EA031069B1 - АНТИТЕЛА ПРОТИВ ИНТЕГРИНОВ αVβ6 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к антителам, которые специфично связываются с интегрином αvβ6. Антитела могут быть полезными для лечения и диагностики различных видов злокачественных заболеваний, а также для детекции αvβ6.

Description

Изобретение относится к антителам, которые специфично связываются с интегрином ανβ6. Антитела могут быть полезными для лечения и диагностики различных видов злокачественных заболеваний, а также для детекции ανβ6.

031069 Bl

По настоящей заявке испрашивается приоритет временной заявки США № 61/600499, поданной 17 февраля 2012 года, и временной заявки США № 61/602511, поданной 23 февраля 2012 года, каждая из которых включена в описание в качестве ссылки в полном объеме.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к моноклональным антителам, которые специфично связываются с интегрином ανβ6, и к способам их применения для лечения злокачественного новообразования. Описанные в изобретении антитела включают антитела 15H3. Антитело 15H3 представляет собой моноклональное антитело мыши, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2. Настоящее изобретение включает химерные и гуманизированные формы антитела 15H3 мыши, а также его человеческие формы. Химерные, гуманизированные и человеческие формы антитела 15H3 содержат, по существу, такие же гипервариабельные участки (CDR), как и антитела 15H3 мыши, и специфично связываются с интегрином σ.νβ6. Три участка CDR вариабельной области тяжелой цепи в антителе 15H3 мыши имеют последовательности SEQ ID NO:3 (HCDR1), SEQ ID NO:4 (H-CDR2) и SEQ ID NO:5 (H-CDR3). Три участка CDR легкой цепи антитела 15H3 мыши имеют последовательности SEQ ID NO:6 (L-CDR1), SeQ ID NO:7 (L-CDR2) и SEQ ID NO:8 (LCDR3). В гуманизированном антителе, содержащем, по существу, такие же гипервариабельные участки (CDR), как и в антителе 15H3 мыши, которое специфично связывается с </.v[^J>6. по меньшей мере одно из положений H28, H30, H72, H73, H75, H78 или H93 из вариабельной области тяжелой цепи необязательно занимает аминокислотный остаток соответствующего положения антитела 15H3 мыши. В любом таком антителе по меньшей мере два положения H28, H30, H72, H73, H75, H78 или H93 необязательно заняты аминокислотным остатком из соответствующего положения антитела 15H3 мыши. В любом таком антителе по меньшей мере четыре положения H28, H30, H72, H73, H75, H78 или H93 необязательно заняты аминокислотным остатком соответствующего положения антитела 15H3 мыши. В любом таком антителе по меньшей мере одно из положений H28 и H30 необязательно занимает S. В любом таком антителе положения H28 и H30 необязательно заняты S. Необязательно в любом таком антителе положения Н28 и H30 заняты S, положение H72 занимают D или Q, положение H73 занимают T или K, положение H75 занимают T или S, положение H78 занимают V или A, и положение 93 занимают A или V. Необязательно в любом из указанных вариантов осуществления не более 10 аминокислотных остатков, не более 9, не более 8, не более 7, не более 6 или не более 5 аминокислотных остатков в каркасной области тяжелой цепи занимают аминокислотные остатки соответствующего положения антитела 15H3 мыши. Необязательно в любом из указанных вариантов осуществления участки CDR вариабельной области тяжелой цепи представляют собой участки SEQ ID NO:1, а участки CDR вариабельной области легкой цепи представляют собой участки SEQ ID NO:2. Необязательно в любом из указанных вариантов осуществления участки CDR вариабельной области тяжелой цепи, по существу, представляют собой участки SEQ ID NO:1, и участки CDR вариабельной области легкой цепи, по существу, представляют собой участки SEQ ID NO:2. Необязательно в любом из указанных вариантов осуществления участки CDR вариабельной области тяжелой цепи представляют собой участки SEQ ID NO:1, и участки CDR вариабельной области легкой цепи представляют собой участки SEQ ID NO:2, которые имеют 0, 1, 2 или 3 консервативные аминокислотные замены в каждом CDR. В одном из аспектов изобретение относится к химерным или гуманизированным антителам, которые специфично связываются с интегрином ανβ6 и содержат последовательности гипервариабельного участка (CDR) тяжелой цепи SEQ ID NO:3 (CDR1), SEQ ID NO:4 (CDR2) и SEQ ID NO:5 (CDR3), и последовательности CDR легкой цепи SEQ ID NO:6 (CDR4), SEQ ID NO:7 (CDR5) и SEQ ID NO:8 (CDR6), которые имеют 0, 1, 2 или 3 консервативные аминокислотные замены в каждом CDR. В этом разделе и, в целом, в настоящей заявке для описания положения вариабельных областей в тяжелой и легкой цепях используется нумерация по Kabat.

Изобретение также относится к антителам (например, гуманизированным антителам), содержащим вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 90% идентична HA (SEQ ID NO:9), и с вариабельной областью легкой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична LA (SEQ ID NO:10). В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к антителам, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 90% идентична HA (SEQ ID NO:9), имеющим по меньшей мере одну обратную мутацию 15H3 мыши в вариабельной каркасной области тяжелой цепи, и вариабельную область легкой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична LA (SEQ ID NO:10). Выражение имеющая по меньшей мере одну обратную мутацию 15H3 мыши в каркасной области вариабельной цепи означает, что по меньшей мере один из аминокислотных остатков в акцепторной каркасной области вариабельной цепи заменен на аминокислотный остаток, который присутствует в соответствующем положении донорного антитела 15H3 мыши. В любом таком антителе по меньшей мере одно положение H28, H30, H72, H73, H75, H78 или H93 необязательно занято аминокислотным остатком соответствующего положения антитела 15H3 мыши. В любом из таких антител по меньшей мере два положения H28, H30, H72, H73, H75, H78 или H93 необязательно заняты аминокислотным остатком соответствующего положения антитела

- 1 031069

15H3 мыши. В любом из таких антител по меньшей мере четыре положения H28, H30, H72, H73, H75, H78 или Н93 необязательно заняты аминокислотным остатком соответствующего положения антитела 15H3 мыши. В любом из таких антител все положения H28, H30, H72, H73, H75, H78 или Н93 необязательно заняты аминокислотным остатком соответствующего положения антитела 15H3 мыши. В любом из таких антител по меньшей мере одно из положений H28 и H30 необязательно занято S. В любом из таких антител положения H28 и H30 необязательно заняты S. Необязательно в любом из таких антител положения Н28 и H30 занимает S, положение Н72 занимает D или Q, положения H73 занимает T или K, положение H75 занимает T или S, положение H78 занимает V или A, и положение H93 занимает A или V. Необязательно в любом из этих вариантов осуществления не более 10 аминокислотных остатков, не более 9, не более 8, не более 7, не более 6 или не более 5 аминокислотных остатков в каркасной области тяжелой цепи заняты аминокислотным остатком из соответствующего положения антитела 15H3 мыши. В любом из этих вариантов осуществления участки CDR вариабельной области тяжелой цепи необязательно представляют собой участки SEQ ID NO:1, и участки CDR вариабельной области легкой цепи представляют собой участки SEQ ID NO:2. В любом из этих вариантов осуществления участки CDR вариабельной области тяжелой цепи необязательно представляют собой, по существу, участки SEQ ID NO:1, и участки CDR вариабельной области легкой цепи, по существу, представляют собой участки SEQ ID NO:2. Необязательно в любом из этих вариантах осуществления участки CDR вариабельной области тяжелой цепи представляют собой участки SEQ ID NO:1, и участки CDR вариабельной области легкой цепи представляют собой участки SEQ ID NO:2, которые имеют 0, 1, 2 или 3 консервативные аминокислотные замены в каждом CDR.

Настоящее изобретение также относится к антителам (например, гуманизированным антителам), содержащим вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 90% идентична HB (SEQ ID NO:11), HF (SEQ ID NO:12), HG (SEQ ID NO:13), HK (SEQ ID NO:14), HL (SEQ ID NO:15), HM (SEQ ID NO:16), HN (SEQ ID NO:17), HO (SEQ ID NO:18), HQ (SEQ ID NO:19), HR (SEQ ID NO:20), HS (SEQ ID NO:21), HT (SEQ ID NO:22) или HU (SEQ ID NO:23), и вариабельную область легкой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична LA (SEQ ID NO:10), LB (SEQ ID NO:24), LC (SEQ ID NO:25), LD (SEQ ID NO:26), LE (SEQ ID NO:27), LF (SEQ ID NO:28) или LG (SEQ ID NO:29), и любые их комбинации (например, антитело может содержать любую вариабельную область тяжелых цепей, спаренную с любой вариабельной областью легкой цепи). Антитело необязательно содержит вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 95% идентична HA, HB, HF, HG, HK, HL, HM, HN, НО, HQ, HR, HS, НТ, HU, и вариабельную область легкой цепи, которая по меньшей мере на 95% идентична LA, LB, LC, LD, LE, LF, или LG, и любые их комбинации (то есть антитело может содержать любую вариабельную область тяжелой цепи, спаренную с любой вариабельной областью легкой цепи). Необязательно в любом таком антителе по меньшей мере одно из положений H28, H30, H72, H73, H75, H78 или Н93 занято аминокислотным остатком соответствующего положения антитела 15H3 мыши. В любом из таких антител по меньшей мере два положения H28, H30, H72, H73, H75, H78 или Н93 необязательно занято аминокислотным остатком соответствующего положения антитела 15H3 мыши. В любом из таких антител по меньшей мере одно положение Н28 и H30 необязательно занимает S. В любом из таких антител положения H28 и H30 необязательно занимают S. Необязательно в любом таком антителе положения Н28 и H30 занимают S, положение Н72 занимает D или Q, положение H73 занимает T или K, положение H75 занимает T или S, положение H78 занимает V или A, и положение 93 занимает A или V. Необязательно в любом из этих вариантов осуществления не более 10 аминокислотных остатков, не более 9, не более 8, не более 7, не более 6 или не более 5 аминокислотных остатков в каркасной области тяжелой цепи заняты аминокислотным остатком соответствующего положения антитела 15H3 мыши. Необязательно в любом из этих вариантов осуществления участки CDR вариабельной области тяжелой цепи представляют собой участки SEQ ID NO:1, и участки CDR вариабельной области легкой цепи представляют собой участки SEQ ID NO:2. Необязательно в любом из этих вариантов осуществления участки CDR вариабельной области тяжелой цепи, по существу, представляют собой участки SEQ ID NO:1, и участки CDR вариабельной области легкой цепи, по существу, представляют собой участки SEQ ID NO:2. Необязательно в любом из этих вариантов осуществления участки CDR вариабельной области тяжелой цепи представляют собой участки SEQ ID NO:1, и участки CDR вариабельной области легкой цепи представляют собой участки SEQ ID NO:2, имеющие 0, 1, 2 или 3 консервативные аминокислотные замены в каждом CDR. Вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи описанных в изобретении антител необязательно слиты с сигнальным пептидом. Примером мышиного сигнального пептида тяжелой цепи является SEQ ID NO:33, примером человеческого сигнального пептида тяжелой цепи является SEQ ID NO:34, примером мышиного сигнального пептида легкой цепи является SEQ ID NO:35, и примером человеческого сигнального пептида легкой цепи явлется SEQ ID NO:36.

В антителах по изобретению вариабельная область тяжелой цепи необязательно слита с константной областью тяжелой цепи, и вариабельная область легкой цепи необязательно слита с константной областью легкой цепи. Константная область тяжелой цепи может представлять собой природную константную область человека или может представлять собой мутантную форму природной константной области

- 2 031069 человека, например область, в которой уменьшено связывание с Fc-гамма рецептором по сравнению с природной константной областью человека. Необязательно константная область тяжелой цепи представляет собой изотип IgG1. Необязательно константная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID N0:30, и константная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID N0:31. Необязательно константная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID N0:32, и константная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID N0:31. Антитело необязательно конъюгировано с цитотоксическим средством (то есть представляет собой конъюгат антителолекарственное средство). Конкретные антитела по настоящему изобретению обладают аффинностью к ανβ6 человека, которая превышает аффинность варианта антитела 15H3 мыши. Некоторые другие антитела обладают аффинностью к (zv[^J>6 человека, которая не более чем в 10 раз ниже, предпочтительно не более чем в 6 раз ниже, более предпочтительно не более чем в 5 раз ниже, еще более предпочтительно не более чем в 2 раза ниже, чем аффинность варианта антитела 15H3 мыши, что определено анализом конкурентного связывания или анализом связывания способом насыщения (например, с помощью анализов, описанных в разделе Примеры). В некоторых аспектах описанные в изобретении гуманизированные антитела имеют аффинность к (zv[^J>6 человека, которая находится в пределах примерно 10-кратной, предпочтительно в пределах примерно 5-кратной, более предпочтительно в пределах примерно 2-кратной аффинности антитела 15H3 мыши против (zv[^J>6 человека. В одном из аспектов описанные в изобретении гуманизированные антитела имеют кажущуюся константу диссоциации (KD) в отношении avP6 человека в диапазоне от 0,1 до 10 нМ, предпочтительно от 0,1 до 5 нМ, более предпочтительно от 0,1 до 2 нМ, от 0,5 до 2 нМ или от 0,5 до 1,5 нМ.

Также изобретение относится к биспецифичным моноклональным антителам, содержащим описанные в изобретении аминокислотные последовательности.

Настоящее изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи любого вышеописанного антитела.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения злокачественного новообразования у пациента, и указанный способ включает введение пациенту описанного выше антитела по эффективной схеме. Предпочтительно антитело конъюгировано с цитотоксическим средством. Злокачественное новообразование представляет собой заболевание, при котором экспрессируется антиген </.v[^J>6. Необязательно злокачественное новообразование представляет собой рак мочевого пузыря, рак головы и шеи (в том числе рак губы, полости рта, полости носа, околоносовых пазух, глотки и гортани), рак кожи, рак легких, рак поджелудочной железы, рак матки, рак молочной железы (в том числе тройной негативный рак молочной железы), рак шейки матки, рак толстой кишки, рак предстательной железы, рак яичников, рак желудка или рак печени. Необязательно злокачественное новообразование является плоскоклеточной карциномой или аденокарциномой.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 показывает выравнивание аминокислотных последовательностей родительского моноклонального антитела (mAb) мыши (называемый 15H3) с вариабельными областями тяжелой цепи (два верхних сектора) и легкой цепи (два нижних сектора) выбранных гуманизированных 15H3.

Фиг. 2 показывает результаты анализов конкурентного связывания на клетках 293F, экспрессирующих (zv[^J>6 человека, с антителами, имеющими тяжелую цепь HB, и родительскими антителами мыши (называемый m15H3).

Фиг. 3A-3C показывают результаты анализы связывания способом насыщения с антителами HBLC и HTLC на клетках 293F и клетках FDC-P1, экспрессирующих </.v[^J>6.

Фиг. 4 показывает результаты анализов конкурентного связывания на клетках 293F, экспрессирующих </.v[^J>6. с антителами, имеющими тяжелые цепи HB, HL и HN, и с родительским антителом мыши (называемый m15H3).

Фиг. 5 показывает результаты анализов конкурентного связывания на клетках 293F, экспрессирующих avP6, с антителами, имеющими тяжелые цепи HB, HQ и HR, и с родительским антителом мыши (называемый m15H3).

Фиг. 6 показывает результаты анализов конкурентного связывания на клетках 293F, экспрессирующих avP6, с антителами, имеющими тяжелые цепи HM, и с родительским антителом мыши (называемый m15H3).

Фиг. 7 показывает результаты анализов конкурентного связывания на клетках 293F, экспрессирующих avP6, с антителами, имеющими тяжелые цепи HB, HL, HS, НТ и HU, и с родительским антителом мыши (называемый m15H3).

Фиг. 8 показывает анализ экспрессии белка </.v[^J>6 в иммуногистохимическом анализе (ИГХ) на образцах рака мочевого пузыря от Tumor Micro Array.

Фиг. 9A-9F в анализах цитотоксичности показывают, что поведение гуманизированных 15H3 конъюгатов антитело против отР6-лекарственное средство (ADC) сходно с поведением родительских антител мыши.

- 3 031069

Фиг. 10 показывает результаты исследования с ксенотрансплантатом линии клеток Detroit 562 рака головы и шеи на голых мышах. Доза указана в фигуре. Первое введение проводили при достижении размеров опухоли примерно 100 мм³.

Фиг. 11 показывает результаты исследования с ксенотрансплантатом линии клеток HPAFII рака поджелудочной железы на голых мышах. Доза и время введения указаны в фигуре.

Фиг. 12 показывает результаты исследования с ксенотрансплантатом линии клеток BxPC-3 рака поджелудочной железы на голых мышах. Доза и время введения указаны в фигуре.

Подробное описание

Настоящее изобретение, среди прочего, относится к моноклональным антителам, которые специфично связываются с α.νβ6 и их конъюгатами. Антитела можно использовать для лечения и диагностики состояний, связанных с экспрессией ανβ6 (включая различные виды злокачественных заболеваний), а также для детекции α.νβ6. Антитела, которые специфично связываются с ανβ6, специфично связываются только с субъединицей β6 интегрина и/или с интегриновым комплексом ανβ6, но не только с субъединицей αν.

Термин выделенное антитело относится к антителу, которое было идентифицировано и выделено и/или отделено от компонентов своего природного окружения, и/или к антителу, которое было получено рекомбинантным способом. Очищенное антитело представляет собой антитело, чистота которого обычно составляет по меньшей мере 50% мас./мас., в пересчете на посторонние белки и другие загрязняющие примеси, возникающие при получении или очистке антитела, но при этом не исключается возможность того, что антитело комбинируют с избытком фармацевтически приемлемого носителя (носителей) или другого носителя, предназначенного для облегчения его применения. Посторонние белки и другие загрязняющие примеси могут включать, например, клеточные компоненты из клеток, из которых антитело было выделено или получено рекомбинантным способом. Иногда антитела имеют чистоту по меньшей мере 60, 70, 80, 90, 95 или 99% мас./мас. в пересчете на посторонние белки и загрязняющие вещества, которые возникают при получении или очистке. Описанные в изобретении антитела, в том числе, мышиные, химерные, гуманизированные антитела и антитела человека, могут быть получены в выделенном и/или очищенном виде.

Термин моноклональное антитело, используемый в изобретении, относится к антителу, полученному из популяции, по существу, гомогенных антител, т.е. составляющие популяцию отдельные антитела являются идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Определение моноклональное указывает на характер антитела, полученного, по существу, из популяции гомогенных антител, и не должно рассматриваться в плане необходимости какого-либо конкретного способа получения антитела. Например, моноклональные антитела, предназначенные для использования в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены способом гибридом, впервые описанным авторами Kohler et al. (1975) Nature 256:495, или могут быть получены способами рекомбинантных ДНК (см., например, патент США № 4816567). Моноклональные антитела также могут быть выделены из библиотек фаговых антител, например, используя способы, описанные в публикациях Clackson et al. (1991) Nature, 352:624-628 и Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597, или могут быть получены другими способами. Антитела, описанные в настоящем изобретении, представляют собой моноклональные антитела.

Специфичное связывание моноклонального антитела с его антигеном-мишенью подразумевает аффинность по меньшей мере 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹ или 10¹⁰ М^-1, при этом величина аффинности обнаружимо выше, и специфичное связывание отличается от неспецифичного, которое происходит по меньшей мере с одной неродственной мишенью. Специфичное связывание может быть результатом образования связей между отдельными функциональными группами или конкретным пространственным расположением (например, типа замок-ключ), тогда как неспецифичное связывание обычно обусловлено силами Вандер-Ваальса. Можно использовать известные способы анализа антител на специфичное связывание с ανβ6, такие как, например, системы конкурентного и неконкурентного иммуноанализа с использованием таких способов, как вестерн-блоттинг, радиоиммуноанализ, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), сэндвич-иммуноанализы или иммунопреципитация.

Основная структурная единица антитела в интактном антителе представляет собой тетрамер субъединиц. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, и каждая пара имеет одну легкую (около 25 кДа) и одну тяжелую цепь (около 50-70 кДа). Аминоконцевой участок каждой цепи включает вариабельную область примерно от 100 до 110 аминокислот или больше, которые в первую очередь отвечают за распознавание антигена. Эта вариабельная область первоначально экспрессируется, будучи связанной с расщепляемым сигнальным пептидом. Карбоксиконцевой участок каждой цепи определяет константную область, отвечающую, главным образом, за эффекторную функцию.

В классификации легких цепей есть каппа- или лямбда-цепи. Тяжелые цепи подразделяются на гамма-, мю-, альфа-, дельта- или эпсилон-цепи и они определяют изотип антитела как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE соответственно. В легких и тяжелых цепях вариабельные и константные области соединены Jучастком длиной приблизительно 12 или более аминокислот с тяжелой цепью, также включающей D

- 4 031069 области длиной приблизительно 10 или более аминокислот (см. общую информацию в издании Fundamental Immunology (Paul, W., Ed., 2-е изд. Raven Press, NY, 1989, гл. 7, которое включено в описание в качестве ссылки в полном объеме).

Вариабельные области каждой пары легкой/тяжелой цепей образуют сайт связывания антитела. Таким образом, интактное антитело имеет два сайта связывания. Эти два сайта связывания являются одинаковыми, за исключением сайтов связывания бифункциональных или биспецифичных антител. Все цепи показывают одинаковое общее строение консервативных каркасных областей (FR), соединенных посредством трех гипервариабельных участков, называемых также гипервариабельными участками или CDR. Участки CDR из двух цепей каждой пары выровнены по каркасным областям, что позволяет связываться со специфичным эпитопом. И легкие и тяжелые цепи содержат домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4 от N-конца к C-концу. Обозначение аминокислот в каждом домене соответствует определению по Kabat: Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991), или по Chothia: Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989). Kabat также представляет широко используемую систему нумерации (нумерация по Kabat), в которой соответствующим остаткам между различными тяжелыми цепями или между различными легкими цепями присваивается один и тот же номер.

Термин антитело включает интактные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты. Обычно фрагменты антител конкурируют с интактным антителом, из которого они были получены, за специфичное связывание с мишенями, включающими отдельные тяжелые цепи, легкие цепи, Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)c, диатела, доменные антитела (dAb), нанотела и Fv. Фрагменты могут быть получены с помощью технологии рекомбинантной ДНК или путем ферментативного или химического разделения интактных иммуноглобулинов. Термин антитело также включает диатело (гомодимерный Fv-фрагмент) или минитело (V_L-V_H-C_H3), биспецифичное антитело или тому подобное. Биспецифичное или бифункциональное антитело представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее две разные пары тяжелых/легких цепей и два разных сайта связывания (см., например, Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Rostelny et al., J. Immunol., 148: 1547-53 (1992)). Термин антитело включает антитело само по себе (голое антитело) или антитело, конъюгированное с цитотоксическим средством.

Термин эпитоп относится к участку антигена, с которым связывается антитело. Эпитоп может быть образован смежными аминокислотами или несмежными аминокислотами, расположенными в юкстапозиции, посредством третичной укладки одного или нескольких белков. Эпитопы, образованные из смежных аминокислот, обычно сохраняются при воздействии денатурирующих растворителей, тогда как эпитопы, образованные третичной укладкой, обычно исчезают при обработке денатурирующими растворителями. Эпитоп обычно включает по меньшей мере 3 аминокислоты, более типично по меньшей мере 5 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Способы определения пространственной конформации эпитопов включают, например, рентгеновскую кристаллографию и 2-мерный ядерный магнитный резонанс (см., например, Epitope Mapping Protocols, в издании Methods in Molecular Biology, т. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996)).

Антитела, которые распознают одинаковые или перекрывающиеся эпитопы, можно идентифицировать с помощью простого иммуноанализа, показывающего способность одного антитела конкурировать с другим антителом за связывание с антигеном-мишенью. Для идентификации контактирующих остатков также можно определять эпитоп антитела с помощью рентгеновской кристаллографии антитела, связанного с его антигеном. Альтернативно, два антитела имеют одинаковый эпитоп, если все аминокислотные мутации в антигене, которые уменьшают или устраняют связывание одного антитела, также уменьшают или устраняют связывание другого антигена. Два антитела имеют перекрывающиеся эпитопы, если некоторые аминокислотные мутации, которые уменьшают или устраняют связывание одного антитела, также уменьшают или устраняют связывание другого антигена.

Конкуренция между антителами определяется с помощью анализа, в котором тестируемое антитело ингибирует специфичное связывание ссылочного антитела с общим антигеном (см., например, Junghans et al., Cancer Res 50: 1495, 1990). Тестируемое антитело конкурирует с ссылочным антителом, если избыток тестируемого антитела (например, по меньшей мере 2-, 5-, 10-, 20- или 100-кратный) ингибирует связывание ссылочного антитела по меньшей мере на 50%, но предпочтительно на 75, 90 или 99%, что измеряют с помощью анализа конкурентного связывания. Идентифицированные в анализе конкурентного связывания антитела (конкурирующие антитела) включают антитела, связывающиеся с тем же эпитопом, что и ссылочное антитело, и антитела, связывающиеся со смежным эпитопом, расположенным достаточно близко к связанному с ссылочным антителом эпитопу, чтобы возникло стерическое препятствие.

Термин пациент включает людей и других млекопитающих, которые также получают терапевтическое лечение.

Термины лечение или лечить относятся к замедлению, прекращению или обратному развитию злокачественного новообразования с экспрессией (zv[^J>6 у пациента, о чем свидетельствует снижение или устранение клинических или диагностических симптомов заболевания, путем введения индивиду анти

- 5 031069 тела против ανβό или конъюгата антитело-лекарственное средство после появления клинического или диагностического симптома злокачественного новообразования с экспрессией ανβό на любой клинической стадии. Лечение может включать, например, уменьшение тяжести симптома, количества симптомов или частоты рецидивов.

При классификации аминокислотных замен по принципу консервативности или неконсервативности считаются консервативными следующие аминокислотные замены: замена серина на треонин, аланин или аспарагин; замена треонина на пролин или серин; замена аспарагина на аспарагиновую кислоту, гистидин или серин; замена аспарагиновой кислоты на глутаминовую кислоту или аспарагин; замена глутаминовой кислоты на глутамин, лизин или аспарагиновую кислоту; замена глутамина на аргинин, лизин или глутаминовую кислоту; замена гистидина на тирозин или аспарагин; замена аргинина на лизин или глутамин; замена метионина на изолейцин, лейцин или валин; замена изолейцина на лейцин, валин или метионин; замена лейцина на валин, изолейцин или метионин; замена фенилаланина на тирозин или триптофан; замена тирозина на триптофан, гистидин или фенилаланин; замена пролина на треонин; замена аланина на серин; замена лизина на глутаминовую кислоту, глутамин или аргинин; замена валина на метионин, изолейцин или лейцин; и замена триптофана на фенилаланин или тирозин.

Процентные показатели идентичности последовательностей определяют в последовательностях антител, максимально выровненных по системе нумерации Kabat. При выравнивании, если область антитела у индивида (например, вся вариабельная область из тяжелой или легкой цепи) сравнивается с той же областью ссылочного антитела, процент идентичности последовательности между областью от индивида и областью ссылочного антитела представляет собой число положений, занятых одинаковыми аминокислотами в обеих областях, полученных от индивида и из ссылочного антитела, деленное на общее число выровненных положений двух областей, без подсчета пропусков, умноженное на 100 для преобразования в проценты.

Обозначение диапазона значений включает все целые числа в пределах диапазона или определяющих диапазон.

Эффекторная функция антитела относится к функции, которая обусловлена Ре-доменом(доменами) иммуноглобулина. Такими функциями может быть, например, антителозависимая клеточная цитотоксичность, антителозависимый клеточной фагоцитоз или комплементзависимая цитотоксичность. Такая функция может осуществляться, например, путем связывания эффекторного Fc-домена (доменов) с Fcрецептором на иммунной клетке с фагоцитарной или литической активностью или путем связывания эффекторного Fc-домена (доменов) с компонентами системы комплемента. Обычно эффект (эффекты), опосредуемый Fc-связывающими клетками или компонентами комплемента, приводят к ингибированию и/или истощению ανβό-нацеленной клетки. Fc-области антитела могут рекрутировать клетки, экспрессирующие Fc-рецептор (FcR), и приводить их в юкстапозицию с клетками-мишенями, покрытыми антителами. Клетки, экспрессирующие поверхностный FcR к IgG, включающие FcyRIII (CD16), FcyRH (CD32) и FcyRI (CD64), могут выступать в качестве эффекторных клеток для уничтожения IgG-покрытых клеток. Такие эффекторные клетки включают моноциты, макрофаги, клетки-природные киллеры (NK), нейтрофилы и эозинофилы. Вовлечение FcyR посредством IgG активирует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) или антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP). ADCC опосредуется эффекторными клетками CD16+ через секрецию мембранных порообразующих белков и протеаз, а фагоцитоз опосредуется эффекторными клетками CD32⁺ и CD64⁺ (см. Fundamental Immunology, 4^th ed., Paul ed., Lippincott-Raven, N.Y., 1997, главы 3, 17 и 30; Uchida et al., 2004, J. Exp. Med. 199: 1659-69; Akewanlop et al., 2001, Cancer Res. 61:4061-65; Watanabe et al., 1999, Breast Cancer Res. Treat. 53: 199-207). В дополнение к ADCC и ADCP Fc-области связанных с клетками антител также могут активировать классический путь комплемента, чтобы вызвать комплементзависимую цитотоксичность (CDC). C1q из системы комплемента связывается с Fc-областями антител, когда они находятся в комплексе с антигенами. Связывание C1q с антителами, которые связаны с клеткой, может запускать каскад событий, включающих протеолитическую активацию C4 и C2 для образования C3-конвертазы. Расщепление C3 до C3b посредством C3-конвертазы позволяет активировать компоненты концевого комплемента, включающие C5b, C6, C7, C8 и C9. В совокупности эти белки образуют поры мембрано-атакующего комплекса на клетках, покрытых антителами. Эти поры нарушают целостность клеточной мембраны, убивая клеткимишени (см. Immunobiology, 6^th ed., Janeway et al., Garland Science N.Y., 2005, глава 2).

Термин антителозависимая клеточная цитотоксичность, или ADCC, представляет собой механизм индукции гибели клеток, который зависит от взаимодействия покрытых антителами клеток-мишеней с иммунными клетками, обладающими литической активностью (также называемых эффекторными клетками). Такие эффекторные клетки включают природные клетки-киллеры, моноциты/макрофаги и нейтрофилы. Эффекторные клетки присоединяются к эффекторному Fc-домену (доменам) иммуноглобулина, связанного с клетками-мишенями посредством их антигенсвязывающих участков. В результате действия эффекторной клетки происходит гибель антител, покрытых клетками-мишенями.

Термин антителозависимый клеточный фагоцитоз, или АПДТ, относится к механизму, при котором происходит полная или частичная интернализация покрытых антителами клеток с помощью фагоци

- 6 031069 тирующих клеток иммунной системы (например, макрофагов, нейтрофилов и дендритных клеток), которые связываются с эффекторным Fc-доменом (доменами) иммуноглобулина.

Термин комплементзависимая цитотоксичность, или CDC, относится к механизму индукции гибели клеток, при котором эффекторный Fc-домен (домены) связанного с мишенью антитела активирует серию ферментативных реакций, в результате чего образуются поры в мембране клетки-мишени. Обычно комплексы антиген-антитело, например комплексы на покрытых антителами клетках-мишенях, связываются с компонентом C1q комплемента и активируют его, что, в свою очередь, активирует каскад комплемента и вызывает гибель клетки-мишени. Активация комплемента может также приводить к отложению компонентов комплемента на поверхности клетки-мишени, что облегчают ADCC путем связывания рецепторов комплемента (например, CR3) на лейкоцитах.

Цитотоксический эффект относится к истощению, элиминации и/или уничтожению клеткимишени. Цитостатический эффект относится к ингибированию клеточной пролиферации. Термин цитотоксическое средство, используемый в настоящем изобретении, относится к средству, которое обладает цитотоксическим и/или цитостатическим действием на клетки. Цитотоксические средства можно конъюгировать с антителом или вводить в комбинации с антителом.

Термин фармацевтически приемлемый означает одобрение или возможность одобрения регулирующим органом федерального правительства или правительства штата или регистрацию в Фармакопее США или в другой общепризнанной фармакопее для применения у животных и более конкретно у людей. Термин фармацевтически совместимый ингредиент относится к фармацевтически приемлемому разбавителю, адъюванту, эксципиенту или носителю, с которым доставляется антитело против ανβό.

Термин фармацевтически приемлемая соль относится к фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим солям антитела против ανβό или его конъюгата или к средству, вводимому вместе с антителом против ανβό. Примеры солей включают такие соли, как сульфат, цитрат, ацетат, оксалат, хлорид, бромид, иодид, нитрат, бисульфат, фосфат, кислый фосфат, изоникотинат, лактат, салицилат, кислый цитрат, тартрат, олеат, таннат, пантотенат, битартрат, аскорбат, сукцинат, малеат, гентизинат, фумарат, глюконат, глюкуронат, сахарат, формиат, бензоат, глутамат, метансульфонат, этансульфонат, бензолсульфонат, р-толуолсульфонат и памоат (т.е. 1,1'-метилен-бис-(2-гидрокси-3 нафтоат)). Понятно, что термин фармацевтически приемлемая соль может включать другую молекулу, такую как ион ацетата, ион сукцината или другой противоион. Противоион может представлять собой любой органический или неорганический радикал, который стабилизирует заряд на исходном соединении. Кроме того, фармацевтически приемлемая соль в своей структуре может иметь более одного заряженного атома. В случаях, когда частью фармацевтически приемлемой соли являются несколько заряженных атомов, такая соль может иметь несколько противоионов. Следовательно, фармацевтически приемлемая соль может иметь один или несколько заряженных атомов и/или один или несколько противоионов.

Если из контекста не следует иное, понятие примерно/приблизительно включает значения в пределах стандартного отклонения указанного значения.

I. Молекулы-мишени.

Если не указано иное, то ανβό означает ανβό человека. Пример последовательности βό человека имеет номер доступа GenBank AAA36122. Пример последовательности av человека имеет номер доступа NCBI NP 002201.1

II. Антитела по настоящему изобретению.

А. Специфичность связывания и функциональные свойства.

Настоящее изобретение относится к антителам 15H3 мыши и химерным, гуманизированным и антителам 15H3 человека.

Аффинность антител по настоящему изобретению (например, химерных, гуманизированных и человеческих форм антител 15H3 мыши) против avβό человека предпочтительно эквивалентна аффинности антитела 15H3 мыши против avβό человека, превышает аффинность антитела 15H3 мыши против avβό человека в десять раз, или в пять раз, или в два раза слабее, чем аффинность антитела 15H3 мыши против avβό человека, например, предпочтительно не более чем в 10 раз слабее, более предпочтительно не более чем в 5 раз слабее и еще более предпочтительно не более чем в 2 раза слабее, чем аффинность антитела 15H3 мыши против avβό человека. Один из способов измерения аффинности антитела против его антигена-мишени состоит в определении кажущейся константы диссоциации. Настоящее изобретение включает антитела (например, химерные, гуманизированные и человеческие формы антитела 15H3 мыши), имеющие кажущуюся константу диссоциации, которая, по существу, аналогична этому показателю у 15H3 мыши (т.е. в пределах погрешности эксперимента), а также антитела, имеющие константу диссоциации ниже или выше, чем у антитела 15H3 мыши против avβό человека. В некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению (например, химерные, гуманизированные и человеческие формы антитела 15H3 мыши) имеют кажущуюся константу диссоциации в пределах диапазона от 0,1- до 10-кратного или предпочтительно в диапазоне от 0,1- до 5-кратного, от 0,1- до 2-кратного или даже от 0,5- до 2-кратного превышения кажущейся константы диссоциации антитела 15H3 мыши против avβό человека. В некоторых аспектах кажущаяся константа диссоциации (KD) антитела против avβό

- 7 031069 человека предпочтительно находится в пределах от 0,1 до 5 нМ, более предпочтительно в пределах от 0,1 до 5 нМ, наиболее предпочтительно в пределах от 0,1 до 2 нМ или от 0,5 до 1,5 нМ. Химерные, гуманизированные и антитела человека 15H3 специфично связываются с ανβό человека в нативной форме и/или рекомбинантно экспрессируются из клеток CHO, например, как антитело 15H3 мыши. Обычно химерные, гуманизированные и антитела против ανβό человека 15H3 конкурируют с 15H3 мыши за связывание с ανβό человека.

Предпочтительные антитела ингибируют злокачественное новообразование (например, рост клеток, метастазирование и/или летальность организмов) при их самостоятельном введении (т.е. в виде голых антител) или в виде конъюгата с цитотоксическим средством, что показано на злокачественных клетках, растущих в культуре, на животной модели или в клинических испытаниях. Животные модели могут быть созданы путем имплантации ανβό-экспрессирующих опухолевых клеточных линий человека в соответствующие расы иммунодефицитных грызунов, например бестимусных голых мышей или мышей SCID. Эти линии опухолевых клеток можно вводить иммунодефицитным грызунам-хозяевам как в виде солидной опухоли путем подкожной инъекции, так и в виде диссеминированных опухолей путем внутривенной инъекции. Эти модели опухоли после имплантации в хозяина можно использовать для оценки терапевтической эффективности антител против ανβό или их конъюгированных форм, как описано в разделе Примеры.

В. Антитела.

Гуманизированное антитело представляет собой созданное генно-инженерными способами антитело, в котором участки CDR нечеловеческого донорского антитела пересажены в последовательности акцепторного антитела человека (см., например, Queen, US 5530101 и 5585089; Winter, US 5225539; Carter, US 6407213; Adair, US 5859205 и Foote US 6881557). Последовательности акцепторного антитела могут, например, представлять собой последовательность антитела человека, композицию таких последовательностей, консенсусную последовательность последовательностей антитела человека или последовательность зародышевой области. Предпочтительной акцепторной последовательностью тяжелой цепи является зародышевый V_H экзон V_H1-46 и экзон V_H-4 экзона J (J_H). Предпочтительной акцепторной последовательностью легкой цепи является экзон VK2-30 (также известный в литературе как KV2-30) и JK-2 для экзона J. Альтернативные предпочтительные акцепторные последовательности тяжелой цепи включают экзоны V_H зародышевой линии V_H1-8 или V_H1-3 с J экзонами (J_H), J_H-1j J_H-2, J_H-3, J_H-4 или J_H-5. Альтернативные предпочтительные акцепторные последовательности легкой цепи включают VK2-29 экзон (также известный в литературе как KV2-30) с J экзонами J_K-1, J_K-2, J_K-3, J_K-4 или J_K-5. Таким образом, гуманизированное антитело представляет собой антитело, имеющее некоторые участки или все участки CDR, полностью или, по существу, происходящие из нечеловеческого донорского антитела, и последовательности каркасной вариабельной области и константные области при их наличии, полностью или, по существу, происходящие из последовательностей антитела человека. Аналогично, гуманизированная тяжелая цепь имеет по меньшей мере один, два и обычно все три участка CDR, полностью или, по существу, происходящие из тяжелой цепи донорского антитела, и последовательности каркасной вариабельной области тяжелой цепи и константные области тяжелой цепи при их наличии, полностью или, по существу, происходящие из человеческих последовательностей каркасной вариабельной области тяжелой цепи и константной области. Аналогично, гуманизированная легкая цепь имеет по меньшей мере один, два и обычно все три участка CDR, полностью или, по существу, происходящие из донорской легкой цепи антитела, и последовательность каркасной вариабельной области легкой цепи и константную область легкой цепи, если они присутствуют, по существу, происходящие из человеческой каркасной вариабельной области легкой цепи и последовательности константной области. В некоторых аспектах гуманизированное антитело содержит гуманизированную тяжелую цепь и гуманизированную легкую цепь. Участок CDR в гуманизированном антитела или антителе человека, по существу, происходит из соответствующего CDR или, по существу, идентичен соответствующему CDR в нечеловеческом антителе, если по меньшей мере ό0, 85, 90, 95 или 100% соответствующих остатков (согласно определению по Kabat) между соответствующими CDR являются идентичными. В некоторых вариантах осуществления CDR в гуманизированном антителе или в антителе человека, по существу, происходит из соответствующего CDR или, по существу, идентичен соответствующему CDR в нечеловеческом антителе, если в каждом CDR имеется не более 3 консервативных аминокислотных замен. Последовательности каркасной вариабельной области из цепи антитела или константной области из цепи антитела, по существу, происходят из последовательности каркасной вариабельной области человека или константной области человека соответственно, если по меньшей мере 70, 80, 85, 90, 95 или 100% от соответствующих остатков согласно определению по Kabat являются идентичными. В некоторых гуманизированных антителах по настоящему изобретению имеется по меньшей мере одна обратная мутация 15H3 мыши в вариабельной каркасной области тяжелой цепи антитела.

Гуманизированные антитела часто включают все шесть участков CDR (предпочтительно согласно определению по Kabat) антитела мыши, но вместе с тем, они также могут иметь меньшее количество CDR (например, по меньшей мере с 3, 4 или 5 CDR) антитела мыши (например, см. Pascalis et al., J. Im

- 8 031069 munol. 169:3076, 2002; Vajdos et al., Journal of Molecular Biology, 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36: 1079-1091, 1999; Tamura et al., Journal of Immunology, 164: 1432-1441, 2000).

Для замены можно выбирать конкретные аминокислоты из остатков вариабельной каркасной области человека исходя из их возможного влияния на конформацию CDR и/или на связывание с антигеном. Изучение такого возможного влияния представляет собой моделирование, исследование характеристик аминокислот в конкретных положениях или эмпирическое наблюдение эффектов замены или мутагенеза конкретных аминокислот.

Например, если между остатком вариабельной каркасной области мыши и выбранным остатком вариабельной каркасной области человека имеется отличие по аминокислоте, аминокислоту из каркасной области человека можно заменить на аминокислоту из эквивалентной каркасной области антитела мыши, если с достаточной вероятностью можно предполагать, что эта аминокислота:

(1) нековалентно связывается непосредственно с антигеном, (2) примыкает к участку CDR, (3) другим образом взаимодействует с участком CDR (например, находится в пределах приблизительно 6 А от участка CDR) или (4) опосредует взаимодействие между тяжелой и легкой цепями.

Несмотря на то что антитело 15H3 идентифицировано как антитело мыши, настоящая заявка включает также антитело 15H3 человека. Термин антитело 15H3 человека означает антитело, которое получено из последовательностей гена иммуноглобулина человека и которое имеет участки CDR, по существу, идентичные участкам CDR антитела 15H3 мыши, и проявляет аналогичные свойства, т.е. специфичность связывания с ανβ6. В некоторых аспектах антитело 15H3 человека содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая, по существу, идентична вариабельной области тяжелой цепи по изобретению, и/или вариабельную область легкой цепи, которая, по существу, идентична вариабельной области легкой цепи по изобретению. В некоторых вариантах осуществления антитело 15H3 по настоящему изобретению не является антителом человека, например антитело 15H3 по настоящему изобретению представляет собой мышиное, химерное или гуманизированное антитело.

Настоящее изобретение относится к антителам 15H3, в которых выявлена по меньшей мере 90% идентичность вариабельной области тяжелой цепи по отношению к HA (SEQ ID NO:9) и по меньшей мере 90% идентичность вариабельной области легкой цепи по отношению к LA (SEQ ID NO: 10). В некоторых аспектах антитело представляет собой гуманизированное антитело и имеет по меньшей мере одну обратную мутацию 15H3 мыши в вариабельной каркасной области тяжелой цепи. Дополнительно изобретение относится к антителам 15H3, у которых идентичность последовательности вариабельной области гуманизированной тяжелой цепи составляет по меньшей мере 90, 95 или 99% по отношению к SEQ ID N0:11-23, и идентичность последовательности вариабельной области гуманизированной легкой цепи составляет по меньшей мере 90, 95 или 99% по отношению к SEQ ID N0:10 и 24-29 и к любым их комбинациям. Изобретение относится к антителам, у которых выявлена идентичность последовательности вариабельной области тяжелой цепи, составляющая по меньшей мере 90, 95, или 99, или 100% по отношению к SEQ ID N0:11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23, и идентичность последовательности гуманизированной вариабельной области легкой цепи, составляющая по меньшей мере 90, 95, или 99, или 100% по отношению к SEQ ID N0:10. В другом варианте осуществления изобретение относится к антителам, у которых идентичность последовательности вариабельной области тяжелой цепи составляет по меньшей мере 90, 95, или 99, или 100% по отношению к SEQ ID N0:11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,

20, 21, 22 или 23, и идентичность последовательности вариабельной области легкой цепи составляет по меньшей мере 90, 95, или 99,или 100% по отношению к SEQ ID N0:24. В другом варианте осуществления изобретение относится к антителам, у которых идентичность последовательности вариабельной области тяжелой цепи составляет по меньшей мере 90, 95, или 99, или 100% по отношению к SEQ ID N0:11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23, и идентичность последовательности вариабельной области легкой цепи составляет по меньшей мере 90, 95, или 99, или 100% по отношению к SEQ ID N0:25. В другом варианте осуществления изобретение относится к антителам, у которых идентичность последовательности вариабельной области тяжелой цепи составляет по меньшей мере 90, 95, или 99, или 100% по отношению к SEQ ID N0:11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23, и идентичность последовательности вариабельной области легкой цепи составляет по меньшей мере 90, 95, или 99, или 100% по отношению к SEQ ID N0:26. В другом варианте осуществления изобретение относится к антителам, у которых идентичность последовательности вариабельной области тяжелой цепи составляет по меньшей мере 90, 95, или 99, или 100% по отношению к SEQ ID N0:11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,

21, 22 или 23, и идентичность последовательности вариабельной области легкой цепи составляет по меньшей мере 90, 95, или 99, или 100% по отношению к SEQ ID N0:27. В другом варианте осуществления изобретение относится к антителам, у которых идентичность последовательности вариабельной области тяжелой цепи составляет по меньшей мере 90, 95, или 99, или 100% по отношению к SEQ ID N0:11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23, и идентичность последовательности вариабельной области легкой цепи составляет по меньшей мере 90, 95, или 99, или 100% по отношению к SEQ ID N0:28. В другом варианте осуществления изобретение относится к антителам, у которых идентичность

- 9 031069 последовательности вариабельной области тяжелой цепи составляет по меньшей мере 90, 95, или 99, или 100% по отношению к SEQ ID NO:11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23, и идентичность последовательности вариабельной области легкой цепи составляет по меньшей мере 90, 95, или 99, или 100% по отношению к SEQ ID NO:29. В некоторых аспектах эти антитела представляют собой гуманизированные антитела, и в соответствующих антителах сохраняются некоторые или все обратные мутации. Другими словами, в таких антителах предпочтительно, что по меньшей мере одно из положений H28, H30, H72, H73, H75, H78 или Н93 занимают аминокислоты из соответствующего положения антитела 15H3 мыши. Необязательно в любом таком антителе по меньшей мере одно из положений H28 и H30 занимает S. Необязательно в любом таком антителе положения Н28 и H30 занимают S. Необязательно в любом таком антителе положения Н28 и H30 занимают S, положение Н72 занимает D или Q, положение H73 занимает T или K, положение H75 занимает T или S; положение H78 занимает V или A, и положение 93 занимает A или V. Предпочтительно в любом из описанных антител, например в гуманизированных антителах 15H3, у которых идентичность последовательности вариабельной области тяжелой цепи составляет по меньшей мере 90, 95 или 99% по отношению к SEQ ID NO:11-23, и идентичность последовательности вариабельной области легкой цепи составляет по меньшей мере 90, 95 или 99% по отношению к SEQ ID NO:10 и 24-29, участки CDR могут быть одинаковыми или, по существу, идентичными по отношению к участкам CDR донорского антитела мыши, т.е. антитела 15H3 мыши (SEQ ID NO:3-8). Участки CDR соответствуют определению по Kabat. Антитела по настоящему изобретению включают антитела HBLA, HBLB, HBLC, HBLD, HBLE, HBLF, HBLG, HLLA, HLLB, HLLC, HLLD, HLLE, HLLF, HLLG, HMLA, HMLB, HMLC, HMLD, HMLE, HMLF, HMLG, HNLA, HNLB, HNLC, HNLD, HNLE, HNLF, HNLG, HRLA, HRLB, HRLC, HRLD, HRLE, HRLF, HRLG, HSLA, HSLB, HSLC, HSLD, HSLE, HSLF, HSLG, HTLA, HTLB, HTLC, HTLD, HTLE, HTLF, HTLG, HULA, HULB, HULC, HULD, HULE, HULF и HULG.

Другой возможный вариант осуществления заключается в замене определенных остатков в участках CDR на соответствующие остатки из последовательностей CDR человека, обычно из участков CDR акцепторных последовательностей человека, используемых при конструировании приведенных в качестве примеров гуманизированных антител. Чтобы сохранить связывание в гуманизированном антителе, от некоторых антител требуется только некоторые из участков CDR, а именно подмножество CDRостатков, необходимых для связывания, которые называются SDR. Остатки CDR, не контактирующие с антигеном и расположенные не в SDR, можно идентифицировать по предшествующим исследованиям (например, часто не нужны остатки H60-H65 из CDR H2) по участкам CDR по Kabat, лежащим вне гипервариабельных петель по Chothia (Chothia, J. Mol. Biol. 196:901, 1987), по молекулярному моделированию и/или эмпирически или как описано в публикации Gonzales et al., Mol. Immunol. 41: 863 (2004). В таких гуманизированных антителах в положениях, в которых отсутствует один или несколько донорских CDR остатков или в которых полностью отсутствует донорский участок CDR, аминокислота, занимающая это положение, может представлять собой аминокислоту, занимающую соответствующее положение (система нумерации по Kabat) в последовательности акцепторного антитела, или консервативную замену. Число таких замен в акцепторе для донорских аминокислот, предназначенных для включения в участки CDR, отражает баланс некоторых конкурирующих факторов. Такие замены имеют потенциальное преимущество в плане уменьшения количества аминокислот мыши в гуманизированном антителе и, следовательно, уменьшают потенциальную иммуногенность.

В предпочтительных вариантах осуществления изобретения CDR-участки гуманизированных антител и антител 15H3 человека являются идентичными или, по существу, идентичными участкам CDR антитела 15H3 мыши (SEQ ID NO:3-8). В любом из описанных в изобретении антител участки CDR могут представлять собой участки антитела 15H3 мыши (т.е. SEQ ID NO:3-8) с 0, 1, 2 или 3 консервативными аминокислотными заменами. В любом из описанных в изобретении антител участки CDR могут представлять собой участки антитела 15H3 мыши (т.е. SEQ ID NO:3-8) с 0, 1, 2 или 3 консервативными аминокислотными заменами в каждом CDR. В любом из описанных в изобретении антител участки CDR могут представлять собой участки антитела 15H3 мыши (т.е. SEQ ID NO:3-8) с 0, 1, 2 или 3 консервативными аминокислотными заменами в CDR1 и CDR2 тяжелой цепи и необязательно в CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи. Путем молекулярного моделирования и эмпирической дедукции было установлено, что в любом из описанных в изобретении антител может находиться консервативная аминокислотная замена, например, в положении 24, 25, 32, 33 и/или 34 в CDR1 легкой цепи, в положении 53-56 в CDR2 легкой цепи, в положении 31 и/или 32 в CDR1 тяжелой цепи и/или в положении 61-65 CDR2 тяжелой цепи. Дополнительно в любом из описанных в изобретении антител следующие три положения могут быть заменены соответствующей аминокислотой человека: лизин в положении 64 в CDR2 тяжелой цепи можно заменить на глутамин, лизин в положении 24 в CDR1 легкой цепи можно заменить на аргинин, и лейцин в положении 54 в CDR2 легкой цепи можно заменить на аргинин.

С. Выбор константной области.

Описанные в изобретении вариабельные области тяжелой и легкой цепей антител могут быть связаны по меньшей мере с частью константной области человека. Выбор константной области зависит частично от того, являются ли желательными антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность,

- 10 031069 антителозависимый клеточный фагоцитоз и/или комплементзависимая цитотоксичность. Например, изотипы IgG1 и IgG3 человека обладают мощной комплементзависимой цитотоксичностью, изотип IgG2 человека имеет слабую комплементзависимую цитотоксичность и IgG4 человека не имеет комплементзависимой цитотоксичности. IgG1 и IgG3 человека также индуцируют более мощные клеточные эффекторные функции, чем IgG2 и IgG4 человека. Константными областями легкой цепи могут быть лямбда или каппа. Антитела могут экспрессироваться в виде тетрамеров, содержащих две легкие и две тяжелые цепи, в виде отдельных тяжелых цепей, легких цепей, таких как Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv, или в виде одноцепочечных антител, в которых вариабельные домены тяжелой и легкой цепи соединены через спейсер.

Между разными людьми выявлены аллотипические вариации и изоаллотипические различия в константных областях человека, то есть у разных людей константные области могут отличаться в одном или нескольких полиморфных положениях. Изоаллотипы отличаются от аллотипов в этих сыворотках, распознающих изоаллотип, который связывается с неполиморфной областью одного или нескольких других изотипов.

В части молекулы или во всей молекуле одна или несколько аминокислот на амино- или карбоксиконце легкой и/или тяжелой цепи, например С-концевой лизин тяжелой цепи, может отсутствовать или дериватизироваться. В константных областях можно делать замены для уменьшения или увеличения эффекторной функции, такой как комплементопосредованная цитотоксичность или ADCC (см., например, Winter et al., патент США № 5624821; Tso et al., патент США №. 5834597 и Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006), или для пролонгирования периода полувыведения из организма человека (см., например, Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004).

Примеры замен включают аминокислотную замену нативной аминокислоты на цистеиновый остаток в аминокислотных положениях 234, 235, 237, 239, 267, 298, 299, 326, 330 или 332 предпочтительно на мутант S239C (замены константных областей приведены в соответствии с индексами EU) в изотипе IgG1 человека (US 20100158909). Наличие дополнительного остатка цистеина позволяет образовывать межцепочечные дисульфидные связи. Такое образование межцепочечной дисульфидной связи может вызывать стерические препятствия, тем самым уменьшая аффинность связывающего взаимодействия Fc-области FcyR. Цистеиновый остаток (остатки), введенный в Fc-область или в непосредственной близости от Fcобласти константной области IgG, также может служить в качестве сайта для конъюгации с терапевтическими средствами (например, для присоединения цитотоксических лекарственных средств с помощью тиольных специфичных реагентов, таких как малеимидные производные лекарственных препаратов). Присутствие терапевтического средства вызывает пространственное затруднение, тем самым дополнительно уменьшая аффинность связывающего взаимодействия Fc-области - FcyR. Другие замены в любом из положений 234, 235, 236 и/или 237 уменьшают аффинность к Fcy рецепторам, в частности к рецептору FcyRI (см., например, патенты США 6624821, 5624821).

Период полувыведения антитела in vivo также может влиять на его эффекторные функции. Период полувыведения антитела можно увеличивать или уменьшать для модификации его терапевтических действий. FcRn представляет собой рецептор, структурно сходный с антигеном MHC класса I, который нековалентно связывается с 32-микроглобулином. FcRn регулирует катаболизм иммуноглобулинов и их трансцитоз через ткани (Ghetie and Ward, 2000, Annu. Rev. Immunol. 18:739-766; Ghetie and Ward, 2002, Immunol. Res. 25:97-113). Взаимодействие IgG-FcRn происходит при pH 6,0 (уровень pH внутриклеточных везикул), но не при pH 7,4 (уровень pH крови), это взаимодействие позволяет возвращать IgG обратно в циркуляторное русло (Ghetie and Ward, 2000, Ann. Rev. Immunol. 18:739-766; Ghetie and Ward, 2002, Immunol. Res. 25:97-113). Проведено картирование участка IgG1 человека, вовлеченного в FcRnсвязывание (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604). Замены в положениях Pro238, Thr256, Thr307, Gln311, Asp312, Glu380, Glu382 или Asn434 в IgG1 человека на аланин увеличивают связывание FcRn (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604). Молекулы IgG1, несущие эти замены, имеют более длительный период полувыведения из сыворотки. Следовательно, эти модифицированные молекулы IgG1 могут выполнять свои эффекторные функции, и, следовательно, проявляют свои терапевтические эффекты в течение более длительного периода времени по сравнению с немодифицированным IgG1. Другие примеры замен для повышения связывания с FcRn включают Gln в положении 250 и/или Leu в положении 428. Нумерация EU используется для всех положений константной области.

Олигосахариды, ковалентно присоединенные к консервативному Asn297, вовлечены в способность Fc-области IgG связываться с FcyR (Lund et al., 1996, J. Immunol. 157:4963-69; Wright and Morrison, 1997, Trends Biotechnol. 15:26-31). Генная инженерия этой гликоформы на IgG может значительно улучшать IgG-опосредованную ADCC. Добавление рассекающих модификаций N-ацетилглюкозамина (Umana et al., 1999, Nat. Biotechnol. 17: 176-180; Davies et al., 2001, Biotech. Bioeng. 74:288-94) к этой гликоформе или удаление фукозы (Shields et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:26733-40; Shinkawa et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:6591-604; Niwa et al., 2004, Cancer Res. 64:2127-33) из этой гликоформы представляют собой два примера констриирования IgG Fc, которое улучшает связывание между IgG Fc и FcyR, тем самым повышая активность Ig-опосредованной ADCC.

С помощью системной замены гидрофильных аминокислот Fc-области IgG1 человека были созданы

- 11 031069 варианты IgG с измененной аффинностью связывания с FcyR (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591604). По сравнению с исходным IgG1 подмножество этих вариантов, включающее замены Thr256/Ser298, Ser298/Glu333, Ser298/Lys334 или Ser298/Glu333/Lys334 на Ala, показало повышение аффинности связывания к FcyR и повышение активности ADCC (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604; Okazaki et al., 2004, J. Mol. Biol. 336: 1239-49).

Активность антител по фиксации комплемента (и связывание с C1q и CDC активность) может быть улучшена путем замен в положениях Lys326 и Glu333 (Idusogie et al., 2001, J. Immunol. 166: 2571-2575). Такие же замены в каркасе IgG2 человека могут преобразовать изотип антитела, который плохо связывается с C1q и имеет тяжелый дефицит действия активации комплемента, в изотип антитела, который может и связываться с C1q и опосредовать CDC (Idusogie et al., 2001, J. Immunol. 166: 2571-75). Также применялись некоторые другие способы улучшения активности антител по фиксации комплемента. Например, пересадка 18-аминокислотного хвостового участка карбоксильного конца IgM к карбоксильным концам IgG значительно повышает их активность CDC. Этот феномен наблюдается даже с IgG4, который обычно не имеет какой-либо обнаруживаемой CDC-активности (Smith et al., 1995, J. Immunol. 154:222636). Кроме того, замена Ser444, расположенного близко к карбоксильному концу тяжелой цепи IgG1, на Cys индуцирует димеризацию IgG1 хвост-в-хвост с 200-кратным увеличением CDC активности по сравнению с мономерным IgG1 (Shopes et al., 1992, J. Immunol. 148:2918-22). Дополнительно конструкции биспецифичных диател со специфичностью к C1q также приобретают CDC активность (Kontermann et al., 1997, Nat. Biotech. 15:629-31).

Активность комплемента может быть снижена путем мутации по меньшей мере одного из аминокислотных остатков 318, 320 и 322 тяжелой цепи в остаток, имеющий другую боковую цепь, например Ala. Другие алкилзамещенные неионные остатки, такие как Gly, Ile, Leu или Val, или такие ароматические неполярные остатки, как Phe, Tyr, Trp и Pro, на месте любого одного из этих трех остатков также уменьшают или устраняют связывающую активность C1q. Для уменьшения или устранения связывающей активности C1q в остатках 320 и 322 можно использовать Ser, Thr, Cys и Met, но не в остатке 318. Замена остатка 318 (Glu) полярным остатком может модифицировать, но не устранять связывающую активность C1q. Замена остатка 297 (Asn) на Ala приводит к устранению литической активности, но лишь незначительно уменьшает (делает примерно в три раза слабее) аффинность к C1q. Эта альтерация разрушает сайт гликозилирования и присутствие углеводов, которые необходимы для активации комплемента. Любое другое замещение на этом участке также разрушает сайт гликозилирования. Нижеуказанные мутации и любые их комбинации также могут уменьшать связывание C1q: D270A, K322A, P329A и P311S (см. WO 06/036291).

Ссылка на константную область человека включает константную область с любым природным аллотипом или любой перестановкой остатков, занимающих полиморфные положения в природных аллотипах. Также может присутствовать до 1, 2, 5 или 10 мутаций относительно природной константной области человека, например, описанных выше мутаций, для уменьшения Fc-гамма рецепторного связывания или увеличения связывания с FcRn.

D. Экспрессия антител.

Химерные или гуманизированные антитела обычно получают путем рекомбинантной экспрессии. Рекомбинантные полинуклеотидные конструкции обычно включают последовательности контроля экспрессии, функционально связанные с кодирующими последовательностями цепей антител, включающих природно-ассоциированные или гетерологичные промоторные области. Последовательности контроля экспрессии предпочтительно представляют собой эукариотические промоторные системы в векторах, способных к трансформации или трансфекции эукариотических клеток-хозяев. После включения вектора в соответствующего хозяина содержание хозяина проводят в условиях, подходящих для высокого уровня экспрессии нуклеотидных последовательностей, а также для сбора и очистки перекрестно-реагирующих антител.

Клетки млекопитающих являются предпочтительными хозяевами для экспрессии нуклеотидных сегментов, кодирующих иммуноглобулины или их фрагменты (см. Winnacker, From Genes to Clones, Нью-Йорк, 1987). В данной области был разработан ряд подходящих линий клеток-хозяев, способных секретировать интактные гетерологичные белки, и эти хозяева включают клеточные линии CHO (например, DG44), различные клеточные линии COS, клетки HeLa, клетки HEK293, L-клетки и непродуцирующие антитела миеломы, включающие SP2/0 и NS0. Предпочтительно клетки не являются клетками человека. Векторы экспрессии для этих клеток могут включать последовательности контроля экспрессии, такие как сайт инициации репликации, промотор, энхансер (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), и необходимые сайты обработки информации, такие как сайты связывания рибосом, сайты сплайсинга РНК, сайты полиаденилирования и последовательности терминации транскрипции. Предпочтительные последовательности контроля экспрессии представляют собой промоторы, полученные из эндогенных генов, цитомегаловируса, SV40, аденовируса, вируса бычьей папилломы и тому подобное (см. Co et al., J. Immunol. 148: 1149 (1992)).

Антитела человека против αγβ6 можно получать с помощью описанных ниже различных способов.

- 12 031069

Способы получения антител человека включают триомный способ по Oestberg et al., Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, патент США № 4634664 и Engleman et al., патент США № 4634666; использование трансгенных мышей, включающих гены иммуноглобулина человека (см., например, Lonberg et al., WO 93/12227 (1993); US 5877397, US 5874299, US 5814318, US 5789650, US 5770429, US 5661016, US 5633425, US 5625126, US 5569825, US 5545806, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (1991), и способы фагового дисплея (см., например, Dower et al., WO 91/17271 и McCafferty et al., WO 92/01047, US 5877218, US 5871907, US 5858657, US 5837242, US 5733743 и US 5565332.

После экспрессии антитела могут быть очищены в соответствии со стандартными процедурами в данной области техники, в том числе очисткой с помощью ВЭЖХ, колоночной хроматографии, гельэлектрофореза и т.п. (см. общую информацию Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)).

III. Нуклеиновые кислоты.

Настоящее изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим какую-либо из тяжелых и легких цепей, описанных выше. Обычно нуклеиновые кислоты также кодируют сигнальный пептид, слитый с тяжелой и легкой цепями. Кодирующие последовательности нуклеиновых кислот могут быть функционально связаны с регуляторными последовательностями, чтобы обеспечить экспрессию кодирующих последовательностей, таких как промотор, энхансер, сайт связывания рибосомы, сигнал терминации транскрипции и тому подобное. Нуклеиновые кислоты, кодирующие тяжелую и легкую цепи, могут быть в выделенной форме или могут быть клонированы в один или несколько векторов. Нуклеиновые кислоты могут быть синтезированы, например, путем твердотельного синтеза или ПЦР перекрывающихся олигонуклеотидов. Нуклеиновые кислоты, кодирующие тяжелую и легкую цепи, могут быть соединены в виде одной непрерывной нуклеиновой кислоты, например в векторе экспрессии, или может находиться по отдельности, например, каждая нуклеиновая кислота клонирована в собственный вектор экспрессии. Примеры нуклеиновых кислот показаны в SEQ ID NO:37 (тяжелая цепь мыши), SEQ ID NO:38 (легкая цепь мыши), SEQ ID NO:39 (HA), SEQ ID NO:40 (HB), SEQ ID NO:41 (HL), SEQ ID NO:42 (HT), SEQ ID NO:43 (HN), SEQ ID NO:44 (HU), SEQ ID NO:45 (LA), SEQ ID NO:46 (LC), SEQ ID NO:47 (LF), SEQ ID NO:48 (LG), SEQ ID NO:49 (сигнальный пептид тяжелой цепи мыши), SEQ ID NO:50 (сигнальный пептид тяжелой цепи человека), SEQ ID NO: 51 (сигнальный пептид легкой цепи мыши) и SEQ ID NO:52 (сигнальный пептид легкой цепи человека). Нуклеиновые кислоты можно делать в выделенной форме. Молекула выделенной нуклеиновой кислоты является молекула, которая была выделена и идентифицирована и/или извлечена из компонентов ее природного окружения, или молекула искусственого происхождения.

IV. Конъюгаты антитело-лекарственное средство.

Антитела против ανβ6 могут быть конъюгированы с цитотоксическими функциональными группами (включающими фармацевтически совместимые соли), с образованием конъюгата антителолекарственное средство (ADC). Особенно подходящие функциональные группы для конъюгации с антителами представляют собой цитотоксические средства (например, химиотерапевтические средства), ферменты превращения пролекарств, радиоактивные изотопы, или соединения, или токсины (эти функциональные группы в совокупности называются терапевтическими средствами). Например, антитело против ανβ6 может быть конъюгировано с цитотоксическим средством, таким как химиотерапевтическое средство или токсин (например, цитостатическое или цитоцидное средство, такое как, например, абрин, рицин A, экзотоксин Pseudomonas или дифтерийный токсин). Примеры полезных классов цитотоксических средств включают, например, средства, связывающиеся с ДНК со стороны малой бороздки, средства алкилирования ДНК и ингибиторы тубулина. Примеры цитотоксических средств включают, например, ауристатины, камптотецины, дуокармицины, этопозиды, майтанзиноиды (например, DM1, DM2, DM3, DM4), таксаны, бензодиазепины, включающие бензодиазепинсодержащие соединения (например, пирроло[1,4]бензодиазепины, индолинобензодиазепины и оксазолидинобензодиазепины) и алкалоиды барвинка. Способы конъюгирования терапевтических средств с белками, и в частности, с антителами, хорошо известны (см., например, Alley et al., Current Opinion in Chemical Biology 2010 14:1-9; Senter, Cancer J., 2008, 14 (3): 154-169).

Терапевтическое средство (например, цитотоксическое средство) может быть конъюгировано таким образом, что его активность снижается, если оно не отщепляется от антитела (например, путем гидролиза, в результате деградации антител или с помощью расщепляющего средства). Такое терапевтическое средство может быть присоединено к антителу с расщепляемым линкером, который чувствителен к расщеплению во внутриклеточной среде αvβ6-экспрессирующей злокачественной клетке, но, по существу, не чувствителен к внеклеточной среде, таким образом, что конъюгат отщепляется от антитела, когда оно интернализовано злокачественной клеткой, экспрессирующей ανβ6 (например, в эндосомальной среде или, например, в силу чувствительности к уровню рН или чувствительности к протеазам, в лизосомальной среде или в кавеолярной среде). Такое терапевтическое средство также может быть присоединено к антителу с помощью нерасщепляемого линкера.

Обычно ADC содержит линкерный участок между терапевтическим средством и антителом против

- 13 031069 ανβό. Как отмечено выше, линкер может быть расщепляемым при внутриклеточных условиях, таким образом, что расщепление линкера высвобождает лекарственное средство из антитела во внутриклеточную среду (например, в лизосомы, или эндосомы, или кавеолы). Линкер может представлять собой, например, пептидильный линкер, который расщепляется внутриклеточными ферментами пептидазой или протеазой, включающими лизосомальную или эндосомальную протеазы. В некоторых аспектах пептидильный линкер имеет длину по меньшей мере две аминокислоты или длину по меньшей мере три аминокислоты. Расщепляющие средства могут включать катепсины B и D и плазмин (см., например, Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). Наиболее типичными являются пептидильные линкеры, которые расщепляются с помощью ферментов, присутствующих в (/л'[’>6-экспрессирующих клетках. Например, можно использовать пептидильный линкер, который расщепляется с помощью тиолзависимой протеазы катепсина-B, обладающей высоким уровнем экспрессии в злокачественной ткани (например, линкер, содержащий пептид Phe-Leu или Val-Cit). Линкер также может представлять собой нерасщепляющийся линкер, например, малеимидоалкиленовый или малеимидарильный линкер, который непосредственно присоединен к терапевтическому средству (например, к лекарственному средству) и высвобождается при разрушении антитела.

Обычно линкер, по существу, не чувствителен к внеклеточной среде, и это означает, что расщепляется не более чем примерно 20%, обычно не более чем примерно 15%, более типично не более чем примерно 10% и еще более типично не более чем около 5%, не более чем примерно 3% или не более чем примерно 1% линкеров в образце ADC, если во внеклеточной среде (например, в плазме) присутствует ADC. Является ли линкер, по существу, не чувствительным к внеклеточной среде, можно определить, например, путем независимой инкубации с плазмой и (a) ADC (образец ADC) и (b) эквивалентное молярное количество неконъюгированного антитела или терапевтического средства (контрольный образец) в течение заданного периода времени (например, 2, 4, 8, 16 или 24 ч), и затем сравнить количество неконъюгированного антитела или терапевтического средства, присутствующего в образце ADC, с количеством, присутствующем в контрольном образце, и измерить это количество, например, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Линкер может также способствовать клеточной интернализации. Линкер может способствовать клеточной интернализации при конъюгировании с терапевтическим средством (т.е. в окружении линкер группа терапевтического средства из ADC, как описано в изобретении). Альтернативно, линкер может способствовать клеточной интернализации при конъюгировании и с терапевтическим средством и с антителом против (zv[^J>6 (т.е. в окружении ADC, как описано в изобретении).

Примеры конъюгатов антитело-лекарственное средство включают конъюгаты антителолекарственное средство на основе ауристатина, что означает, что лекарственный компонент представляет собой лекарственное средство ауристатина. Ауристатины связывают тубулин, показывают действие нарушения динамики микротрубочек и ядерного и клеточного деления и обладают противораковой активностью. Обычно конъюгат антитело-лекарственное средство на основе ауристатина содержит линкер между ауристатиновым препаратом и антителом против avP6. Линкер может представлять собой, например, расщепляемый линкер (например, пептидильный линкер) или нерасщепляемый линкер (например, линкер, высвобождаемый при разрушении антитела). Ауристатин может представлять собой ауристатин E или его производное. Ауристатин может быть, например, сложным эфиром, образованным с ауристатином E и кетокислотой. Например, ауристатин E может взаимодействовать с параацетилбензойной кислотой или бензоилвалириановой кислотой с получением AEB и AEVB соответственно. Другие ауристатины включают MMAF и MMAE. Синтез и структура ауристатинов в качестве примера описаны в опубликованных патентах US № 7659241, 7498298, 2009-0111756, 2009-0018086 и 7968687, каждый из которых включен в описание в качестве ссылки в полном объеме.

Примеры конъюгатов антитело-лекарственное средство на основе ауристатина включают конъюгаты антитело-лекарственное средство vcMMAE, vcMMAF и mcMMAF, как показано ниже, где Ab обозначает антитело, описанное в настоящем изобретении, и val-cit обозначает дипептид валин-цитруллин.

- 14 031069

или его фармацевтически приемлемую соль.

Лекарственная нагрузка обозначена буквой р как число молекул лекарственное средство-линкер на антитело. В зависимости от контекста р может представлять собой среднее число молекул лекарственное средство-линкер на антитело, что также называют средней лекарственной нагрузкой, р находится в диапазоне от 1 до 20 и предпочтительно от 1 до 8. В некоторых предпочтительных вариантах, когда р означает среднюю лекарственную нагрузку, р находится в диапазоне приблизительно от 2 приблизительно до 5. В некоторых вариантах р равно примерно 2, примерно 3, примерно 4 или примерно 5. Среднее количество лекарственного средства на антитело в препарате можно определить с помощью обычных способов, таких как масс-спектроскопия, хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC), анализов ELISA и ВЭЖХ. В некоторых аспектах антитело против (,xvf)6 присоединено к лекарству-линкеру посредством цистеинового остатка антитела. В некоторых аспектах цистеиновым остатком является сконструированный в антителе остаток. В других аспектах цистеиновый остаток представляет собой межцепочечный дисульфидный цистеиновый остаток.

V. Другие антитела против а\Д6.

В некоторых способах по изобретению, в частности в способах лечения рака мочевого пузыря, можно использовать наряду с антителом 15H3 мыши также и химерные, гуманизированные или человеческие формы антитела 15H3 и другие антитела, связывающиеся с внеклеточным доменом av36. Предпочтительно в таких вариантах осуществления антитело конъюгировано с цитотоксическим средством. Описана коллекция антител против av36 (см., например, публикации US № 20100330103 и 20110294982, и патенты US № 7465449; 7943742 и 6692741, каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме).

Другие антитела против avf)6 можно делать de novo путем иммунизации с avf)6 или с одним или несколькими его внеклеточными доменами. Получение других нечеловеческих моноклональных антител против иммуногена, например, от мышей, морских свинок, приматов, кроликов или крыс, можно выполнять, как описано в руководстве Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP Нью-Йорк, 1988), включенном в качестве ссылки. Такой иммуноген может быть получен из природного источника путем пептидного синтеза или путем рекомбинантной экспрессии.

Можно делать гуманизированные, химерные или венированные формы нечеловеческих антител. Общая методика получения гуманизированных антител описана авторами Queen, US 5530101 и 5585089; Winter, US 5225539; Carter, US 6407213; Adair, US 5859205 и Foote, US 6881557). Химерное антитело представляет собой антитело, в котором вариабельные области легкой и тяжелой цепей нечеловеческого антитела (например, мыши) комбинированы с константными областями легкой и тяжелой цепей человека. Такие антитела в значительной степени или полностью сохраняют специфичность связывания антитела мыши, и примерно на две трети являются последовательностью человека. Венированное антитело представляет собой тип гуманизированного антитела, который сохраняет некоторые и обычно все участки CDR и некоторые из нечеловеческих каркасных остатков вариабельной области из нечеловеческого антитела, но имеет замены других каркасных остатков вариабельной области, которые могут участвовать в B- или T-клеточных эпитопах, например в доступных остатках (Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991), с остатками из соответствующих положений последовательности антитела человека. В результате получают антитело, в котором участки CDR полностью или в значительной степени являются участками из нечеловеческого антитела, и каркасы вариабельной области нечеловеческого антитела становятся более

- 15 031069 человекоподобными с помощью замен.

Антитело человека против (ζνβ6 можно получать с помощью различных способов, как описано выше.

Если это желательно, с помощью анализа конкурентного связывания или иным образом можно выбирать любое из антител, имеющее специфичность эпитопа, аналогичную или перекрывающуюся со специфичностью антитела, указанного в качестве примера, такого как антитело 15H3.

VI. Терапевтическое применение.

Антитела по изобретению по отдельности или в виде конъюгатов антитело против (ζνβ6лекарственное средство можно применять для лечения злокачественного новообразования. При некоторых злокачественных заболеваниях выявлено детектируемое содержание </.v[^J>6. которое измеряют как на белковом уровне (например, с помощью иммунологического анализа, используя одно из приведенных в качестве примера антител), так и на уровне мРНК. При некоторых злокачественных заболеваниях выявлены повышенные уровни ανβ6 по сравнению с нераковыми тканями того же типа, предпочтительно от того же самого пациента. Примерный уровень ανβ6 в злокачественных клетках, поддающийся лечению, составляет от 1000 до 200000 молекулы ανβ6 на клетку, вместе с тем можно лечить более высокие или более низкие уровни. Обычно более высокое количество копий является предпочтительным для лечения солидных опухолей, например по меньшей мере приблизительно 15000 молекул ανβ6 на клетку. Необязательно уровень ανβ6 при злокачественном новообразовании измеряется перед проведением лечения.

Примеры злокачественных заболеваний, связанных с экспрессией ανβ6 и поддающихся лечению, включают, например, рак мочевого пузыря, рак головы и шеи (в том числе, например, рак губы, полости рта, полости носа, околоносовых пазух, глотки и гортани), рак кожи, рак легкого, рак поджелудочной железы, рак матки, рак молочной железы (в том числе тройной негативный рак молочной железы), рак толстой кишки, рак предстательной железы, рак яичников, рак желудка и рак печени. В одном из аспектов плоскоклеточные карциномы и аденокарциномы представляют собой примеры злокачественных заболеваний, связанных с экспрессией ανβ6 и поддающихся лечению. Лечение можно применять у пациентов, имеющих первичные или метастатические опухоли этих видов. Лечение также может применять у пациентов, не получавших лечение, у пациентов, невосприимчивых к стандартным способам лечения (например, гормоны, тамоксифен, герцептин), или при рецидиве после реакции на такое лечение. Антитела против ανβ6 и их конъюгаты можно применять для лечения злокачественных заболеваний, при которых наблюдается экспрессия ανβ6. В одном из вариантов осуществления используют человеческое, гуманизированное или химерное антитело против ανβ6 или его конъюгат для лечения индивида, имеющего αvβ6-экспрессирующий рак мочевого пузыря, рак головы и шеи (в том числе, например, рак губы, полости рта, носовой полости, околоносовых пазух, глотки и гортани), рак кожи, рак легкого, рак поджелудочной железы, рак матки, рак молочной железы (в том числе тройной негативный рак молочной железы), рак ободочной кишки, рак предстательной железы, рак яичников, рак желудка или рак печени. В одном из вариантов осуществления человеческое, гуманизированное или химерное антитело против ανβ6 или его конъюгат используют для лечения индивида с αvβ6-экспрессирующей плоскоклеточной карциномой или аденокарциномой.

Настоящая заявка считается первым достоверным раскрытием того, что αvβ6-белок экспрессируется на поверхности злокачественных клеток при раке мочевого пузыря. Таком образом, αvβ6-нацеленные препараты можно применять для лечения пациентов, страдающих αvβ6-экспрессирующим раком мочевого пузыря (например, антитела против ανβ6, пептиды или их конъюгаты). Препараты, нацеленные на ανβ6, для лечения рака мочевого пузыря включают антитела и конъюгаты по изобретению, например, химерные, человеческие и гуманизированные антитела 15H3 и их конъюгаты, но не ограничены указанными антителами или препаратами.

Человеческие, гуманизированные или химерные антитела по отдельности или в виде их конъюгатов вводят по эффективной схеме, подразумевающей, что дозировка, способ введения и частота введения задерживают начало, уменьшают степень тяжести, тормозят дальнейшее ухудшение и/или улучшают по меньшей мере один признак или симптом рака. Схема введения может упоминаться как терапевтически эффективный режим. В некоторых случаях можно наблюдать терапевтическую эффективность у отдельного пациента относительно контроля из анамнеза или прошлого опыта у того же пациента. В других случаях терапевтическая эффективность может быть продемонстрирована в доклинических или клинических испытаниях в популяции пациентов по отношению к контрольной популяции не леченных пациентов.

Примерные дозы для моноклонального антитела представляют собой, например, дозы от 0,1 до 50 мг/кг массы тела пациента, более типично от 1 до 30 мг/кг, от 1 до 20 мг/кг, от 1 до 15 мг/кг, от 1 до 12 мг/кг, или от 1 до 10 мг/кг, или от 2 до 30 мг/кг, от 2 до 20 мг/кг, от 2 до 15 мг/кг, от 2 до 12 мг/кг, или от 2 до 10 мг/кг, или от 3 до 30 мг/кг, от 3 до 20 мг/кг, от 3 до 15 мг/кг, от 3 до 12 мг/кг или от 3 до 10 мг/кг. Примерные дозы для конъюгатов антитело-лекарственное средство представляют собой дозы, например, от 0,01 до 10 мг/кг, от 0,1 до 10 мг/кг, от 0,3 до 3 мг/кг, от 0,5 до 3 мг/кг, от 1 до 7,5 мг/кг, или от 2 до 7,5

- 16 031069 мг/кг, или от 3 до 7,5 мг/кг массы тела индивида, или от 0,1 до 20 мг/кг, или от 0,5 до 5 мг/кг массы тела (например, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мг/кг), или от 10 до 1500 мг или от 200 до 1500 мг в виде фиксированной дозы. В некоторых способах пациенту вводят дозу по меньшей мере 1,5 мг/кг, по меньшей мере 2 мг/кг или по меньшей мере 3 мг/кг с введением один раз каждые три недели или чаще. Доза зависит от индивидуальных свойств цитотоксического лекарственного средства, от частоты введения, состояния пациента и реакции на предшествующее лечение, если таковое имеется, и наряду с прочими факторами от того, является ли расстройство острым или хроническим.

Введение обычно проводят парентерально, хотя это не обязательно. Введение также можно проводить локализованно непосредственно в опухоль. Предпочтительно введение в системный кровоток внутривенным или подкожным путем. Внутривенное введение можно выполнять, например, путем инфузии в течение такого периода, как 30-90 мин, или путем однократной болюсной инъекции.

Частота введения зависит среди прочих факторов от периода полувыведения антитела или конъюгата из циркуляторного русла, от состояния пациента и способа введения. Частота может представлять собой, например, ежедневное, еженедельное, ежемесячное, ежеквартальное введение или нерегулярные интервалы в ответ на изменения в состоянии пациента или в прогрессировании злокачественного новообразования, которое лечат. Примерная частота для внутривенного введения составляет от двух раз в неделю и ежеквартально при непрерывном курсе лечения, хотя также возможно более или менее частое введение. Другие примеры частоты при внутривенном введении представляют собой диапазон между еженедельным введением или в течение трех из каждых четырех недель или каждые три недели при непрерывном курсе лечения, вместе с тем также возможно более или менее частое введение. При подкожном введении примерной частотой является от ежедневного до ежемесячного введение, вместе с тем также возможно более или менее частое введение.

Количество вводимых доз зависит от характера злокачественного заболевания (например, от выявляемых острых или хронических симптомов) и от реакции заболевания на лечение. В некоторых аспектах при острых нарушениях или обострениях хронического заболевания часто достаточное количество составляет от 1 и 10 доз. Иногда достаточно одной болюсной дозы, необязательно с фрагментацией дозы, при остром заболевании или обострения хронического заболевания. Лечение можно повторять при рецидиве острого заболевания или при обострении. При хронических заболеваниях антитело можно вводить через регулярные промежутки времени, например еженедельно, раз в две недели, ежемесячно, ежеквартально, раз в полгода в течение по меньшей мере 1 года, 5 или 10 лет или в течение всей жизни пациента.

Фармацевтические композиции для парентерального введения предпочтительно являются стерильными и, по существу, изотоническими, полученными в условиях GMP. Фармацевтические композиции могут быть представлены в единой лекарственной форме (т.е. в виде дозы для однократного введения). Рецептуру фармацевтических композиций можно получать с использованием одного или нескольких физиологически приемлемых носителей, разбавителей, наполнителей или вспомогательных веществ. Рецептура зависит от выбранного пути введения. Рецептура антител для инъекций может быть приготовлена в виде водных растворов предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хенка, раствор Рингера или физиологический раствор или ацетатный буфер (для уменьшения дискомфорта в месте инъекции). Раствор может содержать вспомогательные средства, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства. Альтернативно антитела могут быть в лиофилизированной форме для смешивания перед применением с подходящим носителем, например со стерильной апирогенной водой. Концентрация антител в жидкой композиции может составлять, например, от 1 до 100 мг/мл.

Лечение антителами и конъюгатами антитело-лекарственное средство по изобретению можно сочетать с химиотерапией, облучением, лечением стволовыми клетками, хирургическим лечением и другими способами, эффективными против расстройства, подлежащего лечению. В некоторых аспектах конъюгаты антитело-лекарственное средство, описанные в настоящем изобретении, могут вводиться с другими лекарственными препаратами, которые входят в стандарт медицинской помощи (например, с терапией первой линии стандарта медицинской помощи, или с терапией второй или третьей линии, или даже со спасительной терапией) для конкретного заболевания, подлежащего лечению. Полезные классы других средств, которые можно вводить с антителами и конъюгатами антитело-лекарственное средство к ανβ6, включают, например, и другие направленные препараты и/или ненаправленные препараты. Примеры включают антитела или конъюгаты антитело-лекарственное средство к другим рецепторам, экспрессируемым на злокачественных клетках, нацеленные на ανβ6 пептиды или конъюгаты, антитубулиновые средства (например, ауристатины), средства, связывающиеся с ДНК со стороны малой бороздки, ингибиторы репликации ДНК, алкилирующие средства (например, платиновые комплексы, такие как cis-платин, комплексы моно(платины), бис-(платины) и три-ядерной платины и карбоплатин), антрациклины, антибиотики, антифолаты, антиметаболиты, химиотеравтические сенсибилизаторы, дуокармицины, этопозиды, фторированные пиримидины, ионофоры, лекситропсины, нитрозомочевины, платинолы, предобразующие соединения, пуриновые антиметаболиты, пуромицины, радиационные сенсибилизаторы, стероиды, таксаны, ингибиторы топоизомеразы, алкалоиды барвинка и тому подобное.

- 17 031069

VII. Другие применения.

Антитела против ανβό можно использовать для детекции ανβό в плане клинической диагностики или лечения или в исследовательских целях. Экспрессия ανβό при злокачественном новообразовании является показателем того, что злокачественное новообразование поддается лечению с помощью антител по настоящему изобретению. Антитела также могут быть проданы как исследовательские реагенты для лабораторных исследований для выявления клеток, несущих ανβό и их реакции на различные стимулы. Для таких применений моноклональные антитела могут быть меченными флуоресцентными молекулами, спин-мечеными молекулами, ферментами или радиоизотопами и могут быть представлены в виде комплекта со всеми необходимыми реагентами для выполнения анализа на ανβό. Антитела по изобретению можно использовать для выявления экспрессии белка ανβό и определения восприимчивости злокачественного заболевания к лечению анти-ανβό ADC. Антитела можно также использовать для очистки ανβό, например, с помощью аффинной хроматографии.

Все патентные заявки, веб-сайт, другие публикации, регистрационные номера и т.п., приведенные выше или ниже, указаны в качестве ссылки в полном объеме для всех целей в такой же степени, как если бы каждый отдельный элемент был конкретно и индивидуально указан как включенный таким образом в качестве ссылки. Если разные варианты последовательности связаны с одним инвентарным номером в разное время, имеется в виду вариант, связанный с этим инвентарным номером на действительную дату подачи настоящей заявки. Действительная дата подачи означает более раннюю из дат фактической подачи или дату подачи приоритетной заявки со ссылкой на регистрационный номер, если это применимо. Любой признак, этап, элемент, вариант осуществления или аспект настоящего изобретения могут быть использованы в сочетании с любыми другими, если специально не указано иное. Несмотря на то что настоящее изобретение было описано в некоторых деталях в виде иллюстрации и примера в целях ясности и понимания, будет очевидно, что можно осуществлять определенные изменения и модификации в объеме прилагаемой формулы изобретения.

Примеры

Материалы.

Клеточные линии, описанные в следующих примерах, сохранялись в культуре в соответствии с условиями, указанными в Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection (ATCC), Национальном институте рака (NCI) или Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany (DMSZ)). Клеточные линии Detroit 562, клеточные линии HPAFII и клеточные линии BXPC3 были получены из ATCC. Эпителиальные клетки почки человека Freestyle™ 293-F (Invitrogen Corp.) и соответствующие трансфектанты сохранялись согласно описанию производителя. Реагенты для клеточных культур были получены в корпорации Invitrogen (Carlsbad, CA.), Molecular Devices (Sunnydale, CA) и от других поставщиков. Реагенты для вторичных антител были приобретены в компании Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA). Рекомбинантный ανβό человека был подготовлен авторами. Рекомбинантные ανβ3 и ανβ8 были приобретены в компании R&D Systems (Minneapolis, MN). Клетки Freestyle™ 293-F экспрессируют эндогенный интегрин αν и они стабильно трансфицировались с полноразмерной кДНК, кодирующей человеческий cynomolgus или интегрин βό мыши для создания клеточных линий HEK293F:huβό, HEK293F:cynoβό и HEK293F:muβό соответственно. Клетки HEK293F, трансфицированные пустым вектором (HEK293F:vector), были использованы в качестве отрицательного контроля. Клетки 3T3 и FDC-P1 мыши, которые экспрессируют эндогенный интегрин av мыши, были трансфицированы клоном полноразмерной кДНК для интегрина βό человека и мыши для создания 3T3:huβό и FDC-P1:muβό соответственно.

Методики.

Анализы связывания путем насыщения.

Анализы связывания путем насыщения проводили с использованием следующих антигенэкспрессирующих клеточных линий: 293F±^6, 293F:cynoβό, FDCPl:muβό и NBT-II крысы. Антигенэкспрессирующие клетки в количестве 0,25-0,5χ10^ό клеток на лунку в виде аликвот вносились в 96-луночный Vдонный планшет. Прямым способом метили m15H3, h15H3 (HBLC) и h15H3 (HTLC) с эквивалентными уровнями биотина и добавляли к клеткам в концентрациях от 0,1 пМ до 150 нМ. Клетки инкубировали на льду в течение 30 мин, промывали три раза в FACS буфере (фосфатно-буферный раствор ФБР, 2% фетальной бычьей сыворотки, 1 мМ MgCl₂, 1 мМ CaCl₂, 0,02% NaN₃), инкубировали на льду в течение 45 мин со стрептавидином (0,5 мкг/мл), конъюгированным с фикоэритрином (PE) в FACS буфере, промывали три раза и ресуспендировали в FACS буфере. Обнаружение связывания проводили с помощью оборудования Becton Dickinson Biosciences FACSCalibur (San Jose, CA). Кажущаяся Kd была рассчитана с использованием программного обеспечения GraphPad Software (LaJolla, CA).

ELISA.

На 90-луночнью планшеты Maxisorb (Nunc) наносили на всю ночь при 4°C 1 мкг/мл рекомбинантного человеческого ανβό, ανβ3 и ανβ8, разведенные в ФБР. Планшеты промывали в ФБР с 0,05% Tween 20 (ФБР-Т). Промывочный буфер удаляли, и планшеты блокировали в течение 30 мин при комнатной

- 18 031069 температуре в блокирующем буфере TBS (TBS плюс 1 мМ MnCl₂, 0,05% Твин 20, 1% бычьего сывороточного альбумина БСА). Планшеты промывали и затем инкубировали в течение 1 ч с биотинилированным антителом (m15H3 или h15H3), разводили в блокирующем буфере TBS в концентрациях, которые варьировались от 4,6 нг/мл до 10 мкг/мл. Планшеты промывали, инкубировали в течение 1 ч с 1 мкг/мл конъюгата пероксидаза хрена (HRP)-стрептавидин, промывали и затем инкубировали с субстратом 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМВ) в течение 10 мин. Реакцию останавливали с помощью 1М H₂SO₄. Поглощение при 450 нм считывали, используя планшетный ридер Fusion HT (Perkin Elmer, Waltham, MA).

Анализы конкурентного связывания.

Анализы конкурентного связывания осуществляли с помощью клеточных линий 293F:huβ и HEK293F:cynoβό. Аликвоты 1х10⁵ клеток, экспрессирующих антиген, вводили в каждую лунку 96луночного V-донного планшета на льду. Клетки инкубировали в течение 1 ч с 2 нМ меченого 15H3 мыши AlexaFluor-647 и с возрастающими концентрациями (от 0,024 до 100 нМ) конструкций немеченного гуманизированного 15H3. Клетки осаждали и промывали 3 раза ФБР. Клетки осаждали и ресуспендировали в 125 мкл из ФБР/БСА. Флуоресценцию анализировали с помощью проточной цитометрии, используя процент насыщенного флуоресцентного сигнала для определения процента связанных меченых 15H3 мыши и затем экстраполируя EC₅₀ путем аппроксимации данных по сигмоидальной кривой доза-ответ с вариабельным наклоном.

Количественный проточный цитометрический анализ.

Количественное определение числа копий αvβό на поверхности клеток проводили с помощью avβό mAb мыши в качестве первичного антитела и непрямого анализа проточной цитометрии DAKO QiFiKit согласно описанию производителя (DAKO A/S, Glostrup, Denmark) и подсчитывали с помощью проточного цитометра Becton Dickinson.

Анализ цитотоксичности.

Опухолевые клетки инкубировали с конъюгатов антитело против avβό-лекарственное средство в течение 96 ч при 37°C. Несвязанные (h00) ADC использовали в качестве отрицательного контроля. Жизнеспособность клеток определяли с помощью люминесцентного анализа CellTiter-Glo® (Promega Corporation, Madison, WI), и результаты измеряли на ридере Fusion HT (Perkin Elmer, Waltham, MA). Результаты представлены в виде IC₅₀, концентрация соединения, необходимая для получения 50% снижения жизнеспособности по сравнению с клетками, обработанными наполнителем (контроль=100%).

Получение конъюгатов антитело-лекарственное средство.

Конъюгаты антитело против αvβό-лекарственное средство получали, как описано в патенте US 20050238649. Оба линкера vcMMAE и mcMMAF описаны в US 20050238649, включенный в изобретение в качестве ссылки для всех целей.

Анализ активности in vivo.

Голым мышам (nu/nu) (7-10 животных на группу) были имплантированы опухолевые клетки, выращенные в культуре. Были имплантированы Detroit 562 (ATCC) в количестве 5х10⁵ клеток в 25%-ном матригеле, и были имплантированы HPAFII (ATCC) в количестве 1х10⁶ в 25%-ном матригеле. Введение гуманизированного αvβ6 ADC или несвязывающего контрольного ADC начинали, когда опухоли достигали объема 100 мм³ (каждые 4 днях4 внутрибрюшинных инъекций). Объемы опухолей контролировали с помощью штангенциркуля, животные были умерщвлены, когда объем опухоли достигал примерно 800 мм³. Графики средних объемов опухоли продолжали для каждой группы, по мере умерщвления одного или нескольких животных. Все процедуры с животными проводили в соответствии с протоколом, утвержденным Комитетом по содержанию и использованию животных в учреждениях (Institutional Animal Care and Use Committee), аккредитованных Ассоциацией по оценке и аккредитации содержания лабораторных животных. (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care).

Иммуногистохимическое окрашивание (ИГХ).

Способ.

Мультиопухолевые микроматрицы (Multi-Tumor microarrays, TMA) (№ в каталоге # MC5001) были приобретены в компании US Biomax Inc. Все образцы были обработаны на автоокрашивателе BondMax™ (Leica).

ИГХ окрашивание тканей FFPE.

Стекла с парафиновыми срезами из блока мультиопухолевой матрицы MC5001 были депарафинизированы с помощью раствора Bond™ DEWAX (Leica, № в каталоге # AR9222) при 72°C и регидратированы. Демаскирование антигена проводили с использованием раствора -2 для демаскирования антигена на основе ЭДТА (Bond™ Epitope Retrieval Solution 2, Leica, № в каталоге # AR9640) в течение 20 мин при 95-100°C. Стекла были обработаны в течение 30 мин с белковым блоком (DAKO, № в каталоге # Х0909) до инкубации с первичным антителом - мышиным антиинтегрин β6 клоном 437216 (RnD МАВ # 41551) при 5 мкг/мл в течение 45 мин при 25°C. В качестве отрицательного контроля использовали совпадающие по изотипу IgG2b мыши (Zymed # 02-6300) в количестве 5 мкг/мл для исходного окрашивания. Для автоматизированного ИГХ окрашивания использовали набор для обнаружения на основе щелочной фос

- 19 031069 фатазы - Fast Red (Bond™ Polymer АР Red Detection kit; Leica, № в каталоге # DS9305). После проявления хромогена срезы докрашивали гематоксилином и заклеивали покровными стеклами. Стекла исследовались и анализировались патологом, и делались снимки с помощью микроскопа Olympus BX41.

ИГХ замороженных тканей.

Стекла с замороженными срезами инкубировали в ацетоне в течение 10 мин при -20°C для фиксации ткани. Применяли перекисный блокирующий реагент PeroxAbolish (Biocare, № в каталоге # PXA96) в течение 15 мин при 25°C для подавления эндогенной пероксидазы. Стекла последовательно инкубировали в авидиновом блоке (Vector, № в каталоге # SP-2001) и затем в биотиновом блоке (Vector, № в каталоге # SP-2001) в течение 15 мин в каждом при 25°C. Стекла инкубировали с первичным антителом гуманизированным антиинтегрин αvβ6 клоном 15H3 в количестве 10 мкг/мл в течение 60 мин. Первичные и вторичные антитела были получены в разбавителе для первичного антитела Bond™ (Leica, № в каталоге # AR9352), содержащем 50 мМ MnCl. IgG человека (Ancell, № в каталоге # 295-010) использовали в количестве 10 мкг/мл в качестве отрицательного контроля для исходного окрашивания. После первичной инкубации антитела было использовано биотинилированное козье античеловеческое вторичное антитело (Jackson, № в каталоге # 109-066-098) в количестве 5 мкг/мл и инкубировано в течение 30 мин при 25°C. Для обнаружения биотинилированного вторичного антитела использовали реактив Vectastain Elite ABC (Vector, № в каталоге # ПК-7100) в течение 30 мин при 25°C. Набор для обнаружения Bond™ Polymer Refine (Leica, № в каталоге # DS9800) был использован для проявления DAB хромогена. Срезы окрашивали гематоксилином и заклеивали покровным стеклом. Стекла исследовались и анализировались патологом и делались снимки с помощью микроскопа Olympus BX41.

Результаты.

1. Связывание антитела мыши.

Для человека, супо, крысы и мыши была определена KD для αvβ6 моноклонального антитела 15H3 мыши и селектированного его варианта. Анализы конкурентного связывания и связывания путем насыщения для ортологов интегрина β6 проводили с использованием генно-инженерных клеточных линий (293F:huβ6, 2931^;:cynof)6 или FDC-P1:muβ6), за исключением клеточных линий крысы. Генноинженерные клеточные линии экспрессировали эндогенный av, который спаривался с рекомбинантной β6 цепью для получения гетеродимерного рецептора, состоящего из эндогенного av и рекомбинантного β6. Аффинность к avβ6 крысы определяли с помощью клеток карциномы мочевого пузыря крысы NBTII, которые экспрессировали эндогенный avβ6.

Таблица 1

Виды	hl5H3 (HTLC) (нМ)	Ы5НЗ (HBLC) (нМ)	Ш15НЗ (нМ)
Человек	1,2	1,4	0, 8
Супо	1,5	1, 6	1,0
Крыса	0,4	нет данных	0,2
Мышь	0,3	0, 6	0,2

Создание 15H3 антитела.

BALB/c мышей иммунизировали три раза путем внутрибрюшинных инъекций трансфектантов в количестве примерно 5х10⁶ 3T3:huβ6. За три дня до слияния мыши получали конечную инъекцию очищенного рекомбинантного avβ6 человека, который вводили внутривенно (6 мкг) и внутрибрюшинно (30 мкг). Лимфоциты, полученные из селезенки и лимфатических узлов, сливали с клетками миеломы P3X63Ag8.653 с использованием полиэтиленгликоля. Слитые клетки восстанавливали в течение ночи в среде для роста гибридом (IMDM, содержащей 4 мМ глутамина, 10% Fetal Clone I, 10% фактора клонирования и пенициллин/стрептомицин). После восстановления клетки осаждали центрифугированием и затем высевали в полутвердую среду. Полутвердая среда состояла из среды CloneMatrix с добавлением среды для роста гибридом плюс HAT для селекции гибридом и CloneDetect для продукции IgG. Гибридомы инкубировали в течение 10 дней при 37°C. На 10-й день клоны IgG-продуцирующей гибридомы собирали с использованием ClonePixFL (Molecular Devices) и переносили в 96-луночные планшеты, содержащие IgG-обедненную среду для роста гибридомы плюс HT. Проводили скрининг супернатантов гибридомной культуры на 2931·':1ιιιβ6 трансфектанты, и положительные клоны идентифицировали с помощью меченого вторичного антитела для обнаружения Alexifluor-647. Планшеты считывали в ридере FMAT 8200 (Applied Biosystems). Гибридомы, которые были связаны с 293F:huβ6 и 293Ε^^β6, но не с 293F:vector, были выращены для прямого конъюгирования. Непосредственно конъюгировавшая группа антител была тестирована в анализе связывания и цитотоксичности. Селекция m15H3 в качестве ведущего антитела была обусловлена проявлением его цитотоксической активности в качестве ADC на множестве avβ6-позитивных опухолевых клеточных линий и наличием сравнимой аффинности к человеческим и cynomolgus-формам антигена. Специфичность 15H3 мыши и гуманизированного 15H3 была подтверждена в анализах связывания, основанном на микроволюметрии (FMAT) и с помощью клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (FACS), в которых было показано связывание антител с трансфектан

- 20 031069 тами 293F:huP6, но не в с (,ζνβ5-положительной родительской линией (293F:vector). Специфичность связывания m15H3 и h15H3 также подтверждалась в анализе ELISA, когда антитела связывались с рекомбинантным ανβό человека, но не с ανβ3 или ανβ8.

Дизайн и тестирование гуманизированных антител.

В этом примере отправной точкой или донорским антителом для гуманизации являются антитела 15H3 мыши. Использовались геномные последовательности VH1-46 и JH4 для тяжелой цепи и VK2-30 и JK2 для легкой цепи.

В первом цикле гуманизации были определены 13 положений в тяжелой цепи (H28, H30, H38, H40, H41, H48, H66, H67, H69, H71, H72, H93 и H108) и 6 положений в легкой цепи (L21, L22, L36, L37, L45 и L63), по которым акцепторная последовательность человека отличается от донорской последовательности и которые могут влиять на связывание антитела в результате прямого контактирования с антигеном, воздействия на конформацию CDR или воздействия на укладку между тяжелыми и легкими цепями. Были созданы восемь гуманизованных тяжелых цепей и пять гуманизированных легких цепей, несущих обратную мутацию в различных перестановках в указанных положениях. Обратные мутации подчеркнуты и выделены жирным шрифтом (табл. 2 и 3). Остальные положения занимают остатки из акцепторной последовательности человека.

Таблица 2

Обратные мутации тяжелой цепи

Обратные мутации легкой цепи

Затем гуманизированные антитела экспрессировали представленные перестановки этих цепей из гуманизированных тяжелых и легких цепей. Все тяжелые цепи были экспрессированы, но только тяжелая цепь HB продемонстрировала заметное связывание (фиг. 2). Все легкие цепи показали связывание в комбинации с тяжелой цепью HB.

На основании данных связывания из первого цикла гуманизации был проведен второй цикл гуманизации. В тяжелой цепи были определены три положения, H73, H75 и H78, в дополнение к H28, H30, H72 и H93, в которых акцепторная последовательность человека отличалась от донорской последовательности и которые могут влиять на связывание антитела в результате прямого контактирования с антигеном, воздействия на конформацию CDR или воздействия на укладку между тяжелой и легкой цепями. В легкой цепи было идентифицировано одно положение, L4, в дополнение к L21, L22, L36, L37, L45 и L63. Было создано 10 дополнительных гуманизованных тяжелых цепей и одна дополнительная гуманизированная легкая цепь, несущие обратную мутацию в различных перестановках указанных положений. Обратные мутации подчеркнуты и выделены жирным шрифтом (табл. 4 и 5). Остальные положения занимают остатки акцепторной последовательности человека.

- 21 031069

Таблица 4

Обратные мутации тяжелой цепи

Антитело	Н2 8	нзо	Н72	Н73	Н75	Н78	Н93	Обратные мутации
НА	Т	т	D	Т	Т	V	А	0
НВ	S	S	D	Т	Т	V	А	2
HF	т	т	D	Т	Т	V	V	1
HG	т	т	Q	Т	Т	V	А	1
НК	т	т	D	К	S	А	А	3
HL	S	S	D	к	S	А	А	5
НМ	S	S	Q	к	S	А	А	6
HN	S	S	Q	т	т	V	А	3
НО	S	S	Q	к	т	V	А	4
HQ	т	т	D	т	S	А	А	2
HR	S	S	D	т	S	А	А	4
HS	S	S	Q	т	S	А	А	5
НТ	S	S	Q	т	т	V	V	4
ни	S	S	Q	к	S	А	V	7

Таблица 5

Были экспрессированы все тяжелые цепи (кроме HO и HK). Кривые связывания показаны в фиг. 47. Данные EC₅₀ приведены в табл. 6 ниже.

Таблица 6

Результаты EC₅₀ для селектированных гуманизированных антител против avp6

АЬ	ЕС50 (нМ)
HBLC	8, 14
HLLC	0, 74
HLLG	0, 97
HMLC	0, 49
HMLG	1, 07
HNLC	11,14
HNLG	3, 16
HRLC	26, 7
HRLG	23, 9
HSLC	32,5
HTLC	3,7
HULC	0, 93

Данные экспрессии.

Анти-Б6 клоны 437216 (R&D Systems) были использованы для иммуногистохимического анализа различных типов опухолей с помощью фиксированных формалином погруженных в парафин тканей (FFPE).

- 22 031069

Результаты данных экспрессии для αvβό в мультиопухолевой матрице

Происхождение опухоли	ανβ6+ экспрессия (%)
Мочевой пузырь	65
Голова и шея	50
Кожа	33
Легкое	30
Поджелудочная железа	30
Матка	30
Молочная железа	26
Толстая кишка	20
Предстательная железа	15
Яичник	14
Желудок	5

Анти-Bό клоны 437216 (R&D Systems) был использованы для иммуногистохимического анализа различных типов опухолей с использованием замороженной ткани.

Результаты данных экспрессии для αvβό в образцах замороженных тканей

Происхождение опухоли	ανβ6+	количество случаев	%
Поджелудочная железа	10	9	100%
Голова и шея	10	10	100%

Анти-Bό клоны 437216 (R&D Systems) были также использованы для иммуногистохимического анализа различных типов нормальных тканей с использованием фиксированных формалином залитых в парафин тканей (FFPE) и замороженной ткани. Все нормальные ткани молочной железы, поджелудочной железы, пищевода, гортани, легких, кожи, матки, молочной железы, толстой кишки, предстательной железы, желудка, яичников не имели экспрессии B6.

Антитело 15H3 также использовали для окрашивания замороженных образцов опухоли и нормальной ткани. Образцы нормальных тканей показывали отрицательный результат в отношении экспрессии B6. 23% (3/13) тканей тройного негативного рака молочной железы показывали экспрессию B6 на уровне от умеренного до сильного. 100% образцов рака поджелудочной железы (5/5 образцов), образцов рака легких (10/10) и образцов рака желудка (10/10) показывали мощную экспрессию B6.

In vitro противоопухолевая активность 15H3 мыши ADC.

Противоопухолевую активность анти-αvβό ADC in vitro измеряли с использованием анализов цитотоксичности. Проводили исследование экспрессии αvβό в разных клеточных линиях с пощью количественного анализа FACS. По данным из приведенной ниже таблицы 15H3 мыши ADC (антитело 15H3 мыши, конъюгированное с vcMMAE или mcMMAF (оба представляют собой маленькие молекулы и/или линкеры, описанные в US20050238649)) показывали эффективное уничтожение αvβό-клеток.

Линия злокачественных клеток	копии/клетки (х103)	M15H3-VC-MMAE 1С50 (нг/мл)	Ml5H3-mc-MMAF 1С50 (нг/мл)
НирТ4	184	35	16
ВхРСЗ	37	34	7
HPAFII	22	76	>2000
Рапс08.13	137	93	1400
Сарап-1	19	365	1508
SU8686	33	отсутствие эффекта	отсутствие эффекта
5637	36	>1000	>1000
SW780	80	614	86
RT4	42	>1000	>1000

На фиг. 9 показано, что в анализах цитотоксичности поведение гуманизированных 15H3 анти-αvβό ADC сходно с поведением мышиных предшественников.

In vivo противоопухолевая активность гуманизированных анти-αvβό ADC.

С помощью моделей рака поджелудочной железы (HPAFII, BxPC-3) и рака головы и шеи (Detroit 562) in vivo была показана противоопухолевая активность селектированных гуманизированных αvβό ADC (в среднем по 4 молекулы лекарственных средств на антитело) (фиг. 10-12). αvβ6-ADC, конъюгированные с vcMMAE, показали значительную задержку развития опухоли или регрессию опухоли по сравнению с необработанными и контрольными ADC. H15H3-vcMMAE (4) относится к конъюгатам антитело-лекарственное средство гуманизированной формы родительского антитела мыши, имеющего в среднем 4 молекулы vcMMAE линкер на антитело. h00-vcMMAE (4) относится к конъюгату антителолекарственное средство несвязывающего контрольного антитела, имеющего в среднем 4 молекулы vcMMAE линкер на антитело. h15H3-1 представляет собой конструкцию HBLC, h15H3-2 представляет собой конструкцию HLLC, и h15H3-3 представляет собой конструкцию HTLC.

- 23 031069

Последовательности

SEQ ID N0:1 - вариабельная область тяжелой цепи мыши белок

EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFSGYFMNWVKQSHGQSLEWIGLINPYNGDSFYNQK FKGKATLTVQKSSSTAHMELQSLTSEDSAVFYCVRGLRRDFDYWGQGTPLTVSS

SEQ ID N0:2 - вариабельная область легкой цепи мыши белок

DWLTQIPLTLSVTIGQPASLFCKSSQSLLDSDGKTYLNWLFQRPGQSPKRLIYLVSELDSGV PDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIKR

SEQ	ID	N0:3 -	CDR1	тяжелой цепи мыши	- белок
GYFMN
SEQ	ID	N0:4 -	CDR2	тяжелой	цепи	мыши	- белок
LINPYNGDSFYNQKFKG
SEQ	ID	N0:5 -	CDR3	тяжелой	цепи	мыши	- белок
GLRRDFDY
SEQ	ID	N0:6-	CDR1	легкой ]	цепи мыши -	белок

KSSQSLLDSDGKTYLN

SEQ ID N0:7 - CDR2 легкой цепи мыши	- белок
LVSELDS
SEQ	ID N0:8	- CDR3 легкой цепи мыши	- белок

WQGTHFPRT

SEQ ID N0:9 - вариабельная область тяжелой цепи НА - белок QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYFMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYNGDSFY NQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGLRRDFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID N0:10 - вариабельная область легкой цепи LA - белок DWMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLVSELD SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIKR

SEQ ID N0:11 - вариабельная область тяжелой цепи НВ белок

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFSGYFMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYNGDSFY NQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGLRRDFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID N0:12 - вариабельная область тяжелой цепи HF белок

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYFMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYNGDSFY NQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCVRGLRRDFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID N0:13 - вариабельная область тяжелой цепи HG белок

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYFMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYNGDSFY NQKFKGRVTMTRQTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGLRRDFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID N0:14 - вариабельная область тяжелой цепи НК белок

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYFMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYNGDSFY NQKFKGRVTMTRDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGLRRDFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID N0:15 - вариабельная область тяжелой цепи HL белок

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFSGYFMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYNGDSFY NQKFKGRVTMTRDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGLRRDFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID N0:16 - вариабельная область тяжелой цепи НМ белок

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFSGYFMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYNGDSFY NQKFKGRVTMTRQKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGLRRDFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID N0:17 - вариабельная область тяжелой цепи HN белок

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFSGYFMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYNGDSFY NQKFKGRVTMTRQTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGLRRDFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID N0:18 - вариабельная область тяжелой цепи НО белок

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFSGYFMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYNGDSFY NQKFKGRVTMTRQKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGLRRDFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID N0:19 - вариабельная область тяжелой цепи HQ белок

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYEMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYNGDSFY NQKFKGRVTMTRDTSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGLRRDFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID N0:20 - вариабельная область тяжелой цепи HR белок

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFSGYFMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYNGDSFY NQKFKGRVTMTRDTSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGLRRDFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID N0:21 - вариабельная область тяжелой цепи HS белок

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFSGYFMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYNGDSFY NQKFKGRVTMTRQTSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGLRRDFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID N0:22 - вариабельная область тяжелой цепи НТ

- 24 031069 белок

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFSGYFMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYNGDSFY NQKFKGRVTMTRQTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCVRGLRRDFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID N0:23 - вариабельная область тяжелой цепи HU белок QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFSGYFMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYNGDSFY NQKFKGRVTMTRQKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRGLRRDFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID N0:24 - вариабельная область легкой цепи LB - белок DWMTQSPLSLPVTLGQPASLFCKSSQSLLDSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLVSELD SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIKR

SEQ ID N0:25 - вариабельная область легкой цепи LC - белок DWMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLFQRPGQSPRRLIYLVSELD SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIKR

SEQ ID N0:26 - вариабельная область легкой цепи LD - белок DWMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWFQQRPGQSPKRLIYLVSELD SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIKR

SEQ ID N0:27 - вариабельная область легкой цепи LE - белок DWMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLVSELD SGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIKR

SEQ ID N0:28 - вариабельная область легкой цепи LF - белок DWMTQSPLSLPVTLGQPASLFCKSSQSLLDSDGKTYLNWLFQRPGQSPKRLIYLVSELD SGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIKR

SEQ ID N0:29 - вариабельная область легкой цепи LG - белок DWLTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLFQRPGQSPRRLIYLVSELD SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIKR

SEQ ID N0:30 - константная область тяжелой цепи IgGl человека - белок ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID N0:31 - константный домен легкой цепи каппа человека - белок

TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS

KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID N0:32 - S239C мутант константной области тяжелой цепи IgGl человека - белок ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PCVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE

LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW

QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID N0:33 сигнальный пептид вариабельной области тяжелой цепи мыши - белок

MGWSCIFLFLLSVTVGVFS

SEQ ID N0:34 сигнальный пептид вариабельной области тяжелой цепи человека - белок

MAWVW Т L L FLMAAAQ SAQA

SEQ ID N0:35 сигнальный пептид вариабельной области легкой цепи мыши - белок

MS PAQ FL FLLVLWIRE TNG

SEQ ID N0:36 сигнальный пептид вариабельной области легкой цепи человека - белок

MKL РVRL LVLM FWIPAS S S

SEQ ID N0:37 вариабельная область тяжелой цепи мыши нуклеиновая кислота gaggttcagctgcagcagtctggacctgagttggtgaaacctggggcttcagtgaagatatcc tgcaaggcttctggttattcatttagtggctactttatgaactgggtgaaacagagccatgga cagagccttgagtggattggacttattaatccttacaatggagactctttttacaatcagaag ttcaagggcaaggccacattgactgtacagaagtcctctagtacagcccacatggaactccag agcctgacatctgaagactctgcagtcttttattgtgttagagggttacgacgggactttgac tattggggccaaggcacccctctcacagtctcctca

SEQ ID N0:38 - вариабельная область легкой цепи мыши нуклеиновая кислота

Gatgttgtgttgacccagattccactcactttgtcggttaccattggacaaccagcctccctc ttttgtaagtcaagtcagagcctcttagatagtgatggaaagacatatttgaattggttattt cagaggccaggccagtctccaaagcgccttatttatctggtgtctgaactggactctggagtc cctgacaggttcactggcagtggatcagggacagatttcacactgaaaatcagcagagtggag gctgaggatttgggagtttattattgctggcaaggtacacattttcctcggacgttcggtgga

- 25 031069 ggcaccaagctggaaatcaaacgg

SEQ ID N0:39 - вариабельная область тяжелой цепи НА нуклеиновая кислота Caggtgcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggagcctctgtgaaggtgtcc tgtaaggcctctggctacaccttcacaggctacttcatgaactgggtgaggcaggcccctggc cagggcctggagtggatgggcctgatcaacccttacaatggagactccttctacaaccagaag ttcaagggcagggtgaccatgaccagggacacctccacctccacagtgtacatggagctgtcc tccctgaggtctgaggacacagctgtgtactactgtgccaggggcctgaggagggactttgac tactggggccagggcaccctggtgacagtgtcctcc

SEQ ID N0:40 - вариабельная область тяжелой цепи НВ нуклеиновая кислота Caggtgcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggagcctctgtgaaggtgtcc tgtaaggcctctggctacagcttctctggctacttcatgaactgggtgaggcaggcccctggc cagggcctggagtggatgggcctgatcaacccttacaatggagactccttctacaaccagaag ttcaagggcagggtgaccatgaccagggacacctccacctccacagtgtacatggagctgtcc tccctgaggtctgaggacacagctgtgtactactgtgccaggggcctgaggagggactttgac tactggggccagggcaccctggtgacagtgtcctcc

SEQ ID N0:41 - вариабельная область тяжелой цепи HL нуклеиновая кислота Caggtgcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggagcctctgtgaaggtgtcc tgtaaggcctctggctacagcttctctggctacttcatgaactgggtgaggcaggcccctggc cagggcctggagtggatgggcctgatcaacccttacaatggagactccttctacaaccagaag ttcaagggcagggtgaccatgaccagggacaagtcctcctccacagcttacatggagctgtcc tccctgaggtctgaggacacagctgtgtactactgtgccaggggcctgaggagggactttgac tactggggccagggcaccctggtgacagtgtcctcc

SEQ ID N0:42 - вариабельная область тяжелой цепи НТ нуклеиновая кислота Caggtgcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggagcctctgtgaaggtgtcc tgtaaggcctctggctacagcttctctggctacttcatgaactgggtgaggcaggcccctggc cagggcctggagtggatgggcctgatcaacccttacaatggagactccttctacaaccagaag ttcaagggcagggtgaccatgaccaggcagacctccacctccacagtgtacatggagctgtcc tccctgaggtctgaggacacagctgtgtactactgtgtcaggggcctgaggagggactttgac tactggggccagggcaccctggtgacagtgtcctcc

SEQ ID N0:43 - вариабельная область тяжелой цепи HN нуклеиновая кислота Caggtgcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggagcctctgtgaaggtgtcc tgtaaggcctctggctacagcttctctggctacttcatgaactgggtgaggcaggcccctggc cagggcctggagtggatgggcctgatcaacccttacaatggagactccttctacaaccagaag ttcaagggcagggtgaccatgaccaggcagacctccacctccacagtgtacatggagctgtcc tccctgaggtctgaggacacagctgtgtactactgtgccaggggcctgaggagggactttgac tactggggccagggcaccctggtgacagtgtcctcc

SEQ ID N0:44 - вариабельная область тяжелой цепи HU нуклеиновая кислота Caggtgcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggagcctctgtgaaggtgtcc tgtaaggcctctggctacagcttctctggctacttcatgaactgggtgaggcaggcccctggc cagggcctggagtggatgggcctgatcaacccttacaatggagactccttctacaaccagaag ttcaagggcagggtgaccatgaccaggcagaagtcctcctccacagcttacatggagctgtcc tccctgaggtctgaggacacagctgtgtactactgtgtcaggggcctgaggagggactttgac tactggggccagggcaccctggtgacagtgtcctcc

SEQ ID N0:45 - вариабельная область легкой цепи LA нуклеиновая кислота gatgtggtgatgacccagtcccctctgtccctgcctgtgaccctgggccagcctgcctccatc tcctgtaagtcctcccagtccctgctggactctgatggcaagacctacctgaactggttccag cagaggcctggccagtcccctaggaggctgatctacctggtgtctgagctggactctggagtg cctgacaggttctctggctctggctctggcacagacttcaccctgaagatctccagggtggag gctgaggatgtgggagtgtactactgttggcagggcacccacttccctaggacctttggaggt ggaaccaagctggagatcaagcgt

SEQ ID N0:46 - вариабельная область легкой цепи LC нуклеиновая кислота gatgtggtgatgacccagtcccctctgtccctgcctgtgaccctgggccagcctgcctccatc tcctgtaagtcctcccagtccctgctggactctgatggcaagacctacctgaactggctgttc cagaggcctggccagtcccctaggaggctgatctacctggtgtctgagctggactctggagtg cctgacaggttctctggctctggctctggcacagacttcaccctgaagatctccagggtggag gctgaggatgtgggagtgtactactgttggcagggcacccacttccctaggacctttggaggt ggaaccaagctggagatcaagcgt

SEQ ID N0:47 - вариабельная область легкой цепи LF нуклеиновая кислота Gatgtggtgatgacccagtcccctctgtccctgcctgtgaccctgggccagcctgcctccctg ttctgtaagtcctcccagtccctgctggactctgatggcaagacctacctgaactggctgttc cagaggcctggccagtcccctaagaggctgatctacctggtgtctgagctggactctggagtg cctgacaggttcacaggctctggctctggcacagacttcaccctgaagatctccagggtggag gctgaggatgtgggagtgtactactgttggcagggcacccacttccctaggacctttggaggt

- 26 031069 ggaaccaagctggagatcaagcgt

SEQ ID N0:48 - вариабельная область легкой цепи LG нуклеиновая кислота gatgtggtgctgacccagtcccctctgtccctgcctgtgaccctgggccagcctgcctccatc tcctgtaagtcctcccagtccctgctggactctgatggcaagacctacctgaactggctgttc cagaggcctggccagtcccctaggaggctgatctacctggtgtctgagctggactctggagtg cctgacaggttctctggctctggctctggcacagacttcaccctgaagatctccagggtggag gctgaggatgtgggagtgtactactgttggcagggcacccacttccctaggacctttggaggt ggaaccaagctggagatcaagcgt

SEQ ID N0:49 - сигнальный пептид вариабельной области тяжелой цепи мыши - нуклеиновая кислота Atgggatggagctgtatctttctctttctcctgtcagtaactgtaggtgtgttctct

SEQ ID N0:50 - сигнальный пептид вариабельной области тяжелой цепи человека - нуклеиновая кислота Atggcttgggtgtggaccttgctattcctgatggcagctgcccaaagtgcccaagca

SEQ ID N0:51 - сигнальный пептид вариабельной области легкой цепи мыши - нуклеиновая кислота atgagtcctgcccagttcctgtttctgttagtgctctggattcgggaaaccaacggt

SEQ ID N0:52 - сигнальный пептид вариабельной области легкой цепи человека - нуклеиновая кислота Atgaagttgcctgttaggctgttggtgctgatgttctggattcctgcttccagcagt

SEQ ID N0:53 - константная область тяжелой цепи IgGl человека - нуклеиновая кислота gctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggc acagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaac tcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctac tccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaac gtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaa actcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttc cccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtg gacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcat aatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctc accgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagcc ctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtg tacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtc aaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaac tacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcacc gtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctg cacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa

SEQ ID N0:54 - константный домен легкой цепи каппа человека - нуклеиновая кислота

Actgtggcggcgccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaact gcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtg gataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagc acctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctac gcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagag tgt

SEQ ID N0:55 - S239C мутант константной области тяжелой цепи IgGl человека - нуклеиновая кислота

Gctagcaccaagggcccatctgtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggc acagctgccctgggctgcctggtcaaggactacttccctgaacctgtgacagtgtcctggaac tcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctac tccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaac gtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaa actcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtgtgtcttcctcttc cccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtg gacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcat aatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctc accgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagcc ctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtg tacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtc aaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaac tacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcacc gtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctg cacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa

- 27 031069

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Seattle Genetics, Inc.

<120> АНТИТЕЛА К ИНТЕГРИНУ АЛЬФА V БЕТА 6 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА <130> AVB6-00112PC <150> US 61/600,499 <151> 2012-02-17 <150> US 61/602,511 <151> 2012-02-23 <160> 55 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 117 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи мыши <400> 1

Glu Val 1

Gln

Leu

Gln Gln Ser Gly Pro Glu

Leu

Val

Lys

Pro

Gly 15

Ala

5

10

Ser

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ser

Phe

Ser

Gly

Tyr

20

25

30

Phe

Met

Asn

Trp

Val

Lys

Gln

Ser

His

Gly

Gln

Ser

Leu

Glu

Trp

Ile

35

40

45

Gly

Leu

Ile

Asn

Pro

Tyr

Asn

Gly

Asp

Ser

Phe

Tyr

Asn

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Lys

Ala

Thr

Leu

Thr

Val

Gln

Lys

Ser

Ser

Ser

Thr

Ala

His

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Gln

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Ala

Val

Phe

Tyr

Cys

85

90

95

Val

Arg

Gly

Leu

Arg

Arg

Asp

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Pro

100

105

110

Leu Thr Val Ser Ser

115 <210>

<211>

<212>

113

Белок

- 28 031069 <213> Искусственная <220>

<223> Вариабельная область легкой цепи мыши <400> 2

Asp Val 1

Val

Leu

Thr Gln 5

Ile

Pro

Leu

Thr 10

Leu

Ser

Val

Thr

Ile 15

Gly

Gln

Pro

Ala

Ser

Leu

Phe

Cys

Lys

Ser

Ser

Gln

Ser

Leu

Leu

Asp

Ser

20

25

30

Asp

Gly

Lys

Thr

Tyr

Leu

Asn

Trp

Leu

Phe

Gln

Arg

Pro

Gly

Gln

Ser

35

40

45

Pro

Lys

Arg

Leu

Ile

Tyr

Leu

Val

Ser

Glu

Leu

Asp

Ser

Gly

Val

Pro

50

55

60

Asp

Arg

Phe

Thr

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile

65

70

75

80

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Leu

Gly

Val

Tyr

Tyr

Cys

Trp

Gln

Gly

85

90

95

Thr

His

Phe

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

110

Arg

<210> <211> <212> <213>	3 5 Белок Искусственная
<220> <223>	CDR1 тяжелой цепи мыши
<400>	3
Gly Tyr Phe Met Asn
1	5

<210> <211> <212> <213>

4 17 Белок Искусственная

<220> <223>	CDR2 тяжелой цепи мыши
<400>	4

- 29 031069

Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Ser Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

5 10 15

Gly

<210>	5
<211>	8
<212>	Белок
<213>	Искусственная
<220>
<223>	CDR3 тяжелой цепи мыши

<400> 5

Gly Leu Arg Arg Asp Phe Asp Tyr

5 <210> 6 <211> 16 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> CDR1 легкой цепи мыши
<400> 6
Lys Ser Ser	Gln Ser Leu Leu Asp	Ser Asp Gly Lys	Thr Tyr Leu Asn
1	5	10	15

<210> <211> <212> <213>	7 7 Белок Искусственная
<220> <223>	CDR2 легкой цепи мыши
<400>	7
Leu Val	Ser Glu Leu Asp Ser
1	5

<210> <211> <212> <213>	8 9 Белок Искусственная
<220> <223>	CDR3 легкой цепи мыши
<400>	8
Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Arg Thr
1	5

- 30 031069 <210> 9 <211> 117 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи HA <400> 9

Gln 1

Val

Gln Leu

Val 5

Gln

Ser Gly Ala Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Gly

Tyr

20

25

30

Phe

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Leu

Ile

Asn

Pro

Tyr

Asn

Gly

Asp

Ser

Phe

Tyr

Asn

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Thr

Ser

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Gly

Leu

Arg

Arg

Asp

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

100

105

110

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

<210> 10 <211> 113 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Вариабельная область легкой цепи LA <400> 10

Asp Val 1

Val

Met

Thr Gln 5

Ser

Pro

Leu

Ser 10

Leu

Pro Val

Thr

Leu Gly 15

Gln

Pro

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Lys

Ser

Ser

Gln

Ser

Leu

Leu

Asp

Ser

20

25

30

Asp

Gly

Lys

Thr

Tyr

Leu

Asn

Trp

Phe

Gln

Gln

Arg

Pro

Gly

Gln

Ser

35

40

45

- 31 031069

Pro Arg 50

Arg

Leu

Ile

Tyr

Leu 55

Val

Ser

Glu Leu

Asp 60

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile

65

70

75

80

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr

Cys

Trp

Gln

Gly

85

90

95

Thr

His

Phe

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

110

Arg <210> 11 <211> 117 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи HB <400> 11

Gln Val 1

Gln Leu Val 5

Gln Ser

Gly Ala

Glu Val 10

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ser

Phe

Ser

Gly

Tyr

20

25

30

Phe

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Leu

Ile

Asn

Pro

Tyr

Asn

Gly

Asp

Ser

Phe

Tyr

Asn

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Thr

Ser

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Gly

Leu

Arg

Arg

Asp

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

100

105

110

Val Thr Val Ser Ser

115

- 32 031069 <210> 12 <211> 117 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи HF <400>12

Gln 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Gln Ser

Gly Ala

Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Gly

Tyr

20

25

30

Phe

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Leu

Ile

Asn

Pro

Tyr

Asn

Gly

Asp

Ser

Phe

Tyr

Asn

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Thr

Ser

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Val

Arg

Gly

Leu

Arg

Arg

Asp

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

100

105

110

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115 <210>13 <211>117 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи HG <400> 13

Gln 1

Val

Gln Leu

Val 5

Gln

Ser

Gly

Ala Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Gly

Tyr

20

25

30

Phe

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

- 33 031069

Gly Leu 50

Ile

Asn

Pro

Tyr

Asn 55

Gly Asp

Ser

Phe

Tyr 60

Asn

Gln

Lys

Phe

Lys Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Gln

Thr

Ser

Thr

Ser

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Met Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala Arg

Gly

Leu

Arg

Arg

Asp

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

100

105

110

Val Thr

Val

Ser

Ser

115

<210>

14

<211>

117

<212>

Белок

<213>

Искусственная

<220>

<223>

Вариабельная

область

тяжелой

цепи HK

<400>

14

Gln Val

Gln

Leu

Val

Gln

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

1

5

10

15

Ser Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Gly

Tyr

20

25

30

Phe Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly Leu

Ile

Asn

Pro

Tyr

Asn

Gly

Asp

Ser

Phe

Tyr

Asn

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Lys Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Lys

Ser

Ser

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala Arg

Gly

Leu

Arg

Arg

Asp

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

100

105

110

Val Thr Val Ser Ser

115

- 34 031069 <210> 15 <211> 117 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи HL <400> 15

Gln 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Gln Ser

Gly Ala

Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ser

Phe

Ser

Gly

Tyr

20

25

30

Phe

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Leu

Ile

Asn

Pro

Tyr

Asn

Gly

Asp

Ser

Phe

Tyr

Asn

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Lys

Ser

Ser

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Gly

Leu

Arg

Arg

Asp

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

100

105

110

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115 <210> 16 <211> 117 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи HM <400> 16

Gln 1

Val

Gln Leu

Val 5

Gln

Ser

Gly

Ala Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ser

Phe

Ser

Gly

Tyr

20

25

30

Phe

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

- 35 031069

Gly Leu 50

Ile

Asn

Pro

Tyr

Asn 55

Gly Asp

Ser

Phe

Tyr 60

Asn

Gln

Lys

Phe

Lys Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Gln

Lys

Ser

Ser

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala Arg

Gly

Leu

Arg

Arg

Asp

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

100

105

110

Val Thr

Val

Ser

Ser

115

<210>

17

<211>

117

<212>

Белок

<213>

Искусственная

<220>

<223>

Вариабельная

область

тяжелой

цепи HN

<400>

17

Gln Val

Gln

Leu

Val

Gln

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

1

5

10

15

Ser Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ser

Phe

Ser

Gly

Tyr

20

25

30

Phe Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly Leu

Ile

Asn

Pro

Tyr

Asn

Gly

Asp

Ser

Phe

Tyr

Asn

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Lys Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Gln

Thr

Ser

Thr

Ser

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Met Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala Arg

Gly

Leu

Arg

Arg

Asp

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

100

105

110

- 3ό Val Thr Val Ser Ser

115 <210> 18 <211> 117 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи HO <400>18

Gln 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Gln Ser

Gly Ala

Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ser

Phe

Ser

Gly

Tyr

20

25

30

Phe

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Leu

Ile

Asn

Pro

Tyr

Asn

Gly

Asp

Ser

Phe

Tyr

Asn

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Gln

Lys

Ser

Thr

Ser

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Gly

Leu

Arg

Arg

Asp

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

100

105

110

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115 <210>19 <211>117 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи HQ <400> 19

Gln 1

Val

Gln Leu

Val 5

Gln

Ser

Gly

Ala Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Gly

Tyr

20

25

30

Phe

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

- 37 031069

Gly Leu 50

Ile

Asn

Pro

Tyr

Asn 55

Gly Asp

Ser

Phe

Tyr 60

Asn

Gln

Lys

Phe

Lys Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Ser

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala Arg

Gly

Leu

Arg

Arg

Asp

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

100

105

110

Val Thr

Val

Ser

Ser

115

<210>

20

<211>

117

<212>

Белок

<213>

Искусственная

<220>

<223>

Вариабельная

область

тяжелой

цепи HR

<400>

20

Gln Val

Gln

Leu

Val

Gln

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

1

5

10

15

Ser Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ser

Phe

Ser

Gly

Tyr

20

25

30

Phe Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly Leu

Ile

Asn

Pro

Tyr

Asn

Gly

Asp

Ser

Phe

Tyr

Asn

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Lys Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Ser

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala Arg

Gly

Leu

Arg

Arg

Asp

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

100

105

110

Val Thr Val Ser Ser

115

- 38 031069 <210> 21 <211> 117 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи HS <400> 21

Gln 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Gln Ser

Gly Ala

Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ser

Phe

Ser

Gly

Tyr

20

25

30

Phe

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Leu

Ile

Asn

Pro

Tyr

Asn

Gly

Asp

Ser

Phe

Tyr

Asn

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Gln

Thr

Ser

Ser

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Gly

Leu

Arg

Arg

Asp

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

100

105

110

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115 <210> 22 <211> 117 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи HT <400> 22

Gln 1

Val

Gln Leu

Val 5

Gln

Ser

Gly

Ala Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ser

Phe

Ser

Gly

Tyr

20

25

30

Phe

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

- 39 031069

Gly Leu 50

Ile

Asn

Pro

Tyr

Asn 55

Gly Asp

Ser

Phe

Tyr 60

Asn

Gln

Lys

Phe

Lys Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Gln

Thr

Ser

Thr

Ser

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Met Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Val Arg

Gly

Leu

Arg

Arg

Asp

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

100

105

110

Val Thr

Val

Ser

Ser

115

<210>

23

<211>

117

<212>

Белок

<213>

Искусственная

<220>

<223>

Вариабельная

область

тяжелой

цепи HU

<400>

23

Gln Val

Gln

Leu

Val

Gln

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

1

5

10

15

Ser Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ser

Phe

Ser

Gly

Tyr

20

25

30

Phe Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly Leu

Ile

Asn

Pro

Tyr

Asn

Gly

Asp

Ser

Phe

Tyr

Asn

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Lys Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Gln

Lys

Ser

Ser

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Val Arg

Gly

Leu

Arg

Arg

Asp

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

100

105

110

Val Thr Val Ser Ser

115

- 40 031069 <210> 24 <211> 113 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Вариабельная область легкой цепи LB <400>24

Asp 1

Val

Val

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Leu

Ser Leu 10

Pro Val

Thr

Leu 15

Gly

Gln

Pro

Ala

Ser

Leu

Phe

Cys

Lys

Ser

Ser

Gln

Ser

Leu

Leu

Asp

Ser

20

25

30

Asp

Gly

Lys

Thr

Tyr

Leu

Asn

Trp

Phe

Gln

Gln

Arg

Pro

Gly

Gln

Ser

35

40

45

Pro

Arg

Arg

Leu

Ile

Tyr

Leu

Val

Ser

Glu

Leu

Asp

Ser

Gly

Val

Pro

50

55

60

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile

65

70

75

80

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr

Cys

Trp

Gln

Gly

85

90

95

Thr

His

Phe

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

110

Arg <210>25 <211>113 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Вариабельная область легкой цепи LC <400> 25

Asp Val 1

Val

Met

Thr Gln 5

Ser

Pro

Leu

Ser 10

Leu

Pro Val

Thr

Leu Gly 15

Gln

Pro

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Lys

Ser

Ser

Gln

Ser

Leu

Leu

Asp

Ser

20

25

30

Asp

Gly

Lys

Thr

Tyr

Leu

Asn

Trp

Leu

Phe

Gln

Arg

Pro

Gly

Gln

Ser

35

40

45

- 41 031069

Pro Arg 50

Arg

Leu

Ile

Tyr

Leu 55

Val

Ser

Glu Leu

Asp 60

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile

65

70

75

80

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr

Cys

Trp

Gln

Gly

85

90

95

Thr

His

Phe

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

110

Arg <210> 26 <211> 113 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Вариабельная область легкой цепи LD <400> 26

Asp 1

Val

Val

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Leu

Ser Leu 10

Pro Val

Thr

Leu 15

Gly

Gln

Pro

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Lys

Ser

Ser

Gln

Ser

Leu

Leu

Asp

Ser

20

25

30

Asp

Gly

Lys

Thr

Tyr

Leu

Asn

Trp

Phe

Gln

Gln

Arg

Pro

Gly

Gln

Ser

35

40

45

Pro

Lys

Arg

Leu

Ile

Tyr

Leu

Val

Ser

Glu

Leu

Asp

Ser

Gly

Val

Pro

50

55

60

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile

65

70

75

80

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr

Cys

Trp

Gln

Gly

85

90

95

Thr

His

Phe

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

110

Arg

- 42 031069 <210> 27 <211> 113 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Вариабельная область легкой цепи LE <400> 27

Asp 1

Val

Val

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Leu

Ser Leu 10

Pro Val

Thr

Leu 15

Gly

Gln

Pro

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Lys

Ser

Ser

Gln

Ser

Leu

Leu

Asp

Ser

20

25

30

Asp

Gly

Lys

Thr

Tyr

Leu

Asn

Trp

Phe

Gln

Gln

Arg

Pro

Gly

Gln

Ser

35

40

45

Pro

Arg

Arg

Leu

Ile

Tyr

Leu

Val

Ser

Glu

Leu

Asp

Ser

Gly

Val

Pro

50

55

60

Asp

Arg

Phe

Thr

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile

65

70

75

80

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr

Cys

Trp

Gln

Gly

85

90

95

Thr

His

Phe

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

110

Arg <210> 28 <211> 113 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Вариабельная область легкой цепи LF <400> 28

Asp Val 1

Val

Met

Thr Gln 5

Ser

Pro

Leu

Ser 10

Leu

Pro Val

Thr

Leu Gly 15

Gln

Pro

Ala

Ser

Leu

Phe

Cys

Lys

Ser

Ser

Gln

Ser

Leu

Leu

Asp

Ser

20

25

30

Asp

Gly

Lys

Thr

Tyr

Leu

Asn

Trp

Leu

Phe

Gln

Arg

Pro

Gly

Gln

Ser

35

40

45

- 43 031069

Pro

Lys 50

Arg

Leu

Ile

Tyr Leu 55

Val

Ser

Glu

Leu

Asp 60

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Thr

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile

65

70

75

80

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr

Cys

Trp

Gln

Gly

85

90

95

Thr

His

Phe

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

110

Arg <210> 29 <211> 113 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Вариабельная область легкой цепи LG <400> 29

Asp Val 1

Val

Leu

Thr 5

Gln Ser

Pro

Leu

Ser 10

Leu

Pro Val

Thr

Leu 15

Gly

Gln

Pro

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Lys

Ser

Ser

Gln

Ser

Leu

Leu

Asp

Ser

20

25

30

Asp

Gly

Lys

Thr

Tyr

Leu

Asn

Trp

Leu

Phe

Gln

Arg

Pro

Gly

Gln

Ser

35

40

45

Pro

Arg

Arg

Leu

Ile

Tyr

Leu

Val

Ser

Glu

Leu

Asp

Ser

Gly

Val

Pro

50

55

60

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile

65

70

75

80

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr

Cys

Trp

Gln

Gly

85

90

95

Thr

His

Phe

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

110

Arg

- 44 031069

<210> <211> <212> <213>

30 330 Белок Искусственная

<220>

<223> Константная область тяжелой цепи IgG1 человека <400> 30

Ala 1

Ser

Thr

Lys

Gly 5

Pro

Ser

Val

Phe

Pro 10

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser 15

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

20

25

30

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

35

40

45

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gln

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

50

55

60

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gln

Thr

65

70

75

80

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

85

90

95

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

100

105

110

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

115

120

125

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

130

135

140

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

145

150

155

160

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

165

170

175

Glu

Gln

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

180

185

190

His

Gln

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

195

200

205

- 45 031069

Lys

Ala 210

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile 215

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser 220

Lys

Ala

Lys

Gly

Gln

Pro

Arg

Glu

Pro

Gln

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

225

230

235

240

Leu

Thr

Lys

Asn

Gln

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

245

250

255

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gln

Pro

Glu

Asn

260

265

270

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

275

280

285

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gln

Gln

Gly

Asn

290

295

300

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

305

310

315

320

Gln

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

325 330 <210> 31 <211> 106 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223>

Константный домен легкой цепи каппа человека

<400>

31

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gln

1

5

10

15

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

20

25

30

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gln

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gln

Ser

35

40

45

Gly

Asn

Ser

Gln

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gln

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

50

55

60

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

65

70

75

80

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gln

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

- 46 031069

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100105 <210>32 <211>330 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> S239C мутант константной области тяжелой цепи IgG1 человека <400> 32

Ala 1

Ser

Thr

Lys

Gly 5

Pro

Ser

Val

Phe

Pro 10

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser 15

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

20

25

30

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

35

40

45

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gln

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

50

55

60

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gln

Thr

65

70

75

80

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

85

90

95

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

100

105

110

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro

Cys

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

115

120

125

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

130

135

140

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

145

150

155

160

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

165

170

175

Glu

Gln

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

180

185

190

- 47 031069

His

Gln

Asp 195

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys 200

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys 205

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

210

215

220

Gln

Pro

Arg

Glu

Pro

Gln

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

225

230

235

240

Leu

Thr

Lys

Asn

Gln

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

245

250

255

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gln

Pro

Glu

Asn

260

265

270

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

275

280

285

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gln

Gln

Gly

Asn

290

295

300

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

305

310

315

320

Gln

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

325

330

<210> 33 <211> 19 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Сигнальный пептид вариабельной области тяжелой цепи мыши <400>33

Met Gly Trp Ser Cys Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Val Gly

5 1015

Val Phe Ser <210>34 <211>19 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Сигнальный пептид вариабельной области тяжелой цепи человека

- 48 031069 <400>34

Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser

5 1015

Ala Gln Ala

<210> <211> <212> <213>

35 19 Белок Искусственная

<220> <223>	Сигнальный пептид вариабельной области легкой цепи мыши
<400>	35

Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg Glu

5 1015

Thr Asn Gly

<210> <211> <212> <213>

36 19 Белок Искусственная

<220> <223>	Сигнальный пептид вариабельной области легкой цепи человека
<400>	36

Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala

5 1015

Ser Ser Ser <210>37 <211>351 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи мыши <400> 37

gaggttcagc	tgcagcagtc	tggacctgag	ttggtgaaac	ctggggcttc	agtgaagata	60
tcctgcaagg	cttctggtta	ttcatttagt	ggctacttta	tgaactgggt	gaaacagagc	120
catggacaga	gccttgagtg	gattggactt	attaatcctt	acaatggaga	ctctttttac	180
aatcagaagt	tcaagggcaa	ggccacattg	actgtacaga	agtcctctag	tacagcccac	240

- 49 031069 atggaactcc agagcctgac atctgaagac tctgcagtct tttattgtgt tagagggtta cgacgggact ttgactattg gggccaaggc acccctctca cagtctcctc a

300

351 <210> 38 <211> 339 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Вариабельная область легкой цепи мыши <400> 38

gatgttgtgt	tgacccagat	tccactcact	ttgtcggtta	ccattggaca	accagcctcc	60
ctcttttgta	agtcaagtca	gagcctctta	gatagtgatg	gaaagacata	tttgaattgg	120
ttatttcaga	ggccaggcca	gtctccaaag	cgccttattt	atctggtgtc	tgaactggac	180
tctggagtcc	ctgacaggtt	cactggcagt	ggatcaggga	cagatttcac	actgaaaatc	240
agcagagtgg	aggctgagga	tttgggagtt	tattattgct	ggcaaggtac	acattttcct	300
cggacgttcg	gtggaggcac	caagctggaa	atcaaacgg			339

<210> 39 <211> 351 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи HA <400> 39

caggtgcagc	tggtgcagtc	tggagctgag	gtgaagaagc	ctggagcctc	tgtgaaggtg	60
tcctgtaagg	cctctggcta	caccttcaca	ggctacttca	tgaactgggt	gaggcaggcc	120
cctggccagg	gcctggagtg	gatgggcctg	atcaaccctt	acaatggaga	ctccttctac	180
aaccagaagt	tcaagggcag	ggtgaccatg	accagggaca	cctccacctc	cacagtgtac	240
atggagctgt	cctccctgag	gtctgaggac	acagctgtgt	actactgtgc	caggggcctg	300
aggagggact	ttgactactg	gggccagggc	accctggtga	cagtgtcctc	c	351

<210>	40
<211>	351
<212>	ДНК
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Вариабельная область тяжелой цепи HB
<400>	40
caggtgcagc tggtgcagtc	tggagctgag	gtgaagaagc	ctggagcctc	tgtgaaggtg	60
tcctgtaagg cctctggcta	cagcttctct	ggctacttca	tgaactgggt	gaggcaggcc	120

- 50 031069

cctggccagg	gcctggagtg	gatgggcctg	atcaaccctt	acaatggaga	ctccttctac	180
aaccagaagt	tcaagggcag	ggtgaccatg	accagggaca	cctccacctc	cacagtgtac	240
atggagctgt	cctccctgag	gtctgaggac	acagctgtgt	actactgtgc	caggggcctg	300
aggagggact	ttgactactg	gggccagggc	accctggtga	cagtgtcctc	c	351

<210> 41 <211> 351 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи HL <400> 41

caggtgcagc	tggtgcagtc	tggagctgag	gtgaagaagc	ctggagcctc	tgtgaaggtg	60
tcctgtaagg	cctctggcta	cagcttctct	ggctacttca	tgaactgggt	gaggcaggcc	120
cctggccagg	gcctggagtg	gatgggcctg	atcaaccctt	acaatggaga	ctccttctac	180
aaccagaagt	tcaagggcag	ggtgaccatg	accagggaca	agtcctcctc	cacagcttac	240
atggagctgt	cctccctgag	gtctgaggac	acagctgtgt	actactgtgc	caggggcctg	300
aggagggact	ttgactactg	gggccagggc	accctggtga	cagtgtcctc	c	351

<210> 42 <211> 351 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи HT <400> 42

caggtgcagc	tggtgcagtc	tggagctgag	gtgaagaagc	ctggagcctc	tgtgaaggtg	60
tcctgtaagg	cctctggcta	cagcttctct	ggctacttca	tgaactgggt	gaggcaggcc	120
cctggccagg	gcctggagtg	gatgggcctg	atcaaccctt	acaatggaga	ctccttctac	180
aaccagaagt	tcaagggcag	ggtgaccatg	accaggcaga	cctccacctc	cacagtgtac	240
atggagctgt	cctccctgag	gtctgaggac	acagctgtgt	actactgtgt	caggggcctg	300
aggagggact	ttgactactg	gggccagggc	accctggtga	cagtgtcctc	c	351

<210>	43
<211>	351
<212>	ДНК
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Вариабельная область тяжелой цепи HN
<400>	43
caggtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggagcctc tgtgaaggtg	60

- 51 031069

tcctgtaagg	cctctggcta	cagcttctct	ggctacttca	tgaactgggt	gaggcaggcc	120
cctggccagg	gcctggagtg	gatgggcctg	atcaaccctt	acaatggaga	ctccttctac	180
aaccagaagt	tcaagggcag	ggtgaccatg	accaggcaga	cctccacctc	cacagtgtac	240
atggagctgt	cctccctgag	gtctgaggac	acagctgtgt	actactgtgc	caggggcctg	300
aggagggact	ttgactactg	gggccagggc	accctggtga	cagtgtcctc	c	351

<210> 44 <211> 351 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи HU <400> 44

caggtgcagc	tggtgcagtc	tggagctgag	gtgaagaagc	ctggagcctc	tgtgaaggtg	60
tcctgtaagg	cctctggcta	cagcttctct	ggctacttca	tgaactgggt	gaggcaggcc	120
cctggccagg	gcctggagtg	gatgggcctg	atcaaccctt	acaatggaga	ctccttctac	180
aaccagaagt	tcaagggcag	ggtgaccatg	accaggcaga	agtcctcctc	cacagcttac	240
atggagctgt	cctccctgag	gtctgaggac	acagctgtgt	actactgtgt	caggggcctg	300
aggagggact	ttgactactg	gggccagggc	accctggtga	cagtgtcctc	c	351

<210> 45 <211> 339 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Вариабельная область легкой цепи LA <400> 45

gatgtggtga	tgacccagtc	ccctctgtcc	ctgcctgtga	ccctgggcca	gcctgcctcc	60
atctcctgta	agtcctccca	gtccctgctg	gactctgatg	gcaagaccta	cctgaactgg	120
ttccagcaga	ggcctggcca	gtcccctagg	aggctgatct	acctggtgtc	tgagctggac	180
tctggagtgc	ctgacaggtt	ctctggctct	ggctctggca	cagacttcac	cctgaagatc	240
tccagggtgg	aggctgagga	tgtgggagtg	tactactgtt	ggcagggcac	ccacttccct	300
aggacctttg	gaggtggaac	caagctggag	atcaagcgt			339

<210> 46 <211> 339 <212> ДНК <213> Искусственная <223> Вариабельная область легкой цепи LC <220>

- 52 031069 <400> 46

gatgtggtga	tgacccagtc	ccctctgtcc	ctgcctgtga	ccctgggcca	gcctgcctcc	60
atctcctgta	agtcctccca	gtccctgctg	gactctgatg	gcaagaccta	cctgaactgg	120
ctgttccaga	ggcctggcca	gtcccctagg	aggctgatct	acctggtgtc	tgagctggac	180
tctggagtgc	ctgacaggtt	ctctggctct	ggctctggca	cagacttcac	cctgaagatc	240
tccagggtgg	aggctgagga	tgtgggagtg	tactactgtt	ggcagggcac	ccacttccct	300
aggacctttg	gaggtggaac	caagctggag	atcaagcgt			339

<210> 47 <211> 339 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Вариабельная область легкой цепи LF <400> 47 gatgtggtga ctgttctgta ctgttccaga tctggagtgc tccagggtgg aggacctttg tgacccagtc agtcctccca ggcctggcca ctgacaggtt aggctgagga gaggtggaac ccctctgtcc gtccctgctg gtcccctaag cacaggctct tgtgggagtg caagctggag ctgcctgtga gactctgatg aggctgatct ggctctggca tactactgtt atcaagcgt ccctgggcca gcaagaccta acctggtgtc cagacttcac ggcagggcac gcctgcctcc cctgaactgg tgagctggac cctgaagatc ccacttccct

120

180

240

300

339 <210> 48 <211> 339 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Вариабельная область легкой цепи LG <400> 48

gatgtggtgc	tgacccagtc	ccctctgtcc	ctgcctgtga	ccctgggcca	gcctgcctcc	60
atctcctgta	agtcctccca	gtccctgctg	gactctgatg	gcaagaccta	cctgaactgg	120
ctgttccaga	ggcctggcca	gtcccctagg	aggctgatct	acctggtgtc	tgagctggac	180
tctggagtgc	ctgacaggtt	ctctggctct	ggctctggca	cagacttcac	cctgaagatc	240
tccagggtgg	aggctgagga	tgtgggagtg	tactactgtt	ggcagggcac	ccacttccct	300
aggacctttg	gaggtggaac	caagctggag	atcaagcgt			339

<210>	49
<211>	57
<212>	ДНК
<213>	Искусственная

- 53 031069 <220>

<223> Сигнальный пептид вариабельной области тяжелой цепи мыши <400>49 atgggatgga gctgtatctt tctctttctc ctgtcagtaa ctgtaggtgt gttctct <210>50 <211>57 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Сигнальный пептид вариабельной области тяжелой цепи человека <400>50 atggcttggg tgtggacctt gctattcctg atggcagctg cccaaagtgc ccaagca <210>51 <211>57 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Сигнальный пептид вариабельной области легкой цепи мыши <400>51 atgagtcctg cccagttcct gtttctgtta gtgctctgga ttcgggaaac caacggt <210>52 <211>57 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Сигнальный пептид вариабельной области легкой цепи человека <400>52 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagt <210>53 <211>990 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Константная область тяжелой цепи IgG1 человека <400> 53 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc

120

180

240

300

- 54 031069

aaatcttgtg	acaaaactca	cacatgccca	ccgtgcccag	cacctgaact	cctgggggga	360
ccgtcagtct	tcctcttccc	cccaaaaccc	aaggacaccc	tcatgatctc	ccggacccct	420
gaggtcacat	gcgtggtggt	ggacgtgagc	cacgaagacc	ctgaggtcaa	gttcaactgg	480
tacgtggacg	gcgtggaggt	gcataatgcc	aagacaaagc	cgcgggagga	gcagtacaac	540
agcacgtacc	gtgtggtcag	cgtcctcacc	gtcctgcacc	aggactggct	gaatggcaag	600
gagtacaagt	gcaaggtctc	caacaaagcc	ctcccagccc	ccatcgagaa	aaccatctcc	660
aaagccaaag	ggcagccccg	agaaccacag	gtgtacaccc	tgcccccatc	ccgggatgag	720
ctgaccaaga	accaggtcag	cctgacctgc	ctggtcaaag	gcttctatcc	cagcgacatc	780
gccgtggagt	gggagagcaa	tgggcagccg	gagaacaact	acaagaccac	gcctcccgtg	840
ctggactccg	acggctcctt	cttcctctac	agcaagctca	ccgtggacaa	gagcaggtgg	900
cagcagggga	acgtcttctc	atgctccgtg	atgcatgagg	ctctgcacaa	ccactacacg	960
cagaagagcc	tctccctgtc	tccgggtaaa				990

<210> 54 <211> 318 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Константный домен легкой цепи каппа человека <400> 54

actgtggcgg	cgccatctgt	cttcatcttc	ccgccatctg	atgagcagtt	gaaatctgga	60
actgcctctg	ttgtgtgcct	gctgaataac	ttctatccca	gagaggccaa	agtacagtgg	120
aaggtggata	acgccctcca	atcgggtaac	tcccaggaga	gtgtcacaga	gcaggacagc	180
aaggacagca	cctacagcct	cagcagcacc	ctgacgctga	gcaaagcaga	ctacgagaaa	240
cacaaagtct	acgcctgcga	agtcacccat	cagggcctga	gctcgcccgt	cacaaagagc	300
ttcaacaggg	gagagtgt					318

<210> 55 <211> 990 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> S239C мутант константной области тяжелой цепи IgG1 человека <400> 55

gctagcacca	agggcccatc	tgtcttcccc	ctggcaccct	cctccaagag	cacctctggg	60
ggcacagctg	ccctgggctg	cctggtcaag	gactacttcc	ctgaacctgt	gacagtgtcc	120
tggaactcag	gcgccctgac	cagcggcgtg	cacaccttcc	cggctgtcct	acagtcctca	180
ggactctact	ccctcagcag	cgtggtgacc	gtgccctcca	gcagcttggg	cacccagacc	240

- 55 031069

tacatctgca	acgtgaatca	caagcccagc	aacaccaagg	tggacaagaa	agttgagccc	300
aaatcttgtg	acaaaactca	cacatgccca	ccgtgcccag	cacctgaact	cctgggggga	360
ccgtgtgtct	tcctcttccc	cccaaaaccc	aaggacaccc	tcatgatctc	ccggacccct	420
gaggtcacat	gcgtggtggt	ggacgtgagc	cacgaagacc	ctgaggtcaa	gttcaactgg	480
tacgtggacg	gcgtggaggt	gcataatgcc	aagacaaagc	cgcgggagga	gcagtacaac	540
agcacgtacc	gtgtggtcag	cgtcctcacc	gtcctgcacc	aggactggct	gaatggcaag	600
gagtacaagt	gcaaggtctc	caacaaagcc	ctcccagccc	ccatcgagaa	aaccatctcc	660
aaagccaaag	ggcagccccg	agaaccacag	gtgtacaccc	tgcccccatc	ccgggatgag	720
ctgaccaaga	accaggtcag	cctgacctgc	ctggtcaaag	gcttctatcc	cagcgacatc	780
gccgtggagt	gggagagcaa	tgggcagccg	gagaacaact	acaagaccac	gcctcccgtg	840
ctggactccg	acggctcctt	cttcctctac	agcaagctca	ccgtggacaa	gagcaggtgg	900
cagcagggga	acgtcttctc	atgctccgtg	atgcatgagg	ctctgcacaa	ccactacaca	960
cagaagagcc	tctccctgtc	tccgggtaaa				990

Claims (1)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Выделенное моноклональное антитело 15H3 мыши, которое специфично связывается с интегрином ανβ6, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит последовательность SEQ ID NO:1, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит последовательность SEQ ID N0:2.

   2. Выделенное моноклональное антитело, которое специфично связывается с интегрином ανβ6, содержащее последовательности гипервариабельных участков (CDR) тяжелой цепи SEQ ID N0:3 (CDR1), SEQ ID N0:4 (CDR2) и SEQ ID N0:5 (CDR3) и последовательности CDR легкой цепи SEQ ID N0:6 (CDR4), SEQ ID N0:7 (CDR5) и SEQ ID N0:8 (CDR6) и не имеющее консервативных аминокислотных замен или имеющее 1, 2 или 3 консервативные аминокислотные замены в каждом CDR.

   3. Гуманизированное моноклональное антитело, которое специфично связывается с интегрином ανβ6, содержащее вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 90% идентична HA (SEQ ID N0:9), при условии наличия по меньшей мере одной обратной мутации в каркасном участке вариабельной области тяжелой цепи, происходящей из антитела мыши 15H3, и при условии, что антитело содержит последовательности гипервариабельных участков (CDR) тяжелой цепи SEQ ID N0:3 (CDR1), SEQ ID N0:4 (CDR2) и SEQ ID N0:5 (CDR3) и не имеет аминокислотных замен или имеет 1, 2 или 3 консервативные аминокислотные замены в каждом CDR; или содержащее вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 90% идентична LA последовательности (SEQ ID N0:10), при условии, что антитело содержит последовательности гипервариабельных участков (CDR) легкой цепи SEQ ID N0:6 (CDR1), SEQ ID N0:7 (CDR2) и SEQ ID N0:8 (CDR3) и не имеет аминокислотных замен или имеет 1, 2 или 3 консервативные аминокислотные замены в каждом CDR.

   4. Антитело по п.2 или 3, где антитело содержит последовательности гипервариабельных участков (CDR) тяжелой цепи SEQ ID N0:3 (CDR1), SEQ ID N0:4 (CDR2) и SEQ ID N0:5 (CDR3) и последовательности CDR легкой цепи SEQ ID N0:6 (CDR4), SEQ ID N0:7 (CDR5) и SEQ ID N0:8 (CDR6).

   5. Антитело по п.2, содержащее вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 90% идентична HA (SEQ ID N0:9), при условии наличия по меньшей мере одной обратной мутации в каркасном участке вариабельной области тяжелой цепи, происходящей из антитела мыши 15H3, и при условии, что антитело содержит последовательности гипервариабельных участков (CDR) тяжелой цепи SEQ ID N0:3 (CDR1), SeQ ID N0:4 (CDR2) и SEQ ID N0:5 (CDR3) и не имеет аминокислотных замен или имеет 1, 2 или 3 консервативные аминокислотные замены в каждом CDR; и содержащее вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 90% идентична LA (SEQ ID N0:10), при условии, что антитело со

   - 56 031069 держит последовательности гипервариабельных участков (CDR) легкой цепи SEQ ID NO:6 (CDR1), SEQ ID NO:7 (CDR2) и SEQ ID NO:8 (CDR3) и не имеет аминокислотных замен или имеет 1, 2 или 3 консервативные аминокислотные замены в каждом CDR.

   6. Антитело по пп.2, 3 или 5, содержащее CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO:5, CDR3 легкой цепи SEQ ID NO:8 и не имеющее аминокислотных замен или имеющее 1, 2 или 3 консервативные аминокислотные замены в остальных CDRs.

   7. Антитело по п.5 или 6, где антитело представляет собой гуманизированное антитело, в котором имеется по меньшей мере один аминокислотный остаток в акцепторном каркасном участке вариабельной области, замененный на аминокислотный остаток, который присутствует в соответствующем положении донорного антитела 15H3 мыши.

   8. Гуманизированное антитело по п.7, в котором имеется по меньшей мере два аминокислотных остатка в акцепторном каркасном участке вариабельной области, замененных на аминокислотные остатки, которые присутствуют в соответствующих положениях донорного антитела 15H3 мыши.

   9. Гуманизированное антитело по п.7, в котором по меньшей мере одно из положений H28 и H30 HA занимает S, при этом нумерация соответствует системе нумерации по Kabat.

   10. Гуманизированное антитело по п.9, где оба положения H28 и H30 заняты S.

   11. Гуманизированное антитело по п.10, в котором положение H72 занимает D или Q, положение H73 занимает T или K, положение H75 занимает T или S, положение H78 занимает V или A и положение 93 занимает A или V.

   12. Антитело по любому из пп.1-11, где антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность LA (SEQ ID NO: 10), за исключением того, что положение L4 занимает M или L, положение L21 занимает I или L, положение L22 занимает S или F, положение L36 занимает F или L, положение L37 занимает Q или F, положение L45 занимает R или K, положение L63 занимает S или T, при этом нумерация соответствует системе нумерации по Kabat.

   13. Антитело по любому из пп.1-12, где антитело представляет собой гуманизированное антитело, и вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность HB (SEQ ID NO:11), HT (SEQ ID NO:22), HL (SEQ ID NO:15), HU (SEQ ID NO:23), HM (SEQ ID NO:16) или HN (SEQ ID NO:17).

   14. Антитело по любому из пп.1-13, в котором вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность LA (SEQ ID NO:10), LB (SEQ ID NO:24), LC (SEQ ID NO:25), LD (SEQ ID NO:26), LE (SEQ ID NO:27), LF (SEQ ID NO:28) или LG (SEQ ID NO:29).

   15. Гуманизированное антитело по п.11, имеющее вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью HB (SEQ ID NO:11) и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью LA (SEQ ID NO:10), LB (SEQ ID NO:24), LC (SEQ ID NO:25), LD (SEQ ID NO:26), LE (SEQ ID NO:27), LF (SEQ ID NO:28) или LG (SEQ ID NO:29); имеющее вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью HT (SEQ ID NO:22) и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью LA (SEQ ID NO:10), LB (SEQ ID NO:24), LC (SEQ ID NO:25), LD (SEQ ID NO:26), LE (SEQ ID NO:27), LF (SEQ ID NO:28) или LG (SEQ ID NO:29); имеющее вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью HL (SEQ ID NO:15) и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью LA (SEQ ID NO: 10), LB (SEQ ID NO:24), LC (SEQ ID NO:25), LD (SEQ ID NO:26), LE (SEQ ID NO:27), LF (SEQ ID NO:28) или LG (SEQ ID NO:29); имеющее вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью HU (SEQ ID NO:23) и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью LA (SEQ ID NO:10), LB (SEQ ID NO:24), LC (SEQ ID NO:25), LD (SEQ ID NO:26), LE (SEQ ID NO:27), LF (SEQ ID NO:28) или LG (SEQ ID NO:29); имеющее вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью HN (SEQ ID NO:17) и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью LA (SEQ ID NO:10), LB (SEQ ID NO:24), LC (SEQ ID NO:25), LD (SEQ ID NO:26), LE (SEQ ID NO:27), LF (SEQ ID NO:28) или LG (SEQ ID NO:29); или имеющее вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью HM (SEQ ID NO:16) и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью LA (SEQ ID NO:10), LB (SEQ ID NO:24), LC (SEQ ID NO:25), LD (SEQ ID NO:26), LE (SEQ ID NO:27), LF (SEQ ID NO:28) или LG (SEQ ID NO:29).

   16. Антитело по любому из пп.2-15, в котором вариабельная область тяжелой цепи слита с константной областью тяжелой цепи человека, и вариабельная область легкой цепи слита с константной областью легкой цепи человека.

   17. Антитело по п.16, в котором константная область тяжелой цепи представляет собой мутантную форму природной константной области человека, обладающую уменьшенным связыванием с Fc-гамма рецептором, по сравнению с природной константной областью человека.

   18. Антитело по п.16, в котором константная область тяжелой цепи представляет собой область изотипа IgG1.

   19. Антитело по любому из пп.1-18, где антитело конъюгировано с цитотоксическим средством.

   20. Антитело по любому из пп.1-19, имеющее 5-кратную аффинность к ανβ6 по сравнению с антителом 15H3 мыши.

   - 57 031069 из из из из пп.1-20, имеющее 2-кратную аффинность к ανβ6 по сравнению с антипп.1-21, имеющее кажущуюся константу диссоциации (KD) для ανβ6 пп.1-22, имеющее кажущуюся константу диссоциации (KD) для ανβ6 пп.1-23, имеющее кажущуюся константу диссоциации (KD) для ανβ6

   21. Антитело по любому телом 15H3 мыши.

   22. Антитело по любому пределах от 0,1 до 5 нМ.

   23. Антитело по любому пределах от 0,1 до 2 нМ.

   24. Антитело по любому пределах от 0,5 до 1,5 нМ.

   25. Антитело по любому из пп.1-24, которое является очищенным.

   26. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, которые определены в любом из пп.1-18.

   27. Способ лечения пациента, страдающего злокачественным новообразованием, включающий введение пациенту антитела по любому из пп.2-25.

   28. Способ по п.27, где злокачественное новообразование представляет собой рак мочевого пузыря, рак головы и шеи, рак кожи, рак легкого, рак поджелудочной железы, рак матки, рак толстой кишки, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак яичников и рак желудка.

   29. Способ по п.27, где рак представляет собой плоскоклеточные карциномы или аденокарциному.

   30. Фармацевтическая композиция для лечения злокачественного новообразования, содержащая антитело по любому из пп.2-25.

   JH15H3 VH hl5H3 HA hl5H3 HB ЫБНЗ HL hlSH3 HU hlSH3 HT

   Ы5НЗ HU

   H115H3 vH hl5H3 HA Ы5 H3 HE

   Ы5НЗ HL

   H15H3 HN hlSK3 HT h!5H3 HU

   П115НЗ VL

   Ы.БНЗ LA

   Ы5НЗ LC hlSHl LF h!5H3 XjG .V.

   ,.v.

   10 ... J. - - -1- · 1 · 20 |..I.. . 30 ......I.:. 40 . I... j .. 50 . .,l\i..T.S..i.. .. 'lf. /,,. / LF., / - . ,K. .

   к.

   LF . . .11FWMTQSPLSL PVTLGQPASISCKS SQSLLDS DGKTYLNWFQQRPGQ SPRRLIYLVS ELD • LF.

   .LF ,LF гй15НЗ vL

   L15H3 LA

   Ы5НЗ LC h!5H3 LF

   Ы5НЗ LG

   Т.

   9Q l·

   100

   1--.-1.

   Фиг. 1

   Фиг. 2

   - 58 031069 m15H3 h15H3(HBLC) h15H3(HTLC) m15H3 h15H3(HBLC) h15H3(HTLC)

   Тестовый образец Kd (нМ) т15НЗ 0.2 h15H3(HBLC) 0.6 h15H3(HTLC) 0.3

   Фиг. 3A-C

   Конкурентное связывание hi5H3 c hu B6

   Конкурент (нМ)

   Фиг. 4

   Фиг. 5

   Фиг. 6

   - 59 031069 (AF488 = 1 нМ)

   Конкурентное связывание

   293F

   Конкурент (нМ)

   Фиг. 7 h15H3 HBLC h15H3 HLLC h15H3 HSLC

   И15НЗ HTLC

   И15НЗ HULC

   Множественная опухоль человека: мочевой пузырь (USBIomax: МС50021 13/20 (65%) = avB6+ (ITGb6-RD)

   Интенсивность окрашивания

   Фиг. 8

   - 60 031069

   Активность h15H3-vcMMAE(4) на клетках Detroit 562 карциномы головы и шеи □etroit562-F лечения

   Ξ(4}1 МГ/КГ : 4 внутрибрюшинно, η = 10

   Фиг. 10

   M5H3-VcMMAE(4) 1 МГ/КГ

   - ό1 031069