CN111303245B - 一种抗合胞病毒膜融合抑制剂 - Google Patents

一种抗合胞病毒膜融合抑制剂 Download PDF

Info

Publication number
CN111303245B
CN111303245B CN202010108065.3A CN202010108065A CN111303245B CN 111303245 B CN111303245 B CN 111303245B CN 202010108065 A CN202010108065 A CN 202010108065A CN 111303245 B CN111303245 B CN 111303245B
Authority
CN
China
Prior art keywords
lys
glu
fmoc
leu
ile
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010108065.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111303245A (zh
Inventor
周述靓
王鹏
邓岚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chengdu Aoda Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Chengdu Aoda Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chengdu Aoda Biotechnology Co ltd filed Critical Chengdu Aoda Biotechnology Co ltd
Priority to CN202010108065.3A priority Critical patent/CN111303245B/zh
Publication of CN111303245A publication Critical patent/CN111303245A/zh
Priority to PCT/CN2021/076437 priority patent/WO2021164677A1/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111303245B publication Critical patent/CN111303245B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及医药合成领域，公开了一种抗合胞病毒(RSV)膜融合抑制剂。本发明所述抗合胞病毒膜融合抑制剂，用于制备治疗疾病的药物组合物，所述药物组合物在制备治疗合胞病毒肺炎药物中的用途。

Description

一种抗合胞病毒膜融合抑制剂
技术领域
本发明涉及一种抗合胞病毒膜融合抑制剂及其用途。
背景技术
人呼吸道合胞病毒(RSV)广泛分布于世界各地，是引起下呼吸道感染的重要病毒病原。RSV感染可导致全球婴幼儿、老年人及免疫缺陷人群高住院率和死亡率。出生一年内约有70％婴儿被RSV感染，绝大多数儿童在出生后的两年内都会受到感染，因急性下呼吸道感染而死亡的婴幼儿中有1/3是由RSV感染所致。世界卫生组织(WHO)报告认为，每年全球范围内约有6400万儿童感染RSV，近350万儿童因RSV感染较重而入院，是流感的16倍，其中每年约20万5岁以下的儿童因感染RSV病毒而死亡，是世界范围儿童住院和死亡的一大因素。在美国，20％～25％的婴幼儿肺炎和50％～75％的毛细支气管炎由RSV引起。一项来自韩国的研究数据显示：18岁以上RSV感染患者中20天全因死亡率高于流感(18.4％vs.6.7％)；与季节性流感组相比，RSV感染导致的死亡风险显著较高。在北京，48％的病毒性肺炎和58％的毛细支气管炎系由RSV引起(1980～1984)；在广州，小儿肺炎及毛细支气管炎的31.4％由RSV引起(1973～1986)。WHO的数据还显示，世界范围内每年RSV感染的老年患者近3000万例，至少有200万例为重症住院病人。有统计资料显示，65岁以上老人死亡案例的原因中RSV感染占了20％。一项最新流行病学调查结果显示，仅在英国18岁以上成人中每个RSV流行季节约有487,247人次需要医疗救治、17,799人次的住院事件以及发生8,482例死亡，其中65岁患者分别约占上述36％的医疗救治、79％的住院以及93％的死亡事件。中国目前60岁以上人口已超过2.4亿，都属于RSV感染的高危人群，家庭和社会所面临的负担巨大。由于全球尚无有效的预防RSV感染的疫苗和治疗RSV感染的有效药物，为全球各国的卫生保健***带来了极大的负担。
早在1996年，美国公司Trimeris根据RSV的HRB序列设计了一组抗RSV多肽膜融合抑制剂，在细胞模型具有较强的抗RSV活性，其中最为突出的是含有35个氨基酸残基的T118，后来的研究相继开发了一些多肽类RSV融合抑制剂，但抗RSV活性很难得到明显的提高，尤其是相对较短的多肽，往往具有显著降低的活性，目前尚没见多肽类RSV融合抑制剂进入临床试验的报道。
发明内容
本发明提供了一种新的抗合胞病毒膜融合抑制剂及其用途。
为实现上述目的，本发明首先提供了一种结构I所示的化合物，该化合物所成的可药用的盐、溶剂化物、螯合物或非共价复合物，基于该化合物基础上的药物前体，或上述形式的任意混合物。
Ac-AA1-Glu-AA3-Val-Asn-Lys-Lys-Ile-Glu-AA10-Ser-Leu-
Lys-AA14-Ile-Glu-AA17-Ser-Asp-Lys-AA21-Leu-Glu-AA24-
Val-Asn-Lys-AA28-AA29(R1)-AA30(R2)-AA31
结构式I
结构I中的AA1为Ile,或为Leu；
结构I中的AA3为Gln,或为Glu；
结构I中的AA10为Gln,或为Glu；
结构I中的AA14为Phe,或为Lys；
结构I中的AA17为Lys,或为Glu；
结构I中的AA21为Leu,或为Lys；
结构I中的AA24为Asn,或为Glu；
结构I中的AA28为Gly,或为Lys；
结构I中的AA29为Lys,或为Dap，或为Orn，或为Dab，或为Dah；
结构I中的AA30为Cys，或为不存在；
结构I中的AA30为Cys时，R1为H；
结构I中的AA30为不存在时，R2为不存在；
结构I中的AA31为NH2，或为OH。
结构I中的R1为丁二酸胆固醇单酯，或为2-胆固醇乙酸，或为2-胆固醇丙酸，或为2-胆固醇丁酸，或为2-胆固醇异丁酸，或为2-胆固醇戊酸，或为2-胆固醇异戊酸，或为2-胆固醇己酸，HO2C(CH2)n1CO-(γGlu)n2-(PEGn3(CH2)n4CO)n5-,或为CH3(CH2)n1CO-(γGlu)n2-，或为不存在；
其中：n1为10至20的整数；
n2为1至5的整数；
n3为1至30的整数；
n4为1至5的整数；
n5为1至5的整数。
结构I中的R2为乙酸胆固醇酯，或为丙酸胆固醇酯，或为丁酸胆固醇酯，或为异丁酸胆固醇酯，或为戊酸胆固醇酯，或为异戊酸胆固醇酯，或为己酸胆固醇酯，或为不存在。
本发明还提供了包括根据本发明化合物的药物组合物，以及提供了本发明化合物的药物组合物用于制备治疗疾病的药物用途。
作为优选，所述药物组合物在制备治疗合胞病毒肺炎药物中的用途。
本发明所涉及到的更多内容在以下有详细描述，或者有些也可以在本发明的实施例中体会。
除非另有所指，本文中所用来表示不同成分的数量、反应条件，在任意情况下都可解读为“大致的”、“大约的”意思。相应的，除有明确的特指外，在下述以及权利要求中所引用的数字参数都是大致的参数，在各自的实验条件下由于标准误差的不同，有可能会得到不同的数字参数。
本文中，当一个化合物的化学结构式和化学名称有分歧或疑义时，以化学结构式确切定义此化合物。本文所描述的化合物有可能含有一个或多个手性中心，和/或者双键以及诸如此类的结构，也可能存在立体异构体，包括双键的异构体(比如几何异构体)、旋光对映异构体或者非对映异构体。相应的，在本文描述范围内的任意化学结构，无论是部分或整体结构中含有上述类似结构，都包括了此化合物的所有可能的对映异构体和非对映异构体，其中也包括了单纯的任一种立体异构体(如单纯的几何异构体、单纯的对映异构体或者单纯的非对映异构体)以及这些异构体的任意一种混合物。这些消旋异构体和立体异构体的混合物由本领域技术人员利用不停的分离技术或手性分子合成的方法也可进一步被拆分成其组成成分的对映异构体或立体异构体。
结构式I的化合物包含了，但并不仅限于，这些化合物的光学异构体、消旋体和/或其他的混合物。上述情况下，其中单一的对映异构体或非对映异构体，如有旋光的异构体，可以用不对称合成的方法或消旋体拆分的方法获得。消旋体的拆分可用不同的方法实现，如常规的用助拆分的试剂重结晶，或用色谱方法。另外，结构式I的化合物也包含了带双键的顺式和/或反式的异构体。
本发明所述化合物包含但不限于，结构式I所示化合物以及他们所有的在药学上可用的不同形式。这些化合物的药学上可用的不同形式包括各种可药用的盐、溶剂化物、络合物、螯合物、非共价的复合物、基于上述物质基础上的药物前体和上述这些形式的任意混合物。
上述所述药物前体包括含在所述化合物内，如结构式I所示化合物的酯或者酰胺衍生物。
本发明提供的结构I所示的化合物性质稳定，是一种新型的抗合胞病毒膜融合抑制剂，可用于对合胞病毒肺炎的治疗。
具体实施方式
本发明公开了一种抗合胞病毒膜融合抑制剂及其用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进相关参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的的化合物和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明中涉及的英文缩写所对应的中文名称见下表所示：
