à gros embryons, recherchées dans l'industrie des huiles. L'huile de maïs est généralement destinée à l'alimentation humaine; elle est parfois utilisée par l'industrie pharmaceutique et cosmétique. Les tourteaux sont eux valorisés en alimentation animale soit directement, ou encore remélangés avec des 'corn-gluten feed'.
De nombreuses plantes portant des mutations affectant à la fois l'embryon et l'albumen de la graine sont connues dans l'état de la technique. Ces plantes mutantes sont classiquement désignées comme des mutants «dek » (pour « détective kernel »). En revanche, il existe très peu de mutants de maïs affectés d'un défaut dans le développement de l'embryon de la graine et laissant intact l'albumen.
Il s'agit essentiellement des plantes mutantes observées par Sheridan et al. (1993, 1995) et de celles décrites par Elster et al. (2000).
Toutefois, ces auteurs ne présentent aucun résultat de co-ségrégation de marqueurs génétiques avec le phénotype mutant.
Heckel et al. (1999) ont analysé cinq mutants de maïs affectés à différents stades du développement de l'embryon. Un premier groupe de mutants comprend des mutants produisant des structures pro-embryonnaires ressemblant à celles produites chez les plantes sauvages, mais les pro-embryons n'atteignent pas les stades de développement ultérieurs.
Dans le second groupe de mutants, les mutants emb*-8522 et emb*-8535 sont affectés d'un déficit complet dans la différenciation apicale-basale, alors que chez le mutant emb*-8516 les auteurs ont observé des structures ressemblant à l'embryon qui provenaient du suspenseur.
Une analyse de co-ségrégation des mutations emb*-8516 et emb*-8522 a permis à Heckel et al. de déterminer que le phénotype mutant co-ségrégeait avec la présence d'un transposon. Toutefois, la caractérisation moléculaire des différentes mutations n'a pas été décrite. En particulier, la mutation affectant la plante mutante emb*-8516 n'a pu être localisée sur aucun des chromosomes du maïs.
SOMMAIRE DE L'INVENTION
Il est fourni selon l'invention des séquences d'acides nucléiques et des polypeptides dont l'expression est essentielle pour le développement de l'embryon dans une graine de plante, et dont un déficit dans l'expression conduit à la production de graines affectées dans le développement du germe.
L'invention a pour objet un acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ISU 2A choisi parmi les séquences ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec les séquences SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6, ou pour un fragment d'un polypeptide ISUM2A, ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.
De préférence, l'acide nucléique codant pour le polypeptide ISUM2A, ou pour un fragment de ce polypeptide, comprend également
un polynucléotide régulateur capable de réguler la synthèse du polypeptide ISUM2A, le polynucléotide régulateur étant de préférence sensible à l'action d'un signal inducteur.
Le polynucléotide régulateur peut être indifféremment un polynucléotide répresseur de la transcription ou de la traduction ou au contraire un polynucléotide activateur de la transcription ou de la traduction.
L'invention est également relative à des procédés d'obtention d'une plante transformée capable de produire des graines à développement de germe affecté, ainsi que les parties d'une telle plante, notamment ses semences.
L'invention a également pour objet un produit de transformation d'une graine à développement du germe affecté produite par ladite plante transformée, de préférence un amidon. L'invention a encore pour objet le polypeptide ISUM2A, ou un fragment de ce polypeptide, codé par un acide nucléique tel que défini ci- dessus, ainsi que des anticorps dirigés contre le polypeptide ISUM2A.
L'invention a également trait à des procédés pour détecter la présence du polypeptide ISU 2A dans un échantillon et à des procédés pour détecter la présence d'un acide nucléique codant pour ce polypeptide dans un échantillon.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Selon l'invention, on a généré une population de 25.000 plantes fortement mutagénisées par l'insertion au hasard, dans leur génome, du transposon mυtator décrit par Bennetzen, J.L. P.S. Springer, A.D. Cresse, et M. Hendrickx (1993), Chandler, V.L. et K.J. Hardeman (1992). Les plantes ont été mises en culture avant analyse de leur ADN. Pour l'une des plantes mutantes, désignée G2422, il a été montré que l'insertion du transposon mutator était localisée dans le premier intron d'un gène particulier, ce gène ayant été désigné isum2A, à une distance de 3 pb du second exon de ce gène.
Sur une autre plante mutante, les inventeurs ont observé une co-ségrégation entre la présence d'un phénotype « graines sans germe » et l'insertion du transposon mutator dans le même gène isum2A.
Le gène isum2A, dont il est montré selon l'invention qu'il est nécessaire au développement normal de l'embryon de la graine, a ensuite été isolé et caractérisé en totalité.
Le gène isυm2A comprend trois exons et deux introns. Le cadre ouvert de lecture débute dans le premier exon et se termine dans le troisième exon de ce gène. Un produit partiel de transcription du gène isum2A a aussi été isolé et caractérisé et la structure d'une grande partie de la protéine ISUM2A a été déduite de l'ADNc correspondant au produit de transcription du gène.
Il a été montré selon l'invention que le gène isum2A était exprimé dans l'embryon et l'albumen 12 jours après pollinisation, ainsi que dans la feuille et la racine.
De plus, le demandeur a montré que l'insertion du transposon mυtator dans l'intron n°2 du gène a provoqué un blocage de l'expression du gène isum2A, puisque la présence de son produit de transcription n'était plus détectable dans un albumen d'une plante homozygote pour l'interruption du gène isum2A (isυm2A::Mu/isum2A::Mu).
On a ainsi montré selon l'invention que des plantes homozygotes pour une mutation dans le gène codant pour le polypeptide
ISUM2A produisaient des graines essentiellement constituées de l'albumen, et ayant un développement du germe affecté. Le germe est également appelé embryon.
Le demandeur a également montré que les semences qui représentent un quart des graines produites par des plantes hétérozygotes et dont les deux copies du gène isum2A comprennent une mutation ne permettaient pas l'obtention d'une plante viable et fertile.
Il a plus particulièrement été montré selon l'invention que les semences qui représentent un quart des graines produites par des plantes hétérozygotes pour l'allèle ou les allèles mutés conduisant à la mutation récessive du type « emb » ne permettraient pas l'obtention d'une plante viable et fertile.
Afin de remédier à cet inconvénient, il est aussi fourni selon l'invention des systèmes de complémentation permettant l'expression d'un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A fonctionnel dans des plantes dans lesquelles les deux allèles du gène isum2a sont mutés, ces systèmes de complémentation pouvant être rendus inductibles de manière à contrôler précisément dans le temps l'expression d'un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A.
Il est ainsi possible, grâce à l'invention, d'obtenir des plantes viables produisant des graines à développement affecté du germe, ces graines étant directement utilisables dans l'industrie sans étape de séparation de l'embryon, tout particulièrement dans l'industrie de l'amidonnerie, et dans l'industrie semoulière.
Selon un autre aspect, l'invention fournit aussi les moyens d'obtention de plantes produisant des graines affectées dans le développement du germe, dans lesquelles le germe est enrichi en huile du fait d'une expression précoce ou d'une surexpression du polypeptide
ISUM2A.
L'invention concerne des séquences nucléotidiques impliquées dans le développement de l'embryon et leur utilisation dans des constructions moléculaires destinées à améliorer la qualité agronomique, alimentaire, ou industrielle d'une plante, modulant notamment la taille de l'embryon et/ou son développement.
En effet, une action précoce et spécifique sur le développement des tissus de l'embryon et de l'albumen peut être recherchée : 1) Selon un premier mode de réalisation, il sera possible d'obtenir des graines ou fruits enrichis en huile (gros embryon), via l'utilisation de promoteurs dirigeant l'expression des acides nucléiques selon l'invention de façon précoce dans le développement de la graine et plus particulièrement au niveau du germe, ou de façon constitutive. 2) Selon un autre mode de réalisation, des albumens à développement de germe affecté pourraient également être obtenus selon ce modèle, pour des applications industrielles en amidonnerie et semoulerie. L'invention vise donc également des procédés pour modifier les qualités agronomiques et/ou nutritionnelles d'une plante, par une action ciblée et précoce sur le développement de l'embryon, utilisant la
transformation des plantes avec un vecteur selon l'invention. En particulier, elle s'intéresse à la modification de la taille et/ou du développement de l'embryon. Elle vise également l'altération du développement de l'embryon, en vue de produire des grains sans embryons pour les céréales notamment, présentant un intérêt pour les industries de l'amidonnerie et de la semoulerie.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'une cassette d'expression telle que définie précédemment, pour l'obtention d'une plante Angiosperme transgénique présentant des qualités agronomiques ou nutritionnelles améliorées.
De manière avantageuse, la plante transgénique obtenue peut produire des graines à teneurs en huile modifiées ou à développement de germe affecté en comparaison avec une plante non transformée. L'invention concerne également l'utilisation des plantes transgéniques obtenues selon l'invention, ou parties de ces plantes, notamment semences, grains et fruits pour la préparation de produits dérivés, notamment de produits alimentaires.
Font également partie de l'invention les produits obtenus, que ce soit des semences, farines de semences ou grains enrichis en huile ou des semences à développement de germe affecté, adaptés à l'industrie semoulière.
L'invention est aussi relative à toute composition pour l'alimentation humaine ou animale préparée à partir desdits produits obtenus.
Selon un autre aspect, l'invention est relative à l'utilisation des séquences et variants alleliques définis selon l'invention dans des programmes de sélection visant à produire des plantes à embryon modifié en taille et/ou développement influant sur le contenu en amidon/ huile. Ces séquences peuvent notamment être utilisées dans des expériences de cartographie et de co-localisation de QTLs pour la teneur en huile ou la taille de l'embryon pour définir les variants alleliques les plus intéressants pour une approche sélection, comprenant:
- le génotypage d'individus au moyen de sondes ou amorces nucléiques obtenues à partir des séquences et variants alleliques décrits selon l'invention;
- la sélection parmi ces individus des plantes qui comprennent une fréquence élevée d'allèles favorables associés à la taille et/ou au développement de l'embryon. ACIDES NUCLEIQUES DU GENE isum2A La séquence nucléotidique du gène isum2A comprend, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', (i) une séquence en amont non codante portant potentiellement des éléments régulateurs de la transcription et/ou de la traduction du gène, (ii) une séquence codante comprenant les trois exons et les deux introns du gène et (iii) une séquence non codante localisée en aval du dernier exon du gène.
La séquence du gène isum2A selon l'invention est référencée comme la séquence SEQ ID N°1 du listage de séquences.
Une analyse d'une population de plantes ayant le phénotype sauvage et produisant des graines contenant un embryon normal a permis d'identifier au moins deux variants du gène isum2A. Un des variants du gène est caractérisé par la substitution du nucléotide G localisé en position 2234 de la séquence SEQ ID N°1 par un nucléotide C. Cette substitution de nucléotide entraîne la substitution de l'acide aminé G (glycine) en position 89 de la séquence du polypeptide ISUM2A SEQ ID N°5 par un acide aminé R (Asparagine) qui est présent dans la séquence du polypeptide ISUM2A variant SEQ ID N°6.
Ainsi, un premier objet de l'invention consiste en un acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide
ISUM2A choisi parmi les séquences ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec les séquences SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6, ou pour un fragment d'un polypeptide ISUM2A.
L'invention concerne aussi un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique tel que défini ci-dessus.
Selon l'invention, toute technique classique de biologie moléculaire, de microbiologie et d'ADN recombinant connue de l'homme du métier peut être utilisée. De telles techniques sont décrites par exemple par SAMBROOK et al. (1989), GLOVER (1985), GAIT (1984),
HAMES et HIGGINS (1984), BERBAL (1984) et AUSUBEL ét al. (1994) .
De manière préférée, tout acide nucléique et tout polypeptide selon l'invention se présente sous une forme isolée ou purifiée.
Le terme " isolé " au sens de la présente invention désigne un matériel biologique qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement). Par exemple, un polynucléotide présent à l'état naturel dans une plante n'est pas isolé. Le même polynucléotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de la plante est isolé. Un tel polynucléotide peut être inclus dans un vecteur et/ou un tel polynucléotide peut être inclus dans une composition et demeurer néanmoins à l'état isolé du fait que le vecteur ou la composition ne constitue pas son environnement naturel.
Le terme " purifié " ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative.
Un polynucléotide ou un polypeptide est à l'état purifié après purification du matériel de départ ou du matériel naturel d'au moins un ordre de grandeur, de préférence 2 ou 3 et préférentiellement quatre ou cinq ordres de grandeur.
Aux fins de la présente description, l'expression " séquence nucléotidique " peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression " séquence nucléotidique " englobe le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.
Les termes " acide nucléique ", "polynucléotide ", " oligonucléotide " ou encore " séquence nucléotidique " englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple brin ou sous la forme de duplex.
Le terme " nucléotide " désigne à la fois les nucléotides naturels (A, T, G, C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (i) un analogue d'une purine, (ii) un analogue d'une pyrimidine, ou (iii) un sucre analogue, de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT N°WO 95/04064.
Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré comme étant " complémentaire " d'un second polynucléotide
lorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée. Les bases complémentaires sont A et T (ou A et U), et C et G.
Selon l'invention, un premier acide nucléique ayant au moins 95% d'identité avec un second acide nucléique de référence, possédera au moins 95%, de préférence au moins 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% ou 99,9% d'identité en nucléotides avec ce second polynucléotide de référence, le pourcentage d'identité entre deux séquences étant déterminé comme décrit ci-dessous.
Le " pourcentage d'identité " entre deux séquences de nucléotides ou d'acides aminés, au sens de la présente invention, peut être déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison. La partie de la séquence nucléotidique ou polypeptidique dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des " gaps ") par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal des deux séquences. Le pourcentage est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique ou un résidu d'aminoacide identique est observé pour les deux séquences (nucléique ou peptidique) comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux bases ou résidus d'aminoacides comparés, par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité de séquence.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus. De manière préférée, le pourcentage d'identité de séquences est déterminé à l'aide du logiciel BLAST (version BLAST 2.06 de Septembre 1998), en utilisant exclusivement les paramètres par défaut.
Un acide nucléique possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique selon l'invention englobe les " variants " d'un acide nucléique selon l'invention.
Par " variant " d'un acide nucléique selon l'invention, on entend un acide nucléique qui diffère de l'acide nucléique de référence par une ou plusieurs substitutions, additions ou délétions d'un nucléotide, par rapport à l'acide nucléique de référence. Un variant d'un acide nucléique selon l'invention peut être d'origine naturelle, tel qu'un variant allélique qui existe naturellement. Un tel acide nucléique variant peut être également un acide nucléique non naturel obtenu, par exemple, par des techniques de mutagenèse.
En général, les différences entre l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique " variant " sont réduites de telle sorte que l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique variant ont des séquences nuciéotidiques très similaires et, dans de nombreuses régions, identiques. Les modifications nuciéotidiques présentes dans un acide nucléique variant peuvent être silencieuses, ce qui signifie qu'elles n'affectent pas la séquence d'acides aminés qui peut être codée par cet acide nucléique variant.
Les modifications de nucléotides dans l'acide nucléique variant peuvent aussi résulter en des substitutions, additions ou délétions d'un ou plusieurs acides aminés dans la séquence du polypeptide qui peut être codé par cet acide nucléique variant.
De manière tout à fait préférée, un acide nucléique variant selon l'invention comportant une phase de lecture ouverte, code pour un polypeptide qui conserve la même fonction ou la même activité biologique que le polypeptide codé par l'acide nucléique de référence. De manière tout à fait préférée, un acide nucléique variant selon l'invention et qui comporte une phase de lecture ouverte, code pour un polypeptide qui conserve la capacité d'être reconnu par des anticorps dirigés contre le polypeptide codé par l'acide nucléique de référence.
Font partie des « variants » d'un acide nucléique codant le polypeptide ISUM2A les acides nucléiques des gènes orthologues à ISUM2 inclus dans le génome de plantes autres que le maïs, et possédant une identité en nucléotides d'au moins 95% avec un acide nucléique codant le polypeptide ISUM2A.
Par " fragment " d'un acide nucléique selon l'invention, on entend une séquence nucléotidique d'une longueur réduite par rapport à
l'acide nucléique de référence, le fragment d'acide nucléique possédant une séquence nucléotidique identique à la séquence nucléotidique de l'acide nucléique de référence sur la partie commune. De tels fragments d'un acide nucléique selon l'invention possèdent au moins 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 ou 3000 nucléotides consécutifs de l'acide nucléique de référence, la longueur maximale en nucléotides d'un fragment d'un acide nucléique selon l'invention étant bien entendu limitée par la longueur maximale en nucléotides de l'acide nucléique de référence. Par « fragment » d'un polypeptide ISU 2A selon l'invention, on entend un fragment polypeptidique d'une longueur réduite par rapport au polypeptide de référence, le fragment polypeptidique possédant une séquence en acides aminés identique à la séquence en acides aminés du polypeptide de référence sur la partie commune. De tels fragments d'un polypeptide ISUM2A selon l'invention possèdent au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 130, 135 ou 140 acides aminés consécutifs d'un polypeptide ISUM2A de référence.
