EP1373865A1 - Verfahren zur prozessüberwachung von biotechnologischen prozessen - Google Patents
Verfahren zur prozessüberwachung von biotechnologischen prozessenInfo
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- EP1373865A1 EP1373865A1 EP02712611A EP02712611A EP1373865A1 EP 1373865 A1 EP1373865 A1 EP 1373865A1 EP 02712611 A EP02712611 A EP 02712611A EP 02712611 A EP02712611 A EP 02712611A EP 1373865 A1 EP1373865 A1 EP 1373865A1
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Classifications
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/55—Specular reflectivity
- G01N21/552—Attenuated total reflection
Definitions
- the invention relates to a method for process monitoring of biotechnological processes using microorganisms.
- the IR spectroscopy of dried cells requires an enormous amount of time and preparation to bring the cells to the IR measurement in a suitable form. It can be assumed that sample preparation alone does not take less than 25 minutes (see Majara et al., Above). Furthermore, no suitable on-line equipment is available for carrying out process monitoring of biotechnological processes using microorganisms, in which the composition and the condition of microorganisms can also be monitored (Majara et al., Above).
- the Fayolle et al. The spectra obtained were measured in an optical cuvette with a 38 ⁇ m layer thickness. Such an arrangement is not suitable for a process control, since this easily clogs up during repeated measurements. Above all, the Fayalle et al. described system the measurement of the amide I band is not possible.
- Contamination of the measuring cells with polymeric or organic material is also regarded as a major disadvantage of infrared technology, especially if the optical crystals of flow lines are irreversibly coated with the contaminants and only through complex physical cleaning processes can be freed from these coatings again (US 5,604,132).
- the present invention therefore provides a method at the outset described type, which is characterized in that both the process medium and the microorganisms in the process medium are directly spectroscopically examined by means of attenuated (attenuated) total reflection (ATR) on an ATR crystal in the infrared range, the process medium containing the microorganisms being included the ATR crystal is contacted so that microorganisms reach at least a distance from the ATR crystal that corresponds to the depth of penetration of the evanescent field and during this contacting is spectroscoped in the infrared range, whereupon the process medium containing the microorganisms from the ATR -Crystal is removed, the ATR crystal is washed and, if necessary, contact is made again with the process medium containing microorganisms.
- ATR attenuated total reflection
- the method according to the invention has surprisingly been able to show that it is possible to carry out a complete and comprehensive process monitoring of biotechnological processes by means of infrared spectroscopy, wherein not only a large number of soluble compounds can be measured and monitored, but also the composition and the state of the Microorganisms are measured online and almost in "real time". According to the invention, this can be carried out without drying the microorganisms, as a result of which the entire process can be carried out so quickly that it is suitable for on-line process control.
- the soluble constituents in the culture medium can be spectroscoped in a manner known per se in the infrared range, for example in a flow cell.
- the microorganisms contained in the process medium are brought up in a special contacting step at least to a distance from the ATR crystal, which corresponds to the penetration depth of the evanescent field, and spectroscopically precisely during this contacting.
- the depth of penetration of the evanescent field is a variable which is dependent in particular on the material, wavelength, angle of incidence and media and is defined, for example, in Harrick (J. Opt * . Soc. Am. 55 (7) (1965, 851-857).
- (Depth of penetration distance from the surface of the ATR crystal at which the amplitude of the evanescent wave has dropped to half the value it has on the surface.)
- aqueous solutions and a wave number of 1000 this is about 2 ⁇ m.
- the process medium containing the microorganisms is then removed from the ATR crystal, the ATR crystal is washed with wash solutions, whereupon renewed contacting with the microorganisms containing the process medium can take place.
- Spectroscopy in infrared is preferably carried out using Fourier-transformed infrared spectroscopy (FTIR spectroscopy), which, as mentioned, has already been used in the past to monitor biotechnological processes, but only with regard to dissolved substances.
- FTIR spectroscopy Fourier-transformed infrared spectroscopy
- Measurement using infrared lasers (e.g. quantum cascade laser) as an IR source is also advantageous.
- a diamond is preferably used as the ATR crystal in the process according to the invention.
- This proves to be much more stable than conventional ATR crystals, especially in the washing process, and is of particular advantage when measuring ATR.
- the ATR measurement is preferably carried out by means of a planar waveguide as an ATR crystal, in particular with that of Brai an et al., Appl. Spectrosc. 51 (4) (1997), pp. 592-597, described methodology carried out (see also WO 00/36442-A, US 5 980 831-A).
- the process medium is preferably guided to the ATR crystal with an automatic flow system from the bioreactor in which the biological process is carried out, during the time during which the biosuspension flows over the ATR crystal
- the "large” microorganism cells do not come close to the ATR surface and are therefore not or only insignificantly detected by the infrared light. These cells therefore do not make any significant contribution to the measured spectra, so that only the dissolved components, such as e.g. Sugar, alcohols, amino acids, etc., can be determined quantitatively, as in Kansiz et al. , Analytica Chimica Acta 21149
- the approach of the microorganisms to the ATR crystal can also take place in another way, for example by temporarily stopping the microorganisms in the process solution by means of suitable filters and, if appropriate, bringing them to the ATR crystal by application centrifugal force, bioelectromagnetic magnetic attachments to the ATR crystal, etc.
- the washing is preferably carried out by treating the ATR crystal with a base, for example with IM NaOH, and then rinsing with distilled water.