英文缩写 中文名称 英文缩写 中文名称
Fmoc 9-芴甲氧羰基 OtBu 叔丁氧基
tBu 叔丁基 Boc 叔丁氧羰酰基
Trt 三苯甲基 Leu 亮氨酸
Ala 丙氨酸 Lys 赖氨酸
Asn 天冬酰胺 Phe 苯丙氨酸
Asp 天冬氨酸 Ser 丝氨酸
Cys 半胱氨酸 Val 缬氨酸
Gln 谷酰胺 Dab 2,4-二氨基丁酸
Glu 谷氨酸 Dah 2,7-二氨基庚酸
Gly 甘氨酸 Dap 2,3-二氨基丙酸
Ile 异亮氨酸 Orn 鸟氨酸
附图说明
1、图1对RSV-EGFP感染靶细胞的抑制活性
2、图2对RSV-Luc的抑制活性
3、图3对RSV感染小鼠体重变化的影响
4、图4RSV感染小鼠的动物活体成像检测
5、图5RSV感染小鼠鼻腔部位荧光信号的统计分析
6、图6RSV感染小鼠肺部荧光信号的统计分析
7、图7RT-qPCR法定量分析RSV感染小鼠肺部RSV的病毒水平
8、图8酶联免疫斑点法定量分析小鼠肺组织RSV复制能力
实施例1化合物1的制备
Ac-Ile-Glu-Gln-Val-Asn-Lys-Lys-Ile-Glu-Gln-Ser-Leu-Lys-
Phe-Ile-Glu-Lys-Ser-Asp-Lys-Leu-Leu-Glu-Asn-Val-Asn-Lys-
Gly-Lys-NH2
制备方法，包括：采用固相多肽合成法制备肽树脂，肽树脂再经酸解得到粗品，最后粗品经过纯化得到纯品；其中固相多肽合成法制备肽树脂的步骤为在载体树脂上通过固相偶联合成法依次接入下列序列中相对应的保护氨基酸或片段，制备肽树脂：
上述制备方法中，所述的Fmoc-保护氨基酸或保护氨基酸片段的用量为所投料树脂总摩尔数的1.2～6倍；优选为2.5～3.5倍。
上述制备方法中，所述的载体树脂取代值为0.2～1.0mmol/g树脂，优选的取代值为0.3～0.5mmol/g树脂。
作为本发明优选的方案，所述固相偶联合成法为：前一步反应得到的保护氨基酸-树脂脱去Fmoc保护基后再与下一个保护氨基酸偶联反应。所述的去Fmoc保护的脱保护时间为10～60分钟，优选的为15～25分钟。所述的偶联反应时间为60～300分钟，优选的为100～140分钟。
所述的偶联反应需添加缩合试剂，缩合试剂选自DIC(N,N-二异丙基碳二亚胺)、N,N-二环己基碳二亚胺，六氟磷酸苯并***-1-基-氧基三吡咯烷基磷、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐或O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯中的一种；优选的为N,N-二异丙基碳二亚胺。所述缩合试剂的摩尔用量为氨基树脂中氨基总摩尔数的1.2～6倍，优选为2.5～3.5倍。
所述的偶联反应需添加活化试剂，活化试剂选自1-羟基苯并***或N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑，优选的为1-羟基苯并***。活化试剂的用量为氨基树脂中氨基总摩尔数的1.2～6倍，优选的为2.5～3.5倍。
作为本发明优选的方案，所述的脱去Fmoc保护的试剂为PIP/DMF(哌啶/N,N-二甲基甲酰胺)混合溶液，混合溶液中含哌啶为10～30％(V)。去Fmoc保护试剂的用量为每克氨基树脂5～15mL，优选的为每克氨基树脂8～12mL。
优选的，肽树脂经酸解同时脱去树脂及侧链保护基得到粗品：
进一步优选的，所述肽树脂酸解时采用的酸解剂为三氟醋酸(TFA)、1,2-乙二硫醇(EDT)和水的混合溶剂，混合溶剂的体积配比为：TFA为80～95％，EDT为1～10％，余量为水。
更进一步优选的，混合溶剂的体积配比为：TFA为89～91％、EDT为4～6％，余量为水。最优的，混合溶剂的体积配比为：TFA为90％、EDT为5％，余量为水。
所述酸解剂用量为每克肽树脂需要4～15mL酸解剂；优选的，每克肽树脂需要7～10mL酸解剂。
使用酸解剂裂解的时间为室温条件下1～6小时，优选的为3～4小时。
进一步的，粗品经高效液相色谱纯化、冻干得到纯品，具体方法为：
取粗品，加水搅拌，调pH值至完全溶解，溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用；
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相***为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度***洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得纯化中间体浓缩液；
取纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；
采用高效液相色谱法进行换盐，流动相***为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min(可根据不同规格的色谱柱，调整相应的流速)；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到纯品醋酸水溶液，冷冻干燥后得纯品。
1、肽树脂的合成
使用Rink Amide BHHA树脂为载体树脂，通过去Fmoc保护和偶联反应，依次与下表所示的保护氨基酸偶联，制得肽树脂。本实施例使用的保护氨基酸相对应的保护氨基酸如下所示：
Figure GDA0002463405390000071
(1)接入主链第1个保护氨基酸
取0.03mol第1个保护氨基酸和0.03mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.03mol DIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液，备用。
取0.01mol的Rink amide MBHA树脂(取代值约0.4mmol/g)，采用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的树脂。
将活化后的第1个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂中，偶联反应60～300分钟，过滤洗涤，得含1个保护氨基酸的树脂。
(2)接入主链第2～30个保护氨基酸
采用上述接入主链第1个保护氨基酸同样方法，依次接入上述对应的第2～30个保护氨基酸，得肽树脂。
2、粗品的制备
取上述肽树脂，加入体积比为TFA︰水︰EDT＝95︰5︰5的裂解试剂(裂解试剂10mL/克树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水***沉淀，再用无水***洗沉淀3次，抽干得类白色粉末即为粗品。
3、纯品的制备
