CN105603101A - 检测8个miRNA表达量的***在制备诊断或辅助诊断肝细胞癌产品中的应用 - Google Patents

检测8个miRNA表达量的***在制备诊断或辅助诊断肝细胞癌产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了检测8个miRNA表达量的***在制备诊断或辅助诊断肝细胞癌产品中的应用。用本发明的8个miRNA——hsa-miR-20a、hsa-miR-21、hsa-miR-26a、hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-146a、hsa-miR-223和hsa-miR-483-5p在血浆中含量建立的模型能够很好地诊断肝细胞癌，灵敏度可达69.6％，特异度可达92.8％，准确率可达83.3％，利用这8个miRNA与AFP对肝细胞癌进行联合诊断时的灵敏度可达85.7％。因此血浆中的miRNA作为肿瘤诊断标志物，对肝细胞癌进行诊断，也可以和AFP一起对肝细胞癌进行诊断。

Description

检测8个miRNA表达量的***在制备诊断或辅助诊断肝细胞癌产品中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中检测8个miRNA表达量的***在制备诊断或辅助诊断肝细胞癌产品中的应用。
背景技术
肝癌是指发生于肝脏的恶性肿瘤，包括原发性肝癌和转移性肝癌两种，人们日常所说的肝癌多指原发性肝癌。原发性肝癌按病理学分型可分为肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)、肝内胆管癌及混合性肝癌，其中HCC肝癌占原发性肝癌的90％左右。原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，根据最新统计，全世界每年新发肝癌患者约六十万，居恶性肿瘤的第五位。当下，肝癌在全球的发病率都呈上升趋势。2014年世界卫生组织(WorldHealthOrganization,简称WHO)发表的《全球癌症报告2014》显示，中国新增癌症病例高居世界第一位，其中肝癌的新增病例和死亡人数均居世界首位。全世界50％以上的新发和死亡肝癌患者发生在中国，每年中国大约有30万人因罹患肝癌死亡。如此高的致死率是因为缺乏敏感而特异的无创性指标来进行早期诊断。肝癌起病隐匿，早期缺乏明显症状，通常在晚期才得以确诊，而该时期由于大多存在癌细胞肝内或/及肝外转移，病人已经丧失了手术切除病灶的机会，统计数据表明肝癌晚期患者5年内的生存率只有7％左右,而早期肝癌的病人治疗后5年生存率能达到50％至70％。WHO提出了癌症三级预防的概念，针对癌症症状出现前的潜在疾患，采取“三早”(早发现、早诊断、早治疗)措施，阻止或减缓疾病的发展，促进癌症康复。研究证实，“三早”措施也是目前全世界公认的提高肝癌治疗效果的关键。
目前肿瘤发现和诊断方法主要包括病史询问、物理诊断、常规检查、影像学检查、内窥镜检查、病理活检和肿瘤标志物检测等。其中，病理活检是癌症确诊的金标准，但由于有创性且一般伴有局部疼痛，一般只在手术治疗时同时进行，穿刺活检可以引起肿瘤转移，虽然在CT精确引导下的穿刺活检定位更加准确,少有病人因为穿刺活检引起转移，但其风险仍然存在，如肝癌的穿刺活检一部分人会有肩部疼痛和轻度胸膜炎及肝周围炎。影像学检查是目前被广泛接受的一种检查方式，具有无痛、指向性好、诊断率高等优势，但在肿瘤早期诊断中还具有一定的局限性，例如很难发现体积小的肿瘤；CT等放射线检查方法对患者具有辐射伤害；MRI等精密度高的仪器检查费用高，预约时间长，普及受限。特别是，影像学检查要求有经验的技术人员做出判断，无经验的人员误诊率高。循环肿瘤生物标志物由于具有无创性，可动态监测等优点，在无症状人群肿瘤筛查方面极具应用前景。目前临床上用于诊断肝癌的肿瘤标志物主要为甲胎蛋白(AFP)，但约40％的肝癌不分泌AFP，使得肝癌检测的灵敏度一般较低(20％-65％)。因此，发现新的肝癌的肿瘤标志物具有重要意义。
