EA028880B1 - Способ ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного материала и ферментации сахаров - Google Patents

Способ ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного материала и ферментации сахаров Download PDF

Info

Publication number
EA028880B1
EA028880B1 EA201500510A EA201500510A EA028880B1 EA 028880 B1 EA028880 B1 EA 028880B1 EA 201500510 A EA201500510 A EA 201500510A EA 201500510 A EA201500510 A EA 201500510A EA 028880 B1 EA028880 B1 EA 028880B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
oxygen
hydrolysis
added
enzymatic hydrolysis
enzyme
Prior art date
Application number
EA201500510A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201500510A1 (ru
EA028880B9 (ru
Inventor
Михаэл Петрус Йозеф Беркхаут
Аида Хисени
Бертус Нордам
Original Assignee
ДСМ АйПи АССЕТС Б.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49554250&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA028880(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. filed Critical ДСМ АйПи АССЕТС Б.В.
Publication of EA201500510A1 publication Critical patent/EA201500510A1/ru
Publication of EA028880B1 publication Critical patent/EA028880B1/ru
Publication of EA028880B9 publication Critical patent/EA028880B9/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C12P7/10—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing cellulosic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/02—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic
    • C12P5/026—Unsaturated compounds, i.e. alkenes, alkynes or allenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/16—Butanols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C12P7/20—Glycerol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/48—Tricarboxylic acids, e.g. citric acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/54—Acetic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P2203/00—Fermentation products obtained from optionally pretreated or hydrolyzed cellulosic or lignocellulosic material as the carbon source
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/30—Fuel from waste, e.g. synthetic alcohol or diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

Изобретение относится к способу получения сахарного продукта из лигноцеллюлозного материала, включающему следующие стадии: a) необязательно, предварительная обработка лигноцеллюлозного материала; b) необязательно, промывка необязательно предварительно обработанного лигноцеллюлозного материала; с) ферментативный гидролиз необязательно промытого и/или необязательно предварительно обработанного лигноцеллюлозного материала с применением ферментной композиции, включающей по меньшей мере две целлюлазы и при условии, что ферментная композиция, по меньшей мере, включает GH61; и d) необязательно, извлечение сахарного продукта; в котором в течение части времени ферментативного гидролиза к лигноцеллюлозному материалу добавляют кислород и в течение части времени ферментативного гидролиза к лигноцеллюлозному материалу добавляют меньше кислорода по сравнению с другой частью времени ферментативного гидролиза, предпочтительно кислород не добавляют к лигноцеллюлозному материалу.