取上述粗品，加水搅拌溶解，溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用。采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相***为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，30mm*250mm的色谱柱流速为20mL/min，采用梯度***洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得纯化中间体浓缩液；
纯化中间体浓缩液用0.45μm滤膜滤过备用，采用高效液相色谱法进行换盐，流动相***为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，30mm*250mm的色谱柱流速为20mL/min(可根据不同规格的色谱柱，调整相应的流速)；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到纯品醋酸水溶液，冷冻干燥，得纯品7.6g，纯度为97.5％，总收率为22.1％。分子量为3442.2(100％M+H)。
实施例2化合物2的制备
Ac-Ile-Glu-Glu-Val-Asn-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Ser-Leu-Lys-
Lys-Ile-Glu-Glu-Ser-Asp-Lys-Lys-Leu-Glu-Glu-Val-Asn-Lys-
Lys-Lys-NH2
制备方法同实施例1，使用的保护氨基酸如下表:
接肽顺序n＝ 保护氨基酸
1 Fmoc-Lys(Boc)
2 Fmoc-Lys(Boc)
3 Fmoc-Lys(Boc)
4 Fmoc-Asn(Trt)
5 Fmoc-Val
6 Fmoc-Glu(OtBu)
7 Fmoc-Glu(OtBu)
8 Fmoc-Leu
9 Fmoc-Lys(Boc)
10 Fmoc-Lys(Boc)
11 Fmoc-Asp(OtBu)
12 Fmoc-Ser(tBu)
13 Fmoc-Glu(OtBu)
14 Fmoc-Glu(OtBu)
15 Fmoc-Ile
16 Fmoc-Lys(Boc)
17 Fmoc-Lys(Boc)
18 Fmoc-Leu
19 Fmoc-Ser(tBu)
20 Fmoc-Glu(OtBu)
21 Fmoc-Glu(OtBu)
22 Fmoc-Ile
23 Fmoc-Lys(Boc)
24 Fmoc-Lys(Boc)
25 Fmoc-Asn(Trt)
26 Fmoc-Val
27 Fmoc-Glu(OtBu)
28 Fmoc-Glu(OtBu)
29 Fmoc-Ile
30 Ac2O
得纯品8.6g，纯度为97.9％，总收率为24.4％。分子量为3527.1(100％M+H)。
实施例3化合物3的制备
Ac-Ile-Glu-Gln-Val-Asn-Lys-Lys-Ile-Glu-Gln-Ser-Leu-Lys-
Phe-Ile-Glu-Lys-Ser-Asp-Lys-Leu-Leu-Glu-Asn-Val-Asn-Lys-
Gly-Lys-Cys(乙酸胆固醇酯)-NH2
1、肽树脂的合成
方法同实施例1，使用的保护氨基酸如下表:
接肽顺序n＝ 保护氨基酸
1 Fmoc-Cys(Trt)
2 Fmoc-Lys(Boc)
3 Fmoc-Gly
4 Fmoc-Lys(Boc)
5 Fmoc-Asn(Trt)
6 Fmoc-Val
7 Fmoc-Asn(Trt)
8 Fmoc-Glu(OtBu)
9 Fmoc-Leu
10 Fmoc-Leu
11 Fmoc-Lys(Boc)
12 Fmoc-Asp(OtBu)
13 Fmoc-Ser(tBu)
14 Fmoc-Lys(Boc)
15 Fmoc-Glu(OtBu)
16 Fmoc-Ile
17 Fmoc-Phe
18 Fmoc-Lys(Boc)
19 Fmoc-Leu
20 Fmoc-Ser(tBu)
21 Fmoc-Gln(Trt)
22 Fmoc-Glu(OtBu)
23 Fmoc-Ile
24 Fmoc-Lys(Boc)
25 Fmoc-Lys(Boc)
26 Fmoc-Asn(Trt)
27 Fmoc-Val
28 Fmoc-Gln(Trt)
29 Fmoc-Glu(OtBu)
30 Fmoc-Ile
31 Ac2O
2、粗品的制备
取上述肽树脂，加入体积比为TFA︰水︰EDT＝95︰5︰5的裂解试剂(裂解试剂10mL/克树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水***沉淀，再用无水***洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，将其溶解于纯DMSO中，加入等摩尔溴乙酸胆固醇酯的三氟乙酸溶液，再加入纯二异丙基乙胺调节至碱性，用RP-HPLC跟踪反应，反应完毕后即得粗品溶液。
3、纯品的制备
方法同实施例1，
得纯品7.2g，纯度为98.6％，总收率为18.1％。分子量为3971.8(100％M+H)。
实施例4化合物4的制备
Ac-Leu-Glu-Gln-Val-Asn-Lys-Lys-Ile-Glu-Gln-Ser-Leu-Lys-
Phe-Ile-Glu-Lys-Ser-Asp-Lys-Leu-Leu-Glu-Asn-Val-Asn-Lys-
Gly-Lys-Cys(乙酸胆固醇酯)-NH2
制备方法同实施例3，使用的保护氨基酸如下表:
Figure GDA0002463405390000111
Figure GDA0002463405390000121
得纯品6.5g，纯度为96.9％，总收率为16.4％。分子量为3971.6(100％M+H)。
实施例5化合物5的制备
Ac-Ile-Glu-Gln-Val-Asn-Lys-Lys-Ile-Glu-Gln-Ser-Leu-Lys-
Phe-Ile-Glu-Lys-Ser-Asp-Lys-Leu-Leu-Glu-Asn-Val-Asn-Lys-
Gly-Lys(丁二酸胆固醇单酯)-NH2
1、肽树脂的合成
使用Rink Amide BHHA树脂为载体树脂，通过去Fmoc保护和偶联反应，依次与下表所示的保护氨基酸偶联，制得肽树脂。本实施例使用的保护氨基酸相对应的保护氨基酸如下所示：
Figure GDA0002463405390000122
Figure GDA0002463405390000131
(1)接入主链第1个保护氨基酸
取0.03mol第1个保护氨基酸和0.03mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.03mol DIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液，备用。
取0.01mol的Rink amide MBHA树脂(取代值约0.4mmol/g)，采用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的树脂。
将活化后的第1个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂中，偶联反应60～300分钟，过滤洗涤，得含1个保护氨基酸的树脂。
(2)接入主链第2～30个保护氨基酸
采用上述接入主链第1个保护氨基酸同样方法，依次接入上述对应的第2～30个保护氨基酸，得含主链氨基酸的树脂。
(3)Lys(Alloc)侧链去保护
取2.5mmol四三苯基膦钯和25mmol苯硅烷，用适量二氯甲烷溶解，去保护4小时，过滤洗涤，得到去Alloc的树脂备用。
(4)接入侧链修饰
采用上述接入主链第1个保护氨基酸同样方法，接入侧链对应的修饰物，得到肽树脂。
2、粗品的制备
方法同实施例1，
3、纯品的制备
方法同实施例1，
得纯品7.7g，纯度为96.5％，总收率为19.7％。分子量为3910.8(100％M+H)。
实施例6化合物6的制备
Ac-Ile-Glu-Gln-Val-Asn-Lys-Lys-Ile-Glu-Gln-Ser-Leu-Lys-
Phe-Ile-Glu-Lys-Ser-Asp-Lys-Leu-Leu-Glu-Asn-Val-Asn-Lys-
Gly-Lys(γGlu-Pal)-NH2
制备方法同实施例5，使用的保护氨基酸如下表:
Figure GDA0002463405390000141
/>
Figure GDA0002463405390000151
得纯品7.1g，纯度为97.6％，总收率为18.6％。分子量为3809.6(100％M+H)。
实施例7化合物7的制备
Ac-Ile-Glu-Gln-Val-Asn-Lys-Lys-Ile-Glu-Gln-Ser-Leu-Lys-
Phe-Ile-Glu-Lys-Ser-Asp-Lys-Leu-Leu-Glu-Asn-Val-Asn-Lys-
Gly-Lys(AEEA-AEEA-γGlu-18烷二酸)-NH2
制备方法同实施例5，使用的保护氨基酸如下表:
Figure GDA0002463405390000152
/>
Figure GDA0002463405390000161
得纯品6.6g，纯度为97.2％，总收率为15.9％。分子量为4157.8(100％M+H)。
实施例8体外抗病毒活性的测定
实验方法1：
基于绿色荧光蛋白报告基因标记RSV病毒(RSV-EGFP)的实验方法参考文献3进行。
将HEp-2细胞铺板，接种密度为2x104细胞/孔。培养24小时后，将多肽3倍系列稀释，分别与3000PFU的RSV-EGFP混合，于37℃5％CO2条件下孵育5分钟后，将上述混合物加入到含有HEp-2细胞的96孔板中，于37℃继续培养48小时。以未感染的HEp-2细胞作为细胞阴性对照，未加药物处理的病毒感染孔作为阳性对照。采用多功能酶标仪于激发波长为479nm、发射波长为517nm时检测荧光强度，并用GraphPad计算病毒感染相对抑制率及IC50值，实验结果见下表和图1。
对RSV-EGFP感染靶细胞的抑制活性
组别 代码 IC50值
对照多肽 T118 14.3μM
化合物1 SV29 5.3μM
化合物2 SV29EK 12.7μM
化合物3 SV29-Chol 0.05μM
化合物4 SV29L-Chol 0.09μM
实验方法2：
采用基于荧光素酶报告基因标记的RSV病毒(RSV-luc)对新型RSV融合抑制剂的抗病毒活性进行了进一步评价。
将多肽药物在96孔板中进行3倍梯度稀释，每种多肽3个复孔，9个稀释梯度，终体积50μL/孔，随后向含有多肽药物的96孔板中加入50μL(100TCID50)RSV-luc病毒液，室温孵育1h。用DMEM培养基配制浓度为10×104/mL Hep-2细胞悬液，混匀后加入上述96孔板中，100μL/孔。放入37℃5％CO2细胞培养箱中培养48小时后，弃上清，在干净的吸水纸上轻轻拍干，加入细胞裂解液30μL/孔，裂解15min后用Bright-Glo Luciferase Assay试剂(Promega)测定每孔的相对荧光单位(RLU)。最终利用Graphpad软件对所得数据进行处理，计算每种多肽药物的IC50值，实验结果见下表和图2。
对RSV-Luc的抑制活性
组别 代码 IC50值
化合物1 SV29 2.4μM
化合物2 SV29EK 2.3μM
化合物3 SV29-Chol 0.01μM
实施例9体内抗病毒活性的测定
用小鼠动物模型的进行抗病毒活性测定。
1、实验方法
采用8周龄的SFP雌性BALB/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)进行药学评价，实验设PBS处理对照组、RSV感染对照组、SV29治疗组和SV29-Chol治疗组。每组4-6只。在阿佛丁(250mg/Kg)麻醉下，先将50μl浓度为50μM的多肽PBS溶液通过滴鼻给药，15分钟后通过鼻腔途径给予RSV-Luc病毒(5x 104PFU)感染。每天检测小鼠体重变化情况。采用小动物活体成像***(Lumina II Small Animal Live Imaging System)检测病毒感染情况，在注射50μl荧光素底物D-Luciferin(7.5mg/ml；PBS)10分钟后进行小鼠活体成像。感染后5天后安乐处死小鼠，取肺组织称重、碾磨，提取总RNA采用RT-qPCR方法定量检测肺组织RSV感染情况。所用PCR引物参考文献4设计合成。
酶联免疫斑点法检测小鼠肺组织病毒量：HEp-2细胞接种于96孔板，2×10 4个细胞/孔；小鼠肺组织称重、研磨(0.1g肺组织/0.1ml PBS(0.1％BSA))，4℃ 10 000×g离心5min分离上清；依次系列稀释后加入上述96孔板中，3个复孔/稀释度，阴性对照孔细胞中仅加维持液，37℃孵育1h后弃培养液，加入1％甲基纤维素，100μl/孔；37℃继续培养3d后经固定、封闭，依次加入山羊抗人RSV多抗(1：500稀释)、HRP标记兔抗山羊抗体(1：5 000稀释)、TMB显色，倒置显微镜下计数病毒斑数。
2、实验结果
(1)对小鼠体重的影响
与PBS处理的对照小鼠比较，RSV感染后1天后小鼠体重即开始下降，感染后2天下降最多。按上述方法经过滴鼻给予SV29和SV29-Chol处理，结果对小鼠体重没有明显影响。
结果见图3.
(2)RSV感染小鼠活体成像检测
采用小动物活体成像***检测的结果见图4～6，结果表明，PBS处理组未见荧光信号，RSV感染者可在第1-5天均可见明显荧光信号，分布于小鼠鼻腔和肺部。在SV29和SV29-Chol治疗后1到4天RSV在鼻腔部位比不治疗的RSV对照组显著减少，特别是在第2天的病毒复制高峰期。结果说明SV29治疗组RSV信号有下降，但SV29-Chol治疗组的下降则不明显。
(3)RSV感染小鼠肺部病毒定量分析
采用定量PCR方法对各实验组小鼠的肺部RSV复制水平进行定量检测的结果见图7～8，结果表明。SV29和SV29-Chol处理均能使小鼠肺部RSV病毒量显著减少。相对而言，SV29的效果要优于SV29-Chol的效果。同时，采用酶联免疫斑点法分析了小鼠肺部RSV病毒复制水平，结果表明SV29和SV29-Chol均能使肺部RSV病毒量降低到很低水平。

Claims (4)

1.一种结构I所示的化合物，其特征在于：
所述结构I为：
Ac-Ile-Glu-Gln-Val-Asn-Lys-Lys-Ile-Glu-Gln-Ser-Leu-Lys-Phe-Ile-Glu-Lys-Ser-Asp-Lys-Leu-Leu-Glu-Asn-Val-Asn-Lys-Gly-Lys-NH2；
或，
Ac-Ile-Glu-Glu-Val-Asn-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Ser-Leu-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Ser-Asp-Lys-Lys-Leu-Glu-Glu-Val-Asn-Lys-Lys-Lys-NH2；
或，
Ac-Ile-Glu-Gln-Val-Asn-Lys-Lys-Ile-Glu-Gln-Ser-Leu-Lys-Phe-Ile-Glu-Lys-Ser-Asp-Lys-Leu-Leu-Glu-Asn-Val-Asn-Lys-Gly-Lys-Cys（乙酸胆固醇酯）-NH2；
或，
Ac-Leu-Glu-Gln-Val-Asn-Lys-Lys-Ile-Glu-Gln-Ser-Leu-Lys-Phe-Ile-Glu-Lys-Ser-Asp-Lys-Leu-Leu-Glu-Asn-Val-Asn-Lys-Gly-Lys-Cys（乙酸胆固醇酯）-NH2。
2.一种包含权利要求1所述化合物的可药用的盐或溶剂化物。
3.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的化合物。
4.一种权利要求3所述的药物组合物在制备治疗合胞病毒肺炎药物中的用途。
CN202010108065.3A 2020-02-21 2020-02-21 一种抗合胞病毒膜融合抑制剂 Active CN111303245B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010108065.3A CN111303245B (zh) 2020-02-21 2020-02-21 一种抗合胞病毒膜融合抑制剂
PCT/CN2021/076437 WO2021164677A1 (zh) 2020-02-21 2021-02-10 一种抗合胞病毒膜融合抑制剂

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010108065.3A CN111303245B (zh) 2020-02-21 2020-02-21 一种抗合胞病毒膜融合抑制剂

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111303245A CN111303245A (zh) 2020-06-19
CN111303245B true CN111303245B (zh) 2023-06-27

Family

ID=71149093

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010108065.3A Active CN111303245B (zh) 2020-02-21 2020-02-21 一种抗合胞病毒膜融合抑制剂

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN111303245B (zh)
WO (1) WO2021164677A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111303245B (zh) * 2020-02-21 2023-06-27 成都奥达生物科技有限公司 一种抗合胞病毒膜融合抑制剂
CN112625094B (zh) * 2021-01-19 2023-09-26 成都奥达生物科技有限公司 一种广谱冠状病毒膜融合抑制剂及其药物用途
CN116162136A (zh) * 2021-11-24 2023-05-26 成都奥达生物科技有限公司 一种抗合胞病毒膜融合抑制剂
CN117186187B (zh) * 2023-07-12 2024-05-31 中国医学科学院病原生物学研究所 一种抗呼吸道合胞病毒膜融合抑制剂及其药物用途

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001040274A2 (en) * 1999-12-06 2001-06-07 Whitehead Institute For Biomedical Research Inhibition of hrsv membrane fusion
CN1351611A (zh) * 1999-05-17 2002-05-29 康久化学公司 病毒感染的长效融合肽抑制剂
CN1502698A (zh) * 2002-11-19 2004-06-09 - 用于重组生产抗融合肽的方法
WO2008144590A2 (en) * 2007-05-16 2008-11-27 Conjuchem Biotechnologies Inc. Long lasting modified antifusogenic peptide for preventing hiv infection
WO2015192223A1 (en) * 2014-05-14 2015-12-23 Mahony James B Peptide inhibitors of respiratory syncytial virus replication
CN106138792A (zh) * 2015-04-09 2016-11-23 田景振 一种具有抗呼吸道合胞病毒活性的中药复方提取物
WO2017149098A1 (en) * 2016-03-03 2017-09-08 Fondation The Ark Fusion respiratory syncytial virus inhibitors and use thereof
CN110551203A (zh) * 2019-09-25 2019-12-10 成都奥达生物科技有限公司 一种艾塞那肽类似物

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1954302A4 (en) * 2005-11-02 2009-11-04 Ambrx Inc BIOSYNTHETIC POLYPEPTIDE FUSION INHIBITORS
US20090053167A1 (en) * 2007-05-14 2009-02-26 Neose Technologies, Inc. C-, S- and N-glycosylation of peptides
US9060975B2 (en) * 2013-03-14 2015-06-23 Mucosis Bv Heat-stable respiratory syncytial virus F protein oligomers and their use in immunological compositions
EA039803B1 (ru) * 2013-04-25 2022-03-15 Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. Стабилизированные растворимые f-полипептиды rsv до слияния
CN111303245B (zh) * 2020-02-21 2023-06-27 成都奥达生物科技有限公司 一种抗合胞病毒膜融合抑制剂

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1351611A (zh) * 1999-05-17 2002-05-29 康久化学公司 病毒感染的长效融合肽抑制剂
WO2001040274A2 (en) * 1999-12-06 2001-06-07 Whitehead Institute For Biomedical Research Inhibition of hrsv membrane fusion
CN1502698A (zh) * 2002-11-19 2004-06-09 - 用于重组生产抗融合肽的方法
WO2008144590A2 (en) * 2007-05-16 2008-11-27 Conjuchem Biotechnologies Inc. Long lasting modified antifusogenic peptide for preventing hiv infection
WO2015192223A1 (en) * 2014-05-14 2015-12-23 Mahony James B Peptide inhibitors of respiratory syncytial virus replication
CN106138792A (zh) * 2015-04-09 2016-11-23 田景振 一种具有抗呼吸道合胞病毒活性的中药复方提取物
WO2017149098A1 (en) * 2016-03-03 2017-09-08 Fondation The Ark Fusion respiratory syncytial virus inhibitors and use thereof
CN110551203A (zh) * 2019-09-25 2019-12-10 成都奥达生物科技有限公司 一种艾塞那肽类似物

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Peptides from conserved regions of paramyxovirus fusion (F) proteins are potent inhibitors of viral fusion;D M Lambert等;《PNAS》;pnas;19960305;第93卷(第5期);第2186-2191页 *
STAT6 inhibitory peptide given during RSV infection of neonatal mice reduces exacerbated airway responses upon adult reinfection;Bharat T. Srinivasa等;《Journal of Leukocyte Biology》;pubmed;20170228;第101卷(第2期);第519-529页 *
呼吸道合胞病毒抑制剂的研究进展;***等;《中国医药生物技术》;CNKI;20181210;第13卷(第6期);第539-543页 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021164677A1 (zh) 2021-08-26
CN111303245A (zh) 2020-06-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111303245B (zh) 一种抗合胞病毒膜融合抑制剂
CN111777671B (zh) 一种长效的psd-95抑制剂
CN110590934B (zh) 一种glp-1化合物
CN110551203B (zh) 一种艾塞那肽类似物
WO2022156620A1 (zh) 一种广谱冠状病毒膜融合抑制剂及其药物用途
CN111675752B (zh) 一种冠状病毒膜融合抑制剂及其药物用途
CN104530199B (zh) 一种抗肿瘤多肽及其制备方法和应用
US20190315806A1 (en) Polymyxin derivative, preparation method and application thereof
EA017957B1 (ru) Композиции и способы, ингибирующие грипп
CN116162136A (zh) 一种抗合胞病毒膜融合抑制剂
CN106883299A (zh) 脂肪组织靶向多肽及其制备方法和应用
EP2021353A2 (en) Peptide substance revealing a stress protective effect, pharmaceutical composition on its base and the method of its application
CN111285923A (zh) 一种psd-95抑制剂
CN116693622A (zh) 基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物、制备方法及应用
CN109232746A (zh) 一种齐考诺肽和tat肽的融合多肽
CN115340594A (zh) 一种抑制破骨细胞分化的订书肽及其制备方法和应用
WO2007054030A1 (fr) Modifications polyethylene glycole de thymosine alpha-1
CN117186187B (zh) 一种抗呼吸道合胞病毒膜融合抑制剂及其药物用途
CN114957403B (zh) 一种广谱冠状病毒膜融合抑制剂及其药物用途
CN116621944A (zh) 一种长效肝炎病毒进入抑制剂
CN116621943A (zh) 一种长效肝炎病毒进入抑制剂
CN103012555A (zh) 具有组织保护活性的新多肽的制备方法及在治疗中的应用
CN113024635B (zh) 一类订书肽化合物及其药物组合物的用途
CN116789761A (zh) 一种广谱冠状病毒膜融合抑制剂及其药物用途
CN116693625A (zh) 一种长效肝炎病毒进入抑制剂

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant