EA025843B1 - Устойчивое к гербициду растение brassica juncea, способ борьбы с сорняками и способы получения и идентификации устойчивого к гербициду растения brassica juncea - Google Patents

Устойчивое к гербициду растение brassica juncea, способ борьбы с сорняками и способы получения и идентификации устойчивого к гербициду растения brassica juncea Download PDF

Info

Publication number
EA025843B1
EA025843B1 EA200970925A EA200970925A EA025843B1 EA 025843 B1 EA025843 B1 EA 025843B1 EA 200970925 A EA200970925 A EA 200970925A EA 200970925 A EA200970925 A EA 200970925A EA 025843 B1 EA025843 B1 EA 025843B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
herbicide
plant
resistant
plants
ana8b
Prior art date
Application number
EA200970925A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200970925A1 (ru
Inventor
Кенинг Яо
Дерек Поттс
Дарил Мэйлс
Original Assignee
Басф Се
Вайтерра, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40429466&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA025843(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Басф Се, Вайтерра, Инк. filed Critical Басф Се
Publication of EA200970925A1 publication Critical patent/EA200970925A1/ru
Publication of EA025843B1 publication Critical patent/EA025843B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/10—Seeds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8278—Sulfonylurea
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Catching Or Destruction (AREA)

Abstract

Изобретение относится к трансгенным или нетрансгенным растениям с повышенными уровнями устойчивости к AHAS-ингибирующим гербицидам. Изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим мутанты большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (AHAS), экспрессирующим векторам, к растениям, содержащим полинуклеотиды, кодирующие субъединицы AHASL, содержащие одну, две или больше мутаций, к растениям, содержащим один, два или более полипептидов субъединицы AHASL с одной мутацией, к способам получения и применения указанных объектов и к способам борьбы с сорняками.

Description

Настоящее изобретение относится к резистентным к гербицидам растениям Втакк1са и новым полинуклеотидным последовательностям, которые кодируют белки большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислоты растений Втакыса дикого типа и резистентных к имидазолинонам, к семенам и способам применения таких растений.
Уровень техники
Синтаза ацетогидроксикислоты (АНА8; ЕС 4.1.3.18, также известная как ацетолактатсинтаза или АЕ8) является первым ферментом, который катализирует биохимический синтез аминокислот с разветвленной цепью валина, лейцина и изолейцина (8шдЬ (1999) ВюкуйЪеык оГ тайпе. 1еисше апб Псисшс. в Р1ап! Ат1по Ашб, 8тдЬ, В.К., еб., Магсе1 Иеккет 1пс. Ыете Уогк, Ыете Уогк, рр. 227-247). АНА8 является местом действия пяти структурно отличающихся семейств гербицидов, включая сульфонилмочевины (Тап е! а1. (2005) Рек! Мапад. 8ск 61: 246-57; Ма11огу-8тйЬ и КсРапдсг (2003) \Уееб Тесйпо1оду 17: 620626; ЬаКокка и Ра1со (1984) Тгепбк Вю1есЬпо1. 2: 158-161), имидазолиноны (8Ьапег е! а1. (1984) Р1ап! Рйук1о1. 76: 545-546), триазолопиримидины (8иЪгататап и Сегузск (1989) ФЫЪйюп оГ асе!о1ас!а!е куп!1аке Ьу йта/оФруптзбтек, в Вюса!а1уык т Адг1си11ига1 В1о1есЬпо1оду, ^Ьйакег, ЕК. и Зоппе!, Р.Е. ебк., АС8 8утрок1ит §епе8, Атепсап Сйетюа1 5оае1у, ХУакНтдЮц И.С., рр. 277-288), Тап е! а1. (2005) Рек! Мапад. 8ск 61: 246-57; Ма11огу-5тйй и Кйапдег (2003) \Уееб ТесЬпо1оду 17: 620-626, сульфониламинокарбонилтриазолиноны (Тап е1 а1. (2005) Рек! Мапад. 8ск 61: 246-57; Ма11оту-8тйй и КеШпдег (2003) \Уееб Тесйпо1оду 17: 620-626). Гербициды на основе имидазолинона и сульфонилмочевины широко используются в настоящее время в сельском хозяйстве благодаря их эффективности при очень низких нормах внесения и относительной нетоксичности для животных. Посредством ингибирования активности АНА8 указанные семейства гербицидов предотвращают дальнейший рост и развитие чувствительных растений, включая многие виды сорняков. Некоторыми примерами коммерчески доступных имидазолиноновых гербицидов являются РиК8И1Т® (имазетапир), 8СЕРТЕК® (имазахин) и ΛΚ8ΕΝΛΡ® (имазапир). Примерами гербицидов на основе сульфонилмочевин являются хлорсульфурон, метсульфуронметил, сульфометуронметил, хлоримуронэтил, тифенсульфуронметил, трибенуронметил, бенсульфуронметил, никосульфурон, этаметсульфуронметил, римсульфурон, трифлусульфуронметил, триасульфурон, примисульфуронметил, циносульфурон, амидосульфурон, флузасульфурон, имазосульфурон, пиразосульфуронэтил и галосульфурон.
Вследствие высокой эффективности и низкой токсичности, имидазолиноновые гербициды являются предпочтительными для применения посредством опрыскивания сверху большой площади поверхности, занятой растительностью. Возможность распылять гербицид сверху над большой площадью растительности снижает затраты, связанные с посадкой и поддержанием насаждений, и снижает необходимость в подготовке места перед применением таких химикатов. Опыление сверху требуемого толерантного вида также дает возможность достигать максимального потенциально возможного урожая требуемого вида благодаря отсутствию конкурирующих видов. Однако возможность применения такой методики опыления сверху зависит от присутствия резистентного к имидазолинону вида нужных растений на опыляемой площади.
Среди основных сельскохозяйственных культур некоторые виды бобовых, такие как соя, резистентны к имидазолиноновым гербицидам от природы, благодаря своей способности быстро метаболизировать гербицидные соединения (8йапег и КоЪшкоп (1985) \Уееб 8б. 33: 469-471). Другие культуры, такие как кукуруза (№уйоике е! а1. (1992) Р1ап! Рйукю1. 100: 882886) и рис (Ватте!! е! а1. (1989) Сгор 8аГепегк Гог НетЫабек, Асабетю Ргекк, №\у Уогк, рр. 195-220) в определенной степени чувствительны к имидазолиноновым гербицидам. Различная чувствительность к имидазолиноновым гербицидам зависит от химической природы конкретного гербицида и разного метаболизма соединения из токсичной в нетоксичную форму в каждом растении (8Ьапег е! а1. (1984) Р1ап! РЬукюЕ 76: 545-546; Вго\\п е! а1., (1987) РекОс. Вюсйет. Рйукю1. 27: 24-29). Другие физиологические различия растений, такие как всасывание и передвижение вещества, также играют важную роль в чувствительности (8йапег и КоЪткоп (1985) \Уееб 8б. 33: 469-471).
Растения, резистентные к имидазолинонам, сульфонилмочевинам и триазолопиримидинам, были успешно получены с использованием мутагенеза семени, микроспоры, пыльцы и каллуса 2еа таук, АгаЫбор818 !йайапа, Втакыса парик (т.е. канолы), О1усше тах, №сойапа !аЪасит и Огу/а кайуа (8еЪакйап е! а1. (1989) Сгор. 8с1. 29: 1403-1408; 8\уапкоп е! а1., 1989 Тйеог. Арр1. Сепе!. 78: 525-530; №\у1юике е! а1. (1991) Тйеот. Арр1. Сепе!. 83: 65-70; 8а1йак1уап е! а1. (1991) Р1ап! Рйукю1. 97: 1044-1050; Моигапб е! а1. (1993) 1. Нетебйу 84: 91-96; патент США № 5545822). Во всех случаях резистентность придает один не полностью доминантный ядерный ген. Четыре резистентных к имидазолинону растений пшеницы также были ранее выделены после мутагенеза семян ТпОсит аекйуит Ь. су. Р1бе1 (№уйоике е! а1. (1992) Р1ап! Рйукю1. 100: 882-886). Исследования наследования подтвердили, что резистентность придает один не полностью до- 1 025843 минантный ген. На основании исследований аллелей авторы пришли к выводу, что мутации в четырех идентифицированных линиях находились в одном и том же локусе. Один из генов резистентности культурного сорта Ρίάθΐ назван Ρδ-4 (ЫетеЬоике с1 а1. (1992) Р1ап1 Рйу51о1. 100: 882-886).
