EA044836B1 - NON-INVASIVE DIAGNOSTICS OF NON-ALCOHOLIC STEATHOEPATITIS - Google Patents
NON-INVASIVE DIAGNOSTICS OF NON-ALCOHOLIC STEATHOEPATITIS Download PDFInfo
- Publication number
- EA044836B1 EA044836B1 EA201892201 EA044836B1 EA 044836 B1 EA044836 B1 EA 044836B1 EA 201892201 EA201892201 EA 201892201 EA 044836 B1 EA044836 B1 EA 044836B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- nash
- mir
- hsa
- level
- scores
- Prior art date
Links
- 208000008338 non-alcoholic fatty liver disease Diseases 0.000 claims description 319
- 206010053219 non-alcoholic steatohepatitis Diseases 0.000 claims description 283
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 91
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 claims description 81
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 claims description 76
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 75
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 61
- 231100000240 steatosis hepatitis Toxicity 0.000 claims description 57
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims description 56
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 56
- 230000007863 steatosis Effects 0.000 claims description 56
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims description 55
- 101000883515 Homo sapiens Chitinase-3-like protein 1 Proteins 0.000 claims description 54
- 102100038196 Chitinase-3-like protein 1 Human genes 0.000 claims description 52
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 49
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 49
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 38
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 38
- 108091067619 Homo sapiens miR-34a stem-loop Proteins 0.000 claims description 34
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 claims description 32
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 27
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 27
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 25
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 24
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 24
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 claims description 23
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 23
- 102100033312 Alpha-2-macroglobulin Human genes 0.000 claims description 22
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 claims description 20
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 claims description 19
- IXZISFNWUWKBOM-ARQDHWQXSA-N fructosamine Chemical compound NC[C@@]1(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O IXZISFNWUWKBOM-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 16
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 claims description 15
- 108010074051 C-Reactive Protein Proteins 0.000 claims description 14
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 claims description 12
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 claims description 12
- 230000005484 gravity Effects 0.000 claims description 12
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 claims description 12
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 claims description 12
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 claims description 11
- 230000007170 pathology Effects 0.000 claims description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 10
- 102000001187 Collagen Type III Human genes 0.000 claims description 9
- 108010069502 Collagen Type III Proteins 0.000 claims description 9
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 claims description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 7
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 7
- 208000004930 Fatty Liver Diseases 0.000 claims description 6
- 102000017011 Glycated Hemoglobin A Human genes 0.000 claims description 6
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 6
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 6
- 108091005995 glycated hemoglobin Proteins 0.000 claims description 6
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 6
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 claims description 5
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 claims description 4
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 claims description 4
- 208000010706 fatty liver disease Diseases 0.000 claims description 4
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 claims description 4
- 230000003284 homeostatic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 claims description 4
- 206010019708 Hepatic steatosis Diseases 0.000 claims description 3
- 238000009534 blood test Methods 0.000 claims description 2
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 claims 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 claims 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 43
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 35
- 238000012317 liver biopsy Methods 0.000 description 33
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 27
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 24
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 23
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 19
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 16
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 16
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 15
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 15
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 14
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 101710095342 Apolipoprotein B Proteins 0.000 description 13
- 102100040202 Apolipoprotein B-100 Human genes 0.000 description 13
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 13
- 108091029119 miR-34a stem-loop Proteins 0.000 description 13
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 12
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 12
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 12
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 11
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 11
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 11
- 108091007780 MiR-122 Proteins 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 10
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 10
- 108010023302 HDL Cholesterol Proteins 0.000 description 9
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 9
- 102000015779 HDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 9
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 9
- 108091040342 miR-34a-1 stem-loop Proteins 0.000 description 9
- 108091035608 miR-34a-2 stem-loop Proteins 0.000 description 9
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 8
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 description 8
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 8
- 108091069016 Homo sapiens miR-122 stem-loop Proteins 0.000 description 8
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 8
- 102000005666 Apolipoprotein A-I Human genes 0.000 description 7
- 108010059886 Apolipoprotein A-I Proteins 0.000 description 7
- 108091065166 Homo sapiens miR-200a stem-loop Proteins 0.000 description 7
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 7
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 7
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 6
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 6
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 6
- 206010042135 Stomatitis necrotising Diseases 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 6
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 6
- 108010022197 lipoprotein cholesterol Proteins 0.000 description 6
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 201000008585 noma Diseases 0.000 description 6
- 108010046315 IDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 5
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 5
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 238000003253 miRNA assay Methods 0.000 description 5
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 238000012549 training Methods 0.000 description 5
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 4
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 4
- 102000003973 Fibroblast growth factor 21 Human genes 0.000 description 4
- 108090000376 Fibroblast growth factor 21 Proteins 0.000 description 4
- 108020004206 Gamma-glutamyltransferase Proteins 0.000 description 4
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 4
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 4
- 102000006640 gamma-Glutamyltransferase Human genes 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 108010034596 procollagen Type III-N-terminal peptide Proteins 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 4
- MXBCYQUALCBQIJ-RYVPXURESA-N (8s,9s,10r,13s,14s,17r)-13-ethyl-17-ethynyl-11-methylidene-1,2,3,6,7,8,9,10,12,14,15,16-dodecahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-ol;(8r,9s,13s,14s,17r)-17-ethynyl-13-methyl-7,8,9,11,12,14,15,16-octahydro-6h-cyclopenta[a]phenanthrene-3,17-diol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1.C1CC[C@@H]2[C@H]3C(=C)C[C@](CC)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MXBCYQUALCBQIJ-RYVPXURESA-N 0.000 description 3
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 3
- 108091065981 Homo sapiens miR-155 stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 3
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 3
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000008050 Total Bilirubin Reagent Methods 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 108010069201 VLDL Cholesterol Proteins 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 3
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 3
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 108091074487 miR-34 stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 108091092493 miR-34-1 stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 108091059780 miR-34-2 stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 108091090568 miR-39 stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 108091056739 miR-39-1 stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 108091039160 miR-39-2 stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 3
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 2
- 108010055851 Acetylglucosaminidase Proteins 0.000 description 2
- 102000011690 Adiponectin Human genes 0.000 description 2
- 108010076365 Adiponectin Proteins 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 208000007082 Alcoholic Fatty Liver Diseases 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 108091070482 Caenorhabditis elegans miR-39 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 2
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 2
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 2
- 102100031734 Fibroblast growth factor 19 Human genes 0.000 description 2
- 102000014702 Haptoglobin Human genes 0.000 description 2
- 108050005077 Haptoglobin Proteins 0.000 description 2
- 101000846394 Homo sapiens Fibroblast growth factor 19 Proteins 0.000 description 2
- 108091067995 Homo sapiens miR-192 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091070493 Homo sapiens miR-21 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091068837 Homo sapiens miR-29b-1 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091068845 Homo sapiens miR-29b-2 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 102100033421 Keratin, type I cytoskeletal 18 Human genes 0.000 description 2
- 108010066327 Keratin-18 Proteins 0.000 description 2
- 108010028554 LDL Cholesterol Proteins 0.000 description 2
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 description 2
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 description 2
- 108010051335 Lipocalin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000013519 Lipocalin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108091008065 MIR21 Proteins 0.000 description 2
- 108091030146 MiRBase Proteins 0.000 description 2
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 2
- 108010022233 Plasminogen Activator Inhibitor 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100039418 Plasminogen activator inhibitor 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100030122 Protein O-GlcNAcase Human genes 0.000 description 2
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 2
- 101100041929 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SDH3 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 description 2
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 description 2
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 2
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 2
- 208000026594 alcoholic fatty liver disease Diseases 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 2
- 229950001279 elafibranor Drugs 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- AFLFKFHDSCQHOL-IZZDOVSWSA-N gft505 Chemical compound C1=CC(SC)=CC=C1C(=O)\C=C\C1=CC(C)=C(OC(C)(C)C(O)=O)C(C)=C1 AFLFKFHDSCQHOL-IZZDOVSWSA-N 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 2
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 2
- 229940039781 leptin Drugs 0.000 description 2
- NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N leptin Chemical compound O=C([C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CCSC)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 2
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- OBHRVMZSZIDDEK-UHFFFAOYSA-N urobilinogen Chemical compound CCC1=C(C)C(=O)NC1CC1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(CC3C(=C(CC)C(=O)N3)C)N2)CCC(O)=O)N1 OBHRVMZSZIDDEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 108091027075 5S-rRNA precursor Proteins 0.000 description 1
- 102000003966 Alpha-1-microglobulin Human genes 0.000 description 1
- 101800001761 Alpha-1-microglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010003827 Autoimmune hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000008439 Biliary Liver Cirrhosis Diseases 0.000 description 1
- 208000015163 Biliary Tract disease Diseases 0.000 description 1
- 102100032752 C-reactive protein Human genes 0.000 description 1
- JHQXCEBEGVCTTB-UHFFFAOYSA-N CSc1ccc(cc1)C(=O)C=Cc1cc(C)c(C(O)=O)c(C)c1OC(C)C Chemical compound CSc1ccc(cc1)C(=O)C=Cc1cc(C)c(C(O)=O)c(C)c1OC(C)C JHQXCEBEGVCTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 108010066813 Chitinase-3-Like Protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000018704 Chitinase-3-Like Protein 1 Human genes 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010008609 Cholangitis sclerosing Diseases 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 102000012192 Cystatin C Human genes 0.000 description 1
- 108010061642 Cystatin C Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010019663 Hepatic failure Diseases 0.000 description 1
- 206010019668 Hepatic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010019728 Hepatitis alcoholic Diseases 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 208000002972 Hepatolenticular Degeneration Diseases 0.000 description 1
- 101000741967 Homo sapiens Presequence protease, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 108091068855 Homo sapiens miR-103a-1 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091068838 Homo sapiens miR-103a-2 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091067692 Homo sapiens miR-199a-1 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091067467 Homo sapiens miR-199a-2 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091067572 Homo sapiens miR-221 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000057248 Lipoprotein(a) Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 208000001145 Metabolic Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000015532 Nicotinamide phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010064862 Nicotinamide phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038632 Presequence protease, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 208000012654 Primary biliary cholangitis Diseases 0.000 description 1
- 102000007156 Resistin Human genes 0.000 description 1
- 108010047909 Resistin Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 102000004987 Troponin T Human genes 0.000 description 1
- 108090001108 Troponin T Proteins 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000018839 Wilson disease Diseases 0.000 description 1
- PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N [N].NC(N)=O Chemical compound [N].NC(N)=O PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000000690 abdominal obesity-metabolic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 208000002353 alcoholic hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L calcium carbonate Substances [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000011984 electrochemiluminescence immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 208000036449 fibrotic liver disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 1
- 230000002641 glycemic effect Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- -1 hsa-miR-34a Proteins 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000835 liver failure Toxicity 0.000 description 1
- 208000007903 liver failure Diseases 0.000 description 1
- 208000018191 liver inflammation Diseases 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000007620 mathematical function Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000004848 nephelometry Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000101 novel biomarker Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 201000000742 primary sclerosing cholangitis Diseases 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 208000010157 sclerosing cholangitis Diseases 0.000 description 1
- 238000013077 scoring method Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000007473 univariate analysis Methods 0.000 description 1
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
Description
Область изобретенияField of invention
Изобретение относится к новому способу диагностики неалкогольного стеатогепатита (NASH) и классификации индивидуума как потенциального реципиента лечения NASH.The invention relates to a new method for diagnosing non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and classifying an individual as a potential recipient of NASH treatment.
Предпосылки изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION
Неалкогольная жировая болезнь печени (NAFLD) является прогрессирующим заболеванием печени, охватывающим диапазон от простого стеатоза до неалкогольного стеатогепатита (NASH).Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a progressive liver disease spanning the spectrum from simple steatosis to non-alcoholic steatohepatitis (NASH).
Неалкогольный стеатогепатит (NASH) также является прогрессирующим заболеванием печени, гистологически отличающимся накоплением жирных кислот, повреждением гепатоцитов и воспалением, напоминающим алкогольный гепатит. NASH представляет собой критическую стадию процесса, который может приводить к циррозу, печеночной недостаточности и/или НСС (печеночно-клеточной карциноме). Для постановки этого диагноза необходимо тщательное документирование отсутствия значительного потребления алкоголя. NASH является одной из наиболее распространенных причин повышения аминотрансфераз у пациентов, рассматриваемых гепатологами при оценке. Ожирение и диабет 2 типа ассоциированы с NASH.Nonalcoholic steatohepatitis (NASH) is also a progressive liver disease characterized histologically by fatty acid accumulation, hepatocyte damage, and inflammation resembling alcoholic hepatitis. NASH is a critical stage of the process that can lead to cirrhosis, liver failure and/or HCC (hepatocellular carcinoma). Making this diagnosis requires careful documentation of the absence of significant alcohol consumption. NASH is one of the most common causes of elevated aminotransferases in patients considered by hepatologists for evaluation. Obesity and type 2 diabetes are associated with NASH.
Вместе с распространением ожирения во всем мире, частота NASH также увеличилась за последние годы, и пациенты с развившимся NASH имеют повышенный показатель смертности, связанной с заболеваниями печени. Т.к. распространенность этих заболевания повышается, ожидают, что распространенность NASH также будет повышаться, и, таким образом, это заболевание становится растущей общественной проблемой в США, а также других странах. Таким образом, растущая распространенность и повышенная смертность, ассоциированные с этими заболеваниями, подчеркивают необходимостьWith the rise of obesity worldwide, the incidence of NASH has also increased in recent years, and patients who develop NASH have an increased rate of liver disease-related mortality. Because As the prevalence of these diseases increases, the prevalence of NASH is also expected to increase, and thus, this disease is becoming a growing public problem in the United States as well as other countries. Thus, the increasing prevalence and increased mortality associated with these diseases highlight the need
i) большего механистического понимания прогрессирования заболевания; и ii) разработки более чувствительного и надежного способа неинвазивной диагностики NASH.i) greater mechanistic understanding of disease progression; and ii) developing a more sensitive and reliable method for non-invasive diagnosis of NASH.
Т.к. эти заболевания потенциально можно реверсировать при достаточно ранней диагностике или, по меньшей мере, ограничить их последствия, представляется важным иметь возможность обеспечить медицинскую область новым инструментам, делающими возможной такую раннюю, быструю и точную диагностику.Because These diseases can potentially be reversed if diagnosed early enough, or at least limit their consequences, it seems important to be able to provide the medical field with new tools that make such early, rapid and accurate diagnosis possible.
Хотя предпринималось несколько попыток предложить неинвазивные способы диагностики и определения активности, стадии или тяжести NASH, в настоящее время гистологический анализ биоптатов печени остается оптимальным подходом для дифференцирования NASH и ранних стадий стеатоза. Стеатоз, лобулярное и портальное воспаление, повреждение гепатоцитов в формах баллонирования и апоптоза и фиброз являются признаками NASH, оцениваемыми при биопсии. Однако биопсия печени имеет ряд очевидных недостатков. Во-первых, материал, собранный при биопсии печени, представляет собой лишь очень небольшую часть печени индивидуума, подвергаемого диагностике, что, таким образом, увеличивает сомнения, касающиеся того, свидетельствует ли полученный образец об общем состоянии органа индивидуума. Кроме того, биопсия печени является очень инвазивным способом, который может являться трудоемким, причиняющим беспокойство и болезненным для пациента, что увеличивает опасения, касающиеся осложнений и смертности. И наконец, в свете приведенного выше, биопсию печени нельзя с достаточными основаниями предлагать в качестве рутинного способа определения того, страдает ли NASH индивидуум из общей совокупности или даже пациенты с риском NASH, и/или определения активности, стадии или тяжести NASH у указанного индивидуума.Although several attempts have been made to offer non-invasive methods for diagnosing and determining the activity, stage or severity of NASH, currently histological analysis of liver biopsies remains the optimal approach for differentiating NASH from early stages of steatosis. Steatosis, lobular and portal inflammation, hepatocyte damage in the forms of ballooning and apoptosis, and fibrosis are features of NASH assessed by biopsy. However, liver biopsy has a number of obvious disadvantages. First, the material collected in a liver biopsy represents only a very small portion of the liver of the individual being diagnosed, thereby increasing doubt as to whether the sample obtained is indicative of the overall health of the individual's organ. In addition, liver biopsy is a highly invasive procedure that can be time-consuming, distressing and painful for the patient, increasing concerns regarding morbidity and mortality. Finally, in light of the above, liver biopsy cannot reasonably be proposed as a routine means of determining whether an individual in the general population, or even patients at risk for NASH, has NASH, and/or determining the activity, stage, or severity of NASH in that individual.
Ультрасонографию также использовали для диагностики жирового гепатоза. Однако этот способ является субъективным, т.к. он основан на интенсивности отраженного сигнала (эхогенности) и конкретных паттернов отраженных сигналов (текстуры). В результате он не является достаточно чувствительным и зачастую неточен, особенно у пациентов с фиброзом на поздних стадиях.Ultrasonography has also been used to diagnose fatty liver disease. However, this method is subjective, because it is based on the intensity of the reflected signal (echogenicity) and specific patterns of reflected signals (texture). As a result, it is not sensitive enough and is often inaccurate, especially in patients with advanced fibrosis.
В современных руководствах по диагностике NASH рекомендуют использование соотношения АСТ/АЛТ у нетяжелых пациентов (Angulo P.N., Engl. J. Med., 2002 Apr 18, 346(16):1221-31; Maher J.J., Semin Gastrointest Dis., 2002, 13:31-9) и биопсии печени у тяжелых пациентов с использованием дискриминантной функции Маддрея выше 32 (Levitsky J., Mailliard M.E., Semin Liver Dis., 2004, 24:233-47; Mathurin P. et al., Gastroenterology, 1996, 110:1847-53; Mathurin P. et al., J. Hepatol., 2002, 36:480-7).Current guidelines for the diagnosis of NASH recommend the use of the AST/ALT ratio in non-severe patients (Angulo P.N., Engl. J. Med., 2002 Apr 18, 346(16):1221-31; Maher J.J., Semin Gastrointest Dis., 2002, 13 :31-9) and liver biopsy in severe patients using a Maddray discriminant function greater than 32 (Levitsky J., Mailliard M.E., Semin Liver Dis., 2004, 24:233-47; Mathurin P. et al., Gastroenterology, 1996, 110:1847-53; Mathurin P. et al., J. Hepatol., 2002, 36:480-7).
Т.к. биопсия печени все еще является инвазивным и затратным способом с потенциальной ошибкой выборочного исследования, предпочтительным может являться наличие быстрого и простого способа для осуществления тестирования, обладающего хорошим прогностическим значением уровня NASH у пациента.Because While liver biopsy is still invasive and costly with potential for sampling bias, it may be preferable to have a quick and easy way to perform testing that has a good predictive value for a patient's NASH level.
В нескольких исследованиях описано, что некоторые сывороточные биомаркеры фиброза имеют лучшие диагностические значения, чем стандартные сывороточные маркеры, такие трансаминазы или ActiTest (Naveau S. et al., Clin. Gastroenterol. Hepatol., 2005, 3(2); Castera L. et al., J. Hepatol., 2000, 32:412-8; Annoni G. et al., Hepatology, 1989;9:693-7; Nojgaard C. et al., J. Hepatol., 2003, 39:179-86; Chossegros P., 1995, 22(2 Suppl):96-9), но ни в одном из этих исследований не идентифицирована точная комбинация маркеров NASH.Several studies have described that some serum fibrosis biomarkers have better diagnostic values than standard serum markers such as transaminases or ActiTest (Naveau S. et al., Clin. Gastroenterol. Hepatol., 2005, 3(2); Castera L. et al. al., J. Hepatol., 2000, 32:412-8; Annoni G. et al., Hepatology, 1989;9:693-7; Nojgaard C. et al., J. Hepatol., 2003, 39:179 -86; Chossegros P., 1995, 22(2 Suppl):96-9), but none of these studies identified the exact combination of NASH markers.
Кроме того, в последние годы в некоторых исследованиях изучали использование неинвазивных биомаркеров, которые приобрели важное значение в области диагностики печени. Например, в ЕР 1846862 В описывают неинвазивный способ in vitro для диагностики алкогольного или неалкогольного стеатогепа- 1 044836 тита в образце сыворотки или плазмы пациента, включающий стадии измерения концентрации 7 биохимических маркеров, а затем их комбинирования с помощью логистической функции для получения конечного значения.In addition, in recent years, some studies have explored the use of noninvasive biomarkers, which have become important in the field of liver diagnostics. For example, EP 1846862 B describes a non-invasive in vitro method for diagnosing alcoholic or non-alcoholic steatohepatitis in a patient serum or plasma sample, comprising the steps of measuring the concentration of 7 biochemical markers and then combining them using a logistic function to obtain a final value.
В WO 2014/049131 описывают анализ крови для неинвазивной диагностики неалкогольного стеатогепатита на основе измерения по меньшей мере одного биомаркера, отражающего апоптоз, по меньшей мере одного биомаркера, отражающего антропометрические данные, по меньшей мере одного биомаркера, отражающего метаболическую активность и необязательно по меньшей мере одного биомаркера, отражающего состояние печени и комбинирования указанных биомаркеров с использованием математической функции.WO 2014/049131 describes a blood test for the non-invasive diagnosis of non-alcoholic steatohepatitis based on the measurement of at least one biomarker reflecting apoptosis, at least one biomarker reflecting anthropometric data, at least one biomarker reflecting metabolic activity and optionally at least one a biomarker reflecting the condition of the liver and combining these biomarkers using a mathematical function.
Осуществлено несколько исследований, в которых сравнивали и комбинировали неинвазивные биомаркеры для оценки печеночного фиброза, а также сравнивали точность различных алгоритмов, включающих эти неинвазивные биомаркеры. Трудность заключается в выборе эффективных и надежных биомаркеров в конечном итоге для их комбинирования посредством алгоритма, анализе различных результатов и необязательно определении хорошо отвечающих пациентов.Several studies have compared and combined noninvasive biomarkers to assess hepatic fibrosis, and have compared the accuracy of different algorithms incorporating these noninvasive biomarkers. The difficulty lies in selecting effective and reliable biomarkers to ultimately combine them through an algorithm, analyzing different results, and not necessarily identifying well-responding patients.
Однако в настоящее время такой точный способ диагностики NASH недоступен.However, such an accurate method for diagnosing NASH is currently not available.
Таким образом, существует потребность в точных, неинвазивных способах диагностики и определения активности, стадии или тяжести NASH у индивидуума.Thus, there is a need for accurate, non-invasive methods for diagnosing and determining the activity, stage or severity of NASH in an individual.
Сущность изобретенияThe essence of the invention
Настоящее изобретение основано на очень точном и полном анализе большого количества переменных, определенных с использованием более 300 образцов высокого качества, полученных от пациентов с NASH при клиническом исследовании, осуществленных заявителем (исследование GFT505-212-7NCT01694849), включающем гистологические данные, полученные с использованием биоптатов печени пациентов. Это исследование привело к открытию ключевых циркулирующих факторов (или биомаркеров), свидетельствующих о NASH и его тяжести, или стадии, или активности.The present invention is based on a very precise and complete analysis of a large number of variables determined using more than 300 high quality samples obtained from patients with NASH in a clinical study carried out by the applicant (study GFT505-212-7NCT01694849), including histological data obtained using biopsies liver of patients. This research led to the discovery of key circulating factors (or biomarkers) indicative of NASH and its severity, or stage, or activity.
Настоящее изобретение относится к способу диагностики стадии или тяжести неалкогольного стеатогепатита (NASH) у индивидуума, и/или классификации индивидуума как реципиента или нереципиента лечения NASH, и/или оценки эффективности лечения, и/или определения прогрессирования или регрессирования патологии у пациентов с NASH, и/или классификации пациента как потенциально отвечающего или неотвечающего на лечение, и/или прогнозирования исхода заболевания у пациента, и/или идентификации суррогатных маркеров клинических исходов, включающих этапы измерения уровня в крови, сыворотки или плазме циркулирующего hsa-miR-34 и измерения в крови, сыворотке или плазме уровня циркулирующей YKL-40.The present invention relates to a method for diagnosing the stage or severity of non-alcoholic steatohepatitis (NASH) in an individual, and/or classifying the individual as a recipient or non-recipient of NASH treatment, and/or assessing the effectiveness of treatment, and/or determining the progression or regression of pathology in patients with NASH, and /or classifying a patient as a potential responder or non-responder to treatment, and/or predicting the patient's disease outcome, and/or identifying surrogate markers of clinical outcomes, including the steps of measuring blood, serum or plasma levels of circulating hsa-miR-34 and measuring blood levels , serum or plasma levels of circulating YKL-40.
Другие аспекты и варианты осуществления будут очевидны из следующего подробного описания.Other aspects and embodiments will become apparent from the following detailed description.
Подробное описание изобретенияDetailed Description of the Invention
Настоящее изобретение основано на количественном анализе и/или комбинировании конкретных циркулирующих микроРНК (мкРНК) и других циркулирующих биомаркеров, таких как биохимические биомаркеры, являющиеся циркулирующими маркерами повреждения печени.The present invention is based on the quantitative analysis and/or combination of specific circulating microRNAs (miRNAs) and other circulating biomarkers, such as biochemical biomarkers that are circulating markers of liver damage.
В частности, заявитель определил, что среди мкРНК, описанных в этой области, есть потенциальные маркеры воспаления в условиях NASH/NAFLD (hsa-miR-21, hsa-miR-24, hsa-miR-33а, hsa-miR-34a, hsa-miR-122 и hsa-miR-155), hsa-miR-34a является ключевым биомаркером для диагностики NASH.In particular, the applicant has identified that among the miRNAs described in this area, there are potential markers of inflammation in NASH/NAFLD conditions (hsa-miR-21, hsa-miR-24, hsa-miR-33a, hsa-miR-34a, hsa -miR-122 and hsa-miR-155), hsa-miR-34a is a key biomarker for the diagnosis of NASH.
Таким образом, первый аспект изобретения относится к способу диагностики стадии или тяжести NASH у индивидуума, включающему измерение уровня циркулирующей hsa-miR-34a в крови, сыворотке или плазме и измерение уровня циркулирующей YKL-40 в крови, сыворотке или плазме и необязательно по меньшей мере одного другого циркулирующего маркера повреждения печени в крови, сыворотке или плазме.Thus, the first aspect of the invention relates to a method for diagnosing the stage or severity of NASH in an individual, comprising measuring the level of circulating hsa-miR-34a in blood, serum or plasma and measuring the level of circulating YKL-40 in blood, serum or plasma and optionally at least one other circulating marker of liver damage in blood, serum or plasma.
По изобретению, комбинации конкретных мкРНК и необязательно других конкретных биохимических маркеров могут приводить к очень точному, неинвазивному способу диагностики и определения стадии или тяжести NASH у индивидуума. Таким образом, настоящее изобретение относится к комбинации обоих типов маркеров таким образом, что способ является очень мощным и точным. Способ по настоящему изобретению обладает селективностью и специфичностью в отношении NASH у индивидуума.According to the invention, combinations of specific miRNAs and optionally other specific biochemical markers can result in a highly accurate, non-invasive method for diagnosing and determining the stage or severity of NASH in an individual. Thus, the present invention relates to a combination of both types of markers in such a way that the method is very powerful and accurate. The method of the present invention has selectivity and specificity for NASH in an individual.
Таким образом, настоящее изобретение обусловлено идентификацией определенного набора циркулирующих маркеров, которые при рассмотрении в совокупности свидетельствуют о NASH и/или активности, стадии или тяжести NASH у индивидуума, тестируемого на NASH или его тяжесть, или стадию, или активность. Изобретение, в частности, относится к способу диагностики неалкогольного стеатогепатита (NASH) и/или определения стадии или тяжести NASH у индивидуума, в котором комбинируют идентификацию циркулирующих микроРНК (мкРНК) и других циркулирующих маркеров повреждения печени и количественный анализ их уровня.Thus, the present invention is driven by the identification of a defined set of circulating markers that, when considered together, are indicative of NASH and/or NASH activity, stage, or severity in an individual being tested for NASH or its severity, stage, or activity. The invention particularly relates to a method for diagnosing non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and/or determining the stage or severity of NASH in an individual, which combines the identification of circulating microRNAs (miRNAs) and other circulating markers of liver damage and quantification of their levels.
В последнее время наблюдают высокий уровень активности в области, окружающей мкРНК как биомаркеров различных заболеваний, включая злокачественные новообразования, гепатит, повреждение печени и NAFLD (неалкогольную жировую болезнь печени) (Osman, Clin. Lab., 2012, 58:393-402; Cermelli et al., PloS.One, 2011, 6:e23937; Elfimova et al., Front. Physiol., 2012, 3:476).Recently, high levels of activity have been observed in the region surrounding miRNAs as biomarkers of various diseases, including malignancies, hepatitis, liver damage and NAFLD (Non-Alcoholic Fatty Liver Disease) (Osman, Clin. Lab., 2012, 58:393-402; Cermelli et al., PloS.One, 2011, 6:e23937; Elfimova et al., Front. Physiol., 2012, 3:476).
мкРНК являются некодирующими, небольшими (от 19 до 25 нуклеотидов в длину), высококонсер- 2 044836 вативными регуляторными РНК, регулирующими экспрессию генов на посттранскрипционном уровне посредством частичной репрессии или деградации мРНК-мишени, в качестве эволюционно консервативного молекулярного механизма для модуляции синтеза белка.miRNAs are non-coding, small (19 to 25 nucleotides in length), highly conserved regulatory RNAs that regulate gene expression at the post-transcriptional level through partial repression or degradation of target mRNA, as an evolutionarily conserved molecular mechanism for modulating protein synthesis.
В настоящее время существует более 2000 известных мкРНК, кодируемых различными межгенными, интронными или экзонными последовательностями в геноме человека, и считают, что мкРНК могут напрямую направленно воздействовать на до 60% всех генов человека. мкРНК участвуют в широком спектре биологических процессов, включая апоптоз, дифференцировку, развитие, пролиферацию и метаболизм клеток.Currently, there are more than 2000 known miRNAs encoded by various intergenic, intronic, or exonic sequences in the human genome, and it is believed that miRNAs can directly target up to 60% of all human genes. miRNAs are involved in a wide range of biological processes, including apoptosis, differentiation, development, proliferation and cell metabolism.
Циркулирующие мкРНК являются удивительно стабильными в среде, богатой рибонуклеазами, в крови, т.к. они могут встраиваться в рибонуклеопротеиновые комплексы или везикулы.Circulating miRNAs are remarkably stable in the ribonuclease-rich environment of the blood because they can be incorporated into ribonucleoprotein complexes or vesicles.
Конкретные профили экспрессии мкРНК ассоциированы с некоторыми заболеваниями, включая некоторые злокачественные новообразования, заболевания печени, сердца, почки и аутоиммунное заболевание. Если профили экспрессии циркулирующих мкРНК сильно коррелируют с конкретными условиями, то профиль циркулирующих мкРНК может служить в качестве биомаркера для диагностики и мониторинга заболеваний. мкРНК недавно стали рассматривать в качестве новых биомаркеров и потенциальных терапевтических мишеней при лечении NAFLD.Specific miRNA expression profiles are associated with several diseases, including some malignancies, liver disease, heart disease, kidney disease, and autoimmune disease. If circulating miRNA expression profiles are highly correlated with specific conditions, then the circulating miRNA profile could serve as a biomarker for disease diagnosis and monitoring. miRNAs have recently been considered as novel biomarkers and potential therapeutic targets for the treatment of NAFLD.
С момента их открытия, мкРНК исследуют на потенциальную взаимосвязь с заболеваниями человека. При многих заболеваниях наблюдают изменения их профилей экспрессии по сравнению с нормальными тканями и сывороткой. В частности, изменения экспрессии мкРНК при заболеваниях сердца, сепсисе, злокачественных новообразованиях и аутоиммунных заболеваниях позволяют найти новый путь исследования и мишени для лечения заболеваний человека.Since their discovery, miRNAs have been investigated for potential relationships with human diseases. Many diseases exhibit changes in their expression profiles compared to normal tissues and serum. In particular, changes in miRNA expression in heart diseases, sepsis, malignancies and autoimmune diseases provide a new avenue of research and targets for the treatment of human diseases.
Эта перспективная новая область позволила провести исследования и обнаружить возможность того, что стабильные мкРНК, детектируемые в сыворотке и плазме, могут служить в качестве биомаркеров ранних стадий заболевания или являться неинвазивным средством определения тяжести заболевания. Однако мкРНК являются достаточно мощным и значительным показателем NASH, и все еще необходимы способы реализации этого, т.к. современным золотым стандартом диагностики или определения стадии NASH все еще остается биопсия печени.This promising new field has led to research and discovery of the possibility that stable miRNAs detected in serum and plasma could serve as biomarkers for early stages of disease or provide a non-invasive means of determining disease severity. However, miRNAs are quite powerful and significant indicators of NASH, and ways to implement this are still needed because The current gold standard for diagnosing or staging NASH is still liver biopsy.
Среди мкРНК hsa-miR-122 предлагают в качестве биомаркера заболевания печени (Chang et al., 2004; Lagos-Quintana et al., 2002).Among miRNAs, hsa-miR-122 has been proposed as a biomarker of liver disease (Chang et al., 2004; Lagos-Quintana et al., 2002).
В исследованиях по определению профиля экспрессии идентифицировали несколько дифференциально экспрессирующихся мкРНК, включая hsa-miR-21, hsa-miR-34a, hsa-miR-122 и hsa-miR-155 при NASH человека и мыши и определяли, что измененная экспрессия этих мкРНК позволяет предполагать их значительную роль в патогенезе NASH. Однако несмотря на некоторый недавний успех в исследовании и лечении NASH в этой области остаются значительные пробелы. Они включают ограниченное понимание биохимической этиологии, широкий спектр ее проявления и основной процесс прогрессирования заболевания от NAFLD до NASH.Expression profiling studies identified several differentially expressed miRNAs, including hsa-miR-21, hsa-miR-34a, hsa-miR-122, and hsa-miR-155, in human and mouse NASH and determined that altered expression of these miRNAs allows suggest their significant role in the pathogenesis of NASH. However, despite some recent success in the research and treatment of NASH, significant gaps remain in this area. These include the limited understanding of the biochemical etiology, the wide spectrum of its manifestations, and the underlying process of disease progression from NAFLD to NASH.
В частности, до сих пор неизвестно, существует ли разная предрасположенность конкретных пациентов или тканей к прогрессированию до NASH и может ли эта предрасположенность быть ассоциированной с измененной экспрессией мкРНК.In particular, it is still unknown whether there is a different susceptibility of specific patients or tissues to progression to NASH and whether this susceptibility may be associated with altered miRNA expression.
В настоящее время не доступен ни один диагностический тест для более точной диагностики NASH с учетом измененной экспрессии мкРНК в отдельности или в комбинации.Currently, no diagnostic test is available to more accurately diagnose NASH based on altered miRNA expression alone or in combination.
Настоящее изобретение основано на очень точном анализе биоптатов пациентов в ходе клинического исследовании для определения корреляции с наличием или уровнем циркулирующих биологических маркеров и определения различных типов пациентов, подлежащих лечению, в соответствие с балльной оценкой NAS, как описано ниже. В частности, по настоящему изобретению, в качестве неограничивающего примера, определяют три класса пациентов с NASH, подлежащих лечению. Этих пациентов классифицируют относительно балльной оценки характеристик NASH.The present invention is based on the very precise analysis of patient biopsies in a clinical trial to determine correlations with the presence or level of circulating biological markers and to identify different types of patients to treat according to NAS scores, as described below. In particular, the present invention, by way of non-limiting example, defines three classes of NASH patients to be treated. These patients are classified according to the NASH characteristic score.
В конкретном варианте осуществления для каждого класса пациентов заявитель определяет список соответствующих биомаркеров для нескольких классов пациентов. Дополнительно описан способ, посредством которого комбинируют эти разные соответствующие биомаркеры.In a specific embodiment, for each class of patients, the applicant defines a list of relevant biomarkers for several classes of patients. Additionally, a method by which these different relevant biomarkers are combined is described.
Таким образом, различные способы напрямую связаны с пациентом, подлежащим лечению. Способы по изобретению могут позволить классифицировать пациентов как будущих реципиентов или нереципиентов лечения NASH в зависимости от их признаков по оценке NASH. Пациент, подлежащий лечению, может зависеть от регуляторного органа или политики здравоохранения каждой страны. Настоящее изобретение относится к мощному инструменту, предоставляемому лечащему врачу для идентификации этих пациентов, подлежащих лечению, т.к. заявитель предлагает различные комбинации маркеров для идентификации нескольких классов пациентов. Осуществление способов по изобретению приводит к точной классификации индивидуумов, находящихся под мониторингом.Thus, the various methods are directly related to the patient to be treated. The methods of the invention may allow patients to be classified as future recipients or non-recipients of NASH treatment based on their NASH score. The patient to be treated may depend on the regulatory authority or health policy of each country. The present invention relates to a powerful tool provided to the attending physician to identify these patients to be treated because the applicant proposes various combinations of markers to identify several classes of patients. The implementation of the methods of the invention results in an accurate classification of the individuals being monitored.
По изобретению, для каждого типа пациентов, подлежащих лечению, можно получать балльную оценку NASH.According to the invention, a NASH score can be obtained for each type of patient to be treated.
Настоящее изобретение относится к способу классификации индивидуума как реципиента или нереципиента, или как потенциального реципиента или потенциального не-реципиента лечения NASH. ЭтаThe present invention relates to a method for classifying an individual as a recipient or non-recipient, or as a potential recipient or potential non-recipient of NASH treatment. This
- 3 044836 классификация также может служить основой для дальнейшего определения того, необходимо ли далее подвергать индивидуума дополнительному подтверждению NASH известными в этой области способами, такими как биопсия печени.- 3 044836 classification can also serve as a basis for further determining whether the individual needs to further undergo additional confirmation of NASH by methods known in the art, such as liver biopsy.
Способ по настоящему изобретению можно использовать для диагностики NASH у индивидуума;The method of the present invention can be used to diagnose NASH in an individual;
определения стадии NASH у индивидуума;determining an individual's NASH stage;
определения тяжести NASH у индивидуума;determining the severity of NASH in an individual;
классификации индивидуума как реципиента или нереципиента лечения NASH;classifying an individual as a recipient or non-recipient of NASH treatment;
оценки эффективности лечения NASH, такой как эффективность лекарственного средства;assessing the effectiveness of NASH treatment, such as drug effectiveness;
определения прогрессирования или регрессирования патологии у пациента с NASH;determining the progression or regression of pathology in a patient with NASH;
определения прогрессирования или регрессирования патологии у пациента с NASH после проведения лечения;determining the progression or regression of pathology in a patient with NASH after treatment;
прогнозирования того, будет ли пациент восприимчивым или нет, т.е. (потенциально) отвечающим или (потенциально) неотвечающим на лечение NASH;predicting whether a patient will be receptive or not, i.e. (potentially) responder or (potentially) non-responder to NASH treatment;
осуществления прогностической оценки, т.е. прогнозирования исхода заболевания.carrying out a prognostic assessment, i.e. predicting the outcome of the disease.
Способы по изобретению делают возможной диагностику, а также мониторинг развития NASH у пациента. Эти способы предпочтительно можно осуществлять для определения начала лечения, например, или для оперативного вмешательства в случае пациентов в более критическом состоянии (такого как трансплантация печени).The methods of the invention make it possible to diagnose as well as monitor the development of NASH in a patient. These methods can preferably be carried out to determine the initiation of treatment, for example, or for surgical intervention in the case of patients in a more critical condition (such as liver transplantation).
Настоящее изобретение основано на точной комбинации разных идентифицированных биомаркеров благодаря математическим алгоритмам, примененным к результатам большого клинического исследования эффекта элафибранора, очень перспективного лекарственного средства для лечения NASH.The present invention is based on a precise combination of different identified biomarkers thanks to mathematical algorithms applied to the results of a large clinical study of the effect of elafibranor, a very promising drug for the treatment of NASH.
В конкретном варианте осуществления используют различные алгоритмы, каждый из которых ориентирован на конкретный класс пациентов.In a particular embodiment, different algorithms are used, each of which is targeted at a specific class of patients.
При определении конкретного алгоритма в зависимости от состояния пациента дальнейшее использование результатов становится более точным и прогностическим.By defining a specific algorithm depending on the patient's condition, further use of the results becomes more accurate and predictive.
Неожиданно среди всех мкРНК, как известно, каким-либо образом ассоциированных с NASH, авторы настоящего изобретения определяли hsa-miR-34 как наиболее мощный и показательный биомаркер NASH при комбинировании по меньшей мере с одним другим биомаркером.Surprisingly, among all the miRNAs known to be associated in any way with NASH, we identified hsa-miR-34 as the most powerful and representative biomarker of NASH when combined with at least one other biomarker.
По настоящему изобретению неалкогольный стеатогепатит или NASH определяют как наличие жирового гепатоза, баллонирования гепатоцитов и воспаления печени.In the present invention, non-alcoholic steatohepatitis or NASH is defined as the presence of fatty liver disease, hepatocyte ballooning and liver inflammation.
Помимо этого основного определения заболевания, NASH может дополнительно включать фиброз печени.In addition to this basic disease definition, NASH may additionally include liver fibrosis.
По настоящему изобретению термины индивидуум и пациент используют взаимозаменяемо и они означают млекопитающего, в частности человека или пациента-человека.In the present invention, the terms individual and patient are used interchangeably and mean a mammal, in particular a human or human patient.
Настоящее изобретение благодаря своей неинвазивной природе можно осуществлять в отношении любого индивидуума, такого как индивидуум без известной предрасположенности к NASH или с предполагаемой предрасположенностью к NASH.The present invention, due to its non-invasive nature, can be practiced in any individual, such as an individual without a known predisposition to NASH or with a suspected predisposition to NASH.
Однако в конкретном варианте осуществления индивидуум является индивидуумом с риском NASH или развития NASH в будущем, таким как индивидуум, имеющий ожирение, диабет, страдающий метаболическим синдромом или имеющий повышенный уровень циркулирующих ферментов печени (АЛТ и/или ACT), или индивидуумом с диагнозом неалкогольной жировой болезни печени (или жирового гепатоза).However, in a specific embodiment, the individual is an individual at risk for NASH or developing NASH in the future, such as an individual who is obese, diabetic, has metabolic syndrome, or has elevated levels of circulating liver enzymes (ALT and/or AST), or an individual diagnosed with non-alcoholic fatty liver disease. liver disease (or fatty liver disease).
Индивидуум также может являться индивидуумом с уже идентифицированной NASH, таким образом, способ по изобретению делает возможным определение рисков развития заболевания в цирроз печени, фиброз, гепатокарциному, показание к трансплантации печени или сердечно-сосудистое заболевание.The individual may also be an individual with already identified NASH, thus the method of the invention makes it possible to determine the risks of disease progression to cirrhosis, fibrosis, hepatocarcinoma, indication for liver transplantation or cardiovascular disease.
Если индивидуум страдает NASH, способ по изобретению делает возможным определение эффективности лекарственного средства для лечения заболевания NASH, и также классификацию пациента как отвечающего/неотвечающего на лечение.If an individual suffers from NASH, the method of the invention makes it possible to determine the effectiveness of a drug for treating the NASH disease, and also to classify the patient as responder/non-responder to treatment.
Настоящее изобретение можно осуществлять для идентификации пациентов, которые могут являться отвечающими или неотвечающими на лечение NASH. В частности, настоящее изобретение делает возможной классификацию пациентов на различные классы.The present invention can be practiced to identify patients who may be responders or non-responders to NASH treatment. In particular, the present invention makes it possible to classify patients into different classes.
В случае классификации каждого пациента настоящее изобретение относится к способу диагностики NASH, или определения стадии или тяжести NASH у индивидуума, или классификации индивидуума как реципиента или не-реципиента лечения неалкогольного стеатогепатита (NASH), или оценки эффективности лечения NASH, такого как посредством введения лекарственного средства, или определения прогрессирования или регрессирования патологии у пациентов с NASH, или определения прогрессирования или регрессирования NASH после проведения лечения, или прогнозирования того, будут ли пациенты восприимчивыми или нет к лечению, или прогностической оценки, т.е. прогнозирования исхода заболевания у пациента, и включающему измерение уровня циркулирующей hsa-miR-34 (например, hsamiR-34a) в крови, сыворотке или плазме, и измерение в крови, сыворотке или плазме уровня циркулирующей YKL-40.In the case of classifying each patient, the present invention relates to a method for diagnosing NASH, or determining the stage or severity of NASH in an individual, or classifying an individual as a recipient or non-recipient of treatment for non-alcoholic steatohepatitis (NASH), or assessing the effectiveness of treatment for NASH, such as through the administration of a drug , or determining the progression or regression of pathology in patients with NASH, or determining the progression or regression of NASH after treatment, or predicting whether patients will be responsive or not to treatment, or prognostic assessment, i.e. predicting the outcome of a disease in a patient, and including measuring the level of circulating hsa-miR-34 (eg, hsamiR-34a) in the blood, serum or plasma, and measuring the level of circulating YKL-40 in the blood, serum or plasma.
- 4 044836- 4 044836
Классификацию пациентов осуществляют в соответствии с гистологическими признаками в биоптатах печени из образцов высокого качества от пациентов с NASH в ходе клинического исследования:Patients are classified according to histological features in liver biopsies from high quality specimens from patients with NASH in a clinical trial:
печеночноклеточный стеатоз, баллонирование, лобулярное воспаление и, необязательно, фиброз.hepatic steatosis, ballooning, lobular inflammation and, optionally, fibrosis.
Основываясь на предшествующем анализе, разрабатывали балльную оценку активности NAFLD (NAS), и ее можно определять следующим образом:Based on the previous analysis, the NAFLD Activity Score (NAS) was developed and can be defined as follows:
NAS основана на 3 признаках, каждый из которых оценивается в от 0 до 2 или 3 (см. таблицу ниже);NAS is based on 3 attributes, each scored from 0 to 2 or 3 (see table below);
NAS представляет собой сумму балльной оценки стеатоза (S), лобулярного воспаления (L) и баллонирования гепатоцитов (В).NAS is the sum of the steatosis (S), lobular inflammation (L) and hepatocyte ballooning (B) scores.
Таким образом, NAS может включать баллы от 0 до 8.Thus, the NAS can include scores from 0 to 8.
Затем необязательно пациентов NASH можно дополнительно охарактеризовывать по стадии фиброза, если он есть. Стадирование фиброза при NASH можно осуществлять в виде 4 стадий с тремя вероятностями для стадии 1, как показано ниже.Optionally, NASH patients can then be further characterized by stage of fibrosis, if present. Staging of fibrosis in NASH can be done in 4 stages with three probabilities for stage 1 as shown below.
Источник: Kleiner et al., Hepatology, 2005, 41:1313-21.Source: Kleiner et al., Hepatology, 2005, 41:1313-21.
Данные, собранные авторами настоящего изобретения, обрабатывали с использованием двух разных биостатистических подходов, что приводило к определению баллов, свидетельствующих о заболевании и/или его тяжести, или стадии, или активности, таким образом, получали мощный, точный и высокопрогностический инструмент для лечащего врача для легкого определения того, страдает ли индивидуум NASH, или для определения стадии, или активности, или тяжести заболевания.The data collected by the present inventors was processed using two different biostatistical approaches, resulting in a score indicative of the disease and/or its severity, or stage, or activity, thereby providing a powerful, accurate and highly predictive tool for the treating physician for to easily determine whether an individual suffers from NASH, or to determine the stage, or activity, or severity of the disease.
Два биостатистических подхода, медианную модель и бутстреп-модель использовали для точного определения комбинации маркеров, коррелирующей с пациентами с NASH, как описано ниже.Two biostatistical approaches, the median model and the bootstrap model, were used to pinpoint the combination of markers correlated with NASH patients, as described below.
Уровни маркеров, измеряемые в настоящем изобретении, определяли в физиологических жидкостях индивидуума, которые представляют собой кровь, более конкретно, образец сыворотки или плазмы.The levels of markers measured in the present invention were determined in the physiological fluids of the individual, which is blood, more specifically a sample of serum or plasma.
В конкретном варианте осуществления уровень маркеров и особенно мкРНК, измеряемых в настоящем изобретении, определяют в образце плазмы и предпочтительно образце плазмы, не содержащем тромбоциты.In a specific embodiment, the level of markers and especially miRNAs measured in the present invention is determined in a plasma sample and preferably a platelet-free plasma sample.
Уровень маркеров, идентифицированных авторами настоящего изобретения, можно определять общепринятыми способами, хорошо известными в этой области, такими как иммунологические анализы (например, ELISA), или молекулярные и биохимические анализы (количественная RT-ПЦР, колориметрические анализы), или аналитические способы (такие как масс-спектрометрия), в зависимости от типа биомаркера (такого как уровень белка, микроРНК, глюкоза).The level of markers identified by the present inventors can be determined by conventional methods well known in the art, such as immunoassays (eg, ELISA), or molecular and biochemical assays (qRT-PCR, colorimetric assays), or analytical methods (such as mass spectrometry), depending on the type of biomarker (such as protein level, microRNA, glucose).
Если тестируемым маркером является микроРНК, более конкретно hsa-miR-34a, его измерение можно осуществлять рядом способов, хорошо известных в этой области, таких как представленные в примерах ниже.If the marker being tested is a microRNA, more specifically hsa-miR-34a, its measurement can be accomplished by a number of methods well known in the art, such as those presented in the examples below.
В кратком изложении, измерения осуществляют с использованием тотальной РНК, выделенной из образца крови, плазмы или сыворотки, в частности бесклеточного, цитратного образца плазмы, не содержащего тромбоциты. Перед выделением РНК к образцу можно добавлять подходящий внутренний контроль (такой как микроРНК с известной последовательностью и количеством, например, miR-39Briefly, measurements are made using total RNA isolated from a blood, plasma or serum sample, in particular a cell-free, platelet-free, citrated plasma sample. Prior to RNA isolation, a suitable internal control (such as a microRNA of known sequence and quantity, e.g. miR-39) can be added to the sample
- 5 044836- 5 044836
С. elegans). Значения Cq определяют с использованием количественной RT-ПЦР. Доступны коммерческие наборы для осуществления таких анализов. Например, анализ qRT-ПЦР мкРНК Taqman: набор для обратной транскрипции микроРНК Taqman, 20-кратные реагенты для анализа микроРНК TaqMan и универсальный мастер-микс TaqMan II (Applied Biosystems) можно использовать по инструкциям производителя. Обратную транскрипцию можно осуществлять с использованием доступных систем для ПЦР, таких как термоциклер GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems), с подходящими параметрами циклов, таких как 16°С в течение 30 мин, затем 42°С в течение 30 мин и 85°С в течение 5 мин перед хранением при 4°С. Обратную транскрипцию можно осуществлять в мультиплексном формате. Затем осуществляют количественную ПЦР с использованием системы для количественной ПЦР, такой как CFX96TM Real-Time System (термоциклер С1000 TouchTM, BioRad). Условия циклов могут быть следующими: 95°С в течение 10 мин, затем 95°С в течение 15 с и 60°С в течение 60 с в течение всего 50 циклов, в затем 30°С в течение 30 с. Режимом определения Cq может являться регрессионный режим в системе для количественной ПЦР. В конкретном варианте осуществления значение Cq, определяемое способом по изобретению, является значением Cq, получаемым с использованием указанных выше конкретных параметров и материалов. Значения Cq образцов можно исключать из анализа, если значения превышают максимум Cq стандартной кривой для каждой мкРНК. Стандартную кривую можно использовать для оценки эффективности реакции.C. elegans). Cq values were determined using quantitative RT-PCR. Commercial kits are available to perform such assays. For example, the Taqman miRNA qRT-PCR assay: Taqman miRNA Reverse Transcription Kit, 20× TaqMan miRNA Assay Reagents, and TaqMan Universal Master Mix II (Applied Biosystems) can be used according to the manufacturer's instructions. Reverse transcription can be performed using commercially available PCR systems, such as the GeneAmp® PCR System 9700 Thermal Cycler (Applied Biosystems), with suitable cycling parameters such as 16°C for 30 min, then 42°C for 30 min, and 85° C for 5 min before storing at 4°C. Reverse transcription can be performed in a multiplex format. Quantitative PCR is then performed using a quantitative PCR system such as the CFX96TM Real-Time System (C1000 TouchTM Thermal Cycler, BioRad). Cycling conditions could be 95°C for 10 min, then 95°C for 15 s and 60°C for 60 s for a total of 50 cycles, then 30°C for 30 s. The mode for determining Cq can be the regression mode in a quantitative PCR system. In a specific embodiment, the Cq value determined by the method of the invention is the Cq value obtained using the above specific parameters and materials. Sample Cq values can be excluded from analysis if the values exceed the maximum Cq of the standard curve for each miRNA. A standard curve can be used to evaluate the efficiency of a reaction.
Серийное разведение можно осуществлять по восьми точкам, начиная с наиболее концентрированного образца кДНК, для обеспечения того, чтобы стандартная кривая охватывала все потенциальные концентрации матрицы, которые могут встречаться в ходе исследования. Стандартную кривую можно получать посредством построения графика log исходного количества матрицы относительно полученных значений Cq. Для получения абсолютных количественных данных синтетическую hsa-мкРНК (например, от Integrated DNA Technologies) можно разводить до 3,125 фмоль/мл и использовать 5 мкл для обратной транскрипции одновременно с РНК, выделенной из образцов сыворотки. Затем продукт можно серийно разводить и можно осуществлять ПЦР с использованием всех образцов (стандартов и РНК, полученной из сыворотки). Построение стандартной кривой можно осуществлять в двух параллелях и использовать для преобразования данных о Cq в копии/мкл. Режим определения Cq представлял собой регрессию. Данные, используемые в построении алгоритма, выражали в формате Log10(копий/мкл сыворотки).Serial dilutions can be performed at eight points, starting with the most concentrated cDNA sample, to ensure that the standard curve covers all potential template concentrations that may be encountered during the study. A standard curve can be obtained by plotting the log of the original amount of matrix against the obtained Cq values. To obtain absolute quantitative data, synthetic hsa-miRNA (eg, from Integrated DNA Technologies) can be diluted to 3.125 fmol/ml and 5 μl used for reverse transcription simultaneously with RNA isolated from serum samples. The product can then be serially diluted and PCR can be performed using all samples (standards and serum-derived RNA). The standard curve can be generated in two parallels and used to convert Cq data to copies/µl. The mode for determining Cq was regression. Data used in constructing the algorithm were expressed in Log10 format (copies/μl of serum).
По настоящему изобретению индивидуума определяют как имеющего NASH, или потенциально имеющего NASH, или вероятно имеющего NASH, если уровень hsa-miR-34a и уровни по меньшей мере одного другого маркера повышены, в частности, по сравнению с референсными значениями, полученными с использованием контрольного (или референсного) образца. Референсный образец может соответствовать образцу физиологической жидкости, такому как образец крови, сыворотки или плазмы, полученному из одного или нескольких индивидуумов, например двух или более, не имеющих NAFLD или NASH.For the purposes of the present invention, an individual is defined as having NASH, or potentially having NASH, or likely having NASH, if the level of hsa-miR-34a and the levels of at least one other marker are increased, particularly compared to reference values obtained using a control ( or reference) sample. The reference sample may correspond to a body fluid sample, such as a blood, serum or plasma sample, obtained from one or more individuals, for example two or more, who do not have NAFLD or NASH.
В настоящем изобретении уровни биомаркеров, т.е. уровень hsa-miR-34 (например, hs-miR-34a) и циркулирующей YKL-40 в крови, сыворотке или плазме, измеряли как описано выше, также можно использовать для определения балльной оценки заболевания, также названной балльной оценкой NASH. Эта балльная оценка, представленная в настоящем описании, является бесценным и мощным инструментом для практического специалиста и нуждающихся в этом индивидуумов, т.к. она делает возможной диагностику NASH, или определение тяжести, или стадии, или активности NASH, а также всех параметров, указанных ниже, с использованием неинвазивного способа, т.е. без использования биопсии печени. Балльную оценку NASH можно сравнивать с пороговыми значениями, позволяющими отличать низкую, умеренную или высокую активность NASH или умеренный и тяжелый NASH.In the present invention, the levels of biomarkers, i.e. the level of hsa-miR-34 (eg, hs-miR-34a) and circulating YKL-40 in blood, serum or plasma, measured as described above, can also be used to determine the disease score, also called the NASH score. This score, presented herein, is an invaluable and powerful tool for the practitioner and individuals in need because it makes it possible to diagnose NASH, or determine the severity, or stage, or activity of NASH, as well as all the parameters mentioned below, using a non-invasive method, i.e. without the use of liver biopsy. The NASH score can be compared to cutoff values that differentiate low, moderate, or high NASH activity, or moderate and severe NASH.
Кроме того, с помощью балльной оценки NASH также можно прогнозировать эффективность лечения, такого как лечение на основе усвоения лекарственного средства.In addition, the NASH score can also predict the effectiveness of treatment, such as treatment based on drug absorption.
По настоящему изобретению эту информацию предпочтительно можно использовать для определения того, будет ли индивидуум реципиентом терапевтического лечения NASH или нет. В конкретном варианте осуществления индивидуума, определенного как пациента с NASH (с низкой, умеренной или высокой активностью NASH или тяжелым NASH), будут лечить с помощью подходящего лечения NASH. В дополнительном конкретном варианте осуществления будут лечить индивидуумов с активностью NASH от умеренной до высокой или тяжелым NASH.In the present invention, this information can preferably be used to determine whether an individual will be a recipient of NASH therapeutic treatment or not. In a specific embodiment, an individual identified as a NASH patient (low, moderate or high NASH activity or severe NASH) will be treated with an appropriate NASH treatment. In a further specific embodiment, individuals with moderate to high NASH activity or severe NASH will be treated.
Кроме того, вычисление баллов NASH также позволяет прогнозировать то, будет ли пациент восприимчивым к лечению или нет, т.е. отвечающим или неотвечающим на лечение.In addition, the calculation of NASH scores also allows one to predict whether a patient will be responsive to treatment or not, i.e. responsive or non-responsive to treatment.
Аналогично балльная оценка NASH позволяет следить за прогрессированием или регрессированием патологии у пациентов с NASH. Кроме того, она делает возможным определение прогрессирования или регрессирования NASH после проведения лечения.Similarly, the NASH score allows one to monitor the progression or regression of pathology in patients with NASH. In addition, it makes it possible to determine the progression or regression of NASH after treatment.
Балльная оценка NASH также делает возможной прогностическую оценку, т.е. прогнозирование исхода заболевания у пациента, например риск развития цирроза.The NASH score also enables prognostic assessment, i.e. predicting patient outcome, such as the risk of developing cirrhosis.
Фактически высокие баллы NASH свидетельствуют о том, что пациент имеет риск и у него может развить отрицательное явление, т.е. цирроз или даже смерть.In fact, high NASH scores indicate that the patient is at risk and may develop a negative event, i.e. cirrhosis or even death.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу классификации индивидуума как реThus, the present invention relates to a method for classifying an individual as a
- 6 044836 ципиента или не-реципиента или потенциального реципиента или потенциального не-реципиента лечения NASH, включающему определение уровней маркеров, как определено выше, вычисление баллов NASH, как представлено в настоящем описании, и классификацию индивидуума как (потенциального) реципиента или (потенциального) не-реципиента лечения с учетом указанных баллов NASH. Эта классификация также может служить основой для дальнейшего определения того, необходимо ли далее подвергать индивидуума дополнительному подтверждению NASH известными в этой области способами, такими как биопсия печени.- 6 044836 recipient or non-recipient or potential recipient or potential non-recipient of NASH treatment, comprising determining marker levels as defined above, calculating NASH scores as presented herein, and classifying the individual as a (potential) recipient or (potential) non-recipient of treatment based on the specified NASH scores. This classification can also serve as a basis for further determining whether the individual needs to further undergo additional confirmation of NASH by methods known in the art, such as liver biopsy.
Кроме того, классификацию индивидуума также можно использовать для определения низкой активности NASH или умеренного NASH у индивидуума и предоставления индивидууму рекомендаций по питанию и/или образу жизни для реверсирования NASH с учетом этой классификации.In addition, an individual's classification can also be used to determine whether an individual has low NASH activity or moderate NASH and provide the individual with dietary and/or lifestyle recommendations for reversing NASH based on that classification.
Пациент, подлежащий лечению, может иметь низкую, умеренную или высокую активность NASH или тяжелый NASH. Однако в предпочтительном варианте осуществления заявитель начал с предположения о том, что пациента, подлежащего лечению, определяют как пациента с риском.The patient to be treated may have low, moderate or high NASH activity or severe NASH. However, in a preferred embodiment, the applicant began with the assumption that the patient to be treated is identified as a patient at risk.
Таким образом, пациента, рассматриваемого в настоящем изобретении, предпочтительно классифицируют как пациента с NASH от умеренного до тяжелого.Thus, the patient of the present invention is preferably classified as having moderate to severe NASH.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения индивидуумов, классифицируемых как имеющих активность NASH от умеренной до высокой или как пациентов с тяжелым NASH, рассматривают в качестве реципиентов или потенциальных реципиентов лечения NASH.In a specific embodiment of the present invention, individuals classified as having moderate to high NASH activity or as having severe NASH are considered recipients or potential recipients of NASH treatment.
В контексте по настоящему изобретению, как правило, пациента с NASH определяют как имеющего следующие оценки при биопсии печени:In the context of the present invention, generally, a patient with NASH is defined as having the following liver biopsy scores:
баллы стеатоза >1;steatosis scores >1;
баллы баллонирования гепатоцитов >1;hepatocyte ballooning scores >1;
баллы лобулярного воспаления >1;lobular inflammation scores >1;
NAS (баллы активности NAFLD) >3 (NAS определяют как сумму баллов стеатоза, баллов баллонирования гепатоцитов и баллов лобулярного воспаления).NAS (NAFLD activity scores) >3 (NAS is defined as the sum of steatosis scores, hepatocyte ballooning scores, and lobular inflammation scores).
Способы по изобретению включают измерение hsa-miR-34 (например, hsa-miR-34a) и циркулирующей YKL-40 в крови, сыворотке или плазме.The methods of the invention include measuring hsa-miR-34 (eg, hsa-miR-34a) and circulating YKL-40 in blood, serum or plasma.
В конкретном варианте осуществления измерения уровней мкРНК осуществляют с использованием образцов плазмы и особенно образцов плазмы, не содержащих тромбоциты.In a specific embodiment, measurements of miRNA levels are performed using plasma samples and especially platelet-free plasma samples.
В соответствии со статистическим анализом биомаркеры также тестировали с использованием проверки на коллинеарность, как описано ниже.According to statistical analysis, biomarkers were also tested using collinearity testing as described below.
Если у двух или более переменных наблюдают корреляцию выше 0,7, осуществляют одномерный анализ различия среднего относительно переменной ответа, определяющей пациентов. Это означает, что коллинеарные переменные также включены, если они существуют. Среди коллинеарных переменных выбирали переменную с наилучшим результатом в одномерном анализе. Эти выбранные переменные, а также другие неколлинеарные переменные включали в моделирование.If two or more variables exhibit a correlation greater than 0.7, a univariate mean difference analysis is performed on the patient-specific response variable. This means that collinear variables are also included if they exist. Among the collinear variables, the variable with the best result in the univariate analysis was selected. These selected variables, as well as other noncollinear variables, were included in the modeling.
В настоящем изобретении уровни биомаркеров, измеренных, как описано выше, также можно использовать для определения балльной оценки заболевания, также называемой балльной оценкой NASH.In the present invention, the levels of biomarkers measured as described above can also be used to determine a disease score, also called a NASH score.
Таким образом, в настоящем описании также описывают способ, где баллы NASH вычисляют из измеренных уровней циркулирующих hsa-miR-34 или YKL-40 в крови, сыворотке или плазме и где диагностируют NASH и/или определяют стадию, или активность, или тяжесть NASH, и/или классифицируют индивидуума как реципиента или не-реципиента лечения NASH, и/или определяют эффективность лечения на основе введения лекарственного средства, и/или измеряют прогрессирование или регрессирование патологии у пациентов с NASH, и/или измеряют прогрессирование или регрессирование NASH после проведения лечения, и/или определяют пациента как восприимчивого к лечению или нет, и/или осуществляют прогностическую оценку, т.е. прогнозирование исхода заболевания у пациента.Thus, the present specification also describes a method where NASH scores are calculated from measured levels of circulating hsa-miR-34 or YKL-40 in blood, serum or plasma and where NASH is diagnosed and/or NASH stage or activity or severity is determined. and/or classify the individual as a recipient or non-recipient of NASH treatment, and/or determine the effectiveness of treatment based on drug administration, and/or measure progression or regression of pathology in patients with NASH, and/or measure progression or regression of NASH after treatment , and/or determine the patient as responsive to treatment or not, and/or perform a prognostic assessment, i.e. predicting the patient's disease outcome.
Согласно изобретению, способ включает стадии измерения уровня циркулирующей hsa-miR-34 в крови, сыворотке или плазме;According to the invention, the method includes the steps of measuring the level of circulating hsa-miR-34 in blood, serum or plasma;
измерение уровня циркулирующей YKL-40 в крови, сыворотке или плазме и необязательно по меньшей мере одного циркулирующего маркера повреждения печени в крови, сыворотке или плазме; и комбинирования результатов посредством математического алгоритма для получения балльной оценки NASH.measuring the level of circulating YKL-40 in blood, serum or plasma and optionally at least one circulating marker of liver damage in blood, serum or plasma; and combining the results through a mathematical algorithm to obtain a NASH score.
В конкретном варианте осуществления по меньшей мере один другой циркулирующий маркер повреждения печени выбирают из группы, состоящей из альфа-2-макроглобулина, гликированного гемоглобина (HbA1c), уровня глюкозы натощак, уровня фруктозамина, инсулина, С-пептида, оценки гомеостатической модели (НОМА), N-концевого про-пептида коллагена типа III, hsa-miR-200, CK18-M30, CK18-M65, АЛТ, ACT, удельного веса мочи), креатинина мочи, базофилов, высокочувствительного С-реактивного белка (HSCRP), β-NAG мочи, лейкоцитов, нейтрофилов и фибриногена. Эти измерения можно дополнять другими параметрами, такими как измерение роста индивидуума, как будет описано ниже. В конкретном варианте осуществления в способе по изобретению комбинируют измерение уровняIn a specific embodiment, the at least one other circulating marker of liver damage is selected from the group consisting of alpha-2-macroglobulin, glycated hemoglobin (HbA1c), fasting glucose, fructosamine, insulin, C-peptide, homeostatic model assessment (HOMA) , N-terminal pro-peptide of collagen type III, hsa-miR-200, CK18-M30, CK18-M65, ALT, AST, urine specific gravity), urine creatinine, basophils, high-sensitivity C-reactive protein (HSCRP), β- NAG of urine, leukocytes, neutrophils and fibrinogen. These measurements can be complemented by other parameters, such as measuring the individual's height, as will be described below. In a specific embodiment, the method of the invention combines level measurement
- 7 044836 miR34 (в частности, hsa-miR-34a, более конкретно hsa-miR-34a-5p) и измерение уровня YKL-40. В дополнительном конкретном варианте осуществления в способе по изобретению комбинируют измерение уровня miR34 (в частности, hsa-miR-34a, более конкретно hsa-miR-34a-5p) и измерение уровня YKL-40 и альфа-2-макроглобулина. В другом конкретном варианте осуществления в способе по изобретению комбинируют измерение уровня miR34 (в частности, hsa-miR-34a, более конкретно hsa-miR-34a-5p) и измерение уровня YKL-40, альфа-2-макроглобулина и гликированного гемоглобина (HbA1c).- 7 044836 miR34 (specifically hsa-miR-34a, more specifically hsa-miR-34a-5p) and YKL-40 level measurement. In a further specific embodiment, the method of the invention combines the measurement of miR34 (specifically hsa-miR-34a, more specifically hsa-miR-34a-5p) and the measurement of YKL-40 and alpha-2-macroglobulin. In another specific embodiment, the method of the invention combines the measurement of miR34 (specifically hsa-miR-34a, more specifically hsa-miR-34a-5p) and the measurement of YKL-40, alpha-2-macroglobulin and glycated hemoglobin (HbA1c). ).
По настоящему изобретению в способах, представленных в настоящем описании, изменение уровней маркеров, анализируемых относительно уровней в контрольном образце, является показателем NASH, и/или стадии или тяжести NASH, и/или классификации индивидуума как реципиента или нереципиента лечения NASH, и/или эффективности лечения на основе введения лекарственного средства, и/или прогрессирования или регрессирования патологии у пациентов с NASH, и/или прогрессирования или регрессирования NASH после проведения лечения, и/или определения пациента как восприимчивого или невосприимчивого к лечению, и/или прогностической оценки, т.е. прогнозирования исхода заболевания пациента.According to the present invention, in the methods presented herein, the change in the levels of markers analyzed relative to the levels in the control sample is an indicator of NASH, and/or the stage or severity of NASH, and/or the classification of the individual as a recipient or non-recipient of the NASH treatment, and/or the effectiveness treatment based on drug administration, and/or progression or regression of pathology in patients with NASH, and/or progression or regression of NASH after treatment, and/or determination of the patient as responsive or unresponsive to treatment, and/or prognostic assessment, i.e. e. predicting the patient's disease outcome.
Термин балльная оценка NASH, также обозначаемый как S, в конкретном варианте осуществления может относиться к вероятности того, что пациент имеет активность NASH от умеренной до высокой или тяжелый NASH.The term NASH score, also referred to as S, in a particular embodiment may refer to the likelihood that a patient has moderate to severe NASH activity or severe NASH.
Первый подкласс пациентов.First subclass of patients.
В контексте по настоящему изобретению и в первом варианте изобретения первый подкласс пациентов определяют как пациента, у которого присутствуют следующие показатели при биопсии печени, или он эквивалентен ему:In the context of the present invention and in the first embodiment of the invention, the first subclass of patients is defined as a patient who has the following findings on liver biopsy, or its equivalent:
баллы стеатоза >1;steatosis scores >1;
баллы баллонирования гепатоцитов >1;hepatocyte ballooning scores >1;
баллы лобулярного воспаления >1;lobular inflammation scores >1;
NAS (баллы активности NAFLD) >4 (NAS определяют как сумму баллов стеатоза, баллов баллонирования гепатоцитов и баллов лобулярного воспаления);NAS (NAFLD activity scores) >4 (NAS is defined as the sum of steatosis scores, hepatocyte ballooning scores, and lobular inflammation scores);
стадия фиброза >2 (такая как стадия фиброза, равная 2, 3 или 4, в частности 2 или 3).fibrosis stage >2 (such as a fibrosis stage of 2, 3 or 4, in particular 2 or 3).
Следующие способы можно осуществлять для диагностики NASH у индивидуума или для классификации индивидуума как потенциально имеющего указанные выше показатели при биопсии печени, или для характеризации пациента как реципиента или не-реципиента лечения NASH.The following methods can be performed to diagnose NASH in an individual, or to classify an individual as potentially having the above findings on liver biopsy, or to characterize a patient as a recipient or non-recipient of NASH treatment.
В первом варианте способа идентификации (или диагностики) первого подкласса пациентов, измеряют уровень hsa-miR-34, в частности hsa-miR-34a, более конкретно hsa-miR-34a-5p, и уровень YKL-40.In a first embodiment of a method for identifying (or diagnosing) a first subclass of patients, the level of hsa-miR-34, in particular hsa-miR-34a, more specifically hsa-miR-34a-5p, and the level of YKL-40 are measured.
В предпочтительном варианте осуществления первого варианта изобретения способ включает стадии измерения уровня hsa-miR-34, в частности hsa-miR-34a, более конкретно hsa-miR-34a-5p; и измерения уровня YKL-40;In a preferred embodiment of the first embodiment of the invention, the method includes the steps of measuring the level of hsa-miR-34, in particular hsa-miR-34a, more particularly hsa-miR-34a-5p; and YKL-40 level measurements;
измерения уровня по меньшей мере одного другого маркера, предпочтительно всех, выбранных в группе, состоящей из альфа-2-макроглобулина, гликированного гемоглобина (HbA1c), уровня глюкозы натощак или уровня фруктозамина,measuring the level of at least one other marker, preferably all selected from the group consisting of alpha-2-macroglobulin, glycated hemoglobin (HbA1c), fasting glucose level or fructosamine level,
N-концевого про-пептида коллагена типа III (PIIINP), hsa-miR-200, в частности hsa-miR-200a, более конкретно hsa-miR-200a-3p).Collagen type III N-terminal pro-peptide (PIIINP), hsa-miR-200, in particular hsa-miR-200a, more specifically hsa-miR-200a-3p).
В конкретном варианте осуществления первого варианта изобретения баллы NASH по изобретению вычисляют с использованием следующих уровней маркеров, измеренных, как указано выше:In a specific embodiment of the first embodiment of the invention, NASH scores of the invention are calculated using the following marker levels measured as above:
уровня miR-34a (более конкретно miR-34a-5p);the level of miR-34a (more specifically miR-34a-5p);
уровня альфа-2-макроглобулина;alpha-2-macroglobulin level;
уровня HbA1c;HbA1c level;
уровня N-концевого про-пептида коллагена типа III;level of N-terminal pro-peptide of type III collagen;
уровня hsa-miR-200a (в частности, hsa-miR-200a-3p); и уровня YKL-40.the level of hsa-miR-200a (in particular, hsa-miR-200a-3p); and YKL-40 level.
В дополнительном конкретном варианте осуществления первого варианта баллы определяют в виде логистической функции гдеIn a further specific embodiment of the first embodiment, the scores are defined as a logistic function where
Y=k+ax A+b xB+cxC+dxD+fxF+gxG, где S представляет собой баллы NASH по настоящему изобретению;Y=k+ax A+b xB+cxC+dxD+fxF+gxG, where S represents the NASH scores of the present invention;
А представляет собой уровень альфа-2-макроглобулина в г/л;A represents the level of alpha-2-macroglobulin in g/l;
В представляет собой уровень HbAlc в процентах (например, В равно 10, если процентная доля измеренного HbAlc составляет 10%);B represents the percentage of HbAlc level (eg, B is 10 if the percentage of measured HbAlc is 10%);
С представляет собой уровень N-концевого про-пептида коллагена типа III в нг/мл;C represents the level of type III collagen N-terminal pro-peptide in ng/ml;
- 8 044836- 8 044836
D представляет собой уровень hsa-miR-34a (в частности, hsa-miR-34a-5p) в Cq;D represents the level of hsa-miR-34a (specifically hsa-miR-34a-5p) in Cq;
F представляет собой уровень hsa-miR-200 (в частности, hsa-miR-200a, более конкретно hsa-miR200a-3p) в Cq;F represents the level of hsa-miR-200 (specifically hsa-miR-200a, more specifically hsa-miR200a-3p) in Cq;
G представляет собой уровень YKL-40 в пг/мл;G represents the YKL-40 level in pg/ml;
k представляет собой константу логистической функции;k represents a constant of the logistic function;
а представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем альфа-2-макроглобулина;a is a coefficient associated with the level of alpha-2-macroglobulin;
b представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем HbA1c;b is the coefficient associated with the HbA1c level;
с представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем N-концевого про-пептида коллагена типа III;c is the coefficient associated with the level of N-terminal pro-peptide of type III collagen;
d представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем hsa-miR-34a (в частности, hsa-miR34a-5p);d is a coefficient associated with the level of hsa-miR-34a (specifically hsa-miR34a-5p);
f представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем hsa-miR-200 (в частности, hsa-miR-200a, более конкретно hsa-miR-200a-3p);f is a coefficient associated with the level of hsa-miR-200 (specifically hsa-miR-200a, more specifically hsa-miR-200a-3p);
g представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем YKL-40;g is a coefficient associated with the YKL-40 level;
Таким образом, баллы NASH представляют собой вероятность того, что пациент имеет активность NASH от умеренной до высокой или тяжелый NASH.Thus, NASH scores represent the probability that a patient has moderate to high NASH activity or severe NASH.
Если S выше или равны пороговому значению, индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как подлежащего лечению NASH или потенциально подлежащего лечению NASH. В конкретном варианте осуществления, если S ниже порогового значения, индивидуума можно классифицировать как подлежащего лечению или неподлежащего лечению, в частности неподлежащего лечению, и/или индивидуума классифицируют как реципиента или потенциального реципиента рекомендаций по питанию и/или образу жизни для лечения низкой активности NASH или умеренного NASH у него.If S is greater than or equal to the cutoff value, the individual is classified as having NASH or having or potentially having a steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS >4, and a fibrosis stage >2 and/or classified as eligible for treatment NASH or potentially treatable NASH. In a specific embodiment, if S is below a threshold, the individual may be classified as treatable or untreatable, particularly not eligible for treatment, and/or the individual is classified as a recipient or potential recipient of dietary and/or lifestyle recommendations for the treatment of low NASH activity or He has moderate NASH.
В конкретном варианте осуществления, полученном с использованием медианной модели, как описано в экспериментальной части заявки, k является числом от 5,94 до 50,74;In a specific embodiment obtained using the median model as described in the experimental portion of the application, k is a number from 5.94 to 50.74;
а является числом от 0 до 1,07;a is a number from 0 to 1.07;
b является числом от 0 до 1,20;b is a number from 0 to 1.20;
с является числом от 0 до 0,24;c is a number from 0 to 0.24;
d является числом от -0,97 до 0;d is a number from -0.97 to 0;
f является числом от -0,87 до 0, g является числом от 0 до 1,74Е-05;f is a number from -0.87 to 0, g is a number from 0 to 1.74E-05;
и где пороговое значение составляет от 0,2017 до 0,4645 и более конкретно равно 0,2302.and where the threshold value is from 0.2017 to 0.4645 and more specifically equal to 0.2302.
В конкретном варианте осуществления, индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,2017 до 0,4645.In a specific embodiment, the individual is classified as having NASH or having or potentially having a steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS >4, and a fibrosis stage >2 and/or is classified as a recipient or potential recipient of treatment , if NASH S scores are greater than or equal to a threshold between 0.2017 and 0.4645.
В дополнительном конкретном варианте осуществления, полученном из медианной модели, k равно 25,13;In a further specific embodiment, derived from the median model, k is 25.13;
а равно 0,52;a is equal to 0.52;
b равно 0,57;b is equal to 0.57;
с равно 0,12;c equals 0.12;
d равно -0,43;d is -0.43;
f равно -0,47; и g равно 9,54Е-06, и где пороговое значение составляет от 0,2017 до 0,4645 и более конкретно равно 0,2302.f is -0.47; and g is equal to 9.54E-06, and where the threshold value is from 0.2017 to 0.4645 and more specifically equal to 0.2302.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,2017 до 0,4645.In a specific embodiment, the individual is classified as having NASH or having or potentially having a steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS >4, and a fibrosis stage >2 and/or is classified as a recipient or potential recipient of treatment, if NASH S scores are greater than or equal to the cutoff value between 0.2017 and 0.4645.
В конкретном варианте осуществления площадь под кривой (AUC) зависимости чувствительности от частоты ложноположительных результатов (ROC) по меньшей мере равна 0,80, предпочтительно 0,82, более предпочтительно 0,84. AUC является хорошо известным критерием, используемым во многих областях для измерения качества алгоритма. Чем больше ее значение близко 1, тем лучше алгоритм.In a specific embodiment, the area under the sensitivity versus false positive rate (ROC) curve (AUC) is at least 0.80, preferably 0.82, more preferably 0.84. AUC is a well-known criterion used in many fields to measure the quality of an algorithm. The more its value is close to 1, the better the algorithm.
В другом конкретном варианте осуществления, полученном из бутстреп-модели, как описано в экспериментальной части заявки, k является числом от 8,24 до 35,44;In another specific embodiment, derived from the bootstrap model as described in the experimental portion of the application, k is a number from 8.24 to 35.44;
а является числом от 0,06 до 0,88;a is a number from 0.06 to 0.88;
- 9 044836 b является числом от 0,14 до 1,04;- 9 044836 b is a number from 0.14 to 1.04;
с является числом от 0,03 до 0,23;c is a number from 0.03 to 0.23;
d является числом от -0,75 до -0,05;d is a number from -0.75 to -0.05;
f является числом от -0,73 до -0,07, g является числом от 3,59Е-06 до 1,78Е-05, и где пороговое значение составляет от 0,2718 до 0,6391 и более конкретно равно 0,3502.f is a number from -0.73 to -0.07, g is a number from 3.59E-06 to 1.78E-05, and where the threshold value is from 0.2718 to 0.6391 and more specifically is 0.3502 .
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,2718 до 0,6391.In a specific embodiment, the individual is classified as having NASH or having or potentially having a steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS >4, and a fibrosis stage >2 and/or is classified as a recipient or potential recipient of treatment, if NASH S scores are greater than or equal to the cutoff value between 0.2718 and 0.6391.
В дополнительном конкретном варианте осуществления, также полученном из бутстреп-модели, k равно 21,84;In a further specific embodiment, also derived from the bootstrap model, k is 21.84;
а равно 0,47;a is equal to 0.47;
b равно 0,59;b is equal to 0.59;
с равно 0,13;c equals 0.13;
d равно -0,40;d is -0.40;
f равно -0,40; и g равно 1,07Е-05, и где пороговое значение составляет от 0,2718 до 0,6391 и более конкретно равно 0,3502.f is -0.40; and g is equal to 1.07E-05, and where the threshold value is from 0.2718 to 0.6391 and more specifically equal to 0.3502.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадии фиброза >2 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,2718 до 0,6391.In a specific embodiment, the individual is classified as having NASH or having or potentially having a steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS >4 and fibrosis stage >2 and/or is classified as a recipient or potential recipient of treatment, if NASH S scores are greater than or equal to the cutoff value between 0.2718 and 0.6391.
В конкретном варианте осуществления AUC по меньшей мере равна 0,80, предпочтительно 0,82, более предпочтительно 0,84.In a particular embodiment, the AUC is at least 0.80, preferably 0.82, more preferably 0.84.
В конкретном варианте осуществления указанные выше способы, описанные для первого варианта, осуществляют с использованием образца плазмы.In a specific embodiment, the above methods described for the first embodiment are carried out using a plasma sample.
В случае бутстреп-модели и медианной модели AUC являлась очень хорошей.In the case of the bootstrap and median models, the AUC was very good.
Это означает, что обе модели в настоящем изобретении можно использовать взаимозаменяемо.This means that both models can be used interchangeably in the present invention.
Настоящее изобретение также относится к набору, содержащему средства для определения уровня (i) hsa-miR-34 (в частности, hsa-miR-34a, более конкретно miR-34a-5p) и YKL-40; и по меньшей мере одного другого маркера, в частности всех маркеров, выбранных из группы, состоящей из (ii) альфа-2-макроглобулина;The present invention also relates to a kit containing means for determining the level of (i) hsa-miR-34 (in particular hsa-miR-34a, more particularly miR-34a-5p) and YKL-40; and at least one other marker, in particular all markers selected from the group consisting of (ii) alpha-2-macroglobulin;
(iii) по меньшей мере одного маркера, выбранного из группы, состоящей из HbA1c, уровня глюкозы натощак, уровня фруктозамина;(iii) at least one marker selected from the group consisting of HbA1c, fasting glucose level, fructosamine level;
(iv) N-концевого про-пептида коллагена типа III;(iv) N-terminal pro-peptide of type III collagen;
(v) hsa-miR-200 (в частности, hsa-miR-200a, более конкретно hsa-miR-200a-3p).(v) hsa-miR-200 (specifically hsa-miR-200a, more specifically hsa-miR-200a-3p).
В конкретном варианте осуществления изобретения указанный набор содержит средства для определения уровня (i) hsa-miR-34 (в частности, hsa-miR-34a, более конкретно miR-34a-5p);In a specific embodiment of the invention, the kit contains means for determining the level of (i) hsa-miR-34 (in particular hsa-miR-34a, more particularly miR-34a-5p);
(ii) альфа-2-макроглобулина;(ii) alpha-2-macroglobulin;
(iii) HbA1c;(iii) HbA1c;
(iv) N-концевого про-пептида коллагена типа III; и (v) hsa-miR-200a (в частности, hsa-miR-200a, более конкретно hsa-miR-200a-3p) и YKL-40.(iv) N-terminal pro-peptide of type III collagen; and (v) hsa-miR-200a (specifically hsa-miR-200a, more specifically hsa-miR-200a-3p) and YKL-40.
Набор по изобретению применим для осуществления способов, описанных выше, и может дополнительно необязательно включать инструкции для осуществления указанных способов. Набор может содержать реагенты и буферы, подходящие для осуществления измерений уровней маркеров, указанных выше. Набор содержит антитела, специфические для белка, подлежащего количественному анализу, и/или праймеры, применимые для количественного анализа уровней микроРНК, как хорошо известно в этой области.The kit of the invention is useful for carrying out the methods described above, and may further optionally include instructions for carrying out said methods. The kit may contain reagents and buffers suitable for making measurements of the marker levels specified above. The kit contains antibodies specific for the protein to be quantified and/or primers useful for quantitating miRNA levels, as is well known in the art.
В этом первом варианте настоящего изобретения заявитель углубился в исследования и решил сфокусироваться на циркулирующих мкРНК в сыворотке.In this first embodiment of the present invention, the applicant went deeper into research and decided to focus on circulating miRNAs in serum.
Как правило, различные циркулирующие маркеры, особенно мкРНК, оценивают с использованием плазмы различных пациентов с риском, подлежащих лечению.Typically, various circulating markers, especially miRNAs, are assessed using plasma from different at-risk patients to be treated.
В новом подходе заявитель оценивал различные циркулирующие маркеры с использованием сывороток. Сыворотку можно определять как прозрачную желтоватую жидкость, полученную после разделения цельной крови на твердые и жидкие компоненты после того, как ей позволили свернуться.In a new approach, the applicant assessed various circulating markers using sera. Serum can be defined as the clear, yellowish liquid obtained by separating whole blood into solid and liquid components after it has been allowed to clot.
мкРНК, анализируемые с использованием сывороток, выражают в Log10(копий/мкл сыворотки), и подробности способа определения этого значения представлены ниже.miRNAs analyzed using sera are expressed in Log10 (copies/μl serum), and details of how to determine this value are presented below.
- 10 044836- 10 044836
В другой модели мкРНК, анализируемые с использованием сывороток, выражают в Cq.In another model, miRNAs analyzed using sera are expressed in Cq.
В предпочтительном варианте осуществления, в котором мкРНК анализируют с использованием сывороток и выражают в Cq по первому варианту по изобретению, способ включает стадии измерения уровня hsa-miR-34 в сыворотке, в частности hsa-miR-34a, более конкретно hsa-miR-34a-5p, и измерения уровня циркулирующей YKL-40 в крови, сыворотке или плазме и необязательно по меньшей мере одного циркулирующего маркера повреждения печени в крови, сыворотке или плазме; и комбинирования результатов посредством математического алгоритма для получения баллов NASH.In a preferred embodiment, in which the miRNA is analyzed using sera and expressed in Cq according to the first embodiment of the invention, the method includes the steps of measuring the level of hsa-miR-34 in serum, in particular hsa-miR-34a, more particularly hsa-miR-34a -5p, and measuring the level of circulating YKL-40 in blood, serum or plasma and optionally at least one circulating marker of liver damage in blood, serum or plasma; and combining the results through a mathematical algorithm to produce NASH scores.
В другом предпочтительном варианте осуществления этого аспекта изобретения способ включает стадии измерения уровня hsa-miR-34 в сыворотке, в частности hsa-miR-34a, более конкретно hsa-miR-34a-5p;In another preferred embodiment of this aspect of the invention, the method includes the steps of measuring the level of hsa-miR-34 in serum, in particular hsa-miR-34a, more specifically hsa-miR-34a-5p;
измерения уровня альфа-2-макроглобулина;alpha-2-macroglobulin level measurements;
измерения уровня гликированного гемоглобина (HbA1c), уровня глюкозы натощак или уровня фруктозамина;measuring glycated hemoglobin (HbA1c), fasting glucose, or fructosamine levels;
измерения уровня YKL-40.YKL-40 level measurements.
В конкретном варианте осуществления первого аспекта изобретения баллы NASH по изобретению вычисляют из следующих уровней маркеров, измеренных, как указано выше:In a specific embodiment of the first aspect of the invention, NASH scores of the invention are calculated from the following marker levels measured as above:
уровня miR-34a (более конкретно miR-34a-5p), измеренного в сыворотке;miR-34a (more specifically miR-34a-5p) levels measured in serum;
уровня альфа-2-макроглобулина в сыворотке;serum alpha-2-macroglobulin levels;
уровня YKL-40 в сыворотке; и уровня HbA1c.serum YKL-40 levels; and HbA1c levels.
В конкретном варианте осуществления баллы определяют в виде логистической функции с использованием уровня has-miR-34a (в частности, hsa-miR-34a-5p) в сыворотке, выраженного в единицах Cq,In a specific embodiment, scores are determined as a logistic function using the serum has-miR-34a (specifically hsa-miR-34a-5p) level expressed in Cq units.
гдеWhere
Y=k+ax A+b xB+cxC+dxD, где S представляет собой баллы NASH;Y=k+ax A+b xB+cxC+dxD where S represents NASH scores;
А представляет собой уровень hsa-miR-34a (в частности, hsa-miR-34a-5p) в сыворотке в Cq;A is the serum level of hsa-miR-34a (specifically hsa-miR-34a-5p) in Cq;
В представляет собой сыворотка уровень альфа-2-макроглобулина в г/л;B represents the serum alpha-2-macroglobulin level in g/L;
С представляет собой сыворотка уровень YKL-40 в пг/мл;C represents the serum level of YKL-40 in pg/ml;
D представляет собой уровень HbAlc в процентах (например, D равно 10, если измеренная процентная доля HbAlc составляет 10%);D represents the percentage of HbAlc (eg, D is 10 if the measured percentage of HbAlc is 10%);
k представляет собой константу логистической функции;k represents a constant of the logistic function;
а представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем hsa-miR-34a (в частности hsa-miR34a-5p) в сыворотке;a is a coefficient associated with the level of hsa-miR-34a (in particular hsa-miR34a-5p) in serum;
b представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем альфа-2-макроглобулина в сыворотке;b is the coefficient associated with serum alpha-2-macroglobulin level;
с представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем YKL-40 в сыворотке;c is the coefficient associated with serum YKL-40 level;
d представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем HbA1c.d is the coefficient associated with HbA1c level.
Если S выше или равны пороговому значению, индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как подлежащего лечению NASH или потенциально подлежащего лечению NASH. В конкретном варианте осуществления, если S ниже порогового значения, индивидуума можно классифицировать как подлежащего лечению или неподлежащего лечению, в частности неподлежащего лечению, и/или индивидуума классифицируют как реципиента или потенциального реципиента рекомендаций по питанию и образу жизни для лечения низкой активности NASH или умеренного NASH у него.If S is greater than or equal to the cutoff value, the individual is classified as having NASH or having or potentially having a steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS >4, and a fibrosis stage >2 and/or classified as eligible for treatment NASH or potentially treatable NASH. In a specific embodiment, if S is below a threshold, the individual may be classified as treatable or untreatable, particularly not eligible for treatment, and/or the individual is classified as a recipient or potential recipient of dietary and lifestyle advice for the treatment of low NASH activity or moderate NASH him.
В конкретном варианте осуществления, полученном из бутстреп-модели, как описано в экспериментальной части заявки, k является числом от 9,51 до 34,37;In a specific embodiment derived from the bootstrap model as described in the experimental portion of the application, k is a number from 9.51 to 34.37;
а является числом от -1,17 до -0,47;a is a number from -1.17 to -0.47;
b является числом от 0,02 до 0,84;b is a number from 0.02 to 0.84;
с является числом от 6,10Е-06 до 2,09Е-05;c is a number from 6.10E-06 to 2.09E-05;
d является числом от 0,07 до 0,89, и где пороговое значение составляет от 0,2013 до 0,5965 и более конкретно равно 0,4661.d is a number from 0.07 to 0.89, and where the threshold value is from 0.2013 to 0.5965 and more specifically equal to 0.4661.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,2013 до 0,5965.In a specific embodiment, the individual is classified as having NASH or having or potentially having a steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS >4, and a fibrosis stage >2 and/or is classified as a recipient or potential recipient of treatment, if NASH S scores are greater than or equal to the cutoff value between 0.2013 and 0.5965.
В дополнительном конкретном варианте осуществления, также полученном из бутстреп-модели,In an additional specific embodiment, also derived from a bootstrap model,
- 11 044836 к равно 21,94;- 11 044836 k equals 21.94;
а равно -0,82;and equals -0.82;
b равно 0,43;b is equal to 0.43;
с равно 1,35Е-05;c equals 1.35E-05;
d равно 0,48, и где пороговое значение составляет от 0,2013 до 0,5965 и более конкретно равно 0,4661.d is equal to 0.48, and where the threshold value is from 0.2013 to 0.5965 and more specifically equal to 0.4661.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,2013 до 0,5965.In a specific embodiment, the individual is classified as having NASH or having or potentially having a steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS >4, and a fibrosis stage >2 and/or is classified as a recipient or potential recipient of treatment, if NASH S scores are greater than or equal to the cutoff value between 0.2013 and 0.5965.
В конкретном варианте осуществления AUC по меньшей мере равна 0,80, предпочтительно 0,82.In a particular embodiment, the AUC is at least 0.80, preferably 0.82.
В дополнительном конкретном варианте осуществления, полученном из медианной модели, как описано в экспериментальной части заявки, к является числом от 6,02 до 56,69;In a further specific embodiment, derived from the median model as described in the experimental portion of the application, k is a number from 6.02 to 56.69;
а является числом от -1,26 до 0,00;a is a number from -1.26 to 0.00;
b является числом от 0,00 до 0,88, с является числом от 0,00 до 2,00Е-05;b is a number from 0.00 to 0.88, c is a number from 0.00 to 2.00E-05;
d является числом от 0,00 до 0,96, и где пороговое значение составляет от 0,9773 до 0,9955 и более конкретно равно 0,9936.d is a number from 0.00 to 0.96, and where the threshold value is from 0.9773 to 0.9955 and more specifically equal to 0.9936.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего стеатоз >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,9773 до 0,9955.In a specific embodiment, an individual is classified as having NASH or having or potentially having steatosis >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS >4, and fibrosis stage >2 and/or is classified as a recipient or potential recipient of treatment if NASH S scores greater than or equal to the cutoff between 0.9773 and 0.9955.
В дополнительном конкретном варианте осуществления, также полученном из медианной модели, к равно 28,17;In a further specific embodiment, also derived from the median model, k is equal to 28.17;
а равно -0,84;and equals -0.84;
b равно 0,36;b is equal to 0.36;
с равно 1,23Е-05;c equals 1.23E-05;
d равно 0,41, и где пороговое значение составляет от 0,9773 до 0,9955 и более конкретно равно 0,9936.d is equal to 0.41, and where the threshold value is from 0.9773 to 0.9955 and more specifically equal to 0.9936.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS >4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,9773 до 0,9955.In a specific embodiment, the individual is classified as having NASH or having or potentially having a steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS >4, and a fibrosis stage >2 and/or is classified as a recipient or potential recipient of treatment, if NASH S scores are greater than or equal to the cutoff value between 0.9773 and 0.9955.
В конкретном варианте осуществления AUC по меньшей мере равна 0,80, предпочтительно 0,82.In a particular embodiment, the AUC is at least 0.80, preferably 0.82.
В случае бутстреп-модели и медианной модели AUC являлась очень хорошей.In the case of the bootstrap and median models, the AUC was very good.
Это означает, что обе модели в настоящем изобретении можно использовать взаимозаменяемо.This means that both models can be used interchangeably in the present invention.
В конкретном варианте осуществления первого варианта изобретения, в котором мкРНК анализируют с использованием сывороток и выражают в копиях/мкл (log10), способ включает стадии измерения уровня hsa-miR-34, в частности hsa-miR-34a, более конкретно hsa-miR-34a-5p, и измерения уровня циркулирующей YKL-40 в крови, сыворотке или плазме и необязательно по меньшей мере одного циркулирующего маркера повреждения печени в крови, сыворотке или плазме; и комбинирования результатов посредством математического алгоритма для получения баллов NASH.In a specific embodiment of the first embodiment of the invention, in which miRNA is analyzed using sera and expressed in copies/μl (log10), the method includes the steps of measuring the level of hsa-miR-34, in particular hsa-miR-34a, more specifically hsa-miR- 34a-5p, and measuring the level of circulating YKL-40 in blood, serum or plasma and optionally at least one circulating marker of liver damage in blood, serum or plasma; and combining the results through a mathematical algorithm to produce NASH scores.
В другом предпочтительном варианте осуществления этого первого варианта изобретения способ включает стадии измерения уровня hsa-miR-34, в частности, hsa-miR-34a, и более конкретно - hsa-miR-34a-5p;In another preferred embodiment of this first embodiment of the invention, the method includes the steps of measuring the level of hsa-miR-34, in particular hsa-miR-34a, and more particularly hsa-miR-34a-5p;
измерения уровня альфа-2-макроглобулина;alpha-2-macroglobulin level measurements;
измерения уровня гликированного гемоглобина (HbA1c), уровня глюкозы натощак или уровня фруктозамина;measuring glycated hemoglobin (HbA1c), fasting glucose, or fructosamine levels;
измерения уровня YKL-40.YKL-40 level measurements.
В этом конкретном варианте осуществления баллы определяют в виде логистической функции с использованием уровня has-miR-34a в сыворотке (в частности, hsa-miR-34a-5p), выраженного в копиях/мкл (log10).In this particular embodiment, scores are determined as a logistic function using the serum level of has-miR-34a (specifically hsa-miR-34a-5p) expressed in copies/μl (log10).
гдеWhere
Y=k+ax A+b xB+cxC+dxD,Y=k+ax A+b xB+cxC+dxD,
- 12 044836 где S представляет собой баллы NASH;- 12 044836 where S represents NASH scores;
А представляет собой уровень hsa-miR-34a (в частности, hsa-miR-34a-5p) в сыворотке в копиях/мкл (log10);A is the serum level of hsa-miR-34a (specifically hsa-miR-34a-5p) in copies/μl (log10);
В представляет собой уровень альфа-2-макроглобулина в сыворотке в г/л;B represents the serum alpha-2-macroglobulin level in g/L;
С представляет собой уровень YKL-40 в сыворотке в пг/мл;C represents the serum YKL-40 level in pg/ml;
D представляет собой уровень HbA1c в процентах (например, D равно 10, если измеренная процентная доля HbA1c составляет 10%);D represents the percentage of HbA1c (eg, D is 10 if the measured percentage of HbA1c is 10%);
k представляет собой константу логистической функции;k represents a constant of the logistic function;
а представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем hsa-miR-34a (в частности hsa-miR34a-5p) в сыворотке;a is a coefficient associated with the level of hsa-miR-34a (in particular hsa-miR34a-5p) in serum;
b представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем альфа-2-макроглобулина в сыворотке;b is the coefficient associated with serum alpha-2-macroglobulin level;
с представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем YKL-40 в сыворотке;c is the coefficient associated with serum YKL-40 level;
d представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем HbA1c.d is the coefficient associated with HbA1c level.
Таким образом, баллы NASH представляют собой вероятность того, что пациент имеет активность NASH от умеренной до высокой или тяжелый NASH.Thus, NASH scores represent the probability that a patient has moderate to high NASH activity or severe NASH.
Если S выше или равны пороговому значению, индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как подлежащего лечению NASH или потенциально подлежащего лечению NASH. В конкретном варианте осуществления, если S ниже порогового значения, индивидуума можно классифицировать как подлежащего лечению или неподлежащего лечению, в частности неподлежащего лечению, и/или индивидуума классифицируют как реципиента или потенциального реципиента, рекомендаций по питанию и/или образу жизни для лечения низкой активности NASH или умеренного NASH у него.If S is greater than or equal to the cutoff value, the individual is classified as having NASH or having or potentially having a steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS >4, and a fibrosis stage >2 and/or classified as eligible for treatment NASH or potentially treatable NASH. In a specific embodiment, if S is below a threshold, the individual may be classified as treatable or untreatable, particularly not eligible for treatment, and/or the individual is classified as a recipient or potential recipient of dietary and/or lifestyle recommendations for the treatment of low NASH activity or moderate NASH.
В конкретном варианте осуществления, полученном из бутстреп-модели, как описано в экспериментальной части заявки, k является числом от -14,50 до -7,40;In a specific embodiment derived from the bootstrap model as described in the experimental portion of the application, k is a number from -14.50 to -7.40;
а является числом от 1,38 до 3,58;a is a number from 1.38 to 3.58;
b является числом от 0,02 до 0,84;b is a number from 0.02 to 0.84;
с является числом от 5,98Е-06 до 2,08Е-05;c is a number from 5.98E-06 to 2.08E-05;
d является числом от 0,07 до 0,89, и где пороговое значение составляет от 0,1895 до 0,6089 и более конкретно равно 0,4255.d is a number from 0.07 to 0.89, and where the threshold value is from 0.1895 to 0.6089 and more specifically equal to 0.4255.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,1895 до 0,6089.In a specific embodiment, the individual is classified as having NASH or having or potentially having a steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS >4, and a fibrosis stage >2 and/or is classified as a recipient or potential recipient of treatment, if NASH S scores are greater than or equal to the cutoff value between 0.1895 and 0.6089.
В дополнительном конкретном варианте осуществления, также полученном из бутстреп-модели, k равно -10,95;In a further specific embodiment, also derived from the bootstrap model, k is -10.95;
а равно 2,48;a is equal to 2.48;
b равно 0,43;b is equal to 0.43;
с равно 1,34Е-05;c equals 1.34E-05;
d равно 0,48, и где пороговое значение составляет от 0,1895 до 0,6089 и более конкретно равно 0,4255.d is equal to 0.48, and where the threshold value is from 0.1895 to 0.6089 and more specifically equal to 0.4255.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,1895 до 0,6089.In a specific embodiment, the individual is classified as having NASH or having or potentially having a steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS >4, and a fibrosis stage >2 and/or is classified as a recipient or potential recipient of treatment, if NASH S scores are greater than or equal to the cutoff value between 0.1895 and 0.6089.
В конкретном варианте осуществления AUC по меньшей мере равна 0,80, предпочтительно 0,82.In a particular embodiment, the AUC is at least 0.80, preferably 0.82.
В дополнительном конкретном варианте осуществления, полученном из медианной модели, как описано в экспериментальной части заявки, k является числом от -27,16 до -0,78;In a further specific embodiment, derived from the median model as described in the experimental portion of the application, k is a number from -27.16 to -0.78;
а является числом от 0 до 3,97;a is a number from 0 to 3.97;
b является числом от 0 до 0,89, с является числом от 0 до 1,98Е-05;b is a number from 0 to 0.89, c is a number from 0 to 1.98E-05;
d является числом от 0 до 0,97, и где пороговое значение составляет от 0,1421 до 0,4556 и более конкретно равно 0,3201.d is a number from 0 to 0.97, and where the threshold value is from 0.1421 to 0.4556 and more specifically equal to 0.3201.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как реципиента илиIn a specific embodiment, the individual is classified as having NASH or having or potentially having a steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS >4, and a fibrosis stage >2 and/or is classified as a recipient or
- 13 044836 потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от- 13 044836 potential recipient of treatment if NASH S scores are greater than or equal to the threshold value from
0,1421 до 0,4556.0.1421 to 0.4556.
В дополнительном конкретном варианте осуществления k равно -11,03;In a further specific embodiment, k is -11.03;
а равно 2,59;a is equal to 2.59;
b равно 0,38;b is equal to 0.38;
с равно 1,21Е-05;c equals 1.21E-05;
d равно 0,40, и где пороговое значение составляет от 0,1421 до 0,4556 и более конкретно равно 0,3201.d is equal to 0.40, and where the threshold value is from 0.1421 to 0.4556 and more specifically equal to 0.3201.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,1421 до 0,4556.In a specific embodiment, the individual is classified as having NASH or having or potentially having a steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS >4, and a fibrosis stage >2 and/or is classified as a recipient or potential recipient of treatment, if NASH S scores are greater than or equal to the cutoff value between 0.1421 and 0.4556.
В конкретном варианте осуществления AUC по меньшей мере равна 0,80, предпочтительно 0,82.In a particular embodiment, the AUC is at least 0.80, preferably 0.82.
В последнем варианте осуществления этого первого варианта, касающегося мкРНК, анализируемой с использованием сывороток и выражаемой в копиях/мкл (log10), заявитель также решил преобразовать измеренные значения некоторых из других биомаркеров в значения log10. Это означает, что измеренные значения некоторых маркеров, определенных выше, выражают в log10.In the final embodiment of this first embodiment regarding miRNA analyzed using sera and expressed in copies/μl (log10), the applicant also decided to convert the measured values of some of the other biomarkers to log10 values. This means that the measured values of some of the markers defined above are expressed in log10.
Таким образом, в этом последнем варианте осуществления первого аспекта изобретения способ включает стадии измерения уровня hsa-miR-34, в частности hsa-miR-34a, более конкретно hsa-miR-34a-5p, или hsamiR-122, в частности hsa-miR-122-5p, и измерения уровня циркулирующей YKL-40 в крови, сыворотке или плазме и необязательно по меньшей мере одного циркулирующего маркера повреждения печени в крови, сыворотке или плазме; и комбинирования результатов посредством математического алгоритма для получения баллов NASH.Thus, in this final embodiment of the first aspect of the invention, the method includes the steps of measuring the level of hsa-miR-34, in particular hsa-miR-34a, more specifically hsa-miR-34a-5p, or hsamiR-122, in particular hsa-miR -122-5p, and measuring the level of circulating YKL-40 in blood, serum or plasma and optionally at least one circulating marker of liver damage in blood, serum or plasma; and combining the results through a mathematical algorithm to produce NASH scores.
В другом предпочтительном варианте осуществления этого варианта изобретения способ включает стадии измерения уровня hsa-miR-34, в частности hsa-miR-34a, более конкретно hsa-miR-34a-5p, в сыворотке;In another preferred embodiment of this embodiment of the invention, the method includes the steps of measuring the level of hsa-miR-34, in particular hsa-miR-34a, more specifically hsa-miR-34a-5p, in serum;
измерения уровня log10(HOMA) (оценки гомеостатической модели), или уровня глюкозы натощак в плазме, или уровня глюкозы натощак в сыворотке, или 1од10(фруктозамина), или НВА1С, или инсулина, или С-пептида;measurements of log10(HOMA) (homeostatic model assessment), or fasting plasma glucose, or fasting serum glucose, or 1od10(fructosamine), or HBA1C, or insulin, or C-peptide;
измерения уровня log10(YKL-40).log10(YKL-40) level measurements.
В этом конкретном варианте осуществления баллы определяют в виде логистической функции с использованием уровня в сыворотке has-miR-34a (в частности hsa-miR-34a-5p), выраженного в копиях/мкл (log10).In this particular embodiment, scores are determined as a logistic function using the serum level of has-miR-34a (specifically hsa-miR-34a-5p) expressed in copies/μl (log10).
гдеWhere
Y=k+ax A+b х B+c х C, где S представляет собой баллы NASH;Y=k+ax A+b x B+c x C where S represents NASH scores;
А представляет собой уровень hsa-miR-34a (в частности, hsa-miR-34a-5p) в сыворотке в копиях/мкл (log10);A is the serum level of hsa-miR-34a (specifically hsa-miR-34a-5p) in copies/μl (log10);
В представляет собой уровень log10(HOMA) в сыворотке;B represents the serum log10(HOMA) level;
С представляет собой уровень log10(YKL-40) в сыворотке, k представляет собой константу логистической функции;C is the serum log10(YKL-40) level, k is the logistic function constant;
а представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем hsa-miR-34a (в частности hsa-miR34a-5p) в сыворотке;a is a coefficient associated with the level of hsa-miR-34a (in particular hsa-miR34a-5p) in serum;
b представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем log10(HOMA) в сыворотке;b is the coefficient associated with the serum log10(HOMA) level;
с представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем log10(YKL-40) в сыворотке.c is the coefficient associated with the serum log10(YKL-40) level.
Таким образом, баллы NASH представляют собой вероятность того, что пациент имеет активность NASH от умеренной до высокой или тяжелый NASH.Thus, NASH scores represent the probability that a patient has moderate to high NASH activity or severe NASH.
Если S выше или равны пороговому значению, индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как подлежащего лечению NASH или потенциально подлежащего лечению NASH. В конкретном варианте осуществления, если S ниже порогового значения, индивидуума можно классифицировать как подлежащего лечению или неподлежащего лечению, в частности неподлежащего лечению и/или индивидуума классифицируют как реципиента или потенциального реципиента рекомендаций по питанию и/или образу жизни для лечения низкой активности NASH или умеренного NASH у него.If S is greater than or equal to the cutoff value, the individual is classified as having NASH or having or potentially having a steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS >4, and a fibrosis stage >2 and/or classified as eligible for treatment NASH or potentially treatable NASH. In a specific embodiment, if S is below a threshold value, the individual may be classified as treatable or untreatable, in particular, untreatable and/or the individual is classified as a recipient or potential recipient of dietary and/or lifestyle recommendations for the treatment of low or moderate NASH activity. He has NASH.
- 14 044836- 14 044836
В конкретном варианте осуществления, полученном из бутстреп-модели, как описано в экспериментальной части заявки, k является числом от -25,68 до -13,34;In a specific embodiment derived from the bootstrap model as described in the experimental portion of the application, k is a number from -25.68 to -13.34;
а является числом от 1,62 до 3,78;a is a number from 1.62 to 3.78;
b является числом от 0,40 до 2,52;b is a number from 0.40 to 2.52;
с является числом от 1,37 до 3,61.c is a number between 1.37 and 3.61.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,2392 до 0,5907.In a specific embodiment, the individual is classified as having NASH or having or potentially having a steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS >4, and a fibrosis stage >2 and/or is classified as a recipient or potential recipient of treatment, if NASH S scores are greater than or equal to the cutoff value between 0.2392 and 0.5907.
В дополнительном конкретном варианте осуществления, также полученном из бутстреп-модели, k равно -19,51;In a further specific embodiment, also derived from the bootstrap model, k is -19.51;
а равно 2,70;a is equal to 2.70;
b равно 1,46;b is equal to 1.46;
с равно 2,49, и где пороговое значение составляет от 0,2392 до 0,5907 и более конкретно равно 0,5313.c is equal to 2.49, and where the threshold value is from 0.2392 to 0.5907 and more specifically equal to 0.5313.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,2392 до 0,5907.In a specific embodiment, the individual is classified as having NASH or having or potentially having a steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS >4, and a fibrosis stage >2 and/or is classified as a recipient or potential recipient of treatment, if NASH S scores are greater than or equal to the cutoff value between 0.2392 and 0.5907.
В конкретном варианте осуществления AUC по меньшей мере равна 0,80, предпочтительно 0,82.In a particular embodiment, the AUC is at least 0.80, preferably 0.82.
Второй подкласс пациентов.Second subclass of patients.
В контексте по настоящему изобретению и во втором варианте изобретения второй подкласс пациентов определяют как (или он эквивалентен) пациента, у которого присутствуют следующие показатели при биопсии печени:In the context of the present invention and in the second embodiment of the invention, the second subclass of patients is defined as (or equivalent to) a patient who has the following findings on liver biopsy:
баллы стеатоза >1;steatosis scores >1;
баллы баллонирования гепатоцитов >1;hepatocyte ballooning scores >1;
баллы лобулярного воспаления >1;lobular inflammation scores >1;
NAS (баллы активности NAFLD) >4 (NAS определяют как сумму баллов стеатоза, баллов баллонирования гепатоцитов и баллов лобулярного воспаления);NAS (NAFLD activity scores) >4 (NAS is defined as the sum of steatosis scores, hepatocyte ballooning scores, and lobular inflammation scores);
стадия фиброза >1 (такая как стадия фиброза, равная 1, 2, 3 или 4).fibrosis stage >1 (such as fibrosis stage 1, 2, 3 or 4).
Способы по изобретению включают измерение hsa-miR-34 и YKL-40 и необязательно по меньшей мере одного другого циркулирующего маркера повреждения печени в крови, сыворотке или плазме.The methods of the invention include measuring hsa-miR-34 and YKL-40 and optionally at least one other circulating marker of liver damage in blood, serum or plasma.
В соответствии со статистическим анализом, биомаркеры также тестировали посредством проверки на коллинеарность, как описано ниже.According to the statistical analysis, biomarkers were also tested by testing for collinearity as described below.
В первом варианте способа идентификации (или диагностики) второго подкласса пациентов измеряют уровень hsa-miR-34, в частности hsa-miR-34a, более конкретно hsa-miR-34a-5p, и уровень YKL-40.In a first embodiment of a method for identifying (or diagnosing) a second subclass of patients, the level of hsa-miR-34, in particular hsa-miR-34a, more specifically hsa-miR-34a-5p, and the level of YKL-40 are measured.
В предпочтительном варианте осуществления второго варианта изобретения способ включает стадии измерения уровня hsa-miR-34, в частности hsa-miR-34a, более конкретно hsa-miR-34a-5p;In a preferred embodiment of the second embodiment of the invention, the method includes the steps of measuring the level of hsa-miR-34, in particular hsa-miR-34a, more particularly hsa-miR-34a-5p;
измерения уровня YKL-40; и необязательно измерения уровня удельного веса мочи или креатинина мочи;YKL-40 level measurements; and optionally measuring urine specific gravity or urine creatinine levels;
измерения уровня базофилов; и измерения уровня HSCRP (высокочувствительного С-реактивного белка).basophil level measurements; and measuring HSCRP (high-sensitivity C-reactive protein) levels.
В более предпочтительном варианте осуществления этого второго варианта изобретения, полученного из медианной модели, способ включает стадии измерения уровня hsa-miR-34, в частности hsa-miR-34a, более конкретно hsa-miR-34a-5p;In a more preferred embodiment of this second embodiment derived from the median model, the method includes the steps of measuring the level of hsa-miR-34, in particular hsa-miR-34a, more particularly hsa-miR-34a-5p;
измерение уровня YKL-40.YKL-40 level measurement.
В конкретном варианте осуществления второго варианта изобретения баллы NASH по изобретению вычисляют из следующих уровней маркеров, измеренных, как указано выше:In a specific embodiment of the second embodiment of the invention, NASH scores of the invention are calculated from the following marker levels measured as above:
уровня miR-34a (более конкретно - miR-34a-5p); и уровня YKL-40.miR-34a level (more specifically miR-34a-5p); and YKL-40 level.
В дополнительном конкретном варианте осуществления второго варианта изобретения баллы определяют в виде логистической функции гдеIn a further specific embodiment of the second embodiment of the invention, the scores are defined as a logistic function where
Y=k+axA+bxB, где S представляет собой баллы NASH;Y=k+axA+bxB, where S represents NASH scores;
А представляет собой уровень hsa-miR-34a (в частности, hsa-miR-34a-5p) в Cq;A represents the level of hsa-miR-34a (specifically hsa-miR-34a-5p) in Cq;
- 15 044836- 15 044836
В представляет собой уровень YKL-40 в пг/мл;B represents the YKL-40 level in pg/ml;
к является числом от -116,08 до 40,97;k is a number from -116.08 to 40.97;
а является числом от -0,82 до 0;a is a number from -0.82 to 0;
b является числом от 0 до 1,88Е-05, и где пороговое значение составляет от 0,1387 до 0,3481 и более конкретно равно 0,2187.b is a number from 0 to 1.88E-05, and where the threshold value is from 0.1387 to 0.3481 and more specifically equal to 0.2187.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >1 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,1387 до 0,3481, более конкретно равны 0,2187.In a specific embodiment, the individual is classified as having NASH or having or potentially having a steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS >4, and a fibrosis stage >1 and/or is classified as a recipient or potential recipient of treatment, if NASH S scores are greater than or equal to a cutoff value between 0.1387 and 0.3481, more specifically equal to 0.2187.
Если S выше или равны пороговому значению, индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >1 и/или классифицируют как подлежащего лечению NASH или потенциально подлежащего лечению NASH. В конкретном варианте осуществления, если S ниже порогового значения, индивидуума можно классифицировать как подлежащего лечению или неподлежащего лечению, в частности неподлежащего лечению, и/или индивидуума классифицируют как реципиента или потенциального реципиента, рекомендаций по питанию и/или образу жизни для лечения низкой активности NASH или умеренного NASH у него.If S is greater than or equal to the threshold, the individual is classified as having NASH or having or potentially having a steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS >4, and fibrosis stage >1 and/or classified as eligible for treatment NASH or potentially treatable NASH. In a specific embodiment, if S is below a threshold, the individual may be classified as treatable or untreatable, particularly not eligible for treatment, and/or the individual is classified as a recipient or potential recipient of dietary and/or lifestyle recommendations for the treatment of low NASH activity or moderate NASH.
В конкретном варианте осуществления, также полученном из медианной модели, как описано в экспериментальной части заявки, k равно 12,87;In a specific embodiment, also derived from the median model as described in the experimental portion of the application, k is 12.87;
а равно -0,42;and equals -0.42;
b равно 8,160Е-06, и где пороговое значение составляет от 0,1387 до 0,3481 и более конкретно равно 0,2187.b is equal to 8.160E-06, and where the threshold value is from 0.1387 to 0.3481 and more specifically equal to 0.2187.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >1 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,1387 до 0,3481, более конкретно равны 0,2187.In a specific embodiment, the individual is classified as having NASH or having or potentially having a steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS >4, and a fibrosis stage >1 and/or is classified as a recipient or potential recipient of treatment, if NASH S scores are greater than or equal to a cutoff value between 0.1387 and 0.3481, more specifically equal to 0.2187.
В конкретном варианте осуществления AUC по меньшей мере равна 0,68, предпочтительно 0,70.In a particular embodiment, the AUC is at least 0.68, preferably 0.70.
В другом предпочтительном варианте осуществления этого второго варианта изобретения, полученного из бутстреп-модели, способ включает стадии измерения уровня hsa-miR-34, в частности hsa-miR-34a, более конкретно hsa-miR-34a-5p;In another preferred embodiment of this second embodiment derived from the bootstrap model, the method includes the steps of measuring the level of hsa-miR-34, in particular hsa-miR-34a, more particularly hsa-miR-34a-5p;
измерения уровня YKL-40;YKL-40 level measurements;
измерения уровня удельного веса мочи;measuring urine specific gravity;
измерения уровня базофилов;basophil level measurements;
измерения уровня HSCRP.HSCRP level measurements.
В конкретном варианте осуществления второго варианта изобретения баллы NASH по изобретению вычисляют из следующих уровней маркеров, как указанно выше:In a specific embodiment of the second embodiment of the invention, the NASH scores of the invention are calculated from the following marker levels as above:
уровня miR-34a (более конкретно, miR-34a-5p);the level of miR-34a (more specifically, miR-34a-5p);
уровня YKL-40;YKL-40 level;
уровня удельного веса мочи;urine specific gravity level;
уровня базофилов; и уровня HSCRP.basophil level; and HSCRP level.
В дополнительном конкретном варианте осуществления второго варианта изобретения баллы определяют в виде логистической функции гдеIn a further specific embodiment of the second embodiment of the invention, the scores are defined as a logistic function where
Y=k+axA+bxB+cxC+dxD+fxF, где S представляет собой баллы NASH;Y=k+axA+bxB+cxC+dxD+fxF where S represents NASH scores;
А представляет собой уровень hsa-miR-34a (в частности, hsa-miR-34a-5p) в Cq;A represents the level of hsa-miR-34a (specifically hsa-miR-34a-5p) in Cq;
В представляет собой уровень YKL-40 в пг/мл;B represents the YKL-40 level in pg/ml;
С представляет собой уровень удельного веса мочи (без единиц);C represents the urine specific gravity level (without units);
D представляет собой уровень базофилов в 10е9/л;D represents the basophil level of 10e9/L;
F представляет собой уровень HSCRP в мг/дл;F represents the HSCRP level in mg/dL;
к является числом от -124,81 и 1,13;k is a number between -124.81 and 1.13;
а является числом от -0,91 до -0,25;a is a number from -0.91 to -0.25;
b является числом от 4,77е-06 до 2,39е-05;b is a number from 4.77e-06 to 2.39e-05;
с является числом от 17,21 до 141,51;c is a number from 17.21 to 141.51;
d является числом от 2,80 до 60,74;d is a number from 2.80 to 60.74;
- 16 044836 f является числом от 0,01 до 0,23, и где пороговое значение составляет от 0,5791 до 0,8269 и более конкретно равно 0,7758.- 16 044836 f is a number from 0.01 to 0.23, and where the threshold value is from 0.5791 to 0.8269 and more specifically equal to 0.7758.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >1 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,5791 до 0,8269.In a specific embodiment, the individual is classified as having NASH or having or potentially having a steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS >4, and a fibrosis stage >1 and/or is classified as a recipient or potential recipient of treatment, if NASH S scores are greater than or equal to the cutoff value between 0.5791 and 0.8269.
Если S выше или равны пороговому значению, индивидуума классифицируют как имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >1 и/или классифицируют как подлежащего лечению NASH или потенциально подлежащего лечению NASH. В конкретном варианте осуществления, если S ниже порогового значения, индивидуума можно классифицировать как подлежащего лечению или неподлежащего лечению, в частности неподлежащего лечению, и/или индивидуума классифицируют как реципиента или потенциального реципиента, рекомендаций по питанию и/или образу жизни для лечения низкой активности NASH или умеренного NASH у него.If S is greater than or equal to the cutoff value, the individual is classified as having or potentially having a steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS >4, and fibrosis stage >1 and/or classified as treatable NASH or potentially subject to NASH treatment. In a specific embodiment, if S is below a threshold, the individual may be classified as treatable or untreatable, particularly not eligible for treatment, and/or the individual is classified as a recipient or potential recipient of dietary and/or lifestyle recommendations for the treatment of low NASH activity or moderate NASH.
В конкретном варианте осуществления, полученном из бутстреп-модели, как описано в экспериментальной части заявки, k равно -61,84;In the specific embodiment obtained from the bootstrap model as described in the experimental portion of the application, k is equal to -61.84;
а равно -0,58;and equals -0.58;
b равно 1,44Е-05;b is equal to 1.44E-05;
с равно 79,36;c equals 79.36;
d равно 31,77;d equals 31.77;
f равно 0,12, и где пороговое значение составляет от 0,5791 до 0,8269 и более конкретно равно 0,7758.f is equal to 0.12, and where the threshold value is from 0.5791 to 0.8269 and more specifically equal to 0.7758.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >1 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,5791 до 0,8269.In a specific embodiment, the individual is classified as having NASH or having or potentially having a steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS >4, and a fibrosis stage >1 and/or is classified as a recipient or potential recipient of treatment, if NASH S scores are greater than or equal to the cutoff value between 0.5791 and 0.8269.
В конкретном варианте осуществления AUC по меньшей мере равна 0,75, предпочтительно 0,77.In a particular embodiment, the AUC is at least 0.75, preferably 0.77.
Настоящее изобретение также относится к набору, содержащему средства для определения уровня, (i) по меньшей мере одного маркера, выбранного из группы, состоящей из hsa-miR-34 (в частности, hsa-miR-34a, более конкретно miR-34a-5p); и (ii) YKL-40; и необязательно (iii) удельного веса мочи или креатинина мочи; базофилов и HSCRP (высокочувствительного С-реактивного белка).The present invention also relates to a kit containing means for determining the level of (i) at least one marker selected from the group consisting of hsa-miR-34 (in particular hsa-miR-34a, more particularly miR-34a-5p ); and (ii) YKL-40; and optionally (iii) urine specific gravity or urine creatinine; basophils and HSCRP (high-sensitivity C-reactive protein).
В конкретном варианте осуществления изобретения указанный набор содержит средства для определения уровня (i) hsa-miR-34 (в частности, hsa-miR-34a, более конкретно miR-34a-5p); и (ii) YKL-40.In a specific embodiment of the invention, the kit contains means for determining the level of (i) hsa-miR-34 (in particular hsa-miR-34a, more particularly miR-34a-5p); and (ii) YKL-40.
В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанный набор содержит средства для определения уровня (i) hsa-miR-34 (в частности, hsa-miR-34a, более конкретно miR-34a-5p);In another specific embodiment of the invention, the kit contains means for determining the level of (i) hsa-miR-34 (in particular hsa-miR-34a, more particularly miR-34a-5p);
(ii) YKL-40;(ii) YKL-40;
(iii) удельного веса мочи;(iii) urine specific gravity;
(iv) базофилов; и (v) HSCRP.(iv) basophils; and (v) HSCRP.
Набор по изобретению применим для осуществления способов, описанных выше, и может дополнительно необязательно включать инструкции по осуществлению указанных способов. Набор может содержать реагенты и буферы, подходящие для осуществления измерений уровней маркеров, указанных выше. Набор содержит антитела, специфические для белка, подлежащего количественному анализу, и/или праймеры, применимые для количественного анализа уровней микроРНК, как хорошо известно в этой области.The kit of the invention is useful for carrying out the methods described above, and may further optionally include instructions for carrying out said methods. The kit may contain reagents and buffers suitable for making measurements of the marker levels specified above. The kit contains antibodies specific for the protein to be quantified and/or primers useful for quantitating miRNA levels, as is well known in the art.
По другому аспекту настоящее изобретение также относится к различным способам классификации пациентов.In another aspect, the present invention also relates to various methods for classifying patients.
Настоящее изобретение также относится к другим заболеваниям печени и более конкретно фиброзным заболеваниям печени, таким как вирусный гепатит (HBV, HCV), алкогольный стеатогепатит, заболевания желчных путей (первичный биллиарный холангит, первичный склерозирующий холангит, аутоиммунный гепатит, болезнь Вильсона, недостаточность альфа-1-антитрипсина).The present invention also relates to other liver diseases and more particularly fibrotic liver diseases such as viral hepatitis (HBV, HCV), alcoholic steatohepatitis, biliary tract diseases (primary biliary cholangitis, primary sclerosing cholangitis, autoimmune hepatitis, Wilson's disease, alpha-1 deficiency -antitrypsin).
- 17 044836- 17 044836
ПримерыExamples
Материалы и способы.Materials and methods.
Сбор и анализы образцов.Sample collection and analysis.
Клиническое исследование.Clinical study.
Клиническое исследование (исследование фазы 2 GOLDEN-505 NASH (GFT505-212-7-NCT01694849) является многоцентровым, рандомизированным, двойным слепым, плацебо-контролируемым исследованием для оценки эффективности и безопасности введения элафибранора (1-[4-метилтиофенил]-3-[3,5диметил-4-карбоксидиметилметилоксифенил]проп-2-ен-1-она) раз в сутки в отношении стеатогепатита у пациентов с неалкогольным стеатогепатитом (NASH).The Phase 2 GOLDEN-505 NASH Study (GFT505-212-7-NCT01694849) is a multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled study to evaluate the efficacy and safety of elafibranor (1-[4-methylthiophenyl]-3-[ 3,5dimethyl-4-carboxydimethylmethyloxyphenyl]prop-2-en-1-one) once daily for steatohepatitis in patients with non-alcoholic steatohepatitis (NASH).
Биопсию печени осуществляли для подтверждения диагноза NASH после соответствующего исключения заболевания печени другой этиологии. NASH диагностировали как стеатогепатит, оцениваемый посредством биопсии печени в пределах 6 месяцев до рандомизации. Подтверждение стеатогепатита было основано на централизованном анализе биоптатов печени. Пациентов NASH определяли как имеющих NAS >3, включая баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1 и баллы лобулярного воспаления >1.Liver biopsy was performed to confirm the diagnosis of NASH after appropriate exclusion of liver disease of other etiologies. NASH was diagnosed as steatohepatitis assessed by liver biopsy within 6 months before randomization. Confirmation of steatohepatitis was based on central analysis of liver biopsies. NASH patients were defined as having NAS >3, including steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, and lobular inflammation score >1.
Исследование было одобрено соответствующими регулирующими органами в каждом участвующем центре, и все пациенты давали согласие на участие в медицинском исследовании.The study was approved by the appropriate regulatory authorities at each participating center, and all patients consented to participate in the medical study.
Образцы плазмы из исследования фазы 2 GOLDEN-505 NASH использовали для идентификации наиболее мощных и значимых маркеров NASH.Plasma samples from the phase 2 GOLDEN-505 NASH study were used to identify the most potent and significant NASH markers.
Биопсию печени осуществляли для подтверждения диагноза NASH после соответствующего исключения заболевания печени другой этиологии.Liver biopsy was performed to confirm the diagnosis of NASH after appropriate exclusion of liver disease of other etiologies.
NASH диагностировали как стеатогепатит, оцениваемый посредством биопсии печени в пределах 6 месяцев до рандомизации. Подтверждение стеатогепатита было основано на централизованном анализе биоптатов печени.NASH was diagnosed as steatohepatitis assessed by liver biopsy within 6 months before randomization. Confirmation of steatohepatitis was based on central analysis of liver biopsies.
Исследование было одобрено соответствующими регулирующими органами в каждом участвующем центре, и все пациенты давали согласие на участие в медицинском исследовании.The study was approved by the appropriate regulatory authorities at each participating center, and all patients consented to participate in the medical study.
Забор крови и лабораторное тестирование.Blood collection and laboratory testing.
Образцы крови получали в соответствии с центральным лабораторным протоколом и руководством Genfit - GFT505-212-7.Blood samples were obtained in accordance with the central laboratory protocol and Genfit guidelines - GFT505-212-7.
В соответствии с протоколом исследования осуществляли следующие анализы.In accordance with the study protocol, the following analyzes were carried out.
Гематология включает гемоглобин, гематокрит, количество эритроцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу (нейтрофилы, лимфоциты, эозинофилы, моноциты, базофилы - абсолютные значения и % значения), тромбоциты и ретикулоциты.Hematology includes hemoglobin, hematocrit, red blood cell count, white blood cell count, leukocyte count (neutrophils, lymphocytes, eosinophils, monocytes, basophils - absolute values and % values), platelets and reticulocytes.
Биохимическая панель I включает глюкозу плазмы, триглицериды (TG), креатинин, клиренс креатинина, гамма-глутамилтрансферазу (GGT), аспартатаминотрансферазу (ACT), аланинаминотрансферазу (АЛТ), креатинфосфокиназу (СРК), щелочную фосфатазу, тиреотропный гормон (TSH) и HbA1c.Biochemical panel I includes plasma glucose, triglycerides (TG), creatinine, creatinine clearance, gamma-glutamyltransferase (GGT), aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), creatine phosphokinase (CPK), alkaline phosphatase, thyroid-stimulating hormone (TSH), and HbA1c.
Биохимическая панель II включает глюкозу плазмы, креатинин, клиренс креатинина, общий белок, альбумин, натрий, калий, хлорид, кальций, мочевую кислоту, мочевину, выраженную как азот мочевины крови (BUN), аспартатаминотрансферазу (ACT), аланинаминотрансферазу (АЛТ), гамма-глутамилтрансферазу (GGT), щелочную фосфатазу, креатинфосфокиназу (СРК), общий билирубин, конъюгированный билирубин, С-реактивный белок (hsCRP), соотношение АСТ/АЛТ и HbA1c.Biochemical panel II includes plasma glucose, creatinine, creatinine clearance, total protein, albumin, sodium, potassium, chloride, calcium, uric acid, urea expressed as blood urea nitrogen (BUN), aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), gamma -glutamyltransferase (GGT), alkaline phosphatase, creatine phosphokinase (CPK), total bilirubin, conjugated bilirubin, C-reactive protein (hsCRP), AST/ALT ratio and HbA1c.
Анализ мочи включает анализ с использованием тест-полосок (удельный вес, рН, RBC, лейкоциты, глюкоза, белок, кетоны, билирубин, уробилиноген и нитрит);Urine testing includes dipstick testing (specific gravity, pH, RBC, white blood cells, glucose, protein, ketones, bilirubin, urobilinogen, and nitrite);
микроскопический анализ включает эритроциты, лейкоциты, цилиндры, кристаллы, бактерии, эпителиальные клетки и дрожжи;microscopic analysis includes red blood cells, white blood cells, casts, crystals, bacteria, epithelial cells and yeast;
химический анализ (альбумин и креатинин).chemical analysis (albumin and creatinine).
Серология включает антитела против ВИЧ I/II, антитела против HCV, РНК HCV (тестировали только после получения образцов при посещении для анализа РНК HCV и в случае реактивного или промежуточного результата на антитела против HCV) и HbsAg.Serology includes HIV I/II antibodies, HCV antibodies, HCV RNA (tested only after specimens were obtained at the HCV RNA visit and if HCV antibody was reactive or intermediate), and HbsAg.
Липидная панель включает триглицериды (TG), общий холестерин, не-HDL-C (вычисление), холестерин липопротеинов высокой плотности (HDL-C), липопротеины низкой плотности (LDL-C) (вычисление), вычисленный холестерин липопротеинов очень низкой плотности (VLDL-C) (вычисление), аполипопротеин AI (ApoAI) и аполипопротеин В (АроВ).Lipid panel includes triglycerides (TG), total cholesterol, non-HDL-C (calculated), high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) (calculated), calculated very low-density lipoprotein cholesterol (VLDL) -C) (calculation), apolipoprotein AI (ApoAI) and apolipoprotein B (ApoB).
Химический анализ мочи включает альфа-1-микроглобулин, бета-N-ацетилглюкозаминидазы (бета-NAG) и нейтрофил-желатиназа-ассоциированный липокалин (N-Gal).Urine chemistry includes alpha-1-microglobulin, beta-N-acetylglucosaminidase (beta-NAG), and neutrophil-gelatinase-associated lipocalin (N-Gal).
Маркеры безопасности включают гомоцистеин, NT-ProBNP, тропонин Т, цистатин С и бета-2микроглобулин.Safety markers include homocysteine, NT-ProBNP, troponin T, cystatin C, and beta-2 microglobulin.
Гликемические и другие липидные параметры включают лептин, инсулин, оценку гомеостатической модели (HOMA-IR), глюкозу сыворотки (для вычисления HOMA-IR), фруктозамин, С-пептид и свободные жирные кислоты (FFA).Glycemic and other lipid parameters include leptin, insulin, homeostatic model assessment (HOMA-IR), serum glucose (for HOMA-IR calculation), fructosamine, C-peptide, and free fatty acids (FFA).
- 18 044836- 18 044836
Воспалительные маркеры включают гаптоглобин, фибриноген, фактор некроза опухоли (ФНО), интерлейкин-6 (ИЛ-6) и ингибитор активатора плазминогена 1 (PAI-1) Ag (цитрат).Inflammatory markers include haptoglobin, fibrinogen, tumor necrosis factor (TNF), interleukin-6 (IL-6), and plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1) Ag (citrate).
Маркеры печени включают цитокератин-18 (СК18) (М65 и М30), адипонектин, ферритин, альфа2-макроглобулин, FGF19 и FGF21, гиалуроновую кислоту (Advia centaur, реагент, производимый Siemens Belgium и переданный Genfit), N-концевой про-пептид коллагена типа III (PIIINP) (Advia centaur, реагент, производимый Siemens Belgium) и тканевый ингибитор матричной металлопротеазы-1 (TIMP-1) (Advia centaur, реагент, производимый Siemens).Liver markers include cytokeratin 18 (CK18) (M65 and M30), adiponectin, ferritin, alpha2-macroglobulin, FGF19 and FGF21, hyaluronic acid (Advia centaur, reagent manufactured by Siemens Belgium and donated by Genfit), collagen N-terminal pro-peptide type III (PIIINP) (Advia centaur, reagent manufactured by Siemens Belgium) and tissue inhibitor of matrix metalloprotease-1 (TIMP-1) (Advia centaur, reagent manufactured by Siemens).
Список способов, инструментов и производителей для каждого биохимического анализа приведен в этой таблице.________________________________________________________________________________A list of methods, instruments and manufacturers for each biochemical analysis is given in this table.________________________________________________________________________________
- 19 044836- 19 044836
Получение и хранение образцов.Receipt and storage of samples.
Образцы крови, используемые в этом исследовании биомаркеров, получали от пациентов исследования 505.212.7 до периода лечения. От каждого пациента получали письменное информированное согласие на получение, хранение и использование дополнительных образцов.Blood samples used in this biomarker study were obtained from study 505.212.7 patients prior to the treatment period. Written informed consent was obtained from each patient to obtain, store, and use additional samples.
Кровь, собранную в пробирки 2,7 мл, содержащие цитрат, обрабатывали посредством отделения бесклеточной плазмы от клеток крови посредством центрифугирования при 1500xg в течение 15 мин. Супернатант плазмы переносили в новую пробирку. Пробирки хранили при -70°С.Blood collected in 2.7 ml tubes containing citrate was processed by separating cell-free plasma from blood cells by centrifugation at 1500xg for 15 min. The plasma supernatant was transferred to a new tube. The tubes were stored at -70°C.
Для перехода к выделению РНК пробирки с плазмой центрифугировали при 13000xg в течение 2 мин для осаждения и удаления тромбоцитов. Супернатант плазмы, не содержащий тромбоциты, переносили в новую пробирку, замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С.To proceed to RNA isolation, plasma tubes were centrifuged at 13,000xg for 2 min to pellet and remove platelets. The plasma supernatant, free of platelets, was transferred to a new tube, frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C.
Выделение тотальной РНК и количественный анализ мкРНК в цитратной плазме.Isolation of total RNA and quantitative analysis of miRNA in citrated plasma.
Тотальную РНК с сохраненной мкРНК выделяли из 400 мкл не содержащей тромбоциты плазмы с помощью набора для выделения miRNeasy (miRNeasy Serum/Plasma Kit (кат. № 217184)) с использованием соотношения плазма/QIAzol 1:5 по инструкциям производителя. В образцы [3,125 фмоль] добавляли синтетическую добавочную miR-39 С. elegans до выделения РНК в качестве внутреннего контроля при выделении РНК. Элюцию осуществляли в 18 мкл элюирующего буфера.Total RNA with retained miRNA was isolated from 400 μl of platelet-free plasma using the miRNeasy Isolation Kit (miRNeasy Serum/Plasma Kit (cat. no. 217184)) using a plasma/QIAzol ratio of 1:5 according to the manufacturer's instructions. [3.125 fmol] samples were spiked with C. elegans synthetic miR-39 spike prior to RNA extraction as an internal control for RNA extraction. Elution was carried out in 18 μl of elution buffer.
Экспрессию зрелой мкРНК определяли по инструкциям производителя с использованием анализа qRT-ПЦР мкРНК Taqman: набор для обратной транскрипции микроРНК TaqMan (Ref: 4366596, Applied Biosystems, Carlsbad, CA), 20-кратная смесь для анализа микроРНК TaqMan (Ref: 4440887, Applied Biosystems) и универсальный мастер-микс TaqMan II (Ref: 4440040, Applied Biosystems).Mature miRNA expression was determined according to the manufacturer's instructions using the Taqman miRNA qRT-PCR assay: TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit (Ref: 4366596, Applied Biosystems, Carlsbad, CA), 20× TaqMan miRNA Assay Mix (Ref: 4440887, Applied Biosystems ) and TaqMan II Universal Master Mix (Ref: 4440040, Applied Biosystems).
Обратную транскрипцию осуществляли с использованием термоциклера GeneAmp® PCR System 9700 (Ref: 200005, Applied Biosystems) с условиями циклов 16°C в течение 30 мин, затем 42°С в течение 30 мин и 85°С в течение 5 мин перед хранением при 4°С. Обратную транскрипцию осуществляли в мультиплексном формате с использованием 4 мкРНК-специфических обратных праймеров для сохранения образца РНК.Reverse transcription was performed using a GeneAmp® PCR System 9700 thermal cycler (Ref: 200005, Applied Biosystems) with cycling conditions of 16°C for 30 min, then 42°C for 30 min, and 85°C for 5 min before storage at 4 °C. Reverse transcription was performed in a multiplex format using 4 miRNA-specific reverse primers to preserve the RNA sample.
Количественную ПЦР осуществляли с использованием системы CFX96™ Real-Time System (термоциклер С1000 Touch™, BioRad) с условиями циклов 95°С в течение 10 мин, затем 95°С в течение 15 с и 60°С в течение 60 с всего в течение 50 циклов и 30°С в течение 30 с.Quantitative PCR was performed using the CFX96™ Real-Time System (C1000 Touch™ Thermal Cycler, BioRad) with cycling conditions of 95°C for 10 min, then 95°C for 15 s, and 60°C for 60 s total. 50 cycles and 30°C for 30 s.
Последовательности специфических праймеров для мкРНК, потенциально представляющих интерес, выбирали в соответствии с представленным в следующей табл. 1.The sequences of specific primers for miRNAs of potential interest were selected as shown in the following table. 1.
Таблица 1Table 1
Последовательности тестируемой мкРНКSequences of the tested miRNA
-20044836-20044836
Данные, используемые при конструировании алгоритма, находились в формате Cq. Режим определения Cq представлял собой регрессию.The data used to construct the algorithm was in Cq format. The mode for determining Cq was regression.
Выделение тотальной РНК и количественный анализ мкРНК в сыворотке.Isolation of total RNA and quantitative analysis of miRNA in serum.
Тотальную РНК в сыворотке с сохраненной мкРНК выделяли из 100 мкл сыворотки с помощью набора для выделения miRVanaParis (АМ1556, Ambion) по инструкциям производителя. К образцам [3,125 фмоль] добавляли синтетическую добавочную miR-39 С. elegans (MSY0000010, Qiagen) до выделения РНК в качестве внутреннего контроля при выделении РНК. Элюцию осуществляли в 100 мкл элюирующего буфера.Total serum RNA with retained miRNA was isolated from 100 μl of serum using the miRVanaParis isolation kit (AM1556, Ambion) according to the manufacturer's instructions. Synthetic C. elegans miR-39 supplement (MSY0000010, Qiagen) was added to [3.125 fmol] samples prior to RNA extraction as an internal control for RNA extraction. Elution was carried out in 100 μl of elution buffer.
Экспрессию зрелой мкРНК определяли по инструкциям производителя с использованием анализа qRT-ПЦР мкРНК Taqman: набор для обратной транскрипции микроРНК TaqMan (Ref: 4366596, Applied Biosystems, Carlsbad, CA), 20-кратная смесь для анализа микроРНК TaqMan (Ref: 4440887, Applied Biosystems) и универсальный мастер-микс TaqMan II (Ref: 4440040, Applied Biosystems).Mature miRNA expression was determined according to the manufacturer's instructions using the Taqman miRNA qRT-PCR assay: TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit (Ref: 4366596, Applied Biosystems, Carlsbad, CA), 20× TaqMan miRNA Assay Mix (Ref: 4440887, Applied Biosystems ) and TaqMan II Universal Master Mix (Ref: 4440040, Applied Biosystems).
Обратную транскрипцию осуществляли с использованием термоциклера GeneAmp® PCR System 9700 (Ref: 200005, Applied Biosystems) с условиями циклов 16°С в течение 30 мин, затем 42°С в течение 30 мин и 85°С в течение 5 мин перед хранением при 4°С. Обратную транскрипцию осуществляли в мультиплексном формате с использованием 4 мкРНК-специфических обратных праймеров для сохранения образца РНК.Reverse transcription was performed using a GeneAmp® PCR System 9700 thermal cycler (Ref: 200005, Applied Biosystems) with cycling conditions of 16°C for 30 min, then 42°C for 30 min, and 85°C for 5 min before storage at 4 °C. Reverse transcription was performed in a multiplex format using 4 miRNA-specific reverse primers to preserve the RNA sample.
Количественную ПЦР осуществляли с использованием системы CFX96™ Real-Time System (термоциклер С1000 Touch™, BioRad) с условиями циклов 95°С в течение 10 мин, затем 95°С в течение 15 с и 60°С в течение 60 с всего в течение 50 циклов и 30°С в течение 30 с.Quantitative PCR was performed using the CFX96™ Real-Time System (C1000 Touch™ Thermal Cycler, BioRad) with cycling conditions of 95°C for 10 min, then 95°C for 15 s, and 60°C for 60 s total. 50 cycles and 30°C for 30 s.
Последовательности специфических праймеров для интересующих мкРНК выбирали в соответствии с представленным в следующей таблице.The sequences of specific primers for the miRNAs of interest were selected as presented in the following table.
- 21 044836- 21 044836
Синтетическую hsa-мкРНК (Integrated DNA Technologies) разводили до 3,125 фмоль/мл и 5 мкл использовали для обратной транскрипции одновременно с РНК, выделенной из образцов сыворотки. Продукт серийно разводили и осуществляли ПЦР с использованием всех образцов (стандарты и РНК из сыворотки). Построение стандартных кривых осуществляли в двух параллелях и использовали для преобразования данных Cq в копии/мкл. Режимом определения Cq являлась регрессия. Данные, используемые для построения алгоритма, находились в формате Ьс^10(копии/мкл сыворотки).Synthetic hsa-miRNA (Integrated DNA Technologies) was diluted to 3.125 fmol/ml and 5 μl was used for reverse transcription simultaneously with RNA isolated from serum samples. The product was serially diluted and PCR was performed using all samples (standards and RNA from serum). Standard curves were generated in duplicate and used to convert Cq data to copies/μl. The mode for determining Cq was regression. The data used to construct the algorithm was in the format bc^10(copies/μl of serum).
Статистический анализ.Statistical analysis.
Цель и определение.Purpose and definition.
Целью этих анализов являлось обнаружение биомаркеров, которые могут быть связаны с идентификацией пациентов с NASH, подлежащих лечению. Пациентов, подлежащих лечению (ТВТ), определяют по-разному в зависимости от различных частей исследования.The goal of these analyzes was to discover biomarkers that may be associated with identifying NASH patients eligible for treatment. Patients eligible to treat (TTP) are defined differently depending on the different parts of the study.
-22 044836-22 044836
В первом аспекте изобретения ТВТ определяют как баллы стеатоза >1;In the first aspect of the invention, TVT is defined as steatosis scores >1;
баллы баллонирования гепатоцитов >1;hepatocyte ballooning scores >1;
баллы лобулярного воспаления >1;lobular inflammation scores >1;
NAS (баллы активности NAFLD) >4 (NAS определяют как сумму баллов стеатоза, баллов баллонирования гепатоцитов и баллов лобулярного воспаления);NAS (NAFLD activity scores) >4 (NAS is defined as the sum of steatosis scores, hepatocyte ballooning scores, and lobular inflammation scores);
стадия фиброза >2 (такая как стадия фиброза, равная 2, 3 или 4, в частности 2 или 3).fibrosis stage >2 (such as a fibrosis stage of 2, 3 or 4, in particular 2 or 3).
Во втором аспекте изобретения ТВТ определяют как баллы стеатоза >1;In the second aspect of the invention, TVT is defined as steatosis scores >1;
баллы баллонирования гепатоцитов >1;hepatocyte ballooning scores >1;
баллы лобулярного воспаления >1;lobular inflammation scores >1;
NAS (баллы активности NAFLD) >4 (NAS определяют как сумму баллов стеатоза, баллов баллонирования гепатоцитов и баллов лобулярного воспаления);NAS (NAFLD activity scores) >4 (NAS is defined as the sum of steatosis scores, hepatocyte ballooning scores, and lobular inflammation scores);
стадия фиброза >1 (такая как стадия фиброза, равная 1, 2, 3 или 4).fibrosis stage >1 (such as fibrosis stage 1, 2, 3 or 4).
В третьем аспекте изобретения ТВТ определяют как баллы стеатоза >1;In the third aspect of the invention, TVT is defined as steatosis scores >1;
баллы баллонирования гепатоцитов >1;hepatocyte ballooning scores >1;
баллы лобулярного воспаления >1;lobular inflammation scores >1;
NAS (баллы активности NAFLD) >4 (NAS определяют как сумму баллов стеатоза, баллов баллонирования гепатоцитов и баллов лобулярного воспаления);NAS (NAFLD activity scores) >4 (NAS is defined as the sum of steatosis scores, hepatocyte ballooning scores, and lobular inflammation scores);
стадия фиброза=1b, 1с, 2, 3 или 4.fibrosis stage=1b, 1c, 2, 3 or 4.
Других пациентов определяли как неподлежащих лечению (NTBT). Для анализа пациентов ТВТ классифицировали как 1 и NTBT как 0 в переменной ответа. Как указано выше, объясняющие переменные включали широкий диапазон биомаркеров, измеренных в образцах крови (гематология, биохимия, свертывание, маркеры печени, циркулирующие мкРНК) или моче (тест-полоски, седиментация) при условии наличия демографических (возраст, пол, раса), географических (исследовательский центр, страна, континент) или медицинских (диабет) данных.Other patients were defined as not eligible for treatment (NTBT). For patient analysis, TVT was classified as 1 and NTBT as 0 in the response variable. As stated above, explanatory variables included a wide range of biomarkers measured in blood (hematology, chemistry, coagulation, liver markers, circulating miRNAs) or urine (test strips, sedimentation) samples, subject to demographic (age, sex, race), geographic (research center, country, continent) or medical (diabetes) data.
Обработка набора данных.Data set processing.
Набор данных, используемый в настоящем исследовании, получали из исследования Golden-505, и исходно он состоял из 274 пациентов и 121 переменных. Обработка набора данных включала следующие стадии:The data set used in the present study was obtained from the Golden-505 study and initially consisted of 274 patients and 121 variables. Processing of the data set included the following stages:
1) удаление пациентов без измерения мкРНК;1) removal of patients without miRNA measurements;
2) удаление переменных с более чем 10 отсутствующими значениями;2) removing variables with more than 10 missing values;
3) удаление пациентов с крайними значениями и 28 с оставшимися отсутствующими значениями.3) removing patients with extreme values and 28 with remaining missing values.
Это приводило к получению набора данных для 216 пациентов для всех способов по настоящему изобретению за исключением способов, касающихся сыворотки, которые осуществляли на 212 пациентах, и 112 переменных, используемых для проверки на коллинеарность между объясняющими переменными.This resulted in a data set of 216 patients for all methods of the present invention except for the serum methods, which were performed on 212 patients, and 112 variables used to test for collinearity between explanatory variables.
Проверка на коллинеарность.Checking for collinearity.
Коэффициент корреляции.Correlation coefficient.
Пирсона вычисляли попарно с использованием количественных переменных. Когда у двух переменных наблюдают коэффициент корреляции выше 0,7 в случае анализа с использованием мкРНК плазмы или 0,6 в случае анализа с использованием мкРНК сыворотки, осуществляли одномерный анализ различия среднего относительно переменной ответа, определяющей пациентов ТВТ. Выбранная переменная была более значимой.Pearson was calculated pairwise using quantitative variables. When two variables exhibited a correlation coefficient greater than 0.7 for the plasma miRNA assay or 0.6 for the serum miRNA assay, univariate mean difference analysis was performed on the response variable identifying TVT patients. The selected variable was more significant.
Коллинеарные и выбранные переменные представлены в табл. 2-7.Collinear and selected variables are presented in Table. 2-7.
Эти переменные зависят от определения пациента и, таким образом, склонны варьироваться в зависимости от категории пациентов.These variables depend on the definition of patient and thus tend to vary across patient categories.
Медианная модель.Median model.
Получение медианной модели начинали с наблюдения набора данных в обучающей выборке, соответствующей 2/3 пациентов TBT/NTBT, и валидационной выборке, соответствующей остальной 1/3 пациентов TBT/NTBT. Это наблюдение осуществляют случайным образом миллион раз и для анализа сохраняют образцы, у которых наблюдают однородность между обучающей и валидационной выборками (не наблюдали значимого различия во всех объясняющих переменных между двумя выборками). В каждой обучающей выборке вычисляли генерализованную логистическую линейную модель переменной ответа (определяющей пациентов TBT/NTBT) относительно объясняющих переменных (биомаркеров). Для каждой модели обучающей выборки осуществляли пошаговое исключение переменных и находили оптимальную модель с помощью наименьшего информационного критерия Акаике (AIC). Таким образом, все объясняющие переменные имели коэффициент модели для каждой обучающей выборки. Медианный алгоритм строили с использованием переменных, у которых наблюдали медианный коэффициент, отличающийся от нуля, и соответствующие ему коэффициенты. Этот алгоритм валидировали (вычисле- 23 044836 ние ROC, AUC, оптимального порогового значения, общей точности, чувствительности, специфичности, положительного прогностического значения и отрицательного прогностического значения) в каждой валидационной выборке и получали оптимальное пороговое значение медианы. По сравнению с бутстреп-моделью медианная модель также применима к общему набору данных для валидации.Obtaining the median model began by observing the data set in the training set corresponding to 2/3 of the TBT/NTBT patients and the validation set corresponding to the remaining 1/3 of the TBT/NTBT patients. This observation is carried out randomly a million times and samples are retained for analysis in which homogeneity is observed between the training and validation samples (no significant differences in all explanatory variables were observed between the two samples). In each training set, a generalized logistic linear model of the response variable (identifying TBT/NTBT patients) was computed with respect to the explanatory variables (biomarkers). For each model of the training set, stepwise elimination of variables was carried out and the optimal model was found using the least Akaike information criterion (AIC). Thus, all explanatory variables had a model coefficient for each training set. The median algorithm was built using variables that had a median coefficient different from zero and the corresponding coefficients. This algorithm was validated (calculating ROC, AUC, optimal cut-off value, overall accuracy, sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value) in each validation set and obtained the optimal median cut-off value. Compared to the bootstrap model, the median model is also applicable to the overall validation data set.
Бутстреп-модель.Bootstrap model.
При построении бутстреп-модели генерализованную логистическую линейную модель переменной ответа (определяющей пациентов TBT/NTBT) относительно объясняющих переменных (биомаркеров) вычисляли с использованием всех пациентов из общего набора данных. Осуществляли пошаговое исключение переменных и выбирали оптимальный алгоритм с использованием AIC. Затем тестировали значимость коэффициентов переменных из этого оптимального алгоритма, запуская алгоритм с использованием 1000 бутстреп-образцов. Коэффициенты с 95%-ным доверительным интервалом, исключающим нуль, считали значимыми. Затем алгоритм валидировали посредством вычисления ROC, AUC, оптимального порогового значения, общей точности, чувствительности, специфичности, положительного прогностического значения и отрицательного прогностического значения.In constructing the bootstrap model, a generalized logistic linear model of the response variable (identifying TBT/NTBT patients) relative to the explanatory variables (biomarkers) was calculated using all patients from the total data set. Variables were eliminated stepwise and the optimal algorithm was selected using AIC. The significance of the coefficients of the variables from this optimal algorithm was then tested by running the algorithm using 1000 bootstrap samples. Coefficients with a 95% confidence interval excluding zero were considered significant. The algorithm was then validated by calculating ROC, AUC, optimal cut-off value, overall accuracy, sensitivity, specificity, positive predictive value, and negative predictive value.
Сравнение с другими способами балльной оценки NASH.Comparison with other NASH scoring methods.
Способы осуществления балльной оценки NASH уже описаны в литературе:Methods for performing NASH scoring have already been described in the literature:
балльная оценка фиброза при NAFLD (индекс Ангуло) (Angulo et al., 2007);NAFLD fibrosis score (Angulo index) (Angulo et al., 2007);
ELF (Guha et al., 2 008) (см. также лист спецификаций ELF http://www.healthcare.Siemens.com/clinicalspecialities/liver-disease/elf-test-now-avail);ELF (Guha et al., 2 008) (see also ELF specification sheet http://www.healthcare.Siemens.com/clinicalspecialities/liver-disease/elf-test-now-avail);
Fibrotest (Ratziu et al., 2006);Fibrotest (Ratziu et al., 2006);
Fibrometer (Cales et al., 2009);Fibrometer (Cales et al., 2009);
FLI (Bedogni et al., 2006);FLI (Bedogni et al., 2006);
балльная оценка стеатоза или SteatoTest (Poynard et al., 2005).steatosis score or SteatoTest (Poynard et al., 2005).
Таким образом, авторы настоящего изобретения оценивали балльную оценку NASH по изобретению с использованием ряда этих уже известных способов.Thus, the inventors of the present invention evaluated the NASH score of the invention using a number of these already known methods.
Сравнение балльной оценки по различным моделям по настоящему изобретению и других балльных оценок и сравнение балльных оценок по различным моделям по настоящему изобретению относительно индивидуальных переменных представлены в табл. 8-12.A comparison of the scores for various models of the present invention and other scores and a comparison of scores for various models of the present invention with respect to individual variables are presented in Table. 8-12.
Данные, представленные в настоящем описании, свидетельствуют о существенном улучшении точности идентификации пациентов с NASH или потенциальных пациентов с NASH, определения активности, стадии или тяжести NASH. Этот вывод имеет исключительно важное значение и будет бесценным инструментом для улучшения эффективности лечения пациентов.The data presented herein demonstrate significant improvements in the accuracy of identifying patients with NASH or potential patients with NASH, determining the activity, stage or severity of NASH. This finding is extremely important and will be an invaluable tool for improving patient outcomes.
Таблица 2table 2
Выбранные и исключенные переменные при проверке на коллинеарность в случае пациента с риском, подлежащего лечению, соответствующего следующим показателям при биопсии печени: баллы стеа- 24 044836 тоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS (баллы активности NAFLD) >4 и стадия фиброза >2 (такая как стадия фиброза, равная 2, 3 или 4, в частности 2 или 3) при измерении в плазме.Selected and excluded variables when testing for collinearity in the case of an at-risk patient to be treated corresponding to the following liver biopsy scores: steatosis scores >1, hepatocyte ballooning scores >1, lobular inflammation scores >1, NAS (NAFLD activity scores ) >4 and fibrosis stage >2 (such as a fibrosis stage of 2, 3 or 4, particularly 2 or 3) when measured in plasma.
Таблица 3Table 3
Выбранные и исключенные переменные при проверке на коллинеарность в случае пациента с риском, подлежащего лечению, соответствующего следующим показателям при биопсии печени: баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS (баллы активности NAFLD) >4 и стадия фиброза >2 (такая как стадия фиброза, равная 2, 3 или 4, в частности 2 или 3) при измерении в сыворотках (мкРНК в копиях/мкл log 10).Selected and excluded variables when testing for collinearity in the case of an at-risk patient eligible for treatment corresponding to the following liver biopsy scores: steatosis scores >1, hepatocyte ballooning scores >1, lobular inflammation scores >1, NAS (NAFLD activity scores) >4, and fibrosis stage >2 (such as fibrosis stage 2, 3 or 4, particularly 2 or 3) when measured in sera (miRNA in copies/μl log 10).
Таблица 4Table 4
- 25 044836- 25 044836
Выбранные и исключенные переменные при проверке на коллинеарность в случае пациента с риском, подлежащего лечению, соответствующего следующим показателям при биопсии печени: баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS (баллы активности NAFLD) >4 и стадия фиброза >2 (такая как стадия фиброза, равная 2, 3 или 4, в частности 2 или 3) при измерении в сыворотках (мкРНК в Cq).Selected and excluded variables when testing for collinearity in the case of an at-risk patient eligible for treatment corresponding to the following liver biopsy scores: steatosis scores >1, hepatocyte ballooning scores >1, lobular inflammation scores >1, NAS (NAFLD activity scores) >4, and fibrosis stage >2 (such as fibrosis stage 2, 3 or 4, particularly 2 or 3) when measured in sera (miRNA in Cq).
Таблица 5Table 5
Значимые выбранные и исключенные переменные при проверке на коллинеарность в случае пациента с риском, подлежащего лечению, соответствующего следующим показателям при биопсии печени: баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS (баллы активности NAFLD) >4 и стадия фиброза >2 (такая как стадия фиброза, равная 2, 3 или 4, в частности 2 или 3) при измерении в сыворотках (мкРНК в копиях/мкл и loglO-трансформация).Significant selected and excluded variables when testing for collinearity in the case of an at-risk patient to be treated corresponding to the following liver biopsy scores: steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS (NAFLD activity score) >4 and fibrosis stage >2 (such as a fibrosis stage of 2, 3 or 4, particularly 2 or 3) when measured in sera (miRNA in copies/μl and loglO-transformation).
Таблица 6Table 6
- 26 044836- 26 044836
Выбранные и исключенные переменные при проверке на коллинеарность в случае пациента с риском, подлежащего лечению, соответствующего следующим показателям при биопсии печени: баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS (баллы активности NAFLD) >4 и стадия фиброза >1 (такая как стадия фиброза, равная 2, 3 или 4, в частности 2 или 3) при измерении в плазме.Selected and excluded variables when testing for collinearity in the case of an at-risk patient eligible for treatment corresponding to the following liver biopsy scores: steatosis scores >1, hepatocyte ballooning scores >1, lobular inflammation scores >1, NAS (NAFLD activity scores) >4, and fibrosis stage >1 (such as fibrosis stage 2, 3 or 4, particularly 2 or 3) when measured in plasma.
Таблица 7Table 7
Выбранные и исключенные переменные при проверке на коллинеарность в случае пациента с риском, подлежащего лечению, соответствующего следующим показателям при биопсии печени: баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS (баллы активности NAFLD) >4 и стадия фиброза >1 (такая как стадия фиброза, равная 2, 3 или 4, в частности, 2 или 3) при измерении в плазме.Selected and excluded variables when testing for collinearity in the case of an at-risk patient eligible for treatment corresponding to the following liver biopsy scores: steatosis scores >1, hepatocyte ballooning scores >1, lobular inflammation scores >1, NAS (NAFLD activity scores) >4, and fibrosis stage >1 (such as fibrosis stage 2, 3 or 4, in particular 2 or 3) when measured in plasma.
Таблица 8Table 8
Сравнение балльных оценок в моделях по настоящему изобретению и других известных моделейComparison of scores in models of the present invention and other known models
- 27 044836- 27 044836
Модели (мкРНК, измеряемой в сыворотке в копиях/мкл log10) в случае пациента с риском, подлежащего лечению, соответствующего следующим показателям при биопсии печени: баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS (баллы активности NAFLD) >4 и стадия фиброза >2 (такая как стадия фиброза, равная 2, 3 или 4, в частности 2 или 3.Models (miRNA measured in serum in copies/µl log10) in the case of an at-risk patient to be treated corresponding to the following liver biopsy scores: steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS (activity score NAFLD) >4 and fibrosis stage >2 (such as a fibrosis stage of 2, 3 or 4, in particular 2 or 3.
Обе модели, полученные из бутстреп-модели и медианной модели по настоящему изобретению, имели лучшую AUC, чем другие известные модели. Различия четко свидетельствуют о важности настоящего изобретения.Both models obtained from the bootstrap model and the median model of the present invention had better AUC than other known models. The differences clearly demonstrate the importance of the present invention.
Таблица 9Table 9
Сравнение балльной оценки с использованием бутстреп-модели по настоящему изобретению и других балльных оценокComparison of the score using the bootstrap model of the present invention and other scores
Модели (мкРНК, измеренная в сыворотке в копиях/мкл log10) в случае пациента с риском, подлежащего лечению, соответствующего следующим показателям при биопсии печени: баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS (баллы активности NAFLD) >4 и стадия фиброза >2 (такая как стадия фиброза, равная 2, 3 или 4, в частности 2 или 3).Models (miRNA measured in serum in copies/µl log10) of an at-risk patient eligible for treatment corresponding to the following liver biopsy scores: steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS (activity score NAFLD) >4 and fibrosis stage >2 (such as a fibrosis stage of 2, 3 or 4, in particular 2 or 3).
В случае всех бутстреп-моделей, представленных в настоящем описании и соответствующих пациенту с риском, как описано выше, значения AUC были статистически лучше, чем значения AUC, полученные с использованием других моделей.For all bootstrap models presented here and matched to the patient at risk as described above, the AUC values were statistically better than the AUC values obtained using the other models.
Значения, полученные с использованием полученной медианной модели, схожи со значениями, полученными с использованием бутстреп-модель, что означает, что обе модели обоснованы.The values obtained using the derived median model are similar to those obtained using the bootstrap model, which means that both models are reasonable.
Продемонстрирована важность настоящего изобретения.The importance of the present invention is demonstrated.
- 28 044836- 28 044836
Таблица 10Table 10
Сравнение балльной оценки с использованием полученных медианных моделей по настоящему изобретению с другими балльными оценкамиComparison of the score using the derived median models of the present invention with other scores
Модели (мкРНК, измеренная в сыворотке в копиях/мкл log10) в случае пациента в случае пациента с риском, подлежащего лечению, соответствующего следующим показателям при биопсии печени: баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS (баллы активности NAFLD) >4 и стадия фиброза >2 (такая как стадия фиброза, равная 2, 3 или 4, в частности 2 или 3).Models (miRNA measured in serum in copies/µl log10) per patient per patient at risk, eligible for treatment, corresponding to the following liver biopsy scores: steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS (NAFLD activity scores) >4 and fibrosis stage >2 (such as a fibrosis stage of 2, 3 or 4, particularly 2 or 3).
В случае всех полученных медианных моделей, представленных в настоящем описании и соответствующих пациенту с риском, как описано выше, значения AUC были статистически лучше, чем значения AUC, полученные с использованием других моделей.For all derived median models presented herein and corresponding to the patient at risk as described above, the AUC values were statistically better than the AUC values obtained using the other models.
Значения, полученные с использованием бутстреп-модели, схожи со значениями, полученными с использованием полученной медианной модели, что означает, что обе модели обоснованы.The values obtained using the bootstrap model are similar to those obtained using the derived median model, which means that both models are reasonable.
Продемонстрирована важность настоящего изобретения.The importance of the present invention is demonstrated.
Таблица 11Table 11
Сравнение балльных оценок с использованием бутстреп-модели по настоящему изобретению с отдельными переменнымиComparison of scores using the bootstrap model of the present invention with individual variables
Модели (мкРНК, измеренная в сыворотке в копиях/мкл log10) в случае пациента в случае пациента с риском, подлежащего лечению, соответствующего следующим показателям при биопсии печени: баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS (баллы активности NAFLD) >4 и стадия фиброза >2 (такая как стадия фиброза, равная 2, 3 или 4, в частности 2 или 3).Models (miRNA measured in serum in copies/µl log10) per patient per patient at risk, eligible for treatment, corresponding to the following liver biopsy scores: steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS (NAFLD activity scores) >4 and fibrosis stage >2 (such as a fibrosis stage of 2, 3 or 4, particularly 2 or 3).
Значение AUC в случае бутстреп-модели, соответствующей пациенту с риском, как описано ранее, в которой комбинируют несколько переменных, было статистически лучше, чем значение AUC, полученное в случае отдельных переменных.The AUC value for the at-risk patient-matched bootstrap model as described previously, in which multiple variables were combined, was statistically better than the AUC value obtained for the individual variables.
Таким образом, комбинация нескольких переменных посредством логистической функции по настоящему изобретению лучше и точнее исследование переменных по отдельности. Продемонстрирована важность настоящего изобретения.Thus, the combination of multiple variables through the logistic function of the present invention is better and more accurate than examining the variables individually. The importance of the present invention is demonstrated.
Таблица 12Table 12
Сравнение балльных оценок с использованием полученной медианной модели по настоящему изобретению с отдельными переменнымиComparison of scores using the derived median model of the present invention with individual variables
Модели (мкРНК, измеренная в сыворотке в копиях/мкл log10) в случае пациента в случае пациента с риском, подлежащего лечению, соответствующего следующим показателям при биопсии печени: баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NASModels (miRNA measured in serum in copies/µl log10) per patient per patient at risk, eligible for treatment, corresponding to the following liver biopsy scores: steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS
--
Claims (9)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP16163048.8 | 2016-03-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA044836B1 true EA044836B1 (en) | 2023-10-05 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7274523B2 (en) | Methods for diagnosing and evaluating non-alcoholic steatohepatitis | |
| De Gonzalo-Calvo et al. | Circulating microRNA profiles predict the severity of COVID-19 in hospitalized patients | |
| AU2017242818B2 (en) | Non-invasive diagnostic of non-alcoholic steatohepatitis | |
| US20150018238A1 (en) | Multi-biomarker-based outcome risk stratification model for pediatric septic shock | |
| US20200248261A1 (en) | Non-invasive diagnostic of non-alcoholic fatty liver diseases, non-alcoholic steatohepatitis and/or liver fibrosis | |
| US20200216901A1 (en) | Non-invasive diagnostic of non-alcoholic fatty liver diseases, non-alcoholic steatohepatitis and/or liver fibrosis | |
| Wan et al. | Plasma long noncoding RNA IL‐7R as a prognostic biomarker for clinical outcomes in patients with acute respiratory distress syndrome | |
| Kim et al. | High fibrosis-4 index is related with worse clinical outcome in patients with coronavirus disease 2019 and diabetes mellitus: a multicenter observational study | |
| US10815526B2 (en) | Temporal pediatric sepsis biomarker risk model | |
| TWI735470B (en) | Method for determining diabetic nephropathy and the use of biomarkers in this method | |
| EA044836B1 (en) | NON-INVASIVE DIAGNOSTICS OF NON-ALCOHOLIC STEATHOEPATITIS | |
| Okuyan et al. | Association of miR-21-5p with routine biochemical markers and inflammatory cytokines in hemodialysis patients | |
| Jain et al. | Role of biomarkers in health care | |
| EA043166B1 (en) | DIAGNOSTICS AND ASSESSMENT OF NON-ALCOHOLIC STEATOHEPATITIS | |
| Saleh et al. | ASSESSMENT OF PROVOCATIVE INFLAMMATORY ROLE OF TRISTETRAPROLIN AND TUMOR NECROSIS FACTOR ALPHA GENES EXPRESSION IN CHRONIC KIDNEY DISEASE. | |
| TW201625945A (en) | Method for predicting hepatocellular carcinoma occurrence in liver cirrhotic patients |