CA2454119A1 - Acides nucleiques codant pour un polypeptide isum2a et utilisation de ces acides nucleiques pour l'obtention de plantes transformees produisant des graines affectees dans le developpement du germe - Google Patents

Abstract

Il est fourni selon l'invention des séquences d'acides nucléiques et des polypeptides dont l'expression est essentielle pour le développement de l'embryon dans une graine de plante, et dont un déficit dans l'expression conduit à la production de graines affectées dans le développement du germe.

Description

Acides nucléiques codant pour un polypeptide ISUM2A et ufiilisation de ces acides nucléiques pour l'obfiention de s planfies firansformées produisanfi des graines affectées dans le développemenfi du germe 1o DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se. rapporte au domaine de l'amélioration des caractéristiques agronomiques des plantes, en vue de l'obtenfiion de produits de transformation des plantes à caractéristiques améliorées 1s pour l'industrie, tout particulièrement pour les industries agro-afimentaires, par exemple pour la production d'amidon, d'huile végétale ou de semoule.
ETAT DE LA TECHNIQUE
De manière générale, il exïste un besoin dans l'état de la technique d'améliorer les qualités agronomiques, alimentaires ou industrielles des graines, en particulier pour les industries de production d'amidon, d'huile végétale ou de semoule. .
2s L'embryon de la grainé est le compartiment de la graine à parür duquel est extraite l'huile végétale. II serait avantageux pour l'industrie d'obtenir des plantes dont les graines possèdent un embryon surdéveloppé riche en huile.
Inversement, des embryons sous-développés seraient so particulièrement avantageux pour la production de semoule.
II serait égalemenfi avantageux pour l'industrié de l'amidon d'obtenir des plantes dont les graines sont dépourvues de germes, ces graines étant constituées essentiellement de l'albumen riche en amidon.
De manière générale, il existe un besoin dans l'état de la 3s technique pour l'isolement et la caractérisation de séquences régulatrices permettant l'expression spécifique . d'un acide nucléique d'intérêt dans l'embryon et/ou . l'albumen, efi ceci de manière précoce

2 dans le cours du développement de la plante, afin de moduler les qualités agronomiques de la grainë: mature.
La production d'amidon pour de multiples applications industrielles atteint aujourd'hui environ 1 milliard de tonnes annuelles s dans le monde. L'amidon représente une matière première qui est utilisée dans des industries aussi diverses que l'alimentatïon, la pharmacie, les industries du papier mais aussi dans le domaine microbioiogique où il peut être mis en oeuvre en tant que substrat nutritif.
Classiquement, l'amidon est obtenu à partir des graines. de ~o plantes céréalières de grande culture telles que le blé, le maïs et le sorgho.
Les graines sont essentiellement constituées d'un germe associé à l'albumen. L'amidon est entièrement contenu dans l'albumen, alors que le germe est riche en huile. II en résulte que les procédés de 1s préparation d'amidon utilisés dans l'industrie de l'amidonnerie comprennent obligatoirement une étape de séparation du germe, riche en huile, de l'albumen qui contient en abondance l'amidon constituant la .. .. .._. ._ . .. .. _... ~matière-première-d'intérét: _. _:._.... _.....-.____..._ __ ___..~_.._. ...._....._.. ..._ ___._ ..__ ..__._.
II serait donc particulièrement avantageux techniquement 2o d'éliminer l'étape de séparation du germe de l'albumen dans les procédés de purification de l'amidon, ce qui permettrait de simplifier significativemenfi ces procédés, et les rendre également plus rapides et moins coûteux .
II existe aussi un besoin dans l'état de la technique d'améliorer les 2s qualités agronomiques des grains utilisés dans les procédés de transformation de la partie vifireuse du grain de maïs (amande) en semoule. Le process de la mouture permet de séparer finement les différents constituants du grain en vue de satisfaire les exigences des utilisateurs. II comprend notamment une étape de séchage qui doit être 30 le plus doux possible pour éviter une migration des lipides du germe vers l'amande, ce qui est préjudiciable à la qualité ultérieure des semoules, et une étape de dégermage, réalisée par fragmentation, qui a pour but de séparer délicatement les germes pour éviter que les lipides qu'ils contiennent ne se retrouvent dans les semoules.

3 L'utilisation en industrie semoulière des grains à développement de germe affecfié selon l'invention, présenfie donc un avantage certain puisqu'elle facilite le process indusfiriel (gain en temps efi en rendement) en éliminant cette 'contamination' de l'amande par les lipides du germe;
s de plus elle assure une bonne qualité et une bonne durée de vie des produifis, celle-ci étant fonction du résidus! de matière grasse (<0.8% est une norme dans la profession pour les produits dits nobles: hominies, gritz, semoules et farines pour l'alimentation humaine).
Les semoules fabriquées sonfi ensuite utilisées presque io exclusivement en alimentation humaine (bières, céréales petit déjeuner, biscuits apéritifs, polenta, tortilla, corn chips, farines alimentaires...).
A titre d'exemples, les grains selon l'invention peuvent être utilisés pour la fabrication de céréales pour petit-déjeuner ou 'corn flakes', qui constituent un marché qui connait depuis 15 ans une augmentation 1s moyenne annuelle de l'ordre de 20%. Deux procédés sont classiquement utilisés: un procédé classique de laminage à partir des hominys (semoules lés plus grosses parfaitement dégermées et calibrées) ou un procédé par cuisson-extrusion à partir des semoules de granulométrie spécifique.
zo Selon un autre mode de réalisation de l'invention, on peut obtenir des graines à gros embryons, recherchées dans l'indusfirie des huiles.
L'huile de maïs est généralement destinée à l'alimentation humaine; elle est parfois utilisée par l'industrie pharmaceutique et cosmétique. Les fiourteaux sont eux valorisés en alimentation animale soifi directement, ou 2s encore remélangés avec des 'corn-gluten feed'.
De nombreuses plantes portant des mufiations affectanfi à la fois l'embryon et l'albumen de la graine sont connues dans l'état de la technique. Ces plantes mutantes sont classiquement désignées comme des mutanfis «dek » (pour « défective kernel »).
3o En revanche, il existe très peu de mutants de maïs affecfiés d'un défaut dans le développement de l'embryon de la graine et laissant intact l'albumen.
II s'agit essentiellement des plantes mutantes observées par Sheridan et al. (1993, 1995) et de celles décrites par Elster et al. (2000).

4 Toutefois, ces auteurs ne présentent aucun résultat de co-ségrégation de marqueurs gënéfiiques avec (e phénotype mutant.
Heckel et a1.(1999) ont analysé cinq mutants de maïs affectés à
différents stades du développement de l'embryon.
s Un premier groupe de mutants comprend des mutants produisant des structures pro-embryonnaires ressemblant à celles produites chez les plantes sauvages, mais les pro-embryons n'atteignent pas les stades de développement ultérieurs.
Dans le second groupe de mutants, les mutants emb* 8522 et 1o emb'~ 8535 sont affectés d'un déficit complet dans la différenciation apicale-basale, alors que chez le mutant emb*-8516 les auteurs ont observé des structures ressemblant à l'embryon qui provenaient du suspenseur.
Une analyse de co-ségrégation des mutations emb*-8576 et 1s emb*-8522 a permis à Heckel et al. de déterminer que le phénotype mutant co-ségrégeait avec la présence d'un transposon. Toutefois, la caractérisation moléculaire des différentes mutations n'a pas été décrite.
En particulier, la mutation affectant la plante mutante emb*-8516 n'a pu étre localisée sur aucun des chromosomes du maïs.
SOMMAIRE DE L'INVENTION
II esfi fourni selon l'invention des séquences d'acides nucléiques et des polypeptides dont l'expression est essentielle pour le 2s développement de !'embryon dans une graine de plante, et dont un déficit dans l'expression conduit à la production de graines affectées dans ie développement du germe.
L'invention a pour objet un acide nucléique comprenant un ~polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A choisi parmi les 3o séquences ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec les séquences SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6, ou pour un fragment d'un polypeptide ISUM2A, ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.
De préférence, l'acide nucléique codant pour le polypeptide ss ISUM2A, ou pour un fragment de ce polypeptide, comprend également

5 PCT/FR02/02553 un polynucléotide régulateur capable de réguler la synthèse du polypeptide ISUM2A, (e polynucléotide régulateur étant de préférence sensible à l'action d'un signal inducteur.
Le polynucléotide régulateur peut étre indifféremment un s polynucléotide répresseur de la transcription ou de la traduction ou au contraire un polynucléotide activateur de la transcription ou de la traduction.
L'invention est également relative à des procédés d'obtention d'une plante transformée capable de produire des graines à
1o développement de germe affecté, ainsi que les parties d'une telle plante, notamment ses semences.
L'invention a également,pour objet un produit de transformation d'une graine à développement . du germe affecté produite par ladite plante transformée, de préférence un amidon.
1s L'invention a encore pour objet le polypeptide ISUM2A, ou un fragment de ce polypeptide, codé par un acide nucléique tel que défini ci-dessus, ainsi pue des anticorps dirigés contre le polypeptide ISUM2A.
L'invention a également traifi à des procédés pour dëtecter la présence du polypeptide ISUM2A dans un échantillon et à des procédés 2o pour détecter la présence d'un acide nucléique codant pour ce polypeptide dans un échantillon.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
2s Selon l'invention, on a généré une population de 25.000 plantes fôrtement mutagénisées par l'insertion au hasard, daris leur génome, du transposon mutator décrit par Bennetzen, J.L. P.S. Springer, A.D.
Cresse, et M. Hendrickx (1993), Chandler, V.L. et K.J. Hardeman (1992).
Les plantes ont été mises en culture avant analyse de leur ADN.
3o Pour l'une des plantes mutantes, désignëe 62422, il a été
montré que l'insertion du trarisposon mutator était localisée dans le premier intron d'un gène particulier, ce gène ayant été désigné isum2A, à
une distance de 3 pb du second exon de ce gène.

6 Sur une aufire plante mutante, les inventeurs ont observé une co-ségrégation entre la présence d'un phénotype « graines sans germe »
efi l'insertion du transposon mutator dans le méme gène isum2A.
Le gène isum2A, donfi il est montré selon l'invention qu'il est s nécessaire au développemenfi normal de l'embryon de la graine, a ensuite éfié isolé et caractérisé en fiotalité.
Le gène isum2A comprend trois exons et deux introns. Le cadre ouvert de lecture débufie dans le premier exon et se termine dans le Troisième exon de ce gène.
1o Un produifi partiel de firanscription du gèné isum2A a aussi éfié
isolé efi caracfiérisé efi la structure d'une grande parfile de la protéine ISUM2A a été déduite de l'ADNc correspondant au produit de transcription du gène.
II a été montré selon l'invention que le gène isum2A était is exprïmé dans l'embryon et l'albumen 12 jours après pollinisation, ainsi que dans la feuille et la racine.
De plus, le demandeur a montré que l'insertion du transposon mutator dans l'infiron n°2 du gène a provoqué un blocage de l'expression du gène isum2A, puisque la présence de son produifi de firanscription 20 n'était plus défiectable dans un albumen d'une plante homozygote pour l'interruption du gène isum2A (isum2A::Mulisum2A::Mu).
On a ainsi montré selon l'invention que des plantes homozygofies pour une mutation dans le gène codant pour le polypeptide ISUM2A produisaient des graines essentiellement constituées de 2s l'albumen, et ayant un développement du germe affecté. Le germe est également appelé embryon.
Le demandeur a égâlement monfirë que les semences qui représentent un quart des graines produites par des plantes hétérozygotes et dont les deux copies du gène isum2A comprennent so une mutation ne permettaient pas l'obfiention d'une plante viable et fertile.
Il a plus particulièrement été montré selon l'invention que les semences qui représentent un quart des graines produites par des plantes hétérozygotes pour l'allèle ou les allèles mutés conduisant à la mutation récessive du type « emb » ne permettraienfi pas l'obtention ss d'une plante viable et ferfiile.

7 Afin de remédier à cet inconvënient, il est aussi fourni selon l'invention des systèmes de complémentation permettant l'expression d'un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A fonctionnel dans des plantes dans lesquelles les deux allèles du gène isum2a sont s mutés, ces systèmes de complémentation pouvant être rendus inductibles de manière à contrôler précisément dans le temps l'expression d'un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A.
II est ainsi possible, grâce à l'invention, d'obtenir des plantes viables produisant des graines à développement affecté du germe, ces io graines étant directement uti¿isables dans l'industrie sans étape de séparation de l'embryon, tout particulièrement dans l'industrie de l'amidonnerie, et dans l'industrié semoulière.
Selon un autre aspect, l'invention fournit aussi les moyens d'obtention de plantes produisant des graines affectées dans le 1s développement du germe, dans lesquelles le germe est enrichi en huile du fait d'une expression précoce ou d'une surexpression du polypeptide ISUM2A.
L'invention concerne des séquences nucléotidiques impliquées dans le développement de l'embryon et leur utilisation dans des 2o constructions moléculaires destinées à améliorer la qualité agronomique, alimentaire, ou industrielle d'une plante, modulant notamment la taille de l'embryon etiou son développement.
En effet, une action précoce et spécifique sur le développement des tissus de l'embryon et de l'albumen peut être recherchée zs 1 ) Selon un premier mode de réalisation, il sera possible d'obtenir des graines ou fruits enrichis en huile (gros embryon), via l'utilisation de promoteurs dirigeant l'expression des acides nucléiques selon l'ïnvention de façon précoce dans le développement de la graine et plus particulièrement au niveau du germe, ou de façon constitutive.
30 2) Selon un autre mode de réalisation, des albumens à développement de germe affecté pourraient également être obtenus selon ce modèle, pour des applications industrielles en amidonnerie et semoulerie.
L'invention vise donc également des procédés pour modifier les qualités agronomiques etlou nutritionnelles d'une plante, par une action 3s ciblée et précoce sur le développement de l'embryon, utilisant fa

8 transformation des plantes avec un vecteur selon l'invention. En particulier, elle s'intéresse à la modification de la taille et/ou du développement dé l'embryon. Elle vise également l'altération du développement de l'embryon, en vue de produire des grains sans s embryons pour les céréales notamment, présentant un intérét pour les industries de l'amidonnerie et de la semoulerie.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'une cassette d'expression telle que dëfinie précédemment, pour l'obtention d'une plante Angiosperme transgénique présentant des qualités agronomiques ou io nutritionnelles améliorées.
De manière avantageuse, la plante transgénique obtenue peut produire des graines à teneurs en huile modifiées ou à développement de germe affecté en comparaison avec une plante non transformée.
L'invention concerne également l'utilisation des plantes transgëniques is obtenues selon l'invention, ou . parties de ces plantes, notamment semences, grains et fruits pour la préparation de produits dérivés, notamment de produits alimentaires.
Font également partie de l'invention les produits obtenus, que ce soit des semences, farines de semences ou grains enrichis ~en huile ou des 2o semences à développement de germe afFecté, adaptés à l'industrie semoulière.
L'invention est aussi relative à toute composition pour l'alimentation humaine ou animale préparée à partir desdits produits obtenus.
Selon un autre aspect, l'invention est relative à l'utilisation des 2s séquences et variants alléliques définis selon l'invention dans des programmes de sélection visant à produire des plantes à , embryon modifié en taille et/ou développement influant sur le contenu en amidon/
huile. Ces séquences peuvent notamment étre utilisées dans des expériences de cartographie ef de co-localisation de QTLs pour la teneur 3o en huile ou la taille de l'embryon pour définir les varianfis alléliques les plus intéressants pour une approche sélection, comprenant:
- le génotypage d'individus au moyen de sondes ou amorces nucléiques obtenues à partir des séquences et variants alléliques décrits selon l'invention;

9 - la sélection parmi ces individus des plantes qui comprennent une fréquence élevée d'allèles favorables associés à la taille et/ou au développement de l'embryon.
ACIDES NUCLEIQUES DU GENE isum2A
s La séquence nucléotidique du gène isum2A comprend, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', (i) une séquence en amont non codante portant potentiellement des élémenfis régulateurs de la transcription et/ou de la traduction du gène, (ü) une séquence codante comprenant les trois exons et les deux introns du gène et (iii) une séquence non codante io localisée en aval du dernier exon du gène, La séquence du gène isum2A selon l'invention est référencëe comme la séquence SEQ ID N°1 du listage de séquences.
Une analyse d'une population de plantes ayant le phénotype sauvage et produisant des graines contenant un embryon normal a 1s permis d'identifier au moins deux variants du gène isum2A. Un des variants du gène ést caractérisé par la substitution du nuciéotide G
localisé en position 2234 de la séquence SEQ ID N°1 par un nucléotide C. Cette substitution de nucléotide entraine la substitution de l'acide aminé G (glycine) en position 89 de la séquence du polypeptide ISUM2A
2o SEQ ID N°5 par un acide aminé R (Asparagine) qui est présent dans la séquence du polypeptide ISUM2A variant SEQ ID N°6.
Ainsi, un premier objet de l'invention consiste en un acide nucléique comprenant un poljrnucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A choisi parmi les séquences ayant au moins 95% d'identité en 2s acides aminés avec les séquences SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6, ou pour un fragment d'un polypeptide ISUM2A.
L'invention concerne aussi un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique tel que défini ci-dessus.
Selon l'invention, toute technique classique de biologie 3o moléculaire, de microbiologie et d'ADN recombinant connue de l'homme du métier peut étre utilisée. De telles techniques sont décrites par exemple par SAMBROOK et al: (1989), GLOVER (1985), GAIT (1984), HAMES et HIGGINS (1984), BERBAL (1984) et AUSUBEL et al. (1994) .
De manière préférée, tout acide nucléïque et tout polypeptide 3s selon l'invention se présente sous une forme isolée ou purifiée.

Le terme " isolë " au sens de la présente invention désigne un matériel biologique qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement). Par exemple, un polynucléotide présenfi à l'état naturel dans une plante n'est pas s isolé. Le méme polynucléotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de la plante est isolé. Un tel polynucléotide peut étre inclus dans un vecteur et/ou un tel polynucléotide peut étre inclus dans une composition et demeurer néanmoins à l'état isolé du fait que le vecteur ou ia composition ne 1o constitue pas son environnement naturel.
Le terme " purifié " ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres composés. II s'agit plutôt d'une définition relative.
Un polynucléotide ou un polypeptide est à l'état purifié après 1s purification du matériel de départ ou du matériel naturel d'au moins un ordre de grandeur, de préférence 2 ou 3 et préférentiellement quatre ou cinq ordres de grandeur.
Aux fins de ta présente description, l'expression " séquence nucléotidique " peut être employée pour désigner indifféremment un 2o polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression " séquence nucléotidique " englobe le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.
Les termes " acide nucléique ", "polynucléotide ", " oligonucléotide " ou encore ".séquence nucléotidique " englobent des 2s séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous ia forme simple brin ou sous la forme de duplex.
Le terme " nucléotide " désigne à la fois les nucléotides naturels (A, T, G, C) ainsi que des nucléotides modifiés , qui comprennent au 30 moins une modification telle que (i) un analogue d'une purine, (ü) un analogue d'une pyrimidine, ou (iii) un sucre analogue, de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT N°WO
95/04064.
Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est 3s considéré comme étant " complémentaire " d'un second polynuclëotide lorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée.
Les bases complémentaires sont A et T (ou A et U), et C et G.
Selon l'invention, un premier acide nucléique ayant au moins s 95% d'identité avec un second acide nucléique de référence, possédera au moins 95%, de préférence aû moins 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,1°l°, 99,2%, 99,3%, 99,4%,99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% ou 99,9%
d'identité en nucléotides avec ce second polynucléotide de référence, le pourcentage d'identité entre deux séquences étant déterminé comme 1o décrit ci-dessous.
Le " pourcentage d'idéntité " entre deux séquences de nucléotides ou d'acides aminés, au sens de la présente invention, peut être déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenétre de comparaison.
is La partie de la séquence nucléotidique ou polypeptidique dans la fenétre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des dëlétions (par exemple des " gaps ") par rapport à la séquence de réfërence (qui ne comprend pas ces addïtions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal des deux séquences.
2o Le pourcentage est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nûcléique ou un résidu d'aminoacide identique est observé pour les deux séquences (nucléique ou peptidique) comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux bases ou résidus d'aminoacides comparés, par le 2s nombre total de positions dans la fenétre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité de séquence.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut étre réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus.
3o De manière préférée, le pourcentage d'identité de séquences est déterminé à !'aide du logiciel BLAST (version BLAST 2.06 de Septembre 1998), en utilisant exclusivement les paramètres par défaut.
Un acide nucléique possédant au moins 95% d'identifié en nucléotides avec un acide nucléique selon l'invention englobe les 3s " variants " d'un acide nucléique selon l'invention.

Par " variant " d'un acide nucléique selon l'invention, on entend un acide nucléique qui diffère de l'acide nucléique de référence par une ou plusieurs substitutions, additions ou délétions d'un nucléotide, par rapport à l'acide nucléique de référence. Un variant d'un acide nucléique s selon l'invention peut être d'orïgine naturelle, tel qu'un variant allélique qui existe naturellement. Un tel acide nucléique variant peut étre également un acide nucléique non naturel obtenu, par exemple, par des techniques de mutagenèse.
En général, (es différences entre ('acide nucléique de référence 1o et l'acide nucléique " variant " sont réduites de telle sorte que l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique variant onfi des séquences nucléotidiques très similaires et, dans de nombreuses régions, identiques. Les modifications nucléotidiques présentes dans un acide nucléique variant peuvent être silencieuses, ce qui signifie qu'elles is n'affectent pas la séquence d'acides aminés qui peut étre codée par cet acide nucléique variant.
Les modifications de nucléotides dans l'acide nucléique variant peuvent aussi résulter en des substitutions, additions ou délétions d'un ou plusieurs acides aminés dans la séquence du polypeptide qui peut 2o être codé par cet acide nucléique variant.
De manière tout à fait prëférée, un acide nucléique variant selon l'invention comportant une phase de lecture ouverte, code pour un polypeptide qui conserve la même fonction ou la méme activité
biologique que le polypeptide codé par l'acide nucléique de référence.
2s De ri~anière tout à fait préférée, un acide nucléique variant selon l'invention et qui comporte une phase de lecture ouverte, code pour un polypeptide qui conserve la capacité d'étre reconnu par des anticorps dirigés contre le polypeptide codé par l'acide nucléique de rëférence.
Font partie des « vâriants » d'un acide nucléique codant le polypeptide ISUM2A les acides nucléiques des gènes orthologues à
ISUM2 inclus dans le génome de plantes autres que le maïs, et possédant une identité en nucléotides d'au moins 95% avec un acide nucléique codant le polypeptide ISUM2A.
Par " fragment " d'un acide nucléique selon l'invention, on 3s entend une séquence nucléotidique d'une longueur réduite par rapport à

l'acide nucléique de référence, le fragment d'acide nucléique possédant une séquence nucléotidique idëntique à la séquence nucléotidique de l'acide nucléique de référence sur la partie commune. De tels fragments d'un acide nucléique selon l'invëntion possèdent au moins 12, 15, 18, 20, s 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 ou 3000 nucléotides consécutifs de l'acide nucléique de référence, la longueur maximale en nucléotides d'un fragment d'un acide nucléique selon l'invention étant bien entendu limitée par la longueur maximale en nucléotides de l'acide nucléique de référence.
~o Par « fragment » d'un polypeptide ISUM2A selon l'invention, on entend un fragment polypeptidique d'une longueur réduite par rapport au polypeptide de référence, le fragment polypeptidique possédant une séquence en acides aminés identique à la séquence en acides aminés du polypeptide de référence sur' la partie commune. De tels fragments is d'un polypeptide ISUM2A selon l'invention possèdent au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 130, 135 ou 140 acides aminés consécutifs d'un polypeptide ISUM2A de référence.
ACIDES NUCLEIQUES GENOMIQUES ïsum2A
Comme indiqué ci-dessus, il a été caractérisé selon l'invention deux variants alléliques de l'acide nucléique génomique du gène isum2A, les deux acides nucléiques génomiques variants étant respectivement référencés comme les séquences nucléotidiques SEQ ID N°1 et SEQ ID
2s N°2 du~üstage de séquences.
En conséquence, la présente invention' a pour objet un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A, ou pour un fragment de ce polypeptide, ledit acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec une séquence so nucléôtidique choisie parmi SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2, ou avec un fragment de l'une des séquences SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2.
Fait également partie de l'invention un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique tel que défini ci-dessus.
Un autre objet de l'invention est un acide nucléique consistant 3s en un polynucléotide possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N°1 et SEQ ID
N°2, .ou avec un fragment de l'une des séquences SEQ ID N°1 ou SEQ
ID N°2, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention est aussi relative à un acide nucléique comprenant s au moins 12, de préférence au moins 15 et de manière tout à fait préférée au moins 20 nucléotides consëcutifs de l'acide nucléique de sëquence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, étant entendu qu'un tel acide nucléique englobe dans sa définition les « fragments » d'un acide nucléique selon l'invention tel que défini dans la présente description.
io Le gène isum2A, défini par la séquence SEQ ID N°1 comprend, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3',. respectivement a) une séquence non codante portant potentiellement des éléments régulateurs de la transcription et/ou de la traduction de ce gène, localisée en amont du premier exon, du nucléotide en position 1 Is jusqu'au nucléotide en position 1812 de la séquence SEQ 1D N°1;
b) une région dite « codante » qui comprend les trois exons et les deux introns du gène isum2A, cette région codante étant localisée du nucléotide en position 1813 jusqu'au nucléotide en position 4074 de la séquence SEQ ID N°1; et 2o c) une région non codante localisée en aval de la région codante, du nucléotide en position 4075 jusqu'au nucléotide en posïtion 5620 de la séquence SEQ ID N°1.
La séquence SEQ ID N°2, qui illustre un variant du gène isum2A, ne contient pas la totalité du cadre ouvert de lecture codant pour 2s un polypeptide ISUM2A. La séquence SEQ ID N°2 comprend une partie localisée du côté 3' de i'exon n°1, ainsi que la totalité des exons n°2 et n°3. Le nucléotide en position 1 de la séquence SEQ ID N°2 correspond au nucléotide en position 2063 de la séquence SEQ ID N°1. Le nucléotide en position 2004 de 1â séquence SEQ ID N°2 correspond au 3o nucléotide en position 4062 de la séquence SEQ ID N°1.
i outefois, la connaissance de la séquence SEî~ iD N°2 par l'homme du métier, et sa comparaison avec la séquence SEQ ID N°1, permet d'accéder directement à la totalité de la séquence codante du gène isum2A défini par la séquence SEQ ID N°2, par exemple en 3s ' complétant les bases manquantes de fexon n°1 de (a séquence SEQ ID

N°2 par les bases correspondantes de l'exon n°1 de la séquence SEQ ID
N°1, en se basant sur .les correspondances données ci-dessus et égâlement dans le tableau 1 ci-dessous.
De mëme, l'homme du métier peut obtenir l'acide nucléique du s gène isum2ä, par exemple en isolant, à partir des informations de la séquence SEQ ID N°1, les régions nucléotidiques équivalentes ou encore en produisant un acide nucléique hybride, obtenu en fusionnant les acides nucléiques de séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°2, sur la base des correspondances données ci-dessus et également dans le io tableau 1 ci-dessous.
Les caractéristiques structurales des trois introns et des deux exons du gène ISUM2A sont détaillées dans le tableau 1 ci-après.

Séauences des exons du gène Isum2A
is Exon Position du Position n nuclotide du nuclotide en 5' sur en 3' sur 1 1813 < 1 2099 37 3 3646 1588 4074 > 2004 L'invention est également relative à un acide nucléïque comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide exonique du gène Isum2A, tel que les polynucléotides 1 à 3 décrits dans lé tableau 1 ci-dessus, qui sont inclus dans l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2.
Un tel acide nucléique code pour au moins une partie du polypeptide codé par le gène Isum2A et peut notamment être inséré
dans un vecteur recombinant destiné à l'expression du produit de 2s traduction correspondant dans une cellule hôte ou dans une planfie transformée avec ce vecteur recombinant.
Un tel acide nucléique peut aussi ëtre utilisé pour la synthèse de sondes et d'amorces nucléotidiques destinées à la détection ou à
l'amplification de séquences nucléotidiques comprises dans le gène 3o Isum2A dans un échantillon, le cas échéant de séquences du gène Isum2A portant une ou plusieurs mutations, préférentiellement une ou plusieurs mutations de nature à modifier le phénotype d'une plante portant un tel gène Isum2A muté, en provoquant la production de graines affectées dans le développement du germe .

Séquences des introns du gène Isum2A
Intron Position sur Position n du nuclotide du nuclotide en 5' en 3' sur 1o d'invention est également relative à un acide nucléique comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide intronique du gène Isum2A, tél que les polynucléotides 1 et 2 décrits dans le tableau 2 ci-dessus, qui sont inclus dans l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2. ' 1s Un tel acide nucléique peut être utilisé comme sonde ou amorce oligonucléotidique pour détecter la présence d'au moins une copie du gène Isum2A dans un échantillon, ou encore pour amplifier une séquence cible déterminée au sein du gène Isum2A
Un tel acide nucléique peut aussi être utilisé pour amplifier une 2o sëquence cible déterminée au sein du gëne isum2A ou t'inhiber par une approche sens ou co-suppression, ou par l'utilisation d'ARN double brin (Wassenegger et al. 1996 ; Kooter et al. 1999) pour interFérence. Un tel acide nucléique peut également être utilisé pour rechercher des variants alléliques fonctionnels du gëne ISUM2, qui pourront ëtre utilisés dans 2s une méthode de sélection de plarites à embryon modifié en taille etiou développement.
La région génomique du gène lsum2A essentiellement restreinte à la région dite " codante " comprenant les 3 exons et les 2 ïntrons est définie comme la séquence débutant au nucléotide en 3o position 1813 et se terminant au nucléotide en position 4074 de la séquence SEQ ID N°1.

Une partie de l'exon n°1, la totalité des exons n°2 et 3 ainsi que les deux introns d'un variant dû. gène isum2A sont compris dans la séquence allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 2004 de la séquence SEQ ID N°2.
s II est précisé que, sur leur région commune, les séquences SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2 ont un pourcentage d'identité en nucléotides supérieur à 95°l°, ce pourcentage étant en fait supérieur à 99%.
L'invention a également pour objet un acide nuclëique comprenant un polynucléotide ~ possédant au moins 95% d'identité en 1o nucléotides avec la séquence nucléotidique débutant. au nucléotide en position 1813 et se terminant au nucléotide en position 4074 de la séquence SEQ ID N°1 ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention concerne aussi un acide nucléïque possédant au 1s moins 95% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique dëbutant au nucléotide en position 1813 et se terminant au nucléotide en position '4074 de la séquence SEQ ID N°1, ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention â encore pour objet un acide nucléique comprenant 20 la séquence nucléotidique débutant au nuclëotide en position 1813 et se terminant au nucléotide en position 4074 de la séquence SEQ ID N°1 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention a également trait à un acide nucléique consistant en la séquence nucléotidique débutant au nucléotide en position 1813 et se 2s terminant au nucléotide en position 4074 de la séquence SEQ ID N°1 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Un autre objet de l'invention consiste en un acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend l'une des séquences nucléotidiques suivantes:
3o a) la séquence allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 1812 de la séquence SE~t ID N°1, ou un acide nucléique de séquence complémentaire;
b) la séquence allant du nucléotide en position 1813 jusqu'au nucléotide en position 2099 de la séquence SEQ ID N°1, ou un acide 3s nucléique de séquence complémentaire;

c) la séquence allant du nucléotide en position 2100 jusqu'au nucléotide en position 2206 de la séquence SEQ ID N°1 , ou un acide nucléique de séquence complémentairé;
d) la séquence allant du nucléotide en position 2207 jusqu'au s nucléotide en position 2323 de la séquence SEQ ID N°1, ou un acide nucléïque de séquence complémentaire;
e) la séquence allant du nucléotide en position 2324 jusqu'au nuclëotide en position 3645 de la séquence SEQ ID N.°1, ou un acide nucléique de séquence complémentaire;
1o f) la séquence allant .du nucléotide en position 3646 jusqu'au nuclëotide en position 4074 de la séquence SEQ ID N°1, ou un acide nucléique de séquence complémentaire; et g) la séquence allant du nucléotide en position 4075 jusqu'au nucléotide en position 5620 de la séquence SEQ ID N°1 ou un acide 1s nucléique de séquence complémentaire.
L'acide nucléique de séquence SEQ iD N°1 est représenté à la figure 1, dans laquelle sont également détaillées les positions des différents exons et introns du gëne Isum2A.
2o PRODUITS DE TRANSCRIPTION DU GENE Isum2A
II a été montré selon l'invention que le gène Isum2A est transcrit sous la forme d'un ARN messager. Cet ARN messager comporte un cadre de lecture ouvert codant pôur la protéine ISUM2A.
2s La partie de l'ADNc du gène lsum2A comprenant le cadre de lecture ouverfi codant pour le polypeptide iSUM2A de sëquence SEQ iD
N° 5 a une longueur de 833 nûcléotides et est référencé comme la séquence SEQ ID N°3 du listage de séquences. L'ADNc de séquence SEQ ID N°3 dérive du variant de plante sauvage désigné HD5xHD7.
Cet 3o ADNc est représenté sur la Figure 2.
La partie de l'ADNc du gène Isum2A comprenant une partie du cadre de lecture ouvert codant pour le polypeptide ISUM2A de séquence SEQ ID N° 6 a une longueur de 621 nucléotides et est référencé
comme la sëquence SEQ ID N°4 du listage de séquences. L'ADNc de séquence SEQ ID N°4 dérive du variant de plante sauvage désigné A188. Cefi ADNc partiel est représenté sur la Figure 3.
Les acides nucléiques de séquences SEQ ID N°3 et SEQ ID
N°4 présentent des similarités avec une séquence d'EST référencée s dans la base de données GENBANK sous le numéro d'accès A1001298 et désignée « ISUM2 ». C'est la raison pour laquelle il a éfié attribué la désignation « isum2A » au gène nouvellement découvert selon l'invention.
La séquence de l'EST N°A1001298 possède un degré d'identité
1o en nucléotides de 94% et 95% avec les séquences SEQ 1D N°3 et SEQ
ID N°4, respectivement. Aucun cadre de lecture ouvert n'est décrit pour cet EST.
Les acides nucléiques .de séquences SEQ ID N°3 et SEQ ID
N°4 présentent aussi des similarités avec une séquence d'EST
Is référencée dans la base de données GENBANK sous le numéro d'accès AI374506. Cette séquence a été obtenue à partir du méme clone « MEST6-D3 » que la séquence Ai . 001298. La séquence de l'EST
n°AI374506 posséde un degré d'identité en nuc(éotides de 92% et 98%
avec tes séquences SEQ ID N°3 et SEQ ID N°4, respecfiivemenfi.
Aucun 2o cadre de lecture ouvert n'est décrit pour cet EST.
Un autre objet de l'invention consiste en un acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A et possédanfi au moins 99% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4, ou avec un fragment de cette 2s séquence nucléofiidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à ces acides nucléiques.
L'invention est aussi relâtive à un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A et possédant au moins 99% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°3 ou SEQ ID
N°4 30 ou un fragmenfi de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à ces acides nucléiques.
L'invention a encore pour objet un acide nucléique caractérisé
en ce qu'if comprend la séquence nucléotidique SEQ ID N°3 ou SEQ ID
N°4 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

Fait également partie de l'invention un acide nucléique constitué
de la sëquence nucléotidique SEQ ID N°3 au SEQ ID N°4, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Le gène Isum2A code pour un polypeptide de 143 acides s aminés de longueur dont deux variants alléliques ont été identifiés selon l'invention, respectivement les polypeptides variants de séquence SEQ
ID N°5 et SEQ ID N°6, qui possédent entre eux un degré
d'identité de plus de 99%.
En conséquence, l'invention est également relative à un acide 1o nucléique codant pour un polypeptide possédant au moins 95% d'identité
en acides aminés avec la séquence SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6.
L'invention a également trait à un acïde nucléique caractërisé
en ce qu'il code pour le polypeptide de séquence SEQ ID N°5 ou SEQ ID
N°6.
~s Fait également partie de l'invention un acide nucléique codant pour un " fragment " d'un polypeptide possédant au moins 95% d'identité
en nucléotides avec un polypeptide de séquence en acides aminés SEQ
ID N°5 ou SEQ ID N°6.
L'invention concerne aussi un acide nucléique codant pour un 2o fragment d'un polypeptide de séquence en acides aminés SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6.
Un polypeptide ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec un polypeptide de référence comprend au moins 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1 %, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% ou 2s 99,9% d'identité en acides aminés avec le polypeptide de référence.
Sont englobés dans la définition d'un polypeptide ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec un polypeptide de référence selon l'invention, les polypeptides dits " variants ". Par " variant " d'un polypeptide selon l'invention, on entend un polypeptide dont la séquence 3o en acides aminés comprend une ou plusieurs substitutions, additïons ou délétions d'au moins un résidu d'acide aminé, par rapport à la séquence d'acides aminés du polypeptide de référence, étant entendu que les substitutions d'acides aminés peuvent être de nature conservative ou non conservative.

Un variant d'un polypeptide de référence selon ('invention consiste en un polypeptide qui conserve la fonction ou l'activité
biologique du polypeptide de référence et/ou qui est reconnu par des anticorps dirigés contre le polypeptide de référence. Ces variants s polypeptidiques peuvent résulter de variations alléliques caractérisées par des différences dans les séquences nucléotidiques du gène codant pour ces polypeptides. De tels variants polypeptides peuvent aussi résulter d'épissages alternatifs ou de modifications post-traductionnelles.
Par " fragment " d'un polypeptide de référence selon l'invention, 1o on entend un polypeptide possëdant au moins 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 135 ou 140 acides aminés consécutifs d'un polypeptide tel que défini dans la présente description.
SONDES ET AMORCES SELON L'INVENTION
is Les acides nucléiques selon l'invention, et en particulier les séquences nucléotidiques SEQ ID N°1 à SEQ iD N°4, leurs fragments d'au moins 12 nucléotides, les séquences ayant au moins 95% d'identité
en nucléotides avec au môins une partie des séquences SEQ ID N°1 à
2o SEQ ID N°4, ainsi que les acides nucléiques de séquence complémentaire, sont utiles pour la détection de la présence d'au moins une copie d'une séquence nucléotidique du gène lsum2A ou encore d'un fragment ou d'un variant allélique de cette dernière dans un échantillon.
Font également partie de l'invention les sondes et amorces 2s nucléotidiques hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique choisi parmi (es séquences SEQ ID
N°1 à SEQ ID N°4.
Les conditions d'hybridation ci-dessous sont mises en oeuvre pour l'hybridation d'un acide nucléique, sonde ou amorce, de 20 bases 3o de longueur.
Le niveau et la spécificité d'hybridation dépend de différents paramètres, tels que a) la pureté de la préparation de l'acide nucléique sur lequel la sonde ou l'amorce doit s'hybrider ;

b) la composition en bâses de la sonde ou de l'amorce, les paires de base G-C possédant une plus grande stabilité thermique que lés paires de bases A-T ou A-U
c) la longueur de la séquence de bases homologues entre la s sonde ou l'amorce et l'acide nucléique ;
d) la force ionique : le taux d'hybridation augmente avec l'accroissement de la force ionique et la durée du temps d'incubation ; ' e) la température d'incubation ;
f) la concentration de l'âcide nucléique sur lequel la sonde ou l'amorce doit s'hybrïder ;
g) la présence d'agents dénaturants tels que des agents favorisant la rupture des liaisons hydrogène, comme le formamide ou l'urée, qui accroissent la stringence de l'hybridation ;
h) le temps d'incubation, le taux d'hybridation augmentant avec 1s la durée de l'incubation ;
i) la présence d'agents d'exclusion de volume, tels que le dextran ou le sulfate de dextran, qui augmentent le taux d'hybridation du fait qu'ils accroissent tes concentrations effectives de la sonde ou l'amorce et de l'acide nucléique qui doit s'hybrider, au sein de la 2o préparation.
Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm).
Pour les séquences comprenant plus de 360 bases, Tm est 2s définie par la relation:
Tm= 81,5 + 0,41 (%G+C)+16,6 Log(concentration en cations) -0,63 (% formamide)-(600/nombre .de bases) (SAMBROOK et al., (1989), pages 9.54-9.62).
Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est 3o définie par la relation: Tm= 4(G+C) + 2(A+T).
Dans des conditions de stringence appropriées, dans lesquelles les séquences aspécifiques n'hybrident pas, la température d'hybridation est approximativement de 5 à 30°C, de préférence de 5 à 10°C en-dessous de Tm.

Par « conditions d'hybridation de 'forte stringence » selon l'invention, on entend des conditions d'hybridation telles que l'on se place à une température d'hybridation dé 5°C au-dessous du Tm.
Les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être s adaptées en fonction de la longueur et de la composition en bases de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon les techniques connues de l'homme du métier.
Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES
~o et HIGGINS (1985) ou encore dans l'ouvrage de AUSUBEL et al. (1989).
A titre illustratif, les conditions d'hybridation utilisées pour un acide nucléique de 200 bases de longueur sont les suivantes Préhybridation:
mêmes conditions que pour l'hybridation 1s durée: 1 nuit.
Hybridation:
x SSPE (0.9 M NaC1,.50 mM phosphate de sodium pH 7.7, 5 mM EDTA) 20 5 x Denhardt's (0.2% PVP, 0.2% Ficoll, 0.2% SAB) 100 pg/ml ADN de sperme de saumon 0.1 % SDS
durée: ~ nuit.
Lavages:
2s 2 x SSC, 0.1 % SDS 10 min 65°C
1 x SSC, 0.1 % SDS 10 min 65°C
0.5 x SSC, 0.1 % SDS 10 min 65°C
0.1 x SSC, 0.1 % SDS 10 min 65°C.
so Les sondes ou les amorces nucléotidiques selon l'invention comprennent au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, en particulier d'un acide nucléique de séquences SEQ
ID N°1 à 4 ou de sa séquence .complémentaire, d'un acïde nucléique ayant 95% d'identité en nucléotides avec une séquence choisie parmi les 3s séquences SEQ ID N°1 à 4 ou . de sa séquence complémentaire ou encore d'un acide nucléique hybridant dans des conditions d'hybridation de forte stringence avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ
ID N°1 à 4 ou de sa séquence complémentaire.
De préférence, des sondes ou amorces nucléotidiques selon s l'invention auront une longueur d'au moins 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 ou 3000 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention.
Alternativement, une sonde ou une amorce nucléotidique selon l'invention consistera et/ou comprendra les fragments d'une longueur de zo 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 ou 3000 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention.
Des exemples d'amorces et de couples d'amorces permettant d'amplifier un fragment d'acide nucléique du gène Isum2A de séquence Is SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2 sont par exemple les amorces SEQ ID N°10 à13et17à23.
L'utilisation des amorces de séquences SEQ ID N°10 à 13 et 17 à 23 dans des réactions d'amplification est décrite dans les exemples.
Une amorce ou une sonde nucléôtidique selon l'invention peut 20 être préparée par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon des techniques telles que la méthode au phosphodïester de NARANG et ai. (1979) ou de BROWN et al. (1979), la méthode au diéthylphosphoramidïtes de BEAUCAGE et al.
2s (1980) ou encore la technique sur support solide décrite dans le brevet européen n°EP 0 707 592. Chacun des acides nucléiques selon l'invention, y compris les sondes et amorces oligonucléotidiques décrites ci-dessus, peut étre marqué, si désiré, en incorporant une molécule détectable, c'est-à-dire un marqueur détectable, par des moyens 3o spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou encore chimiques.
Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des isotopes radioactifs (32P 3H, 3~S), des molécules fluorescentes (5 bromodéoxyuridine, fluorescéine, acétylaminofluorène) ou encore des 3s ligands tels que la biotine.