В результате компьютерного моделирования трехмерной конформации комплекса ΑΗΑδингибитор спрогнозировано наличие нескольких аминокислот в предполагаемом кармане связывания ингибитора в качестве сайтов, индуцированные мутации в которых вероятно могли бы придавать избирательную резистентность к имидазолинонам (Ой е1 а1. (1996) 1. Мо1. Βίο1. 263: 359-368). Растения пшеницы, полученные с некоторыми из таких рационально сконструированных мутаций в предполагаемых сайтах связывания фермента ΑΗΑδ действительно обладали специфичной резистентностью к одному классу гербицидов (Ой е1 а1. (1996) 1. Мо1. Βίο1. 263: 359-368). О резистентности растений к имидазолиноновым гербицидам также сообщалось в нескольких патентах. В патентах США № 4761373, 5331107, 5304732, 6211438, 6211439 и 6222100 в общем описано применение измененного гена ΑΗΑδ для того, чтобы вызвать резистентность к гербицидам у растений, и в частности, описаны некоторые резистентные к имидазолинонам линии кукурузы. В патенте США № 5013659 описаны растения, обладающие резистентностью к гербицидам вследствие мутаций по меньшей мере в одной аминокислоте в одном или нескольких консервативных областях. Описанный в указанной публикации мутации кодируют либо перекрестную резистентность к имидазолинонам и сульфонилмочевинам, либо специфичную резистентность к сульфонилмочевинам, но специфичная к имидазолинонам резистентность не описана. В патенте США № 5731180 и патенте США № 5767361 обсуждается изолированный ген, имеющий одну аминокислотную замену в аминокислотной последовательности ΑΗΑδ однодольного растения дикого типа, который приводит к специфичной к имидазолинонам резистентности. Кроме того, были созданы растения риса, которые резистентны к гербицидам, которые отрицательно влияют на ΑΗΑδ, в результате селекции мутаций, а также с помощью отбора резистентных к гербицидам растений из пула растений риса, полученных в результате культивирования пыльника. Смотрите патенты США № 5545822, 5736629, 5773703, 5773704,5952553 и 6274796.
В растениях, также как во всех других исследованных организмах, фермент ΑΗΑδ состоит из двух субъединиц: большой субъединицы (каталитическая роль) и малой субъединицы (регуляторная роль) (НидДейу и Рапд (2000) 1. Вюейет. Мо1. Вю1. 33: 1-36). Большая субъединица ΑΗΑδ (также называемая в настоящем описании ΑΗΑδΕ) может кодироваться одним геном, как в случае Ά^аЪ^άορ5^5 и риса, или несколькими представителями семейства генов, как у кукурузы, канолы и хлопка. Специфичные однонуклеотидные замены в большой субъединице придают ферменту некоторую степень нечувствительности к одному или нескольким классам гербицидов (Сйапд и Оидд1еЬу (1998) Вюейет 1. 333: 765-777).
Например, пшеница обыкновенная, Ттйюит аевйуит Ь., содержит три гомологичных гена большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот. Каждый из генов экспрессируется на значительном уровне, о чем свидетельствует реакция на гербициды и биохимический данные, полученные для мутантов по каждому из трех генов (Αδ<^ηζί е1 а1. (2003) 1п1етпайопа1 δοс^еίу о£ Р1ап1 Мо1еси1аг Вю1ощ515 Сопдге55. Вагсе1опа, δρηίη, Ке£. Ыо. δ10-17). Кодирующие последовательности всех трех генов имеют обширную гомологию на нуклеотидном уровне (\УО 03/014357). Посредством секвенирования генов ΑΗΑδΕ нескольких сортов Ттйюит ае8ЙУит обнаружено, что молекулярной основой толерантности к гербицидам у большинства 1М1-толерантных (толерантных к имидазолинонам) линий является мутация δе^653(Άΐ)Ά8η, означающая замену серина на аспарагин в положении, эквивалентном присутствию серина в положении аминокислоты 653 у ^161^3515 1йайапа (\УО 03/014357). Указанная мутация является следствием однонуклеотидного полиморфизма (δ№) в последовательности ДНК, кодирующей белок ΑΗΑδΕ.
Также известно, что многочисленные гены ΑΗΑδΕ встречаются у видов двудольных растений. Недавно, Ко1ктап е1 а1. ((2004) Тйеог. Αρρ1. Сепе1. 109: 1147-1159) сообщили об идентификации, клонировании и секвенировании трех генов ΑΗΑδΕ (ΑΗΑδΕ1, ΑΗΑδΕ2 и ΑΗΑδΕ3) из резистентных к гербицидам генотипов и генотипов дикого типа подсолнечника (Ηе1^аηΐйи5 аппии5 Б.). Ко1ктап е1 а1. сообщили, что резистентность к гербицидам является следствием либо замены Рго197йеи (используется обозначение положений аминокислот ΑΗΑδΕ), либо замены Α1ι205Υι1 в белке ΑΗΑδΕ1, и что каждая из указанных замен придавала резистентность как к имидазолиноновым гербицидам, так и гербицидам на основе сульфонилмочевины.
Принимая во внимание высокую эффективность и низкую токсичность, имидазолиноновые гербициды являются предпочтительными для применения в сельском хозяйстве. Однако возможность применения имидазолиноновых гербицидов в конкретной системе возделывания сельскохозяйственных культур зависит от возможности использования резистентных к имидазолинонам сортов представляющего интерес культурного растения. Чтобы фермеры могли более гибко использовать типы и нормы внесения имидазолиноновых гербицидов и гербициды на основе сульфонилмочевины, часто требуется более высокая степень толерантности к гербицидам. Также для селекционеров растений, которые разрабатывают толерантные к гербицидам сорта, желательна работа с мутациями, которые обеспечивают более высокую толерантность к гербицидам, обеспечивающим для селекционеров большую гибкость в подборе исходной зародышевой плазмы, которую они используют для создания новых сортов. Чтобы получить такие резистентные к имидазолинонам сорта, селекционерам растений необходимо создавать дополнительные
- 2 025843 селекционные линии, предпочтительно с повышенной резистентностью к имидазолинонам. Таким образом, необходимы дополнительные резистентные к имидазолинонам селекционные линии и сорта культурных растений, а также способы и композиции для получения и применения резистентных к имидазолинонам селекционных линий и сортов.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к растениям Вгаккюа, обладающим повышенной резистентностью к гербицидам, по сравнению с растением Втакыса дикого типа. В частности, растения Вгаккюа согласно изобретению обладают повышенной резистентностью по меньшей мере к одному гербициду, который отрицательно влияет на активность фермента АНА8 по сравнению с растением Втакыса дикого типа. Растение Втакыса содержит в своем геноме по меньшей мере одну копию полинуклеотида большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (АНА8Ь), который кодирует резистентный к гербициду полипептид АНА8Ь, при этом полипептид АНА8Ь выбран из группы, состоящей из: а) полипептида, имеющего аспарагин в положении, соответствующем положению 653 в последовательности 8ЕО ГО N0:1 или положению 638 в последовательности 8Е0 ГО N0:2, или положению 635 в последовательности 8Е0 ГО N0:3; Ь) полипептида, имеющего треонин в положении, соответствующем положению 122 в последовательности 8Е0 ГО N0:1 или положению 107 в последовательности 8Е0 ГО N0:4, или положению 104 в последовательности 8Е0 ГО N0:5; и с) полипептида, имеющего лейцин в положении, соответствующем положению 574 в последовательности 8Е0 ГО N0:1 или положению 557 в последовательности 8Е0 ГО N0:6.
Настоящее изобретение также относится к повышенной устойчивости к гербицидам, которая достигается в случае сочетания мутаций АНА8 из разных геномов в растении В. _щпсеа. В одном примере растения, сочетающие в себе мутацию ЬК (АНА81) (в геноме В Втакыса _щисеа) с введенной в результате интрогрессии мутацией РМ2 (АНА83) (в геноме А Вгаккюа парик, интрогрессированной в Втакыса _)ипсеа). Полученная устойчивость гибридов значительно повышена и оказывает неожиданный синергетический эффект по сравнению с эффектом, который наблюдается в современном коммерческом продукте, в котором сочетаются РМ1 и РМ2. В другом примере предлагается растение В. _щпсеа, в котором сочетаются мутации аК (АНА81) (в геноме А В. _)ипсеа) с мутацией А107Т (в геноме В В. _щпсеа), которые также обеспечивают синергетические уровни устойчивости к гербицидам по сравнению с растениями, сочетающими в себе мутации РМ1 и РМ2.
