EP1385966A2 - Rekombinante fusionsproteine und deren trimere - Google Patents

Rekombinante fusionsproteine und deren trimere

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EP1385966A2
EP1385966A2 EP02769144A EP02769144A EP1385966A2 EP 1385966 A2 EP1385966 A2 EP 1385966A2 EP 02769144 A EP02769144 A EP 02769144A EP 02769144 A EP02769144 A EP 02769144A EP 1385966 A2 EP1385966 A2 EP 1385966A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
recombinant fusion
component
fusion protein
trimer
protein
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02769144A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jürg TSCHOPP
Pascal Schneider
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Topotarget Switzerland SA
Original Assignee
Apoxis SA
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Filing date
Publication date
Application filed by Apoxis SA filed Critical Apoxis SA
Publication of EP1385966A2 publication Critical patent/EP1385966A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to recombinant fusion proteins with the property of being able to form trimers, the recombinant fusion proteins having at least one component A and at least one component B, component B having trimerizing properties and component A having biological properties, and trimers of these recombinant fusion proteins. Furthermore, the present invention relates to the use of such trimers for the production of a medicament or their use for in-vitro diagnosis or for the production of an in-vitro diagnostic agent.
  • DNA sequences which code for such a fusion protein, as well as expression vectors and host cells which contain the DNA sequence or the expression vector, are also the subject of the present invention.
  • Proteins that occur physiologically as trimers are abundant in nature. Due to interactions on the surfaces of these proteins that trim trimers in solution, there can be spontaneous or, for example, kinetic delays because of concentration- or milieu-dependent aggregation of proteins. Hydrophobic interactions, hydrogen bonds, covalent bonds, for example disulfide bonds, and / or Coulomb forces are responsible for this.
  • structural motifs can be found with certain proteins, which lead to the formation of specific structure-related intermolecular super secondary structures and thus - in addition to other multimerization states - to protein trimers. The formation of super secondary structures is based on characteristic amino acid sequences of the proteins that form these trimers.
  • coiled-coil triple helices can be mentioned as super-secondary structures, which bring about a trimerization of proteins through interactions of characteristic ⁇ -helices which occur with each of the proteins forming the coiled-coil form.
  • the coiled-coil triple helix as an intermolecular "trimerization domain" of proteins is structurally represented as a three-strand, twisted superhelix.
  • Such coiled-coil motifs with a triple helix character occur particularly in extracellular protein trimers, but very particularly in proteins or protein complexes connective tissue.
  • CMP Cartilage Matrix Protein
  • the structure of collagen fibers is characterized by tropocollagen, which consists of three helical twisted polypeptides.
  • the protofibril of a hair is also made up of a triple helix made of ⁇ -Keratm with the motif "Coiled-Coil", albeit left-handed.
  • the proteins Clq, collagen ⁇ l (X), ⁇ 2 (VII), the wintering protein, ACRP30, the inner ear structural protein, the cerebellin and the multimerin are known as the protein family under the name Clq family have been summarized (Kischore and Reid, Immunopharmacol., 42 (1999) 15-21), which are present as higher aggregates of trimers, for example.
  • the structure of the protein Clq known from the complement system is characterized by monomers, each of which has a globular so-called "head domains and a" collagen-like "helical sequence section.
  • the a mono-coil triple helix forms trimerize the monomers, and six of these Clq trimers in turn form an oligomer, whereby the oligomerization of the protein trimers is based on interactions between the individual coiled-coil triple helices.
  • multi- (oligo-) merized protein complex Clq to a structure called "bouquet", whereby it is ensured that 18 globular, C-terminally arranged "head domains are connected to a hexamer of trimers.
  • Proteins from the class of the collectins are also known from the literature, which are characterized by a collagen-like domain, a neck region and moreover by a globular carboxy-terminal lectin binding domain.
  • the col lectins occur physiologically as oligomers of trimers.
  • the proteins Lung Surfactant Protein A (SP-A) and the mannose binding protein (MBP), each from the Collectine family trimerize through the interactions of their "collagen-like" domain and ultimately exist as hexamers of trimers (Epstein et al., Current Opinion in Immunology, Vol. 8, No. 1, 1996, 29-35).
  • the proteins known under the name Collectine also form oligomers (for example hexamers) of multimers (for example trimers).
  • FasL membrane-arranged FasL is biological, i.e. apoptotic, effective, whereas after the extracellular protein section has been split off from the membrane-bound section (so-called sFasL), this non-membrane-bound sFasL fraction can no longer physiologically produce an apoptotic effect on target cells.
  • sFasL membrane-bound FasL
  • sFasL trimers which - as explained above - are obtained after cleavage from the membrane-containing protein section, nevertheless by the use of cross-linking antibodies can be reactivated with regard to their physiological function.
  • a fusion protein consisting of the trimerization domain from FasL, a short linker sequence and a flag marker (with the flag amino acid sequence (one-letter code) DYKDDDDK) was constructed, expressed, and such non-structural (ie not over specific secondary structure interactions resulting in the formation of a super secondary structure) trimerized fusion proteins cross-linked by antibodies directed against the flag marker
  • the unpublished German patent application DE 19963859 discloses Bieder oligomers of di-, tri-, quattro- or pentamers, ie higher-order aggregates, which are made up of recombinant fusion proteins which comprise two components A and B.
  • the recombinant fusion proteins can have, for example, a TNF cytokine as component A and as Component B is a protein segment that connects the recombinant fusion proteins into higher-order aggregates.
  • trimers of recombinant fusion proteins which have at least one component A and at least one component B, component A comprising a protein or a protein segment with a biological function, in particular with a binding function, and the component B comprises a protein or a protein segment which trimerizes the recombinant fusion proteins without the action of third molecules, ie produces a trimer of biologically active components A.
  • trimers are thus provided which cannot form higher-order aggregates, for example dimers of trimers, but rather in solution essentially, at least 90%, preferably at least 95% and very particularly preferably at least 99% , each based on the total number of trimers, are present as trimerized recombinant fusion proteins.
  • a protein or protein segment with a biological function are, in particular, proteins which have a ligand function, very particularly for antibodies or receptors (i.e.
  • amino acid sequences with covalently or non-covalently coupled active substances for example amino acid sequences with covalently or non-covalently coupled active substances (possibly of an organic-chemical nature)
  • antibodies or sections of antibodies with paratopes or also hormones for example peptide horns.
  • the present invention is based on the knowledge that signal proteins in particular, or whose sections or derivatives are used according to the invention as component A, are only biologically active as higher-order aggregates, but bind to receptors as trimers in vitro and in vivo, but do not bind them activate, but rather competitively occupy the binding sites and can not trigger a biologically activating signal, but only block.
  • cleavage products which comprise the extramembrane, in particular the extracellular protein segments, are preferred as component A of a trimerizing recombinant signal protein.
  • amino acid sequences that can act as antigens can also be used as component A in the recombinant fusion protein.
  • receptors e.g. Receptors from the TNF receptor family (e.g. FasR), or sections or derivatives of such receptors are used that also have a binding function (thus interact as a binding partner with another molecule, e.g. membrane-bound FasL) and i.S. the present invention therefore also fall under the term "ligand". Binding fragments of biological receptors of this type are particularly suitable for use as medicaments when the complementary biological ligand is present in the patient in unphysiologically high concentrations
  • components A which are present in trimers according to the invention can have identical components A (homotrimers) or different components A (heterotrimers), ie different ones recombinant fusion proteins form a trimer according to the invention.
  • proteins with different components A possibly with different biological functions, can be linked in the trimer according to the invention.
  • component A of two recombinant proteins can be identical and the third fusion protein can differ with regard to component A, or all three fusion proteins can also differ with regard to component A.
  • the arrangement, the specific combination and / or the number of components A in the trimer typically finely modulated inhibitory, possibly in combination with activating, effects can be achieved.
  • component A in the recombinant fusion protein is a peptide hormone, a growth factor, a cytokine, an interleukin or a section thereof, preferably a bondable section.
  • functional derivatives of the abovementioned peptides, protein segments and / or proteins can also be used as component A in the recombinant fusion protein which is part of a trimer according to the invention.
  • its component A comprises a receptor, for example a receptor for a peptide hormone, a growth factor, a cytokine, an interleukin, or component A of the fusion protein according to the invention is a section or a Derivative of such a receptor.
  • a receptor for example a receptor for a peptide hormone, a growth factor, a cytokine, an interleukin, or component A of the fusion protein according to the invention is a section or a Derivative of such a receptor.
  • a receptor for a peptide hormone, a growth factor, a cytokine, an interleukin, or component A of the fusion protein according to the invention is a section or a Derivative of such a receptor.
  • FasR hereinafter also referred to simply as Fas
  • Functional derivatives of biologically active proteins, protein segments or peptides are in particular those proteins which maintain the biological function, in particular the binding property to the interaction partner, for example the membrane-bound receptor, but nevertheless have sequence differences from the corresponding native sequences.
  • sequence deviations gene can be one or more insertion (s), deletion (s) and / or substitutions), preference being given to a sequence homology of at least 70% and a sequence homology of at least 85% between the derivative used and the native sequence stronger and at least 90% is very particularly preferred.
  • the term functional derivatives includes those amino acid sequences which have conservative substitution with respect to the physiological sequences. Conservative substitutions are substitutions in which amino acids from the same class are exchanged for one another.
  • amino acids with aliphatic side chains, positively or negatively charged side chains, aromatic groups in the side chains or amino acids whose side chains can form hydrogen bonds for example side chains which have a hydroxyl function.
  • an amino acid with a polar side chain is replaced by another amino acid with a likewise polar side chain or, for example, an amino acid characterized by a hydrophobic side chain is substituted by another amino acid with a likewise hydrophobic side chain (eg serine (threonine) by threonine (serine) or leucine (isoleucine) by isoleucine (leucine)).
  • Insertions and substitutions are possible, in particular, at those sequence positions that do not change the three-dimensional structure or affect the binding region.
  • a change in a three-dimensional structure through insertion (s) or deletion (s) can be easily checked, for example, with the aid of CD spectra (circular dichroism spectra) (Urry, 1985, Absorption, circular dichroism and ORD of Polypeptides, in: Modern Physical Methods in Biochemistry, Neuberger et al. (ed.), Elsevier, Amsterdam).
  • Suitable methods for producing proteins with amino acid sequences which have substitutions for the (the) native sequences are disclosed, for example, in the publications US Pat. No. 4,737,462, US Pat. No. 4,588,585, US Pat. No.
  • a ligand can therefore also be a protein that is normally referred to as a receptor.
  • a receptor can also "ligand" i.S. of this invention, e.g. when communicating with its interaction partner, e.g. a signaling molecule binds.
  • a trimer of recombinant fusion proteins is particularly preferred when component A in the recombinant fusion protein is a cytokine from the TNF cytokine family, a section of such a TNF cytokine or a functional derivative of a TNF cytokine or a corresponding TNF cytokine section
  • the biological effect of the TNF cytokines used in the target cells by binding to the corresponding receptors in vivo can, for example, produce apoptotic, proliferative or activating effects, but typically only as a trimer ensure binding to the respective receptor, but no longer perform the activating function.
  • the proteins CD40L, FasL, TRAIL, TNF (in particular TNF which binds to the receptor TNF-R2), CD30L and EDA or their sections or derivatives are very particularly preferred.
  • Extracellular sections of the aforementioned membrane-bound TNF cytokines or their functional derivatives are preferably used as component A in the recombinant fusion protein.
  • component A of the recombinant fusion protein is part of the invented Trimers according to the invention is selected from the group consisting of hFasL (AA 139-281), hTRAIL (AA 95-281), hCD40L (AA 116-261) and m or hTNF ⁇ (AA 77-235).
  • Component A selected for a recombinant fusion protein which is to become part of an oligomer according to the invention is already in solution as a trimer.
  • component B will only intensify the trimerization of component A. This situation occurs, for example, when component A, for example a TNF ligand or a section or derivative thereof, which is typically trimerized already in solution, is to be further stabilized in its trimeric form by component B.
  • component A of a recombinant fusion protein as such does not show a timer structure mediated by surface interaction in solution or in vivo
  • component B according to the invention will have to ensure trimerization of component A of the recombinant fusion proteins.
  • the latter typically occurs, for example, when only portions of the native protein are used as component A of the recombinant fusion protein which, as such, cannot trimerize or at least do not exist as trimer in vivo because, for example, the equilibrium is strongly shifted to the side of the monomer is, for example, sections of cytokines, in particular C-terminal sections (for example comprising at least 100 AS (each calculated from the C-terminus), preferably at least 120 AS and particularly preferably at least 150 AS from the C-terminus) of FasL, CD40L, CD30L, TRAIL, EDA or TNF.
  • C-terminal sections for example comprising at least 100 AS (each calculated from the C-terminus), preferably at least 120 AS and particularly preferably at least 150 AS from the C-terminus) of FasL, CD40L, CD30L, TRAIL, EDA or TNF.
  • component A of the recombinant fusion protein can also be an amino acid sequence according to the present invention which is suitable for acting as a carrier for a receptor agonist or receptor antagonist.
  • a small organic chemical molecule active as a pharmacologically active substance can typically be covalently coupled to such an amino acid sequence, for example via an ether linkage to threonine or serine, an amide-like linkage or via an ester linkage.
  • Coupled agonists or antagonists of this type can increase the binding constant of a trimer according to the invention, preferably to values of at least 10 * 9 M "1 , or modulate the biological effect, in particular to increase the inhibitory behavior of a trimer according to the invention, in particular with regard to the inhibition of the triggering of the apoptotic signal cascade.
  • a trimer according to the invention can be used as a carrier of pharmacologically active substances In this way, a pharmacological active ingredient can be selectively brought into the spatial vicinity of certain cells which represent the pharmacological point of attack of these active ingredients by the choice of a corresponding carrier trimer according to the invention.
  • the coupling of such an active ingredient to a FasL trimer the Binding of the FasL trimer blocks the FasR (and thus inhibits apoptosis according to the invention, thus ensuring the cell's survival) while the active substance is applied directly to the target cell
  • the active ingredient combines cytotoxic substances with the trimer that prevent an attack by immune cells against the target cells, for example in the case of degenerative, in particular neurodegenerative, diseases, especially Parkinson's disease or Alzheimer's disease.
  • Parkinson's disease the destruction of the dopamine-producing cells in the substantia nigra can be prevented in this way according to the invention.
  • the use of such systems of the carrier according to the invention and, if appropriate, covalently coupled active component as pharmaceuticals in human or veterinary medicine is disclosed
  • Component B of the recombinant fusion protein will typically be a protein from the family of the Clq proteins or the Collectine.
  • the proteins of the Clq or collectin family are particularly preferred as part of the recombinant fusion protein, namely as component B, when only their trimerization domain but not their oligomerization domain is transcribed or translated as part of the recombinant fusion protein.
  • Component B in the recombinant fusion protein preferably also does not contain the globular "Kop domain which is characteristic of the aforementioned proteins in the native state.
  • the aforementioned component B in a recombinant fusion protein according to the invention will therefore have a sequence which typically only contains, for example, the collagen type Section that contains the functionality for trimerization Formation of a triple helix, but not those sequence sections which also have the ability to enter into a bi- or oligomer structure (for example a tetra- or hexamer of for example triple helices) with other triple helices.
  • a bi- or oligomer structure for example a tetra- or hexamer of for example triple helices
  • the trimerizing fusion protein will only have the domains of the proteins from the families of the Clq proteins or collectins as component B responsible for the trimerization, while their respective "head domains" by other proteins or protein segments which also perform a biological function than Component A.
  • the term "recombinant fusion protein” is therefore to be understood in the context of the present invention in such a way that the at least one component A and the at least one component B in the recombinant fusion protein are artificially fused, ie that a fusion protein as defined by the present invention does not correspond to a naturally occurring protein
  • component B becomes the corresponding sequence segments of the proteins Clq, MBP, SP-A (“lung surfactant protein A”), SP-D (“lung surfactant protein D”), BC (bovine serum ⁇ glutinin), and CL43 (bovine Collectin-43) and / or ACRP30 or functional derivatives of these protein segments.
  • Trimers of recombinant fusion proteins are particularly preferred when component B of the recombinant fusion protein is a protein segment of the Clq protein or the ACRP30 protein with a sequence segment of at least 8 AA length, typically at least 20 AA length from the collagen-like sequence regions which form a triple helix, or has a functional derivative thereof.
  • a very particularly preferred embodiment of the present invention are trimers of recombinant fusion proteins whose component B is an amino acid sequence according to FIG. 1 (framed sequence, AS 45 to 111) or a functional derivative of this murine (m: murine) amino acid sequence (e.g. the analog human sequence or the analog sequence of another mammal) or a section of this sequence
  • Trimers of such fusion proteins which have sequences from different host organisms are particularly preferred. Aggregates according to the invention are very particularly preferred if they originate from chimeric fusion proteins, component A originating from a different animal species than component B. In this way it can be advantageous for component A to be an amino acid sequence from the mouse, rat, pig or a other vertebrates, in particular from a mammal, or a functional derivative thereof and component B is of human origin or vice versa. On the other hand, the sequences of component A and component B in a fusion protein according to the invention, which forms a trimer according to the invention, but also from the same animal species.
  • the recombinant fusion proteins are trimerized by a short amino acid sequence of more than 6 amino acids, preferably from 8 to 30, very particularly preferably from 8 to 20 amino acids, which is present as component B in the recombinant fusion proteins Trimerization of fusion proteins achieved by means of these short amino acid sequences is typically based on the formation of super-secondary structures, in particular on the formation of "coiled-coil" triple helices.
  • all sequence sections of proteins which generate trimers through the formation of super-secondary structures are suitable, for example typical ones Collagen-like triple helices or sections thereof (such as those used for the proteins CMP, COMP, collagen or laminin).
  • component B of the recombinant fusion protein which leads to trimerization should essentially not form any higher aggregates
  • component B should typically not have any cysteine residue which can form an intermolecular disulfide bridge.
  • Component B in a recombinant fusion protein is therefore preferably no cysteine residue or only those cysteine residues which have an intramolecular disulfide bridge, that is to say in the recombinant fusion protein itself have to avoid that under oxidizing conditions a covalent linkage with the at least one cysteine residue of a fusion protein of another trimer can occur.
  • the fusion protein can have additional sequence segments.
  • tag sequences for example at least one flag tag, that is to say the amino acid sequence DYKDDDDK, and / or, for example, at least one His tag (containing several consecutive histidines, for example at least 5). and / or further tag or antigenic sequences.
  • the individual sections (components A, B or tag sequences, where two or more components A can also occur in the fusion protein according to the invention) of a fusion protein according to the invention can be separated from one another by linker sequences.
  • linker sequences (at least 2 AA, preferably at least 5 AA) are used for the structural separation of the various functional components in the recombinant fusion protein and can preferably also take on a "hinge" function, i.e. represent an amino acid sequence of flexible structure.
  • Linkers which contain at least one proteolytic interface which allows component A to be separated from component B are particularly preferred.
  • the proteolytic interface in the linker is preferably a thrombin consensus sequence.
  • Component A can in principle be arranged at the C or N terminal of component B, preferably at the C terminal.
  • the tag sequences can occur at any position of a recombinant fusion protein according to the invention, preferably at the N-pinus.
  • methods which serve to block cellular extramembrane receptors.
  • Such methods are characterized by recombination of at least one component A, which corresponds to a protein or protein segment with a biological function, with at least one trimerizing component B, with first (a) such a recombinant fusion protein is expressed, for example in an expression vector, (b) is isolated and then (c) is added for in vitro investigations of a cell culture, for example a cell suspension.
  • the present method is therefore suitable for protecting cells from apoptotic cell death, for example, for in vitro investigations.
  • Such cells with trimers according to the invention bound according to the method can then be used for further in vitro investigations or also for the production of a medicament.
  • Such cells treated in vitro can be retransplanted.
  • Such a procedure can be used for autoimmune diseases or degenerative diseases in order to protect the cells from apoptotic destruction in vivo.
  • component A is a TNF cytokine, a section of a TNF cytokine or a functional derivative of such a protein or protein section
  • Trimers of the present invention are suitable for the production of a medicament or for the treatment of diseases or disorders for medical use, ie for both human and veterinary use, in particular when component A is a signal protein or a portion of such or a derivative of the protein or section is a wide spectrum of diseases or disorders can be treated with the trimers claimed according to the invention (hetero- or homotrimers). They are used in particular when increased extracellular concentrations of the corresponding physiological ligands or an increase in the number of membrane-bound receptors occur / occur in a clinical picture.
  • trimers according to the invention can be used, for example, for the manufacture of a medicament for the treatment of hyperinflammatory disorders, autoimmune disorders, disorders based on hyperapoptotic reactions, or degenerative, in particular special neurodegenerative diseases (e.g. Parkinson's disease), possibly also viral infections. Trimers according to the invention are particularly suitable when the disease necessitates treatment which would like to prevent the biological action of native cytokines, ie serves to block corresponding cytokine receptors.
  • Examples include: treatment of viral hepatitis (HBV, HCV), Alcohol-induced hepatitis diseases, chelestatic hepatitis, Wilson's disease, hepatitis due to autoimmune disorders, rejection reactions after liver transplantation, GvHD, TEN (toxic epidermal necrolysis), Hashimoto's thyroiditis or multiple sclerosis.
  • HBV viral hepatitis
  • HCV Alcohol-induced hepatitis diseases
  • chelestatic hepatitis Wilson's disease
  • hepatitis due to autoimmune disorders rejection reactions after liver transplantation
  • GvHD TEN (toxic epidermal necrolysis), Hashimoto's thyroiditis or multiple sclerosis.
  • Another object of the present invention are DNA sequences which code for fusion proteins of the aforementioned type. Such DNA sequences are expressed in expression vectors, the corresponding expression vectors which contain a DNA sequence for the fusion proteins according to the invention also being the subject of the invention.
  • the present invention furthermore includes those host cells which are transfected with DNA sequences which code for the fusion proteins according to the invention. In this context, host cells which are transfected with expression vectors are very particularly preferred, the expression vectors in turn containing DNA sequences which code for the fusion proteins according to the invention. All of the aforementioned objects according to this invention can be considered as pharmaceuticals or for the manufacture of a pharmaceutical, in particular for the treatment of diseases which are disclosed in the present patent application, possibly as part of a composition
  • trimers according to the invention or the further objects of the present invention are preferably used in the context of the present invention for the production of a medicament or for the treatment of the aforementioned diseases or disorders such that they are used for parenteral, ie for example subcutaneous, intramuscular, intraarterial or intravenous, or oral or intranasal or anal, intraperitoneal, vaginal or buccal, intracerebral, intraocular administration (injection or infusion), possibly also for topical application.
  • parenteral ie for example subcutaneous, intramuscular, intraarterial or intravenous, or oral or intranasal or anal, intraperitoneal, vaginal or buccal, intracerebral, intraocular administration (injection or infusion), possibly also for topical application.
  • trimers or host cells according to the invention which form trimers according to the invention, or the DNA sequences which code for recombinant fusion proteins which can form trimers, or corresponding expression vectors can in each case serve as medicaments as such or can be used for the production of a medicament. However, they can also be used in combination with other active active ingredient components or pharmaceutical auxiliaries, carriers or additives as medicaments.
  • the trimers according to the invention or the further subject matter of the invention can thus be combined as constituents in combination with pharmaceutically acceptable carriers, auxiliaries and / or additives. According to the present invention, (pharmaceutical) compositions containing articles according to the invention, in particular trimers according to the invention are therefore also disclosed.
  • compositions according to the invention can include filling substances or substances, such as lactose, mannitol, substances for covalently attaching polymers, such as, for example, polyethylene glycol to inhibitors according to the invention, complexing with metal ions or including materials in or on special preparations of polymer compounds, such as, for example, polylactate, polyglycolic acid, hydrogel or on liposomes, microemulsion, micelles, unilamelar or multilamelar vesicles, erythrocyte fragments or spheroplasts.
  • polylactate polyglycolic acid
  • hydrogel or on liposomes such as, for example, polylactate, polyglycolic acid, hydrogel or on liposomes, microemulsion, micelles, unilamelar or multilamelar vesicles, erythrocyte fragments or spheroplasts.
  • the respective embodiments of the compositions are selected depending on the physical behavior, for example with regard to solubility
  • Controlled or constant release of the active ingredient component according to the invention in the composition includes formulations based on lipophilic depots (for example fatty acids, waxes or oils).
  • lipophilic depots for example fatty acids, waxes or oils.
  • coatings of substances or compositions according to the invention containing such substances namely coatings with polymers (for example poloxamers or poloxarnines) are also disclosed.
  • Substances or compositions have protective coatings, for example protease inhibitors or permeability enhancers.
  • Trimers according to the invention are preferably also used in the field of in vitro diagnosis or, for example, for biochemical cleaning processes.
  • fusion proteins are described which are suitable for the trimerization of, provided that the recombinant fusion protein contains at least one component A and at least one component B, component A being a protein or a protein segment with a biological function, in particular with Contains ligand function for antibodies or receptors, and component B contains a trimerizing section or a functional derivative of such a section of a protein, as described above as a component of the trimers according to the invention.
  • component A being a protein or a protein segment with a biological function, in particular with Contains ligand function for antibodies or receptors
  • component B contains a trimerizing section or a functional derivative of such a section of a protein, as described above as a component of the trimers according to the invention.
  • component B of a recombinant fusion protein according to the invention is typically a protein segment selected from the group , consisting of the family of the Clq proteins or the Collectine or of the family of the collagen-like proteins, wherein the component B of the recombinant fusion protein preferably contains only a trimerizing section, but does not have the trimers oligimerizing structure or globular “Kop domain.
  • component B therefore have at least one amino acid sequence with the heptad pattern (abcdefg) n , which structurally forms a helix forming a triple helix, the amino acids of which in positions a and d preferably carry apolar side chains and thereby the formation of the superhelical structure described above, here as a triple helix from three helices allow.
  • sequences from at least one heptad pattern preferably at least two, can originate, for example, from one of the following protein keratin, collagen, Clq, MBP, SP-A, SP-D, BC, CL43 or ACRP30.
  • a functional derivative of such a section of the aforementioned proteins can also be used in the context of the present invention, the definition of a functional derivative selected above for component A correspondingly also valid for component B.
  • Another object of the present invention is an inhibitor which is present as a hexamer (2x3) in vitro by forming a disulfide bridge in solution (ApoFasL-060).
  • this inhibitor is present - possibly in an oxidizing environment - as a trimer or behaves like a trimer and in this way develops inhibitory properties.
  • ApoFasL-060 consists of an N-terminal flag sequence, a linker and a specific linker as well as the AS 103 to 138 from hFasL and the AS 139 to 281 (component A), also from hFasL (see FIG. 1).
  • an inhibitor of the ApoFasL-060 type can also carry, as component A, the corresponding binding sections of other TNF cytokines, for example OX40L, RANKL, TWEAK, Lta, Ltab2, LIGHT, CD27L, 41-BB, GITRL, APPJL, VEGI and BAFF or their sections or derivatives are very particularly preferred are the proteins CD40L, FasL, TRAIL, TNF (in particular TNF which binds to the receptor TNF-R2), CD30L and EDA or their sections or derivatives, in particular their respective human sequences ,
  • TNF cytokines for example OX40L, RANKL, TWEAK, Lta, Ltab2, LIGHT, CD27L, 41-BB, GITRL, APPJL, VEGI and BAFF or their sections or derivatives are very particularly preferred are the proteins CD40L, FasL, TRAIL, TNF (in particular TNF which binds to the receptor TNF-R2),
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of the FasL chimeras according to the invention (FasL-199, FasL-060 and FasL-267) in the one-letter code.
  • the two protein chimeras FasL-199 and FasL-267 contain a component of the protein ACRP30, one Plasma protein that is structurally similar to the complement factor Clq and is produced by adipocytes.
  • the ACRP30 protein has a length of 247 amino acids, with a secretion signal sequence (AS 1 to 17) at the N-terminus, followed by a sequence of 27 amino acids (AS 18 to 44), which is responsible for the oligomerization of the protein
  • AS 1 to 17 secretion signal sequence
  • AS 18 to 44 sequence of 27 amino acids
  • the following section (AS 45 to 110) of the native protein contains 22 collagen-like sequence repeats, which accordingly form the “coiled-coil” domain. This coiled-coil domain ensures trimerization in the native state.
  • FasL-199 was constructed using PCR amplification and contains the complete oligomerization domain of murine ACRP30 (mACRP30) (amino acids 18 to 110). The C-terminal of this is the FasL chimeric protein, the trimerization domain of FasL (amino acids 139 to 281). Linker sequences are located between the N-terminal flag tag and the mACRP30 section and between mACRP30 (component B) and the human hFasL section (component A) (LQ).
  • the Q ⁇ marenprotein FasL-267 largely corresponds to the construct FasL-199, but has a deletion of the mACRP30 section. It does not contain the oligomerization domain (amino acids 18 to 44) of ACRP30.
  • the deletion mutant was prepared by PCR from EST clone AA673154. Deletion of amino acids 18 to 44 of mACRP30 causes the construct to be a trimer, as shown by the gel filtration experiments
  • the ca ⁇ mar protein FasL-060 has a flag sequence at the N-terminus, followed by a linker (GPGQVQLQ), a specific linker that can form a disulfide bridge, the AS 103 to 138 of human FasL (hFasL) and finally as component A AS 139 to 281 from hFasL.
  • GPGQVQLQ linker
  • ApoFasL-060 behaves as a trimer or as a hexamer.
  • FIG. 2 shows in FIG. 2A the activity of ApoFasL-060 and ApoFasL-267 in vitro with regard to the viability of Bjab cells. Plotted on the y axis in each case the absorbance at OD 490 ⁇ m, plotted on the x-axis (in logarithmic representation) is the concentration of the fusion proteins added for the cytotoxicity test. The optical density at 490 nm is a measure of the viability of the cells (high optical density corresponds to a low one apoptotic effect of the added substances and thus a high cell viability).
  • FIG. 2B shows the inhibitory activity of ApoFasL-267 (o) and ApoFasL-060 () in a representation as in FIG. 2A.
  • oligomerized FasL at a concentration of 50 ng / ml was added in all experiments to trigger apoptosis.
  • Figure 2C shows the results of affinity studies, comparing the affinity of FasL-199 and FasL-267 with Bjab cells.
  • ApoFasL-267 and FasL-199 compete with ZB4 antibodies for binding to Fas on BJAB cells.
  • the percentage of bound ZB4 is plotted against the concentration of FasL-199 () or FasL-267 (o).
  • FIG. 3 shows the results of in vivo experiments, namely the effect of ApoFasL-060 inhibition on hepatolysis induced by agonistic anti-Fas antibody J02.
  • FIG. 3A shows the results of experiments in which mice were injected intravenously with either ApoFasL-060 (25 ⁇ g / mouse) or saline (control) before the intravenous injection of 5 ⁇ g J02 antibodies.
  • the filled bars in FIG. 3A represent the serum titers (in U / ml) of ALT and the open bars of AST represents the results of the measurements four hours after iv injection.
  • the right-hand plot shows the result of the control experiment.
  • 3B shows the survival rate of mice that received 10 ⁇ g of J02 antibodies, namely after pretreatment with saline (filled bars) or with ApoFasL-060 (20 ⁇ g) (light gray bars, 2nd in each case from the left) or only with ApoFasL-060 (dark gray bars, third from the left) or with ApoFasL-060 and cross-linking antibody (medium gray bars, each on the right), depending on the time after administration (2h, 4h, 24h).
  • saline filled bars
  • ApoFasL-060 20 ⁇ g
  • ApoFasL-060 dark gray bars, third from the left
  • ApoFasL-060 and cross-linking antibody medium gray bars, each on the right
  • ApoFasL-060 prevents the lethal effects of the agonistic anti-Fas -Antibody J02 in mice.
  • the inhibitory effect of ApoFasL-060 (medium gray bars) is canceled by cross-linking antibodies.
  • FIG. 4 shows the effect of ApoFasL-267 after liver damage induced by oligomerized FasL.
  • Figure 4 shows the results from experiments in which the mice were intravenously injected with either saline or 25 ⁇ g of ApoFasL-267 prior to the intravenous injection of oligomerized FasL (FasL-199).
  • the serum titers of ALT (filled bars) and AST (open bars) were analyzed after four hours. Again the bars represent the respective titers in U / ml.
  • FIG FasL-267 show the results Gift of agonistic, ie FasL triggering apoptosis
  • the left-hand plot represents the comparative experiment without administration of agonistic FasL.
  • the results of experiments with FasL-199 without protective ligands and of FasL-199 in combination with protective ligands are thus shown in FIG FasL-267 shown
  • FIG. 5 shows the effect of soluble FasL in the case of AAP-induced hepatitis.
  • the mice were injected intravenously with either ApoFasL-267 (Figure 5A) or ApoFasL-060 ( Figures 5B and 5C) prior to the intraperitoneal injection of AAP (300 mg / kg).
  • the titres (U / ml) of ALT (filled bars) and AST (open bars) are plotted in FIGS. 5A and 5B, each five hours after the Injection were measured.
  • the left-hand plots in FIGS. 5A and 5B correspond to the comparative tests, while the right-hand plots (FIG. 5A) and in FIG. 5B the middle and right-hand plots represent the results after administration of the inhibitors according to the invention.
  • FIG. 5C shows the relative decrease in the aminotransferase titers compared to sham-treated (KontroU) animals (100%).
  • FIG. 6 shows the effect of ApoFasL-267 and ApoFasL-060 on a mouse liver treated with AAP.
  • the mice were treated as described above in FIG. 5, 24 hours after the hepatitis induction, the livers were dissected and histologically evaluated in FIG. 6 three images of histological sections (addition of AAP, addition of AAP and ApoFasL-267 and finally a comparative approach (control) after addition of saline).
  • Treatment of the mice with ApoFasL-267 prevents liver damage, as can be seen from a comparison with the histological section from the control animals.
  • the livers of animals treated exclusively with AAP show necrosis and apoptosis in the center Venous area, sinusoidal inflamed blood and vacuolated hepatocytes.
  • FIG. 7A shows the cDNA sequence and the amino acid sequence derived therefrom for the Fas chimera Fas-ACRP30 (MKB216).
  • the construct contains amino acids 17 to 172 of the extracellular domain of Fas (ie the Fas receptor), fused via a linker of 14 amino acids to the complete oligomerization domain of murine ACRP30 (amino acids 18 to HO).
  • the amino terminal also contains an Ig heavy chain signal sequence and a Flag Tg. Furthermore, the restriction sites are indicated in the figure.
  • FIG. 7B shows a restriction map with the specified interfaces of the construct from FIG. 7A.
  • the inhibitory effect of Fas-ACRP30 in vitro against FasL-mediated apoptosis in A20 cells is documented in FIG. 8.
  • the absorpti- on at 490 nm (measure of the survivability of the cells; cf. also FIG. 2), while the concentration of the respective fusion protein is plotted in ng / ml on the x-axis.
  • the inhibitory effect of Fas-ACRP30 was compared to that of Fas -Fc, a dimeric form of Fas, and that of Fas-COMP, a pentameric form of Fas.
  • the FasL DCLitemaer FasL-199 according to the invention served as an apoptosis-inducing agent.
  • the Fas-ACRP30 construct inhibits FasL-induced apoptosis with an ICs ⁇ value of 80 ng / ml. This value is comparable to that of the pentameric Fas derivative Fas-COMP (35 ng / ml), while the IC 50 value for (dimeric) Fas-Fc is more than 1 ⁇ g / ml
  • the expression vector for FasL-199 was constructed in the following manner. First, a PCR amplification using the oligonucleotides JT1147 (ACA ATG CAT GAA GAT GAC GTT ACT AC) and JT1148 (AGA CTG GAG AGC GGC TTC) was carried out using the EST clone AA673154 TCC AGG) The sequence coding for amino acids 18 to 111 of the murine ACRP30, framed by the restriction sites Nsil and Pstl, is cloned into the Pstl site of the vector coding for trimeric FasL (such that the fused Nsil / Pstl site on the 5th Side of the coding sequence).
  • the vector for expressing the fusion protein FasL-167 (with the AS 44-111 from mACRP30) was amplified with the aid of the alternative 5'-oligonucleotide JT1421 (AAA ATG CAT GCA GGC ATC CCA GGA C).
  • the PCR product was converted into a PCR "blunt" system ligated and the Nsi / Pstl cassette subcloned into the FasL-containing vector as described above.
  • Other fusion proteins with alternative TNF cytokines in combination with ACRP30 were obtained by substituting the corresponding sequence of FasL in the expression vector FasL-ACRP30 created with the respective ligand sequence in the restriction sites Pstl and EcoRI
  • HEK293 cells were stably transfected using the calcium phosphate method. After three days of incubation, the HEK293 cells were cultivated for two weeks in a selection medium which contained 800 ⁇ g ml G418 (see also aa0 : Schneider et al., J. Exp. Med. 1998). These stably transfected clones were removed and distributed in 96-well plates in selection media. The supernatants were examined for the presence of the recombinant protein using the anti-flag Western blot technique
  • the stably transfected cells were bottled for 10 to 14 days in 800 ml of a non-selective medium.
  • the culture was centrifuged and the supernatant was filter-sterilized.
  • Fusion proteins from FasL with murine ACRP30 (FasL-267 or FasL-199) were then purified in the following manner.
  • the supernatants were mixed with NaCl and CaCl 2 (final concentrations of 150 mM or 2 mM) and the pH was adjusted to 7.0 using hydrochloric acid / sodium hydroxide solution.
  • the recombinant protein was then applied to a 1 ml M2 agarose column (Sigma, Switzerland) (0.5 ⁇ / ra, 48 h , 4 ° C), the column with 10 volumes of TBS containing 2 mM CaCl 2 , and finally in TBS-EDTA (10 mM) (0.1 ml / min, 4 ° C) or 50 mM citrate-NaOH (pH 2.5) (1 ml / min, 4 ° C.) and optionally neutralized with 0.2 volumes of 1 M Tris-HCl (pH 8).
  • the buffer was against PBS in concentrators with a 30 kDA limit (Millipore )
  • concentration of purified proteins was determined by the bicmonchonic acid method (Pierce Chemical Co., Rockford, PL, USA) using rmder serum albumin as standard and the purity of the samples was determined by SDS-PAGE and Coomassie Blue staining
  • the human T lymphoplastoma Jurkat cells, BJAB Burkitt lymphoma cells or Raji cells were grown in RPMI accompanied by 10% FCS.
  • the human embryonic kidney cells 293 were cultivated in a DMEM multi-substance mix F12 (1: 1), enriched with 2% FCS. All media contained antibiotics (penicillin and streptomycin at 5 ⁇ gml each and neomycin at 10 ⁇ g / ml).
  • the cytotoxic assay was essentially as previously described by Schneider et al. (J. Biol. Chem. 272: 18827-18833, 1997). 50,000 cells were incubated for 16 hours in 100 ⁇ l medium, the medium displaying the indicated ligand concentrations in the presence or absence of 1 ⁇ g ml of M2 antibodies The cell survival rates were determined using PMS / MTS (phenanzin methosulfate 3- [4,5-dimemylthiazol-2-yl] -5- [3-carboxymethoxyphenyl] -2- [4-sulfophenyl] -2H-tetrazolium, salt) (Promega Corp., Madison, WI). Color development was allowed for the time required (typically 1-3 hours).
  • the absorbance was measured at 490 ⁇ m.
  • the optical density at 490 nm is a measure of the viability of the cells (high optical density corresponds to a low apoptotic effect of the added substances and thus a high viability of the cells).
  • mice were injected intravenously into female Balb / c mice (8 to 10 weeks old). The mice were bled out at the specified time intervals with subsequent quantification of the titers of the aminotransferases AST and ALT (aspartate aminotransferase and alanine aminotransferase)
  • anti-Flag-MI and anti-Flag-M2 antibodies coupled to agarose were purchased from Sigma (Buchs, Switzerland).
  • Antibodies J02 were purchased from Pharmingen and cell culture reagents from Life Sciences (Basel, Switzerland).
  • the affinity of ApoFasL-267 and FasL-199 was determined using a composition assay.
  • the monoclonal anti-Fas antibodies ZB4 were labeled with 100 ⁇ Ci (1251) by the iodo gene method (Pierce, Rockford, IL) resulted in a specific activity of 1.5 ⁇ Ci / ⁇ g protein.
  • 1x105 Bjab cells were incubated with radiolabelled ZB4 and unlabeled competitors in serial dilution (100 ⁇ g / ml to 10 ng / ml) for 1 h at 37 ° C. After three washes with cold PBS, which contained 1% BSA, the was the bound radioactivity was determined with a ⁇ -counter and expressed as a percentage of bound cpm. All experiments were carried out in triplicate
  • Ausfuhtungsbeispiel A recombinant fusion protein (1, FasL-199) was expressed, which amino acids 139 to 281 of hFasL (h: human) as component A and N-terminal of the Amino acid 139 of component A as component B had a 94 AA long sequence (AS 18 to 111 of mACRP30).
  • a flag sequence with the amino acids DYKDDDDK and a linker sequence GPGQVQLQLH arranged between the flag tag and component B was expressed (see FIG. 1) at the N-terminus of the fusion protein (N-terminal of component B)
  • Components A and B are separated by the linker sequence LQ
  • Fusion protein (1) therefore differed from fusion protein (2) by a deletion which comprised the specific linker and amino acids 103 to 138 of hFasL (FIG. 1).
  • the vector construction of the fusion proteins (1) and (2) was carried out according to the procedure described above.
  • the expression and purification of the fusion proteins was carried out according to the method shown in (b),
  • the degree of multi- or oligomerization of the purified fusion proteins (1 or 2) was determined by electron microscopy. It was found that FasL-199 as hexamer (2x3mer), corresponding measurements for FasL-267 gave results for a trimer and for ApoFasL-060 as well a hexamer.
  • Bjab-Burkitt lymphoma cells grown according to (c) were removed and subjected to a cytotoxic assay according to (d).
  • the assay was carried out in each case with increasing concentrations of trimerized fusion proteins ApoFasL-060 and ApoFasL-267 in the presence or absence of anti-Flag-M2 antibodies (Sigma, Buchs, Switzerland) (FIG. 2A), by reducing the absorbance at OD 490 nm was determined.
  • the inhibitors ApoFasL-060 and ApoFasL-267 used are shown in FIG. 1 (see first exemplary embodiment).
  • mice were injected with agonistic J02 anti-Fas antibodies, which in the mice treated in this way led to the exit from fulminant liver failure. Hepatolysis in these mice was demonstrated by the high serum titers of amino transferases (AST and ALT).
  • the mice were pretreated with ApoFasL-060 (1 mg / kg), whereby the animal after administration of J02- Antibodies were saved from the liver failure (hepatolysis) triggered by them (see FIG. 3A).
  • the protective effect of ApoFasL-060 was dose-dependent.
  • the FasL-induced hepatolysis is very high in the animals used for the control to be observed quickly (within two hours) after administration of FasL-199, namely with arninotransferase titers, which are increased by a factor of 10.
  • the pretreatment of the animals with ApoFasL-267 therefore prevents according to the AST or ALT serum titer certain liver damage to the animals. 4. Rest example
  • Acetaminophen (AAP), a pain reliever, is known to induce fulminant liver failure.
  • the molecular mechanism is based on Fas-mediated apoptosis. It was therefore examined in the present exemplary embodiment whether trimeric ApoFasL-267 and or hexameric ApoFasL-060 can protect the liver cells from AAP-induced cell death.
  • AAP a sublethal dose of AAP (0 g kg) was injected intraperitoneally into the mice. Five hours later, any liver damage was determined by determining the serum titers of ALT and AST. The ALT and AST titers were determined in accordance with the IFCC guidelines (International Federation of Clinical Chemistry) determined as an enzymatic test.
  • Fig. 6A The AAP-induced liver damage was examined histologically (Fig. 6A). The following are worth mentioning: necrosis and apoptosis in the central area of the venula, sinusoidal inflammation of blood, vacuolated hepatocytes. In contrast, as shown in FIG. 6B, no such liver damage is recognizable in the case of pretreatment with ApoFasL-267 (or ApoFasL-060, not shown). 5th exemplary embodiment
  • Fas-ACRP30 a fusion protein from the extracellular domain of the Fas receptor (amino acids 17 to 172) and the complete oligomerization domain of murine ACRP30 (amino acids 18 to HO), which linkers of 14 amino acids with one another are connected, produced ( Figure 7).
  • the recombinant protein was analyzed by SDS-PAGE and had an apparent molecular weight of 55 kDa under reducing conditions or 150 kDa under non-reducing conditions. From this it can be concluded that the construct MKB216 (hereinafter referred to as Fas-ACRP30) is essentially a hexamer (2x3mer)
  • FasL-sensitive A20 cells were preincubated with increasing concentrations of Fas-ACRP30 before the addition of oligomerized FasL.
  • the particularly effective FasL oligomer served in present experiment, the construct according to the invention FasL-199.
  • Fas-ACRP30 compared with that of a dimeric form of Fas (Fas-Fc) and a pentameric form of Fas (Fas-COMP).
  • Fas-ACRP30 is an effective inhibitor of FasL-mediated apoptosis

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Abstract

The invention relates to recombinant fusion proteins having the property of being able to form trimers. Said recombinant fusion proteins comprise at least one component A and at least one component B. Component B . Component B has trimerizing properties and component A has biological properties. The invention also relates to trimers of said recombinant fusion proteins. The invention further relates to the use of said trimers in the production of a medicament or the use thereof for in-vitro diagnosis or in the production of in-vitro diagnosis agent. The invention also relates to DNA sequences coding for said fusion protein and expression vectors and host cells containing said DNA sequences or expression vector.

Description

Rekombinante Fusionsproteine und deren Trimere
Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante Fusionsproteine, mit der Eigenschaft, Trimere bilden zu können, wobei die rekombinanten Fusionsproteine mindestens eine Komponente A und mindestens eine Komponente B aufweisen, wobei die Komponente B einen trimerisierende Eigenschaften und die Komponente A biologische Eigenschaften aufweist, sowie Trimere dieser rekombinanten Fusionsproteinen. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von derartigen Trimeren zur Herstellung eines Arzneimittels bzw. deren Verwendung zur In-vitro-Diagnose bzw. zur Herstellung eines in vitro Diagnosemittels. Auch DNA-Sequenzen, die für ein derartiges Fusionsprotein kodieren, sowie Expressionsvektoren und Wirtszellen, die die DNA-Sequenz bzw. den Expressionsvektor enthalten, sind Gegenstand der vorliegen- den Erfindung.
Proteine, die physiologisch als Trimere auftreten, sind in der Natur in großer Zahl vorhanden. Aufgrund von Wechselwirkungen an den Oberflächen dieser in Lösung trime- risierenden Proteine kann es zu spontanen oder aber auch zu bspw. kinetisch verzöger- ten, weil konzentrations- oder milieuabhängigen Zusammenlagerungen von Proteinen kommen. Hierfür sind hydrophobe Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen, kovalente Bindungen, bspw. Disulfidbrücken, und/oder Coulomb-Kräfte verantwortlich. Daneben aber sind bei gewissen Proteinen Strukturmotive anzutreffen, die zur Bildung von spezifischen strukturbedingten intermolekularen Supersekundärstrukturen und damit - neben anderen Multimerisierungszuständen - zu Proteintrimeren führen. Die Formation von Supersekundärstrukturen beruht auf charakteristischen Aminosäurese- quenzen der diese Trimere bildenden Proteine. Als Supersekundärstrukturen wären beispielsweise sog. "Coiled-Coil-Tripelhelices" zu nennen, die eine Trimerisierung von Proteinen durch Interaktionen von charakteristischen α-Helices, die bei jedem der die Coiled-Coil-Form ausbildenden Proteine auftreten, bewirken. Die Coiled-Coil- Tripelhelix als intermolekulare "Trimerisierungsdomäne" von Proteinen stellt sich strukturell als dreisträngige, umeinander gewundene Superhelix dar. Derartige Coiled- Coil-Motive mit Tripelhelix-Charakter treten insbesondere bei extrazellulären Proteintrimeren auf, ganz besonders aber bei Proteinen bzw. Proteinkomplexen des Bindegewebes.
So etwa beschreiben Beck et al. (J. Mol. Biol. (1996) 256, 909-923) ein Bindegewebs- protein, das sog. Cartilage Matrix Protein (CMP), dessen Aggregation zu einem Ho- motrimer auf einer Tripelhelix, die das Resultat der Zusammenlagerung von drei komplementären Helices (jeweils als Bestandteil eines Polypeptids) darstellt, mit Coiled- Coil-Muster beruh Charakteristisch für die Aminosäuresequenz einer solchen eine Tripelhelix bildenden Helix ist dabei das Heptadmuster (abcdefgV Deren Aminosäuren in den Positionen a und d tragen gewöhnlich apolare Seitenketten und erlauben dadurch die Ausbildung der oben beschriebenen superhelikalen Struktur, hier als Tripelhelix aus drei Helices.
Weiterhin treten auch bei Proteinen aus der Kollagenfamilie spezifische strukturbedingte Multimerisierungsphänomene durch die Ausbildung von Supersekundärstrukturen auf. Dabei ist die Struktur von Kollagenfasern durch das Tropokollagen gekennzeichnet, das aus drei helikalen verdrillten Polypeptiden besteht. Auch die Protofibrille eines Haares ist aus einer Tripelhelix aus α-Keratm mit dem Motiv "Coiled-Coil", al- lerdings linksgängig, aufgebaut. Darüber hinaus sind aufgrund ihrer Sequenzhomologien in ihren jeweiligen multimeri- sierenden Sequenzabschnitten die Proteine Clq, Kollagen αl (X), α2 (VII), das Überwinterungsprotein, ACRP30, das innere Ohrstrukturprotein, das Cerebellin und das Multimerin als Proteinfamilie unter der Bezeichnung Clq-Familie zusammengefaßt worden (Kischore und Reid, Immunopharmacol., 42 (1999) 15-21), die surikturbedingt als höhere Aggregate von bspw. Trimeren vorliegen. Unter den in dieser Familie auftretenden Proteinen mit Multimerisierungseigenschaften ist bspw. die Struktur des aus dem Komplementsystem bekannten Proteins Clq durch Monomere charakterisiert, die jeweils eine globuläre sog. "Kopf-Domänen und einen "kollagenähnlichen" helikalen Sequenzabschnitt aufweisen. Über diesen helikalen Sequenzabschnitt, der eine Coiled- Coil-Tripelhelix bildet, trimerisieren die Monomere. Sechs dieser Clq-Trimere formen wiederum ein Oligomer, wobei wiederum die Oligomerisierung der Proteintrimere auf Interaktionen zwischen den einzelnen Coiled-Coil-Tripelhelices beruht. Im Ergebnis führt diese strukturelle Anordnung beim Protein bzw. multi- (oligo-) merisierten Prote- inkomplex Clq zu einem als "Bouquet" bezeichneten Aufbau, wobei sichergestellt wird, daß 18 globuläre, C-terminal angeordnete "Kopf-Domänen zu einem Hexamer von Trimeren verbunden werden.
Eine ähnliche Struktur wie beim Protein Clq ist auch beim Protein ACRP30, gleich- falls ein Protein aus der Clq-Familie, anzutreffen (Hu et al, J. Biol. Chem., Vol. 271, Nr. 18, 10697-10703, 1996). Bei diesem von Adipozyten sekretierten Serumprotein handelt es sich mit überwiegender Wahrscheinlichkeit um Quattromere von Trimeren, wobei, wie auch beim Clq-Protein, globuläre C-terminale Domänen über kollagenähnliche Tripelhelices verbunden werden. Mutmaßlich vier dieser Tripelhelices formen schließlich wiederum ein Oligomer durch entsprechende Interaktionen. In der Veröffentlichung von Shapiro und Scherer (Current Biology 1998, 8:335-338) findet sich die mit Hilfe der Rδntgenstrukturanalyse ermittelte Struktur eines Homotrimers von ACRP30 dargestellt.
Weiterhin sind aus der Literatur Proteine aus der Klasse der Collectine bekannt, die durch eine kollagenartige Domäne, eine Halsregion und darüber hinaus durch eine globuläre carboxyterminale Lectinbindungsdomäne charakterisiert sind. Auch die Col- lectine treten physiologisch als Oligomere von Trimeren auf. So trimerisieren beispielsweise die Proteine Lung Surfactant Protein A (SP-A) und das Mannose- Bindungsprotein (MBP), jeweils aus der Familie der Collectine, durch die Interaktionen ihrer "kollagenähnlichen" Domäne und liegen schließlich als Hexamere von Tri- meren vor (Epstein et al., Current Opinion in Immunology, Vol. 8, Nr. 1, 1996, 29-35). Demgemäß bilden also auch die unter der Bezeichnung Collectine bekannten Proteine Oligomere (bspw. Hexamere) von Multimeren (bspw. Trimere) aus.
Aus der Literatur ist zudem zu entnehmen, daß zahlreiche physiologisch als Signalmo- leküle wirkende Proteine ein biologisches Signal nur in bestimmten Zuständen trans- duzieren können. So ist beispielsweise membranständig angeordnetes FasL biologisch, d.h. apoptotisch, wirksam, während nach Abspaltung des extrazellulären Proteinabschnitts von dem membranständigen Abschnitt (sog. sFasL) diese nicht- membrangebundene sFasL-Fraktion physiologisch keine apoptotische Wirkung auf Zielzellen mehr hervorrufen kann. In der Veröffentlichung von Schneider et al. (J. Exp. Med., Vol. 187, Nr. 8, 1998, 1205-1213) wurde beschrieben, daß die biologische Wirkung von sFasL-Trimeren, die - wie zuvor erläutert - nach Abspaltung vom membranständigen Proteinabschnitt erhalten werden, gleichwohl durch den Einsatz von vernetzenden Antikörpern in Hinblick auf deren physiologische Funktion reaktiviert werden kann. Hierzu wurde ein Fusionsprotein, bestehend aus der Trimerisierungsdo- mäne von FasL, einer kurzen Linkersequenz und einer Flag-Markierung (mit der Flag- Aminosäuresequenz (Ein-Buchstaben-Code) DYKDDDDK) konstruiert, exprimiert, und derartige nicht-strukturbedingt (also nicht über spezifische Sekundärstruktur- Interaktionen mit dem Ergebnis der Bildung einer Supersekundärstruktur) trimerisierte Fusionsproteine durch gegen die Flag-Markierung gerichtete Antikörper vernetzt
In der nicht veröffentlichten deutschen Patentanmeldung DE 19963859 werden Bieder Oligomere von Di-, Tri-, Quattro- oder Pentameren, also Aggregate höherer Ordnung, offenbart, die aus rekombinanten Fusionsproteinen aufgebaut sind, die zwei Komponenten A und B umfassen. Um bspw. die biologische (apoptotische) Wirksamkeit von TNF-Cytokinen zu erhöhen, können gemäß der DE 19963859 die rekombinanten Fusionsproteine als Komponente A bspw. ein TNF-Cytokin aufweisen und als Komponente B einen Proteinabschnitt, der die rekombinanten Fusionsproteine zu Aggregate höherer Ordnung verbindet.
Wenn auch bei vielen medizinischen Indikationen derartige Komplexe mit hoher apop- totischer Wirkung erwünscht sind, ist es gleichwohl zur Behandlung zahlreicher Erkrankungen erforderlichen, Substanzen zur Verfügung zu stellen, die die Auslösung apoptotischer Ereignisse zuverlässig blockieren. Aus der Veröffentlichung von Suda et al. (J. Exp. Med. 1997, 186, S. 2045-2050) ist bekannt, daß lösliche FasL-Trimere die Apoptose, die durch ein oligomerisierte Moleküle induziert wird, unter gewissen Um- ständen blockieren können. Substanzen auf bspw. Proteinbasis, die zuverlässig am Rezeptor selbst die Auslösung bspw. apoptotischer Ereignisse blockieren können, nicht-nativer Natur sind und daher besser gegen eine physiologische Degradation in vivo geschützt sind, sind im Stand der Technik jedoch nicht bekannt.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, solche Substanzen zur Verfügung zu stellen, die als Biomoleküle eine biologisch blockierende Funktion am Rezeptor selbst entfalten können, so daß bspw. die Auslösung der apoptotischen Signaltrans- duktionskette unterdrückt wird.
Die vorliegende Aufgabe wird durch den Gegenstand des Anspruchs 1, nämlich durch Trimere rekombinanter Fusionsproteine, die mindestens eine Komponente A und mindestens eine Komponente B aufweisen, wobei die Komponente A ein Protein oder einen Proteinabschnitt mit biologischer Funktion, insbesondere mit Bindungsfunktion, umfaßt und die Komponente B ein Protein oder einen Proteinabschnitt umfaßt, das/der die rekombinanten Fusionsproteine ohne Wirkung von Drittmolekülen trimerisiert, d.h. ein Trimer von biologisch wirksamen Komponenten A erzeugt. Erfindungsgemäß werden also Trimere zur Verfügung gestellt, die keine Aggregate höherer Ordnung, bspw. Dimere von Trimeren, bilden können, sondern vielmehr in Lösung im wesentlichen, mindestens zu 90 %, vorzugsweise zu mindestens 95 % und ganz besonders be- vorzugt zu mindestens 99 %, jeweils bezogen auf die Gesamtzahl der Trimere, als tri- merisierte rekombinante Fusionsproteine vorliegen. Unter einem Protein oder Proteinabschnitt mit biologischer Funktion (Komponente A im Fusionsprotein) sind insbesondere Proteine, die eine Ligandenfunktion, ganz besonders für Antikörper oder Rezeptoren, haben (also als Bindungspartner mit einem oder mehr Molekül(en) in Wechselwirkung treten können), modifizierte Aminosäure- Sequenzen, z.B. Aminosäuresequenzen mit kovalent oder nicht-kovalent angekoppelten Wirkstoffen (ggf. organisch-chemischer Natur), Antikörper oder Abschnitte von Antikörpern mit Paratopen oder auch Hormone, bspw. Peptidhoπnone, zu verstehen. Hierbei beruht die vorliegende Erfindung auf der Erkenntnis, daß insbesondere Signalproteine, die oder deren Abschnitte oder Derivate erfindungsgemäß als Komponente A eingesetzt werden, biologisch erst als Aggregate höherer Ordnung aktiv sind, dagegen als Trimere in vitro und in vivo an Rezeptoren binden, diese aber nicht aktivieren, sondern vielmehr kompetitiv die Bindungsstellen besetzen und kein biologisch aktivierendes Signal auslösen können, sondern ausschließlich blockieren.
Bei physiologisch membranständigen Signalproteinen, bspw. bei TNF-Cytokinen, werden als Komponente A eines trimerisierenden rekombinante Signalproteins Spaltprodukte, die die extramembranδsen, insbesondere die extrazellulären Proteinabschnitte, umfassen, bevorzugt. Aber auch Aminosäuresequenzen, die als Antigene wirken können, können als Komponente A im rekombinanten Fusionsprotein eingesetzt wer- den. Schließlich können als Komponente A auch Rezeptoren, z.B. Rezeptoren aus der TNF-Rezeptorfamilie (bspw. FasR), oder Abschnitte bzw. Derivate solcher Rezeptoren zum Einsatz kommen, die gleichfalls Bindungsfunktion haben (damit also als Bindungspartner mit einem anderen Molekü bspw. membranständigem FasL, in Wechselwirkung treten) und i.S. der vorliegenden Erfindung daher auch unter den Begriff "Ligand" fallen. Derartige bindungsfähige Fragmente von biologischen Rezeptoren eignen sich insbesondere zur Verwendung als Arzneimittel, wenn der komplementäre biologische Ligand beim Patienten in unphysiologisch hohen Konzentrationen vorliegt
In einer bevorzugten Ausführungsform können die Komponenten A die in erfindungsgemäßen Trimeren vorliegen, identische Komponenten A (Homotrimere) oder unterschiedliche Komponenten A (Heterotrimere) aufweisen, d.h. es können verschiedene rekombinante Fusionsproteine ein erfindungsgemäßes Trimer bilden. Auf diese Weise können Proteine mit verschiedenen Komponenten A, ggf. mit unterschiedlicher biologischer Funktion, im erfindungsgemäßen Trimer verbunden sein. Hierbei können die Komponenten A von zwei rekombinanten Proteinen identisch sein und das dritte Fusi- onsprotein hinsichtlich seiner Komponente A abweichen oder auch alle drei Fusionsproteine sich in Hinblick auf die Komponente A unterscheiden. Auf diese Weise werden durch die Wahl, die Anordnung, die spezifische Kombination und/oder durch die Anzahl der Komponenten A im Trimer typischerweise fein modulierte inhibitorische, ggf. in Kombination mit aktivierenden, Wirkungen erzielt werden können.
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform handelt es sich bei der Komponente A im rekombinanten Fusionsprotein um ein Peptidhormon, einen Wachstumsfaktor, ein Cytokin, ein Interleukin oder einen Abschnitt derselben, vorzugsweise um einen bin- dungsfahigen Abschnitt. Aber auch funktioneile Derivate der vorgenannten Peptide, Proteinabschnitte und/oder Proteine können als Komponente A im rekombinanten Fusionsprotein, das Bestandteil eines erfindungsgemäßen Trimers ist, zum Einsatz kommen.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen trimeren rekombinanten Fusionsproteins umfaßt dessen Komponente A einen Rezeptor, beispielsweise einen Rezeptor für ein Peptidhormon, einen Wachstumsfaktor, ein Cytokin, ein Interleukin, oder es handelt sich bei der Komponenten A des erfindungsgemäßen Fusionsproteins um einen Abschnitt bzw. ein Derivat eines derartigen Rezeptors. Besonders bevorzugte Beispiele für einen solchen Rezeptor sind Rezeptoren aus der TNF-Rezeptorfamilie, insbesondere FasR (im folgenden auch lediglich als Fas bezeichnet).
Als funktioneile Derivate von biologisch aktiven Proteinen, Proteinabschnitten oder Peptiden werden insbesondere solche Proteine bezeichnet, die die biologische Funkti- on, insbesondere die Bindungseigenschaft an den Interaktionspartner, bspw. den membranständigen Rezeptor, aufrechterhalten, gleichwohl aber Sequenzunterschiede zu den entsprechenden nativen Sequenzen aufweisen. Bei diesen Sequenzabweichun- gen kann es sich um eine oder mehr Insertion(en), Deletion(en) und/oder Substitutionen) handeln, wobei eine Sequenzhomologie von mindestens 70% bevorzugt und eine Sequenzhomologie von mindestens 85 % zwischen dem eingesetzten Derivat und der nativen Sequenz starker und mindestens 90 % ganz besonders bevorzugt ist Insbe- sondere fallen unter den Begriff der funktioneilen Derivate solche Aminosäuresequenzen, die gegenüber den physiologischen Sequenzen konservative Substitution aufweisen. Als konservative Substitutionen werden solche Substitutionen bezeichnet, bei denen Aminosäuren gegeneinander ausgetauscht werden, die aus der gleichen Klasse stammen. Insbesondere gibt es Aminosäuren mit aliphatischen Seitenketten, positiv oder negativ geladenen Seitenketten, aromatischen Gruppen in der Seitenketten oder Aminosäuren, deren Seitenketten Wasserstoffbrücken eingehen können, bspw. Seitenketten, die eine Hydroxyfunktion besitzen. Das bedeutet, daß bspw. eine Aminosäure mit einer polaren Seitenkette durch eine andere Aminosäure mit einer gleichfalls polaren Seitenkette ersetzt wird oder beispielsweise eine durch eine hydrophobe Seitenket- te gekennzeichnete Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit gleichfalls hydrophober Seitenkette substituiert wird (z.B. Serin (Threonin) durch Threonin (Serin) bzw. Leucin (Isoleucin) durch Isoleucin (Leucin)). Insertionen und Substitutionen sind insbesondere an solchen Sequenzpositionen möglich, die keine Veränderung der dreidimensionalen Struktur hervorrufen oder den Bindungsbereich betreffen. Eine Veränderung einer dreidimensionalen Struktur durch Insertion(en) oder Deletion(en) ist bspw. mit Hilfe von CD-Spektren (Zirkulardichroismus-Spektren) leicht überprüfbar (Urry, 1985, Absorption, circular Dichroism and ORD of Polypeptides, in: Modern Physical Methods in Biochemistry, Neuberger et al. (Hrgb.), Elsevier, Amsterdam). Geeignete Verfahren zur Herstellung von Proteinen mit Aminosäuresequenzen, die gegenüber der (den) nativen Sequenzen Substitutionen aufweisen, werden bspw. in den Druckschriften US 4,737,462, US 4,588,585, US 4,959,314, US 5,116,943, US 4,879,111 und US 5,017,691 offenbart. Die Herstellung von Derivaten ist insbesondere auch bei Sambrook et al, (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben, wobei Codons weggelassen, ergänzt oder ausgetauscht werden können. Derivate können insbesondere auch solche Proteine sein, die stabilisiert sind, um der physiologischen Degradation zu entgehen, bspw. durch Stabilisierung des Proteinrückgrats durch Substitution der durch Stabilisierung des Proteinrückgrats durch Substitution der amidartigen Bindung, bspw. auch durch den Einsatz von ß- Aminosäuren.
Unter einem Liganden werden i.S. der vorliegenden Erfindung alle an Bindungsreakti- onen beteiligten Moleküle verstanden. Bei einem Liganden kann es sich demnach auch um ein normalerweise als Rezeptor bezeichnetes Protein handeln. Auch ein solcher Rezeptor kann "Ligand" i.S. dieser Erfindung sein, bspw. wenn er an seinen Interaktionspartner, z.B. ein Signalmolekül, bindet.
Besonders bevorzugt ist ein Trimer von rekombinanten Fusionsproteinen dann, wenn die Komponente A im rekombinanten Fusionsprotein ein Cytokin aus der Familie TNF-Cytokine, ein Abschnitt eines solchen TNF-Cytokins oder ein funktionelles Derivat eines TNF-Cytokins oder eines entsprechenden TNF-Cytokin-Abschnitts ist Dabei kann die biologische Wirkung der eingesetzten TNF-Cytokine bei den Zielzellen durch Bindung an die entsprechenden Rezeptoren in vivo (z.B. bei der Bindung in Form eines Aggregats höherer Ordnung) bspw. apoptotische, proliferative oder aktivierende Wirkungen hervorrufen, typischerweise als Trimer dann aber nur noch die Bindung an den jeweiligen Rezeptor sicherstellen, jedoch nicht mehr die aktivierende Funktion ausüben. In einer nicht abschließenden Aufzählung kommen als TNF-Cytokine und damit als Komponente A im Fusionsprotein insbesondere die Proteine OX40L, RANKL, TWEAK, Lta, Ltab2, LIGHT, CD27L, 41-BB, GITRL, APRIL, VEGI und BAFF bzw. deren Abschnitte oder Derivate in Betracht. Ganz besonders bevorzugt sind die Proteine CD40L, FasL, TRAIL, TNF (insbesondere TNF, das an den Rezeptor TNF-R2 bindet), CD30L und EDA bzw. deren Abschnitte oder Derivate. Als Kompo- nente A im rekombinanten Fusionsprotein werden dabei bevorzugt extrazelluläre Abschnitte der vorgenannten membranständigen TNF-Cytokine oder deren funktionelle Derivate verwendet. Ganz besonders bevorzugt sind diese Spaltprodukte dann, wenn insbesondere deren Bindungsdungsvermδgen an den jeweiligen Rezeptor erhalten bleibt Auch funktionelle Derivate, im oben genannten Sinn, der vorgenannten TNF- Cytokine oder Abschnitte der TNF-Cytokine können als Komponente A des Fusionsproteins zum Einsatz kommen. In einer ganz besonders bevorzugten Ausfuhrungsform ist die Komponente A des rekombinanten Fusionsproteins, das Bestandteil des erfin- dungsgemäßen Trimers ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus hFasL (AA 139- 281), hTRAIL (AA 95-281), hCD40L (AA 116-261) und m oder hTNFα (AA 77-235).
Erfindungsgemäß ergeben sich demnach folgende Möglichkeiten: Die für ein rekom- binantes Fusionsprotein, das Bestandteil eines erfindungsgemäßen Oligomers werden soll, ausgewählte Komponente A liegt bereits als solche in Lösung als Trimer. Die Komponente B wird in einem solchen Fall die Trimerisierung der Komponenten A nur noch verstarken. Diese Situation findet sich bspw. dann, wenn die Komponente A, bspw. ein TNF-Ligand bzw. ein Abschnitt oder Derivat desselben, die bereits in Lö- sung typischerweise trimerisiert ist, durch die Komponente B in seiner trimeren Gestalt weiter stabilisiert werden soll. Für den Fall jedoch, daß die Komponente A eines rekombinanten Fusionsproteins als solche in Lösung bzw. in vivo keine durch Oberflächen-Wechselwirkung vermittelte Timerstruktur zeigt, wird die Komponente B erfindungsgemäß eine Trimerisierung der Komponente A der rekombinanten Fusionsprote- ine sicherstellen müssen. Letzteres tritt bspw. typischerweise dann ein, wenn als Komponente A des rekombinanten Fusionsproteins nur Abschnitte des nativen Proteins verwendet werden, die als solche nicht trimerisieren können oder zumindest in vivo nicht als Trimer vorliegen, weil bspw. das Gleichgewicht stark auf die Seite des Monomers verschoben ist, also bspw. Abschnitte von Cytokinen, insbesondere C- terminale Abschnitte (bspw. umfassend mindestens 100 AS (jeweils gerechnet vom C- Terminus), vorzugsweise mindestens 120 AS und insbesondere bevorzugt mindestens 150 AS vom C-Teπninus) von FasL, CD40L, CD30L, TRAIL, EDA oder TNF.
Bei der Komponente A des rekombinanten Fusionsproteins kann es sich aber in einer bevorzugten Ausfuhrungsform auch um eine Aminosäuresequenz nach Maßgabe der vorliegenden Erfindung handeln, die dazu geeignet ist, als Träger für einen Rezeptora- gonisten oder Rezeptorantagonisten zu fungieren. So etwa kann ein als pharmakologi- scher Wirkstoff aktives, kleines organisch-chemisches Molekül typischerweise kova- lent an eine derartige Aminosäυresequenz angekoppelt werden, beispielsweise über eine Etherbindung an Threonin oder Serin, eine amidartige Bindung oder über eine Esterbindung. Derartige angekoppelte Agonisten oder Antagonisten können die Bindungskonstante eines erfindungsgemäßen Trimers erhöhen, vorzugsweise auf Werte von mindestens 10*9 M"1, oder die biologische Wirkung modulieren, insbesondere das inhibitorische Verhalten eines erfindungsgemäßen Trimers, insbesondere in Hinblick auf die Inhibition der Auslösung der apoptotischen Signalkaskade, verstärken. Darüber hinaus kann ein erfindungsgemäßer Trimer als Träger pharmakologisch wirksamer Substanzen eingesetzt werden. Auf diese Weise kann ein pharmakologischer Wirkstoff durch die Wahl eines entsprechenden erfindungsgemäßen Trägertrimers selektiv in räumliche Nachbarschaft bestimmter Zellen, die den pharmakologischen Angriffsort dieser Wirkstoffe darstellen gebracht werden. In Betracht kommt bspw. die Kopplung eines derartigen Wirkstoffes an ein FasL-Trimer, wobei die Bindung des FasL-Trimers den FasR blockiert (und damit erfindungsgemäß die Apoptose inhibiert, der Zelle damit das Überleben sichert), während der Wirkstoff unmittelbar auf die Zielzelle aufgebracht wird. Eine Verwendung eines diesbezüglichen Systems könnte sich bspw. ergeben, wenn als Wirkstoff cytotoxische Substanzen mit dem Trimer verknüpft werden, die einen Angriff von Immunzellen gegen die Zielzellen verhindern, bspw. bei degene- rativen, insbesondere neurodegenerativen Erkrankungen, vor allem Morbus Parkinson oder Morbus Alzheimer. Im Falle von Morbus Parkinson kann auf diese erfindungsgemäße Weise der Untergang der Dopamin erzeugenden Zellen in der Substantia Nigra verhindert werden. Allgemein wird daher der Einsatz derartiger Systeme von erfindungsgemäßem Träger und ggf. kovalent angekoppelter Wirkstoffkomponente als Arzneimittel in der Human- oder Veterinärmedizin offenbart
Bei der Komponente B des rekombinanten Fusionsproteins wird es sich typischerweise um ein Protein aus der Familie der Clq-Proteine oder der Collectine handeln. Besonders bevorzugt sind die Proteine der Clq- oder der Collectinfamilie als Bestandteil des rekombinanten Fusionsproteins, nämlich als Komponente B, dann, wenn nur deren Trimerisierungsdomäne, nicht aber deren Oligomerisierungsdomäne als Bestandteil des rekombinanten Fusionsprotein transkribiert bzw. translatiert wird. Vorzugsweise wird die Komponente B im rekombinanten Fusionsprotein auch die für die vorgenannten Proteine im nativen Zustand charakteristische globuläre "Kop -Domäne nicht ent- halten. Die vorgenannte Komponente B in einem erfindungsgemäßen rekombinanten Fusionsprotein wird also eine Sequenz aufweisen, die typischerweise nur den bspw. kollagenartigen Abschnitt enthält, der die Funktionalität zur Trimerisierung durch Ausbildung einer Tripelhelix aufweist, nicht aber jene Sequenzabschnitte, die darüber hinaus die Fähigkeit besitzen, mit anderen Tripelhelices eine Bi- oder Oligomerstruk- tur (bspw. ein Tetra- oder Hexamer von bspw. Tripelhelices) einzugehen.
Typischerweise wird daher das trimerisierende Fusionsprotein nur die für die Trimeri- serung verantwortlichen Domänen der Proteine aus den Familien der Clq-Proteine oder Collectine als Komponente B aufweisen, während deren jeweilige "Kopf - Domänen durch andere, gleichfalls eine biologische Funktion wahrnehmende Proteine oder Proteinabschnitte als Komponente A ersetzt werden. Der Begriff "rekombinantes Fusionsprotein" ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung also so zu verstehen, daß die mindestens eine Komponente A und die mindestens eine Komponente B im rekombinanten Fusionsprotein artifiziell fusioniert sind, d.h., daß ein Fusionsprotein i.S. der vorliegenden Erfindung keinem natürlich auftretenden Protein entspricht
Auch funktionelle, d.h. trimerisierende, Derivate von Proteinen aus der Clq-Protein- Familie oder der Familie der Collectine bzw. funktionelle Derivate von Abschnitten der vorgenannten Proteine können als Komponente B für die Aggregation von rekombinanten Fusionsproteinen zu Trimeren zum Einsatz kommen. Dabei wird beispielsweise die Komponente B die entsprechenden Sequenzabschnitte der Proteine Clq, MBP, SP-A ("lung surfactant protein A"), SP-D ("lung surfactant protein D"), BC (Bovines Serum∞nglutinin), CL43 (Bovines Collectin-43) und/oder ACRP30 oder auch von funktionellen Derivaten dieser Proteinabschnitte enthalten.
Besonders bevorzugt sind Trimere von rekombinanten Fusionsproteinen dann, wenn die Komponente B des rekombinanten Fusionsproteins einen Proteinabschnitt des Proteins Clq oder des Proteins ACRP30 mit einem Sequenzabschnitt von mindestens 8 AS Länge, typischerweise mindestens 20 AS Länge aus den kollagenartigen Sequenzbereichen, die eine Tripelhelix bilden, oder ein funktionelles Derivat derselben aufweist Als ganz besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellen sich Trimere von rekombinanten Fusionsproteinen dar, deren Komponente B eine Aminosäuresequenz gemäß Figur 1 (eingerahmte Sequenz, AS 45 bis 111) oder ein funktionelles Derivat dieser murinen (m: murin) Aminosäuresequenz (bspw. die analoge humane Sequenz oder die analoge Sequenz eines anderen Säugetiers) bzw. einen Abschnitt dieser Sequenz enthält
Insbesondere bevorzugt sind Trimere solcher Fusionsproteine, die Sequenzen aus ver- schiedenen Wirtsorganismen aufweisen. Ganz besonders bevorzugt sind erfindungsgemäße Aggregate dann, wenn sie aus chimären Fusionsproteinen stammen, wobei die Komponente A aus einer anderen Tierart stammt als die Komponente B. Derart kann es vorteilhaft sein, daß die Komponente A einer Aminosäuresequenz aus der Maus, Ratte, Schwein oder einem anderen Vertebraten, insbesondere aus einem Säuger, oder einem funktioneilen Derivat derselben entspricht und die Komponente B humanen Ursprungs ist oder umgekehrt Andererseits bevorzugt können die Sequenzen der Komponente A und der Komponente B in einem erfindungsgemäßen Fusionsprotein, das ein erfindungsgemäßes Trimer bildet, aber auch aus der gleichen Tierart stammen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Trimerisierung der rekombinanten Fusionsproteine durch eine kurze Aminosäuresequenz von mehr als 6 Aminosäuren, vorzugsweise von 8 bis 30, ganz besonders bevorzugt von 8 bis 20 Aminosäuren, die in den rekombinanten Fusionsproteinen als Komponente B vorhanden ist Die durch diese kurzen Aminosäuresequenzen erreichte Trimerisierung von Fusionsproteinen, beruht typischerweise auf der Ausbildung von Supersekundärstrukturen, insbesondere auf der Ausbildung von „coiled-coil"- Tripelhelices. Hierzu sind bspw. alle Sequenzabschnitte von Proteinen geeignet, die durch Ausbildung von Supersekundärstrukturen Trimere generieren, z.B. typische Kollagen-artige Tripelhelices bzw. Abschnitte derselben (wie sie z.B. bei den Proteinen CMP, COMP, Kollagen oder Laminin).
Da die zur Trimerisierung führende Komponente B des rekombinanten Fusionsproteins erfindungsgemäß im wesentlichen keine höheren Aggregate bilden sollte, sollte die Komponente B typischerweise keinen Cysteinrest aufweisen, der eine intermolekulare Disulfidbrücke ausbilden kann. Vorzugsweise wird die Komponente B in einem rekombinanten Fusionsprotein daher keinen Cysteinrest oder nur solche Cysteinreste, die eine intramolekulare Disulfidbrücke, also im rekombinanten Fusionsprotein selbst besitzen, um zu vermeiden, daß unter oxidierenden Bedingungen eine kovalente Verknüpfung mit dem mindestens einen Cysteinrest eines Fusionsproteins eines anderen Trimers auftreten kann.
Das Fusionsprotein kann neben den Komponenten A und B zusätzliche Sequenzabschnitte aufweisen. Bevorzugt sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung in diesem Zusammenhang sog. Tag-Sequenzen, beispielsweise mindestens ein Flag-Tag, also die Aminosäurenfolge DYKDDDDK, und/oder aber auch beispielsweise mindestens ein His-Tag (enthaltend mehrere konsekutive Histidine, bspw. mindestens 5) und/oder weitere Tag- oder antigenische Sequenzen. Darüber hinaus können die einzelnen Abschnitte (Komponenten A, B oder Tagsequenzen, wobei auch zwei oder mehr Komponenten A im erfindungsgemäßen Fusionsprotein auftreten können) eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins durch Linkersequenzen voneinander getrennt sein. Diese Linkersequenzen (mindestens 2 AS, vorzugsweise mindestens 5 AS) dienen zur struk- turellen Abtrennung der verschiedenen funktionellen Komponenten im rekombinanten Fusionsprotein und können bevorzugt auch eine "Scharnier"-Funktion übernehmen, d.h. eine Aminosäuresequenz flexibler Struktur darstellen. Ganz besonders bevozugt sind solche Linker, die mindestens eine proteolytische Schnittstelle enthalten, die es erlaubt die Komponenten A von den Komponenten B abzutrennen. Bei der proteolyti- sehen Schnittstelle im Linker handelt es sich vorzugsweise um eine Thrombin- Konsensussequenz.
Die Komponente A kann grundsätzlich C- oder N-teπninal von der Komponente B angeordnet sein, vorzugsweise C-terminal. Die Tag-Sequenzen können an jeder Positi- on eins erfindungsgemäßen rekombinanten Fusionsprotein auftreten, vorzugsweise am N-Teπninus.
Als weiterer Erfindungsgegenstand der vorliegenden Erfindung werden auch Verfahren offenbart, die zur Blockierung von zellulären extramembranösen Rezeptoren die- nen. Derartige Verfahren zeichnen sich durch Rekombination mindestens einer Komponente A, die einem Protein oder Proteinabschnitt mit biologischer Funktion entspricht, mit mindestens einer trimerisierenden Komponente B aus, wobei zunächst (a) ein derartiges rekombinantes Fusionsprotein, bspw. in einem Expressionsvektor, exprimiert wird, (b) isoliert wird und dann (c) für in vitro Untersuchungen einer Zellkultur, bspw. einer Zellsuspension, zugegeben wird. Damit ist das vorliegende Verfahren geeignet, für in vitro Untersuchungen, Zellen bspw. vor dem apoptotischen Zelltod zu bewahren. Derartige Zellen mit verfahrensgemäß gebundenen erfindungsgemäßen Trimeren können dann für weitere in vitro Untersuchungen eingesetzt werden oder auch zur Herstellung eines Arzneimittels dienen. Im Falle einer hohen Bindungskonstante können derartige in vitro behandelte Zellen retransplantiert werden. Bspw. kommt eine derartige Vorgehensweise bei Autoimmunerkrankungen oder degenerati- ven Erkrankungen in Betracht, um die Zellen vor einem apoptotischen Untergang in vivo zu bewahren.
Ganz besonders bevorzugt ist ein Verfahren obiger Art dann, wenn die Komponente A ein TNF-Cytokin, ein Abschnitt eines TNF-Cytokins oder ein funktionelles Derivat eines solchen Proteins oder Proteinabschnitts ist
Trimere der vorliegenden Erfindung kommen zur Herstellung eines Arzneimittels bzw. zur Behandlung von Erkrankungen oder Störungen zum medizinischen, d.h. sowohl zum human- als auch zum veterinärmedizinischen Einsatz, in Betracht insbesondere wenn die Komponente A ein Signalprotein oder ein Abschnitt eines solchen oder ein Derivat des Proteins oder Abschnitts ist Ein weites Spektrum von Erkrankungen oder Störungen kann mit den erfindungsgemäß beanspruchten Trimeren (Hetero- oder Ho- motrimere) behandelt werden. Ihre Verwendung ist insbesondere dann gegeben, wenn erhöhte extrazelluläre Konzentrationen der entsprechenden physiologischen Liganden oder eine Erhöhung der Zahl der membranständigen Rezeptoren bei einem Krankheitsbild auftreten/auftritt. Hierbei kann es sich auch um erhöhte Konzentrationen von membranständigen Signalmolekülen, bspw. TNF-Cytokinen (bspw. FasL), auf den Zellen selbst oder von löslichen Signalmolekülen, bspw. nach Proteasespaltung löslichem TNF-Cytokin, handeln. In einer keinesfalls abschließenden Aufzählung können derartige erfindungsgemäße Trimere bspw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von hyperinflarnmatorischen Störungen, Autoimmunerkrankungen, Erkrankungen, die auf hyperapoptotischen Reaktionen beruhen, oder degenerativen, ins- besondere neurodegenerativen Erkrankungen (bspw. Morbus Parkinson), ggf. auch viralen Infektionen eingesetzt werden. Erfindungsgemäße Trimere sind dann ganz besonders geeignet, wenn die Erkrankung eine Behandlung erforderlich macht, die die biologische Wirkung von nativen Cytokinen verhindern möchte, also zur Blockade entsprechender Cytokin-Rezeptoren dient Als Beispiele wäre zu nennen: Behandlung von viraler Hepatits (HBV, HCV), Alkohol- induzierte Hepatitis-Erkrankungen, cho- lestatische Hepatitis, Morbus Wilson, Hepatitis wegen Störung des Autoimmunsystems, von Abstoßungsreaktionen nach Lebertransplantation, GvHD, TEN (toxische epidermale Nekrolyse), Hashimoto Thyroiditis oder Multiple Sklerose.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind DNA-Sequenzen, die für Fusionsproteine der vorgenannten Art kodieren. Derartige DNA-Sequenzen werden in Expressionsvektoren exprimiert, wobei auch die entsprechenden Expressionsvektoren, die eine DNA-Sequenz für die erfindungsgemäßen Fusionsproteine enthalten, Gegens- tand der Erfindung sind. Weiterhin gehören zur vorliegenden Erfindung solche Wirtszellen, die mit DNA-Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen Fusionsproteine kodieren, transfiziert sind. Ganz besonders bevorzugt sind in diesem Zusammenhang Wirtszellen, die mit Expressionsvektoren transfiziert sind, wobei die Expressionsvektoren wiederum DNA-Sequenzen enthalten, die für die erfindungsgemäßen Fusionsproteine kodieren. Alle vorgenannten Gegenstände nach dieser Erfindung kommen als Arzneimittel bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels, insbesondere zur Behandlung von Erkrankungen, die in der vorliegenden Patentanmeldung offenbart sind, ggf. als Bestandteil einer Zusammensetzung in Betracht
Die erfindungsgemäßen Trimere bzw. die weiteren Gegenstände der vorliegenden Erfindung werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt so zur Herstellung eines Arzneimittels bzw. zur Behandlung der vorgenannten Erkrankungen oder Störungen verwendet, daß sie zur parenteralen, d.h. beispielsweise subkutanen, intramuskulären, intraarteriellen oder intravenösen, oder oralen oder intranasalen oder analen, intraperitonealem, vaginalen oder bukkalen, intrazerebralen, intraokularen Verabreichung (Injektion oder Infusion) , ggf. auch zur topischen Applikation, geeignet sind. Die erfindungsgemäßen Trimere bzw. Wirtszellen, die erfindungsgemäße Trimere bilden, oder die DNA-Sequenzen, die für rekombinante Fusionsproteine codieren, die Trimere bilden können, oder entsprechende Expressionsvektoren können jeweils als solche als Arzneimittel dienen bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels herangezogen werden. Sie können aber auch in Kombination mit anderen aktiven Wirkstoffkompo- nenten bzw. pharmazeutischen Hilfs-, Träger- oder Zusatzstoffen als Arzneimittel zum Einsatz kommen. Die erfindungsgemäßen Trimere oder die weiteren Erfindungsgegenstände können damit als Bestandteile in Kombination mit pharmazeutisch akzeptablen Träger-, Hilfs- und/oder Zusatzstoffen kombiniert werden. Offenbart werden nach Maßgabe der vorliegenden Erfindung daher auch (pharmazeutische) Zusammensetzungen, enthaltend erfindungsgemäße Gegenstände, insbesondere erfindungsgemäße Trimere. Entsprechende Herstellungswege sind bei "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980) offenbart, das vollinhaltlich Bestandteil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung ist Für die parenterale Verabreichung kommen als Trägerstoffe bspw. steriles Wasser, sterile Kochsalzlösungen, Polyalky- lenglykole, hydrogenierte Naphthalen und insbesondere biokompatible Lactidpolyme- re, Lactid/Glycolidcopolymer oder Polyoxyethylen-/Polyoxypropylencopolymere in Betracht. Erfindungsgemäße Zusammensetzungen können Füllsubstanzen oder Substanzen, wie Lactose, Mannitol, Substanzen zur kovalenten Anknüpfung von Polyme- ren, wie z.B. Polyethylenglykol an erfindungsgemäße Inhibitoren, Komplexierung mit Metallionen oder Einschluß von Materialien in oder auf besondere Präparationen von Polymerverbindung, wie z.B. Polylaktat, Polyglykolsäure, Hydrogel oder auf Liposo- men, Mikroemulsion, Micellen, unilamelare oder multilamelare Vesikel, Erythrozyten- Fragmente oder Sphäroplasten, enthalten. Die jeweiligen Ausführungsformen der Zu- sammensetzungen werden abhängig vom physikalische Verhalten, beispielsweise in Hinblick auf die Löslichkeit, die Stabilität, Bioverfügbarkeit oder Abbaubarkeit gewählt Konstrollierte oder konstante Freisetzung der erfindungsgemäßen Wirkstoffkomponente in der Zusammensetzung schließt Formulierungen auf der Basis lipophiler Depots ein (z.B. Fettsäuren, Wachse oder Öle). Im Rahmen der vorliegenden Erfin- düng werden auch Beschichtungen erfindungsgemäßer Substanzen oder Zusammensetzungen, enthaltend solche Substanzen, nämlich Beschichtungen mit Polymeren offenbart (z.B. Poloxamere oder Poloxarnine). Weiterhin können erfindungsgemäßen Substanzen bzw. Zusammensetzungen protektive Beschichtungen, z.B. Proteaseinhibi- toren oder Permeabilitätsverstärker, aufweisen.
Erfindungsgemäße Trimere finden bevorzugt auch Verwendung im Bereich der In- vitro-Diagnose oder aber beispielsweise für biochemische Reinigungsverfahren. Zu denken ist an den Einsatz von erfindungsgemäßen Trimeren im Rahmen von biochemischen Reinigungsverfahren, insbesondere chromatographischen Verfahren, bspw. auf Reinigungssäulen, die mit derartigen Komplexen bepackt sein können, um bspw. Zellen, die die korrespondierenden extrazellulären Rezeptoren exprimieren, isolieren zu können. Damit wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Verwendung von derartigen Komplexen auch zu Nachweiszwecken offenbart.
Als weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung werden vorliegend Fusionsprote- ine beschrieben, die zur Trimerisierung von geeignet sind, sofern das rekombinante Fusionsprotein mindestens eine Komponente A und mindestens eine Komponente B enthält, wobei die Komponente A ein Protein oder einen Proteinabschnitt mit biologischer Funktion, insbesondere mit Ligandenfunktion für Antikörper oder Rezeptoren enthält, und die Komponente B einen trimerisierenden Abschnitt oder ein funktionelles Derivat eines solchen Abschnitts eines Proteins, wie als Bestandteil der erfindungsgemäßen Trimere oben beschrieben, enthält Damit werden erfindungsgemäß alle jene rekombinaten Fusionsproteine offenbart, die zuvor als Bestandteile von erfindungsgemäßen Trimeren offenbart sind. Die obige Offenbarung - im Zusammenhang mit erfindungsgemäßen Trimeren - zu den Komponenten A und B bzw. zur Konstruktion eines rekombinanten Fusionsproteins korrespondiert daher mit den Ausfuhrungsformen eines erfindungsgemäßen rekombinanten Proteins selbst. So ist die Komponente B eines erfindungsgemäßen rekombinanten Fusionsproteins typischerweise ein Proteinabschnitt ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus der Familie der Clq-Proteine oder der Collectine bzw. aus der Familie der kollagenartigen Proteine, wobei die Komponente B des rekombinanten Fusionsproteins vorzugsweise ausschließlich einen trimerisierenden Abschnitt enthält, aber keine die Trimere oligimerisierende Struktur oder globuläre „Kop -Domäne aufweist. Typischerweise wird die Komponente B daher mindestens eine Aminosäuresequenz mit dem Heptadmuster (abcdefg)n aufweisen, das strukturell eine eine Tripelhelix bildenden Helix bildet, deren Aminosäuren in den Positionen a und d vorzugsweise apolare Seitenketten tragen und dadurch die Ausbildung der oben beschriebenen superhelikalen Struktur, hier als Tripelhelix aus drei Helices erlauben. Derartige Sequenzen aus mindestens einem Heptadmuster, vorzugsweise mindestens zwei können bspw. aus einem der folgenden Protein Keratin, Kollagen, Clq, MBP, SP-A, SP-D, BC, CL43 oder ACRP30 stammen. Auch ein funktionelles Derivat eines solchen Abschnitts der vorgenannten Proteine kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung zum Einsatz kommen, wobei die oben gewählte Definition eines funktioneilen Derivats für die Komponente A entsprechend auch für die Komponente B gilt
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Inhibitor, der als Hexamer (2x3) durch Ausbildung einer Disulfidbrücke in Lösung in vitro vorliegt (ApoFasL- 060). In vivo liegt dieser Inhibitor - ggf. in oxidierendem Milieu - als Trimer vor oder verhält sich wie ein Trimer und entfaltet auf diese Weise inhibitorische Eigenschaften. ApoFasL-060 besteht aus einer N-terminalen Flag-Sequenz, einem Linker und einem spezifischen Linker sowie den AS 103 bis 138 aus hFasL und den AS 139 bis 281 (Komponente A), ebenfalls aus hFasL (s. Fig. 1). Analog kann ein Inhibitor der Art von ApoFasL-060 auch als Komponente A die entsprechenden Bindungsäbschnitte anderer TNF-Cytokine tragen, bspw. OX40L, RANKL, TWEAK, Lta, Ltab2, LIGHT, CD27L, 41-BB, GITRL, APPJL, VEGI und BAFF bzw. deren Abschnitte oder Derivate in Betracht Ganz besonders bevorzugt sind die Proteine CD40L, FasL, TRAIL, TNF (insbesondere TNF, das an den Rezeptor TNF-R2 bindet), CD30L und EDA bzw. deren Abschnitte oder Derivate, insbesondere deren jeweilige humane Sequenzen.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Figuren näher erläutert:
Figur 1 zeigt die Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen FasL-Chimären (FasL- 199, FasL-060 und FasL-267) im Ein-Buchstaben-Code. Die beiden Proteinchimären FasL-199 und FasL-267 enthalten einen Bestandteil des Proteins ACRP30, eines Plasmaproteins, das strukturell ähnlich dem Komplement-Faktor Clq ist und von Adi- pozyten produziert wird. Das Protein ACRP30 hat nativ eine Länge von 247 Aminosäuren, wobei sie am N-Terminus eine Sekretionssignalsequenz (AS 1 bis 17), mit einer nachfolgenden Sequenz von 27 Aminosäuren (AS 18 bis 44), die für die Oligo- merisierung des Proteins verantwortlich ist, aufweist Der nachfolgende Abschnitt (AS 45 bis 110) des nativen Proteins enthält 22 kollagenartige Sequenzwiederholungen, die demnach die „coiled-Coil"-Domäne bilden. Diese coiled-Coil-Domäne sorgt im nativen Zustand für die Trimerisierung.
Die Protemchimäre FasL-199 (Kontrolle) wurde mit Hilfe einer PCR-Amplifizierung konstruiert und enthält die vollständige Oligomerisierungsdomäne von murinem ACRP30 (mACRP30) (Aminosäuren 18 bis 110). C-terminal hiervon das FasL- Chimärenprotein die Trimerisierungsdomäne von FasL (Aminosäuren 139 bis 281). Linker-Sequenzen befinden sich zwischem dem N-terminalen Flag-Tag und dem mACRP30- Abschnitt sowie zwischen mACRP30 (Komponente B) und dem humanen hFasL-Abschnitt (Komponente A) (LQ).
Das Qύmärenprotein FasL-267 entspricht weitestgehend dem Konstrukt FasL- 199, weist jedoch eine Deletion des mACRP30-Abschnitts auf. Es enthält nicht die Oligo- merisierungsdomäne (Aminosäuren 18 bis 44) von ACRP30. Die Deletionsmutante wurde durch PCR Verfahren aus dem EST-Klon AA673154 hergestellt Die Deletion der Aminosäuren 18 bis 44 von mACRP30 bewirkt, daß das Konstrukt als Trimer vorliegt, wie durch die Gelfiltrationsexperimente gezeigt
Das caύmärenprotein FasL-060 weist am N-Terminus eine Flag-Sequenz, gefolgt von einem Linker (GPGQVQLQ), einem spezifischen Linker, der eine Disulfidbrücke bilden kann, die AS 103 bis 138 von humanem FasL (hFasL) und schließlich als Komponente A die AS 139 bis 281 von hFasL auf. Je nach Ausbildung der Disulfidbrücke verhält sich ApoFasL-060 als Trimer oder als Hexamer.
Figur 2 zeigt in Figur 2A die Aktivität von ApoFasL-060 und ApoFasL-267 in vitro in Hinblick auf die Überlebensfähigkeit von Bjab-Zellen. Aufgetragen auf der y- Achse ist jeweils die Absorbanz bei OD 490 um, aufgetragen auf der x-Achse jeweils (in logarithmischer Darstellung) ist die Konzentration der zugegebenen Fusionsproteine für den Zytotoxizitätstest Die optische Dichte bei 490 nm ist ein Maß für die Lebensfähigkeit der Zellen (hohe optische Dichte entspricht einer geringen apoptotischer Wir- kung der zugegebenen Substanzen und damit einer hohen Lebensfähigkeit der Zellen). Dargestellt sind die Kurvenverläufe für Assays mit ApoFasL-267 (o), ApoFasL-060 ( ), jeweils ohne Zugäbe von kreuzvernetzendem Antikörper, oder jeweils unter Zugäbe von kreuzvernetzendem Antikörper (•, ■). FasL-267 allein ist auch bei hohen Konzentrationen (d.h. geringer Verdünnung) für die Zellen nicht zytotoxisch - im Un- terschied zu FasL-267 mit kreuzvernetzendem Antikörper.
Figur 2B zeigt in einer Darstellung wie in Figur 2A die inhibitorische Aktivität von ApoFasL-267 (o) und ApoFasL-060 ( ). Um die inhibitorische Aktivität bestimmen zu können, wurden zur Auslösung der Apoptose oligomerisiertes FasL bei einer Konzent- ration von 50 ng/ml in allen Versuchen hinzugegeben.
Figur 2C zeigt die Ergebnisse von Affinitätsuntersuchungen, und zwar vergleichend die Affinität von FasL-199 und FasL-267 gegenüber Bjab-Zellen. Hierbei konkurrieren ApoFasL-267 und FasL- 199 mit ZB4- Antikörpern um die Bindung an Fas auf BJAB- Zellen. Aufgetragen ist der Prozentsatz von gebundenem ZB4 (einem anti-Fas- Antikδrper) gegen die Konzentration von FasL-199 ( ) bzw. FasL-267 (o). Innerhalb der Meßungenauigkeiten ergab sich kein Unterschied in Hinblick auf das Affinität der beiden FasL-Liganden. Damit konnte gezeigt werden, daß der Unterschied der beiden Liganden in Hinblick auf deren Zytotoxizität nicht auf unterschiedlicher Bindungsaffi- nität an den Rezeptor beruht.
Figur 3 zeigt die Ergebnisse von in vivo-Experimenten, und zwar die Wirkung der ApoFasL-060-Inhibition auf die durch agonistischen anti-Fas-Antikörper J02 induzierte Hepatolyse. Figur 3A zeigt die Ergebnisse von Versuchen, bei denen Mäusen intra- venös entweder ApoFasL-060 (25 μg/Maus) oder Kochsalzlösung (Kontrolle) vor der intravenösen Injektion von 5 μg J02-Antikδrper injiziert wurde. Die ausgefüllten Balken in Figur 3A stellen die Serumtiter (in U/ml) von ALT und die offenen Balken von AST als Ergebnisse der Messungen vier Stunden nach iv Injektion dar. Die rechte Auftragung gibt das Ergebnis des Kontrollversuchs wieder. In Figur 3B ist die Überlebensrate von Mäusen dargestellt, die 10 μg J02-Antikörper erhalten haben, und zwar nach Vorbehandlung mit Kochsalzlösung (ausgefüllte Balken) oder mit ApoFasL-060 (20 μg) (hellgraue Balken, jeweils 2. von links) oder nur mit ApoFasL-060 (dunkelgraue Balken, jeweils dritter von links) oder mit ApoFasL-060 und kreuzvernetzendem Antikörper (mittelgraue Balken, jeweils rechts), in Abhängigkeit von der Zeit nach Verabreichung (2h, 4h, 24h). Nach 4 h ist keine der Mäuse, die ausschließlich agonistischen J02-Antikδrper erhalten hat (schwarze Balken), am Leben, während der Inhibitor (hellgraue Balken) das Überleben der Mäuse nahezu vollständig ermöglicht Damit verhindert ApoFasL-060 die Letalwirkung des agonistischen anti-Fas-Antikörpers J02 in Mäusen. Durch kreuvemetzenden Antikörper wird die inhibitorische Wirkung von ApoFasL-060 (mittelgraue Balken) wieder aufgehoben.
Figur 4 zeigt die Wirkung von ApoFasL-267 nach einem durch oligomerisiertes FasL induzierten Leberschaden. Figur 4 stellt die Ergebnisse aus Versuchen dar, bei denen den Mäusen intravenös entweder Kochsalzlösung oder 25 μg von ApoFasL-267 vor der intravenösen Injektion von oligomerisiertem FasL (FasL-199) injiziert wurde. Die Serumtiter von ALT (ausgefüllte Balken) und AST (offene Balken) wurden nach Ab- lauf von vier Stunden analysiert Wiederum stellen die Balken die jeweiligen Titer in U/ml dar. Die Auftragungen in der Mitte und rechts in Figur 4 zeigen die Ergebnisse nach Gabe von agonistischem, d.h. Apoptose auslösendem FasL, die linke Auftragung stellt den Vergleichsversuch ohne Gabe von agonistischem FasL dar. Neben den Ergebnissen von Kontrollexperimenten sind somit in Figur 4 die Ergebnisse von Versu- chen mit FasL-199 ohne protektiven Liganden und von FasL-199 in Kombination mit protektivem Liganden FasL-267 dargestellt
In Figur 5 ist die Wirkung von löslichem FasL im Falle einer AAP-induzierten Hepatitis dargestellt. Den Mäusen wurde intravenös entweder ApoFasL-267 (Figur 5A) oder ApoFasL-060 (Figuren 5 B und 5C) vor der intraperitonealen Injektion von AAP (300 mg/kg) injiziert. Aufgetragen sind in den Figuren 5A und 5B die Titer (U/ml) von ALT (ausgefüllte Balken) und AST (offene Balken), die jeweils fünf Stunden nach der Injektion gemessen wurden. Die linken Auftragungen in den Figuren 5A und 5B entsprechen den Vergleichsversuchen, während die rechte (Figur 5A) bzw. in Figur 5B die mittlere und die rechte Auftragung die Resultate nach Gabe der erfindungsgemäßen Inhibitoren darstellen. Figur 5C zeigt die relative Abnahme der Aminotransferase-Titer im Vergleich zu scheinbehandelten (KontroU)-Tieren (100%).
Figur 6 stellt die Wirkung von ApoFasL-267 und ApoFasL-060 auf eine mit AAP behandelte Mäuseleber dar. Die Mäuse wurden, wie vorangehend in Figur 5 beschrieben, behandelt 24 Stunden nach der Hepatitis-Induktion wurden die Lebern seziert und histologisch ausgewertet Figur 6 enthält drei Abbildungen von histologischen Schnitten (Zugabe von AAP, Zugabe von AAP und ApoFasL-267 und schließlich ein Vergleichsansatz (Kontrolle) nach Zugabe von Kochsalzlösung). Die Behandlung der Mäuse mit ApoFasL-267 (oder ApoFasL-060, nicht dargestellt) verhindert Leberschädigungen, wie aus einem Vergleich mit dem histologischen Schnitt aus den Kontroll- tieren erkennbar ist Dagegen zeigen die Lebern von ausschließlich mit AAP behandelten Tieren Nekrose und Apoptose im zentralen Venula-Bereich, sinusoidaler entzündlicher Blutandrang und vakuolisierte Hepatocyten.
Figur 7A zeigt die cDNA-Sequenz sowie die davon abgeleitete Arninosäuresequenz der erfindungsgemäßen Fas-Chimäre Fas-ACRP30 (MKB216). Das Konstrukt enthält die Aminosäuren 17 bis 172 der extrazellulären Domäne von Fas (also dem Fas- Rezeptor), fusioniert über einen Linker von 14 Aminosäuren an die vollständige Oli- gomerisierungsdomäne von murinem ACRP30 (Aminosäuren 18 bis HO). Aminoter- minal enthält das Konstrukt außerdem eine Signalsequenz der schweren Kette von Ig sowie einen Flag-Tg. Des weiteren sind in der Figur die Restriktionsschnittstellen angegeben.
Figur 7B zeigt eine Restriktionskarte mit den angegebenen Schnittstellen des Kon- strukts von Figur 7A.
In Figur 8 ist die Inhibitorwirkung von Fas-ACRP30 in vitro gegenüber FasL- vermittelter Apoptose bei A20-Zellen dokumentiert Auf der y- Achse ist die Absorpti- on bei 490 nm (Maß für die Überlebensfähigkeit der Zellen; vgl. auch Figur 2) aufgetragen, während auf der x-Achse die Konzentration des jeweiligen Fusionsproteins in ng/ml aufgetragen ist Es wurde die inhibitorische Wirkung von Fas-ACRP30 mit derjenigen von Fas-Fc, einer dimeren Form von Fas, und derjenigen von Fas-COMP, ei- ner pentamären Form von Fas, verglichen. Als Apoptose-induzierendes Agens diente die erfindungsgemäße FasL-Cfeimäre FasL-199. Das Fas-ACRP30-Konstrukt inhibiert die FasL-induzierte Apoptose mit einem ICsα-Wert von 80 ng/ml. Dieser Wert ist vergleichbar mit demjenigen des pentameren Fas-Derivats Fas-COMP (35 ng/ml), während der ICso-Wert für (dimeres) Fas-Fc mehr als 1 μg/ml beträgt
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert:
Die folgenden experimentellen Gegebenheiten (a) bis (f) sind, soweit einschlägig und nicht entsprechende a.a.O. offenbarte Modifizierungen gelten, für die sechs nachfolgenden Ausführungsbeispiele heranzuziehen:
(a) Vektorkonstruktionen für die FasL-, TRAIL-, TNFα- und CD40L- Fusionsproteine: Die Trimerisierungsdomäne von FasL (AS 139-281) wurde aus humaner cDNA unter Verwendung der Ohgonukleotide JT398 (ACT GCA GGA AAA AAA GGA GCT G) und J290 (CAA CAT TCT CGG TGC CTG TAA C) amplifiziert Das PCR-Produkt wurde in pCRII (InVitrogen) ligiert und die kodierenden Sequenz, eingerahmt von den Restriktionsschnittstellen Pstl und EcόK, dann, enthaltend ein für das Signalpeptid von Ifärnagglutinin codierendes DNA-Fragment, einschließlich 6 Basen der im 5'- Bereich unübersetzten Sequenz (CAA AAC ATG GCT ATC ATC TAC CTC ATC CTC CTG TTC ACC GCT GTG CGG GGC) sowie das Flag-Epitop (GAT TAC AAA GAC GAT GAC GAT AAA), den Linker (GGA CCC GGA CAG GTG CAG), die Restriktionsschnittstellen Pstl, Soll, Xhol und Bamϊü, zwischen die Restriktions- Schnittstellen HiruM und BamYQ. eines modifizierten pCRUI-Vektors (PS038, InVitrogen, NV Leek, Niederlande) subkloniert, in dem die Basen 720-769 deletiert wurden (PS 038). Der Expressionsvektor für FasL-199 wurde in folgender Weise konstruiert Mittels des EST-Klons AA673154 wurde zunächst eine PCR-Amplifikation mit Hilfe der Oligo- nukleotide JT1147 (ACA ATG CAT GAA GAT GAC GTT ACT AC) und JT1148 (AGA CTG GAG AGC GGC TTC TCC AGG) durchgeführt Die für die Aminosäuren 18 bis 111 des murinen ACRP30 kodierende Sequenz, eingerahmt von den Restriktionsschnittstellen Nsil und Pstl in die Pstl-Schnittstelle des für trimeren FasL kodierenden Vektors kloniert (dergestalt, daß die fusionierte Nsil/Pstl-Schnittstelle auf der 5 - Seite der kodierenden Sequenz lag). Der Vektor zur Expression des Fusionsproteins FasL-167 (mit den AS 44-111 von mACRP30) wurde mit Hilfe des alternativen 5'- Oligonukleotids JT1421 (AAA ATG CAT GCA GGC ATC CCA GGA C) amplifi- ziert Das PCR-Produkt wurde in ein PCR-„blunt" System ligiert und die Nsi/Pstl- Kassette in den FasL-enthaltenden Vektor - wie oben beschrieben - subkloniert Andere Fusionsproteine mit alternativen TNF-Cytokinen in Kombination mit ACRP30 wurden durch Substituierung der entsprechenden Sequenz von FasL im Expressionsvektor FasL-ACRP30 mit der jeweiligen Ligandensequenz in die Restriktionsschnittstellen Pstl und EcoRI erstellt
(b) Expression und Reinigung der rekombinanten Proteine: HEK293-Zellen wurden mit Hilfe de Calciumphosphat-Methode stabil transfiziert Nach drei Tagen Inkubation wurden die HEK293-Zellen für zwei Wochen in einem Selektionsmedium kultiviert, das 800 μg ml G418 enthielt (siehe auch a.a.0: Schneider et al., J. Exp. Med. 1998). Diese stabil transflzierten Klone wurden entnommen und in 96 well"-Platten in Selektionsmedien verteilt Die Überstände wurden mit Hilfe der anti-Flag Westem-Blot-Technik in Hinblick auf die Präsenz des rekombinaten Proteins untersucht
Die stabil transflzierten Zellen wurden für die Dauer von 10 bis 14 Tagen in 800 ml eines nicht-selektiven Mediums in Flaschen aufgezogen. Die Kultur wurde zentrifu- giert und der Überstand filtersterilisiert Fusionsproteine von FasL mit murinem ACRP30 (FasL-267 oder FasL-199) wurden dann in der folgenden Weise aufgereinigt Die Überstände wurden mit NaCl und CaCl2 versetzt (Endkonzentrationen von 150 mM bzw. 2 mM) und der pH-Wert mittels Salzsäure/Natronlauge auf 7,0 eingestellt Daraufhin wurde das rekombinante Protein auf eine 1 ml M2-Agarose-Säule (Sigma, Schweiz) aufgebracht (0,5 πύ/ra , 48 h, 4°C), die Säule mit 10 Volumina TBS, enthaltend 2 mM CaCl2, gewaschen und schließlich in TBS-EDTA (10 mM) (0,1 ml/min, 4°C) oder 50 mM Citrat-NaOH (pH 2,5) (1 ml/min, 4°C) eluiert und ggf. mit 0,2 Volumina von 1 M Tris-HCl (pH 8) neutralisiert Der Puffer wurde gegen PBS in Kon- zentratoren mit einer 30kDA-Grenze (Millipore) ausgetauscht Die Konzentration von gereinigten Proteinen wurde durch das Bicmchoninsäure-Verfahren (Pierce Chemical Co., Rockford, PL, USA) unter Verwendung von Rmderserumalbumin als Standard bestimmt und die Reinheit der Proben durch SDS-PAGE und Coomassie-Blue- Färbung ermittelt
(c) Zellen:
Die humanen T-Lymphoplastom-Jurkat-Zellen, BJAB Burkitt-Lymphomzellen oder Raji-Zellen wurden in RPMI, begleitet von 10% FCS, aufgezogen. Die humanembryonischen Nierenzellen 293 wurden in einem DMEM Mehrstoffmix F12 (1:1), angereichert mit 2% FCS, kultiviert Alle Medien enthielten Antibiotika (Penicillin und Streptomycin bei 5μgml jeweils und Neomycin bei 10 μg/ml).
(d) ZytotoxischerAssay:
Der zytotoxische Assay wurde im wesentlichen, wie zuvor bei Schneider et al. (J. Biol. Chem. 272:18827-18833, 1997) beschrieben durchgeführ Hierbei wurden 50.000 Zellen für die Dauer von 16 Stunden in 100 μl Medium inkubiert, wobei das Medium die angezeigten Ligandenkonzentrationen in Gegenwart oder Abwesenheit von 1 μg ml M2-Antikδrper enthielt Die Zellüberlebensraten wurden mit Hilfe von PMS/MTS (Phenanzinmethosulfat 3-[4,5-dimemylthiazol-2-yl]-5-[3-carboxymethoxyphenyl]-2- [4-sulfophenyl]-2H-tetrazolium, Salz) (Promega Corp., Madison, WI) bestimmt Die Farbentwicklung wurde für die erforderliche Zeit (typischerweise 1-3 Stunden) zugelassen. Die Absorbanz wurde bei 490 um gemessen. Die optische Dichte bei 490 nm ist ein Maß für die Lebensfähigkeit der Zellen (hohe optische Dichte entspricht einer geringen apoptotischer Wirkung der zugegebenen Substanzen und damit einer hohen Lebensfähigkeit der Zellen). (e) Behandlung der Mäuse
Weiblichen Balb/c-Mäusen (8 bis 10 Wochen alt) wurden die verschiedenen Konstruk- te intravenös injiziert Das Ausbluten der Mäuse erfolgte nach den angegeben Zeitintervallen mit nachfolgender Quantifizierung der Titer der Aminotransferasen AST und ALT (Aspartataminotransferase und Alaninaminotransferase)
(f) Materialien
Die anti-Flag-Ml- bzw. anti-Flag-M2-Antikδrper , gekoppelt an Agarose wurden von Sigma (Buchs, Schweiz) erworben. Die Antikörper J02 wurden von Pharmingen und die Zellkultur-Reagenzien von Life Sciences (Basel, Schweiz) erworben.
(g) Bindungsstudie
Die Affinität von ApoFasL-267 und FasL-199 wurde unter Verwendung eines Kompe- titionsassays bestimmt Die monoklonalen anti-Fas-Antikδrper ZB4 wurden hierzu mit 100 μCi (1251) durch die iodo-Gen-Methode (Pierce, Rockford, IL) markiert Dies führte zu einer spezifischen Aktivität von 1,5 μCi/μg Protein. 1x105 Bjab-Zellen wurden mit radiomarkiertem ZB4 und nicht-markierten Kompetitoren in serieller Verdünnung (100 μg/ml bis 10 ng/ml) für lh bei 37°C inkubiert Nach drei Waschgängen mit kaltem PBS, das 1% BSA enthielt, wurde die an die Zellen gebundene Radioaktivität mit einem γ-Zähler bestimmt und als Prozentsatz von gebundenem cpm ausgedrückt Alle Experimente wurden dreifach ausgeführt
Im übrigen wird hinsichtlich der Beschreibung der für die Durchführung der Ausfüh- rungsbeispiele eingesetzten Methoden ausdrücklich auf Schneider et al. (J. Exp. Med., Vol. 187, Nr. 8, 1998, 1205-1213) und die dort als Referenzen zitierten Publikationen verwiesen.
1. Ausfuhtungsbeispiel Es wurde ein rekombinantes Fusionsprotein (1, FasL-199) exprimiett, das die Aminosäuren 139 bis 281 des hFasL (h: human) als Komponente A und N-terminal von der Aminosäure 139 der Komponente A als Komponente B eine 94 AA lange Sequenz (AS 18 bis 111 von mACRP30) aufwies. Darüber hinaus wurde am N-Terminus des Fusionsproteins (N-Teπninal von der Komponente B) eine Flag-Sequenz mit den A- minosäuren DYKDDDDK und einer zwischen dem Flag-Tag und der Komponente B angeordneten Linkersequenz GPGQVQLQLH angekoppelt (s. Figur 1) exprimiert Komponente A und B sind durch die Linkersequenz LQ getrennt
Für Vergleichsversuche wurde ein Fusionsprotein (2, FasL-267) exprimiert, das N- terminal gleichfalls die vorgenannte Flag-Sequenz mit der gleichen C-terminal folgen- den Linkersequenz und daran C-terminal angeschlossen die Aminosäuren 139 bis 281 von hFasL aufwies. Fusionsprotein (1) unterschied sich von Fusionsprotein (2) demnach durch eine Deletion, die den spezifischen Linker und die Aminosäuren 103 bis 138 von hFasL umfaßte (Figur 1).
Die Vektorkonstruktion der Fusionsproteine (1) und (2) erfolgte nach der oben beschriebenen Verfahrensweise. Die Expression und Reinigung der Fusionsproteine erfolgte nach dem unter (b) dargestellten Verfahren,
Der Multi- bzw. Oligomersierungsgrad der gereinigten Fusionsproteine (1 bzw. 2) wurde durch Elektronenmikroskopie bestimmt Hierbei ergab sich, dass FasL-199 als Hexamer (2x3mer), entsprechende Messungen für FasL-267 ergaben Resultate für ein Trimer und für ApoFasL-060 ebenfalls ein Hexamer.
2. Ausfuhiungsbeispiel Inihibitorische Wirkung von ApoFasL-060 und ApoFasL-267 auf die Fas-vermittelte Apoptose in vitro.
Es wurden gemäß (c) gezüchtete Bjab-Burkitt-Lymphoma-Zellen entnommen und einem zytotoxischen Assay gemäß (d) unterzogen. Für diese Zeilinie wurde der Assay jeweils mit steigenden Konzentrationen von trimerisierten Fusionsproteinen ApoFasL- 060 uns ApoFasL-267 in Gegenwart oder Abwesenheit von anti-Flag-M2- Antikörpern (Sigma, Buchs, Schweiz) durchgeführt (Figur 2A), indem die Absorbanz bei OD 490 nm bestimmt wurde. Die eingesetzten Inhibitoren ApoFasL-060 und ApoFasL-267 sind in Figur 1 dargestellt (s. 1. Ausführungsbeispiel).
Beide Inhibitoren zeigen ähnliche Zelltod-induzierende Eigenschaften, wenn sie mit gegen den Flag-Tag gerichtete Antikörper kreuzvernetzt werden (Figur 2A). ApoFasL- 060 induziert den Zelltod auch dann, wenn keine kreuzvernetzenden Antikörper vorhanden sind aufgrund seiner Aggregatstruktur. Damit zeigen die Ergebnisse des 2. Ausführungsbeispiels, daß ApoFasL-060 und ApoFasL-267 jeweils an den Fas- Rezeptor binden können, jedoch deren Oligomerisierung zur Transduktion des Todes- Signals erforderlich ist Hierbei ist die verringerte Zytotoxizität der beiden Inhibitoren nicht auf eine verringerte Affinität gegenüber dem Fas-Rezeptor zurückzuführen, da deren Affinität gegenüber oligomerisiertem FasL (FasL-199) nicht verringert ist
Darüber hinaus wurden Bjab-Zellen mit steigenden Konzentrationen von ApoFasL- 267 präinkubiert und anschließend FasL-199 zur Induktion der Apoptose hinzugefügt (s. Figur 2B). Hierbei zeigte sich, daß der durch FasL-199 induzierte Zelltod durch ApoFasL-267 verhindert werden kann. Die Messreihe lässt erkennen, daß ApoFasL- 267 als trimeres Molekül den Zelltod in vitro mit einer inhibitorischen Konzentration (IC) von 100 ng/ml verhindern kann. Während also das in trimerer Form vorliegende ApoFasL-267 die Apoptose durch die Blockade des Rezeptors verhindert, kann das aggregierende ApoFasL-060 die FasL-199 induzierte Apoptose in vitro nicht verhindern, da es aufgrund seiner Struktur selbst Apoptose-induzάerend wirkt
3. Ausfuhrungsbeispiel
In vivo Versuche nach Hepatolyse-Induktion
A. Wirkung von AρoFasL-060 Hierzu wurden Mäusen agonistische J02-anti-Fas-Antikδrper injiziert, die bei den der- art behandelten Mäusen zum Exitus durch fulminant verlaufendes Leberversagen führten. Die Hepatolyse bei diesen Mäusen wurde durch die hohen Serumtiter von Ami- notransferasen (AST und ALT) nachgewiesen. Experimentell wurden die Mäuse mit ApoFasL-060 (1 mg/kg) vorbehandelt, wodurch das Tier nach Gabe von J02- Antikörpern vor der von diesen ausgelösten Leberversagen (Hepatolyse) bewahrt wurden (s. Figur 3A). Die protektive Wirkung von ApoFasL-060 war erwartungsgemäß dosisabhängig. Bei einer Gabe von 5 μg J02-Antikδrper konnten AST- und ALT-Titer wie bei jenen Mäusen, die als Kontrolle dienten, beobachtet werden. Bei einer Dosis von 10 μg J02-Antikδrper war eine überwiegende Schutzwirkung zu beobachten (Reduktion der AST- und ALT-Titer von ungefähr 90%). Im Ergebnis zeigte sich, daß ApoFasL-060 eo ipso nicht toxisch ist, sofern nicht ein kreuzvernetzender Antikörper (Figur 3B) eingesetzt wurde, so daß auch hier die Zelltod inhibierende Wirkung auf der Bindung an den Fas-Rezeptor ohne Auslösung des Todessignals beruht
Die Letaldosis von J02-Antikörper (10 μg/pro Maus, intravenös injiziert) verursachten bei allen untersuchten Mäusen innerhalb von vier Stunden den Exitus (Figur 3B). Die Vorbehandlung dieser Tiere mit ApoFasL-060 reduzierte die Mortalität dramatisch - die Überlebensrate beträgt 86% nach 24 Stunden. Der Inhibitor ApoFasL-060 (allein injiziert) erweist sich als nicht toxisch - allerdings nach Co-Injektion mit kreuzvernetzendem Antikörper wirkt er hochtoxisch, mit einer Mortalitätsrate von 80% nach vier Stunden.
B. Wi«"k""c von ApoFasL-267 In diesem Ausführungsbeispiel wurde den Mäusen entweder Kochsalzlösung (als Kontrolle) oder ApoFasL-267 vor der Injektion von FasL-199 injiziert Anschließend wurde ein hepatolytischer Befund dieser derart behandelten Mäuse nach den jeweiligen Serumtitern von AST und ALT beurteilt (siehe Figur 4). Die mit ApoFasL-267 vorbehandelten Mäuse sind gegen die Hepatolyse, die durch das oligomere FasL (FasL-199) induziert wird, geschützt Die FasL-induzierte Hepatolyse ist bei den zur Kontrolle eingesetzten Tieren sehr schnell (innerhalb von zwei Stunden) nach der Gabe von FasL-199 zu beobachten, nämlich mit Arninotransferase-Titern, die um den Faktor 10 erhöht sind. Die Vorbehandlung der Tiere mit ApoFasL-267 verhindert demnach nach Maßgabe der AST bzw. ALT-Serumtiter bestimmten Leberschaden der Tiere. 4. Ausruhtungsbeispiel
Inhibition der Acetaminophen (AAP)- induzierten Hepatitis
Acetaminophen (AAP), ein Schmerzmittel, induziert bekanntermaßen fulminantes Le- berversagen. Der molekulare Mechanismus beruht auf Fas-vermittelter Apoptose. Es wurde im vorliegenden Ausführungsbeispiel daher untersucht, ob trimeres ApoFasL- 267 und oder hexameres ApoFasL-060 die Leberzellen vor AAP-induziertem Zelltod bewahren kann. Hierzu wurde den Mäusen eine subletale Dosis von AAP (0 g kg) intraperitoneal injiziert Fünf Stunden später wurden etwaige Leberschäden durch Be- Stimmung der Serumtiter von ALT und AST ermittelt Die ALT- bzw. AST-Titer wurden entsprechend den IFCC-Richtlinien (International Federation of Clinical Che- mistry) als enzymatischer Test bestimmt Die Gabe von ApoFasL-267 oder ApoFasL- 060 verhinderte eine AAP-bedingte Erhöhung der AST- oder ALT-Titer. Im Vergleich zu unbehandelten Mäusen ergab sich zum Beobachtungszeitpunkt eine deutliche Ver- ringerung der Aminotransferase-Titer (75 bis 90%) bei den erfindungsgemäß vorbehandelten Mäusen.
Der protektive Effekt der Vorbehandlung mit ApoFasL-060 erwies sich als dosisabhängig (s. Figuren 5B und 5C). Im Fall einer Verabreichung von 25 μg ApoFasL-060 (1 mg/kg) war keine AAP-induzierte Hepatolyse zu beobachten, im Fall einer Injektion von 12,5 μg ergaben sich leicht erhöhte Aminotransferase-Titer, also ein leichter Leberschaden, noch niedrigere Dosen, z.B. 6 μg/Maus führten zu einem Verlust an pro- tektiver Wirkung. Bei diesen niedrigen Dosen ergab sich kein Unterschied zu den Kontrolltieren, die nur mit Kochsalz-Lösung behandelt worden waren. Dies erlaubt die Feststellung, daß es sich bei der beobachteten Inhibition um eine kompetitive Besetzung der Bindungsstellen auf dem Rezeptor handelt
Die AAP-induzierte Leberschädigung wurde histologisch untersucht (Fig.6A). Hierbei sind zu nennen: Nekrose und Apoptose im zentralen Venula-Bereich, sinusoidaler ent- zündlicher Blutandrang, vakuolisierte Hepatocyten. Dagegen, wie in der Figur 6B gezeigt, sind im Falle einer Vorbehandlung mit ApoFasL-267 (oder ApoFasL-060, nicht dargestellt) keine derartigen Leberschädigungen erkennbar. 5. Ausfuhrungsbeispiel
A. Konstruktion einer Chimäre des Fas-Rezeptors
Zur Herstellung eines äußerst wirksamen Inhibitors der FasL-vermittelten Apoptose wurde ein Fusionsprotein aus der extrazellulären Domäne des Fas-Rezeptors (Aminosäuren 17 bis 172) und der vollständigen Oligomerisierungsdomäne von murinem ACRP30 (Aminosäuren 18 bis HO), welche Ober einen Linker von 14 Aminosäuren miteinander verbunden sind, hergestellt (Figur 7). Das rekombinante Protein wurde mittels SDS-PAGE analysiert und wies dabei ein apparentes Molekulargewicht von 55 kDa unter reduzierenden Bedingungen bzw. von 150 kDa unter nicht-reduzierenden Bedingungen auf. Daraus ist zu schließen, daß das Konstrukt MKB216 (im folgenden Fas-ACRP30 genannt) im wesentlichen als Hexamer (2x3mer) vorliegt
B. Inhibitorische Wirkung von Fas-ACRP30 gegenüber FasL-vetmitteltet Apoptose
Um die inhibitorische Wirkung des erfindungsgemäßen Fusionsproteins Fas-ACRP30 gegenüber der FasL-vermittelten Apoptose in vitro zu belegen, wurden FasL-sensitive A20-Zellen mit ansteigenden Konzentrationen von Fas-ACRP30 vor der Zugabe von oligomerisiertem FasL vorinkubiert Als besonders wirksames FasL-Oligomer diente im vorliegenden Experiment das erfindungsgemäße Konstrukt FasL-199. In dieser Weise wurde der. inhibitorische Effekt des erfindungsgemäßen Konstrukts Fas- ACRP30 mit demjenigen einer dimeren Form von Fas (Fas-Fc) und einer pentamären Form von Fas (Fas-COMP) verglichen. Wie in der Figur 8 gezeigt, vermag eine Konzentration an Fas-ACRP30 von 80 ng/ml eine 50%ige Verminderung der FasL- vermittelten Apoptose hervorzurufeα Dieser Wert ist deutlich geringer als derjenige des dimeren Vergleichskonstrukts Fas-Fc (IC50 > 1 μg/ml). Die inhibitorische Wirkung von Fas-COMP ist mit einem ICso-Wert von 35 ng/ml vergleichbar mit derjenigen von Fas-ACRP30. Diese Daten belegen somit, daß Fas-ACRP30 ein wirksamer Inhibitor der FasL-vermittelten Apoptose ist

Claims

Ansprüche
1. Trimer eines rekombinanten Fusionsproteins, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Fusionsprotein mindestens eine Komponente A und mindestens eine Komponente B aufweist, wobei die Komponente A ein Protein oder ein Proteinabschnitt mit biologischer Funktion, insbesondere mit Ligandenfunktion für Antikörper, für lösliche oder membranständige Signalmoleküle oder für
Rezeptoren oder ein Antikörper oder Abschnitt eines Antikörpers, umfasst und die Komponente B ein Protein oder einen Proteinabschnitt umfasst, der die Komponente A trimerisiert.
2. Trimer eines rekombinanten Fusionsproteins nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß die Komponenten A der rekombinanten Fusionsproteine im Trimer identisch oder verschieden sind.
3. Trimer eines rekombinanten Fusionsproteins nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente A der rekombinanten Fusionsproteine ein
Peptidhormon, ein Wachstumsfaktor, ein Zytokin, ein Interleukin, ein Rezeptor, ein Abschnitt derselben oder ein funktionelles Derivat der vorgenannten Sequenzen ist
4. Trimer eines rekombinanten Fusionsproteins nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente A des rekombinanten Fusionsproteins ein Zytokin aus der Familie der TNF-Zytokine oder ein TNF- Zytokinrezeptor, ein Abschnitt eines solchen TNF-Zytokins oder -Rezeptors oder ein funktionelles Derivat eines TNF-Zytokins oder -Rezeptors bzw. eines Abschnitts eines solchen TNF-Zytokins oder -Rezeptors ist.
5. Trimer eines rekombinanten Fusionsproteins nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente A des rekombinanten Fusionsproteins ein TNF-Zytokin oder ein Abschnitt eines TNF-Zytokins, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus CD40L, FasL, TRAIL, TNF-α, CD30L, OX40L, RANKL, TWEAK, Lta, Ltab2, LIGHT, CD27L, 41-BB, GITRL, AP-
RTL, EDA, VEGI und BAFF, oder ein funktionelles Derivat der vorgenannten Sequenzen ist.
6. Trimer eines rekombinanten Fusionsproteins nach einer der vorgenannten An- sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente B einen Proteinabschnitt umfasst, der mindestens ein Heptadmuster einer Kollagendomäne aufweist
7. Trimer eines rekombinanten Fusionsproteins nach einem der vorgenannten An- sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente B einen Abschnitt des
Proteins ACRP30 umfaßt, einschließlich der Trimerisierungsdomäne, ohne höhere Aggregate von Trimeren bilden zu können.
8. Trimer eines rekombinanten Fusionsproteins nach einem der vorgenannten An- sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente B eine Aminosäuresequenz, wie gemäß Figur 1 für die Sequenz von Aminosäure 44 bis 111 von ACRP30 angegeben, oder ein funktionelles Derivat derselben enthält, wobei Figur 1 Bestandteil des Anspruchs ist
9. Trimer einer rekombinanten Fusionsproteins nach einem der vorgenannten Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Fusionsprotein die FasL-267-Sequenz gemäß Figur 1 aufweist, wobei Figur 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist.
10. Trimer eines rekombinanten Fusionsproteins nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Fusionsprotein zwischen Komponente A und Komponente B eine Linkersequenz aufweist.
11. Trimer eines rekombinanten Fusionsproteins nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Linkersequenz das Dipeptid LQ aufweist
12. Trimer eines rekombinanten Fusionsproteins nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Fusionsprotein eine vorzugsweise N-terminale Tag-Sequenz aufweist
13. Trimer eines rekombinanten Fusionsproteins, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei der drei im Trimer enthaltenen rekombinanten Fuionsproteine verschiedene Komponenten B aufweisen.
14. Verwendung von Trimeren nach einem der Ansprüche 1 - 13 zur Herstellung eines Arzneimittels.
15. Verwendung von Trimeren nach einem der Ansprüche 1 — 13 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von viraler Hepatitis (HBV, HCV), Alko- hol-induzierter Hepatitis, cholestatische Hepatitis, Wilsons Krankheit, autoim- muner Hepatitis, Abstoßungsreaktion bei Lebertransplantation, Erkrankungen, die auf hyperapoptotischen Reaktionen beruhen, degenerativen Erkrankungen, insbesondere neurodegenerativen Erkrankungen, Entzündungserkrankungen, toxischer epidermaler Nekrolyse (TEN), Multiple Sklerose, Hashimoto Thyroi- ditis, GvHD.
16. Rekombinantes Fusionsprotein, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Fusionsprotein eine Komponente A und eine Komponente B enthält, wobei die Komponente A ein Protein oder einen Proteinabschnitt mit biologischer Funktion, insbesondere mit Ligandenfunktion für Antikörper oder Rezeptoren oder einen Antikörper oder Abschnitt eines Antikörpers oder für lösliche oder membranständige Signalmoleküle, ist und die Komponente B einen trimerisierenden Abschnitt oder ein funktionelles Derivat eines solchen Abschnitts eines Proteins, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus der Familie der Clq-Proteine und der Collectine, enthält
17. DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz für ein rekom- binantes Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 13 codiert.
18. Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß der Expressionsvektor eine DNA-Sequenz nach Anspruch 17 enthält
19. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 18 transfiziert ist.
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