- a base for example with IM NaOH
- distilled water e.g., distilled water
- bases e.g., IM NaOH
- alternative washing solutions can also be used, for example Na 2 CO 3 (for example 5%), wherein washing steps with distilled water can likewise preferably be connected.
- the method according to the invention is particularly suitable for monitoring biotechnological processes using single-cell eukaryotes, in particular yeast, or bacteria, in particular E. coli, but the method is based on any suspension (submerged) cultivation, ie in which microorganisms or Aggregates of the same are in suspended form, can be used in principle.
- microorganisms are recombinant microorganisms and / or antibiotic-producing microorganisms which, because of their sensitivity and complicated metabolic processes, require extremely precise and complex process analysis.
- the method according to the invention can preferably also be used in the production of single-cell protein or for the production of feed or foodstuffs based on microorganisms, and for the measurement of microbial carbohydrates.
- the method according to the invention can be used in the entire infrared range, but the spectroscopy is particularly preferably carried out in the middle infrared range with a wave number between 4000 and 400 / cm, in particular between 1800 and 900 / cm, the so-called "fingerprint" range.
- the measurements can of course also be carried out preferably in the near infrared, that is to say at wavelengths between 2.5 p and 750 nm.
- Spectroscopy of soluble constituents in the process medium is preferably carried out before the spectroscopy of the microorganisms. After the spectroscopy of the microorganisms, the washing step can preferably be connected.
- the method is particularly preferably carried out in such a way that, after the ATR crystal has come into contact with the process medium, the movement of the medium is stopped, so that the microorganisms are deposited on the ATR crystal (which also places them at a suitable distance from the ATR Crystal can reach), whereupon the spectroscopy of the microorganisms is carried out.
- the secondary structure of proteins can be monitored in the process medium, but in particular also in the case of the microorganisms.
- the content of lipids in the process medium and / or in the microorganisms can also be monitored.
- the present invention also relates to a device for carrying out the method according to the invention, comprising an ATR element connected to an automatic flow system with an ATR crystal, an infrared spectroscopy device connected to the ATR crystal and a via automatic flow system with washing system connected to the ATR element.
- An automatic flow system is generally a device that, for example, transports and manipulates liquid or suspended samples using, for example, pumps, hoses and valves.
- the infrared spectroscopy device is preferably connected to an electronic data processing system (IR-EDP), with which the recorded spectra can be analyzed and with which preferably process devices (actuators), such as inflow devices, temperature controllers, pH controllers, etc., for the bioreactor, if they are connected to the IR EDP, can be controlled by the IR EDP, with which a change in the process parameters can be controlled.
- IR-EDP electronic data processing system
- the device according to the invention further comprises a bioreactor, which may be filled with process medium and microorganisms.
- the automatic flow system can also be used to condition the process medium or e.g. Measurement, pH value settings, temporary filtering or separation steps, separation of substances that could impair the measurement, etc., are carried out.
- the flow system according to the invention preferably has hoses with an inner diameter of greater than 0.7 mm, that is to say larger than the standardized diameters (0.3, 0.5 and 0.7 mm), since it is the case with hoses with standard diameters due to the Microorganisms can easily become constipated.
- Tubes with inner diameters of 1 mm and above, in particular 1.2 mm and (far) above, are preferably used according to the invention.
- a dead volume of more than 5 ⁇ l, more preferably 10 ⁇ l or more, in particular 20 ⁇ l or more, is preferably provided.
- the infrared spectroscopy device is preferably a FTIR spectrometer, which is particularly well suited for optimally obtaining infrared spectra with ATR crystals. IR measurement using lasers (eg quantum cascade laser) is also advantageous.
- lasers eg quantum cascade laser
- the ATR crystal is preferably positioned horizontally with respect to the process medium to be measured or flowing past, so that the process medium can be passed over the ATR crystal.
- the microorganisms can simply sediment on the ATR crystal due to gravity and be measured there.
- the ATR crystal can also be used with a collecting device for microorganisms, e.g. a hinged filter, which - when the microorganisms are to be measured - opens and positions the "captured" microorganisms on the ATR crystal.
- microorganisms to the ATR crystal by means of suitable electrical charge induction.
- This can e.g. can be realized by an external electric field, as in "free-flow” electrophoresis (Raymond et al., Anal. Chem. 68, (15) (1996), pp. 2515-2522), or else by applying one charged surface on the ATR crystal, e.g. through a layer of poly-L-lysine.
- substances can also be provided on the ATR crystal that favorably influence the washing process or influence the adhesion of microorganisms; in particular, monolayers of these substances are provided.
- the ATR element is preferably designed as a flow cell, so that the measurement of soluble constituents / cells can be started by combining "flow on” with “stop” steps.
- the ATR crystal is preferably a diamond which, owing to its hardness properties and the resulting ease of maintenance, is particularly suitable for such a process. Crystals made of germanium, silicon or crystals of comparable hardness are also preferred.
- the device according to the invention is preferably equipped with a stopping device for stopping the flow of the process medium, which allows an IR measurement despite stopping.
- Fig. 1 the process control and growth curve of a baker's yeast production
- Fig. 4 the 2nd derivative of Fig. 3, vector normalized
- Fig. 6 Spectra on-line (in vivo), baker's yeast fermentation recorded with ATR technology
- the method according to the invention was used in the second biotechnological process.
- the spectra of the microorganisms measured during the "stopped-flow" time are very similar to those recorded in the dried state (FIGS. 6, 7 and 8).