В одном варианте настоящее изобретение относится к резистентным к гербицидам двойным мутантным растениям Втакаса, которые происходят из линии Втакаса, которая была названа 105Ζ-07801. В другом варианте настоящее изобретение относится к резистентным к гербицидам растениям Втакаса, которые происходят из линии Втакаса, которая была названа 104Е-0139. В еще одном варианте настоящее изобретение относится к резистентным к гербицидам растениям Втакаса, которые происходят из линии Вгаккюа, которая была названа 104Е-0130. В еще одном варианте, настоящее изобретение относится к резистентным к гербицидам растениям Вгаккюа, которые происходят из линии Вгаккюа, которая была названа 104Е-0122.
Резистентное к гербицидам растение Вгаккюа согласно изобретению может содержать одну, две, три, четыре или больше копий гена или полинуклеотида, кодирующего резистентный к гербицидам белок АНА8Ь согласно изобретению. Резистентное к гербицидам растение Вгаккюа согласно изобретению может содержать ген или полинуклеотид, кодирующий резистентный к гербицидам белок АНА8Ь, содержащий одиночную, двойную или большее количество мутаций. Растения Вгаккюа согласно изобретению также включают семена и растения-потомки, которые содержат по меньшей мере одну копию гена или полинуклеотида, кодирующего резистентный к гербицидам белок АНА8Ь согласно изобретению. Семена или полученные из них растения-потомки, которые содержат один полинуклеотид, кодирующий полипептид АНА8Ь, содержащий одиночную, двойную или большее количество мутаций, или два или более полинуклеотидов, кодирующих полипептиды АНА8Ь с одиночной мутацией, имеют неожиданно более высокий уровень устойчивости к АНА8-ингибирующему гербициду, например, имидазолиноновому гербициду или гербициду на основе сульфонилмочевины, чем предполагается на основании данных о наличии полипептидов АНА8Ь с одиночной мутацией в одном растении. В растениях и их потомстве наблюдается синергетический эффект, а не аддитивный эффект в отношении устойчивости к гербицидам, при этом уровень устойчивости к гербицидам у растений и их потомства, содержащих множественные мутации, выше чем уровень устойчивости к гербицидам у растения, содержащего белок АНА8Ь с единичной мутацией.
Настоящее изобретение относится к способу борьбы с сорняками, растущими рядом с нетрансгенными и трансгенными резистентными к гербицидам растениями согласно изобретению. Такие растения включают, например, резистентные к гербицидам растения Вгаккюа, описанные выше, и растения, трансформированные молекулой полинуклеотида, кодирующего резистентный к гербицидам белок АНА8Ь согласно изобретению. Трансформированные растения содержат в своих геномах по меньшей мере одну кассету экспрессии, содержащую промотор, который управляет экспрессией гена в растительной клетке, при этом промотор оперативно связан с полинуклеотидом АНА8Ь согласно изобретению. Способ включает в себя применение эффективного количества гербицида по отношению к сорнякам и
- 3 025843 резистентному к гербицидам растению, при этом резистентное к гербицидам растение имеет повышенную резистентность по меньшей мере к одному гербициду, в частности к имидазолиноновому или сульфонилмочевинному гербициду, по сравнению с растением дикого типа или ^трансформированным растением. Настоящее изобретение относится к способам повышения активности АНА8 в растении для получения резистентного к гербицидам растения и для повышения устойчивости к гербицидам уже устойчивого к гербицидам растения. В некоторых вариантах осуществления изобретения способы включают в себя трансформацию растительной клетки полинуклеотидной конструкции, содержащей нуклеотидную последовательность, оперативно связанную с промотором, который управляет экспрессией в растительной клетке, и регенерацию трансформированного растения из трансформированной растительной клетки. Нуклеотидная последовательность выбрана из таких нуклеотидных последовательностей, которые кодируют резистентные к гербицидам белки АНА8Ь согласно изобретению. В других вариантах способы включают в себя обычную селекцию растений, которая заключается в перекрестном опылении резистентного к гербицидам растения согласно изобретению с другим растением и, кроме того, может включать в себя отбор потомства, которое обладает свойствами резистентности к гербицидам родительского растения, которое является резистентным к гербицидам растением согласно изобретению.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к изолированным молекулам полинуклеотидов и изолированным полипептидам белков АНА8Ь Вгаккюа. Молекулы полинуклеотидов согласно изобретению содержат нуклеотидные последовательности, которые кодируют резистентные к гербицидам белки АНА8Ь согласно изобретению. Резистентные к гербицидам белки АНА8Ь согласно изобретению содержат полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из а) нуклеотидной последовательности, указанной в 8ЕО ГО N0:13; Ь) нуклеотидной последовательности, указанной в 8Е0 ГО N0:14; с) нуклеотидной последовательности, указанной в 8Е0 ГО N0:15; й) нуклеотидной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 90% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью, указанной в 8Е0 ГО N0:13, при этом белок имеет аспарагин в положении, соответствующем положению 653 в последовательности 8Е0 ГО N0:1, или положению 638 в последовательности 8Е0 ГО N0:2, или положению 635 в последовательности 8Е0 ГО N0:3; е) нуклеотидной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 90% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью, указанной в 8Е0 ГО N0:14, при этом белок имеет треонин в положении, соответствующем положению 122 в последовательности 8Е0 ГО N0:1, или положению 107 в последовательности 8Е0 ГО N0:4, или положению 104 в последовательности 8Е0 ГО N0:5; Г) нуклеотидной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 90% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью, указанной в 8Е0 ГО N0:15, при этом белок имеет треонин в положении, соответствующем положению 122 в последовательности 8Е0 ГО N0:1, или положению 107 в последовательности 8Е0 ГО N0:4, или положению 104 в последовательности 8Е0 ГО N0:5. Вышеуказанный белок АНА8Ь дополнительно содержит по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из а) аспарагина в положении, соответствующем положению 653 в последовательности 8Е0 ГО N0:1, или положению 638 в последовательности 8Е0 ГО N0:2, или положению 635 в последовательности 8Е0 ГО N0:3; Ь) треонина в положении, соответствующем положению 122 в последовательности 8Е0 ГО N0:1, или положению 107 в последовательности 8Е0 ГО N0:4, или положению 104 в последовательности 8Е0 ГО N0:5; и с) лейцина в положении, соответствующем положению 574 в последовательности 8Е0 ГО N0:1 или положению 557 в последовательности 8Е0 ГО N0:6.
Также предлагаются кассеты экспрессии, векторы для трансформации, трансформированные клетки-хозяева, отличные от клеток человека, и трансформированные растения, части растений и семена, которые содержат одну или несколько молекул полинуклеотидов согласно изобретению.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 изображено выравнивание нуклеотидных последовательностей кодирующих областей гена АНА8Ь дикого типа из АгаЫйоркь (НаПапа (А1АНА8Ь, 8Е0 ГО N0:11), резистентного к гербицидам гена В)АНА8Е1В-8653Н Втакк1са щпсеа из линии 104Е-0044 (104Е-0044, 8Е0 ГО N0:12), резистентного к гербицидам гена В|АНА8Е1А-8653Н Втакк1са щпсеа из линии 104Е-0139 (104Е-0139, 8Е0 ГО N0:13), резистентного к гербицидам гена В]АНА8Ь1В-А122Т Втакыса щпсеа из линии 104Е-0130 (Ю4Е-0130. 8Е0 ГО N0:14), резистентного к гербицидам гена В]АНА§Ь1А-А122Т Втакк1са щпсеа из линии 104Е-0122 (В]АНА§Ь1А, 8Е0 ГО N0:15), резистентного к гербицидам гена ВпАНА§Т1А-^574Ь Втакк1са парик из линии РМ2 (ВпАНА8Ь1А, 8Е0 ГО N0:16), гена В]АНА8Ь1А дикого типа Вгаккюа щпсеа (В]АНА§Ь1А, 8Е0 ГО N0:17), гена В]АНА8Ь1В дикого типа Втакыса щпсеа (В]АНА§Ь1В, 8Е0 ГО N0:18), гена ВпАНА8Ь1А дикого типа Втакыса парик (ВпАНА8Ь1А, 8Е0 ГО N0:19), гена ВпАНА§Ь1С дикого типа ВгакК1са парик (ВпАНА8Ь1С, 8Е0 ГО N0:20). Анализ осуществляли с помощью пакета программ Уес1ог ЭТ1, использующих алгоритм Рак! А1§отйЪт (открытие пробела 15, продолжение пробела 6,66 и разделение пробелов 8, матрица к^дарйиат!).