巴塞罗那(BCLC)临床肝癌分期***依据肝癌的大小、肝功能状态、生理状态和肿瘤相关症状将肿瘤分为0期、A期、B期、C期和D期共五个时期。0期为超早期，此期肿瘤特点为单个肿瘤，小于2cm；A期为早期，单个肿瘤，不大于5cm；或不多于3个肿瘤，各肿瘤都不大于3cm；B期为中期，肿瘤个数为单个或多个，且肿瘤大于5cm；C期为晚期，此期已出现明显的血管侵犯或则转移；D期为终末期，此期肝脏已发生严重的损伤。BCLC分期将肿瘤的发展与临床治疗有机结合，通过评估评估病人的患病情况从而采取及时有效的干预措施，提高肝癌的治疗效果和存活率。对于0期患者，通过手术切除治愈率可以达到100％；A期患者5年生存率可以达到50％-75％；B期患者3年生存率仅为50％；C期、D期患者的生存率极低。因此，早发现早治疗是提高肝细胞癌治愈率和生存率最行之有效的方法。
MicroRNA(简写为miRNA)是一类长度19-25个核苷酸的真核生物内源性小分子单链RNA，在生物进化过程中相对保守，不编码蛋白质，对mRNA的表达起着重要的调控作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何诊断肝细胞癌。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测8个miRNA表达量的***在下述1)或2)中的应用：
1)制备诊断或辅助诊断肝细胞癌产品；
2)诊断或辅助诊断肝细胞癌；
所述8个miRNA为hsa-miR-20a、hsa-miR-21、hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-26a、hsa-miR-146a和hsa-miR-223。
上述应用中，所述表达量可为绝对表达量或相对表达量。所述相对表达量可为相对于ath-miR159a、has-miR1228和/或hsa-miR-16的相对表达量。所述表达量可为所述8个miRNA在血浆或血清中的表达量。
上述应用中，所述检测8个miRNA表达量的***可包括利用定量PCR检测所述8个miRNA的表达量的***。
上述应用中，所述利用定量PCR检测所述8个miRNA的表达量的***可包括成套引物、成套探针和/或进行定量PCR所需的其他试剂和/或仪器；
所述成套引物为序列表中序列1-序列16所示的单链DNA；所述成套探针的序列分别如序列表中序列17-序列24所示。
所述进行定量PCR所需的其他试剂可为基因表达MasterMix。MasterMix具体可为ABI公司产品，货号为4440046。所述进行定量PCR所需的其他试剂也可为DNA聚合酶和/或dNTP。所述进行定量PCR所需的仪器可为ABI7900、ABIViiATM7和/或ABIQuantStudioTM实时荧光定量PCR仪。
上述应用中，所述检测8个miRNA表达量的***还包括数据处理装置，所述数据处理装置用于将来自待测对象的所述8个miRNA表达量转换为所述待测对象的诊断结果。所述数据处理装置可为软件和/或模块。
上述应用中，所述数据处理装置能通过记载X1和X2的特征诊断肝细胞癌和非肝细胞癌；所述X1为至少50例肝细胞癌患者组成的肝细胞癌组的所述8个miRNA含量，所述X2为至少50例非肝细胞癌患者组成的非肝细胞癌组的所述8个miRNA含量。
可通过包括下述步骤的方法将所述X1和所述X2的特征记载在所述数据处理装置中：将所述X1和所述X2导入所述数据处理装置中，通过对所述X1和所述X2进行机器学习构建可用于诊断肝细胞癌的模型(将该模型命名为肝细胞癌诊断模型)。
所述通过对所述X1和所述X2进行机器学习构建可用于诊断肝细胞癌的模型可包括Y1或Y2；
Y1、对在所述肝细胞癌组中随机选择出的部分肝细胞癌患者(如大于等于50％的肝细胞癌患者)的所述8个miRNA含量和在所述非肝细胞癌组中随机选择出的部分非肝细胞癌患者的所述8个miRNA含量进行机器学习构建可用于诊断肝细胞癌的模型；
Y2、将所述Y1进行m次，得到m个可用于诊断肝细胞癌的模型；在所述m个可用于诊断肝细胞癌的模型中选择k个在所述肝细胞癌组和所述非肝细胞癌组中进行诊断的准确率高(如大于等于0.75)的模型，将这k个模型作为诊断肝细胞癌的模型(将其命名为模型1)；m≥1000；m≥k≥10，k为奇数。
利用所述模型1对待测患者进行诊断的方法包括：如所述模型1中的所述k个可用于诊断肝细胞癌的模型中大于50％的模型的结果为所述待测患者为肝细胞癌患者，所述待测患者为或候选为肝细胞癌患者；如所述模型1中的所述k个可用于诊断肝细胞癌的模型中小于50％的模型的结果为所述待测患者为肝细胞癌患者，所述待测患者为或候选为非肝细胞癌患者。
上述应用中，所述数据处理装置可通过决策树算法处理数据。所述决策树算法具体可为随机森林决策树算法。
上述应用中，所述检测8个miRNA表达量的***可仅为所述利用定量PCR检测所述8个miRNA的表达量的***，也可为所述利用定量PCR检测所述8个miRNA的表达量的***与所述数据处理装置。
上述应用中，所述检测8个miRNA表达量的***也可仅为由所述成套引物、所述成套探针和/或所述进行定量PCR所需的其他试剂组成的试剂或试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明还提供了以所述8个miRNA作为肝细胞癌标志物的诊断或辅助诊断肝细胞癌的***在所述1)或所述2)中的应用。
上述应用中，所述诊断或辅助诊断肝细胞癌的***可为所述检测8个miRNA表达量的***。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述检测8个miRNA表达量的***与检测甲胎蛋白含量的***在所述1)或所述2)中的应用。
所述检测甲胎蛋白含量的***可为检测甲胎蛋白含量的用到的试剂和/或仪器。所述检测甲胎蛋白含量的***也可为检测甲胎蛋白含量的试剂盒，如Roche公司的货号为04491742190的试剂盒。
上述应用中，所述甲胎蛋白含量可为血清中甲胎蛋白的含量。
为解决上述技术问题，本发明还提供了以所述8个miRNA与甲胎蛋白作为肝细胞癌标志物的诊断或辅助诊断肝细胞癌的***在所述1)或所述2)中的应用。
上述应用中，所述以所述8个miRNA与甲胎蛋白作为肝细胞癌标志物的诊断或辅助诊断肝细胞癌的***，由所述检测8个miRNA表达量的***与所述检测甲胎蛋白含量的***组成。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述下述M1)或M2)的应用：
M1)以所述8个miRNA作为肝细胞癌标志物在诊断或辅助诊断肝细胞癌中的应用；
M2)以所述8个miRNA与甲胎蛋白作为肝细胞癌标志物在诊断或辅助诊断肝细胞癌中的应用。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述P1)的***或P2)的产品：
P1)所述检测8个miRNA表达量的***；
P2)由所述检测8个miRNA表达量的***与所述检测甲胎蛋白含量的***组成的产品。
本发明中，所述肝脏良性疾病可为肝炎、肝硬化、局灶性结节性增生、血管瘤、血管平滑肌脂肪瘤、肝囊肿、肝细胞腺瘤中的至少一种。
本发明中，所述肝细胞癌可为早期肝细胞癌。所述早期肝细胞癌可为巴塞罗那0期肝细胞癌、巴塞罗那A期肝细胞癌、巴塞罗那B期或巴塞罗那C期肝细胞癌。
实验证明，利用本发明的8个miRNA——hsa-miR-20a、hsa-miR-21、hsa-miR-26a、hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-146a、hsa-miR-223和hsa-miR-483-5p在血浆中的表达量建立的模型能够很好地筛选肝细胞癌患者，灵敏度较高(可达69.6％)，特异度高(可达92.8％)，准确率可达83.3％，利用这8个miRNA与AFP对肝细胞癌进行联合诊断时的灵敏度可达85.7％，分别比单独利用本发明的8个miRNA进行诊断与单独利用AFP进行诊断的灵敏度高16.1％和28.6％。利用本发明的8个miRNA还可以提高对在早期肝细胞癌中诊断出肝细胞癌的灵敏度：在肝细胞癌早期与进展期(0期，A期和B期)样本中利用8个miRNA检测肝细胞癌的灵敏度分别高于在相应肝细胞癌时期利用AFP检测肝细胞癌的灵敏度，在肝细胞癌早期与进展期(0期，A期和B期)样本中利用8个miRNA与AFP对肝细胞癌进行联合诊断的灵敏度分别高于在相应肝细胞癌时期时期用8个miRNA或AFP检测肝细胞癌的灵敏度。因此8个miRNA以及8个miRNA与AFP在肝细胞癌早中期上较AFP对肝细胞癌的预测效果更佳，可对人群的肝细胞癌风险进行早期预警，提高早诊的比例。
基于此制备的用于检测血浆中8个miRNA含量的试剂盒仅仅需要血浆而不需要任何其它组织。本发明中的八个miRNA在肿瘤发生早期即发生明显的血浆异常表达，可用于肿瘤早期诊断；本发明采用多个生物标志物miRNA的组合模式，采用体外诊断多变量指标分析可促进肿瘤的诊断效果。此外，血浆miRNA不受RNA酶影响，可在低温条件下长期保存，不受冻融影响，检测方便，可实现检测技术的标准化。因此血浆中的miRNA作为肿瘤诊断标志物，具有非侵入、可动态监测的优点，是对早期肿瘤患病诊断技术的良好补充。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
灵敏度(真阳性率)：实际有病而按试验标准被正确判断为有病的百分率，灵敏度越大越好，理想灵敏度为100％。
特异度(真阴性率)：实际无病而按试验标准被正确判断为无病的百分率，特异度越大越好，理想特异度为100％。
实施例1、8个miRNA可用于诊断肝细胞癌
一、样本的选择
本申请的发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血浆样本，***收集完整的人口学资料、临床资料等，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了877人的血浆样本作为TLDA(TaqmanLowDensityArray，TLDA)芯片检测和后续一系列qRT-PCR验证的实验样品，这877人包括入选肝细胞癌组的272例肝细胞癌患者、健康对照组的275个健康人、肝脏良性疾病组的155例肝脏良性疾病患者以及其他组织器官良恶性组的175例其他组织器官良恶性患者(共包括30例肺癌、30例胃癌、30例结直肠癌、21例食管癌、29例肺部良性疾病、10例胃部良性疾病、10例结直肠良性疾病和15例子宫良性疾病)。
肝细胞癌组的入选标准为：经病理学明确诊断的初诊、未经治疗的肝细胞癌患者，并且采血前未经过手术和放化疗，无手术前放化疗。
健康对照组的入选标准为：无肿瘤疾病史，与肝细胞癌组性别、年龄匹配。
肝脏良性疾病组的入选标准为：患有肝炎、肝硬化、局灶性结节性增生、血管瘤、血管平滑肌脂肪瘤、肝囊肿、肝细胞腺瘤中的至少一种的肝脏良性疾病的患者。
其他组织器官良恶性组的入选标准为：患有肺炎、肺结核、肺错构瘤、肺真菌病和肺中叶综合征等肺部良性疾病，胃息肉和胃炎等胃部良性疾病，结直肠息肉、结直肠炎和憩室等结直肠良性疾病，子宫内膜增生、子宫内膜息肉、子宫腺肌症和***等子宫良性疾病；经病理学明确诊断的初诊、未经治疗的肺癌、食管癌、胃癌、结直肠癌患者，并且采血前未经过手术和放化疗，无手术前放化疗。
二、发现阶段
从肝细胞癌组中选取10例肝细胞癌患者血浆样本、从健康对照组中选取5个健康人的血浆样本利用TLDA芯片(AppliedBiosystems公司)进行检测，具体步骤为：
(1)提取血浆总RNA：
分别提取10例肝细胞癌患者和5个健康人血浆总RNA,提取前在血浆中加入合成的ath-miR159a。
(2)反转录得到cDNA：
利用MicroRNA反转录试剂盒(ABI,4366596),加入反转录引物(ABI，4444750)进行反转录得到cDNA。
(3)预扩增：
加入MasterMix(ABI,4440049)及预扩增引物(ABI，4444750)对芯片特异性的miRNA进行预扩增以增加表达所需的cNDA的量。
(4)荧光定量PCR反应：
在TaqManHumanMicroRNAArrayv3.0(ABI,4444913)上加入MasterMix(ABI,4440049)进行定量PCR反应。利用ABI7900荧光定量PCR仪，选择384-wellTaqManLowDensityArray特定的程序进行反应。
(5)数据分析与处理：
miRNA的不同表达水平以2^(-ΔCt)表示，其中ΔCt＝CT样本-CT参照，以血浆中稳定表达的hsa-miR-16作为参照进行标准化来计算相对表达量。通过比较肝细胞癌组与健康对照组血浆miRNA的2^(-ΔCt)表达量均值筛选差异表达的miRNA。选择满足下列任一条件的miRNA：a.肝细胞癌组中的表达量为健康对照组2倍及2倍以上,统计学差异小于0.05；b.极值法，肝细胞癌组中的表达量为健康对照组4倍及4倍以上，不考虑统计学差异；c.肝细胞癌组中的表达量为健康对照组2倍及2倍以上，统计学差异不显著，但是在肝细胞癌早诊相关文献有报道的。满足上述条件的miRNA包括：hsa-let-7e、hsa-let-7b、hsa-miR-20a、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-194、hsa-miR-221、hsa-miR-122、hsa-miR-146a、hsa-miR-99a、hsa-miR-223、hsa-miR-27a、hsa-miR-192、hsa-miR-26a和hsa-miR-21(表1)。
表1、TLDA芯片中的差异表达miRNA
三、初步验证阶段
从肝细胞癌组中选取50例肝细胞癌患者血浆样本、从健康对照组中选取50个健康人的血浆样本，利用实时荧光定量PCR方法对表1中的14个miRNA相对于参照基因ath-miR159a、has-miR1228和hsa-miR-16表达量均值的相对表达量进行进一步检测，具体步骤如下：
(1)提取血浆总RNA：
分别提取50例肝细胞癌患者和50个健康人血浆总RNA，提取前在血浆中加入合成的ath-miR159a。
(2)反转录得到cDNA：
利用反转录试剂盒(ABI,4366596),加入反转录引物(表3)的混合物进行反转录得到cDNA。
(3)Taqman定量PCR反应：
取稀释后的cDNA，加入基因表达MasterMix(ABI，4440046)，加入扩增上下游引物及探针(表4)进行taqman定量PCR反应。仪器使用的是ABI7900荧光定量PCR仪。
(4)数据分析和处理：
两组样品血浆miRNA的表达量比值可用方程2-ΔCt表示，其中ΔCt＝CT样本-CT参照，以非人源的外掺入的ath-miR159a和血浆中稳定表达的has-miR1228、hsa-miR-16三者的表达量均值作为参照基因，计算相对表达量。
结果如表2所示。在初步验证阶段发现，发现阶段选出的14个miRNA中有5个miRNA(hsa-miR-20a、hsa-miR-21、hsa-miR-122、hsa-miR-192和hsa-miR-483-5p)在肝细胞癌患者中的表达量为健康人的2倍以上，而且差异显著(p<0.05)；另有3个miRNA(hsa-miR-26a、hsa-miR-146a和hsa-miR-223)在肝细胞癌患者中的表达量为健康人的2倍以上，因此选定这8种miRNA作为肝细胞癌miRNA标志物。
表2、qRT-PCR验证中差异表达的miRNA的表达情况
步骤(2)中用得到的这8种miRNA的相对表达量用到的反转录引物如表3所示，步骤(3)中用得到的引物及探针如表4所示。
表3、miRNA序列及反转录引物序列
表4、引物及探针
四、进一步验证阶段
对上述8个miRNA分别进行两个阶段的进一步验证，分别为验证阶段1和验证阶段2，这两个阶段用到的样本如表5所示。
表5、样本数
阶段 肝细胞癌组 健康对照组 肝脏良性疾病组 其他组织器官良恶性组
验证阶段1(训练集) 112 125 75 ——
验证阶段2(验证集) 160 150 80 175
合计 272 275 155 175
(一)验证阶段1
在训练集(125例健康对照组健康人、75例肝脏良性疾病组患者和112例肝细胞癌组患者)中按照步骤三中的实时荧光定量PCR方法检测表2中8个miRNA相对于参照基因ath-miR159a、has-miR1228和hsa-miR-16表达量均值的相对表达量，然后采用随机森林法建立模型对样本进行预测，评价这8个miRNA的组合对于训练集中肝细胞癌患者的早期诊断的诊断价值。
在机器学习中，随机森林由许多的决策树组成，因为决策树的形成采用了随机的方法，因此也叫做随机决策树，它是利用多棵树对样本进行训练并预测的一种分类器。随机森林中的树之间是没有关联的。当测试数据进入随机森林时，其实就是让每一棵决策树进行分类，最后取所有决策树中分类结果最多的那类为最终的结果。因此随机森林是一个包含多个决策树的分类器，并且其输出的类别是由个别树输出的类别的众数而定。换言之，常规的随机森林将一组“weaklearner”决策树聚在一起形成一个“stronglearner”，该“stronglearner”分类的结果即是上述“weaklearner”投票的结果，得票最多的那一分组即为该“stronglearner”的预测结果，随机森林不仅适用于两分类，同样适用于多分类。
采用随机森林三分类的方法对训练集中三个分组“健康对照组、肝脏良性疾病组和肝细胞癌组”进行随机抽样，每组中挑选1/2的样本作为训练集′，剩余1/2的样本作为测试集，通过机器学习训练集′中构建一个有10000棵“weaklearner”决策树构成的“stronglearner”随机森林模型，并用该模型预测测试集数据，将此过程重复操作10000次即可得到10000个随机森林模型，然后根据每个模型的测试集预测准确率选取准确率0.75以上的91个模型组成一个“strongerlearner”模型作为肝细胞癌风险评估的分类器(C-RF模型)。具体的，当以未发现患有肝细胞癌的人为待测对象时，利用C-RF模型进行诊断，如C-RF模型中的91个模型中大于50％的模型的结果为待测患者为肝细胞癌患者，待测患者为肝细胞癌患者；如C-RF模型中的91个模型中小于50％的模型的结果为待测患者为肝细胞癌患者，所述待测患者为非肝细胞癌患者。
利用C-RF模型对训练集中的各组样本分别进行预测，结果如表6所示，肝细胞癌组中78例样本被准确预测为肝细胞癌，灵敏度为69.6％；健康对照组中116例样本被准确预测为非肝细胞癌，特异性为92.8％；肝脏良性疾病组中66例样本被准确预测为非肝细胞癌，特异性为88.0％；训练集中利用C-RF模型进行预测的准确率为83.3％。
(二)验证阶段2
在独立的验证集(160例肝细胞癌组患者、150例健康对照组健康人、80例肝脏良性疾病组患者和175例其他组织器官良恶性组患者)中按照步骤三中的实时荧光定量PCR方法检测表2中8个候选miRNA的相对表达量，然后采用训练集建立的C-RF模型进行预测，评价这8个miRNA的组合对于验证集中肝细胞癌患者的早期诊断的诊断价值。验证集中的样本与验证集中的样本相互独立。
利用C-RF模型对验证集各组样本分别进行预测，结果如表6所示，肝细胞癌组中98例样本被准确预测为肝细胞癌，灵敏度为61.3％；健康对照组中138例样本被准确预测为非肝细胞癌，特异性为92.0％；肝脏良性疾病组中71例样本被准确预测为非肝细胞癌，特异性为88.8％；其他组织器官良恶性组中159例样本被准确预测为非肝细胞癌，特异性为90.9％；验证集中利用C-RF模型进行预测的准确率为82.5％。
表6、miRNA组合对训练集和验证集人群中的性能指标分析
从以上数据可以看出，选出的表2中的这8种miRNA组合对于肝细胞癌诊断的灵敏度较高，特异度高，假阳性率低；此外，对于肝细胞癌和肝脏良性疾病疾病，肝细胞癌和其他组织器官良恶性疾病的鉴别诊断也具有极为重要的意义。
五、甲胎蛋白(AFP)与miRNA可以联合诊断肝细胞癌患者
目前临床上用于诊断肝细胞癌的肿瘤标志物主要为甲胎蛋白(AFP),通过对肝细胞癌患者联检miRNA标志物与AFP标志物的诊断阳性率，特别是miRNA标志物对AFP阴性患者的检出率对于探讨miRNA标志物在肝细胞癌诊断中的应用价值是很有必要的。
(一)、AFP含量的测定
检测实施例1步骤四中训练集和验证集肝细胞癌组中各人血清中的AFP含量，AFP的含量可通过甲胎蛋白检测试剂盒进行检测(Roche，04491742190)。
(二)、肝细胞癌患者的诊断
临床上常用的用血清中AFP的含量诊断肝细胞癌的一个参考值为20ng/ml。如待测对象血清中AFP含量＜20ng/ml，该待测对象为或候选为非肝细胞癌患者，如待测对象血清中AFP含量≥20ng/ml，该待测对象为或候选为肝细胞癌患者。根据该标准将表5中训练集和验证集中的肝细胞癌组样本分为AFP阳性组和AFP阴性组：样本中AFP含量＜20ng/ml，该样本归为AFP阴性组；样本中AFP含量≥20ng/ml，该样本归为AFP阳性组。
在训练集肝细胞癌组中，根据利用AFP诊断肝细胞癌的标准，共有64例样本确定为肝细胞癌，灵敏度为57.1％。利用本发明的8个miRNA诊断肝细胞癌进行诊断的灵敏度比单独利用AFP进行诊断的灵敏度高12.5％。在AFP阳性样本和AFP阴性样本中分别统计步骤四的C-RF模型的肝细胞癌检出率，64例AFP阳性样本中有46例样本确定为肝细胞癌，检出率为71.9％；48例AFP阴性样本中有32例样本确定为肝细胞癌，检出率为66.7％(表7)。可知，利用本发明的8个miRNA与AFP进行联合诊断共诊断出96例(64例+32例)肝细胞癌患者，联合诊断的灵敏度为85.7％，分别比单独利用本发明的8个miRNA进行诊断与单独利用AFP进行诊断的灵敏度高16.1％和28.6％。
在验证集肝细胞癌组中，根据利用AFP诊断肝细胞癌的标准，共有94例样本确定为肝细胞癌，灵敏度为58.8％。利用本发明的8个miRNA诊断肝细胞癌进行诊断的灵敏度比单独利用AFP进行诊断的灵敏度高2.5％。在AFP阳性样本和AFP阴性样本中分别统计步骤四的C-RF模型的肝细胞癌检出率，94例AFP阳性样本中有59例样本确定为肝细胞癌，检出率为62.8％；66例AFP阴性样本中有39例样本确定为肝细胞癌，检出率为59.1％(表7)。可知，利用本发明的8个miRNA与AFP进行联合诊断共诊断出133例(94例+39例)肝细胞癌患者，联合诊断的灵敏度为83.1％，分别比单独利用本发明的8个miRNA进行诊断与单独利用AFP进行诊断的灵敏度高21.8％和24.3％。
表7、miRNA标志物组合对AFP的阴性/阳性样本的检出率分析
(三)miRNA标志物与AFP对不同时期的肝细胞癌的诊断
根据巴塞罗那(BCLC)临床肝细胞癌分期***将表5中训练集和验证集中的肝细胞癌组样本分为不同的时期，对训练集和验证集中不同时期的肝细胞癌样本分别进行灵敏度统计分析(表8)。
表8数据显示，训练集中8个miRNA在各分期中进行检测的灵敏度均高于用AFP进行检测的灵敏度。验证集中肝细胞癌早期与进展期(0期，A期和B期)样本中利用miRNA检肝细胞癌的灵敏度均高于利用AFP检测肝细胞癌的灵敏度，因此miRNA在肝细胞癌早中期上较AFP对肝细胞癌的预测效果更佳。
表8、miRNA标志物与AFP联检对肝细胞癌组的检出率(敏感度)分析
因此AFP标志物与miRNA标志物间相互补充，可以更有效的筛选出肝细胞癌的高危人群，特别的，miRNA标志物在肝细胞癌早期的性能较AFP性能更佳，在巴塞罗那0期，A期、B期的灵敏度都明显高于AFP，更为有效的补充AFP阳性率不足的缺陷，对HCC原发性肝细胞癌的早期发现和早期诊断具有重要意义。

Claims (10)

1.检测8个miRNA表达量的***在下述1)或2)中的应用：
1)制备诊断或辅助诊断肝细胞癌产品；
2)诊断或辅助诊断肝细胞癌；
所述8个miRNA为hsa-miR-20a、hsa-miR-21、hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-26a、hsa-miR-146a和hsa-miR-223。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测8个miRNA表达量的***包括利用定量PCR检测所述8个miRNA的表达量的***。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述利用定量PCR检测所述8个miRNA的表达量的***包括成套引物、成套探针和/或进行定量PCR所需的其他试剂和/或仪器；
所述成套引物为序列表中序列1-序列16所示的单链DNA；所述成套探针的序列分别如序列表中序列17-序列24所示。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述检测8个miRNA表达量的***还包括数据处理装置，所述数据处理装置用于将来自待测对象的所述8个miRNA表达量转换为所述待测对象的诊断结果。
5.以权利要求1所述8个miRNA作为肝细胞癌标志物的诊断或辅助诊断肝细胞癌的***在权利要求1中所述1)或所述2)中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述诊断或辅助诊断肝细胞癌的***为权利要求1-4中任一所述检测8个miRNA表达量的***。
7.权利要求1-4中任一所述检测8个miRNA表达量的***与检测甲胎蛋白含量的***在权利要求1中所述1)或所述2)中的应用。
8.以权利要求1所述8个miRNA与甲胎蛋白作为肝细胞癌标志物的诊断或辅助诊断肝细胞癌的***在权利要求1中所述1)或所述2)中的应用。
9.下述M1)或M2)的应用：
M1)以权利要求1所述8个miRNA作为肝细胞癌标志物在诊断或辅助诊断肝细胞癌中的应用；
M2)以权利要求1所述8个miRNA与甲胎蛋白作为肝细胞癌标志物在诊断或辅助诊断肝细胞癌中的应用。
10.下述P1)的***或P2)的产品：
P1)权利要求1-4中任一所述检测8个miRNA表达量的***；
P2)由权利要求1-4中任一所述检测8个miRNA表达量的***与检测甲胎蛋白含量的***组成的产品。
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