Le marquage des sondes est fait de préférence par incorporation de molécules marquées au sein des polynuclëotides par extension d'amorces, ou bien par rajout sur les extrémités 5' ou 3'.
Des exemples de marquage non radioactif de fragments s d'acides nucléiques sont décrits notamment dans le brevet français n°FR
78 10 975 ou encore dans les articles de URDEA et al. (1988) ou SANCHEZ PESCADOR et al. (1988).
De manière avantageuse, les sondes selon l'invention peuvent avoir des caractéristiques structurelles de nature à permettre une 1o amplification du signal, telles que les sondes décrites par URDEA et al;
(1991 ) ou encore dans le brevet européen n°EP 0 225 807 (Chiron).
Les sondes oligonucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées notamment dans des hybridations de type Southern à l'ADN
génomique du gène Isum2A ou encore dans des hybridations à l'ARN
1s messager de ce gène lorsque l'expression du transcrit correspondant est recherchée dans un échantillon.
Les sondes selon l'invention peuvent aussi âtre utilisées pour la détection de produits d'amplification PCR ou encore pour la détection de mésappariements.
20 Des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent âtre immobilisées sur un support solide. De tels supports solides sont bien. connus de l'homme du métier et comprennent des surfaces des puits de plaques de micro-titration, des billes de polystyrène, des billes magnétiques, des bandes de nitrocellulose ou encore des as microparticules telles que des particules de latex.
En conséquence, l'invention a encore pour objet un açide nûcléique utïlisable en tant que sonde ou amorce nucléotidique caractérisé en ce qu'il comprend au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique fiel que défini ci-dessus, en particulier d'un acide 3o nucléique de séquences nuclèotidiques SEQ 1D N°1 à SEQ ID
N°4.
L'invention est également relative à un acide nucléique utilisable en tant que sonde ou amorce nucléotidique caractérisé en ce qu'il consiste en un polynucléotide d'au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, de manière tout à fait préférée d'un acide nucléique de séquences choisies parmi les séquences nucléotïdiques SEQ ID N°1 à SEQ ID N°4.
Comme décrit ci-dessus, un tel acide nucléique peut en outre étre caractérisé en ce qu'il est marqué par une molécule détecfiable.
s Un acide nucléique utilisable en tant pue sonde ou amorce nucléotidique pour la détection ou l'amplification d'une séquence génomique, de l'ARNm ou de l'ADNc du gène Isum2A peut en outre être caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les séquences suivantes a) les séquences nucléotidiques hybridant, dans des conditions io d'hybridafiion de forte stringence, avec un acide nuclëique de séquence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2; et b) les séquences comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 ou SEQ ID
N°2.
is La présente invention concerne également un procédé de détection de la présence d'un acide nucléique du gène Isum2A dans un échanfiillon, ladite méthode comprenant les ëtapes de 1 ) metfire en contact une sonde ou ~ une pluralifié de sondes nucléotidiques selon l'invention avec l'échantillon à tester ;
20 2) détecter le complexe évenfiuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.
Selon un mode de réalisafiion particulier du procédé de détection selon l'invention, la ou les sondes oligonucléotidiques sont immobilisées sur un support.
2s Selon un autre aspect, les sondes oligonucléotidiques comprennenfi un marqueur détectable.
L'invention concerne en outre un nécessaire ou kit pour la détection de la présence d'un acide nucléique selon l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant:
3o a) une ou plusieurs sondes nucléotidiques telles que décrites ci-dessus ;
b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'hybridation.
Selon un premier aspect, lé nécessaire ou kit de détection est 3s caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support.

Selon un second aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.
Selon un mode de réalisation particulier du kit de dëtection s décrit ci-dessus, un tel kit comprendra une pluralité de sondes oligonucléotidiques conformes à l'invention qui vont être utilisées pour détecter des séquences cïbles d'intérét du gène lsum2A ou alternatïvement dëtecter des mutations dans les régions codantes ou les régions non codantes du gène Isum2A, plus particulièrement des acides 1o nucléiques de séquence SEQ ID N°1 à SEQ ID N°4 ou les acides nucléiques de séquence complémentaire.
On entend par " séquence cible " au sens de l'invention, une séquence nucléotidique comprise dans un acide nucléique, ladite séquence nucléotidique hybridant, dans les condïtions d'hybridation Is spécifiées dans la description, avec une sonde ou une amorce nucléotidique de l'invention.
Une séquence cible peut être par exemple une séquence comprise dans un acide nucléique régulateur du gëne Isum2A ou encore une séquence comprise dans une région codante gènomique ou de 20 l'ADNc de ce gène.
Les amorces nucléotidiques selon l'invention peuvenfi être utilisées pour amplifier un fragment nucléotidique quelconque (ADNg, ADNc, ARNm) du gène Isum2A, et plus particuliërement tout ou partie d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 à SEQ ID N°4, ou encore 2s un fragment ou un variant de ces séquences.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement d'un acide nucléique de.séquence SEQ ID N°1 à SEQ
ID N°4 ou un fragment ou un variant allélique de celui-ci contenu dans un 3o échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de a) mettre en contacfi l'échantillon dans lequel la présence de l'acide nucléique cible est suspectée avec une paire d'amorces nucléotidiques dont la position d'hybridafiion est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de la région de l'acide nucléique cible du gène Isum2A dont l'amplification est recherchée, en présence des réactifs nécessaires à la réaction d'amplification ; et b) détection de l'acide nucléique éventuellement amplifié.
Pour mettre en oeuvre le procédé d'amplification tel pue défini s ci-dessus, on aura avantageusement recours à l'une quelconque des amorces nucléotidiques décrites ci-après.
L'invention a en outre pour objet un nécessaire ou kit pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ
1o ID N°1 à 4, ledit nécessaire ou kit comprenant a) un couple d'amorces nucléotidiques conforme à l'invention, dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de l'acide nucléique cible du gène Isum2A dont l'amplification est recherchée ;
zs b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification.
Un tel nécessaire ou kit d'amplification comprendra avantageusement au moins une paire d'amorces nucléotidiques telle que décrite ci-dessus.
2o Selon un mode de réalisation préféré, des amorces selon l'invention comprennent tout ou partie d'un polynucléotide choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID N°10 à 13 et 17 à 23.
CONSTRUCTIONS D'ACIDE NUCLEIQUE SELON L'INVENTION
L'isolement et la caractérisation du gène isum2A selon 2s l'invention et la démonstration de la nécessité de l'expression du gène isum2A à un niveau détectable dans la plante pour obtenir un développement normal de ('embryon de la graine, après pollinisation, ont permis aux inventeurs de réaliser des constructions d'acide nucléique permettant l'expression d'au moins une copie fonctionnelle du gène so isum2A dans un hôte cellulaire, particulièrement dans une cellule de plante transformée avec de telles constructions d'acide nucléique.
De préférence, ladite cellule porte au moins un allèle isum2A
non fonctionnel. De manière tout à fait préférée, ladite cellule porte les deux allèles isum2A non fonctionnels.

II a été mis au point selon l'invention des constructions d'acide nucléique permettant l'obtention d'une expression contrôlée d'au moins une copie fonctionnelle d'un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A dans un hôte cellulaire, particulièrement dans une cellule de s plante.
En conséquence, l'invention a également pour objet un acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A tel que défini dans la présente description, ou pour un fragment de ce po(ypeptide, ledit acide nucléique comprenant de plus un 1o polynucléotide régulateur capable de réguler la transcription ou la traduction du polynucléotide codant pour le polypeptide ISUM2A, ou le fragment de ce polypeptide.
Fait également partie de l'invention l'acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique tel que défini ci-dessus.
is Une construction d'acide nucléique comprenant un polynucléatide codant pour un polypeptide ISUM2A ainsi qu'un polynucléotide régulateur est également désignée « cassette d'expression » dans la présenfie description. De manière générale, une cassette d'expression selon l'invention comprendra au moins un 2o polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A, les autres éléments fonctionnels permettant l'expression du polypeptide ISUM2A pouvant être portés par un vecteur dans lequel la cassette d'expression peut ëtre insérée.
Une cassette d'expression selon l'invention peut aussi contenir, 2s de manière non limitative, outre. un polynucléotide régulateur, également d'autres é(ëments fonctionnels téls que des séquences leader ou une séquence terminateur ou encore des séquences d'initiation et d'arrêt de la transcription.
Selon un autre mode de réalisation d'une construction d'acides 3o nucléiques de l'invention, on utilise des promoteurs.connus pour diriger l'expression de la séquence d'acide nûcléique fusionnée de façon constitutive ou tissu spécifique (graine) ou stade développement.
A titre d'exemple, on peut citer:
a) des promoteurs constitutifs:

le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur, ou le promoteur 19S ou avantageusement le promoteur constitutif double 35S (pd35S), décrits dans l'article de ICay et al., 1987 ;
- le promoteur active du riz suivi de l'intron active de riz (pAR
s IAR) contenu dans le plasmide pAct1-F4 décrit par Mc Elroy et al., 1991 ;
- le promoteur constitutif EF-1 a du gène codant pour le facteur d'élongation végétale décrit dans la demande PCT n°WO
90/02172 ou encore dans l'article de AXELOS et al. (1989) ;
io - le superpromoteur chimérique PSP (NI et al., 1995) consfiitué de la fusion de trois copies de l'élément d'activité transcriptionnelle du promoteur du gène de la octopin synthase de Agrobacterium tumefaciens et de l'élément d'activation de la transcription du promoteur du gène de la mannopin synthase de Agrobacterium 1s tumefaciens ; et - le promoteur ubiquitine du tournesol (BINET et al., 1991 ) ;
- le promoteur de l'ubiquitine 1 de maïs (CHRISTENSEN et al., 1996).
- le promoteur de l'ubiquitine 1 de maïs (Christensen et al., 1996) 20 b) des promoteurs spécifiques:
- des promoteurs spécifiques des graines (Datla, R. et al., 1997), notamment les promoteurs de la napine (EP 255 378), de la phaseoline (Riggs et al., 1989)., de la glutenine, de l'héliantinine (W0 92117580), de l'albumine (W0 98/45460), de l'oléosine (W0 2s 98/45461 ), de l'ATS1 ou de l'ATS3 (W0 99120775).
- des promoteurs Esr tels que décrits dans la demande PCT/FROO102596 qui permettent une expression à la fois spécifique à
l'interface entre l'embryon . et l'albumen et précoce au cours du développement de l'albumen.
30 - le promoteur du gène Vp1 décrit par Mc Carty et al. (1989).
Les acides nucléiques régulateurs ci-dessus peuvent étre utilisés pour surexprimer le polynucléotide codant pour le polypeptide ISUM2A
ou encore un fragment du polypeptide ISUM2A, en particulier lorsque l'obtention de plantes possédant des graines à gros embryons riches en 3s huile est recherchée.

Ainsi, l'invention concerne aussi un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A ou pour un fragment d'un polypeptide ISUM2A tel que défini ci-déssus efi comprenant un polynucléotide régulateur régulant la transcription etlou la traduction de la séquence codante, dans lequel le s polynucléotide régulateur permet un haut niveau de transcription de l'ARNm correspondant etlou un haut niveau de traduction du polypeptide correspondant dans l'organismé hôte, y compris cellule hôte ou plante, dans lequel il est exprimé.
L'invention est également relatïve à l'utilisation d'un acide nucléique 1o tel que défini ci-dessus, d'un vecteur recombinant comprenant cet acide nucléique ou encore d'une cellule hôte transfectée ou transformée avec cet acide nucléique pour l'obtention d'une plante transformée susceptible de produire des graines riches en huile.
Dans un mode de réalisation préférée, on recherche une ~s expression contrôlée du polynucléotide codant pour le polypeptide ISUM2A, tout particulièrement . lorsque la production de graines à
développement de germe affecté est recherchée.
Comme indiqué précédemment, un défaut dans l'expression du gène isum2A provoque la production de graines sans germe, ces graines 2o n'étant pas fertiles et ne permettant pas la multiplication des plantes mutées dans le gène isum2A.
De plus, l'expression du gène isum2A semble nécessaire à une croissance normale de la plante avant la pollinisation.
La pollinisation est le moment où le pollen mature entre en 2s contact avec une soie réceptive.
If en résulte que l'obtention d'une production de graines à
développement de germe affecté par une plante implique a) une expression normale d'au moins une copie fonctionnelle d'un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A depuis le stade 3o de germination de la graine jusqu'à la pollinisation de la plante°;
et b) une absence de la transcription ou de la traduction de cet acide nucléique dès la pollinisation de la plante, afin de produire des graines affectées dans le développement du germe.
L'absence de transcriptiôn ou de traduction de l'acide nucléique 3s codant pour un polypeptide ISUM2A dès le stade de la pollinisation affecte ou bloque le développement de l'embryon de la graine afin d'aboufiir à l'objectif recherché.
Lorsqu'on cherchera à reproduire et multiplier les plantes d'intérét, et que la production dé graines normales et fertiles sera s recherchée, l'expression normale du polypeptide ISUM2A sera poursuivie pendant tout le développement de la plante, y compris après la pollinisation.
. Pour poursuivre l'objectif de l'invention, il est donc particuliérement avantageux d'utiliser des constructions d'acides 1o nucléiques dans lesquelles le polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A est placé sous le contrôle d'un polynucléofiide régulateur dont l'activité peut êfire contrôlée dans le temps.
L'invention est donc égalemenfi relative à un acide nucléiqûe comprenant un polynucléotide codant pour un polypepfiide ISUM2A
zs choisi parmi les séquences ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec les séquences SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6 et qui comprend aussi un po(ynucléotide régulateur sensible à l'action, directe ou indirecte, d'un signal inducteur, aussi désigné polynucléotide régulateur inductible.
2o Selon un premier aspect, le polynucléotide régulateur est un polynucléotide « répresseur » de la transcription ou de la traduction.
Par polynucléotide régulâteur « répresseur », on entend selon l'invention une séquence régulatrice dont l'acfiivité constitutive peut ëtre bloquée par un signal externe. , Un tel signal externe peut être l'absence 2s de fixafiion d'un facfieur de transcription reconnu par le polynucléotide régulateur répresseur. L'absence de fixation du facteur de transcription peut étre induite sous l'effet du signal inducteur répresseur auquel le polynucléotide régulateur répresseur est sensible.
Selon ce premier mode de réalisation particulier, l'expression de so la séquence codant pour un polypeptide ISUM2A est constitutive dans l'hôte cellulaire choisi, en l'absence du signal inducteur répresseur auquel le polynucléotide régulateur répresseur est directement ou indirectement sensible.
La mise en contact de l'hôte cellulaire avec le signal inducteur ss répresseur a pour effet, grâce à une action directe ou indirecte sur le polynucléotide régulateur répresseur, d'inhiber et/ou de bloquer l'expression du polynucléotide codant pour le polypeptide ISUM2A.
Pour réaliser les constructions d'ADN selon l'invention comprenant un polynucléotide régulateur répresseur, l'homme du métier s aura recours à ses connaissances générales techniques dans le domaine de l'expression de gènes chez les végétaux.
Selon un second mode de réalisation d'une construction d'acide nucléique de l'invention, le po(ynucléotide rëgulateur est un polynucléotide activateur de la transcription ou de la traduction.
~o De manière tout à fait préférée, le polynucléotide régulateur activateur de la transcription ou de la traduction est sensible, directement ou indirectement, à l'action d'un signal inducteur activateur. ¿1 s'agit alors d'un polynucléotide « activateur inductible » au sens de l'invention.
Selon l'invention, un . polynucléotide régulateur du type 1s « activateur inductible » est une séquence régulatrice qui n'est activée qu'en prësence d'un signal externe. Un tel signal externe peut étre la fixation d'un facteur de transcription, la fixation d'un facteur de transcription pouvant étre induite sous l'effet du signal inducteur activateur auquel le polynucléotide régulateur est directement ou 2o indirectement sensible.
Lorsqu'une telle construction d'acides nucléiques est utilisée dans un hôte cellulaire, l'expression du polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A selon l'invention peut être induite en mettant en contact l'hôte cellulaire transformé avec le signal inducteur activateur 2s auquel le polynucléotide régulateur activateur est, directement ou indirectement, sensible.
Lorsque l'on recherche l'absence d'expression du polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A chez cet hôte cellulaire transformé, il suffit alors d'éliminer ou supprimer la présence du so signal inducteur activateur auquel le polynucléotide régulateur de la transcription ou de la traduction est sensible.
L'homme du métier aûra recours à ses connaissances générales techniques dans le domaine des polynucléotides régulateurs, en particulier ceux actifs chez les végétaux, pour définir les constructions 3s répondant à la définition du second mode de réalisation ci-dessus.

Pour les besoins d'une bonne clarté dans l'exposé des caractéristiques des construcfiions nucléotidiques qui sont préférentiellement utilisées poûr l'ôbtention d'une production de graines sans germe, plusieurs systèmes inductibles et contrôlables de s l'expression d'un polypeptide ISUN12A dans des plantes sont définis ci-après. Les caractéristiques générales de systèmes d'expression appropriés sont tout d'abord résumés dans le Tableau 3 ci-dessous, puis leurs aspects fonctionnels sont ensuite détaillés.
1o Tableau 3 Exemples de systèmes d'expression inductibles de ISUM2A.
Systme d'inducton Systme d'expression Fond gntique de Promoteur Gne Promoteur Gne l'hte cellulaire ou de la plante I isum2A~sum2A'a' ConstitutifActivateurSous contrleIsum2A

rgulablede l'activateur par inducteur 11 isum2Alisum2A' ConstitutifRpresseurSous contrleIsum2A
ou spcifque rgulabledu rpresseur de l'embryon par inducteur III Isum2A'"llsum2A'"aConstitutifActivateurSous contrlePolynuclotide ou spcifiqe rgulablede l'activateurantisens de de l'embryon par Isum2A

inducteur a isum 2A7isum2A-: homozygote pour une copie non fonctionnelle du gène isum2A, par exemple une mutation.
blsum 2A+/Isum2A*: homozygote portant deux copies fonctionnelles du ~s gène isum2A.
Description du système d'expression inductible I du tableau 3 !
Le système d'expression inductible ! du tableau 3 constitue une illustration d'une construction d'acides nucléiques dans laquelle le polynucléotide régulateur est un polynucléotide « activateur inductible »
de la transcription et/ou de la traduction, selon le second mode de réalisation défini précédemment.
Le système d'expression I comprend:
s (i) une premiëre cassette d'expression comprenant un acide nucléique codant pour un polypéptide ISUM2A placé sous le contrôle d'un promoteur dont l'activité est induite uniquement en présence d'un composé activateur, lorsque ce composé activateur, en général un facteur de transcription, est lié à un composé inducteur.
io (ü) une seconde cassette d'expression comprenant un acide nucléique codant pour le composé activâteur, par exemple le facteur de transcription ci-dessus, placé sous le contrôle d'un promoteur permettant l'expression constitutive du composé activateur.
Selon le système 1, la transcription ou la traduction de la is séquence codant pour un polypeptide ISUMZA est induite uniquement lorsque le composé activateur est complexé au composé inducteur. Le complexe entre le composé activateur et le composé inducteur se fixe sur le promoteur contrôlant l'expression de l'acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A, et~active l'expression de ce dernier.
20 Un exemple du système I est illustré à l'exemple 3, dans lequel, ¿e système comprend:
(i) un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A
placé sous le contrôle d'un promoteur contenant la séquence UAS, qui est reconnue par le composë activateur GVG. Le composé activateur 2s GVG est une protéine de fusion entre le domaine de liaison à l'ADN de la protéine GAL4, le domaine activateur du gène VP16 et le récepteur au glucocorticoïde du rat (GR).
(ü) un acide nucléiqué codant 'pour la protéine de fusion GVG
définie ci-dessus, qui est placé sous le contrôle d'un promoteur 3o constitutif.
Dans l'exemple 3, la protéine de fusion GVG est exprimée constitutivement dans la plante, mais n'active pas le promoteur contrôlant l'expression du polypeptide lSUM2A, en l'absence de glucocorticoïde.

En revanche, lorsque la plante est mise en présence du composé inducteur représenté par un glucocorticoïde, le glucocorticoïde se fixe sur la protéine de fusion GVG, et le complexe ainsi formé enfire le composé inducteur activateur (glucocorticoïde) et le composé activateur s (la protéine de fusion GVG) va se fixer sur la séquence UAS du promoteur contrôlant l'expression d'un polypeptide ISUM2A, ce qui active le promoteur contenant la séquence UAS et induit la synthèse du polypeptide ISUM2A.
Dans le système d'expression inductible ci-dessus, le 1o glucocorticoïde constitue le composé inducteur.
Le signal inducteur activateur est la fixation du complexe composé activateur/composé inducteur (polypeptide de fusion GVG/glucocorticoïde) sur le ~polynucléotide régulateur activateur (promoteur contenant la séquence UAS).
Is On utilisera le système d'expression I préférentiellement dans un hôte cellulaire végétal ou dans une plante dont les deux copies du gène isum2A sont non foncfiionnelles, par exemple dont les deux copies du gène isum2A sont mutées.
2o Système d'expression inductible II du tableau 3.
Le système d'expression inductible II est une illustration du mode de réalisation d'une construction d'acides nucléiques selon l'invention, selon le premier mode de réalisation exposé précédemment, dans lequel le polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A est 2s placé sous le contrôle d'un polynucléotide régulateur « répresseur ».
Dans le système II selon le tableau 3, le système d'expression contient deux cassettes d'expression, respectivement:
(i) une première cassette d'expression comprenant un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A, placé sous le contrôle 3o d'une région régulatrice dont l'activité est constitutive parce qu'elle est induite en présence d'un composé activateur produit de manière constitutive;
(ü) une seconde cassette d'expression comprenant un acide nucléique codant pour le composé activateur actif sur la région 3s régulatrice de la cassetfie d'expression (i) ci-dessus, ledit acide nucléique codant pour le composé activateur étant placé sous le contrôle d'un promoteur constitutif, préférentiellement un promoteur constitutif fort, ou encore un promoteur actif spécifiquement dans les cellules de l'embryon de la graine.
s Dans le système II, le composé activateur perd sa fonction d'activaton de la région régulatrice contrôlant l'expression de l'acide nucléique codant pour un polypeptide iSUM2A, lorsque ce composé
activateur est mis en prësence,d'un ligand spëcifique, qui est ici désigné
composé inducteur répresseur.
1o Ainsi, en l'absence du ligand spécifique constituant le composé
inducteur répresseur, le composé activateur est exprimé de manière constitutive et active l'expression d'un polypeptide ISUM2A.
En revanche, lorsque le composé activateur est mis en présence du composé inducteur répresseur avec lequel il se lie, le zs composé activateur est désactivé et ne se fixe plus sur la région régulatrice contrôlant l'expression de l'acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A. Dans cette situation, le polypeptide ISUM2A n'est plus exprimé.
L'exemple 2 illustre un mode de réalisation particulier d'un 2o système II tel que défini ci-dessus. Le système II présenté à l'exemple 2 comprend respectivement:
(i) une première cassette d'expression comprenant un acide nucléique codant pour le composé activateur tTA, placé sous le contrôle d'un promoteur constitutif fort, le promoteur du gène de l'actine 1 du riz;
2s et (ü) une seconde cassette d'expression comprenant un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A placé sous le contrôle d'un promoteur contenant un motif TRE, le promoteur étant activé
lorsque l'activateur tTA se fixe sur l'élément TRE.
30 Ainsi, en l'absence de .tout composé inducteur répresseur, le composé activateur tTA est produit de manière constitutive et active le promoteur contrôlant la séquence codant pour un polypeptide ISUM2A.
En revanche, en présence du composé inducteur répresseur, qui dans ce cas est la tétracycline ou un dérivé de la tétracycline, 3s l'activateur tTA est désactivé et ne se fixe plus sur le motif TRE du promoteur contrôlant l'acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A. Dans cette situation, en présence de tétracycline, le polypeptide ISUM2A n'est plus exprimé.
Le signal inducteur répresseur est !'absence de fixatiôn du s . complexe composé activateur/composé inducteur répresseur (activateur tTAltéfiracycline) sur le polynucléotide régulateur répresseur (promoteur contenant le motif TRE).
Préférentiellement, un système d'expression II tel que défini ci dessus sera utilisé dans un hôte cellulaire végétal ou dans une plante 1o pour laquelle les deux copies du gène isum2A sont mutées ou inactivées.
Système d'expression 111 is Le système d'expression III, qui est résumé dans le tableau 3, est trës similaire, au regard des êléments de rëgulation de l'expression des cassettes d'expression qu'il contient, au système d'expression I ci-dessus.
Avec le système d'expression III, il est possible de contrôler 20 l'expression d'un polynucléotide antisens susceptible d'inhiber la production d'un polypeptide ISUM2A dans une plante comprenant au moins une copie fonctionnelle du gène isum2A, préférentiellement dans une plante comprenant les deux copies du gène isum2A fonctionnelles.
Le système III d'expression comprend deux cassettes 2s d'expression, respectivement:
(i) une cassette d'expression contenant un acide nucléique codant pour un polynucléotide antisens ou RNAi inhibant la traduction du polypeptide ISUM2A, cet acide nucléique étant placé sous le contrôle d'un promoteur qui est activé par un composé activateur donné lorsque 3o ce composé activateur est lié à un composé inducteur; et (ü) une cassette d'expression comprenant un acide nucléique codant pour le composé activateur, cet acide nucléique étanfi placé sous le contrôle d'un promoteur constitutif ou spécifique de l'embryon, préférentiellement un promoteur fort.

Selon le système d'expression III, en l'absence de liaison du composé activateur avec le composé inducteur, le promoteur contrôlant l'expression du polynucléotide antisens ou RNAi est inactif et le polynucléotide antisens n'est pas produit.
s En revanche, en présence du composé inducteur capable d'activer le composé activateur, par exemple en se complexant avec celui-ci, le composé activateur activé se fixe sur le promoteur contrôlant l'expression du polynucléotide antisens isum2A ce qui active l'expression du pofynucléotide antisens entraînant une inhibition de la traduction du io gène isum2A.
Grâce au système d'expression III, la synthèse du polypeptide ISUM2A est donc ïnhibée en présence du composé inducteur activant le composé activateur.
Un tel système d'expression permet de contrôler précisément le is moment ou l'on dësire bloquer la synthèse du poiypeptide ISUM2A, en mettant en présence te composé activateur dësactivé avec le composé
inducteur activant le composé activateur, par exemple dès le début de la pollinisation.
Un exemple illustratif d'un système d'expression III peut étre 2o directement dérivé de celui décrit à l'exemple 3, lorsqu'on substitue l'acide nucléique codant un polypeptide 1SUM2A par un acide nucléique codant un polynucléotide antisens inhibant la traduction du polypeptide ISUM2A ou tout autre méthode d'inhibition de gènes endogènes utilisant un transgène et connues de l'homme du méfier (co-suppression, 2s , ribozyme, ARN double brin...).
Les systèmes d'expression inductibles d'un polypeptide ISUM2A comprennent plusieurs cassettes d'expression qui peuvent indifféremment étre incluses dâns un seul vecteur d'expression, ou au contraire dans des vecteurs d'expression distincts.
3o Un système d'expression inductible tels que les systëmes I, II et III décrits ci-dessus comprennent avantageusement au moins un gène marqueur de sélection comme par exemple un gène de résistance à
l'herbicide BASTA, bien connu de l'homme du métier.

Selon un premier mode de réalisation, le gène marqueur de sélection est porté par le vecteur comprenant la ou les cassettes d'expression constituant le système d'expression inductible.
Selon un second mode de réalisation, le gène marqueur de s sélection est porté par un vecteur distinct d'un vecteur comprenant la ou les cassettes d'expression constituant le système d'expression inductible.
Pour réaliser une construction d'acide nucléique de l'invention, on utilisera un polynucléotide régulateur activateur inductible choisi parmi 1o ceux décrits ci-dessous.
polynuclëotides rëgulateurs inductibles préférës selon l'invention, La séquence régulatrice capable de contrôler l'acide nucléique Is codant pour un polypeptide lSUM2A selon l'invention peut être une séquence régulatrice inductible par un métabolite particulier, tel que - une séquence régulatrice inductible par les glucocorticoïdes telle que décrite par AOYAMA et al. (1997) ou telle que décrit par McNELLYS et al. (1998);
20 - une séquence régulatrice inductible par l'éthanol, telle que celle décrite par SALTER et al. (1998) ou encore telle que décrite par CADDICK et al. (1998);
- une séquence régulatrice inductible par la tétracycline telle que celle commercialisée par ia Société CLONTECH.
2s - une séquence de promoteur inductible par un pathogène ou par un métabolite produit par un pathogène.
- une séquence régulatrice de gènes de type PR, inductible par l'acide salicylique ou le BTH ou l'aliette (Gorlach et al., 1996, Molina et al., 1998) ;
30 ' - une sëquence régulatrice de type récepteur Ecdysone (Martinet et al., 1999) inductible par le tebufenozide (référence produit RH5992, commercialisé par ROHM & HAAS) par exempte, appartenant à
la famille des dibenzoylhydrazines.

Autres séquences contenant des signaux rëgulateurs De manière avantageuse, l'acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide ISUM2A peut aussi contenir une ou plusieurs s autres séquences contenant des signaux régulateurs de l'expréssion de la région codant ISUM2A, ou alternativement étre placé sous le contrôle de telles séquences régulatrices.
Sëquences "leader "
io Les autres séquences contenant des signaux régulateurs englobent des séquençes 5' 'non traduites dites " leader ". De telles séquences peuvent augmenter la traduction de l'ARNm codant ISUM2A.
Parmi celles-ci, on peut citer, à titre illustratif mais non limitatif Is - le leader EMCV (EncephaloMyoCarditis VIRUS 5' non coding region) (ELROY-STEIN et al., 1989);
- ie leader TEV (Tobacco Etch Virus) (CARRINGTON AND
FREED, 1990);
- le leader du gène BiP codant pour la protéine de liaison à la 2o chaîne lourde de l'immunoglobuline humaine (MACEJACK et al., 1991);
- le leader AMV RNA 4 provenant de l'ARNm de la protéine du virus de la mosaïque de la luzerne (JOBLING et al. 1987);
- le leader du virus dè la mosaïque du tabac (GALLIE et al., 1989).
as Séquences " terminateur "
L'acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide ISUM2A, ou le vecteur. dans lequel est inséré cet acide nucléique peut 3o aussi comprendre des séquences dites " terminateurs ".
Parmi les terminateurs utilisables dans les constructions de l'invention, on peut citer, à titre illustratif mais non limitatif - le polyA 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV), décrit dans l'article de FRANCK et al. (1980);

le terminateur nos correspondant à la région 3' non-codante du gène de la nopaline synthase du plasmide Ti d'Agrobacterium fiumefaciens (DEPICKER et al., 1992).
- le terminateur du gène.histone (EP 0 633 317).
s Selon une autre alternative, la cassette d'expression selon l'invention peut comprendre ,. un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A fusionné à une séquence régulatrice de gènes de type fragment GR récepteur aux glucocorticoïdes (Aoyma et al. 1997), ledit polynucléotide étant placé sous le contrôle d'une séquence 1o promotrice de type promoteur natif d'ISUM2 ou promoteur constitutif. En présence de l'hormone, la protéine hybride résultante n'est plus retenue dans le cytoplasme et peut donc rentrer dans le chloroplaste et s'intégrer au ribosome.
1s VECTEURS RECOMBINANTS DE L'INVENTION
Un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide ISUM2A peut être inséré dans un vecteur approprié.
Par " vecteur " au sens de la présente invention, on entendra une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire qui est 20 indifféremment sous forme simple brin ou double brin.
Un vecteur recombinant selon l'invention est de préférence un vecteur d'expression, ou plus spécifiquement un vecteur d'insertion, un vecteur de transformation ou un vecteur d'intégration.
II peut s'agir notamment d'un vecteur d'origine bactérienne bu 2s virale.
Dans tous les cas, l'acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide ISUM2A est placé sous le contrôle d'une ou plusieurs séquences contenant des signaux de régulation de son expression dans la plante considérée, soit que les signa~ix de régulation soient tous 3o contenus dans l'acide nucléique codant ISUM2A, comme c'est le cas dans les constructions d'acides' nucléiques décrites dans la section précédente, soit que l'un, plusieurs d'entre eux, ou encore tous les signaux de régulation soient contenus dans le vecteur receveur dans lequel l'acide nucléique codant ISUM2A a été inséré.

Un vecteur recombinanfi selon l'invention comprend avantageusement des séquences d'initiation et d'arrêt de la transcription appropriées.
En outre, les vecteurs recombinants selon l'invention peuvent s irïclure une ou plusieurs origines de réplication fonctionnelles dans les cellules hôtes dans lesquelles leur expression est recherchée, ainsi que, le cas échéant, des séquences nuclëotidiques marqueurs de sélection.
Les vecteurs recombinants selon l'invention peuvent aussi inclure un ou plusieurs des signaux de régulation de l'expression tels qué
1o définis ci-dessus dans la description.
Les vecfieurs bactériens préférés selon l'invention sont par exemple les vecteurs pBR322 (ATCC n°37 017) ou encore les vecfieurs tels que pAA223-3 (Pharmacie, Uppsala, Suêde) et pGEM1 (Promega Biotech, Madison, WI, Etats-Unis).
1s On peut encore citer d'autres vecteurs commercialisés tels que les vecteurs pQE70, pQE60, pQE9 (Quiagen), psiX174, pBluescript SA, pNHBA, pMHl6A, pMH18A, pMH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI efi pSG (Stratagene).
II peut s'agir également .de vecteurs du type Baeulovirus tel que 20 le vecteur pVL1392/1393 ,(Pharmingen) utilisé pour transfecter les cellules de la lignée Sf9 (ATCC N°CRL 1711 ) dérivée de Spodoptera frugiperda.
Lîe manière préférée, et pour l'application principale des vecteurs de l'invention consistant à obtenir une expression stable, efi 2s préférentiellement inductible, d'une séquence codant pour un polypeptide ISUM2A dans une plante, on aura recours à des vecteurs spécialement adaptës pour l'expression de séquences d'intérêt dans des cellules de plantes, tels que les vecteurs suivants:
- vecteur pBIN19 (BEVAN et al.), commercialisé par la Société
3o CLONTECH (Palo Alto, Californie, USA);
- vecteur pBl 101 (JEFFERSON, 1987), commercialisé par la Société CLONTECH ;
- vecteur pB1121 (JEFFERSON, 1987), commercialisé par la Société CLONTECH;

- vecteur pEGFP; Yang et al. (1996), commercialisé par la Société CLONTECH;
- vecteur pCAMBIA 1302 (HAJDUKIIEWICZ et al., 1994) - vecteurs intermédiaires et superbinaires dérivés des vecteurs s pSBl2 et pSB1 décrits par Japan Tobacco (EP 672 752 et Ishida et al., 1996).
Font également partie de l'invention les vecteurs pRDP5 et pRDP4 décrits à l'exemple 2 ainsi que les vecteurs pRDP2 et pRDP3 décrits à l'exemple 3, avec l'ensemble de leurs caractérisfiiques définies io dans ces exemples.
CELLULES HOTES TRANSFORMÉES SELON L'INVENT10N.
Pour' permetfire l'expression d'un acide nucléique codant pour Is un polypeptide ISUM2A ,selon l'invention placé sous le contrôle d'une sëquence régulatrice appropriée, les acides nucléiques ou les vecteurs recombinants définis dans la prësente description doivent étre introduits dans une cellule hôte. L'introduction des polynuclëotides selon l'invention dans une cellule hôte peut être réalisée in vitro, selon les techniques bien 2o connues de l'homme du métier.
L'invention a en outre pour objet une cellule hôte transformée par un acide nucléique selon l'invention ou par un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus.
Une telle cellule hôte transformée est préférentiellement 2s d'origine bactérienne, fongique ou végétale.
Ainsi, peuvent être notamment utilisées des cellules bactériennes de différentes souches de Escherichia coli ou encore d'Agrobacterïum fumefaciens.
Avantageusement, la cellule hôte transformée est une cellule de 3o plante ou encore un protoplaste de plante.
Parmi les cellules susceptibles d'être transformées selon le procédé de l'invention, on peut citer à filtre d'exemples des cellules de plantes de grandes cultures .(maïs, blé, colza, tournesol, pois, soja, orge..). Préférentiellement, on peut choisir des plantes connues pour contenir de grandes réserves (protéiques, glucidiques et lipidiques), notamment les plantes céréalières ôu les plantes oléagineuses.
Les plantes hybrides obtenues par le croisement de plantes selon l'invention, fiont aussi partie de l'invention.
s Préférentiellement, il s'agit d'une cellule ou d'un protoplaste d'une plante céréalière. La cellule ou le protoplaste est préférentiellement originaire du maïs, du blé, de l'orge, du sorgho, du millet, du seigle ou du riz.
De manière tout à fait préférée, il s'agit d'une cellule originaire io du maïs.
L'invention a également pour objet l'ufiilisation d'un acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A, le cas échéant sous la forme d'une construction d'acide nucléique telle que définie ci-dessus, pour fabriquer une plante transformée capable de Is produire des graines à développement du germe affecté.
L'invention est également relative à l'utilisation d'un vecteur recombinant tel que déni dans la présente description pour fabriquer une plante transformëe capable de produire ~ des graines à
développement du germe affecté:
2o L'invention concerne aussi l'utilisation d'un hôte cellulaire transformé par un acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A, le cas échéant sous la forme d'une construction d'acide nucléique ou cassette d'expression telle que défiinie ci-dessus, pour fabriquer une plante transformée capable de produire 2s des graines à développement du germe affecté.
L'invention concerne aussi une plante transformée comprenant une pluralité de cellules hôtes tellés que définies ci-dessus.
PLANTES TRANSFORMEES . PAR UN ACIDE NUCLÉIQUE
3o PERMETTANT LA SYNTHESE DU POLYPEPTIDE ISUM2A ET
PROCÉDÉS POUR LEUR OBTENTION.
L'invention concerne aussi un organisme multicellulaire végétal transformé, caractérisé en ce qu'il comprend une cellule hôte 3s transformée ou une pluralité de cellules hôtes transformées par un acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour le polypeptide ISUM2A tel que défini dans la présente description ou encore par un vecteur recombinant comprenant un tel acide nucléique.
L'invention a encore pour objet une plante transformée s comprenant, sous une forme artificiellement intégrée dans son génome, un acide nucléique permettant la synthése du polypeptide ISUM2-A, tel que défini dans la présente description.
La plante transformée peut contenir une pluralité de copies d'un acide nucléique codant pour le polypeptide ISUM2A, dans les situations 1o dans lesquelles une surexpression du polypeptide ISUM2A est recherchée. Une surexpression du polypeptide ISUM2A est recherchée notamment lorsque l'on souhaite obtenir des plantes produisant des graines dont le germe a une taille significativement plûs grande que dans les plantes « sauvages » et qui.est enrichi en huile.
1s Selon ~un autre aspect, la surexpression du polypeptide ISUM2A
peut étre obtenue en transformânt une cellule hôte ou une plante avec un acide nucléique codant pour le polypeptide ISUM2A et dans lequel le polynucléotide comprenant le cadre ouvert de lecture est placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur permettant un haut niveau ~de 2o transcription de l'ARNm correspondant ou un haut niveau de traduction du polypeptide ISUM2A dans la cellule hôte ou dans la plante.
L'invention est donc également relative à une plane transformée telle que définie ci-dessus dont les graines sont riches en huile.
Elle est également relative à une plante transformée telle que 2s définie ci-dessus et qui possède des qualités agronomiques et/ou nutritionnelles améliorées.
Elle concerne aussi un procédé d'obtention d'une telle plante transformée.
Parmi les plantes sûsceptibles d'étre transformées selon 30 l'invention, on peut citer à titre d'exemple illustratif mais non limitatif des plantes de grande culture, préférentiellement le maïs, le blé, le colza, le tournesol, le pois, le soja et l'orge.
Compte-tenu du but poursuivi par l'invention, qui consiste principalement à obtenir des graines à développement de germe afFecté
3s riches en amidon, les plantes préférées selon l'invention sont celles dont les graines possèdenfi une forte teneur en amidon ou une forte quantité
d'amidon et de manière tout â. fait préférée le maïs, le blé, l'orge, le sorgho, le millet, le seigle ou le riz.
Les plantes hybrides obtenues par le croisement de plantes s transformées selon l'invention font également partie de l'invention.
L'invention concerne aussi toute partie d'une plante transformée telle que définie dans la présente description, telle que la racine, mais aussi les parties aériennes Gommé la fige, fa feuille, (a fleur et surtout la graine.
1o L'invention a encore pour objet une semence ou une graine de plante produit par une plante transformée telle que définie ci-dessus.
Typiquement, une telle semence transformée ou un tel grain transformé
comprend une ou plusieurs cellules comprenant dans leur génome une ou plusieurs copies d'un acide nucléique permettant la synthèse du 1s polypeptide ISUM2A, le cas échéant de manière contrôlée et inductible.
Lorsqu'une surexpression du polypeptide ISUM2A a éfië
obfienue dans la plante, les semences ou graines de plantes sont enrichies en huile. L'invention a donc aussi pour objet des semences et des grains enrichis en huile , préparés ou obtenus à partir d'une plante 2o transformée surexprimant le polypeptide ISUM2A~.
Les graines riches en huile sonfi utïlisées pour la préparation de semences ou des farines de semences enrichies en huile utilisables dans l'agriculture efi dans l'industrie agro-alimentaire.
Selon un mode de réalisation préférentiel d'une plante 2s transformée selon l'invention, on cherche à exprimer de manière contrôlée le polypeptide ISUM2A, ce qui implique que la plante transformêe ne contient, en , tant que copie fonctionnelle d'un polynucléotide codant. pour le polypeptide ISUM2A, uniquement la ou les copies qui ont été artificiellemerit introduites dans leurs cellules, et 3o préférentiellement dans leur génome, alors que les séquences du gène isum2A retrouvées naturellement dans la plante sauvage portent au moins une mutation provoquant un défaut dans l'expression du gène isum2A.
De telles plantes mutées dans le gène isum2A sont par 3s exemple les plantes mutantes 62422 ou les plantes mutantes emb*-X516 décrites par HECKEL et al. (1999). L'homme du métier peut, grâce à l'invention, produire d'autres plantes mutées dans le gène isum2A , par exemple par insertion au hasard du transposon Mutator dans une population de plantes de phénotype sauvage (Isum2A+/Isum2A~), puis en s détectant chez les mutants obtenus, ceux d'entre ces mutants qui n'expriment plus le gène isum2A, par exemple à l'aide des sondes ou des amorces nucléotidiques décrites dans les exemples.
Selon ce mode de réalisation préférentiel, la plante transformée selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle dérive d'une plante dans io laquelle les deux copies du gène isum2A portent chacune au moins une mutation provoquant un défaut dans son expression, au niveau transcriptionnel ou traductionnel.
Selon un second mode de réalisation préférentiel selon l'invention, on cherche à inhiber de manière contrôlée la synthèse du Is polypeptide ISUM2A, par exemple au travers de l'expression d'un polynuciéotide antisens.
Dans ce cas, la plante transformëe comprend au moins une copie fonctionnelle du gène isum2A et préférentiellement les deux copies du gène isum2A sont fonctionnelles.
20 ~ L'invention est également relative à un procédé pour l'obtention d'une plante transformée susceptible de produire des graines affectées dans le développement du germe, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
a) transformation d'au moins une cellule végétale ;
2s - par un acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A choisi parmi les séquences ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec les séquences SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6, ledit acide nucléique comprenant également un polynucléotide régulateur tel que défini dans la présente description ; ou 30 - par un vecteur recombinant comprenant un tel acide nucléique;
b) sélection des cellules transformées à l'étape a) ayant intégré
dans leur génome au moins une copie d'un acide nucléïque codant pour le polypeptide ISUM2A.

c) régénération d'une plante transformëe à partir des cellules transformées obtenues à l'étape b) ;
Par « graines affectées dans le développement du germe », on entend selon l'invention des graines dont le développement du germe est s « anormal », c'est-à-dire diffère significativement du germe d'une graine de plante dite « sauvage ».
Selon un premier aspect, le développemenfi du germe peut ëtre affecté de telle sorte que sa taille est significativement plus grande que celle du germe retrouvé dans les graines de plantes « sauvages » non 1o affectées dans l'expression du gène isum2A. Une taille significativement plus grande du germe peut ëtre obtenue en surexprimant le polypeptide ISUM2A, par exemple soit en introduisanfi une pluralité de copies d'un acide nucléique codant ce polypeptide dans une cellule hôte ou dans une plante, soit en plaçant une copie du gène isum2A ou de son ADNc sous is le contrôle d'un polynucléotide régulateur permettant la surexpression du polypeptide ISUM2A dans la cellule hôte ou dans la plante.
En surexprimant le polypeptide ISUM2A du stade précoce du développement de l'embryon, ôn obtient des graines de grande taille riches en huile.
2o L'invention a encore pour objet un mode de réalisation particulier du procédé ci-dessus pour l'obtention d'une plante transformée susceptible de produire des graines à développement du germe affecté dans lequel au moins une cellule végétale est transformée à l'étape a) par Agrobacterium tumefaciens contenant 2s - un acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A choisi parmi les séquences ayant au moins 95%
d'identité en acides aminés avec les séquences SEQ ID N°5 et SEQ ID
N°6 et comprenant un polynucléotide régulateur tel que défini dans la présente description ; ou 30 - un vecteur recombinant comprenant un tel acide nucléique ;
Chacun des procédés d'obtention d'une plante transformée selon l'invention peut comprendre les étapes supplémentaires suivantes:
d) croisement d'une plante sélectionnée à l'étape c) avec une plante hétérozygote comprenant une copie fonctionnelle du gène isum2A
3s et une copie inactive du gène isum2A;

e) sélection des plantes issues du croisement de l'étape d) qui sont homozygotes et portent deux copies inactives du gène isum2A.
De préférence, le polynucléotide régulateur est sensible à
l'action d'un signal inducteur ; on dit aussi que le polynucléotide s régulateur est inductible.
Selon un premier ò mode de réalisation préférentiel, le polynucléotide régulateur inductible consiste en un polynucléotide régulateur « répresseur » tel que défini dans la présente description.
Selon un second mode de réalisation préférentiel, le 1o polynucléotide régulateur inductible est un polynucléotide régulateur activateur » de la transcription ou de la traduction tel que défini dans la présente description.
La présente invention concerne aussi une plante transformée, telle qu'obtenue par !'un des procédés d'obtention défini ci-dessus.
1s L'invention a également trait à une plante transgénique hybride obtenue par le croisement d'urie plante transformée telle que définie ci-dessus.
L'invention est encore relative à une partie d'une plante transformée selon l'invention.
~o L'invention a encore pour objet un procédé pour l'obtention de grains de plantes à développement du germe affecté, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
a) cultiver, jusqu'à pollinisation, une plante dont les deux copies du gène isum2A portent au moins une mutation provoquant un défaut 2s dans la production du polypeptide ISUM2A et dans le génome de laquelle on a introduit artificiellement un acide nucléique comprenant - un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A choisi parmi les séquences ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec les séquences SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6 ; et - un polynucléotide régulateur inductible du type répresseur contrôlant l'expression du polynucléotide codant pour le polypeptide ISUM2A, la culture de la plante étant effectuée en l'absence du signal inducteur répresseur auquel le polynuclëotide rëgulateur répresseur est sensible ;

b) mettre en contact la plante transformée définie en a) avec le signal inducteur répresseur auquel le polynucléotide régulateur répresseur est sensible, pendant une période allant de la pollinisation jusqu'à la fin de la formation des grains ;
s c) récupérer les grains matures, caractérisës en ce qu'ils sont affectés dans le développement du germe.
Le développement du germe peut étre affecté de telle sorte que sa taille est significativement réduite par rapport à celui des graines provenant de plantes sauvages,. voire inexistant, comme cela a été
1o montré lorsque la plante possède un gène isum2A non fonctionnel ou encore lorsqu'on introduit un acide, nucléique codant pour le polypeptide ISUM2A sous le contrôle d'un polynucléotide régulateur permettant de bloquer la transcription ou la traduction de manière contrôlée afin d'affecter le développement du ,germe.
Is La présente invention a aussi pour objet un procédé pour l'obtention de grains de plantes à développement du germe affecté, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
a) cultiver, jusqu'à la pollinisation, une plante dont les deux 2o copies du gène isum2A portent chacune au moins une mutation provoquant un défaut dans la production du polypeptide ISUM2A et dans le génome de laquelle on a introduit artificiellement un acide nucléique comprenant - un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A choisi 2s parmi les sëquences ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec les séquences SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6 ; et - un polynucléotide régulateur du type activateur inductible contrôlant l'expression du polynucléotide codant pour le polypeptide ISUM2A, 30 la culture de la plante étant efFectuée en présence du signal inducteur activateur auquel le polynucléotide régulateur activateur est sensible;
b) poursuivre la culture de la plante tranformée définie en a) en l'absence du signal inducteur activateur auquel le polynucléotide régulateur activateur .est sensïble, à partir de la période suivant la 3s pollinisation;

c) récupérer les grains matures, caractérisés en ce qu'ils sont affectés dans le développement du germe.
L'invention concerne aussi une semence à développement du germe affecté telle qu'élle est obtenue selon l'un des procédés définis ci s dessus.
L'invention est égaiement relative à une semence à
développement du germe affecté, caractérisée en ce que chacune de ses cellules constitutives comprenne sous une forme artificiellement intégrée dans leur génome, un acide nucléique comprenant 1o - un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A choisi parmi les séquences ayant au mains 95% d'identité en acides aminés avec les séquences SEQ ID N°5 ét SEQ ID N°6 ; et - un polynucléotide régulateur.
Selon un premier mode de réalisation le polynucléotide rs régulateur consiste en un polynucléotide rëgulateur inductible du type rëpresseur.
Selon un second mode de réalisation préférentielle, le polynucléotide régulateur consiste en un polynucléotide régulateur du type activateur inductible.
2o Fait également partie de l'invention tout produit de transformation d'une semence telle que définie dans la présente description, en particulier une semence ou une huille.
De préférence, le produit de transformation est un amidon.
Pour obtenir de l'amidon à partir d'une semence à
2s . développement du germe affecté selon l'invention, l'homme du métier aura avantageusement recours aux techniques décrites dans l'ouvrage « Handbuch der Starke » (vol. ~ I; Max Ullmann (ed.), Paul Varey Verlag, Berlin) ou encore dans l'article de Morrison et Karkalas (Methods in Plant Biochemistry, 7 990, vol.2: 323-352, Academic Press l.td; Londres).
30 . L'amidon obtenu à partir des semences à développement du germe affecté selon l'invention peut être utilisé par l'industrie agro-alimentaire, l'industrie pharmaceutique, l'industrie du papier ou encore dans le domaine microbiologique. où il peut ëfire mis en oeuvre en tant que substrat nutritif.

La transformation de cellules végétales peut étre réalisée par les techniques connues de l'homme du métier.
On peut citer notamment les méthodes de transfert direct de gènes telles que la microinjectiôn directe dans des embryoïdes de plante s (NEUHAUS et al., 1987), l'infiltration sous vide (BECHTOLD et al., 1993) ou l'électroporation (CHUPEAU et al., 1989) ou encore ia précipitation directe au moyen de PEG (SCHOCHER et al., 1986) ou le bombardement par canon de particules recouvertes de l'ADN
plasmidique d'intérêt (FROMM M. et al. 1990).
1o On peut également infecter la plante par une souche bactérienne notamment d'Agrobâcterium. Selon un mode de réalisation du procédé de l'invention, les cellules végétales sont transformées par un vecteur selon !'invention, ledit hôte cellulaire étant susceptible d'infecter lesdites cellules végétales en permettant l'intégration dans le 1s génome de ces dernières, des séquences nucléotidiques d'intérët initialement contenues dans l'ADN du vecteur susmentionné.
Avantageusement, l'hôte cellulaire susmentionné utilisé est Agrobacterium fumefaciens, notamment selon la méthode décrite dans l'article d'AN et al., (1986), ou encore Agrobacterium rhizogenes, zo notamment selon la méthode décrite dans l'article de GUERCHE et al., (1987) ou encore dans la demande PCT N°WO 00 22.148.
Par exemple, la transformation des cellules végétales peut être réalisée par le transfert de la région T du plasmide circulaire extra-chromosomique inducteur de tumeurs Ti d'Agrobacterium tumefaciens, 2s en utilisant un système binaire (WATSON et al. 1994). Pour ce faire, deux vecteurs sont construits. Dans l'un de ces vecteurs, la région T a été éliminée par délétion, à l'exception des bordures droite et gauche, entre eux le gène d'intérêt, ainsi qu'un gène marqueur sont insérés pour permettre la sélection dans les cellules de plantes. L'autre partenaire du 3o système binaire est un plasmide Ti auxiliaire, plasmide mbdifié qui n'a plus de région T mais confient toujours les gènes de virulence vir, nécessaires à la transformation de ta cellule végétale.
Selon un mode préféré, on peut utiliser la méthode décrite par ISHIDA et al. (1996) pour la transformation des Monocotylédones.

Selon un autre protocole, la transformation est réalisée selon la méthode décrite par FINER et al. (1992) utilisant le canon à particules de tungstène ou d'or.
L'homme du métier est capable de mettre en oeuvre de s nombreux procédés de l'état de la technique afin d'obfienir des plantes transformées par un acide nucléique permettant la -'synthèse du polypeptide ISUM2A.
L'homme du métier pourra se référer avantageusement à la technique décrite par BECHTOLD et al. (1993) afin de transformer une 1o plante à l'aide de la bactérie Agrobacfierium tumefaciens. Des techniques ûtilisant d'autres types de vecteurs peuvent également être utilisées, (elles que les techniques décrites par BOUCHEZ et al. (1993) ou encore par HORSCH et al. (1994).
A titre illustratif, une plante transgénique selon l'invention peut 1s être obtenue par des techniques de bioüstique telles que celles décrites par FINER et al. (1992) ou encore celles décrites par VAIN et al. (1993).
D'autres techniques préférées de transformation d'une plante conformément à l'invention par Agrobacterium fumefaciens sont celles décrites par ISHIDA et al. (1996) ou encore dans la demande PCT
20 publiée sous le n°WO 95/06 722 au nom de JAPAN TOBACCO.

Comme déjà décrit précédemment, le gène isum2A code pour un polypeptide possédant une lôngueur de 143 acides aminés, pour 2s , lequel il a pu étre observé au moins deux polypeptides variants.
Le premier polypeptide variant codé par le gène isum2A
possède la séquence en acides aminés SEQ ID N°5 et est codé par le gène isum2A présent dans le génome du plant de maïs désigné HDSx HD7.
3o Le second polypeptide variant ISUM2A est codé par le gène isum2A présent dans le génome du plant de maïs désigné A188.
Les polypeptides ISUM2A de séquences SEQ ID N°5 et SEQ ID
N°6 se différencient uniquement par la substitution d'un résidu d'acide aminé, le polypeptide de séquence SEQ ID N°5 possédant un résidu glycine en position 89 et le polypeptide de séquence SEQ ID N°6 ayant un résidu d'acide aminé asparagine à cette position.
L'expression de l'un ou l'autre des variants polypeptidiques 1SUM2A conduit dans tous les cas à l'expression d'un phénotype s sauvage chez la plante, ladite plante produisant des grains matures et fertiles comprenant un embryon complètement développé.
Une recherche d'homologie dans la base de données PROSITE
a permis de montrer des similarités de structure entre les polypeptides ISUM2A selon l'invention et lés protéines L35 du chloroplaste.
1o Le polypeptide ISUM2A de séquence en acides aminés SEQ ID
N°5 possède un poids moléculaire calculé de 15112 daltons, un point isoélectrique calculé de 11,75 et une charge à pH 7 de 28,19.
Le polypeptide ISUM2A de séquence SEQ ID N°5 possède 40 résidus d'acides aminés chargés (R, K, H, Y, C, D, E), 3 résidus d'acides Is aminés acides (D, E), 31 résidus d'acides aminés basiques (K, R), 31 résidus d'acides aminés polaires (N, C, Q, S, T, Y) et 55 résidus d'acides aminés hydrophobes (A, I, L, F, W,V).
Compte-tenu de la présence d'une seule substitution d'un résidu d'acide aminé, par rapport à la séquence SEQ ID N°5, le 20 polypeptide ISUM2A de séquence SEQ ID N°6 possède des caractéristiques très similaires . à celles décrites ci-dessus pour le polypeptide ISUM2A de séquence SEQ ID N°5.
L'invention a donc encore pour objet ie polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6 ainsi qu'un 2s polypeptide possédant au moins 95% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6, ou un fragment ou un variant de celui-ci.
Un fragment d'un polypeptide ISUM2A selon l'invention comprend au moins 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 30 130, 135 ou 140 acides aminés consécutifs d'un polypeptide de séquence SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6.
Fait également partie de l'invention, un polypeptide comprenant

10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 130, 135 ou 140 açides aminés consécutifs d'un polypeptide de séquence SEQ ID N°5 ou 3s SEQ ID N°6.

L'invention est également relative à un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec la séquence d'un polypeptide ISUM2A de séquence SEQ 1D N°5 ou SEQ ID N°6.
s Avantageusement, fait aussi partie de l'invention un polypeptide ayant .au moins 96%_, 97_%, 98%, 99%, 99;1 %,_99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% ou 99,9% d'identité en acides aminës avec la séquence d'un polypeptide de séquence SEQ ID N°5 ou SEQ ID
N°6, ou un fragment peptidique de ce dernier.
io De manière générale, les polypeptides selon la présente invention se présentent sous une forme isolée ou purifiëe.
Un autre objet de l'invention consiste en un polypeptide comprenant des modifications d'acides aminés de 1, 2, 3, 4 ou 5 substitutions, additions ou délétions d'un acide aminé par rapport à la is séquence d'acides aminés d'un polypeptide de séquence SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6 ou encore d'un fragment ou d'un variant de celui-ci.
Un polypeptide , selon l'invention peut êfire obtenu par recombinaison génétique selon des techniques bien connues de l'homme du métier, par exemple des techniques décrites dans AUSUBEL
zo et al. (1989).
Un polypeptide selon l'invention peut ëtre également préparé
par des techniques classiques de synthèse chimique, indifféremment en solution homogène ou en phase solide.
A titre illustratif, un polypeptide selon l'invention pourra être 2s préparé par la technique en solution homogène décrite par HOUBEN
WEIL (1974) ou encore par la technique de synthèse en phase solide décrite par MERRIFIELD (1965x; 1965b).
De préférence, les polypeptides variants d'un polypeptide selon l'invention conservent leur capacité à étre reconnus par des anticorps 3o dirigés contre les polypeptides de séquences SEQ ID N°5 ou 6.
Un polypeptide codé par le gène Iscrm2A selon l'invention, tel qu'un polypeptide de séquence en acides aminés SEQ ID N°5 ou 6, ou encore un variant ou un fragment peptidique de ce dernier est utile notamment pour la préparation d'anticorps destinés à Ix détection de la présence et/ou de l'expression d'un polypeptide de séquences SEQ ID
N°5 ou 6 ou d'un fragment peptidique de ce dernier dans un échantillon.
Outre la détection de la présence d'un polypeptide codé par le gène Isum2A ou encore d'un fragment peptidique d'un tel polypeptide s dans un échantillon, des anfiicorps dirigés contre ces polypeptides sont utilisés_pour quantifier ia synthése. d'un polypeptide de séquences SEQ
ID N°5 ou 6, par exemple dans des cellules d'une plante, et dëterminer ainsi le développement de l'embryon.
Par " anticorps " au sens de la présente invention, on entendra 1o ' notamment des anticorps polyclonaux ou monoclonaux ou des fragments (par exemple les fragments F(ab)'2, F(ab)) ou encore tout polypeptide comprenant un domaine de l'anticorps initial reconnaissant le polypeptide ou le fragment de polypeptide cible selon l'invention.
Des anticorps monoclaux peuvent étre préparés à partir is d'hybridomes selon la technique décrite par KOHLER et MILSTEIN
(1975) La présente invention concerne également des anticorps dirigés contre un polypeptide tel que décrit ci-dessus ou un fragment ou un "
variant de ce dernier, tel que produit dans la technique du trioma ou 2o encore la technique d'hybridome décrite par KOZBOR et al. (1983).
L'invention a également trait à des fragments d'anticorps simple chaîne Fv (ScFv) tels que décrits dans le brevet US N°4,946,778 ou encore par MARTINEAU et al. (1998).
Les anticorps selon l'invention comprennent également des 2s fragments d'anticorps obtenus à l'aide de banques de phages telles que décrites par RIDDER et al. (1995) ou encore des anticorps humanisés tels que décrits par REINMANN et al. (1997) et LEOER et al. (1997). Les préparations d'anticorps selon l'invention sont utiles dans des tests de détection immunologiques destinés à l'identification de la présence et/ou 3o de la quantité d'un polypeptide dé séquences SEQ ID N°5 ou 6, ou d'un fragment peptidique de celui-ci, présent dans un échantillon.
Un anticorps selon l'invention pourra comprendre en outre un marqueur détectable isotopïque . ou non isotopique, par exemple fluorescent, ou encore être couplé à une molécule telle que la biotine, 3s selon des techniques bien connues de l'homme du métier.

Ainsi, l'invention a en outre pour objet un procédé pour détecter la présence d'un polypeptide conforme à l'invention dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de:
a) mettre en contact l'échantillon à tester avec un anticorps tel s que décrit ci-dessus;
b) détecter le _com_plexe antigè_ne/anticorps formé.
L'invention est également relative à un nëcessaire ou kit de diagnostic pour la détection de la présence d'un polypeptide conforme à
l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant:
ro a) un anticorps tel que défini ci-dessus;
b) le cas échéant, un ou plusieurs réactifs nécessaires à la détection du complexe antigène/anticorps formé.
Un autre objet de l'invention consiste en l'utilisation d'un acide nucléique ou d'un variant allélique d'un acide nucléique tel que défini ci-ls dessus dans des programmes de sélection pour l'obtention de plantes à
embryon modifié en taule ei/ou développement influant sur le contenu en amidon et/ou en huile.
L'invention concerne aussi une méthode de sélection de plantes à embryon modifié en taille etlou en développement comprenant les 2o étapes de a) génotypes des plantes (individus) au moyen de sondes ou amorces nucléotidiques obtenues à partir des 'acides nucléiques tels que définis précédemment ou de variants de ces acides nucléiques ;
b) sélectionner, parmi . ces plantes (individus), celles qui 2s comprennent une fréquence élevée d'alléles favorables associées à la taille et/ou au développement de l'embryon.
La préserite invention, est en outre illustrée, sans pour autant êfire limitée, par les figures et les exemples suivants:

La figure 1 illustre la séquence nucléotidique génomique du gène isum2A présent dans le plant de mars désigné HD5 x HD7 référencé comme ia séquence SEQ ID N°1 du listage de séquences. Les trois exons du gène isum2A sont représentés sous la forme de boites, 3s sous la séquence nucléotidique correspondante. Les différents sites de reconnaissance pour les endonucléases de restriction sont indiqués, au-dessus de la séquence nucléotidique correspondante.
La figure 2 illustre une séquence nucléotidique de l'ADNc du gène isum2A dans le plant de maïs désigné HD5 x HD7, cette séquence s étant référencée comme la séquence SEQ ID N°3 du listage de séq_u__ences Les séquences dérivées des trois exons du gène sont représentëes par des boîtes focalisées sous la séquence nucléotidique correspondante.
1o La séquence en acides aminés déduite est représentée au-dessous des boîtes représentant les exons.
La boîte désignée « RL35 domain » correspond à la partie de la séquence du polypeptide ISUM2A qui esfi homologue avec certaines protéines du chloroplaste. Le polypeptide ISUM2A représenté sur la 1s figure 2 est réfërencé comme la séquence SEQ ID N°5 du listage de séquences.
La figure 3 illustre une sëquence d'ADNc partiel correspondant à l'ARN messager retrouvé dans le plant de maïs désigné A188, cette séquence nucléotidique étant référencée comme la séquence SEQ ID
2o N°4 du listage dé séquences.
La séquence déduite de la protéine codée par l'ADNc est représentée au-dessous de la séquence nucléotidique correspondante, et est référencée comme la séquence SEQ ID N°6 du listage de séquences.
2s Les boïtes localisées au-dessous de la séquence peptidique représentent les trois exons dérivés du gène isum2A retrouvés dans la lignée de maïs A188.
La boîte désignée « RL35 domain » correspond à la partie du polypeptide ISUM2A possédant une homologie avec des protéines du 3o chloroplaste.
La figure 4 illustre la structure en exons et introns du gène isum2A, les boîtes représentant lés exons du gène. La base A du codon ATG est ie nucléotide en position 51 du premier exon et la base T du codon TGA d'arrét de la traduction et le nucléotide en position 76 du ss troisième exon. Les boîtes situées au-dessous de la structure du gène isum2A représentent les différents clones d'ADN génomique utilisës dans les exemples. Les boîtes situées au-dessus de la structure du gène isum2A représentent les différents clones d'ADNc utilisés dans les exemples.
s La figure 5 illustre une carte du plasmide pRDPS.
L_a figure_6_illus_tre la carte du plasmide _pT_RE commercialisé par la Société CLONTECH LABORATORIES Inc, et dont la structure est accessible dans la base des données GENBANK sous le numéro d'accès U89931.
io La figure 7 illustre la carte du plasmide pDM302 décrit par CAO
et al. (1992).
La figure 8 illustre la carte du plasmide pTet-Off commercialisé
par la Société CLONTECH (référence catalogue année 2000: K1620-A).
La figure 9 illustre la carte du plasmide pRDP4.
Is La figure 10 illustre la carte du plasmide pTA7001 décrit par AOYAMA et al. (1997).
La figure 11 illustre la carte du plasmide pRDP2.
La figure 12 illustre la carte du plasmide pRDP3.
La figure 13 illustre le principe de fonctionnement du système 2o d'expression II résumé dans le tableau 3 et objet de l'exemple 2.
La figure 13A illustre l'expression constitutive du polypeptide ISUM2A sous l'effét de l'activation du promoteur contenant la séquence TRE par l'activateur tTA, qui est lui-même exprimé de manière constitutive.
2s La figure 13B illustre la répression de la synthèse du polypeptide ISUM2A lorsque l'activateur tTA est mis en contact avec la tétracycline, qui le désactive et l'empêche d'activer le promoteur contenant la séquence TRE.
La figure 14 illustre ûn schéma de fonctionnement d'un système 3o d'expression I résumé dans le tableau 3 et objet de !'exemple 3.
La figure 14A illustre la synthèse du polypeptide ISUM2A
lorsque le promoteur contenant ia séquence UAS est activé par fa protéine de fusion GVG, en présence d'un glucocorticoïde.
La figure 14B illustre l'absence de production de polypeptide 3s ISUM2A dans une situation dâns laquelle la protéine de fusion GVG est produite en l'absence de glucocorticoïde et n'active pas la séquence UAS du promoteur contrôlant l'eXpression du gène isum2A.
EXEMPLES:
s EXEMPLE 1: Clonage de la séquence génomlq~ue du gène Isum2A
A. MATERIELS ET METHODES
A9. Matériel végétal io ~ Les plantes de la lignée A188 (Gerdes et Tracy, 1993), ont été
utilisées pour le "genomic walk" et l'isolement d'ARN. Les fragments d'ADN contenus dans la banque génomique criblée proviennent quant à
eux de la lignée hybride HD5xHD7 (Barloy et coll., 1989). Le mutant emb*-8516 et le parent recurrent Rscm2 ont été décrits dans Heckel et is coll. (1999).
A2. Culture des plantes Les plantes ont été cultivées soit en chambre climatique, avec une période d'éclairement de 16 h (100 Wm-2), une humidité relative de 80 2o et une alternance 24°C/19°C (jour/nuit), soit en serre sous les mêmes conditions mais sans contrôle de l'humidité, soit en plein champ à Lyon.
Toutes les plantes ont été pollinisées à la main.
A3. Isolemenf d'ADN gënomique de plante 2s Une jeune feuille de maïs de 10 cm ~ de long a été prélevée, mise dans un tube Eppendorf de 1,5 ml et broyée avec un pilon adapté
dans de l'azote liquide. 500 p1 de tampon d'extraction (Tris-HCI pH8 100 mM, EDTA pH8 50 mM, NaCI 100 mM, SDS 1 %) a été ajouté et le tube incubé 5 min à 55°C. Après deux extractions au phénol/chloroforme le 3o surnageant a été précipité à l'aide de 50 p1 acétate de sodium et 350 girl l'isopropanol (froid) pendant 10 min à température ambiante. Le culot d'ADN a été rincé avec 1 ml éthanol 70 %, séché et repris dans 50 p1 TE10.01 (Tris-HCI pH8 10 mM, EDTA pH8 0,1 mM) additionné de 20 pg/ml de RNAse A.

A4. PCR sur ADN génomique L'ADN génomique a été dilué 10 fois et 2 p1 ont été utilisé dans une réaction de 20 p1 contenant chaque amorce 1 pM, dNTP 100 pM et 1 u Taq polymérise dans le tampon fourni avec l'enzyme (Pharmacia). La s réaction a été réalisée dans un amplificateur PCR Perkin Elmer DNA
Thermal Cycler 2400 ou 9700 dé la façon suivante: après dénaturation de l'ADN 2 min à 94°C, les échantillons ont subit 30 cycles de 30 s de dénaturation à 94°C I 45 s d'hybridation à 60°C / 1 mïn d'élongation à
72°C. Toutes les amorces avaient des Tm entre 60° et 62°C.
io A5. Clonage L'ADN plasmidique a ëté préparé suivant le protocole de lyse alcaline décrit par Sambrook et coll. (1989). Les digestions d'ADN
génomique, d'ADN plasmidique ou d'ADN du pliage lambda par des 1s enzymes de restriction ont été réalisées selon les conseils des fabricants (Gibco, Boehringer Mannhein, Promega). Les produits de digestion ou d'amplification par PCR ont été séparës par électrophorèse sur gel d'agarose dans du tampon TAE (Sambrook et coll., 1989). Les fragments de restriction ont été ligués dans le vecteur pBluescript et les produits 20 PCR dans pGEM-T-easy, à l'aide de la T4-DNA ligase suivant les conseils du fournisseur (Promega), en utilisant 50 ng de vecteur, et un rapport molaire insert/vecteur de l'ordre de 3/1. Ces constructions ont été
introduites dans la souche bactérienne DH5-a par transformation par choc thermique, selon le protocole de Hanahan (1983).
~s A.6. Hybridation d'ADN
Des membranes pour hybridation d'ADN ont été obtenues soit par transfert de fragments de restriction de gels d'agarose sur des membranes Hybond N+ (Amersham) par capillarité, en présence de so soude 0,4 N, soit par transfert de plages de lyse de pliage lambda sur des membranes Hybond N (Amersham). Les membranes ont été
préhybridées selon les conseils du fournisseur, pendant 4 à 12 h à 65°C
en présence de SSPE 5 x (SSPE 20 x contient NaCI 3,6 M, phosphate de sodium 0,2 M, EDTA pH 7,7 ; 0,02 M). Puis elles ont été hybridées ss pendant 16 h dans les mémes .conditions. Les sondes utilisées pour l'hybridation ont éfié marquées . râdioactivement avec 50 pCi de a3~P-dCTP, en utilisant le kit Ready-To-GOT"" DNA labelling beads (Amersham). Après hybridation, les membranes ont subi quatre rinçages, à 65°C dans des solutions à 0,,1 % de SDS et de concentrations en SSC
s de 2 x, 1 x, 0,5 x et 0,1 x (SSC 20 x contient NaCl3 M, Na3-citrate 0,3 M), et ont été exposées à des films pour autoradiographie (X-OMAT, Kodak).
A.7. Criblage de banque d'ADN génomique Une banque d'ADN génomique contenue dans le phage lambda io EMBL3 SP6lT7 (Stratagene) a été étalée à la densité de 1,5x105 plages de lyse par boîte, sur 10 boîtes, puis transférée sur membrane Hybond N
selon les recommandations du fournisseur (Amersham). Après ' hybridation et autoradiographie, les plages de lyse donnant un signal ont été prélevées sur les boîtes et étalées à une densité moindre, ainsi deux ~s fois de suite afin d'obtenir un clone unique par boîte, sous forme de plages isolées. Les ADN ont alors été préparés selon Sambrook et colt.
(1989).
A.8. AIMS ("amplification of insetion mutagenised sites") 20 L'amplification de sites mutagénisés par insertion a été obtenue selon Frey efi colt. (1998). L'enzyme Tru9A (Promega) a étë utilisée pour la digestion à la place de Msel: Les séquences des amorces "Mu specific" et "Mu-nested" ont été dégénérées à des positions additionnelles. Les amorces utilisées Mu15 (SEQ ID N°14) et Mu16 ~s (SEQ ID N°8) sont listées dans le tableau 4.
A.9. "Genomic viralk"
Le protocole de Devic et colt. (1997) a été appliqué sans modification en utilisant les enzymes Dral, EcoRV, Pvull, Scal et Sspl.
3o Les produits PCR ont été cloné dans !e vecteur pGEM~ -T- Easy (Promega).
A.10. RT PCR
Les ARN totaux ont été extraits de 50 mg de tissu broyé dans 3s de l'azote liquide avec le réactif TRIZOLT"" en suivant le protocole du fournisseur (Gibco). Les ARN, resuspendus dans 50 p1 d'eau Versol (Aguettant), onfi été dénaturés à 65°C pendant 5 min et traités à la DNase I selon les indications du fournisseur (Promega). Ils ont ensuite été purifiés par deux extractions volume à volume au phénol/chloroforme s pH 4,5 et une précipitation à l'éthanol. 6 pg d'ARN purifiés ont été
"reverse" transcrits par la MuLV reverse transcriptase (Gibco) dans un volume total de 20 NI comme conseillé par le fournisseur, avec une amorce polyT à une concentration finale de 2,5 pM. Après inacfiivation de la reverse transcriptase par chauffage à 95°C pendant 5 min, 2 p1 de la 1o réaction de firanscription inverse ont été amplifiés par la Taq polymérise comme décrit ci-dessus.
A.11. Séguen~age Le séquençage a été réalisé par la société Genome Express à
1s Grenoble (France). Les logiciels Sequencher 3.1.1 (Gene Codes Corporation) efi DNAstar (Laser Gene) ont permis d'analyser et d'assembler les séquences obtenues.
B. RESULTATS
2o B.1. Clonage des séquences flanquant l'insertion de mutator dans emb =8516 . a) Clonage d'une séquence flinguante Comme décrit dans Heckel et al. (1999), un produit AIMS de as 107 pb a été obtenu avec ies amorces Mu16 (SEQ ID N°8) et adapMsel (SEQ ID N° 9). Ce "produit AIMS" (voir figure 4) contient 70 pb de la séquence flanquante entre les deux amorces, qui ne monfire pas d'homologie significative avec les séquences référencées dans les bases de données.
b) Allongement de la sëquence flanquante Pour allonger cette séquence flanquanfie la technique du "genomic walk" (Devic et al., 1997) a été employée sur l'ADN génomique 3s du génotype A188. Avec les amorces "nested" GW4 (SEQ ID N°12) et GW4b (SEQ ID N°13) et coupure par Sspl, un produit de 244 pb a été
obtenu (clone L223a, Fig. 4), qui contenait 153 pb supplémentaires de la séquence flanquante.
Pour caractériser la séquence de l'autre cété de l'insertion, on a s utilisé la technique de "genomic walk" avec les amorces "nested" GW3 (SEQ ID N° 10) et GW3b (SEQ LD N°11) avec coupure par Sspl. Le produit de 1532 pb (clone L223c, Fig. 4) contenait 1463 pb de séquence flanquante supplémentaire.
io c) Homologie de la séquence flanquante dans les bases de données Contrairement aux séquences "produit AIMS" et du clone L223a, la séquence du clone L223c montrait une homologie dans les bases de donnée avec un EST du maïs. Deux séquences du même is ADNc se trouvent dans Genebank: une séquence â partir du bout 5' dans l'accession A1001298, et une séquence à partir du bout 3' dans l'accession AI374506. Cet EST porte le nom Isum2 sans explication de cet âcronyme. L'homologie était forte mais restreinte à une petite partie de L223c.
2o Une réaction PCR a été effectuée sur de l'ADN génomique avec les amorces Isum2b (SEQ ID N°18) et Isum2e (SEQ ID N°20), qui sont localisées de part et d'autres de l'intron présumé. Le produit d'amplification a été cloné et séquencé. La séquence de ce clone L157a (fig.4) a montré que ia séquence . présente dans ie produit AIMS, dans 2s L223a et dans une partie de L223c correspondait à un intron d'Isum2.
B.2. Isolement d'un deuxième allèle a) Criblage d'une collection de mutants d'insertion par génétique inverse (ce machine à gène »).
Une population de 25000 plantes fortement mutagénisées avec le transposon mutator a été criblée par PCR pour une insertion dans Isum2. Les plantes ont été p(antëes dans 10 blocs de 50 x 50 plantes.
Des pools d'ADNs des 500 lignes et 500 colonnes ont été analysés par 3s RCR pour la présence d'une amplification avec l'amorce OMuA ( SEQ ID

N° 24 dans mutator) en combinaison avec une amorce dans un exon d'Isum2. Les quatre amorces Isum2b (SEQ ID N°18), Isum2c (SEQ ID
N°19), Isum2k ~(SEQ ID N°21) et 8516g (SEQ ID N°23) spécifiques d'Isum2 ont été testées.
s Des résultats positifs ont ëté obtenus avec les amorces Isum2b et Isum2k. Les plantes en question ont été identifiées et l'amplification a été confirmée sur ADN de plante individuelle. Puis leur descendance a été anafysëe pour distinguer des insertions somatiques (absentes dans les gamètes) des insertions germinatives (présentes dans les gamètes).
io De toutes les insertions seulement une a été retrouvée dans la génération suivante. Le séquençage des produits d'amplification PCR a montré qu'il s'agissait d'une insèrtion dans l'intron 1 d'Isum2A à 3 pb en amont de l'exon 2, retrouvée dans une plante désignée 62422.
Les grains de cette plante 62422 ont étë analysés pour la 1s présence du phénotype « grains dëpourvus de germe » . La présence de nombreuses mutations "parasites" dans ce matériel fortement mutagénisé a rendu difficile l'évaluation d'une partie des grains. Des grains avec un phénotype « grain dépourvu de germe » ont été détectés.
2o b) Mangue de complémentation entre les deux allèles mutés de isum2A.
Pour prouver que le phénotype « grain dépourvu de germe » du mutant emb*-8516 décrit par Heçkel et al. (1999) était aussi causé par l'insertion de mufator dans te gène Isum2A, une complémentation entre 2s le mutant emb*-8516 et la descendance de la plante 62422 avec une insertion de mutator dans le méme gène Isum2A a été entreprise.
16 plantes hétérozygotes +lemb*-8516 ont été pollinisées par 6 plantes hétérozygotes +lemb*-2422. Dans aucun cas, la mutation emb*-8516 n'a été complémentée. Ceci montre que les plantes 62422 portent 3o une mutation dans le même gène qui cause le phénotype emb du mutant emb'~ 8516. Comme les deux ont une insertion de mutator dans le gène Isum2A, il est avéré que cette mutation du gène isum2A provoque le phénotype « grain dépourvu de germe ».

B.3. Le gène Isum2A
a) Séquences génomiques d'Isum2A
Pour le gène lsum2A sine première séquence génomique a été
s obtenue par criblage d'une banque génomique de plantes du génotype HD5 x HD7 et une seconde séquence génomique a été obtenue par PCR sur des plantes du génotype A188. Les clones utilisés pour le séquençage sont présentés dans la Fig. 4.
La séquence du génotype HD5 x HD7 (Fig. 1) émane des deux 1o sous-clones L211 c1 (fragment Xhol de 9 kb) et L211 c2 (fragment Xhol de 6 kb).
La séquence du génotype A188 (Fig. 2) provient des clones L157a (PCR avec les amorces Isum2b (SEQ ID N°18) et Isum2e (SEQ
ID N°20)), L223a (genomic walk, voir ci-dessus) et L223c (genomic walk, Is voir ci-dessus).
b) Séquences ADNc La séquence ADNc partiel du génotype A188 (SEQ ID N°4, fig.3) provient des clones L158a et L254 (fig.4). Le premier a été obtenu 2ô ~ p~r RT-PCR sûr émbryôns dé 12 JAP âvéc lés amôrcésTsum2b (SEQ !D---N°18) et Isum 2c (SEQ ID N°19), le deuxième par RT-PCR sur albumen de 7JAP avec les amorces Isum2a (SEQ ID N°17) et Isum21 (SEQ ID
N°22).
La séquence ADNc du génotype HD5 x HD7 (SEQ ID N°3, fig.2) 2s a été obtenue à partir de la séquence génomique (SEQ ID N°1) en utilisant l'EST Isum2 (ci-dessus) pour déterminer la limite 5' du premier exon et la limite 3' du dernier exon.
Le Tableau 4 ci-dessous détaille les différentes amorces 30 . utilisées dans cet exemple.

Tableau 4 Amorces utilisées Nom Squence 5' vers 3' SEQ Utilisation ID
N

Mul6 TCYATAATGGCAATTATCTC 8 produit AIMS

adapMselGATGAGTCCTGAGTAAN 9 produit AIMS

GW3 GAAACTGGAAAGGCGAAATGGAGGGACG 10 L223c GW3b GCTCGATAGGTTTATTGTGATAACGTTGCTGG11 L223c GW4 GTCCCTCCATTTCGCCTTTCCAGTTTCC 12 L223a, GW4b CCAGCAACGTTATCACAATAAACCTATCGAGC13 L223a MulS GAGAAGCCAACGCCAWCGCCTCYATTTCGTC 14 produitAIMS

AP1 GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGC 1S tout "genomic walk"

AP2 CTATAGGGCTCGAGCGGC 16 tout "genomic walk"

Isum2a CTACCCGCAGCCAGCCTCGCATTCC 17 L254 Isum2b GGCGGGGAAGAAGGGCTACAAGATGAAGAC 18 MAG, L158a1, LlS7a Isum2c GCCAAGAAGAACACCAAGCGCAAGAAGAG 19 MAGa Isum2e CGATCTGCTGGCCATATCCTAAGAG 20 L1S8a1, LlS7a Isum2k CATCTTCGAGAGCCTCTTCTTGCG 21 MAG

Isum21 CTTCATCTTGTAGCCCTTCTTCCCCG 22 L254 8516g GCACCCGTAACATTGTCGTAGTC 23 MAG

OMuA CTTCGTCCATAATGGCAATTATCTC 24 MAG

aMAG signifie "Machine à genes".

EXEMPLE 2:
Construction d'un vecteur comprenant un polynucléotide codant pour un laolyloeptide ISUM2A placé sous te contrôle d'un pol~mucléotide régulateur inductible du type represseur.
s Le système d'expression décrit dans cet exemple constitue une illustration du système d'expression ii résumé dans le tableau 3 et dont Ie principe de fonctionnement général est dëtaillé dans la description.
Ce système d'expression implique la construction de deux 1o vecteurs, respectivement:
(i) le vecteur pRDPS, qui contient le gène isum2A placé sous le contrôle de la séquence TRE reconnue par l'activateur tTA; et (ü) le vecteur pRDP4, qui contient le gène de l'activateur tTA, actif en absence de tétracycline, placé sous le contrôle du promoteur 1s actine9 du riz, qui est un promoteur fort et constitutif chez les monocotyiédones.
1. Construction du vecfieur pRDP5 2o Le vecteur pTRE, commercialisé par la Société CLONTECH
Laboratories Inc., et qui est également décrit dans la bâse de données GENBANk sous le numéro d'accès 089931, est utilisé comme vecteur de départ (fig.6). Le vecteur pTRE est clivé par l'endonucléase de restriction BamHl, au niveau des nucléotides 471 et 483 du vecteur, fe as fragment d'ADN localisë entre les deux sites BamHl précités étant alors excisé.
Après clivage et excision, on réalise un remplissage des bouts .cohésifs à l'aide de la polymérase de Klenow.
On réalise ensuite une amplification du gène isum2A décrit à
30 l'exemple 1, plus spécifiquement de la région génomique allant du codon ATG à la fin du cadre de lecfiure et comprenanfi également une séquence terminateur, par amplification PCR.
Puis, ie produit d'amplification du gène isum2A est ligaturé dans le vecteur pTRE ouvert afin de construire le vecteur pRDP5 illustré à la 3s figure 5.

Dans le vecteur pRDPS; le gëne isum2A est placé sous le contrôle du promoteur prTRE, qui est reconnu par l'activateur tTA.
2) Construction du vecteur pRDP4 s Le vecteur pRDP4 contient le gène de l'activateur tTA sous le contrôle du promoteur actinel du riz.
Le vecteur de départ ést le plasmide pDM302 qui a été décrit par CAO et a1.(1992) et qui est illustré sur la figure 7.
io Le plasmide pDM302 est digéré avec l'endonucléase de restriction Smal.
Puis, on utilise le vecteur pTet-Off commercialisé par la Société
CLONTECH Laboratories Inc. (référence catalogue n°K 1620-A, année 2000), et qui est illustré sur la figure 8, pour amplifier ia séquence du is gène tTA par PCR.
Puis, le produit d'amplification du gène tTA est ligaturé au niveau du site Smal ouvert du plasmide pDM302 afin de construire le plasmide pRDP4 illustré à la figure 9.
Le plasmide pRDP4 comprend le gène tTA sous le contrôle du 2o promoteur actine1 du riz.
Un schéma de fonctionnement du système d'expression inductible décrit dans le présent exemple est représenté sur la figure 13, soif en l'absence de tétracycline (figure 13A), soit en présence de tétracycline (fig.l3B).
2s Un résumé des caractéristiques des différents vecteurs utilisés ou préparés selon l'exemple 2 est présenté dans les tableaux 5 à 8 ci-après.

Positions des élëments caractéristiques du plasmide pDM302 ~L nité: kïlobase) vecteur pSP72 0,00 0,04 promoteur actinl 0,04 1,43 polylinker 1,43 1,46 Smal _ 1,47 1,46 rsistance Basta 1,47 2,03 Smai 2,03 2,04 polylinker 2,03 2,08 terminateur nos 2,08 2,34 vecteur pSP72 2,34 4,74 Positions des éléments caractéristiques du plasmide pRDP4 ,unité: küobase~
vecteur pSP720,0 0,04 promoteur 0,04 1,43 actin1 polylinker 1,43 1,46 tTA 7 ,47 2,47 poiylinker 2,47 2,52 terminateur 2,52 2,78 nos vecteur pSP722,78 5,18 s Positions des éléments caractéristiques du plasmide~TRE2J~unité: kilobase~
promoteur avec 0,00 0,44 TRE

polylinker 0,44 0,49 terminateur SV40 0,49 0,95 vecteur pUC 0,95 3,10 Positions des éléments caractéristiques 1o du plasmide pRDPS (unité-kilobase) promoteur avec TRE 0,00 0,44 polylinker 0,44 0,49 Isum2A (ATG terminateur)0,49 2,73 terminateur SV40 2,73 3,19 vecteur pUC 3,19 5,34 EXEMPLE 3.
Construction d'un vecteur comprenant un pol~mucléotide codant 1s pour un polypeptide ISUM2A placé sous le contrôle d'un polynucléotide régulateur du ~~pe activateur inductible Le système d'expression selon l'exemple 3 constitue une illustrafiion du système d'expression I résumé dans ie tableau 3, et qui est 2o commenté dans la description.
Le système d'expression selon l'exemple 3 comprend deux cassetfies d'expression, respectivement (i) une cassette d'expression comprenant le gène isum2A placé
sous le contrôle d'un promoteur contenant la séquence UAS reconnue 2s par l'activateur GVG; et (ü) une cassette d'expression codant pour l'activateur GVG, placé sous le contrôle du promoteur actine1 du riz, qui est un promoteur fort et constitutif chez les monocotylédones.
s 7. Construction du vecteur pRDP2 Le vecteur de départ est le plasmide pTA7001 décrit par AOYAMA et al. (1997) et qüi est représenté sur la figure 10.
Le vecteur pTA7001 est soumis à une digestion par les 1o enzymes Sse83871 et Pmel afin d'exciser le promoteur 35S du virus de la mosaïque du choufleur.
Après digestion, on remplit des bouts cohésifs à l'aide de la pôlymérase de Klenow.
Puis, on amplifie le promoteur actïnel du riz par PCR, à partir 1s du plasmide pDM302 illustré à la figure 7.
Puis, le produit d'amplification du promoteur actine1 du riz est ligaturé dans le vecteur pTA7001 préalablement digéré, pour construire le plasmide pRDP2 illustré à la figure 11.
20 2. Construction du vecteur pRDP3 Le vecteur de départ est le vecteur pRDP2 construit selon le protocole ci-dessus.
Le vecteur pRDP2 esfi d'abord soumis à une digestion à l'aide 2s des endonucléases de restriction Xhol et Spel.
Après digestion, on remplit des bouts cohésifs à l'aide de la poly-mérase de Klenow.
Puis, on amplifie la région codante du gène isum2A par PCR.
Enfin, le produit d'amplification du gène isum2A est ligaturé
3o dans le vecteur pRDP2 ouvert 'afin de construire ie vecteur pRDP3 illustré à la figure 12.
Le vecteur pRDP3 contient deux cassettes d'expression, respectivement (i) une cassette d'expression contenant le gène isum2A placé
3s sous ie contrôle de la séquence UAS reconnue par l'activateur GVG; et (ü) une cassette d'expression comprenant la séquence codant pour l'activateur GVG placé sous le confirôle du promoteur constitutif de l'actine 1 du riz.
Le gène GVG code pour une protéine de fusion entre le s domaine de liaison à l'ADN de la protéine GAL4, le domaine activateur du gène VP16 et le récepteur au glucocorticoïde du rat (GR).
Un schéma du fonctionnement du système d'expression inducfiible décrit dans le présent exemple esfi représenté sur la figure 14, soit en présence de glucocorticoïde (figure 14A), soit en l'absence de io glucocorticoïde (figure 14B).
Lorsque l'on met en oeuvre le système d'expression selon l'exemple 3, en présence du signal inducteur activateur constitué par une hormone de glucocorfiicoïde, le facteur de transcripfiion hybride GVG est transporté dans le noyau et active fortement tous les promoteurs xs contenant la séquence UAS (figure 14B).
Les tableaux 9 à 1'i ci-après présentent un résumé des caractérisfiiques principales des différents vecteurs utilisés ou préparés selon l'exemple 3.
20 .

Positions des éléments caractéristiques du plasmide ~pTA7001 bordure droite ~ 0,00 0,03 Sse83871 0,05 0,05 promoteur 35S 0,05 0,86 Pmel 0,87 0,87 GVG 0,87 2,18 terminateur E9 2,21 2,76 promoteur Nos 2,78 3,11 rsistance l'hygromycine3,12 4,15 terminateur Nos 4,15 4,40 terminateur 3A 4,89 4,42 Spel 4,89 4,89 Xhol 4,94 4,94 TATA minimal 5,00 4,94 6 x GAL4 UAS 5,20 5,00 bordure gauche 5,84 5,86 pB1101 5,20 0,04 Positions des éléments caractéristiques du plasmide pRDP2 bordure droite 0,00 0,03 promoteur actinel 0,05 1,28 GVG 1,28 2,60 terminateur E9 2,62 3,18 promoteur Nos 3,20 3,53 rsistance l'hygromycine3,54 4,56 terminateur Nos 4,56 4,81 terminateur 3A 5,31 4,84 Spel 5,31 5,31 Xhol 5,36 5,36 TATA minimal 5,41 5,36 6 x GAL4 UAS 5,61 5,41 bordure gauche 6,25 6,28 pB1101 5,61 0,04 Tableau 11 Positions des éléments caractéristiques du plasmide pRDP3 s bordure droite 0,00 0,03 promoteur actine1 0,05 1,28 GVG 1,28 2,60 terminateur E9 2,62 3,18 promoteur Nos 3,20 3,53 rsistance l'hygromycine3,54 4,56 terminateur Nos 4,56 4,81 terminateur 3A 5,31 4,84 Isum2A 7,18 5,31 TATA minimal 7,23 7,18 6 x GAL4 UAS 7,44 7,23 bordure gauche 8,08 8,10 pB1101 7,44 0,04 EXEMPLE 4:
Obtention de plantes transformées par unacide nucléiaue 1o çomprenant un pol~mucléotide permettant !a production d'un lool~~eptide ISUM2A.
La transformation d'une plante dans le but d'obtenir une expression stable du poiynucléotide d'intérét dans la plante transformée est nécessaire pour assurer une modification durable du grain de maïs.
1s Des essais sont réalisés avec une construction de vecteurs décrits dans les exemples 2 et 3.

20 La méthode utilisée repose sur l'utilisation d'un canon à
particules identique à celui décrit par FiNER (1992).

Les cellules cibles sont des cellules indifférenciées en divisions rapides ayant conservé une aptitude à la régénération de plantes entières. Ce type de cellules compose le cal embryogène (dit de type II) de maïs. Ces cals sont obtenus à partir d'embryons immatures de s génotype Hill selon la méthode et sur les milieux décrits par ARMSTRONG (1994) MAIZE ,HANDBOOK; 1994, M. FREELING, V.
WALBOT EDS.; PP 665-671. Des fragments de tels cals d'une surface de.10 à 20 mm2 ont été disposës; 4 h avant bombardement, à raison de 16 fragments par boîte au centre d'une boîte de Pétri contenant un milieu 1o de culture identique au milieu d'initiation, additionné de 0,2 M de mannitol + 0,2 M de sorbitol. Les plasmides décrits dans les exemples précédents et portant les gènes à introduire, sont purifiés sur colonne QiagenR en suivant les instructions du fabricant. Ils sont ensuite précipités sur des particules de tungstène (M10) en suivant le protocole is décrit par KLEIN (1987). Les particules ainsi enrobées sont projetées vers les cellules cibles à l'aide du canon et selon le protocole décrit par J.
FINER (1992). Les boîtes de cals ainsi bombardées sont ensuite scellées à l'aide de ScellofraisR puis cultivées à l'ôbscurité à 27°C.
Le premier repiquage a lieu 24 h après, puis tous les quinze jours pendant 3 2o mois sur milieu identique au milieu d'initiation additionné d'un agent sélectif. On obtient après 3 mois ou parFois plus tôt, des cals dont la croissance n'est pas inhibée par l'agent sélectif, habituellement et majoritairement composés de. cellules résultant de la division d'une cellule ayant intégré dans son pàtrimoine génétique une ou plusieurs 2s copies du gène de sélection. La fréquence d'obtention de tels cals est d'environ 0,8 cal par boîte bombardée.
Ces cals sont identifiés, individualisés, multipliés puis cultivés de façon à régénérer des plantules, en modifiant l'équilibre hormonal et osmotique des cellules selon la méthode décrite par VAIN et al. (1989).
3o Ces plantes sont ensuite acclimatées en serre où elles peuvent étre croisées pour l'obtention d'hybridés ou autofécondées.

4.2 Transformation par Agrrobacterium Une autre technique de transformation utilisable dans le cadre de l'invention utilise Agrobacterium tumefaciens, selon le protocole décrit s par ISHIDA et al. (1996), notamment à partir d'embryons immatures de jours après la fécondation. Tous les milieux utilisés sont référencés dans la référence citée. La transformation débute avec une phase de co-culture oû les embryons immatures des plantes de maïs sont mis en contact pendant au moins 5 min avec Agrobacterium fumefaciens LBA
l0 4404 contenant les vecteurs superbinaires. Le plasmide superbinaire est le résulfiat d'une recombinaison homologue entre un vecteur intermédiaire porteur de l'ADN-T contenant le gène d'intérét et/ou le marqueur de sélection dérivé des plasmides décrits dans les exemples précédents, et le vecteur pSB1 de Japan Tobacco (EP 672 752) qui Is contient: les gënes vira et vire du plasmide pTiBo542 présent dans la souche supervirulente A281 d'Agrobacterium tumefaciens (ATCC 37349) et une région homologue retrouvée dans le vecteur intermédiaire permettant cette recombinaison homologue. Les embryons sont ensuite placés sur milieu LSAs pendant 3 jours à l'obscurité et à 25°C. Une 2o première sélection est effectuée sur les cals transformés: les cals embryogènes sont transférés sur milieu LSDS contenant de la phosphinotricine à 5 mg/I et de là céfotaxime à 250 mg/I (élimination ou limitation de la contamination par Agrobacterium tumefaciensJ. Cette étape est menée 2 semaines à l'obscurité et à 25°C. La deuxième étape 2s de sélection est réalisée par transfert des embryons qui se sont développés sur milieu LSDS, sur milieu LSD10 (phosphinotricine à 10 mg/I) en présence de céfotaxime, pendant 3 semaines dans les mémes conditions que précédemment. La troisième étape de sélection consiste à exciser les cals de type I qui restent blancs (fragments de 1 à 2 mm) et 3o à les transférer 3 semaines à l'obscurité et à 25°C sur milieu LSD
10 en présence de céfotaxime.
La régénération des plantules est effectuée en excisant les cals de type I qui ont proliféré efi én les transférant sur milieu LSZ en présence de phosphinotricine à 5 mg/I et de céfotaxime pendant 2 3s semaines à 22°C et sous lumière continue.

Les plantes ayant régénéré sont transférées sur milieu RM + G2 contenant 100 mg/l d'Augmentin pendant 2 semaines à 22°C et sous illumination continue pour l'étape de développement. Les plantes obtenues sont alors transférées au phytotron en vue de leur s acclimatation.
EXEMPLE 5 : Analyses biochimigues Des analyses biochimiques ont ëté rëalisées sur des graines de maïs 1o obtenues après autofécondation de plantes hétérozygotes portant la mutation emb8516. Ainsi la descendance est composée de graines à
phénotype sauvage, avec embryon (soit homozygotes sauvages, soit hétérozygotes) ou à phénotype mutant sans embryon (homozygotes mutantes). .
1s Ces graines ont été triées mânuellement (tri visuel en fonction du phénotype) pour séparer celles à phénotype mutant de celles à
phénotype sauvage.
Les méthodes mises en oeuvre sur ces graines pour mesurer les 2o différents paramètres (teneur en matière sèche, dosages des cendres brutes, de l'amidon EWERS, des matières grasses hydrolysables, des acides aminés...) peuvent étre basées sur les normes AFNOR
homologuées 'NFV' ou expérimentales 'XPV' suivantes (disponibles sur le site internet http://www.afnor.fr, normes en lignes) :
2s - Teneur en matière sèche résiduelle (MSR 4H-130) : NFV 03-708 Mars 1976. Maïs. Détermination de la teneur en eau sur grains entiers et sur grains broyés. La méthode mise en oeuvre dans le cas présent n'utilise pas le broyeur réfrigéré, c'est la raison pour laquelle ce n'est pas une vraie teneur en matière sèche, mais 3o simplement une matière sèche résiduelle sur le broyage destiné à
être analysé.

- Dosage des cendres brufies (cendres (2)) : NFV 18-101 Oct 1977.
Commission Aliment des animaux. Dosage des cendres brutes.
- Dosage de l'amidon EWERS (amidon Ewers (2)) : 3°directive de la communauté européenne avec rectificatif JOCE du 27/11/80.
s Dosage de l'amidon, méthode polarimétrique.
Dosage des matières grasses avec hydrolyse (MGH (2)) : NFV
18-117 Août 1997. Aliment des animaux. Dosage de la matière grasse. Procédé B. .
- Dosage des parois (parois (2)) : XP V 18-111 Janvier 1998.
io Aliment des animaux. Détermination de la teneur en parois végétales insolubles dans l'eau.
- Dosage des acides aminés (acides aminés). Les méthodes mises en oeuvre sont les suivantes XP V 18 113 Janvier 1998. Aliments des animaux. Dosage des 1s acides aminés.
XP V 18 114 Janvier 1998. Aliments des animaux. Dosage du tryptophane.
- Dosage des matières azotées totales : méthode de DUMAS : NFV
18-120.
2o Les résultats des analyses effectuées sur le matériel homozygote comportant la mutation Emb8516 (gène Isum2) et le témoin sauvage correspondant sont représentés dans le tableau ci-dessous Les données du tableau sont exprimées en glkg MS
Sauvage Emb8516 DifFrentiel (Tmoin) (%) ~ Tmoin Matire-Sche-(MS)-en-g/I~g.888.60 . 885.9.0 -0.30--___., de farine _ _ Teneur en Parois 115.10 143.00 24.24 Amidon Ewers 678.40 719.50 6.06 Matires Grasses 63.60 20.70 -67.45 H drol sables Cendres (Minraux) 16.30 11.60 -28.83 MS Ajinomoto en 902.70 892.00 -1.19 glkg de farine Matire Azote Totale115.87 107.62 -7.12 Ajinomoto Lysine 3.43 3.03 -11.66 Thronine 4,21 3.81 -9.50 Mthionine 2,10 1.79 -14.76 Cystine 2.55 2.47 -3.14 Methi_onine+Cystine4.54 4.26 -6.17 Tryptophane 0.85 0.77 -9.41 Alanine 8.64 7.74 -10.42 Arginine 5.43 4.48 -17.50 Acide Aspartique 7.64 7.62 -0.26 Acide Glutamique 21.38 18.83 -11.93 Glycine 4.43 3.92 -11.51 Histidine 3.43 3.14 -8.45 Isoleucine 4.10 3.70 -9.76 Leucine 14.29 12.78 -10.57 Phnylalanine 5.76 5.04 -12.50 Srine 5.65 4.93 -12.74 Tyrosine 3.77 3.48 -7.69 Valine 5.65 5.27 -6.73 Acides Amins Totaux103.32 92.81 ~ -10.17 ~

s Ces analyses montrent qu'il n'y a pas de différence au niveau de la teneur en matière sèche des graines.
Par contre l'absence d'embryon fiée à la mutation Emb$516 conduit à une forte diminution de la teneur en matières grasses hydrolysées (moins d'un tiers de la valeur du témoin), en cendres-minéraux (baisse de 28.8%) et. une légère baisse en acides aminés totaux (10,2%). Ces données confirment l'importance de l'embryon en tant que source de matières grasses et minérales et, indirectement, l'effet de la régulation négative ~de l'expression du polypeptide ISUM2 sur s la qualité en huile de la graine nature.
Ces dimnûtions en mâtières grasses, cendres (mineraux) ét acides aminés sont par ailleurs compensées par une augmentation de fa teneur en paroi (24,2%) et en amidon (6,1 %), ce qui confirme la relation étroite qui existe entre développement de l'embryon et développement 1o de l'albumen et !a possibilitë de moduler les qualifiés agronomiques de l'embryon et/ou de l'albumen en fonction des applications recherchées (semoulerie ou amidonnerie).
Ces expériences confirment donc l'intérêt d'utiliser les séquences d'acides nucléiques et polypeptides selon l'invention 1s impliquées dans le dëveloppement de l'embryon et/ou l'albumen, pour moduler les qualités agronomiques de la graine mature.

SEQUENCES SEQ ID N~ Description 1 Acide nuclique gnomique HD5XHD7 2 Acide nuclique gnomique A188 _-3_ ADN.c_de_H.DS_~H.Q7 4 ADNc de A188 Polypeptide ISUM2A de HD5 x HD7 6 Polypeptide ISUM2A de A188 7 Squence insertion 62422 8 Amorce Mul6 9 Amorce adap Msel Amorce GW3

11 Amorce GW3b

12 Amorce GW4

13 Amorce GW4b

14 Amorce Mu15 Amorce AP1 16 Amorce AP2 17 Amorce Isum2a 18 Amorce Isum2b 19 Amorce Isum2c Amorce Isum2e 21 Amorce Isum2le 22 Amorce Isum21 23 Amorce 8516g 24 Amorce OMuA

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LISTE DE SEQUENCES
<110> Institut National de la Recherche Agronomique (I.N
Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS
Ecole Normale Supêrieure de Lyon (ENSL) Universitê Claude Bernard de Lyon (UCBL) Biogemma <120> Acides nucléiques codant pourun polypeptide ISUM2A et utilisation de ces acides nucléiques pour l~obtention de plantes transformées produisant des graines affectêes dans le développement du germe.
<130> mutant emb <140>
<141>
<160> 24 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 5620 <212> ADN
<213> Zea mays <400> 1 cactagagta aactagttag tccaaatatt tgtgttgggc attcaaccac caaaatttaa 60 ttagggacta ggtgtaatcc taattccctt tcataaactc tatcccgtcg agtccgtttg 120 cttgtgactt agtttgggac cctccttttc tattgaaagg ggttcagatc gctggggacc 180 aagactgaag gaaaaggcgt ttgtcctcta gggtggtccg gagctgtgta gccgcttagc 240 ctggtcctgt accctaagcc tacatacttc accactcttg aacaggtggc ctattacctg 300 gaactgggtc cctagaggcc cggacctcct tctagcttac aggttggctt cctaaactct 360 gctcgtcaag cccggttgcg catctcaaag gatcaagtgc aacagagtgt gggtcccatg 420 ggtgtgttac taaacatcaa tcttgagtca tatgcagggc aaaatcctgg ttaggcggta 480 gccgaggcgt cgggtagaac accaagagac acccacacca agtgctagcg acctaaacca 540 tgacatgggg gctcgggccc accagtcata tgtagtgggt ggcaggcgta ggtgtgaaaa 600 ggcgggatat gaaccgtcgg gcgcacgaca cacacaatga gtaccttctc aggaatccct 66O
gtagtgataa aaaccgattt tactgccacg atggtggcca acgttatgcc catgaaccag 720 gcgtgggagc cgcaggtcaa tgagctgcat cgacataagc gacagtaagt gatctgâcgg 780 taagcgtaac agcgagcgtg acaccgttgg cgctagtcac aatcaagttg cttgtagcag 840 gatcacagtt atgccccccc cacttgcgag ttcgtaacct ctcccgaggt gggctcgggg 900 gccactgtcg ataccccgta actagggtac tCtctcctac tgtgtcaagg cagatacctg 960 tgcggttagc tctaaccaca tgctaaagaa ctaagcagcc gggcccacgg gaccggacct 1020 cgactgacaa ggaccgctgg ccttggaact cgctccctgc tcagggacag atccggtgct 1080 gccacgtgtc ctagaagaga agatgcctag ggactactcc cataggtctg gacccatggg 1140 tggggcccga atccccacgt atgtcgtccg gaccccatgg gcgggtcctg aatctccacg 1200 tatgtcgttc.gaâtttattg tattgcattg tgtgtagtgt cgtattattg gacattcttt 1260 tctttcggtt gaactgcgta tatattgtta ggattgaatt ttgtgtattg atggatttat 1320 cattgaaatt tgtgattttt tattgctgat tgtagcaatg agagcacaaa gcagtgtaaa 1380 actcgactca ctgaagaatt ctatgagata ttaaggtcaa tgattatata tattatttat 1440 ttttatacat taattatgca ctaacatttt tattaaataa tttatgtgtg attgtaacag 1500 catggacatc gtacctgtta caatataata gccctccctt tacttcattc atgttctgca 1560 ttccggtctg gtcgtctgga gaggaggtct cctatgttct gcgagacagc gagagcgata 1620 cagtagtctg gtacgcctct tcccgtatcc gtagcgtcga cgctgctgcc tgctgggaaa 1680 aattcgtggg ctgaccgttg ccacaaacgg cccaagcgac gcaagcctcc ctgcaggctg 1740 cagcacggag ctcgctcgct gctatctgtc ttagccatcc gtccgcagcc tatccaattc 1800 cattccaaat ccgcagtccg cagacgagag tggaagcggg gcacagacag gaagagaagc 1860 caatggcgct gtccctctcc ctcgcgcgcc ccgcgcccct cgccgtttcc gccggcgcag 1920 gagccaggaa gctacccgca gccagcctcg cattcccggc gaaatccttc ttcggcgcgc 1980 cgctggccgc caccgcggec tccgtcgcgt cgccgctccc gcgcaagccg gccacctcca 2040 ccacctcgct cgaggtcgtc gcggcgggga agaagggcta caagatgaag acgcacaagg 2100 ttctttcctg.ctatctcgtc cttggttcct gagagtcatc gggttgttcg gtgccttttg 2160 ctgattcgtg~tctcggtcgg ttctttgtgt gtcgtcgctc gtcaaggcgt cggcgaagcg 2220 gttccgggtg acggggaggg gcaagatcgt gcggcggtgc gccgggaagc agcacttgct 2280 cgccaagaag aacaccaagc gcaagaagag gctctcgaag atggtattct tctttcctcc 2340 ctccactccc actctagtgc cgctcaaatt ttgttcagct gcttcttatg tcgcagctaa 2400 tgacggcttg catattagtt attgcctgtt ttaatagctg tacatagaaa acaagtccgg 2460 tgcgtctccg taaattagat gctaatgtcg atttttttat gtcaatagca cattgcgctc 2520 tcgtatttta attgctcgat aggtttattg tgataacgtt gctggaaact ggaaaggcga 2580 aatggaggga cgtccggact ggggtttgtt ttgctgatgt gctctggggt gctacctttg 2640 ttactttctt ggatctcgtt gtctcctact cattaggatg cacagtctgt tcctcgatca 2700 tcaaatgtgt gtcagggcca atagatggca tgaaaaagct tttggctaca attgaacttg 2760 tcgaagttca.cagattatta tcatggtcct tatataacgt ttgtttctga aaatgaactg 2820 ttttacttgt acacataaaa ttacctctgg aaataggcat tacaattttc agaaagaagt 2880 gggtgtgggt gtaaaacgta ctgacctatg aacatttcta gttttactcc actattgtta 2940 gtcagctaat gtattggggg agtgctgccc atgaattaga catcctgttc ttccattttt 3000 gtgttgtgat aataactttc agattcatca agaatgtaag ggtcttagaa gttagaactt 3060 gttctactgt agaatttggt gataattgaa tagcgaggat atttctcctc gatggatccc 3120 ctccatttac ctgtccacca aaccagcact aggaatcctg atttcccact aatctgcact 3180 ttagtttttt tctgattaag tccagtcttt cccatccttc acgcatcctt cacgatgaat 3240 gctgtagaat ttggttatgt cattcttatg aatcctgatt tcccactaat ctgcacttca 3300 gttagtgtgt gcttagctgc tttcttttgt gaaccgggct atattagaga ggtgtagttt 3360 tttcagatta agacattaag tccagtcttt accatccttc acgcattcat cgtagtagtc 3420 tgatgtactg cttcacacac acacacctag cagttgatgt tggcatccca tgggcatggg 3480 gtgaagcaaa atttctattt ttttgtgaca gaaaaattat taacctctgt ccataaagtt 3540 gcgggccatt ttcaatgtat ccttgaaacc gtggcaattc catttgcagt ctgaacttga 3600 cgttttcttt tcttcttaaa tcacactgct atatattttt ttcaggtgca agtcaacaag 3660 agtgactacg acaatgttac gggtgcactg ccctacctca aagtgaatag gaaagcaaac 3720 tgagagctac gtggtcttca aaaaatcatt aagtttcgtt ccaccaaatt gtaattttgt 3780 gtatcttcca ctgtatttcc ttctcaaaaa tactgaggca tcatttcaaa gcaagcaaaa 3840 aacaactcct ggtatcaaca gtatagcgat atttcagaat gaggtgcact gcttgctata 3900 gttgttattt agtcgcaaat atgtgcaagt aagagtggca cttgagccat tagctcctct 3960 taggatatgg ccagcagatc gtgtatatgg ctgtgcaâga cactgttttg caccatttta 4020 tatatagact gcattgttta catgatgaag cttgaaatag gatatgggat gagtgcaact 4080 gctggagata gcctcaggga gctaaacttt tcactggtct gtcttaaacc ttaatetaat 4140 ggttttcatc tgtattgctg gctgccaaat tgtggacgtt ttttgggtaa ccagtttcat 4200 gaccaaattt cagtgacgcc aatgcttgtc tttaaaaaaa tcgtattttg caaaaaaaaa 4260 tttgtagtca ccaaccaaat atgtgtaaca aactttcttt cctctgcttt gtgatctcca 4320 agttcatctt aactatctgc tttgggaata acaaatgatc gattcggccc tatttagctc 4380 tccttttcct aaaacccaca aacctatttg tagttttgta caccgccata gctgtcaaca 4440 atgaatgttg atccgagata gggagagggt gaaatcacga gataaaccta aacataccat 4500 ctgactgtta tctagtattc tactaaccaa cctaaagagt tttgctggct agaacaaatc 4560 ctatgatcta acctatgcac tgctttagga agtaaaggca cataaaacac acaagtgcta 4620 gctcgcggat. ctctattcca ttttgaagct ccacagagga tataattttg gtcacaactc 4680 ataaggtttg tcagatcacg gtcttgagct cgctgcaatg cgtcatgaaa gggtctccta 4740 tcgctgaata agtgtgttca tgatgttcca tacaacgctt gagggtagat atatcgatag 4800 tgcattagtg taacgtgttg acccttttta gtactatgac aaagggtcgt ggtcagcaat 4860 ggaccatcat gtttgttttg gttaataggt ggattcatct atatttatac cactatataa 4920 tctattcgtc taaattttac aaaacccacc caaccaaatc atctccacac ccatgacctc 4980 cattaaatcc gtcaaacaaa gtgcacccag acttaacâçg ccatcaaaac taacagttca 5040 gattgctgaa taaccccttc tcccttactc acccgaatcc aatggacaag attatttcga 5100 tcatccttca tccctacccc tcccctgcga ctgaaaggga aatagggtta acattttccc 5160 agtattaatt ttggtggttg aatgcccaac acaaatattg gactaactag tttgctctag 5220 attatatatt ctacaggtgc ataaaggttc aacacaaacc aataaaagat caaagttagg 5280 gttcaaaaac aaaagagcaa agaaaccgag tgtgccctgg ctggcgcac cggactgtcc 5340 ggtgcaccag gaccgtacag ttccaaactc gccaccçttg ggtttctctg gacgtgctcc 5400 gctataattc âctggaatgt ccggtgcacc agcggagcaa cggctacttc gcgcaatggt 5460 cgcctgcaaa aâagctgaag aatcagatga acagtgcgcg gcagtgcgcg gcagagcaga 5520 gccgcccgtc agaggcgcac cggacactgc gcagtgcatg tctggtgcca ctagaagaca 5580 aagcctccaa tggtcagagg ctcccgaacc ctaacggttg 5620 <210> 2 <211> 2004 <212> ADN
<213> Zea mays <400> 2 ggcggggaag aagggctaca agatgaagac gcacaaggtt ctttccctgc tatctcgtcc 60 ttggttcctg agagtcatcg ggttgttcgg tgccttttgc tgattcgtgt ctcggtcggt 120 tctttgtgtg tcgtcgctcg tcaaggcgtc ggcgaagcgg ttccgggtga cgcggagggg 180 caagatcgtg cggcggtgcg ccgggaagca gcacttgctc gccaagaaga acaccaagcg 240 caagaagagg ctctcgaaga tggtattctt ctttcctccc tccactccca ctctagtgcc 300 gctcaaattt tgttcagctg cttcttatgt cgcagctaat gacggcttgc atattagtta 360 ttgcctgttt taatagctgt acatagaaaa caagtccggt gcgtctccgt aaattagatg 420 ctaatgtgga tttttttatg tcaatagcac attgcgctct cgtattttaa ttgctcgata 480 ggtttattgt gataacgttg ctggaaactg gaaaggcgaa atggagggac gtccggactg 540 gggtttgttt tgctgatgtg ctctggggtg ctacctttgttactttcttg gcatctcgtt 600 gtctcctact cattaggatg cacagtctgt tcctcgatca tcaaatgtgt gtgagggcca 660 atagatggca tgaaaaagct tttggctaca attgaacttg tcgaagttca cagattatta 720 tcatggtcct tatataacgt ttgtttctga aaatgaactg ttttacttgt acacataaaa 780 ttacctctgg aaataggcat tacaattttc agaaagaagt gggtgtgggt gtaaaacgta 840 ctgacctatg aacatttcta gttttactcc actattgtta gtcagctaat gtattggggg 900 agtgctgccc atgaattaga catcctgttc ttccattttt gtgttgtgat aataactttc 960 agattcatca agaatgtaag ggtcttagaa gttagaactt gttctactgt agaatttggt 1020 gataattgaa tagcgaggat atttctcctc gatggatccc ctccatttac ctgtccacca 1080 aaccagcact aggaatcctg atttcccact aatctgcact ttagtttttt tctgattaag 1140 tccagtcttt cccatccttc acgcatcctt cacgatgaat gctgtagaat ttggttatgt 1200 cattcttatg aatcctgatt tcccactaat ctgcacttca gttagtgtgt gcttagctgc 1260 tttcttttgt gaaccgggct atattagaga ggtgtagttt tttcagatta agacattaag 1320 tccagtcttt accatccttc acgcattcat cgtagtagtc tgatgtactg ettcacacac 1380 acacacacct agcagttgat gttggcatcc catgggcatg gggtgaagca aaatttctat 1440 ttttttgtga cagaaaaatt attaacctct gtccataaag ttgcgggcca ttttcaatgt 1500 atccttgaaa ccgtggcaat tccatttgca gtctgaactt gacgttttct tttcttctta 1560 aatcacactg ctatatattt ttttcaggtg caagtcaaca agagtgacta cgacaatgtt 1620 acgggtgcac tgccctacct caaagtgaat aggaaagcaa actgagagct acgtggtctt 1680 caaaaaatca ttaagtttcg ttccaccaaa ttgtaatttt gtgtatcttc cactgtattt 1740 ccttctcaaa aatactgagg catcatttca aagcaagcaa aaaacaactc ctggtatcaa 1800 cagtatagcg atatttcaga atgaggtgca ctgcttgcta tagttgttat ttagtcgcaa 1860 atatgtgcaa gtaagagtgg cacttgagcc attagctcct cttaggatat ggccagcaga 1920 tcgtgtatat ggctgtgcaa gacactgttt tgcaccattt tatatataga ctgcattgtt 1980 tacatgatga agcttgaaat agga 2004 <210> 3 <211> 833 <212> ADN
<213> Zea mays <400> 3 gcagtccgca gacgagagtg gaagcggggc acagacagga agagaagcca atggcgctgt 60 cectetccct egcgegcccc gcgccectcg ccgtttccgc cggcgcagga gecaggaagc 120 tacccgcagc cagcctcgca ttcccggcga aatccttctt cggcgcgccg ctggccgcca 180 ccgcggcctc cgtegcgtcg cegctcccgc gcaagccggc cacctccacc acetcgctcg 240 aggtcgtcgc ggcggggaag aagggctaca agatgaagac gcacaaggcg tcggcgaagc 300 ggttccgggt gacggggagg ggcaagatcg tgcggeggtg cgccgggaag cagcacttgc 360 tcgccaagaa gaacaccaag cgcaagaaga ggctctcgaa gatggtgcaa gtcaacaaga 420 gtgactacga caatgttacg ggtgcactgc cctacctc.aa agtgaatagg aaagcaaact 480 gagagctacg tggtcttcaa aaaatcatta agtttcgttc caccaaattg taattttgtg 540 tatcttccac tgtatttcct tctcaaaaat actgaggcat catttcaaag caagcaaaaa 600 acaactcctg gtatcaacag tatagcgata tttcagaâtg aggtgcactg cttgctatag 660 ttgttattta gtcgcaaata tgtgcaagta agagtggcac ttgagccatt agctcctctt 720 aggatatggc cagcagatcg tgtatatggc tgtgcaâgac actgttttgc accattttat 780 atatagactg cattgtttac atgatgaagc ttgaaatagg atatgggatg agt 833 <210> 4 <211> 621 <212> AbN
<213> Zea mays <400> 4 ctacccgcag ccagcctcgc attcccggcg aaatccttct tcggcgcgcc gctggetgcc 60 accgcggcet ccgtcgcgtc gccgctcccg cgcaagccgg ccacctccac cacctcgctt 120 gaggtcgtcg cggcggggaa gaagggctac aagatgaaga cgcacaaggc gtcggcgaag 180 cggttccggg tgacggggag gggcaagatc gtgcggcggt gcgccgggaa gcagcacttg 240 ctcgccaaga agaacaccaa gcgcaagaag aggctctcga agatggtgca agtcaacaag 300 agtgactacg acaatgttac gggtgcactg ccetacctca aagtgaatag gaaagcaaac 360 tgagagctac gtggtcttca aaaaatcatt aagtttcgtt ccaccaaatt gtaattttgt 420 gtatettcca ctgtatttcc ttctcaaaaa tactgaggca tcatttcaaa gcaagcaaaa 480 aacaactect ggtatcaaca gtatagcgat atttcagaat gaggtgcact gcttgctata 540 gttgttattt agtcgcaaat atgtgcaagt aagagtggca cttgagccat tagctcctct 600 taggatatgg ccagcagatc g <210> 5 <211> 143 <212> PRT
<213> Zea mays <400> 5 Met Ala Leu Ser Leu Ser Leu Ala Arg Pro Ala Pro Leu Ala Val Ser Ala Gly Ala Gly Ala Arg Lys Leu Pro Ala Ala Ser Leu Ala Phe Pro Ala Lys Ser Phe Phe Gly AIa Pro Leu Ala Ala Thr Ala Ala Ser Val Ala Ser Pro Leu Pro Arg Lys Pro Ala Thr Ser Thr Thr Ser Leu Glu Val Val Ala Ala Gly Lys Lys Gly Tyr Lys Met Lys Thr His Lys Ala Ser Ala Lys Arg Phe Arg Val Thr Gly Arg Gly Lys Ile Val Arg Arg Cys Ala Gly Lys Gln His Leu Leu Ala Lys Lys Asn Thr Lys Arg Lys Lys Arg Leu Ser Lys Met Val Gln Val Asn Lys Ser Asp Tyr Asp Asn 115 ~ 120 125 Val Thr Gly Ala Leu Pro Tyr Leu Lys Val Asn Arg Lys Ala Asn <210> 6 <211> 143 <212> PRT
<213> Zea mays <400> 6 Met Ala Leu Ser Leu Ser Leu Ala Arg Pro Ala Pro Leu Ala Val Ser Ala Gly Ala Gly Ala Arg Lys Leu Pro Ala Ala Ser Leu Ala Phe Pro Ala Lys Ser Phe Phe Gly Ala Pro Leu Ala Ala Thr Ala Ala Ser Val Ala Ser Pro Leu Pro Arg Lys Pro Ala Thr Ser Thr Thr Ser Leu Glu Val Val Ala Ala Gly Lys Lys Gly Tyr Lys Mét Lys Thr His Lys Ala Ser Ala~Lys Arg Phe Arg Val Thr Arg Arg Gly Lys Ile Val Arg Arg Cys Ala Gly Lys Gln His Leu Leu Ala Lys Lys Asn Thr Lys Arg Lys Lys Arg Leu Ser Lys Met Val Gln Val Asn Lys Ser Asp Tyr Asp Asn Val Thr G1y Ala Leu Pro Tyr Leu Lys Val Asn Arg Lys Ala Asn <210> 7 <211> 166 <212> ADN
<213> Zea mays <400> 7 ggcggggaag aagggctaca agatgaagac gcacaaggtt ctttcctgct atctcgtcct 60 tggttcctga gagtcatcgg gttgttcggt gccttttgct gattcgtgtc tcggtcggtt 120 ctttgtgtgt cgtcgctcgt cgagataatt gccattatgg acgaag 166 <210> 8 <211> 20 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce <400> 8 tcyataatgg caattatctc 20 <210> 9 <211> 17 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220> ' <223> Description de la séquence artificielle: amorce <400> 9 gatgagtcct.gagtaan 17 <210> 10 <211> 28 <212> ADN
<213> Sêquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce <400> 10 gaaactggaa aggcgaaatg gagggacg 28 <210> 11 <211> 32 <212> ADN
<213> Sêquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce <400> 11 gctcgatagg tttattgtga taacgttgct gg 32 <210> 12 <211> 28 <212> ADN
<213> Sêquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce <400> 12 gtccctccat ttcgcctttc cagtttcc 28 <210> 13 <211> 32 <212> ADN
<213> Sêquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence axtificielle:amorce <400> 13 ccagcaacgt tatcacaata aacctatcga gc 32 <210> 14 <211> 31 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>

<223> Description de la séquence artificielle: amorce <400> 14 gagaagccaa cgccawcgcc tcyatttcgt c 31 <210> 15 <211> 27 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce <400> 15 ggatcctaat acgactcact atagggc 27 <210> 16 <211> 18 <212> ADN
<213> Séquencé artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce <400> 16 ctatagggct cgagcggc 18 <210> 17 <211> 25 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce <400> 17 ctacccgcag ccagcctcgc attcc 25 <210> 18 <211> 30 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce <400> 18 ggcggggaag aagggctaca agatgaagac 30 <210> 19 <211> 29 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce ô
<400> 19 gccaagaaga.acaccaagcg caagaagag 29 <210> 20 <211> 25 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce <400> 20 cgatctgctg gccatatcct aagag 25 <210> 21 <211> 24 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce <400> 21 catcttcgag agcctcttct tgcg 24 <210> 22 <211> 26 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce <400> 22 CttCatCttg tagCCCttCt tCCCCg 26 <210> 23 <211> 23 <212> ADN
<213> Sëquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificieTle:amorce <400> 23 gcacccgtaa cattgtcgta gtc 23 <210> 24 <211> 25 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce <400> 24 cttcgtccat aatggcaatt atctc 25

Claims (40)

Revendications

1. Acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A choisi parmi les séquences ayant au moins 95%
d'identité en acides aminés avec les séquences SEQ ID No 5et SEQ ID
No 6, ou pour un fragment d'au moins 100 acides aminés consécutifs d'un polypeptide ISUM2-A, ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.

2. Acide nucléique selon la revendication 1 comprenant un polynucléotide possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec (a séquence nucléotidique SEQ ID No1, ou avec un fragment d'au moins 300 nucléotides consécutifs de cette séquence nucléotidique, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

3. Acide nucléique selon la revendication 1 comprenant un polynucléotide possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID No2, ou avec un fragment d'au moins 300 nucléotides consécutifs de cette séquence nucléotidiqué, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

4. Acide nucléique selon la revendication 1 comprenant un polynucléotide possédant au moins 99% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID No3, ou avec un fragment d'au moins 300 nucléotides consécutifs de cette séquence nucléotidique, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

5. Acide nucléique selon la revendication 1 comprenant un polynucléotide possédant au moins 99% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID No4, ou avec un fragment d'au moins 300 nucléotides consécutifs de cette séquence nucléotidique, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

6. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé
en ce qu'il comprend un polynucléotide régulafieur capable de réguler la transcription ou la traduction du polynucléotide codant pour le polypeptide ISUM2A, ou le fragment de ce polypeptide, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

7. Acide nucléique selon la revendication 6, caractérisé en ce que le polynucléotide régulateur permet la surexpression du polypeptide ISUM2A ou du fragment de ce polypeptide dans un organisme hôte.

8. Acide nucléique selon l'une des revendications 6 ou 7 caractérisé en ce que le polynucléotide régulateur est sensible à l'action d'un signal inducteur.

9. Acide nucléique selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que le polynucléotide régulateur est un polynucléotide répresseur inductible de la transcription ou de la traduction.

10. Acide nucléique selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que le polynucléotide régulateur est un polynucléotide activateur inductible de la transcription ou de la traduction.

11. Acide nucléique selon la revendication 10, caractérisé en ce que le polynucléotide activateur inductible est un polynucléotide codant l'activateur GVG, placé sous le contrôle du promoteur du gène de l'actin 1 du riz.

12. Acide nucléique utilisable en tant que sonde ou amorce hybridant spécifiquement avec un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5, ou un acide de séquence complémentaire.

13. Sonde ou amorce nucléotidique hybridant spécifiquement avec un acide nucléique codant pour un polypeptide iSUM2A,caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les séquences SEQ
ID N°10 à 13 et 17 à 23.

14. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 12 ou 13 pour détecter la présence d'un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A dans un échantillon.

15. Vecteur recombinant comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 13.

16. Cellule hôte transformée par un acide nucléique selon l'un des revendications 1 à 13 ou par un vecteur recombinant selon la revendication 15.

17. Cellule hôte selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule de plante.

18. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 13, d'un vecteur recombinant selon la revendication 15 ou d'une cellule hôte transformée selon l'une des revendications 16 ou 17 pour fabriquer une plante transformée capable de produire des graines à
développement affecté du germe.

19. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 6 ou 7, d'un vecteur recombinant comprenant un tel acide nucléique ou d'une cellule hôte recombinante transfectée ou transformée avec cet acide nucléique pour l'obtention d'une plante transformée suscepfiible de produire des graines riches en huile.

20. Plante transformée par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 13 ou par un vecteur recombinant selon la revendication 15.

21. Plante transformée comprenant une pluralité de cellules hôtes selon la revendication 17.

22. Plante transformée selon l'une des revendications 20 ou 21, caractérisée en ce qu'elle dérivé d'une plante dont les deux copies du géne Isum2A portent chacune au moins une mutation provoquant un défaut dans la production d'un polypeptide ISUM2A de séquence SEQ ID
N° 5 ou 6.

23. Procédé pour l'obtention d'une plante transformée susceptible de produire des graines à développement du germe affecté, caractérisé
en ce qu'il comporte les étapes suivantes:
a) transformation d'au moins une cellule végétale par un acide nucléique selon l'une des revendications 6 à 10 ; ou par un vecteur recombinant comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 6 à 10;
b) sélection des cellules transformées obtenues à l'étape a) ayant intégré dans leur génome au moins une copie d'un acide nucléique selon l'une des revendications 6 à 10 ;
c) Régénération d'une plante transformée à partir des cellules transformées obtenues à l'étape b).

24. Procédé selon la revendication 23 dans lequel au moins une cellule végétale est transformée à l'étape a) par Agrobacterium tumefaciens contenant un acide nucléique selon l'une des revendications 6 à 10 ou un vecteur recombinant comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 6 à 10

25. Plante transformée, telle qu'obtenue par le procédé selon l'une des revendications 23 ou 24.

26. Plante transgénique hybride obtenue par le croisement d'une plante selon la revendication 25.

27. Partie d'une plante transformée selon l'une des revendications 25 ou 26.

28. Procédé pour l'obtention de grains de plantes à
développement affecté du germe, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes:

a) cultiver, jusqu'à la pollinisation, une plante dont les deux copies du gène Isum2A portent chacune au moins une mutation provoquant un défaut dans la production du polypeptide ISUM2A et dans le génome de laquelle on a introduit un acide nucléique selon la revendication 9 ;
en l'absence du signal inducteur répresseur auquel le polynucléotide régulateur répresseur est sensible.
b) mettre en contact la plante transformée définie en a) avec le signal inducteur répresseur auquel le polynucléotide régulateur répresseur est sensible, pendant une période allant du début de la pollinisation jusqu'à la fin de la formation des grains;
c) récupérer les grains matures, affectés dans le développement du germe.

29. Procédé pour l'obtention de grains de plantes à
développement affecté du germe caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes:
a) Cultiver, jusqu'à la pollinisation, une plante dont les deux copies du gène Isum2A portent chacune au moins une mutation provoquant un défaut dans la production du polypeptide ISUM2A et dans le génome de laquelle on a introduit un acide nucléique selon la revendication 10;
en présence du signal inducteur activateur auquel le polynucléotide régulateur activateur est sensible.
b) poursuivre la culture de la plante transformée définie en a) en l'absence du signal inducteur activateur auquel le polynucléotide régulateur activateur est sensible, à partir de la période suivant la pollinisation.
c) récupérer les grains mâtures, affectés dans le développement du germe.

30. Semence affectée dans le développement du germe telle qu'obtenue par le procédé selon l'une des revendications 28 ou 29.

31. Semence affectée dans le développement du germe caractérisée en ce que chacune de ses cellules constitutives comprennent, sous une forme artificiellement intégrée dans leur génome, un acide nucléique selon l'une des revendications 6 à 10.

32. Produit de transformation d'une semence selon l'une des revendications 30 ou 31.

33. Produit de transformation selon la revendication 32 caractérisé
en ce qu'il s'agit d'un amidon.

34. Produit de transformation selon la revendication 32, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une farine de semence ou d'une huile.

35. Polypeptide ISUM2A, ou fragment de ce polypeptide, codé par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 10.

36. Polypeptide selon la revendication 35, caractérisé en ce qu'il possède au moins 95% d'identité en acides aminés avec l'une des séquences SEQ ID N o 5 et SEQ ID N o 6.

37. Anticorps dirigé contre un polypeptide selon l'une des revendications 35 ou 36.

38. Procédé pour détecter la présence d'un polypeptide selon l'une des revendications 35 ou 36, dans un échantillon, comprenant les étapes suivantes:
a) mettre en contact l'échantillon à tester avec un anticorps selon la revendication 37;
b) détecter le complexe antigène/anticorps éventuellement formé.

39. Nécessaire ou kit pour la détection d'un polypeptide selon l'une des revendications 35 ou 36 dans un échantillon, comprenant:
a) un anticorps selon la revendication 37 ;
b) le cas échéant, un ou plusieurs réactifs nécessaires à la détection du complexe antigène/anticorps.

40. Utilisation d'un acide nucléique ou d'un variant allélique d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5 dans des programmes de sélection pour l'obtention de plantes à embryon modifié
en taille et/ou développement influant sur le contenu en amidon et/ou en huile.

4l.Méthode de sélection de plantes à embryon modifié en taille et/ou en développement comprenant les étapes de:
a) génotyper des plantes (individus) au moyen de sondes ou amorces nucléotidiques obtenues à partir des acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 5 ou de variants de ces acides nucléiques ;
b) sélectionner, parmi ces plantes (individus), celles qui comprennent une fréquence élevée d'allèles favorables associées à la taille et/ou au développement de l'embryon.