На фиг. 2 изображено выравнивание аминокислотных последовательностей гена АНА8Ь дикого типа из АтаЫйорык (НаПапа (А1АНА§Ь, 8Е0 ГО N0:1), резистентного к гербицидам гена В]АНА§Ь1В§653N Втакыса щпсеа из линии 104Е-0044 (104Е-0044, 8Е0 ГО N0:2), резистентного к гербицидам гена В)АНА8Е1А-8653Н Втакыса щпсеа из линии 104Е-0139 (104Е-0139, 8Е0 ГО N0:3), резистентного к гер- 4 025843 бицидам гена В_)ЛНЛ§Ь1В-Л122Т Вгаккюа _)ипсеа из линии 104Е-0130 (104Е-0130, 8ЕО ГО N0:4), резистентного к гербицидам гена В_)АНА8Е1А-А122Т Вгаккюа _)ипсеа из линии 104Е-0122 (104Е-0122, 8ЕО ГО N0:5), резистентного к гербицидам гена ВпАНА8Е1А-\У574Е Вгаккюа парик из линии РМ2 (ВпАНА8Ь1А, 8Е0 ГО N0:6), гена В_)АНА8Е1А дикого типа Вгаккюа .(ипсеа (В_)АНА8Е1А, 8Е0 ГО N0:7), гена В|АНА8Е1В дикого типа Вгаккюа .(ипсеа (В_)АНА8Е1В, 8Е0 ГО N0:8), гена ВпАНА8Ь1А дикого типа Вгаккюа парик (ВпАНА8Ь1А, 8Е0 ГО N0:9), гена ВпАНА8Ь1С дикого типа Вгаккюа парик (ВпАНА8Ь1С, 8Е0 ГО N0:10). Анализ осуществляли, используя пакет программ УесЮг КП (штраф за открытие пробела равен 10, штраф за продолжение пробела равен 0,05, штраф за разделение пробелов равен 8, матрица Ыокиш 62МТ2).
Фиг. 3 представляет собой столбчатую диаграмму, показывающую результаты анализа активности фермента АНА8 для линий растений В. _щпсеа.
Фиг. 4 представляет собой диаграмму, показывающую результаты анализа опрыскивания в теплице линий растений В. _щпсеа.
На фиг. 5 приведена таблица, показывающая идентификационные номера соответствующих последовательностей ДНК или белка.
На фиг. 6 показана активность фермента АНА8 в белковых экстрактах, выделенных из гомозиготных линий В. _)цпсеа, линий, содержащих сочетания мутаций аК, ЬК, А107Т и А104Т В. _щпсеа друг с другом и с интрогрессированной в В. _)ипсеа мутацией РМ2, при концентрации имазамокса 100 мкМ.
На фиг. 7 показано среднее значение повреждения растений (фитотоксичность) линий Р2 В. _щпсеа, имеющих разную зиготность и разные сочетания мутаций АНА8 аК и А107Т, через 2 недели после опрыскивания теплицы 35 г активного ингредиента имазамокса/га.
На фиг. 8 показано среднее значение фитотоксичности для растений линий ОН В. _)ипсеа, содержащих сочетания мутаций В. _щпсеа аК, ЬК, А107Т и А104Т друг с другом и с интрогрессированной в В. _)ипсеа мутацией РМ2, после опрыскивания 35 г активного ингредиента имазамокса/га (Кар!ог®).
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к растениям Вгаккюа, имеющим повышенную резистентность к гербицидам по сравнению с растением Вгаккюа дикого типа. Резистентные к гербицидам растения Вгаккюа получали как подробно описано ниже, воздействуя на изолированные микроспоры Вгаккюа дикого типа (в отношении резистентности к гербицидам) мутагеном, культивируя микроспоры в присутствии эффективного количества имидазолинонового гербицида и отбирая выжившие зародыши. Из выживших зародышей получали гаплоидные растения Вгаккюа и затем хромосомы удваивали, чтобы получить способные к размножению дигаплоидные растения Вгаккюа, которые имеют повышенную резистентность к имидазолиноновому гербициду по сравнению с резистентностью растения Вгаккюа дикого типа. В одном варианте настоящее изобретение относится к резистентной к гербицидам линии Вгаккюа, называемой в настоящем описании 104Е-0139, которая была получена в результате мутагенеза микроспор, как подробно описано ниже. В другом варианте настоящее изобретение относится к резистентной к гербицидам линии Вгаккюа, называемой в настоящем описании 104Е-0130. которая была получена в результате мутагенеза микроспор. В еще одном варианте настоящее изобретение относится к резистентной к гербицидам линии Вгаккюа, называемой в настоящем описании 104Е-0122, которая была получена в результате мутагенеза микроспор. В еще одном варианте настоящее изобретение относится к резистентной к гербицидам линии Вгаккюа, называемой в настоящем описании 105Ζ-07801, которая была получена скрещиванием мутантной линии В. _)ипсеа ЬК (И.8. 2005/0283858) с мутантной линией РМ2 (смотрите И8 2004/0142353 и И8 2004/0171027; также смотрите Найоп е! а1., Мо1. Оеп. ОепеЕ 246: 419-425, 1995), которая исходно была получена в результате интрогрессии в Вгаккюа .щпсеа из Вгаккюа парик.
Таким образом, настоящее изобретение относится к растениям Вгаккюа .щпсеа, обладающим резистентностью к гербицидам, ингибирующим АНА8. Предлагаются линии В. _)ипсеа, которые содержат одиночную мутацию по меньшей мере в одном полинуклеотиде АНА8Ь, при этом одиночная мутация выбрана из группы, состоящей из трансверсии О-на-А, которая соответствует аминокислоте в положении 653 последовательности АНА8Ь1 АгаЬМроык (НаЕапа, и трансверсии О-на-А, которая соответствует аминокислоте в положении 122 последовательности АНА8Ь1 А. ШаПапа.
Из резистентных к гербицидам растений Вгаккюа .щпсеа 104Е-0139 и растений Вгаккюа .(ипсеа дикого типа выделяли кодирующую область гена большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (называемого АНА8Ь1) посредством амплификации в полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенировали. В результате сравнения полинуклеотидных последовательностей резистентных к гербицидам растений Вгаккюа и растений Вгаккюа дикого типа было обнаружено, что кодирующая область полинуклеотидной последовательности АНА8Ь1 из резистентного к гербицидам растения Вгаккюа локализована в геноме А Вгаккюа _щпсеа и отличается от полинуклеотидной последовательности АНА8Ь1 растения дикого типа одним нуклеотидом в результате трансверсии О-на-А (фиг. 1). Указанная трансверсия О-на-А в полинуклеотидной последовательности АНА8Ь1 приводит к новой замене 8ег на Акп в положении аминокислоты 635 (соответствующей аминокислоте 653 АНА8Ь1 А. ШаПапа) в консервативной области рассчитанной аминокислотной последовательности белка АНА8Ь1 в сравнении с аминокислотной последовательностью белка АНА8Ь1 дикого типа (фиг. 2).
- 5 025843
Из резистентных к гербицидам растений Втакк1са .щпсеа 104Е-0130 и растений Втакк1са .(ипсеа дикого типа выделяли кодирующую область гена большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (называемого АНАЗЬ1) посредством амплификации в полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенировали. В результате сравнения полинуклеотидных последовательностей резистентных к гербицидам растений Втакк1са и растений Втаккюа дикого типа было обнаружено, что кодирующая область полинуклеотидной последовательности АНАЗЬ1 из резистентной к гербицидам линии Втаккюа 104Е-0130 локализована в геноме В Втаккюа _)ипсеа и отличается от полинуклеотидной последовательности АНАЗЬ1 растения дикого типа одним нуклеотидом в результате трансверсии С-на-А (фиг. 1). Указанная трансверсия Сна-А в полинуклеотидной последовательности АНАЗЬ1 приводит к новой замене А1а на Тйт в положении аминокислоты 107 (соответствующей аминокислоте 122 АНАЗЬ1 А. (ЪаПапа) в консервативной области рассчитанной аминокислотной последовательности белка АНАЗЬ1 в сравнении с аминокислотной последовательностью белка АНАЗЬ1 дикого типа (фиг. 2).
Из резистентных к гербицидам растений Втаккюа .щпсеа 104Е-0122 и растений Втаккюа .(ипсеа дикого типа выделяли кодирующую область гена большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (называемого АНАЗЬ1) посредством амплификации в полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенировали. В результате сравнения полинуклеотидных последовательностей резистентных к гербицидам растений Втакк1са и растений Втаккюа дикого типа было обнаружено, что кодирующая область полинуклеотидной последовательности АНАЗЬ1 из резистентной к гербицидам линии Втаккюа 104Е-0122 локализована в геноме А Втаккюа _)ипсеа и отличается от полинуклеотидной последовательности АНАЗЬ1 растения дикого типа одним нуклеотидом в результате трансверсии С-на-А (фиг. 1). Указанная трансверсия Сна-А в полинуклеотидной последовательности АНАЗЬ1 приводит к новой замене А1а на Тйт в положении аминокислоты 104 (соответствующей аминокислоте 122 АНАЗЬ1 А. (йаПаиа) в консервативной области рассчитанной аминокислотной последовательности белка АНАЗЬ1 в сравнении с аминокислотной последовательностью белка АНАЗЬ1 дикого типа (фиг. 2).
Настоящее описание также относится к растениям В. _щпсеа, которые содержат, по меньшей мере, два мутантных полинуклеотида АНАЗЬ. Такие растения также называют в настоящем описании растениями, содержащими сочетанные мутации. Мутации могут быть в одном и том же или в разных геномах растения В. _)ипсеа. Растения В. _)ипсеа могут содержать любое количество мутантных полинуклеотидов АНАЗЬ и любое сочетание мутаций, включая без ограничения мутации, соответствующие положению 653 в последовательности ЗЕО ГО N0:1, положению 638 в последовательности ЗЕО ГО N0:2, положению 635 в последовательности ЗЕО ГО N0:3, положению 122 в последовательности ЗЕО ГО N0:1, положению 107 в последовательности ЗЕО ГО N0:4, положению 104 в последовательности ЗЕО ГО N0:5, положению 574 в последовательности ЗЕО ГО N0:1 или положению 557 в последовательности ЗЕО ГО N0:6.
Также в настоящем изобретении предлагаются растения В. _щпсеа, имеющие два мутантных полинуклеотида АНАЗЬ в разных геномах, один мутантный полинуклеотид АНАЗЬ в геноме А и второй мутантный полинуклеотид АНАЗЬ в геноме В. Такие растения В. _щпсеа, имеющие два мутантных полинуклеотида АНАЗЬ, включают растения, содержащие мутацию ЬК мутация и мутацию РМ2. К таким растениям относятся растения В. _щпсеа линии 105Ζ-07801. а также их семена и потомство, а также потомки, полученные от скрещиваний с линией В. _)ипсеа 105Ζ-07801. В другом аспекте растения В. _щпсеа, имеющие две мутации АНАЗЬ, включают растения, в которых сочетается мутация аК (например, из линии 104Е-0139) с мутацией А122Т (например, из линии Л04Е-0130). в линии потомков В. _)ипсеа. В одном аспекте такие растения, сочетающие в себе две мутации АНАЗЬ1, имеют синергетический уровень устойчивости к гербицидам по сравнению с аддитивными уровнями устойчивости к гербицидам растений В. _)ипсеа, содержащих соответствующие отдельные мутации.
Мутации РМ1 и РМ2 получали, используя мутагенез микроспор Втаккюа парик, как описано в Зетапкоп е! а1. (Р1ап! Се11 Керойк 7: 83-87(1989)). Мутация РМ2 характеризуется заменой одного нуклеотида (С на Т) на 3'-конце гена АНАЗ3, предположительно в геноме А Втаккюа парик (Кийебде е! а1. Мо1. Сеп. СепеЕ 229: 31-40 (1991)), что приводит к аминокислотной замене Тгр на Ьеи, Тгр556(Вп)Ьеи (НаНоп е! а1., Мо1. Сеп. СепеЕ 246: 419-425, 1995). Мутация РМ1, предположительно присутствующая в геноме С Втаккюа парик (КиИебде е! а1. Мо1. Сеп. СепеЕ 229: 31-40 (1991)), характеризуется заменой одного нуклеотида в геноме АНАЗ1 (С на А), приводящей к аминокислотной замене Зег на Акп, Зег638(Вп)Акп (смотрите ЗаШакАап е! а1., Р1ап! РЬукю1. 97: 1044-1050, 1991, и Найоп е! а1., Мо1. Сеп. СепеЕ 232: 167-173, 1992; также смотрите ИЗ 2004/0142353 и ИЗ 2004/0171027). Сообщалось, что мутантные гены РМ1 (АНАЗ1) и РМ2 (АНАЗ3) действуют аддитивно, обеспечивая устойчивость к имидазолиноновым гербицидам (З\\апкоп е! а1., Тйеот. Арр1. СепеЕ 78: 525-530, 1989).
Поскольку полагают, что РМ2 локализована в геноме А Втаккюа парик, и оба вида: Втаккюа .щпсеа и Втаккюа тара, содержат геном А, то перенос мутантного гена РМ2 из парик либо в _щпсеа, либо в тара можно осуществить, используя скрещивание видов (интрогрессию) и отбор при селекции у условиях низких уровней гербицида. Поскольку полагают, что РМ1 локализована в геноме С Втаккюа парик, то интрогрессия такого мутанта из В. парик в Втаккюа .(ипсеа (А,В) или Втаккюа тара (А,А) намного более сложна, так как она зависит от того произойдет ли редкое событие хромосомной транслокации (между
- 6 025843 геномом С Вгакк1са парик и либо геномом А, либо геномом В Вгакк1са .(ипсеа). Такое событие хромосомной транслокации часто может быть отягощено отсутствием стабильности, а также неспособностью исключить сопротивление связывания, которое часто имеет место при использовании такого способа. В патенте США № 6613963 описаны устойчивые к гербицидам растения Вгаккюа .щпсеа РМ1/РМ2, полученные с использованием такого способа интрогрессии. Исходя из аддитивной устойчивости, обеспечиваемой мутациями РМ1 и РМ2 у В. парик, можно ожидать, что интрогрессия двух мутаций, РМ1 и РМ2, в Вгаккюа _)ипсеа также приведет в аддитивной устойчивости к гербицидам.
Чтобы преодолеть проблемы, связанные с переносом признака устойчивости к гербицидам из генома С Вгаккюа парик в геномы А или В Вгаккюа гара и/или Вгаккюа .(ипсеа, предпочтительно прямое получение мутации в требуемом геноме. В заявке на выдачу патента США 2005/0283858 описана устойчивая к гербицидам мутация АНАЗ1 Вгаккюа _)ипсеа, ЬК, которую получали прямым мутагенезом, приводящим к 8ΝΡ в гене АНАЗ1, что вызывало замену 8ег638Лкп (положение 653 на основании использования номенклатуры положений аминокислот в АНАЗЬ АгаЫборкю) в гене АНАЗЬ в геноме В.
Растения В. _)ипсеа, имеющие две или более мутаций АНАЗЬ, предлагаемые в настоящем изобретении, могут иметь повышенные уровни резистентности к гербицидам по сравнению с аддитивными уровнями резистентности в случае отдельных мутаций. Растения, имеющие две или более мутаций АНАЗЬ, могут иметь уровни резистентности, которые на 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50%, или еще выше в сравнении с аддитивным уровнями резистентности, обеспечиваемые отдельными мутациями АНАЗЬ.
Увеличение резистентности можно измерить, используя любой способ определения резистентности АНАЗ. Например, резистентность можно измерить, определяя резистентность в В. _)ипсеа в процентах через период времени, составляющий 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 или 28 дней, после обработки гербицидом, ингибирующим АНАЗ. Затем резистентность в процентах можно сравнить с уровнями, полученными суммированием резистентности в процентах растений, содержащих соответствующие отдельные мутации АНАЗЬ. В одном аспекте резистентность определяют измерением резистентности растений в процентах через 14 дней после обработки 2-кратным количеством гербицида, ингибирующего АНАЗ.
Изобретение, кроме того, относится к изолированным молекулам полинуклеотидов, содержащим нуклеотидные последовательности, которые кодируют белки большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (АНАЗЬ), и к таким белкам АНАЗЬ. Изобретение раскрывает выделение и нуклеотидную последовательность полинуклеотида, кодирующего резистентный к гербицидам белок АНАЗЫ Вгаккюа, из резистентного к гербицидам растения Вгаккюа, которое было получено с помощью химического мутагенеза растений Вгаккюа дикого типа. Резистентные к гербицидам белки АНАЗЫ согласно изобретению имеют замену серина на аспарагин в положении 635 гена АНАЗШ В. _)ипсеа, локализованного в геноме А, или замену аланина на треонин в положении 107 гена АНАЗШ В. _)ипсеа, локализованного в геноме В, или замену аланина на треонин в положении 104 гена АНАЗШ В. _)ипсеа, локализованного в геноме А. В изобретении, кроме того, раскрыто выделение и нуклеотидная последовательность молекулы полинуклеотида, кодирующей белок АНАЗЫ дикого типа Вгаккюа.
Настоящее изобретение относится к изолированным молекулам полинуклеотидов, которые кодируют белки АНАЗШ из Вгаккюа, в частности Вгаккюа .(ипсеа. В частности, изобретение относится к изолированным молекулам полинуклеотидов, содержащим: нуклеотидную последовательность, указанную в ЗЕО ГО N0:13, нуклеотидные последовательности, кодирующие белок АНАЗЫ, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в ЗЕО ГО N0:3, нуклеотидную последовательность, указанную в ЗЕО ГО N0:14, нуклеотидные последовательности, кодирующие белок АНАЗЫ, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в ЗЕО ГО N0:4, нуклеотидную последовательность, указанную в ЗЕО ГО N0:15, нуклеотидные последовательности, кодирующие белок АНАЗЫ, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в ЗЕО ГО N0:5, и фрагменты и варианты таких нуклеотидных последовательностей, которые кодируют функциональные белки АНАЗЬТ
Изолированные резистентные к гербицидам молекулы полинуклеотидов АНАЗЫ согласно изобретению содержат нуклеотидные последовательности, которые кодируют резистентные к гербицидам белки АНАЗЬТ Такие молекулы полинуклеотидов можно использовать в полинуклеотидных конструкциях для трансформации растений, в частности культурных растений, чтобы повысить резистентность растений к гербицидам, в частности, гербицидам, которые, как известно, ингибируют активность АНАЗ, более конкретно к имидазолиноновым гербицидам. Такие полинуклеотидные конструкции можно использовать в кассетах экспрессии, экспрессирующих векторах, векторах для трансформации, плазмидах и тому подобном. Трансгенные растения, полученные после трансформации такими полинуклеотидными конструкциями, проявляют повышенную резистентность к АНАЗ-ингибирующим гербицидам, таким как, например, имидазолиноновые и сульфонилмочевинные гербициды.
Композиции согласно изобретению включают в себя нуклеотидные последовательности, которые кодируют белки АНАЗЬТ В частности, настоящее изобретение относится к изолированным молекулам полинуклеотидов, содержащим нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотную последовательность, показанную в ЗЕО ГО N0:3, 4 или 5, и их фрагменты и варианты, которые кодируют полипептиды, обладающие активностью АНАЗ. Кроме того, предлагаются полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, кодируемую полинуклеотидной молекулой, описанной в настоящей
- 7 025843 публикации, например, нуклеотидной последовательностью, указанной в БЕО ГО N0:13, 14 или 15 и ее фрагментами и вариантами, которые кодируют полипептиды, обладающие активностью АНАБ.
Настоящее изобретение относится к белкам АНАБЬ с аминокислотными заменами в конкретных аминокислотных положениях в консервативных областях белков АНАБЬ Вгаккюа, раскрытых в настоящем описании. Если в настоящем описании не оговорено особо, конкретные аминокислотные положения относятся к положению такой аминокислоты в полноразмерной аминокислотной последовательности АНАБЬ А. (НаПапа. указанной в БЕО ГО N0:1. Кроме того, специалистам в данной области будет понятно, что такие аминокислотные положения могут варьировать в зависимости от того, добавляются или удаляются аминокислоты, например, на Ν-конце аминокислотной последовательности. Таким образом, изобретение охватывает аминокислотные замены в указанном положении или эквивалентном положении (например, в положении аминокислоты 653 или эквивалентном положении).
Подразумевается, что эквивалентное положение означает положение, которое находится в той же самой консервативной области, что и указанное положение аминокислоты. Например, аминокислота 122 в последовательности БЕО ГО N0:1 находится в положении, эквивалентном положению аминокислоты 107 в последовательности БЕО ГО N0:4, и в положении, эквивалентном положению аминокислоты 104 в последовательности БЕО ГО N0:5. Подобным образом, аминокислота 653 в белке АНАБЬ АгаЫбор818 1йаПапа, имеющем аминокислотную последовательность, указанную в БЕО ГО N0:1, находится в положении, эквивалентном положению аминокислоты 638 в АНАБЬ1В Вгаккюа и положению аминокислоты 635 в белках АНАБЬ1А Вгаккюа, имеющим аминокислотную последовательность, указанную в БЕО ГО N0:2 и 3 соответственно.
Изобретение охватывает изолированные или по существу очищенные композиции нуклеиновых кислот или белков. Изолированная или очищенная молекула полинуклеотида или белка или его биологически активная часть в значительной степени или по существу не содержит компонентов, которые обычно сопровождают или взаимодействуют с молекулой полинуклеотида или белком и обнаружены в его природном окружении. Таким образом, изолированная или очищенная молекула полинуклеотида или белка по существу не содержит других клеточных компонентов или культуральной среды при получения основанными на рекомбинации способами, или по существу не содержит химических предшественников или других химических вещества при химическом синтезе. Предпочтительно «изолированная» нуклеиновая кислота не содержит последовательностей (предпочтительно кодирующих белок последовательностей), которые в природе фланкируют нуклеиновую кислоту (т.е. последовательностей, расположенных на 5'- и 3'-концах нуклеиновой кислоты) в геномной ДНК организма, из которого нуклеиновая кислота получена. Например, в различных вариантах изолированная молекула полинуклеотида может содержать меньше, чем примерно 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 или 0,1 т.п.н. нуклеотидных последовательностей, которые в природе фланкируют молекулу полинуклеотида в геномной ДНК клетки, из которой нуклеиновая кислота получена. Белок, который по существу не содержит клеточного материала, включает препараты белка, содержащие менее чем примерно 30, 20, 10, 5 или 1% (сухой массы) загрязняющего белка. В том случае, когда белок согласно изобретению или его биологически активную часть получают способами на основе рекомбинации, предпочтительно культуральная среда составляет менее чем примерно 30, 20, 10, 5 или 1% (сухой массы) химических предшественников или химических вещества, отличных от представляющего интерес белка.
Настоящее изобретение относится к изолированным полипептидам, составляющим белки АНАБЬТ Изолированные полипептиды содержат аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, указанных в БЕО ГО N0:3, 4 или 5, аминокислотных последовательностей, кодируемых нуклеотидными последовательностями, указанными в БЕО ГО N0:13, 14 или 15, и функциональных фрагментов и вариантов указанных аминокислотных последовательностей, которые кодируют полипептид АНАБЬ1, обладающий активностью АНАБ. Под функциональными фрагментами и вариантами подразумевают фрагменты и варианты указанных полипептидов, которые обладают активностью АНАБ.
В некоторых вариантах осуществления изобретения способы включают в себя применение устойчивых к гербицидам или резистентных к гербицидам растений. Под устойчивым к гербицидам или резистентным к гербицидам растением подразумевают растение, которое устойчиво или резистентно по меньшей мере к одному гербициду на уровне, которое обычно может убивать или ингибировать рост нормального растения или растения дикого типа. В одном варианте осуществления изобретения устойчивые к гербицидам растения согласно изобретению содержат устойчивый к гербицидам или резистентный к гербицидам белок АНАБЬ. Под устойчивым к гербицидам белком АНАБЬ или резистентным к гербицидам белком АНАБЬ подразумевают, что такой белок АНАБЬ обладает более высокой активностью АНАБ по сравнению с активностью АНАБ белка АНАБЬ дикого типа в присутствии по меньшей мере одного гербицида, который, как известно, препятствует проявлению активности АНАБ, и при концентрации или уровне гербицида, который, как известно, ингибирует активность АНАБ белка АНАБЬ дикого типа. Кроме того, активность АНАБ такого устойчивого к гербицидам или резистентного к гербицидам белка АНАБЬ может быть названа в настоящем описании устойчивой к гербицидам или резистентной к гербицидам активностью АНАБ.
- 8 025843
Для настоящего изобретения термины устойчивый к гербицидам и резистентный к гербицидам используют взаимозаменяемо, и подразумевается, что термины имеют эквивалентное значение и эквивалентный диапазон использования. Подобным образом, термины устойчивость к гербицидам и резистентность к гербицидам используют взаимозаменяемо, и подразумевается, что термины имеют эквивалентное значение и эквивалентный диапазон. Подобным образом, термины резистентный к имидазолинонам и резистентность к имидазолинонам используют взаимозаменяемо, и подразумевается, что термины имеют эквивалентное значение и эквивалентный диапазон как и термины устойчивый к имидазолинонам и устойчивость к имидазолинонам соответственно.
Изобретение охватывает резистентные к гербицидам полинуклеотиды АНАЗЫ и резистентные к гербицидам белки АНАЗЫ. Под резистентным к гербицидам полинуклеотидом АНА8Ы подразумевают полинуклеотид, который кодирует белок, обладающий резистентной к гербицидам активностью АНАЗ. Под резистентным к гербицидам белком АНА8Ы подразумевают белок или полипептид, который обладает резистентной к гербицидам активностью АНАЗ. Кроме того, понятно, что устойчивый гербицидам или резистентный к гербицидам белок АНАЗЬ может быть введен в растение в результате трансформации растения или его предка нуклеотидной последовательностью, кодирующей устойчивый к гербицидам или резистентный к гербицидам белок АНАЗЬ. Такие устойчивые к гербицидам или резистентные к гербицидам белки АНЛ8Ь кодируются устойчивыми к гербицидам или резистентными к гербицидам полинуклеотидами АНАЗЬ. Альтернативно устойчивый к гербицидам или резистентный к гербицидам белок АНАЗЬ может встречаться в растении в результате происходящей в природе или индуцированной мутации в эндогенном гене АНАЗЬ в геноме растения или его предка.
