附图简述
通过举例方式给出、但不意在将本发明限定于所描述的特定实施方案的下列详细描述可与附图(通过引用并入)结合起来理解,其中:
图1显示具有棉花糖外观的玻璃化团块的照片。
发明详述
在本公开中,“包含”、“包括”、“含有”和“具有”等可具有在美国专利法中归属于它们的含义,并且可表示“包括”、“包含”等;“基本上由……组成”或“基本上组成”类似地具有在美国专利法中被归有的含义,并且该术语是开放式的(open-ended),允许超出被引述的内容存在,只要被引述的内容的基本或新型特征不因超出被引述的内容的存在而改变,但不包括现有技术实施方案。
本发明情境中的“受试者”可以是脊椎动物例如哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物或鱼;更有利地为人、伴侣动物或家养动物;产生食物或产生饲料的动物;家畜、狩猎动物、竞赛动物或运动动物例如但不限于牛、犬、猫科动物、山羊、绵羊、猪、马和禽类。优选地,脊椎动物是犬。
如本文中所使用的,“重组”是指合成的或以其它方式经体外操作的核酸(例如,“重组核酸”),指使用重组核酸在细胞中、受试者中或其它生物学***中产生基因产物的方法,或指由重组核酸编码的多肽(“重组蛋白”)。“重组方法”还包括切除具有来自不同来源的不同编码区、结构域或启动子序列的核酸并且将其连接入表达盒或载体,以进行例如核酸编码序列的可诱导的或组成型表达。
如本文中所用,术语“可操作连接的”意指所述组分处于允许它们以其所需的方式起作用的关系中。
术语“异源的”,当用于指核酸时,表示核酸存在于自然中其不是被通常发现的细胞、病毒、受试者或细菌中;或包括两个或更多个核酸亚序列,所述亚序列不以在自然中通常发现的相同的相互间关系被发现,或者被重组工程化从而在细胞、受试者或结构中其表达水平或者其与其它核酸或其它分子的物理关系不是自然中通常所发现的。例如,可重组产生异源核酸,其具有以非天然发现的形式排列的两个或更多个来自不相关基因的序列;例如***例如痘病毒或腺病毒载体中的可操作连接至启动子序列的犬基因。作为实例,目标异源核酸可编码免疫原性基因产物,其中将载体中包含的目标异源核酸作为免疫原性组合物或疫苗组合物治疗性或预防性地施用。异源序列可包括启动子和序列的各种组合,其许多实例于本文中被详细地描述。
如本文中所用,“载体”是允许或促进实体从一个环境转移至另一个环境的工具。例如,重组核酸技术中使用的一些载体允许实体例如核酸区段(例如异源核酸区段,例如异源cDNA区段)转移进入靶细胞。本文中还使用的是术语“表达载体”。本发明包括重组载体,其可包括但不限于病毒载体、细菌载体、真菌载体、原生动物载体、质粒载体或其组合。
关于用于在载体中表达的异源核酸(例如,其编码目标表位和/或抗原和/或免疫原和/或治疗剂)和提供此种异源核酸的文献,以及关于用于增强核酸分子的表达的转录和/或翻译因子的表达,以及关于术语例如特别是“目标表位”、“治疗剂”、“免疫反应”、“免疫学反应”、“保护性免疫反应”、“免疫组合物”、“免疫原性组合物”和“疫苗组合物”,参考1999年11月23日发布的美国专利No.5,990,091以及WO98/00166和WO99/60164,和其中引用的文献以及该专利和那些PCT申请的进行中记录的文献;将其全部通过引用并入本文。因此,可在本发明的实施中参考美国专利No.5,990,091以及WO98/00166和WO99/60164,以及其中引用的文献和该专利及那些PCT申请的进行中的文献或记录,和本文中引用的或以其它方式通过引用并入本文中的其它文献;并且本文中引用的所有异源核酸分子、启动子和载体可被用于本发明的实施。在这方面,还提及美国专利No.6,706,693;6,716,823;6,348,450;美国专利申请系列No.10/424,409;10/052,323;10/116,963;10/346,021;和1999年2月25日公布的来自PCT/US98/16739的WO99/08713。
“抗原”是被免疫***识别且诱导免疫反应的物质。抗原可包括:被杀死的、减毒的或活的完整生物体;生物体的亚单位或部分;包含具有免疫原性性质的***物的重组载体;能够在呈递给宿主动物后诱发免疫反应的核酸块或片段;蛋白质、多肽、肽、糖蛋白、表位、半抗原、碳水化合物、糖或其任意组合。备选地,抗原可包含毒素或抗毒素。在本说明书中可互换使用的相似术语是“免疫原”。“病原体”是指疾病的特定致病剂,例如细菌、真菌、原生动物、寄生虫或病毒。
如本文中所用,术语“玻璃化”意在指使用在特定的温度范围中进行特定时间长度的一系列受控压力减少而使液体生物制剂干燥至低水份(例如少于约4%)、“棉花糖”-样外观。可在任何室(chamber)或容器(包括冷冻干燥器)中进行玻璃化,其中可调节气压和温度以适应本公开中所呈现的范围。术语“玻璃化组合物”和“玻璃化制剂”可互换使用,并且在本文中意指已经受本文中公开的玻璃化法的任何组合物、制剂或配制剂。
如本文中所用,术语“免疫原性组合物”和“免疫组合物”以及“免疫原性或免疫组合物”涵盖了引发抗从载体表达的目标抗原或免疫原的免疫反应的任何组合物;例如,在施用至受试者中后,引发抗所靶向的目标免疫原或抗原的免疫反应。术语“疫苗的组合物”和“疫苗”及“疫苗组合物”涵盖诱导抗目标抗原的保护性免疫反应的任何组合物,或其有效地保护抵抗抗原;例如,在施用或注射入受试者后,引发抗所靶向的抗原或免疫原的保护性免疫反应或提供有效的抗从载体表达的抗原或免疫原的保护。
如本文中所用,术语“多价”意指包含超过一种抗原(不论来自相同物种还是来自不同物种)的免疫原性组合物或疫苗组合物,或包含来自不同属的抗原的组合的免疫原性组合物或疫苗组合物。
在本发明的情境中,“活性免疫原性组分”包括活减毒病原体例如活减毒病毒、活减毒细菌、真菌或寄生虫。当活免疫原性组分为本发明的多价活减毒CDV和cPi2免疫原性组合物、悬液或溶液的一部分时,活免疫原性组分可有利地源自除副粘病毒外的病原体。本发明还涵盖的是衍生自或来源于本文中描述的一种或多种病原体的重组异源免疫原或抗原,其可被包含及表达在特别是病毒载体、细菌载体、真菌载体和质粒载体中。本发明还包括来源于一种或多种病原体的异源免疫原或抗原的表位、免疫调节剂例如细胞因子、治疗剂、毒素、抗体、抗体的抗原结合片段、佐剂,或其它种类例如反义RNA、催化RNA、小干扰RNA等等。
术语“兽医用组合物”意指包含用于兽医用途的载体的组合物,所述载体表达治疗性蛋白例如红细胞生成素(EPO)或免疫调节性蛋白例如干扰素(IFN)。类似地,术语“药物组合物”意指包含用于表达治疗性蛋白的载体的任何组合物。
本发明的组合物和方法可被适当地用于任何生物学物质/试剂或组合生物品物质/试剂+药物/兽医用试剂的稳定化和玻璃化。“生物品”包括但不限于免疫调节剂例如细胞因子、治疗剂、毒素、抗体、抗体的抗原结合片段、佐剂或其它种类例如反义RNA、催化RNA、小干扰RNA等等。在玻璃化材料/物质重构后,这些化合物可作为预防性免疫来用于预防疾病,或作为治疗性免疫来缓解疾病的症状。
本发明涵盖用于活减毒免疫原性组合物的玻璃化的方法,其可包括至少一种稳定剂,例如非还原糖或抗氧化化合物。在一些实施方案中,玻璃化稳定剂可任选地包含至少一种非还源寡糖和/或至少一种填充剂(bulking agent)和/或至少一种糖醇。这些稳定剂可保持或帮助保持生物学成分(包括但不限于病毒、细菌、真菌、寄生虫、蛋白质、多肽等)的免疫原性、感染性和活力。本发明的玻璃化法中使用的稳定剂可具有良好的方面,包括例如一致的形状和颜色,并且对于施用至受试者是安全的。
“还原性单糖”是能够贡献电子、从而能够在氧化-还原反应过程中减少另一种化合物的糖。一般而言,还原性单糖在其结构中具有醛基或酮基。可用比色测试来鉴定还原性糖,例如Fehling’s试剂测试,当铜离子试剂在还原性糖的存在下被还原成铜金属时其产生从深蓝至红色的颜色变化。在本发明中,还原性单糖优选包括葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、山梨糖或其组合。在本发明的一个实施方案中,提供了至少两种还原性单糖的组合。还原性单糖在冷冻干燥过程(特别是升华步骤(即,第一和第二干燥步骤))中,对于组合物(特别是蛋白质和活减毒病原体)的保护是重要的,其中还原性单糖代替升华的水并且维持生物结构的内聚力(cohesion)。
任选地,糖醇和/或非还原性寡糖可被添加来稳定根据本发明玻璃化的制剂。本公开包括还原性单糖和糖醇的组合、还原性单糖和非还原性寡糖的组合以及还原性单糖、糖醇和非还原性寡糖的组合。糖醇可以是例如山梨醇、甘露醇、木糖醇或麦芽糖醇。
本发明的情境中的“非还原性寡糖”是包含2至10个糖单元并且在氧化还原反应中不能还原另一种化合物的糖。在本发明中,非还原性寡糖可以是非还原性二糖或非还原性三糖,有利地包括海藻糖、蔗糖或棉子糖。本发明的稳定剂还可包括至少两种非还原性寡糖的混合物。
“酸性抗氧化剂”化合物被定义为与氧化剂、自由基(即具有未配对电子的分子)或释放自由基的化学品反应并且中和其的化合物。在本发明的情境中,抗氧化化合物可以为酸的形式。酸性抗氧化剂包括但不限于抗坏血酸和/或酸性氨基酸例如天冬氨酸和谷氨酸。超过一种酸性抗氧化剂化合物的组合是根据本公开的方法玻璃化的制剂的适当组分。
填充剂也是根据本公开的内容玻璃化的组合物的适当组分。填充剂可以是药学上或兽医上可接受的聚合物,例如但不限于葡聚糖、麦芽糖糊精、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、交聚维酮和羟乙基淀粉。淀粉衍生物的其它非限制性实例包括微晶纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素。填充剂增加生物组合物的T’g值,从而允许在冷冻过程中使用更高的温度。“T’g值”被定义为玻璃转化温度,其对应于低于其冷冻的组合物变成玻璃态的温度。填充剂可帮助提供在本公开的玻璃化团块中观察到的良好方面,该团块具有轻的、蓬松的、棉花糖的一般外观。