Description

Изобретение относится к способу получения сахарного продукта из лигноцеллюлозного материала, включающему следующие стадии: а) необязательно, предварительная обработка лигноцеллюлозного материала; Ъ) необязательно, промывка необязательно предварительно обработанного лигноцеллюлозного материала; с) ферментативный гидролиз необязательно промытого и/или необязательно предварительно обработанного лигноцеллюлозного материала с применением ферментной композиции, включающей по меньшей мере две целлюлазы и при условии, что ферментная композиция, по меньшей мере, включает СН61; и б) необязательно, извлечение сахарного продукта; в котором в течение части времени ферментативного гидролиза к лигноцеллюлозному материалу добавляют кислород и в течение части времени ферментативного гидролиза к лигноцеллюлозному материалу добавляют меньше кислорода по сравнению с другой частью времени ферментативного гидролиза, предпочтительно кислород не добавляют к лигноцеллюлозному материалу.
028880
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к способу ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного материала и ферментации сахаров.
Уровень техники
Лигноцеллюлозный растительный материал, в настоящем документе также называемый исходным сырьем, представляет собой возобновляемый источник энергии в форме сахаров, которые могут быть превращены в ценные продукты, например в сахара или биотопливо, такое как биоэтанол. Во время этого процесса (лигно- или геми)-целлюлоза, присутствующая в исходном сырье, таком как пшеничная солома, кукурузная солома, рисовая шелуха и т.п., конвертируется в редуцирующие сахара с помощью ферментов, воздействующих на (геми)-целлюлозу, которые, при необходимости, под воздействием микроорганизмов, таких как дрожжи, бактерии и грибы, конвертируются затем в ценные продукты, такие как этанол.
Поскольку (геми)-целлюлоза представляет собой кристаллическое вещество, заключенное в сети лигнина, ее конверсия в редуцирующие сахара в целом протекает медленно и не полностью. Как правило, ферментативный гидролиз необработанного исходного сырья дает выход по сахарам < 20% от теоретического количества. После применения химической и термофизической предварительной обработки (геми)-целлюлоза становится более доступной для действия целлюлолитических ферментов, и, таким образом, конверсия протекает быстрее и дает более высокие выходы.
Типичный выход этанола из глюкозы, полученной из предварительно обработанной кукурузной соломы, равен 40 галлонам этанола на 1000 кг сухой кукурузной соломы (ВаДдег, Ρ., Е1йаио1 Ггот се11и1оке: а депега1 ге\зе\у. ТгепДк ίη пего сгорк аиД пего икек, 2002, 1. 1атск аиД А. АЫркеу (еДк.) ΆδΗδ Ргекк, А1ехапДпа. УА) или 0,3 г этанола на г исходного сырья. Максимальный выход этанола по отношению к целлюлозе равен приблизительно 90%.
Целлюлолитические ферменты, большинство из которых продуцируются такими видами, как ТпсйоДегта, Нитюо1а и АкрегдШик, применяют в промышленности для конверсии предварительно обработанного исходного сырья в массу, содержащую нерастворимую (геми)целлюлозу, полученные из нее редуцирующие сахара и лигнин.
Целлюлолитические термостабильные ферменты, полученные из Какаткоша, применяют для разрушения исходного лигноцеллюлозного сырья, и данные ферменты известны своей термостабильностью, что описано в АО 2007091231. Полученную массу применяют для ферментации, в ходе которой редуцирующие сахара превращаются в дрожжевую биомассу (клетки), углекислый газ и этанол. Этанол, полученный таким образом, называют биоэтанолом.
Гидролиз, также называемый разжижение, предварительное осахаривание или осахаривание, представляет собой наиболее распространенный способ получения сахаров из предварительно обработанного лигноцеллюлозного исходного сырья, как правило, происходит в ходе процесса, длящегося от 6 до 168 ч (Китаг, δ., Сйет. Еид. Тесйио1. 32 (2009) 517-526) при повышенных температурах от 45 до 50°С и в нестерильных условиях. В ходе этого гидролиза присутствующая целлюлоза частично (как правило, от 30 до 95% в зависимости от активности ферментов и условий гидролиза) конвертируется в редуцирующих сахара. В случае ингибирования ферментов соединениями, присутствующими в предварительно обработанном исходном сырье, и высвободившимися сахарами, а также для того, чтобы свести к минимуму тепловую инактивацию, данный период повышения температуры сводят к минимуму, насколько это возможно.
Следующая за гидролизом ферментация протекает в ходе отдельной, предпочтительно анаэробной, стадии способа, или в том же самом, или в другом сосуде, в котором температуру снижают до 30-33°С (мезофильный способ) для приспособления к росту биомассы микроорганизмов, как правило, дрожжей, и продукции ею этанола. В ходе данного способа ферментации оставшийся (геми)целлюлозный материал конвертируется в редуцирующие сахара под действием ферментов, присутствующих еще со стадии гидролиза, в то время как нарастает биомасса микроорганизмов и производится этанол. Ферментацию заканчивают в тот момент, когда (геми)целлюлозный материал превращается в ферментируемые сахара, а все ферментируемые сахара превращаются в этанол, углекислый газ и составляющие клеток микроорганизмов. Это может продолжаться до 6 дней. В целом, общее время гидролиза и ферментации может достигать 13 дней.
Полученная таким образом ферментированная масса состоит из неферментируемых сахаров, негидролизуемого (геми)целлюлозного материала, лигнина, клеток микроорганизмов (чаще всего дрожжевых клеток), воды, этанола, растворенного углекислого газа. Во время последующих стадий этанол отгоняют из массы и дополнительно очищают. Оставшуюся суспензию твердых веществ высушивают и применяют в качестве, например, горючего, удобрения или корма для скота.
В АО 2010080407 предлагают обрабатывать целлюлозный материал композицией целлюлаз в анаэробных условиях. Удаление или исключение активных форм кислорода может повысить эффективность ферментных систем, гидролизующих целлюлозу. Гидролиз целлюлозного материала, например лигноцеллюлозы, под действием ферменной композиции может снижаться из-за окислительного повреждения компонентов ферменной композиции и/или окисления целлюлозного материала, например под действи- 1 028880
ем молекулярного кислорода.
В УО 2009046538 раскрыт способ обработки лигноцеллюлозного сырья из растительных материалов для высвобождения ферментируемых сахаров, где для обработки материалов применяется ферментативный гидролиз в вакууме, и в результате чего получают обогащенный по сахарам технологический поток, содержащий сниженное количество летучих сахаров/ингибирующих ферментацию соединений, таких как фурфурол и уксусная кислота. Помимо удаления летучих ингибирующих соединений также удаляются другие соединения и/или молекулы, в том числе азот, кислород, аргон и углекислый газ.
В каждую партию исходного сырья добавляют ферменты для того, чтобы сделать максимальным выход и скорость получения ферментируемых сахаров, высвобождающихся из предварительно обработанного лигноцеллюлозного сырья в течение заданного времени процесса. В целом, расходы на производство ферментов, отношение выхода этанола к количеству исходного сырья и иные инвестиции представляют собой основные факторы затрат в общей себестоимости производства (Китаг, 8. СЬет. Еид. ТесЬио1. 32 (2009) 517-526). До настоящего времени снижение затрат на используемые ферменты достигали путем применения ферментных препаратов из одного или из нескольких микробных источников (УО 2008/008793) с более широкой и/или высокой (специфической) гидролитической активностью, что позволяет снизить количество используемых ферментов, повысить скорость конверсии и/или повысить выход при конверсии, и, таким образом, снизить суммарные затраты при получении этанола в целом. Это требует больших инвестиций в научно-исследовательские разработки данных ферментных продуктов. В случае, когда ферментный продукт состоит из ферментов, происходящих из нескольких микробных источников, необходимы большие капиталовложения для производства каждого отдельного фермента.
Поэтому желательно усовершенствовать приведенный выше способ, включающий гидролиз и ферментацию.
Раскрытие изобретения
Таким образом, цель изобретения заключается в обеспечении способа, где стадию гидролиза проводят в усовершенствованных условиях. Другая цель изобретения заключается в обеспечении способа, включающего гидролиз с уменьшенным временем процесса. Еще одна цель изобретения заключается в обеспечении способа, в котором дозировка фермента может быть снижена и, в то же время, выход целевого продукта гидролиза сохранится на прежнем уровне или даже увеличится. Еще одна цель заключается в обеспечении способа, включающего гидролиз, в котором условия гидролиза оптимизируют. Еще одна цель изобретения заключается в обеспечении способа, включающего гидролиз, в котором выход целевого продукта гидролиза увеличивается при применении такой же дозировки фермента. Одна или несколько из этих целей достигается настоящим изобретением.
Настоящее изобретение обеспечивает способ получения сахарного продукта из лигноцеллюлозного материала, включающий следующие стадии:
a) необязательно, предварительная обработка лигноцеллюлозного материала;
b) необязательно, промывка необязательно предварительно обработанного лигноцеллюлозного материала;
c) ферментативный гидролиз необязательно промытого и/или необязательно предварительно обработанного лигноцеллюлозного материала с применением ферментной композиции, включающей по меньшей мере две целлюлазы, при условии, что ферментная композиция, по меньшей мере, включает ОН61; и
б) необязательно, извлечение сахарного продукта;
в котором в течение части времени ферментативного гидролиза, к лигноцеллюлозному материалу добавляют кислород и в течение части времени ферментативного гидролиза к лигноцеллюлозному материалу добавляют меньше кислорода по сравнению с другой частью времени ферментативного гидролиза, предпочтительно кислород вообще не добавляют к лигноцеллюлозному материалу.
Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ получения продукта ферментации из лигноцеллюлозного материала, включающий следующие стадии:
a) необязательно, предварительная обработка лигноцеллюлозного материала;
b) необязательно, промывка необязательно предварительно обработанного лигноцеллюлозного материала;
c) ферментативный гидролиз необязательно промытого и/или необязательно предварительно обработанного лигноцеллюлозного материала с применением ферментной композиции, включающей по меньшей мере две целлюлазы, при условии, что ферментная композиция, по меньшей мере, включает ОН61;
б) ферментация гидролизованного лигноцеллюлозного материала для получения продукта ферментации и
е) необязательно, извлечение продукта ферментации;
в котором в течение части времени ферментативного гидролиза к лигноцеллюлозному материалу добавляют кислород и в течение части времени ферментативного гидролиза к лигноцеллюлозному материалу добавляют меньше кислорода по сравнению с другой частью времени ферментативного гидролиза, предпочтительно кислород вообще не добавляют к лигноцеллюлозному материалу.
- 2 028880
В соответствии с предпочтительным воплощением изобретения часть времени, в течение которого добавляют меньше кислорода или предпочтительно не добавляют кислород, равна от 10 до 80%, предпочтительно от 20 до 80%, более предпочтительно от 30 до 80% и наиболее предпочтительно от 40 до 80% от общего времени ферментативного гидролиза.
В соответствии с другим предпочтительным воплощением изобретения часть времени, в течение которого добавляют больше кислорода, равна от 2 до 80%, предпочтительно от 4 до 60%, более предпочтительно от 8 до 50% и наиболее предпочтительно от 10 до 50% от общего времени ферментативного гидролиза, более предпочтительно часть времени, в течение которого добавляют больше кислорода, равна
a) от 12 до 50% и предпочтительно от 20 до 40%, если кислород добавляли во второй половине времени ферментативного гидролиза;
b) от 2 до 30%, предпочтительно от 4 до 25% и более предпочтительно от 5 до 20% от общего времени ферментативного гидролиза, если кислород добавляли в первой половине времени ферментативного гидролиза; или
c) или комбинация а) и Ь).
Преимущественно концентрация кислорода в жидкой фазе гидролиза в течение части времени, когда добавляют кислород, по меньшей мере в 2 раза, предпочтительно по меньшей мере в 4 раза, более предпочтительно по меньшей мере в 10 раз выше концентрации кислорода в жидкой фазе в течение части времени, когда кислорода добавляли меньше или кислород не добавляли.
В соответствии с дополнительным предпочтительным воплощением изобретения в части времени, когда кислород добавляли, концентрация кислорода в жидкой фазе, в которой присутствовал лигноцеллюлозный материал, в ходе ферментативного гидролиза, равна по меньшей мере 0,001 моль/м3, предпочтительно по меньшей мере 0,002 моль/м3 и наиболее предпочтительно по меньшей мере 0,003 моль/м3 и еще более предпочтительно более чем 0,01 моль/м3, например более чем 0,02 моль/м3 или 0,03 моль/м3. В реакторах объемом менее чем 1 м3 величины ΌΘ (концентрация растворенного кислорода) менее чем 0,01 моль/м3 или 0,02 моль/м3 будут получены при медленном перемешивании. Интенсивное смешивание или перемешивания при такой шкале вводит часть газовой фазы свободного пространства в реакционную жидкость. Например, смешивание или перемешивание может создать воронку, которая затянет кислород в жидкость. В целом, продувка свободного пространства кислородом (например, в виде воздуха) в комбинации с (энергичным) смешиванием или перемешиванием введет достаточно кислорода в целлюлозный материал в реактор для гидролиза для реакторов, размером вплоть до от 100 л до 1 м3. В более широком масштабе, например в реакторе размером 50 м3 или более, например 100 м3, так много энергии потребуется для энергичного перемешивания, что с экономической точки зрения это не найдет применения в способе промышленной эксплуатации. В целом в крупных реакторах перемешивание или смешивание без введения воздуха или кислорода приведет к величинам ΌΘ менее чем 0,01 моль/м3. В соответствии с еще одним предпочтительным воплощением изобретения при добавлении кислорода (в той части времени, когда кислород добавляли), концентрация кислорода в жидкой фазе, в которой присутствовал лигиоцеллюлозный материал, в ходе ферментативного гидролиза предпочтительно равна самое большее 80% от насыщающей концентрации кислорода в условиях протекания реакции гидролиза, более предпочтительно самое большее 0,12 моль/м3, еще более предпочтительно самое большее 0,09 моль/м3, еще более предпочтительно самое большее 0,06 моль/м3, даже еще более предпочтительно самое большее 0,045 моль/м3 и наиболее предпочтительно самое большее 0,03 моль/м3. Температура и давление влияют на ΌΘ. Приведенные выше предпочтительные и типичные величины, выраженные в моль/м3, относятся к нормальному атмосферному давлению и температуре, равной примерно 62°С. Специалисту в данной области техники известны подходящие величины ΌΘ на основе современных учений.
В соответствии с другим предпочтительным воплощением изобретения реактор для ферментативного гидролиза имеет объем, равный 1 м3 или более. Время протекания ферментативного гидролиза настоящего способа предпочтительно равно от 5 до 150 ч. В соответствии с дополнительным предпочтительным аспектом изобретения ферментную композицию получают из гриба, предпочтительно микроорганизма рода Какаткоша, или ферментная композиция включает фермент грибов, предпочтительно фермент Какаткоша. В соответствии с еще одним дополнительным предпочтительным аспектом изобретения содержание сухого вещества на стадии гидролиза с) равно 10 мас.% или более предпочтительно равно 14 мас.% или более и еще более предпочтительно равно от 14 до 33 мас.%. Ферментативный гидролиз предпочтительно протекает в реакторе периодического действия, в реакторе периодического действия с подпиткой и/или в реакторе для непрерывного культивирования. Предпочтительно кислород, который вводят в настоящем способе, представляет собой кислородсодержащий газ, такой как воздух. Термин "меньше кислорода добавляют к лигноцеллюлозному материалу или меньше кислорода присутствует в лигноцеллюлозном материале" в течение части времени ферментативного гидролиза, означает, что вводят по меньшей мере на 50% меньше, предпочтительно по меньшей мере на 70% меньше, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90% меньше кислорода (выраженного в моль кислорода/м3), например, в виде пузырей, или меньше кислорода присутствует по сравнению с тем, сколько его добавляют или сколько его присутствует в течение другой части времени ферментативного гидролиза, при которой
- 3 028880
меньше кислорода добавляют.
В предпочтительном воплощении кислород добавляют в виде (газообразных) пузырей.
Удивительно, но в соответствии с изобретением путем добавления кислорода можно достичь многих преимуществ процесса, включая оптимизацию температурных условий, уменьшение времени процесса, уменьшение дозировки фермента, повторное применение ферментов, увеличенные выходы и другие оптимизации процесса, приводящие к снижению затрат.
В одном варианте воплощении используемая стабильная ферментная композиция сохраняет активность в течение 30 ч или более. В соответствии с дополнительным вариантом воплощения гидролиз предпочтительно проводят при температуре, равной 40°С или более, более предпочтительно при температуре, равной 50°С или более, и наиболее предпочтительно при температуре, равной 55°С или более. Способ изобретения будет проиллюстрирован более подробно ниже.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 - влияние осуществляемого перед гидролизом барботирования азотом или воздухом 10%-го исходного сырья аС8, на общее количество глюкозы (г/л), высвобождаемое под действием смеси ТЕС210 (1), смеси 4Е-ОН61 (2) и смеси 4Е-ЕС (3).
Фиг. 2 - глюкоза, полученная по примеру 2, 1 = эксперимент 1: без аэрации, 2 = эксперимент 2: непрерывная аэрация, 3 = эксперимент 3: аэрация, начиная с 72 ч и до конца.
Фиг. 3 - влияние времени аэрации на количество глюкозы, полученное в ходе ферментативного гидролиза,-= без аэрации, ··· = аэрация между временами гидролиза 0 и 100 ч,---аэрация между временами гидролиза 0 и 7 ч и---аэрация между временами гидролиза 72 и 100 ч.
Фиг. 4 - влияние времени аэрации на количество глюкозы, полученное в ходе ферментативного гидролиза в эксперименте 1 ( = аэрация между временами гидролиза 0 и 100 ч) и 2 (□ = аэрация между временами гидролиза 72 и 100 ч).
Фиг. 5 - влияние времени аэрации на количество глюкозы, полученное в ходе ферментативного гидролиза, —— аэрация между временами гидролиза 72 и 100 ч и —·— аэрация между временами гидролиза 0 и 7 ч.
Осуществление изобретения
На протяжении всего настоящего описания и сопровождающей формулы изобретения, слова "содержат" и "включают" и такие вариации, как "содержит", "содержащий", "включает" и "включающий" следует интерпретировать включительно. То есть данные слова предназначены для выражения потенциального включения других элементов или целых чисел, конкретно не перечисленных, где позволяет контекст. Слова, указанные в единственном числе, также включают и множественное число. Например "элемент" может означать один элемент или несколько элементов.
В контексте настоящего изобретения "усовершенствованный", "увеличенный", "сниженный" применяют, чтобы показать, что настоящее изобретение демонстрирует преимущество по сравнению с такой же ситуацией, способом или условиями способа, за исключением того, что не добавляют никакого дополнительного кислорода. В контексте настоящего изобретения "измеряли в тех же условиях" или "анализировали в тех же условиях" и т.п. означает, что способ изобретения и такой же способ без добавления кислорода (или с добавлением меньшего количества кислорода) осуществляют в тех же условиях (за исключением добавления кислорода) и что результаты настоящего способа при сравнении со способом без добавления кислорода (или с добавлением меньшего количества кислорода) оценивают с применением таких же условий, предпочтительно с помощью такого же анализа и/или такой же методики, более предпочтительно в рамках такого же или параллельного эксперимента. Условия гидролиза представляют собой пример таких условий.
В предшествующем уровне техники предлагается улучшить гидролиз целлюлолитического материала, применяя анаэробные условия (АО 2010/080407) или вакуум (АО 2009/046538) в ходе ферментативного гидролиза. В процессах, описанных в этих документах, уровень кислорода был понижен. Неожиданно было обнаружено, что гидролиз настоящего изобретения приводит к получению улучшенного продукта реакции, который дает более высокие количества (восстанавливающих) сахаров и/или желаемых продуктов ферментации в следующей за гидролизом ферментации по сравнению со способом, в котором кислород не добавляют. В целом увеличение в наблюдаемое превращении глюкозы было равно от 5 до 15% (мас./мас.) или даже вплоть до 25% (мас./мас.).
Кислород может быть добавлен несколькими способами. Например, кислород может быть добавлен в виде газообразного кислорода, в виде газа, обогащенного кислородом, такого как обогащенный кислородом воздух, или в виде воздуха (пример, кислородсодержащего газа). Кислород может быть добавлен непрерывно или с перерывами. Термин "кислород добавляют" означает, что кислород добавляют к жидкой фазе (включающей лигноцеллюлозный материал) в реакторе для гидролиза, и не означает, что кислород присутствует в свободном пространстве в реакторе над жидкой фазой (в комбинации с медленным перемешиванием или без перемешивания), в результате чего кислород вынужден диффундировать из свободного пространства в жидкую фазу. Поэтому предпочтительно, чтобы кислород добавляли в виде пузырьков, наиболее предпочтительно в виде небольших пузырьков.
В случае если фермент может быть поврежден из-за присутствия или добавления кислорода, то мо- 4 028880
жет быть применена более мягкая поставка кислорода. В этом случае может быть найден баланс между усовершенствованной продукцией глюкозы и активностью фермента. Добавление кислорода к целлюлолитическому материалу может быть выполнено в ходе ферментативного гидролиза. В случае если кислород добавляют в газообразной форме, кислородсодержащий газ может быть введен, например нагнетен, в жидкое содержимое реактора для гидролиза. В другом воплощении изобретения кислородсодержащий газ вводят в поток жидкого целлюлолитического материала, который входит в реактор для гидролиза. В еще одном воплощении изобретения кислородсодержащий газ вводят вместе с целлюлолитическим материалом, который входит в реактор для гидролиза, или с частью жидкого содержимого реактора, который проходит через внешний контур реактора. В большинстве случаев добавление кислорода перед входом в реактор для гидролиза было недостаточно, и добавление кислорода также может быть выполнено в ходе гидролиза. В другом воплощении изобретения в газовую фазу, находящуюся в верхней части реактора (в свободном пространстве), непрерывно или с перерывами вносили новые порции кислородсодержащего газа. В последнем случае было необходимо (энергичное) смешивание или перемешивание для поставки кислорода в виде пузырьков и/или путем диффузии в жидкое содержимое реактора, предпочтительно в комбинации с повышенным давлением в реакторе. В целом продувка свободного пространства воздухом в комбинации с (энергичным) смешиванием или перемешиванием может ввести достаточно кислорода в целлюлозный материал в реакторе для гидролиза, что верно для реакторов размером от 100 л до 1 м3. В более крупном масштабе, например в реакторе размером 50 м3 или более, например 100 м3, для энергичного перемешивания требуется так много энергии, что с экономической точки зрения это не найдет применения в промышленном процессе.
В соответствии с настоящим изобретением кислород может быть добавлен в течение части стадии гидролиза. Добавление кислорода в течение только части гидролиза может быть выполнено, например, в случае, если происходит окислительное повреждение фермента (ферментов). В случае если кислород, присутствующий в содержимом реактора для гидролиза, в сахарном продукте или в гидролизате, формируемом на стадии гидролиза, может или повлиять на, или повредить последующей стадии ферментации, добавление кислорода может быть выполнено в течение всего процесса за исключением последней части гидролиза и, таким образом, кислород (его большая часть) будет поглощен, прежде чем гидролизованная биомасса войдет в реактор для ферментации. Преимущественно кислород предпочтительно в виде (газообразных) пузырей добавляют на последней части стадии гидролиза.
Авторы изобретения выдвинули гипотезу о том, что в первой части (энзиматического) гидролиза (стадии гидролиза) аморфные полисахариды гидролизуются до сахаров, таких как глюкоза, а во второй части стадии гидролиза оставшиеся кристаллические полисахариды превращаются в сахара. Аморфные полисахариды, например, превращаются в олигосахариды под действием эндоглюканаз, после этого олигосахариды могут быть превращены в сахара под действием целлобиогидролаз и β-глюкозидаз (ВС). В соответствии с настоящей гипотезой аморфные полисахариды расположены на внешней стороне полисахаридов или полисахаридных комплексов, тогда как кристаллические полисахариды расположены относительно в большей степени с внутренней стороны полисахаридов или полисахаридных комплексов, присутствующих в лигноцеллюлозном материале. Такая конверсия кристаллических полисахаридов может продолжаться даже тогда, когда большая часть аморфных полисахаридов гидролизуется. В особенности, добавление кислорода выгодно в ходе гидролиза кристаллических полисахаридов, например, при разрушении полисахаридов до олигосахаридов. В соответствии с данной гипотезой добавление кислорода в особенности полезно во второй части стадии гидролиза. В целом, сокращение времени добавления кислорода (или сокращение второй части гидролиза) необходимо, в случае относительно низкого количества кристаллических полисахаридов в лигноцеллюлозном материале по сравнению с гидролизом лигноцеллюлозного материала, в котором присутствуют относительно большие количества кристаллических полисахаридов. Авторы изобретения также утверждают, что добавление кислорода выгодно для гидролиза кристаллических полисахаридов. Таким образом, добавление кислорода очень полезно, в особенности, на той фазе, где кристаллические полисахариды атакуются ферментами. Вне этой фазы может быть эффективнее не добавлять кислород. Таким образом, подачу кислорода можно начинать только во второй части или второй половине гидролиза. В конце гидролиза, когда большая часть кристаллических полисахаридов разрушится, добавление кислорода предпочтительно останавливают. На последней части второй части или второй половины гидролиза большинство полисахаридов превращаются в олигосахариды, которые во время дальнейшего разрушения до сахаров меньшего размера больше не нуждаются в кислороде. Таким образом, предпочтительно в конце гидролиза добавлять к лигноцеллюлозному материалу меньше кислорода по сравнению с добавлением кислорода во время аэрированной части или еще более предпочтительно кислород не добавлять к лигноцеллюлозному материалу в конце гидролиза. Эта гипотеза приведена исключительно в качестве возможного объяснения эффекта, замеченного авторами изобретения, и настоящее изобретение не зависит от правильности данной теории.
