EA035031B1

EA035031B1 - Биологически активное производное аллоферона-1

Info

Publication number: EA035031B1
Application number: EA201401291A
Authority: EA
Inventors: Игорь БЕККЕР; Мариола Кучер; Элизабет Чарниевска; Борис Алексеевич НИКОНОВ; Су Ин КИМ
Original assignee: Индивидуальный Предприниматель Беккер Герман Петрович
Priority date: 2013-09-10
Filing date: 2014-12-19
Publication date: 2020-04-20
Also published as: EA201401291A3; EA201401291A2; RU2013141484A; RU2576830C2

Abstract

Изобретение относится к белкам и биологически активным пептидам с иммуномодулирующей, противораковой и противовирусной активностью, а также лекарственным средствам на их основе. Замена в молекуле Аллоферона-1 гистидина на фенилаланин позволяет получить производные, содержащие заместители в ароматическом кольце. Заменой гистидина в положении 1 на фенилаланин, содержащий аминогруппу в пара-положении ароматического звена, получено производное Аллоферона-1: Phe(p-NH)-Gly-Val-Ser-Gly-His-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly. Полученный пептид стимулирует индукцию интерлейкина-18, интерферон-гамма, подавляет вирусы гриппа А и В и, следовательно, обладает иммуномодулирующей, противораковой и противовирусной активностью. Указанное производное Ааллоферона-1 может быть использовано для создания лекарственных средств.

Description

Изобретение относится к белкам и биологически активным пептидам с иммуномодулирующей и противовирусной активностью.

Известна группа противовирусных пептидов, выделенных из насекомых с общей формулой XpHisGly-X₂-His-Gly-Val-X₃, или их фармацевтически приемлемые соли, или эфиры, или амиды, где Xi отсутствует либо содержит не менее 1 аминокислоты; Х₂ содержит не менее 1 аминокислоты либо представляет собой пептидную связь; Х₃ отсутствует либо содержит не менее 1 аминокислоты, причем указанные аминокислоты выбраны из групп: алифатической, ароматической или гетероциклической (патент РФ № 2172322, МПК C07K 7/06, C07K 7/08, A61K 38/08, A61K 38/10, A61P 37/02, опубл. 20.08.2001 г.).

На основе одного из пептидов этой группы Аллоферона-1, имеющего структуру His-Gly-Val-SerGly-His-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly, был разработан лекарственный препарат Аллокин-альфа лиофилизат для приготовления раствора для подкожного введения, который выпускается с 2003 г. в качестве лекарственного средства для лечения хронического рецидивирующего герпеса 1 и 2 типа, острого гепатита В и папилломовирусных инфекций.

Противовирусная активность Аллоферона-1 обусловлена многими факторами.

Так установлено, что он обладает прямым противовирусным действием (1). Однако основным механизмом биологической активности Аллоферона-1 можно считать индукцию цитокинов, в том числе интерферона-альфа (2) и интерлейкина-18 (3).

Семейство пептидов, описываемое общей формулой

X1 -His-Gly-X2-His-Gly- Val-Хз включает большое число молекул, построенных на основе природных аминокислот, обладающих широким спектром биологических свойств.

Одной из возможностей изменения молекул и соответственно их биологической активности является введение в состав пептида химически модифицированных аминокислот. Наиболее простым объектом для модификации является введение в молекулу Аллоферона-1 фенилаланина, содержащего заместители в ароматическом ядре.

Технической задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является создание новых производных пептида Аллоферона-1, обладающих повышенной биологической активностью, которые могут быть использованы для создания лекарственных препаратов для лечения и профилактики вирусных и микробных инфекций, а также опухолей.

Для решения поставленной технической задачи путем замены в молекуле Аллоферона-1 гистидина в положении 1 на фенилаланин, имеющий в пара-положении нуклеофильный заместитель, получен пептид

Phe(p-NH2)-Gly-Val-Ser-Gly-His-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly

Рке(р-ЛН2)-Аллоферон

Технический результат состоит в том, что полученный пептид обладает высокой иммуномодулирующей, противораковой и противовирусной активностью, что будет подтверждено примерами.

Синтез пептида произведен по стандартной Fmoc-процедуре твердофазным способом. Удаление защиты производилось 20%-ным раствором пиперидина в диметилформамиде. Реакцию сочетания проводили с помощью HBTU в присутствии HOBt и NMM в течение 2 ч при комнатной температуре. Финишное отделение пептида проводили с помощью TFA, EDT и воды (95:2,5:2,5) в течение 2 ч при комнатной температуре.

Сырой пептид промывали холодным диэтиловым эфиром, растворяли в воде и лиофилизовали. Очистка пептида производилась методом HPLC с использованием колонок TOSOH Bioscience C18 (21,5x300 мм) (Tosoh, Japan) с UV-детектором 210/240 нм. Процесс проводили в градиенте водаацетонитрил, содержащий 0,1% TFA при скорости потока 7 мл/мин. Очищенный лиофилизованный пептид имел чистоту более 95%.

Финишная стадия получения пептида - лиофилизация из раствора в 50% уксусной кислоте.

Химическая идентификация пептида была подтверждена методом масс-спектрометрии с использованием масс-спектрометра типа Microflex LT MALDI-TOF (Bruker Daltonics GmbH).

Возможность достижения цели изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Изучение влияния Phe(p-NH2)-Аллоферона на индукцию IL-18.

Индукция осуществлялась путем введения подкожно Phe(p-NH2)-Аллоферона и для сравнения Аллоферона-1 однократно в дозе 2 мг на 1 кг веса лабораторных животных. Для эксперимента использовались мыши линии BALB/C, самки, массой 16-22 г, возраста 14 недель, полученные из питомника лабораторных животных и прошедшие необходимый карантин. Температура окружающей среды была 22±2°C, относительная влажность 60±5%, содержание аммиака составляло 10 ppm, углекислого газа - не превышало 0,15% к объему воздуха, кратность воздухообмена составляла 10-15 крат/ч при скорости движения воздуха - 0,3 м/с. Фильтрование воздуха обеспечивали с помощью фильтров грубой фильтрации. Кормили мышей гранулированным комбикормом, изготовленным в соответствии со стандартами приготовления кормов для лабораторных животных. Корм предварительно стерилизовали в автоклаве с использованием вакуума при 121°C и 1,2 атм в течение 20 мин. Кормление проводили 1 раз в сутки из расчета 8,0 г

- 1 035031 на одну мышь, после чистки клеток. Питьевую воду заливали в бутылки-поилки вместимостью 200 мл и стерилизовали при 121°C и 1,2 атм в течение 45 мин, пробки автоклавировали отдельно. Поилки ежедневно заменяли на новые. Определялся уровень интерлейкина-18 (IL-18) в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа с использованием специфических антител. Количество IL-18 в сыворотке определяли на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 16, 24, 32, 40, 48, 56 ч после введения препаратов.

Параллельно изучалось фоновое количество IL-18, присутствующее в сыворотке крови исследуемых животных. Для этой цели использовалось 14 мышей в качестве контрольной группы, которые получали подкожную инъекцию физиологического раствора. В опытной группе использовалось 84 животных. В случае контрольной группы доверительный интервал рассчитывался по измерениям разведения одного и того же образца. В опытной группе доверительный интервал вычислялся относительно трех образцов от трех животных на каждую измеряемую точку.

Через 3-4 ч после введения у пептидов наблюдается небольшой достоверный пик увеличения концентрации IL-18. Через 24 ч наблюдается второй пик значительного увеличения содержания IL-18 в сыворотке крови опытной группы животных, который длиться около 20 ч. Наличие первого пика на 3-4 ч возможно обусловлено не специфической индукцией. Значительное повышение IL-18 на 2-3-й день эксперимента свидетельствует о специфической способности препаратов индуцировать изучаемый цитокин. Результаты испытания препарата приведены в табл. 1.

Таблица 1

Динамика концентрации ИЛ-18 (пг/мл) в крови мышей после введения Phe(p-NH2)-Аллоферона

Интервал между наблюдения -ми, часы

Контроль

Аллоферон-1

Phe(p-NH2)Аллоферон

216±15

210±18

208±20

213±17

223±12

203±29 211±21

213±17

218±12

212±22

220±15

200±30

204±28

213±17

218±12 216±18 245±15 250±16 220±25 212±30 213±17 224±12 229±11 240±15 362±22 354±14

242±18 291±19

230±17 236±12 255±13 257±14 244±16 227±13 229±11 244±15 252±19 305±25 395±18 373±19 231±28 475±25

Введение как Phe(p-NH2)-Аллоферона, так и Аллоферона-1 вызвало индукцию ИЛ-18, которая длилась до 3 суток. Максимальная концентрация ИЛ-18 достигается спустя 32 ч после однократного введения пептида. Характер индукции - интенсивность и временной диапазон - для пептидов одинакова. При этом Phe(p-NH2)-Аллоферон показывают более высокий уровень индукции интерлейкина-18, чем Аллоферон-1.

Максимальный уровень интерлейкина-18 был зафиксирован для Phe(p-NH2)-Аллоферона через 32 ч (395 пг/мл). Фоновый уровень в среднем в группе контрольных животных составил 200 пг/мл.

Пример 2. Изучение интерфероногенности Phe(p-NH2)-Аллоферона.

Активность определялась путем введения Phe(p-NH2)-Аллоферона и Аллоферона-1 подкожно однократно в дозе 1 мг на 1 кг веса лабораторных животных. Для эксперимента использовались мыши линии BALB/C, самки, массой 16-22 г, возраста 18 недель, содержавшиеся в соответствии с протоколом, изложенным выше в примере 1. Определялся уровень интерферон-гамма в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа с использованием специфических антител. Количество интерферона в сыворотке определяли на 3, 6, 12, 16, 24, 32, 40 и 48 ч после введения препарата.

Параллельно изучалось фоновое количество интерферон-гамма, присутствующее в сыворотке исследуемых животных. Для этой цели использовалось 8 мышей в качестве контрольной группы, которые получали подкожную инъекцию физиологического раствора. Среднее значение по контрольной группе на 5% уровне значимости составило 29±8 пг/мл исследуемой сыворотки. В каждой опытной группе также использовались по 8 мышей, которые получали подкожную инъекцию в дозе 25 мкг с изучаемым Phe(p-NH2)-Аллофероном, а также Аллофероном-1. Результаты испытания препаратов представлены в табл. 2.

- 2 035031

Таблица 2

Изучение динамики индукции интерферон-гамма

Интервал между наблюдениями, часы	Контроль	Аллоферон-1	Phe(p-NH2)Аллоферон
3	30+7	91+16	101+17
6	28+5	88+12	99+13
12	29+8	62+5	63+6
16	31+6	46+7	40+12
24	28+9	38+6	36+9
32	28+12	28+7	34+14
40	30+6	22+7	22+10
48	29+13	29+12	25+8

Полученные данные свидетельствуют о том, что Phe(p-NH2)-Аллоферон вызывает индукцию интерферон-гамма, превышающую уровень индукции Аллоферона-1.

На основании вышеизложенного можно утверждать, что разработанный пептид обладает всеми заявленными свойствами.

Пример 3. Изучение влияния Phe(p-NH2)-Аллоферона на резистентность мышей к вирусу гриппа А.

Антивирусное действие пептида изучали на модели летальной вирусной инфекции мышей вирусом гриппа А. Суспензию вируса вводили интраназально в дозе, соответствующей 10 LD₅₀. Аллоферон-1 и Phe(p-NH2)-Аллоферон в 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида вводили внутрибрюшинно за одни сутки до инокуляции вируса, затем через 1, 2, 4, 6 и 8 дней после инокуляции. Препараты испытывали в дозе 25 мкг. В контроле мышам вводили равный объем растворителя. Критерием эффективности служила выживаемость животных через 10 суток после инфицирования вирусом. Для проведения эксперимента были отобраны половозрелые белые мыши, самцы, весом 20,0-22,0 г, полученные из питомника лабораторных животных и прошедшие необходимый карантин. Содержание мышей осуществлялось по протоколу, изложенному выше в примере 1. В эксперименте были использованы 60 мышей.

Введение Phe(p-NH2)-Аллоферона и Аллоферона-1 инфицированным животным вызывало дозозависимый протекторный эффект (табл. 3). Препараты в дозе 25 мкг вызывали значительное увеличение числа выживших в течение срока наблюдения животных. Эффект данной дозы высокодостоверен.

Таблица 3

Изучение влияния Phe(p-NH2)-Аллоферона на резистентность мышей к вирусу гриппа А

Препарат	Доза, мкг	К-во ЖИВОТНЫХ	Смертность через 10 суток после введения вируса
			N	%
Контроль	-	20	14	70
Аллоферон-1	25	20	5	25**
РНе(р-МН2)-Аллоферон	25	20	1	5***

**Р<0,01.

***Р<0,001.

Таким образом, результаты примера 3 свидетельствуют о том, что Phe(p-NH2)-Аллоферон в дозе 25 мкг оказывает выраженное антивирусное действие на мышей, инфицированных вирусом гриппа А, превышающее антивирусное действие Аллоферона-1.

Пример 4. Изучение влияния Phe(p-NH2)-Аллоферона на резистентность мышей к вирусу гриппа В.

Исследование влияния Phe(p-NH2)-Аллоферона на устойчивость мышей к вирусу гриппа В проводилось на 120 мышах. Для проведения эксперимента были отобраны половозрелые белые мыши, самцы, весом 20,0-22,0 г, полученные из питомника лабораторных животных и прошедшие необходимый карантин. Содержание мышей осуществлялось по протоколу, изложенному выше в примере 1. Мышей инфицировали штаммом LEE 1/40 вируса гриппа В, взятым в инфекционной дозе, соответствующих 30 LD₅₀. В качестве позитивного контроля использовали специфический антивирусный препарат Рибавирин.

Аллоферон-1 и Phe(p-NH2)-Аллоферон вводили внутрибрюшинно в дозе 25 мкг за 1 сутки до инфицирования вирусом, затем через 1, 2, 4, 6 и 8 суток.

Результаты изложены в табл. 4.

- 3 035031

Таблица 4 Изучение влияния пептидов на резистентность мышей к вирусу гриппа В

Препарат	Доза вируса (ЛД50)	К-во животных	Смертность через 10 суток после введения вируса
			N	%
Контроль	30	20	16	80
Рибавирин	30	20	12	60
Аллоферон-1	30	20	6	30**
Phe(p-NH2)- Аллоферон	30	20	1	5***

**Р<0,01. ***Р<0,001.

В контроле интраназальное введение вируса вызвало тяжелую пневмонию с высокой летальностью (80%). На этом фоне Рибавирин при высокой инфекционной нагрузке (30 LD₅₀) в условиях данного эксперимента оказался малоэффективным. В то же время Phe(p-NH2)-Аллоферон оказал выраженное протекторное действие, превышающее антивирусное действие Аллоферон-1.

Таким образом, результаты примера 4 свидетельствуют о том, что Phe(p-NH2)-Аллоферон в дозе 25 мкг оказывает выраженное антивирусное действие на мышей, инфицированных вирусом гриппа В, существенно превышающее защитный эффект Рибавирина, хорошо зарекомендовавшего себя антивирусного средства, а также Аллоферона-1 и может служить основой для создания новых антивирусных препаратов.

<110>

<120>

Перечень последовательностей

Общество с ограниченной ответственностью «ЮНИТ МФ » Obshchestvo S Ogranichennoy Otvetstvennostyu «UNIT MF»

Биологически активное производное Аллоферона-1

Biologically active derivates of Alloferon-l

130>

RU2013141484

RU 2013141484

2013-09-10

160>

170>

Patentin version 3.5 <210>

<211>

<212>

белок artificial sequence искусственная последовательность <220>

<223>

Peptide 1

Пептид 1 <220>

<221>

<222>

<223>

misk feature

Xaa can be phenylalanine having a amino group in para-position

Xaa может быть фенилаланином, имеющим амино-группу в пара-положении

400>

Xaa Gly Val Ser Gly His Gly Gln His Gly Val His Gly

5 10

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Производное Аллоферона-1 с аминокислотной последовательностью Phe(p-NH2)-Gly-Val-SerGly-His-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly, обладающее высокой иммуномодулирующей, противораковой и противовирусной активностью.
2. Иммуномодулирующая, противораковая и противовирусная фармацевтическая композиция, содержащая производное Аллоферона-1 по п.1 или его фармацевтически приемлемую соль в сочетании со вспомогательными веществами.