FR2818286A1 - Acides nucleiques et polypeptides exprimes specifiquement dans les cellules de la zone de transfert d'un grain de plante et leurs applications - Google Patents

Acides nucleiques et polypeptides exprimes specifiquement dans les cellules de la zone de transfert d'un grain de plante et leurs applications Download PDF

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Peter Rogowsky
Jean Louis Magnard
Pascual Perez
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Abstract

La présente invention concerne des acides nucléiques exprimés spécifiquement dans la zone de transfert d'un grain de plante, de préférence des acides nucléiques constitutifs des gènes DD1-a et DD1-b du maïs.L'invention est également relative à des vecteurs recombinants de clonage et/ou d'expression comprenant un acide nucléique selon l'invention ainsi qu'à des cellules hôtes transformées par un acide nucléique ou un vecteur recombinant de l'invention, en particulier des cellules hôtes d'origine végétale.

Description

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La présente invention concerne des acides nucléiques exprimés spécifiquement dans la zone de transfert d'un grain de plante, de préférence des acides nucléiques constitutifs des gènes DD1-a et DD1-b du maïs.
L'invention est également relative à des vecteurs recombinants de clonage et/ou d'expression comprenant un acide nucléique selon l'invention ainsi qu'à des cellules hôtes transformées par un acide nucléique ou un vecteur recombinant de l'invention, en particulier des cellules hôtes d'origine végétale.
L'invention a également pour objet une plante transformée par un acide nucléique ou un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus ainsi que leurs procédés d'obtention.
L'invention a également trait à un polypeptide codé par un acide nucléique selon l'invention.
DESCRIPTION DE L'ETAT DE LA TECHNIQUE
Les angiospermes, ou plantes à fleurs, se caractérisent par leur mode de reproduction sexué par double fécondation. Deux gamètes mâles sont transportés par le tube pollinique et pénètrent dans l'ovule, puis dans le sac embryonnaire. Tandis que l'un va féconder l'oosphère pour donner un embryon diploïde, l'autre s'unit aux deux noyaux polaires de la cellule centrale, permettant ainsi la formation d'un deuxième organisme, celui-ci triploïde, appelé albumen ou embryon accessoire. Pendant la phase précoce de développement, de 0 à 12 JAP tour après pollinisation), après un développement syncitial, l'albumen se cellularise, et des territoires cellulaires se différencient au sein de cet organisme principalement en quatre zones.
L'une de ces zones est l'albumen amylacé, qui à maturité occupe environ les deux tiers du volume du grain et est un lieu de stockage des différentes substances de réserve dont l'amidon. Une seconde zone principale est la couche à aleurone, constituée des cellules à la périphérie de l'albumen et qui synthétise des enzymes hydrolytiques essentielles lors de la mobilisation des réserves nécessaires à la germination. Une troisième zone principale est la zone ESR ( embryo surrounding region ) qui entoure l'embryon, puis se limite au pourtour du suspenseur à partir de sept JAP et est formée de
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petites cellules au cytoplasme dense qui serait impliqué dans le transfert de métabolites vers l'embryon.
La quatrième zone principale consiste en la zone de transfert qui permet le passage de nutriments depuis les tissus maternels jusqu'à l'albumen et l'embryon en développement.
C'est lors de la phase précoce du développement que se mettent en place les structures majeures qui constitueront le futur grain. Or, très peu de gènes spécifiques de cette phase sont connus, et leur fonction n'a pas été déterminée.
La zone de transfert est l'endroit clef qui préside au contrôle de la quantité et/ou de la qualité des métabolites qui transitent de la plante mère vers le grain.
Il existe un besoin dans l'état de la technique de disposer de séquences régulatrices s'exprimant de manière prépondérante, ou même de manière exclusive, dans la zone de transfert, qui puissent être intégrées dans des cassettes d'expression comprenant de telles séquences régulatrices contrôlant l'expression d'un gène d'intérêt, afin de modifier qualitativement ou quantitativement le contenu en métabolites de l'albumen du grain, en vue de l'obtention de grains matures, en particulier de céréales, ayant des caractéristiques de constitution améliorées, par exemple nutritives ou industrielles.
Il existe également un besoin dans l'état de la technique d'identifier des protéines exprimées spécifiquement dans la zone de transfert pendant la formation de l'albumen, qui sont susceptibles d'être impliquées dans le passage de nutriments de la plante mère vers l'albumen en développement, et dont une modulation de l'expression permettrait de contrôler la qualité ou la quantité de nutriments présente dans l'albumen du grain mature.
A la connaissance du demandeur, seules quelques protéines ont. été décrites dans l'état de la technique comme étant exprimées de manière prépondérante dans la zone de transfert du grain. L'article de HUEROS et al.
(1999a) concerne l'étude de l'expression du gène BETL1 de maïs et divulgue qu'une séquence de 985 bp localisée en amont du gène BETL 1 a peut contrôler l'expression d'un gène rapporteur dans des plants de maïs transgéniques. Toutefois, la séquence nucléotidique du promoteur du gène
BETL1 a n'est pas décrite dans cet article.
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L'article de HUEROS et al. (1995) décrit la protéine BETL1 ayant une séquence de 85 acides aminés de longueur, ainsi que la séquence nucléotidique codant pour cette protéine et montre l'expression du gène BETL1 dans les cellules de transfert de l'endosperme du maïs. Cet article divulgue la séquence de l'ARN messager qui constitue le produit de transcription du gène BETL1 mais ne décrit aucune séquence génomique de ce gène.
L'article de HUEROS et al. (1999b) présente la séquence en acides aminés des protéines BETL-2, BETL-3 et BETL-4 qui sont également exprimés principalement dans la zone de transfert du grain. Cet article décrit également de courtes séquences nucléotidiques partielles localisées en amont de ces gènes susceptibles d'intervenir dans la régulation de leur expression dans la plante. Toutefois, aucune séquence complète d'un promoteur fonctionnel n'est décrite.
Le demandeur s'est attaché à identifier et caractériser de nouveaux gènes exprimés spécifiquement dans les cellules de la zone de transfert du grain, tout particulièrement pendant le développement de l'albumen, dans le but d'identifier : a) des séquences régulatrices spécifiquement exprimées dans la zone de transfert du grain qui peuvent être utilisées pour contrôler l'expression de séquences d'intérêt, préférentiellement de séquences codant pour des protéines, par exemple des enzymes, des protéines impliquées dans la défense de la plante vis-à-vis de stress externes tels que des pathogènes, des protéines signal intervenant dans la communication entre la plante mère et l'albumen ou l'embryon ou encore entre l'albumen et l'embryon, des protéines marqueurs (luciférase, GUS, GFP, etc...) des protéines cytotoxiques (Barnase, toxine diphtérique, etc. ). Parmi les enzymes, on peut citer celles permettant de modifier la quantité ou la qualité des métabolites transférés de la plante mère vers l'albumen en développement afin d'obtenir des grains matures ayant des caractéristiques, notamment nutritives ou industrielles améliorées. b) des séquences codant pour des protéines qui sont naturellement exprimées dans la zone de transfert du grain et qui sont susceptibles d'être impliquées dans le transfert de métabolites de la plante mère vers l'albumen en développement ou encore dans la défense des plantes contre des
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pathogènes ou encore la signalisation ainsi que les acides nucléiques codant pour de telles protéines, qui peuvent être placés sous le contrôle de promoteurs, le cas échéant de promoteurs inductibles, permettant de modifier la qualité ou la quantité des métabolites transférés de la plante mère vers l'albumen en développement ou encore d'accroître la résistance de la plante ainsi transformée à certains pathogènes ou d'influencer le développement de l'embryon ou de l'albumen.
DESCRIPTION DE L'INVENTION
Le demandeur a ainsi montré selon l'invention que deux gènes très fortement homologues, respectivement désignés DD1-a et DD1-b, étaient exprimés de manière spécifique dans la zone de transfert du grain en développement chez le maïs et a isolé et caractérisé ces séquences ainsi que celles des protéines codées par les gènes DD1-a et DD1-b.
Le demandeur a également caractérisé les séquences régulatrices localisées en amont des deux gènes.
Les séquences nucléotidiques des gènes DD1-a et DD1-b possèdent moins de 60% d'homologie avec les séquences des gènes BETL décrites par HUEROS et al. précédemment cités.
En outre, les gènes DD1-a et DD1-b sont exprimés plus précocement (Jour 7 après pollinisation) que les gènes BETL (Jour 10 après pollinisation).
Les résultats d'hybridation in situ et d'amplification par RT-PCR montrent que les gènes DD1-a et DD1-b sont exprimés avant la visualisation histochimique d'une zone basale de transfert de l'albumen complètement formée et définie.
L'expression forte et précoce des gènes DD1-a et DD1-b contrôlée par leurs séquences régulatrices respectives, montre que ces deux gènes sont d'un grand intérêt industriel pour modifier les qualités et les caractéristiques de la zone de transfert qui est reconnue comme l'élément clef du remplissage du grain.
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ACIDES NUCLEIQUES DES GENES DD1-a et DD1-b SELON L'INVENTION.
Les séquences nucléotidiques des deux gènes DD1-a et DD1-b comprennent chacune, de l'extrémité 5'vers l'extrémité 3', (i) la séquence régulatrice permettant l'expression spécifique du gène dans la zone de transfert, (ii) une séquence codante comprenant les exons et les introns du gène et (iii) une séquence non codante en aval du dernier exon du gène.
La séquence du gène DD1-a selon l'invention est référencée comme la séquence SEQ ID N 1 du listage de séquences.
La séquence du gène DD1-b selon l'invention est référencée comme la séquence SEQ ID D ? 2 du listage de séquences.
Ainsi, un premier objet de l'invention consiste en un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO1 et SEQ ID NO2, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique.
L'invention concerne aussi un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique tel que défini ci-dessus.
Selon l'invention, toute technique classique de biologie moléculaire, de microbiologie et d'ADN recombinant connue de l'homme du métier peut être utilisée. De telles techniques sont décrites par exemple par SAMBROOK et al. (1989), GLOVER (1985), GAIT (1984), HAMES et
HIGGINS (1985a), HAMES et HIGGINS (1984), BERBAL (1984) et AUSUBEL et al. (1994).
De manière préférée, tout acide nucléique et tout polypeptide selon l'invention se présentent sous une forme isolée ou purifiée.
Le terme isolé au sens de la présente invention désigne un matériel biologique qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement). Par exemple, un polynucléotide présent à l'état naturel dans une plante n'est pas isolé. Le même polynucléotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de la plante est isolé.
Un tel polynucléotide peut être inclus dans un vecteur et/ou un tel polynucléotide peut être inclus dans une composition et demeurer
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néanmoins à l'état isolé du fait que le vecteur ou la composition ne constitue pas son environnement naturel.
Le terme purifié ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative.
Un polynucléotide ou un polypeptide est à l'état purifié après purification du matériel de départ ou du matériel naturel d'au moins un ordre de grandeur, de préférence 2 ou 3 et préférentiellement quatre ou cinq ordres de grandeur.
Aux fins de la présente description, l'expression séquence nucléotidique peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression séquence nucléotidique englobe le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.
Les termes acide nucléique , potynudéotide , oligonucléotide ou encore séquence nucléotidique englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple brin ou sous la forme de duplex.
Le terme nucléotide désigne à la fois les nucléotides naturels (A, T, G, C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (i) un analogue d'une purine, (ii) un analogue d'une pyrimidine, ou (iii) un sucre analogue, de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT N WO 95/04064.
Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré comme étant complémentaire d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynuléotide dont l'orientation est inversée. Les bases complémentaires sont A et T (ou A et U), et C et G.
Selon l'invention, un premier acide nucléique ayant au moins 80% d'identité avec un second acide nucléique de référence, possédera au moins
80%, de préférence au moins 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 99, 5% d'identité en nucléotides avec ce second polynucléotide de référence, le pourcentage d'identité entre deux séquences étant déterminé comme décrit ci-dessous.
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Le pourcentage d'identité entre deux séquences de nucléotides ou d'acides aminés, au sens de la présente invention, peut être déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.
La partie de la séquence nucléotidique ou polypeptidique dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des gaps ) par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal des deux séquences.
Le pourcentage est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique ou un résidu d'aminoacide identique est observé pour les deux séquences (nucléique ou peptidique) comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux bases ou résidus d'aminoacides par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité de séquence.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus.
De manière préférée, le pourcentage d'identité de séquences est déterminé à l'aide du logiciel BLAST (version BLAST 2.06 de Septembre 1998), en utilisant exclusivement les paramètres par défaut.
Un acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique selon l'invention englobe les variants d'un acide nucléique selon l'invention.
Par variant d'un acide nucléique selon l'invention, on entend un acide nucléique qui diffère de l'acide nucléique de référence par une ou plusieurs substitutions, additions ou délétions d'un nucléotide, par rapport à l'acide nucléique de référence. Un variant d'un acide nucléique selon l'invention peut être d'origine naturelle, tel qu'un variant allélique qui existe naturellement. Un tel acide nucléique variant peut être également un acide nucléique non naturel obtenu, par exemple, par des techniques de mutagenèse.
En général, les différences entre l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique variant sont réduites de telle sorte que l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique variant ont des séquences nucléotidiques
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très similaires et, dans de nombreuses régions, identiques. Les modifications nucléotidiques présentes dans un acide nucléique variant peuvent être silencieuses, ce qui signifie qu'elles n'affectent pas la séquence d'acides aminés qui peut être codée par cet acide nucléique variant.
Les modifications de nucléotides dans l'acide nucléique variant peuvent aussi résulter en des substitutions, additions ou délétions d'un ou plusieurs acides aminés dans la séquence du polypeptide qui peut être codé par cet acide nucléique variant.
De manière tout à fait préférée, un acide nucléique variant selon l'invention comportant une phase de lecture ouverte, code pour un polypeptide qui conserve la même fonction ou la même activité biologique que le polypeptide codé par l'acide nucléique de référence.
De manière tout à fait préférée, un acide nucléique variant selon l'invention et qui comporte une phase de lecture ouverte, code pour un polypeptide qui conserve la capacité d'être reconnu par des anticorps dirigés contre le polypeptide codé par l'acide nucléique de référence.
Par fragment d'un acide nucléique selon l'invention, on entend une séquence nucléotidique d'une longueur réduite par rapport à l'acide nucléique de référence, le fragment d'acide nucléique possédant une séquence nucléotidique identique à la séquence nucléotidique de l'acide nucléique de référence sur la partie commune. De tels fragments d'un acide nucléique selon l'invention possèdent au moins 12,15, 18,25, 30,35, 40,45, 50,60, 100,150, 200,300, 400,500, 1000,2000, 3000 ou 4000 nucléotides consécutifs de l'acide nucléique de référence, la longueur maximale en nucléotides d'un fragment d'un acide nucléique selon l'invention étant bien entendu limitée par la longueur maximale en nucléotides de l'acide nucléique de référence.
ACIDES NUCLEIQUES DU GENE DD1-a
Comme indiqué ci-dessus, l'acide nucléique génomique du gène DD1-a est référencé comme la séquence nucléotidique SEQ ID NO1 du listage de séquences.
En conséquence, la présente invention a pour objet un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité
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Figure img00090001

en nucléotide avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO1, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique.
Fait également partie de l'invention un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique tel que défini ci-dessus.
Un autre objet de l'invention est un acide nucléique consistant en un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO1, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique, ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention est aussi relative à un acide nucléique comprenant au moins 12, de préférence au moins 15 et de manière tout à fait préférée au moins 20 nucléotides consécutifs de l'acide nucléique de séquence SEQ ID NO1, étant entendu qu'un tel acide nucléique englobe dans sa définition des fragments d'un acide nucléique selon l'invention tel que défini dans la présente description.
La séquence du gène DD1-a telle que décrite dans la séquence SEQ ID NO1 comprend, de l'extrémité 5'vers l'extrémité 3', respectivement : a) la séquence régulatrice du gène DD1-a permettant l'expression de la protéine DD1-a dans la zone de transfert du grain en développement ; b) une région dite codante qui comprend les exons et les introns du gène DD1-a ; et (c) une région non codante localisée en aval de la région codante et susceptible de contenir des éléments de régulation de l'expression du gène DD1-a.
La région régulatrice du gène DD1-a débute au nucléotide en position 1 et se termine au nucléotide en position 3598 de la séquence SEQ tDN 1.
La région non codante localisée en aval de la région codante du gène DD1-a débute au nucléotide en position 6541 et se termine au nucléotide en position 7159 de la séquence nucléotidique SEQ ID ? 1.
La séquence du gène DD1-a comprend aussi cinq exons et quatre introns, dont les caractéristiques structurales sont détaillées respectivement dans les tableaux 1 et 2 ci-après.
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TABLEAU 1 Séquences des exons du gène DD1-a
Figure img00100001
<tb>
<tb> Exon <SEP> no <SEP> Position <SEP> du <SEP> nucléotide <SEP> en <SEP> 5'sur <SEP> Position <SEP> du <SEP> nucléotide <SEP> en <SEP> 3'sur
<tb> la <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 1 <SEP> la <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N 1
<tb> 1 <SEP> 3582 <SEP> 3778
<tb> 2 <SEP> 4489 <SEP> 4668
<tb> 3 <SEP> 4742 <SEP> 4795
<tb> 4 <SEP> 4875 <SEP> 5012
<tb> 5 <SEP> 6181 <SEP> 6730
<tb>
L'invention est également relative à un acide nucléique comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide exonique du gène DD1-a, tel que les polynucléotides 1 à 5 décrits dans le tableau 1 ci-dessus, qui sont tous inclus dans l'acide nucléique de séquence SEQ ID ? 1.
Un tel acide nucléique code pour au moins une partie du polypeptide codé par le gène DD1-a et peut notamment être inséré dans un vecteur recombinant destiné à l'expression du produit de traduction correspondant dans une cellule hôte ou dans une plante transformée avec ce vecteur recombinant.
Un tel acide nucléique peut aussi être utilisé pour la synthèse de sondes et d'amorces nucléotidiques destinées à la détection ou à l'amplification de séquences nucléotidiques comprises dans le gène DD1-a dans un échantillon, le cas échéant de séquences du gène DD1-a portant une ou plusieurs mutations, préférentiellement une ou plusieurs mutations de nature à modifier le phénotype d'une plante portant un tel gène DD1-a muté, par exemple en modifiant la régulation du transfert de métabolites de la plante mère vers l'albumen en formation dans le grain ou encore en modifiant la régulation de la réponse à un stress biotique tel que l'infection par un pathogène des végétaux, ou encore le développement de l'albumen ou de l'embryon.
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TABLEAU 2 Séquences des introns du gène DD1-a
Figure img00110001
<tb>
<tb> Intron <SEP> no <SEP> Position <SEP> du <SEP> nucléotide <SEP> en <SEP> 5'sur <SEP> Position <SEP> du <SEP> nucléotide <SEP> en <SEP> 3'sur
<tb> la <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N'l <SEP> la <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N'l
<tb> 1 <SEP> 3779 <SEP> 4488
<tb> 2 <SEP> 4669 <SEP> 4741
<tb> 3 <SEP> 4796 <SEP> 4874
<tb> 4 <SEP> 5013 <SEP> 6180
<tb>
L'invention est également relative à un acide nucléique comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide intronique du gène DD1-a, tel que les polynucléotides 1 à 4 décrits dans le tableau 2 ci-dessus, qui sont tous inclus dans l'acide nucléique de séquence SEQ ID NO1.
Un tel acide nucléique peut être utilisé comme sonde ou amorce oligonucléotidique pour détecter la présence d'au moins une copie du gène DD1-a dans un échantillon, ou encore pour amplifier une séquence cible déterminée au sein du gène DD1-a.
La région génomique du gène DD1-a essentiellement restreinte à la région dite codante comprenant les 5 exons et les 4 introns est référencée comme la séquence SEQ ID N 5 du listage de séquences.
La séquence SEQ ID N 5 a une longueur de 3149 nucléotides et comprend notamment : - la séquence de l'exon 1 du gène DD1-a allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 197 de la séquence SEQ ID N 5 ; - la séquence de l'exon 2 allant du nucléotide en position 908 jusqu'au nucléotide en position 1087 de la séquence SEQ ID N 5 ; - la séquence de l'exon 3 allant du nucléotide en position 1161 jusqu'au nucléotide en position 1214 de la séquence SEQ ID N 5 ; - la séquence de l'exon 4 allant du nucléotide en position 1294 jusqu'au nucléotide en position 1431 de la séquence SEQ ID N 5 ; - la séquence de l'exon 5 allant du nucléotide en position 2600 jusqu'au nucléotide en position 3149 de la séquence SEQ ID N 5 ;
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Figure img00120001