Настоящее изобретение относится к растениям, растительным тканям, растительным клеткам и клеткам-хозяевам с увеличенной и/или повышенной резистентностью или устойчивостью по меньшей мере к одному гербициду, в частности, к гербициду, который препятствует проявлению активности фермента АНАЗ, более конкретно к имидазолиноновому или сульфонилмочевинному гербициду. Термин повышенная относится к увеличению резистентности или устойчивости в большей степени, чем ожидается. Предпочтительное количество или концентрация гербицида является эффективным количеством или эффективной концентрацией. Под эффективным количеством и эффективной концентрацией подразумевают количество и концентрацию, соответственно, которые достаточны для того, чтобы убить или ингибировать рост сходного растения дикого типа, растительной ткани, растительной клетки, микроспоры или клетки-хозяина, но такое указанное количество не убивает или не ингибирует так сильно рост резистентного к гербицидам растения, растительной ткани, растительных клеток, микроспор и клеток-хозяев согласно настоящему изобретению. Обычно эффективное количество гербицида представляет собой количество, которое обычно используют в системах производства сельскохозяйственной продукции, чтобы убить представляющие интерес сорняки. Такое количество известно специалистам в данной области или может быть легко определено способами, известными в данной области. Кроме того, понятно, что эффективное количество гербицида в системах производства сельскохозяйственной продукции может в значительной степени отличаться от эффективного количества гербицида для системы культивирования растений, такой как, например, система культивирования микроспор.
Гербициды согласно настоящему изобретению представляют собой гербициды, которые препятствуют проявлению активности фермента АНАЗ, например активность АНАЗ снижается в присутствии гербицида. Такие гербициды также могут быть названы в настоящем описании АНАЗ-ингибирующими гербицидами или просто ингибиторами АНАЗ. В используемом в настоящем описании смысле АНАЗ-ингибирующий гербицид или ингибитор АНАЗ не означает ограничение одним гербицидом, который препятствует проявлению активности фермента АНАЗ. Таким образом, если не указано или не очевидно из контекста иное, АНАЗ-ингибирующий гербицид или ингибитор АНАЗ может означать один гербицид или смесь двух, трех, четырех или более гербицидов, каждый из которых препятствует проявлению активности фермента АНАЗ.
Под сходным растением дикого типа, растительной тканью, растительной клеткой или клеткойхозяином подразумевают растение, растительную ткань, растительную клетку или клетку-хозяина, соответственно, которые не обладают свойствами резистентности к гербицидам и/или которые не имеет конкретного полинуклеотида согласно изобретению, который раскрыт в настоящем описании. Следовательно, использование термина дикого типа не означает, что растение, растительная ткань, растительная клетка, или другая клетка-хозяин не имеет рекомбинантной ДНК в своем геноме и/или не обладает свойствами резистентности к гербицидам, которые отличаются от свойств, описанных в настоящей публикации.
В используемом в настоящем описании смысле и если четко не указано иное термин «растение» означает растение на любой стадии развития, а также любую часть или части растения, которые могут быть не отделены или отделены от целого интактного растения. Такие части растения включают без ограничения органы, ткани и клетки растения, включая каллусы растений, скопления растительных клеток, протопласты растений и культуры растительных клеток, из которых растения могут быть регенерированы. Примеры конкретных частей растения включают стебель, лист, корень, соцветие, цветок, цветок компактного соцветия, плод, цветоножку, плодоножку, тычинку, пыльник, рыльце, столбик, завязь, лепе- 9 025843 сток, чашелистик, плодолистик, кончик корня, корневой чехлик, корневой волосок, волосок семени, пальцевое зерно, микроспору, зародыш, семяпочку, семядолю, гипокотиль, эпикотиль, ксилему, флоэму, паренхиму, эндосперм, клетку-спутницу, замыкающую клетку и любые другие известные органы, ткани и клетки растения. Кроме того, понятно, что семя относится к понятию растение.
Растения согласно настоящему изобретению включают как нетрансгенные растения, так и трансгенные растения.
Подразумевается, что нетрансгенное растение означает растение, не имеющее рекомбинантной ДНК в своем геноме. Трансгенное растение означает растение, содержащее рекомбинантную ДНК в своем геноме. Такое трансгенное растение может быть получено введением рекомбинантной ДНК в геном растения. В том случае, когда такую рекомбинантная ДНК вводят в геном трансгенного растения, потомство растения также может содержать рекомбинантную ДНК. Растение-потомок, которое содержит по меньшей мере часть рекомбинантной ДНК по меньшей мере одного трансгенного растения-предка, также является трансгенным растением.
Настоящее изобретение относится к резистентной к гербицидам линии Вга881са, которую называют в настоящем описании .ГО4Е-0122. Депонировано по меньшей мере 2500 семян Вгаккюа линии Ϊ04Ε-0122 в депозитарии для нужд патентования Американской коллекции типов культур (АТСС), Мап8а88а8, УА 20110 И8А, 19 октября 2006 года с номером патентуемого депозита АТСС РТА-7944. Настоящее изобретение относится к резистентной к гербицидам линии Вга881са, которую называют в настоящем описании 104Е-0130. Депонировано по меньшей мере 2500 семян Вгаккюа линии Л04Е-0130 19 октября 2006 года с номером патентуемого депозита АТСС РТА-7945. Настоящее изобретение относится к резистентной к гербицидам линии Вгаккюа, которую называют в настоящем описании Л04Е-0139. Депонировано по меньшей мере 2500 семян Вгаккюа линии Л04Е-0139 19 октября 2006 года с номером патентуемого депозита АТСС РТА-7946. Настоящее изобретение относится к резистентной к гербицидам двойной мутантной линии Вга881са, которую называют в настоящем описании Ι05Ζ-07801. По меньшей мере, 625 семян линии Вга881са Ι05Ζ-07801 депонировано 2 апреля 2007 года, остальные 1875 депонированы 15 января 2008 года с номером патентуемого депозита АТСС РТА-8305. Депозит будет храниться по условиям Будапештского договора о признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры. Депозит линий Вгаккюа Л04Е-0122. Л04Е-0130, Л04Е-0130 и Ι05Ζ-07801 помещен на срок по меньшей мере 30 лет и будет храниться по меньшей мере 5 лет с момента последнего запроса о выдаче образца депозита, полученного АТСС. Кроме того, заявители удовлетворили все требования статьи 37 С.Р.К § 1.8011.809, включая предоставление свидетельства о жизнеспособности образца.
Имеющие одиночную мутацию резистентные к гербицидам линии Вгаккюа Л04Е-0122, Л04Е-0130 и 104Е-0139 согласно настоящему изобретению получали в результате мутационной селекции. Микроспоры Вга881са дикого типа подвергали мутагенезу, воздействуя мутагеном, в частности химическим мутагеном, более конкретно этилнитрозомочевиной (ΕΝϋ). Однако настоящее изобретение не ограничено резистентными к гербицидам растениями Вгаккюа, которые получены способом мутагенеза с использованием химического мутагена ΕΝυ. Любой способ мутагенеза, известный в данной области, может быть использован для получения резистентных к гербицидам растений Вгаккюа согласно настоящему изобретению. Такие способы мутагенеза могут включать в себя, например, использование любого одного или нескольких из следующих мутагенов: излучения, такого как рентгеновское излучение, гамма-излучение (например, кобальт-60 или цезий-137), нейтроны (например, продукт деления ядра урана-235 в атомном реакторе), бета-излучение (например, испускаемого радиоактивными изотопами, такими как фосфор-32 или углерод-14) и ультрафиолетовое излучение (предпочтительно от 250 до 290 нм), и химические мутагены, такие как этилметансульфонат (ЕМ8), аналоги оснований (например, 5-бромурацил), родственные соединения (например, 8-этоксикофеин), антибиотики (например, стрептонигрин), алкилирующие агенты (например, сернистый иприт, азотистый иприт, эпоксиды, этиленамины, сульфаты, сульфонаты, сульфоны, лактоны), азид, гидроксиламин, азотистая кислота или акридины. Резистентные к гербицидам растения также могут быть получены с использованием способов культивирования тканей, чтобы отобрать растительные клетки, содержащие мутации резистентности к гербицидам, и затем из них регенерировать резистентные к гербицидам растения. Смотрите, например, патенты США № 5773702 и 5859348, которые включены в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме. Дополнительные подробности мутационной селекции можно найти в публикации Ргшщрак о£ СиНтуаг Оеуе1ортеШ. Рейг, 1993 Мастй1ап РиЫЫйпд Сотрапу, содержание которой включено в настоящее писание в виде ссылки.