ACIDES NUCLEIQUES GENOMIQUES isum2A
Comme indiqué ci-dessus, il a été caractérisé selon l'invention deux variants alleliques de l'acide nucléique génomique du gène isum2A, les deux acides nucléiques génomiques variants étant respectivement référencés comme les séquences nuciéotidiques SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2 du listage de séquences.
En conséquence, la présente invention a pour objet un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A, ou pour un fragment de ce polypeptide, ledit acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2, ou avec un fragment de l'une des séquences SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2.
Fait également partie de l'invention un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique tel que défini ci-dessus.
Un autre objet de l'invention est un acide nucléique consistant en un polynucléotide possédant au moins 95% d'identité en nucléotides
avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2, ou avec un fragment de l'une des séquences SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention est aussi relative à un acide nucléique comprenant au moins 12, de préférence au moins 15 et de manière tout à fait préférée au moins 20 nucléotides consécutifs de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, étant entendu qu'un tel acide nucléique englobe dans sa définition les « fragments » d'un acide nucléique selon l'invention tel que défini dans la présente description. Le gène isum2A, défini par la séquence SEQ ID N°1 comprend, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', respectivement : a) une séquence non codante portant potentiellement des éléments régulateurs de la transcription et/ou de la traduction de ce gène, localisée en amont du premier exon, du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 1812 de la séquence SEQ ID N°1; b) une région dite « codante » qui comprend les trois exons et les deux introns du gène isum2A, cette région codante étant localisée du nucléotide en position 1813 jusqu'au nucléotide en position 4074 de la séquence SEQ ID N°1 ; et c) une région non codante localisée en aval de la région codante, du nucléotide en position 4075 jusqu'au nucléotide en position 5620 de la séquence SEQ ID N°1.
La séquence SEQ ID N°2, qui illustre un variant du gène isum2A, ne contient pas la totalité du cadre ouvert de lecture codant pour un polypeptide ISU 2A. La séquence SEQ ID N°2 comprend une partie localisée du côté 3' de l'exon n°1 , ainsi que la totalité des exons n°2 et n°3. Le nucléotide en position 1 de la séquence SEQ ID N°2 correspond au nucléotide en position 2063 de la séquence SEQ ID N°1. Le nucléotide en position 2004 de la séquence SEQ ID N°2 correspond au nucléotide en position 4062 de la séquence SEQ ID N°1.
Toutefois, la connaissance de ia séquence SEQ iD N°2 par l'homme du métier, et sa comparaison avec la séquence SEQ ID N°1 , permet d'accéder directement à la totalité de la séquence codante du gène isum2A défini par la séquence SEQ ID N°2, par exemple en complétant les bases manquantes de l'exon n°1 de la séquence SEQ ID
N°2 par les bases correspondantes de l'exon n°1 de la séquence SEQ ID N°1, en se basant sur les correspondances données ci-dessus et également dans le tableau 1 ci-dessous.
De même, l'homme du métier peut obtenir l'acide nucléique du gène isum2A, par exemple en isolant, à partir des informations de la séquence SEQ ID N°1, les régions nuciéotidiques équivalentes ou encore en produisant un acide nucléique hybride, obtenu en fusionnant les acides nucléiques de séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°2, sur la base des correspondances données ci-dessus et également dans le tableau 1 ci-dessous.
Les caractéristiques structurales des trois introns et des deux exons du gène ISUM2A sont détaillées dans le tableau 1 ci-après.
TABLEAU 1 Séquences des exons du gène lsum2A
L'invention est également relative à un acide nucléique comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide exonique du gène lsum2A, tel que les polynucléotides 1 à 3 décrits dans le tableau 1 ci-dessus, qui sont inclus dans l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2.
Un tel acide nucléique code pour au moins une partie du polypeptide codé par le gène lsum2A et peut notamment être inséré dans un vecteur recombinant destiné à l'expression du produit de traduction correspondant dans une cellule hôte ou dans une plante transformée avec ce vecteur recombinant.
Un tel acide nucléique peut aussi être utilisé pour la synthèse de sondes et d'amorces nuciéotidiques destinées à la détection ou à l'amplification de séquences nuciéotidiques comprises dans le gène lsum2A dans un échantillon, le cas échéant de séquences du gène
lsum2A portant une ou plusieurs mutations, préférentiellement une ou plusieurs mutations de nature à modifier le phénotype d'une plante portant un tel gène lsum2A muté, en provoquant la production de graines affectées dans le développement du germe .
TABLEAU 2 Séquences des introns du gène lsum2A
L'invention est également relative à un acide nucléique comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide intronique du gène lsum2A, tel que les polynucléotides 1 et 2 décrits dans le tableau 2 ci-dessus, qui sont inclus dans l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2. Un tel acide nucléique peut être utilisé comme sonde ou amorce oligonucléotidique pour détecter la présence d'au moins une copie du gène lsum2A dans un échantillon, ou encore pour amplifier une séquence cible déterminée au sein du gène lsum2A
Un tel acide nucléique peut aussi être utilisé pour amplifier une séquence cible déterminée au sein du gène isum2A ou l'inhiber par une approche sens ou co-suppression, ou par l'utilisation d'ARN double brin (Wassenegger et al. 1996 ; Kooter et al. 1999) pour interférence. Un tel acide nucléique peut également être utilisé pour rechercher des variants alleliques fonctionnels du gène ISUM2, qui pourront être utilisés dans une méthode de sélection de plantes à embryon modifié en taille et/ou développement.
La région génomique du gène lsum2A essentiellement restreinte à la région dite " codante " comprenant les 3 exons et les 2 introns est définie comme la séquence débutant au nucléotide en position 1813 et se terminant au nucléotide en position 4074 de la séquence SEQ ID N°1.
Une partie de l'exon n°1 , la totalité des exons n°2 et 3 ainsi que les deux introns d'un .variant du gène isum2A sont compris dans la séquence allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 2004 de la séquence SEQ ID N°2. II est précisé que, sur leur région commune, les séquences
SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2 ont un pourcentage d'identité en nucléotides supérieur à 95%, ce pourcentage étant en fait supérieur à 99%.
L'invention a également pour objet un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique débutant au nucléotide en position 1813 et se terminant au nucléotide en position 4074 de la séquence SEQ ID N°1 ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention concerne aussi un acide nucléique possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique débutant au nucléotide en position 1813 et se terminant au nucléotide en position 4074 de la séquence SEQ ID N°1 , ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention a encore pour objet un acide nucléique comprenant la séquence nucléotidique débutant au nucléotide en position 1813 et se terminant au nucléotide en position 4074 de la séquence SEQ ID N°1 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention a également trait à un acide nucléique consistant en la séquence nucléotidique débutant au nucléotide en position 1813 et se terminant au nucléotide en position 4074 de la séquence SEQ ID N°1 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Un autre objet de l'invention consiste en un acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend l'une des séquences nuciéotidiques suivantes: a) la séquence allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 1812 de la séquence SEQ ID N°1 , ou un acide nucléique de séquence complémentaire; b) la séquence allant du nucléotide en position 1813 jusqu'au nucléotide en position 2099 de la séquence SEQ ID N°1 , ou un acide nucléique de séquence complémentaire;
c) la séquence allant du nucléotide en position 2100 jusqu'au nucléotide en position 2206 de la séquence SEQ ID N°1 , ou un acide nucléique de séquence complémentaire; d) la séquence allant du nucléotide en position 2207 jusqu'au nucléotide en position 2323 de la séquence SEQ ID N°1 , ou un acide nucléique de séquence complémentaire; e) la séquence allant du nucléotide en position 2324 jusqu'au nucléotide en position 3645 de la séquence SEQ ID N°1 , ou un acide nucléique de séquence complémentaire; f) la séquence allant du nucléotide en position 3646 jusqu'au nucléotide en position 4074 de la séquence SEQ ID N°1 , ou un acide nucléique de séquence complémentaire; et g) la séquence allant du nucléotide en position 4075 jusqu'au nucléotide en position 5620 de la séquence SEQ ID N°1 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 est représenté à la figure 1 , dans laquelle sont également détaillées les positions des différents exons et introns du gène lsum2A.
PRODUITS DE TRANSCRIPTION DU GENE lsum2A
Il a été montré selon l'invention que le gène lsum2A est transcrit sous la forme d'un ARN messager. Cet ARN messager comporte un cadre de lecture ouvert codant pour la protéine ISUM2A La partie de l'ADNc du gène lsum2A comprenant le cadre de lecture ouvert codant pour le polypeptide ISUM2A de séquence SEQ ID N° 5 a une longueur de 833 nucléotides et est référencé comme la séquence SEQ ID N°3 du listage de séquences. L'ADNc de séquence SEQ ID N°3 dérive du variant de plante sauvage désigné HD5xHD7. Cet ADNc est représenté sur la Figure 2.
La partie de l'ADNc du gène lsum2A comprenant une partie du cadre de lecture ouvert codant pour le polypeptide ISUM2A de séquence SEQ ID N° 6 a une longueur de 621 nucléotides et est référencé comme la séquence SEQ ID N°4 du listage de séquences. L'ADNc de séquence
SEQ ID N°4 dérive du variant de plante sauvage désigné A188. Cet ADNc partiel est représenté sur la Figure 3.
Les acides nucléiques de séquences SEQ ID N°3 et SEQ ID N°4 présentent des similarités avec une séquence d'EST référencée dans la base de données GENBANK sous le numéro d'accès AI001298 et désignée « ISUM2 ». C'est la raison pour laquelle il a été attribué la désignation « isum2A » au gène nouvellement découvert selon l'invention.
La séquence de l'EST N°AI001298 possède un degré d'identité en nucléotides de 94% et 95% avec les séquences SEQ ID N°3 et SEQ ID N°4, respectivement. Aucun cadre de lecture ouvert n'est décrit pour cet EST.
Les acides nucléiques de séquences SEQ ID N°3 et SEQ ID N°4 présentent aussi des similarités avec une séquence d'EST référencée dans la base de données GENBANK sous le numéro d'accès AI374506. Cette séquence a été obtenue à partir du même clone « EST6-D3 » que la séquence AI 001298. La séquence de l'EST n°AI374506 possède un degré d'identité en nucléotides de 92% et 98% avec les séquences SEQ ID N°3 et SEQ ID N°4, respectivement. Aucun cadre de lecture ouvert n'est décrit pour cet EST.
Un autre objet de l'invention consiste en un acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A et possédant au moins 99% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à ces acides nucléiques.
L'invention est aussi relative à un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A et possédant au moins 99% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ou un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à ces acides nucléiques.
L'invention a encore pour objet un acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend la séquence nucléotidique SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Fait également partie de l'invention un acide nucléique constitué de la séquence nucléotidique SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Le gène lsum2A code pour un polypeptide de 143 acides aminés de longueur dont deux variants alleliques ont été identifiés selon l'invention, respectivement les polypeptides variants de séquence SEQ
ID N°5 et SEQ ID N°6, qui possèdent entre eux un degré d'identité de plus de 99%.
En conséquence, l'invention est également relative à un acide nucléique codant pour un polypeptide possédant au moins 95% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6.
L'invention a également trait à un acide nucléique caractérisé en ce qu'il code pour le polypeptide de séquence SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6. Fait également partie de l'invention un acide nucléique codant pour un " fragment " d'un polypeptide possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec un polypeptide de séquence en acides aminés SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6.
L'invention concerne aussi un acide nucléique codant pour un fragment d'un polypeptide de séquence en acides aminés SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6.
Un polypeptide ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec un polypeptide de référence comprend au moins 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% ou 99,9% d'identité en acides aminés avec le polypeptide de référence.
Sont englobés dans la définition d'un polypeptide ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec un polypeptide de référence selon l'invention, les polypeptides dits " variants ". Par " variant " d'un polypeptide selon l'invention, on entend un polypeptide dont la séquence en acides aminés comprend une ou plusieurs substitutions, additions ou délétions d'au moins un résidu d'acide aminé, par rapport à la séquence d'acides aminés du polypeptide de référence, étant entendu que les substitutions d'acides aminés peuvent être de nature conservative ou non conservative.
Un variant d'un polypeptide de référence selon l'invention consiste en un polypeptide qui conserve la fonction ou l'activité biologique du polypeptide de référence et/ou qui est reconnu par des anticorps dirigés contre le polypeptide de référence. Ces variants polypeptidiques peuvent résulter de variations alleliques caractérisées par des différences dans les séquences nuciéotidiques du gène codant pour ces polypeptides. De tels variants polypeptides peuvent aussi résulter d'épissages alternatifs ou de modifications post-traductionnelles.
Par " fragment " d'un polypeptide de référence selon l'invention, on entend un polypeptide possédant au moins 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 135 ou 140 acides aminés consécutifs d'un polypeptide tel que défini dans la présente description.
SONDES ET AMORCES SELON L'INVENTION
Les acides nucléiques selon l'invention, et en particulier les séquences nuciéotidiques SEQ ID N°1 à SEQ ID N°4, leurs fragments d'au moins 12 nucléotides, les séquences ayant au moins 95% d'identité en nucléotides avec au moins une partie des séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°4, ainsi que les acides nucléiques de séquence complémentaire, sont utiles pour la détection de la présence d'au moins une copie d'une séquence nucléotidique du gène lsum2A ou encore d'un fragment ou d'un variant allélique de cette dernière dans un échantillon.
Font également partie de l'invention les sondes et amorces nuciéotidiques hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°4.
Les conditions d'hybridation ci-dessous sont mises en œuvre pour l'hybridation d'un acide nucléique, sonde ou amorce, de 20 bases de longueur.
Le niveau et la spécificité d'hybridation dépend de différents paramètres, tels que : a) la pureté de la préparation de l'acide nucléique sur lequel la sonde ou l'amorce doit s'hybrider ;
b) la composition en bases de la sonde ou de l'amorce, les paires de base G-C possédant une plus grande stabilité thermique que les paires de bases A-T ou A-U ; c) la longueur de la séquence de bases homologues entre la sonde ou l'amorce et l'acide nucléique ; d) la force ionique : le taux d'hybridation augmente avec l'accroissement de la force ionique et la durée du temps d'incubation ; e) la température d'incubation ; f) la concentration de l'acide nucléique sur lequel la sonde ou l'amorce doit s'hybrider ; g) la présence d'agents dénaturants tels que des agents favorisant la rupture des liaisons hydrogène, comme le formamide ou l'urée, qui accroissent la stringence de l'hybridation ; h) le temps d'incubation, le taux d'hybridation augmentant avec la durée de l'incubation ; i) la présence d'agents d'exclusion de volume, tels que le dextran ou le sulfate de dextran, qui augmentent le taux d'hybridation du fait qu'ils accroissent les concentrations effectives de la sonde ou l'amorce et de l'acide nucléique qui doit s'hybrider, au sein de la préparation.
Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm).
Pour les séquences comprenant plus de 360 bases, Tm est définie par la relation:
Tm= 81,5 + 0,41 (%G+C)+16,6 Log(concentration en cations) - 0,63 (% formamide)-(600/nombre de bases) (SAMBROOK et al., (1989), pages 9.54-9.62).
Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation: Tm= 4(G+C) + 2(A+T).
Dans des conditions de stringence appropriées, dans lesquelles les séquences aspécifiques n'hybrident pas, la température d'hybridation est approximativement de 5 à 30°C, de préférence de 5 à 10°C en- dessous de Tm.
Par « conditions d'hybridation de forte stringence » selon l'invention, on entend des conditions d'hybridation telles que l'on se place à une température d'hybridation de 5°C au-dessous du Tm.
Les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être adaptées en fonction de la longueur et de la composition en bases de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon les techniques connues de l'homme du métier.
Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de H AMES et HIGGINS (1985) ou encore dans l'ouvrage de AUSUBEL et al. (1989).
A titre illustratif, les conditions d'hybridation utilisées pour un acide nucléique de 200 bases de longueur sont les suivantes : Préhybridation: mêmes conditions que pour l'hybridation durée: 1 nuit.
Hybridation:
5 x SSPE (0.9 M NaCI, 50 mM phosphate de sodium pH 7.7, 5 mM EDTA) 5 x Denhardt's (0.2% PVP, 0.2% Ficoll, 0.2% SAB)
100 μg/ml ADN de sperme de saumon
0.1% SDS durée: 1 nuit. Lavages: 2 x SSC, 0.1% SDS 10 min 65°C
1 x SSC, 0.1 % SDS 10 min 65°C
0.5 x SSC, 0.1 % SDS 10 min 65°C
0.1 x SSC, 0.1% SDS 10 min 65°C.
Les sondes ou les amorces nuciéotidiques selon l'invention comprennent au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, en particulier d'un acide nucléique de séquences SEQ ID N°1 à 4 ou de sa séquence complémentaire, d'un acide nucléique ayant 95% d'identité en nucléotides avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N°1 à 4 ou . de sa séquence complémentaire ou
encore d'un acide nucléique hybridant dans des conditions d'hybridation de forte stringence avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N°1 à 4 ou de sa séquence complémentaire.
De préférence, des sondes ou amorces nuciéotidiques selon Tinvention auront une longueur d'au moins 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 ou 3000 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention.