Авторы изобретения также заметили, что аэрация в течение ферментативного гидролиза в начале гидролиза приводит к увеличению продукции глюкозы в ходе гидролиза.
На фиг. 3 показан эффект аэрации. По сравнению с неаэрируемым гидролизом (показанным как "неаэрируемая" кривая), аэрация в начале гидролиза (показанная как кривая "аэрация 0-7 ч") приведет к
- 5 028880
немедленному увеличению продукции глюкозы. Например, уже через 24 ч гидролиза было обнаружено, что продукция глюкозы соответствует продукции глюкозы без аэрации при 60 ч гидролиза в идентичных условиях (за исключением аэрации). По сравнению с неаэрируемым гидролизом аэрация в последней части гидролиза (показанная как кривая "аэрация 72-100 ч") приведет к немедленному увеличению в продукции глюкозы после аэрации. Например, уже через 24 ч после начала аэрации (на 72 ч) процесса гидролиза обнаруживают увеличение продукции глюкозы на 30% по сравнению с продукцией глюкозы без аэрации в идентичных условиях (за исключением аэрации). Авторы изобретения полагают, что путем применения аэрации как на старте, так и в последней части гидролиза (то есть между периодов с аэрацией имеет место период без аэрации), можно увеличить продукцию глюкозы, причем это увеличение продукции глюкозы будет больше по сравнению с продукцией при условии проведения одного из двух этих увеличений. Настоящее объяснение дано в качестве руководства и инструкции для специалиста в данной области техники, чтобы он мог выбрать правильные условия для настоящего способа гидролиза.
Несколько примеров частичной аэрации в ходе ферментативного гидролиза приведены в примерах для того, чтобы продемонстрировать положительный эффект настоящего изобретения. Этот положительный эффект обнаружили для нескольких субстратов или типов исходного сырья и, таким образом, считается, что он имеет место при гидролизе всех типов субстратов или всех типов исходного сырья.
Несколько примеров ферментных композиций ферментативного гидролиза приведены в примерах для того, чтобы показать положительный эффект настоящего изобретения. Этот положительный эффект обнаружили для нескольких ферментных композиций, и, таким образом, считается, что он имеет место для всех типов гидролизующих ферментных композиций.
В соответствии с предпочтительным вариантом воплощения изобретения часть времени, в течение которого добавляют меньше кислорода или предпочтительно кислород не добавляют, равна от 10 до 80%, предпочтительно от 20 до 80%, более предпочтительно от 30 до 80% и наиболее предпочтительно от 40 до 80% от общего времени ферментативного гидролиза. В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом воплощения изобретения часть времени, в течение которого добавляют больше кислорода, равна от 2 до 80%, предпочтительно от 4 до 60%, более предпочтительно от 8 до 50% и наиболее предпочтительно от 10 до 50% от общего времени ферментативного гидролиза. В целом концентрация кислорода в жидкой фазе в течение части времени, когда добавляют кислород, по меньшей мере в 2 раза, предпочтительно по меньшей мере в 4 раза, более предпочтительно по меньшей мере в 10 раз выше концентрации кислорода в жидкой фазе в течение части времени, когда кислорода добавляют меньше или кислород не добавляют.
В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом воплощения изобретения в течение части времени, когда добавляют кислород в жидкую фазу (с помощью аэрации или добавления кислорода), концентрация кислорода (ЭО) в жидкой фазе, где присутствует лигноцеллюлозный материал в ходе ферментативного гидролиза, равна по меньшей мере 0,001 моль/м3, предпочтительно по меньшей мере 0,002 моль/м3, более предпочтительно по меньшей мере 0,003 моль/м3 и еще более предпочтительно более чем 0,01 моль/м3, например более чем 0,02 моль/м3 или 0,03 моль/м3. В реакторах, объемом менее чем 1 м3, при медленном перемешивании будут получены величины ΌΟ менее чем 0,01 моль/м3 или 0,02 моль/м3. Интенсивное смешивание или перемешивания при такой шкале вводит часть газовой фазы свободного пространства в реакционную жидкость. Например, смешивание или перемешивание может создать воронку, которая затянет кислород в жидкость. В целом продувка свободного пространства воздухом в комбинации с (энергичным) смешиванием или перемешиванием введет достаточно кислорода в целлюлозный материал в реакторе для гидролиза для реакторов, размером вплоть до 100 л до 1 м3. В более широком масштабе, например, в реакторе, размером 50 м3 или более, например, 100 м3, для энергичного перемешивания требуется так много энергии, что с экономической точки зрения это не найдет применения в промышленном процессе. В целом в крупных реакторах перемешивание или смешиванием без введения воздуха или кислорода приведет к величинам ΌΟ менее чем 0,01 моль/м3.
В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом воплощения изобретения (полученным путем аэрации или добавлением кислорода) концентрация кислорода в жидкой фазе, где присутствует лигноцеллюлозный материал в ходе ферментативного гидролиза, равна в течение части времени, когда добавляют кислород, предпочтительно самое большее 80% от насыщающей концентрации кислорода в условиях протекания реакции гидролиза, более предпочтительно самое большее 0,12 моль/м3, еще более предпочтительно самое большее 0,09 моль/м3, еще более предпочтительно самое большее 0,06 моль/м3, даже еще более предпочтительно самое большее 0,045 моль/м3 и наиболее предпочтительно самое большее 0,03 моль/м3. Температура и давление влияют на ΌΟ. Приведенные выше предпочтительные и типичные величины (моль/м3) относятся к нормальному атмосферному давлению и к температуре, равной примерно 62°С. Специалисту в данной области техники известны подходящие величины ΌΟ на основе современных учений.
В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом воплощения изобретения концентрация кислорода в жидкой фазе, где присутствует лигноцеллюлозный материал в ходе ферментативного гидролиза, в течение части времени, когда кислорода добавляют меньше или кислорода не добавляют, равна менее чем 0,02 моль/м3, предпочтительно менее чем 0,01 моль/м3, более предпочтительно менее чем
- 6 028880
0,005 моль/м3 и наиболее предпочтительно менее чем 0,001 моль/м3.
Добавление кислорода в виде воздуха или другого кислородсодержащего газа в соответствии с изобретением также может быть использовано для перемешивания или смешивания содержимого реактора для гидролиза. Настоящий способ изобретения в особенности показал свои преимущества на опытном производстве и в промышленных масштабах. Предпочтительно реактор для гидролиза имел объем, равный 1 м3, или более предпочтительно более чем 10 м3 и наиболее предпочтительно 50 м3 или более. В целом, реактор для гидролиза был меньше чем 3000 м3 или 5000 м3 Авторы изобретения выдвинули теорию, согласно которой, в особенности при больших масштабах, для гидролиза доступно недостаточно кислорода, что может быть связано с ограничениями в переносе кислорода в реакторе, например в целлюлолитической биомассе. В экспериментах, проводимых в лабораторном масштабе, данная кислородная недостаточность может не иметь такой важной роли. Отношение площади поверхности (или площади контакта кислорода с содержимым реактора) к объему реактора более благоприятно для мелкомасштабных экспериментов в сравнении с крупномасштабными экспериментами. Кроме того, выполнять смешивание в мелкомасштабных экспериментах будет относительно легче, чем в крупномасштабных. Также в ходе данных мелкомасштабных экспериментов транспорт кислорода из свободного пространства реактора гидролиза происходит быстрее по сравнению с ситуацией в крупномасштабных экспериментах. Эта теория приведена исключительно в качестве возможного объяснения замеченного авторами изобретения эффекта, и настоящее изобретение не зависит от правильности данной теории. В соответствии с дополнительным воплощением изобретения добавление кислорода может быть применено для контроля, по меньшей мере частично, гидролиза.
Способ изобретения преимущественно применяют в комбинации с применением термостабильных ферментов.
Термин "термостабильный фермент" означает, что фермент имеет температурный оптимум, равный
60°С или выше, например 70°С или выше, такой как 75°С или выше, например 80°С или выше, такой как 85°С или выше. Например, они могут быть изолированы из термофильных микроорганизмов или могут быть сконструированы специалистом и искусственно синтезированы. В одном из воплощений полинуклеотиды могли быть изолированы или получены из термофильных или термоустойчивых мицелиальных грибов или изолированы из нетермофильных или нетермоустойчивых грибов, но при этом кодируемые ими ферменты, как оказалось, являются термостабильными.
Термин "термофильный гриб" означает гриб, который растет при температуре, равной 50°С или выше. Термин "термоустойчивый гриб" означает гриб, который растет при температуре, равной 45°С или выше, имея максимум около 50°С.
Примеры штаммов термофильных грибов представляют собой Казатзоша етегзопн (ранее известные как Та1аготусез етегзош; Та1аготусез ешегзопн, РешсШшт деозтйЫа етегзопн и Казашзоша етегзопн применяют в настоящем документе взаимозаменяемо).
Подходящие клетки термофильных или термоустойчивых грибов могут представлять собой клетку
Нитгсо1а, Ккгготисог, МусеИоркГкога, Казатзота,
Та1аготусез, Ткегтотусез, Ткегтоазсиз или ΤΜβΙανΐα, предпочтительно, клетку Казатзота етегзопИ. Предпочтительные термофильные или термоустойчивые грибы представляют собой Нитгсо1а уугзеа уаг. Гкегтогбеа, Нитгсо1а 1апи%тоза, МусеИоркГкога ГкегторкИа, РариГазрога ГкегторкШа, Казатзота ЪуззоскГатуИогИез, Казатзота
етегзопп,
КиЗСипЗОгии ОТ^ПиСви,
гшьигпьигии
еЪиГПеаП,
иГ СУ715 ίΐρΐ ίαία,
Казатзота суНгиГгозрога, Ккгготисог ризШиз, Ккгготисог тгекег, Та1аготусез ЪасгШзрогиз, Та1аготусез 1еусеГГаггиз, Та1аготусез гкегторкПиз, Ткегтотусез Гепиутозиз, Ткегтоазсиз сгизГасеиз, Ткегтоазсиз ГкегторкИиз Ткегтоазсиз аигапИасиз и ТЫекта
ГеггезГгИз.
Термофильные грибы не ограничены конкретным таксономическим отрядом и встречаются по всему дереву жизни грибов. Примеры представляют собой КЫ/отисог в мукоровых, МусеНоркШога в сордариевых и Та1аготусез, Ткегтотусез и Ткегтоазсиз у эуроциевых (Моискасса, 1997). Большинство видов Та1аготусез представлять собой мезофилов, за исключением видов в пределах секций Етегзогй и Ткегторкйа. Секция Етегзопн включает Та1аготусез етегзопн, Та1аготусез ЪуззосШатуйоШез, Та1аготусез ЪасйНзрогиз и Та1аготусез 1еусеИапиз, все они хорошо растут при 40°С. Та1аготусез ЪасйНзрогиз термоустойчивый, Т. 1еусекапиз от термоустойчивого до термофильного и Т. етегзопн и Т. Ъуззоск1атуйоШез истинные термофилы (§1о1к апй Батзоп, 1972). Единственный член Та1аготусез секции Ткегторкйа, Т Шегторкйиз, быстро растет при 50°С (Еуапз апй §1о1к, 1971; Еуапз, 1971; §1о1к апй Батзоп, 1972). Современная классификация этих термофильных видов Та1аготусез в основном базируется на феноти- 7 028880
пических и физиологических признаках, таких как их способность расти при температурах выше 40°С, на окраске аскоспора, структуре покрова аскомы и формирование определенного типа анаморфа. 8Го1к и 8атзоп (1972) утверждают, что члены секции Етегзопп имеют анаморфы или серии Раесйотусез (Т. ЬуззосН1атуйо1Йез и Т. 1еусейапиз), или серии РешсШшт суйпйгозрогит (Т. етегзопп и Т. Ьасййзрогиз). Позднее, Ρϊΐΐ (1979) отнес виды, принадлежащие к серии РешсШшт суНпйгозрогит, к роду СеозтиНт, на основе различных признаков, таких как формирование конидий из терминальных пор, а не на воротничках (шейках), признак, относящийся к РешсШшт и Раесйотусез. Внутри рода СеозтйШа только О. агдП1асеа термоустойчивый, и 8(о1к е! а1. (1969) и Еуапз (1971) предложили связь с членами Та1аготусез зес!. Етегзопп. Филогенетическая связь термофильных видов Та1аготусез с Та1аготусез и трихокомовыми неизвестна. См., 1. НоиЬгакеп, АпФше уап Бееи^епНоек 2012 БеЬ; 101(2): 403-21.
Казатзоша представляет собой новый род, включающий термоустойчивые и термофильные виды Та1аготусез и ОеозтйЫа (Л. НоиЬгакеп е! а1., \Ша зирга). На основании фенотипических, физиологических и молекулярных данных НоиЬгакеп е! а1. предложили отнести виды Т. етегзопп, Т. ЬуззосЫатускж!ез, Т. еЬитеиз, О. агдШасеа и О. суйпйгозрога к новому роду Казатзоша. Та1аготусез етегзопп, РешсШшт деозтйЫа етегзопп и Казатзоша етегзопп применяют в настоящем документе взаимозаменяемо.
Предпочтительные термофильные грибы представляют собой Казатзоша ЬуззосН1атуйо1Йез, Казатзоша етегзопп, ТНегтотусез 1епидтозиз, Та1аготусез ФегторНйиз, ТНегтоазсиз сшзЫсеиз, ТНегтоазсиз ФегторНйиз и ТНегтоазсиз аигапИасиз.
"Мицелиальные грибы" включают все мицелиальные формы подотдела Еитусо!а и Оотусо!а (по определению 11а\\кз\\'опН е! а1., В ЛтзжопН апй В1зЬу'з Июйопагу о£ ТНе Бипщ, 8'1' ейШоп, 1995, САВ 1п(етайопа1, Бшсегзру Ргезз, СатЬпйде, ϋΚ). Мицелиальные грибы характеризуются мицелиальной стенкой, которая состоит из хитина, целлюлозы, глюкана, хитозана, маннана и других сложных полисахаридов. Вегетативный рост происходит за счет удлинения гифов, и катаболизм углерода облигатно
аэробный. Штаммы мицелиальных грибов включают, без ограничений, штаммы
Асгетотит,
А§агчсиз, АзрегдШиз, АигеоЪазгсИит, Скгузозрогшт, Соргтиз, Сгур(ососсиз, РШЪазгсНит, Ризаггит, ОеозтИЫа, Нитгсо1а, Ма§пароПке, Мисог, МусеИорЫкога, ЛеосаШтазИх, Реигозрога, РаееПотуеез, РетсИИит, Ргготусез, Рапегоскае1е, Р1еиго1из, Казатзоша, ЗскггоркуИит, Та1аготусез, Ткегтоазсиз, Ткегтотусез, ТЫекгма, То1урос1асИит и
ГггсАоб/еттяа.
Несколько штаммов мицелиальных грибов легко доступны для любого пользователя в ряде коллекций культур, таких как Американская коллекция типовых культур (АТСС), Германский банк микроорганизмов (Ώ8Μ), Центральное бюро грибковых культур (СВ8) и Коллекция патентованных культур Службы сельскохозяйственных исследований, Северный региональный исследовательский центр (ЫККБ). Примеры таких штаммов включают АзрегдШиз шдег СВ8 513,88, АзрегдШиз огу2ае АТСС 20423, 1БО 4177, АТСС 1011, АТСС 9576, АТСС 14488-14491, АТСС 11601, АТСС12892, Р. сЬгузодепит СВ8 455,95, РешсШшт сйппит АТСС 38065, РешсШшт сЬгузодепит Р2, Та1аготусез етегзопп СВ8 393,64, Асгетопшт сЬгузодепит АТСС 36225 или АТСС 48272, ТпсНойегта геезе1 АТСС 26921 или АТСС 56765 или АТСС 26921, АзрегдШиз зо_]ае АТСС 11906, СНгузозрогшт 1искпо\сепзе С1, Оагд 27Κ, νΚΜ Б3500-0, АТСС44006 и производные от них.
Преимущество экспрессии и продукции ферментов (например, по меньшей мере двух, трех или четырех различных целлюлаз) в подходящем микроорганизме может заключаться в высоком выходе ферментной композиции, которая может быть применена в способе настоящего изобретения.
В соответствии с изобретением, путем добавления кислорода можно достичь многих преимуществ процесса, включая оптимизацию температурных условий, сокращение времени процесса, уменьшение дозы фермента, повторное применение ферментов и другие оптимизации процесса, приводящие к снижению затрат. Преимущественно изобретение обеспечивает способ, в котором стадию гидролиза проводят в усовершенствованных условиях. Изобретение также обеспечивает способ, включающий гидролиз с сокращенным временем процесса. Кроме того, изобретение обеспечивает способ, в котором дозировка фермента может быть снижена, а в то же время выход целевого продукта гидролиза может быть сохранен на том же уровне. Другое преимущество изобретения заключается в том, что настоящий способ, включающий гидролиз, может привести к оптимизации условий процесса. Еще одно дополнительное преимущество изобретения заключается в том, что увеличивается выход целевого продукта гидролиза в способе, включающем этот гидролиз, при этом применяется такая же дозировка фермента.
Стабильная ферментная композиция.
Стабильная ферментная композиция в настоящем документе означает, что ферментная композиция сохраняет активность после реакции гидролиза, которая проходила в течение 30 ч, предпочтительно, по меньшей мере, на уровне 10, 20, 30, 40, 50, 60, 65, 70, 75, 80 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% от своей первоначальной активности. Предпочтительно ферментная композиция сохраняет активность после реакции гидролиза, которая проходила в течение 40, 50, 60, 70, 80, 90 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450
- 8 028880
или 500 ч.
Ферментная композиция может быть получена путем ферментации подходящего субстрата подходящим микроорганизмом, например, с Какаткоша етегкопи или ЛкрегдШик тдет. где ферментная композиция продуцируется микроорганизмом. Микроорганизм может быть изменен так. чтобы улучшить или производить целлюлазную композицию. Например. микроорганизм может быть мутирован с помощью классических методик улучшения штамма или с помощью методов рекомбинантной ДНК. Таким образом. микроорганизмы. перечисленные в настоящем документе. могут быть применены как таковые для получения целлюлазной композиции или они могут быть изменены для увеличения продукции или для получения измененной целлюлазной композиции. которая может включать гетерологичные целлюлазы. т.е. ферменты. которые исходно не производились данным микроорганизмом. Предпочтительно для получения целлюлазной композиции применяют гриб. более предпочтительно мицелиальный гриб. Преимущественно применяют термофильный или термоустойчивый микроорганизм.
Необязательно. применяют субстрат. который индуцирует экспрессию ферментов в ферментной композиции во время продукции ферментной композиции.
Ферментную композицию применяют для высвобождения сахара из лигноцеллюлозы. которая включает полисахариды. Основные полисахариды представляют собой целлюлозу (глюканы). гемицеллюлозу (ксиланы. гетероксиланы и ксилоглюканы). Кроме того. некоторое количество гемицеллюлозы может присутствовать в виде глюкоманнанов. например. в исходном сырье. полученном из древесины. Ферментативный гидролиз данных полисахаридов до растворимых сахаров. включающих и мономеры и мультимеры. например глюкозу. целлобиозу. ксилозу. арабинозу. галактозу. фруктозу. маннозу. рамнозу. рибозу. галактуроновую кислоту. глюкуроновую кислоту и другие гексозы и пентозы. происходит под действием различных ферментов. работающих согласованно. Термин "сахарный продукт" означает продукт ферментативного гидролиза исходного сырья или лигноцеллюлозного материала. Сахарный продукт будет включать растворимые сахара. включая как мономеры. так и мультимеры. предпочтительно будет включать глюкозу. Примеры других сахаров представляют собой целлобиозу. ксилозу. арабинозу. галактозу. фруктозу. маннозу. рамнозу. рибозу. галактуроновую кислоту. глюкуроновую кислоту и другие гексозы и пентозы. Сахарный продукт может быть применен как таковой или может быть дополнительно обработан. например очищен.
Кроме того. пектины и другие пектиновые вещества. такие как арабинаны. могут составлять значительную долю от сухой массы типичных клеточных стенок из неодревеснённых тканей растения (примерно от четверти до половины сухой массы может быть представлено пектинами).
Целлюлоза представляет собой линейный полисахарид. состоящий из остатков глюкозы. соединенных 3-1.4-связями. Линейная природа волокон целлюлозы. а также стехиометрия соединенной β-связью глюкозы (по отношению к а-) создает структуры. более склонные к образованию межнитевых водородных связей по сравнению с сильно разветвленные соединенными а-связью структурами крахмала. Таким образом. полимеры целлюлозы бывают. как правило. менее растворимыми и образуют более прочно связанные волокна по сравнению с волокнами. обнаруживаемыми в крахмале.
Ферменты. которые могут быть включены в примененную в изобретении стабильную ферментную композицию. будут описаны более подробно далее.
СН61. эндоглюканазы (ЕС) и экзоцеллобиогидролазы (СВН) катализируют гидролиз нерастворимой целлюлозы до таких продуктов. как целлоолигосахариды (целлобиозы в качестве основного продукта). тогда как β-глюкозидазы (ВС) превращают олигосахариды. главным образом. целлобиозу и целлотриозу в глюкозу.
Гемицеллюлоза представляет собой сложный полимер. и ее композиция часто варьирует в широких пределах от организма к организму и от одного типа ткани к другому. В целом. основной компонент гемицеллюлозы представляет β-1.4-связанную ксилозу. пятиуглеродный сахар. Однако данная ксилоза часто бывает разветвленной на от 0 до 3 и/или от 0 до 2 атоме ксилозы и может быть замещена связями с арабинозой. галактозой. маннозой. глюкуроновой кислотой. галактуроновой кислотой или путем этерификации до уксусной кислоты (и этерификацией феруловой кислоты до арабинозы). Гемицеллюлоза также может содержать глюкан. представляющий собой общий термин для обозначения соединенного βсвязью шестиуглеродного сахара (такого как β-(1.3)(1.4) глюканы и упомянутые выше гетероглюканы) и. кроме того. для глюкоманнанов (в которых как глюкоза. так и манноза присутствуют в линейной основной цепи. соединенные друг с другом β-связьми).
Ксиланазы вместе с другими вспомогательными ферментами. например с а-Ь-арабинофуранозидазами. ферулоил- и ацетилксиланэстеразами. глюкуронидазами и β-ксилозидазами. катализируют гидролиз гемицеллюлоз.
Пектиновые вещества включают пектины. арабинаны. галактаны и арабиногалактаны. Пектины представляют собой наиболее сложные полисахариды в растительной клеточной стенке. Они надстраиваются вокруг основной цепи соединенных через а(1.4)-связь звеньев Ό-галактуроновой кислоты. которые перемежаются до некоторой степени Ь-рамнозой. В любой клеточной стенке существует ряд структурных единиц. которые соответствуют этому описанию и. как правило. считается. что в одной пектино- 9 028880
вой молекуле основные цепи различных структурных единиц непрерывно связаны друг с другом.
Основные типы структурных единиц представляют собой галактуронан (гомогалактуронан), который может быть замещен метанолом по карбоксильной группе и ацетатом по 0-2 и 0-3; рамногалактуронан I (КС!), в котором звенья галактуроновой кислоты чередуются со звеньями рамнозы, несущими боковые цепи галактаном, присоединенные через (1,4)-связь, и арабинана, присоединенные через (1,5)связь. Боковые цепи арабинана могут быть присоединены непосредственно к рамнозе или опосредованно через цепи галактана; ксилогалактуронан, с единственными ксилозильными звеньями по 0-3 галактуроновой кислоты (тесно связанной с КСГ); и рамногалактуронан II (КСП), особенно сложная минорная единица, содержащая необычные сахара, например апиозу. Единица КСП может содержать два апиозильных остатка, которые в подходящих ионных условиях могут обратимо образовывать сложные эфиры с боратом.
Композиция, используемая в способе изобретения, включает предпочтительно по меньшей мере две активности, хотя, как правило, композиция будет включать более чем две активности, например три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или более активностей. Как правило, композиция изобретения может включать по меньшей мере две различные целлюлазы или одну целлюлазу и по меньшей мере одну гемицеллюлазу. Композиция изобретения может включать целлюлазы, но не включать ксиланазы. Кроме того, композиция изобретения может включать вспомогательную ферментативную активность, т.е. дополнительную активность, которая или непосредственно, или опосредованно приводит к разрушению лигноцеллюлозы. Примеры таких вспомогательных активностей указаны в настоящем документе.
Таким образом, композиция для применения в изобретении может включать СН61, эндоглюканазную активность и/или целлобиогидролазную активность и/или β-глюкозидазную активность. Композиция, используемая в изобретении, может включать более чем одну ферментативную активность в одном или нескольких из данных классов. Например, композиция, используемая в изобретении, может включать две эндоглюканазные активности, например эндо-1,3(1,4)^ глюканазную активность и эндоф’)-1.4глюканазную активность. Такая композиция также может включать одну или несколько ксиланазных активностей. Такая композиция может включать вспомогательную ферментативную активность.
Композиция, используемая в изобретении, может быть получена из Какашкоша ешегеопи. В изобретении предполагается, что основной набор (разрушающих лигноцеллюлозу) ферментативных активностей может быть получен из Какашкоша ешегкопй. Как показано в настоящем документе, Какашкоша ешегкопй может обеспечить высокоэффективный набор активностей для гидролиза лигноцеллюлозной биомассы. Данная активность затем может быть дополнена дополнительными ферментативными активностями из других источников. Такие дополнительные активности могут быть получены из классических источников и/или произведены генетически модифицированным организмом.
Активности в композиции, используемой в изобретении, могут быть термостабильными. В настоящем документе это означает, что активность имеет температурный оптимум, равный примерно 60°С или выше, например примерно 70°С или выше, такой как, примерно 75°С или выше, например примерно 80°С или выше, такой как 85°С или выше. Активности в композиции, используемой в изобретении, как правило, не будут иметь такой же температурный оптимум, но предпочтительно, тем не менее, будут термостабильными.
Кроме того, ферментативные активности в композиции, используемой в изобретении, может быть способны работать при низких значениях рН. Для целей настоящего изобретения термин "низкие значения рН" указывает на рН, равный примерно 5,5 или ниже, примерно 5 или ниже, примерно 4,9 или ниже, примерно 4,8 или ниже, примерно 4,7 или ниже, примерно 4,6 или ниже, примерно 4,5 или ниже, примерно 4,4 или ниже, примерно 4,3 или ниже, примерно 4,2 или ниже, примерно 4,1 или ниже, примерно 4,0 или ниже, примерно 3,9 или ниже, или примерно 3,8 или ниже, примерно 3,7 или ниже, примерно 3,6 или ниже, или примерно 3,5 или ниже.
Активности в композиции, используемой в изобретении, могут быть определены комбинацией любых из вышеперечисленных температурных оптимумов и величин рН.
Композиция, используемая в способе изобретения, может включать в дополнение к активностям, полученным из Какашкоша, целлюлазу (например, одну, полученную из источника, отличного от Какашкоша) и/или гемицеллюлазу (например, одну, полученную из источника, отличного от Какашкоша) и/или пектиназу.
Композиция, используемая в изобретении, может включать один, два, три, четыре или более классов целлюлаз, например одну, две три или четыре или все из СН61, эндоглюканазу (ЕС), одну или две экзоцеллобиогидролазы (СВН) и β-глюкозидазу (ВС). Композиция, используемая в изобретении, может включать две или более из любых данных классов целлюлаз.
Композиция изобретения может включать активность, которая имеет другой тип целлюлазной активности, и/или гемицеллюлазной активности, и/или пектиназной активности по сравнению с типом активности, обеспеченной композицией для применения в способе изобретения. Например, композиция изобретения может включать один тип целлюлазной и/или гемицеллюлазной активности и/или пектиназной активности, обеспеченной композицией, как описана в настоящем документе, и второй тип цел- 10 028880
люлазной и/или гемицеллюлазной активности и/или пектиназной активности, обеспеченной дополнительной целлюлозой/гемицеллюлазой/пектиназой.
В настоящем документе целлюлаза представляет собой любой полипептид, который способен разрушать или модифицировать целлюлозу. Полипептид, который способен разрушать целлюлозу представляет собой полипептид, который способен катализировать процесс расщепления целлюлозы на звенья меньшего размера, или частично, например, на целлодекстрины, или полностью на мономеры глюкозы. Применение целлюлазы в соответствии с изобретением может привести при контакте с целлюлозой к смешанной популяции целлодекстринов и мономеров глюкозы. Такая деградация, как правило, будет проходить посредством реакции гидролиза.
Белки СН61 (семейство 61 гликозидгидролазы или иногда называемые БОГУ) представляют собой кислород-зависимые полисахаридмонооксигеназы (РМО) в соответствии с новейшими данными литературы. Часто в литературе указывают, что данные белки усиливают действие целлюлаз в отношении лигноцеллюлозных субстратов. ОН61 первоначально классифицировали как эндоглюканазу на основании измерений очень слабой эндо-1,4-Р-й-глюканазной активности у одного из членов семейства. Термин "ОН61", как применен в настоящем документе, следует понимать как семейство ферментов, которые обладают общими консервативными участками последовательности и фолдинга, чтобы быть классифицированы в семейство 61 согласно общепризнанной системе классификации ί','ΛΖΥ ОН (1Шр://\у\у\у.са/у.ог8/гН61.1Цт1). Семейство гликозидгидролазы 61 представляет собой члена семейства гликозидгидролаз ЕС 3.2.1. В настоящем документе ОН61 применяют как составную часть целлюлазы.
В настоящем документе гемицеллюлаза представляет собой любой полипептид, который способен разрушать или модифицировать гемицеллюлозу. Другими словами, гемицеллюлаза может быть способна разрушать или модифицировать одно или более из следующего: ксилана, глюкуроноксилана, арабиноксилана, глюкоманнана и ксилоглюкана. Полипептид, способный разрушать гемицеллюлозу, представляет собой полипептид, который способен катализировать процесс расщепления гемицеллюлозы на полисахариды меньшего размера, или частично, например, на олигосахариды, или полностью на мономеры сахаров, например на мономеры сахаров, представляющие собой гексозу или пентозу. Гемицеллюлаза в соответствии с изобретением может приводить к смешанной популяции олигосахаридов и мономеров сахаров при контакте с гемицеллюлозой. Такая деградация, как правило, будет происходить в ходе реакции гидролиза.
В настоящем документе пектиназа представляет собой любой полипептид, который способен разрушать или модифицировать пектин. Полипептид, который способен разрушать пектин представляет собой полипептид, который способен катализировать процесс расщепления пектина на звенья меньшего размера, или частично, например, или на олигосахариды, или полностью на мономеры сахаров. Пектиназа в соответствии с изобретением может приводить к смешанной популяции олигосахаридов и мономеров сахаров при контакте с пектиназой. Такое деградация, как правило, будет происходить в ходе реакции гидролиза.
Соответственно, композиция изобретения может включать любую целлюлазу, например, ОН61, целлобиогидролазу, эндо-Р-1,4-глюканазу, β-глюкозидазу или β-(1,3)(1,4)-глюканазу.
В настоящем документе целлобиогидролаза (ЕС 3.2.1.91) представляет собой любой полипептид, который способен катализировать гидролиз 1,4^-О-глюкозидных связей в целлюлозе или целлотетраозе, высвобождая целлобиозу с концов цепей. Данный фермент также может быть отнесен к целлюлазе, 1,4β-целлобиозидазе, 1,4^-целлобиогидролазе, 1,4^-Э-глюканцеллобиогидролазе, авицелазе, экзо-1,4^-Эглюканазе, экзоцеллобиогидролазе или экзоглюканазе.
В настоящем документе эндо^-1,4-глюканаза (ЕС 3.2.1.4) представляет собой любой полипептид, который способен катализировать эндогидролиз 1,4^-О-глюкозидных связей в целлюлозе, лихенине или β-Ό-глюканах злаковых. Такой полипептид также может быть способен гидролизовать 1,4-связи в β-Όглюканах, также содержащих 1,3-связи. Данный фермент также может быть отнесен к целлюлазе, авицелазе, β-1,4-эндоглюкангидролазе, β-1,4-глюканазе, карбоксиметилцеллюлазе, целлюдекстриназе, эндо1,4^-О-глюканазе, эндо-1,4^-О-глюканогидролазе, эндо-1.4-(3-глюканазе или эндоглюканазе.
В настоящем документе β-глюкозидаза (ЕС 3.2.1.21) представляет собой любой полипептид, который способен катализировать гидролиз терминальных, нередуцирующих остатков β-Ό-глюкозы с высвобождением β-Ό-глюкозы. Такой полипептид может иметь широкую специфичность в отношении β-Όглюкозидов и также может гидролизовать одно или несколько из следующего: β-Ό-глюктозид, а-Ьарабинозид, β-Ό-ксилозид или β-Ό-фукозид. Данный фермент также может быть отнесен к амигдалазе, β-Ό-глюкозидглюкогидролазе, целлобиазе или гентобиазе.
В настоящем документе β-(1,3)(1,4)-глюканаза (ЕС 3.2.1.73) представляет собой любой полипептид, способный катализировать гидролиз 1,4^-О-глюкозидных связей в β-Ό-глюканах, содержащих 1,3- и 1,4-связи. Такой полипептид может действовать на лихенин и β-Ό-глюканы злаковых, но не на β-Όглюканы, содержащие только 1,3- или 1,4-связи. Данный фермент также может быть отнесен к лихениназе, 1,3-1,4^-О-глюкан-4-глюканогидролазе, β-глюканазе, эндо^-1,3-1,4 глюканазе, лихеназе или β- 11 028880
глюканазе со смешанными связями. ЕС 3.2.1.6, которая описана как эндо-1,3(4)-Р-глюканаза, представляет собой альтернативу этому типу фермента. Данный тип фермента гидролизует 1,3- или 1,4-связи в βΌ-глюкане, если остаток глюкозы, редуцирующая группа которого участвует в образовании гидролизуемой связи, самозамещен по С-3. Альтернативные названия включают эндо-1.3-(3-глюканаэу. ламинариназу, 1,3-(1,3;1,4)^-О-глюкан-3-(4)-глюканогидролазу; субстраты включают ламинарии, лихенин и β-Όглюканы злаковых.
Композиция изобретения может включать любую гемицеллюлазу, например эндоксиланазу, βксилозидазу, а-Ь-арабинофуранозидазу, а-Э-глюкуронидазу, ацетилксиланэстеразу, ферулоилэстеразу, кумароилэстеразу, а-галактозидазу, β-галактозидазу, β-маннаназа или β-маннозидазу.
В настоящем документе эндоксиланаза (ЕС 3.2.1.8) представляет собой любой полипептид, который способен катализировать эндогидролиз 1,4^-О-ксилозидные связи в ксиланах. Данный фермент также может быть отнесен к эндо-1,4^-ксиланазе или 1,4^-О-ксиланксиланогидролазе. Альтернатива представляет собой глюкуроноарабиноксилан-эндоксиланазу ЕС 3.2.1.136, фермент, который способен гидролизовать 1,4-ксилозидные связи в глюкуроноарабиноксиланах.
В настоящем документе β-ксилозидаза (ЕС 3.2.1.37) представляет собой любой полипептид, способный катализировать гидролиз 1,4^-О-ксиланов, последовательно удаляя остатки Ό-ксилозы с нередуцирующих концов. Такие ферменты также могут гидролизовать ксилобиозу. Данный фермент также может быть отнесен к ксилан-1,4^-ксилозидазе, 1,4^-О-ксилан-ксилогидролазе, экзо-1,4^-ксилозидазе или ксилобиазе.
В настоящем документе, а-Ь-арабинофуранозидаза (ЕС 3.2.1.55) представляет собой любой полипептид, который способен действовать на а-Ь-арабинофуранозиды, а-Ь-арабинаны, содержащие (1,2)-, и/или (1,3)-, и/или (1,5)-связи, арабиноксиланы и арабиногалактаны. Данный фермент также может быть отнесен к а-Ы-арабинофуранозидазе, арабинофуранозидазе или арабинозидазе.
В настоящем документе а-Э-глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.139) представляет собой любой полипептид, способный катализировать реакцию, протекающую согласно следующему уравнению: а-Όглюкуронозид + Н(2)О = спирт + Ό-глюкуронат. Данный фермент также может быть отнесен к аглюкуронидазе или а-глюкозидуроназе. Данные ферменты также могут гидролизовать 4-Ометилированную глюкуроновую кислоту, которая также может присутствовать в качестве заместителя в ксиланах. Альтернатива представляет собой ЕС 3.2.1.131: ксилан-а-1,2-глюкуронозидазу, которая катализирует гидролиз а-1,2-(4-О-метил)глюкуронозильных связей.
В настоящем документе ацетилксиланэстераза (ЕС 3.1.1.72) представляет собой любой полипептид, который способен катализировать деацетилирование ксиланов и ксилоолигосахаридов. Такой полипептид может катализировать гидролиз ацетильных групп полимерного ксилана, ацетилированной ксилозы, ацетилированной глюкозы, а-нафтилацетата или р-нитрофенилацетата, но, как правило, не триацетилглицерина. Такой полипептид, как правило, не действует на ацетилированный маннан или пектин.
В настоящем документе ферулоилэстераза (ЕС 3.1.1.73) представляет собой любой полипептид, способный катализировать реакцию по следующему уравнению: ферулоил-сахарид + Н(2)О = ферулат + сахарид. Сахарид, например, может представлять собой олигосахарид или полисахарид. Фермент может, как правило, катализировать гидролиз 4-гидрокси-3-метоксициннамоильной (ферулоильной) группы эстерифицированного сахара, который обычно представляет собой арабинозу в "природных" субстратах, рнитрофенолацетат и метилферулат, как правило, представляют собой неудовлетворительные субстраты. Данный фермент также может быть отнесен к гидролазе циннамоилового эфира, эстеразе феруловой кислоты или гидроксициннамоилэстеразе. Он также может быть отнесен к вспомогательному гемицеллюлазному ферменту, поскольку он может помогать ксиланазам и пектиназам разрушать гемицеллюлозу и пектин клеточной стенки растений.
В настоящем документе кумароилэстераза (ЕС 3.1.1.73) представляет собой любой полипептид, способный катализировать реакцию по следующему уравнению: кумароил-сахарид + Н(2)О = кумарат + сахарид. Сахарид, например, может представлять собой олигосахарид или полисахарид. Данный фермент также может быть отнесен к транс-4-кумароилэстеразе, транс-п-кумароилэстеразе, п-кумароилэстеразе или эстераза п-кумаровой кислоты. Данный фермент также входит в ЕС 3.1.1.73, поэтому также может быть отнесен к ферулоилэстеразе.
В настоящем документе, а-галактозидаза (ЕС 3.2.1.22) представляет собой любой полипептид, способный катализировать гидролиз терминальных нередуцирующих остатков а-О-галактозы в а-Όгалактозидах, включая галактозу олигосахаридов, галактоманнанов, галактанов и арабиногалактанов. Такой полипептид также может быть способен гидролизовать а-О-фукозиды. Данный фермент также может быть отнесен к мелибиазе.
В настоящем документе β-галактозидаза (ЕС 3.2.1.23) представляет собой любой полипептид, способный катализировать гидролиз терминальных нередуцирующих остатков β-Ό-глюктозы в β-Όглюктозидах. Такой полипептид также может быть способен гидролизовать а-Ь-арабинозиды. Данный фермент также может быть отнесен к экзо-(1^4)^-О-галактаназе или лактазе.
- 12 028880
В настоящем документе β-маннаназа (ЕС 3.2.1.78) представляет собой любой полипептид, который способен катализировать неупорядоченный гидролиз 1,4^-О-маннозидных связей в маннанах, галактоманнанах и глюкоманнанах. Данный фермент также может быть отнесен к маннан-эндо-1,4^маннозидазе или эндо-1,4-маннаназе.
В настоящем документе β-маннозидаза (ЕС 3.2.1.25) представляет собой любой полипептид, способный катализировать гидролиз терминальных нередуцирующих остатков β-Ό-маннозы в β-Όманнозидах. Данный фермент также может быть отнесен к маннаназам или манназой.
Композиция изобретения может включать любую пектиназу, например эндополигалактуроназу, пектинметилэстеразу, эндогалактаназу, β-галактозидазу, пектинацетилэстеразу, эндопектинолиазу, пектатлиазу, а-рамнозидазу, экзогалактуроназу, экзполиглактуронатлиазу, рамногалактуронангидролазу, рамногалактуронанлиазу, рамногалактуронанацетилэстеразу, рамногалактуронангалакту-роногидролазу и ксилогалактуроназу.
В настоящем документе эндополигалактуроназа (ЕС 3.2.1.15) представляет собой любой полипептид, который способен катализировать неупорядоченный гидролиз 1,4-а-О-галактозидуроновых связей в пектате и других галактуронанах. Данный фермент также может быть отнесен к полигалактуроназе, пектиндеполимеразе, пектиназе, эндополигалактуроназе, пектолазе, пектингидролазе, пектинполигалактуроназе, поли-а-1,4-галактуронидгликангидролазе, эндогалактуроназе, эндо-О-галактуроназе или поли(1,4-а-О-галактуронид) гликангидролазе.
В настоящем документе пектинметилэстераза (ЕС 3.1.1.11) представляет собой любой фермент, способный катализировать реакцию: пектин + η Н2О = η метанол + пектат. Фермент может быть также известен как пектинэстераза, пектиндеметоксилаза, пектинметоксилаза, пектинметилэстераза, пектаза, пектиноэстераза или пектинпектилгидролаза.
В настоящем документе эндогалактаназа (ЕС 3.2.1.89) представляет собой любой фермент, способный катализировать эндогидролиз 1,4^-О-галактозидных связей в арабиногалактанах. Фермент также может быть известен как арабиногалактанэндо-1,4^-галактозидаза, эндо-1,4^-галактаназа, галактаназа, арабиногалактаназа или арабиногалактан-4^-Э-галактаногидролаза.
В настоящем документе пектинацетилэстеразу определяют как любой фермент, который обладает ацетилэстеразной активностью, которая катализирует деацетилирование ацетильных групп на гидроксильных группах остатков Оа1иА пектина.
В настоящем документе эндопектинлиаза (ЕС 4.2.2.10) представляет собой любой фермент, способный катализировать элиминирующее расщепление (1^4)-а-О-галактуронанметилового эфира с образованием олигосахаридов с 4-деокси-6-О-метил-а-О-галакт-4-энуронозиловыми группами на их нередуцирующих концах. Фермент также может быть известен как пектинлиаза, пектин-транс-элиминаза; эндопектинлиаза, полиметилгалактуроновая трансэлиминаза, пектинметилтрансэлиминаза, пектолиаза, РЬ, ΡΝΌ или РМОЬ или (1^4)-6-О-метил-аГО-галактуронанлиаза.
В настоящем документе пектатлиаза (ЕС 4.2.2.2) представляет собой любой фермент, способный катализировать элиминирующее расщепление (1^4)-а-О-галактуронана с образованием олигосахаридов с 4-деокси-а-О-галакт-4-энуронозиловыми группами на их нередуцирующих концах. Фермент также быть известен как полигалактуроновая трансэлиминаза, трансэлиминаза пектиновой кислоты, полигалактуронатлиаза, эндопектинметилтрансэлиминаза, пектаттрансэлиминаза, эндогалактуронаттрансэлиминаза, лиаза пектиновой кислоты, пектиновая лиаза, лиаза а-1,4-О-эндополигалактуроновой кислоты, РОЛ-лиаза, РРаза-Ν, лиазаэндо-а-1,4-полигалактуроновой кислоты, лиаза полигалактуроновой кислоты, пектин-транс-элиминаза, транс-элиминаза полигалактуроновой кислоты или (1^4)-α-Όгалактуронанлиаза.
В настоящем документе а-рамнозидаза (ЕС 3.2.1.40) представляет собой любой полипептид, способный катализировать гидролиз терминальных нередуцирующих остатков а-Ь-рамнозы в а-Ьрамнозидах или альтернативно в рамногалактуронане. Данный фермент также может быть известен как а-Ь-рамнозидаза Т, а-Ь-рамнозидаза N или а-Ь-рамнозид-рамногидролаза.
В настоящем документе экзогалактуроназа (ЕС 3.2.1.82) представляет собой любой полипептид, способный гидролизовать пектиновую кислоту на нередуцирующем конце, высвобождая дигалактуронат. Фермент также может быть известен как экзополи- а-галактуронозидаза, экзополигалактуронозидаза или экзополигалактуранозидаза.
В настоящем документе, экзогалактуроназа (ЕС 3.2.1.67) представляет собой любой полипептид, способный катализировать реакцию: (1,4-а-О-галактуронид)п + Н2О = (1,4-а-О-галактуронид)п-1 + Όгалактуронат. Фермент также может быть известен как галактуран-1,4-а-галактуронидаза, экзополигалактуроназа, поли(галактуронат)гидролаза, экзо-О-галактуроназа, экзо-О-галактуронаназа, экзополи-Όгалактуроназа или поли(1,4-а-Э-галактуронид)галактуроногидролаза.
В настоящем документе экзополигалактуронат-лиаза (ЕС 4.2.2.9) представляет собой любой полипептид, способный катализировать элиминирующее расщепление 4-(4-деокси-а-О-галакт-4-энуронозил)Ό-галактуроната на редуцирующем конце пектата, т.е. деэстерифицированного пектина. Данный фер- 13 028880
мент может быть известен как пектат-дисахарид-лиаза, пектат-экзо-лиаза, трансэлиминаза экзопектиновой кислоты, экзопектат-лиаза, транс-элиминаза экзополигалактуроновой кислоты, РАТЕ, экзо-РАТЕ, экзо-РОЬ или дисахарид-лиаза редуцирующего конца (1^4)-а-Э-галактуронана.
В настоящем документе рамногалактуронан-гидролаза представляет собой любой полипептид, способный гидролизовать связь между галактозилуроновой кислотой и рамнопиранозилом в любой эндоформе в строго чередующихся рамногалактуронановых структурах, состоящий из дисахарида [(1,2-а-Ьрамноил-(1,4)-а-галактозилуроновой кислоты].
В настоящем документе рамногалактуронан-лиаза представляет собой любой полипептид, который представляет собой любой полипептид, который способен расщеплять связи а-Е-Кйар-(1^4)-а-Э-Оа1рА связи эндо-способом в рамногалактуронане посредством β-элиминации.
В настоящем документе рамногалактуронан-ацетилэстераза представляет собой любой полипептид, который катализирует деацетилирование основной цепи чередующихся остатков рамнозы и галактуроновой кислоты в рамногалактуронане.
В настоящем документе рамногалактуронан-галактуроногидролаза представляет собой любой полипептид, способный гидролизовать экзоспособом галактуроновую кислоту от нередуцирующего конца строго чередующихся структур рамногалактуронана.
В настоящем документе ксилогалактуроназа представляет собой любой полипептид, который действует на ксилогалактуронан эндо-способом посредством расщепления основной цепи замещенной рксилозой галактуроновой кислоты. Данный фермент также может быть известен как ксилогалактуронангидролаза.
В настоящем документе а-Ь-арабинофуранозидаза (ЕС 3.2.1.55) представляет собой любой полипептид, который способен действовать на а-Ь-арабинофуранозиды, а-Ь-арабинаны, содержащие (1,2)-, и/или (1,3)-, и/или (1,5)-связи, арабиноксиланы и арабиногалактаны. Данный фермент также может быть отнесен к α-Ν-арабинофуранозидазе, арабинофуранозидазе или арабинозидазе.
В настоящем документе эндоарабинаназа (ЕС 3.2.1.99) представляет собой любой полипептид, способный катализировать эндогидролиз 1,5-а-арабинофуранозидных связей в 1,5-арабинанах. Фермент также может быть известен как эндоарабиназа, арабинан-эндо-1,5-а-Ь-арабинозидаза, эндо-1,5-а-Ьарабинаназа, эндо-а-1,5-арабаназа; эндоарабаназа или 1,5-а-Ь-арабинан-1,5-а-Ь-арабинаногидролаза.
Композиция изобретения, как правило, будет включать по меньшей мере одну целлюлазу, и/или по меньшей мере одну гемицеллюлазу, и/или по меньшей мере одну пектиназу (одна из которых представляет собой полипептид в соответствии с изобретением). Композиция изобретения может включать ОН61, целлобиогидролазу, эндоглюканазу и/или β-глюкозидазу. Такая композиция также может включать одну или несколько гемицеллюлаз и/или одну или несколько пектиназ.
Кроме того, в композиции изобретения могут присутствовать один или несколько (например, две, три, четыре или все) из перечисленных ферментов: амилаза, протеаза, липаза, лигниназа, гексозилтрансфераза, глюкуронидаза или экспансии или индуцируемый целлюлозой белок или интегрирующий на целлюлозе белок или подобный белок (выше они названы вспомогательными активностями).
"Протеаза" включает ферменты, которые гидролизуют пептидные связи (пептидазы), а также ферменты, которые гидролизуют связи между пептидами и другими составляющими, такими как сахара (гликопептидазы). Множество протеаз, которые характеризуются в соответствии с ЕС 3.4 и которые подходят для применения в изобретении, включены в настоящий документ путем отсылки. Некоторые специфичные типы протеаз включают цистеиновые протеазы, включая пепсин, папаин и сериновые протеазы, включая химотрипсины, карбоксипептидазы и металлоэндопептидазы.
Термин "липаза" включает ферменты, которые гидролизуют липиды, жирные кислоты и ацилглицериды, включая фосфоглицериды, липопротеины, диацилглицерины и т.п. В растениях липиды используются в качестве структурных компонентов для ограничения потери воды и патогенных инфекций. Эти липиды включают воски, полученные из жирных кислот, а также кутин и суберин.
Термин "лигниназа" включает ферменты, которые могут гидролизовать или разрушать структуру лигниновых полимеров. Ферменты, которые могут разрушить лигнин, включают лигнинпероксидазы, марганецпероксидазы, лакказы и феруоилэстеразы и другие ферменты, описанные в данной области техники, известные своей способностью деполимеризовать или, в ином случае, разрушать лигниновые полимеры. Также включают ферменты, способные гидролизовать связи, образованные между гемицеллюлозными сахарами (особенно арабинозой) и лигнином. Лигниназы включают, но не ограничиваются ими, следующие группы ферментов: лигнинпероксидазы (ЕС 1.11.1.14), марганецпероксидазы (ЕС 1.11.1.13), лакказы (ЕС 1,10,3,2) и феруоилэстеразы (ЕС 3.1.1.73).
Термин "гексозилтрансфераза" (2,4,1-) включает ферменты, которые способны катализировать трансферазную реакцию, но которые могут также катализировать реакцию гидролиза, например, целлюлозы и/или продуктов деградации целлюлозы. β-глюканозилтрансфераза представляет собой пример гексозилтрансферазы, которая может быть применена в изобретении. Такой фермент может быть способен катализировать деградацию (1,3)(1,4)глюкана и/или целлюлозы и/или продукта деградации целлюлозы.
Термин "глюкуронидаза" включает ферменты, которые катализируют гидролиз глюкуронозида, на- 14 028880
пример β-глюкуронозида с получением спирта. Многие глюкуронидазы были охарактеризованы, и они могут подходить для применения в изобретении, например β-глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.31), гиалуроноглюкуронидаза (ЕС 3.2.1.36), глюкуронозилдисульфглюкозамин-глюкуронидаза (3.2.1.56), глицирризинат^-глюкуронидаза (3.2.1.128) или α-Ό-глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.139).
Композиция используемая в изобретении может включать экспансин или экспансинподобный белок, такой как сволленин (см., §а1Ьешо е! а1., Еиг. 1. ВюЬет. 269. 4202-4211, 2002) или сволленинподобный белок.
Экспансины вовлечены в ослабление структуры клеточной стенки в ходе роста растительной клетки. Предполагается, что экспансины разрушают водородные связи между целлюлозой и другими полисахаридами клеточной стенки, не обладая гидролитической активностью. Таким образом, они, как считается, позволяют раздвинуть волокна целлюлозы и расширить клеточную стенку. Сволленин, экспансинподобный белок содержит домен Ν-концевого углевод-связывающего модуля семейства 1 (ΘΒΌ) и Сконцевой экспансинподобный домен. Для целей настоящего изобретения экспансинподобный белок или сволленинподобный белок может включать один или оба таких домена и/или может разрушать структуру клеточных стенок (например, нарушая структуру целлюлозы), необязательно, без образования детектируемых количеств редуцирующих сахаров.
Композиция, используемая в изобретении, может представлять собой индуцируемый целлюлозой белок, например полипептидный продукт гена Ср1 или С1р2 или аналогичных генов (см., Рогетаи е! а1., 1. Βίο1. СЬет. 278(34), 31988-31997, 2003), целлюлоза/целлюлосома-интегрирующий белок, например полипептидный продукт гена СрА или С1рС, или скаффолдин или скаффолдиноподобный белок. Скаффолдины и интегрирующие в целлюлозу белки представляют собой мультифункциональные интегрирующие субзвенья, которые могут организовать целлулолитические субзвенья в мультиферментный комплекс. Это достигается за счет взаимодействия двух комплементарных классов доменов, т. е. домена сцепления и стыковочного домена на каждой ферментной единице. Субъединица скаффолдина также несет модуль связывания с целлюлозой (СВМ), который опосредует прикрепление целлюлосомы к ее субстрату. Скаффолдин или интегрирующий в целлюлозу белок для целей настоящего изобретения может включать один или оба таких домена.
Композиция, используемая в способе изобретения, может состоять из члена каждого класса ферментов, упомянутых выше, нескольких членов одного класса ферментов или любой комбинации этих данных классов ферментов или вспомогательных белков (т.е. тех белков, которые упомянуты в настоящем документе и которые не имеют энзиматической активности рег 8е, но, тем не менее, помогают при деградации лигноцеллюлозы).
Композиция, используемая в способе изобретения, может состоять из ферментов, полученных (1) от коммерческих поставщиков; (2) из ферментов, экспресируемых клонированными генами; (3) из сложного бульона (такого как бульон, получаемый в результате роста микробного штамма в среде, в которой штаммы секретируют белки и ферменты в среды); (4) из клеточных лизатов штаммов, растущих как в (3); и/или (5) из растительного материала, экспрессирующего ферменты. Различные ферменты в композиции изобретения могут быть получены из различных источников.