- la séquence de l'intron 1 du gène DD1-a allant du nucléotide en position 198 jusqu'au nucléotide en position 907 de la séquence SEQ ID ? 5 ; - la séquence de l'intron 2 allant du nucléotide en position 1088 jusqu'au nucléotide en position 1160 de la séquence SEQ ID ? 5 ; - la séquence de l'intron 3 allant du nucléotide en position 1215 jusqu'au nucléotide en position 1293 de la séquence SEQ D ? 5 ; - la séquence de l'intron 4 allant du nucléotide en position 1432 jusqu'au nucléotide en position 2599 de la séquence SEQ ID D ? 5.
L'invention a également pour objet un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence nucléotidique SEQ D ? 5 ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention concerne aussi un acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence nucléotidique SEQ ID N 5 ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention a encore pour objet un acide nucléique comprenant la séquence nucléotidique SEQ D ? 5, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention a également trait à un acide nucléique consistant en la séquence nucléotidique SEQ D ? 5 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Un autre objet de l'invention consiste en un acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend l'une des séquences nucléotidiques suivantes : a) la séquence allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 197 de la séquence SEQ ID NO5, ou un acide nucléique de séquence complémentaire ; b) la séquence allant du nucléotide en position 908 jusqu'au nucléotide en position 1087 de la séquence SEQ ID N 5, ou un acide nucléique de séquence complémentaire ; c) la séquence allant du nucléotide en position 1161 jusqu'au nucléotide en position 1214 de la séquence SEQ ID N 5, ou un acide nucléique de séquence complémentaire ;
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Figure img00130001

d) la séquence allant du nucléotide en position 1294 jusqu'au nucléotide en position 1431 de la séquence SEQ ID NOS, ou un acide nucléique de séquence complémentaire ; e) la séquence allant du nucléotide en position 2600 jusqu'au nucléotide en position 3149 de la séquence SEQ ID NOS, ou un acide nucléique de séquence complémentaire ; f) la séquence allant du nucléotide en position 198 jusqu'au nucléotide en position 907 de la séquence SEQ ID NOS, ou un acide nucléique de séquence complémentaire ; g) la séquence allant du nucléotide en position 1088 jusqu'au nucléotide en position 1160 de la séquence SEQ ID NOS, ou un acide nucléique de séquence complémentaire ; et h) la séquence allant du nucléotide en position 1215 jusqu'au nucléotide en position 1293 de la séquence SEQ ID n 5 ; i) la séquence allant du nucléotide en position 1432 jusqu'au nucléotide en position 2599 de la séquence SEQ ID N 5, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'acide nucléique de séquence SEQ ID NOS est représenté à la figure 1, dans laquelle sont également détaillées les positions des différents exons et introns du gène DD1-a.
Il a été montré selon l'invention que le gène DD1-a est transcrit sous la forme d'un ARN messager qui a été partiellement isolé et caractérisé. Cet ARN messager comporte un cadre de lecture ouvert codant partiellement pour la protéine DD1-a.
L'ADNc partiel du gène DD1-a a une longueur de 782 nucléotides et est référencé comme la séquence SEQ ID 7 du listage de séquences.
Un autre objet de l'invention consiste en un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO ?, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique précité.
L'invention est aussi relative à un acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO7 ou un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique précité.
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L'invention a encore pour objet un acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend la séquence nucléotidique SEQ ID ? 7 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Fait également partie de l'invention un acide nucléique constitué de la séquence nucléotidique SEQ ID NO ?, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Le gène DD1-a code pour un polypeptide de 304 acides aminés de longueur possédant un degré d'identité en acides aminés d'environ 90% par rapport à la séquence en acides aminés du polypeptide codé par le gène DD1-b selon l'invention, après alignement des deux séquences.
Le polypeptide codé par l'acide nucléique de séquence SEQ ID NO1 ou SEQ ID NOS du gène DD1-a est référencé comme la séquence SEQ ID ? 9 du listage de séquences. Ce polypeptide est aussi codé par l'ADNc résultant de la transcription du gène DD1-a.
En conséquence, l'invention est également relative à un acide nucléique codant pour un polypeptide possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID ? 9.
L'invention a également trait à un acide nucléique caractérisé en ce qu'il code pour le polypeptide de séquence SEQ ID D ? 9.
Fait également partie de l'invention un acide nucléique codant pour un fragment d'un polypeptide possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec un polypeptide de séquence en acides aminés SEQ ID ? 9.
L'invention concerne aussi un acide nucléique codant pour un fragment d'un polypeptide de séquence en acides aminés SEQ ID ? 9.
Un polypeptide ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec un polypeptide de référence comprend au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% au moins 99,5% d'identité en acides aminés avec le polypeptide de référence.
Sont englobés dans la définition d'un polypeptide ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec un polypeptide de référence selon l'invention, les polypeptides dits variants . Par variants d'un polypeptide selon l'invention, on entend un polypeptide dont la séquence en acides aminés comprend une ou plusieurs substitutions, additions ou délétions d'au moins un résidu d'acide aminé, par rapport à la séquence d'acides aminés du polypeptide de référence, étant entendu que les
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substitutions d'acides aminés peuvent être de nature conservative ou non conservative.
Un variant d'un polypeptide de référence selon l'invention consiste en un polypeptide qui conserve la fonction ou l'activité biologique du polypeptide de référence et/ou qui est reconnu par des anticorps dirigés contre le polypeptide de référence. Ces variants polypeptidiques peuvent résulter de variations alléliques caractérisées par des différences dans les séquences nucléotidiques du gène codant pour ces polypeptides. De tels variants polypeptides peuvent aussi résulter d'épissages alternatifs ou de modifications post-traductionnels.
Par fragment d'un polypeptide de référence selon l'invention, on entend un polypeptide possédant au moins 15,20, 25,30, 40,50, 60,70, 80,90, 100,150 ou 250 acides aminés consécutifs d'un polypeptide tel que défini dans la présente description.
ACIDES NUCLEIQUES DU GENE DD1-b
Comme indiqué précédemment, l'acide nucléique génomique du gène DD1-b selon l'invention, est référencé comme la séquence SEQ ID ? 2 du listage de séquences.
Ainsi, l'invention concerne aussi un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO2, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique.
Elle a également trait à un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique défini ci-dessus.
L'invention est aussi relative à un acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO2, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique précité.
La séquence génomique du gène DD1-b selon l'invention de séquence SEQ ID ? 2 comprend, de l'extrémité 5'vers l'extrémité 3', les séquences suivantes : a) la séquence régulatrice du gène DD1-b permettant l'expression spécifique de ce gène dans la zone de transfert du grain en développement ;
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Figure img00160001

b) une région nucléotidique dite codante comprenant les quatre exons et les trois introns du gène DD1-b ; et c) une région non codante localisée en aval de la région codante cidessus, et qui est susceptible de contenir des éléments de régulation additionnels du gène DD1-b.
L'invention est aussi relative à un acide nucléique comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs du polynucléotide de séquence SEQ ID ? 2.
La séquence régulatrice du gène DD1-b débute au nucléotide en position n 1 et se termine au nucléotide en position no2816 de la séquence SEQ ID D ? 2. Cette séquence régulatrice est référencée comme la séquence SEQ ID NO4 du listage de séquences.
La séquence nucléotidique codante du gène DD1-b qui comprend l'ensemble des exons et des introns de ce gène est référencée comme la séquence SEQ ID ? 6 du listage de séquences.
La séquence localisée en aval de la région codante du gène DD1-b débute au nucléotide en position 5459 et se termine au nucléotide en position 6128 de la séquence nucléotidique SEQ ID ? 2.
Comme déjà mentionné, la séquence du gène DD1-b comprend 4 exons et 3 introns, dont les caractéristiques structurales sont détaillées respectivement dans les tableaux 3 et 4 ci-après.
TABLEAU 3 Séquences des exons du gène DD1-b
Figure img00160002
<tb>
<tb> Exon <SEP> no <SEP> Position <SEP> du <SEP> nucléotide <SEP> en <SEP> 5'sur <SEP> Position <SEP> du <SEP> nucléotide <SEP> en <SEP> 3'sur
<tb> la <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 2 <SEP> la <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 2
<tb> 1 <SEP> 2800 <SEP> 2996
<tb> 2 <SEP> 3724 <SEP> 3903
<tb> 3 <SEP> 4102 <SEP> 4239
<tb> 4 <SEP> 5099 <SEP> 5658
<tb>
L'invention est également relative à un acide nucléique comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide exonique du gène
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DD1-b, tels que les polynucléotides 1 à 4 décrits dans le tableau 3 ci-dessus, qui sont tous inclus dans l'acide nucléique de séquence SEQ ID ? 2.
L'invention concerne aussi un acide nucléique consistant en au moins 12 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide exonique du gène DD1-b.
Un tel acide nucléique code pour au moins une partie du polypeptide DD1-b et peut notamment être inséré dans un vecteur recombinant destiné à l'expression du produit de traduction correspondant dans une cellule hôte ou dans une plante transformée avec ce vecteur recombinant.
Un tel acide nucléique peut aussi être utilisé pour la synthèse de sondes et d'amorces nucléotidiques destinées à la détection ou à l'amplification de séquences nucléotidiques comprises dans le gène DD1-b dans un échantillon, le cas échéant de séquences du gène DD1-b portant une ou plusieurs mutations, préférentiellement une ou plusieurs mutations de nature à modifier le génotype d'une plante portant un tel gène DD1-b muté, par exemple en modifiant la régulation du transfert de métabolites de la plante mère vers l'albumen en développement ou encore en modifiant la régulation de la réponse de la plante à un stress biotique tel que l'infection par un pathogène des végétaux.
TABLEAU 4 Séquences des introns du gène DD1-b
Figure img00170001
<tb>
<tb> Exon <SEP> no <SEP> Position <SEP> du <SEP> nucléotide <SEP> en <SEP> 5'sur <SEP> Position <SEP> du <SEP> nucléotide <SEP> en <SEP> 3'sur
<tb> la <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO2 <SEP> la <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> D <SEP> ? <SEP> 2
<tb> 1 <SEP> 2997 <SEP> 3723
<tb> 2 <SEP> 3904 <SEP> 4101
<tb> 342405098
<tb>
L'invention est également relative à un acide nucléique comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide intronique du gène DD1-b, tels que les polynucléotides 1 à 3 décrits dans le tableau 4 ci-dessus, qui sont tous inclus dans l'acide nucléique de séquence SEQ ID ? 2.
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Un tel acide nucléique peut être utilisé comme sonde ou amorce oligonucléotidique pour détecter la présence d'au moins une copie du gène DD1-b dans un échantillon, ou encore pour amplifier une séquence cible déterminée au sein du gène DD1-b.
La séquence nucléotidique du gène DD1-b essentiellement restreinte à la région codante comprenant les quatre exons et les trois introns du gène est référencée comme la séquence SEQ ID ? 6 du listage de séquence.
L'invention a encore pour objet un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO6, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique précité.
L'invention est également relative à un acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO6, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique précité.
L'invention a encore pour objet un acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO6, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Un autre objet de l'invention consiste en un acide nucléique consistant en la séquence nucléotidique SEQ ID N 6, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
La séquence nucléotidique SEQ ID ? 6 comprend notamment les séquences suivantes : a) la séquence de l'exon 1 du gène DD1-b allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 197 de la séquence SEQ ID ? 6 ; b) la séquence de l'exon 2 allant du nucléotide en position 925 jusqu'au nucléotide en position 1104 de la séquence SEQ ID ? 6 ; c) la séquence de l'exon 3 allant du nucléotide en position 1303 jusqu'au nucléotide en position 1440 de la séquence SEQ ID ? 6 ; d) la séquence de l'exon 4 allant du nucléotide en position 2300 jusqu'au nucléotide en position 2859 de la séquence SEQ ID ? 6 ;
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Figure img00190001

e) la séquence de l'intron 1 du gène DD1-b allant du nucléotide en position 198 jusqu'au nucléotide en position 924 de la séquence SEQ ID ? 6 ; f) la séquence de l'intron 2 allant du nucléotide en position 1105 jusqu'au nucléotide en position 1302 de la séquence SEQ ID ? 6 ; et g) la séquence de l'intron 3 allant du nucléotide en position 1441 jusqu'au nucléotide en position 2299 de la séquence SEQ ID ? 6.
En conséquence, l'invention a encore pour objet un acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend l'une des séquences nucléotidiques suivantes : a) la séquence allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 197 de la séquence SEQ ID Ne6, ou un acide nucléique de séquence complémentaire ; b) la séquence allant du nucléotide en position 925 jusqu'au nucléotide en position 1104 de la séquence SEQ ID Ne6, ou un acide nucléique de séquence complémentaire ; c) la séquence allant du nucléotide en position 1303 jusqu'au nucléotide en position 1440 de la séquence SEQ ID Ne6, ou un acide nucléique de séquence complémentaire ; et d) la séquence allant du nucléotide en position 2300 jusqu'au nucléotide en position 2659 de la séquence SEQ ID Ne6, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Les séquences nucléotidiques des introns 1,2 et 3 du gène DD1-b ainsi que leurs acides nucléiques de séquences complémentaire font également partie de l'invention.
Il a été montré selon l'invention que le gène DD1-b est transcrit sous la forme d'un ARN messager qui a été isolé et caractérisé. Cet ARN messager comporte un cadre de lecture ouvert unique codant pour la protéine DD1-b d'une longueur de 286 acides aminés.
De part et d'autre du cadre ouvert de lecture, cet ARN messager comprend respectivement une région 5'non traduite (5'-UTR) et une région
3'non traduite (3'-UTR).
L'ADNc correspondant au produit de transcription du gène DD1-b peut être défini comme la séquence SEQ ID N 8 du listage de séquences.
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Figure img00200001
Un ADNc dérivé de l'ARN messager du gène DD1-b de séquence nucléotidique SEQ ID ? 8 comprend respectivement : a) une séquence 5'-UTR allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 14 de la séquence SEQ ID ? 8 ; b) une phase ouverte de lecture allant du nucléotide en position 15, la base A du codon d'initiation de la traduction ATG, jusqu'au nucléotide en position 875, base G du codon TAG d'arrêt de la traduction de la séquence nucléotidique SEQ ID NO8, et qui correspond à la séquence codante de l'ARN messager du gène DD1-b ; et c) une région 3'UTR allant du nucléotide en position 876 jusqu'au nucléotide en position 1075 de la séquence SEQ ID ? 8.
En conséquence, un autre objet de l'invention consiste en un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO8, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique précité.
L'invention est aussi relative à un acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID ? 8 ou un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique précité.
L'invention a également trait à un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 15 jusqu'au nucléotide en position 875 de la séquence SEQ ID D ? 8.
Un autre objet de l'invention consiste en un acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec une séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 15 jusqu'au nucléotide en position 875 de la séquence SEQ ID ? 8.
L'invention a encore pour objet un acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend la séquence nucléotidique SEQ ID ? 8 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Fait également partie de l'invention un acide nucléique constitué de la séquence nucléotidique SEQ ID NO8, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
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Constitue aussi un objet de l'invention un acide nucléique défini par la séquence allant du nucléotide en position 15 jusqu'au nucléotide en position 875 de la séquence nucléotidique SEQ ID NO8, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Les séquences nucléotidiques génomiques SEQ ID ? 2 et SEQ ID ? 6 ainsi que l'ADNc de séquence SEQ ID ? 8 codent pour un polypeptide du gène DD1-b.
Il a été montré selon l'invention l'existence de variants polypeptidiques codés par le gène DD1-b, selon les souches de maïs desquelles ils proviennent, et qui possèdent entre eux environ 98% d'identité en acides nucléiques et qui possèdent une longueur de 286 acides aminés.
De tels polypeptides variants n'induisent pas l'expression d'un phénotype particulier, par exemple de déficience dans le transfert de métabolites de la plante mère vers l'albumen en développement dans les plantes considérées. En conséquence, il est permis de considérer que les rares substitutions d'acides aminés rendant compte de différences entre les polypeptides codés par le gène DD1-b selon la plante considérée n'affectent pas la fonction ni l'activité biologique du polypeptide, l'ensemble des substitutions observées dans la séquence en acides aminés de 286 acides aminés de longueur pouvant ainsi définir un ensemble de polypeptides variants qui entrent dans la portée de la présente invention.
Les variants polypeptidiques codés par le gène DD1-b diffèrent entre eux exclusivement par une ou plusieurs substitutions d'un acide aminé.
Ainsi, les produits de traduction du gène DD1-b forment un ensemble de polypeptides fortement homologues, cet ensemble de polypeptides étant défini comme la séquence SEQ ID N 10 du listage de séquences.
L'invention a donc encore pour objet un acide nucléique codant pour un polypeptide possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID NO10.
L'invention est également relative à un acide nucléique codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID NO10.
Un premier variant polypeptidique particulier codé par le gène DD1- b est référencé comme la séquence SEQ ID NO 11 du listage de séquences.
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Ce premier variant polypeptidique est codé par le génome de la souche de maïs désignée HD5 x HD7.
Un second variant polypeptidique particulier codé par le gène DD1b est référencé comme la séquence SEQ ID N 12 du listage de séquences.
Ce second variant polypeptidique est codé par le génome de la souche de maïs désignée A188.
En conséquence, l'invention a encore pour objet un acide nucléique codant pour un polypeptide possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID NO11.
L'invention est aussi relative à un acide nucléique codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID NO11.
Fait aussi partie de l'invention un acide nucléique codant pour un polypeptide possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID NO12.
Constitue un autre objet de l'invention un acide nucléique codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID NO12.
L'invention concerne aussi un acide nucléique codant pour un fragment peptidique d'un polypeptide choisi parmi les polypeptides de séquence en acides aminés SEQ ID N 10 à 12.
REGION REGULATRICE DES GENES DD1-a et DD1-b
On a montré selon l'invention que les régions régulatrices des gènes DD1-a et DD1-b ont la capacité de diriger l'expression de ces gènes spécifiquement dans les cellules de la zone de transfert du grain en développement. Les propriétés de contrôle d'une expression spécifique de tissu d'un gène d'intérêt qui caractérisent les régions régulatrices des gènes DD1-a et DD1-b, peuvent donc être mises à profit pour diriger l'expression d'acides nucléiques autres que les acides nucléiques contenant les phases de lecture ouvertes respectivement des gènes DD1-a et DD1-b.
Ainsi, les séquences régulatrices des gènes DD1-a et DD1-b, ainsi que des fragments biologiquement actifs de ces dernières, peuvent être utilisés pour construire des cassettes d'expression contenant un gène d'intérêt placé sous le contrôle de l'une quelconque de ces séquences
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régulatrices dans le but d'exprimer spécifiquement ledit gène d'intérêt dans les cellules de la zone de transfert du grain en développement.
La séquence régulatrice du gène DD1-a, qui est comprise dans la séquence SEQ ID N 1, est référencée comme la séquence SEQ D ? 3 du listage de séquences.
La séquence régulatrice du gène DD1-b selon l'invention, qui est comprise dans la séquence SEQ ID 2, est référencée comme la séquence SEQ ID N 4 du listage de séquences.
La figure 5 représente la séquence nucléotidique SEQ ID N03 selon l'invention. Sur cette figure, les différents motifs structuraux caractéristiques d'une séquence régulatrice sont indiqués par des boîtes précisant la désignation de chacun des motifs identifiés par le demandeur.
La figure 6 représente la séquence SEQ ID N 4 selon l'invention.
Sur cette figure, les motifs structuraux caractéristiques d'une séquence régulatrice sont représentés par des boîtes contenant les désignations de chacun des motifs structuraux identifiés par le demandeur.
La séquence SEQ ID ? 3 comprend une boîte TATA localisée du nucléotide en position no3518 jusqu'au nucléotide en position 3524 de la séquence SEQ ID ? 3.
La séquence SEQ ID N 4 comprend une boîte TATA localisée du nucléotide en position 2736 jusqu'au nucléotide en position 2742 de la séquence SEQ ID N 4.
Le demandeur a également identifié la présence de répétitions directes dans chacune des séquences régulatrices SEQ ID N 3 et SEQ ID
N 4, notamment d'une séquence répétée désignée R6 de 33 paires de bases présente au nombre de sept copies dans la séquence régulatrice SEQ ID ? 3 du gène DD1-a et au nombre de sept copies dans la séquence régulatrice SEQ ID ? 4 du gène DD1-b.
La position du nucléotide de départ de chacune des séquences répétées R6 dans les séquences SEQ ID ? 3 et SEQ ID ? 4 sont représentées dans le tableau 5 ci-après.
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Figure img00240001

Tableau 5
Figure img00240002
<tb>
<tb> répétition <SEP> position <SEP> séquence
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 3
<tb> aR6-1 <SEP> 2762 <SEP> TAACCCAACTAAGCACATCTATCGCAATTATTA
<tb> aR6-2 <SEP> 2840 <SEP> CATTCCAACTAAGCATATCTCTTGTAGTTAGTA
<tb> aR6-3 <SEP> 2928 <SEP> TATCCCAACTAAGCATACCTCTTACGATTATCA
<tb> aR6-4 <SEP> 3219 <SEP> CATCCCAACTAAGCATATCTCTTACAATTATTA
<tb> aR6-5 <SEP> 3296 <SEP> CATTCCAACTAAGCAAACCTCTTGGTATTATTA
<tb> aR6-6 <SEP> 3401 <SEP> CAACTAAG <SEP> T <SEP> TCTTATGATTATT
<tb> aR6-7 <SEP> 3466 <SEP> CATTCCAGCTAAGCATATCTCTTGCAATTATTA
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> N04
<tb> bR6-1 <SEP> 1841 <SEP> TAACCCAATTAAGCACATCTCTTGCAATTATTA
<tb> bR6-2 <SEP> 1918 <SEP> CATTCCAACTAAGCATATCTCTTGTAGTTATTA
<tb> bR6-3 <SEP> 2009 <SEP> TATCCCAACTAAGCATACCAATTACGATTATCA
<tb> bR6-4 <SEP> 2418 <SEP> CCTCCCAACTAAGCATATCTCTTACAATTATTA
<tb> bR6-5 <SEP> 2495 <SEP> CATTCCAACTAAGCAAATCTCTTGGAATTATTA
<tb> bR6-6 <SEP> 2602 <SEP> TATCCCAACTAAGCACATCCCTCATGATTATTG
<tb> bR6-7 <SEP> 2684 <SEP> TATTCCAGCTAAGCATATCTTTTACAATTATTA
<tb> consensus <SEP> YatYCCAacTAAGCAnAtCtcTtRnraTTAtta
<tb>
Figure img00240003

Les séquences régulatrices SEQ ID ? 3 et SEQ ID ? 4 des gènes DD1-a et DD1-b selon l'invention comprennent quelques motifs constitués de séquences répétées inverses, respectivement des séquences du type STEM-LOOP ainsi que des séquences PALINDROMIQUES .
Les structures de type STEM-LOOP sont représentées dans le tableau 6 ci-après.
<Desc/Clms Page number 25>
Tableau 6
Figure img00250001
<tb>
<tb> position
<tb> SEQ <SEP> ID
<tb> ? <SEP> 3
<tb> IR1-L <SEP> 2406 <SEP> GGTGTTTGAATACACTAGAGCTAATAGTTAGT-45AACTATTAGCTATTTTT
<tb> IR1-R <SEP> 2598 <SEP> GGGGTGTGAATGCACTCGAGCTAATAGTTAGT-48AACTATTAACTAATTTA
<tb> IR1A-L <SEP> 2424 <SEP> AGCTAATAGTT-24
<tb> IR1A-R <SEP> 2493 <SEP> AGCTAATAGTT-24
<tb> IR1B-L <SEP> 2508 <SEP> AGCTAATAGTTAGTTGGCTA-16
<tb> IR1B-R <SEP> 2580 <SEP> AGTTAATAGTTAGCTAGCTA-16
<tb> IR7-L <SEP> TCCTATATAAGAAAGATATAAT-22
<tb> IR7-R <SEP> 3526 <SEP> CTATATATAGCACAATATACT-22
<tb> SEQ <SEP> ID
<tb> N 4
<tb> IR7-L <SEP> 2654 <SEP> CCATATATAGAAAAATATAAT-24
<tb> IR7-R <SEP> 2744 <SEP> CTATATATAGCACAATATACT-24
<tb>
La région autour de IR1 n'est pas conservée entre les promoteurs DD1-a et DD1-b. La séquence IR1-L est elle-même une structure stem-
Figure img00250002

loop composée de IR1A-L et R1A-R. De même, IRI-R est un stem- loop entre IR1B-L et IR1 B-R. La structure de type STEM-LOOP R7 contient dans le loop la répétition R6 décrite ci-avant. Elle contient dans le stem le palindrome IR6 décrit ci-dessous ainsi que la boîte TATA.
Les structures de type PALINDROMIQUES de chacune des séquences SEQ ID D ? 3 et SEQ D N 4 selon l'invention sont décrites dans le tableau 7 ci-dessous.
<Desc/Clms Page number 26>
Figure img00260001

Tableau 7
Figure img00260002
<tb>
<tb> position <SEP> DD1-a <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> W3 <SEP> position <SEP> DD1-b <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N 4
<tb> IR2-L <SEP> 2394 <SEP> TAG-ATAGATAGGG <SEP> 1365 <SEP> TATGGTAGACATAC
<tb> IR2-R <SEP> 2419TGT-ATTCAAACAC <SEP> 1392TATGGTAAAAATAT
<tb> IR3-L <SEP> 3001 <SEP> TCTTTCTAT <SEP> 2081 <SEP> TCTTTCTAT
<tb> IR3-R <SEP> 3018TCTTTCTAT <SEP> 2098 <SEP> TCTTTCTAT
<tb> IR4-L <SEP> 3165 <SEP> CGATAT <SEP> 2364 <SEP> CTATAT
<tb> IR4-R <SEP> 3176 <SEP> CTACAT <SEP> 2375 <SEP> CTATAT
<tb> IR5-L <SEP> 3435 <SEP> ATATCTTCCTAT <SEP> 2648 <SEP> ATATCTCCATAT
<tb> IR5-R <SEP> 3458 <SEP> ATATCTTTCTAT <SEP> 2671 <SEP> ATATTTTTCTAT
<tb> IR6-L <SEP> 3517 <SEP> CTATA <SEP> 2735 <SEP> CTATA
<tb> IR6-R <SEP> 3526 <SEP> CTATA <SEP> 2744 <SEP> CTATA
<tb>
En outre, plusieurs éléments régulateurs cis potentiels ont été identifiés dans chacune des séquences SEQ ID D ? 3 et SEQ I N04 à la fois. Ces éléments cis sont détaillés respectivement dans les tableaux 8 et 9 cidessous.
Par une étude d'homologie de séquences avec les données de séquences répertoriées dans la base de donnée PLACE, le demandeur a identifié des éléments structuraux caractéristiques de certaines séquences régulatrices, telles que représentées dans le tableau 8 ci-dessous.
<Desc/Clms Page number 27>
Tableau 8
Figure img00270001
<tb>
<tb> Désignation <SEP> du <SEP> motif <SEP> position <SEP> position <SEP> séquence
<tb> (nomenclature <SEP> PLACE) <SEP> DD1-a/DD1-b/
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> SEQ <SEP> ID
<tb> NO3 <SEP> NO4
<tb> BOXIINTPATPB <SEP> 2819 <SEP> 1897 <SEP> ATAGAA
<tb> 3010 <SEP> 2090
<tb> 3447 <SEP> 2660
<tb> CCAATBOX1 <SEP> 1826 <SEP> 673 <SEP> CCAAT
<tb> DOFCOREZM <SEP> 1710 <SEP> 565 <SEP> AAAG
<tb> 1738 <SEP> 596
<tb> 2682 <SEP> 1751
<tb> 2823 <SEP> 1901
<tb> 3014 <SEP> 2094
<tb> DPBFCORECDC3 <SEP> 3044 <SEP> 2124 <SEP> ACANNG
<tb> EBOXNNAPA <SEP> 3562 <SEP> 2780 <SEP> CANNTG
<tb> IBOX <SEP> 3105 <SEP> 2191 <SEP> GATAAG
<tb> MYBCORE <SEP> 2663 <SEP> 1732 <SEP> CNGTTR
<tb> POLLEN <SEP> 1LELAT52 <SEP> 2821 <SEP> 1899 <SEP> AGAAA
<tb> 3012 <SEP> 2092
<tb> 3279 <SEP> 2478
<tb> 3449 <SEP> 2662
<tb> 3573 <SEP> 2791
<tb> ROOTMOTIFTAPOX1 <SEP> 1789 <SEP> 646 <SEP> ATATT
<tb> 2883 <SEP> 1961
<tb> 3157 <SEP> 2353
<tb> 3394 <SEP> 2593
<tb> 3509 <SEP> 2727
<tb>
Figure img00270002

Le motif BOXIINTPATPB est retrouvé dans de nombreux promoteurs végétaux, y compris dans le promoteur du gène atpB du tabac et différents autres gènes de plastie végétaux, ce motif étant décrit notamment dans l'article de KAPOOR et al. (1999).
Figure img00270003
Le motif CCAATBOX1 constitue une séquence commune retrouvée dans les régions non codantes localisées du côté 5'de nombreux gènes eukaryotes.
Le motif DOFCOREZM possède un site de reconnaissance pour les protéines Dof de maïs. Les protéines Dof sont des protéines se liant à l'ADN
<Desc/Clms Page number 28>
possédant potentiellement un unique motif en doigt de zinc. Le motif DOFCOREZM est décrit notamment par YANAGISAWA et al., (1999).
Le motif DPBFCORECDC3 est une classe particulière de facteur de transcription de type bZIP, retrouvé notamment dans la séquence promotrice du gène Dc3 de la carotte, dont l'expression est spécifique de l'embryon. Le motif DPBFCORECDC3 est notamment décrit par KIM et al. (1997).
Le motif EBOXNNAPA est retrouvé dans la séquence régulatrice d'un gène de protéine de stockage de Brassica napus et est décrit par exemple par STALBERG et al. (1996).
Le motif IBOX est une séquence conservée retrouvée en amont des gènes régulés par la lumière. Un tel motif a été notamment retrouvé
Figure img00280001

dans la région promotrice du gène rbcS chez la tomate et chez Arabidopsis. Le motif IBOX est notamment décrit par GIULIANO et al. (1998) et par DONALD et al. (1990).
Le motif MYBCORE est un site de fixation pour les protéines MYB, ATMYB1 et ATMYB2, toutes isolées chez Arabidopsis. La protéine ATMYB2 est impliquée dans la régulation de gènes sensibles à un stress hydrique chez Arabidopsis. Une protéine MYB de pétunia, la protéine MYB. Ph3 est impliquée dans la régulation de la biosynthèse des flavonoïdes comme décrit par SOLANO et al., (1995).
Le motif MYBCORE est décrit notamment par LUSCHER et al ; (1990), par URAO et al. (1993) et par SOLANO et al. (1995).
Le motif POLLEN 1 LELA T52 constitue l'un des deux éléments régulateurs responsables de l'activation spécifique du pollen chez la tomate du gène lat52. Un tel motif structural est notamment décrit par BATE et al ; (1998).
Le motif ROOTMOTIFTAPOX1 est retrouvé à la fois dans les promoteurs du gène rolD et du gène de la peroxydase POX1 spécifique des racines de blé. Un tel motif structural est notamment décrit par ELMAYAN et al. (1995).
<Desc/Clms Page number 29>
Figure img00290001
Par une étude d'homologie de séquence entre les séquences nucléotidiques SEQ ID ? 3 et SEQ ID N 4 selon l'invention d'une part, et d'autre part les séquences répertoriées dans la base de données CARE, le demandeur a identifié des motifs caractéristiques supplémentaires dans les séquences régulatrices des gènes DD1-a et DD1-b, qui sont détaillés dans le tableau 9 ci-après. Tableau 9
Figure img00290002
<tb>
<tb> Désignation <SEP> du <SEP> position <SEP> position <SEP> séquence
<tb> motif <SEP> DD1-a/SEQ <SEP> ID <SEP> N 3 <SEP> DD1-b/SEQ <SEP> ID <SEP> N 4
<tb> (nomenclature
<tb> CARE)
<tb> AT-TCT-motif <SEP> 3237 <SEP> 2436 <SEP> TCTTAC
<tb> GM-CAAT-box <SEP> 2727 <SEP> 1806 <SEP> CAATT
<tb> 2785 <SEP> 1864
<tb> 3242 <SEP> 2441
<tb> 3489 <SEP> 3207
<tb> OS#TATC-box <SEP> 2927 <SEP> 2008 <SEP> TATCCCA
<tb> PC-chs-CMA2a <SEP> 3560 <SEP> 2778 <SEP> TCACTTGA
<tb> ZM#TATA-box <SEP> 2891 <SEP> 1969 <SEP> TATATAT
<tb> 33472546
<tb> 35172735
<tb>
Les motifs structuraux du tableau 9 ci-dessus sont précisés ciaprès.
Le motif AT-TCT constitue une partie d'une séquence d'ADN conservée du gène gabB impliqué dans la réponse à la lumière. Un tel motif structural est par exemple décrit par KWON et al. (1994).
Le motif GM-CAAT-box est un élément agissant en cis qui est retrouvé communément dans les régions promotrices et activatrices ( enhances ).
Le motif structural OS#TATC-box est un élément agissant en cis impliqué dans la réponse à la gibberelline, qui est décrit notamment par TAKAIWA et al. (1991).
<Desc/Clms Page number 30>
Le motif PC-chs-CMA2a est la partie d'un module d'ADN conservé chs impliqué dans la réponse à la lumière, qui est notamment décrit par HERMANN et al. (1988).
Le motif ZM-TATA-box est l'élément promoteur proprement dit localisé en général à une distance d'environ 30 bases du site d'initiation de la transcription. Un tel motif structural est notamment décrit par SHEEN et al.
(1991).
En conséquence, l'invention a également pour objet un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO3, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique précité.
L'invention a également pour objet un acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO3, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique, ou un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique précité.
L'invention est également relative à un acide nucléique caractérisé
Figure img00300001

en ce qu'il comprend la séquence nucléotidique SEQ ID ? 3.
L'invention a également trait à un acide nucléique constitué de la séquence nucléotidique SEQ ID ? 3.
Un autre objet de l'invention consiste en un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO4, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique précité.
Constitue un autre objet de l'invention un acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO4, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique précité.
<Desc/Clms Page number 31>
Figure img00310001
L'invention a également trait à un acide nucléique comprenant la séquence nucléotidique SEQ ID N 4, ainsi qu'un acide nucléique constitué de la séquence nucléotidique SEQ ID N 4.
L'invention est également relative à un acide nucléique comprenant un polynucléotide régulateur de l'expression d'une séquence nucléotidique d'intérêt chez une plante, ledit polynucléotide régulateur comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence nucléotidique SEQ ID N 3 ou SEQ ID N 4, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique.
Par fragment d'un acide nucléique de l'une des séquences régulatrices du gène DD1-a ou DD1-b selon l'invention, on entend une séquence nucléotidique d'une longueur en bases inférieure à celle de la séquence SEQ ID N 3 ou SEQ ID N 4 et conservant la capacité à diriger l'expression d'une séquence nucléotidique d'intérêt dans une plante.
De manière tout à fait préférée, un fragment d'un acide nucléique régulateur selon l'invention consiste en une séquence nucléotidique d'une longueur en bases inférieure à celle de la séquence SEQ ID N 3 ou SEQ ID ? 4 et conservant la capacité à diriger l'expression d'une séquence nucléotidique d'intérêt dans les cellules de la zone de transfert du grain en développement.
L'activité biologique d'un fragment d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N 3 ou SEQ ID N 4 régulateur selon l'invention peut être aisément vérifiée par l'homme du métier, notamment à l'aide des constructions de vecteurs et des procédés de transformation de plantes avec ces derniers, tels que décrits dans les exemples de la présente description.
A titre illustratif, un fragment d'un acide nucléique régulateur selon l'invention peut être obtenu par coupure enzymatique de l'un des acides nucléiques décrits ci-dessus, de manière préférée d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N 3 ou SEQ ID N 4, à l'aide d'une exonucléase ou encore d'une endonucléase de restriction.
<Desc/Clms Page number 32>
Notamment, un fragment d'un acide nucléique régulateur selon l'invention peut être obtenu par exemple par délétion d'un ou plusieurs nucléotides du polynucléotide de séquence SEQ ID ? 3 OU SEQ ID ? 4 à l'aide de la technique à l'exonucléase lil, telle que décrite par exemple par AUSUBEL et al. (1989).
Un fragment d'un acide nucléique régulateur selon l'invention a avantageusement une longueur d'au moins 200,250, 300,400, 500,750, 1000,1200, 1500,2000 ou 2500 nucléotides, ou encore paires de bases (bp), s'il se présente sous la forme double brin.
Pour la mise en oeuvre d'enzymes de restriction aux fins d'obtenir des fragments d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de SAMBROOK et al.
(1989).
Un fragment d'un acide nucléique régulateur selon l'invention pourra également être préparé par amplification spécifique du fragment d'intérêt à l'aide d'un couple d'amorces encadrant, respectivement du côté 5' et du côté 3', la séquence d'intérêt, par exemple à l'aide de la méthode PCR, telle que décrite notamment dans les brevets américains n US 4.683. 195, US 4.683. 202 et US 4.965. 188.
Par exemple, l'homme du métier peut obtenir un fragment de l'acide nucléique régulateur du gène DD1-a de séquence SEQ ID D ? 3 par amplification de la séquence SEQ ID ? 3 à l'aide de la paire d'amorces de séquences respectives SEQ ID N 13 et SEQ ID N 17, ou encore avec la paire d'amorces de séquences respectives SEQ ID N 14 et SEQ ID N 17.
L'homme du métier peut obtenir un fragment d'un acide nucléique
Figure img00320001

régulateur du gène DD1-b de séquence SEQ ID ? 4 en mettant en oeuvre une paire d'amorces respectivement de séquences SEQ ID N 15 et SEQ ID ? 17 ou encore une paire d'amorces de séquences respectives SEQ ID ? 16 et SEQ ID NO17.
Des fragments d'un acide nucléique régulateur de séquence SEQ ID N 3 ou SEQ ID N 4 selon l'invention comprennent de préférence au
<Desc/Clms Page number 33>
moins l'une des boîtes TATA référencées pour chacune de ces séquences dans le tableau 9 ci-dessus, et encore plus préférentiellement les trois boîtes TATA référencées dans ce tableau.
L'intérêt d'un acide nucléique régulateur du gène DD1-a ou DD1-b
Figure img00330001

selon l'invention, comprenant la séquence SEQ ID D ? 3 ou SEQ ID NO4, ou encore un fragment de l'une de ces séquences, est d'inclure cet acide nucléique régulateur dans une construction d'ADN, ou cassette d'expression, comprenant également un polynucléotide d'intérêt dont l'expression spécifique est recherchée dans les cellules de la zone de transfert du grain.
L'invention a donc encore pour objet un acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique d'intérêt placée sous le contrôle d'un polynucléotide régulateur tel que défini ci-dessus. Un tel acide nucléique peut être appelé cassette d'expression .
L'invention concerne encore un acide nucléique comprenant un polynucléotide régulateur tel que défini ci-avant, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une séquence nucléotidique d'intérêt fonctionnellement associée au polynucléotide régulateur.
De manière générale, la séquence nucléotidique d'intérêt peut être toute séquence codant pour une protéine dont l'expression est recherchée dans une plante ou encore toute séquence codant pour un acide nucléique sens ou un acide nucléique antisens.
Dans un mode de réalisation préféré, la séquence nucléotidique d'intérêt code pour une protéine impliquée dans le transfert de métabolites vers l'albumen en développement d'un grain de plante.
L'invention a donc aussi pour objet l'utilisation d'un acide nucléique régulateur du gène DD1-a ou du gène DD1-b tel que défini ci-dessus dans des constructions nucléotidiques destinées à améliorer la qualité agronomique, alimentaire ou industrielle d'une plante, en contrôlant notamment la taille et/ou le développement de l'albumen du grain.
<Desc/Clms Page number 34>
On peut par exemple rechercher une augmentation de la teneur en lysine et ainsi modifier qualitativement la composition en protéines de l'albumen. On peut aussi rechercher une modification du rapport amylose/amylopectine afin de modifier la qualité de l'amidon stocké dans l'albumen, ou encore une augmentation de la teneur en amidon et augmenter ainsi la taille de l'albumen par rapport à l'embryon.
Par la transformation de plantes avec de telles constructions nucléotidiques, on peut également rechercher une action précoce et spécifique sur le développement des tissus de l'albumen en utilisant, en tant que séquence nucléotidique d'intérêt, une séquence dérivée d'un gène stimulateur (p. ex. hormone telle qu'une cytokinine ou une auxine). L'expression d'une hormone sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur du gène DD1-a ou DD1-b chez une plante peut permettre de modifier les processus de cellularisation et, de façon corrélée, le développement de l'albumen (SCOTT et al., 1998).
On peut aussi utiliser des séquences nucléotidiques d'intérêt dérivées de gènes codant pour des transporteurs de nutriments (notamment des sucres) à l'interface plante/albumen, ou encore dérivées de gènes codant pour des inhibiteurs de ces transports, en vue d'une accumulation différentielles de nutriments dans l'albumen.
On peut également utiliser des séquences nucléotidiques d'intérêt codant pour des protéines d'intérêt thérapeutique, telle que l'hémoglobine ou le Facteur Veil.
Des exemples illustratifs, mais non limitatifs, de séquences nucléotidiques d'intérêt pouvant être placées sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur des gènes DD1-a ou DD1-b selon l'invention sont présentés ci-dessous.
<Desc/Clms Page number 35>
Séquences nucléotidiques d'intérêt placées sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention a) Métabolisme des sucres
De manière générale, la séquence nucléotidique d'intérêt peut coder pour l'une quelconque des enzymes impliquées dans le stockage des sucres
Figure img00350001

dans l'albumen, telles que l'invertase, la saccharose phosphate synthase, la saccharose synthase, l'UDP-glucose pyrophosphorylase, l'ADP-glucose pyrophosphorylase, la"starch branching enzyme"ou la"starch synthase".
La séquence nucléotidique d'intérêt peut aussi coder pour un transporteur de sucrose ou un transporteur d'hexose dans la zone de transfert BETL afin d'améliorer soit le transfert des assimilats soit d'augmenter la teneur en hexose dans l'endosperme ou bien dans la zone de transfert elle-même. Dans ce dernier cas, il peut y avoir un accroissement de l'activité mitotique via une stimulation du cycle cellulaire, notamment parce que les promoteurs DDt-a et DD1-b sont très précoces. Des séquences codant pour des transporteurs de sucres sont par exemple celles codant pour le transporteur symplastique H+ de sucrose (AOKI et al., 1999) ou pour divers transporteurs de monosaccharides décrits dans la base de données Est ZmDB (GAI et al., 2000).
La séquence nucléotidique d'intérêt peut aussi coder pour une hexokinase telle que décrite par JANG et al., (1997) afin d'améliorer le remplissage du grain.
L'utilisation de l'invertase (EC 3.2. 1.26) permettrait un clivage plus efficace du saccharose en glucose et fructose et serait susceptible d'augmenter la vitesse de transport et aussi de favoriser l'obtention de grains plus gros, puisqu'il est observé que des plantes mutantes pour cette enzyme possède des grains très petits. On peut utiliser une séquence codant pour une invertase pariétale ou pour une invertase soluble. On peut par exemple utiliser les séquences dérivées des gènes Inc W1 (NO d'accès AF050129 de
<Desc/Clms Page number 36>
Figure img00360001

la base de données GenBank), Inc W2 (NO d'accès AF050128), lnc W3 (NO d'accès AF043346 et AF 043728), lnc W4 (NO d'accès AF 043347), Ivr1 (NO d'accès U16123 et AF171874) ou encore celle référencée sous le NO d'accès Y16262.
L'utilisation de la saccharose synthase (E. C. 2.4. 1.13) permettrait d'induire une augmentation de la consommation du saccharose dans l'albumen et devrait ainsi diminuer son transport vers l'embryon et réduire la taille de ce dernier et augmenter la taille de l'albumen. Ont peut par exemple utiliser les séquences dérivées des gènes Sh1 (NO d'accès X02382 et X02400 de la base de données GenBank) ou Sus1 (No d'accès L33244 et L22296). b) Protéines du cycle cellulaire
On peut induire une augmentation de la division cellulaire localisée dans la zone de transfert par l'utilisation, en tant que séquence nucléotidique d'intérêt, de certaines cyclines, en particulier la cycline D2 décrite par (COCKROFT et al., 2000), ou encore la cystine D3, en vue d'obtenir un meilleur remplissage du grain. c) Protéines de réserve
Afin d'augmenter la teneur en différents acides aminés, tels que la lysine ou encore les acides aminés soufrés comme la cystéine et la méthionine, il serait possible de favoriser le transport (flux) de ces acides aminés ou précurseurs de ces acides aminés vers l'albumen à l'aide de séquences nucléotidiques d'intérêt codant pour des transporteurs ou des perméases d'acides aminés, tels que par exemple les perméases de la lysine (CHEN et BUSCH, 1999) et les perméases de la méthionine (FISCHER et aL, 1998). On peut aussi utiliser une séquence codant pour un
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transporteur de soufre afin d'augmenter la synthèse d'acides aminés soufrés par les cellules de l'albumen et conduire ainsi à un accroissement de la teneur en ces acides aminés. Des séquences codant pour un transporteur de soufre sont par exemple décrites par HAWKESFORD et al. (2000).
On peut aussi mettre en oeuvre des séquences nucléotidiques d'intérêt codant pour des transporteurs de certains ions ou encore codant pour la ferritine. d) Protéines de défense
La séquence nucléotidique d'intérêt peut aussi coder pour une protéine impliquée dans la résistance aux maladies, telles que les chitinases (demande PCT N WO 92/01792), les glucanases (demande PCT N WO 93/02197), l'oxalate oxydase (demande PCT ? WO 94/13790) ou encore les peptides anti-bactériens et/ou antifongiques, en particulier des peptides de moins de 100 acides aminés riches en cystéine comme les thionines ou les défensines de plantes, et plus particulièrement les peptides lytiques de toutes origines comprenant un ou plusieurs ponts disulfures entre les cystéines et des régions comprenant des acides aminés basiques, notamment les peptides lytiques suivants : l'androctonine (demande PCT N'WO 97/30082 et demande PCT/FR 98/01814 déposée le 18 Août 1998) ou la drosomicine (demande n PCT/FR 98/01462 déposée le 8 Juillet 1998).
La séquence nucléotidique d'intérêt peut aussi coder pour une protéine ou un peptide choisi parmi les peptides éliciteurs fongiques, en particulier les élicithines (KAMOUN et al., 1993 ; PANABIERES et al., 1995).
Une protéine de défense d'intérêt peut également être un peptide antimicrobien du type thionine, défencine, knottine, ou une protéine de transfert lipidique (BROEKAERT et al., 1997). Il peut s'agir aussi d'un peptide antifongique PAFP-s de Phytolacca Americana (FENG-SHAO et al.,
1999).
<Desc/Clms Page number 38>
Figure img00380001

e) Molécule si-gnalimétabolisme des hormones La séquence nucléotidique d'intérêt peut aussi coder pour une molécule signale telle que le gène IPT de l'isopentenyl transferase (HEIDEKAMP et al., 1983).
On peut aussi utiliser des séquences des gènes rolC et iaa en vue de la surexpression d'auxine qui stimule aussi la division cellulaire.
On peut également mettre en oeuvre des séquences codant pour des molécules ligands, telles que la protéine CLAVATA 3 d'Arabidopsis. f) Autres séquences nucléotidiques d'intérêt
On peut utiliser les séquences des gènes Esr ( embryo surrounding région ) décrits par OPSAHL-FERSTAD et al. (1997) qui sont exprimées spécifiquement dans la région entourant l'embryon et dont une régulation (surexpression ou sous-expression) au niveau de la zone des cellules de transfert pourrait influer sur la taille de l'endosperme ou de son développement.
On peut aussi mettre en oeuvre des séquences mutées ou tronquées des gènes du type polycomb telles que les séquences MEDEA, FIS et FIE (MA, 1999) qui participent au contrôle du développement de l'endosperme avant fécondation et qui interviennent dans la configuration de la chromatine et peuvent ainsi avoir une relation avec le niveau de méthylation de cette dernière. La surexpression de gène du type polycomb muté ou encore l'inhibition de l'expression de tels gènes par des oligonucléotides antisense puissent conduire à un développement plus important de la zone BETL et donc à un meilleur remplissage.
On peut également utiliser des séquences nucléotidiques d'intérêt codant pour des protéines cytotoxiques telles que la barnase ou la toxine diphtérique afin de détruire spécifiquement un tissu, en l'occurence la zone
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de transfert, et d'utiliser les faits sur le développement du grain, notamment sur le développement de l'embryon en l'absence de la zone de transfert.
SONDES ET AMORCES SELON L'INVENTION
Les acides nucléiques selon l'invention, et en particulier les séquences nucléotidiques SEQ ID NO1 à SEQ ID NO8, leurs fragments d'au moins 12 nucléotides, les séquences ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec au moins une partie des séquences SEQ ID NO1 à SEQ ID NO8, ainsi que les acides nucléiques de séquence complémentaire, sont utiles pour la détection de la présence d'au moins une copie d'une séquence nucléotidique du gène DD1-a ou du gène DD1-b ou encore d'un fragment ou d'un variant allélique de cette dernière dans un échantillon.
Font également partie de l'invention les sondes et amorces nucléotidiques hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID NO1 à SEQ ID ? 8.
Par conditions d'hybridation de forte stringence, au sens de l'invention, on entend les conditions d'hybridation suivantes :
Figure img00390001

Préhybridation : mêmes conhditions que pour l'hybridation durée : 1 nuit.
Hybridation :
5 x SSPE (0.9 M NaCI, 50 mM phosphate de sodium pH 7.7, 5 mM EDTA)
5 x Denhardt's (0.2% PVP, 0.2% Ficoll, 0.2% SAB)
100 ug/m) ADN de sperme de saumon
0.1% SDS durée : 1 nuit.
<Desc/Clms Page number 40>
Figure img00400001
Lavages : 2 x SSC, 0. 1% SDS 10 min 65 C
1 x SSC, 0.1 % SDS 10 min 65 C
0.5 x SSC, 0.1 % SDS 10 min 65 C
0.1 x SSC, 0. 1% SDS 10 min 65OC.
Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm).
Pour les séquences comprenant plus de 360 bases, Tm est définie par la relation :
Tm= 81,5 + 0,41 (% G+C) +16,6 Log (concentration en cations)-0, 63 (% formamide)- (600/nombre de bases) (SAMBROOK et al., (1989), pages 9.54-9. 62).
Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm= 4 (G+C) + 2 (A+T).
Dans des conditions de stringence appropriées, dans lesquelles les séquences aspécifiques n'hybrident pas, la température d'hybridation est approximativement de 5 à 30oC, de préférence de 5 à 10 C en-dessous de Tm.
Les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon les techniques connues de l'homme du métier.
Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et
HIGGINS (1985) ou encore dans l'ouvrage de AUSUBEL et al. (1989).
Les sondes ou les amorces nucléotidiques selon l'invention comprennent au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, en particulier d'un acide nucléique de séquences SEQ ID
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Figure img00410001

NO1 à 8 ou de sa séquence complémentaire, d'un acide nucléique ayant 80% d'identité en nucléotide avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N 1 à 8 ou de sa séquence complémentaire ou encore d'un acide nucléique hybridant dans des conditions d'hybridation de forte stringence avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N 1 à 8 ou de sa séquence complémentaire.
De préférence, des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention auront une longueur d'au moins 12,15, 18,20, 25,30, 35,40, 50, 75,100, 150,200, 300,400, 500,1000, 2000 ou 3000 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention.
Alternativement, une sonde ou une amorce nucléotidique selon l'invention consistera et/ou comprendra les fragments d'une longueur de 12, 15,18, 20,25, 30,35, 40,50, 75,100, 150,200, 300,400, 500,1000, 2000 ou 3000 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention.
Des exemples d'amorces et de couples d'amorces permettant d'amplifier un fragment d'acide nucléique du gène DD1-a ou DD1-b de séquence respective SEQ ID N 1 ou SEQ ID ? 2 sont par exemple les amorces SEQ ID ? 13 à 17 et 20 à 32.
Le couple d'amorces SEQ ID N 13 et SEQ ID N 17 permet d'amplifier un fragment d'environ 3 kb contenu dans la séquence régulatrice du gène DD1-a de séquence SEQ ID ? 3.
Le couple d'amorces SEQ ID N 14 et SEQ ID ? 17 permet d'amplifier un acide nucléique d'environ 1 kb contenu dans la séquence régulatrice du gène DD1-a de séquence SEQ ID N 3.
Le couple d'amorces SEQ ID ? 15 et SEQ ID ? 17 permet l'amplification d'un acide nucléique d'environ 2,5 kb contenu dans la séquence régulatrice du gène DD1-b de séquence SEQ ID ? 4.
Le couple d'amorces de séquences SEQ ID ? 16 et SEQ ID N 17 permet l'amplification d'un acide nucléique d'environ 1,6 kb contenu dans la séquence régulatrice du gène DD1-b de séquence SEQ ID N 4.
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Figure img00420001
*L'utilisation des amorces de séquences SEQ ID N 20 à 25 dans des réactions d'amplification est décrite à l'exemple 1.
Une amorce ou une sonde nucléotidique selon l'invention peut être préparée par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon des techniques telles que la méthode au phosphodiester de NARANG et al. (1979) ou de BROWN et al. (1979), la méthode au diéthylphosphoramidites de BEAUCAGE et al. (1980) ou encore la technique sur support solide décrite dans le brevet européen noEP 0 707 592. Chacun des acides nucléiques selon l'invention, y compris les sondes et amorces oligonucléotidiques décrites ci-dessus, peut être marqué, si désiré, en incorporant une molécule détectable, c'est-à-dire un marqueur détectable, par des moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou encore chimiques.
Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des isotopes radioactifs (32p 3H, 35S), des molécules fluorescentes (5-bromodéoxyuridine, fluorescéine, acétylaminofluorène, digoxigénine) ou encore des ligands tels que la biotine.
Le marquage des sondes est fait de préférence par incorporation de molécules marquées au sein des polynucléotides par extension d'amorces, ou bien par rajout sur les extrémités 5'ou 3'.
Des exemples de marquage non radioactif de fragments d'acides nucléiques sont décrits notamment dans le brevet français n FR 78 10 975 ou encore dans les articles de URDEA et al. (1988) ou SANCHEZ PESCADOR et al. (1988).
De manière avantageuse, les sondes selon l'invention peuvent avoir des caractéristiques structurelles de nature à permettre une amplification du signal, telles que les sondes décrites par URDEA et al ; (1991) ou encore dans le brevet européen n EP 0 225 807 (Chiron).
Les sondes oligonucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées notamment dans des hybridations de type Southern à l'ADN
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génomique du gène DD1-a ou du gène DD1-b ou encore dans des hybridations à l'ARN messager de l'un quelconque des deux gènes lorsque l'expression du transcrit correspondant est recherchée dans un échantillon.
Les sondes selon l'invention peuvent aussi être utilisées pour la détection de produits d'amplification PCR ou encore pour la détection de mésappariements.
Une sonde particulière selon l'invention est par exemple la sonde de séquence SEQ ID ? 26 ou encore la sonde de séquence SEQ ID NO29.
Des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être immobilisées sur un support solide. De tels supports solides sont bien connus de l'homme du métier et comprennent des surfaces des puits de plaques de micro-titration, des billes de polystyrène, des billes magnétiques, des bandes de nitrocellulose ou encore des microparticles telles que des particules de latex.
En conséquence, l'invention a encore pour objet un acide nucléique utilisable en tant que sonde ou amorce nucléotidique caractérisé en ce qu'il comprend au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus, en particulier d'un acide nucléique de séquences nucléotidiques SEQ ID NO1 à SEQ ID ? 8.
L'invention est également relative à un acide nucléique utilisable en tant que sonde ou amorce nucléotidique caractérisé en ce qu'il consiste en un polynucléotide d'au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, de manière tout à fait préférée d'un acide
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nucléique de séquences choisies parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID àSEQ ID N 8.
Un tel acide nucléique utilisable en tant que sonde ou amorce est par exemple l'acide nucléique comprenant et/ou consistant dans un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID N 13 à SEQ ID NO17.
Comme décrit ci-dessus, un tel acide nucléique peut en outre être caractérisé en ce qu'il est marqué par une molécule détectable.
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Un acide nucléique utilisable en tant que sonde ou amorce nucléotidique pour la détection ou l'amplification d'une séquence génomique, de l'ARNm ou de l'ADNc du gène DD1-a peut en outre être caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les séquences suivantes : a) les séquences nucléotidiques hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique de séquence SEQ tDN 1 ; et b) les séquences comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique de séquence SEQ ID NO1.
Selon un autre aspect, un acide nucléique utilisable en tant que sonde ou amorce nucléotidique pour la détection ou l'amplification d'une séquence génomique, de l'ARNm ou de l'ADNc du gène DD1-b, peut être caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les séquences suivantes : a) les séquences nucléotidiques hybridant, dans des conditions
Figure img00440001

d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique de séquence SEQ ID D ? 2 ; et b) les séquences comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique de séquence SEQ ID ? 2.
La présente invention concerne également un procédé de détection de la présence d'un acide nucléique du gène DD1-a ou DD1-b dans un échantillon, ladite méthode comprenant les étapes de :
1) mettre en contact une sonde ou une pluralité de sondes nucléotidiques selon l'invention avec l'échantillon à tester ;
2) détecter le complexe éventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.
Selon un mode de réalisation particulier du procédé de détection selon l'invention, la ou les sondes oligonucléotidiques sont immobilisées sur un support.
Selon un autre aspect, les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.
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L'invention concerne en outre un nécessaire ou kit pour la détection de la présence d'un acide nucléique selon l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant : a) une ou plusieurs sondes nucléotidiques telles que décrites cidessus ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'hybridation.
Selon un premier aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support.
Selon un second aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.
Selon un mode de réalisation particulier du kit de détection décrit cidessus, un tel kit comprendra une pluralité de sondes oligonucléotidiques conformes à l'invention qui vont être utilisées pour détecter des séquences cibles d'intérêt du gène DD1-a ou du gène DD1-b ou alternativement détecter des mutations dans les régions codantes ou les régions non codantes du gène DD1-a ou DD1-b, plus particulièrement des acides nucléiques de séquence SEQ ID NO1 à SEQ ID ? 8 ou les acides nucléiques de séquence complémentaire.
On entend par séquence cible au sens de l'invention, une séquence nucléotique comprise dans un acide nucléique, ladite séquence nucléotidique hybridant, dans les conditions d'hybridation spécifiées dans la description, avec une sonde ou une amorce nucléotique de l'invention.
Une séquence cible peut être par exemple une séquence comprise dans un acide nucléique régulateur du gène DD1-a ou DD1-b ou encore une séquence comprise dans une région codante génomique ou de l'ADNc de l'un ou l'autre de ces gènes ou encore une séquence commune aux gènes DD1-a ou DD1-b.
Les amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées pour amplifier un fragment nucléotidique quelconque (ADNg, ADNc, ARNm)
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Figure img00460001

du gène DD1-a ou du gène DD1-b, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquence SEQ ID NO1 à SEQ ID NOS, ou encore un fragment ou un variant de ces séquences.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement d'un acide nucléique de séquence SEQ ID NO1 à SEQ ID NOS ou un fragment ou un variant allélique de celui-ci contenu dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de : a) mettre en contact l'échantillon dans lequel la présence de l'acide nucléique cible est suspectée avec une paire d'amorces nucléotidiques dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5'et du côté 3' de la région de l'acide nucléique cible du gène DD1-a ou du gène DD1-b dont l'amplification est recherchée, en présence des réactifs nécessaires à la réaction d'amplification ; et b) détection de l'acide nucléique éventuellement amplifié.
Pour mettre en oeuvre le procédé d'amplification tel que défini cidessus, on aura avantageusement recours à l'une quelconque des amorces nucléotidiques décrites ci-après.
L'invention a en outre pour objet un nécessaire ou kit pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ ID NO1 à 8, ledit nécessaire ou kit comprenant : a) un couple d'amorces nucléotidiques conforme à l'invention, dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5'et du côté 3' de l'acide nucléique cible du gène DD1-a ou du gène DD1-b dont l'amplification est recherchée ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification.
Un tel nécessaire ou kit d'amplification comprendra avantageusement au moins une paire d'amorces nucléotidiques telle que décrite ci-dessus.
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Selon un mode de réalisation préféré, des amorces selon l'invention comprennent tout ou partie d'un polynucléotide choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID ? 13 à SEQ ID NO 17.
VECTEURS RECOMBINANT SELON L'INVENTION
Selon encore un autre aspect, l'invention concerne des vecteurs recombinants de clonage et/ou d'expression comprenant l'un quelconque des acides nucléiques définis ci-dessus.
VECTEURS RECOMBINANTS COMPRENANT UN ACIDE NUCLEIQUE REGULATEUR DU GENE DD1-a OU DU GENE DD1-b.
Un autre objet de l'invention consiste en des vecteurs recombinants dans lesquels a été insérée une séquence régulatrice du gène DD1-a ou du gène DD1-b ou encore un fragment d'une telle séquence régulatrice, telle que les fragments définis dans la présente description.
Avantageusement, un vecteur recombinant selon l'invention pourra comprendre un acide nucléique régulateur de séquence SEQ ID ? 3 ou
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SEQ ID ? 4 ou encore un fragment de la séquence SEQ ID ? 3 ou SEQ ID ? 4 capable de diriger l'expression d'un gène d'intérêt placé sous son contrôle dans les cellules d'une plante, et de manière tout à fait préférée dans les cellules de la zone de transfert d'un grain en développement.
Font ainsi partie de l'invention des vecteurs recombinants pour l'expression d'un polynucléotide d'intérêt dans la zone de transfert d'un grain de végétal en développement comprenant : a) un acide nucléique régulateur du gène DD1-a ou du gène DD1-b tel que défini dans la présente description ; et b) un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle de l'acide nucléique régulateur défini en a).
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Préférentiellement, le polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle de l'acide régulateur du gène DD1-a ou DD1-b est un acide nucléique codant pour une protéine impliquée dans le transfert de métabolites vers l'albumen en développement d'un grain de plante.
Les polynucléotides d'intérêt préférés ont été décrits précédemment dans la description.
Le polynucléotide d'intérêt peut consister en un polynucléotide codant pour un polypeptide détectable, ou polypeptide marqueur tel par exemple un polynucléotide codant pour la protéine GUS ou encore pour une protéine fluorescente, telle que la protéine GFP (Green Fluorescent Protein) ou YFP (Yellow Fluorescent Protein).
Un vecteur qui peut être mis en oeuvre pour l'introduction d'un acide nucléique régulateur selon l'invention capable de contrôler un polynucléotide d'intérêt est le plasmide L127a5 représenté à la figure 7 ;
Des vecteurs recombinants dans lesquels ont été introduits un acide nucléique régulateur du gène DD1-a ou du gène DD1-b selon l'invention localisés en amont d'un polynucléotide d'intérêt sont par exemple le vecteur recombinant L246a représenté à la figure 8, le vecteur L246b représenté à la figure 9, le vecteur L247a représenté à la figure 10 et le vecteur L247b représenté à la figure 11.
Le vecteur L246a comprend un acide nucléique d'environ 3 kb de la séquence régulatrice du gène DD1-a localisé en amont du gène rapporteur GUS. Le vecteur L246a est contenu dans la souche de Escherichia coli déposée à la CNCM le 4 Octobre 2000 sous le nO d'accès 1-2567.
Le vecteur recombinant L246b comprend un acide nucléique régulateur d'environ 1 kb du gène DD1-a, plus précisément un acide nucléique allant du nucléotide en position 2585 jusqu'au nucléotide en position 3595 de la séquence nucléotidique SEQ ID ? 3.
Le vecteur L 247a contient un acide nucléique régulateur d'environ
2,5 kb du gène DD1-b. Le vecteur L247a est contenu dans la souche de
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Figure img00490001

Escherichia coli déposée à la CNCM le 4 Octobre 2000 sous le n'd'accès 1- 2568.
Le vecteur L247b comprend un acide nucléique régulateur d'environ 1,6 kb de la séquence du gène DD1-b, plus précisément un acide nucléique régulateur allant du nucléotide en position 1204 au nucléotide en position 2813 de la séquence nucléotidique SEQ ID D ? 4.
L'invention a encore pour objet un vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les vecteurs L246a, L246b, L247a et L247b. Pour l'ensemble des vecteurs L246a, L246b, L247a et L247b, l'acide nucléique régulateur du gène DD1-a et du gène DD1-b est localisé en amont du gène marqueur GUS, dont il contrôle l'expression.
VECTEURS RECOMBINANT CONTENANT UN ACIDE NUCLEIQUE CODANT POUR UN POLYPEPTIDE SELON L'INVENTION.
Un autre objet de l'invention, consiste en un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression contenant une séquence codante du gène DD1-a ou du gène DD1-b, placé sous le contrôle d'une séquence régulatrice appropriée fonctionnelle dans l'organisme hôte dans lequel l'expression d'un polypeptide selon l'invention est recherchée.
Il a été montré selon l'invention qu'un polypeptide codé par le gène DD1-a ou le gène DD1-b est exprimé spécifiquement dans les cellules de la zone de transfert du grain en développement et est ainsi susceptible d'être impliqué dans le transfert des métabolites de la plante mère vers l'albumen, ou encore d'être impliqué dans la défense de la plante envers divers pathogènes végétaux, de constituer un signal pour le développement de l'albumen et/ou de l'embryon comme c'est le cas des gènes codant pour les protéines BETL1 à BETL4 décrits par HUEROS et al. (1999b).
Ainsi, l'invention a encore pour objet un vecteur d'expression recombinant comprenant : a) un acide nucléique régulateur de l'expression d'un polynucléotide d'intérêt dans un organisme hôte déterminé ; et
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Figure img00500001

b) un polynucléotide d'intérêt codant pour un polypeptide selon l'invention, préférentiellement un acide nucléique de séquences SEQ ID NO1, 2,5, 6,7 ou 8.
Afin d'améliorer la qualité ou la quantité des métabolites présents dans l'albumen du grain mature, ou encore d'augmenter la résistance d'une plante à divers pathogènes végétaux, il est donc utile de surexprimer un acide nucléique codant pour un polypeptide codé par le gène DD1-a ou par le gèneDD1-b.
Le cas échéant, la séquence régulatrice capable de contrôler l'acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention peut être une séquence régulatrice inductible par un métabolite particulier, tel que : - une séquence régulatrice inductible par les glucocorticoïdes telle que décrite par AOYMA et al. (1997) ou telle que décrit par McNELLYS et al.
(1998) ; - une séquence régulatrice inductible par l'éthanol, telle que celle décrite par SALTER et al. (1998) ou encore telle que décrite par KADDICK et al ; (1998) ; - une séquence régulatrice inductible par la tétracycline telle que celle commercialisée par la Société CLONTECH.
La séquence régulatrice capable de contrôler l'acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention peut comprendre un promoteur constitutif, tel que : - le promoteur 35S, ou avantageusement le promoteur constitutif double 35S (pd35S) du CaMV, décrits dans l'article de KAY ET6 AL. (1987) ; - le promoteur actine du riz suivi de l'intron actine de riz (PAR-LAR) contenu dans le plasmide pAct-1-F4 décrit par McELROY et-al. (1991) ; - le promoteur pUbi1 du gène codant- pour l'ubiquitine 1 de maïs (CHRISTENSEN et aL, (1992).
La séquence régulatrice capable de contrôler l'acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention peut aussi diriger une
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expression de l'acide nucléique d'intérêt spécifiquement dans certains tissus, comme la graine, la feuille ou la racine. Il peut s'agir notamment des séquences régulatrices suivantes : - un promoteur tissu spécifique comme le promoteur HMWG de blé ou d'orge, ou encore le promoteur pCRU du gène de la cruciférine de radis, qui permettent tous trois une expression de la protéine d'intérêt dans les graines (ROBERTS et al. (1989) ; ANDERSON O. D. et al. (1989) ; DEPIGNY-THIS et al. (1992) ; - les promoteurs PGEA1 et PGEA6 correspondant à la région 5' non codante des gènes de la protéine de réserve de graines, GEA1 et GEA6 respectivement d'Arabidopsis thaliana (AUBIER et al., (1993) et permettant une expression spécifique dans les graines ; - le promoteur du gène de zéine de maïs (Pzéine) contenu dans le plasmide p63, et permettant l'expression dans l'albumen des semences de maïs (REINA et al., 1990) ; - des promoteurs spécifiques de régions ou de tissus particuliers des plantes, et plus particulièrement des promoteurs spécifiques des graines (DATLA, R. et al., 1997), notamment les promoteurs de la napine (EP 255
Figure img00510001

378), de la phaseoline, de la glutenine, de l'héliantinine (WO 92/17580), de l'albumine (WO 98/45460), de l'oélosine (WO 98/45461), de l'ATS1 ou de l'ATS3 (PCT/US 98/06978, déposée le 20 Octobre 1998, incorporée ici par référence) ; - promoteurs spécifiques des tissus feuilles ou racines.
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Figure img00520001

caractéristiques générales des vecteurs recombinants selon l'invention.
Par vecteur au sens de la présente invention, on entendra une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire qui est indifféremment sous forme simple brin ou double brin.
Un vecteur recombinant selon l'invention est indifféremment un vecteur de clonage, un vecteur d'expression, ou plus spécifiquement un vecteur d'insertion, un vecteur de transformation ou un vecteur d'intégration.
Il peut s'agir d'un vecteur d'origine bactérienne ou virale.
Selon un premier mode de réalisation, un vecteur recombinant selon l'invention est utilisé afin d'amplifier l'acide nucléique qui y est inséré après transformation ou transfection de l'hôte cellulaire désiré.
Selon un second mode de réalisation, il s'agit de vecteur d'expression comprenant : a) soit un acide nucléique régulateur du gène DD1-a ou du gène DD1-b tel que défini ci-dessus placé à proximité d'un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle de cet acide nucléique régulateur ; b) soit un acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention codé par le gène DD1-a ou le gène DD1-b, ou encore pour un fragment d'un tel polypeptide, ledit polynucléotide étant placé sous le contrôle d'une séquence régulatrice fonctionnelle dans l'organisme hôte dans lequel l'expression de l'acide nucléique codant pour un peptide selon l'invention est recherchée.
Un vecteur recombinant selon l'invention comprend avantageusement aussi des séquences d'initiation et d'arrêt de la transcription appropriée.
En outre, les vecteurs recombinants selon l'invention pourront inclure une ou plusieurs origines de réplication fonctionnelle chez les hôtes cellulaires dans lesquels leur amplification ou leur expression est
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recherchée, ainsi que des séquences nucléotidiques marqueurs de sélection.
Selon un aspect avantageux, un vecteur recombinant selon l'invention est un vecteur intégratif permettant l'insertion de multiples copies de la séquence d'ADN insérée dans ce vecteur dans le génome d'une plante, dont la transformation par un acide nucléique selon l'invention est recherchée.
A titre d'exemples de promoteurs utilisables dans un vecteur recombinant selon l'invention, on peut citer notamment les promoteurs bactériens tels que les promoteurs Lacl, LacZ, les promoteurs de l'ARN polymérase du bactériophage T3 ou T7, ou encore les promoteurs PR ou PL du phage lambda.
Des promoteurs pour l'expression d'un acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention dans les plantes sont par exemple le promoteur CaMV 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur, Mc ELROY et al. (1991), le promoteur du gène de l'actine 1 du riz (Mc ELROY et al., (1990) ou encore le promoteur du gène AdH du maïs (DENNIS et al., 1984) ou le promoteur de l'ubiquitine du maïs (CHRISTENSEN et al., 1996).
On peut aussi utiliser des promoteurs chimériques comprenant des séquences activatrices ( enhancer ), tels que le promoteur 35S décrit par
HIGGINS et al. (1991).
D'autres promoteurs utiles pour l'expression d'un polynucléotide d'intérêt dans les plantes sont décrits notamment dans les brevets n US
5,750, 866 et US 5,633, 363, l'ensemble des documents et articles précités constituant des références sur lesquelles l'homme du métier pourra se fonder pour construire des vecteurs recombinants selon l'invention.
De manière générale, pour le choix d'un promoteur adapté, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de
SAMBROOK et al. (1989) ou encore aux techniques décrites par FULLER et al. (1996).
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De manière avantageuse, la cassette d'expression peut aussi contenir des séquences 5'non traduites dites leaders . De telles séquences peuvent augmenter la traduction. Parmi celles connues de l'homme du métier, on peut citer : - le leader EMCV (EncephaloMyoCarditis VIRUS 5'non coding region) (ELROY-STEIN et al., 1989) ; - le leader TEV (Tobacco Etch Virus) (CARRINGTON AND FREED, 1990) ; -le leader du gène BiP codant pour la protéine de liaison à la chaîne lourde de l'immunoglobuline humaine (MACEJACK et al., 1991) ; - le leader AMV RNA 4 provenant de l'ARNm de la protéine du virus de la mosaïque de la luzerne (JOBLING et al. 1987) ; - le leader du virus de la mosaïque du tabac (GALLIE et al., 1989).
Les vecteurs selon l'invention peuvent aussi comprendre des séquences dites terminateurs .
Parmi les terminateurs utilisables dans les constructions de l'invention, on peut citer notamment : - le polyA 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV), décrit dans l'article de FRANCK et al. (1980) ; - le terminateur nos correspondant à la région 3'non-codante du gène de la opaline synthase du plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens (DEPICKER et al., 1992), - le terminateur du gène histone (EP 0 633 317).
Le vecteur d'expression peut aussi comprendre des séquences de type peptides signaux vacuolaire ou apoplastique lorsqu'elles ne sont pas déjà présentes dans la séquence du gène d'intérêt, pour amener la protéine codée par le gène hétérologue dans des compartiments particuliers des cellules de plante, en particulier celles comprenant la zone de transfert de l'endosperme.
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Les vecteurs bactériens préférés selon l'invention sont par exemple les vecteurs pBR322 (ATCC n 37 017) ou encore les vecteurs tels que pAA223-3 (Pharmacia, Uppsala, Suède) et pGEM1 (Promega Biotech, Madison, Wl, Etats-Unis).
On peut encore citer d'autres vecteurs commercialisés tels que les vecteurs pQE70, pQE60, pQE9 (Quiagen), psi174, pBluescript SA, pNH8A, pMH16A, pMH18A, pMH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI et pSG (Stratagene).
Il peut s'agir également de vecteurs du type Baculovirus tel que le vecteur pVL1392/1393 (Pharmingen) utilisé pour transfecter les cellules de la lignée Sf9 (ATCC N CRL 1711) dérivée de Spodoptera frugiperda.
Préférentiellement, on aura recours à des vecteurs spécialement adaptés pour l'expression de séquence d'intérêt dans des cellules de plantes, tels que les vecteurs suivants : - vecteur pBIN19 (BEVAN et al.), commercialisé par la Société CLONTECH (Palo Alto, Californie, USA) ; - vecteur pB1 101 (JEFFERSON, 1987), commercialisé par la Société CLONTECH ; - vecteur pBI121 (JEFFERSON, 1987), commercialisé par la Société CLONTECH ; - vecteur pEGFP ; Yang et al. (1996), commercialisé par la Société CLONTECH ; - vecteur pCAMBIA 1302 (HAJDUKIIEWICZ et al., 1994) - vecteur L 127a5 représenté à la figure 7.
CELLULES HOTES TRANSFORMEES SELON L'INVENTION.
Pour permettre l'expression d'un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide régulateur du gène DD1-a ou du gène DD1-b selon l'invention ou encore pour permettre l'expression d'un acide nucléique
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codant pour un polypeptide selon l'invention placé sous le contrôle d'une séquence régulatrice appropriée, les acides nucléiques ou les vecteurs recombinants définis dans la présente description doivent être introduits dans une cellule hôte. L'introduction des polynucléotides selon l'invention dans une cellule hôte peut être réalisée in vitro, selon les techniques bien connues de l'homme du métier pour transformer ou transfecter des cellules, soit en culture primaire, soit sous la forme de lignée cellulaire.
L'invention a en outre pour objet une cellule hôte transformée par un acide nucléique selon l'invention ou par un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus.
Une telle cellule hôte transformée est préférentiellement d'origine bactérienne, fongique ou végétale.
Ainsi, peuvent être notamment utilisées des cellules bactériennes de différentes souches de Escherichia coli ou encore d'Agrobacterium tumefaciens.
De manière préférée, la cellule hôte transformée est une cellule de plante ou encore un protoplaste de plante.
De manière tout à fait préférée, il s'agit d'une cellule ou d'un protoplaste d'une plante céréalière. La cellule ou le protoplaste est préférentiellement originaire du maïs, du blé, de l'orge, du sorgho ou du millet.
Figure img00560001
Cellules hôtes contenant un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléiQue régulateur du gène DD1-a ou du gène DD1-b.
Une cellule hôte transformée préférée selon l'invention est la souche de Escherichia coli DH5a contenant le plasmide L246a déposée à la CNCM le 4 Octobre 2000 sous le numéro d'accès 1-2567.
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Une seconde cellule hôte transformée selon l'invention est la souche de Escherichia coli DH5a contenant le plasmide L247a déposée à la CNCM le 4 Octobre 2000 sous le numéro d'accès 1-2568.
D'autres cellules hôtes transformées préférées selon l'invention sont respectivement des cellules hôtes transformées avec le plasmide L246b ou le plasmide L247b représentés respectivement dans les figures 9 et 11.
PLANTES TRANSFORMEES SELON L'INVENTION.
L'invention concerne aussi un organisme multicellulaire végétal transformé, caractérisé en ce qu'il comprend une cellule hôte transformée ou une pluralité de cellules hôtes transformées par un acide nucléique tel que défini dans la présente description ou encore par un vecteur recombinant selon l'invention.
L'invention a encore pour objet une plante transgénique comprenant, sous une forme intégrée dans son génome, un acide nucléique tel que défini dans la présente description.
De manière générale, l'invention est aussi relative à l'utilisation d'un acide nucléique tel que défini dans la présente description pour l'obtention de plantes transformées (transgéniques) à qualité agronomique, alimentaire ou industrielle améliorée, par exemple en contrôlant la taille et/ou le développement de l'albumen du grain.
Plante transformée par un acide nucléique comprenant un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur du gène DD1-a ou du gène DD1-b.
L'un des objectifs poursuivi selon la présente invention est l'obtention de plantes transgéniques dont le grain mature possède des
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caractéristiques améliorées, notamment du point de vue de la qualité ou de la quantité des nutriments contenus dans son albumen.
L'invention vise donc également des procédés pour modifier les qualités agronomiques et/ou nutritionnelles d'une plante, par une action ciblée et précoce sur le développement de l'albumen, utilisant la transformation des plantes avec un vecteur selon l'invention. En particulier, elle s'intéresse à la modification de la taille et/ou du développement de l'albumen.
L'invention a plus précisément pour objet l'utilisation d'une cassette d'expression telle que définie précédemment, pour l'obtention d'une plante Angiosperme transgénique présentant des qualités agronomiques ou nutritionnelles améliorées.
L'invention concerne également l'utilisation des plantes transgéniques obtenues selon l'invention, ou parties de ces plantes, notamment semences, grains et fruits pour la préparation de produits dérivés, notamment de produits alimentaires.
L'invention permet d'atteindre cet objectif au travers de l'obtention de plantes transgéniques dont le transgène caractéristique est constitué d'un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur du gène DD1-a ou du gène DD1-b selon l'invention, tel que décrit en détail dans la partie correspondante de la présente description.
Un tel acide nucléique régulateur comprend préférentiellement un acide nucléique de séquence SEQ ID ? 3 ou SEQ ID NO4, ou un fragment fonctionnel d'un acide nucléique de séquence SEQ ID ? 3 ou SEQ ID NO4, capable de diriger l'expression du polynucléotide d'intérêt dans la plante, plus particulièrement de diriger l'expression du polynucléotide d'intérêt dans les cellules de la zone de transfert du grain en développement.
De préférence, le polynucléotide d'intérêt, placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur du gène DD1-a ou du gène DD1-b, et constituant le transgène d'une plante transformée selon l'invention code pour
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une protéine impliquée dans le transfert de métabolites vers l'albumen en développement d'un grain de plante.
Les polynucléotides d'intérêt sont ceux décrits précédemment dans la description.
Parmi les plantes susceptibles d'être transformées selon l'invention, on peut citer à titre d'exemples des cellules de plantes de grandes cultures (maïs, blé, colza, tournesol, pois, soja, orge) ou des plantes potagères et fleurs.
En particulier, on peut choisir des plantes connues pour contenir d'importantes réserves (protéiques, glucidiques et lipidiques), notamment les plantes céréalières ou les plantes oléagineuses.
Les plantes hybrides obtenues par le croisement de plantes selon l'invention, font aussi partie de l'invention.
Préférentiellement, une plante transformée selon l'invention est une céréale et de manière tout à fait préférée un maïs, un blé, une orge, un sorgho ou un millet.
L'invention a encore pour objet une semence ou un grain de plante dont une ou plusieurs cellules constitutives comprennent dans leur génome une ou plusieurs copies d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus.
Selon un autre aspect, l'invention concerne aussi une semence d'une plante transgénique telle que définie ci-dessus, ou encore un fruit d'une telle plante transgénique.
Les semences ou grains matures d'une plante transgénique telle que définie ci-avant possèdent des caractéristiques qualitatives ou quantitatives en nutriments améliorées, pouvant se caractériser par exemple par une plus forte teneur en divers sucres et amidons.
Plantes transformées par un acide nucléique codant pour un polypeptide du gène DD1-a ou du gène DD1-b.
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Figure img00600001
L'invention a également pour objet un organisme multi-cellulaire végétal transformé par un acide nucléique codant pour un polypeptide codé par le gène DD1-a ou par le gène DD1-b.
Préférentiellement, l'acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention est placé sous le contrôle d'éléments de régulation fonctionnels chez la plante dans laquelle son expression est recherchée.
L'invention a également trait à une plante transformée par un acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention ou encore par un vecteur recombinant contenant, insérée dans celui-ci, une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide selon l'invention.
De manière préférée, l'acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention est choisi parmi l'acide nucléique de séquences SEQ ID NO1, 2,5, 6,7 et 8.
De manière préférée, l'organisme multicellulaire végétal ou la plante transformée par un acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention est une céréale, et de manière tout à fait préférée un maïs, un blé, une orge, un sorgho ou un millet.
Outre son rôle potentiel dans le transfert de métabolites de la plante mère vers l'albumen en formation, un polypeptide selon l'invention possède, comme il sera décrit ci-dessous dans la description, des propriétés d'hydrophilicité caractéristiques de polypeptides de type défensine , ce qui pourrait permettre d'attribuer aux polypeptides codés par les gènes DD1a et DD1-b selon l'invention un rôle actif dans la défense de la plante vis-àvis de divers pathogènes végétaux.
Ainsi, une plante transformée par un acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention pourrait posséder des caractéristiques de résistance améliorées à divers pathogènes de plantes.
L'invention est également relative à un procédé d'obtention d'une plante transgénique telle que définie dans la présente section, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
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a) obtention d'une cellule hôte recombinante végétale selon l'invention ; b) régénération d'une plante entière à partir de la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a) ; c) sélection des plantes obtenues à l'étape b) ayant intégré un acide nucléique tel que défini dans la présente description.
La cellule hôte recombinante végétale est : - soit une cellule hôte recombinante transformée par un acide nucléique comprenant un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur tel que défini dans la description ; - soit une cellule hôte recombinante transformée avec un acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide selon l'invention, placé sous le contrôle d'une séquence régulatrice fonctionnelle chez les végétaux.
L'invention a encore pour objet un procédé d'obtention d'une plante transgénique, transformée avec un acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) obtention d'une cellule hôte recombinante d'Agrobacterium tumefaciens transformée avec un acide nucléique selon l'invention ; b) transformation d'une plante d'intérêt par infection avec la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a) ; c) sélection des plantes ayant intégré dans leur génome un acide nucléique selon l'invention.
L'invention a également trait à un procédé d'obtention d'une plante transgénique caractérisée en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) transfecter une cellule de plante avec un acide nucléique selon l'invention ou avec un vecteur recombinant tel que défini dans la présente description ; b) régénérer une plante entière à partir des cellules de plantes recombinantes obtenues à l'étape a) ;
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c) sélectionner des plantes ayant intégré dans leur génome un acide nucléique selon l'invention.
L'un quelconque des procédés d'obtention d'une plante transformée décrits ci-dessus peut en outre comporter les étapes additionnelles suivantes : d) croisement entre elles de deux plantes transgéniques telle qu'obtenue à l'étape c) ; e) sélection des plantes homozygotes pour le transgène.
Dans un second mode de réalisation particulier, l'un quelconque des procédés d'obtention d'une plante transgénique décrit ci-dessus peut en outre comporter les étapes additionnelles suivantes : f) croisement d'une plante transgénique obtenue à l'étape c) avec une plante de la même espèce ; g) sélection des plantes issues du croisement de l'étape f) ayant conservé le transgène.
Un autre objet de l'invention consiste en une plante transgénique, telle qu'obtenue selon l'un quelconque des procédés d'obtention d'une plante transformée définie ci-avant.
L'invention a également pour objet un procédé d'obtention d'une plante Angiosperme présentant des qualités agronomiques ou nutritionnelles améliorées, comprenant les étapes consistant à : transformer au moins une cellule de plante Angiosperme par un vecteur tel que défini précédemment ; cultiver la cellule ainsi transformée de manière à générer une plante contenant dans son génome une cassette d'expression selon l'invention.
La transformation de cellules végétales peut être réalisée par les techniques connues de l'homme du métier.
On peut citer notamment les méthodes de transfert direct de gènes telles que la microinjection directe dans des embryoïdes de plante (NEUHAUS et al., 1987), l'infiltration sous vide (BECHTOLD et al., 1993) ou l'électroporation (CHUPEAU et al., 1989) ou encore la précipitation directe
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au moyen de PEG (SCHOCHER et aL, 1986) ou le bombardement par canon de particules recouvertes de l'ADN plasmidique d'intérêt (FROMM M. et al. 1990).
On peut également infecter la plante par une souche bactérienne notamment d'Agrobacterium. Selon un mode de réalisation du procédé de l'invention, les cellules végétales sont transfrormées par un vecteur selon l'invention, ledit hôte cellulaire étant susceptible d'infecter lesdites cellules végétales en permettant l'intégration dans le génome de ces dernières, des séquences nucléotidiques d'intérêt initialement contenues dans l'ADN du vecteur susmentionné. Avantageusement, l'hôte cellulaire susmentionné utilisé est Agrobacterium tumefaciens, notamment selon la méthode décrite dans l'article d'AN et al., (1986), ou encore Agrobacterium rhizogenes, notamment selon la méthode décrite dans l'article de GUERCHE et al., (1987) ou encore dans la demande PCT NOWO 00 22.148.
Par exemple, la transformation des cellules végétales peut être réalisée par le transfert de la région T du plasmide circulaire extrachromosomique inducteur de tumeurs Ti d'Agrobacterium tumefaciens, en utilisant un système binaire (WATSON et al. 1994). Pour ce faire, deux vecteurs sont construits. Dans l'un de ces vecteurs, la région T a été éliminée par délétion, à l'exception des bordures droite et gauche, un gène marqueur étant inséré entre eux pour permettre la sélection dans les cellules de plantes. L'autre partenaire du système binaire est un plasmide Ti auxiliaire, plasmide modifrié qui n'a plus de région T mais contient toujours les gènes de virulence Vif, nécessaires à la transformation de la cellule végétale.
Selon un mode préféré, on peut utiliser la méthode décfrite par ISHIDA et al. (1996) pour la transformation des Monocotylédones.
Selon un autre protocole, la transformation est réalisée selon la méthode décrite par FINER et al. (1992) utilisant le canon à particules de tungstène ou d'or.
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L'homme du métier est capable de mettre en oeuvre de nombreux procédés de l'état de la technique afin d'obtenir des plantes transformées par un acide nucléique du gène DD1-a ou du gène DD1-b selon l'invention.
L'homme du métier pourra se référer avantageusement à la technique décrite par BECHTOLD et al. (1993) afin de transformer une plante à l'aide de la bactérie Agrobacterium tumefaciens. Des techniques utilisant d'autres types de vecteurs peuvent également être utilisées, telles que les techniques décrites par BOUCHEZ et ai. (1993) ou encore par HORSCH et al. (1994).
A titre illustratif, une plante transgénique selon l'invention peut être obtenue par des techniques de biolistique telles que celles décrites par FINER et al. (1992) ou encore celles décrites par VAIN et al. (1993).
D'autres techniques préférées de transformation d'une plante conformément à l'invention par Agrobacterium tumefaciens sont celles décrites par ISHIDA et al. (1996) ou encore dans la demande PCT publiée sous le noWO 95/06 722 au nom de JAPAN TOBACCO.
L'invention a encore pour objet une semence de plante dont les cellules constitutives comprennent un acide nucléique selon l'invention qui a été artificiellement inséré dans leur génome.
L'invention a encore pour objet une semence d'une plante transgénique telle que définie ci-avant ou encore un fruit d'une telle plante transgénique.
Un autre objet de l'invention consiste en l'utilisation d'un acide nucléique régulateur du gène DD1-a ou du gène DD1-b tel que défini dans la présente description pour l'expression in vitro ou in vivo, de préférence in planta, d'un polynucléotide d'intérêt, préférentiellement un polynucléotide codant pour une protéine impliquée dans le transfert de métabolites vers l'albumen en formation d'un grain de plante.
Selon un autre aspect, l'invention concerne encore l'utilisation d'un acide nucléique codant pour un polypeptide codé par le gène DD1-a ou par
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le gène DD1-b selon l'invention pour l'expression in vivo ou in vitro, de préférence in planta, d'un polypeptide selon l'invention ou encore d'un fragment d'un tel polypeptide.
De manière tout à fait préférée, l'utilisation ci-dessus est caractérisée en ce qu'il s'agit d'une expression in vivo chez une plante transformée avec un tel acide nucléique.
POLYPEPTIDES CODES PAR LE GENE DD1-a ET LE GENE DD1-b
Comme déjà décrit précédemment, le gène DD1-a et le gène DD1b selon l'invention codent respectivement pour des polypeptides possédant une longueur de 304 et 286 acides aminés, pour lesquels il a pu être observé des polypeptides variants.
Toutefois, le degré d'identité entre les séquences d'acides aminés des polypeptides codés respectivement par le gène DD1-a et le gène DD1-b est très élevé, proche de 90% d'identité en acides aminés, après alignement des séquences.
Les polypeptides codés par le gène DD1-a ou le gène DD1-b possèdent un peptide signal putatif, ce qui est une caractéristique d'une protéine sécrétée.
Le caractère hydrophile de la protéine mature est compatible avec une fonction dans le milieu extracellulaire.
De plus, la même combinaison peptide signal putatif/protéine mature hydrophile des polypeptides selon l'invention est commune avec d'autres polypeptides retrouvés principalement exprimés au niveau des cellules de la zone de transfert du maïs, tels que les polypeptides BETL-1 à BETL-4 décrits par HUEROS et al. (1999).
Le polypeptide codé par la séquence du gène DD1-a SEQ ID NO1 est le polypeptide de séquence SEQ ID ? 9 du listage de séquences.
Le polypeptide DD1-a possède un poids moléculaire calculé de 33408 daltons. Il possède 19 résidus d'acides aminés fortement basiques (K,
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R), 29 résidus d'acides aminés fortement acides (D, E), 98 acides aminés hydrophobes (A, 1, L, F W, V) et 97acides aminés polaires (N, C, Q, S, T, Y).
Le polypeptide de séquence SEQ ID ? 9 codé par le gène DD1-a possède un point isoélectrique calculé de 5,40 et une charge calculée à pH 7,0 de 8,61.
L'invention a donc encore pour objet un polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID ? 9 ainsi qu'un polypeptide possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID ? 9 ou un fragment ou un variant de celui-ci.
Pour le polypeptide codé par le gène DD1-b, deux polypeptides variants possédant entre eux une identité de 98% en acides aminés ont été identifiés par le demandeur.
En tenant compte des substitutions d'acides aminés permettant de différencier ces deux variants polypeptides codés par le gène DD1-b, il a été possible de définir une famille de polypeptides fortement homologues comprenant des résidus d'acides aminés variants, qui est défini comme le polypeptide de séquence SEQ ID ? 10 du listage de séquences.
Le premier polypeptide variant codé par le gène DD1-b est le polypeptide de séquence SEQ ID ? 11 du listage de séquences.
Le second polypeptide variant codé par le gène DD1-b selon l'invention est le polypeptide de séquence SEQ ID ? 12 du listage de séquences.
Le polypeptide de séquence SEQ ID N 12 a un poids moléculaire apparent de 31357 daltons. Le polypeptide de séquence SEQ 1 D NO 12 possède 18 résidus d'acides aminés fortement basiques (K, R), 27 résidus d'acides aminés fortement acides (DE), 91 acides aminés hydrophobes A, I, L, F, W, V) et 91 acides aminés polaires (N, C, Q, S, T, Y).
Le polypeptide de séquence SEQ ID N 12 a un point isoélectrique calculé de 5,44 et une charge calculée à pH 7,0 de-7, 74.
L'invention est donc également relative à un polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID ? 10 ainsi qu'à un
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polypeptide possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N 10 ou un fragment ou un variant de celui-ci.
L'invention a encore pour objet un polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID ? 11 ainsi qu'un polypeptide possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID NO11, ou un fragment ou un variant de celui-ci.
Un autre objet de l'invention consiste en un polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID ? 12 ainsi qu'un polypeptide possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID NO12, ou un fragment ou un variant de celui-ci.
Un fragment d'un polypeptide selon l'invention, comprendra au moins 10,15, 20,25, 30,40, 50,60, 70,80, 90,100, 150,200 ou 250 acides aminés consécutifs d'un polypeptide de séquences SEQ ID N 9 à 12.
Fait également partie de l'invention un polypeptide comprenant 10, 15,20, 25,30, 40,50, 60,70, 80,90, 100,150, 200 ou 250 acides aminés consécutifs d'un polypeptide de séquences SEQ ID N 9 à 12.
L'invention est également relative à un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence d'un polypeptide de séquences SEQ ID ? 9 à 12.
Avantageusement, fait aussi partie de l'invention un polypeptide ayant au moins 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% d'identité en acides aminés avec la séquence d'un polypeptide de séquences SEQ D ? 9 à 12, ou un fragment peptidique de ce dernier.
De manière générale, les polypeptides selon la présente invention se présentent sous une forme isolée ou purifiée.
Un autre objet de l'invention consiste en un polypeptide comprenant des modifications d'acides aminés de 1,2, 3,4, 5,10 à 20 substitutions, additions ou délétions d'un acide aminé par rapport à la séquence d'acides aminés d'un polypeptide de séquences SEQ D ? 9 à 12 ou encore d'un fragment ou d'un variant de celui-ci.
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Un polypeptide selon l'invention peut être obtenu par recombinaison génétique selon des techniques bien connues de l'homme du métier, par exemple des techniques décrites dans AUSUBEL et al. (1989).
Un polypeptide selon l'invention peut être également préparé par des techniques classiques de synthèse chimique, indifféremment en solution homogène ou en phase solide.
A titre illustratif, un polypeptide selon l'invention pourra être préparé par la technique en solution homogène décrite par HOUBEN WEIL (1974) ou encore par la technique de synthèse en phase solide décrite par MERRIFIELD (1965a ; 1965b).
De préférence, les polypeptides variants d'un polypeptide selon l'invention conservent leur capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre les polypeptides de séquences SEQ ID ? 9 à 12.
Un polypeptide codé par le gène DD1-a ou le gène DD1-b selon l'invention, tel qu'un polypeptide de séquence en acides aminés SEQ ID ? 9 à 12, ou encore un variant ou un fragment peptidique de ce dernier est utile notamment pour la préparation d'anticorps destinés à la détection de la présence et/ou de l'expression d'un polypeptide de séquences SEQ ID D ? 9 à 12 ou d'un fragment peptidique de ce dernier dans un échantillon.
Outre la détection de la présence d'un polypeptide codé par le gène DD1-a ou le gène DD1-b ou encore d'un fragment peptidique d'un tel polypeptide dans un échantillon, des anticorps dirigés contre ces polypeptides sont utilisés pour quantifier la synthèse d'un polypeptide de séquences SEQ ID ? 9 à 12, par exemple dans des cellules d'une plante, et déterminer ainsi la capacité de cette plante à transférer des métabolites de la plante mère vers l'albumen du grain en formation ou encore la capacité de résistance d'une telle plante à divers pathogènes de végétaux.
Par anticorps au sens de la présente invention, on entendra notamment des anticorps polyclonaux ou monoclonaux ou des fragments (par exemple les fragments F (ab) '2, F (ab)) ou encore tout polypeptide
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comprenant un domaine de l'anticorps initial reconnaissant le polypeptide ou le fragment de polypeptide cible selon l'invention.
Des anticorps monoclaux peuvent être préparés à partir d'hybridomes selon la technique décrite par KOHLER et MILSTEIN (1975)
La présente invention concerne également des anticorps dirigés contre un polypeptide tel que décrit ci-dessus ou un fragment ou un variant de ce dernier, tel que produit dans la technique du trioma ou encore la technique d'hybridome décrite par KOZBOR et al. (1983).
L'invention a également trait à des fragments d'anticorps simple chaîne Fv (ScFv) tels que décrits dans le brevet US NO4, 946,778 ou encore par MARTINEAU et al. (1998).
Les anticorps selon l'invention comprennent également des fragments d'anticorps obtenus à l'aide de banques de phages telles que décrites par RIDDER et al. (1995) ou encore des anticorps humanisés tels que décrits par REINMANN et al. (1997) et LEGER et al. (1997). Les préparations d'anticorps selon l'invention sont utiles dans des tests de détection immunologiques destinés à l'identification de la présence et/ou de la quantité d'un polypeptide de séquences SEQ ID ? 9 à 12, ou d'un fragment peptidique de celui-ci, présent dans un échantillon.
Un anticorps selon l'invention pourra comprendre en outre un marqueur détectable isotopique ou non isotopique, par exemple fluorescent, ou encore être couplé à une molécule telle que la biotine, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
Ainsi, l'invention a en outre pour objet un procédé pour détecter la présence d'un polypeptide conforme à l'invention dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de : a) mettre en contact l'échantillon à tester avec un anticorps tel que décrit ci-dessus ; b) détecter le complexe antigène/anticorps formé.
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L'invention est également relative à un nécessaire ou kit de diagnostic pour la détection de la présence d'un polypeptide conforme à l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant : a) un anticorps tel que défini ci-dessus ; b) le cas échéant, un ou plusieurs réactifs nécessaires à la détection du complexe antigène/anticorps formé.
La présente invention est en outre illustrée sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples suivants : Figures
La figure 1 représente la séquence génomique codante du gène DD1-a, identique à la séquence SEQ ID ? 5. La ligne supérieure représente le brin codant et la ligne inférieure représente le brin non codant. Chacun des cinq exons du gène DD1-a est représenté par des boîtes.
La figure 2 représente la séquence génomique codante du gène DD1-b. Cette séquence est identique à la séquence SEQ ID D ? 6. La ligne supérieure représente la séquence du brin codant et la ligne inférieure représente la séquence du brin non codant. Chacun des quatre exons du gène DD1-b est représenté par des boîtes.
La figure 3 représente la séquence partielle de l'ADNc correspondant au gène DD1-a.
La ligne supérieure représente la séquence nucléotidique du brin codant. La ligne inférieure représente la séquence d'acides aminés déduite.
La figure 4 représente la séquence de l'ADNc correspondant à un produit de transcription du gène DD1-b. Les régions 5'-UTR et 3'-UTR sont représentées par des flèches. La phase de lecture ouverte est représentée par une boîte. La boîte désignée DD1 AMPLICON est l'ADNC partiel de séquence SEQ ID N 26 à partir de laquelle les amorces destinées à l'élongation en 5' (5'RACE) et vers l'extrémité 3' (3'RACE) ont été conçues.
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Figure img00710001

La ligne inférieure représente la séquence en acides aminés du polypeptide DD1-b de séquence SEQ ID NO12.
La figure 5 représente la séquence de l'acide nucléique régulateur du gène DD1-a de séquence SEQ ID ? 3. Les boîtes représentent les différents motifs caractéristiques d'une région régulatrice retrouvés dans cette séquence et qui sont définis de manière précise dans la description.
La figure 6 représente la séquence de l'acide nucléique régulateur du gène DD1-b de séquence SEQ ID ? 4. Les boîtes représentent les différents motifs retrouvés dans cette séquence et qui sont définis plus précisément dans la description.
La figure 7 représente une carte du vecteur L 127a5 qui comprend la cassette d'expression inutilisée pour exprimer un gène d'intérêt sous le contrôle de différents fragments des acides nucléiques régulateurs des gènes DD1-a et DD1-b.
La figure 8 représente une carte du vecteur L 246a dans lequel le gène rapporteur GUS est placé sous le contrôle d'un fragment d'environ 3 kb de l'acide nucléique régulateur du gène DD1-a.
La figure 9 illustre une carte du vecteur L246b qui comprend le gène rapporteur GUS placé sous le contrôle d'un fragment d'environ 1 kb de l'acide nucléique régulateur du gène DD1-a.
La figure 10 représente une carte du vecteur L247a qui comprend le gène rapporteur GUS placé sous le contrôle d'un fragment d'environ 2,5 kb de l'acide nucléique régulateur du gène DD1-b.
La figure 11 représente une carte du vecteur L247b qui comprend le gène rapporteur GUS placé sous le contrôle d'un fragment d'environ 1,6 kb de l'acide nucléique régulateur du gène DD1-b.
La figure 12 représente un alignement entre les séquences en acides aminés du polypeptide DD1-a de séquence SEQ ID NO9, du polypeptide DD1-b de séquence SEQ ID N 11 et du polypeptide DD1-b de séquence SEQ ID NO12. La ligne supérieure représente une séquence en
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acides aminés consensus. La seconde ligne représente la séquence en acides aminés déduite de la séquence partielle de l'ADNc codant pour DD1- a. La 3 ème ligne représente la séquence de la protéine DD1-a. Les deux lignes inférieures représentent les séquences en acides aminés des deux variants polypeptidiques de DD1-b de séquences SEQ ID NO11 et SEQ ID
Figure img00720001

NO12.
La figure 13 illustre le profil d'expression des gènes DD1-a et DD1b. Après transcription inverse et amplification par PCR (RT-PCR), les ADN ont été transférés sur membrane puis hybridés avec la sonde de séquence SEQ ID NO26. L'expression a été visualisée à partir d'ADN amplifiés dans les tissus suivants : soies, épis, tiges ; feuilles ; racines et l'albumen à 7,9, 12 et 15 jours après pollinisation (JAP). La piste désignée M correspond au marqueurs moléculaires utilisés comme témoins.
La figure 14 illustre le profil d'expression tissulaire des gènes DD1-a et DD1-b réalisés à l'aide d'hybridation in situ sur des coupes longitudinales de grain de maïs de 7,9, 12 et 15 jours après pollinisation (JAP). a, b, 7 JAP ; c, d, 9 JAP et 12 JAP ; g, h15 JAP. a, c, e, g sonde DD1 antisens ; b, d, f, f témoin négatif (sonde DD1 sens).
EXEMPLE 1 : A-MATERIE ET METHODES A-1 LIGNEES VEGETALES
Les plantes de la lignée A188 (GERDES et TRACY, 1993) ont été utilisées pour l'isolement d'ARN et pour la réalisation des hybridations in situ.
Les grains de ces plantes, obtenus par pollinisation à la main, ont été récoltés à différents stades compris entre 7 et 15 JAP. Les fragments d'ADN contenus dans la banque génomique criblée proviennent quant à eux de la
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lignée hybride HD5xHD7. La cartographie a été réalisée grâce aux lignées recombinantes stables issues des croisements Co159xTx303 et Cm37xT232, (BROOKHAVEN NATIONAL LABORATORY, Upton, N. Y.
Etats-Unis). Toutes ces plantes ont été cultivées en serre, avec une période d'éclairement de 16 h, une humidité relative de 80%, et une alternance 24 C/19 C (jour/nuit).
A-2 CLONAGE
L'ADN plasmidique a été préparé suivant le protocole de lyse alcaline décrit par SAMBROOK et al. (1989). Les digestions d'ADN génomique et plasmidique par des enzymes de restriction ont été réalisées selon les conseils des fabricants (GIBCO, BOEHRINGER MANNHEIM, PROMEGA). Les produits de digestion ou d'amplification par PCR ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose dans du tampon TAE SAMBROOK et al. 1989). Les fragments de restriction ont été ligués dans le vecteur pBluescript et les produits PCR dans le vecteur pGEM-T-easy, à l'aide de la T4-DNA ligase suivant les conseils du fournisseur (Promega), en utilisant 50 ng de vecteur, et un rapport molaire insert/vecteur de l'ordre de 3/1. Ces constructions ont été introduites dans la souche bactérienne DH5a par transformation par choc thermique, selon le protocole de HANAHAN (1983).
A-3 SEQUENCAGE
Les réactions de séquençage ont été réalisées soit à partir de minipréparations d'ADN plasmidique ayant subi une extraction volume à volume au phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25 : 24 : 1) pH 8 et une précipitation à l'éthanol, soit à partir de produits PCR purifiés à l'aide du kit QlAquick PCR purification (Qiagen). Les produits de la réaction dye terminator
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Figure img00740001

obtenus avec le kit Thermo Sequenase (Amersham) ont migré sur un séqueneur automatique ABI 373 A (Applied Biosystems).
Les logiciels Sequencher 3.1. 1 (Gene Codes Corporation) et DNAstar (Laser Gene) ont permis d'analyser et d'assembler les séquences obtenues. Les bases de données ont été consultées avec le logiciel blast (Basic local Alignment S Tool, National Center for Biotechnology Information, ALTSCHUL et al., (1997). Des motifs de signature protéiques ont été recherchés dans les bases de données Prosite profiles , Prosite patterns , Pfam et Gribskov collection , disponibles sur le serveur de l'ISB (Institute of Swiss Bioinformatics).
A-4 Southern blot
Les fragments d'ADN ont été transférés des gels d'agarose sur des membranes de nylon (Hybond N+, Amersham) par capilarité, en présence de soude 0, 4N. Les membranes ont été préhybridées selon les conseils du fournisseur, pendant 4 à 12 h en conditions stringentes (à 65OC, en présence de SSPE 5x et sans formamide). Puis elles ont été hybridées pendant 16 h dans les mêmes conditions. Les sondes utilisées pour l'hybridation ont été marquées radioactivement avec 50uCi d'oP-dCTP, seion ie protocoie suivant : 25 à 100 ng d'ADN linéaire ont été dénaturés 5 min dans l'eau bouillante, dans un volume de 9 ut, avec deux amorces spécifiques antiparallèles (séquences listées dans le tableau 10) à une concentration finale de 5 M.
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Figure img00750001
TABLEAU 10 Séquences de 5'vers 3'des amorces utilisées pour la fabrication de sondes radioactives (≈A. 4) et pour la RT-PCR (≈A. 5.).
Figure img00750002
<tb>
<tb> orientation <SEP> nom <SEP> séquence <SEP> spécificité
<tb> sens <SEP> GAPDH5 <SEP> AGGGTGGTGCCAAGAAGGTTG <SEP> GAPDH
<tb> SEQ <SEP> DNA18
<tb> antisens <SEP> GAPDH3 <SEP> GTAGCCCCACTCGTTGTCGTA <SEP> GAPDH
<tb> SEQ <SEP> DNA19
<tb> sens <SEP> 154U <SEP> CACTGGATGCTTTAACCTGGACTGT <SEP> DD1-a <SEP> et <SEP> DD1-b
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> N 20
<tb> antisens <SEP> 154L <SEP> CATTGCCCATGGGAGGACTTG <SEP> DD1-a <SEP> et <SEP> DD1-b
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> N 21
<tb> sens <SEP> GM2 <SEP> CTGCTGGTGGATATACAGGTG <SEP> DD1-a <SEP> et <SEP> DD1-b
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> No <SEP> 30
<tb> antisens <SEP> 203-3' <SEP> TGAATAGAGGATGATACAAGCAA <SEP> DD1-a
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> No <SEP> 31
<tb> antisens <SEP> 204-3' <SEP> GATTTGAATAGAGGATGATACAAGAC <SEP> DD1-b
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> No <SEP> 32
<tb>
Figure img00750003

Puis l'ADN et les amorces ont été hybridés 10 min à température ambiante et 5 min sur glace. Les réactifs suivants ont alors été ajoutés sur glace : 2 un de dAGT (200 uM chacun : dATP, dGTP, dTTP) lui SAB (1 mg/ml), 2) J ! tampon de restriction &num;Z concentré 10x (GIBCO), 5 u ! d'oPdCTP (activité 3000 Ci/mmol), et 1 u ! d'enzyme de Klenow (1 U/ul). Les fragments d'ADN ont été marqués à 37 C pendant 45 minutes, puis l'élongation a été prolongée par une incubation de 15 min avec 1 ut de dCTP froid 200 uM et 1 pI d'enzyme de Klenow. Les sondes ainsi obtenues ont été
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purifiées sur des colonnes de Sepharose CL-6B par centrifugation 3 minutes à 400g.
Après hybridation, les membranes ont subi quatre rinçages, à 65 C dans des solutions à 0,1% de SDS et de concentrations en SSC de 2x, 1x, 0,5x et 0, 1x, et ont été exposées à des films pour autoradiographie (X- OMAT, Kodak).
A-5 ( RT-PCR ?)
Des grains de maïs ont été disséqués sous la loupe binoculaire à différents stades de développement (7,9, 12 et 15 JAP) en séparant l'embryon de l'albumen. Les ARN totaux de ces deux organismes ont été extraits selon le protocole décrit par Mc PHERSON et al. (1991). Ces différentes manipulations ont été conduites en parallèle sur des tissus témoins de plantes du même génotype : soies de 10 cm, tiges, feuilles et racines matures, et jeunes épis non pollinisés de 10 cm.
Les ARN, resuspendus dans 50 ut d'eau Versol (Aguettant), ont été dénaturés à 65 C pendant 5 min et traités à la DNase 1 selon les indications du fournisseur (Promega). Ils ont ensuite été purifiés par deux extractions volume à volume au phénol : chloroforme/alcool isoamylique (25 : 24 : 1) pH 4,5
Figure img00760001

et une précipitation à l'éthanol, 6 pg d'ARN purifiés ont été reverse transcrits par la MuLV reverse transcriptase (Gibco) dans un volume total de 20 ut comme conseillé par le fournisseur, avec les amorces antisens présentées dans le tableau 10 ci-dessus, à une concentration finale de 2, 5 utvt.
Après inactivation de la reverse transcriptase par chauffage à 95 C pendant 5 min, 2 ut de la réaction de transcription inverse ont été amplifiés par la Taq polymérase avec le tampon fourni par le fabricant (Pharmacia).
Les couples d'amorces sens/antisens présentés dans le tableau 10 ont été utilisés à une concentration finale de 1 pM. La réaction a été réalisée dans un amplificateur PCR Perkin Elmer DNA Thermal Cycler 2400 de la façon
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Figure img00770001

suivante : après dénaturation de l'ADN 2 min à 94"C, les échantillons ont subit 30 cycles de 30 s de dénaturation à 94 oC/45 s d'hybridation à 55OC/1 min d'élongation à 72OC.
Une amplification des transcrits du gène Gapdh a constitué le témoin positif de transcription inverse. En effet, ce gène code pour une enzyme impliquée dans la glycolyse, la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase, dont l'expression est ubiquitaire et constitutive. Une amplification a également été réalisée en omettant les ARN, afin de disposer d'un témoin négatif attestant de l'absence d'ADN contaminant dans les réactifs.
A-6 ELONGATION D'AMORCES ( RACE-PCR )
Le kit Marathon cDNA Amplification a été utilisé pour obtenir des extrémités d'ADNc, en suivant les indications du fabricant (CLONTECH), à l'aide des amorces suivantes : TABLEAU 11 Séquences de 5'vers 3'des amorces utilisées pour la RACE-PCR
Figure img00770002
<tb>
<tb> 1 ) <SEP> réaction <SEP> d'ampliation <SEP> 2 ) <SEP> réaction <SEP> d'amplication
<tb> ( <SEP> nested <SEP> primer <SEP> )
<tb> Amorce <SEP> 5'RACE <SEP> TTCACTAGTGTTTGAT <SEP> CCACCCCAGGTTATGA
<tb> CCCTGGCCAGTAGAAT <SEP> ATCCAGCGTG <SEP> (SEQ <SEP> ID
<tb> C <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO22) <SEP> NO24)
<tb> Amorce <SEP> 3'RACE <SEP> CCACTGGATGCTTTAA <SEP> AAGATGATGGAGATTG
<tb> CCTGGACTGTAATGGT <SEP> GTGGCTACACTTTGGA
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO23) <SEP> TA <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO25)
<tb> Amorce <SEP> 5'et <SEP> CCATCCTAATACGACT <SEP> ACTCACTATAGGGCTC
<tb> adaptateur <SEP> 3'RACE <SEP> CACTATAGGGC <SEP> (SEQ <SEP> GAGCGGC <SEP> (SEQ <SEP> ID
<tb> ID <SEP> NO27) <SEP> NO28)
<tb>
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Cette technique repose sur l'amplification de fragments d'ADNc aux extrémités desquels ont été ligués des adaptateurs. Les ADNc utilisés pour la réaction ont été préparés à partir d'ARN polyA+ extraits de la partie basale de grains de maïs de 7 JAP, comprenant l'embryon et la partie basale de l'albumen. Une première amplification a été effectuée entre une amorce spécifique de DD1 (contenant au moins 50% de GC ; température d'hybridation entre 65 et 70 C ; située à une extrémité du clone partiel) et une amorce située dans un adaptateur ligué à l'autre extrémité de l'ADNc servant de matrice. Les produits de cette réaction sont alors amplifiés avec une amorce spécifique située plus à l'intérieur de l'amplicon et une autre amorce de l'adaptateur.
Afin de disposer d'un témoin positif de la présence du gène DD1 parmi les ADNc utilisés, une amplification a été réalisée entre les deux amorces SEQ ID ? 20 et SEQ ID NO21. Le témoin négatif, qui vérifie l'absence d'ADN amplifiable dans les réactifs, a été obtenu en remplaçant les ADNc par de l'eau, puis en amplifiant par les amorces situées en 5'.
A. 7 HYBRIDATION IN SITU
Les hybridations in situ ont été réalisées selon le protocole de COEN et al. (1990), avec les modifications décrites par BRADLEY et al.
(1993). Les principales étapes en sont, en résumé : A. 7. 1 PREPARATION DES TISSUS
Les grains isolés ont été immergés dans une solution de fixation à 4% de paraformaldéhyde et infiltrés sous vide. Puis ils ont été déshydratés par des incubations successives dans des solutions éthyliques salées de degré croissant en éthanol. Les échantillons ont alors été imprégnés pendant plusieurs jours dans un mélange d'Histoclear Il (National
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Figure img00790001

Diagnostics) et de paraffine (Paraplast Plus, Sherwood Medical Co) en concentration croissante. Ils ont ensuite été inclus dans de petits blocs de paraffine pure pour être coupés au microtome, en sections longitudinales et transversales de 7 um d'épaisseur. Ces coupes ont été fixées sur des lames Probe-On Plus préchargées positivement (Fisher Scientific).
A. 7. 2. FABRICATION DE SONDES MARQUEES A LA DIGOXINENINE Les sondes DD1 sens et antisens ont été obtenues par transcription in vitro d'un ADNc partiel du gène DD1 (SEQ ID N'26) clonie dans les deux orientations dans le vecteur pGEM-T-easy. Toutes les transcriptions in vitro ont été réalisées par la T7-ARN polymérase, en présence des nucléotides suivants : ATP, CTP et GTP 1 mM, UTP 0, 65 mM, et digoxinénine-11-UTP 0, 35 mM.
A. 7. 3. HYBRIDATION Les lames ont été hybridées avec la sonde pendant 16 h, à 55OC, dans un tampon d'hybridation contenant entre autre 50% de formamide.
Elles ont ensuite été rincées à 55 C dans une solution à 0, 1% de SDS et de concentration en SSC de 0, 1 x pendant 30 min, puis dans une solution à 50% de formamide et de concentration en SSC de 2x pendant deux fois 1 h 30 min, avec agitation lente.
A. 7. 4 REVELATION Après une incubation de 1 h 30 min avec une dilution 1/1000 d'anticorps anti-digoxigénine couplé à la phosphatase alcaline, les lames ont été révélées par une solution de NBT (nitroblue tetrazolium chloride) et BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate p-toluidine salt), des substrats
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chromogènes de la phosphatase alcaline. Elles ont ensuite été lavées dans des bains de 30 à 100% d'éthanol, et colorées au calcofluor à 0, 1%. Les photographies ont été faites sous un microscope avec un objectif Plan fluor 10/0, 30, à l'aide d'un appareil Nikon FDX 35 sur des pellicules Kodak Elite Chrome 100 ASA.
A. 8. CRIBLAGE DE BANQUE D'ADN GNOMIQUE
Une banque d'ADN génomique contenue dans le phage lambda EMBL3 SP6/T7 (Stratagene) a été étalée à la densité de 1,5 x 105 plages de lyse par boîte, sur 10 boîtes, puis transférée sur membrane Hybond N, selon la technique décrite par SAMBROOK et al. (1989). Les membranes ont été hybridées avec la sonde de séquence SEQ ID no 29 provenant d'un clone d'ADN génomique partiel du gène DD1-b marqué radioactivement. Après révélation des membranes en autoradiographie, les plages de lyse donnant un signal ont été prélevées sur les boîtes et étalées à une densité moindre, ainsi deux fois de suite afin d'obtenir un clone unique par boîte, sous forme de plages isolées. Les ADN ont alors été préparés selon SAMBROOK et al.
(1989).
A. 9.-CARTOGRAPHIE
La cartographie a été réalisée comme décrit par BURR et BURR (1991). L'ADN génomique des lignées parentales Co159, Tx303, Cm37 et T232 a été digéré par les enzymes de restriction suivantes : BamHI, EcoRI, Hindlll, EcoRV, Pstl, Xbal, Sad, Spel, Xhol, Sall, Pvull, et Clal, et transféré sur membrane de nylon (voir paragraphe A. 4). Une sonde marquée radioactivement, correspondant à un clone d'ADN génomique partiel du gène DD1-b de séquence SEQ ID NO29, a été utilisée pour identifier des polymorphismes de longueur des fragments de restriction.
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Un polymorphisme a été observé avec la digestion par EcoRI de l'ADN des deux parents Co 159 et Tx303 et l'ADN génomique de 41 descendants Co159xTx303 a donc été digéré par EcoRI. Selon que la digestion a conduit à l'obtention du même polymorphisme que le parent Tx303 ou que le parent Co159, un score de 1 ou de 2 a été respectivement attribué à l'individu. Pour les individus chez qui la discrimination n'a pas été possible, il a été attribué un x.
Ces résultats ont permis de déterminer la position des gènes sur la carte génétique du maïs, à l'aide du programme Map Maker.
B-RESULTATS B. 1. PROFIL D'EXPRESSION DES GENES DD1
Afin d'obtenir des profils d'expression spatio-temporelle précis des gènes DD1, la technique de RT-PCR a été utilisée avec les oligonucléotides du tableau 10 et la séquence SEQ ID N 26 comme sonde. Les résultats des RT-PCR relatifs à l'albumen et aux tissus témoins sont représentés sur la figure 13.
Le gène DD1 (figure 13) n'est pas exprimé dans les tissus végétatifs, mais présente une fenêtre d'expression très étroite dans l'albumen, située entre 7 et 9 JAP. A 12 JAP, on peut encore observer un signal très faible, qui disparaît totalement à 15 JAP. L'expression de DD1 est donc spécifique de la phase précoce du développement de l'albumen. La sonde DD1 donne également un signal dans la piste du marqueur de taille, car de petites régions du vecteur de clonage présentes aux extrémités de la sonde sont homologues aux séquences du marqueur.
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B. 2 CARACTERISATION DE DD1 B. 2.1 PROFIL D'EXPRESSION TISSULAIRE DE DD1
Afin de préciser le profil d'expression tissulaire de DD1, nous avons réalisé des hybridations in situ sur des coupes longitudinales de grains de maïs de 7,9, 12 et 15 JAP. Avec une sonde antisens, on observe un signal restreint à la zone de transfert de l'albumen. Ce signal est fort à 7 et à 9 JAP (figures 14a et 14c, puis plus faible à 12 JAP (figure 14e), indiquant une diminution du niveau d'expression de l'ARN correspondant au gène DD1. A 15 JAP, on n'observe plus aucun signal (figure 14g), ni dans la zone de transfert, ni dans le reste du grain. Une sonde sens, utilisée comme contrôle négatif, ne donne qu'un signal diffus qui correspond au bruit de fond (figures 14b, d f h). Ceci confirme les résultats obtenus par RT-PCR : le gène DD1 est exprimé lors du développement précoce du grain de maïs, entre 7 et 12 JAP, et son expression est localisée dans la zone de transfert de l'albumen, à la base du grain.
B-2. 2. CLONAGE DE L'ADNC DU GENE DD1-B
Afin d'obtenir la séquence d'ADNc de DD1, nous avons effectué une RACE-PCR vers chaque extrémité du gène. Après DNA gel blot des produits des deux réactions, on obtient plusieurs bandes après hybridation avec la sonde DD1 (SEQ ID NO26) entre 0,4 et 0,8 kb pour la réaction 5', et entre 0,4 kb et 0,6 kb pour la réaction 3'. Les produits de ces deux réactions ont été clonés et séquencés. Toutes les séquences correspondaient au gène désigné plus tard comme DD1-b.
B-2. 3 SEQUENCE DE DD1
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Les séquences des produits des réactions 5'et 3'étant chevauchantes, une séquence consensus de 1075 pb a été obtenue sur la base des clones les plus longs vers chaque extrémité. Cette séquence contient un cadre ouvert de lecture de 858 pb, et plusieurs sites de polyadénylation. Elle code pour une protéine de 286 acides aminés, très hydrophile, qui comporte néanmoins un domaine hydrophobe dans sa partie N-terminale. La séquence d'ADNc ne révèle aucune homologie significative avec les bases de données de séquences.
B. 2. 4- CLONES GENOMIQUES DE DD1
Pour élucider la structure intron/exon et avoir accès au promoteur, il était nécessaire de disposer de clones génomiques. L'amplicon DD1 (SEQ ID NO26, (382 pb) semblait trop petit pour produire une bonne sonde utilisable pour le criblage de banque et la cartographie. Aussi, une amplification par PCR sur ADN génomique a été réalisée, à l'aide des mêmes amorces (SEQ ID N 20 et SEQ ID NO21) que celles utilisées pour la RT-PCR (tableau 10). L'obtention de deux produits de taille supérieure à celle des produits de la RT-PCR a montré qu'il existe dans l'ADN génomique au moins un intron entre les deux amorces spécifiques. Ces deux fragments, d'environ 1,2 kb et 1,5 kb, ont été clonés puis entièrement séquencés. Leurs séquences exoniques comme introniques sont très homologues. Le plus grand fragment contient deux insertions, de 49 et 282 pb, ainsi que 26 délétions ponctuelles. Ceci est une première indication de la présence de deux gènes DD1-a (produit de 1,5 kb) et DD1-b (produit de 1,2 kb) dans le génome du maïs.
Disposant de clones suffisamment longs, une banque d'ADN génomique a été cribléee utilisant comme sonde le fragment d'environ 1,2 kb de DD1-b (SEQ ID NO29). Ce fragment présente suffisamment d'homologie avec le fragment d'environ 1,5 kb de DD1-a pour lui permettre de s'hybrider
<Desc/Clms Page number 84>
avec les deux gènes, mais ne contient pas les insertions qui pourraient correspondre à des séquences répétées, et donc s'hybrider avec d'autres parties du génome sans relation avec les gènes DD1.
Lors du premier criblage, trente clones positifs en autoradiographie ont été obtenus. Les plages de lyse correspondantes ont été prélevées et testées par PCR pour la présence des fragments de 1,5 kb (DD1-a) ou de 1,2 kb (DD1-b). Pour le deuxième tour de criblage, nous avons retenu 3 clones donnant un fragment PCR de 1,5 kb, 2 clones donnant une bande de 1,2 kb, ainsi que 7 clones ne présentant pas de fragment d'amplification. Après hybridation, 8 de ces 12 clones émettaient des signaux, notamment tous ceux qui avaient répondu en PCR. Nous avons donc étalé à nouveau ces clones pour obtenir des plages de lyse isolées. Pour chaque clone, l'ADN d'une plage a été isolé et digéré par les enzymes Sall, Xbal, ainsi que par les deux enzymes simultanément. Une fois hybridées, les membranes de ces digestions nous ont permis d'identifier des fragments de restriction contenant au moins une partie de DD1. Pour un clone lambda DD1-a et un clone lambda DD1-b les fragments de restriction ont été sous-clonés, et les différents types de sous-clones ont été séquencés.
Les séquences obtenues sont répertoriées ici comme SEQ ID NO1 et SEQ ID N 2. Elles contiennent les régions régulatrices, les régions codantes et des régions en aval des gènes DD1-a et DD1-b.
B 2.5 CARTOGRAPHIE DES GENES DD1
La cartographie peut apporter des renseignements sur la fonction d'un gène si celui-ci co-cartographie avec une mutation de phénotype connu.
Pour cartographier les gènes DD1, nous disposions de deux populations de lignées recombinantes stables, issues des croisements Co159xTx303 et T232xCm37. Pour trouver des polymorphismes de longueur des fragments de restriction des gènes DD1, nous avons digéré l'ADN des 4 lignées
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parentales par différentes enzymes. Après hybridation avec une sonde correspondant au clone génomique partiel de DD1-b de 1,2 kb (SEQ ID NO29), plusieurs polymorphismes ont été révélés. La digestion par Xhol montre un polymorphisme entre les parents T232 et Cm37 ; les digestions par Hindlll et Clal entre les lignées Tx303 et Co159 ; enfin les digestions par BamHI, EcoRI, EcoRV, Xbal et Sacl montrent l'existence d'un polymorphisme chez les deux couples de parents. Par ailleurs, le nombre de bandes hybridantes (entre 1 et 4) indique un faible nombre de copies du gène DD1 dans le génome du maïs.
Les gènes DD1 ont été cartographiés en digérant par EcoRI l'ADN de 41 individus Co159xTx303. L'hybridation des membranes avec la même sonde montre la présence de trois fragments de restriction dans chaque plante, dont deux ségrègent de façon indépendante (tableau 12). Comme attendu la sonde de 1,2 kb reconnaît donc deux gènes différents.
TABLEAU 12
Polymorphismes observés après digestion par EcoRI des
ADN de 41 individus Co159xTx303 (classés de gauche à droite), où 1=Co159, 2=Tx303 et x = illisible
Figure img00850001
<tb>
<tb> Gène <SEP> DD1-a <SEP> x1111112122211222121x22112111221212x11121
<tb> Gène <SEP> DD1-b <SEP> 11212112111121112112x2212112222122x21212
<tb>
Figure img00850002

La position exacte des gènes DD1-a et DD1-b par rapport à des marqueurs connus sur la carte génétique du maïs a été déterminée. Le gène DD1-a se trouve sur le bras long du chromosome 8, à la position 130,5 centimorgans, entre le marqueur bn ! 17. 17 et le gène sps1. Le gène DD1-b est situé sur le bras long du chromosome 6, à la position 78 centimorgans, entre les marqueurs pll et tug8.
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Figure img00860001

B 2. 6. EXPRESSION DES DEUX GENES DD1-a ET DE DD1-b
Figure img00860002

Le séquençage de clones génomiques et la cartographie avaient mis en évidence l'existence de deux gènes DD1 dans le génome du maïs.
*Cependant l'expression des deux gènes ne pouvait pas être affirmée par les expériences de RT-PCR et d'hybridation in situ décrites ci-dessus, parce que les amorces et sondes utilisées ne différenciaient pas entre les deux gènes.
La quasi-identité entre tous les clones RACE et le gène DD1-b était une première preuve de l'expression du gène DD1-b. Pour confirmer ce résultat et pour adresser l'expression du gène DD1-a, de nouveaux expériences de RT-PCR ont été entreprises. Les amorces 203-3'et 204-3' (Tableau 10) spécifiques respectivement de DD1-a et de DD1-b ont été testées en combinaison avec l'amorce GM2 (Tableau 10) s'hybridant sur les deux gènes. Sur des ADN plasmidiques contenant soit un fragment DD1-a ou un fragment DD1-b une amplification a été obtenue uniquement avec l'amorce correspondante. Par la suite des ADNc de caryopses de 7 JAP ont été amplifiés avec les couples GM2/203-3'et GM2/204-3'. Une bande hybridant à une sonde DD1 a été obtenue dans les deux cas. Le clonage et séquençage des fragments correspondants a montré qu'il s'agissait d'ADNc de DD1-a et de DD1-b. Par conséquent les deux gènes sont exprimés dans des caryopses de 7 JAP. Par ailleurs le séquençage du produit GM2/203-3' a révélé la présence d'une petite insertion de 54 pb par comparaison au produit GM2/204-3'. Cette séquence a été retrouvée dans l'ADN génomique de DD1-a. La présence de sites d'épissage canoniques à ses extrémités confirme la présence d'un petit exon. Une séquence homologue est présente dans l'ADN génomique de DD1-b, mais absente dans l'ADNc du gène DD1-b (clone RACE et produit GM2/204-3'). Il semblerait alors que les deux gènes DD1 aient assez divergé dans l'évolution pour permettre un épissage alternatif.
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EXEMPLE 2 : Construction de vecteurs recombinants selon l'invention dans lesquels est inséré un acide nucléique comprenant un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur du gène DD1-a ou du gène DD1-b.
Plusieurs vecteurs comprenant un acide nucléique régulateur du gène DD1-a ou du gène DD1-b localisé en amont d'un gène rapporteur, le gène GUS, ont été réalisés.
Le vecteur de départ destiné à recevoir les inserts d'ADN d'intérêt est le vecteur L127a5 représenté dans la figure 7. Le vecteur L127 a 5 ainsi que sa construction sont décrits par BONELLO et al. (2000). Dans cet article, le vecteur L 127 a 5 est désigné prEsr3-GUS.
Pour chacune des séquences régulatrices respectives du gène DD1-a et du gène DD1-b, deux constructions de vecteurs ont été réalisées, chacune des constructions comprenant un fragment long ou au contraire un fragment court de la séquence régulatrice.
Les séquences régulatrices des gènes DD1-a et DD1-b ont tout d'abord été amplifiées par PCR à l'aide d'amorces contenant des sites de restriction.
Après digestion avec des endonucléases de restriction appropriés, les fragments amplifiés des séquences régulatrices sont intégrés dans le plasmide L127a5 représenté à la figure 7 et décrit également dans la demande de brevet français No 99 12305 déposée le 1 er Octobre 1999.
Le tableau 13 ci-après représente schématiquement les différentes constructions réalisées.
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Figure img00880001

Tableau 13
Figure img00880002
<tb>
<tb> construction <SEP> promoteur <SEP> taille <SEP> primer <SEP> 5'site <SEP> primer <SEP> 3'
<tb> promoteur
<tb> L246a <SEP> DD1-a <SEP> 3,0 <SEP> kb <SEP> 203 <SEP> (3, <SEP> 0) <SEP> pst <SEP> Gus <SEP> Xbal
<tb> L246b <SEP> DD1-a <SEP> 1,0 <SEP> kb <SEP> 203 <SEP> (1,0 <SEP> HindIII <SEP> Gus <SEP> Xbal
<tb> L247a <SEP> DD1-b <SEP> 2,5 <SEP> kb <SEP> 204 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> Pst <SEP> ! <SEP> Gus <SEP> Xbal
<tb> L247b <SEP> DD1-b <SEP> 1,6 <SEP> kb <SEP> 204 <SEP> (1, <SEP> 6) <SEP> Pst) <SEP> Gus <SEP> Xba <SEP> !
<tb>
Figure img00880003

amorce 203 (3, 0) ATGCCTGCAGCTACCGCATCGCATTACTGGCTCTG (SEQ DNA13) amorce 203 (1, 0) ATGCAAGCTTTGCATTCACACCCCTAAAG (SEQ ID NO14) amorce 204 (2, 5) ATGCCTGCAGGGGACCTGAGTGAGTTGA (SEQ DNA15) amorce 204 (1, 6) ATGCCTGCAGGAGATGCCAAGAATAAAGGGTAAAG (SEQ DNA16) amorce Gus ATGCTCTAGATTTGTAAGGATGGTTATATTTCTCT (SEQ ID NO17) Adaptateurs utilisés : adaptateur JFB34 TCGACTGCAGCCCA
GACGTCGGGTTCGA adaptateur JFB56 CTAGACCCGAATTCGC
TGGGCTTAAGCGCCGG
Le vecteur L246a a été construit après introduction d'une séquence d'environ 3 kb du promoteur du gène DD1-a après amplification d'un fragment génomique de ce gène à l'aide du couple d'amorces de séquences SEQ ID ? 13 (amorce 203 (3, 0)) et SEQ ID D ? 17 (amorce GUS) puis digestion par les endonucléases de restriction Pstl et Xbal. (Figure 8).
Le vecteur L246b a été obtenu par introduction dans le vecteur L127a5 d'un acide nucléique constituant le produit d'amplification d'un fragment génomique du gène DD1-a à l'aide du couple d'amorces de séquences SEQ ID D N 14 (amorce 203 (1, 0)) et SEQ ID BN 17 (amorce GUS), avant digestion par les endonucléases de restriction HindIII et Xbal. (Figure 9).
Le vecteur L247a a été obtenu par l'introduction dans le vecteur L127a5 d'un acide nucléique constituant le produit d'amplification d'un
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Figure img00890001

fragment génomique du gène DD1-b à l'aide du couple d'amorces de séquences SEQ ID ? 15 (amorce 204 (2, 5)) et SEQ ID ? 17 (amorce GUS) avant digestion par les endonucléases de restriction Pstl et Xbal. (Figure 10).
Le vecteur L247b a été réalisé par l'introduction dans le vecteur L127a5 d'un fragment d'amplification génomique obtenu à l'aide du couple d'amorces SEQ ID ? 16 (amorce 204 (1, 6)) et SEQ ID ? 17 (amorce GUS), avant digestion par les endonucléases de restriction Pst ! et Xbal. (Figure 11).
L'ADN génomique du gène DD1-a de départ utilisé pour amplifier les séquences d'intérêt destinées à être introduites dans les vecteurs L246a et L246b est contenu dans le plasmide L203b23, qui comprend un insert d'ADN génomique de 6 kb cloné avec les enzymes Sali et Xbal dans le vecteur pBCSK+ commercialisé par la Société Stratagene.
Le matériel de départ pour l'amplification des inserts d'ADN d'intérêt du gène DD1-b est le plasmide L204b17 qui comprend 12 kb d'un insert d'ADN génomique cloné avec l'enzyme Xbal dans le vecteur pBCSK+ commercialisé par la Société Stratagene.
Les fragments d'ADN génomique proviennent de clones lambda EMBL3 SP6/T7 d'une banque génomique du génotype HD5xHD7 obtenue après digestion partielle avec l'enzyme Sau3A décrite à l'exemple 1, au paragraphe A. 8 de la section Matériels et Méthodes .
Les références pour le plasmide L127a5 sont les suivantes : - plasmide pBSSK+. commercialisé par la Société Stratagene ; - plasmide pBI101 décrit par JEFFERSON et al., 1987 EXEMPLE 3 : Obtention de plantes transgéniques transformées par un transgène comprenant un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle d'une séquence régulatrice selon l'invention.
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La transformation d'une plante dans le but d'obtenir une expression stable du polynucléotide d'intérêt dans la plante transformée est nécessaire pour assurer une modification durable du grain de maïs. Des essais sont réalisés avec une construction de vecteurs L246a, L246b, L247a et L247b décrits à l'exemple 2.
4-1 CANON A PARTICULES
La méthode utilisée repose sur l'utilisation d'un canon à particules identique à celui décrit par FINER (1992).
Les cellules cibles sont des cellules indifférenciées en divisions rapides ayant conservé une aptitude à la régénération de plantes entières.
Ce type de cellules compose le cal embryogène (dit de type Il) de maïs. Ces cals sont obtenus à partir d'embryons immatures de génotype Hill selon la méthode et sur les milieux décrits par ARMSTRONG (1994). Des fragments de tels cals d'une surface de 10 à 20 mm2 ont été disposés, 4 h avant bombardement, à raison de 16 fragments par boîte au centre d'une boîte de Pétri contenant un milieu de culture identique au milieu d'initiation, additionné de 0,2M de mannitol + 0,2 M de sorbitol. Les plasmides décrits dans les exemples précédents et portant les gènes à introduire, sont purifiés sur colonne QiagenRen suivant les instructions du fabricant. Ils sont ensuite précipités sur des particules de tungstène (M10) en suivant le protocole décrit par KLEIN (1987). Les particules ainsi enrobées sont projetées vers les cellules cibles à l'aide du canon et selon le protocole décrit par J. FINER (1992). Les boîtes de cals ainsi bombardées sont ensuite scellées à l'aide de Scellofra puis cultivées à l'obscurité à 27 C. Le premier repiquage a lieu 24 h après, puis tous les quinze jours pendant 3 mois sur milieu identique au
Figure img00900001

milieu d'initiation additionné d'un agent sélectif. On obtient après 3 mois ou parfois plus tôt, des cals dont la croissance n'est pas inhibée par l'agent sélectif, habituellement et majoritairement composés de cellules résultant de la division d'une cellule ayant intégré dans son patrimoine génétique une ou
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plusieurs copies du gène de sélection. La fréquence d'obtention de tels cals est d'environ 0, 8 cal par boîte bombardée.
Ces cals sont identifiés, individualisés, multipliés puis cultivés de façon à régénérer des plantules, en modifiant l'équilibre hormonal et osmotique des cellules selon la méthode décrite par VAIN et al. (1989). Ces plantes sont ensuite acclimatées en serre où elles peuvent être croisées pour l'obtention d'hybrides ou autofécondées.
5.2 Transformation par Acrobacterium
Une autre technique de transformation utilisable dans le cadre de l'invention utilise Agrobacterium tumefaciens, selon le protocole décrit par ISHIDA et al. (1996), notamment à partir d'embryons immatures de 10 jours après la fécondation. Tous les milieux utilisés sont référencés dans la référence citée. La transformation débute avec une phase de co-culture où les embryons immatures des plantes de maïs sont mis en contact pendant au moins 5 min avec Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 contenant les vecteurs superbinaires. Le plasmide superbinaire est le résultat d'une recombinaison homologue entre un vecteur intermédiaire porteur de l'ADN-T contenant le gène d'intérêt et/ou le marqueur de sélection dérivé des plasmides décrits dans les exemples précédents, et le vecteur pSB1 de Japan Tobacco (EP 672 752) qui contient : les gènes virB et virG du plasmide pTiBo542 présent dans la souche supervirulente A281 d'Agrobacterium tumefaciens (ATCC 37349) et une région homologue retrouvée dans le vecteur intermédiaire permettant cette recombinaison homologue. Les embryons sont ensuite placés sur milieu LSAs pendant 3 jours à l'obscurité et à 25OC. Une première sélection est effectuée sur les cals transformés : les cals embryogènes sont transférés sur milieu LSD5 contenant de la phosphinotricine à 5 mg/1 et de la céfotaxime à 250 mg/1 (élimination ou limitation de la contamination par Agrobacterium tumefaciens). Cette étape
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Figure img00920001

est menée 2 semaines à l'obscurité et à 25OC. La deuxième étape de sélection est réalisée par transfert des embryons qui se sont développés sur milieu LSD5, sur milieu LSD10 (phosphinotricine à 10 mg/1) en présence de céfotaxime, pendant 3 semaines dans les mêmes conditions que précédemment. La troisième étape de sélection consiste à exciser les cals de type 1 qui restent blancs (fragments de 1 à 2 mm) et à les transférer 3 semaines à l'obscurité et à 25 C sur milieu LSD 10 en présence de céfotaxime.
La régénération des plantules est effectuée en excisant les cals de type 1 qui ont proliféré et en les transférant sur milieu LSZ en présence de phosphinotricine à 5 mg/1 et de céfotaxime pendant 2 semaines à 22 C et sous lumière continue.
Les plantes ayant régénéré sont transférées sur milieu RM + G2 contenant 100 mg/1 d'Augmentin pendant 2 semaines à 22 C et sous illumination continue pour l'étape de développement. Les plantes obtenues sont alors transférées au phytotron en vue de leur acclimatation.
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TABLEAU 14 Séquences de l'invention
Figure img00930001
<tb>
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> N
<tb> 1 <SEP> acide <SEP> nucléique <SEP> génomique <SEP> du <SEP> gène <SEP> DD1-a
<tb> 2 <SEP> acide <SEP> nucléique <SEP> génomique <SEP> du <SEP> gène <SEP> DD1-b
<tb> 3 <SEP> acide <SEP> nucléique <SEP> régulateur <SEP> du <SEP> gène <SEP> DD1-a
<tb> 4 <SEP> acide <SEP> nucléique <SEP> régulateur <SEP> du <SEP> gène <SEP> DD1-b
<tb> 5 <SEP> région <SEP> codante <SEP> du <SEP> gène <SEP> DD1-a
<tb> 6 <SEP> région <SEP> codante <SEP> du <SEP> gène <SEP> DD1-b
<tb> 7 <SEP> ADNc <SEP> du <SEP> gène <SEP> DD1-a
<tb> 8 <SEP> ADNc <SEP> du <SEP> gène <SEP> DD1-b
<tb> 9 <SEP> polypeptide <SEP> codé <SEP> par <SEP> DD1-a
<tb> 10 <SEP> famille <SEP> de <SEP> polypeptides <SEP> codés <SEP> par <SEP> DD1-b
<tb> 11 <SEP> polypeptide <SEP> variant <SEP> DD1-b
<tb> 12 <SEP> polypeptide <SEP> variant <SEP> DD1-b
<tb> 13-25,27-28 <SEP> amorces
<tb> 30-32
<tb> 26 <SEP> et <SEP> 29 <SEP> sondes
<tb>
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Claims (42)

REVENDICATIONS
1. Acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO1 et SEQ ID NO2, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
2. Acide nucléique selon la revendication 1 comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID n 3, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
3. Acide nucléique selon la revendication 1 comprenant un polynucléotide régulateur de l'expression d'une séquence nucléotidique d'intérêt chez une plante, ledit polynucléotide régulateur comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID No 3, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
4. Acide nucléique selon la revendication 1 comprenant un polynucléotide régulateur de l'expression d'une séquence nucléotidique d'intérêt chez une plante, ledit polynucléotide régulateur comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO 4, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
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5. Acide nucléique selon l'une des revendications 3 et 4, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique d'intérêt placée sous le contrôle du polynucléotide régulateur.
6. Acide nucléique selon la revendication 1 comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO 5, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
7. Acide nucléique selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID ? 9.
8. Acide nucléique selon la revendication 7 comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO 7, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
9. Acide nucléique selon la revendication 1 comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO 6, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
10. Acide nucléique selon la revendication 9, caractérisé en ce'il code pour un polypeptide possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID NO 10.
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11. Acide nucléique selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID No 11.
12. Acide nucléique selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID NO 12.
13. Acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
14. Acide nucléique selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les séquences SEQ ! D ? 13 à 17 et 20 à 32.
15. Acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 13 et 14, caractérisé en ce qu'il est marqué par une molécule détectable.
16. Vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression comprenant un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 15.
17. Vecteur recombinant pour l'expression d'un polynucléotide d'intérêt dans la zone de transfert d'un grain de végétal en développement comprenant : a) un acide nucléique selon l'une des revendications 3 et 4 ; et b) un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle de l'acide nucléique défini en a).
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18. Vecteur recombinant d'expression comprenant : a) un acide régulateur de l'expression d'un polynucléotide d'intérêt dans un organisme hôte déterminé ; et b) un polynucléotide d'intérêt constitué d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 et 6 à 12, le polynucléotide d'intérêt défini en b) étant placé sous le contrôle de l'acide nucléique régulateur défini en a).
19. Vecteur recombinant selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il s'agit du vecteur contenu dans la souche Escherichia coli déposée à la CNCM le 4 Octobre 2000 sous le Numéro d'accès 1-2567. [L246a]
20. Vecteur recombinant selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il s'agit du vecteur contenu dans la souche Escherichia coli déposée à la CNCM le 4 Octobre 2000 sous le Numéro d'accès 1-2568. [L247a]
21. Cellule hôte transformée par un acide nucléique selon l'une quelconques des revendications 1 à 15 ou par un vecteur recombinant selon l'une des revendications 17 à 20.
22. Cellule hôte recombinante selon la revendication 21 caractérisée en ce qu'elle est d'origine bactérienne ou végétale.
23. Cellule hôte selon la revendication 21, caractérisée en en ce qu'il s'agit d'une cellule de la souche de Escherichia coli déposée à la CNCM le 4 Octobre 2000 sous le Numéro d'accès 1-2567 [L246a]
24. Cellule hôte selon la revendication 21, caractérisée en en ce qu'il s'agit d'une cellule de la souche de Escherichia coli déposée à la CNCM le 4 Octobre 2000 sous le Numéro d'accès 1-2568 [L247a]
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25. Cellule hôte selon la revendication 21, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule de plante.
26. Plante transformée par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 14 ou par un vecteur recombinant selon l'une des revendications 16 à 20.
27. Procédé d'obtention d'une plante transgénique caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) obtention d'une cellule hôte recombinante végétale selon l'une des revendications 21 et 24 ; b) Régénération d'une plante entière à partir de la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a) ; c) Sélection des plantes obtenues à l'étape b) ayant intégré un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 14.
28. Procédé d'obtention d'une plante transgénique caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) Obtention d'une cellule hôte recombinante d'Agrobacterium tumefaciens selon la revendication 22 ; b) Transformation d'une plante d'intérêt par infection avec la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a) ; c) Sélection des plantes ayant intégré dans leur génome un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 14.
29. Procédé d'obtention d'une plante transgénique caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes :
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a) transfecter une cellule de plante avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 14 ou avec un vecteur recombinant selon l'une des revendications 16 à 20 ; b) régénérer une plante entière à partir des cellules de plante recombinantes obtenues à l'étape a) ; c) sélectionner des plantes ayant intégré dans leur génome un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 14.
30. Procédé d'obtention d'une plante transgénique selon l'une des revendications 27 à 29, caractérisé en ce qu'il comporte en outre les étapes de : d) croisement entre elles de deux plantes transgéniques telles qu'obtenues à l'étape c) ; e) sélection des plantes homozygotes pour le transgène.
31. Procédé d'obtention d'une plante transgénique selon l'une des revendications 27 à 29, caractérisé en ce qu'il comporte en outre les étapes de : f) croisement d'une plante transgénique obtenue à l'étape c) avec une plante de la même espèce ; g) sélection des plantes issues du croisement de l'étape d) ayant conservé le transgène.
32. Plante transgénique, telle qu'obtenue selon le procédé selon l'une des revendications 27 à 31.
33. Semence d'une plante transgénique selon la revendication 32.
34. Polypeptide codé par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 12.
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Figure img01070001
35. Polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID ? 9 ou polypeptide possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N 9, ou un fragment ou un variant de celui-ci.
36. Polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID ? 10 ou polypeptide possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ D N 10 ou un fragment ou un variant de celui-ci.
37. Polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID N 11 ou polypeptide possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N 11 ou un fragment de celui-ci.
38. Polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID ? 12 ou polypeptide possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ D N 12 ou un fragment de celui-ci.
39. Anticorps dirigé contre un polypeptide selon l'une des revendications 35 à 38.
40. Procédé pour détecter la présence d'un polypeptide selon l'une des revendications 35 à 38 dans un échantillon comprenant les étapes de : a) mise en contact de l'échantillon avec un anticorps selon la revendication 39 ; b) détection du complexe antigène/anticorps formé
41. Nécessaire ou kit pour la détection d'un polypeptide selon l'une des revendications 35 à 38 dans un échantillon, comprenant : a) un anticorps selon la revendication 39 ; b) le cas échéant, un ou plusieurs réactifs nécessaires à la détection du complexe antigène/anticorps formé.
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42. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 2 à 5 pour l'obtention d'une plante transformée à qualité agronomique, alimentaire ou industrielle améliorée.
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