Alternativement, une sonde ou une amorce nucléotidique selon l'invention consistera et/ou comprendra les fragments d'une longueur de 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 ou 3000 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention.
Des exemples d'amorces et de couples d'amorces permettant d'amplifier un fragment d'acide nucléique du gène lsum2A de séquence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2 sont par exemple les amorces SEQ ID N°10 à 13 et 17 à 23.
L'utilisation des amorces de séquences SEQ ID N°10 à 13 et 17 à 23 dans des réactions d'amplification est décrite dans les exemples.
Une amorce ou une sonde nucléotidique selon l'invention peut être préparée par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon des techniques telles que la méthode au phosphodiester de NARANG et al. (1979) ou de BROWN et al. (1979), la méthode au diéthylphosphoramidites de BEAUCAGE et al. (1980) ou encore la technique sur support solide décrite dans le brevet européen n°EP 0 707 592. Chacun des acides nucléiques selon l'invention, y compris les sondes et amorces oligonucléotidiques décrites ci-dessus, peut être marqué, si désiré, en incorporant une molécule détectable, c'est-à-dire un marqueur détectable, par des moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou encore chimiques.
Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des isotopes radioactifs (32P 3H, 35S), des molécules fluorescentes (5- bromodéoxyuridine, fluorescéine, acétylaminofluorène) ou encore des ligands tels que la biotine.
Le marquage des sondes est fait de préférence par incorporation de molécules marquées au sein des polynucléotides par extension d'amorces, ou bien par rajout sur les extrémités 5' ou 3'.
Des exemples de marquage non radioactif de fragments d'acides nucléiques sont décrits notamment dans le brevet français n°FR 78 10 975 ou encore dans les articles de URDEA et al. (1988) ou SANCHEZ PESCADOR et al. (1988).
De manière avantageuse, les sondes selon l'invention peuvent avoir des caractéristiques structurelles de nature à permettre une amplification du signal, telles que les sondes décrites par URDEA et al; (1991 ) ou encore dans le brevet européen n°EP 0 225 807 (Chiron).
Les sondes oligonucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées notamment dans des hybridations de type Southern à l'ADN génomique du gène lsum2A ou encore dans des hybridations à TARN messager de ce gène lorsque l'expression du transcrit correspondant est recherchée dans un échantillon.
Les sondes selon l'invention peuvent aussi être utilisées pour la détection de produits d'amplification PCR ou encore pour la détection de mésappariements. Des sondes ou amorces nuciéotidiques selon l'invention peuvent être immobilisées sur un support solide. De tels supports solides sont bien connus de l'homme du métier et comprennent des surfaces des puits de plaques de micro-titration, des billes de polystyrène, des billes magnétiques, des bandes de nitrocellulose ou encore des microparticules telles que des particules de latex.
En conséquence, l'invention a encore pour objet un acide nucléique utilisable en tant que sonde ou amorce nucléotidique caractérisé en ce qu'il comprend au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus, en particulier d'un acide nucléique de séquences nuciéotidiques SEQ ID N°1 à SEQ ID N°4.
L'invention est également relative à un acide nucléique utilisable en tant que sonde ou amorce nucléotidique caractérisé en ce qu'il consiste en un polynucléotide d'au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, de manière tout à fait préférée d'un
acide nucléique de séquences choisies parmi les séquences nuciéotidiques SEQ ID N°1 à SEQ ID N°4.
Comme décrit ci-dessus, un tel acide nucléique peut en outre être caractérisé en ce qu'il est marqué par une molécule détectable. Un acide nucléique utilisable en tant que sonde ou amorce nucléotidique pour la détection ou l'amplification d'une séquence génomique, de l'ARNm ou de l'ADNc du gène lsum2A peut en outre être caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les séquences suivantes : a) les séquences nuciéotidiques hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique de séquence
SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2; et b) les séquences comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2. La présente invention concerne également un procédé de détection de la présence d'un acide nucléique du gène lsum2A dans un échantillon, ladite méthode comprenant les étapes de :
1) mettre en contact une sonde ou une pluralité de sondes nuciéotidiques selon l'invention avec l'échantillon à tester ; 2) détecter le complexe éventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.
Selon un mode de réalisation particulier du procédé de détection selon l'invention, la ou les sondes oligonucléotidiques sont immobilisées sur un support. Selon un autre aspect, les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.
L'invention concerne en outre un nécessaire ou kit pour la détection de la présence d'un acide nucléique selon l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant: a) une ou plusieurs sondes nuciéotidiques telles que décrites ci- dessus ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'hybridation.
Selon un premier aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support.
Selon un second aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.
Selon un mode de réalisation particulier du kit de détection décrit ci-dessus, un tel kit comprendra une pluralité de sondes oligonucléotidiques conformes à l'invention qui vont être utilisées pour détecter des séquences cibles d'intérêt du gène lsum2A ou alternativement détecter des mutations dans les régions codantes ou les régions non codantes du gène lsum2A, plus particulièrement des acides nucléiques de séquence SEQ ID N°1 à SEQ ID N°4 ou les acides nucléiques de séquence complémentaire.
On entend par " séquence cible " au sens de l'invention, une séquence nucléotidique comprise dans un acide nucléique, ladite séquence nucléotidique hybridant, dans les conditions d'hybridation spécifiées dans la description, avec une sonde ou une amorce nucléotidique de l'invention.
Une séquence cible peut être par exemple une séquence comprise dans un acide nucléique régulateur du gène lsum2A ou encore une séquence comprise dans une région codante génomique ou de l'ADNc de ce gène.
Les amorces nuciéotidiques selon l'invention peuvent être utilisées pour amplifier un fragment nucléotidique quelconque (ADNg,
ADNc, ARNm) du gène lsum2A, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 à SEQ ID N°4, ou encore un fragment ou un variant de ces séquences.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 à SEQ
ID N°4 ou un fragment ou un variant allélique de celui-ci contenu dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de : a) mettre en contact l'échantillon dans lequel la présence de l'acide nucléique cible est suspectée avec une paire d'amorces nuciéotidiques dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de la région de l'acide nucléique cible du gène
lsum2A dont l'amplification est recherchée, en présence des réactifs nécessaires à la réaction d'amplification ; et b) détection de l'acide nucléique éventuellement amplifié.
Pour mettre en oeuvre le procédé d'amplification tel que défini ci-dessus, on aura avantageusement recours à l'une quelconque des amorces nuciéotidiques décrites ci-après.
L'invention a en outre pour objet un nécessaire ou kit pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ ID N°1 à 4, ledit nécessaire ou kit comprenant : a) un couple d'amorces nuciéotidiques conforme à l'invention, dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de l'acide nucléique cible du gène lsum2A dont l'amplification est recherchée ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification.
Un tel nécessaire ou kit d'amplification comprendra avantageusement au moins une paire d'amorces nuciéotidiques telle que décrite ci-dessus. Selon un mode de réalisation préféré, des amorces selon l'invention comprennent tout ou partie d'un polynucléotide choisi parmi les séquences nuciéotidiques SEQ ID N°10 à 13 et 17 à 23. CONSTRUCTIONS D'ACIDE NUCLEIQUE SELON L'INVENTION
L'isolement et la caractérisation du gène isum2A selon l'invention et la démonstration de la nécessité de l'expression du gène isum2A à un niveau détectable dans la plante pour obtenir un développement normal de l'embryon de la graine, après pollinisation, ont permis aux inventeurs de réaliser des constructions d'acide nucléique permettant l'expression d'au moins une copie fonctionnelle du gène isum2A dans un hôte cellulaire, particulièrement dans une cellule de plante transformée avec de telles constructions d'acide nucléique.
De préférence, ladite cellule porte au moins un allèle isum2A non fonctionnel. De manière tout à fait préférée, ladite cellule porte les deux allèles isum2A non fonctionnels.
Il a été mis au point selon l'invention des constructions d'acide nucléique permettant l'obtention d'une expression contrôlée d'au moins une copie fonctionnelle d'un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A dans un hôte cellulaire, particulièrement dans une cellule de plante.
En conséquence, l'invention a également pour objet un acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A tel que défini dans la présente description, ou pour un fragment de ce polypeptide, ledit acide nucléique comprenant de plus un polynucléotide régulateur capable de réguler la transcription ou la traduction du polynucléotide codant pour le polypeptide ISUM2A, ou le fragment de ce polypeptide.
Fait également partie de l'invention l'acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique tel que défini ci-dessus. Une construction d'acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A ainsi qu'un polynucléotide régulateur est également désignée « cassette d'expression » dans la présente description. De manière générale, une cassette d'expression selon l'invention comprendra au moins un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A, les autres éléments fonctionnels permettant l'expression du polypeptide ISUM2A pouvant être portés par un vecteur dans lequel la cassette d'expression peut être insérée.
Une cassette d'expression selon l'invention peut aussi contenir, de manière non limitative, outre un polynucléotide régulateur, également d'autres éléments fonctionnels tels que des séquences leader ou une séquence terminateur ou encore des séquences d'initiation et d'arrêt de la transcription.
Selon un autre mode de réalisation d'une construction d'acides nucléiques de l'invention, on utilise des promoteurs. connus pour diriger l'expression de la séquence d'acide nucléique fusionnée de façon constitutive ou tissu spécifique (graine) ou stade développement. A titre d'exemple, on peut citer: a) des promoteurs constitutifs:
- le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur, ou le promoteur 19S ou avantageusement le promoteur constitutif double 35S (pd35S), décrits dans l'article de Kay et al., 1987 ;
- le promoteur actine du riz suivi de l'intron actine de riz (pAR- IAR) contenu dans le plasmide pAct1-F4 décrit par Me Elroy et al., 1991 ;
- le promoteur constitutif EF-1α du gène codant pour le facteur d'élongation végétale décrit dans la demande PCT n°WO 90/02172 ou encore dans l'article de AXELOS et al. (1989) ; - le superpromoteur chimérique PSP (NI et al., 1995) constitué de la fusion de trois copies de l'élément d'activité transcriptionnelle du promoteur du gène de la octopin synthase de Agrobacterium tumefaciens et de l'élément d'activation de la transcription du promoteur du gène de la mannopin synthase de Agrobacterium tumefaciens ; et
- le promoteur ubiquitine du tournesol (BINET et al., 1991) ;
- le promoteur de l'ubiquitine 1 de maïs (CHRISTENSEN et al., 1996).
- le promoteur de l'ubiquitine 1 de maïs (Christensen et al., 1996) b) des promoteurs spécifiques:
- des promoteurs spécifiques des graines (Datla, R. et al., 1997), notamment les promoteurs de la napine (EP 255 378), de la phaseoline (Riggs et al., 1989)., de la glutenine, de l'héliantinine (WO 92/17580), de l'albumine (WO 98/45460), de l'oléosine (WO 98/45461 ), de IΑTS1 ou de IΑTS3 (WO 99/20775).
- des promoteurs Esr tels que décrits dans la demande PCT/FR00/02596 qui permettent une expression à la fois spécifique à l'interface entre l'embryon et l'albumen et précoce au cours du développement de l'albumen. - le promoteur du gène Vp1 décrit par Me Carty et al. (1989).
Les acides nucléiques régulateurs ci-dessus peuvent être utilisés pour surexprimer le polynucléotide codant pour le polypeptide ISUM2A ou encore un fragment du polypeptide ISUM2A, en particulier lorsque l'obtention de plantes possédant des graines à gros embryons riches en huile est recherchée.
Ainsi, l'invention concerne aussi un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A ou pour un fragment d'un polypeptide ISUM2A tel que défini ci-dessus et comprenant un polynucléotide régulateur régulant la transcription et/ou la traduction de la séquence codante, dans lequel le polynucléotide régulateur permet un haut niveau de transcription de l'ARNm correspondant et/ou un haut niveau de traduction du polypeptide correspondant dans l'organisme hôte, y compris cellule hôte ou plante, dans lequel il est exprimé.
L'invention est également relative à l'utilisation d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus, d'un vecteur recombinant comprenant cet acide nucléique ou encore d'une cellule hôte transfectée ou transformée avec cet acide nucléique pour l'obtention d'une plante transformée susceptible de produire des graines riches en huile.
Dans un mode de réalisation préférée, on recherche une expression contrôlée du polynucléotide codant pour le polypeptide ISUM2A, tout particulièrement lorsque la production de graines à développement de germe affecté est recherchée.
Comme indiqué précédemment, un défaut dans l'expression du gène isum2A provoque la production de graines sans germe, ces graines n'étant pas fertiles et ne permettant pas la multiplication des plantes mutées dans le gène isum2A.
De plus, l'expression du gène isum2A semble nécessaire à une croissance normale de la plante avant la pollinisation.
La pollinisation est le moment où le pollen mature entre en contact avec une soie réceptive.
Il en résulte que l'obtention d'une production de graines à développement de germe affecté par une plante implique : a) une expression normale d'au moins une copie fonctionnelle d'un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A depuis le stade de germination de la graine jusqu'à la pollinisation de la plante ; et b) une absence de la transcription ou de la traduction de cet acide nucléique dès la pollinisation de la plante, afin de produire des graines affectées dans le développement du germe.
L'absence de transcription ou de traduction de l'acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A dès le stade de la pollinisation
affecte ou bloque le développement de l'embryon de la graine afin d'aboutir à l'objectif recherché.
Lorsqu'on cherchera à reproduire et multiplier les plantes d'intérêt, et que la production de graines normales et fertiles sera recherchée, l'expression normale du polypeptide ISUM2A sera poursuivie pendant tout le développement de la plante, y compris après la pollinisation.
Pour poursuivre l'objectif de l'invention, il est donc particulièrement avantageux d'utiliser des constructions d'acides nucléiques dans lesquelles le polynucléotide codant pour un polypeptide
ISUM2A est placé sous le contrôle d'un polynucléotide régulateur dont l'activité peut être contrôlée dans le temps.
L'invention est donc également relative à un acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A choisi parmi les séquences ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec les séquences SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6 et qui comprend aussi un polynucléotide régulateur sensible à l'action, directe ou indirecte, d'un signal inducteur, aussi désigné polynucléotide régulateur inductible. Selon un premier aspect, le polynucléotide régulateur est un polynucléotide « répresseur » de la transcription ou de la traduction.
Par polynucléotide régulateur « répresseur », on entend selon l'invention une séquence régulatrice dont l'activité constitutive peut être bloquée par un signal externe. Un tel signal externe peut être l'absence de fixation d'un facteur de transcription reconnu par le polynucléotide régulateur répresseur. L'absence de fixation du facteur de transcription peut être induite sous l'effet du signal inducteur répresseur auquel le polynucléotide régulateur répresseur est sensible.
Selon ce premier mode de réalisation particulier, l'expression de la séquence codant pour un polypeptide ISUM2A est constitutive dans l'hôte cellulaire choisi, en l'absence du signal inducteur répresseur auquel le polynucléotide régulateur répresseur est directement ou indirectement sensible.
La mise en contact de l'hôte cellulaire avec le signal inducteur répresseur a pour effet, grâce à une action directe ou indirecte sur le
polynucléotide régulateur répresseur, d'inhiber et/ou de bloquer l'expression du polynucléotide codant pour le polypeptide ISUM2A.
Pour réaliser les constructions d'ADN selon l'invention comprenant un polynucléotide régulateur répresseur, l'homme du métier aura recours à ses connaissances générales techniques dans le domaine de l'expression de gènes chez les végétaux.
Selon un second mode de réalisation d'une construction d'acide nucléique de l'invention, le polynucléotide régulateur est un polynucléotide activateur de la transcription ou de la traduction. De manière tout à fait préférée, le polynucléotide régulateur activateur de la transcription ou de la traduction est sensible, directement ou indirectement, à l'action d'un signal inducteur activateur. Il s'agit alors d'un polynucléotide « activateur inductible » au sens de l'invention.
Selon l'invention, un polynucléotide régulateur du type « activateur inductible » est une séquence régulatrice qui n'est activée qu'en présence d'un signal externe. Un tel signal externe peut être la fixation d'un facteur de transcription, la fixation d'un facteur de transcription pouvant être induite sous l'effet du signal inducteur activateur auquel le polynucléotide régulateur est directement ou indirectement sensible.
Lorsqu'une telle construction d'acides nucléiques est utilisée dans un hôte cellulaire, l'expression du polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A selon l'invention peut être induite en mettant en contact l'hôte cellulaire transformé avec le signal inducteur activateur auquel le polynucléotide régulateur activateur est, directement ou indirectement, sensible.
Lorsque l'on recherche l'absence d'expression du polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A chez cet hôte cellulaire transformé, il suffit alors d'éliminer ou supprimer la présence du signal inducteur activateur auquel le polynucléotide régulateur de la transcription ou de la traduction est sensible.
L'homme du métier aura recours à ses connaissances générales techniques dans le domaine des polynucléotides régulateurs, en particulier ceux actifs chez les végétaux, pour définir les constructions répondant à la définition du second mode de réalisation ci-dessus.
Pour les besoins d'une bonne clarté dans l'exposé des caractéristiques des constructions nuciéotidiques qui sont préférentiellement utilisées pour l'obtention d'une production de graines sans germe, plusieurs systèmes inductibles et contrôlables de l'expression d'un polypeptide ISUM2A dans des plantes sont définis ci- après. Les caractéristiques générales de systèmes d'expression appropriés sont tout d'abord résumés dans le Tableau 3 ci-dessous, puis leurs aspects fonctionnels sont ensuite détaillés.
Tableau 3 : Exemples de systèmes d'expression inductibles de ISUM2A.
a isum 2A7isum2A": homozygote pour une copie non fonctionnelle du gène isum2A, par exemple une mutation. blsum 2A+/lsum2A+: homozygote portant deux copies fonctionnelles du gène isum2A.
Description du système d'expression inductible I du tableau 3
Le système d'expression inductible I du tableau 3 constitue une illustration d'une construction d'acides nucléiques dans laquelle le
polynucléotide régulateur est un polynucléotide « activateur inductible » de la transcription et/ou de la traduction, selon le second mode de réalisation défini précédemment.
Le système d'expression I comprend: (i) une première cassette d'expression comprenant un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A placé sous le contrôle d'un promoteur dont l'activité est induite uniquement en présence d'un composé activateur, lorsque ce composé activateur, en général un facteur de transcription, est lié à un composé inducteur. (ii) une seconde cassette d'expression comprenant un acide nucléique codant pour le composé activateur, par exemple le facteur de transcription ci-dessus, placé sous le contrôle d'un promoteur permettant l'expression constitutive du composé activateur.
Selon le système I, la transcription ou la traduction de la séquence codant pour un polypeptide ISUM2A est induite uniquement lorsque le composé activateur est complexé au composé inducteur. Le complexe entre le composé activateur et le composé inducteur se fixe sur le promoteur contrôlant l'expression de l'acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A, et active l'expression de ce dernier. Un exemple du système I est illustré à l'exemple 3, dans lequel, le système comprend:
(i) un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A placé sous le contrôle d'un promoteur contenant la séquence UAS, qui est reconnue par le composé activateur GVG. Le composé activateur GVG est une protéine de fusion entre le domaine de liaison à l'ADN de la protéine GAL4, le domaine activateur du gène VP16 et le récepteur au glucocorticoïde du rat (GR).
(ii) un acide nucléique codant pour la protéine de fusion GVG définie ci-dessus, qui est placé sous le contrôle d'un promoteur constitutif.
Dans l'exemple 3, la protéine de fusion GVG est exprimée constitutivement dans la plante, mais n'active pas le promoteur contrôlant l'expression du polypeptide ISUM2A, en l'absence de glucocorticoïde.
En revanche, lorsque la plante est mise en présence du composé inducteur représenté par un glucocorticoïde, le glucocorticoïde se fixe sur la protéine de fusion GVG, et le complexe ainsi formé entre le composé inducteur activateur (glucocorticoïde) et le composé activateur (la protéine de fusion GVG) va se fixer sur la séquence UAS du promoteur contrôlant l'expression d'un polypeptide ISUM2A, ce qui active le promoteur contenant la séquence UAS et induit la synthèse du polypeptide ISUM2A.
Dans le système d'expression inductible ci-dessus, le glucocorticoïde constitue le composé inducteur.
Le signal inducteur activateur est la fixation du complexe composé activateur/composé inducteur (polypeptide de fusion GVG/glucocorticoïde) sur le polynucléotide régulateur activateur (promoteur contenant la séquence UAS). On utilisera le système d'expression I préférentiellement dans un hôte cellulaire végétal ou dans une plante dont les deux copies du gène isum2A sont non fonctionnelles, par exemple dont les deux copies du gène isum2A sont mutées.
Système d'expression inductible II du tableau 3.
Le système d'expression inductible II est une illustration du mode de réalisation d'une construction d'acides nucléiques selon l'invention, selon le premier mode de réalisation exposé précédemment, dans lequel le polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A est placé sous le contrôle d'un polynucléotide régulateur « répresseur ».
Dans le système II selon le tableau 3, le système d'expression contient deux cassettes d'expression, respectivement:
(i) une première cassette d'expression comprenant un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A, placé sous le contrôle d'une région régulatrice dont l'activité est constitutive parce qu'elle est induite en présence d'un composé activateur produit de manière constitutive;
(ii) une seconde cassette d'expression comprenant un acide nucléique codant pour le composé activateur actif sur la région régulatrice de la cassette d'expression (i) ci-dessus, ledit acide nucléique
codant pour le composé activateur étant placé sous le contrôle d'un promoteur constitutif, préférentiellement un promoteur constitutif fort, ou encore un promoteur actif spécifiquement dans les cellules de l'embryon de la graine. Dans le système II, le composé activateur perd sa fonction d'activation de la région régulatrice contrôlant l'expression de l'acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A, lorsque ce composé activateur est mis en présence d'un iigand spécifique, qui est ici désigné composé inducteur répresseur. Ainsi, en l'absence du Iigand spécifique constituant le composé inducteur répresseur, le composé activateur est exprimé de manière constitutive et active l'expression d'un polypeptide ISUM2A.
En revanche, lorsque le composé activateur est mis en présence du composé inducteur répresseur avec lequel il se lie, le composé activateur est désactivé et ne se fixe plus sur la région régulatrice contrôlant l'expression de l'acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A. Dans cette situation, le polypeptide ISUM2A n'est plus exprimé.
L'exemple 2 illustre un mode de réalisation particulier d'un système II tel que défini ci-dessus. Le système II présenté à l'exemple 2 comprend respectivement:
(i) une première cassette d'expression comprenant un acide nucléique codant pour le composé activateur tTA, placé sous le contrôle d'un promoteur constitutif fort, le promoteur du gène de l'actine 1 du riz; et
(ii) une seconde cassette d'expression comprenant un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A placé sous le contrôle d'un promoteur contenant un motif TRE, le promoteur étant activé lorsque l'activateur tTA se fixe sur l'élément TRE. Ainsi, en l'absence de tout composé inducteur répresseur, le composé activateur tTA est produit de manière constitutive et active le promoteur contrôlant la séquence codant pour un polypeptide ISUM2A.
En revanche, en présence du composé inducteur répresseur, qui dans ce cas est la tétracycline ou un dérivé de la tétracycline, l'activateur tTA est désactivé et ne se fixe plus sur le motif TRE du
promoteur contrôlant l'acide nucléique codant pour un polypeptide 1SUM2A. Dans cette situation, en présence de tétracycline, le polypeptide ISUM2A n'est plus exprimé.
Le signal inducteur répresseur est l'absence de fixation du complexe composé activateur/composé inducteur répresseur (activateur tTA tétracycline) sur le polynucléotide régulateur répresseur (promoteur contenant le motif TRE).
Préférentiellement, un système d'expression II tel que défini ci- dessus sera utilisé dans un hôte cellulaire végétal ou dans une plante pour laquelle les deux copies du gène isum2A sont mutées ou inactivées.
Système d'expression III
Le système d'expression III, qui est résumé dans le tableau 3, est très similaire, au regard des éléments de régulation de l'expression des cassettes d'expression qu'il contient, au système d'expression I ci- dessus.
Avec le système d'expression III, il est possible de contrôler l'expression d'un polynucléotide antisens susceptible d'inhiber la production d'un polypeptide ISUM2A dans une plante comprenant au moins une copie fonctionnelle du gène lsum2A, préférentiellement dans une plante comprenant les deux copies du gène isum2A fonctionnelles.
Le système III d'expression comprend deux cassettes d'expression, respectivement:
(i) une cassette d'expression contenant un acide nucléique codant pour un polynucléotide antisens ou RNAi inhibant la traduction du polypeptide ISUM2A, cet acide nucléique étant placé sous le contrôle d'un promoteur qui est activé par un composé activateur donné lorsque ce composé activateur est lié à un composé inducteur; et
(ii) une cassette d'expression comprenant un acide nucléique codant pour le composé activateur, cet acide nucléique étant placé sous le contrôle d'un promoteur constitutif ou spécifique de l'embryon, préférentiellement un promoteur fort.
Selon le système d'expression III, en l'absence de liaison du composé activateur avec le composé inducteur, le promoteur contrôlant l'expression du polynucléotide antisens ou RNAi est inactif et le polynucléotide antisens n'est pas produit. En revanche, en présence du composé inducteur capable d'activer le composé activateur, par exemple en se complexant avec celui-ci, le composé activateur activé se fixe sur le promoteur contrôlant l'expression du polynucléotide antisens isum2A ce qui active l'expression du polynucléotide antisens entraînant une inhibition de la traduction du gène isum2A.
Grâce au système d'expression III, la synthèse du polypeptide ISUM2A est donc inhibée en présence du composé inducteur activant le composé activateur.
Un tel système d'expression permet de contrôler précisément le moment ou l'on désire bloquer la synthèse du polypeptide ISUM2A, en mettant en présence le composé activateur désactivé avec le composé inducteur activant le composé activateur, par exemple dès le début de la pollinisation.
Un exemple illustratif d'un système d'expression III peut être directement dérivé de celui décrit à l'exemple 3, lorsqu'on substitue l'acide nucléique codant un polypeptide ISUM2A par un acide nucléique codant un polynucléotide antisens inhibant la traduction du polypeptide ISUM2A ou tout autre méthode d'inhibition de gènes endogènes utilisant un transgène et connues de l'homme du métier (co-suppression, ribozyme, ARN double brin...).
Les systèmes d'expression inductibles d'un polypeptide ISUM2A comprennent plusieurs cassettes d'expression qui peuvent indifféremment être incluses dans un seul vecteur d'expression, ou au contraire dans des vecteurs d'expression distincts. Un système d'expression inductible tels que les systèmes I, Il et
III décrits ci-dessus comprennent avantageusement au moins un gène marqueur de sélection comme par exemple un gène de résistance à l'herbicide BASTA, bien connu de l'homme du métier.
Selon un premier mode de réalisation, le gène marqueur de sélection est porté par le vecteur comprenant la ou les cassettes d'expression constituant le système d'expression inductible.
Selon un second mode de réalisation, le gène marqueur de sélection est porté par un vecteur distinct d'un vecteur comprenant la ou les cassettes d'expression constituant le système d'expression inductible.
Pour réaliser une construction d'acide nucléique de l'invention, on utilisera un polynucléotide régulateur activateur inductible choisi parmi ceux décrits ci-dessous.
polynucléotides régulateurs inductibles préférés selon l'invention.
La séquence régulatrice capable de contrôler l'acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A selon l'invention peut être une séquence régulatrice inductible par un métabolite particulier, tel que :
- une séquence régulatrice inductible par les glucocorticoïdes telle que décrite par AOYAMA et al. (1997) ou telle que décrit par McNELLYS et al. (1998); - une séquence régulatrice inductible par l'éthanol, telle que celle décrite par SALTER et al. (1998) ou encore telle que décrite par CADDICK et al. (1998);
- une séquence régulatrice inductible par la tétracycline telle que celle commercialisée par la Société CLONTECH. - une séquence de promoteur inductible par un pathogène ou par un métabolite produit par un pathogène.
- une séquence régulatrice de gènes de type PR, inductible par l'acide salicylique ou le BTH ou l'aliette (Gorlach et al., 1996, Molina et al., 1998) ; - une séquence régulatrice de type récepteur Ecdysone
(Martinez et al., 1999) inductible par le tebufenozide (référence produit RH5992, commercialisé par ROHM & HAAS) par exemple, appartenant à la famille des dibenzoylhydrazines.
Autres séquences contenant des signaux régulateurs
De manière avantageuse, l'acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide ISUM2A peut aussi contenir une ou plusieurs autres séquences contenant des signaux régulateurs de l'expression de la région codant ISUM2A, ou alternativement être placé sous le contrôle de telles séquences régulatrices.
Séquences " leader
Les autres séquences contenant des signaux régulateurs englobent des séquences 5' non traduites dites " leader ". De telles séquences peuvent augmenter la traduction de l'ARNm codant ISUM2A. Parmi celles-ci, on peut citer, à titre illustratif mais non limitatif : - le leader EMCV (EncephaloMyoCarditis VIRUS 5' non coding région) (ELROY-STEIN et al, 1989);
- le leader TEV (Tobacco Etch Virus) (CARRINGTON AND FREED, 1990);
- le leader du gène BiP codant pour la protéine de liaison à la chaîne lourde de l'immunoglobuline humaine (MACEJACK et al., 1991);
- le leader AMV RNA 4 provenant de l'ARNm de la protéine du virus de la mosaïque de la luzerne (JOBLING et al. 1987);
- le leader du virus de la mosaïque du tabac (GALLIE et al., 1989).
Séquences " terminateur
L'acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide ISUM2A, ou le vecteur dans lequel est inséré cet acide nucléique peut aussi comprendre des séquences dites " terminateurs ".
Parmi les terminateurs utilisables dans les constructions de l'invention, on peut citer, à titre illustratif mais non limitatif :
- le polyA 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV), décrit dans l'article de FRANCK et al. (1980);
- le terminateur nos correspondant à la région 3' non-codante du gène de la nopaline synthase du plasmide Ti d' Agrobacterium tumefaciens (DEPICKER et al., 1992).
- le terminateur du gène histone (EP 0 633 317). Selon une autre alternative, la cassette d'expression selon l'invention peut comprendre un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A fusionné à une séquence régulatrice de gènes de type fragment GR récepteur aux glucocorticoïdes (Aoyma et al. 1997), ledit polynucléotide étant placé sous le contrôle d'une séquence promotrice de type promoteur natif d'ISUM2 ou promoteur constitutif. En présence de l'hormone, la protéine hybride résultante n'est plus retenue dans le cytoplasme et peut donc rentrer dans le chloroplaste et s'intégrer au ribosome.
VECTEURS RECOMBINANTS DE L'INVENTION
Un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide ISUM2A peut être inséré dans un vecteur approprié.
Par " vecteur " au sens de la présente invention, on entendra une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire qui est indifféremment sous forme simple brin ou double brin.
Un vecteur recombinant selon l'invention est de préférence un vecteur d'expression, ou plus spécifiquement un vecteur d'insertion, un vecteur de transformation ou un vecteur d'intégration.
Il peut s'agir notamment d'un vecteur d'origine bactérienne ou virale.
Dans tous les cas, l'acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide ISUM2A est placé sous le contrôle d'une ou plusieurs séquences contenant des signaux de régulation de son expression dans la plante considérée, soit que les signaux de régulation soient tous contenus dans l'acide nucléique codant ISUM2A, comme c'est le cas dans les constructions d'acides nucléiques décrites dans la section précédente, soit que l'un, plusieurs d'entre eux, ou encore tous les signaux de régulation soient contenus dans le vecteur receveur dans lequel l'acide nucléique codant ISUM2A a été inséré.
Un vecteur recombinant selon l'invention comprend avantageusement des séquences d'initiation et d'arrêt de la transcription appropriées.
En outre, les vecteurs recombinants selon l'invention peuvent inclure une ou plusieurs origines de replication fonctionnelles dans les cellules hôtes dans lesquelles leur expression est recherchée, ainsi que, le cas échéant, des séquences nuciéotidiques marqueurs de sélection.
Les vecteurs recombinants selon l'invention peuvent aussi inclure un ou plusieurs des signaux de régulation de l'expression tels que définis ci-dessus dans la description.
Les vecteurs bactériens préférés selon l'invention sont par exemple les vecteurs pBR322 (ATCC n°37 017) ou encore les vecteurs tels que pAA223-3 (Pharmacia, Uppsala, Suède) et pGEM1 (Promega Biotech, Madison, Wl, Etats-Unis). On peut encore citer d'autres vecteurs commercialisés tels que les vecteurs pQE70, pQE60, pQE9 (Quiagen), psiX174, pBluescript SA, pNH8A, pMH16A, pMH18A, pMH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI et pSG (Stratagene).
Il peut s'agir également de vecteurs du type Baculovirus tel que le vecteur pVL1392/1393 (Pharmingen) utilisé pour transfecter les cellules de la lignée Sf9 (ATCC N°CRL 1711) dérivée de Spodoptera frugiperda.
De manière préférée, et pour l'application principale des vecteurs de l'invention consistant à obtenir une expression stable, et préférentiellement inductible, d'une séquence codant pour un polypeptide ISUM2A dans une plante, on aura recours à des vecteurs spécialement adaptés pour l'expression de séquences d'intérêt dans des cellules de plantes, tels que les vecteurs suivants:
- vecteur pBIN19 (BEVAN et al.), commercialisé par la Société CLONTECH (Palo Alto, Californie, USA);
- vecteur pBI 101 (JEFFERSON, 1987), commercialisé par la Société CLONTECH ;
- vecteur pBI121 (JEFFERSON, 1987), commercialisé par la Société CLONTECH;
- vecteur pEGFP; Yang et al. (1996), commercialisé par la Société CLONTECH;
- vecteur pCAMBIA 1302 (HAJDUKIIEWICZ et al., 1994)
- vecteurs intermédiaires et superbinaires dérivés des vecteurs pSB12 et pSB1 décrits par Japan Tobacco (EP 672 752 et Ishida et al,
1996).
Font également partie de l'invention les vecteurs pRDPδ et pRDP4 décrits à l'exemple 2 ainsi que les vecteurs pRDP2 et pRDP3 décrits à l'exemple 3, avec l'ensemble de leurs caractéristiques définies dans ces exemples.
CELLULES HOTES TRANSFORMEES SELON L'INVENTION.
Pour permettre l'expression d'un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A selon l'invention placé sous le contrôle d'une séquence régulatrice appropriée, les acides nucléiques ou les vecteurs recombinants définis dans la présente description doivent être introduits dans une cellule hôte. L'introduction des polynucléotides selon l'invention dans une cellule hôte peut être réalisée in vitro, selon les techniques bien connues de l'homme du métier.
L'invention a en outre pour objet une cellule hôte transformée par un acide nucléique selon l'invention ou par un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus.
Une telle cellule hôte transformée est préférentiellement d'origine bactérienne, fongique ou végétale.
Ainsi, peuvent être notamment utilisées des cellules bactériennes de différentes souches de Escherichia coli ou encore d'Agrobacterium tumefaciens.
Avantageusement, la cellule hôte transformée est une cellule de plante ou encore un protoplaste de plante.
Parmi les cellules susceptibles d'être transformées selon le procédé de l'invention, on peut citer à titre d'exemples des cellules de plantes de grandes cultures (maïs, blé, colza, tournesol, pois, soja, orge..). Préférentiellement, on peut choisir des plantes connues pour
contenir de grandes réserves (protéiques, glucidiques et lipidiques), notamment les plantes céréalières ou les plantes oléagineuses. Les plantes hybrides obtenues par le croisement de plantes selon l'invention, font aussi partie de l'invention. Préférentiellement, il s'agit d'une cellule ou d'un protoplaste d'une plante céréalière. La cellule ou le protoplaste est préférentiellement originaire du maïs, du blé, de l'orge, du sorgho, du millet, du seigle ou du riz.
De manière tout à fait préférée, il s'agit d'une cellule originaire du maïs.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A, le cas échéant sous la forme d'une construction d'acide nucléique telle que définie ci-dessus, pour fabriquer une plante transformée capable de produire des graines à développement du germe affecté.
L'invention est également relative à l'utilisation d'un vecteur recombinant tel que défini dans la présente description pour fabriquer une plante transformée capable de produire des graines à développement du germe affecté. L'invention concerne aussi l'utilisation d'un hôte cellulaire transformé par un acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A, le cas échéant sous la forme d'une construction d'acide nucléique ou cassette d'expression telle que définie ci-dessus, pour fabriquer une plante transformée capable de produire des graines à développement du germe affecté.
L'invention concerne aussi une plante transformée comprenant une pluralité de cellules hôtes telles que définies ci-dessus.
PLANTES TRANSFORMEES PAR UN ACIDE NUCLEIQUE PERMETTANT LA SYNTHESE DU POLYPEPTIDE ISUM2A ET PROCEDES POUR LEUR OBTENTION.
L'invention concerne aussi un organisme multicellulaire végétal transformé, caractérisé en ce qu'il comprend une cellule hôte transformée ou une pluralité de cellules hôtes transformées par un acide
nucléique comprenant un polynucléotide codant pour le polypeptide ISUM2A tel que défini dans la présente description ou encore par un vecteur recombinant comprenant un tel acide nucléique.
L'invention a encore pour objet une plante transformée comprenant, sous une forme artificiellement intégrée dans son génome, un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide ISUM2-A, tel que défini dans la présente description.
La plante transformée peut contenir une pluralité de copies d'un acide nucléique codant pour le polypeptide ISUM2A, dans les situations dans lesquelles une surexpression du polypeptide ISUM2A est recherchée. Une surexpression du polypeptide ISUM2A est recherchée notamment lorsque l'on souhaite obtenir des plantes produisant des graines dont le germe a une taille significativement plus grande que dans les plantes « sauvages » et qui est enrichi en huile. Selon un autre aspect, la surexpression du polypeptide ISUM2A peut être obtenue en transformant une cellule hôte ou une plante avec un acide nucléique codant pour le polypeptide ISUM2A et dans lequel le polynucléotide comprenant le cadre ouvert de lecture est placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur permettant un haut niveau de transcription de l'ARNm correspondant ou un haut niveau de traduction du polypeptide ISUM2A dans la cellule hôte ou dans la plante.
L'invention est donc également relative à une plane transformée telle que définie ci-dessus dont les graines sont riches en huile.
Elle est également relative à une plante transformée telle que définie ci-dessus et qui possède des qualités agronomiques et/ou nutritionnelles améliorées.
Elle concerne aussi un procédé d'obtention d'une telle plante transformée.
Parmi les plantes susceptibles d'être transformées selon l'invention, on peut citer à titre d'exemple illustratif mais non limitatif des plantes de grande culture, préférentiellement le maïs, le blé, le colza, le tournesol, le pois, le soja et l'orge.
Compte-tenu du but poursuivi par l'invention, qui consiste principalement à obtenir des graines à développement de germe affecté riches en amidon, les plantes préférées selon l'invention sont celles dont
les graines possèdent une forte teneur en amidon ou une forte quantité d'amidon et de manière tout à fait préférée le maïs, le blé, l'orge, le sorgho, le millet, le seigle ou le riz.
Les plantes hybrides obtenues par le croisement de plantes transformées selon l'invention font également partie de l'invention.
L'invention concerne aussi toute partie d'une plante transformée telle que définie dans la présente description, telle que la racine, mais aussi les parties aériennes comme la tige, la feuille, la fleur et surtout la graine. L'invention a encore pour objet une semence ou une graine de plante produit par une plante transformée telle que définie ci-dessus. Typiquement, une telle semence transformée ou un tel grain transformé comprend une ou plusieurs cellules comprenant dans leur génome une ou plusieurs copies d'un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide ISUM2A, le cas échéant de manière contrôlée et inductible.
Lorsqu'une surexpression du polypeptide ISUM2A a été obtenue dans la plante, les semences ou graines de plantes sont enrichies en huile. L'invention a donc aussi pour objet des semences et des grains enrichis en huile , préparés ou obtenus à partir d'une plante transformée surexprimant le polypeptide ISUM2A.
Les graines riches en huile sont utilisées pour la préparation de semences ou des farines de semences enrichies en huile utilisables dans l'agriculture et dans l'industrie agro-alimentaire.
Selon un mode de réalisation préférentiel d'une plante transformée selon l'invention, on cherche à exprimer de manière contrôlée le polypeptide ISUM2A, ce qui implique que la plante transformée ne contient, en tant que copie fonctionnelle d'un polynucléotide codant pour le polypeptide ISUM2A, uniquement la ou les copies qui ont été artificiellement introduites dans leurs cellules, et préférentiellement dans leur génome, alors que les séquences du gène isum2A retrouvées naturellement dans la plante sauvage portent au moins une mutation provoquant un défaut dans l'expression du gène isum2A.
De telles plantes mutées dans le gène isum2A sont par exemple les plantes mutantes G2422 ou les plantes mutantes emb*-
8516 décrites par HECKEL et al. (1999). L'homme du métier peut, grâce à l'invention, produire d'autres plantes mutées dans le gène isum2A , par exemple par insertion au hasard du transposon Mutator dans une population de plantes de phénotype sauvage (lsum2A7lsum2A+), puis en détectant chez les mutants obtenus, ceux d'entre ces mutants qui n'expriment plus le gène isum2A, par exemple à l'aide des sondes ou des amorces nuciéotidiques décrites dans les exemples.
Selon ce mode de réalisation préférentiel, la plante transformée selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle dérive d'une plante dans laquelle les deux copies du gène isum2A portent chacune au moins une mutation provoquant un défaut dans son expression, au niveau transcriptionnel ou traductionnel.
Selon un second mode de réalisation préférentiel selon l'invention, on cherche à inhiber de manière contrôlée la synthèse du polypeptide ISUM2A, par exemple au travers de l'expression d'un polynucléotide antisens.
Dans ce cas, la plante transformée comprend au moins une copie fonctionnelle du gène isum2A et préférentiellement les deux copies du gène isum2A sont fonctionnelles. L'invention est également relative à un procédé pour l'obtention d'une plante transformée susceptible de produire des graines affectées dans le développement du germe, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) transformation d'au moins une cellule végétale ; - par un acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A choisi parmi les séquences ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec les séquences SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6, ledit acide nucléique comprenant également un polynucléotide régulateur tel que défini dans la présente description ; ou - par un vecteur recombinant comprenant un tel acide nucléique; b) sélection des cellules transformées à l'étape a) ayant intégré dans leur génome au moins une copie d'un acide nucléique codant pour le polypeptide ISUM2A.
c) régénération d'une plante transformée à partir des cellules transformées obtenues à l'étape b) ;
Par « graines affectées dans le développement du germe », on entend selon l'invention des graines dont le développement du germe est « anormal », c'est-à-dire diffère significativement du germe d'une graine de plante dite « sauvage ».
Selon un premier aspect, le développement du germe peut être affecté de telle sorte que sa taille est significativement plus grande que celle du germe retrouvé dans les graines de plantes « sauvages » non affectées dans l'expression du gène isum2A. Une taille significativement plus grande du germe peut être obtenue en surexprimant le polypeptide ISUM2A, par exemple soit en introduisant une pluralité de copies d'un acide nucléique codant ce polypeptide dans une cellule hôte ou dans une plante, soit en plaçant une copie du gène isum2A ou de son ADNc sous le contrôle d'un polynucléotide régulateur permettant la surexpression du polypeptide ISUM2A dans la cellule hôte ou dans la plante.
En surexprimant le polypeptide ISUM2A du stade précoce du développement de l'embryon, on obtient des graines de grande taille riches en huile. L'invention a encore pour objet un mode de réalisation particulier du procédé ci-dessus pour l'obtention d'une plante transformée susceptible de produire des graines à développement du germe affecté dans lequel au moins une cellule végétale est transformée à l'étape a) par Agrobacterium tumefaciens contenant : - un acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A choisi parmi les séquences ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec les séquences SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6 et comprenant un polynucléotide régulateur tel que défini dans la présente description ; ou - un vecteur recombinant comprenant un tel acide nucléique ;
Chacun des procédés d'obtention d'une plante transformée selon l'invention peut comprendre les étapes supplémentaires suivantes: d) croisement d'une plante sélectionnée à l'étape c) avec une plante hétérozygote comprenant une copie fonctionnelle du gène isum2A et une copie inactive du gène isum2A;
e) sélection des plantes issues du croisement de l'étape d) qui sont homozygotes et portent deux copies inactives du gène isum2A.
De préférence, le polynucléotide régulateur est sensible à l'action d'un signal inducteur ; on dit aussi que le polynucléotide régulateur est inductible.
Selon un premier mode de réalisation préférentiel, le polynucléotide régulateur inductible consiste en un polynucléotide régulateur « répresseur » tel que défini dans la présente description.
Selon un second mode de réalisation préférentiel, le polynucléotide régulateur inductible est un polynucléotide régulateur « activateur » de la transcription ou de la traduction tel que défini dans la présente description.
La présente invention concerne aussi une plante transformée, telle qu'obtenue par l'un des procédés d'obtention défini ci-dessus. L'invention a également trait à une plante transgénique hybride obtenue par le croisement d'une plante transformée telle que définie ci- dessus.
L'invention est encore relative à une partie d'une plante transformée selon l'invention. L'invention a encore pour objet un procédé pour l'obtention de grains de plantes à développement du germe affecté, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) cultiver, jusqu'à pollinisation, une plante dont les deux copies du gène isum2A portent au moins une mutation provoquant un défaut dans la production du polypeptide ISUM2A et dans le génome de laquelle on a introduit artificiellement un acide nucléique comprenant :
- un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A choisi parmi les séquences ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec les séquences SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6 ; et - un polynucléotide régulateur inductible du type répresseur contrôlant l'expression du polynucléotide codant pour le polypeptide ISUM2A, la culture de la plante étant effectuée en l'absence du signal inducteur répresseur auquel le polynucléotide régulateur répresseur est sensible ;
b) mettre en contact la plante transformée définie en a) avec le signal inducteur répresseur auquel le polynucléotide régulateur répresseur est sensible, pendant une période allant de la pollinisation jusqu'à la fin de la formation des grains ; c) récupérer les grains matures, caractérisés en ce qu'ils sont affectés dans le développement du germe.
Le développement du germe peut être affecté de telle sorte que sa taille est significativement réduite par rapport à celui des graines provenant de plantes sauvages, voire inexistant, comme cela a été montré lorsque la plante possède un gène isum2A non fonctionnel ou encore lorsqu'on introduit un acide nucléique codant pour le polypeptide ISUM2A sous le contrôle d'un polynucléotide régulateur permettant de bloquer la transcription ou la traduction de manière contrôlée afin d'affecter le développement du germe.
La présente invention a aussi pour objet un procédé pour l'obtention de grains de plantes à développement du germe affecté, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) cultiver, jusqu'à la pollinisation, une plante dont les deux copies du gène isum2A portent chacune au moins une mutation provoquant un défaut dans la production du polypeptide ISUM2A et dans le génome de laquelle on a introduit artificiellement un acide nucléique comprenant :
- un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A choisi parmi les séquences ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec les séquences SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6 ; et
- un polynucléotide régulateur du type activateur inductible contrôlant l'expression du polynucléotide codant pour le polypeptide ISUM2A, la culture de la plante étant effectuée en présence du signal inducteur activateur auquel le polynucléotide régulateur activateur est sensible; b) poursuivre la culture de la plante tranformée définie en a) en l'absence du signal inducteur activateur auquel le polynucléotide régulateur activateur est sensible, à partir de la période suivant la pollinisation;
c) récupérer les grains matures, caractérisés en ce qu'ils sont affectés dans le développement du germe.
L'invention concerne aussi une semence à développement du germe affecté telle qu'elle est obtenue selon l'un des procédés définis ci- dessus.
L'invention est également relative à une semence à développement du germe affecté, caractérisée en ce que chacune de ses cellules constitutives comprenne sous une forme artificiellement intégrée dans leur génome, un acide nucléique comprenant : - un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A choisi parmi les séquences ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec les séquences SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6 ; et
- un polynucléotide régulateur.
Selon un premier mode de réalisation le polynucléotide régulateur consiste en un polynucléotide régulateur inductible du type répresseur.
Selon un second mode de réalisation préférentielle, le polynucléotide régulateur consiste en un polynucléotide régulateur du type activateur inductible. Fait également partie de l'invention tout produit de transformation d'une semence telle que définie dans la présente description, en particulier une semence ou une huille.
De préférence, le produit de transformation est un amidon.
Pour obtenir de l'amidon à partir d'une semence à développement du germe affecté selon l'invention, l'homme du métier aura avantageusement recours aux techniques décrites dans l'ouvrage « Handbuch der Starke » (vol. I; Max Ullmann (éd.), Paul Varey Verlag, Berlin) ou encore dans l'article de Morrison et Karkalas (Methods in Plant Biochemistry, 1990, vol.2: 323-352, Académie Press Ltd; Londres). L'amidon obtenu à partir des semences à développement du germe affecté selon l'invention peut être utilisé par l'industrie agroalimentaire, l'industrie pharmaceutique, l'industrie du papier ou encore dans le domaine microbiologique, où il peut être mis en œuvre en tant que substrat nutritif.
La transformation de cellules végétales peut être réalisée par les techniques connues de l'homme du métier.
On peut citer notamment les méthodes de transfert direct de gènes telles que la microinjection directe dans des embryoïdes de plante (NEUHAUS et al, 1987), l'infiltration sous vide (BECHTOLD et al., 1993) ou l'électroporation (CHUPEAU et al, 1989) ou encore la précipitation directe au moyen de PEG (SCHOCHER et al, 1986) ou le bombardement par canon de particules recouvertes de l'ADN plasmidique d'intérêt (FROMM M. et al. 1990). On peut également infecter la plante par une souche bactérienne notamment d1 Agrobacterium. Selon un mode de réalisation du procédé de l'invention, les cellules végétales sont transformées par un vecteur selon l'invention, ledit hôte cellulaire étant susceptible d'infecter lesdites cellules végétales en permettant l'intégration dans le génome de ces dernières, des séquences nuciéotidiques d'intérêt initialement contenues dans l'ADN du vecteur susmentionné. Avantageusement, l'hôte cellulaire susmentionné utilisé est Agrobacterium tumefaciens, notamment selon la méthode décrite dans l'article d'AN et al, (1986), ou encore Agrobacterium rhizogenes, notamment selon la méthode décrite dans l'article de GUERCHE et al, (1987) ou encore dans la demande PCT N°WO OO 22.148.
Par exemple, la transformation des cellules végétales peut être réalisée par le transfert de la région T du plasmide circulaire extrachromosomique inducteur de tumeurs Ti d' Agrobacterium tumefaciens, en utilisant un système binaire (WATSON et al. 1994). Pour ce faire, deux vecteurs sont construits. Dans l'un de ces vecteurs, la région T a été éliminée par délétion, à l'exception des bordures droite et gauche, entre eux le gène d'intérêt, ainsi qu'un gène marqueur sont insérés pour permettre la sélection dans les cellules de plantes. L'autre partenaire du système binaire est un plasmide Ti auxiliaire, plasmide modifié qui n'a plus de région T mais contient toujours les gènes de virulence vir, nécessaires à la transformation de la cellule végétale.
Selon un mode préféré, on peut utiliser la méthode décrite par ISHIDA et al. (1996) pour la transformation des Monocotylédones.
Selon un autre protocole, la transformation est réalisée selon la méthode décrite par FINER et al. (1992) utilisant le canon à particules de tungstène ou d'or.
L'homme du métier est capable de mettre en oeuvre de nombreux procédés de l'état de la technique afin d'obtenir des plantes transformées par un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide ISUM2A.
L'homme du métier pourra se référer avantageusement à la technique décrite par BECHTOLD et al. (1993) afin de transformer une plante à l'aide de la bactérie Agrobacterium tumefaciens. Des techniques Utilisant d'autres types de vecteurs peuvent également être utilisées, telles que les techniques décrites par BOUCHEZ et al. (1993) ou encore par HORSCH et al. (1994).
A titre illustratif, une plante transgénique selon l'invention peut être obtenue par des techniques de biolistique telles que celles décrites par FINER et al. (1992) ou encore celles décrites par VAIN et al. (1993).
D'autres techniques préférées de transformation d'une plante conformément à l'invention par Agrobacterium tumefaciens sont celles décrites par ISHIDA et al. (1996) ou encore dans la demande PCT publiée sous le n°WO 95/06 722 au nom de JAPAN TOBACCO.
POLYPEPTIDES CODES PAR LE GENE ISUM2A
Comme déjà décrit précédemment, le gène isum2A code pour un polypeptide possédant une longueur de 143 acides aminés, pour lequel il a pu être observé au moins deux polypeptides variants.
Le premier polypeptide variant codé par le gène isum2A possède la séquence en acides aminés SEQ ID N°5 et est codé par le gène isum2A présent dans le génome du plant de maïs désigné HD5x HD7. Le second polypeptide variant ISUM2A est codé par le gène isum2A présent dans le génome du plant de maïs désigné A188.
Les polypeptides ISUM2A de séquences SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6 se différencient uniquement par la substitution d'un résidu d'acide aminé, le polypeptide de séquence SEQ ID N°5 possédant un résidu
glycine en position 89 et le polypeptide de séquence SEQ ID N°6 ayant un résidu d'acide aminé asparagine à cette position.
L'expression de l'un ou l'autre des variants polypeptidiques
ISUM2A conduit dans tous les cas à l'expression d'un phénotype sauvage chez la plante, ladite plante produisant des grains matures et fertiles comprenant un embryon complètement développé.
Une recherche d'homologie dans la base de données PROSITE a permis de montrer des similarités de structure entre les polypeptides
ISUM2A selon l'invention et les protéines L35 du chloroplaste. Le polypeptide ISUM2A de séquence en acides aminés SEQ ID
N°5 possède un poids moléculaire calculé de 15112 daltons, un point isoélectrique calculé de 11,75 et une charge à pH 7 de 28,19.
Le polypeptide ISUM2A de séquence SEQ ID N°5 possède 40 résidus d'acides aminés chargés (R, K, H, Y, C, D, E), 3 résidus d'acides aminés acides (D, E), 31 résidus d'acides aminés basiques (K, R), 31 résidus d'acides aminés polaires (N, C, Q, S, T, Y) et 55 résidus d'acides aminés hydrophobes (A, I, L, F, W,V).
Compte-tenu de la présence d'une seule substitution d'un résidu d'acide aminé, par rapport à la séquence SEQ ID N°5, le polypeptide ISUM2A de séquence SEQ ID N°6 possède des caractéristiques très similaires à celles décrites ci-dessus pour le polypeptide ISUM2A de séquence SEQ ID N°5.
L'invention a donc encore pour objet le polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6 ainsi qu'un polypeptide possédant au moins 95% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6, ou un fragment ou un variant de celui-ci.
Un fragment d'un polypeptide ISUM2A selon l'invention comprend au moins 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 130, 135 ou 140 acides aminés consécutifs d'un polypeptide de séquence SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6.
Fait également partie de l'invention, un polypeptide comprenant
10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 130, 135 ou 140 acides aminés consécutifs d'un polypeptide de séquence SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6.
L'invention est également relative à un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec la séquence d'un polypeptide ISUM2A de séquence
SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6. Avantageusement, fait aussi partie de l'invention un polypeptide
99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% ou 99,9% d'identité en acides aminés avec la séquence d'un polypeptide de séquence SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6, ou un fragment peptidique de ce dernier. De manière générale, les polypeptides selon la présente invention se présentent sous une forme isolée ou purifiée.
Un autre objet de l'invention consiste en un polypeptide comprenant des modifications d'acides aminés de 1 , 2, 3, 4 ou 5 substitutions, additions ou délétions d'un acide aminé par rapport à la séquence d'acides aminés d'un polypeptide de séquence SEQ ID N°5 ou
SEQ ID N°6 ou encore d'un fragment ou d'un variant de celui-ci.
Un polypeptide selon l'invention peut être obtenu par recombinaison génétique selon des techniques bien connues de l'homme du métier, par exemple des techniques décrites dans AUSUBEL
Un polypeptide selon l'invention peut être également préparé par des techniques classiques de synthèse chimique, indifféremment en solution homogène ou en phase solide.
A titre illustratif, un polypeptide selon l'invention pourra être préparé par la technique en solution homogène décrite par HOUBEN WEIL (1974) ou encore par la technique de synthèse en phase solide décrite par MERRIFIELD (1965a; 1965b).
De préférence, les polypeptides variants d'un polypeptide selon l'invention conservent leur capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre les polypeptides de séquences SEQ ID N°5 ou 6.
Un polypeptide codé par le gène lsum2A selon l'invention, tel qu'un polypeptide de séquence en acides aminés SEQ ID N°5 ou 6, ou encore un variant ou un fragment peptidique de ce dernier est utile notamment pour la préparation d'anticorps destinés à la détection de la
présence et/ou de l'expression d'un polypeptide de séquences SEQ ID N°5 ou 6 ou d'un fragment peptidique de ce dernier dans un échantillon.
Outre la détection de la présence d'un polypeptide codé par le gène lsum2A ou encore d'un fragment peptidique d'un tel polypeptide dans un échantillon, des anticorps dirigés contre ces polypeptides sont utilisés pour quantifier la synthèse d'un polypeptide de séquences SEQ ID N°5 ou 6, par exemple dans des cellules d'une plante, et déterminer ainsi le développement de l'embryon.
Par " anticorps " au sens de la présente invention, on entendra notamment des anticorps polyclonaux ou monoclonaux ou des fragments (par exemple les fragments F(ab)'2, F(ab)) ou encore tout polypeptide comprenant un domaine de l'anticorps initial reconnaissant le polypeptide ou le fragment de polypeptide cible selon l'invention.
Des anticorps monoclaux peuvent être préparés à partir d'hybridomes selon la technique décrite par KOHLER et MILSTEIN (1975)
La présente invention concerne également des anticorps dirigés contre un polypeptide tel que décrit ci-dessus ou un fragment ou un variant de ce dernier, tel que produit dans la technique du trioma ou encore la technique d'hybridome décrite par KOZBOR et al. (1983).
L'invention a également trait à des fragments d'anticorps simple chaîne Fv (ScFv) tels que décrits dans le brevet US N°4, 946,778 ou encore par MARTINEAU et al. (1998).
Les anticorps selon l'invention comprennent également des fragments d'anticorps obtenus à l'aide de banques de phages telles que décrites par RIDDER et al. (1995) ou encore des anticorps humanisés tels que décrits par REINMANN et al. (1997) et LEGER et al. (1997). Les préparations d'anticorps selon l'invention sont utiles dans des tests de détection immunologiques destinés à l'identification de la présence et/ou de la quantité d'un polypeptide de séquences SEQ ID N°5 ou 6, ou d'un fragment peptidique de celui-ci, présent dans un échantillon.
Un anticorps selon l'invention pourra comprendre en outre un marqueur détectable isotopique ou non isotopique, par exemple fluorescent, ou encore être couplé à une molécule telle que la biotine, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
Ainsi, l'invention a en outre pour objet un procédé pour détecter la présence d'un polypeptide conforme à l'invention dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de: a) mettre en contact l'échantillon à tester avec un anticorps tel que décrit ci-dessus; b) détecter le complexe antigène/anticorps formé. L'invention est également relative à un nécessaire ou kit de diagnostic pour la détection de la présence d'un polypeptide conforme à l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant: a) un anticorps tel que défini ci-dessus; b) le cas échéant, un ou plusieurs réactifs nécessaires à la détection du complexe antigène/anticorps formé.
Un autre objet de l'invention consiste en l'utilisation d'un acide nucléique ou d'un variant allélique d'un acide nucléique tel que défini ci- dessus dans des programmes de sélection pour l'obtention de plantes à embryon modifié en taille et/ou développement influant sur le contenu en amidon et/ou en huile.
L'invention concerne aussi une méthode de sélection de plantes à embryon modifié en taille et/ou en développement comprenant les étapes de : a) génotyper des plantes (individus) au moyen de sondes ou amorces nuciéotidiques obtenues à partir des acides nucléiques tels que définis précédemment ou de variants de ces acides nucléiques ; b) sélectionner, parmi ces plantes (individus), celles qui comprennent une fréquence élevée d'allèles favorables associées à la taille et/ou au développement de l'embryon.
La présente invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples suivants:
FIGURES
La figure 1 illustre la séquence nucléotidique génomique du gène isum2A présent dans le plant de maïs désigné HD5 x HD7 référencé comme la séquence SEQ ID N°1 du listage de séquences. Les trois exons du gène isum2A sont représentés sous la forme de boîtes, sous la séquence nucléotidique correspondante. Les différents sites de
reconnaissance pour les endonucléases de restriction sont indiqués, au- dessus de la séquence nucléotidique correspondante.
La figure 2 illustre une séquence nucléotidique de l'ADNc du gène isum2A dans le plant de maïs désigné HD5 x HD7, cette séquence étant référencée comme la séquence SEQ ID N°3 du listage de séquences
Les séquences dérivées des trois exons du gène sont représentées par des boîtes localisées sous la séquence nucléotidique correspondante. La séquence en acides aminés déduite est représentée au- dessous des boîtes représentant les exons.
La boîte désignée « RL35 domain » correspond à la partie de la séquence du polypeptide ISUM2A qui est homologue avec certaines protéines du chloroplaste. Le polypeptide ISUM2A représenté sur la figure 2 est référencé comme la séquence SEQ ID N°5 du listage de séquences.
La figure 3 illustre une séquence d'ADNc partiel correspondant à l'ARN messager retrouvé dans le plant de maïs désigné A188, cette séquence nucléotidique étant référencée comme la séquence SEQ ID N°4 du listage de séquences.
La séquence déduite de la protéine codée par l'ADNc est représentée au-dessous de la séquence nucléotidique correspondante, et est référencée comme la séquence SEQ ID N°6 du listage de séquences. Les boîtes localisées au-dessous de la séquence peptidique représentent les trois exons dérivés du gène isum2A retrouvés dans la lignée de maïs A188.
La boîte désignée « RL35 domain » correspond à la partie du polypeptide ISUM2A possédant une homologie avec des protéines du chloroplaste.
La figure 4 illustre la structure en exons et introns du gène isum2A, les boîtes représentant les exons du gène. La base A du codon ATG est le nucléotide en position 51 du premier exon et la base T du codon TGA d'arrêt de la traduction et le nucléotide en position 76 du troisième exon. Les boîtes situées au-dessous de la structure du gène
isum2A représentent les différents clones d'ADN génomique utilisés dans les exemples. Les boîtes situées au-dessus de la structure du gène isum2A représentent les différents clones d'ADNc utilisés dans les exemples. La figure 5 illustre une carte du plasmide pRDP5.
La figure β illustre la carte du plasmide pTRE commercialisé par la Société CLONTECH LABORATORIES Inc. et dont la structure est accessible dans la base des données GENBANK sous le numéro d'accès U89931. La figure 7 illustre la carte du plasmide pDM302 décrit par CAO ét al. (1992).
La figure 8 illustre la carte du plasmide pTet-Off commercialisé par la Société CLONTECH (référence catalogue année 2000: K1620-A).
La figure 9 illustre la carte du plasmide pRDP4. La figure 10 illustre la carte du plasmide pTA7001 décrit par
AOYAMA et al. (1997).
La figure 11 illustre la carte du plasmide pRDP2.
La figure 12 illustre la carte du plasmide pRDP3.
La figure 13 illustre le principe de fonctionnement du système d'expression 11 résumé dans le tableau 3 et objet de l'exemple 2.
La figure 13A illustre l'expression constitutive du polypeptide ISUM2A sous l'effet de l'activation du promoteur contenant la séquence TRE par l'activateur tTA, qui est lui-même exprimé de manière constitutive. La figure 13B illustre la répression de la synthèse du polypeptide ISUM2A lorsque l'activateur tTA est mis en contact avec la tétracycline, qui le désactive et l'empêche d'activer le promoteur contenant la séquence TRE.
La figure 14 illustre un schéma de fonctionnement d'un système d'expression I résumé dans le tableau 3 et objet de l'exemple 3.
La figure 14A illustre la synthèse du polypeptide ISUM2A lorsque le promoteur contenant la séquence UAS est activé par la protéine de fusion GVG, en présence d'un glucocorticoïde.
La figure 14B illustre l'absence de production de polypeptide ISUM2A dans une situation dans laquelle la protéine de fusion GVG est
produite en l'absence de glucocorticoïde et n'active pas la séquence UAS du promoteur contrôlant l'expression du gène isum2A.
EXEMPLES: EXEMPLE 1 : Clonage de la séquence génomique du gène isum2A.
A. MATERIELS ET METHODES
Ai. Matériel végétal Les plantes de la lignée A188 (Gerdes et Tracy, 1993), ont été utilisées pour le "genomic walk" et l'isolement d'ARN. Les fragments d'ADN contenus dans la banque génomique criblée proviennent quant à eux de la lignée hybride HD5xHD7 (Barloy et coll., 1989). Le mutant emb*-8516 et le parent récurrent Rscm2 ont été décrits dans Heckel et coll. (1999).
A2. Culture des plantes
Les plantes ont été cultivées soit en chambre climatique, avec une période d'éclairement de 16 h (100 Wm-2), une humidité relative de 80 % et une alternance 24°C/19°C (jour/nuit), soit en serre sous les mêmes conditions mais sans contrôle de l'humidité, soit en plein champ à Lyon. Toutes les plantes ont été pollinisées à la main.
A3. Isolement d'ADN génomique de plante Une jeune feuille de maïs de 10 cm de long a été prélevée, mise dans un tube Eppendorf de 1 ,5 ml et broyée avec un pilon adapté dans de l'azote liquide. 500 μl de tampon d'extraction (Tris-HCI pH8 100 mM, EDTA pH8 50 mM, NaCI 100 mM, SDS 1 %) a été ajouté et le tube incubé 5 min à 55°C. Après deux extractions au phénol/chloroforme le surnageant a été précipité à l'aide de 50 μl acétate de sodium et 350 μl l'isopropanol (froid) pendant 10 min à température ambiante. Le culot d'ADN a été rincé avec 1 ml éthanol 70 %, séché et repris dans 50 μl TE10.01 (Tris-HCI pH8 10 mM, EDTA pH8 0,1 mM) additionné de 20 μg/ml de RNAse A.
A4. PCR sur ADN génomique
L'ADN génomique a été dilué 10 fois et 2 μl ont été utilisé dans une réaction de 20 μl contenant chaque amorce 1 μM, dNTP 100 μM et 1 u Taq polymérase dans le tampon fourni avec l'enzyme (Pharmacia). La réaction a été réalisée dans un amplificateur PCR Perkin Elmer DNA Thermal Cycler 2400 ou 9700 dé la façon suivante: après dénaturation de l'ADN 2 min à 94°C, les échantillons ont subit 30 cycles de 30 s de dénaturation à 94°C / 45 s d'hybridation à 60°C / 1 min d'élongation à 72°C. Toutes les amorces avaient des Tm entre 60° et 62°C.
A5. Clonage
L'ADN plasmidique a été préparé suivant le protocole de lyse alcaline décrit par Sambrook et coll. (1989). Les digestions d'ADN génomique, d'ADN plasmidique ou d'ADN du phage lambda par des enzymes de restriction ont été réalisées selon les conseils des fabricants (Gibco, Boehringer Mannhein, Promega). Les produits de digestion ou d'amplification par PCR ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose dans du tampon TAE (Sambrook et coll., 1989). Les fragments de restriction ont été ligués dans le vecteur pBluescript et les produits PCR dans pGEM-T-easy, à l'aide de la T4-DNA ligase suivant les conseils du fournisseur (Promega), en utilisant 50 ng de vecteur, et un rapport molaire insert/vecteur de l'ordre de 3/1. Ces constructions ont été introduites dans la souche bactérienne DH5-α par transformation par choc thermique, selon le protocole de Hanahan (1983).
A.6. Hybridation d'ADN
Des membranes pour hybridation d'ADN ont été obtenues soit par transfert de fragments de restriction de gels d'agarose sur des membranes Hybond N+ (Amersham) par capillarité, en présence de soude 0,4 N, soit par transfert de plages de lyse de phage lambda sur des membranes Hybond N (Amersham). Les membranes ont été préhybridées selon les conseils du fournisseur, pendant 4 à 12 h à 65°C en présence de SSPE 5 x (SSPE 20 x contient NaCI 3,6 M, phosphate de sodium 0,2 M, EDTA pH 7,7 ; 0,02 M). Puis elles ont été hybridées pendant 16 h dans les mêmes conditions. Les sondes utilisées pour
l'hybridation ont été marquées radioactivement avec 50 μCi de α32P- dCTP, en utilisant le kit Ready-To-GO™ DNA labelling beads (Amersham). Après hybridation, les membranes ont subi quatre rinçages, à 65°C dans des solutions à 0,1 % de SDS et de concentrations en SSC de 2 x, 1 x, 0,5 x et 0,1 x (SSC 20 x contient NaCI3 M, Na3-citrate 0,3 M), et ont été exposées à des films pour autoradiographie (X-OMAT, Kodak).
A.7. Criblage de banque d'ADN génomique
Une banque d'ADN génomique contenue dans le phage lambda EMBL3 SP6/T7 (Stratagene) a été étalée à la densité de 1 ,5x105 plages de lyse par boîte, sur 10 boîtes, puis transférée sur membrane Hybond N selon les recommandations du fournisseur (Amersham). Après hybridation et autoradiographie, les plages de lyse donnant un signal ont été prélevées sur les boîtes et étalées à une densité moindre, ainsi deux fois de suite afin d'obtenir un clone unique par boîte, sous forme de plages isolées. Les ADN ont alors été préparés selon Sambrook et coll. (1989).
A.8. AIMS ("amplification ofinsetion mutagenised sites") L'amplification de sites mutagénisés par insertion a été obtenue selon Frey et coll. (1998). L'enzyme Tru9A (Promega) a été utilisée pour la digestion à la place de Msel. Les séquences des amorces "Mu- specific" et "Mu-nested" ont été dégénérées à des positions additionnelles. Les amorces utilisées Mu15 (SEQ ID N°14) et Mu16 (SEQ ID N°8) sont listées dans le tableau 4.
A.9. "Genomic walk"
Le protocole de Devic et coll. (1997) a été appliqué sans modification en utilisant les enzymes Dral, EcoRV, Pvull, Seal et Sspl. Les produits PCR ont été clone dans le vecteur pGEM® -T- Easy (Promega).
A.10. RT-PCR
Les ARN totaux ont été extraits de 50 mg de tissu broyé dans de l'azote liquide avec le réactif TRIZOL™ en suivant le protocole du
fournisseur (Gibco). Les ARN, resuspendus dans 50 μl d'eau Versol (Aguettant), ont été dénaturés à 65°C pendant 5 min et traités à la DNase I selon les indications du fournisseur (Promega). Ils ont ensuite été purifiés par deux extractions volume à volume au phénol/chloroforme pH 4,5 et une précipitation à l'éthanol. 6 μg d'ARN purifiés ont été "reverse" transcrits par la MuLV reverse transcriptase (Gibco) dans un volume total de 20 μl comme conseillé par le fournisseur, avec une amorce polyT à une concentration finale de 2,5 μM. Après inactivation de la reverse transcriptase par chauffage à 95°C pendant 5 min, 2 μl de la réaction de transcription inverse ont été amplifiés par la Taq polymerase comme décrit ci-dessus.
A.11. Séquençage
Le séquençage a été réalisé par la société Génome Express à Grenoble (France). Les logiciels Sequencher 3.1.1 (Gène Codes Corporation) et DNAstar (Laser Gène) ont permis d'analyser et d'assembler les séquences obtenues.
B. RESULTATS B.1. Clonage des séquences flanquant l'insertion de mutator dans emb*-8516 a) Clonage d'une séquence flanquante
Comme décrit dans Heckel et al. (1999), un produit AIMS de 107 pb a été obtenu avec les amorces Mu 16 (SEQ ID N°8) et adapMsel (SEQ ID N° 9). Ce "produit AIMS" (voir figure 4) contient 70 pb de la séquence flanquante entre les deux amorces, qui ne montre pas d'homologie significative avec les séquences référencées dans les bases de données.
b) Allongement de la séquence flanquante
Pour allonger cette séquence flanquante la technique du
"genomic walk" (Devic et al, 1997) a été employée sur l'ADN génomique du génotype A188. Avec les amorces "nested" GW4 (SEQ ID N°12) et
GW4b (SEQ ID N°13) et coupure par Sspl, un produit de 244 pb a été obtenu (clone L223a, Fig. 4), qui contenait 153 pb supplémentaires de la séquence flanquante.
Pour caractériser la séquence de l'autre côté de l'insertion, on a utilisé la technique de "genomic walk" avec les amorces "nested" GW3
(SEQ ID N° 10) et GW3b (SEQ ID N°11) avec coupure par Sspl. Le produit de 1532 pb (clone L223c, Fig. 4) contenait 1463 pb de séquence flanquante supplémentaire.
c) Homologie de la séquence flanquante dans les bases de données
Contrairement aux séquences "produit AIMS" et du clone L223a, la séquence du clone L223c montrait une homologie dans les bases de donnée avec un EST du maïs. Deux séquences du même ADNc se trouvent dans Genebank: une séquence à partir du bout 5' dans l'accession AI001298, et une séquence à partir du bout 3' dans l'accession AI374506. Cet EST porte le nom Isum2 sans explication de cet acronyme. L'homologie était forte mais restreinte à une petite partie de L223c. Une réaction PCR a été effectuée sur de l'ADN génomique avec les amorces Isum2b (SEQ ID N°18) et Isum2e (SEQ ID N°20), qui sont localisées de part et d'autres de l'intron présumé. Le produit d'amplification a été clone et séquence. La séquence de ce clone L157a (fig.4) a montré que la séquence présente dans le produit AIMS, dans L223a et dans une partie de L223c correspondait à un intron d'lsum2.
B.2. Isolement d'un deuxième allèle a) Criblage d'une collection de mutants d'insertion par génétique inverse (« machine à gène »).
Une population de 25000 plantes fortement mutagénisées avec le transposon mutator a été criblée par PCR pour une insertion dans lsum2. Les plantes ont été plantées dans 10 blocs de 50 x 50 plantes.
Des pools d'ADNs des 500 lignes et 500 colonnes ont été analysés par PCR pour la présence d'une amplification avec l'amorce OMuA ( SEQ ID
N° 24 dans mutator) en combinaison avec une amorce dans un exon d'lsum2. Les quatre amorces Isum2b (SEQ ID N°18), Isum2c (SEQ ID N°19), Isum2k (SEQ ID N°21) et 8516g (SEQ ID N°23) spécifiques d'lsum2 ont été testées. Des résultats positifs ont été obtenus avec les amorces Isum2b et Isum2k. Les plantes en question ont été identifiées et l'amplification a été confirmée sur ADN de plante individuelle. Puis leur descendance a été analysée pour distinguer des insertions somatiques (absentes dans les gamètes) des insertions germinatives (présentes dans les gamètes). De toutes les insertions seulement une a été retrouvée dans la génération suivante. Le séquençage des produits d'amplification PCR a montré qu'il s'agissait d'une insertion dans l'intron 1 d'lsum2A à 3 pb en amont de l'exon 2, retrouvée dans une plante désignée G2422.
Les grains de cette plante G2422 ont été analysés pour la présence du phénotype « grains dépourvus de germe » . La présence de nombreuses mutations "parasites" dans ce matériel fortement mutagénisé a rendu difficile l'évaluation d'une partie des grains. Des grains avec un phénotype « grain dépourvu de germe » ont été détectés.
b) Manque de complémentation entre les deux allèles mutés de isum2A.
Pour prouver que le phénotype « grain dépourvu de germe » du mutant emb*-8516 décrit par Heckel et al. (1999) était aussi causé par l'insertion de mutator dans le gène lsum2A, une complémentation entre le mutant emb*-8516 et la descendance de la plante G2422 avec une insertion de mutator dans le même gène lsum2A a été entreprise.
16 plantes hétérozygotes +lemb*-8516 ont été pollinisées par 6 plantes hétérozygotes +lemb*-2422. Dans aucun cas, la mutation emb*- 8516 n'a été complémentée. Ceci montre que les plantes G2422 portent une mutation dans le même gène qui cause le phénotype emb du mutant emb*-8516. Comme les deux ont une insertion de mutator dans le gène lsum2A, il est avéré que cette mutation du gène isum2A provoque le phénotype « grain dépourvu de germe ».
B.3. Le gène lsum2A a) Séquences génomiques d'lsum2A
Pour le gène lsum2A une première séquence génomique a été obtenue par criblage d'une banque génomique de plantes du génotype
HD5 x HD7 et une seconde séquence génomique a été obtenue par
PCR sur des plantes du génotype A188. Les clones utilisés pour le séquençage sont présentés dans la Fig. 4.
La séquence du génotype HD5 x HD7 (Fig. 1) émane des deux sous-clones L211c1 (fragment Xhol de 9 kb) et L211c2 (fragment Xhol de 6 kb).
La séquence du génotype A188 (Fig. 2) provient des clones L157a (PCR avec les amorces Isum2b (SEQ ID N°18) et Isum2e (SEQ ID N°20)), L223a (genomic alk, voir ci-dessus) et L223c (genomic walk, voir ci-dessus).
b) Séquences ADNc
La séquence ADNc partiel du génotype A188 (SEQ ID N°4, fig.3) provient des clones L158a et L254 (fig.4). Le premier a été obtenu par RT-PCR sur emb1yons^ëT2^AP™avëc1ës^mόrœsTsljm2ïî (SEQ ID N°18) et Isum 2c (SEQ ID N°19), le deuxième par RT-PCR sur albumen de 7JAP avec les amorces Isum2a (SEQ ID N°17) et Isum2l (SEQ ID N°22).
La séquence ADNc du génotype HD5 x HD7 (SEQ ID N°3, fig.2) a été obtenue à partir de la séquence génomique (SEQ ID N°1) en utilisant l'EST Isum2 (ci-dessus) pour déterminer la limite 5' du premier exon et la limite 3' du dernier exon.
Le Tableau 4 ci-dessous détaille les différentes amorces utilisées dans cet exemple.
Tableau 4 : Amorces utilisées
âMAG signifie "Machine à gènes".
EXEMPLE 2:
Construction d'un vecteur comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A placé sous le contrôle d'un polynucléotide régulateur inductible du type répresseur.
Le système d'expression décrit dans cet exemple constitue une illustration du système d'expression II résumé dans le tableau 3 et dont le principe de fonctionnement général est détaillé dans la description.
Ce système d'expression implique la construction de deux vecteurs, respectivement:
(i) le vecteur pRDP5, qui contient le gène isum2A placé sous le contrôle de la séquence TRE reconnue par l'activateur tTA; et
(ii) le vecteur pRDP4, qui contient le gène de l'activateur tTA, actif en absence de tétracycline, placé sous le contrôle du promoteur actinel du riz, qui est un promoteur fort et constitutif chez les monocotylédones.
1. Construction du vecteur pRDPδ
Le vecteur pTRE, commercialisé par la Société CLONTECH
Laboratories Inc, et qui est également décrit dans la base de données GENBANk sous le numéro d'accès U89931, est utilisé comme vecteur de départ (fig.6). Le vecteur pTRE est clivé par l'endonucléase de restriction BamHI, au niveau des nucléotides 471 et 483 du vecteur, le fragment d'ADN localisé entre les deux sites BamHI précités étant alors excisé.
Après clivage et excision, on réalise un remplissage des bouts cohésifs à l'aide de la polymerase de Klenow.
On réalise ensuite une amplification du gène isum2A décrit à l'exemple 1 , plus spécifiquement de la région génomique allant du codon ATG à la fin du cadre de lecture et comprenant également une séquence terminateur, par amplification PCR.
Puis, le produit d'amplification du gène isum2A est ligaturé dans le vecteur pTRE ouvert afin de construire le vecteur pRDPδ illustré à la figure 5.
Dans le vecteur pRDPδ, le gène isum2A est placé sous le contrôle du promoteur prTRE, qui est reconnu par l'activateur tTA.
2) Construction du vecteur pRDP4
Le vecteur pRDP4 contient le gène de l'activateur tTA sous le contrôle du promoteur actinel du riz.
Le vecteur de départ est le plasmide pDM302 qui a été décrit par CAO et al. (1992) et qui est illustré sur la figure 7. Le plasmide pDM302 est digéré avec l'endonucléase de restriction Smal.
Puis, on utilise le vecteur pTet-Off commercialisé par la Société CLONTECH Laboratories Inc. (référence catalogue n°K 1620-A, année 2000), et qui est illustré sur la figure 8, pour amplifier la séquence du gène tTA par PCR.
Puis, le produit d'amplification du gène tTA est ligaturé au niveau du site Smal ouvert du plasmide pDM302 afin de construire le plasmide pRDP4 illustré à la figure 9.
Le plasmide pRDP4 comprend le gène tTA sous le contrôle du promoteur actinel du riz.
Un schéma de fonctionnement du système d'expression inductible décrit dans le présent exemple est représenté sur la figure 13, soit en l'absence de tétracycline (figure 13A), soit en présence de tétracycline (fig.13B). Un résumé des caractéristiques des différents vecteurs utilisés ou préparés selon l'exemple 2 est présenté dans les tableaux 5 à 8 ci- après.
TABLEAU 6
Positions des éléments caractéristiques du plasmide pRDP4 (unité: kilobase)
10
TABLEAU 7 Positions des éléments caractéristiques du plasmide pTRE2 (unité: kilobase)
EXEMPLE 3.
Construction d'un vecteur comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A placé sous le contrôle d'un polynucléotide régulateur du type activateur inductible.
Le système d'expression selon l'exemple 3 constitue une illustration du système d'expression I résumé dans le tableau 3, et qui est commenté dans la description.
Le système d'expression selon l'exemple 3 comprend deux cassettes d'expression, respectivement :
(i) une cassette d'expression comprenant le gène isum2A placé sous le contrôle d'un promoteur contenant la séquence UAS reconnue par l'activateur GVG; et
(ii) une cassette d'expression codant pour l'activateur GVG, placé sous le contrôle du promoteur actinel du riz, qui est un promoteur fort et constitutif chez les monocotylédones.
1. Construction du vecteur pRDP2
Le vecteur de départ est le plasmide pTA7001 décrit par AOYAMA et al. (1997) et qui est représenté sur la figure 10.
Le vecteur pTA7001 est soumis à une digestion par les enzymes Sse8387l et Pmel afin d'exciser le promoteur 35S du virus de la mosaïque du choufleur.
Après digestion, on remplit des bouts cohésifs à l'aide de la polymerase de Klenow.
Puis, on amplifie le promoteur actinel du riz par PCR, à partir du plasmide pDM302 illustré à la figure 7.
Puis, le produit d'amplification du promoteur actinel du riz est ligaturé dans le vecteur pTA7001 préalablement digéré, pour construire le plasmide pRDP2 illustré à la figure 11.
2. Construction du vecteur pRDP3
Le vecteur de départ est le vecteur pRDP2 construit selon le protocole ci-dessus.
Le vecteur pRDP2 est d'abord soumis à une digestion à l'aide des endonucléases de restriction Xhol et Spel.
Après digestion, on remplit des bouts cohésifs à l'aide de la poly-mérase de Klenow.
Puis, on amplifie la région codante du gène
par PCR. Enfin, le produit d'amplification du gène isum2A est ligaturé dans le vecteur pRDP2 ouvert afin de construire le vecteur pRDP3 illustré à la figure 12.
Le vecteur pRDP3 contient deux cassettes d'expression, respectivement :
(i) une cassette d'expression contenant le gène isum2A placé sous le contrôle de la séquence UAS reconnue par l'activateur GVG; et
(ii) une cassette d'expression comprenant la séquence codant pour l'activateur GVG placé sous le contrôle du promoteur constitutif de l'actine 1 du riz.
Le gène GVG code pour une protéine de fusion entre le domaine de liaison à l'ADN de la protéine GAL4, le domaine activateur du gène VP16 et le récepteur au glucocorticoïde du rat (GR).
Un schéma du fonctionnement du système d'expression inductible décrit dans le présent exemple est représenté sur la figure 14, soit en présence de glucocorticoïde (figure 14A), soit en l'absence de glucocorticoïde (figure 14B).
Lorsque l'on met en oeuvre le système d'expression selon l'exemple 3, en présence du signal inducteur activateur constitué par une hormone de glucocorticoïde, le facteur de transcription hybride GVG est transporté dans le noyau et active fortement tous les promoteurs contenant la séquence UAS (figure 14B).
Les tableaux 9 à 11 ci-après présentent un résumé des caractéristiques principales des différents vecteurs utilisés ou préparés selon l'exemple 3.
TABLEAU 9
Positions des éléments caractéristiques du plasmide pTA7001
TABLEAU 10 Positions des éléments caractéristi ues du
Tableau 11
Positions des éléments caractéristiques du plasmide pRDP3
EXEMPLE 4:
Obtention de plantes transformées par un acide nucléique comprenant un polynucléotide permettant la production d'un polypeptide ISUM2A.
La transformation d'une plante dans le but d'obtenir une expression stable du polynucléotide d'intérêt dans la plante transformée est nécessaire pour assurer une modification durable du grain de maïs. Des essais sont réalisés avec une construction de vecteurs décrits dans les exemples 2 et 3.
4-1 CANON A PARTICULES
La méthode utilisée repose sur l'utilisation d'un canon à particules identique à celui décrit par FINER (1992).
Les cellules cibles sont des cellules indifférenciées en divisions rapides ayant conservé une aptitude à la régénération de plantes entières. Ce type de cellules compose le cal embryogène (dit de type II) de maïs. Ces cals sont obtenus à partir d'embryons immatures de génotype Hill selon la méthode et sur les milieux décrits par ARMSTRONG (1994) MAIZE HANDBOOK; 1994, M. FREELING, V. WALBOT EDS.; PP 665-671. Des fragments de tels cals d'une surface de 10 à 20 mm2 ont été disposés, 4 h avant bombardement, à raison de 16 fragments par boîte au centre d'une boîte de Pétri contenant un milieu de culture identique au milieu d'initiation, additionné de 0,2 M de mannitol + 0,2 M de sorbitol. Les plasmides décrits dans les exemples précédents et portant les gènes à introduire, sont purifiés sur colonne QiagenR en suivant les instructions du fabricant. Ils sont ensuite précipités sur des particules de tungstène (M 10) en suivant le protocole décrit par KLEIN (1987). Les particules ainsi enrobées sont projetées vers les cellules cibles à l'aide du canon et selon le protocole décrit par J. FINER (1992). Les boîtes de cals ainsi bombardées sont ensuite scellées à l'aide de ScellofraisR puis cultivées à l'obscurité à 27°C. Le premier repiquage a lieu 24 h après, puis tous les quinze jours pendant 3 mois sur milieu identique au milieu d'initiation additionné d'un agent sélectif. On obtient après 3 mois ou parfois plus tôt, des cals dont la croissance n'est pas inhibée par l'agent sélectif, habituellement et majoritairement composés de cellules résultant de la division d'une cellule ayant intégré dans son patrimoine génétique une ou plusieurs copies du gène de sélection. La fréquence d'obtention de tels cals est d'environ 0,8 cal par boîte bombardée.
Ces cals sont identifiés, individualisés, multipliés puis cultivés de façon à régénérer des plantules, en modifiant l'équilibre hormonal et osmotique des cellules selon la méthode décrite par VAIN et al. (1989). Ces plantes sont ensuite acclimatées en serre où elles peuvent être croisées pour l'obtention d'hybrides ou autofécondées.
4.2 Transformation par Agrobacterium
Une autre technique de transformation utilisable dans le cadre de l'invention utilise Agrobacterium tumefaciens, selon le protocole décrit par ISHIDA et al. (1996), notamment à partir d'embryons immatures de 10 jours après la fécondation. Tous les milieux utilisés sont référencés dans la référence citée. La transformation débute avec une phase de co- culture où les embryons immatures des plantes de maïs sont mis en contact pendant au moins 5 min avec Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 contenant les vecteurs superbinaires. Le plasmide superbinaire est le résultat d'une recombinaison homologue entre un vecteur intermédiaire porteur de l'ADN-T contenant le gène d'intérêt et/ou le marqueur de sélection dérivé des plasmides décrits dans les exemples précédents, et le vecteur pSB1 de Japan Tobacco (EP 672 752) qui contient: les gènes virB et virG du plasmide pTiBo542 présent dans la souche supervirulente A281 d' Agrobacterium tumefaciens (ATCC 37349) et une région homologue retrouvée dans le vecteur intermédiaire permettant cette recombinaison homologue. Les embryons sont ensuite placés sur milieu LSAs pendant 3 jours à l'obscurité et à 25°C. Une première sélection est effectuée sur les cals transformés: les cals embryogènes sont transférés sur milieu LSD5 contenant de la phosphinotricine à 5 mg/l et de la céfotaxime à 250 mg/l (élimination ou limitation de la contamination par Agrobacterium tumefaciens). Cette étape est menée 2 semaines à l'obscurité et à 25°C. La deuxième étape de sélection est réalisée par transfert des embryons qui se sont développés sur milieu LSD5, sur milieu LSD10 (phosphinotricine à 10 mg/l) en présence de céfotaxime, pendant 3 semaines dans les mêmes conditions que précédemment. La troisième étape de sélection consiste à exciser les cals de type I qui restent blancs (fragments de 1 à 2 mm) et à les transférer 3 semaines à l'obscurité et à 25°C sur milieu LSD 10 en présence de céfotaxime.
La régénération des plantules est effectuée en excisant les cals de type I qui ont proliféré et en les transférant sur milieu LSZ en présence de phosphinotricine à 5 mg/l et de céfotaxime pendant 2 semaines à 22°C et sous lumière continue.
Les plantes ayant régénéré sont transférées sur milieu RM + G2 contenant 100 mg/l d'Augmentin pendant 2 semaines à 22°C et sous illumination continue pour l'étape de développement. Les plantes obtenues sont alors transférées au phytotron en vue de leur acclimatation.
EXEMPLE 5 : Analyses biochimiques
Des analyses biochimiques ont été réalisées sur des graines de maïs obtenues après autofécondation de plantes hétérozygotes portant la mutation emb8516. Ainsi la descendance est composée de graines à phénotype sauvage, avec embryon (soit homozygotes sauvages, soit hétérozygotes) ou à phénotype mutant sans embryon (homozygotes mutantes). Ces graines ont été triées manuellement (tri visuel en fonction du phénotype) pour séparer celles à phénotype mutant de celles à phénotype sauvage.
Les méthodes mises en œuvre sur ces graines pour mesurer les différents paramètres (teneur en matière sèche, dosages des cendres brutes, de l'amidon EWERS, des matières grasses hydrolysables, des acides aminés...) peuvent être basées sur les normes AFNOR homologuées 'NFV ou expérimentales 'XPV suivantes (disponibles sur le site internet http://www.afnor.fr. normes en lignes) : - Teneur en matière sèche résiduelle (MSR 4H-130) : NFV 03-708
Mars 1976. Maïs. Détermination de la teneur en eau sur grains entiers et sur grains broyés. La méthode mise en oeuvre dans le cas présent n'utilise pas le broyeur réfrigéré, c'est la raison pour laquelle ce n'est pas une vraie teneur en matière sèche, mais simplement une matière sèche résiduelle sur le broyage destiné à être analysé.
- Dosage des cendres brutes (cendres (2)) : NFV 18-101 Oct 1977. Commission Aliment des animaux. Dosage des cendres brutes.
- Dosage de l'amidon EWERS (amidon Ewers (2)) : 3°directive de la communauté européenne avec rectificatif JOCE du 27/11/80. Dosage de l'amidon, méthode polarimétrique.
- Dosage des matières grasses avec hydrolyse (MGH (2)) : NFV 18-117 Août 1997. Aliment des animaux. Dosage de la matière grasse. Procédé B.
- Dosage des parois (parois (2)) : XP V 18-111 Janvier 1998. Aliment des animaux. Détermination de la teneur en parois végétales insolubles dans l'eau.
- Dosage des acides aminés (acides aminés). Les méthodes mises en oeuvre sont les suivantes :
XP V 18 113 Janvier 1998. Aliments des animaux. Dosage des acides aminés.
XP V 18 114 Janvier 1998. Aliments des animaux. Dosage du tryptophane.
- Dosage des matières azotées totales : méthode de DUMAS : NFV 18-120.
Les résultats des analyses effectuées sur le matériel homozygote comportant la mutation Emb8516 (gène Isum2) et le témoin sauvage correspondant sont représentés dans le tableau ci-dessous :
TABLEAU 12
Les données du tableau sont exprimées en g/kg MS
Ces analyses montrent qu'il n'y a pas de différence au niveau de la teneur en matière sèche des graines.
Par contre l'absence d'embryon liée à la mutation Emb8516 conduit à une forte diminution de la teneur en matières grasses hydrolysees (moins d'un tiers de la valeur du témoin), en cendres-
minéraux (baisse de 28.8%) et une légère baisse en acides aminés totaux (10,2%). Ces données confirment l'importance de l'embryon en tant que source de matières grasses et minérales et, indirectement, l'effet de la régulation négative de l'expression du polypeptide ISUM2 sur la qualité en huile de la graine nature.
Cë^~clirhihϋtions en matières grasses, cendrêΕ_(7ïïiœTΗϋx)"ër acides aminés sont par ailleurs compensées par une augmentation de la teneur en paroi (24,2%) et en amidon (6,1%), ce qui confirme la relation étroite qui existe entre développement de l'embryon et développement de l'albumen et la possibilité de moduler les qualités agronomiques de l'embryon et/ou de l'albumen en fonction des applications recherchées (semoulerie ou amidonnerie).
Ces expériences confirment donc l'intérêt d'utiliser les séquences d'acides nucléiques et polypeptides selon l'invention impliquées dans le développement de l'embryon et/ou l'albumen, pour moduler les qualités agronomiques de la graine mature.
TABLEAU 13
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Claims
1. Acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A choisi parmi les séquences ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec les séquences SEQ ID Nc5 et SEQ ID N° 6, ou pour un fragment d'au moins 100 acides aminés consécutifs d'un polypeptide ISUM2-A, ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.
2. Acide nucléique selon la revendication 1 comprenant un polynucléotide possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°1, ou avec un fragment d'au moins 300 nucléotides consécutifs de cette séquence nucléotidique, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
3. Acide nucléique selon la revendication 1 comprenant un polynucléotide possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°2, ou avec un fragment d'au moins 300 nucléotides consécutifs de cette séquence nucléotidique, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
4. Acide nucléique selon la revendication 1 comprenant un polynucléotide possédant au moins 99% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°3, ou avec un fragment d'au moins 300 nucléotides consécutifs de cette séquence nucléotidique, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
5. Acide nucléique selon la revendication 1 comprenant un polynucléotide possédant au moins 99% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°4, ou avec un fragment d'au moins 300 nucléotides consécutifs de cette séquence nucléotidique, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
6. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide régulateur capable de réguler la transcription ou la traduction du polynucléotide codant pour le polypeptide ISUM2A, -ou le fragment de ce polypeptide, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
7. Acide nucléique selon la revendication 6, caractérisé en ce que le polynucléotide régulateur permet la surexpression du polypeptide
ISUM2A ou du fragment de ce polypeptide dans un organisme hôte.
8. Acide nucléique selon l'une des revendications 6 ou 7 caractérisé en ce que le polynucléotide régulateur est sensible à l'action d'un signal inducteur.
9. Acide nucléique selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que le polynucléotide régulateur est un polynucléotide répresseur inductible de la transcription ou de la traduction.
10. Acide nucléique selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que le polynucléotide régulateur est un polynucléotide activateur inductible de la transcription ou de la traduction.
11. Acide nucléique selon la revendication 10, caractérisé en ce que le polynucléotide activateur inductible est un polynucléotide codant l'activateur GVG, placé sous le contrôle du promoteur du gène de l'actin 1 du riz.
12. Acide nucléique utilisable en tant que sonde ou amorce hybridant spécifiquement avec un acide nucléique Godant pour un polypeptide ISUM2A, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5, ou un acide de séquence complémentaire.
13. Sonde ou amorce nucléotidique hybridant spécifiquement avec un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A,caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les séquences SEQ ID N° 10 à 13 et 17 à 23.
14. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 12 ou 13 pour détecter la présence d'un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A dans un échantillon.
15. Vecteur recombinani comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 13.
16. Cellule hôte transformée par un acide nucléique selon l'un des revendications 1 à 13 ou par un vecteur recombinant selon la revendication 15.
17. Cellule hôte selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule de plante.
18. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 13, d'un vecteur recombinant selon la revendication 15 ou d'une cellule hôte transformée selon l'une des revendications 16 ou 17 pour fabriquer une plante transformée capable de produire des graines à développement affecté du germe.
19. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications
6 ou 7, d'un vecteur recombinant comprenant un tel acide nucléique ou d'une cellule hôte recombinante transfectée ou transformée avec cet acide nucléique pour l'obtention d'une plante transformée susceptible de produire des graines riches en huile.
20. Plante transformée par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 13 ou par un vecteur recombinant selon la revendication 15.
21. Plante transformée comprenant une pluralité de cellules hôtes selon la revendication 17.
22. Plante transformée selon l'une des revendications 20 ou 21, caractérisée en ce qu'elle dérive d'une plante dont les deux copies du gène lsum2A portent chacune au moins une mutation provoquant un défaut dans la production d'un polypeptide ISUM2A de séquence SEQ ID N° 5 ou 6.
23. Procédé pour l'obtention d'une plante transformée susceptible de produire des graines à développement du germe affecté, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) transformation d'au moins une cellule végétale par un acide nucléique selon l'une des revendications 6 à 10 ; ou par un vecteur recombinant comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 6 à 10; b) sélection des cellules transformées obtenues à l'étape a) ayant intégré dans leur génome au moins une copie d'un acide nucléique selon l'une des revendications 6 à 10 ;
c) Régénération d'une plante transformée à partir des cellules transformées obtenues à l'étape b).
24. Procédé selon la revendication 23 dans lequel au moins une cellule végétale est transformée à l'étape a) par Agrobacterium tumefaciens contenant un acide nucléique selon l'une des revendications 6 à 10 ou un vecteur recombinant comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 6 à 10.
25. Plante transformée, telle qu'obtenue par le procédé selon l'une des revendications 23 ou 24.
26. Plante transgénique hybride obtenue par le croisement d'une plante selon la revendication 25.
27. Partie d'une plante transformée selon l'une des revendications
25 ou 26.
28. Procédé pour l'obtention de grains de plantes à développement affecté du germe, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) cultiver, jusqu'à la pollinisation, une plante dont les deux copies du gène lsum2A portent chacune au moins une mutation provoquant un défaut dans la production du polypeptide ISUM2A et dans le génome de laquelle on a introduit un acide nucléique selon la revendication 9 ; en l'absence du signal inducteur répresseur auquel le polynucléotide régulateur répresseur est sensible. b) mettre en contact la plante transformée définie en a) avec le signal inducteur répresseur auquel le polynucléotide régulateur répresseur est sensible, pendant une période allant du début de la pollinisation jusqu'à la fin de la formation des grains ; c) récupérer les grains matures, affectés dans le développement du germe.
29. Procédé pour l'obtention de grains de plantes à développement affecté du germe caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) Cultiver, jusqu'à la pollinisation, une plante dont les deux copies du gène lsum2A portent chacune au moins une mutation provoquant un défaut dans la production du polypeptide ISUM2A et dans le génome de laquelle on a introduit un acide nucléique selon la revendication 10; en présence du signal inducteur activateur auquel le polynucléotide régulateur activateur est sensible. b) poursuivre la culture de la plante transformée définie en a) en l'absence du signal inducteur activateur auquel le polynucléotide régulateur activateur est sensible, à partir de la période suivant la pollinisation. c) récupérer les grains mâtures, affectés dans le développement du germe.
30. Semence affectée dans le développement du germe telle qu'obtenue par le procédé selon l'une des revendications 28 ou 29.
31. Semence affectée dans le développement du germe caractérisée en ce que chacune de ses cellules constitutives comprennent, sous une forme artificiellement intégrée dans leur génome, un acide nucléique selon l'une des revendications 6 à 10.
32. Produit de transformation d'une semence selon l'une des revendications 30 ou 31.
33. Produit de transformation selon la revendication 32 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un amidon.
34. Produit de transformation selon la revendication 32, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une farine de semence ou d'une huile.
35. Polypeptide ISUM2A, ou fragment de ce polypeptide, codé par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 10.
36. Polypeptide selon la revendication 35, caractérisé en ce qu'il possède au moins 95% d'identité en acides aminés avec l'une des séquences SEQ ID N° 5 et SEQ ID N° 6.
37. Anticorps dirigé contre un polypeptide selon l'une des revendications 35 ou 36.
38. Procédé pour détecter la présence d'un polypeptide selon l'une des revendications 35 ou 36 dans un échantillon, comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact l'échantillon à tester avec un anticorps selon la revendication 37 ; b) détecter le complexe antigène/anticorps éventuellement formé.
39. Nécessaire ou kit pour la détection d'un polypeptide selon l'une des revendications 35 ou 36 dans un échantillon, comprenant : a) un anticorps selon la revendication 37 ; b) le cas échéant, un ou plusieurs réactifs nécessaires à la détection du complexe antigène/anticorps.
40. Utilisation d'un acide nucléique ou d'un variant allélique d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5 dans des programmes de sélection pour l'obtention de plantes à embryon modifié en taille et/ou développement influant sur le contenu en amidon et/ou en huile.
41.Méthode de sélection de plantes à embryon modifié en taille et/ou en développement comprenant les étapes de : a) génotyper des plantes (individus) au moyen de sondes ou amorces nuciéotidiques obtenues à partir des acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 5 ou de variants de ces acides nucléiques ; b) sélectionner, parmi ces plantes (individus), celles qui comprennent une fréquence élevée d'allèles favorables associées à la taille et/ou au développement de l'embryon.
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