EA031229B1 - Способ витрификации биологического материала - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к иммунологии и производству вакцин. Более конкретно изобретение относится к способу витрификации биологических препаратов, включающих пептиды, антигены, антитела, клетки и т.п.

Description

Изобретение относится к иммунологии и производству вакцин. Более конкретно изобретение относится к способу витрификации биологических препаратов, включающих пептиды, антигены, антитела, клетки и т.п.

031229 Bl

Включение в виде ссылки

Настоящая заявка истребует приоритет по предварительной заявке USSN 61/490987, поданной 27 мая 2011 г. и включенной в полном объеме в настоящую заявку в виде ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение в общем смысле относится к области иммунологии и производству вакцин. Более конкретно настоящее изобретение относится к стабилизаторам для лиофилизированных живых аттенуированных иммуногенных и/или вакцинных композиций, которые могут содержать, inter alia, парамиксовирус собак. Изобретение относится также к стабилизированным лиофилизированным живым аттенуированным иммуногенным и/или вакцинным композициям, например, парамиксовируса собак, которые могут содержать указанные стабилизаторы. Другие аспекты изобретения описаны в или будут очевидны из нижеследующего описания и находятся в пределах сущности изобретения.

Предшествующий уровень техники

Иммуногенные и вакцинные композиции, содержащие биологические ингредиенты, такие как вирусы, бактерии, паразиты, грибы, белки, полипептиды, гликопротеины и особенно аттенуированные живые микроорганизмы, заметно чувствительны к условиям, в которых они приготовляются, составляются и хранятся.

Такие биологические ингредиенты могут модифицироваться и разрушаться в результате химических реакций (например, гидролиза, дезаминирования, реакции Майяра), многие из которых опосредуются водой. Жидкая вода делает возможным движение молекул и может приводить к изменению конформации белков в композициях, содержащих биологические ингредиенты. За счет ограничения доступа к воде или удаления воды можно снизить основной фактор изменения и разрушения. Способы предшествующего уровня техники для поддержания стабильности биологических ингредиентов предусматривали в основном вымораживание воды или удаление воды лиофильной сушкой.

Лиофилизация или процесс лиофильной сушки является общераспространенным способом удаления воды в производстве обезвоженных продуктов. В большинстве случаев лиофильная сушка водной композиции включает три стадии. На первой водная композиция замораживается в условиях низкой температуры. На второй замороженная вода удаляется сублимацией в условиях пониженного давления и низкой температуры. На этой стадии композиция обычно содержит около 15% воды. На третьей остаточная вода дополнительно удаляется десорбцией в условиях пониженного давления и повышенных температур. По окончании процесса лиофилизации получается лиофилизированный продукт, называемый также пастилкой или лепешкой. Лиофилизированный продукт содержит очень низкое количество остаточной воды (примерно от 0,5 до 5% (мас./мас.)) и сухой материал в аморфной форме. Это специфическое состояние квалифицируется как стекловидное.

Однако в ходе стадий приготовления, например, до и в процессе лиофилизации, а также в процессе хранения иммуногенных композиций и вакцинных композиций наблюдаются значительные потери иммуногенной активности биологических ингредиентов. Целостность биологических ингредиентов должна гарантироваться, чтобы была уверенность в сохранении иммунизационной эффективности иммуногенных композиций и вакцинных композиций. Иммуногенная активность биологических ингредиентов измеряется их способностью вызывать и стимулировать иммунологический ответ при их введении в клетку-хозяина или субъекту.

В уровне техники отмечается устойчивая потребность в создании поливалентных иммуногенных композиций или вакцинных композиций с целью ограничить манипуляции, проводимые над субъектами, и сократить частоту введения. По определению поливалентная иммуногенная композиция или вакцинная композиция содержит более одного активного иммуногенного компонента, происходящего из или производного по меньшей мере от двух различных патогенов. Стабильность вирусов из разных родов может варьировать в ходе стадии лиофильной сушки и последующего периода хранения, что ведет к потере жизнеспособности или инфективности. В случае вирусов, таких как парамиксовирусы собак, обычно вводимые активные иммуногенные компоненты представляют собой живые аттенуированные вирусы. Чтобы эффективно стимулировать иммунную систему, живые аттенуированные вирусы должны реплицироваться в иммунизированном субъекте. Потеря жизнеспособности или инфективности может происходить в процессе лиофильной сушки поливалентных иммуногенных композиций или вакцинных композиций, в период хранения композиций или до введения композиций после их восстановления. Поэтому в такие лиофилизированные композиции добавлялись стабилизаторы. Однако для получения поливалентных иммуногенных композиций или вакцинных композиций, сохраняющих свою инфективность и/или жизнеспособность, особенно выгодно было бы иметь общий стабилизатор, способный сохранить жизнеспособность и инфективность различных живых аттенуированных патогенов.

Стабилизация биологических ингредиентов в сухом виде в типичных случаях включает сохранение (консервирование) антитоксинов, антигенов и бактерий (Flosodort et al. (1935) J. Immunol. 29, 389). Однако применение этого способа ограничивает частичная денатурация белков в процессе сушки из жидкого состояния при температурах окружающей среды. Сушка из замороженного состояния помогла уменьшить денатурацию и способствовала улучшенному, хотя и неполному, консервированию биологических ингредиентов, включая бактерии и вирусы (Stamp et al. (1947) J. Gen. Microbiol. 1, 251; Rightsel et al.

- 1 031229 (1967) Cryobiology 3, 423; Rowe et al. (1971) Cryobiology 8, 251).

С недавних пор в качестве стабилизаторов стали добавлять сахара, например сахарозу, раффинозу и трегалозу, в различных комбинациях перед лиофилизацией вирусов. Большое число соединений было протестировано на их способность стабилизировать различные вакцины, содержащие живые аттенуированные биологические ингредиенты, в частности вирусы. Такие соединения включают SPGA (сахароза, фосфат, глутамат и альбумин; Bovarnick et al. (1950) J. Bacteriol. 59, 509-522; патент США № 4000256), бычий или человеческий сывороточный альбумин, соли щелочных металлов глутаминовой кислоты, соли алюминия, сахарозу, желатин, крахмал, лактозу, сорбит, трис-ЭДТА, гидролизат казеина, лактобионат натрия и калия и первичный или вторичный кислый фосфат щелочного металла. Другие соединения включают, например, SPG-NZ амин (например, патент США № 3783098) и смеси поливинилпирролидонов (PVP) (например, патент США № 3915794). В последнее время живые аттенуированные флавирусы стабилизировали сложной смесью из нескольких соединений, включающей сорбит, сахарозу, необязательно трегалозу и/или другой дисахарид либо трисахариды, мочевину и специфическую комбинацию аминокислот (US 2010/0015180A1, Sanofi Pasteur).

Вакцинные и иммуногенные композиции оказали огромное влияние на здоровье населения, снизив заболеваемость и смертность от множества вирулентных патогенов. Однако непредвиденные побочные эффекты, возникающие от добавок в иммуногенные композиции и вакцинные композиции, по-прежнему представляют потенциальную угрозу, которая может перевесить любые защитные и лечебные свойства иммуногенных композиций и вакцинных композиций.

В той форме, в какой желатин зачастую используется в вакцинах в США, он может спровоцировать серьезные аллергические реакции примерно в 1 из 2 млн доз.

Аллергические реакции, причиной которых, как предполагалось ранее, являлся альбумин (яичный белок), скорее всего вызываются желатином в той же вакцине. В случае человеческого сывороточного альбумина, хотя никаких болезней не ассоциировалось когда-либо с присутствием человеческого сывороточного альбумина в вакцинах, существует опасность трансмиссии вируса через этот белок, происходящий из крови человека.

Продукты животного происхождения, такие как бычий альбумин и желатин, несут с собой риск передачи CJD (болезни Крейцфельда-Якоба, известной также как коровье бешенство) через продукты, полученные из крови и соединительной ткани крупного рогатого скота и применяемые в производстве вакцин. Однако сообщений о случаях передачи CJD через продукты крови и соединительной ткани не было зарегистрировано; прионы, которые вызывают CJD, не были обнаружены в крови или соединительной ткани, а использование продуктов из мяса коров, импортируемого из стран, где известны случаи коровьего бешенства, запрещено. Тем не менее, с учетом указанных рисков были предприняты усилия по недопущению применения в иммуногенных композициях такого рода продуктов, которые, как показали наблюдения, вызывают нежелательные иммунные реакции.

De Rizzo (de Rizzo et al. (1989) Bull. Pan. Am. Health Organ. 23(3), 299-305) сообщил о лиофилизированных препаратах вируса кори, содержащих сорбит-желатин или растворы глутаминовой кислотылактозы. Эти препараты хранились при -20°C, и их вирусные титры определялись в течение 21месячного периода хранения. Полученные данные показали, что лиофилизированные вирусы без стабилизатора являются устойчивыми в хранении при -20°C в течение 21 месяца. Кроме того, хорошо известно, что лиофилизированные вирусы кори являются стабильными в хранении при -20°C и способны сохранять активность практически без потерь в продолжение многих лет (Gray А., (1978) Dev. Biol. Stand. 41, 265-266). Однако эти результаты были получены при температуре -20°C, при которой лиофилизированные вирусы кори являются стабильными и не показывают дополнительного стабилизирующего эффекта. Эти результаты указывают только на то, что сорбит-желатин и растворы глутаминовой кислотылактозы не оказывают отрицательного влияния на стабильность вирусов кори, которые хранятся в лиофилизированном виде при -20°C.

Precausta (Precausta et al. (1980) J. Clin. Microbiol. 12(4), 483-489) оценивал влияние остаточной воды и среды, в которой производилась герметичная укупорка флаконов, на титр инфективности вируса чумы собак (CDV) и вируса инфекционного бронхита (IBV) собак после лиофильной сушки. Раствор лактозы добавляли в препарат CDV до конечной концентрации 75 мг/мл, тогда как IBV-вакцина содержала 40 мг маннита/мл. Сравнение титра CDV до лиофильной сушки с титром после лиофильной сушки и спустя 12 месяцев хранения при 6°C показало, что титр CDV снизился с 10^1,6 до 10^2,0 CCID₅₀/^ (50% культуральная инфекционная доза на 1 мл элюата), что отражает весьма значительное снижение титра CDV.

В уровне техники известно несколько способов удаления воды в целях сохранности (консервирования) биологического препарата. Термин распылительная сублимационная сушка означает распыление с жидкостью в криогенной среде с последующей сублимационной сушкой полученных замороженных частиц. Пенная сушка означает сушку концентрированного раствора в виде стекловидной пены путем выпаривания воды. А пенная сушка сублимацией означает сушку предварительно замороженного раствора в виде стекловидной пены путем сублимации льда при температуре, ниже температуры стеклования и температуры разрушения матрикса.

Следовательно, существует потребность в новых стабилизаторах и способах сохранения жизнеспо

- 2 031229 собности и инфективности биологических ингредиентов в лиофилизированном виде, которые являются безопасными и пригодными для инъекций субъектам и которые имеют хороший внешний вид.

Цитирование или идентификация любого документа в настоящей заявке не является признанием того, что такой документ представляет собой предшествующий уровень техники для настоящего изобретения.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение направлено на удовлетворение потребности в уровне техники путем создания, inter alia, новых способов производства витрифицированных биопрепаратов, таких как белки, пептиды, антитела, бактерии, вирусы, одноклеточные паразиты или любая человеческая либо животная ткань. Вирусы могут включать живые аттенуированные вирусы собачьей чумы (CDV), парагриппа 2 типа собак (cPi2), аденовирус собак, вирусы болезни Марека, инфекционного бурсита или ньюкаслской болезни. Бактерии могут включать Pasteurella spp. или Avibacterium spp.; биопрепараты могут включать KSAC полипептид Leishmania.

В одном варианте осуществления изобретения обобщенный способ витрификации предусматривает стадии:

(a) приготовления жидкого биологического препарата путем объединения по меньшей мере одного биологически активного ингредиента и по меньшей мере одного стабилизатора, где стабилизатор содержит или состоит по меньшей мере из аспарагиновой кислоты, наполнителя, состоящего из декстрана и одной из следующих комбинаций: глюкоза+раффиноза, глюкоза+фруктоза, глюкоза+галактоза и глюкоза+сахароза;

(b) подвергания препарата контролируемым изменениям давления и температуры для снижения влагосодержания препарата до менее чем примерно 5 мас.% и витрификации тем самым биологического материала.

В частности, способ по изобретению может включать следующие этапы:

(a) наполнение флаконов биологическим препаратом из п.1;

(b) загрузки флаконов в контейнер с контролируемой температурой, в котором температура составляет от -15 до 10°C, в частности от -10 до 5°C, более конкретно около 5°C;

(c) понижение давления воздуха в контейнере с контролируемой температурой до достижения давления в диапазоне от 15 до 30 мбар;

(d) поддержание давления, достигнутого на стадии (с), в течение от 5 до 20 мин, в частности от 10 до 15 мин, с тем, чтобы температура продукта стабилизировалась и создались условия для высвобождения летучих газов, включающих карбонаты, из биологического препарата, при этом температура в контейнере остается на уровне примерно от 4 до 6°C или около 5°C в течение всей стадии, тем самым завершая процесс витрификации.

В еще одном частном варианте воплощения вышеописанный способ включает также следующие стадии, которые выполняются после стадии (d):

(e) понижение давления воздуха в контейнере до значения примерно от 4 до 7 мбар или около 5 мбар в течение примерно от 5 до 20 мин;

(f) поддержание давления стадии (f) в течение примерно от 30 до 60 мин;

(g) повышение температуры в контейнере от отрицательной до положительной температуры (примерно от 30 до 50°C) в течение периода времени от 45 до 85 мин или около 60 мин и поддержание давления постоянным до достижения температуры примерно от 10 до 20°C или около 15°C;

(h) понижение давления воздуха в контейнере до значения примерно от 1,5 до 4 или около 3 мбар для ускорения концентрирования и до достижения температуры контейнера примерно 30°C с последующим поддержанием в течение примерно от 30 до 90 или 60 мин;

и где активным биопрепаратом является иммуноген, полипептид, нуклеотид, живой вирус, живые бактерии, живой протист или субъединица, происходящая из болезнетворного или вызывающего болезнь патогена.

В еще одном варианте воплощения после стадии (h) вышеописанного способа осуществляют следующие стадии:

(i) дальнейшее понижение давления до значения примерно от 0,5 до 4,0 или около 1 мбар и поддержание давления постоянным до завершения пенообразования;

(j) последующее понижение давления до значения примерно от 5 до 100 или около 25 мкбар при одновременном поддержании температуры на уровне около 30°C в течение примерно от 400 до 2400 или более минут до достижения желательного влагосодержания примерно от 0,5 до 15% или примерно от 1 до 4%, (k) герметичная укупорка флаконов, находящихся в контейнере с контролируемой температурой, и завершение тем самым процесса витрификации, где активным биопрепаратом является живой аттенуированный вирус.

В следующем варианте воплощения изобретения биопрепаратом по изобретению может быть вирус чумы собак (CDV), вирус парагриппа 2 типа собак (PI2) или их комбинации.

Или же биологическим препаратом является аттенуированный вирус, представленный вирус ветря

- 3 031229 ной оспы канареек, вирус болезни Марека, вирус инфекционного бурсита, вирус западно-нильской лихорадки (WNV) или вирус лейкемии кошек (FeLV).

В ином варианте воплощения изобретения биологическим препаратом по изобретению является бактерия, в частности Avibacterium.

В дополнительном варианте воплощения препарат содержит по меньшей мере один адъювант.

Верифицированный биологический материал в предпочтительно варианте воплощения является стабильным при 4°C в течение по меньшей мере одного года. Например, витрифицированный биологический материал может быть стабильным при -20 и -80°C в течение по меньшей мере одного года.

Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей биологический материал, который был витрифицирован способом по изобретению.

Специалист в данной области может проводить способ по изобретению с использованием любого известного или еще подлежащего изготовлению подходящего сушильного аппарата. Не ограничивающие примеры подходящего сушильного аппарата включают: 1) сушилку малой производительности (одна полка, 200 флаконов емкостью по 3 куб.см каждый); 2) экспериментальную сушилку (2 полки, 3000 флаконов емкостью по 3 куб.см) или (3) сушилку BERLIN с высокой производительностью (3 полки, 10000 флаконов емкостью по 3 куб.см). Могут быть предприняты рутинные модификации контура регулирования давления в сушильном аппарате с тем, чтобы лиофильная сушилка могла работать в еще более широком диапазоне по сравнению с ее обычным диапазоном.

Эти и другие варианты осуществления изобретения раскрываются или станут очевидными из и охватываются нижеследующим подробным описанием.

Краткое описание чертежей

Нижеследующее подробное описание, приведенное в виде примера, но не имеющее целью ограничить изобретение описанными конкретными вариантами осуществления, может стать понятнее вкупе с прилагаемым чертежом, включенным в описание в виде ссылки, на котором показана фотография витрифицированных масс, имеющих внешний вид сладкой (сахарной) ваты.

Подробное описание изобретения

В контексте изобретения заключает в себе, заключающий в себе, содержащий и имеющий и подобные термины могут иметь значение, приписанное им в патентном законодательстве США, и могут означать включает, включающий и т.п.; подобно этому состоящий в основном из или состоит в основном из имеет значение, приписанное им в патентном законодательстве США, и термин не является исчерпывающим и допускает присутствие большего, чем то, что излагается, при условии, что основные или новые характеристики того, что излагается, не изменяются в случае присутствия большего, чем то, что излагается, но исключает варианты предшествующего уровня техники.