Ферменты могут быть получены экзогенно в микроорганизмах, дрожжах, грибах, бактериях или растениях, затем выделены и добавлены, например, к лигноцеллюлозному сырью. Альтернативно, ферменты продуцируют, но не выделяют, и неочищенную клеточную массу в ферментационном бульоне или растительный материал (такой как кукурузная солома или пшеничная солома) и им подобные, могут быть добавлены, например, в исходное сырье. Альтернативно, неочищенная клеточная масса или среда продуцирования фермента или растительный материал могут быть обработаны для предотвращения дальнейшего микробного роста (например, нагреванием или добавлением антимикробных средств), а затем добавлены, например, в исходное сырье. Данные неочищенные смеси ферментов могут включать организм, продуцирующий фермент. Альтернативно, фермент может быть получен при ферментации, в которой используют (предварительно обработанное) исходное сырье (такое как кукурузная солома или пшеничная солома) для обеспечения питания организма, который продуцирует фермент(ферменты). Таким образом, растения, которые продуцируют ферменты, могут сами служить в качестве лигноцеллюлозного исходного сырья и могут быть добавлены в лигноцеллюлозное исходное сырье.
В применениях и способах, описанных в настоящем документе, компоненты композиций, описанные выше, могут быть внесены одновременно (т.е. в качестве единой композиции рег 8е) или по отдельности или последовательно.
Изобретение, таким образом, относится к способам, в которых применяют описанную выше композицию и к применениям композиции в промышленных способах.
Лигноцеллюлозный материал.
Лигноцеллюлозный материал в настоящем документе включает любой лигноцеллюлозный и/или гемицеллюлозный материал. Лигноцеллюлозный материал, подходящий для применения в качестве исходного сырья в изобретении, включает биомассу, например первичную биомассу и/или непервичную биомассу, такую как сельскохозяйственная биомасса, коммерческая органика, строительный и городской
- 15 028880
мусор, твердые бытовые отходы, макулатура и отходы садоводства. Распространенные формы биомассы включают деревья, кустарники и травы, пшеницу, пшеничную солому, жом сахарного тростника, просо, мискант, кукурузу, кукурузную солому, листовую обертку початков кукурузы, стержни кукурузных початков, стебли канолы, стебли соевых бобов, сахарное сорго, кукурузное зерно, включая волокна из зерен, продукты и побочные продукты помола зерен, таких как кукуруза, пшеница и ячмень (включая влажный помол и сухой помол), часто называемые "отруби или волокна", а также в качестве твердых коммунальных отходов, макулатуру и отходы садоводства. Биомасса также может представлять собой, без ограничений, травянистый материал, отходы сельского хозяйства, отходы лесного хозяйства, твёрдые коммунальные отходы, макулатуру, и жом и отходы бумажного производства. "Сельскохозяйственная биомасса" включает ветки, кусты, стебли кустарников, кукурузу и листовую обёртку початков кукурузы, энергетические культуры, лесоматериалы, плоды, цветки, зерно, злаковые, травянистые культуры, листья, кору, хвою, бревна, корни, побеги, деревянистые культуры с коротким оборотом рубки, кустарники, просо, деревья, овощи, кожуру плодов, лозу, жом сахарной свёклы, пшеничную крупку, шелуху овса и древесину твердых и мягких пород (не включая древесину с вредными материалами). Кроме того, сельскохозяйственная биомасса включает материалы органических отходов, образованных в ходе сельскохозяйственных процессов, включая фермерскую и лесоводческую деятельность, особенно, включая древесные отходы лесного хозяйства. Сельскохозяйственная биомасса может представлять собой любую из вышеупомянутых биомасс, отдельно или в любой комбинации или их смесью.
Предварительная обработка.
Исходное сырье, необязательно, может быть предварительно обработано путем нагревания, механической и/или химической модификации или любой комбинации таких способов с целью повышения доступности субстрата для ферментативного гидролиза и/или гидролиза гемицеллюлозы и/или солюбилизации гемицеллюлозы и/или целлюлозы и/или лигнина, любым способом, известным в данной области техники. В одном из воплощений предварительную обработку проводят, обрабатывая лигноцеллюлозу паром, применяя обработку горячей водой или обработку разбавленной кислотой или разбавленным основанием.
Стадия промывки.
Необязательно, способ в соответствии с изобретением включает стадию промывки. Необязательная стадия промывки может быть применена для удаления водорастворимых соединений, которые могут действовать как ингибиторы на стадии ферментации. Стадия промывки может быть проведена известным способом.
Ферментативный гидролиз.
Ферментная композиция, примененная в способе изобретения, может чрезвычайно эффективно гидролизовать лигноцеллюлолитический материал, например кукурузную солому или пшеничную солому, который в дальнейшем может быть превращен в полезный продукт, такой как этанол, биогаз, бутанол молочную кислоту, пластмассы, органическую кислоту, растворитель, добавку к кормам для животных, лекарственный препарат, витамин, аминокислоту, фермент или сырьё для химической промышленности. Кроме того, промежуточные продукты из способа, следующего за гидролизом, например молочная кислота в качестве промежуточного продукта при получении биогаза, могут быть применены в качестве строительного блока для других веществ. Настоящее изобретение проиллюстрировано получением этанола, но это сделано только в иллюстративных целях, а не как ограничение, в равной степени могут быть получены и другие упомянутые полезные продукты.
Способ в соответствии с изобретением включает стадию ферментативного гидролиза. Ферментативный гидролиз включает, без ограничений, гидролиз с целью перевода исходного сырья в жидкое состояние и гидролиз с целью высвобождения сахара их исходного сырья или и то, и другое. На данной стадии необязательно предварительно обработанный и необязательно промытый лигноцеллюлозный материал приводят в контакт с ферментной композицией в соответствии с изобретением. В зависимости от лигноцеллюлозного материала и предварительной обработки различные условия реакции, например, температура, дозировка фермента, время реакции гидролиза и концентрация сухого вещества, могут быть адаптированы специалистом для достижения желаемого превращения лигноцеллюлозы в сахар. Некоторые указания приведены ниже.
В одном из аспектов изобретения гидролиз проводят при температуре, равной 45°С или более, 50°С или более, 55°С или более, 60°С или более, 65°С или более, или 70°С или более. Высокая температура в ходе гидролиза имеет много преимуществ, включая работу ферментной композиции в своем оптимуме температуры, снижение риска (бактериального) заражения, снижение вязкости, меньшее количество необходимой охлаждающей воды, применение охлаждающей воды с более высокой температурой, повторное применение ферментов и т.д.
В следующем аспекте изобретения количество добавленной ферментной композиции (в настоящем документе также называемое дозировка фермента или ферментная нагрузка) является низким. В одном варианте воплощения количество фермента равно 6 мг белка/г массы сухого вещества или ниже, 5 мг белка/г сухого вещества или ниже, 4 мг белка/г сухого вещества или ниже, 3 мг белка/г сухого вещества или ниже, 2 мг белка/г сухого вещества или ниже, или 1 мг белка/г сухого вещества или ниже (выражает- 16 028880
ся как белок в мг белка/г сухого вещества). В одном варианте воплощения, количество фермента равно 0,5 мг фермента/г массы сухого вещества или ниже, 0,4 мг ферментной композиции/г массы сухого вещества или ниже, 0,3 мг фермента/г массы сухого вещества или ниже, 0,25 мг фермента/г массы сухого вещества или ниже, 0,20 мг фермента /г массы сухого вещества или ниже, 0,18 мг фермента/г массы сухого вещества или ниже, 0,15 мг фермента/г массы сухого вещества или ниже или 0,10 мг фермента /г массы сухого вещества или ниже (выражается как сумма целлюлазных ферментов в мг фермента/г сухого вещества). Низкие дозировки фермента допустимы, поскольку из-за активности и стабильности ферментов возможно увеличение времени реакции гидролиза.
В дополнительном аспекте изобретения продолжительность реакции гидролиза равна 5 ч или более, 10 ч или более, 20 ч или более, 40 ч или более, 50 ч или более, 60 ч или более, 70 ч или более, 80 ч или более, 90 ч или более, 100 ч или более, 120 ч или более, 130 ч или более. В другом аспекте продолжительность реакции гидролиза равна от 5 до 150 ч, от 40 до 130 ч, от 50 до 120 ч, от 60 до 120 ч, от 60 до 110 ч, от 60 до 100 ч, от 70 до 100 ч, от 70 до 90 ч или от 70 до 80 ч. Благодаря стабильности ферментной композиции можно увеличивать продолжительность реакции гидролиза с соответствующим повышением выхода сахара.
рН в ходе гидролиза может быть выбран специалистом. В дополнительном аспекте изобретения рН в ходе гидролиза может быть равен от 3,0 до 6,4. Стабильные ферменты изобретения могут иметь широкий диапазон рН, вплоть до 2 единиц рН, вплоть до 3 единиц рН, вплоть 5 единиц рН. Оптимум рН может лежать в пределах рН от 2,0 до 8,0, от 3,0 до 8,0, от 3,5 до 7,0, от 3,5 до 6,0, от 3,5 до 5,0, от 3,5 до 4,5, от 4,0 до 4,5 или может быть равен примерно 4,2.
В дополнительном аспекте изобретения стадию гидролиза проводят до тех пор, пока из лигноцеллюлозного материала не высвободится 70% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 92% или более, 95% или более доступного сахара.
Важно, что способ изобретения может быть осуществлен с использованием высокой концентрации сухого вещества (лигноцеллюлозного материала) в реакции гидролиза. Таким образом, изобретение может быть осуществлено с содержанием сухого вещества, равным примерно 5 мас.% или выше, примерно 8 мас.% или выше, примерно 10 мас.% или выше, примерно 11 мас.% или выше, примерно 12 мас.% или выше, примерно 13 мас.% или выше, примерно 14 мас.% или выше, примерно 15 мас.% или выше, примерно 20 мас.% или выше, примерно 25 мас.% или выше, примерно 30 мас.% или выше, примерно 35 мас.% или выше или примерно 40 мас.% или выше. В дополнительном воплощении содержание сухого вещества на стадии гидролиза равно 14 мас.%, 15 мас.%, 16 мас.%, 17 мас.%, 18 мас.%, 19 мас.%, 20 мас.%, 21 мас.%, 22 мас.%, 23 мас.%, 24 мас.%, 25 мас.%, 26 мас.%, 27 мас.%, 28 мас.%, 29 мас.%, 30 мас.%, 31 мас.%, 32 мас.%, 33 мас.% или более или от 14 до 33 мас.%.
Ферментация.
Способ в соответствии с изобретением включает стадию ферментации. Таким образом, в дополнительном аспекте изобретение включает такие процессы на стадии ферментации, где для ферментации источника углерода, включающего сахар(сахара), например глюкозу, Ь-арабинозу и/или ксилозу, применяют микроорганизмы. Источник углерода может включать любой углеводный олиго- или полимер, включающий звенья Ь-арабинозы, ксилозы или глюкозы, такой, например, как лигноцеллюлоза, ксиланы, целлюлоза, крахмал, арабинан и им подобные. Для высвобождения звеньев ксилозы или глюкозы из таких углеводов, соответствующие карбогидразы (такие как ксиланазы, глюканазы, амилазы и им подобные) могут быть добавлены к среде ферментации или могут быть получены с помощью модифицированной клетки-хозяина. В последнем случае модифицированная клетка-хозяин может быть создана методами генетической инженерии для продуцирования и экскреции такой карбогидразы. Дополнительное преимущество применения олиго- или полимерных источников глюкозы заключается в том, что оно позволяет поддерживать низкие(сниженные) концентрации свободной глюкозы в ходе ферментации, например, применяя скоростьлимитирующие количества карбогидраз. Это, в свою очередь, будет препятствовать подавлению систем, необходимых для метаболизма и транспорта отличного от глюкозы сахара, такого как ксилоза. В предпочтительном способе модифицированная клетка-хозяин ферментирует как Ьарабинозу (необязательно, ксилозу), так и глюкозу, предпочтительно одновременно, в таком случае предпочтительно применяют модифицированную клетку-хозяина, которая нечувствительна к глюкозной репрессии для предотвращения диауксического роста. В добавлении к источнику Ь-арабинозы, необязательно, ксилозы (и глюкозы) в качестве источника углерода, среда ферментации дополнительно будет включать соответствующий ингредиент, необходимый для роста модифицированной клетки-хозяина. Композиции среды ферментации для роста микроорганизмов, таких как дрожжи или мицелиальные грибы, хорошо известны в данной области техники.
Продолжительность ферментации может быть меньше, чем при традиционной ферментации в тех же условиях, в которых часть ферментативного гидролиза по-прежнему должна принять участие в ходе ферментации. В одном из воплощений продолжительность ферментации равна 100 ч или менее, 90 ч или менее, 80 ч или менее, 70 ч или менее, или 60 ч или менее, для композиции сахаров с 50 г/л глюкозы и соответствующих других сахаров из лигноцеллюлозного исходного сырья (например, 50 г/л ксилозы, 35 г/л Ь-арабинозы и 10 г/л галактозы). Для более разбавленных композиций сахаров продолжительность
- 17 028880
ферментации может быть соответственно снижена.
Процесс ферментации может представлять собой аэробный или анаэробный процесс. Анаэробный процесс ферментации в настоящем документе определяют как проведение ферментации в отсутствии кислорода или как проведение ферментации, в котором кислород в значительной степени не потребляется, предпочтительно потребляется менее чем 5, 2,5 или 1 ммоль/л/ч, более предпочтительно 0 ммоль/л/ч (т.е. потребление кислорода не детектируется), и в котором органические молекулы служат в качестве как донора электронов, так и акцептора электронов. В отсутствие кислорода ΝΆΌΗ, производимый в гликолизе и при образовании биомассы, не может быть окислен путем окислительного фосфорилирования. Для решения этой проблемы многие микроорганизмы используют пируват или одно его производных в качестве акцептора электрона и водорода, тем самым регенерируя ΝΆΌ+. Таким образом, в предпочтительном анаэробном процессе ферментации пируват применяют в качестве акцептора электрона (и водорода), и он восстанавливается до таких продуктов ферментации, как этанол, молочная кислота, 3гидроксипропионовая кислота, акриловая кислота, уксусная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, фумаровая кислота, аминокислота, 1,3-пропандиол, этилен, глицерин, биогаз, βлактамные антибиотики и цефалоспорин. В предпочтительном воплощении процесс ферментации представляет собой анаэробный процесс. Анаэробный процесс предпочтителен, поскольку он дешевле аэробных процессов: для него требуется менее специализированное оборудование. Кроме того, ожидается, что анаэробные процессы дадут более высокий выход продукта по сравнению с аэробными процессами. В аэробных условиях, как правило, выход биомассы выше, чем в анаэробных условиях. Вследствие этого, как правило, в аэробных условиях, ожидаемый выход продукта ниже, чем в анаэробных условиях.
В другом варианте воплощения процесс ферментации представляет собой процесс ферментации лимитированных по кислороду условиях. Более предпочтительно процесс ферментации является аэробным и в лимитированных по кислороду условиях.
Лимитированный по кислороду процесс ферментации представляет собой такой процесс, в котором потребление кислорода лимитируется переносом кислорода из газообразной фазы в жидкость. Степень ограничения по кислороду определяют по количеству и композиции потока входящего газа, а также по фактическим характеристикам по смешиванию/массопереносу примененного ферментационного оборудования. Предпочтительно в процессе с лимитированными по кислороду условиями, скорость потребления кислорода равна по меньшей мере 5,5, более предпочтительно по меньшей мере 6 и еще более предпочтительно по меньшей мере 7 ммоль/л/ч.
Процесс ферментации предпочтительно осуществляют при температуре, оптимальной для модифицированной клетки. Таким образом, для большинства клеток дрожжей или грибов процесс ферментации осуществляют при температуре менее чем 42°С, предпочтительно менее чем 38°С. Для клеток-хозяев, представляющих собой дрожжевые клетки или клетки мицелиальных грибов, процесс ферментации предпочтительно осуществляют при температуре ниже чем 35, 33, 30 или 28°С и при температуре выше чем 20, 22 или 25°С.
В одном варианте воплощения изобретения стадию ферментации проводят с микроорганизмом, который способен ферментировать по меньшей мере один С5-сахар. В одном варианте воплощения процесс представляет собой процесс продукции этанола, поэтому он включает стадию, предусматривающую ферментирование среды, содержащей сахар(сахара) микроорганизмом, который способен ферментировать по меньшей мере один С 5-сахар, где клетка-хозяин способна ферментировать глюкозу, Ь-арабинозу и ксилозу до этанола. В варианте воплощения этого процесса микроорганизм, который способен ферментировать по меньшей мере один С5-сахар, представляет собой дрожжи. В одном варианте воплощения дрожжи принадлежат к роду Бассйаготусек, предпочтительно к виду §ассйаготусек се1^ыае, где были сделаны генетические изменения. Пример такого микроорганизма и его получение подробно описано в АО 2008/041840 и в заявке на европейский патент ЕР10160622.6, поданной 21 апреля 2010. В варианте воплощения способ ферментации для получения этанола представляет собой анаэробный процесс ферментации. Термин "анаэробный" уже был определен выше в настоящем документе. В другом предпочтительном варианте воплощения способ ферментации для получения этанола представляет собой аэробный процесс ферментации. В другом предпочтительном варианте воплощения способ ферментации для получения этанола представляет собой процесс ферментации в лимитированных по кислороду условиях, более предпочтительно аэробный и в условиях лимитирования по кислороду. Лимитированные по кислороду условия уже были определены выше в настоящем документе.
В таком процессе объемная продукция этанола предпочтительно равна по меньшей мере 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 5,0 или 10,0 г этанол на л/ч. Выход по этанолу на Ь-арабинозе и, необязательно, на ксилозе и/или глюкозе в способе предпочтительно равен по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98%. Выход по этанолу в настоящем документе определяют как процент от теоретического максимального выхода, который для глюкозы и Ь-арабинозы и, необязательно, ксилозы равен 0,51 г этанола на 1 г глюкозы или ксилозы.
В одном из аспектов способ ферментации, ведущий к продукции этанола, имеет несколько преимуществ по сравнению с известными способами ферментации, применяемыми для получения этанола:
возможны анаэробные процессы;
- 18 028880
также возможны условия лимитирования по кислороду;
могут быть получены повышенные выходы по этанолу и повышенные объёмы производства этанола;
примененный штамм может быть способен использовать Ь-арабинозу и. необязательно. ксилозу.
Альтернативно в описанном выше способе ферментации могут быть применены по меньшей мере две различные клетки. это означает. что данный способ представляет собой процесс совместной ферментации. Все предпочтительные воплощения процессов ферментации. такие как описаны выше. также представляют собой предпочтительные воплощения данного способа совместной ферментации: идентичный продукт ферментации. идентичный источник Ь-арабинозы и источник ксилозы. условия ферментации (аэробные или анаэробные условия. лимитированные по кислороду условия. температура. при которой способ осуществляют. эффективность производства этанола. выход этанола).
Процесс ферментации может быть осуществлен без необходимости доведения рН в ходе процесса. Другими словами. способ таков. что может быть осуществлен без добавления какой-либо кислоты(кислот) или основания(оснований). Однако это верно за исключением стадии предварительной обработки. на которой может быть добавлена кислота. Дело в том. что композиция изобретения способна действовать при низких рН и. таким образом. нет необходимости корректировать рН предварительно обработанного кислотой исходного сырья для того. чтобы могли протекать осахаривание или гидролиз. Соответственно. способ изобретения может представлять собой безотходный способ с применением только органических продуктов без необходимости введения неорганических химических соединений.
Общее время реакции.
В соответствии с изобретением общее время реакции (или совокупное время реакции на стадии гидролиза и на стадии ферментации) может быть снижено. В одном из воплощений изобретения общее время реакции равно 300 ч или менее. 200 ч или менее. 150 ч или менее. 140 ч или менее. 130 или менее. 120 ч или менее. 110 ч или менее. 100 ч или менее. 90 ч или менее. 80 ч или менее. 75 ч или менее или примерно 72 ч при 90%-м выходе глюкозы. Соответственно. снижение общего времени может быть достигнуто при снижении выхода глюкозы.
Продукты ферментации.
Продукты ферментации. которые могут быть получены в соответствии с изобретением. включают аминокислоты. витамины. лекарственные препараты. кормовые добавки для животных. химические продукты специального назначения. химическое исходное сырье. пластмассы. растворители. различные виды топлива или другие органические полимеры. молочную кислоту и этанол. включая топливный этанол (термин "этанол" понимается как включающий этиловый спирт или смеси этилового спирта и воды).
Конкретные полезные продукты. которые могут быть получены способами изобретения. включают различные виды биотоплива (включая биогаз. этанол и бутанол); молочную кислоту; 3-гидроксипропионовую кислоту; акриловую кислоту; уксусную кислоту; 1.3-пропандиол; этилен; глицерин; пластмассы; химические продукты специального назначения; органические кислоты. включая лимонную кислоту. янтарную кислоту и малеиновую кислоту; растворители; добавки к кормам для животных; лекарственные препараты. такие как β-лактамный антибиотик или цефалоспорин; витамины; аминокислоты. например лизин. метионин. триптофан. треонин и аспарагиновую кислоту; ферменты. например протеазу. целлюлазу. амилазу. глюканазу. лактазу. липазу. лиазу. оксидоредуктазу. трансферазу или ксиланазу; исходное химическое сырье; или добавку к кормам для животных. но не ограничиваются ими.
Разделение продуктов ферментации.
Способ в соответствии с изобретением. необязательно. включает извлечение продукт ферментации. Продукт ферментации может представлять собой продукт. отделенный от ферментационного бульона любым известным способом. Таким образом. для каждого продукта ферментации специалист будет способен выбрать надлежащую методику разделение. Например. этанол может быть отделен от дрожжевого ферментационного бульона путем перегонки. например перегонки традиционным способом с водяным паром/перегонки при пониженном давлении.
Некоторые воплощения изобретения будет подробно описаны ниже. но они никоим образом не ограничивают объем настоящего изобретения.
Применение термостабилъных ферментов в оптимальных температурных условиях.
В одном из воплощений изобретение относится к применению термостабильных ферментов. таких как целлюлолитические ферменты из Какаткоша. для получения редуцирующих сахаров из предварительно обработанного лигноцеллюлозного сырья. например. в продукции этанола. Целлюлолитические ферменты из Какаткоша. применяемые для воздействия на предварительно обработанное лигноцеллюлозное сырье. демонстрируют максимальные скорости превращения при температуре в диапазоне от 50 до 70°С. Фермент сохраняет активность в данных условиях в течение 14 дней и более без полного прекращения активности.
При применении оптимальных температурных условий максимальное количество редуцирующих сахаров может быть высвобождено из исходного сырья (полный гидролиз) в самые короткие из возможных времена гидролиза. В этом случае 100% превращения целлюлозы в глюкозу достигали менее чем за 5 дней.
- 19 028880
Теоретический максимальный выход (Υρδ тах в г продукта на 1 г глюкозы) продукта ферментации может быть получен из учебника биохимии. Для этанола 1 моль глюкозы (180 г) в соответствии с нормальным гликолитическим энзиматическим путем в дрожжах дает 2 моль этанола (=2x46 = 92 г этанола). Теоретический максимальный выход этанола из глюкозы, таким образом, равен 92/180 = 0,511 г этанола/г глюкозы.
Для биогаза (МА 74 г/моль) или изобиогаза теоретический максимальный выход равен 1 моль биогаза на 1 моль глюкозы. Таким образом, Υρδ тах для (изо-)биогаза = 74/180 = 0,411 г (изо-)биогаза/г глюкозы.
Для молочной кислоты выход ферментации для гомомолочной ферментации равен 2 моль молочной кислоты (МА = 90 г/моль) на 1 моль глюкозы. В соответствии с данной стехиометрией Υρδ тах = 1 г молочной кислоты/г глюкозы.
Для других продуктов ферментации может быть выполнен аналогичный расчет.
Снижение издержек, достигаемое с применением целлюлолитических ферментов из Какаткоша, будет достигаться в результате сокращения времени способа в целом.
Компенсация снижения дозировки фермента продлением времени гидролиза с помощью ферментов Какаткоша.
Благодаря высокой стабильности ферментов активность со временем не прекращается, хотя в ходе гидролиза высвобождаются меньше редуцирующих сахаров.
Поэтому возможно снижать дозировку фермента и продлевать применение фермента, увеличивая время гидролиза с получением аналогичных уровней высвобождающихся редуцирующих сахаров. Например, 0,175 мл фермента/г сухого вещества исходного сырья приводит к выходу, равному приблизительно 90% от теоретического максимума редуцирующих сахаров из предварительно обработанного исходного сырья в течение 72 ч. При применении 0,075 мл фермента/г исходное сырье сухого вещества достигали приблизительно 90% превращения от теоретического максимума в течение 120 ч. Результаты показали, что благодаря стабильности ферментативной активности снижение дозировки фермента может быть скомпенсировано за счет продления времени гидролиза с получением такого же количества редуцирующего сахара. Такие же рассуждения для гидролиза предварительно обработанного исходного сырья при содержании сухого вещества выше чем 10% показывают, что компенсирующий эффект продленного времени гидролиза имеет место при 15% сухого вещества исходного сырья.
Снижение издержек, достигаемое с применением стабильных целлюлолитических ферментов, таких как ферменты Какаткоша, является результатом того, что для получения сходного выхода гидролиза может быть использовано меньшее количество фермента.
Снижение риска загрязнения со стабильными ферментами.
В традиционном способе превращения лигноцеллюлозного материала в этанол стадии процесса предпочтительно выполняют в септических условиях для снижения эксплуатационных расходов. Таким образом, может происходить заражение и рост загрязняющих микроорганизмов, что приводит к нежелательным побочным эффектам, таким как продукция молочной кислоты, муравьиной кислоты и уксусной кислоты, потери в выходах этанола на субстрате, продукция токсинов и внеклеточных полисахаридов, что может существенно повлиять на стоимость производства. Высокая температура способа и/или короткое время способа будут снижать риск загрязнения в ходе гидролиза и ферментации. Термостабильные ферменты, такие как ферменты Какаткоша, способны гидролизовать лигноцеллюлозное исходное сырье при температурах выше 60°С. При данных температурах риск того, что загрязняющие микроорганизмы вызовут нежелательные побочные эффекты, будет наименьшим, практически равным нулю.