如果将葡聚糖用作填充剂,其分子量可为约5000Da至约70000Da,优选约10,000Da至约40,000Da。如果将PVP用作填充剂,其分子量可以为约8,000Da至约360,000Da,特别是约10,000Da至约60,000Da。
如果麦芽糖糊精被用作填充剂,其葡萄糖当量值(DE,其为淀粉聚合物水解的程度的定量量度)可为约3至约20,优选约5至约18,更优选约10至约15。如果羟乙基淀粉被用作填充剂,则其分子量可为约70,000Da至约450,000Da,优选约130,000Da至约200,000Da。羟乙基淀粉的取代的程度可以为约0.4至约0.7,特别是约0.4至约0.6。取代的程度被定义为羟乙基的数目/葡萄糖单元。
生物学制剂的一些组分(包括稳定剂)可能不是容易溶解的。然而,替代适当的类似组分(例如通过选择更加可溶的组分)和/或调节稳定剂中存在的不可溶组分的量或数量以获得可溶的稳定剂完全在本领域技术人员所及的范围内。组分的溶解度可通过视觉溶解度测试容易地检测。溶解度测试包括在约55℃的温度下添加稳定剂的所有组分,以及混合约30分钟的步骤。在室温下且无任何搅动下进行约24小时后,可就沉淀物的外观而言视觉检查稳定剂。如果稳定剂是透明的或清澈的,则稳定剂的所有成分都是可溶的。
根据本公开的内容玻璃化的生物学制剂可包含任何数目的稳定剂。表1提供了数个实例。“葡聚糖”包含具有40,000Da的分子量的葡聚糖-40,000。
表1:稳定剂的组成
本公开还提供的是玻璃化的免疫原性组合物,其通过首先产生包含活减毒病毒(例如但不限于副粘病毒)的免疫原性悬液或溶液、随后按照本公开的方法玻璃化所述悬液或溶液来产生。犬副粘病毒特别可包括犬瘟热病毒(CDV)和犬副流感2型病毒(cPi2)(两者皆为活减毒病毒的形式)。
在实施方案中,本公开涵盖玻璃化的活减毒副粘病毒,特别是犬副粘病毒。犬副粘病毒是副黏液病毒科的病毒,其包括犬瘟热病毒(CDV)和犬副流感2型病毒(cPi2)。犬副粘病毒促成许多食肉动物物种(特别是家养动物例如犬或非家养动物例如白鼬、狮子、老虎和豹)中的各种疾病。
在本公开的情境中,术语“散装(bulk)疫苗组合物”意指离开抗原生产的最终阶段(纯化的或未纯化的、单价的或多价混合后)的组合物。术语“干燥疫苗组合物”意指残余水份少于或等于约4%,或约3%的组合物,并且准备好用水溶液将其重构以用作疫苗或直接以干燥颗粒形式使用。还可研磨所述干燥疫苗组合物,并用适当的赋形剂(包括粘合剂)配制以产生适合口服的剂量单位,例如片剂和丸剂。
本发明还涉及用于稳定化一种或多种活减毒副粘病毒的方法。在活减毒副粘病毒生产的最终阶段(例如,在细胞上培养,感染和病毒培养,随后在一个或多个步骤中进行纯化),通过添加稳定剂稀释包含活减毒副粘病毒的纯化的或未纯化的以及浓缩的或未浓缩的病毒收获物,随后进行玻璃化。
活减毒疫苗或免疫原性组合物具有下列优势:其可以以低剂量被施用,特别是如果其为自我复制性的;其密切模拟受试者中的天然/野生型感染,并且其同时(即在单次施用中)给受试者提供所有可能的免疫学上重要的抗原。
普遍认同的是,基于活减毒微生物的免疫原性组合物或疫苗组合物具有诱发高度有效类型的免疫反应的能力。这样的免疫原性组合物或疫苗组合物具有下述优势:一旦动物宿主被免疫接种,病原体至宿主的进入就诱导更早的、细胞介导的免疫或体液免疫的加速召回,这能够在感染可呈现临床上显著的部分之前控制生物体的进一步生长。基于杀死的病原体(杀死的疫苗)的免疫原性组合物或疫苗组合物在本领域中通常被承认不能或不太可能实现该类型的反应。然而,取决于减毒的水平,包含活病原体的免疫原性组合物或疫苗组合物呈现经免疫接种的宿主在免疫接种后可感染针对其寻求保护的疾病的危险。因此,具有活病原体的免疫属性但在给受试者施用后不能够引起不欲的副作用的免疫原性组合物或疫苗组合物将是高度需要的。
活减毒病原体可通过掺入广泛的突变(包括单核苷酸改变、定点突变、***、置换、缺失或重排)来产生。决于突变的性质,这些突变可影响病原体基因组的小区段,例如15至30个核苷酸,或病原体基因组的大区段,例如50至1000个核苷酸。例如,可将突变引入病原体的非编码调控区或元件的上游或下游以去除或削弱其活性,从而产生减毒的表型。
病原体基因组的非编码调控区的突变(其可引起病原体基因的复制的下调和/或病原体基因的转录的下调)可在每一轮复制中导致缺陷病原体的产生;即包含少于完全感染性病原体所需的基因组区域或片段的完全补体的病原体。因此,改变的病原体将显示减弱的特征,这在于病原体在每一轮复制中将产生多于野生型病原体的缺陷性病原体。然而,由于每一轮中合成的蛋白质、抗原或免疫原的量对于野生型病原体和缺陷性病原体而言相似,此种减毒的病原体可能能够诱发受试者中良好的免疫反应。
当病原体的基因编码结构蛋白时,例如在病原体为例如病毒、衣壳、基质、表面或包膜蛋白的情形中,在复制过程中产生的颗粒的数目将减少,从而经突变的病原体显示减弱的特征;例如,导致亚临床水平的感染的滴度。例如,病毒衣壳表达的减少将减少复制过程中包装的核壳体的数目,然而包膜蛋白表达的减少可减少后代病毒体的数目和/或感染性。备选地,复制所需的病毒酶(例如聚合酶、复制酶、解旋酶等)表达的减少应当减少在复制过程中产生的后代基因组的数目。由于在复制过程中产生的感染性颗粒的数目减少,被改变的病毒显示减弱的特征。然而,产生的抗原性病毒颗粒的数目通常将足以诱发受试者中剧烈的免疫反应。
工程化减毒病原体的备选方式包括将突变(包括但不限于一个或多个氨基酸残基的***、缺失或置换)和/或表位引入一种或多种病原体的蛋白质。这可通过将适当的突变工程化到病原体的相应基因序列中来容易地实现。改变病原体蛋白质的活性从而使复制被修饰或减少的任何变化被包括在本发明中。
例如,在减毒病毒的情境中,可将干扰但不完全消除病毒至宿主细胞受体的附着并且确保感染的突变工程化到病毒表面抗原或参与加工的病毒蛋白酶中以产生减毒的株。可修饰病毒表面抗原或毒力因子以包含一个或多个氨基酸的***、置换或缺失或者干扰或减小病毒抗原对于宿主细胞受体的结合亲和力的表位。该方法提供了下述额外的优势:可产生表达外来或异源表位的嵌合病毒,所述病毒还显示减弱的特征。这样的病毒是用作活重组疫苗的理想候选者。
被工程化到任何病毒酶中的突变包括但不限于在酶的活性位点的氨基酸序列中的***、缺失和置换。例如,酶的结合位点可被改变,从而其对于其底物的结合亲和力减小,并且所述酶因而较不特异和/或较不高效。例如,所选择的靶标是病毒聚合酶复合物,因为温度敏感性突变存在于所有聚合酶蛋白中。因此,可将引入与此种温度敏感性相关的氨基酸位置中的变化工程化到病毒聚合酶基因中,从而产生减毒的病毒株。
CDV是直径为约100-300nm并且属于麻疹病毒属的有包膜单链RNA病毒。CDV病毒体核心包含与病毒RNA紧密缔合的核蛋白(NP)肽。第二核心肽为磷蛋白(P)。CDV包膜包含3个肽M蛋白(基质蛋白)和两个糖蛋白。糖蛋白是血凝素糖蛋白(H)和融合(F)糖蛋白。融合糖蛋白被降解成为更小的亚单位,称为F1和F2。H蛋白主要负责病毒至靶细胞的吸附,而融合糖蛋白负责细胞至细胞的融合。迄今为止,所有已知的温热病病毒分离物包含这些共同的病毒多肽。对犬感染的途径是通过感染性气溶胶滴剂,病毒的传播是通过咳嗽、打喷嚏和封闭限制在温暖、潮湿、密闭的环境中而被促进的。研究表明病毒感染首先在上口鼻道的呼吸上皮中发生,随后扩展至深肺实质(Gorham"Canine Distemper",(1960)Advance VeterinaryScience,Brandley和Jungher Editors,6:288-315)。
位于扁桃体中的呼吸上皮中或沿着其分布的组织巨噬细胞和单核细胞似乎是获得并且复制CDV的第一细胞类型。随后病毒在血流中扩散至远处的淋巴网状组织。这是通过病毒血症实现的,并且在初始感染后2至4天中的任何时候发生。感染后8至9天,病毒扩散至淋巴网状组织之外,以包括上皮和间充质组织(Appel,(1969)Am.J.Vet.Res.30,1167-1182)。正是在病毒感染的该阶段,针对病毒抗原的特异性宿主免疫反应影响疾病的结果。疾病的急性致命形式的特征在于不受限制的病毒扩散至身体中的实际上每一个组织。可在被感染的受试者的每一种***物和分泌物中发现病毒,并且通过使用免疫荧光法或抗原追踪技术,可在犬中的实际上每一个细胞类型中观察到抗原的存在。对于这些动物中的大多数,死亡的最可能的原因是暴发的致命神经病学损害和/或脑炎。
一些经CDV感染的犬显示临床上延迟的疾病进展和适度的恢复性免疫反应。临床征象(如果存在的话)在疾病早期是细微的,并且是中枢神经***(CNS)内病毒持续的反映。CNS疾病之外的随后发展是可变的。大多数经CDV感染的犬基本上不显示明显的疾病临床征象,并且被识别为恢复期的临床上正常的犬。已显示最终从CDV感染恢复的活跃感染的犬在感染后第6天或第7天时或左右显示出自由循环的抗病毒抗体(Krakowka,等人,(1975)J.Infect.Dis.132,384-392)。滴度在早期恢复期中快速上升至高水平。
急性感染了CDV的犬显示可变程度的抑郁、厌食和发烧。皮肤可不定地脱水、干燥粗糙和无弹性。这些动物中的一部分显示畏光和黏脓性眼-鼻分泌物的证据。间歇性腹泻是常见的临床征象。在疾病的该急性病毒血症期,病毒散布在每一种分泌物和***物中。随着疾病进展,肺炎(通常是由于继发性细菌侵入者)可发生。该疾病阶段的犬是中度至严重淋巴细胞减少的,这取决于继发性感染的程度或量。虽然被急性影响的犬实际上可以显示神经学征象的每种组合,在其最常见的呈现中,犬呈现癫痫小发作或癫痫大发作。这些惊厥性发作随着时间过去且以递增的频率发生。
犬瘟热的第二神经病学形式是其伴随老犬脑炎(ODE)发生或在亚临床感染和表观恢复后发生。CNS征象在呈现上变化可以极大,并且可被误认为是脑肿瘤、脑损伤、细菌性脑膜炎、脑积水和脊椎盘疾病。犬的CDV感染的主要非神经表现是CDV相关的免疫抑制(Krakowka,等人,(1980)Am.J.Vet.Res.41,284-292)。许多犬瘟热病毒感染的征象可归因于在该衰弱的动物中发生的巧合的继发性感染过程。
犬的疾病还可与细菌病原体例如肺炎细菌种类(包括但不限于支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、巴斯德菌属的种(Pasteurella species)、葡萄球菌属(Staphylococcus)和链球菌属(Streptococcus)的种)相关。这些细菌促成经CDV感染的犬的临床上显著的化脓性结膜炎、鼻炎和支气管肺炎。混合病毒感染(主要是呼吸型的)也是常见的。除了犬腺病毒II感染外,呼肠孤病毒、犬副流感病毒以及推测地其它病毒例如犬疱疹病毒都可参与双重或多重混合感染。
cPi2是诱发犬中最常遇到的病毒性疾病之一的呼吸性疾病的RNA病毒。当副流感病毒、犬腺病毒-2和细菌支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)的组合一起发生时,产生“犬舍咳”。cPi2还引起气管支气管炎,其在一些动物中导致渗出性肺炎。咳嗽的征象在暴露于病毒后7至9天时发生。除非继发性感染发生,否则临床征象是轻微的并且持续时间短。
cPi2是球状有包膜病毒,其平均直径为150-200nm,具有被覆盖有糖蛋白突棘(spike)的脂双层围绕的螺旋核衣壳。每一个病毒颗粒包含单链非节段负义RNA基因组与核蛋白(NP)以及磷蛋白(P)和大(L)蛋白。cPi2感染通过吸入被感染的呼吸道飞沫核获得。鼻和鼻咽是感染的主要部位。病毒主要通过经由血细胞凝集素神经氨酸酶蛋白(其与宿主细胞中的神经氨酸受体特异性组合)附着至这些区域的纤毛上皮细胞来起始感染。随后,病毒通过与细胞膜融合(由F1和F2受体介导)进入细胞。病毒繁殖并细胞内和细胞外地侵入其它细胞。病毒繁殖在整个气管支气管组织中发生,这引起增强的粘液产生。
喉气管炎是喉和气管的炎症,当其在犬中发生时,其通常也称为“犬舍咳”。主要症状是表现为短促、干“咳”的咳嗽,或一系列这样的咳嗽。在其最严重时,咳嗽可以是突发性的,感染涉及整个呼吸道,通常产生肺炎。咳嗽也被表征为深度的,持久的,非产生性的,并且一般伴随流泪和流鼻涕。温度可以是正常的,尽管其通常升高。疾病的发作可以是突然的并且可没有初步迹象而发生。由于疾病有很强的传染性,被感染的犬应当被隔离以防止整个群体的感染。疾病给犬舍主人造成主要的经济损失,而通常不是致命的,其还可使犬虚弱从而产生来自其它疾病的严重作用。
活cPi2病毒和其它病毒(例如CDV、犬腺病毒2型(CAV2)和犬细小病毒(CPV))可在动物组织培养物中繁殖直至使两种病毒均成为非致病性的(即,使病毒失活或以其它方式减毒)。cPi2病毒能够在广泛的组织培养***(例如鸡胚、鸭胚、猪肾、猪睾丸、胎牛肾、猫肾、犬肾和猴肾)中繁殖;以及还可在已建立的细胞系(例如马-达氏牛肾(MDBK)、马-达氏犬肾(MDCK)和Serum Institute兔角膜(SIRC))中繁殖。
为了进行例如犬腺病毒2型(CAV2)的繁殖,肾组织培养物是优选的,特别是来源于牛和犬的那些肾组织培养物,因为CAV2不象cPi2病毒那样有利地在其它动物组织培养***中复制。每一种病毒的减毒可通过标准系列传代(包括末端稀释传代技术(terminaldilution passage))来实现,其中可采用易感组织培养物中充足次数的传代,直至使病毒成为非致病性而不丧失免疫原性。免疫原、免疫原性组合物或从其制备的免疫原性悬液或溶液可刺激对疾病易感的犬的免疫反应而不以任何显著的程度产生通常因毒性试剂引起的临床症状。可在与上文所述的相同或不同的组织中进行繁殖。
传代时间间隔应当足以允许病毒在传代之间复制,温育温度优选维持在约30℃至约38℃。最佳传代时间间隔取决于所使用的具体培养***和温度。无论如何,是否已发生病毒的充分复制可通过标准技术来进行测定,例如Shelokov,A.(1958)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.97,802中描述的血细胞吸附技术(其对于cPi2病毒特别有用),或通过细胞病变观察,例如通过允许病毒至可观察到严重致细胞病变效应的点之前在特定的传代过程中生长并同时持续温育。
有利的繁殖方法利用犬肾细胞,特别是连续MDCK细胞系。例如,为了免疫原性或疫苗目的,可以以3天的间隔和以约30至约38℃的温育温度对通过犬肾组织培养物分离的病毒进行约至少15次,优选约20至约45次传代。优选使用更高的传代的材料,因为这将有益于在有需要的受试者中产生有利的免疫反应。
在制备免疫原性组合物或疫苗组合物中,可使强毒CDV在常规病毒生长条件中生长在培养的哺乳动物细胞中。可在细胞种植时用病毒接种宿主细胞,或当细胞单层为90-100%汇合时以含有CDV的培养基更换接种宿主细胞。感染复数(MOI)比率可以为约0.001至约0.05,优选约0.01。可使用任何适当的哺乳动物细胞生长培养基来产生病毒,例如但不限于伊格尔最低基础培养基、达尔伯克改良伊格尔培养基、Iscove’s改良达尔伯克培养基、Ham’s F12培养基、F15培养基、RPMI1640培养基,其包含动物血清例如胎牛血清、小牛血清、马血清、犬血清等,以约0%至约10%,补允剂例如L-谷氨酰胺和其它氨基酸(必需和非必需的)、Hanks平衡盐溶液(HBSS)、Earle’s盐溶液、丙酮酸钠、碳酸氢钠、胰岛素、转铁蛋白和抗生素及抗真菌剂例如但不限于庆大霉素、青霉素、链霉素、多粘菌素B、两性霉素和本发明还包括的是无血清细胞培养基。
将经感染的细胞培养物在接种后在约35℃至约40℃的温度范围内维持约2至约7天,此时可收获病毒。可用细胞生长培养基接种经感染的培养物,可在2至5天的额外温育期后收获所述培养物。将病毒液体收获至无菌容器中,并可通过过滤进行澄清。可使用常规超滤技术(例如,Millipore Pellicon***),利用具有105道尔顿的颗粒大小排阻限的过滤器进一步浓缩病毒液体。
可与本发明的稳定剂混合的其它活减毒病毒包括但不限于狂犬病病毒、流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、腺病毒例如犬2型腺病毒(CAV2)、呼吸道合胞病毒、EB病毒、鼻病毒、痘病毒科例如痘苗病毒、猪痘、浣熊痘、禽痘病毒例如鸡痘、金丝雀痘、鸠痘、鸽痘、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、冠状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、水痘带状疱疹病毒、疱疹病毒(人和动物)、单纯疱疹病毒、细小病毒例如犬细小病毒(CPV)、巨细胞病毒、肝炎病毒例如犬传染性肝炎病毒、人***瘤病毒、甲病毒例如西门利克森林病毒(Semliki ForestVirus)、辛德毕斯病毒、罗斯河病毒、东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、阿尼昂尼昂病毒(O’nyong-nyong virus)、黄病毒例如登革热病毒和西尼罗病毒、布亚病毒、腺病毒、轮状病毒、肝病毒科例如Orthohepadnaviruses和禽嗜肝病毒、丝状病毒、逆转录病毒科例如猪内源性逆转录病毒、HTLV-1、HTLV-2、FeLV、BLV、MLV、MMSV、Mason-Pfizer猴病毒、慢病毒例如HIV-1、HIV-2、FIV、SIV、BIV、猫杯状病毒、猫泛白细胞减少症病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫鼻气管炎病毒、TGE病毒(猪)和***病毒。
将包含例如犬副粘病毒的免疫原性组合物或悬液或溶液与稳定剂混合,并使用根据本公开的方法进行玻璃化。可将1体积的犬副粘病毒悬液或溶液与1体积的稳定剂混合。
可使用所公开的方法玻璃化的适当的制剂包括犬副粘病毒免疫原性悬液或溶液以及至少来源于或衍生自除副粘病毒外的病原体的活免疫原性组分。本文中定义的活免疫原性组分可包含活减毒病原体例如活减毒病毒、细菌、真菌或寄生虫。然而,活免疫原性组分还可包含被杀死的病毒、重组异源免疫原、抗原、免疫原性亚单位(例如蛋白质、多肽、肽、表位、半抗原)或衍生自或来源于本文中描述的一种或多种病原体的免疫原或抗原的表位,其可从病毒载体、细菌载体、质粒载体等表达。
本发明的活免疫原性组分可包含一种或多种选自犬病原体的免疫原,所述犬病原体包括但不限于狂犬病病毒,犬腺病毒2型(CAV2),犬疱疹病毒(CHV),犬细小病毒(CPV),犬冠状病毒,犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)、黄疸出血型钩端螺旋体(Leptospiraicterohaemorragiae)、感冒伤寒型钩端螺旋体(Leptospira grippotyphosa)、博氏包柔螺旋体(Borrelia burgdorferi)、支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)等,包括其组合。
活免疫原性组分可包括来自CDV的HA、F、NP基因、来自CPV的衣壳基因、来自犬冠状病毒的突棘、M、N基因、来自cPi2的HN和F基因、来自钩端螺旋体属的基因、来自博德特菌属的基因、来自疏螺旋体属的基因以及来自犬疱疹病毒的gB、gC和gD基因等等。这些组分可用作用于保护犬免受由这些病原体引起的疾病的免疫原性组合物或疫苗组合物。
犬腺病毒2型(CAV2)对于狗是广泛且高度传染性的。其产生类似于感冒的症状。通常地,传染性疾病的第一征象是发烧,其通常在1至2天内消退。受影响的犬可具有扁桃体炎,腹部压痛、增大的肝、呕吐和腹泻。急性疾病通常是致命的。可将CAV2灭活或减毒,并且与CDV(和/或cPi2)组合以产生多价疫苗。备选地,可使用CAV2的免疫原或抗原或CAV2免疫原(例如衣壳、基质或六邻体蛋白)的表位。
犬细小病毒(CPV)是可引起幼犬的呕吐、腹泻、胃肠炎、心肌炎和肝炎的常见肠病毒。其被发现广泛存在于犬中。CPV可作为灭活的、活减毒的或CPV免疫原、抗原或CPV免疫原(例如VP1、VP2(衣壳)基因产物)的表位存在于本发明的免疫原性组合物、悬液或溶液中。
还可将犬的两种常见细菌感染以其减毒形式组合在本发明的稳定化的免疫原性组合物、悬液或溶液中;这些是犬钩端螺旋体和黄疸出血型钩端螺旋体。钩端螺旋体感染(Lepto infection)在犬中、特别是被CDV、cPi2或在患有瘟热或犬舍咳的犬中频繁观察到的病毒的组合感染的犬中是常见的,因此,它们被包括在本发明的稳定化的免疫原性组合物、悬液或溶液中具有重大效用。
可用于本发明的组合物和方法中的其它活免疫原性组分可包含一种或多种免疫原,其选自鸟类病原体,包括但不限于鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)、传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)、减蛋综合征病毒(EDS)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、火鸡病毒、禽流感病毒、马立克氏病病毒、庖疹病毒例如感染性喉气管炎病毒、禽传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒、痘病毒包括鸟痘病毒、鸡痘、金丝雀痘、鸽痘、鹌鹑痘、和鸠痘(dovepox)、鸟类多瘤病毒、禽肺炎病毒、禽鼻气管炎病毒、禽网状内皮组织增生病毒、禽逆转录病毒、禽内源性病毒(avian endogenousvirus)、禽幼红细胞增多症病毒、禽肝炎病毒(avian hepatitis virus)、禽贫血症病毒、禽肠炎病毒(avian enteritis virus)、泡疹病毒(Pacheco’s disease virus)、禽白血病病毒、禽细小病毒、禽轮状病毒、禽白血病病毒(avian leukosis virus)、禽肌腱膜纤维肉瘤(avian musculoaponeurotic fibrosarcoma virus)、禽成髓细胞血症病毒、禽成髓细胞血症相关病毒(avian myeloblastosis-associated virus)、禽髓细胞组织增生病毒、禽肉瘤病毒、禽脾脏坏死病毒(avian spleen necrosis virus)及其组合。
关于具体的免疫原,活性免疫原性组分还可以是新城疫疾病病毒的HN和F基因、来自传染性法氏囊病病毒的多蛋白和VP2基因、来自传染性支气管炎病毒的S和N基因以及来自马立克氏病病毒的gB和gD基因。这些组分可用作用于保护禽类免患由这些病原体引起的疾病的免疫原性组合物或疫苗组合物。
备选地,活免疫原性组分包含一种或多种来自猫病原体的免疫原,所述猫病原体为例如但不限于猫疱疹病毒(FHV),猫杯状病毒(FCV),猫白血病病毒(FeLV),猫传染性腹膜炎病毒、猫白细胞减少症病毒、猫免疫缺陷病毒(FIV),狂犬病病毒等及其组合。
活免疫原性组分还可包括来自猫疱疹病毒的gB、gC和gD基因、来自FeLV的env和gag/pro基因、来自FIV病毒的env、gag/pol和tat基因、来自猫杯状病毒的衣壳基因、来自猫传染性腹膜炎病毒的S修饰基因、M和N基因以及来自猫细小病毒的VP2基因。这些组分可用作用于保护猫免受患这些病原体引起的疾病的免疫原性或疫苗组合物。
活免疫原性组分可包含一种或多种来自马病原体的免疫原,所述马病原体为例如马疱疹病毒(1型或4型)、马流感病毒,马脑脊髓炎病毒(EEV)、破伤风、西尼罗病毒等或其组合。
活免疫原性组分还可包含来自马疱疹病毒1型的gB、gC、gD和立即早期基因、来自马疱疹病毒4型的gB、gC、gD和立即早期基因、来自马流感病毒的HA、NA、M和NP基因,来自东方马脑炎病毒的基因、来自西方马脑炎病毒的基因、来自委内瑞拉马脑炎病毒的基因、来自西尼罗病毒的prM-M-E基因和来自马动脉炎病毒的基因,但不限于这些序列。这些组分可用作用于保护马免患由这些病原体引起的疾病的免疫原性组合物或疫苗组合物。
活免疫原性组分可包含一种或多种来自牛病原体的免疫原,所述牛病原体为例如狂犬病病毒、牛轮状病毒、牛副流感病毒3型(bCPI2-3)、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、***病毒(FMDV)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、传染性牛鼻气管炎病毒(IBR)、大肠杆菌(Escherichia coli)、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、溶血巴斯德菌(Pasteurella haemolytica)等,及其组合。
活免疫原性组分还可选自来自牛疱疹病毒1型的gB、gC、gD和立即早期基因、来自BRSV的F和G基因、来自BVDV的E1、E2基因、来自PI3病毒的HN和F基因或来自轮状病毒的基因。这些组分可用作用于保护牛免患由这些病原体引起的疾病的免疫原性或疫苗组合物。
此外,活免疫原性组分可包含一种或多种来自猪病原体的免疫原,所述猪病原体是例如但不限于猪流感病毒(SIV)、猪环状病毒2型(PCV-2)、猪繁殖呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪霍乱病毒(HCV)、FMDV、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、支气管炎博德特菌(Bordetellabronchiseptica)、大肠杆菌等,及其组合。
活免疫原性组分还可包括来自PRV的gB、gC、gD和立即早期基因、来自猪流感病毒的HA,NA,M和NP基因、来自猪霍乱病毒的多蛋白、E1、E2、来自PCV2病毒的ORF1和ORF2基因、来自PRRSV病毒的ORF3、ORF4、ORF5、ORF6或ORF7或来自猪肺炎支原体的基因。这些组分可用作用于保护猪免患由这些病毒体引起的疾病的免疫原性组合物或疫苗组合物。
活免疫原性组分可包含编码在病原体中表达的蛋白的序列,所述病原体为例如RNA或DNA病毒如HIV、HCV、HBV、HPV、EBV、HSV、CMV、HTLV、汉坦病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、立夫特山谷热病毒、拉沙病毒和流感病毒、出血性肠炎病毒(hemorrhagic enteritidisvirus)(HEV)、传染性鼻气管炎病毒(infectious rhinotracheitis virus)(IBRV)。此种免疫原可有利地被用作保护受试者(例如人)免患由这些病原体引起的疾病的免疫原性组合物或疫苗组合物。
活免疫原性组分还可以是,例如来自下列病原性细菌中的任一种及其抗原:放线杆菌属的种(Actinobacillus species)例如胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)、百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、副百日咳博代氏菌(Bordetella parapertussis)、支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、鸟博德特氏菌(Bordetella avium)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumonia)、鹦鹉衣原体(Chlamydia psittaci)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)的种例如克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumonia)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、假结核分枝杆菌(Mycobacterium pseudotuberulosis)、肺炎分支杆菌(Mycobacterium pneumoniae)、A组链球菌属(Group A Streptococcus)、马链球菌(Streptococcus equi)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、草绿色链球菌(Streptococcus viridians)、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)、丹毒丝菌属的种(Erysipelothrix species)、肠产毒性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)、沙门氏菌属的种(Salmonella species)、阿哥拉沙门氏菌(Salmonella agona)、布洛克兰沙门菌(Salmonella blockley)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteriditis)、哈达尔沙门菌(Salmonella hadar)、海德尔堡沙门菌(Salmonella Heidelberg)、梦得维的沙门菌(Salmonella Montevideo)、山夫顿堡沙门菌(Salmonella senftenberg)、猪霍乱沙氏杆菌(Salmonella cholerasuis)、立克次体属的种(Rickettsia species),幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、猫胃螺杆菌(Helicobacter felis)、志贺菌属的种(Shigella species)、利斯塔氏菌属的种(Listeriaspecies)、嗜肺军团菌(Legionella pneumonia)、假单胞菌属的种(Pseudomonasspecies)、疏螺旋体属的种(Borrelia species)、伯氏疏螺旋体(Borellia burgdorferi)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)、梭菌属的种(Clostridium species)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、尿素分解尿素支原体(Ureaplasma urealyticum)、葡萄球菌属的种(Staphylococcus species)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、鼠疫巴斯德菌(Pasteurella pestis)、弯曲杆菌属的种(Campylobacter species)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、密螺旋体属的种(Treponema species)、钩端螺旋体属(Leptospira species)、白喉杆菌(Corynebacteriumdiphtheria)、杜克雷嗜血杆菌(Hemophilus ducreyi)、流感嗜血杆菌(Hemophilusinfluenza)、埃立克体属的种(Erlichhia species)等等。
活免疫原性组分还可来源于真菌或霉菌例如黄曲霉菌、烟曲菌、青霉属的种、镰刀菌属的种、念珠菌属的种例如念珠菌毛癣菌(Candida trichophyton)、***滑假丝酵母、光滑假丝酵母、杜氏假丝酵母和白色念珠菌、根霉菌属的种、隐球菌属的种例如新型隐球菌、Cryptococcus grubii,格特隐球菌、Paracoccidiodes brasiliensis、夹膜组织胞浆菌,以及其它真菌和霉菌。
活免疫原性组分还可选自来源于寄生虫的种类的寄生虫抗原,所述寄生虫的种类包括但不限于疟原虫属的种、锥虫属的种、贾第虫属的种、牛蜱属的种、巴贝虫属的种、内阿米巴属的种、艾美球虫属的种、利什曼原虫属的种、血吸虫属的种、布鲁丝虫属的种、吸虫属的种、恶丝虫属的种、吴策线虫属的种、盘尾属的种、密螺旋体属的种、弓形虫属的种、隐球菌属的种、球虫目的种、组织滴虫病的种、六鞭毛虫病的种、贾第虫属的种等;线虫包括蛔虫属的种、毛线虫属的种等,蠕虫例如肝蛭,绦虫等等;其它寄生虫如病原性生物体。用于制备来源于病毒、细菌、真菌、霉菌、原生动物、线虫及蠕虫的免疫原的方法在本领域是已知的。
其它有用的免疫原可以是例如纯化的分泌的抗原毒力因子例如毒素、细胞毒素等。可通过修饰(类毒素)解毒的毒素抗原,其可与佐剂例如氢氧化铝组合施用,并可被用于刺激毒素中和抗体的形成。可可被用作免疫原的毒素的实例包括细菌内毒素和外毒素例如脂多糖,肠毒素包括不耐热肠毒素(LT)、热稳定肠毒素(ST)、志贺样毒素(verotoxin,VT)等。细菌外毒素免疫原被分泌至周围培养基中,包括例如白喉毒素(白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae))、破伤风毒素(破伤风梭菌(Clostridium tetani))、由金黄色葡萄球菌分泌的肠毒素、肉毒毒素(肉毒梭菌(Clostridium botulinum));和由藻类产生毒素例如神经毒素等。通过细菌的自溶释放的热稳定内毒素包括例如从革兰阴性霍乱弧菌(Vibrio cholerae)释放的霍乱毒素、由肠细菌例如大肠杆菌产生的大肠杆菌素(细菌素)。
衍生自或来源于病毒、细菌、真菌等的免疫原可使用适当的培养基或宿主细胞系以及本领域技术人员公知的常规方法,通过体外培养法产生。例如,可将PRRSV在适当的细胞系例如MA-104细胞系(参见美国专利No.5,587,164;5,866,401;5,840,563;6,251,404等)中培养。可使用PK-15细胞系(参见美国专利No.6,391,314)以类似的方式培养PCV-2;可在卵上培养SIV(美国专利No.6,048,537);以及可在适当的培养基中培养猪肺炎支原体(美国专利No.5,968,525;5,338,543;Ross R.F.等人,(1984)Am.J.Vet.Res.45:1899-1905)。有利地,可将CDV在貂肺细胞(例如美国专利No.5,178,862中描述的那些貂肺细胞)中培养。用于制备病毒来源的免疫原的其它技术在本领域中是已知的,并且描述于例如Ulmer等人,Science259:1745(1993);Male等人,Advanced Immunology,第14.1-14.15页,J.B.Lippincott Co.,Philadelphia,Pa.(1989)中。
还有用的是模拟抗原性肽序列的免疫原性合成肽。这样的免疫原可使用例如R.B.Merrifield,Science85:2149-2154(1963)中描述的固相技术来合成,被纯化,并任选地使用双功能偶联剂例如戊二醛等将其偶联至载体蛋白例如胞壁酰二肽(MDP)、牛血清白蛋白(BSA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)等。
合成的抗原也被包含在定义内,例如多表位(polyepitope)、侧翼表位以及其它重组或合成来源的抗原。参见例如,Bergmann等人(1993)Eur.J.Immunol.23,2777-2781;Bergmann等人(1996)J.Immunol.157,3242-3249;Suhrbier,A.(1997)Immunol.CellBiol.75,402-408;Gardner等人(1998)12th World AIDS Conference,Geneva,Switzerland,Jun.28-Jul.3,1998。为了本发明的目的,免疫原性片段通常可包括分子的至少约3个氨基酸,优选至少约5个氨基酸,更优选至少约10-15氨基酸,最优选25或更多个氨基酸。对于片段的长度,没有临界上限,其可以包括几乎全长蛋白质序列,或甚至包含蛋白质的两个或更多个、或至少一个表位的融合蛋白。
因此,表达表位的核酸的最小结构可包含编码蛋白质或多蛋白的表位、免疫原或抗原的核苷酸。编码总的蛋白或多蛋白的片段的核酸更有利地包含编码总的蛋白质或多蛋白的序列的最少约21个核苷酸,有利地至少约42个核苷酸,优选至少约57、约87或约150个连续或邻接的核苷酸,或基本上由其组成,或由其组成。表位测定程序,例如产生重叠肽文库(Hemmer B.等人,(1998)Immunology Today19(4),163-168)、肽扫描(Pepscan)(Geysen等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81,3998-4002;Geysen等人,(1985)Proc.Nat.Acad.Sci.USA82,178-182;Van der Zee R.等人,(1989)Eur.J.Immunol.19,43-47;Geysen H.M.,(1990)Southeast Asian J.Trop.Med.Public Health21,523-533; Peptide Synthesis Kits de Chiron)和算法(De Groot A.等人,(1999)Nat.Biotechnol.17,533-561和PCT申请系列No.PCT/US2004/022605中)(将所有这些通过引用整体并入本文)可被用于实施本发明而无需过度实验。还可参考本文中引用和并入的其它文献,用于确定免疫原或抗原的表位以及从而编码这样的表位的核酸分子的方法。
在本发明中,活免疫原性组分还可包含治疗剂、细胞因子、毒素、免疫调节剂、蛋白质、肽、抗体、抗体的抗原结合片段、佐剂或可由DNA编码且被需要用于递送至动物或动物细胞或组织的任何其它分子。
本发明还涉及的是在本发明的免疫原性组合物和疫苗组合物中包含反义、催化或小干扰RNA种类,所述RNA种类可被靶向针对存在于接受者细胞内、或可能存在于接受者细胞内的任何分子。这些RNA种类包括但不限于编码细胞调节分子(例如白细胞介素-6、癌症的致病因子例如人***瘤病毒、酶)的RNA种类、病毒RNA和病原体来源的RNA例如HIV-1RNA。RNA还可靶向非转录的DNA序列处,例如启动子或增强子区域,或靶向存在于接受者细胞中的任何其它分子,例如但不限于参与DNA合成的酶或tRNA分子。
此外,可将细胞因子和免疫调节剂在本发明免疫原性组合物和疫苗组合物中共表达。实例包括但不限于IL-2、IL-4、TNF-α、GM-CSF、IL-10、IL-12、IGF-1、IFN-α、IFN-β和IFN-γ。
可将特定序列基序例如RGD基序***病毒或质粒载体的H-I环中以增强其感染性。已显示该序列是某些细胞外基质和粘着蛋白与被称为整联蛋白的细胞表面受体的超家族相互作用所必需的。RGD基序的***可有利地用于免疫受损的受试者。重组载体可通过将特定抗原或免疫原或其片段克隆进入任何载体(例如本文中描述的那些载体)来构建。重组载体可被用于转导脊椎动物的细胞,以用作免疫剂。(参见,例如,美国专利申请系列No.10/424,409,通过引用并入)。
优选地,编码活性免疫原性组分(例如抗原、免疫原和表位)的密码子是“最优化的”密码子,即密码子是频繁出现(即高度表达)在犬基因中的那些密码子,而不是被例如CDV或cPi2频繁使用的那些密码子。这样的密码子使用提供了活免疫原性组分在细胞中的高效表达。在其它实施方案中,例如,当活免疫原性组分在细菌、酵母或其它表达***中表达时,密码子使用模式被改变以代表抗原或免疫原在其中表达的生物体中所高度表达的基因的密码子偏向。密码子使用模式在关于许多物种的高度表达的基因的文献中是已知(例如,Nakamura等人,1996;Wang等人,1998;McEwan等人1998)。
在一些情形中,可能必需修饰编码序列,从而可将其以适当的方向连接至控制序列;即,以维持恰当的阅读框架。还可能需要产生所需的活性免疫原性组分的突变体或类似物。突变体或类似物可通过缺失编码蛋白质的序列的一部分,通过***序列,和/或通过置换序列内的一个或多个核苷酸来制备。用于修饰核苷酸序列的技术,例如定点诱变被描述于例如Sambrook等人,同上;DNA Cloning,同上;Nucleic Acid Hybridization,同上中。
可将可用作根据本发明的活性免疫原性组分的免疫原包含在载体中。这样的载体包括但不限于体内重组表达载体例如核酸载体或质粒(EP申请No.1001025;Chaudhuri P,(2001)Res.Vet.Sci.70,255-6)、病毒载体例如但不限于腺病毒载体、痘病毒载体例如鸡痘(美国专利系列No.5,174,993;5,505,941;和5,766,599)、金丝雀痘载体(美国专利系列No.5,756,103)、逆转录病毒载体、疱疹病毒载体、基于甲病毒的载体、真菌载体或细菌载体(大肠杆菌或沙门菌属的种)。可用于本发明的载体的具体实例被描述于本文中。
载体可以是病毒载体,有利地为包含至少一个活性免疫原性组分或其表位或其片段的禽痘病毒载体。在特别有利的实施方案中,禽痘病毒载体是金丝雀痘载体,有利地为减毒金丝雀痘载体例如ALVAC。减毒金丝雀痘病毒被描述于美国专利No.5,756,103(ALVAC)和WO01/05934中。禽痘病毒载体可以是鸡痘载体,有利地为减毒的鸡痘载体例如TROVAC。也参考与减毒的鸡痘病毒株TROVAC相关的美国专利No.5,766,599。在这方面,参考可在登录号VR-111下从ATCC获得的金丝雀痘。许多鸡痘病毒免疫株也是可获得的,例如由Merial销售的DIFTOSEC CT株和由Intervet销售的NOBILIS VARIOLE疫苗;以及还参考与减毒的鸡痘病毒株TROVAC相关的美国专利No.5,766,599。
也可用于递送活性免疫原性组分的病毒载体包括痘病毒,例如牛痘病毒或减毒的牛痘病毒(例如,MVA,安卡拉疫苗株在鸡胚成纤维细胞上进行超过570次传代后获得的经修饰的安卡拉株;参见Stickl&Hochstein-Mintzel,(1971)Munch.Med.Wschr.113,1149-1153;Sutter等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89,10847-10851;可获得作为ATCCVR-1508;或NYVAC,参见美国专利No.5,494,807,例如,美国专利No.5,494,807(其讨论了NYVAC的构建)的实施例1至6,以及从哥本哈根株痘苗病毒基因组缺失额外的ORF的NYVAC的变体,以及异源核酸编码序列至该重组位点的***,以及还有匹配的启动子的使用;也参见WO96/40241)、禽痘病毒或减毒禽痘病毒(例如,金丝雀痘、鸡痘、鸠痘、牛痘、鸽痘、鹌鹑痘、ALVAC或TROVAC;参见,例如,美国专利No.5,505,941,5,494,807)、猪痘、浣熊痘、骆驼痘或黏液瘤病病毒。
关于有关产生其重组体和如何施用其重组体的方法的信息,本领域技术人员可参考本文中引用的文献和WO90/12882,例如关于痘苗病毒,特别提及美国专利No.4,769,330,4,722,848,4,603,112,5,110,587,5,494,807和5,762,938;关于鸡痘,特别提及美国专利No.5,174,993,5,505,941和US-5,766,599;关于金丝雀痘,特别提及美国专利No.5,756,103;关于猪痘,特别提及美国专利No.5,382,425;以及,关于浣熊痘,特别提及WO00/03030。
当表达载体是痘苗病毒时,编码待表达的活性免疫原性组分(例如免疫原、抗原、表位等)的核酸的***位点有利地在胸苷激酶(TK)基因或***位点、血凝素(HA)基因或***位点、编码A型包涵体(ATI)的区域;也参见本文中引用的文献,特别是关于痘苗病毒的那些文献。在金丝雀痘的情况下,有利地,***位点是ORF C3、C5和/或C6;也参见本文中引用的文献,特别是关于金丝雀痘病毒的那些文献。在鸡痘的情况下,有利地,***位点是ORFsF7和/或F8;也参见本文中引用的文献,特别是关于鸡痘病毒的那些文献。MVA病毒区域的***位点有利地如在各种出版物中的,包括Carroll M.W.等人(1997)Vaccine15(4),387-394;Stittelaar K.J.等人(2000)J.Virol.,2000,74(9),4236-4243;Sutter G.等人(1994)Vaccine12(11),1032-1040;并且在这方面,还注意到完整MVA基因组被描述于Antoine G.,(1998)Virology244,365-396中,这使得本领域技术人员能够使用其它***位点或其它启动子。
有利地,可将待表达的核酸***在特定痘病毒启动子的控制下,所述启动子为例如,特别是牛痘启动子7.5kDa(Cochran等人,(1985)J.Virology54,30-35)、牛痘启动子I3L(Riviere等人,(1992)J.Virology66,3424-3434)、牛痘启动子HA(Shida,(1986)Virology150,451-457)、牛痘启动子42K(Cooper J.A.等人,(1981)J.Virol.37(1),284-94)、牛痘启动子ATI(Funahashi等人(1988)J.Gen.Virol.69,35-47)、痘苗11K启动子(美国专利No.5,017,487);痘苗启动子H6(Taylor J.等人,(1988)Vaccine6,504-508;Guo P.等人(1989)J.Virol.63,4189-4198;Perkus M.等人(1989)J.Virol.63,3829-3836),或合成的痘苗或痘病毒启动子。
有利地,对于免疫接种哺乳动物,表达载体可以是金丝雀痘或鸡痘载体。如此,可有具有有限的或非生产性的复制的异源蛋白表达。
可用于递送和表达活性免疫原性组分的另一种病毒载体是腺病毒。腺病毒是无包膜的DNA病毒。从腺病毒衍生的载体具有许多使它们特别适用于基因转移的特性。重组腺病毒载体是携带一个或多个异源核苷酸序列(例如,2、3、4、5或更多个异源核苷酸序列)的腺病载体。例如,腺病毒的生物学已被详尽表征,病毒在将其DNA引入宿主细胞中方面极其高效,病毒可感染广泛的细胞,并且具有广泛的宿主范围,病毒可相对容易地大量产生,以及可通过病毒基因组的早期区域1(“E1”)的缺失而使病毒成为复制缺陷性的。
与例如逆转录病毒相反,腺病毒不整合入宿主细胞的基因组,能够感染非***性细胞,并且能够高效地体内转移重组基因(Brody等人,1994)。这些特性使腺病毒成为用于例如目标异源核酸至有需要的细胞、组织或受试者内的体内基因转移的吸引人的候选者。
优选包含多个缺失的腺病毒载体,用于增加载体的携带能力和减小重组的可能性,以产生复制型腺病毒(RCA)。当腺病毒包含多个缺失时,每一个缺失(如果单独存在)不必然导致复制缺陷型腺病毒。只要缺失之一使得腺病毒成为复制缺陷型的,则可包含另外的缺失用于其它目的,例如,以增加腺病毒基因组对异源核苷酸序列的携带能力。优选地,超过一个缺失阻止功能性蛋白质的表达并且使得腺病毒为复制缺陷性的。更优选地,所有缺失均为将使腺病毒为复制缺陷性的缺失。
采用腺病毒重组体的本发明的实施方案可包括E1-缺陷性或缺失的、E3-缺陷性或缺失的和/或E4-缺陷性或缺失的腺病毒载体,或其中所有病毒基因都缺失的“无肠”腺病毒载体。腺病毒载体可在E1、E3或E4基因中包含突变,或在这些或所有腺病毒基因中包含缺失。E1突变提高了载体的安全裕度(margin),因为E1-缺陷型腺病毒突变体被认为在非许可细胞中是复制缺陷型的,并且至少是高度减毒的。E3突变通过破坏腺病毒籍以下调MHC I类分子的机制增强了抗原的免疫原性。E4突变通过抑制晚期基因表达减小腺病毒载体的免疫原性,从而可允许利用相同的载体重复再免疫接种。本发明包括任何血清型或血清组的腺病毒载体,所述腺病毒载体在E1、E3、E4、E1和E3以及E1和E4中被缺失或突变。
“无肠”腺病毒载体是腺病毒载体家族中的最新模型并且来源于人腺病毒序列。其复制需要辅助病毒和表达E1a和Cre的特殊人293细胞系,此条件不存在于天然环境中;载体被除去了所有病毒基因,因而作为疫苗携带者的载体是非免疫原性的,并且可被多次接种以用于再免疫。“无肠”腺病毒载体还包含36kb空间来容纳目标异源核酸,因而允许许多抗原或免疫原向细胞中的共递送。
因此,本发明中的载体可以是任何适当的重组病毒或病毒载体,这包括但不限于痘病毒(例如,痘苗病毒,禽痘病毒、金丝雀痘病毒、鸡痘病毒、浣熊痘病毒、猪痘病毒等)、腺病毒(例如,犬腺病毒)、疱疹病毒、杆状病毒、逆转录病毒(如在通过引用并入本文中的文献中的);或所述载体可以是质粒。本文中引用和通过引用并入本文中的文献,除了提供可用于实施本发明的载体的实例外,还可提供待通过本发明的稳定化的免疫原性组合物、悬液或溶液中的或包含在其中的载体表达的其它活性免疫原性组分的来源。
用于表达活性免疫原性组分的元件可以有利地存在于质粒载体中。术语质粒涵盖含有根据本发明的核酸和其在所需宿主或靶标的细胞中体内表达所必需的元件的任何DNA转录单元;并且,在这方面,应注意超螺旋或非超螺旋、环状DNA以及线性形式意欲在本发明的范围内。
活性免疫原性组分(例如抗原、免疫原和表位)的表达(以最少的方式)包含起始密码子(ATG)、终止密码子和启动子,以及任选地还包括多腺苷酸化序列,用于某些载体例如质粒和某些病毒载体例如除痘病毒外的病毒载体。当核酸在载体中编码多蛋白片段时,ATG被置于阅读框架的5'末端,终止密码子被置于3'末端。可存在用于控制表达的其它元件,例如增强子序列、稳定化序列和允许蛋白质的表达、修饰和分泌的信号序列。
核酸“编码序列”或“编码特定蛋白质的核苷酸序列”是当置于适当的调控元件的控制之下时体外或体内转录并且翻译成多肽的DNA序列。编码序列的边界通过位于5'末端的起始密码子和位于3'末端的翻译终止密码子来确定。编码序列可包括但不限于原核生物序列、来自真核生物mRNA的cDNA、来自真核生物(例如,哺乳动物)DNA的基因组DNA和甚至合成的DNA序列。转录终止序列通常将位于编码序列的3'。
核酸“控制元件”总体地是指启动子、RNA剪接位点、核糖体结合位点、多腺苷酸化信号(例如,来源于牛生长激素的多腺苷酸化信号、SV40多腺苷酸化信号)、转录终止序列、上游调控结构域、增强子、复制起始点(其可以是细菌来源的,例如来源于细菌载体例如pBR322,或真核生物来源的,例如自主复制序列(ARS))、包装信号、可以被包含或不包含在活性免疫原性组分(例如免疫原、抗体或表位)的编码序列中的前导序列。如果包含信号序列,则其可以是天然的同源序列,或异源序列。前导序列可在翻译后加工中被宿主除去。参见,例如,美国专利No.4,431,739;4,425,437;4,338,397等,其总体地提供了编码序列在宿主细胞中的转录和翻译。
并非所有这些控制序列总是需要存在于重组载体中,只要所需的基因能够被转录和翻译。当RNA聚合酶结合启动子并且将编码序列转录成mRNA时,控制元件例如启动子“指导编码序列在细胞中转录”。所得的mRNA随后被翻译成编码序列编码的多肽。
取决于所需的水平和组织特异性表达,可使用多种启动子/增强子元件。启动子可以是组成型的或诱导型的(例如,金属硫蛋白启动子、四环素可诱导启动子和蜕皮激素可诱导启动子等等),这取决于所需的表达模式。启动子可以是天然的或异源的,并且可以是天然或合成序列。在此情境中,“异源的”描述未在向其中引入了转录起始区的野生型宿主中发现的转录起始区。选择启动子,而使得其在靶细胞或目标组织中起作用。本发明包括脑特异性、肝特异性和肌肉特异性(包括骨骼肌、心肌、平滑肌和/或膈肌特异性)启动子。哺乳动物和禽类启动子也是优选的,特别是犬启动子。
启动子可以有利地是“早期”启动子。“早期”启动子在本领域中是已知的并且被定义为驱动在从头蛋白质合成不存在的情况下快速和瞬时表达的基因的表达的启动子。启动子还可以是“强”或“弱”启动子。术语“强启动子”和“弱启动子”在本领域是已知的并且可通过在启动子处的转录起始的相对频率(次数/分钟)来定义。“强”或“弱”启动子还可通过其对于RNA聚合酶的亲和力来定义。
可将异源基因置于启动子、核糖体结合位点(对于细菌表达)和任选地增强子或操纵子的控制之下,从而编码所需的蛋白质的DNA序列在被包含活性免疫原性组分的载体转化的宿主或受试者中被转录成为RNA。
可将控制元件和其它调控序列连接至编码序列,随后***载体,例如上述克隆性载体。备选地,可将编码序列直接克隆到已包含控制序列和适当的限制性位点的表达载体中。
更优选地,抗原或免疫原可操作地与例如人巨细胞病毒(CMV)主要立即早期启动子、猴病毒40(SV40)启动子、β-肌动蛋白启动子、白蛋白启动子、延伸因子1-α(EF1-α)启动子、PγK启动子、MFG启动子或劳斯肉瘤病毒启动子缔合。其它表达控制序列包括来源于免疫球蛋白基因、腺病毒、牛***瘤病毒、疱疹病毒等的启动子。除了任何犬病毒启动子以外,任何哺乳动物病毒启动子也可用于实施本发明。在病毒来源的犬启动子中,感染性犬疱疹病毒的立即早期基因的启动子、早期(即,胸苷激酶、DNA解旋酶、核糖核苷酸还原酶)或晚期启动子可用于本发明的方法和载体中。其它启动子包括犬腺病毒的E1启动子以及犬主要组织相容性复合物I启动子。此外,选择以足够高的水平表达目标抗原或免疫原以诱导或引发针对所述抗原或免疫原的免疫反应的适当启动子(而无过度实验)完全在本领域技术人员的能力范围内。
已推测驱动具有CMV启动子的异源核苷酸转录可导致具有免疫能力的动物中表达的下调(参见,例如,Guo等人,1996)。因此,还优选地将抗原或免疫原序列与例如不导致抗原或免疫原表达的这种下调的经修饰CMV启动子结合。
本发明的载体还可包含多接头或多克隆位点(“MCS”),其可有利地位于启动子的下游。多接头提供了用于抗原或免疫原分子的***的位点,所述抗原或免疫原分子与启动子序列“同框”,引起“可操作地”将启动子序列连接至目标抗原或免疫原。多克隆位点和多接头对于本领技术人员来说是公知的。
本文中描述的载体还可包含抗生素抗性基因。可整合入本发明的载体的此种抗生素抗性基因的实例包括但不限于氨苄青霉素、四环素、新霉素、zeocin、卡那霉素、博来霉素、潮霉素、氯霉素等。
在其中有超过1种抗原或免疫原的实施方案中,抗原或免疫原序列可与单个上游启动子和一个或多个下游内部核糖体进入位点(IRES)序列(例如,微小核糖核酸病毒EMCIRES序列)可操作地结合。IRES序列允许两个或更多个编码序列从单个mRNA序列多顺反子翻译。
本发明的载体随后可用于转化适当的宿主细胞或受试者。许多哺乳动物细胞系在本领域是已知的,包括可从美国典型培养物保存中心(ATCC)获得的永生化细胞系,例如但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如,Hep G2)、马-达牛肾(“MDBK”)细胞、马-达犬肾(“MDCK”)细胞以及其它细胞。类似地,细菌宿主例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、沙门菌属的种、志贺菌属的种和链球菌属的种可用于本发明。可用于本发明的酵母宿主包括,特别是酿酒酵母菌、白色假丝酵母、麦芽糖假丝酵母、汉逊酵母、脆壁克鲁维酵母、乳克鲁维酵母、季也蒙氏毕赤酵母、毕赤氏巴斯德酵母、裂殖酵母菌丝和耶氏解脂假丝酵母。可用于本发明的昆虫宿主包括但不限于草地贪夜蛾细胞。
备选地,载体可用于感染培养中的细胞以表达所需的基因产物,例如以产生目标蛋白质或肽。优选地,蛋白质或肽被分泌进入培养基,并且可使用本领域已知的常规技术从其纯化。指导蛋白质的细胞外分泌的信号肽序列在本领域是已知的,可通过本领域已知的常规技术将编码所述信号肽的核苷酸序列可操作地连接至编码目标肽或蛋白质的核苷酸序列。备选地,可裂解细胞,并从细胞裂解物纯化表达的重组蛋白。优选地,细胞是脊椎动物细胞,更优选哺乳动物细胞。
用于制备和/或施用用于体内或体外表达本发明的基因的基因产物的载体或重组体或质粒的方法可以是任何所需的方法,例如,由如下文献中公开的方法或与所述公开的方法类似的方法,或由如下文献中引用的文献公开的方法:美国专利No.4,603,112;4,769,330;4,394,448;4,722,848;4,745,051;4,769,331;4,945,050;5,494,807;5,514,375;5,744,140;5,744,141;5,756,103;5,762,938;5,766,599;5,990,091;5,174,993;5,505,941;5,338,683;5,494,807;5,591,639;5,589,466;5,677,178;5,591,439;5,552,143;5,580,859;6,130,066;6,004,777;6,130,066;6,497,883;6,464,984;6,451,770;6,391,314;6,387,376;6,376,473;6,368,603;6,348,196;6,306,400;6,228,846;6,221,362;6,217,883;6,207,166;6,207,165;6,159,477;6,153,199;6,090,393;6,074,649;6,045,803;6,033,670;6,485,729;6,103,526;6,224,882;6,312,682;6,348,450和6;312,683;1986年10月16日提交的美国专利申请系列No.920,197;WO90/01543;W091/11525;WO94/16716;WO96/39491;WO98/33510;EP265785;EP0370573;Andreansky等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93,11313-11318;Ballay等人(1993)EMBO J.4,3861-65;Felgner等人(1994)J.Biol.Chem.269,2550-2561;Frolov等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93,11371-11377;Graham,F.L.