Субъект в контексте настоящего изобретения может быть представителем позвоночных, например млекопитающим, птицей, пресмыкающимся, земноводным или рыбой; более предпочтительно человеком, животным-компаньоном или домашним животным; животным, предназначенным для производства пищевой продукции или для производства кормов; представителем сельскохозяйственного скота, дичи, ездовых или охотничьих животных, таким как, но весь перечень не ограничивается только названными здесь, крупный рогатый скот, собаки, кошки, козы, овцы, свиньи, лошади и птицы. Предпочтительно позвоночное является собакой.

В контексте изобретения рекомбинантный относится к нуклеиновой кислоте, синтезированной или подвергнутой иным образом манипуляциям in vitro (например, рекомбинантная нуклеиновая кислота), к методам использования рекомбинантных нуклеиновых кислот для продуцирования генных продуктов в клетках, в субъектах или в других биологических системах, либо к полипептиду (рекомбинантный белок), кодируемому рекомбинантной нуклеиновой кислотой. Рекомбинационные процессы включают также эксцизию и лигирование нуклеиновых кислот, содержащих различные кодирующие области, домены или промоторные последовательности из различных источников в кассете экспрессии или векторе экспрессии, например, для индуцибельной или конститутивной экспрессии нуклеинокислотных кодирующих последовательностей.

В контексте изобретения термин функционально связанный означает, что описываемые компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать предназначенным образом.

Термин гетерологичный применительно к нуклеиновой кислоте указывает на то, что нуклеиновая кислота находится в клетке, вирусе, субъекте или бактерии, где она обычно не встречается в природе или содержит две или более нуклеотидных подпоследовательностей, которые не находятся в такой взаимосвязи друг с другом, какая обычно встречается в природе, или рекомбинантно сконструирована таким образом, что ее уровень экспрессии или физическая взаимосвязь с другими нуклеиновыми кислотами или другими молекулами в клетке, субъекте или структуре обычно не встречается в природе. Например, может быть рекомбинантно сконструирована гетерологичная нуклеиновая кислота, содержащая две или более последовательностей из неродственных генов, расположенные в таком порядке, какой не встречается в природе, например ген собаки, функционально связанный с промоторной последовательностью, вставленной, например, в поксвирусный или аденовирусный вектор. Например, гетерологичная нуклеиновая кислота, представляющая интерес, может кодировать иммуногенный генный продукт, в котором

- 4 031229 представляющая интерес гетерологичная нуклеиновая кислота, содержащаяся в векторе, вводится в лечебных или профилактических целях как иммуногенная композиция или вакцинная композиция. Гетерологичные последовательности могут содержать различные комбинации промоторов и последовательностей, многочисленные примеры которых подробно описаны в настоящем документе.

В контексте изобретения вектор служит инструментом, который делает возможным или облегчает перенос объекта из одной среды в другую. Например, некоторые векторы, используемые в технике рекомбинантных нуклеиновых кислот, позволяют переносить объекты, такие как сегмент нуклеиновой кислоты (например, сегмент гетерологичной нуклеиновой кислоты, такой как сегмент гетерологичной кДНК), в клетку-мишень. В описании употребляется также термин экспрессирующий вектор. Настоящее изобретение охватывает рекомбинантные векторы, которые могут включать, без ограничения, вирусные векторы, бактериальные векторы, грибковые векторы, протозойные векторы, плазмидные векторы или их рекомбинанты.

Что касается гетерологичных нуклеиновых кислот для экспрессии в векторе (например, кодирующих представляющий интерес эпитоп и/или антиген, и/или иммуноген, и/или терапевтическое средство) и документов, описывающих такие гетерологичные нуклеиновые кислоты, а также что касается экспрессии факторов транскрипции и/или трансляции для усиления экспрессии молекул нуклеиновых кислот и что касается терминов, таких как эпитоп, представляющий интерес, терапевтическое средство, иммунный ответ, иммунологический ответ, защитный иммунный ответ, иммунологическая композиция, иммуногенная композиция и вакцинная композиция, inter alia, то следует сослаться на патент США № 5990091, опубликованный 23 ноября 1999 г., WO 98/00166 и WO 99/60164; документы, упоминаемые в них, и документы, зафиксированные в процедуре рассмотрения указанного патента и указанных РСТ заявок, все включены в настоящую заявку в виде ссылки. Так, патент США № 5990091 и заявки WO 98/00166 и WO 99/60164 и документы, упоминаемые в них, как и документы, зафиксированные в процедуре рассмотрения указанного патента и указанных РСТ заявок, и другие документы, упоминаемые в настоящей заявке или иным образом включенные в настоящую заявку в виде ссылок, могут приниматься во внимание при практическом использовании настоящего изобретения; и все молекулы гетерологичных нуклеиновых кислот, промоторы и векторы, упоминаемые в вышеуказанных материалах, могут использоваться в практическом осуществлении настоящего изобретения. В этом отношении следует упомянуть также патенты США №№ 6706693; 6716823; 6348450; патентные заявки США с серийными номерами 10/424 409; 10/052 323; 10/116 963; 10/346 021 и WO99/08713, опубликованную 25 февраля 1999 г., из PCT/US98/16739.

Антиген - это вещество, которое распознается иммунной системой и которое индуцирует иммунный ответ. Антиген может включать целостный организм, убитый, аттенуированный или живой; субъединицу или часть организма; рекомбинантный вектор, содержащий вставку с иммуногенными свойствами; часть или фрагмент нуклеиновой кислоты, способный индуцировать иммунный ответ при презентации животному-хозяину; белок, полипептид, пептид, гликопротеин, эпитоп, гаптен, углевод, сахар или любую комбинацию перечисленного. Альтернативно, антиген может включать токсин или антитоксин. Аналогичным термином, употребляемым взаимозаменяемо в данном контексте, является иммуноген. Патоген относится к специфическому возбудителю болезни, такому как бактерия, грибок, простейшее, паразит или вирус.

Термин витрификация в контексте изобретения означает сушку жидкого биологического препарата до низкого влагосодержания (например, ниже примерно 4%) и внешнего вида, напоминающего сладкую (сахарную) вату, с проведением ряда контролируемых понижений давления в течение определенных периодов времени в определенных диапазонах температур. Витрификация может осуществляться в любой камере или контейнере, включающем лиофильную сушилку, в котором давление воздуха и температура могут регулироваться в пределах диапазонов, указанных в настоящем изобретении. Термины витрифицированная композиция и витрифицированный препарат могут употребляться взаимозаменяемо и означают любую композицию, препарат или смесь, подвергнутые описанному здесь способу витрификации.

В контексте изобретения термины иммуногенная композиция, иммунологическая композиция и иммуногенная или иммунологическая композиция охватывают любую композицию, которая вызывает иммунный ответ против представляющего интерес антигена или иммуногена, экспрессированного векторами; например, после введения ее субъекту вызывает иммунный ответ против представляющего интерес антигена- или иммуногена-мишени. Термины вакцина и вакцинная композиция охватывают любую композицию, которая индуцирует защитный иммунный ответ против представляющего интерес антигена или которая эффективно защищает от антигена, например, после введения или инъекции ее субъекту вызывает защитный иммунный ответ против антигена- или иммуногена-мишени либо обеспечивает эффективную защиту от антигена или иммуногена, экспрессированного векторами.

В контексте изобретения термин поливалентный означает иммуногенную композицию или вакцинную композицию, содержащую более одного антигена из одного и того же или разных видов, либо иммуногенную композицию или вакцинную композицию, содержащую комбинацию антигенов из различных родов.

- 5 031229

Активный иммуногенный компонент в контексте настоящего изобретения включает живые аттенуированные патогены, такие как живые аттенуированные вирусы, живые аттенуированные бактерии, грибки или паразиты. Если активный иммуногенный компонент является частью поливалентной иммуногенной композиции, суспензии или раствора живых аттенуированных вирусов CDV и cPi2 по изобретению, то активный иммуногенный компонент может предпочтительно происходить из другого патогена, а не парамиксовируса. Изобретением охватываются также рекомбинантные гетерологичные иммуногены или антигены, происходящие из одного или более патогенов, описанных здесь, которые могут содержаться и экспрессироваться, inter alia, в вирусных векторах, бактериальных векторах, грибковых векторах и плазмидных векторах. Изобретение также охватывает эпитопы гетерологичных иммуногенов или антигенов, происходящих из одного или более патогенов, иммуномодуляторы, такие как цитокины, терапевтические агенты, токсины, антитела, антигенсвязывающие фрагменты антитела, адъюванты, или другие виды, такие как антисмысловые РНК, каталитические РНК, малые (короткие) интерферирующие РНК, наряду с прочими.

Термин ветеринарная композиция означает композицию, содержащую вектор для применения в ветеринарии, экспрессирующий терапевтический белок, такой как, например, эритропоэтин (ЕРО), или иммуномодулирующий белок, такой как, например, интерферон (IFN). Равным образом, термин фармацевтическая композиция означает композицию, содержащую вектор для экспрессии терапевтического белка.

Композиции и способы настоящего изобретения могут соответственно применяться для стабилизации и витрификации любого биологического вещества/агента или комбинации биологическое вещество/агент плюс фармацевтический/ветеринарный агент. Биопрепараты включают, но не ограничиваются, иммуномодуляторами, такими как цитокины, терапевтические агенты, токсины, антитела, антигенсвязывающие фрагменты антитела, адъюванты, или другие виды, такие как антисмысловые РНК, каталитические РНК, малые интерферирующие РНК, наряду с прочими. После восстановления витрифицированных материалов/веществ эти соединения могут использоваться для предупреждения заболеваний в рамках профилактической иммунизации или облегчения симптомов заболевания в рамках терапевтической иммунизации.

Изобретение предлагает способ витрификации живых аттенуированных иммуногенных композиций, которые могут содержать по меньшей мере один стабилизатор, например нередуцирующие сахара или антиоксидантные соединения. В некоторых вариантах осуществления изобретения стабилизаторы витрификации могут необязательно включать по меньшей мере один нередуцирующий олигосахарид и/или по меньшей мере один наполнитель, и/или по меньшей мере один сахарный спирт. Эти стабилизаторы могут сохранять или способствовать сохранению иммуногенности, инфективности и жизнеспособности биологических ингредиентов, включающих, но не ограниченных, вирусы, бактерии, грибки, паразиты, белки, полипептиды, наряду с прочими. Стабилизаторы, применяемые в способах витрификации по изобретению, могут иметь хороший внешний вид, включая, например, однородную форму и окраску, и являются безопасными для введения в организм субъекта.

Редуцирующий моносахарид - это сахарид, способный отдавать электроны и восстанавливать тем самым другое соединение в окислительно-восстановительных реакциях. В большинстве случаев редуцирующий моносахарид содержит в своей структуре альдегидные или кетоновые группы. Существуют колориметрические тесты для идентификации редуцирующих сахаров, например тест с реактивом Фелинга, который дает изменение цвета с интенсивно-синего на красный, так как ион меди в реактиве восстанавливается до металлической меди в присутствии редуцирующего сахара. В настоящем изобретении редуцирующий моносахарид предпочтительно включает глюкозу, галактозу, фруктозу, маннозу, сорбозу или их комбинации. В одном варианте осуществления изобретения используется комбинация по меньшей мере двух редуцирующих моносахаридов. Редуцирующие моносахариды имеют важное значение для защиты композиций, в частности белков и живых аттенуированных патогенов, в процессе лиофильной сушки, особенно на стадии сублимации (т.е. первой и второй стадиях обезвоживания), на которой редуцирующие моносахариды занимают место сублимированной воды и поддерживают когезию биологической структуры.

Для стабилизации препаратов, витрифицированных способом по настоящему изобретению, необязательно могут добавляться сахарные спирты и/или нередуцирующие олигосахариды. Настоящее изобретение предлагает комбинации редуцирующих моносахаридов и сахарных спиртов, комбинации редуцирующих моносахаридов и нередуцирующих олигосахаридов и комбинации редуцирующих моносахаридов, сахарных спиртов и нередуцирующих олигосахаридов. Не ограничивающим примером сахарного спирта может быть сорбит, маннит, ксилит или мальтит.

Нередуцирующие олигосахариды в контексте изобретения представляют собой сахара, содержащие от двух до десяти единиц сахарида, которые не способны восстанавливать другое соединение в окислительно-восстановительных реакциях. В настоящем изобретении нередуцирующий олигосахарид может быть нередуцирующим дисахаридом или нередуцирующим трисахаридом, преимущественно включающим трегалозу, сахарозу или раффинозу. Стабилизаторы по изобретению могут также включать смесь по меньшей мере из двух нередуцирующих олигосахаридов.

- 6 031229

Соединение кислотный антиоксидант определяется как химическое соединение, которое реагирует с и нейтрализует оксиданты, свободные радикалы (т.е. молекулы с неспаренными электронами) или химические соединения, которые выделяют свободные радикалы. В контексте настоящего изобретения антиоксидантное соединение может быть в кислотной форме. Кислотные антиоксиданты включают, но не ограничиваются, аскорбиновую кислоту и/или кислые аминокислоты, такие как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота. Комбинации из более чем одного кислотного антиоксиданта являются подходящими компонентами препаратов, витрифицированных способами настоящего изобретения.

Наполнители также являются подходящими компонентами композиций, витрифицированных согласно настоящему изобретению. Наполнители могут представлять собой фармацевтически приемлемые или приемлемые для ветеринарии полимеры, такие как, но весь перечень не ограничивается названными здесь, декстран, мальтодекстрин, поливинилпирролидон (PVP), кросповидон и гидроксиэтилированный крахмал. Другие не ограничивающие примеры производных крахмала включают микрокристаллическую целлюлозу, метилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксиэтилметилцеллюлозу и гидроксипропилметилцеллюлозу. Наполнители повышают величину T'g биологических композиций, что позволяет применять повышенные температуры в процессе замораживания. Величина T'g определяется как температура стеклования, которая соответствует температуре, ниже которой замороженная композиция становится стекловидной. Наполнитель может содействовать обеспечению хорошего внешнего вида витрифицированных масс по настоящему изобретению, внешний вид которых напоминает легкую, пушистую сладкую (сахарную) вату.

Если в качестве наполнителя используется декстран, то его молекулярная масса может составлять примерно от 5000 до 70000 Да, предпочтительно примерно от 10000 до 40000 Да. Если в качестве наполнителя используется PVP, то его молекулярная масса может составлять примерно от 8000 до 360000 Да, в частности примерно от 10000 до 60000 Да.

Если в качестве наполнителя используется мальтодекстрин, то его декстрозный эквивалент (DE, который является количественной мерой степени гидролиза крахмального полимера) может составлять примерно от 3 до 20, предпочтительно примерно от 5 до 18, более предпочтительно примерно от 10 до 15. Если в качестве наполнителя используется гидроксиэтилированный крахмал, то его молекулярная масса может составлять примерно от 70000 до 450000 Да, предпочтительно примерно от 130000 до 200000 Да. Степень замещения гидроксиэтилированного крахмала может быть примерно от 0,4 до 0,7, в частности примерно от 0,4 до 0,6. Степень замещения определяется как количество гидроксиэтилированных групп на единицу глюкозы.

Некоторые компоненты биологических препаратов, включая стабилизаторы, могут быть трудно растворимыми. Однако для специалиста в данной области не составит труда заменить их соответствующим образом аналогичными компонентами (например, выбрав более растворимый компонент) и/или адаптировать количество нерастворимого компонента, присутствующего в стабилизаторе, к цели получения растворимого стабилизатора. Растворимость компонента может легко контролироваться визуальным тестом на растворимость. Тест на растворимость включает стадии добавления всех компонентов стабилизатора при температуре около 55°C и смешивания их в продолжение примерно 30 мин. Спустя примерно 24 ч при комнатной температуре без применения мешалки может проводиться визуальный контроль стабилизатора на появление осадка. Если стабилизатор прозрачный - значит все компоненты стабилизатора являются растворимыми.

Биологические препараты, витрифицированные согласно настоящему изобретению, могут содержать любое число стабилизаторов. Табл. 1 приводит несколько примеров. Dextran содержит декстран40000, имеющий молекулярную массу 40000 Да.

Таблица 1

Составы стабилизаторов

Стабилизаторы	Редуцирующий(е) моносахарид(ы) или смесь	Кислотный антиоксидант	Наполнитель	Растворитель
F2	Глюкоза (5%мас./об.) Раффиноза (5% мас./об.)	Аспарагиновая кислота (0,50% мас./об.)	“Dextran” (10% мас./об.)	Вода для инъекций (до 100% об./об.)
F2B	Глюкоза (3% мас./об.) Раффиноза (3% мас./об.)	Аспарагиновая кислота (0,20% мас./об.)	“Dextran” (6% мас./об.)	Вода для инъекций (до 100% об./об.)
F6B	Галактоза (3% мас./об.) Маннит (6% мас./об.)	Аспарагиновая кислота (0,40% мас./об.)		Вода для инъекций (до 100% об./об.)
F33	Глюкоза (5% мас./об.) Фруктоза (5% мас./об.)	Аспарагиновая кислота (0,50% мас./об.)	“Dextran” (10% мас./об.)	Вода для инъекций (до 100% об./об.)
F37	Глюкоза (5% мас./об.) Раффиноза (5% мас./об.) Сорбит (10% мас./об.)	Аспарагиновая кислота (0,50% мас./об.)		Вода для инъекций (до 100% об./об.)
А	Глюкоза (1% мас./об.) Галактоза (5% мас./об.)	Аспарагиновая кислота (0,50% мас./об.)	“Dextran” (6% мас./об.)	Вода для инъекций (до 100% об./об.)
Н	Глюкоза (5% мас./об.) Раффиноза (5% мас./об.)	Аспарагиновая кислота (0,50% мас./об.)	“Dextran” (6% мас./об.)	Вода для инъекций (до 100% об./об.)
К	Глюкоза (5% мас./об.) Сахароза (1% мас./об.)	Аспарагиновая кислота (0,50% мас./об.)	“Dextran” (6% мас./об.)	Вода для инъекций (до 100% об./об.)
и	Глюкоза (1% мас./об.) Галактоза (1% мас./об.)	Аспарагиновая кислота (0,50% мас./об.)	“Dextran” (6% мас./об.)	Вода для инъекций (до 100% об./об.)

Изобретением также предлагается витрифицированная иммуногенная композиция, которая приго- 7 031229 товляется путем первоначального получения иммуногенной суспензии или раствора, содержащего живой аттенуированный вирус, такой как (но весь перечень не ограничивается названными здесь) парамиксовирус, и последующей витрификации указанной суспензии или раствора способами настоящего изобретения. Парамиксовирус собак может включать, inter alia, вирус чумы собак (CDV) и вирус парагриппа 2 типа собак (cPi2), оба в форме живых аттенуированных вирусов.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение охватывает витрифицированные живые аттенуированные парамиксовирусы, в частности парамиксовирусы собак. Парамиксовирус собак - это вирус семейства Paramyxoviridae, которое включает вирус чумы собак (CDV) и вирус парагриппа 2 типа собак (cPi2). Парамиксовирусы собак ответственны за множество заболеваний у многих видов хищников, в частности домашних животных, таких как собаки, или диких животных, таких как хорьки, львы, тигры и леопарды.

В контексте настоящего изобретения термин готовая к расфасовке вакцинная композиция означает композицию, которая выходит на конечной стадии производства антигенов, очищенную или неочищенную, моновалентную или после поливалентного смешивания. Термин сухая вакцинная композиция означает композицию, в которой остаточное влагосодержание составляет менее или равное примерно 4% или примерно 3% и которая готова для восстановления водным раствором для последующего использования в качестве вакцины или непосредственно в виде высушенных частиц. Сухая вакцинная композиция может также измельчаться и смешиваться с соответствующими вспомогательными веществами (эксципиентами), включая связующие вещества, для получения пригодных для перорального приема единиц дозирования, например таблеток и пилюлей.

Настоящее изобретение относится также к способу стабилизации одного или более живых аттенуированных парамиксовирусов. На конечной стадии производства живых аттенуированных парамиксовирусов (например, культивирование на клетках, инфицирование и культивирование вируса с последующей очисткой в одну или более стадий) полученный урожай очищенных или неочищенных и концентрированных или неконцентрированных вирусов, включая живой аттенуированный парамиксовирус, разводится добавлением стабилизатора с последующей витрификацией.

Живая аттенуированная вакцинная или иммуногенная композиция имеет следующие преимущества: она может вводиться в малых дозах, особенно если она самореплицирующаяся; она точно имитирует природную инфекцию/инфекцию вирусом дикого типа в организме субъекта и в то же время обеспечивает субъекта всеми возможными иммунологически важными антигенами, т.е. при однократном введении.

Существует общее мнение, что иммуногенные композиции или вакцинные композиции на основе живых аттенуированных микроорганизмов обладают способностью индуцировать высокоэффективный тип иммунного ответа. Такие иммуногенные или вакцинные композиции имеют то преимущество, что после иммунизации животного-хозяина проникновение патогена в организм хозяина вызывает ускоренную мобилизацию врожденного, клеточно-опосредованного или гуморального, иммунитета, который способен контролировать дальнейший рост организма до того, как инфекция может достигнуть клинически значимого распространения. Иммуногенные композиции или вакцинные композиции на основе убитого патогена (убитой вакцины) в большинстве случаев рассматриваются в уровне техники как неспособные достигнуть или маловероятно, что достигнут указанного типа ответа. Однако иммуногенные композиции или вакцинные композиции, которые содержат живой патоген, в зависимости от уровня аттенуации несут с собой опасность того, что иммунизированный хозяин после иммунизации может заболеть той болезнью, защиты от которой он ищет. Поэтому наиболее желательными являются иммуногенные композиции или вакцинные композиции, которые обладают иммунизирующими свойствами живого патогена, но которые неспособны вызывать нежелательные побочные эффекты при введении их субъекту.

Живые аттенуированные патогены могут создаваться путем введения широкого спектра мутаций, включающих изменения единичных нуклеотидов, сайт-специфические мутации, инсерции, замены, делеции или перестройки. Эти мутации могут оказывать влияние на малый сегмент генома патогена, например от 15 до 30 нуклеотидов, или на большие сегменты генома патогена, например от 50 до 1000 нуклеотидов, в зависимости от природы мутации. Например, мутации могут вводиться выше (против хода транскрипции) или ниже (по ходу транскрипции) от некодирующей регуляторной области или элемента патогена с тем, чтобы нейтрализовать или ослабить его активность, что приводит к аттенуированному фенотипу.

Мутации в некодирующих регуляторных областях генома патогена, которые могут приводить к подавлению репликации гена патогена и/или к подавлению транскрипции гена патогена, могут иметь результатом образование дефектных патогенов в каждом цикле репликации, т.е. патогенов, содержащих меньше, чем полный комплемент, геномных областей или сегментов, необходимых для полностью инфекционного патогена. Следовательно, измененный патоген будет проявлять аттенуированные характеристики в том, что этот патоген будет порождать более дефектные патогены, чем патогены дикого типа, в каждом цикле репликации. Однако, поскольку количество белка, антигена или иммуногена, синтезируемого в каждом цикле, одинаково как для патогена дикого типа, так и для дефектного патогена, то такие аттенуированные патогены, по всей вероятности, способны индуцировать эффективный иммунный

- 8 031229 ответ в организме субъекта.

Если ген патогена кодирует структурный белок, например, в случае патогенов, таких как вирусы, капсидный, матриксный, поверхностный или оболочечный белок, то количество частиц, образующихся в процессе репликации, будет снижаться, так что мутированный патоген будет показывать аттенуированные характеристики, например титр, который приводит к субклиническим уровням инфекции. Например, снижение экспрессии вирусного капсида может уменьшить число упакованных нуклеокапсидов в процессе репликации, в то время как снижение экспрессии оболочечного белка может снизить количество и/или инфективность вирионов потомства. Альтернативно, снижение экспрессии вирусных ферментов, необходимых для репликации, например, полимеразы, репликазы, геликазы и др., должно снизить число геномов потомства, генерируемых в процессе репликации. Поскольку количество инфекционных частиц, образующихся в ходе репликации, снижается, измененные вирусы показывают аттенуированные характеристики. Однако количество образующихся частиц антигенного вируса в большинстве случаев будет достаточным для индуцирования интенсивного иммунного ответа в организме субъекта.

Альтернативный путь создания аттенуированных патогенов предусматривает введение мутации, включающей, но не ограниченной, инсерцию, делецию или замену одного или более аминокислотных остатков и/или эпитопов, в один или более белков патогена. Это может легко осуществляться путем конструирования соответствующей мутации в последовательности соответствующего гена патогена. Любое изменение, которое изменяет активность белка патогена таким образом, что репликация модифицируется или снижается, охватывается настоящим изобретением.

Например, в контексте аттенуированных вирусов мутации, которые препятствуют, но полностью не устраняют прикрепление вируса к рецепторам клетки-хозяина и последующее инфицирование, могут быть сконструированы в вирусных поверхностных антигенах или вирусных протеазах, вовлеченных в процесс получения аттенуированного штамма. Вирусные поверхностные антигены или факторы вирулентности могут модифицироваться таким образом, чтобы они содержали инсерции, замену или делеции одной или более аминокислот или эпитопов, которые мешают или снижают аффинность связывания вирусного антигена по отношению к рецепторам клетки-хозяина. Этот подход дает дополнительное преимущество в том, что можно получить химерный вирус, который экспрессирует чужой или гетерологичный эпитоп и который также показывает аттенуированные характеристики. Такие вирусы являются идеальными кандидатами для применения в качестве живых рекомбинантных вакцин.

Мутации, сконструированные в любом из вирусных ферментов, включают, но не ограничиваются, инсерции, делеции и замены в аминокислотной последовательности активного участка фермента. Например, сайт связывания фермента может быть изменен таким образом, чтобы его аффинность связывания по отношению к субстрату снизилась, в результате чего фермент станет менее специфичным и/или эффективным. Например, хорошей целью является вирусный полимеразный комплекс, поскольку чувствительные к температуре мутации существуют во всех полимеразных белках. Поэтому изменения для введения в положения аминокислот, ассоциированные с такой температурной чувствительностью, могут быть сконструированы в вирусном полимеразном гене таким образом, чтобы получить аттенуированный вирусный штамм.

CDV - это оболочечный вирус с одноцепочечной РНК, около 100-300 нм в диаметре, относящийся к роду Morbillivirus. Ядро вириона CDV содержит нуклеопротеин(NP)-пептид, который тесно связан с вирусной РНК. Вторым коровым пептидом является фосфопротеин (Р). Оболочка CDV содержит три пептида - белок М (матриксный белок) и два гликопротеина. Гликопротеины представляют собой гликопротеины гемагглютинина (Н) и слитый гликопротеин (F). Слитый гликопротеин расщепляется на мелкие субъединицы, обозначенные как F₁ и F₂. Белок Н отвечает главным образом за адсорбцию вируса на клетках-мишенях, а слитый гликопротеин ответственен за слияние клетки-с-клеткой. В настоящее время считается, что изоляты всех известных вирусов чумы содержат эти общие вирусные полипептиды. Передача инфекции собаке происходит через капли взвешенных инфекционных частиц, и трансмиссия вируса облегчается за счет кашля, чиханья и безвыгульного содержания в жарком, влажном, тесном пространстве. Исследования показывают, что вирусная инфекция сначала локализуется в респираторном эпителии верхнего ороназального тракта с последующим распространением в глубокие отделы легочной паренхимы (Gorham Canine Distemper, (1960) Advance Veterinary Science, Brandley and Jungher Editors, 6: 288315).

Тканевые макрофаги и моноциты, локализованные в или по всему респираторному эпителию в миндалинах, являются, по-видимому, доминирующими видами клеток в захвате и репликации CDV. Затем вирус распространяется по кровотоку в отдаленные лимфоретикулярные ткани. Это завершается виремией и обычно происходит в течение от двух до четырех суток после начального заражения. В период между восьмыми и девятыми сутками после заражения вирус распространяется за пределы лимфоретикулярных тканей, поражая эпителиальные и мезенхимальные ткани (Appel, (1969) Am. J. Vet. Res. 30, 1167-1182). Это именно та стадия вирусной инфекции, на которой специфические иммунные ответы хозяина на вирусные антигены влияют на исход болезни. Острая жизнеугрожающая форма болезни характеризуется неограниченным распространением вируса практически в каждую ткань организма. Вирус может обнаруживаться в каждой экскреции и секреции в инфицированном субъекте, и с помощью имму

- 9 031229 нофлуоресцентных методов или методов отслеживания антигенов может наблюдаться присутствие антигена практически в каждом виде клеток в организме собаки. Для большинства из этих животных наиболее вероятной причиной смерти является скоротечное смертельное неврологическое поражение и/или энцефалит.

У некоторых CDV-инфицированных собак наблюдается клинически замедленное прогрессирование болезни и умеренные иммунные ответы, характерные для периода выздоровления. Клинические признаки, если таковые присутствуют, малозаметны на ранней стадии болезни и являются отражением вирусной персистенции в центральной нервной системе (CNS). Последующее развитие болезни по всей CNS носит изменчивый характер. Большинство CDV-инфицированных собак в основном не показывают никаких явных клинических признаков болезни и идентифицируются как выздоравливающие, клинически нормальные собаки. У активно инфицированных собак, которые постепенно выздоравливают после CDV-инфекции, на шестые или седьмые сутки либо спустя примерно шесть или семь суток с момента инфицирования обнаруживаются, как было показано, свободно циркулирующие антивирусные антитела (Krakowka, et al., (1975) J. Infect. Dis. 132, 384-392). Титры быстро повышаются до высоких уровней на ранней стадии выздоровления.

Собаки, пораженные острой CDV-инфекцией, показывают изменчивую степень депрессии, анорексии и лихорадки. Кожа может быть обезвоженной, сухой-огрубевшей и неэластичной. У некоторой части таких животных наблюдается фотофобия (светобоязнь) и симптом слизисто-гнойных выделений из глаз и носа. Периодически возникающая диарея является общераспространенным клиническим признаком. В течение этой острой виремической фазы болезни происходит выделение вируса в среду при каждой секреции и экскреции. По мере прогрессирования болезни может развиться пневмония, зачастую вызываемая вторичной бактериальной инфекцией. У собак в этой стадии болезни наблюдается лимфопения от умеренной до тяжелой формы в зависимости от степени или количества вторичной инфекции. Хотя собаки, пораженные острой инфекцией, могут показывать практически любую комбинацию неврологических признаков, в ее наиболее общем проявлении собаки подвержены малым или большим судорожным припадкам. Эти приступы судорог случаются в течение длительного времени и с увеличивающейся частотой.

Второй неврологической формой чумы собак является такая ее форма, которая наблюдается при энцефалите старых собак (ODE) или после субклинической инфекции и кажущегося выздоровления. CNS-признаки могут сильно варьировать в своем проявлении и могут быть ошибочно приняты за опухоль головного мозга, травму головы, бактериальный менингит, гидроцефалию и заболевание межпозвонковых дисков. Основным не относящимся к нервной системе проявлением CDV-инфекции у собак является CDV-ассоциированная иммуносупрессия (Krakowka, et al., (1980) Am. J. Vet. Res. 41, 284-292). Многие из признаков инфекции вирусом чумы собак представляют собой вторичные инфекционные процессы - от характерных до сопутствующих, происходящие в организме такого ослабленного животного.

Болезнь у собак может также ассоциироваться с бактериальными патогенами, такими как виды бактерий, являющиеся возбудителями пневмонии и включающие, но не ограниченные, Bordetella bronchiseptica, Pasteurella spp., Staphylococcus и Streptococcus spp. Эти бактерии ответственны за гнойный конъюнктивит, ринит и бронхопневмонию, клинически отмечаемые у CDV-инфицированных собак. Смешанные вирусные инфекции, главным образом респираторного типа, также являются общераспространенными. Помимо аденовирусной-2 инфекции, в двойные или множественные смешанные вирусные инфекции могут вовлекаться реовирус, вирус парагриппа собак и предположительно другие вирусы, такие как вирус герпеса собак.

cPi2 представляет собой РНК-вирус, который индуцирует респираторное заболевание, являющееся одним из наиболее распространенных вирусных заболеваний у собак. Если происходит совместное инфицирование комбинацией вируса парагриппа, аденовируса-2 собак с бактериями Bordetella bronchiseptica, то последствием этого является питомниковый вирусный кашель. cPi2 вызывает также трахеобронхит, который у некоторых животных приводит к экссудативной пневмонии. Симптомы кашля проявляются спустя 7-9 суток после заражения вирусом. Клинические признаки остаются умеренными и кратковременными до тех пор, пока не проявятся вторичные инфекции.

cPi2 является сферическим оболочечным вирусом со средним диаметром 150-200 нм, со спиральным нуклеокапсидом, окруженным липидным двойным слоем, покрытым гликопротеиновыми шипами. Каждая вирусная частица содержит геном из однонитевой несегментированной РНК отрицательной полярности с нуклеопротеидом (NP) и фосфопротеином (Р) и большими (L) белками. Заражение вирусом cPi2 происходит через вдыхание воздушно-капельной взвеси инфекционных частиц. Нос и носоглотка являются основными местами локализации инфекции. Вирус инициирует инфекцию главным образом за счет прикрепления к имеющим реснички эпителиальным клеткам в вышеуказанных местах с помощью белков - гемагглютинина и нейраминидазы, которые специфическим образом соединяются с рецепторами нейраминовой кислоты в клетках-хозяевах. Затем вирусы проникают в клетку через слияние с клеточной мембраной, опосредованное рецепторами F₁ и F₂. Вирусы размножаются и проникают в другие клетки как внутриклеточным, так и внеклеточным путем. Размножение вируса происходит в трахеоброн

- 10 031229 хиолярных тканях, вызывая увеличенное образование слизи.

Ларинготрахеит - это воспаление гортани и трахеи, которое, если оно случается у собак, известно как питомниковый вирусный кашель. Основным симптомом является кашель, проявляемый в виде кратковременного сухого покашливания (кх-кх) или приступами такого покашливания. В наиболее тяжелой форме кашель может быть пароксизмальным, и инфекция поражает весь дыхательный тракт, зачастую приводя к пневмонии. Кашель характеризуется также как глубокий, постоянный, непродуктивный (без отделения мокроты, сухой) и в большинстве случаев сопровождается слезотечением и постоянными выделениями из носа. Температура может быть нормальной, хотя в большинстве случаев повышенной. Начало болезни может быть внезапным и может наступать без предварительных признаков. Поскольку болезнь очень заразная, необходимо изолировать инфицированных собак во избежание распространения инфекции на всю популяцию. Болезнь наносит основной экономический ущерб владельцам питомников и, хотя обычно не является угрожающей для жизни, может настолько ослабить собак, что возможно проявление серьезных последствий от других заболеваний.

Живой вирус cPi2 и другие вирусы, такие как CDV, аденовирус 2 типа собак (CAV2) и парвовирус собак (CPV), могут размножаться в культурах животной ткани до тех пор, пока оба вируса не перейдут в непатогенную форму, т.е. вирусы становятся неактивными или, говоря иначе, аттенуированными. Вирус cPi2 способен к размножению в широком спектре систем тканевых культур, таких как, например, куриный эмбрион, утиный эмбрион, почки свиньи, семенники самцов свиньи, эмбриональные почки крупного рогатого скота, почки кошки, почки собаки и почки обезьяны, а также в устойчивых клеточных линиях, таких как, например, клетки Мадин-Дарби почек крупного рогатого скота (MDBK), клетки Мадин-Дарби почек собаки (MDCK) и клетки роговицы глаза кролика Института сывороток (SIRC).

Для размножения, например, аденовируса 2 типа собак (CAV2) предпочитается использовать культуры ткани почек, в частности культуры ткани почек крупного рогатого скота и собаки, поскольку CAV2 не в должной мере реплицируется в других системах культур животной ткани, как это делает вирус cPi2. Аттенуация каждого вируса может выполняться стандартными серийными пассажами, включая методы пассирования с конечными разведениями, которые предусматривают проведение достаточного числа пассажей в чувствительной культуре ткани до тех пор, пока вирус не перейдет в непатогенную форму без потери иммуногенности. Иммуноген, иммуногенная композиция или иммуногенная суспензия либо раствор, приготовленные таким путем, могут стимулировать иммунный ответ у собак, восприимчивых к болезни без проявления клинических симптомов, обычно из-за отсутствия достаточного количества вирулентного агента. Размножение может проводиться в одних и тех же или различных тканях, таких как ткани, описанные выше.

Временные интервалы между пассажами должны быть достаточными для репликации вируса между пассажами, а температуры инкубации предпочтительно поддерживаются на уровне примерно от 30 до 38°C. Оптимальный временной интервал между пассажами зависит от конкретной системы культуры и применяемой температуры. В любом случае независимо от того, произошла ли достаточная или недостаточная репликация вируса, она может легко определяться стандартными методами, такими как метод хемосорбции, описанный в Shelokov, А. (1958) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 97, 802, который особенно подходит для вируса cPi2, или путем цитопатических наблюдений, например, когда вирусу дают возможность расти в течение конкретного пассажа до того момента, когда можно будет наблюдать сильно выраженный цитопатический эффект при продолжающейся инкубации.

Предпочтительный метод размножения утилизирует клетки почек собаки, в частности непрерывные MDCK клеточные линии. Например, в случае иммуногенных или вакцинных композиций можно проводить по меньшей мере около 15 и предпочтительно примерно от 20 до 45 пассажей выделенных вирусов через культуру ткани почек собаки с интервалами примерно в три дня и при температурах инкубации примерно от 30 до 38°C. Предпочитается использовать многократно пассированный материал, поскольку он способствует формированию благоприятных иммунных ответов у субъектов, нуждающихся в этом.

Для получения иммуногенных композиций или вакцинных композиция вирулентный CDV может выращиваться в культивируемых клетках млекопитающих в обычных условиях роста вирусов. Клеткихозяева могут высеваться с вирусом во время посева клеток или с изменением CDV-содержащих сред, если конфлуэнтность монослоя клеток составляет 90-100%. Показатель множественности инфекции (MOI) может равняться примерно от 0,001 до 0,05, предпочтительно примерно 0,01. Для продуцирования вируса или вирусов может использоваться любая подходящая питательная среда для выращивания клеток млекопитающих, такая как, но весь перечень не ограничивается только названными здесь, минимальная поддерживающая среда Игла; среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко; среда Дульбекко, модифицированная по способу Исков; среда Хэма F12; среда F15; среда RPMI 1640, содержащая сыворотку крови животных, такую как фетальная телячья сыворотка, телячья сыворотка, лошадиная сыворотка, собачья сыворотка и т.п., с добавлением примерно от 0 до 10% добавок, таких как Lглутамин и другие аминокислоты как незаменимые, так и заменимые; сбалансированный солевой раствор Хенкса (HBSS), солевой раствор Эрла, пируват натрия, бикарбонат натрия, инсулин, трансферрин, антибиотики и противогрибковые агенты, такие как, но весь перечень не ограничивается только названными здесь, гентамицин, пенициллин, стрептомицин, полимиксин В, амфотерицин и фунгизон (FUNGI

- 11 031229

ZONE®). Настоящее изобретение охватывает также не содержащие сыворотку питательные среды для выращивания клеток.

Инфицированные клеточные культуры поддерживались при температуре примерно от 35 до 40°C в течение примерно от 2 до 7 суток после посева; в это время можно собирать урожай вируса. Инфицированными культурами можно инокулировать питательную среду для клеток, которые могут собираться после дополнительного периода инкубации от 2 до 5 суток. Вируссодержащие жидкости собираются в стерильные контейнеры и могут осветляться фильтрацией. Вируссодержащие жидкости могут далее концентрироваться по традиционной технологии ультрафильтрации (например, системы Millipore Pellicon) с фильтрами, имеющими предельную проницаемость для частиц размером 10⁵ Да.

Другие живые аттенуированные вирусы, которые могут смешиваться со стабилизаторами настоящего изобретения, включают, без ограничения, вирусы бешенства, вирусы гриппа, вирусы парагриппа, вирус паротита, аденовирусы, такие как аденовирус 2 типа собак (CAV2), респираторно-синцитиальный вирус, вирус Эпштейна-Барра, риновирусы, поксвирусы, такие как вирус осповакцины, вирус оспы свиней, вирус оспы енотов; авипоксвирусы, такие как вирус оспы домашней птицы (в основном кур), вирус ветряной оспы канареек, вирус оспы мелких диких голубей, вирус оспы голубей; полиовирусы, вирусы коксаки, ЕСНО-вирусы, коронавирусы, вирус кори, вирус коревой краснухи, вирус опоясывающего лишая, вирусы герпеса (человека и животных), вирус простого герпеса, парвовирусы, такие как парвовирус собак (CPV), цитомегаловирус; вирусы гепатита, такие как вирус инфекционного гепатита собак; папилломавирус человека, альфа-вирусы, такие как вирус леса Семлики, Синдбис вирус, вирус лихорадки реки Росс; вирус восточного энцефалита лошадей, вирус западного энцефалита лошадей, вирус венесуэльского энцефалита лошадей, вирус лихорадки О'ньонг-ньонг; флавивирусы, такие как вирус лихорадки денге и вирус западно-нильской лихорадки; буньявирусы, аденовирусы, ротавирусы, гепаднавирусы, такие как ортогепаднавирусы и авигепаднавирусы; филовирусы, ретровирусы, такие как эндогенный ретровирус свиньи, HTLV-1, HTLV-2, FeLV, BLV, MLV, MMSV, вирус обезьян Мейзона-Пфайзера, лентивирусы, такие как HIV-1, HIV -2, FIV, SIV, BIV, калицивирус кошек, вирус панлейкопении кошек, вирус инфекционного перитонита кошек, вирус ринотрахеита кошек, вирус TGE (инфекционного гастроэнтерита) (свиньи) и вирус ящура.

Иммуногенные композиции или суспензии, или растворы, которые содержат, например, парамиксовирусы собак, смешиваются со стабилизаторами и витрифицируются способами настоящего изобретения. Один объем суспензии или раствора парамиксовируса может смешиваться с одним объемом стабилизатора.

Подходящие препараты, которые могут витрифицироваться описанными здесь способами, включают иммуногенную суспензию или раствор парамиксовируса собаки и по меньшей мере один активный иммуногенный компонент, который происходит из другого патогена, а не парамиксовирусов. Активный иммуногенный компонент в контексте изобретения может включать живые аттенуированные патогены, такие как живые аттенуированные вирусы, бактерии, грибки или паразиты. Однако активный иммуногенный компонент может также включать убитые вирусы, рекомбинантные гетерологичные иммуногены, антигены, иммуногенные субъединицы (например, белки, полипептиды, пептиды, эпитопы, гаптены) или эпитопы иммуногенов либо антигенов, происходящих из одного или более патогенов, описанных здесь, которые могут экспрессироваться с вирусных векторов, бактериальных векторов, плазмидных векторов и т.п.

Активный иммуногенный компонент настоящего изобретения может содержать один или более иммуногенов, выбранных из патогена собак, включающего, но не ограниченного, вирус бешенства, аденовирус 2 типа собак (CAV2), вирус герпеса собак (CHV), парвовирус собак (CPV), коронавирус собак, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorragiae, Leptospira grippotyphosa, Borrelia burgdorferi, Bordetella bronchiseptica и т.п. или их комбинации. Активный иммуногенный компонент может содержать гены НА, F, NP вируса CDV, капсидный ген вируса CPV, шип, гены М, N коронавируса собак, гены HN и F вируса cPi2, гены Leptospira, гены Bordetella, гены Borrelia и гены gB, gC и gD вируса герпеса собак, наряду с другими. Эти компоненты могут быть полезны в качестве иммуногенных композиций или вакцинных композиций для защиты собак от болезни, вызываемой этими патогенами.

Аденовирус 2 типа собак (CAV2) является широко распространенным и высококонтагиозным вирусом собак. Он вызывает симптомы, напоминающие простуду. В большинстве случаев первым признаком контагиозного заболевания является лихорадка, которая обычно проходит через один-два дня. У больных собак могут наблюдаться тонзиллит (ангина), болезненность при ощупывании живота, увеличенная печень, рвота и диарея. Острая фаза болезни обычно приводит к летальному исходу. Для приготовления поливалентной вакцины CAV2 можно инактивировать или аттенуировать и сочетать с CDV (и/или с cPi2). Альтернативно, можно использовать иммуногены или антигены CAV2 либо эпитопы CAV2иммуногенов, такие как капсидные, матриксные или гексоновые белки.

Парвовирус собак (CPV) является типичным кишечным вирусом, который может вызывать рвоту, диарею, гастроэнтерит, миокардит и гепатит у молодых собак. Установлено, что он широко распространен среди собак. CPV может присутствовать в иммуногенных композициях, суспензиях или растворах по изобретению в виде инактивированного, живого аттенуированного вируса или иммуногенов, антигенов

- 12 031229

CPV либо эпитопов CPV-иммуногенов, таких как генные продукты VP1, VP2 (капсид).

Две типичные бактериальные инфекции (Leptospira canicola и Leptospira icterohaemorrhagiae) собак также могут комбинироваться в аттенуированной форме в стабилизированных иммуногенных композициях, суспензиях или растворах по настоящему изобретению. Лептоспирозные инфекции широко распространены у собак и особенно у собак, инфицированных вирусами CDV, cPi2 или комбинациями этих вирусов, как это часто наблюдается у собак, болеющих чумой или питомниковым инфекционным кашлем, поэтому их включение в стабилизированные иммуногенные композиции, суспензии или растворы по настоящему изобретению дает значительную выгоду.

Другой активный иммуногенный компонент, пригодный для использования в композициях и способах настоящего изобретения, может содержать один или более иммуногенов, выбранных из птичьих патогенов, включающих, но не ограниченных, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, вирус инфекционного бронхита (IBV), вирус ньюкаслской болезни (NDV), вирус синдрома снижения яйценоскости (EDS), вирус инфекционного бурсита (IBDV), вирус индеек, вирус птичьего гриппа, вирус болезни Марека, вирусы герпеса, такие как вирус инфекционного ларинготрахеита, вирус птичьего инфекционного бронхита, птичий реовирус, поксвирусы, включающие птичий поксвирус, поксвирус домашней птицы (кур), поксвирус канареек, поксвирус голубей, поксвирус перепелов и поксвирус диких голубей, птичий полиомавирус, птичий пневмовирус, вирус птичьего ринотрахеита, вирус птичьего ретикулоэндотелиоза, птичьи ретровирусы, птичий эндогенный вирус, вирус птичьего эритробластоза, вирус птичьего гепатита, вирус птичьей анемии, вирус птичьего энтерита, вирус болезни Пачеко, вирус птичьей лейкемии, птичий парвовирус, птичий ротавирус, вирус птичьего лейкоза, вирус птичьей мышечноапоневротической фибросаркомы, вирус птичьего миелобластоза, птичий миелобластозассоциированный вирус, вирус птичьего миелоцитоматоза, вирус птичьей саркомы, вирус птичьего некроза селезенки и их комбинации.

Что касается специфических иммуногенов, то активные иммуногенные компоненты могут также быть генами HN и F вируса ньюкаслской болезни, полипротеином и генами VP2 вируса инфекционного бурсита, генами S и N вируса инфекционного бронхита и генами gB и gD вируса болезни Марека. Эти компоненты могут использоваться в качестве иммуногенных композиций или вакцинных композиций для защиты птиц от болезни, вызываемой этими патогенами.

Альтернативно, активный иммуногенный компонент содержит один или более иммуногенов патогена кошек, такого как, но без ограничения, вирус герпеса кошек (FHV), калицивирус кошек (FCV), вирус лейкемии кошек (FeLV), вирус инфекционного перитонита кошек, вирус панлейкопении кошек, вирус иммунодефицита кошек (FIV), вирус бешенства и др. и их комбинации.

Активный иммуногенный компонент может также включать гены gB, gC и gD вируса герпеса кошек, гены env и gag/pro вируса FeLV, гены env, gag/pol и гены tat вируса FIV, капсидный ген калицивируса кошек, S-модифицированный ген, гены М и N вируса инфекционного перитонита кошек и ген VP2 парвовируса кошек. Эти компоненты могут быть пригодны в качестве иммуногенных или вакцинных композиций для защиты кошек от болезни, вызываемой этими патогенами.

Активный иммуногенный компонент может содержать один или более иммуногенов патогена лошадей, такого как вирус герпеса лошадей (1 типа или 4 типа), вирус гриппа лошадей, вирус энцефаломиелита лошадей (EEV), вирус столбняка, вирус западно-нильской лихорадки и др. или их комбинации.

Активный иммуногенный компонент может также включать гены gB, gC, gD и немедленно-ранние гены вируса герпеса 1 типа лошадей, гены gB, gC, gD и немедленно-ранние гены вируса герпеса 4 типа лошадей, гены НА, NA, М и NP вируса гриппа лошадей, гены вируса восточного энцефалита лошадей, гены вируса западного энцефалита лошадей, гены вируса венесуэльского энцефалита лошадей, ргМ-М-Е гены вируса западно-нильской лихорадки и гены вируса артериита лошадей, но они не ограничиваются этими последовательностями. Указанные компоненты могут быть пригодны в качестве иммуногенных или вакцинных композиций для защиты лошадей от болезни, вызываемой этими патогенами.

Активный иммуногенный компонент может содержать один или более иммуногенов патогена крупного рогатого скота, такого как вирус бешенства, ротавирус крупного рогатого скота, вирус парагриппа 3 типа крупного рогатого скота (bCPI2-3), коронавирус крупного рогатого скота, вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), вирус ящура (FMDV), респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота (BRSV), вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (IBR), Escherichia coli, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica и т.п. и их комбинации.

Активный иммуногенный компонент может также выбираться из генов gB, gC, gD и немедленноранних генов вируса герпеса 1 типа крупного рогатого скота, генов F и G вируса BRSV, полипротеина, генов E1, E2 вируса BVDV, генов HN и F вируса PI3 или генов ротавируса. Указанные компоненты могут быть пригодны в качестве иммуногенных или вакцинных композиций для защиты крупного рогатого скота от болезни, вызываемой этими патогенами.

Кроме того, активный иммуногенный компонент может содержать один или более иммуногенов патогена свиней, такого как, но не ограниченного, вирус свиного гриппа (SIV), цирковирус 2 типа свиней (PCV-2), вирус репродуктивного респираторного синдрома свиней (PRRSV), вирус псевдобешенства (PRV), парвовирус свиней (PPV), вирус свиной холеры (HCV), FMDV, Mycoplasma hyopneumoniae, Ery

- 13 031229 sipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Escherichia coli и т.п. и их комбинации.

Активный иммуногенный компонент может также включать гены gB, gC, gD и немедленно-ранние гены вируса PRV, гены НА, NA, М и NP вируса свиного гриппа, полипротеин, E1, E2 вируса свиной холеры, гены ORF1 и ORF2 вируса PCV2, гены ORF3, ORF4, ORF5, ORF6 или ORF7 вируса PRRSV или гены Mycoplasma hyopneumoniae. Указанные компоненты могут быть пригодны в качестве иммуногенных или вакцинных композиций для защиты свиней от болезни, вызываемой этими патогенами.

Активный иммуногенный компонент может содержать последовательности, кодирующие белок, который экспрессируется в патогенах, таких как РНК- или ДНК-вирусы, например HIV, HCV, HBV, HPV, EBV, HSV, CMV, HTLV, хантавирус, вирус Эбола, вирус Марбурга, вирус лихорадки долины Рифт, вирус Ласса и вирус гриппа, вирус геморрагического энтерита (HEV), вирус инфекционного ринотрахеита (IBRV), наряду с прочими. Такие иммуногены могут использоваться преимущественно как иммуногенные композиции или вакцинные композиции для защиты субъектов, таких как человек, от болезни, вызываемой этими патогенами.

Активный иммуногенный компонент может также быть, к примеру, одним из следующих патогенных бактерий и их антигенов: Actinobacillus spp., такие как Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Bordetella bronchiseptica, Bordetella avium, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci; Klebsiella spp., такие как Klebsiella pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium pseudotuberulosis, Mycobacterium pneumoniae, Streptococcus группы А, Streptococcus equi, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans, Neisseria gonorrhoeae; Erysipelothrix spp., энтеротоксигенные бактерии Escherichia coli, Vibrio cholerae, Bacillus anthracis, Haemophilus influenzae, Haemophilus somnus, Haemophilus parasuis; Salmonella spp., Salmonella agona, Salmonella blockley, Salmonella enteriditis, Salmonella hadar, Salmonella Heidelberg, Salmonella montevideo, Salmonella senftenberg, Salmonella cholerasuis; Rickettsia spp., Helicobacter pylori, Helicobacter felis; Shigella spp., Listeria spp., Legionella pneumoniae, Pseudomonas spp., Borrelia spp., Borellia burgdorferi, Neisseria meningitides, Clostridium spp., Clostridium difficile, Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Pasteurella pestis, Campylobacter spp., Campylobacter jejuni, Treponema spp., Leptospira spp., Corynebacterium diphtheria, Hemophilus ducreyi, Hemophilus influenza, Erlichhia spp., наряду с прочими.

Активный иммуногенный компонент может также происходить из гриба или плесени, таких как Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatis, Penicillium spp., Fusarium spp., Candida spp., такие как Candida trichophyton, Candida parapsilosis, Candida glabrata, Candida dubliniensis и Candida albicans; Rhizopus spp., Cryptococcus spp., такие как Cryptococcus neoformans, Cryptococcus grubii, Cryptococcus gattii, Paracoccidiodes brasiliensis, Histoplasma capsulatum и другие грибы и плесени.

Активный иммуногенный компонент может также выбираться из паразитарных антигенов, происходящих из видов паразитов, включающих, но не ограничиваемых, Plasmodium spp., Trypanosome spp., Giardia spp., Boophilus spp., Babesia spp., Entamoeba spp., Eimeria spp., Leishmania spp., Schistosoma spp., Brugia spp., Fascida spp., Dirofilaria spp., Wuchereria spp., Onchocerea spp., Treponema spp., Toxoplasma spp., Cryptococcus spp., Coccidia spp., Histomoniasis spp., Hexamitiasis spp., Giardia spp. наряду с прочими; нематоды, включающие виды Ascaris, Trichinella и др.; гельминты, такие как трематоды, ленточные черви (цепень), наряду с прочими; и другие подобные патогенные организмы. Методы получения иммуногенов, происходящих из вирусов, бактерий, грибков, плесеней, простейших, нематод и гельминтов, известны в уровне техники.

Другими полезными иммуногенами могут быть, например, очищенные секретируемые факторы вирулентности антигенов, такие как токсины, цитотоксины и др. Токсичные антигены, которые детоксифицируются модификацией (токсоиды), могут вводиться в комбинации с адъювантом, таким как гидроксид алюминия, и могут использоваться для стимуляции образования токсиннейтрализующих антител. Примеры токсинов, которые могут использоваться как иммуноген, включают бактериальные эндотоксины и экзотоксины, такие как липополисахарид, энтеротоксины, включающие термолабильные энтеротоксины (LT), термостабильные энтеротоксины(ST), веротоксин (VT) и др. Иммуногены бактериальных экзотоксинов секретируются в окружающую среду и включают, например, дифтерийный токсин (Corynebacterium diphtheriae), столбнячный токсин (Clostridium tetani), энтеротоксины, секретируемые Staphylococcus aureus, ботулиновые токсины (Clostridium botulinum) и токсины, продуцируемые водорослями, такие как нейротоксины, и др. Термостабильные эндотоксины, высвобождаемые автолизом бактерий, включают, например, холерные токсины, высвобождаемые из грамотрицательных Vibrio cholerae, колицины, продуцируемые кишечными бактериями, такими как E. coli (бактериоцин).

Иммуногены, происходящие из вирусов, бактерий, грибков и т.п., могут продуцироваться методами культивирования in vitro с применением соответствующей питательной среды или линий клеток-хозяев, и традиционными методами хорошо известными специалистам в данной области. Например, PRRSV может культивироваться в соответствующей линии клеток, такой как линия клеток МА-104 (см. патенты США №№ 5587164; 5866401; 5840563; 6251404, наряду с другими). Равным образом, PCV-2 может культивироваться с использованием линии клеток PK-15 (см. патент США № 6391314); SIV может культиви- 14 031229 роваться на куриных яйцах (патент США № 6048537) и Mycoplasma hyopneumoniae могут культивироваться в подходящей питательной среде (патенты США №№ 5968525; 5338543; Ross R.F. et al., (1984) Am. J. Vet. Res. 45: 1899-1905). CDV может культивироваться преимущественно в клетках легких норки, в таких, какие описаны в патенте США № 5178862. Другие методы получения иммуногенов вирусного происхождения известны в уровне техники и описаны, например, в Ulmer et al., Science 259: 1745 (1993); Male et al., Advanced Immunology, pages 14.1-14. 15, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, Pa. (1989).

Также пригодными являются иммуногенные синтетические пептиды, которые имитируют антигенные пептидные последовательности. Такие иммуногены могут синтезироваться с помощью твердофазного метода синтеза, описанного, например, в RB. Merrifield, Science 85:2149-2154 (1963), очищаться и необязательно связываться с белком-носителем, таким как мурамилдипептид (MDP), бычий сывороточный альбумин (BSA), гемоцианин лимфы улитки (KLH) и др., с помощью бифункционального связывающего (сшивающего) агента, такого как глутаральдегид и др.

Синтетические антигены также подпадают под определение, например, полиэпитопы, фланкирующие эпитопы и другие рекомбинантные или синтетические антигены; см., например, Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23, 2777-2781; Bergmann et al. (1996) J. Immunol. 157, 3242-3249; Suhrbier, A. (1997) Immunol. Cell Biol. 75, 402-408; Gardner et al. (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, Jun. 28-Jul. 3, 1998. Иммуногенные фрагменты для целей настоящего изобретения могут обычно содержать по меньшей мере примерно 3 аминокислоты, предпочтительно по меньшей мере примерно 5 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере примерно 10-15 аминокислот и наиболее предпочтительно 25 или более аминокислот. Не существует критического верхнего предела для длины фрагмента, который мог бы вместить чуть ли не полноразмерную последовательность белка или даже слитого белка, содержащего два или более либо по меньшей мере один эпитоп белка.

Таким образом, минимальная структура нуклеиновой кислоты, экспрессирующей эпитоп, может содержать нуклеотиды для кодирования эпитопа, иммуногена или антигена белка или полипротеина. Более выгодно, если нуклеиновая кислота, кодирующая фрагмент общего белка или полипротеина, содержит или состоит в основном из или состоит минимум из примерно 21 нуклеотида, преимущественно по меньшей мере из примерно 42 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере из примерно 57, примерно 87 или примерно 150 последовательных или смежных нуклеотидов последовательности, кодирующей общий белок или полипротеин. Процедуры определения эпитопов, такие как создание библиотек перекрывающихся пептидов (Hemmer В. et al., (1998) Immunology Today 19(4), 163-168), Pepscan (Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3998-4002; Geysen et al., (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82, 178-182; Van der Zee R. et al., (1989) Eur. J. Immunol. 19, 43-47; Geysen H.M., (1990) Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health 21, 523-533; Multipin® Peptide Synthesis Kits de Chiron) и алгоритмы (De Groot A. et al., (1999) Nat. Biotechnol. 17, 533-561 и РСТ Application Serial No. PCT/US2004/022605), все из которых включены в полном объеме в настоящую заявку в виде ссылки, могут применяться при практическом осуществлении изобретения без излишнего экспериментирования. Другие документы, цитируемые или включенные в настоящую заявку, также могут использоваться в качестве справочных материалов по методам определения эпитопов иммуногена или антигена и, следовательно, молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют такие эпитопы.

В настоящем изобретении активный иммуногенный компонент может также содержать терапевтический агент, цитокин, токсин, иммуномодулятор, белок, пептид, антитело, антигенсвязывающий фрагмент антитела, адъювант или любую другую молекулу, кодируемую ДНК и желательную для доставки в организм животного или в животную клетку либо ткань.

Настоящим изобретением рассматривается также включение антисмысловых, каталитических или малых интерферирующих видов РНК в иммуногенные композиции и вакцинные композиции по настоящему изобретению, которые могут быть нацелены против любой молекулы, присутствующей в клеткереципиенте или предположительно присутствующей в клетке-реципиенте. Указанные виды РНК включают, но не ограничиваются, виды РНК, кодирующие регуляторные молекулы клеток, такие как интерлейкин-6, агент, вызывающий рак, такой как человеческий папилломавирус, ферменты, вирусную РНК и патогенную РНК, например HIV-1 РНК. РНК также могут быть нацелены на нетранскрибированные ДНК-последовательности, такие как промоторные или энхансерные области, или на любую другую молекулу, присутствующую в клетках-реципиентах, такую как, но без ограничения, ферменты, вовлеченные в синтез ДНК, или молекулы тРНК.

К тому же, цитокины и иммуномодуляторы могут совместно экспрессироваться в иммуногенных композициях и вакцинных композициях настоящего изобретения. Примеры включают, но не ограничиваются, IL-2, IL-4, TNF-α, GM-CSF, IL-10, IL-12, IGF-1, IFN-α, IFN-β и IFN-γ.

Специфические последовательности - мотивы, например RGD-мотив, могут быть вставлены в HIпетлю вирусного или плазмидного вектора для усиления его инфективности. Эти последовательности, как было показано, являются крайне важными для взаимодействия определенных белков внеклеточного матрикса и белков адгезии с суперсемейством рецепторов клеточной поверхности, называемых интегринами. Инсерция RGD-мотива может быть выгодно полезной для иммунокомпромисных субъектов. Ре

- 15 031229 комбинантный вектор может быть сконструирован путем клонирования специфического антигена или иммуногена либо их фрагментов в любой из векторов, таких как описанные здесь. Рекомбинантный вектор может использоваться для трансдукции клеток позвоночных с целью использования в качестве иммунизирующего агента (см., например, заявку на патент США с серийным № 10/424409, включенную в настоящую заявку в виде ссылки).

Предпочтительно кодоны, кодирующие активные иммуногенные компоненты, такие как антигены, иммуногены и эпитопы, являются оптимизированными кодонами, т.е. кодонами, которые часто появляются, например, в высокоэкспрессируемых генах собаки вместо тех кодонов, которые часто используются, например, вирусом CDV или cPi2. Такое использование кодонов обеспечивает эффективную экспрессию активного иммуногенного компонента в клетках. В других вариантах осуществления изобретения, например, в которых активный иммуногенный компонент экспрессируется в бактериях, дрожжах или другой системе экспрессии, паттерн использования кодонов изменяется, с тем чтобы стать ближе к кодонам высокоэкспрессируемых генов в организме, в котором антиген или иммуноген экспрессируется. Паттерны использования кодонов известны в литературе для высокоэкспрессируемых генов многих видов (например, Nakamura et al., 1996; Wang et al., 1998; McEwan et al., 1998).

В некоторых случаях может возникнуть необходимость модификации кодирующей последовательности таким образом, чтобы она могла прикрепляться к управляющим последовательностям с соответствующей ориентацией, т.е. сохраняя собственную рамку считывания. Может быть желательным также получение мутантов или аналогов желательных активных иммуногенных компонентов. Мутанты или аналоги могут быть получены делецией части последовательности, кодирующей белок, инсерцией последовательности и/или заменой одного или более нуклеотидов в последовательности. Методики модификации нуклеотидных последовательностей, такие как сайт-направленный мутагенез, описаны, например, в Sambrook et al., supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

Иммуногены, пригодные в качестве активных иммуногенных компонентов по настоящему изобретению, могут содержаться в векторах. Такие векторы включают, но не ограничиваются, рекомбинантные векторы для экспрессии in vivo, например нуклеинокислотный вектор или плазмида (заявка ЕР № 1001025; Chaudhuri P., (2001) Res. Vet. Sci. 70, 255-6), вирусные векторы, такие как, но без ограничения, аденовирусные векторы, поксвирусные векторы, такие как вектор на основе вируса оспы домашней птицы (патенты США №№ 5174993; 5505941 и 5766599) и вектор на основе вируса ветряной оспы канареек (патент США № 5756103), ретровирусные векторы, векторы на основе вируса герпеса, векторы на основе альфа-вируса, грибковые векторы или бактериальные векторы (Escherichia coli или Salmonella spp.). Конкретные примеры векторов, пригодных для использования в изобретении, описаны в настоящей заявке.

Вектор может быть вирусным вектором, преимущественно вектором на основе вируса оспы птиц, содержащим по меньшей мере один активный иммуногенный компонент или его эпитоп, или его фрагмент. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения вектор на основе вируса оспы птиц является вектором на основе вируса ветряной оспы канареек, предпочтительно - вектором на основе ослабленного вируса ветряной оспы канареек, таким как ALVAC. Ослабленные вирусы ветряной оспы канареек описаны в патенте США № 5756103 (ALVAC) и WO01/05934. Вектор на основе вируса оспы птиц может быть вектором на основе вируса оспы домашней птицы (кур), предпочтительно - вектором на основе ослабленного вируса оспы домашней птицы, таким как TROVAC. Можно сослаться также на патент США № 5766599, который относится к аттенуированному штамму вируса оспы домашней птицы TROVAC. В этом отношении можно упомянуть вирус ветряной оспы канареек, доступный из АТСС под номером доступа VR-111. Имеются также многочисленные вакцинные штаммы вируса оспы домашней птицы, например штамм DIFTOSEC СТ, реализуемый Merial, и вакцина NOBILIS VARIOLE, поставляемая на рынок Intervet; следует сделать ссылку и на патент США № 5766599, который относится к аттенуированному штамму вируса оспы домашней птицы TROVAC.

Вирусный вектор, пригодный также для доставки активных иммуногенных компонентов, включает поксвирус, например вирус осповакцины или аттенуированный вирус осповакцины (например, MVA (модифицированный штамм Анкара), полученный после более чем 570 пассажей вакцинного штамма Анкара на фибробластах куриных эмбрионов, см. Stickl & Hochstein-Mintzel, (1971) Munch. Med. Wschr. 113, 1149-1153; Sutter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 10847-10851, доступный как ATCC VR1508, или NYVAC, см. патент США № 5494807, например, примеры 1-6 патента США № 5494807, в котором обсуждаются конструкция NYVAC, а также варианты NYVAC с дополнительными ORF, делетированными из генома штамма Копенгаген вируса осповакцины, а также инсерция гетерологичных нуклеинокислотных кодирующих последовательностей в сайты этого рекомбинанта, и, наконец, использование специально подобранных промоторов; см. также WO96/40241); вирус оспы птиц или аттенуированный вирус оспы птиц (например, вирус ветряной оспы канареек, вирус оспы домашней птицы (кур), вирус оспы диких голубей, вирус осповакцины, вирус оспы голубей, вирус оспы перепелов, ALVAC или TROVAC, см., например, патенты США №№ 5505941, 5494807), вирус оспы свиней, вирус оспы енотов, вирус оспы верблюдов или миксоматозный вирус.

Информацию о методах создания их рекомбинантов и о том, как вводить эти рекомбинанты, специалист в данной области может найти в документах, перечисленных здесь, и в WO90/12882, например,

- 16 031229 что касается вируса осповакцины, то упоминание об этом содержится в патентах США №№ 4769330, 4722848, 4603112, 5110587, 5494807 и 5762938, inter alia; что касается вируса оспы домашней птицы, то об этом упоминается в патентах США №№ 5174993, 5505941 и US-5766599, inter alia; что касается вируса ветряной оспы канареек, то упоминание об этом можно найти в патенте США № 5756103, inter alia; что касается вируса оспы свиней, то об этом упоминается в патенте США № 5382425, inter alia, а что касается вируса оспы енотов, то упоминание об этом можно найти в WO00/03030, inter alia.

Если экспрессирующим вектором является вирус осповакцины, то инсерционным сайтом или сайтами для нуклеиновой кислоты или нуклеиновых кислот, кодирующих экспрессируемые активные иммуногенные компоненты, такие как иммуногены, антигены, эпитопы и др., преимущественно является ген тимидинкиназы (ТК) или инсерционным сайтом является ген гемагглютинина (НА) либо инсерционный сайт находится в области, кодирующей тельце включения типа A (ATI); см. также документы, цитируемые в описании, особенно те, которые относятся к вирусу осповакцины. В случае вируса ветряной оспы канареек инсерционным сайтом или сайтами преимущественно являются ORF (открытые рамки считывания) - C3, С5 и/или С6; см. также документы, цитируемые в описании, особенно те, которые относятся к вирусу ветряной оспы канареек. В случае вируса оспы домашней птицы инсерционным сайтом или сайтами преимущественно являются ORF - F7 и/или F8; см. также документы, цитируемые в описании, особенно те, которые относятся к вирусу оспы домашней птицы. Об инсерционном сайте или сайтах для вируса MVA речь идет преимущественно в различных публикациях, включая Carroll М.\У. et al. (1997) Vaccine 15(4), 387-394; Stittelaar K.J. et al. (2000) J. Virol, 2000, 74(9), 4236-4243; Sutter G. et al. (1994) Vaccine 12(11), 1032-1040, и в этом отношении необходимо также заметить, что полный геном MVA описан в Antoine G., (1998) Virology 244, 365-396, что позволяет специалисту в данной области использовать другие инсерционные сайты или другие промоторы.

Преимущественно экспрессируемая нуклеиновая кислота может встраиваться под контролем специфического поксвирусного промотора, например промотора 7,5 кДа вируса осповакцины (Cochran et al. (1985) J. Virology 54, 30-35), промотора I3L вируса осповакцины (Riviere et al. (1992) J. Virology 66, 34243434), промотора НА вируса осповакцины (Shida, (1986) Virology 150, 451-457), промотора 42К вируса осповакцины (Cooper J.A. et al. (1981) J. Virol. 37(1), 284-94), промотора ATI вируса осповакцины (Funahashi et al. (1988) J. Gen. Virol. 69, 35-47), промотора ПК вируса осповакцины (патент США № 5017487); промотора Н6 вируса осповакцины (Taylor J. et al. (1988) Vaccine 6, 504-508; Guo P. et al. (1989) J. Virol. 63, 4189-4198; Perkus M. et al. (1989) J. Virol. 63, 3829-3836) или синтетических промоторов вируса осповакцины или поксвируса, inter alia.

Преимущественно для иммунизации млекопитающих экспрессирующим вектором может быть вектор ветряной оспы канареек или вектор оспы домашней птицы. В этом случае экспрессия гетерологичных белков может происходить с ограничением продуктивной репликации или ее полным отсутствием.

Другим вирусным вектором, пригодным для доставки и экспрессии активных иммуногенных компонентов, является аденовирус. Аденовирус - это необолочечный ДНК-вирус. Векторы, происходящие из аденовирусов, имеют ряд особенностей, которые делают их особенно пригодными для переноса генов. Рекомбинантный аденовирусный вектор представляет собой аденовирусный вектор, который несет одну или более гетерологичных нуклеотидных последовательностей (например, две, три, четыре, пять или более гетерологичных нуклеотидных последовательностей). Например, биология аденовирусов подробно охарактеризована; вирус является чрезвычайно эффективным во введении своей ДНК в клетку-хозяина; вирус способен инфицировать множество различных клеток и имеет широкий спектр хозяев; вирус может относительно легко продуцироваться в больших количествах, и вирус может быть превращен в дефектный по репликации путем делеций в ранней области 1 (Е1) вирусного генома.

В отличие, например, от ретровирусов аденовирусы не встраиваются в геном клетки-хозяина, способны инфицировать неделящиеся клетки и способны эффективно переносить рекомбинантные гены in vivo (Brody et al., 1994). Эти особенности делают аденовирусы привлекательными кандидатами для переноса генов in vivo, например, целевой (представляющей интерес) гетерологичной нуклеиновой кислоты в клетки, ткани или субъекты, нуждающиеся в этом.

Аденовирусные векторы, содержащие множественные делеций, являются предпочтительными в плане как увеличения емкости вектора, так и снижения вероятности рекомбинации с образованием компетентного по репликации аденовируса (RCA). Если аденовирус содержит множественные делеций, то совсем необязательно, что каждая из делеций, если таковые присутствуют, приведет к дефектному по репликации вирусу. Пока одна из делеций превращает аденовирус в дефектный по репликации, дополнительные делеций могут включаться для других целей, например для увеличения емкости аденовирусного генома для введения гетерологичных нуклеотидных последовательностей. Предпочтительно более чем одна из делеций препятствует экспрессии функционального белка и превращает аденовирус в дефектный по репликации. Более предпочтительно - все делеции представляют собой делеции, превращающие аденовирус в дефектный по репликации.

Варианты осуществления изобретения, использующие аденовирусные рекомбинанты, могут включать Е1-дефектные или делетированные, Б3-дефектные или делетированные и/или Е4-дефектные или делетированные аденовирусные векторы либо выпотрошенный (gutless) аденовирусный вектор, в

- 17 031229 котором все вирусные гены делетированы. Аденовирусные векторы могут содержать мутации в Е1, E3 или Е4 генах либо делеции в этих или во всех аденовирусных генах. Мутация в Е1 увеличивает безопасность вектора, поскольку считается, что Е1-дефектные мутанты аденовируса являются дефектными по репликации в непермиссивных клетках и, по меньшей мере, высоко аттенуированными. Мутация в E3 повышает иммуногенность антигена за счет разрушения механизма, по которому происходит подавление аденовирусом молекул МНС (главного комплекса гистосовместимости класса I). Мутация в Е4 снижает иммуногенность аденовирусного вектора путем подавления экспрессии поздних генов, в результате чего возможна повторная реиммунизация с использованием того же вектора. Настоящее изобретение охватывает аденовирусные векторы любого серотипа или серогруппы, которые содержат делеции или мутации в Е1, E3, Е4, Е1 и E3, Е1 и Е4.

Выпотрошенный аденовирусный вектор является самой последней моделью в семействе аденовирусных векторов и происходит из последовательностей человеческого аденовируса. Его репликация требует вируса-хелпера и специальной линии человеческих клеток 293, экспрессирующих как Е1а, так и Cre, т.е. условий, которых не существует в природной среде; вектор лишен всех вирусных генов, поэтому он как носитель вакцины не является иммуногенным и может быть инокулирован множество раз для реиммунизации. Выпотрошенный аденовирусный вектор содержит также пространство в 36 кб для размещения представляющей(их) интерес гетерологичной(ых) нуклеиновой(ых) кислоты(кислот), за счет чего возможна совместная доставка большого числа антигенов или иммуногенов в клетки.

Таким образом, вектор в изобретении может быть любым подходящим рекомбинантным вирусом или вирусным вектором, включающим, без ограничения, поксвирус (например, вирус осповакцины, вирус оспы птиц, вирус ветряной оспы канареек, вирус оспы домашней птицы (кур), вирус оспы енотов, вирус оспы свиней и др.), аденовирус (например, аденовирус собаки), вирус герпеса, бакуловирус, ретровирус (как в документах, включенных в настоящую заявку в виде ссылки), либо вектор может быть плазмидой. В документах, цитируемых и включенных в настоящую заявку в виде ссылки, в дополнение к приведенным примерам векторов, пригодных для практического осуществления изобретения, могут также содержаться описание источников других активных иммуногенных компонентов, экспрессируемых вектором или векторами в (или включенных в) стабилизированных иммуногенных композициях, суспензиях или растворах по изобретению.

Элементы для экспрессии активных иммуногенных компонентов могут присутствовать преимущественно в плазмидном векторе. Термин плазмидный относится к любой транскрипционной единице ДНК, содержащей нуклеиновую кислоту согласно изобретению и элементы, необходимые для ее in vivo экспрессии в клетке или клетках желательного хозяина или мишени; в этом отношении следует заметить, что суперскрученная (суперспиральная) или несуперскрученная кольцевая плазмида, а также линейная форма, входят в объем притязаний изобретения.

В минимальном варианте экспрессия активного иммуногенного компонента, такого как антиген, иммуноген и эпитоп, обеспечивается инициирующим (стартовым) кодоном (ATG), стоп-кодоном и промотором и необязательно последовательностью полиаденилирования для определенных векторов, таких как плазмидный и некоторые вирусные векторы, например вирусные векторы, другие чем поксвирусы. Если нуклеиновая кислота кодирует фрагмент полипротеина в векторе, то ATG располагается на 5'-конце рамки считывания, а стоп-кодон располагается на 3'-конце. Могут присутствовать и другие элементы для контроля экспрессии, такие как энхансерные последовательности, стабилизирующие последовательности и сигнальные последовательности, разрешающие экспрессию, модификацию и секрецию белка.

Нуклеинокислотная кодирующая последовательность или нуклеотидная последовательность, кодирующая конкретный белок, представляет собой последовательность ДНК, которая транскрибируется и транслируется в полипептиде in vitro или in vivo, когда она помещена под контроль соответствующих регуляторных элементов. Границы кодирующей последовательности определяются стартовым кодоном на 5'-конце и стоп-кодоном трансляции на 3'-конце. Кодирующая последовательность может включать, но не ограничиваться, прокариотические последовательности, кДНК из эукариотической мРНК, последовательности геномной ДНК из эукариотической (например, млекопитающих) ДНК и даже последовательности синтетической ДНК. Последовательность терминации транскрипции обычно локализуется со стороны 3'-конца по отношению к кодирующей последовательности.

Нуклеинокислотные контрольные элементы собирательно относятся к промоторам, сайтам сплайсинга РНК, сайтам связывания рибосомы, сигналам полиаденилирования (например, сигналам полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота, сигналу полиаденилирования SV40), последовательностям, терминирующим транскрипцию, вышерасположенным (слева, по ходу транскрипции) регуляторным доменам, энхансерам, ориджинам репликации (которые могут быть бактериальными ориджинами, например, из бактериальных векторов, таких как pBR322, или эукариотическими ориджинами, например, автономно реплицирующимися последовательностями (ARS)), сигналам (сигнальным последовательностям) упаковки, лидерным последовательностям, которые могут содержаться или нет в кодирующей последовательности активного иммуногенного компонента, такого как иммуноген, антиген или эпитоп. Если включена сигнальная последовательность, то это может быть или нативная гомологичная последовательность, или гетерологичная последовательность. Лидерные последовательности могут уда

- 18 031229 ляться хозяином в посттрансляционном процессинге; см., например, патенты США №№ 4431739; 4425437; 4338397 и др., которые описывают транскрипцию и трансляцию кодирующей последовательности в клетке-хозяине.

Не все из этих управляющих последовательностей должны в обязательном порядке присутствовать в рекомбинантном векторе при условии, что желательный ген способен транскрибироваться и транслироваться. Регуляторный элемент, такой как промотор, направляет транскрипцию кодирующей последовательности в клетке, если РНК полимераза связывается с промотором и транскрибирует кодирующую последовательность в мРНК. Результирующая мРНК транслируется затем в полипептиде, кодируемом последовательностью.

Множество различных промоторных/энхансерных элементов может использоваться в зависимости от требуемого уровня и места (например, конкретного типа ткани) экспрессии. Промотор может быть конститутивным или индуцибельным (например, металлотионеиновый промотор, тетрациклиновый индуцибельный промотор и экдизоновый индуцибельный промотор, наряду с прочими) в зависимости от желательного паттерна экспрессии. Промотор может быть нативным или гетерологичным и может представлять собой природную или синтетическую последовательность. Гетерологичный в данном контексте описывает область транскрипционной инициации, которая не встречается в клетке-хозяине дикого типа, в которую вводится область инициации транскрипции. Обычно выбирается такой промотор, который будет функционировать в представляющей интерес клетке(ах)-мишени или ткани(тканях)-мишени. Специфические для клеток головного мозга, печени и мышечной ткани (включая специфические для скелетной, сердечной, гладкой мышц и/или диафрагмы) промоторы рассматриваются в настоящем изобретении. Предпочитаются также промоторы млекопитающих и птиц, в частности промоторы собаки.

Промотор может представлять собой преимущественно ранний промотор. Ранний промотор известен в уровне техники и определяется как промотор, запускающий экспрессию гена, который быстро и транзиентно экспрессируется в отсутствие синтеза белка de novo. Промотор также может быть сильным или слабым промотором. Термины сильный промотор и слабый промотор известны в уровне техники и могут определяться относительной частотой инициации транскрипции (... раз в минуту) в промоторе. Сильный или слабый промотор может также определяться своей аффинностью по отношению к РНК полимеразе.

Гетерологичный ген может помещаться под контроль промотора, сайта связывания рибосомы (для бактериальной экспрессии) и необязательно энхансера или оператора, так что последовательность ДНК, кодирующая желательный белок, транскрибируется в РНК в клетке-хозяине или субъекте, трансформированном вектором, содержащим активный иммуногенный компонент.

Регуляторные элементы и другие регуляторные последовательности могут лигироваться с кодирующей последовательностью перед вставкой в вектор, такой как клонирующие векторы, описанные выше. Альтернативно, кодирующая последовательность может клонироваться прямо в экспрессирующий вектор, который уже содержит управляющие последовательности и соответствующий сайт рестрикции.

Более предпочтительно, когда антигены или иммуногены функционально связаны, например, с основным немедленно-ранним промотором цитомегаловируса человека (CMV), промотором вакуолизирующего обезьяньего вируса 40 (SV40), промотором β-актина, промотором альбумина, промотором фактора элонгации 1-α (EF1-a), PyK промотором, MFG промотором или с промотором вируса саркомы Рауса. Другие экспрессирующие управляющие последовательности включают промоторы генов иммуноглобулина, аденовируса, вируса папилломы крупного рогатого скота, вируса герпеса и т.п. При практическом осуществлении изобретения может использоваться также любой вирусный промотор млекопитающего в дополнение к любому вирусному промотору собаки. Из собачьих промоторов вирусного происхождения в способах и векторах по настоящему изобретению могут использоваться промоторы немедленно-ранних генов вируса инфекционного герпеса собаки, ранние (т.е. тимидинкиназа, ДНК геликаза, рибонуклеотидредуктаза) или поздние промоторы. Другие промоторы включают Е1 промотор аденовируса собаки, а также промотор главного комплекса гистосовместимости I собаки. Более того, в компетенции специалиста в данной области выбрать подходящий промотор, который экспрессирует представляющий интерес антиген или иммуноген на достаточно высоких уровнях с тем, чтобы индуцировать или вызвать иммуногенный ответ на антиген или иммуноген без излишнего экспериментирования.

Было выдвинуто предположение, что запуск транскрипции гетерологичных нуклеотидов с помощью CMV промотора может приводить к подавлению экспрессии в организме иммунокомпетентных животных (см., например, Guo et al., 1996). Именно поэтому предпочитается функционально связывание последовательностей антигена или иммуногена, например, с модифицированным CMV промотором, что не приводит к указанному выше подавлению экспрессии антигена или иммуногена.

Векторы по изобретению могут также содержать полилинкер или сайт множественного клонирования (MCS), который преимущественно локализуется ниже (по ходу транскрипции) от промотора. Полилинкер обеспечивает участок для инсерции молекул антигена или иммуногена, которые находятся в одной рамке с промоторной последовательностью, приводя к функциональному связыванию промоторной последовательности с представляющим интерес антигеном или иммуногеном. Сайты множест

- 19 031229 венного клонирования и полилинкеры хорошо известны специалистам в данной области.

Векторы, описанные здесь, могут также содержать гены устойчивости к антибиотикам. Примеры таких генов устойчивости к антибиотикам, которые могут вводиться в векторы по изобретению, включают, но не ограничиваются, ампициллин, тетрациклин, неомицин, зеоцин, канамицин, блеомицин, гигромицин, хлорамфеникол, наряду с другими.

В вариантах осуществления изобретения, в которых более одного антигена или иммуногена, последовательностей антигена или иммуногена могут быть функционально связаны с единичным вышерасположенным(против хода транскрипции) промотором и с одной или более последовательностями нижерасположенного (по ходу транскрипции) участка внутренней посадки рибосомы (IRES) (например, IRESпоследовательность пикорнавируса ЕМС). IRES-последовательность делает возможной трансляцию двух или более кодирующих последовательностей из одной последовательности полицистронной мРНК.

Кроме того, векторы по изобретению могут использоваться для трансформации соответствующей клетки-хозяина или субъекта. Ряд линий клеток млекопитающих известен в уровне техники и включает иммортализованные клеточные линии, доступные из Американской коллекции типовых культур (АТСС), такие как, но не ограничиваемые, клетки яичников китайского хомячка (СНО), клетки HeLa, клетки почки новорожденного хомяка (ВНК), клетки почек обезьян (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2), клетки Мадин-Дарби почки эмбриона крупного рогатого скота (MDBK), клетки Мадин-Дарби почек собаки(MDCK), а также другие. Равным образом, бактерии-хозяева, такие как Е. coli, Bacillus subtilis, Salmonella spp., Shigella spp. и Streptococcus spp., могут найти применение в настоящем изобретении. Дрожжи-хозяева, пригодные для настоящего изобретения, включают, inter alia, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe и Yarrowia lipolytica. Насекомые-хозяева, пригодные для настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются, клетки Spodoptera frugiperda.

Альтернативно, векторы могут использоваться для инфицирования клетки в культуре с целью экспрессии желательного генного продукта, например, для продуцирования представляющего интерес белка или пептида. Предпочтительно белок или пептид секретируется в среду и может очищаться из нее с помощью рутинных методов, известных в уровне техники. Сигнальные пептидные последовательности, которые направляют секрецию белков из клетки, известны в уровне техники, а нуклеотидные последовательности, кодирующие эти белки, могут быть функционально связаны с нуклеотидной последовательностью, кодирующей представляющий интерес пептид или белок, с помощью рутинных методик, известных в уровне техники. Альтернативно, клетки могут быть подвергнуты лизису, а экспрессированный рекомбинантный белок может быть очищен из клеточного лизата. Предпочтительно клетка является клеткой позвоночных, более предпочтительно - клеткой млекопитающих. Методы создания и/или введения вектора или рекомбинантов, или плазмиды для экспрессии продуктов генов по изобретению либо in vivo, либо or in vitro могут быть любыми желательными методами, например методом, описанным или аналогичным описанному в следующих документах: патенты США №№ 4603112; 4769330; 4394448; 4722848; 4745051; 4769331; 4945050; 5494807; 5514375; 5744140; 5744141; 5756103; 5762938; 5766599;

5990091; 5174993; 5505941; 5338683; 5494807; 5591639; 5589466; 5677178; 5591439; 5552143; 5580859;

6130066; 6004777; 6130066; 6497883; 6464984; 6451770; 6391314; 6387376; 6376473; 6368603; 6348196;

6306400; 6228846; 6221362; 6217883; 6207166; 6207165; 6159477; 6153199; 6090393; 6074649; 6045803;

6033670; 6485729; 6103526; 6224882; 6312682; 6348450 и 6312683; патентная заявка США с серийным № 920197, поданная 16 октября 1986 г.; WO 90/01543; W091/11525; WO 94/16716; WO 96/39491; WO 98/33510; ЕР 265785; ЕР 0 370 573; Andreansky et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11313-11318; Ballay et al. (1993) EMBO J. 4, 3861-65; Feigner et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2550-2561; Frolov et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11371-11377; Graham, F.L. (1990) Trends Biotechnol. 8, 85-87; Grunhaus et al. (1992) Sem. Virol. 3, 237-52; Ju et al. (1998) Diabetologia 41, 736-739; Kitson et al. (1991) J. Virol. 65, 3068-3075; McClements et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11414-11420; Moss, B. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11341-11348; Paoletti, E. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11349-11353; Pennock et al. (1984) Mol. Cell. Biol. 4, 399-406; Richardson (Ed), (1995) Methods in Molecular Biology 39, Baculovirus Expression Protocols, Humana Press Inc.; Smith et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3, 2156-2165; Robertson et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11334-11340; Robinson et al. (1997) Sem. Immunol. 9, 271; и Roizman, B. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11307-11312.

Экспрессия в субъекте гетерологичной последовательности может приводить к иммунному ответу в организме субъекта на продукты экспрессии антигена или иммуногена. Таким образом, активные иммуногенные компоненты по настоящему изобретению могут использоваться в иммуногенной композиции или вакцинной композиции в качестве средства для индуцирования иммунного ответа, который может быть, но не обязательно, защитным. Методы молекулярной биологии, применяемые в контексте изобретения, описаны Sambrook et al. (2001).

Еще одной альтернативой или дополнением к вышесказанному является то, что в иммуногенных или вакцинных композициях по настоящему изобретению нуклеотидная последовательность, кодирующая антигены или иммуногены, может содержать делецию из нее части, кодирующей трансмембранный

- 20 031229 домен. Следующей альтернативой или дополнением к вышесказанному является то, что вектор или иммуногенная композиция могут также содержать и экспрессировать в клетке-хозяине нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичную сигнальную последовательность tPA, такую как tPA млекопитающих и/или стабилизирующий интрон, например интрон II кроличьего гена β-глобина.

Вектор может вводиться субъекту в таком количестве, которое позволяет достигнуть количества, установленные для композиций генных продуктов (например, эпитопа, антигена, терапевтического агента и/или антитела). Изобретение охватывает дозировки, ниже и выше тех, которые приведены здесь в качестве примера; и в случае любой композиции, подлежащей введению субъекту, включая ее компоненты, и в случае любого конкретного способа введения предпочитается проводить определение токсичности, например, путем определения 50% культуральной инфекционной дозы на 1 мл элюата (CCID₅₀), летальной дозы (LD) и LD₅₀ для подходящего субъекта, и определение дозировки композиции, концентрации компонентов в ней и сроков введения композиции, которые вызывают подходящий иммунный ответ, например, титрованиями сывороток и их анализа, например ELISA и/или анализом нейтрализации сывороткой. Такое определение не требует излишнего экспериментирования на базе общих знаний специалиста, сведений из данного документа и цитируемых в нем документов.

Поливалентные иммуногенные композиции и/или вакцинные композиции, и/или иммуногенные суспензии или растворы, содержащие живой аттенуированный CAV2, живой аттенуированный CDV, живой аттенуированный cPi2 и живой аттенуированный CPV, и содержащие стабилизатор по настоящему изобретению были протестированы в нижеприведенных примерах. Эти поливалентные вакцины показали хорошую стабильность для CDV, cPi2, CAV2 и CPV. Это указывает на то, что стабилизаторы настоящего изобретения способны сохранять жизнеспособность и инфективность CDV, cPi2, CAV2 и CPV. Это также указывает на то, что стабилизаторы настоящего изобретения способны сохранять жизнеспособность и инфективность множества других вирусов, а не только парамиксовирусов собак, предпочтительно - парвовируса и аденовируса собак.

Стабилизаторы по настоящему изобретению могут также использоваться в качестве моновалентной иммуногенной композиции или вакцинной композиции, содержащей CAV, CPV, CDV или cPi2.

Стадия охлаждения (b) может осуществляться при температурах ниже примерно -40°C (стадия замораживания воды). Сушка стабилизированной иммуногенной суспензии или раствора путем сублимации льда при низком давлении (с) может происходить, например, при давлении, ниже или равном примерно 200 мкбар, в то время как последующее понижение давления может происходить до значения, ниже или равного примерно 100 мкбар. И, наконец, температура стабилизированной иммуногенной суспензии или раствора в процессе удаления избыточной остаточной воды (d) происходит, например, при температурах примерно от 20 до 30°C.

Способ лиофильной сушки может также использоваться применительно к иммуногенной суспензии или раствору, содержащему живой аттенуированный парамиксовирус собак и по меньшей мере один активный иммуногенный компонент другого патогена, отличающегося от парамиксовируса, причем этот компонент смешивается со стабилизатором по изобретению для получения лиофилизированной стабилизированной поливалентной иммуногенной или вакцинной композиции.

Влагосодержание витрифицированного материала может колебаться примерно от 0,5 до 5% (мас./мас), предпочтительно примерно от 0,5 до 3% (мас./мас), более предпочтительно примерно от 1,0 до 2,6% (мас./мас).

Для применения и введения в субъекта витрифицированная стабилизированная иммуногенная композиция или вакцинная композиция может восстанавливаться путем регидратации растворителем. Растворителем в типичных случаях является вода, например деминерализованная или дистиллированная, вода для инъекций, но растворители могут также включать физиологические растворы или буферы, такие как, например, раствор фосфатного буфера (PBS), или адъюванты, включающие, но не ограничиваемые, эмульсии вода-в-масле, Corynebacterium parvum, бацилла Кальметте-Герена, гидроксид алюминия, глюкан, декстран сульфат, оксид железа, альгинат натрия, бакто-адъювант (Bacto-Adjuvant), некоторые синтетические полимеры, такие как полиаминокислоты и сополимеры аминокислот, сапонин, REGRESSIN (Vetrepharm, Athens, Ga.), AVRIDINE (К^диоктадецил-И.И-бис-(2гидроксиэтил)пропандиамин), парафиновое масло, мурамилдипептид и др. Другие конкретные примеры адъювантов и композиций адъювантов детализируются ниже.

Подходящие адъюванты включают fMLP (N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин; патент США № 6017537) и/или полимер акриловой кислоты или метакриловой кислоты, и/или сополимер малеинового ангидрида и алкенилпроизводного. Полимеры акриловой кислоты или метакриловой кислоты могут быть сшитыми, например, полиалкениловыми эфирами сахаров или полиспиртов. Эти соединения известны под термином карбомер (Pharmeuropa, Vol. 8, No. 2, June 1996). Специалист в данной области может также ознакомиться с патентом США № 2909462 (включенным в настоящую заявку в виде ссылки), который обсуждает такие акриловые полимеры, сшитые полигидроксилированным соединением, содержащим по меньшей мере 3 гидроксильные группы; полигидроксилированное соединение содержит не более 8 гидроксильных групп; в другом примере атомы водорода по меньшей мере 3 гидроксилов заменены на ненасыщенные алифатические радикалы, содержащие по меньшей мере 2 атома углерода.

- 21 031229

Радикалы могут содержать примерно от 2 до 4 атомов углерода, например винилы, аллилы и другие этиленоненасыщенные группы. Ненасыщенные радикалы сами могут содержать другие заместители, такие как метил. Продукты, реализуемые под названием Carbopol® (Noveon Inc., Ohio, USA), особенно пригодны для использования в качестве адъювантов. Они бывают сшитыми аллилсахарозой или аллилпентаэритритолом, которые упоминаются в продуктах Carbopol® 974P, 934Р и 971Р.

Что касается сополимеров малеинового ангидрида и алкенилпроизводного, то они упоминаются в продуктах EMA® (Monsanto), которые представляют собой сополимеры малеинового ангидрида и этилена, которые могут быть линейными или сшитыми, например сшитыми дивиниловым эфиром; см. патент США № 6713068 и Regelson, W. et al., 1960; (включенные в настоящую заявку в виде ссылки).

Катионные липиды, содержащие соль четвертичного аммония, описаны в патенте США № 6713068, содержание которого включено в настоящую заявку в виде ссылки, могут также использоваться в способах и композициях настоящего изобретения. Среди этих катионных липидов предпочтение отдается DMRIE Щ-(2-гидроксиэтил)-У№диметил-2,3-бис-(тетрадецилокси)-1-пропанаммоний; WO96/34109), преимущественно ассоциированный с нейтральным липидом, предпочтительно - с DOPE (диолеоилфосфатидилэтаноламин; Behr J.P. et al., 1994), с образованием DMRIE-DOPE.

Общее содержание компонентов в восстановленных готовых для инъекции иммуногенных композициях или вакцинных композициях по изобретению может использоваться для обеспечения инъекции в изотонической концентрации, например, в диапазоне примерно от 100 до 600 мОсм, в большинстве случаев - примерно от 250 до 450 мОсм, предпочтительно около 330 мОсм.

Дозировки живых аттенуированных патогенов, особенно CDV и cPi2, в лиофилизированных стабилизированных иммуногенных композициях или вакцинных композициях или в восстановленных, готовых для инъекций, иммуногенных композициях или вакцинных композициях могут колебаться примерно от 10² до 10⁷ CCID^/дозу, а белков, полипептидов или гликопротеинов в лиофилизированных стабилизированных поливалентных иммуногенных композициях или вакцинных композициях или в восстановленных, готовых для инъекций, поливалентных иммуногенных композициях или вакцинных композициях могут колебаться в эквивалентном титре до инактивации примерно от 10⁵ до 10⁹ CCID50 на дозу, предпочтительно примерно от 10⁶ до 10⁸ CCID50 на дозу.

Восстановленные, готовые к употреблению иммуногенные композиции или вакцинные композиции могут вводиться животному через парентеральный или мукозальный пути введения, предпочтительно внутримышечно и подкожно. Однако введение таких восстановленных, готовых к употреблению иммуногенных композиций или вакцинных композиций может также осуществляться через носовую полость, накожно, местно или перорально. Объем дозы для инъекции может составлять примерно от 0,1 до 2,0 мл, предпочтительно около 1,0 мл.

Изобретение описывается далее в нижеприведенных, не ограничивающих его объем примерах, которые являются иллюстрацией различных вариантов осуществления изобретения и ни в коей мере не ограничивают настоящее изобретение.

Примеры

Пример 1. Способ витрификации биологического материала (общее описание с приведением конкретных параметров).

Биологические композиции витрифицировались в соответствии со следующими общими стадиями:

(1) приготовление биологического препарата, включающее этапы добавления активных биологических ингредиентов, добавления стабилизаторов, которые снижают или устраняют разрушение, вызванное подверганием биологических ингредиентов способу криогенного консервирования, такому как криогенное гранулирование, витрификация и лиофильная сушка, и необязательно добавления одного или более адъювантов, которые повышают иммуногенность биопрепарата в случае иммунологических препаратов;

(2) розлив биологического препарата со стадии (1) во флаконы;

(3) загрузка флаконов в контейнер с контролируемой температурой, в котором температура составляет от -15 до 10°C, в частности от -10 до 5°C, более конкретно около 5°C;

(4) понижение давления воздуха в контейнере с контролируемой температурой до достижения давления в диапазоне от 15 до 30 мбар;

(5) поддержание давления, достигнутого на стадии (4), в течение от 5 до 20 мин, в частности от 10 до 15 мин, с тем, чтобы температура продукта стабилизировалась и создались условия для высвобождения летучих газов, включающих карбонаты, из биологического препарата, при этом температура в контейнере остается на уровне примерно от 4 до 6°C или около 5°C в течение всей стадии;

(6) понижение давления воздуха в контейнере до значения примерно от 4 до 7 или около 5 мбар в продолжение примерно от 5 до 20 мин;

(7) поддержание давления стадии (6) в течение примерно от 30 до 60 мин, что позволяет биологическому препарату стать более концентрированным;

(8) повышение температуры в контейнере с отрицательной до положительной температуры (примерно от 30 до 50°C) в течение от 45 до 85 или около 60 мин и поддержание давления постоянным до

- 22 031229 достижения температуры примерно от 10 до 20°C или около 15°C;

(9) понижение давления воздуха в контейнере до значения примерно от 1,5 до 4 мбар или около 3 мбар для ускорения концентрирования и до достижения температуры в контейнере примерно 30°C с последующим поддержанием этой температуры в течение примерно от 30 до 90 или 60 мин;

(10) последующее понижение давления до значения примерно от 0,5 до 4,0 или около 1 мбар и поддержание постоянного давления до завершения пенообразования;

(11) дальнейшее понижение давления до значения примерно от 5 до 100 или около 25 мкбар при одновременном поддержании температуры около 30°C в течение примерно от 400 до 2400 или более минут до достижения желательного влагосодержания примерно от 0,5 до 15% или примерно от 1 до 4%;

(12) герметичная укупорка флаконов пробками в контейнере лиофильной сушилки и завершение тем самым способа витрификации.

Таблица 2

Витрификация RECOMBITEK® (EURICAN, Merial) на основе вируса чумы собак (CDV) и вируса парагриппа 2 типа собак (PI2)]; HR 4%

Давление	Температура полок сушилки	Температура Ловушки
Стадия	Tps мин	Давление, мбар	Стадия	Tps мин	Темп-ра °C	Стадия	Tps мин	Темп-ра °C
снижение вакуума	0	238	охлаждающие плиты	0	-10	охлаждающая ловушка	20	-70
снижение вакуума	10	30	греющая плита	20	-4
стабильный вакуум	20	30	стабильная	35	-4
снижение вакуума	10	5	греющая плита	60	30
стабильный вакуум	40	5	стабильная	1275	30
снижение	10	з
вакуума
стабильный	15	з
вакуум
снижение вакуума	5	1,5
стабильный вакуум	160	1,5-1
высокий вакуум	1050	/

- 23 031229

Таблица 3

Витрификация IB88: HR 3,9%

Давление	Температура полок сушилки	Температура ловушки
Стадия	Tps мин	Давление, мбар	Стадия	Tps мин	Темп-ра °C	Стадия	Tps мин	Темп-ра °C
снижение вакуума	0	247	охлаждающие плиты	0	-7	охлаждающая ловушка	20	-70
снижение вакуума	10	20	греющая плита	25	-4
стабильный вакуум	15	20	стабильная	20	-4
снижение вакуума	5	5	греющая плита	60	30
стабильный вакуум	50	5	стабильная	1375	30
снижение вакуума	10	3
стабильный вакуум	30	3
снижение вакуума	5	2
стабильный вакуум	85	2-1,5
ВЫСОКИЙ вакуум	1270	/

Таблица 4

Cellules CEP-parquet MO23; Cellules EB66; витрификация СЕР 50/50 S32+S 325 г/л; витрификация ЕВ66 50/50 S32+S 325 г/л

Давление	Температура полок сушилки	Температура ловушки
Стадия	Tps мин	Давление, мбар	Стадия	Tps мин	Темп-ра °C	Стадия	Tps мин	Темп-ра °C
снижение вакуума	0	780	охлаждающие плиты	0	-11	охлаждающая ловушка	30	-70
снижение вакуума	10	22	греющая плита	5	-5
стабильный вакуум	10	22	стабильная	40	-5
снижение вакуума	5	5	греющая плита	70	30
стабильный вакуум	50	5	стабильная	1335	30
снижение вакуума	5	3
стабильный вакуум	40	3
снижение вакуума	10	2
стабильный вакуум	5	2
снижение вакуума	10	1,5
стабильный вакуум	10	1,5
снижение вакуума	10	1
стабильный вакуум	125	1
ВЫСОКИЙ вакуум	1150	/

- 24 031229

Таблица 5

Cellules CEP-parquet 09/17; витрификация СЕР 50/50 S32+S 325 г/л

Давление	Температура полок сушилки	Температура ловушки
Стадия	Tps мин	Давление, мбар	Стадия	Tps мин	Темп-ра °C	Стадия	Tps мин	Темп-ра °C
снижение вакуума	0	660	охлаждающие плиты	0	-5	охлаждающая ловушка	30	-70
снижение вакуума	10	15	стабильная	45	-5
стабильный вакуум	10	15	греющая плита	60	30
снижение вакуума	10	5	стабильная	1330	30
стабильный вакуум	50	5
снижение вакуума	10	3
стабильный вакуум	20	3
снижение вакуума	10	2,5
снижение вакуума	10	2
снижение вакуума	10	1,5
стабильный вакуум	20	1,5
ВЫСОКИЙ вакуум	1275	/

Таблица 6

Витрификация MAREK: HR 5,4%

Давление	Температура полок сушилки	Температура ловушки
Стадия	Tps мин	Давление, мбар	Стадия	Tps мин	Темп-ра °C	Стадия	Tps мин	Темп-ра °C
снижение вакуума	0	780	охлаждающие плиты	0	-5	охлаждающая ловушка	20	-70
снижение вакуума	10	23	стабильная	45	-5
стабильный вакуум	10	20	греющая плита	65	30
снижение вакуума	10	5	стабильная	1325	30
стабильный вакуум	50	5
снижение вакуума	10	3
стабильный вакуум	10	3
снижение вакуума	10	2
снижение вакуума	10	2
снижение вакуума	10	1,5-1
стабильный вакуум	50	1,5-1
высокий вакуум	1255	/

- 25 031229

Таблица 7 Витрификация vCP97 50/50 S11+S 325 г/л: HR 8,2%; витрификация Vcp2017 50/50 S11+S 325 г/л: HR 7,61%;

витрификация vCP97 50/50 F2+S 325 г/л: HR 8,76%; витрификация vCP2017 50/50 F2+S 325 г/л: HR 7,06%

Давление	Температура полок сушилки	Температура ловушки
Стадия	Tps мин	Давление, мбар	Стадия	Tps мин	Темп-ра °C	Стадия	Tps мин	Темп-ра °C
снижение вакуума	0	122	охлаждающие плиты	0	-10	охлаждающая ловушка	30	-70
снижение вакуума	10	23	греющая плита	10	-5
стабильный вакуум	20	23	стабильная	20	-5
снижение вакуума	15	5	греющая плита	100	30
стабильный вакуум	45	5	стабильная	1325	30
снижение вакуума	10	3
стабильный вакуум	10	3
снижение вакуума	5	2
стабильный вакуум	5	2
снижение вакуума	10	1,5
снижение вакуума	10	1
стабильный вакуум	10	1
ВЫСОКИЙ вакуум	1295	/

- 26 031229

Витрификация vCP97 50/50 S11+S 325 г/л: HR 13,1%; витрификация vCP97 50/50 F2+S 325 г/л: HR 8,2%

Таблица 8

Давление	Температура полок сушилки	Температура ловушки
Стадия	Tps мин	Давление, мбар	Стадия	Tps мин	Темп-ра °C	Стадия	Tps мин	Темп-ра °C
снижение вакуума	0	412	охлаждающие плиты	0	4	охлаждающая ловушка	30	-70
снижение вакуума	5	17	стабильная	20	4
стабильный вакуум	10	17	греющая плита	70	30
снижение вакуума	5	14	стабильная	1620	30
стабильный вакуум	10	14
снижение вакуума	5	12
снижение вакуума	5	10
снижение вакуума	10	8
стабильный вакуум	10	8
снижение вакуума	5	6
стабильный вакуум	10	6
снижение вакуума	5	4
стабильный вакуум	5	4
снижение вакуума	5	2
снижение вакуума	5	1,3
стабильный вакуум	60	1,3
ВЫСОКИЙ вакуум	1570	/

- 27 031229

Таблица 9

Витрификация PA Newcastle (вирус ньюкаслской болезни): HR 4,6%

Давление	Температура полок сушилки	Температура ловушки
Стадия	Tps мин	Давление, мбар	Стадия	Tps мин	Темп-ра °C	Стадия	Tps мин	Темп-ра °C
снижение вакуума	0	520	охлаждающие плиты	0	4	охлаждающая ловушка	20	-70
снижение вакуума	5	22	греющая плита	90	30
снижение вакуума	5	17	стабильная	1410	30
стабильный вакуум	10	17
снижение вакуума	5	14
снижение вакуума	5	12
снижение вакуума	5	10
снижение вакуума	5	8
стабильный вакуум	5	8
снижение вакуума	5	6
стабильный вакуум	25	6
снижение вакуума	5	4
стабильный вакуум	5	4
снижение вакуума	5	2
стабильный вакуум	5	2
снижение вакуума	5	1,3
стабильный вакуум	95	1,3
высокий вакуум	1310	/

- 28 031229

Таблица 10

Витрификация PA IB88: HR 4,6%

Давление	Температура полок сушилки	Температура ловушки
Стадия	Tps мин	Давление, мбар	Стадия	Tps мин	Темп-ра °C	Стадия	Tps мин	Темп-ра °C
снижение вакуума	0	490	охлаждающие плиты	0	4	охлаждающая ловушка	25	-70
снижение вакуума	5	22	стабильная	10	4
снижение вакуума	5	17	греющая плита	85	30
стабильный вакуум	10	17	стабильная	1030	30
снижение вакуума	5	12
стабильный вакуум	5	12
снижение вакуума	5	10
снижение вакуума	5	8
снижение вакуума	5	6
стабильный вакуум	40	6
снижение вакуума	5	4
стабильный вакуум	5	4
снижение вакуума	5	2
стабильный вакуум	5	2
снижение вакуума	5	1
стабильный вакуум	150	1
высокий вакуум	865	/

- 29 031229

Таблица 11

Витрификация Pasteurella 50/50 S54+S (325 г/л): HR 5,5%; витрификация Pasteurella 50/50 F2+S (325 г/л): HR 6,1%

Давление	Температура полок сушилки	Температура ловушки
Стадия	Tps мин	Давление, мбар	Стадия	Tps мин	Темп-ра °C	Стадия	Tps мин	Темп-ра °C
снижение вакуума	0	715	охлаждающие плиты	0	4	охлаждающая ловушка	30	-70
снижение вакуума	5	30	стабильная	15	4
снижение вакуума	5	18	греющая плита	75	30
стабильный вакуум	10	18	стабильная	1455	30
снижение вакуума	5	14
стабильный вакуум	5	14
снижение вакуума	5	12
снижение вакуума	5	10
стабильный вакуум	5	10
снижение вакуума	5	8
стабильный вакуум	10	8
снижение вакуума	5	6
стабильный вакуум	30	6
снижение вакуума	5	4
снижение вакуума	5	2
снижение вакуума	5	1
стабильный вакуум	1015	1
высокий вакуум	460	/

- 30 031229

Таблица 12

Витрификация Avibacterium 50/50 S54+S (325 г/л): HR 4,8%; витрификация Avibacterium 50/50 F2+S (325 г/л): HR 6%

Давление	Температура полок сушилки	Температура ловушки
Стадия	Tps мин	Давление, мбар	Стадия	Tps мин	Темп-ра °C	Стадия	Tps мин	Темп-ра °C
снижение вакуума	0	404	охлаждающие плиты	0	4	охлаждающая ловушка	15	-70
снижение вакуума	5	23	стабильная	15	4
снижение вакуума	5	17	греющая плита	80	30
стабильный вакуум	10	17	стабильная	1705	30
снижение вакуума	5	14
стабильный вакуума	5	14
снижение вакуума	5	12
снижение вакуума	5	10
стабильный вакуум	5	10
снижение вакуума	5	8
стабильный вакуум	15	8
снижение вакуума	5	6
стабильный вакуум	20	6
снижение вакуума	5	4
снижение вакуума	5	2
снижение вакуума	5	1
стабильный вакуум	1255	1
высокий вакуум	385	/

- 31 031229

Витрификация vCP2017 50/50 S11+S 325 г/л: HR 7,5%; витрификация vCP2017 50/50 F2+S 325 г/л: HR 7,1%

Таблица 13

Давление	Температура полок сушилки	Температура ловушки
Стадия	Tps мин	Давление, мбар	Стадия	Tps мин	Темп-ра °C	Стадия	Tps мин	Темп-ра °C
снижение вакуума	0	372	охлаждающие плиты	0	4	охлаждающая ловушка	15	-70
снижение вакуума	5	18	стабильная	10	4
снижение вакуума	5	17	греющая плита	75	30
стабильный вакуум	10	17	стабильная	1625	30
снижение вакуума	5	13
снижение вакуума	5	10
снижение вакуума	5	8
снижение вакуума	5	6
стабильный вакуум	30	6
снижение вакуума	5	4
снижение вакуума	5	2
снижение вакуума	5	1
стабильный вакуум	170	1
ВЫСОКИЙ вакуум	1455	/

Витрификация ERN: HR 4,1%

Таблица 14

Давление	Температура полок сушилки	Температура ловушки
Стадия	Tps мин	Давление, мбар	Стадия	Tps мин	Темп-ра °C	Стадия	Tps мин	Темп-ра °C
Снижение вакуума	0	372	охлаждающие плиты	0	4	охлаждающая ловушка	10	-70
Снижение вакуума	5	17	стабильная	15	4
Снижение вакуума	5	15	греющая плита	75	30
стабильный вакуум	10	15	стабильная	1625	30
Снижение вакуума	5	12
Снижение вакуума	5	10
Снижение вакуума	5	8
Снижение вакуума	5	6
Стабильный вакуум	50	6
Снижение вакуума	5	4
Снижение вакуума	5	2
Снижение вакуума	5	1
Стабильный вакуум	135	1
Высокий вакуум	1415	/

- 32 031229

Пример 2. Изучение стабильности после лиофильной сушки.

EURICAN (CDV & PI2) подвергали лиофилизации, витрификации (способом, описанным выше) или криогенному гранулированию. В таблицах приводятся суммарные подробности протестированных иммунологических композиций.

Таблица 15

Изучение стабильности RECOMBITEK® (EURICAN, Merial) в течение 9-месячного периода

	Титр в logio ССШ50/МЛ
Цикл	Лиофилизация EURICAN	Витрификация EURICAN	Г ранулирование EURICAN
Валентность	CDV	PI2	CDV	PI2	CDV	PI2
Целевая композиция	0,48 мл	6,73	0,48 мл	6,73	0,48 мл	6,73
Т 0	5,41	6,14	5,88	6,47	5,07	6,02
Т 3 месяца	5,33	5,95	5,71	6,47	4,72	5,9
Т 6 месяцев	5,4	5,99	5,78	6,39	4,68	5,6
Т 9 месяцев	5,39	5,71	5,76	6,6	4,69	5,88

Таблица 16

Изучение стабильности vCP97 (антигены FeLV с вектором на основе вируса ветряной оспы канареек, Merial FeLV®) в течение 6-месячного периода

	Титр в logio ССШ50/МЛ
	Лиофилизация в стабилизаторе S11	Лиофилизация в стабилизаторе F02	Витрификация в стабилизаторе S11	Витрификация в стабилизаторе F02
Целевая композиция	8,1	8,1	8,1	8,1
Т 0	7,91	7,87	8,2	7,94
Т 6 месяцев	7,56	7,6	7,48	7,65

Таблица 17

Изучение стабильности vCP2017 (WNV с вектором на основе вируса ветряной оспы канареек, Merial RECOMBITEK® WNV) в течение 6-месячного периода

	Титр в logioCCIDso/мл
	Лиофилизация в стабилизаторе S11	Лиофилизация в стабилизаторе F02	Витрификация в стабилизаторе S11	Витрификация в стабилизаторе F02
Целевая композиция	7,5	7,5	7,5	7,5
Т 0	6,87	6,93	7,07	7
Т 6 месяцев	6,34	6,52	6,9	6,53

Таблица 18

Изучение стабильности аттенуированных Avibacterium в течение 3-месячного периода

	Pasteurella	Avibacterium
	Лиофил. в стабил. 54	Лиофил. в стабил. F02	Витриф. в стабил. 54	Витриф. в стабил. F02	Лиофил. в стабил. 54	Лиофил. в стабил. F02	Витриф. в стабил. 54	Витриф. в стабил. F02
Т 0 перед лиофил. OR витриф.	9,73	9,73	9,45	9,45	8,97	8,97	9,01	9,01
Т 0 после лиофил. OR витриф.	8,8	8,88	7,83	7,82	8,15	8,15	4,76	4,58
Т 1 неделя	8,8	8,88	7,84	7,83	/	/	/	/
Т 1 месяц	/	/	/	/	7,58	7,87	5,56	5,63
Т 3 месяца	8,76	8,66	7,78	7,18	/	/	/	/

Таблица 19

Изучение стабильности вирусного препарата болезни Марека, витрифицированного способом настоящего изобретения, в течение 18-месячного периода

	Титр в logioPFU/мл
	091023-1 S32 50%/50% РА	091023-4 S32 1/3-2/3 РА	091126-8 S32+Sac 30%/70% РА
Т 0	4,75	4,65	4,88
Т 6 месяцев	5,11	5,07	5,25
Т 12 месяцев	4,05	3,96	4,37
Т 18 месяцев	4,17	4,05	???

- 33 031229

Вирус инфекционного бурсита (коронавирус), вирус болезни Ньюкасла (NDV), Leishmania KSAC полипептид и CEF-клетки (фибробласты куриных эмбрионов) также были успешно витрифицированы способом настоящего изобретения.

Пример 3. Тестирование вакцин на собаках.

Витрифицированные вакцины, описанные в примере 1, вводили животным после восстановления стерильной водой для инъекций. Четырех собак, свободных от специфической патогенной микрофлоры (SPF), в возрасте от 3 до 5 месяцев и 4 обычных собак в возрасте от 3 до 5 месяцев произвольно распределяли по 4 группам по два животных в каждой, причем каждая группа включала одну SPF-собаку и одну обычную собаку. В каждой группе двух собак иммунизировали подкожно в день-0 двойной дозой (2 мл) соответствующей им витрифицированной/стабилизированной вакцины. В день-14 собак иммунизировали подкожно однократной дозой (1 мл) той же стабилизированной вакцины. Проводили наблюдения за проявлением местных аллергических реакций немедленного типа и общих аллергических реакций немедленного типа, ректальной температурой, местными реакциями, общими реакциями и клиническими симптомами. Никакой местной или общей реакции после введения вакцины не наблюдалось. Следовательно, безопасность витрифицированных/стабилизированных вакцин, по-видимому, является высокой.

Хотя в описании подробно представлены предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, специалисту понятно, что изобретение, регламентируемое прилагаемой формулой изобретения, не ограничивается только изложенными выше конкретными подробностями, поскольку возможны многие очевидные варианты, не ущемляющие сущность или объем изобретения.

Claims (9)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ витрификации биологического материала, включающий стадии:

   (a) приготовления жидкого биологического препарата путем объединения по меньшей мере одного биологически активного ингредиента и по меньшей мере одного стабилизатора, который уменьшает или устраняет разрушение биологически активных ингредиентов в процессе осуществления способа, и наполнение флаконов полученным препаратом;

   (b) воздействия на препарат контролируемыми изменениями давления и температуры для снижения влагосодержания препарата до менее чем примерно 5 мас.% и витрификации тем самым биологического материала, где контролируемые изменения включают следующие этапы:

   A) загрузка флаконов в контейнер с контролируемой температурой, в котором температура составляет от -15 до 10°C, в частности от -10 до 5°C, более конкретно 5°C;

   B) понижение давления воздуха в контейнере с контролируемой температурой до достижения давления в диапазоне от 15 до 30 мбар;

   C) поддержание давления, достигнутого на этапе В), в течение от 5 до 20 мин, в частности от 10 до 15 мин, с тем, чтобы температура продукта стабилизировалась и создались условия для высвобождения летучих газов, включающих карбонаты, из биологического препарата, при этом температура в контейнере остается на уровне от 4 до 6°C или 5°C в течение всей стадии;

   D) понижение давления воздуха в контейнере до значения от 4 до 7 мбар или около 5 мбар в течение от 5 до 20 мин;

   E) поддержание давления этапа D) в течение от 30 до 60 мин, что позволяет биологическому препарату стать более концентрированным;

   F) повышение температуры в контейнере от отрицательной до положительной температуры (между 30-50°C) в течение периода времени от 45 до 85 мин или около 60 мин и поддержание давления постоянным до достижения температуры 10-20°C или около 15°C;

   G) понижение давления воздуха в контейнере до значения от 1,5 до 4 мбар или около 3 мбар для ускорения концентрирования и до достижения температуры контейнера 30°C с последующим поддержанием в течение от 30 до 90 мин или 60 мин;

   H) дальнейшее понижение давления до значения 0,5-4,0 мбар или около 1 мбар и поддержание давления постоянным до завершения пенообразования;

   I) последующее понижение давления до значения между 5 и 100 мкбар или около 25 мкбар при одновременном поддержании температуры на уровне около 30°C в течение 400-2400 или более минут до достижения желательного влагосодержания 0,5-15% или 1-4%;

   J) герметичная укупорка флаконов, находящихся в контейнере, с завершением способа витрификации.
2. 2. Способ по п.1, в котором биологически активным ингредиентом является иммуноген, полипептид, нуклеотид, живой вирус, живые бактерии, живой протист или субъединица, происходящая из болезнетворного или вызывающего болезнь патогена.
3. 3. Способ по п.2, где указанным ингредиентом является живой аттенуированный вирус.
4. 4. Способ по п.3, в котором вирусом является вирус чумы собак (CDV), вирус парагриппа 2 типа собак (PI2) или их комбинации.
5. 5. Способ по п.3, в котором аттенуированным вирусом является вирус ветряной оспы канареек, ви

   - 34 031229 рус болезни Марека, вирус инфекционного бурсита, вирус западно-нильской лихорадки (WNV) или вирус лейкемии кошек (FeLV).
6. 6. Способ по п.2, в котором бактерией является Avibacterium.
7. 7. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором стадия (а) включает добавление одного или нескольких адъювантов для того, чтобы приготовить препарат, содержащий по меньшей мере один адъювант.
8. 8. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором витрифицированный биологический материал является стабильным при 4°C в течение по меньшей мере одного года.
9. 9. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором витрифицированный биологический материал является стабильным при -20 и -80°C в течение по меньшей мере одного года.