На протяжении стадии ферментации, на которой продуцируется этанол, температура, как правило, равна от 30 до 37°С и предпочтительно не будет увеличиваться из-за потерь в продукции. Если время ферментации будет как можно более коротким, то риски и эффекты заражения и/или роста загрязняющих микроорганизмов будут снижены насколько это возможно. Со стабильными ферментами, такими как ферменты Какаткоша, насколько можно сократить время ферментации (см. описание выше), и, таким образом, риски заражения и/или роста загрязняющих микроорганизмов будут снижены насколько это возможно. Снижение затрат, достигаемое путем применения целлюлолитических термостабильных ферментов из Какаткоша, в этом случае происходит в результате снижения риска сбоев в способе, связанных с заражением.
Стабильные ферменты снижают затраты на охлаждение и увеличивают продуктивность заводов по производству спирта.
Первая стадия после предварительной термической обработки представляет собой охлаждение предварительно обработанного исходного сырья до температур, при которых ферменты оптимально активны. В промышленных масштабах это, как правило, выполняют путем добавления (охлажденной) воды, что будет, помимо снижения температуры, уменьшать содержание сухого вещества. Путем применения термостабильных ферментов, таких как ферменты Какаткоша, снижение расходов может быть достигнуто благодаря и тому, что (ί) требуется меньшее охлаждение предварительно обработанного исходного сырья, поскольку в ходе гидролиза допускаются более высокие температуры, и (ίί) меньше поды добавляют, что увеличивает содержание сухого вещества в ходе гидролиза и ферментации и, таким обра- 20 028880
зом, увеличивает мощность производства этанола (полученное количество в единицу времени на объем) завода по производству спирта. Кроме того, путем применения термостабильных ферментов в соответствии с изобретением, таких как фгрменты Какашкоша, снижение расходов также может быть достигнуто путем применения охлаждающей воды, которая имеет более высокую температуру по сравнению с водой, которую применяют в способе с нетермостабильными ферментами.
Повторное применение ферментов после гидролиза со стабильными ферментами.
В конце гидролиза ферментативные активности, по всей видимости, будут низкими, поскольку мало редуцирующих сахаров высвобождается, когда превращена почти вся целлюлоза. Количество присутствующей энзиматической активности, однако, упадет лишь незначительно, предположительно, главным образом, из-за абсорбции ферментов на субстрате. Применяя разделение твердого вещества и жидкости после гидролиза, такое как центрифугирование, фильтрация, осаждение и т.п., 60% или более, например 70% ферментативной активности в растворе может быть извлечено и повторно применено для гидролиза нового предварительно обработанного лигноцеллюлозного исходного сырья в ходе следующего гидролиза.
Кроме того, после разделения твердого вещества и жидкости фермент в растворе может быть отделен от раствора, содержащего редуцирующие сахара и другие продукты гидролиза, полученные в результате деятельности ферментов. Данное разделение может быть выполнено, без ограничений, с помощью (ультра и микро)фильтрации, центрифугирования, осаждения, седиментации, с исходной адсорбцией фермента на носителе любого типа или без нее.
Например, после гидролиза предварительно обработанного исходного сырья с ферментной нагрузкой, равной 0,175 мл/г сухого вещества исходного сырья, редуцирующие сахара высвобождаются в количестве 50% от теоретического максимума в течение 20 ч, и после такого же гидролиза 90% от теоретически максимального количества редуцирующих сахаров высвобождается в течение 72 ч. С помощью центрифугирования и ультрафильтрации 60-70% ферментативной активности извлекают в ретентате, в то время как фильтрат содержит более чем 80% высвобожденных редуцирующих сахаров. Путем повторного использования ретентата или как есть, или после дополнительной очистки и/или концентрации, дозировка фермента на протяжении следующей стадии гидролиза может быть снижена на 60-70%. Снижение расходов, достигаемое путем применения целлюлолитических стабильных ферментов, таких как ферменты из Какашкоша, в этом случае происходит за счет уменьшения дозировки фермента.
Повторное применение ферментов после гидролиза в комбинации с продукцией ферментов и повторным применением клеток дрожжей со стабильными ферментами.
Способ, включающий повторное применение ферментов после гидролиза, как описано выше, может быть скомбинирован с повторным применением продуцирующих этанол микроорганизмов после ферментации и с применением фильтрата, содержащего редуцирующие сахара, в качестве субстрата (очищенного и/или сконцентрированного или разбавленного) в ферментации фермент-продукция и в качестве субстрата для культивирования этанол-продуцирующих микроорганизмов.
Повторное применение ферментов после перегонки при пониженном давлении со стабильными ферментами.
Термостабильность ферментов, таких как ферменты из Какашкоша, позволяет сохранить целлюлолитическую активность после гидролиза, ферментации и перегонки при пониженном давлении в тонкой барде. Общая активность фермента снижается на протяжении трех последовательных стадий способа. Таким образом, тонкая барда, полученная после перегонки при пониженном давлении, может быть применена повторно в качестве источника фермента для вновь запущенного цикла гидролиз-ферментацияперегонка способа превращения предварительно обработанной пшеничной соломы в этанол. Тонкая барда может быть применена или в сконцентрированной или (не)разбавленной форме и/или может быть очищена с дополнительной добавкой фермента или без нее.
Повторное применение ферментов в комбинации с добавкой фермента после перегонки при пониженном давлении с термостабилъными ферментами.
В оптимальном способе количество фермента, которое добавляют в тонкую барду, перед ее повторным применением в новом цикле способа равно количеству активности, потерянной в ходе трех последовательных стадий способа предыдущего цикла способа. В этом случае избегают передозировки фермента и, таким образом, получают наиболее эффективное применение фермента.
Кроме того, обеспечивая высокую дозировку фермента на первом цикле способа и дополнительное внесение в следующие циклы способа фермента в количестве, равном активности, потерянной в ходе трех последовательных стадий способа, на каждом цикле способа могут быть получены наивысшие из возможных скоростей гидролиза, что приводит к сокращению времени гидролиза до менее чем 48 ч в комбинации с наиболее эффективным применением ферментов.
Применение стабильных ферментов в системах с перемешиванием.
Благодаря перемешиванию в ходе гидролиза ферменты чаще приходят в контакт с субстратами, что приводит к более эффективному применению каталитической активности. Это приводит к снижению дозировок ферментов и, таким образом, к снижению затрат, если только перемешивание не имеет отрицательного влияния на ферменты. Стабильные ферменты, такие термостабильные ферменты из Какаш- 21 028880
зота, представляют собой устойчивые ферменты и могут противостоять условиям окружающей среды, которые характеризуются (локальным) высоким усилием сдвига и высокими температурами, которые возникают при интенсивном перемешивании суспензий. Применение стабильных ферментов в системе с перемешиванием, таким образом, выгодно и приведет к снижению дозировки и, таким образом, к снижению затрат.
Изобретение далее будет описано с помощью следующих примеров, которые не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения.
Примеры
Экспериментальная информация.
Штаммы.
Штамм Казатзоша (Та1аготусез) етегзопи был депонирован в Ссп1гаа1 Ьигеаи уоог зсЫтте1си11игез, Иррза1а1аап 8, Р.О. Вох 85167, ΝΕ-3508 ΆΌ Утрехт, Нидерланды, в декабре 1964 г., с кодом доступа СВ§ 393.64.
Другие подходящие штаммы могут быть в равной степени использованы в настоящих примерах для демонстрации эффекта и преимуществ изобретения. Например, ТЕС-101, ТЕС-147, ТЕС-192, ТЕС-201 или ТЕС-210 представляют собой подходящие штаммы Казатзоша, которые описаны в \7О 2011/000949.
Получение предварительно обработанного кислотой субстрата из кукурузной соломы.
Предварительно обработанную разбавленной кислотой кукурузную солому (аС8) получали, как описано в работе §ске11, Ό.Ι., Лррйеб Вюскет1з1гу и Вю1есЬпо1оду (2003), уо1. 105-108, рр. 69-85. Применяли полупромышленный реактор для предварительной обработки, который работал в стационарных условиях при 190°С, продолжительность обработки 1 мин и эффективная концентрация кислоты Н2§О4 была равна 1,45% (мас./мас.) в жидкой фазе.
Анализы для определения белка.
1. Суммарный белок.
ТсА биурет.
Способ представляет собой комбинацию осаждения белка трихлоруксусной уксусной кислотой (ТСА) для удаления мешающих веществ, что позволяет проводить определение концентрации белка с помощью колориметрической биуретовой реакции. В биуретовой реакции ион меди(11) восстанавливается до иона меди(1), который образует комплекс с азотами и углеродами пептидных связей в щелочном растворе. Фиолетовая окраска указывает на наличие белков. Интенсивность окраски и, следовательно, поглощения при 546 нм прямо пропорционально концентрации белка, в соответствии с законом БераЛамберта. Стандартизацию проводили с применением БСА (бычий сывороточный альбумин) и содержание белка выражают в г белка как эквивалент БСА/л или мг белка как эквивалент БСА/мл. Содержание белка рассчитывали с помощью стандартных протоколов расчета, известных в данной области техники, окладывая ОЭ546 против концентрации образцов с известными концентрациями, с последующим расчетом концентрации неизвестных образцов с помощью уравнения, полученного из калибровочной линии.
2. Индивидуальные белки с применением РАСЕ.
Предварительная обработка образцов для δΌδ-РАСЕ.
Основываясь на расчетной концентрации белка в образцах, образцы получали следующим образом. К 10 мкл образца добавляли 40 мкл воды Μί11ίρ и 50 мкл ТСА (20%) для разведения образца в пять раз (~1 мг/мл) и осаждения белков. После инкубации 1 ч на льду образец центрифугировали (10 мин, 14000 грт). Осадок промывали 500 мкл ацетона и центрифугировали (10 мин, 14000 грт). Осадок обрабатывали, как описано ниже.
δΌδ-РАСЕ.
Осадок растворяли в 65 мкл воды Μί11ίρ. 25 мкл буфера для образцов NиРАСЕ™ ЬЭЗ (4х) "ΙηνίΙΐΌдеп" и 10 мкл восстановителя для образцов NиРАСЕ™ (10х) НпуИгодеп". Перед стадией денатурации образец разбавляли в 5 раз, применяя смесь Μί11ίΟ; буфер для образцов NиРАСЕ™ БН5> и 10 мкл восстановителя для образцов №.1РАСЕ''™ в соотношении 65:25:10. После смешивания образцы инкубировали в термомиксере в течение 10 мин при 70°С. Растворы образцов наносили на 4-12% В1з-Тг1з гель (ΝυРАСЕ™ В1зТг1з, "1пу11годеп2). Образец (10 мкл) маркера Μ12 (НпуИгодеп") также наносили на гель. Гель прогоняли при 200 V в течение 50 мин, применяя ХСЕЬЬ §иге1оск, с 600 мл 20х разбавленного буфера δΌδ в камере для внешнего буфера и 200 мл 20х разбавленного буфера δΌδ, содержащего 0,5 мл антиоксиданта (№РАСЕ™ "кцЦгодеп") в камере для внутреннего буфера. После прогона гель дважды промывали деминерализованной водой, гели фиксировали раствором 50% метанол/7% уксусная кислота в течение 1 ч и окрашивали §урго КиЬу (50 мл на гель) в течение ночи. Изображение получали с помощью "Туркооп 9200" (610 ВР 30, Сгееп (532 нм), РМТ 600ν, 100 мкм) после промывки геля водой Μί11ίρ.
Количественный анализ белка.
Применяя сканер "Туркооп" отношение между полосами белка в границах дорожки определяли стандартными способами, известными в данной области техники. Образец наносили в трех повторностях и уровень яркости определяли с помощью программы "1таде диаи!". Величины выражали в относительных % белка к общему белку, рассчитывали, применяя уровень яркости выбранной полосы белка по от- 22 028880
ношению к суммарному уровню яркости всех белковых полос.
Расчет превращение глюкана.
% превращение глюкана (%) = (глюкоза (г/л)х100%)/(глюкан (фракция на СВ)Хсв (г/кг) х1,1), где
глюкоза (г/л) = концентрация глюкозы в супернатанте после гидролиза.
глюкан (фракция на св) = содержание глюкана субстрата перед предварительной обработкой.
св (г/кг) = сухое вещество гидролиза (например, 20% св - 200 г/кг).
1Д = увеличение массы из-за включения воды в ходе гидролиза.
Пример расчета
глюкоза = 60 г/л
фракция глюкана = 0,40 (равно 40% на сухое вещество)
св = 200 г/кг
пример превращения глюкана = (60*100) / (0,4 х 200 х 1,1) = 68% превращения
Пример 1. Оценка влияния отсутствия кислорода в ходе гидролиза на целлюлолитическую активность смеси целлюлазных ферментов.
Влияние отсутствия кислорода в ходе гидролиза на целлюлолитическую активность трех различных ферментных смесей оценивали в соответствии с процедурами, описанными ниже. Реакции гидролиза проводили с исходным сырьем, представляющем собой предварительно обработанную кислотой кукурузную солому (аС8), при конечной концентрации СВ, равной 10% (мас./мас.). Данный раствор исходного сырья получали разведением раствора концентрированного исходного сырья водой. Затем значение рН доводили до рН 4,5 раствором 4М МаОН. Удаление кислорода из исходного сырья осуществляли в две стадии. Во-первых, раствор исходного сырья дегазировали с помощью ультразвука при пониженном давлении в ультразвуковой ванне (Бгапкотс 5510Ε-ΌΤΗ, кеПтц; Оецак) в течение 15 мин. На второй стадии кислород дополнительно удаляли путем непрерывного барботирования током азота через 500 мл раствора 10% СВ исходного сырья в течение 3 ч. Перед барботированием через раствор исходного сырья ток азота барботировали через воду для того, чтобы насытить его водным паром и предотвратить испарение воды из раствора исходного сырья. Одновременно 500 мл такой же партии 10% (мас./мас.) СВ аС8 барботировали воздухом в качестве кислородсодержащего контрольного образца с аналогичными настойками и в соответствии с таким же протоколом.
Гидролиз обедненного по кислороду (барботированного азотом) и насыщенного кислородом (барботированного воздухом) 10% (мас./мас.) растворов исходного сырья аС8 проводили в герметичной, 30миллилитровой колбе для центрифугирования ("Ма1§епе Оакпбде") в полном реакционном объеме, равном 10 мл. Колбы, уже содержащие раствор целлюлазы, примененный для эксперимента с истощением по кислороду, барботировали азотом перед и в ходе заполнения их исходным сырьем. Каждый гидролиз проводили в двух повторностях с 7,5 мг/г СВ целлюлазной ферментной смеси, добавленной в общем объеме, не превышавшем 375 мкл. Три протестированные целлюлазные ферментные смеси включали смесь ТЕС-210 (смесь целлюлаз), смесь 4Е-ОН61 (состоящую из 9% (мас./мас.) от общего белка ВО, 30% (мас./мас.) от общего белка СВН1, 25% (мас./мас.) от общего белка СВНП и 36% (мас./мас.) от общего белка ОН61) и смесь 4Е-ЕО (состоящую из 9% (мас./мас.) от общего белка ВО, 30% (мас./мас.) от общего белка СВН1, 25% (мас./мас.) от общего белка СВНП и 36% (мас./мас.) от общего белка ЕО). ТЕС-210 ферментировали в соответствии с процедурами инокуляции и ферментации, описанными в ШО 2011/000949. Применяли смесь 4Е (как описано в ШО 2011/098577).
Центрифужные колбы, содержавшие исходное сырье и раствор ферментов, помещали в печьинкубатор (гибридизационная печь "Тесйпе НВ-ГО") и инкубировали в течение 72 ч при 65°С, одновременно вращая в заданном положении 3 (12 грт/ мин). Затем образцы гидролиза охлаждали на льду и немедленно 50 мкл каждого супернатанта разводили в 1450 мкл воды со степенью чистоты I. Разбавленный супернатант затем фильтровали (0,45 мкм фильтр, Ра11 ΡΝ 454) и фильтраты анализировали на содержание сахара, как описано ниже.
Концентрации сахара разбавленного образца измеряли с помощью НРЙС, оборудованного колонкой "Лттех НРХ-87Р" (Вюгаб #1250098), элюировали водой при 85°С со скоростью тока, равной 0,6 мл/мин, и количественно определяли путем интегрирования сигналов глюкозы, полученных при детекции показателя преломления (К.1.), калиброванного по стандартным растворам глюкозы.
Данные, представленные в табл. 1, на фиг. 1, показали, что высвобождение глюкозы из барботированного азотом исходного сырья было ниже, чем высвобождение глюкозы из барботированного воздухом исходного сырья при инкубации как со смесью ТЕС-210, так и со смесью 4Е-ОН61. Не наблюдали разницы в детектируемом высвобождении глюкозы между барботированньгм азотом и барботированным воздухом исходным сырьем для образцов, гидролизованных смесью 4Е-ЕО.
На основании данных результатов мы заключили, что присутствие кислорода улучшает целлюлоли- 23 028880
тическое поведение целлюлазной смеси, которая содержит ферменты СН61.
Влияние барботирования азотом или воздухом через 10%-ное исходное сырье аС5 перед гидролизом на общее количество глюкозы, высвободившееся под действием трех различных смесей целлюлаз
Целлюлазная смесь Барботирование воздухом Средняя глюкоза (г/л) станд. отклон. Барботирование N2 Средняя глюкоза (г/л) станд. отклон.
ТЕС-210 34,5 0,8 31,9 1,1
смесь 4Е-ОН61 31,7 1,4 27,4 0,1
смесь 4Е-ЕО 22,7 0,1 23,3 1,7
Пример 2. Влияние кислорода на целлюлолитическую активность целлюлазных ферментных смесей в ходе гидролиза лигноцеллюлозного сырья.
В этом примере показано влияние кислорода на целлюлолитическую активность смеси ферментов в ходе гидролиза лигноцеллюлозного сырья. Реакции гидролиза проводили с предварительно обработанным кислотой исходным сырьем, представляющим собой кукурузную солому (аС5), в конечной концентрации, равной 20% (мас./мас.) СВ. Данный раствор исходного сырья получали разведением концентрированного раствора исходного сырья водой. Затем рН доводили до рН 4,5 10%-ным раствором (мас./мас.) ΝΗ4ΟΗ.
Гидролиз осуществляли в перемешиваемом реакторе с контролируемым рН и контролируемой температурой с рабочим объемом, равным 1 л. Каждый гидролиз осуществляли в двух повторностях с 2,5 мг/г СВ целлюлазной ферментной смеси ТЕС-210. ТЕС-210 получали в соответствии с процедурами инокуляции и ферментации, описанными в ΑΟ 2011/000949.
Были выполнены следующие эксперименты.
1. 1 л 20% аС5, рН 4,5, температура 62°С, скорость перемешивания 60 грт (это соответствует уровню IX.) < 0,002 моль кислорода на 1 м3), 2,5 мг/г СВ смеси целлюлаз ТЕС-210, время инкубации 120 ч (эксперимент сравнения).
2. Как в эксперименте 1, но в начале гидролиза барботирование воздуха в раствор начинали к уровню растворенного кислорода, равному 20% (это соответствует величине 0,03 моль кислорода на 1 м3, измеренной с помощью электрода IX) (растворенный кислород)). Данный уровень растворенного кислорода поддерживали на протяжении всего оставшегося гидролиза.
3. Как в эксперименте 1, но на 72-м часу барботирование воздуха в раствор к уровню растворенного кислорода, равному 20% (это соответствует величине 0,03 моль кислорода на 1 м3, измеренной с помощью электрода IX) (растворенный кислород)). Данный уровень растворенного кислорода поддерживали на протяжении всего оставшегося гидролиза.
После гидролиза образцы охлаждали на льду и немедленно 50 мкл каждого супернатант разводили в 1450 мкл воды со степенью чистоты I. Разбавленный супернатант затем фильтровали (0,45 мкм фильтр, Ра11 ΡΝ 454) и фильтраты анализировали на содержание сахара, как описано ниже.
Концентрацию сахара разбавленных образцов оценивали с помощью НРЕС, оборудованного колонкой Аттех НРХ-87Р (Вюгай #1250098), элюцию проводили водой при 85°С со скоростью тока 0,6 мл/мин и количественно определяли путем интегрирования сигналов глюкозы, полученных детекцией показателя преломления (Κ.Ι.), калиброванного по стандартным растворам глюкозы.
Результаты, приведенные на фиг. 2, ясно демонстрируют увеличение продукции глюкозы в случае добавления воздуха. Кроме того, добавление воздуха к реакции гидролиза во второй части времени приводит к превосходящей продукции глюкозы по сравнению с экспериментом, в котором воздух не добавляли или воздух добавляли на протяжении всей стадии гидролиза.
Пример 3. Влияние частичной аэрадия (по времени) на ферментативный гидролиз лигноцеллюлозного исходного сырья в полупромышленном масштабе.
В данном примере показано влияние концентрации растворенного кислорода на целлюлолитическую активность смеси ферментов или композиции в ходе гидролиза лигноцеллюлозного исходного сырья в полупромышленном масштабе. Реакции гидролиза проводили с предварительно обработанным кислотой исходным сырьем, кукурузной соломой (аС5), в конечной концентрации, равной 17,1% (мас./мас.) СВ. Раствор исходного сырья получали разведением суспензии концентрированного исходного сырья водой. рН доводили до рН 4,5 25%-ным (мас./мас.) раствором Ν^Ο^
Ферментативный гидролиз проводили в 270-литровом опытном реакторе, с контролируемыми рН и температурой, с рабочим объемом, равным 150 л. Растворенный кислород в ходе способа контролировали, регулируя скорость вращения крыльчатки при заданном воздушном потоке и избыточном давлении. Ферментативный гидролиз осуществляли в дозировке, равной 2,5 мг (белка ТСА)/г СВ целлюлазной ферментной смеси ТЕС-210. ТЕС-210 получали в соответствии с процедурами инокуляции и ферментации, описанными в ΑΟ 2011/000949.
Были выполнены следующие эксперименты.
- 24 028880
Эксперимент 1.
Аэрацию проводили с 0 до 120 ч; 150 л 17,1% рС8, рН 4,5, температура 62°С, избыточное давление 1 бар, воздушный поток в свободном пространстве 10 кг/ч, 2,5 мг ТС А/г СВ смеси целлюлаз ТЕС-210, время инкубации 120 ч в 270-литровом опытном реакторе. Концентрацию растворенного кислорода (ΌΟ) реакционной смеси измеряли постоянно, применяя ΌΟ-электрод. Уровень ΌΟ поддерживали равным 0,15-0,22 моль/м3 путем регулирования скорости крыльчатки.
Эксперимент 2.
Аэрацию проводили между 72 и 120 ч: 150 л 17,1% рС8, рН 4,5, температура 62°С, дозировка фермента 2,5 мг ТС А/г СВ смеси целлюлаз ТЕС-210 и полное время инкубации равно 120 ч в 270-литровом опытном реакторе. Концентрацию растворенного кислорода (ΌΟ) в реакционной смеси измеряли постоянно с помощью ΌΟ электрода. В течение первых 72 ч способа применяли следующие настройки: отсутствие избыточного давления, отсутствие воздушного потока в свободном пространстве и уровень ΌΟ поддерживали равным 0,02-0,05 моль/м3 путем регулирования скорости крыльчатки. В течение последних 48 ч способа применяли следующие настройки: избыточное давление 1 бар, воздушный поток в свободном пространстве 10 кг/ч и уровень ΌΟ поддерживали равным 0,15-0,22 моль/м3 путем регулирования скорости крыльчатки.
В ходе ферментативного гидролиза ежедневно отбирали образцы для анализа углеводов (глюкоза, целлобиоза) с помощью ΝΜΚ и для анализа вязкости и измерения рН.
Анализ композиции предварительно обработанной кукурузной соломы выполняли с помощью химического гидролиза образцов и определения моносахаридов с помощью ΝΜΚ.
Образцы, отобранные в ходе ферментативного гидролиза, анализировали на наличие (олиго )сахаров, органических кислот и ингибиторов с помощью проточного ΝΜΚ.
Результаты, представленные на фиг. 4, показали, что в ходе ферментативного гидролиза в эксперименте 2 с частичной аэрацией (□ = аэрация между временами гидролиза, равными 72 и 120 ч) продуцируется больше глюкозы, чем в ходе ферментативного гидролиза в эксперименте 1 ( - аэрация между временами гидролиза, равными 0 и 120 ч).
Пример 4. Влияние времени введения растворенного кислорода на ферментативный гидролиз лигноцеллюлозного сырья.
В данном примере показано влияние времени введения растворенного кислорода на ферментативный гидролиз лигноцеллюлозного сырья. Реакции гидролиза проводили с предварительно обработанным кислотой исходным сырьем, кукурузной соломой (аС8), в конечной концентрации, равной 20% (мас./мас.) СВ. Раствор исходного сырья получали разведением суспензии концентрированного исходного сырья водой. рН доводили до рН 4,5 25%-ным (мас./мас.) раствором ЯНЮН.
Ферментативный гидролиз проводили в 2-литровом реакторе, с контролируемыми рН и температурой, с рабочим объемом, равным 1 л. Растворенный кислород в ходе способа контролировали, регулируя скорость вращения крыльчатки и путем непрерывного добавления в свободное пространства свежего воздуха в случае с повышенной концентрацией растворенного кислорода. Ферментативный гидролиз осуществляли в дозировке, равной 1,5 мг (ТСА белок)/г СВ целлюлазной ферментной смеси ТЕС-210. ТЕС-210 получали в соответствии с процедурами инокуляции и ферментации, описанными в νΟ 2011/000949.
Были выполнены следующие эксперименты.
Эксперимент 1. Аэрацию проводили с 0 до 7 ч: 1 л 20% рС8, рН 4,5, температура 62°С, 1,5 мг ТСА/г СВ смеси целлюлаз ТЕС-210, время инкубации 120 ч. Концентрацию растворенного кислорода (ΌΟ) в реакционной смеси измеряли постоянно, применяя ΌΟ-электрод. ΌΟ поддерживали на уровне > 0,05 моль/м3 в течение первых 7 ч гидролиза. Между 7 и 120 ч времени гидролиза ΌΟ поддерживали на уровне < 0,02 моль/м3.
Эксперимент 2. Аэрацию проводили между 72 и 120 ч: 1 л 20% рС8, рН 4,5, температура 62°С, 1,5 мг ТСА/г СВ смеси целлюлаз ТЕС-210, время инкубации 120 ч. Концентрацию растворенного кислорода (ΌΟ) реакционной смеси измеряли постоянно с помощью ΌΟ электрода. В течение первых 72 ч гидролиза ΌΟ поддерживали на уровне < 0,01 моль/м3. Между 72 и 120 ч времени гидролиза ΌΟ поддерживали на уровне > 0,05 моль/м3.
В ходе ферментативного гидролиза ежедневно отбирали образцы для анализа углеводов (глюкоза, целлобиоза) с помощью ΝΜΚ и для анализа вязкости и измерения рН.
Анализ композиции предварительно обработанной кукурузной соломы выполняли с помощью химического гидролиза образцов и определения моносахаридов с помощью ΝΜΚ.
Результаты, представленные на фиг. 5, ясно демонстрируют увеличение скорости образования глюкозы при аэрировании реакционной смеси. Эксперимент 1, который аэрировали с 0 до 7 ч, ясно показал увеличение скорости образования глюкозы в течение первых 7 ч способа по сравнению с неаэрируемой ситуацией, на протяжении данной фазы способа в эксперименте 2. Кроме того, эксперимент 2 продемонстрировал увеличение скорости образования глюкозы между 72 и 120 ч по сравнению с неаэрируемой ситуацией в течение данного периода в эксперименте 1.
- 25 028880