(1990)Trends Biotechnol.8,85-87;Grunhaus等人(1992)Sem.Virol.3,237-52;Ju等人(1998)Diabetologia41,736-739;Kitson等人(1991)J.Virol.65,3068-3075;McClements等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93,11414-11420;Moss,B.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93,11341-11348;Paoletti,E.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93,11349-11353;Pennock等人(1984)Mol.Cell.Biol.4,399-406;Richardson(Ed),(1995)Methods in Molecular Biology39,“BaculovirusExpression Protocols,”Humana Press Inc.;Smith等人(1983)Mol.Cell.Biol.3,2156-2165;Robertson等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93,11334-11340;Robinson等人(1997)Sem.Immunol.9,271;和Roizman,B.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93,11307-11312。
异源序列在受试者中的表达可导致受试者对抗原或免疫原的表达产物的免疫反应。因此,本发明的活性免疫原性组分可用于免疫原性组合物或疫苗组合物来提供诱导免疫反应的手段,所述免疫反应可以是但不需要是保护性的。本发明的情境中使用的分子生物学技术由Sambrook等人(2001)描述。
甚至进一步备选地或另外地,在本发明中包括的免疫原性或疫苗组合物中,可从编码抗原或免疫原的核苷酸序列删除编码跨膜结构域的一部分。甚至进一步备选地或另外地,载体或免疫原性组合物还可包含和在宿主细胞中表达编码异源tPA信号序列(例如哺乳动物tPA)和/或稳定化内含子(例如兔β-珠蛋白基因的内含子II)的核苷酸序列。
可以以获得对于基因产物(例如,表位、抗原、治疗剂和/或抗体)组合物所述的量的量给受试者施用载体。本发明考虑了低于和高于本文中举例说明的那些剂量的剂量,并且对于待给受试者施用的任何组合物,包括其组分,和对于任何具体的施用方法,优选例如通过在适当的受试者中测定中位细胞培养感染剂量(cell culture infective dose)(CCID50)、致死剂量(LD)和LD50来测定毒性;并且通过例如血清的滴定及其分析,例如通过ELISA和/或血清中和分析来测定引发适当的反应的组合物的剂量、其中组分的浓度和施用组合物的时间。根据本领域技术人员的知识、本公开和本文中引用的文献,这样的测定不需要过度实验。
本申请的实施例中已测试了包含活减毒CAV2、活减毒CDV、活减毒cPi2和活减毒CPV以及包含根据本发明的稳定剂的多价免疫原性组合物和/或疫苗组合物和/或免疫原性悬液或溶液。这些多价疫苗显示对于CDV、cPi2、CAV2和CPV的良好稳定性。这表明本发明的稳定剂能够保存CDV、cPi2、CAV2和CPV的活力和感染性。这还表明本发明的稳定剂能够保存除犬副粘病毒外的多种病毒(尤其是犬细小病毒和犬腺病毒)的活力和感染性。根据本发明的稳定剂还可用作包含CAV、CPV、CDV或cPi2的单价免疫原性组合物或疫苗组合物。
冷却步骤(b)可在低于约–40℃(水冷冻步骤)的温度下进行。通过在低压下升华冰而干燥经稳定的免疫原性悬液或溶液(c)可在例如低于或等于约200μbar的压力下进行,然而压力的进一步降低可在低于或等于约100μbar的压力下进行。最后,在除去过量残余水的过程(d)中经稳定的免疫原性悬液或溶液的温度在例如约20℃至约30℃的温度下进行。
冷冻干燥的过程还可利用免疫原性悬液或溶液来进行,所述悬液或溶液包含活减毒犬副粘病毒和至少一种来源于除副粘病毒外的病原体的活免疫原性组分,将其与根据本发明的稳定剂混合,以获得冻干的经稳定的多价免疫原性或疫苗组合物。
玻璃化材料的水分含量可在约0.5%至约5%w/w,优选约0.5%至约3%w/w,更优选约1.0%至约2.6%w/w的范围内。
为了将其用于和施入受试者,可通过用溶剂再水化来重构玻璃化的稳定化的免疫原性组合物或疫苗组合物。溶剂通常是水,例如去矿物质水或蒸馏水、注射用水,但还可包括生理溶液或缓冲液,例如磷酸盐缓冲溶液(PBS)或佐剂,包括但不限于油包水乳剂、短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)、卡介苗(Bacillus Calmette Guerin)、氢氧化铝、葡聚糖、硫酸葡聚糖、氧化铁、海藻酸钠、Bacto-佐剂、某些合成聚合物例如多聚氨基酸和氨基酸的共聚物、皂苷、“REGRESSIN”(Vetrepharm,Athens,Ga.)、“AVRIDINE”(N,N-十八烷基-N',N'-双(2-羟乙基)-丙二胺)、石蜡油、胞壁酰二肽等。佐剂和佐剂组合物的其它具体实例被详述于本文中。
适当的佐剂包括fMLP(N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸;美国专利No.6,017,537)和/或丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和/或马来酸酐的共聚物和烯基衍生物的共聚物。丙烯酸或在丙烯酸聚合可以例如利用糖或多元醇的聚烯醚来交联。这些化合物以术语“卡波姆”命名(Pharmeuropa,第8卷,No.2,June1996)。本领域技术人员还可参考美国专利No.2,909,462(通过引用并入),其讨论了利用包含至少3个羟基的多羟基化化合物交联的此种丙烯酸类聚合物;多羟基化化合物包含不超过8个羟基;作为另一个实例,至少3个羟基的氢原子被包含至少2个碳原子的不饱和脂肪族基替代。基(radical)可包含约2至约4个碳原子,例如乙烯基、烯丙基和其它烯键式不饱和基团。不饱和基自身可包含其它取代基,例如甲基。在名称(Noveon Inc.,Ohio,USA)下销售的产品特别适合用作佐剂。它们与烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联,关于该内容,参考产品974P、934P和971P。
关于马来酸酐的共聚物和烯基衍生物的共聚物,参考产品(Monsanto),其为马来酸酐和乙烯的共聚物,其可以是线性的或交联的,例如与二乙烯醚交联。此外,可参考美国专利No.6,713,068和Regelson,W.等人,1960;(通过引用并入)。
包含季铵盐的阳离子脂质被描述于美国专利No.6,713,068中(将其内容通过引用并入本文),其也可用于本发明的方法和组合物。在这些阳离子脂质当中,优选的是DMRIE(N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧)-1-丙烷铵;WO96/34109),其有利地与中性脂质(有利地DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺;Behr J.P.等人,1994)缔合以形成DMRIE-DOPE。
本发明的重构的准备好注射的免疫原性组合物或疫苗组合物中的组分的总含量可被用于以等渗浓度(例如,在约100-600mOsm的范围内,通常在约250-450mOsm的范围内,优选约330mOsm)提供注射。
冻干的稳定化的免疫原性组合物或疫苗组合物或重构的准备好注射的免疫原性组合物或疫苗组合物中的活减毒病原体(特别是CDV和cPi2)的剂量,可在约102至约107CCID50/剂的范围中。对于冻干的稳定化的多价免疫原性组合物或疫苗组合物或重构的准备好使用的多价免疫原性组合物或疫苗组合物中的蛋白质、多肽或糖蛋白,其在灭活之前可在约105至约109CCID50/剂量,优选约106至约108CCID50/剂量的等同滴度的范围内。
可通过注射(通过胃肠外或粘膜途径,优选肌内和皮下)给动物施用重构的准备好使用的免疫原性组合物或疫苗组合物。然而,这样的重构的准备好使用的免疫原性组合物或疫苗组合物的施用还可包括鼻内、皮内、局部或品服施用。用于注射的剂量的体积可以为约0.1ml至约2.0ml,优选约1.0ml。
本发明现将通过下列非限定性实施例被进一步描述,所述实施例通过对本发明的各种实施方案举例说明的方式给出,并且无意以任何方式限定本发明。