- the comparison of the second derivatives clearly shows that the spectra recorded online contain practically the same information as that of the dried microorganisms (see FIGS. 4 and 8).
- FIGS. 9 and 10 show, information about the secondary structure of proteins as well as about the increase / decrease of lipids, RNA and the like can be derived from the spectra.
- the method according to the invention and the device according to the invention can be used for process monitoring / control of any cultivation processes of suspension cultures. It is also able to detect the degeneration of microorganisms online.
- Industrially particularly preferred areas of application for the method according to the invention are the production of recombinant proteins, in particular of proteins which are formed intracellularly, especially when Inclusion bodies, the production of antibiotics, the production of polyhydroxyalkanoates, but also in the field of basic research on bioprocesses.
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Abstract
Beschrieben wird ein Verfahren zur Prozessüberwachung von biotechnologischen Prozessen unter Verwendung von Mikroorganismen, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass sowohl das Prozessmedium als auch die Mikroorganismen im Prozessmedium direkt mittels attenuierter Totalreflexion (ATR) an einem ATR-Kristall im Infrarot-Bereich spektroskopiert werden, wobei das Prozessmedium, enthaltend die Mikroorganismen, mit dem ATR Kristall kontaktiert wird, so dass Mikroorganismen zumindest auf einen Abstand zum ATR-Kristall, der der Eindringtiefe des evaneszenten Feldes entspricht, gelangen, und während dieser Kontaktierung im Infrarot-Bereich spektroskopiert wird, worauf das Prozessmedium, enthaltend die Mikroorganismen, vom ATR-Kristall entfernt wird, der ATR-Kristall gewaschen wird, und gegebeenefalls eine erneute Kontaktierung mit dem Prozessmedium, enthaltend Mikroorganismen, erfolgt, sowie eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens.
Description
Verfahren zur Prozessüberwachung von biotechnologischen
Prozessen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Prozessüberwachung von biotechnologischen Prozessen unter Verwendung von Mikroorganismen.
Die Überwachung von biotechnologischen (Fermentations-)prozessen ist äußerst komplex. Neben den im Fermentationsmedium produzierten Substanzen und deren Gehalt im Fermentationsmedium sind auch die Mikroorganismen und deren physiologischer Status zu überwachen. Bei einer derartigen Prozessüberwachung sollten Daten über den Fermentationsprozess, wie Ausbeute, Lebensfähigkeit und Stoffwechselzustand der Mikroorganismen, möglichst annähernd "real time" erfasst werden, um umgehend auf Änderungen in der Zusammensetzung des Fermentationsmediums bzw. im Status der Mikroorganismen reagieren zu können. Eine Prozesskontrolle der löslichen Bestandteile von Reaktionsprozessen, insbesondere von Fermentationsprozessen mittels Infrarot-Spektroskopie, wurde beispielsweise zur Messung von Substanzen, wie Glukose, Essigsäure, Milchsäure, Lactose und Galactose sowie Ethanol, beschrieben. Es ist mit dieser Methodologie auch möglich, mehrere Substanzen gleichzeitig zu erfassen.
Obgleich die Infrarot-Spektroskopie von biologischen ganzen Zellen prinzipiell möglich ist (siehe Hopkinson et al . , Analyst 112 (1987), 501-505; Fayolle et al . , Vibr. Spectroscopy 14 (1997), 247-252), wurde diese für eine genaue Analyse der Zellen bislang nur in getrocknetem Zustand bzw. in Deuteriumoxid in Betracht gezogen (McGovern et al . , J. Biotechnol. 72 (1999), 157-167; Schuster et al., Vibr. Spectroscopy 19 (1999), 467-477 und Majara et al., J. Inst. Brew. 104 (1998), 143-146). Die ständige Überwachung von Zellen in biotechnologischen Prozessen mittels Infrarot-Spektroskopie wurde daher nicht für geeignet erachtet, und zwar methodologisch und apparativ. Weiters wurde die Infrarot- Spektroskopie von ganzen Zellen bislang auch auf Grund des "bio- fouling"-Effekts für nicht praktikabel gehalten: im Zuge der Messung von nicht-getrockneten Fermentationslösungen, die Zellen enthalten, kommt es zu Ablagerungen an den IR-Messkristallen (ATR-Kristallen) , die manuell entfernt werden müssen (siehe Hop-
kinson et al . , oben, die auch besonders die Problematik des Zer- kratzens der Kristalle und der dadurch bedingten Kontamination und Artefakt-Erzeugung in nachfolgenden Spektra hervorgehoben haben) . Diese manuelle Reinigung wird daher als zu aufwendig und für eine Routine-Analytik in der Prozessüberwachung als ungeeignet angesehen. Auf der anderen Seite erfordert die IR-Spektroskopie von getrockneten Zellen einen enormen Zeit- und Präparationsaufwand, um die Zellen in geeigneter Form zur IR-Messung zu bringen. So kann davon ausgegangen werden, dass alleine die Probenpräparation nicht unter 25 Minuten erfordert (siehe Majara et al . , oben). Weiters ist auch kein geeignetes on-line-Equipment zur Durchführung von Prozessüberwachungen von biotechnologischen Prozessen unter Verwendung von Mikroorganismen, bei welchen auch die Zusammensetzung und der Zustand von Mikroorganismen überwacht werden können, erhältlich (Majara et al . , oben) .