Claims (21)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ получения сахарного продукта из лигноцеллюлозного материала, включающий стадию ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного материала с применением ферментной композиции, содержащей по меньшей мере две целлюлазы, при условии, что ферментная композиция, по меньшей мере, включает ОН61; где в течение части времени ферментативного гидролиза к лигноцеллюлозному материалу добавляют кислород и в течение части времени ферментативного гидролиза к лигноцеллюлозному материалу добавляют меньше кислорода по сравнению с другой частью времени ферментативного гидролиза или не добавляют кислород, где реактор для ферментативного гидролиза имеет объем, равный 1 м3 или более, и где содержание сухого вещества на стадии гидролиза равно 10 мас.% или более.
  2. 2. Способ по п.1, где в течение части времени ферментативного гидролиза к лигноцеллюлозному материалу добавляют кислород и в течение части времени ферментативного гидролиза к лигноцеллюлозному материалу не добавляют кислород.
  3. 3. Способ по п.1 или 2, дополнительно включающий предварительную обработку лигноцеллюлозного материала.
  4. 4. Способ по любому из пп.1-3, дополнительно включающий промывку лигноцеллюлозного материала.
  5. 5. Способ по любому из пп.1-4, дополнительно включающий извлечение сахарного продукта.
  6. 6. Способ по любому из пп.1-5, дополнительно включающий стадию ферментации гидролизованного лигноцеллюлозного материала для получения продукта ферментации.
  7. 7. Способ по п.6, дополнительно включающий извлечение сахарного продукта.
  8. 8. Способ по любому из пп.1-7, в котором часть времени, в течение которого добавляют меньше кислорода или не добавляют кислород, равна от 10 до 80% от общего времени ферментативного гидролиза.
  9. 9. Способ по любому из пп.1-7, в котором часть времени, в течение которого добавляют больше кислорода, равна от 2 до 80% от общего времени ферментативного гидролиза.
  10. 10. Способ по п.9, в котором часть времени, в течение которого добавляют больше кислорода, равна
    a) от 12 до 50%, если кислород добавляют во второй половине времени ферментативного гидролиза;
    b) от 2 до 30% от общего времени ферментативного гидролиза, если кислород добавляют в первой половине времени ферментативного гидролиза; или
    c) комбинации а) и Ь).
  11. 11. Способ по любому из пп.1-10, в котором концентрация кислорода в жидкой фазе гидролиза в течение части времени, когда добавляют кислород, по меньшей мере в 2 раза выше концентрации кислорода в жидкой фазе в течение части времени, когда добавляют меньше кислорода или кислород не добавляют.
  12. 12. Способ по любому из пп.1-11, в котором в части времени, когда кислород добавляют, концентрация кислорода в жидкой фазе, в которой присутствует лигноцеллюлозный материал в ходе ферментативного гидролиза, равна по меньшей мере 0,001 моль/м3, или в котором в части времени, когда кислород добавляют, концентрация кислорода в жидкой фазе, в которой присутствует лигноцеллюлозный материал в ходе ферментативного гидролиза, была равна самое большее 0,12 моль/м3.
  13. 13. Способ по любому из пп.1-12, в котором кислород добавляют в виде пузырей.
  14. 14. Способ по любому из пп.1-13, в котором время протекания ферментативного гидролиза равно от 5 до 150 ч.
  15. 15. Способ по любому из пп.1-14, в котором используемая ферментная композиция сохраняет активность в течение 30 ч или более.
  16. 16. Способ по любому из пп.1-13, в котором гидролиз проводят при температуре, равной 45°С или более.
  17. 17. Способ по любому из пп.1-14, в котором ферментную композицию получают из гриба.
  18. 18. Способ по любому из пп.1-15, в котором содержание сухого вещества на стадии гидролиза равно 14 мас.% или более.
  19. 19. Способ по любому из пп.1-16, в котором ферментативный гидролиз протекает в реакторе периодического действия, периодического действия с подпиткой и/или в реакторе для непрерывного культивирования.
  20. 20. Способ по любому из пп.1-17, в котором кислород вводят в виде кислородсодержащего газа.
  21. 21. Способ по любому из пп.6-20, в котором ферментирование осуществляется микроорганизмом, который способен ферментировать по меньшей мере один С5 сахар.
    - 26 028880
EA201500510A 2012-11-09 2013-11-07 Способ ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного материала и ферментации сахаров EA028880B9 (ru)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP12191957 2012-11-09
EP13174656 2013-07-02
EP13176083 2013-07-11
EP13176500 2013-07-15
EP13184702 2013-09-17
EP13184701 2013-09-17
PCT/EP2013/073253 WO2014072393A1 (en) 2012-11-09 2013-11-07 Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars

Publications (3)

Publication Number Publication Date
EA201500510A1 EA201500510A1 (ru) 2015-09-30
EA028880B1 true EA028880B1 (ru) 2018-01-31
EA028880B9 EA028880B9 (ru) 2018-05-31

Family

ID=49554250

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201500510A EA028880B9 (ru) 2012-11-09 2013-11-07 Способ ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного материала и ферментации сахаров
EA201500516A EA032496B1 (ru) 2012-11-09 2013-11-07 Способ ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного материала и ферментации сахаров

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201500516A EA032496B1 (ru) 2012-11-09 2013-11-07 Способ ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного материала и ферментации сахаров

Country Status (23)

Country Link
US (7) US9957528B2 (ru)
EP (4) EP2917355B1 (ru)
JP (3) JP6429155B2 (ru)
KR (2) KR102104152B1 (ru)
CN (3) CN104769116A (ru)
AU (4) AU2013343597B2 (ru)
BR (3) BR122016020119B1 (ru)
CA (2) CA2888170C (ru)
DK (3) DK2917355T3 (ru)
EA (2) EA028880B9 (ru)
ES (3) ES2973866T3 (ru)
FI (1) FI3613860T3 (ru)
HR (3) HRP20240339T1 (ru)
HU (3) HUE048887T2 (ru)
IN (2) IN2015DN03027A (ru)
LT (1) LT3613860T (ru)
MX (3) MX360283B (ru)
MY (2) MY176707A (ru)
PL (2) PL2917355T3 (ru)
RS (1) RS65279B1 (ru)
SI (1) SI3613860T1 (ru)
UA (2) UA117357C2 (ru)
WO (2) WO2014072395A1 (ru)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2917355B1 (en) 2012-11-09 2019-10-23 DSM IP Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material with addition of oxygen
WO2014072390A1 (en) 2012-11-09 2014-05-15 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
CN105074001A (zh) 2013-02-21 2015-11-18 诺维信公司 糖化和发酵纤维素材料的方法
WO2015004098A1 (en) * 2013-07-11 2015-01-15 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
US9938552B2 (en) 2013-11-01 2018-04-10 Novozymes A/S Methods of saccharifying and fermenting a cellulosic material
MX2016012798A (es) * 2014-04-03 2016-12-09 Dsm Ip Assets Bv Proceso y aparato para hidrolisis enzimatica de material lignocelulosico y fermentacion de azucares.
US10144939B2 (en) 2014-04-30 2018-12-04 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
WO2015175308A1 (en) * 2014-05-13 2015-11-19 Danisco Us Inc. Improved enzymatic hydrolysis of biomass
EP3191597A1 (en) * 2014-08-21 2017-07-19 Novozymes A/S Process for saccharifying cellulosic material under oxygen addition
US10557157B2 (en) 2014-12-19 2020-02-11 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
CA2973302C (en) 2015-01-28 2022-10-25 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
DK3640336T3 (da) * 2015-01-28 2022-06-27 Dsm Ip Assets Bv Fremgangsmåde til enzymatisk hydrolyse af lignocellulosemateriale og fermentering af sukre
WO2016207147A1 (en) * 2015-06-22 2016-12-29 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
BR112018073839A2 (pt) 2016-05-20 2019-02-26 Poet Res Inc métodos para remover um ou mais compostos de um hidrolisado lignocelulósico via arraste a gás e sistemas relacionados
BR112019010355B1 (pt) * 2016-11-24 2024-03-05 Dsm Ip Assets B.V. Composição de enzimas
BR112020005439A2 (pt) * 2017-10-09 2020-09-24 Dsm Ip Assets B.V. processo para hidrólise enzimática de material lignocelulósico e fermentação de açúcares
US11371012B2 (en) 2017-11-16 2022-06-28 Poet Research, Inc. Methods for propagating microorganisms for fermentation and related methods and systems
CA3084665A1 (en) 2017-12-11 2019-06-20 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Processes for isolation and recovery of c5 sugars
EP3530743A1 (en) 2018-02-21 2019-08-28 Cambridge Glycoscience Ltd Method of production
BR112021002910A2 (pt) 2018-08-15 2021-07-20 Cambridge Glycoscience Ltd novas composições, seu uso e métodos para sua formação
FR3087449A1 (fr) 2018-10-19 2020-04-24 Afyren Procede de preparation de molecules organiques par fermentation anaerobie
US20220090155A1 (en) 2019-02-15 2022-03-24 Borregaard As Chemically modified lignin as reducing agent for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass
JP2022545650A (ja) 2019-08-16 2022-10-28 ケンブリッジ グリコサイエンス エルティーディー バイオマスを処理してオリゴ糖および関連組成物を生成する方法
JP2023506464A (ja) 2019-12-12 2023-02-16 ケンブリッジ グリコサイエンス エルティーディー 低糖の多相食料品

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3105581C2 (de) 1981-02-16 1985-05-15 Otto Dr. 2300 Kiel Moebus Verfahren zur Fermentation von Kohlenhydraten unter Erzeugung von Äthanol und Biomasse
KR930701654A (ko) 1991-04-18 1993-06-12 리차드 지. 바커 고 경점도 산소 탈리그닌화를 제공하기 위해 펄프에 알칼리를 첨가하는 방법
FR2694768B1 (fr) 1992-07-30 1994-12-23 Pasteur Institut Séquences d'oligonucléotides pour la détection spécifique de mollicutes par amplication de gènes conservés.
US5865898A (en) * 1992-08-06 1999-02-02 The Texas A&M University System Methods of biomass pretreatment
EP1259466B1 (en) 2000-02-17 2008-10-22 Technical University of Denmark A method for processing lignocellulosic material
AU2001268603B2 (en) 2000-06-26 2006-11-09 University Of Florida Research Foundation, Inc. Methods and compositions for simultaneous saccharification and fermentation
US7034062B2 (en) 2001-05-25 2006-04-25 BP Exploration Operatiing Company Limited Fischer-tropsch process
US8580541B2 (en) 2003-03-19 2013-11-12 The Trustees Of Dartmouth College Lignin blockers and uses thereof
WO2005100582A2 (en) 2004-03-25 2005-10-27 Novozymes Inc. Methods for degrading or converting plant cell wall polysaccharides
DK1828373T3 (da) 2004-11-29 2011-10-17 Inbicon As Enzymatisk hydrolyse af biomasser med et højt tørstof (DM) indhold
AU2006337184B2 (en) 2005-09-30 2012-08-16 Novozymes, Inc. Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material
IES20060090A2 (en) 2006-02-10 2007-06-13 Nat Univ Ireland Talaromyces emersonii enzyme systems
US8968515B2 (en) 2006-05-01 2015-03-03 Board Of Trustees Of Michigan State University Methods for pretreating biomass
WO2008008793A2 (en) 2006-07-10 2008-01-17 Dyadic International Inc. Methods and compositions for degradation of lignocellulosic material
AU2007302867B2 (en) 2006-10-02 2013-11-07 Dsm Ip Assets B.V. Metabolic engineering of arabinose-fermenting yeast cells
CA2689910A1 (en) 2007-05-31 2008-12-11 Novozymes, Inc. Compositions for degrading cellulosic material
WO2009003167A1 (en) 2007-06-27 2008-12-31 Novozymes A/S Methods for producing fermentation products
US8980599B2 (en) 2007-08-02 2015-03-17 Iogen Energy Corporation Method for the production of alcohol from a pretreated lignocellulosic feedstock
CA2701949A1 (en) 2007-10-09 2009-04-16 Sunopta Bioprocess Inc. Two-stage enzymatic hydrolysis process for treating lignocellulosic materials
US20090098617A1 (en) * 2007-10-10 2009-04-16 Murray Burke Enzymatic treatment under vacuum of lignocellulosic materials
AU2008316597B2 (en) 2007-10-25 2014-01-23 Landmark Ip Holdings, Llc System and method for anaerobic digestion of biomasses
CA2709490A1 (en) 2007-12-19 2009-07-09 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
WO2010011957A2 (en) 2008-07-25 2010-01-28 The Regents Of The University Of California Enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass through enhanced removal of oligomers
EA020808B1 (ru) 2008-08-11 2015-01-30 ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. Деградация лигноцеллюлозного материала
CN102325889A (zh) 2008-12-19 2012-01-18 诺维信股份有限公司 增加纤维素材料水解的方法
CA2763031A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Novozymes, Inc. Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material
MX2011013700A (es) 2009-07-03 2012-04-30 Dsm Ip Assets Bv Cepa talaromyces y composiciones de enzimas.
EP2486139B1 (en) 2009-10-08 2020-09-16 DSM IP Assets B.V. Process for the preparation of a fermentation prodcut from lignocellulose containing material
CA2789301A1 (en) * 2010-02-11 2011-08-18 Dsm Ip Assets B.V. Host cell capable of producing enzymes useful for degradation of lignocellulosic material
CN102191299A (zh) 2010-03-10 2011-09-21 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 多步酶解提高木质纤维素糖化得率的方法
BR112013002377B1 (pt) 2010-08-06 2020-12-29 Novozymes A/S método para degradar ou hidrolisar um polissacarídeo, para produzir sacarídeos solúveis e para produzir uma substância orgânica, e, processo para produzir um produto de fermentação
BR112013010008B1 (pt) 2010-11-02 2020-09-08 Novozymes, Inc. Métodos para degradar e para fermentar um material celulósico, e para produzir um produto de fermentação
DK2689011T3 (en) 2011-03-25 2018-01-22 Novozymes As PROCEDURE FOR DEGRADATION OR CONVERSION OF CELLULOSE-SUBSTANCING MATERIAL
US20120276593A1 (en) 2011-04-29 2012-11-01 Danisco Us Inc. Use of cellulase and glucoamylase to improve ethanol yields from fermentation
WO2013028701A1 (en) 2011-08-22 2013-02-28 Codexis, Inc. Gh61 glycoside hydrolase protein variants and cofactors that enhance gh61 activity
WO2014072392A1 (en) 2012-11-09 2014-05-15 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
WO2014072390A1 (en) 2012-11-09 2014-05-15 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
EP2917355B1 (en) 2012-11-09 2019-10-23 DSM IP Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material with addition of oxygen
CN105074001A (zh) 2013-02-21 2015-11-18 诺维信公司 糖化和发酵纤维素材料的方法
MX2016012798A (es) 2014-04-03 2016-12-09 Dsm Ip Assets Bv Proceso y aparato para hidrolisis enzimatica de material lignocelulosico y fermentacion de azucares.
US10144939B2 (en) 2014-04-30 2018-12-04 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
US10557157B2 (en) 2014-12-19 2020-02-11 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAVID CANNELLA , HENNING JØRGENSEN: "Do new cellulolytic enzyme preparations affect the industrial strategies for high solids lignocellulosic ethanol production ?", BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, WILEY, US, vol. 111, no. 1, 1 January 2014 (2014-01-01), US, pages 59 - 68, XP002721360, ISSN: 0006-3592, DOI: 10.1002/bit.25098 *
KARA K PODKAMINER;WILLIAM R KENEALY;CHRISTOPHER D HERRING;DAVID A HOGSETT;LEE R LYND: "Ethanol and anaerobic conditions reversibly inhibit commercial cellulase activity in thermophilic simultaneous saccharification and fermentation (tSSF)", BIOTECHNOLOGY FOR BIOFUELS, BIOMED CENTRAL LTD, GB, vol. 5, no. 1, 15 June 2012 (2012-06-15), GB, pages 43, XP021108101, ISSN: 1754-6834, DOI: 10.1186/1754-6834-5-43 *
KOSTYLEV M, WILSON D: "Synergistic interactions in cellulose hydrolysis", BIOFUELS, vol. 3, no. 1, 1 January 2012 (2012-01-01), pages 61 - 70, XP002693861, ISSN: 1759-7269, DOI: 10.4155/bfs.11.150 *
MATHIEU BEY, SIMENG ZHOU, LAETITIA POIDEVIN, BERNARD HENRISSAT, PEDRO M. COUTINHO, JEAN-GUY BERRIN, AND JEAN-CLAUDE SIGOILLOT: "Cello-Oligosaccharide Oxidation Reveals Differences between Two Lytic Polysaccharide Monooxygenases (Family GH61) from Podospora anserina", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 79, 1 January 2013 (2013-01-01), US, pages 488 - 496, XP008160285, ISSN: 0099-2240, DOI: 10.1128/AEM.02942-12 *
YU DENG ; STEPHEN S. FONG: "Influence of culture aeration on the cellulase activity of Thermobifida fusca", APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, SPRINGER, BERLIN, DE, vol. 85, no. 4, 21 August 2009 (2009-08-21), Berlin, DE, pages 965 - 974, XP019778511, ISSN: 1432-0614 *

Also Published As

Publication number Publication date
EA201500510A1 (ru) 2015-09-30
UA116789C2 (uk) 2018-05-10
US10717995B2 (en) 2020-07-21
MX360067B (es) 2018-10-22
UA117357C2 (uk) 2018-07-25
LT3613860T (lt) 2024-01-25
CA2888333C (en) 2023-01-24
EA032496B1 (ru) 2019-06-28
CA2888170C (en) 2021-04-13
US10131923B2 (en) 2018-11-20
HUE048887T2 (hu) 2020-08-28
IN2015DN03027A (ru) 2015-10-02
CA2888170A1 (en) 2014-05-15
MX2015005628A (es) 2015-09-04
ES2761448T3 (es) 2020-05-19
US11434507B2 (en) 2022-09-06
US20200248209A1 (en) 2020-08-06
US9982280B2 (en) 2018-05-29
US10724057B2 (en) 2020-07-28
MY169456A (en) 2019-04-11
JP2019010108A (ja) 2019-01-24
JP6690085B2 (ja) 2020-04-28
CA2888333A1 (en) 2014-05-15
US20180237804A1 (en) 2018-08-23
DK2917355T3 (da) 2020-01-20
EP3656866A1 (en) 2020-05-27
AU2017206241A1 (en) 2017-08-10
IN2015DN03084A (ru) 2015-10-02
CN104769116A (zh) 2015-07-08
AU2013343597A1 (en) 2015-04-30
KR20150082275A (ko) 2015-07-15
AU2017206278A1 (en) 2017-08-10
JP2015534829A (ja) 2015-12-07
PL3613860T3 (pl) 2024-04-08
EP2917354A1 (en) 2015-09-16
BR112015004344A2 (pt) 2015-09-22
US20200224223A1 (en) 2020-07-16
AU2013343597B2 (en) 2017-06-22
PL2917355T3 (pl) 2020-04-30
EP3613860B1 (en) 2023-12-27
JP6396307B2 (ja) 2018-09-26
WO2014072395A1 (en) 2014-05-15
ES2773953T3 (es) 2020-07-15
US11434508B2 (en) 2022-09-06
HUE064894T2 (hu) 2024-04-28
HRP20240339T1 (hr) 2024-05-24
HRP20191960T1 (hr) 2020-02-07
MX2015005631A (es) 2015-08-14
EP3613860A1 (en) 2020-02-26
ES2973866T3 (es) 2024-06-24
RS65279B1 (sr) 2024-03-29
MX360283B (es) 2018-10-25
US20190032093A1 (en) 2019-01-31
KR20150082276A (ko) 2015-07-15
US20150299749A1 (en) 2015-10-22
CN104769117A (zh) 2015-07-08
US9957528B2 (en) 2018-05-01
KR102104152B1 (ko) 2020-04-24
BR122016020119B1 (pt) 2022-04-12
HRP20200092T1 (hr) 2020-04-03
EP2917354B1 (en) 2020-01-15
US20150307903A1 (en) 2015-10-29
EP2917355A1 (en) 2015-09-16
SI3613860T1 (sl) 2024-03-29
EP2917355B1 (en) 2019-10-23
HUE047092T2 (hu) 2020-04-28
DK3613860T3 (da) 2024-02-19
EA201500516A1 (ru) 2015-08-31
US20180208949A1 (en) 2018-07-26
AU2013343595A1 (en) 2015-04-30
DK2917354T3 (da) 2020-04-06
KR102104151B1 (ko) 2020-04-24
EA028880B9 (ru) 2018-05-31
MY176707A (en) 2020-08-19
MX2018012714A (es) 2021-11-16
JP2016501012A (ja) 2016-01-18
FI3613860T3 (fi) 2024-02-01
AU2013343595B2 (en) 2017-06-22
JP6429155B2 (ja) 2018-11-28
CN112813119A (zh) 2021-05-18
WO2014072393A1 (en) 2014-05-15
BR112015004163A2 (pt) 2015-10-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11434507B2 (en) Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
US11427844B2 (en) Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
WO2014072392A1 (en) Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
WO2014072389A1 (en) Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars

Legal Events

Date Code Title Description
TH4A Publication of the corrected specification to eurasian patent
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM