EP0386185A1 - Procede d'expression genetique de proteines heterologues par des cellules transfectees in vivo - Google Patents

Procede d'expression genetique de proteines heterologues par des cellules transfectees in vivo

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EP0386185A1
EP0386185A1 EP19890908148 EP89908148A EP0386185A1 EP 0386185 A1 EP0386185 A1 EP 0386185A1 EP 19890908148 EP19890908148 EP 19890908148 EP 89908148 A EP89908148 A EP 89908148A EP 0386185 A1 EP0386185 A1 EP 0386185A1
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EP
European Patent Office
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cells
gene
animal
liposomes
protein
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Withdrawn
Application number
EP19890908148
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German (de)
English (en)
Inventor
Michel Co Fidanza Gerome Fischbach
Miguel Diez Ibanez
Hanwei Cao
Michel Dreano
Christos Tsaconas
Frederic Montandon
Peter Bromley
Prudent Padieu
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Intracel Corp
Original Assignee
Intracel Corp
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Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
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    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins

Definitions

  • the subject of the invention is a method of genetic expression of heterologous proteins transfected by cells in vivo using at least one gene expression vector encapsulated in liposomes, according to which a suspension of liposomes is prepared in which the expression vector is encapsulated and this suspension of liposomes is injected into the circulating blood of an animal.
  • the method according to the invention is intended, on the one hand, to produce an oncogene capable of immortalizing differentiated cells and proliferating in vitro as well as producing proteins of industrial interest.
  • the method according to the invention is intended, on the other hand, to produce in vivo at least one heterologous protein by the cells of the "transfected" animal, as well as antibodies directed against this protein.
  • HBs hepatitis B virus
  • liposomes encapsulating unfractionated mouse DNA were injected into Balb / c mice which do not produce urinary protein 2 (mup2) and mup2 in the urine of these animals.
  • the aim of the present invention is to allow the genetic expression of heterologous proteins by cells transfected in vivo using at least one expression vector for a gene encapsulated in liposomes, so as to allow synthesis various proteins in sufficient quantity for their practical applications.
  • the oncogenic sequences of the ras cell gene of Harvey (as described by Tabin et al., 1982, Nature 300, 143-149) and the gene of growth hormone (hGH) under the control of the protein promoter of the heat shock protein gene of 70,000 d (hsp70 for "heat shock protein 70 kd") (as described by Dreano et al., 1988, Bio / Technology 6, 953-958).
  • the promoter of the hsp70 gene was used. It constitutes a particularly powerful promoter, and it is expressed in almost all eukaryotic cells when these are subjected to a thermal shock and thus makes it possible thus to control the process of expression of the genes which it directs.
  • ⁇ is particularly important in the case of in vivo transfection, in accordance with the present invention, to obtain the best possible expression, in a controlled manner, in order to be able to program the expression and thus mimic the conventional immunization conditions using a purified antigen.
  • it is of great practical interest to be able to extend the field of application of the method according to the invention to the greatest number of types of producer cells.
  • Figure 1 is an autoradiography obtained in an example of the implementation of the invention.
  • Figure 2 is an autoradiography obtained in another example of the implementation of the invention.
  • Monolamellar liposomes were prepared, according to the method of Deamer et al., 1976, Biochem. Biophys. Acta 433, 629-634, from 2 mg of phosphatidylcholine dissolved in 1 ml of chloroform and taken up, after evaporation, in 1 ml of diethyl ether.
  • the final suspension of liposomes is carried out in 1 ml of complete basic synthetic culture medium but without serum, containing 100 ⁇ g of plasmid DNA pl7hGHneo and pEJ.
  • This solution is freed from diethyl ether by bubbling air-C02 (95: 5, v / v), at 20 ° C, while equilibrating the medium at physiological pH with a buffer system, for the purpose of injection.
  • the culture medium used was WME medium (Williams et al., 1974, Exp. Cell. Res. 89, 139-142) containing 10% fetal calf serum as well as. insulin and cortisol.
  • WME medium Williams et al., 1974, Exp. Cell. Res. 89, 139-142
  • fetal calf serum 10% fetal calf serum
  • cortisol cortisol.
  • a test was carried out in parallel on a control rat, using liposomes produced in the absence of plasmids.
  • a culture plate containing 24 culture wells of 2 cm 2 was seeded at the rate of approximately 10 cells per well.
  • the culture medium of the biogenerator was changed every three days, that of the flasks and of the 24-well plate every two days.
  • the number of cells in the biogenerator was evaluated at 21.10? cells, which corresponds to a growth of 5.4 cell generations.
  • the doubling time of the cell population was therefore 27 hours.
  • these parameters could be estimated at 4.7 generations in five days, corresponding to a doubling time of the cell population of 26 hours, therefore very comparable to that of cells cultured in suspension.
  • the cells cultivated in the 24-well culture plate underwent a hyperthermic shock of 43 ° C for 3 h.
  • the hGH was assayed by RIA in each culture medium collected 24 h later.
  • hGH was produced at respective rates of 5, 8 and 20 ng / 10 ⁇ cells / 24 h.
  • the cells of the most productive population were subcultured and seeded in 24 other wells.
  • a new hyperthermic shock was applied 8 days later.
  • HGH was found in 4 of the 24 media collected, at the rate of 3, 5, 9 and 31 ng / 10 6 cells / 24 h.
  • the recombinant cells cultivated in a flask, expressed these two endogenous proteins for a period extending beyond 75 days of culture at rates close to, or even higher than, those of freshly isolated hepatocytes, namely between 15 and 26 ⁇ g / 10 ⁇ cells / 24 h for albumin and around 1.1 ⁇ g / 10 ⁇ cells / 24 h for transferrin.
  • bile acids The production of bile acids by the cells cultivated in a biogenerator 70 days after the culture was measured by gas chromatography-mass spectrometry (Tsaconas et al., 1986, Anal. Biochem. 157, 300-315).
  • the free bile acids were separated from the conjugates by thin layer chromatography.
  • the bile acids that were identified were chenodeoxycholic acid (CDC) and cholic acid (CH). These are the two major primary bile acids in rat liver.
  • the production rates were:
  • CDC 1.7 nmol / mg of cellular protein / 24 h and CH: 3.5 nmol / mg cellular protein / 24 h.
  • the CDC / (CH + CDC) ratio is equal to 33%, a proportion normally observed in the hepatic secretion of these primary bile acids:
  • this secretion which corresponds to 13.1 nmol / mg of cellular protein / 24 h represents approximately 1.5 to 2 times that of normal liver.
  • the hepatocytes constitute 90% of the liver and that it is especially the hepatocytes of the external zone of the hepatic globule which synthesize the bile acids, whereas probably all the recombined cells are responsible for this biosynthesis .
  • the analyzed fraction of bile steroids contained, within the limit of normal values, neutral bile sterols of the hydroxycholesterol and ketocholesterol type, as well as other bile acids dihydroxylated and trihydroxylated which normally accompany the secretion of chenodeoxycholic acid and cholic acid.
  • hepatocytes can be transfected in vivo, in situ in the liver, by two plasmids, each encapsulated in liposomes.
  • the hepatocytes transfected in vivo by the plasmids pEJ and pl7hGHneo, encapsulated in liposomes, injected into the tail vein and cultured, are therefore able to proliferate in vitro, they retain specific functions of the liver, well beyond two months of culture. Part of these hepatocytes, not cloned for this activity, secrete human growth hormone in the culture medium.
  • hepatocytes made proliferative should make it possible to obtain lines of transformed hepatocytes which would keep a high level of fundamental hepatic activity, thus making it possible to study the metabolism of endogenous compounds coming from other tissues and of xenobiotic compounds produced by chemistry. industrial and pharmacy.
  • this model constitutes a tool of great interest for work on the expression of oncogenic genes and genes coding for the biosynthesis of proteins, for industrial production.
  • the plasmids used are the plasmids pl7hGHneo and pl7HBN which both contain the hybrid gene hsp70-hGH (Dreano et al., 1988, Bio / Technology 6, 953-958).
  • Monolamellar liposomes were prepared according to the method of Deamer et al., 1976, Biochem. Biophys. Acta 433, 629-634, from 2 mg of phosphatidylcholine dissolved in 1 ml of chloroform and taken up, after evaporation, in 1 ml of diethyl ether.
  • the final liposome suspensions are produced in 1 ml of complete basic synthetic culture medium but without serum, containing either 100 ⁇ g of plasmid DNA pl7HBN or 100 ⁇ g of plasmid DNA pl7hGHneo or no DNA.
  • These solutions are freed from diethyl ether by bubbling air-C02 (95: 5, v / v), at 20 ° C, while equilibrating the medium at physiological pH with a buffer system, in order to injection.
  • the animals were subjected to thermal stress by raising the ambient temperature to 45 ° C. for 20 min. 1 day after each heat induction, 1 ml of blood from each rat was taken and immediately centrifuged to collect the plasma.
  • Radioimmunoassay radioimmunoassay
  • the plasma samples from rats injected with liposomes encapsulating plasmids p! 7HBN or pl7hGHneo contained between 4 and 6 times more GH than those of the control rat.
  • the assay of the hGH secreted in the blood of the transfected animal was carried out either by radioimmunoassay (hGH-RIA kit, Pasteur Diagnostics, F-92430 Marnes-la-Coquette), or by ELISA immunoenzymatic assay on spherical supports (Sensibead EIA Kit, Terumo Médical Corp., Elkton, MD 21921). TABLE H
  • Two 10-week Fisher F-344 rats received, on the first, twentieth and twenty-seventh days of the experiment, a metacardiac injection of liposomes prepared according to Example 1, encapsulating the plasmid p! 7HBN or p17hGHneo.
  • the animals were subjected to a thermal stress of 20 min at 45 ° C every 3 to 5 days after the first injection.
  • the blood of each animal was taken on the thirtieth day of the experiment and was used to prepare the serum.
  • cells of line 6 obtained by transfection of NIH-3T3 cells with plasmids containing the c- ras oncogene and the hGH gene under the control of the promoter of the human hsp70 gene (Dreano et al., 1986, Gene 49, 1-8), " were incubated at 43 ° C for 2 hours, then 24 hours at 37 ° C in the presence of [35S] -methionine.
  • the culture supernatants of these cells were used to detect the presence of anti-hGH antibodies by the immunoprecipitation technique. Briefly, they were incubated at 4 ° C. for 3 hours either with rat sera injected with the liposomes encapsulating p! 7hGHneo or plTHBN either with an untreated rat serum or with a rabbit serum hyperimmunized against hGH (DAKO ). 'The reaction mixtures were then brought into contact with protein-A Sepharose for 20 hours at 4 ° C.
  • the immune complexes linked to protein A of the sepharose beads were washed three times with NET-NP40 buffer (100 mM NaCl, ImM EDTA, 10 mM Tris pH 7.5, 0.5% NP40) and twice with A RIP A-urea buffer (1M urea, 1% Na deoxycholate, 1% NP40, 0.05 M Tris pH 7.5, 0.15 M NaCl, 0.02 M EDTA).
  • sample buffer 50 mM Tris HC1 pH 6.8, 1% SDS, 10% Glycerol, 0.005% Bromophenol blue, 1.4 M 2- mercaptoethanol
  • sample buffer 50 mM Tris HC1 pH 6.8, 1% SDS, 10% Glycerol, 0.005% Bromophenol blue, 1.4 M 2- mercaptoethanol
  • FIG. 1 show a protein of the molecular weight of hGH (22 kd, indicated by an arrow without tail) whose size was calculated by comparison with the position of proteins of known molecular weight whose position is indicated by a arrow to the left of the figure).
  • the radioactive hGH thus detected was immunoprecipitated by the sera of animals injected with the liposomes encapsulating both the plasmid pl7HBN (1) and p! 7hGHneo (2), and this in a manner comparable to the hGH immunoprecipitated by the serum of commercial rabbit (+).
  • This protein is absent from the sample analyzed with the serum from the untreated rat (-) •
  • the sera were analyzed according to the technique described in Example 3 and compared to the serum of an untreated rabbit and to the serum of a rabbit hyperimmunized against hGH (DAKO).
  • results, presented in FIG. 2, show a band corresponding to a molecular weight of approximately 22 kd (molecular weight of hGH, indicated by an arrow without tail) in the samples containing either the commercial serum (+) or the sera from the 3 rabbits injected with the liposomes encapsulating the plasmid p! 7hGHneo (1, 2, 3). This band is absent in the sample containing untreated rabbit serum (-).
  • Examples 3 and 4 show the presence of anti-hGH antibodies in the serum rats or rabbits injected with the liposomes encapsulating pl7hGHneo or pl7HBN thus confirming that this technique allows the synthesis in vivo of a protein encoded by heterologous DNA injected into liposomes and that the animal's immune response can be stimulated without injecting the antigen.
  • the detection of anti-hGH antibodies in both the blood circulating from rats to "transfected" rabbits formally demonstrates expression of the hGH gene by "transfected" animals.
  • the method according to the invention makes it possible to obtain hyperimmunized animals which can be used subsequently as a source of biological material for the production of monodonal antibodies.
  • the cultured recombinant hepatocytes After culturing the liver of the rat subjected to transfection, the cultured recombinant hepatocytes furthermore secreted hGH 30 days after the cultivation, ie 50 days after the transfection.
  • Co-transfection of hepatocytes from rats or any other animal with a vector plasmid of a selection gene and a vector plasmid of an expression gene of biotechnological interest is therefore possible in vivo.
  • This model makes it possible to obtain highly specialized cells, capable of proliferating in vivo, after explantation and then selection in cell culture of the organ of the "transfected" animal.
  • these proliferative recombinant cells express hepatic functions, together with the recombinant gene.
  • the expression method by in vivo transfection according to the invention is of great interest for producing differentiated cells capable of proliferating in vitro having industrial applications inter alia in the fields of pharmacology, toxicology and carcinogenesis.
  • it makes it possible to insert or reinsert in vivo an unexpressed gene leading to the in vivo synthesis of heterologous biologically active or antigenic proteins. This latter application allows either to vaccinate animals or to use them for the production of antibodies.

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Abstract

Le procédé décrit sert à l'expression génétique in vivo de protéines hétérologues telles que l'oncogène c-ras de Harvey, le gène de l'hormone de croissance humaine (hGH) et le gène de résistance à la néomycine par des cellules transfectées à l'aide de liposome que l'on injecte en suspension dans le sang circulant d'un animal (rat ou lapin). Le vecteur d'expression encapsulé dans les liposomes injectés peut contenir par exemple le gène codant pour un oncogène. Dans ce cas, on prélève de l'animal un organe contenant des cellules différenciées transfectées que l'on remet en culture in vitro afin de sélectionner les cellules qui expriment l'oncogène et qui par conséquent peuvent proliférer in vitro. Lorsque l'animal est injecté avec des liposomes encapsulant le gène de l'hGH et le gène de résistance à la néomycine, les cellules sélectionnées dans des milieux de culture contenant l'antibiotique, produisent l'hGH. D'autre part, lorsque le vecteur d'expression contient le gène de l'hGH sous contrôle du promoteur humain du gène de la protéine de choc thermique de 70 kd, est injecté aux animaux, ceux-ci sécrètent dans le sang circulant, de l'hGH après induction thermique. De plus, la répétition de ces étapes induit la synthèse d'anticorps anti-hGH par l'animal. Les domaines principaux d'application de l'invention sont soit de produire des cellules différenciées capables de profiférer in vitro, soit la production in vivo de protéines hétérologues biologiquement actives ou antigéniques.

Description

Procédé d'expression génétique de protéines hétérologues par des cellules transfectées in vivo
Domaine technique
L'invention a pour objet un procédé d'expression génétique de protéines hétérologues transfectées par des cellules in vivo à l'aide d'au moins un vecteur d'expression de gène encapsulé dans des liposomes, selon lequel on prépare une suspension de liposomes dans lesquels le vecteur d'expression est encapsulé et l'on injecte cette suspension de liposomes dans le sang circulant d'un animal.
Le procédé selon l'invention est prévu, d'une part, pour produire un oncogene capable d'immortaliser des cellules différenciées et de proliférer in vitro ainsi que de produire des protéines d'intérêt industriel.
Le procédé selon l'invention est prévu, d'autre part, pour produire in vivo au moins une protéine hétérologue par les cellules de l'animal "transfecté", ainsi que des anticorps dirigés contre cette protéine.
Technique antérieure
L'état de la technique relative à l'expression génétique de protéines hétérologues par des cellules transfectées in vivo à l'aide de vecteurs d'expression de gène encapsulés dans des liposomes, peut être illustré par les publications citées ci-après à titre d'exemple.
Selon EP-A1-0 027 662, on a réalisé la synthèse d'antigène de surface du virus de l'hépatite B (HBs) dans le foie de lapins injectés avec ces liposomes encapsulant le gène de l'HBs.
Selon le brevet US-A-4 394 448, on a injecté dans des souris Balb/c qui ne produisent pas de protéine urinaire 2 (mup2), des liposomes encapsulant de l'ADN de souris non-fractionné et on a retrouvé de la mup2 dans l'urine de ces animaux.
Dans l'article de Nandi et al, 1986, J. Biol. Chem. 261, 16722-16726, on a décrit l'encapsulation du gène de la préproinsuline I de rat et, après injection chez le rat, la synthèse d'insuline. L'ensemble des résultats présentés dans les publications ci-dessus montrent qu'une information génétique véhiculée par les liposomes dans un animal peut entraîner la synthèse de protéines hétérologues dans un animal "transfecté".
Exposé de l'invention
Le but de la présente invention est de permettre l'expression génétique de protéines hétérologues par des cellules transfectées in vivo à l'aide d'au moins un vecteur d'expression d'un gène encapsulé dans des liposomes, de manière à permettre la synthèse de diverses protéines en quantité adéquate pour leurs applications pratiques.
A cette fin, l'invention a pour objet un procédé d'expression génétique tel que défini dans les revendications.
Lors de la mise en oeuvre de la présente invention, on a introduit dans des rats les séquences oncogéniques du gène cellulaire ras de Harvey (tel que décrit par Tabin et al., 1982, Nature 300, 143-149) et le gène de l'hormone de croissance humaine (hGH) sous contrôle du promoteur de la protéine du gène de la protéine de choc thermique de 70.000 d (hsp70 pour "heat shock protein 70 kd") (tel que décrit par Dreano et al., 1988, Bio/ Technology 6, 953- 958).
L'expression de ces gènes a été retrouvée dans les hépatocytes de ces animaux après les avoir remis en culture in vitro. En effet, ils se sont avérés capables et de proliférer in vitro et de produire, après induction par la chaleur, de l'hGH.
On a, en outre, introduit deux plasmides (pl7hGHneo et pl7HBN, tels que décrit par Dreano et al., 1988, Bio/Technology 6, 953-958) contenant le gène hybride hsp70-hGH, dans des rats et dans des lapins (dans le cas du pl7hGHneo). On a retrouvé dans le sang circulant de ces animaux soit de l'hGH soit des anticorps anti-hGH.
Les avantages de L'utilisation de gènes exprimés sous une induction contrôlée, par le promoteur des gènes des hsp, pour la production de protéines hétérologues par des cellules en culture a été amplement décrit (notamment par Nover, 1987, Enz. Microb. Technol. 9, 129-144).
Dans la présente invention, on a utilisé le promoteur du gène de la hsp70. Il constitue un promoteur particulièrement puissant, et il est exprimé dans la quasi totalité des cellules eucaryotes lorsque celles ci sont soumises à un choc thermique et permet ainsi de contrôler ainsi le processus d'expression des gènes qu'il dirige. π est particulièrement important dans le cas de la transfection in vivo, conformément à la présente invention, d'obtenir la meilleure expression possible, de façon contrôlée, afin de pouvoir programmer l'expression et de mimer ainsi les conditions d'immunisation classiques utilisant un antigène purifié. De même, il est d'un grand intérêt pratique de pouvoir étendre le champs d'application du procédé selon l'invention au plus grand nombre de types de cellules productrices.
La transfection in vivo permet d'obtenir des anticorps polyclonaux dirigés contre toute sorte de protéines sécrétées (ou trans-membranaire) ainsi que leurs variants génétiques sans aucune production in vitro de l'antigène ni de lignées cellulaires le produisant.
Les dessins annexés illustrent des résultats obtenus dans deux exemples de la mise en oeuvre de l'invention décrite ci-après.
Description sommaire des dessins
Figure 1 est une autoradiographie obtenue dans un exemple de la mise en oeuvre de l'invention.
Figure 2 est une autoradiographie obtenue dans un autre exemple de la mise en oeuvre de l'invention.
Manière de réaliser l'invention
L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples suivants:
Exemple 1
On a réalisé la transfection in vivo d'hépatocytes de rat par des liposomes encapsulant des vecteurs d'expression, et obtenu la synthèse consécutive in vitro des gènes recombinés de la manière décrite ci-dessous. 1. Vecteurs d'expression utilisés:
- Le plasmide pEJ contenant l'oncogène cellulaire ras de Harvey sous sa forme mutée, isolé chez l'homme par Tabin et al., 1982, Nature 300, 143-149.
- Le plasmide pl7hGHneo (Dreano et al., 1986, Gène 49, 1-8) contenant le gène de résistance à la neomycine sous contrôle des séquences régulatrices du Virus Simien 40 (SV40) et le gène de l'hormone de croissance humaine (hGH) dirigé par le promoteur humain du gène de la hsp70. L'avantage de l'utilisation de gènes exprimés sous une induction contrôlée, par le promoteur du gène des protéines de choc thermique, pour la production de protéines hétérologues dans une variété de cellules en culture a été amplement décrit par Nover, 1987, Enz. Microb. TechnoL, 9, 129-144.
- Le plasmide plTHBN contenant le même gène hybride hsp70-hGH, un gène de résistance à la neomycine dirigé par les séquences régulatrices du gène de la thymidine kinase du virus de l'Herpès Simplex 1 et un fragment subgénomique transformant du virus du papillome bovin (Dreano et al., 1988, Bio/Technology 6, 953-958).
2. Transfection:
2.1 Des liposomes monolamellaires ont été préparés, selon la méthode de Deamer et al., 1976, Biochem. Biophys. Acta 433, 629-634, à partir de 2 mg de phosphatidylcholine dissous dans 1 ml de chloroforme et repris, après évaporation, dans 1 ml d'éther diéthylique. La suspension finale de liposomes est réalisée dans 1 ml de milieu de culture synthétique de base complet mais sans sérum, contenant 100 μg d'ADN de plasmide pl7hGHneo et pEJ. Cette solution est débarrassée de l'éther diéthylique par un bullage d'air-C02 (95:5, v/v), à 20°C, tout en équilibrant le milieu au pH physiologique par un système tampon, en vue de l'injection.
2.2 Cette suspension de liposomes encapsulant les plasmides a été injectée dans la veine caudale d'un rat Fisher F-344 de huit semaines, à raison de 1 ml en 30 secondes. Ceci correspond à une injection intraveineuse de lOOμg d'ADN de plasmide.
2.3 Cette injection a été répétée deux fois, à huit jours d'intervalle, (ou autant de fois et selon un rythme reconnu comme nécessaire pour observer une transfection de cellules de l'organe concerné).
2.4 Le lendemain de la dernière injection, on a sacrifié l'animal et isolé les hépatocytes par perfusion à la collagenase (Williams et al., 1977, In Vitro 13, 808-817).
Le milieu de culture utilisé était le milieu WME (Williams et al., 1974, Exp. Cell. Res. 89, 139-142) contenant 10% de sérum de veau foetal ainsi que . de l'insuline et du cortisol. Après 28 h de culture, les cellules ont été entretenues avec du milieu WME additionné de 2% d'Ultroser G® (L B) qui est un substitut de sérum. Il contient, d'une façon standardisée, des protéines dont de l'albumine' et de la transferrine, des acides gras indispensables, des facteurs de croissance dont l'EGF (Epidermal Growth Factor) ainsi que des hormones dont l'insuline et la dexaméthasone. Ce substitut a été choisi pour ses apports constants en facteurs de croissance et en hormones.
Un essai a été effectué en parallèle sur un rat témoin, en utilisant des liposomes produits en l'absence de plasmides.
3. Résultats:
3.1 Prolifération des hépatocytes:
Pendant les deux premiers jours de culture, aucune différence du point de vue de la morphologie cellulaire n'a pu être détectée au microscope optique entre les deux préparations d'hépatocytes provenant, d'une part, du rat ayant reçu des liposomes encapsulant des plasmides et, d'autre part, du rat ayant reçu des liposomes sans plasmides. Les jours suivants des dômes de cellules mitotiques ont commencé à apparaître dans les cultures provenant du foie du rat ayant reçu des injections de liposomes encapsulant les plasmides. Ces cellules de forme arrondie se sont détachées d'une façon continue du tapis d'hépatocytes pour former des grappes de cellules poussant en suspension. Après 25 jours de culture, il ne restait plus de plages d'hépatocytes dans les flacons de la culture primaire d'hépatocytes du rat témoin, alors que dans la culture provenant du rat traité par les liposomes encapsulant les plasmides, la couche cellulaire était restée intacte. Ceci a été observé pendant plus de 75 jours.
Ces cellules ont gardé une morphologie typique d'hépatocytes pendant toute cette période. Pourtant, des cellules transformées ont continué à se diviser en permanence, en se détachant de la couche de cellules étalées.
Ces cellules en suspension ont été récupérées à partir du milieu de culture, par une centrifugation à 65 g pendant 10 mn et ont été ensuite réensemencées dans des flacons neufs, dans le même milieu. Dans ces conditions, elles se sont attachées et ont proliféré. La viabilité cellulaire, estimée par l'exclusion du bleu trypane a été supérieure à 95%. Au 17ème jour après la mise en culture, les cultures du milieu de culture usagé provenant de dix flacons ont été rassemblées, soit environ 5.106 cellules, pour être ensemencées, en suspension, sans l'aide de microsupports sphériques, dans un biogénérateur, dans un volume final de 200 ml du même milieu de culture. Elles ont maintenu leur prolifération en suspension. Parallèlement, une plaque de culture contenant 24 puits de culture de 2 cm.2 a été ensemencée à raison d'environ 10 cellules par puits. Le milieu de culture du biogénérateur a été changé tous les trois jours, celui des flacons et de la plaque de 24 puits tous les deux jours. Après six jours de culture, le nombre de cellules dans le biogénérateur a été évalué à 21.10? cellules, ce qui correspond à une croissance 5,4 générations cellulaires. Le temps de doublement de la population cellulaire a donc été de 27 heures. Dans les flacons de culture de 25 cm2 ces paramètres ont pu être estimés à 4.7 générations en cinq jours, correspondant à un temps de doublement de la population cellulaire de 26 heures, donc très comparable à celui des cellules cultivées en suspension.
3.2 Sécrétion d'hGH et sélection par la généticine:
Les cellules cultivées dans la plaque de culture de 24 puits ont subi un choc hyperthermique de 43°C pendant 3 h. L'hGH a été dosée par RIA dans chaque milieu de culture recueilli 24 h plus tard. Dans 3 des 24 puits, l'hGH a été produite aux taux respectifs de 5, 8 et 20 ng/lO^ cellules /24 h. Les cellules de la population la plus productrice ont été repiquées et ensemencées dans 24 autres puits. Un nouveau choc hyperthermique a été pratiqué 8 jours plus tard. L'hGH a été retrouvée dans 4 des 24 milieux recueillis, à raison de 3, 5, 9 et 31 ng/106 cellules/24 h. 3.3 Sécrétion d'albumine et de transferrine de rat:
Les cellules recombinées, cultivées dans un flacon, ont exprimé ces deux protéines endogènes pendant une période s'étendant au-delà de 75 jours de culture à des taux proches, voire supérieurs, à ceux des hépatocytes fraîchement isolés, à savoir entre 15 et 26 μg/10^ cellules/24 h pour l'albumine et autour de 1,1 μg/lO^ cellules/24 h pour la transferrine.
Les résultats obtenus sont rassemblés dans le Tableau I qui suit.
TABLEAU I
SECRETION D'ALBUMINE ET DE TRANSFERRINE PAR DES HEPATOCYTES DE RAT TRANSFORMES IN VTVO AR CO-TRANSFECΗON AVEC LES PLASMIDES pEJ ET p!7hGHneo ET CULTIVES EN FLACONS DE 75 cm2.
3.4 Biosynthèse des acides biliaires primaires du foie de rat:
La production d'acides biliaires par les cellules cultivées en biogénérateur 70 jours après la mise en culture a été mesurée par chromatographie gazeuse-spectrométrie de masse (Tsaconas et al., 1986, Anal. Biochem. 157, 300-315). Les acides biliaires libres ont été séparés des conjugués par chromatographie en couche mince. Les acides biliaires qui ont été identifiés étaient l'acide chénodésoxycholique (CDC) et l'acide cholique (CH). Ce sont les deux acides biliaires primaires majeurs du foie de rat.
Les taux de production ont été:
- fraction libre: CDC: 1,7 nmol/mg de protéine cellulaire/24 h et CH: 3,5 nmol/mg de protéine cellulaire/24 h. Le rapport CDC/(CH + CDC) est égal à 33%, proportion observée normalement dans la sécrétion hépatique de ces acides biliaires primaires:
- fraction conjuguée: CDC: 2,6 nmol/mg de protéine cellulaire/24 h et CH: 5,2 nmol/mg de protéine cellulaire/24 h.
Par rapport aux taux de production in vivo des acides biliaires primaires libres et conjugués, cette- sécrétion qui correspond à 13.1 nmol/mg de protéine cellulaire/24 h représente environ 1,5 à 2 fois celle du foie normal. Pourtant il faut noter que, dans l'organe, les hépatocytes constituent 90% du foie et que ce sont surtout les hépatocytes de la zone externe du globule hépatique qui synthétisent les acides biliaires, alors que vraisemblablement toutes les cellules recombinées sont responsables de cette biosynthèse. D'autre part, la fraction analysée des stéroïdes biliaires contenait, dans la limite des valeurs normales, des stérols biliaires neutres de type hydroxycholestérols et cétocholestérols, ainsi que d'autres acides biliaires dihydroxylés et trihydroxylés qui accompagnent normalement la sécrétion de l'acide chénodésoxycholique et de l'acide cholique.
Cet exemple démontre que des hépatocytes peuvent être transfectés in vivo, in situ dans le foie, par deux plasmides, chacun encapsulé dans des liposomes. L'un, le pEJ, vecteur de l'oncogène cellulaire ras de Harvey muté et l'autre le p!7hGHneo, vecteur du gène d'expression de l'hormone de croissance humaine et du gène de sélection par résistance à la neomycine, afin d'obtenir ensuite par explantation de la glande hépatique des hépatocytes capables de proliférer en culture et d'exprimer le gène recombiné, codant pour la synthèse de la protéine d'intérêt thérapeutique.
Les hépatocytes transfectés in vivo par les plasmides pEJ et pl7hGHneo, encapsulés dans des liposomes, injectés dans la veine caudale et mis en culture, sont donc capables de proliférer in vitro, us gardent des fonctions spécifiques du foie, bien au-delà de deux mois de culture. Une partie de ces hépatocytes, non clones pour cette activité, sécrètent l'hormone de croissance humaine dans le milieu de culture.
Les résultats de ces travaux de transfection in vivo démontrent la réalité du transfert du matériel génétique du plasmide encapsulé dans des liposomes lorsqu'il est véhiculé sous cette forme par le sang veineux vers les cellules hépatiques de l'animal intact, et finalement capté. La recombinaison d'un gène oncogénétique permet d'obtenir des hépatocytes différenciés qui prolifèrent en culture, tout en exprimant des fonctions spécifiques du foie: biosynthèse d'albumine, de transferrine et des acides biliaires libres et conjugués, métabolisme des composés endogènes et métabolisme des sénobio tiques, impliquant l'activité des mono-oxygénases à cytochromes P-450. Comparativement, les hépatocytes de rats normaux, donc de rats non traités, ne sont maintenus en culture que quelques jours, perdant vite ces fonctions avant de se lyser, comme cela est bien connu.
Le clonage des hépatocytes rendus prolifératifs devrait permettre d'obtenir des lignées d'hépatocytes transformés qui garderaient un haut niveau d'activité hépatique fondamentale, permettant ainsi d'étudier le métabolisme des composés endogènes venant des autres tissus et de composés xénobiotiques produits par la chimie industrielle et la pharmacie. En même temps, ce modèle constitue un outil de grand intérêt pour des travaux sur l'expression de gènes oncogènes et de gènes codant pour la biosynthèse de protéines, pour une production industrielle.
Exemple 2
On a réalisé de la manière décrite ci-dessous l'expression chez le rat de l'hormone de croissance humaine résultant de la transfection in vivo.
1. Vecteur d'expression:
Les plasmides utilisés sont les plasmides pl7hGHneo et pl7HBN qui contiennent tous les deux le gène hybride hsp70-hGH (Dreano et al., 1988, Bio/Technology 6, 953-958).
2. Transfection:
2.1) Des liposomes monolamellaires ont été préparés selon la méthode de Deamer et al., 1976, Biochem. Biophys. Acta 433, 629-634, à partir de 2 mg de phosphatidylcholine dissous dans 1 ml de chloroforme et repris, après évaporation, dans 1 ml d'éther diéthylique. Les suspensions finales de liposomes sont réalisées dans 1 ml de milieu de culture synthétique de base complet mais sans sérum, contenant soit 100 μg d'ADN de plasmide pl7HBN soit 100 μg d'ADN de plasmide pl7hGHneo soit pas d'ADN. Ces solutions sont débarrassées de l'éther diéthylique par un bullage d'air-C02 (95:5, v/v), à 20°C, tout en équilibrant le milieu au pH physiologique par un système tampon, en vue de l'injection.
2.2 Chaque suspension de liposomes (encapsulant les plasmides) a été injectée dans la veine caudale d'un rat Fisher F-344 de huit semaines, à raison de 1 ml en 30 secondes.
2.3 Cette injection est répétée deux fois, à huit jours d'intervalle, (ou autant de fois et selon un rythme reconnu comme nécessaire pour observer une transfection de cellules des organes concernés.
2.4 1, 2 et 7 jours après l'injection, les animaux ont été soumis à un stress thermique par élévation de la température ambiante à 45°C pendant 20 mn. 1 jour après chaque induction thermique, 1 ml de sang de chaque rat a été prélevé et centrifugé immédiatement pour recueillir le plasma.
2.5 L'hGH a été dosée par radiôimmuno-essai (radioimmunoassay, RIA) dans le plasma des trois rats (voir le Tableau II qui suit).
Dans les analyses du sérum de l'animal injecté avec les liposomes . vides, un faible signal a été observé, probablement dû à une réaction non spécifique entre l'hormone de croissance de rat et les anticorps anti-hGH du RIA.
Les échantillons de plasma des rats injectés avec des liposomes encapsulant les plasmides p!7HBN ou pl7hGHneo contenaient entre 4 et 6 fois plus de GH que ceux du rat témoin. Les rats ont bien synthétisé de l'hGH après l'injection des liposomes encapsulant l'un ou l'autre des plasmides vecteurs du gène de l'hGH.
Le dosage de l'hGH sécrétée dans le sang de l'animal transfecté a été réalisé soit par dosage radio-immunologique (Trousse hGH-RIA, Pasteur Diagnostics, F-92430 Marnes-la-Coquette), soit par dosage immuno- enzymatique ELISA sur des supports sphériques (Trousse Sensibead EIA, Terumo Médical Corp., Elkton, MD 21921). TABLEAU H
EXPRESSION IN VIVO CHEZ LE RAT DE L'hGH APRES INJECTION DE
LIPOSOMES CONTENANT SOIT LE pl7HBN, SOIT LE pl7hGHneo.
Exemple 3
On a réalisé de la manière décrite ci-dessous l'expression chez le rat d'anticorps dirigés contre l'hormone de croissance humaine résultant de la transfection in vivo suivante.
Deux rats Fisher F-344 de 10 semaines ont reçu, le premier, le vingtième et le vingt-septième jour de l'expérience, une injection mtracardiaque de liposomes préparés selon l'exemple 1, encapsulant le plasmide p!7HBN ou pl7hGHneo. Les animaux ont été soumis à un stress thermique de 20 mn à 45°C tous les 3 à 5 jours après la première injection. Le sang de chaque animal a été prélevé au trentième jour de l'expérience et a été utilisé pour préparer le sérum.
Dans le même temps, des cellules de la lignée 6, obtenue par transfection de cellules NIH-3T3 avec des plasmides contenant l'oncogène c- ras et le gène de l'hGH sous contrôle du promoteur du gène de la hsp70 humaine (Dreano et al., 1986, Gène 49, 1-8), "ont été incubées à 43°C pendant 2 heures, puis 24 heures à 37°C en présence de [35S]-méthionine.
Les surnageants de culture de ces cellules (0,5 ml) ont été utilisés pour détecter la présence d'anticorps anti-hGH par la technique d'immuno- précipitation. Brièvement, ils ont été incubés à 4°C pendant 3 heures soit avec des sérums des rats injectés avec les liposomes encapsulant p!7hGHneo ou plTHBN soit avec un sérum de rat non traité soit avec un sérum de lapin hyperimmunisé contre l'hGH (DAKO).' Les mélanges réactionnels ont ensuite été mis en présence de protéine-A-sépharose pendant 20 heures à 4°C. Après centrifugation, les complexes immuns liés à la protéine A des billes de sépharose (billes) ont été lavés trois fois avec un tampon NET- NP40, (lOOmM NaCl, ImM EDTA, lOmM Tris pH 7.5, 0.5 % NP40) et deux fois avec un tampon RIP A-urée (1M urée, 1% Deoxycholate de Na, 1% de NP40, 0.05 M Tris pH 7.5, 0.15 M NaCl, 0.02 M EDTA). Les billes ont été enfin remises en suspension dans 50 μl de "sample buffer" (50 mM Tris HC1 pH 6.8, 1% SDS, 10% Glycérol, 0.005% Bleu de Bromophénol, 1.4 M 2- mercaptoéthanol) puis portées à ébullition pendant 2 mn à 100°C. Les surnageants ont été analysés par électrophorèse sur gel d'acrylamide 15%- SDS (Laemmli, 1970, Nature 227, 680-685).
Les résultats de la Figure 1 montrent une protéine du poids moléculaire de l'hGH (22kd, indiquée par une flèche sans queue) dont la taille a été calculée par comparaison avec la position de protéines de poids moléculaire connu dont la position est indiquée par une flèche à gauche de la figure). L'hGH radioactive ainsi détectée, a été immunoprécipitée par les sérums des animaux injectés avec les liposomes encapsulant aussi bien le plasmide pl7HBN (1) que p!7hGHneo (2), et cela de façon comparable à l'hGH immunoprécipitée par le sérum de lapin commercial (+). Cette protéine est absente de l'échantillon analysé avec le sérum du rat non traité (-)• Exemple 4
On a réalisé de la manière décrite ci-dessous l'expression chez le lapin d'anticorps dirigés contre l'hormone de croissance humaine résultant de la transfection in vivo.
Trois lapins New Zealand (K.f.m., Switzerland) de 8 à 10 semaines semaines ont reçu des injections de liposomes, préparés selon l'exemple 2, encapsulant le plasmide p!7hGHneo dans la veine de l'oreille. Les animaux ont subi un stress thermique, par élévation de la température ambiante à 43°C pendant 30 mn, deux et sept jours après injection. Le même protocole expérimental a été répété 1 nouvelle fois six mois plus tard. Quelques ml de sang de chaque animal ont alors été prélevés et ont été utilisés pour préparer les sérums.
Les sérums ont été analysés selon la technique décrite dans l'exemple 3 et comparés au sérum d'un lapin non traité et au sérum d'un lapin hyperimmunisé contre l'hGH (DAKO).
Les résultats, présentés dans la Figure 2, montrent une bande correspondant à un poids moléculaire d'environ 22 kd (poids moléculaire de l'hGH, indiquée par une flèche sans queue) dans les échantillons contenant soit le sérum commercial (+) soit les sérums des 3 lapins injectés avec les liposomes encapsulant le plasmide p!7hGHneo (1, 2, 3). Cette bande est absente dans l'échantillon contenant du sérum du lapin non traité (-).
Comme il ressort des exemples ci-dessus, le transfert d'un ADN de plasmide au moyen de liposomes injectés in vivo chez un animal, notamment le rat et le lapin, a permis de faire exprimer le gène codant pour l'hormone de croissance humaine (hGH). Cette hGH a été retrouvée dans le sang d'un rat ainsi traité, sécrétée jusqu'au dernier prélèvement effectué, 20 jours après la transfection. Par la suite, les résultats des exemples 3 et 4 montrent la présence d'anticorps anti-hGH dans le sérum rats ou des lapins injectés avec les liposomes encapsulant pl7hGHneo ou pl7HBN confirmant ainsi, que cette technique permet la synthèse in vivo d'une protéine codée par un ADN hétérologue injecté dans des liposomes et que la réponse immunitaire de l'animal peut être stimulée sans injection de l'antigène. De plus, la mise en évidence d'anticorps anti-hGH aussi bien dans le sang circulant de rats que de lapins "transfectés" démontre de manière formelle l'expression du gène de l'hGH par les animaux "transfectés".
Il va de soi que le procédé selon l'invention permet d'obtenir des animaux hyperimmunisés pouvant être utilisés par la suite comme source de matériel biologique pour la production d'anticorps monodonaux.
Après la mise en culture du foie du rat soumis à la transfection, les hépatocytes recombinants cultivés sécrétaient par ailleurs encore l'hGH 30 jours après la mise en culture, soit 50 jours après la transfection. La co- transfection des hépatocytes du rat ou de tout autre animal par un plasmide vecteur d'un gène de sélection et un plasmide vecteur d'un gène d'expression à intérêt biotechnologique est donc réalisable in vivo. Ce modèle permet d'obtenir des cellules hautement spécialisées, capables de proliférer in vivo, après explantation puis sélection en culture de cellules de l'organe de l'animal "transfecté". Dans le cas des hépatocytes, ces cellules recombinantes prolifératives expriment des fonctions hépatiques, en même temps que le gène recombiné.
Possibilité d'application industrielle
Le procédé d'expression par transfection in vivo selon l'invention, présente un grand intérêt pour produire des cellules différenciées capables de proliférer in vitro présentant des applications industrielles entre autres dans les domaines de la pharmacologie, de la toxicologie et de la cancérogénèse. D'autre part, elle permet d'insérer ou de réinsérer in vivo un gène non exprimé débouchant sur la synthèse in vivo de protéines hétérologues biologiquement actives Ou antigéniques. Cette dernière application permet soit de vacciner des animaux soit de les utiliser pour la production d'anticorps.

Claims

Revendications
1. Procédé d'expression génétique de protéines hétérologues par des cellules transfectées in vivo à l'aide d'au moins un vecteur d'expression d'un gène encapsulé dans des liposomes, selon lequel on prépare une suspension de liposomes dans lesquels le vecteur d'expression est encapsulé et l'on injecte cette suspension de liposomes dans le sang circulant d'un animal, caractérisé par le fait que: a) l'on injecte dans l'animal une suspension de liposomes encapsulant au moins un vecteur d'expression contenant un gène codant pour un oncogene, de manière que des cellules différenciées de l'animal, ainsi transfectées, puissent produire l'oncogène, b) l'on prélève de l'animal un organe contenant les cellules transfectées qui expriment l'oncogène, et c) l'on remet les cellules de l'organe prélevé en culture in vitro de manière à obtenir des cellules qui expriment l'oncogène et qui sont capables de proliférer in vitro.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on injecte une suspension de liposomes encapsulant en outre un vecteur d'expression contenant un gène codant pour une autre protéine désirée, de manière à pouvoir obtenir lesdites cellules qui expriment l'oncogène ainsi que l'autre protéine.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que ledit vecteur d'expression contient un gène codant pour un oncogene cellulaire.
4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que ledit vecteur d'expression contient le gène de l'ongène c-ras de Harvey.
5. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que lesdites cellules différendées transfectées sont des hépatocytes.
6. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que le gène codant pour ladite protéine désirée est le gène de l'hormone de croissance humaine.
7. Procédé d'expression génétique de protéines hétérologues par des cellules transfectées in vivo à l'aide d'au moins un vecteur d'expression de gènes encapsulé dans des liposomes, selon lequel on prépare une suspension de liposome dans lesquels les vecteurs d'expression sont encapsulés et l'on injecte cette suspension de liposomes dans un animal, caractérisé par le fait que: a) l'on injecte dans l'animal une suspension de liposomes encapsulant un vecteur d'expression contenant un gène codant pour la protéine d'intérêt sous contrôle d'un promoteur du gène de protéine de choc thermique, de manière que les cellules transfectées de l'animal puissent produire in vivo la protéine d'intérêt, b) l'on soumet l'animal à un choc thermique de manière à favoriser l'expression des gènes sous contrôle dudit promoteur de gène, c) l'on prélève du sang circulant de l'animal des protéines d'intérêt ou des anticorps dirigés contre cette protéine, et d) l'on répète ces opérations d'injection (a), de choc thermique (b) et de prélèvement (c) le nombre de fois nécessaire pour obtenir une synthèse adéquate de la protéine ou des anticorps.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que le gène codant pour ladite protéine désirée est le gène de l'hormone de croissance humaine.
9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que ledit promoteur du gène de protéine de choc thermique, est celui d'une protéine humaine de poids moléculaire de 70 kd.
10. Procédé selon la revendication 1 ou 7, caractérisé par le fait que l'on encapsule ledit vecteur d'expression dans des liposomes neutres monolamellaires.
11. Procédé selon la revendication 1 ou 7, caractérisé par le fait que l'on injecte ladite suspension de liposomes dans un rat ou dans un lapin.
12. Procédé selon la revendication 1 ou 7, caractérisé par le fait que le vecteur utilisé est un plasmide.
13. Procédé selon la revendication 1 ou 7, caractérisé par le fait que par l'intermédiaire du ou des vecteurs injectés, on transfecte les cellules soit par un ou plusieurs gènes d'expression et par un ou plusieurs gènes de sélection, soit par un ou plusieurs gènes de sélection.
14. Protéine hétérologue telle que produite in vitro ou in vivo par des cellules transfectées selon les revendications 1 ou 7.
15. Cellules capables de proliférer in vitro, résultant de la transfection in vivo, par mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1.
16. Cellules selon la revendication 15, caractérisées par le fait qu'il s'agit d'hépatocytes.
17. Anticorps, dirigés contre la protéine exprimée in vivo par les cellules transfectées par mise en oeuvre du procédé selon la revendication 7.
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