Die von Fayolle et al. erhaltenen Spektren wurden in einer optischen Küvette mit 38 um Schichtdicke gemessen. Eine solche Anordnung ist für eine Prozesskontrolle nicht geeignet, da diese leicht bei der wiederholten Messung verstopft. Vor allem ist beim von Fayalle et al . beschriebenen System die Messung der Amid-I- Bande nicht möglich.
Auch die Verunreinigungen der Messzellen mit polymerem oder organischem Material (u.a. "bio-fouling" ) ' wird als ein wesentlicher Nachteil der Infrarot-Technologie angesehen, insbesondere, wenn die optischen Kristalle von Durchflusszeilen von den Verunreinigungen irreversibel überzogen sind und nur durch aufwendige physikalische Reinigungsverfahren wieder von diesen Überzügen befreit werden können (US 5,604,132).
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Prozessüberwachung von biotechnologischen Prozessen unter Verwendung von Mikroorganismen zur Verfügung zu stellen, bei welchem sowohl die löslichen Stoffe im Prozessmedium als auch die Mikroorganismen schnell, verlässlich, automatisch, gut reproduzierbar und mit hohem Informationsgehalt gemessen und überwacht werden können.
Die vorliegende Erfindung sieht daher ein Verfahren der eingangs
beschriebenen Art vor, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass sowohl das Prozessmedium als auch die Mikroorganismen im Prozessmedium direkt mittels abgeschwächter (attenuierter) Totalreflexion (ATR) an einem ATR-Kristall im Infrarot-Bereich spektroskopiert werden, wobei das Prozessmedium, enthaltend die Mikroorganismen, mit dem ATR-Kristall kontaktiert wird, so dass Mikroor ganismen zumindest auf einen Abstand zum ATR-Kristall, der der Eindringtiefe des evaneszenten Feldes entspricht, gelangen und während dieser Kontaktierung im Infrarot-Bereich spektroskopiert wird, worauf das Prozessmedium, enthaltend die Mikroorganismen, vom ATR-Kristall entfernt wird, der ATR-Kristall gewaschen wird, und gegebenenfalls eine erneute Kontaktierung mit dem Prozessmedium, enthaltend Mikroorganismen, erfolgt.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren konnte überraschenderweise gezeigt werden, dass es möglich ist, mittels Infrarot-Spektroskopie eine komplette und umfassende Prozessüberwachung von biotechnologischen Prozessen durchzuführen, wobei nicht nur eine Vielzahl von löslichen Verbindungen gemessen und überwacht werden können, sondern auch die Zusammensetzung und der Zustand der Mikroorganismen on-line und nahezu in "real time" gemessen wird. Dies kann erfindungsgemäß ohne Trocknung der Mikroorganismen durchgeführt werden, wodurch der gesamte Prozess so schnell durchgeführt werden kann, dass er sich für eine on-line-Prozess- kontrolle eignet. Die löslichen Inhaltsstoffe im Kulturmedium können dabei in an sich bekannter Weise im Infrarot-Bereich, beispielsweise in einer Durchflusszelle, spektroskopiert werden. Die im Prozessmedium enthaltenden Mikroorganismen werden in einem speziellen Kontaktierungsschritt zumindest auf einen Abstand zum ATR-Kristall, der der Eindringtiefe des evaneszenten Feldes entspricht, herangebracht und genau während- dieser Kontaktierung im Infrarot-Bereich 'Spektroskopiert .
Die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes ist eine insbesondere Material-, Wellenlängen-, Einfallswinkel- und Medien-abhängige Größe, die z.B. in Harrick (J. Opt*. Soc. Am. 55 (7) (1965, 851- 857) definiert ist. (Eindringtiefe = Abstand von der Oberfläche des ATR-Kristalls, bei dem die Amplitude der evaneszenten Welle auf die Hälfte des Wertes gefallen ist, welche sie an der Oberfläche hat.) Bei Diamant, wässerigen Lösungen und einer Wellen-
zahl von 1000 beträgt diese etwa 2 um.
Das Prozessmedium enthaltend die Mikroorganismen wird dann vom ATR-Kristall entfernt, der ATR-Kristall mit Waschlösungen gewaschen, worauf gegebenenfalls erneute Kontaktierungen mit den Prozessmedium enthaltenden Mikroorganismen erfolgen können.
Bevorzugterweise wird die Spektroskopie im Infrarot mit Fourier- transformierter Infrarot-Spektroskopie (FTIR-Spektroskopie) durchgeführt, welche, wie erwähnt, bereits in der Vergangenheit zur Überwachung von biotechnologischen Prozessen, allerdings ausschließlich im Hinblick auf gelöste Substanzen, verwendet worden ist. Die Messung mittels Infrarot-Lasern (z.B. Quantum-Kaskaden- Laser) als IR-Quelle ist ebenfalls vorteilhaft.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird ein Diamant als ATR-Kristall im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt. Dieser erweist sich vor allem im Waschprozess wesentlich stabiler als herkömmliche ATR-Kristalle und ist bei der ATR-Messung von besonderem Vorteil . Bevorzugterweise wird die ATR-Messung mittels plana- rem Wellenleiter als ATR-Kristall, insbesondere mit der von Brai an et al., Appl . Spectrosc. 51 (4) (1997), S. 592-597, beschriebenen Methodologie durchgeführt (vgl. auch WO 00/36442-A, US 5 980 831-A) .
Bevorzugterweise wird das Prozessmedium mit einem automatischen Fließsystem aus dem Bioreaktor, in dem der biologische Prozess durchgeführt wird, an den ATR-Kristall geführt, wobei während der Zeit, während der die Biosuspension über den ATR-Kristall strömt
("flow on" ) , die "großen" Mikroorganismen-Zellen nicht in die Nähe der ATR-Oberfläche kommen und daher nicht bzw. nur unwesentlich vom Infrarotlicht erfasst werden. Diese Zellen liefern daher keinen nennenswerten Beitrag zu den gemessenen Spektren, so dass während der "flow on" -Phase nur die gelösten Bestandteile, wie z.B. Zucker, Alkohole, Aminosäuren, etc., quantitativ bestimmt werden, wie in Kansiz et al . , Analytica Chimica Acta 21149
(2001), 1-12, beschrieben. Hierbei wurden beispielsweise bei der Überwachung einer Aceton-Butanol-Fermentation simultan Aceton, Acetat, n-Butanol, Butyrat und Glukose in mittleren IR gemessen.
Wenn der Durchfluss nun beispielsweise abgestoppt wird, kommt es zum Absetzen der Mikroorganismen auf dem ATR-Kristall, wodurch diese nun gemessen werden können. Gegebenenfalls können dabei auch mechanische Druckkräfte ausgeübt werden, die den Annäherungsschritt der Mikroorganismen an den ATR-Kristall effizienter gestalten.
Die Annäherung der Mikroorganismen .an den ATR-Kristall (und damit die temporäre Vermessung dieser Mikroorganismen) kann aber auch auf andere Weise erfolgen, etwa durch temporäres Aufhalten der Mikroorganismen in der Prozesslösung durch geeignete Filter und gegebenenfalls Heranbringen an den ATR-Kristall, durch Anwendung von Zentrifugalkraft, durch bioelektrisch-magnetische Anlagerungen an den ATR-Kristall, etc..
Bei der Messung der Zellen kann auch eine Variation des Einfallswinkels an der Grenzfläche ATR-Kristall/Medium, wie von Shick et al. (Appl. Spectrosc. 47 (8) (1993), s. 1237-1244) beschrieben, verwendet werden. Die Messung kann auch mit zwei oder mehr ATR- Kristallen, gegebenenfalls mit unterschiedlichen Einfallswinkeln, durchgeführt werden.
Das Waschen erfolgt erfindungsgemäß bevorzugt durch Behandlung des ATR-Kristalls mit einer Base, beispielsweise mit IM NaOH, und darauffolgendem Spülen mit destilliertem Wasser. Die Zugabe von Basen ermöglicht die vollständige Deprotonierung der analysierten Säuren und das Abstoppen der StoffWechselaktivitäten. Alternativ oder in Kombination dazu können auch alternative Waschlösungen zum Einsatz kommen, beispielsweise Na2Cθ3 (z.B. 5%), wobei ebenfalls bevorzugt Waschschritte mit destilliertem Wasser angeschlossen werden können.
Es hat sich gezeigt, dass erfindungsgemäß die Dauer eines Messzyklus von ganzen Zellen mittels Infrarot von zumindest knapp unter 30 Minuten gemäß der üblichen Methoden (Majara et al., oben), vorzugsweise auf unter 20 Minuten, besonders bevorzugt auf unter 10 Minuten, insbesondere auf unter 5 Minuten, verringert werden kann, so dass Überwachungspunkte des biologischen Prozesses in den genannten Abständen möglich sind, was für eine ausreichend genaue Prozessüberwachung ausreicht.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders gut zur Überwachung von biotechnologischen Prozessen unter Verwendung von einzelligen Eukaryonten, insbesondere Hefe, oder Bakterien, insbesondere E. coli, wobei das Verfahren aber auf jegliche Suspen- sions- (Submers-) kultivierung, i.e. bei welcher Mikroorganismen oder Aggregate derselben in suspendierter Form vorliegen, prinzipiell anwendbar ist.
Besonders bevorzugte Mikroorganismen sind demgemäß rekombinante Mikroorganismen und/oder Antibiotika-produzierende Mikroorganismen, die auf Grund ihrer Empfindlichkeit und komplizierten Stoffwechselvorgänge einer äußerst genauen und komplexen Prozessanalytik bedürfen. Das erfindungsgemäß Verfahren kann vorzugsweise auch bei der Herstellung von Einzellenprotein oder zur Herstellung von Futterstoff oder Nahrungsmitteln auf Basis von Mikroorganismen verwendet werden, sowie zur Messung von mikrobiellen Kohlehydraten.
Eine genaue Prozesskontrolle ist auch bei biotechnologischen Prozessen erforderlich, bei welchen in den Mikroorganismen Einschlusskörper gebildet werden. Auch diese Mikroorganismen bzw. Einschlusskörper können mittels Infrarot-Spektroskopie gut überwacht und mit den erfindungsgemäßen Verfahren demgemäß auch in industriellem Maßstab kontrolliert werden. Es ist bekannt, dass die SekundärStruktur von Proteinen mittels IR-Spektroskopie analysiert werden kann (Millot et al., Anal. Chim. Acta 295 (1994), S. 233-241; Naumann et al . "Infrared and Ra an Spectroscopy of Biological Materials" (2000), S. 323-378; Eds . Gremlich et al . , Marcel Dekker, New York) . Gerade Einschlusskörper haben eine charakteristische Sekundärstruktur, die besonders reich an ß-Falt- blatt ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist im gesamten Infrarot-Bereich anwendbar, besonders bevorzugt erfolgt die Spektroskopie jedoch im mittleren Infrarot-Bereich bei einer Wellenzahl zwischen 4000 und 400/cm, insbesondere zwischen 1800 und 900/cm, dem sogenannten "Fingerprint"-Bereich. Aber die Messungen können selbstverständlich auch bevorzugt im nahen Infrarot durchgeführt werden, also bei Wellenlängen zwischen 2,5 p bis 750 nm.
Vorzugsweise wird die Spektroskopie von löslichen Bestandteilen im Prozessmedium vor der Spektroskopie der Mikroorganismen vorgenommen. Nach der Spektroskopie der Mikroorganismen kann bevorzugterweise der Waschschritt angeschlossen werden.
Wie erwähnt, wird das Verfahren besonders bevorzugt so durchgeführt, dass nach der Kontaktierung des ATR-Kristalls mit dem Prozessmedium die Bewegung des Mediums gestoppt wird, so dass die Mikroorganismen auf dem ATR-Kristall abgesetzt werden (wodurch sie ebenfalls auf einen geeigneten Abstand zum ATR-Kristall gelangen können) , worauf die Spektroskopie der Mikroorganismen durchgeführt wird.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann im Prozessmedium, insbesondere aber auch bei den Mikroorganismen, die SekundärStruktur von Proteinen überwacht werden. Weiters kann im Prozessmedium und/ oder bei den Mikroorganismen auch der Gehalt von Lipiden überwacht werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, umfassend ein mit einem automatischen Fließsystem verbundenes- ATR-Element mit einem ATR-Kristall, eine mit dem ATR- Kristall verbundene Infrarot-Spektroskopie-Einrichtung und ein über ein automatisches Fließsystem mit dem ATR-Element verbundenes Waschsystem.
Diese Vorrichtung ist auf Grund des automatischen Fließsystems zur IR-Kontrolle und Überwachung von biotechnologischen Prozessen besonders geeignet. Ein automatisches Fließsystem ist generell eine Vorrichtung, die z.B. flüssige bzw. suspendierte Proben mittels z.B. Pumpen, Schläuchen und Ventilen transportiert und manipuliert. Vorzugsweise ist die Infrarot-Spektroskopie-Einrichtung mit einer elektronischen Datenverarbeitungs-Anlage (IR-EDV) verbunden, womit die aufgenommenen Spektren analysiert werden können und mit der vorzugsweise Prozesseinrichtungen (Stellglieder) , wie z.B. Zuflusseinrichtungen, Temperaturregler, pH-Regler, usw., für den Bioreaktor, wenn sie mit der IR-EDV verbunden sind, von der IR-EDV steuerbar sind, womit eine Veränderung von Pro-
zessparametern gesteuert werden kann. Damit kann eine automatische Prozesskontrolle durchgeführt werden, mit der beispielsweise vorgegebene Soll-Werte durch gezielte Zusteuerung von Nährmittel und Prozesskontrollmittel in den Bioreaktor effizient und vollautomatisch überwacht, kontrolliert und gegebenenfalls korrigiert werden können. Beispielsweise können auf Grund der IR-Spektroskopie-Informationen gezielt Nährstoffe aber auch beispielsweise Expressions-Repressoren, Attenuatoren oder Induktoren (z.B. in re- kombinanten Kulturen) zugesetzt werden.
Vorzugsweise umfasst die erfindungsgemäße Vorrichtung weiters einen Bioreaktor, der gegebenenfalls mit Prozessmedium und Mikroorganismen gefüllt ist.
Über das automatische Fließsystem kann auch eine Konditionierung des Prozessmediums vorgenommen werden oder z.B. Messung, pH-Wert- Einstellungen, temporäre Filtrierungs- oder Trennschritte, Abtrennung von Substanzen, die die Messung beeinträchtigen könnten, etc., vorgenommen werden.
Bevorzugterweise weist das erfindungsgemäße Fließsystem Schläuche mit einen Innendurchmesser von größer als 0,7 mm, also größer als die standardisierten Durchmesser (0,3, 0,5 und 0,7 mm) auf, da es bei den Schläuchen mit Standard-Durchmessern aufgrund der Mikroorganismen leicht zu Verstopfungen kommen kann. Vorzugsweise werden erfindungsgemäß Schläuche mit Innendurchmessern von 1 mm und darüber, insbesondere 1,2 mm und (weit) darüber, verwendet.
Obgleich normalerweise bei der IR-Spektroskopie mittels ATR-Kri- stallen ein geringes Detektionsvolumen (= Totvolumen des ATR-Ele- ments; Messvolumen, das sich auf dem ATR-Kristall befindet) erwünscht ist (geringere Probenmenge, genauere Messung, Hintanhaltung von Verdünnungen, etc.), hat es sich bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung als günstig erwiesen, das Totvolumen des ATR- Elements größer als die üblichen 5 μl vorzusehen. Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist daher vorzugsweise ein Totvolumen von mehr als 5 μl, noch bevorzugter 10 μl oder mehr, insbesondere 20 μl oder mehr, vorgesehen.
Die Infrarot-Spektroskopie-Einrichtung ist bevorzugterweise ein
FTIR-Spektrometer, das sich besonders gut zur optimalen Gewinnung von Infrarotspektren mit ATR-Kristallen eignet. IR-Messung mittels Lasern (z.B. Quantum-Kaskaden-Laser) ist ebenfalls vorteilhaft.
Vorzugsweise ist der ATR-Kristall horizontal gegenüber dem zu messenden bzw. vorbeifließenden Prozessmedium positioniert, so dass das Prozessmedium über den ATR-Kristall geleitet werden kann. Beim Abstoppen des Flusses können dann die Mikroorganismen bedingt durch die Schwerkraft einfach auf dem ATR-Kristall sedi- mentieren und dort gemessen werden. Beispielsweise kann aber auch der ATR-Kristall mit einer Auffangvorrichtung für Mikroorganismen, z.B. einem aufklappbaren Filter, verbunden werden, der - wenn die Mikroorganismen gemessen werden sollen - aufklappt und die "eingefangenen" Mikroorganismen auf- den ATR-Kristall positioniert.
Weiters ist es möglich, durch geeignete elektrische Ladungsinduk- tion die Mikroorganismen an den ATR-Kristall heranzubringen. Dies kann z.B. durch ein äußeres elektrisches Feld realisiert werden, wie bei der "Free-Flow"-Elektrophorese (Raymond et al . , Anal. Chem. 68 ,(15) (1996), S. 2515-2522), oder aber auch durch Aufbringen einer geladenen Oberfläche auf den ATR-Kristall, z.B. durch eine Schicht von poly-L-Lysin.
Vorzugsweise können auf dem ATR-Kristall auch Substanzen vorgesehen werden, die den Waschvorgang günstig beeinflussen oder die Anhaftung von Mikroorganismen beeinflussen, insbesondere werden dabei Monolayer dieser Substanzen vorgesehen.
Vorzugsweise ist das ATR-Element als Durchflusszelle ausgeführt, so dass die Messung von löslichen Bestandteilen/Zellen durch Kombination von "flow on" mit "Stopp"-Schritten aufgenommen werden kann.
Der' ATR-Kristall ist, wie schon oben erwähnt, vorzugsweise ein Diamant, der sich auf Grund seiner Härteeigenschaften und der dadurch bedingten erleichterten Wartung besonders gut für ein derartiges Verfahren eignet. Ebenfalls bevorzugt sind Kristalle aus Germanium, Silizium oder Kristalle vergleichbarer Härte.
Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße Vorrichtung mit einer An- haltevorrichtung zum Stoppen des Flusses des Prozessmediums ausgestattet, die trotz Stoppens eine IR-Messung erlaubt.
Die Erfindung wird an Hand der nachfolgenden Beispiele sowie der Zeichnungsfiguren, auf die sie selbstverständlich nicht eingeschränkt ist, näher erläutert.
Es zeigen:
Fig. 1: die Prozessführung und Wachstumskurve einer Backhefeproduktion;
Fig. 2: den Verlauf der Speicherstoff-Bildung in dieser Fermentation;
Fig. 3: ein IR-Spektrum von getrockneter Backhefe, normiert auf Amid (Protein) ;
Fig. 4: die 2. Ableitung von Fig. 3, Vektor-normiert;
Fig. 5: Referenzspektren reiner Zellkomponenten;
Fig. 6: Spektren on-line (in vivo), Backhefe-Fermentation mit ATR-Technik aufgenommen;
Fig. 7 und 8: Spektren der Mikroorganismen "on-line" (in vivo) erfindungsgemäß; und
Fig. 9 und 10: FTIR-Spektren von Zellen (Chlostridium) im getrockneten Zustand. Fig. 9 zeigt die Analyse von unterschiedlichen SekundärStrukturen in den Proteinen getrockneter Zellen.
B e i s p i e l e :
Die Leistungsfähigkeit des entwickelten Verfahrens wurde an Hand einer Hefefermentation gezeigt:
Zunächst wurde eine Hefekultur während etwa 15 Stunden in C-limi- tiertem Wachstum gehalten und anschließend in einer N-limitierten Reifungsphase. Während der C-limitierten Wachstumsphase kommt es zu keiner Einlagerung von Speicherkohlehydraten in den Hefezellen. Diese tritt erst dann auf, wenn auf N-limitiertes Wachstum umgeschaltet wird. Fig. 2 zeigt die Ergebnisse von Referenzanalysen (HPLC, nass-chemisch) .
Dieser biotechnologische Prozess wurde zweimal durchgeführt: beim ersten biotechnologischen Prozess (gemäß dem Stand der Technik) wurden Proben manuell entnommen, getrocknet und spektroskopiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 und 4 gezeigt. Man sieht deutlich, dass erst in der N-limitierten Phase Kohlehydrate aufgenommen werden. Die Information im mittleren Infrarot ermöglicht auch, zwischen unterschiedlichen Zuckern zu unterscheiden. Die Abfolge der Speicherstoffbildung von zuerst Glycogen, dann Trehalose konnte durch externe Referenzanalyse (Fig. 2) und Referenzspektren reiner Zellkomponenten (Fig. 5) bestätigt werden.
Beim zweiten biotechnologischen Prozess wurde das erfindungsgemäße Verfahren angewendet. Die während der "stopped-flow"-Zeit gemessenen Spektren der Mikroorganismen sind jenen der im getrockneten Zustand aufgenommenen sehr ähnlich (Fig. 6, 7 und 8) . Der Vergleich der zweiten Ableitungen zeigt deutlich, dass die on-line aufgenommenen Spektren praktisch die gleiche Information enthalten, wie jene von den getrockneten Mikroorganismen (siehe Fig. 4 und 8) .
Diese Experimente belegen somit die Funktionstüchtigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens. Wie die Figuren 9 und 10 zeigen, ist aus den Spektren auch Information über die Sekundärstruktur von Proteinen sowie über den Anstieg/Abnahme von Lipiden, RNA, und dgl., ableitbar. Das erfindungsgemäße Verfahren bzw. die erfindungsgemäße Vorrichtung kann zur Prozessüberwachung/Steuerung von jeglichen Kultivierungsprozessen von Suspensionskulturen eingesetzt werden. Es ist auch in der Lage, die Degeneration von Mikroorganismen on-line zu erkennen. Industriell besonders bevorzugte Einsatzgebiete für das erfindungsgemäße Verfahren sind die Herstellung von rekombinanten Proteinen, insbesondere von Proteinen, die intrazellulär gebildet werden, besonders bei Bildung von
Einschlusskörpern (inclusion bodies) , die Herstellung von Antibiotika, die Herstellung von Polyhydroxyalkanoaten, aber auch im Bereich der Grundlagenforschung an Bioprozessen.
Claims
1. Verfahren zur .Prozessüberwachung von biotechnologischen Prozessen unter Verwendung von Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, dass sowohl das Prozessmedium als auch die Mikroorganismen im Prozessmedium direkt mittels attenuierter Totalreflexion (ATR) an einem ATR-Kristall im Infrarot-Bereich spektroskopiert werden, wobei das Prozessmedium, enthaltend die Mikroorganismen, mit dem ATR-Kristall kontaktiert wird, so dass Mikroorganismen zumindest auf einen Abstand zum ATR-Kristall, der der Eindringtiefe des evaneszenten Feldes entspricht, gelangen, und während dieser Kontaktierung im Infrarot-Bereich spektroskopiert wird, worauf das Prozessmedium, enthaltend die Mikroorganismen, vom ATR-Kristall entfernt wird, der ATR-Kristall gewaschen wird, und gegebenenfalls eine erneute Kontaktierung mit dem Prozessmedium, enthaltend Mikroorganismen, erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Spektroskopie im Infrarot mit Fourier-transformierter Infrarot- Spektroskopie (FTIR-Spektroskopie) erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein Diamant-ATR-Kristall eingesetzt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet, dass das Prozessmedium mit einem automatischen Fließsystem aus dem Bioreaktor, in dem der biotechnologische Prozess durchgeführt wird, an den ATR-Kristall geführt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Waschen eine Behandlung des ATR-Kristalls mit einer Base umfasst.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Spektroskopie im Abstand von zumindest 20 Minuten, vorzugsweise von zumindest 10 Minuten, insbesondere von zumindest 5 Minuten, durchgeführt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekenn-
zeichnet, dass als Mikroorganismen einzellige Eukaryonten, insbesondere Hefe, oder Bakterien, insbesondere E. coli, verwendet werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Spektroskopie bei einer Wellenzahl von 400 bis 4000 erfolgt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 , dadurch gekennzeichnet, dass die Spektroskopie von löslichen Bestandteilen im Prozessmedium vor der Spektroskopie der Mikroorganismen vorgenommen wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Kontaktierung des ATR-Kristalls mit dem Prozessmedium die Bewegung des Mediums gestoppt wird, so dass die Mikroorganismen' auf dem ATR-Kristall abgesetzt werden, worauf die Spektroskopie der Mikroorganismen durchgeführt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismen rekombinante Mikroorganismen und/oder Antibiόtika-produzierende Mikroorganismen verwendet werden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der biotechnologische Prozess unter Bildung von Einschlusskörpern in den Mikroorganismen durchgeführt wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12 , dadurch gekennzeichnet, dass im Prozessmedium die SekundärStruktur von Proteinen überwacht wird.
1 . Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 , dadurch gekennzeichnet, dass im Prozessmedium der Gehalt von Lipiden überwacht wird.
15. Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 14, umfassend ein mit einem automatischen Fließsystem verbundenes ATR-Element mit einem ATR-Kristall, eine mit dem ATR-Kristall verbundene Infrarot-Spektroskopie-Einrichtung
und ein über ein automatisches Fließsystem mit dem ATR-Element verbundenes Waschsystem.
16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Infrarot-Spektroskopie-Einrichtung mit einer elektronischen Datenverarbeitungs-Anlage (IR-EDV) verbunden ist, womit die aufgenommenen Spektren analysiert werden können.
17. Vorrichtung nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung weiters einen Bioreaktor, gegebenenfalls gefüllt mit Prozessmedium, enthaltend Mikroorganismen, um- fasst.
18. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die IR-EDV mit Prozesssteuerungs-Einrichtungen zum Bioreaktor verbunden ist, welche von der IR-EDV steuerbar sind.
19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Infrarot-Spektroskopie-Einrichtung ein FTIR-Spektrometer ist.
20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass der ATR-Kristall horizontal gegenüber dem Prozessmedium positioniert ist, so dass das Prozessmedium über den ATR-Kristall geleitet werden kann.
21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das ATR-Element als Durchfluss-Zelle ausgeführt ist.
22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass der ATR-Kristall ein Diamant ist.
23.. Vorrichtung nach" einem der Ansprüche 15 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass das automatische Fließsystem Schläuche mit einem Innendurchmesser von mehr als 0,7 mm, vorzugsweise 1,0 mm oder mehr, insbesondere 1,2 mm oder mehr, umfasst.
24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass das ATR-Element ein Totvolumen von mehr als 5-
μl, vorzugsweise 10 μl oder mehr, insbesondere 20 μl oder mehr, aufweist.
25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Infrarot-Spektroskopie-Einrichtung einen Laser als IR-Quelle umfasst.
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