Анализ гена АНА8Ь1 растения Вгаккюа линии Л04Е-0139 выявил мутацию, которая приводит к замене серина на аспарагин в положении аминокислоты 635 в гене АНА8Ь генома А В. _)ипсеа и придает повышенную резистентность к гербициду. Таким образом, настоящее изобретение раскрывает тот факт, что замена серина другой аминокислотой в положении 635 (соответствующем положению аминокислоты 653 в АНА8Ь1 А. 1йайапа) может быть причиной того, что растение Вгаккюа приобретает повышенную резистентностью к гербициду, в частности, к имидазолиноновому и/или сульфонилмочевинному гербициду. Резистентные к гербицидам растения Вгаккюа согласно изобретению включают без ограничения такие растения Вгаккюа, которые содержат в своих геномах по меньшей мере одну копию полинуклеотида АНА8Ь1, который кодирует резистентный к гербицидам белок АНА8Ь1, который содержит аспарагин
- 10 025843 в положении аминокислоты 635 или эквивалентном положении.
Анализ гена АНА8Ь1 растения Вгакк1са линии 104Е-0130 выявил мутацию, которая приводит к замене аланина на треонин в положении аминокислоты 107 в гене АНА8Ь в геноме В В. _)ипсеа и придает повышенную резистентность к гербициду. Таким образом, настоящее изобретение раскрывает тот факт, что замена аланина другой аминокислотой в положении 107 (соответствующем положению аминокислоты 122 в АНА8Ь1 А. (НаПапа) может быть причиной того, что растение Вгаккюа приобретает повышенную резистентностью к гербициду, в частности, к имидазолиноновому и/или сульфонилмочевинному гербициду. Резистентные к гербицидам растения Вгаккюа согласно изобретению включают без ограничения такие растения Вгаккюа, которые содержат в своих геномах по меньшей мере одну копию полинуклеотида АНА8Ы, который кодирует резистентный к гербицидам белок АНА8Ь1, который содержит треонин в положении аминокислоты 107 или эквивалентном положении.
Анализ гена АНА8Ы растения Вгаккюа линии 104Е-0122 выявил мутацию, которая приводит к замене аланина на треонин в положении аминокислоты 104 в гене АНА8Ь в геноме А В. _щпсеа и придает повышенную резистентность к гербициду. Таким образом, настоящее изобретение раскрывает тот факт, что замена аланина другой аминокислотой в положении 104 (соответствующем положению аминокислоты 122 в АНА§Ь1 А. (НаПапа) может быть причиной того, что растение Вгаккюа приобретает повышенную резистентностью к гербициду, в частности к имидазолиноновому и/или сульфонилмочевинному гербициду. Резистентные к гербицидам растения Вгаккюа согласно изобретению включают без ограничения такие растения Вгаккюа, которые содержат в своих геномах по меньшей мере одну копию полинуклеотида АНА8Ы, который кодирует резистентный к гербицидам белок АНА8Ы, который содержит треонин в положении аминокислоты 104 или эквивалентном положении.
Растения Вгаккюа согласно изобретению дополнительно включают растения, которые содержат, по сравнению с белком АНА8Ы дикого типа, аспарагин в положении аминокислоты 653 (номенклатура для А. (НаПапа), треонин в положении аминокислоты 122 (номенклатура для А. (НаПапа) и одну или несколько дополнительных замен в белке АНА8Ы по сравнению с белком АНА8Ы дикого типа, при этом такое растение Вгаккюа обладает повышенной резистентностью по меньшей мере к одному гербициду по сравнению с растением Вгаккюа дикого типа.
Настоящее изобретение относится к растениям и способам получения растений Вгаккюа, резистентных к гербицидам, действующим на АНА8, растений Вгаккюа, обладающих повышенной устойчивостью к АНА8-гербицидам, и семенам таких растений. Таким образом, растения, описанные в настоящей публикации, могут быть использованы в программах селекции, чтобы создать дополнительные устойчивые к гербицидам растения В. _щпсеа, такие как коммерческие сорта В. _щпсеа. В соответствии с такими способами первое родительское растение Вгаккюа может быть использовано в скрещиваниях со вторым родительским растением Вгаккюа, при этом по меньшей мере одно из указанных двух родительских растений Вгаккюа имеет по меньшей мере одну мутацию, придающую резистентность АНА8 к гербицидам. Одним из применений способа является применение для получения гибридных растений Р1. Другой важный аспект такого способа заключается в том, что способ может быть использован для создания новых родительских дигаплоидных или инбредных линий. Например, линия Вгаккюа, которая описана в настоящей публикации, может быть скрещена с любым вторым растением, и полученное гибридное потомство подвергнуто самоопылению и/или скрещиванию между сибсами в течение примерно 5-7 поколений или большего количества поколений, с получением таким образом большого количества отдельных родительских линий. Затем указанные родительские линии могут быть скрещены с другими линиями, и полученное гибридное потомство может быть подвергнуто анализу в отношении наличия полезных свойств. Таким образом могут быть идентифицированы новые линии, придающие требуемые свойства. В указанных способах можно использовать различные методики селекции, включая гаплоидию, способ отбора педигри, способ отбора одного семени в потомстве, модифицированный способ отбора одного семени в потомстве, повторяющийся отбор и возвратное скрещивание.
Линии Вгаккюа можно скрещивать, используя любые естественные или механические методики. Механическое опыление может быть осуществлено посредством контролирования типов пыльцы, которая может быть перенесена на рыльце, либо ручным опылением.
Растения-потомки Вгаккюа можно оценивать любым способом, чтобы определить присутствие мутантного полинуклеотида или полипептида АНА§Ь. Такие способы включают фенотипическую оценку, генотипическую оценку или их сочетания. Потомство растений Вгаккюа можно оценить в последующих поколениях в отношении резистентности к гербицидам и других требуемых свойств. Резистентность к ингибирующим АНА8 гербицидам можно оценить, подвергая растения воздействию одного или нескольких подходящих ингибирующих АНА8 гербицидов и оценивая повреждение гербицидами. Некоторые свойства, такие как устойчивость к полеганию и высота растения, можно оценивать посредством визуального осмотра растений, тогда как способность быстро созревать, могут быть оценены в результате визуального осмотра семян в стручках. Другие свойства, такие как процентное содержание масла, процентное содержание белка и общее содержание глюкозинолатов в семенах, могут быть оценены с использованием таких методик, как спектроскопия в ближней инфракрасной области и/или жидкостная хроматография и/или газовая хроматография. Генотипическая оценка растений Вгаккюа включает в себя
- 11 025843 применение таких методик, как электрофорез изоферментов, оценка полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (КРЬР), оценка случайно амплифицированных полиморфных ДНК (ΚΛΡΌ), случайно праймируемая полимеразная цепная реакция (АР-ПЦР), фингерпринтинг амлифицированной ДНК (ΌΛΡ), оценка амплифицированной области с охарактеризованной последовательностью (8САК), полиморфизм длин амплифицированных фрагментов (АРЬР), оценка повторов простых последовательностей (88К), которые также называют микросателлитами.
Дополнительные композиции и способы анализа генотипа растений Вгаккюа, предлагаемых в настоящем изобретении, включают способы, описанные в публикации патента США № 2004/0171027, публикации патента США № 2005/02080506 и публикации патента США № 2005/0283858, полное содержание которых включено в настоящее описание в виде ссылки.
Оценка и обработка (посредством воздействия одного или нескольких подходящих АНА8ингибирующих гербицидов) может быть осуществлена на протяжении нескольких поколений. Эффективность новых линий можно оценить, используя объективные критерии в сравнении с контрольными сортами. Линии, обладающие требуемыми сочетаниями свойств, либо скрещивают с другой линией, либо подвергают самоопылению, чтобы получить семена. Самоопыление относится к переносу пыльцы с одного цветка на тот же самый цветок или другой цветок на том же растении. Растения, которые были подвергнуты самоопылению и селекции в отношении типа в течение многих поколений, становятся гомозиготными почти по всем локусам и дают однородную популяцию гомозиготного потомства.
Любой способ селекции можно использовать в способах согласно настоящему изобретению. В одном примере резистентные к гербицидам растения согласно настоящему изобретению можно разводить, используя способ на основе гаплоидов. В таких способах родителей, имеющих генетическую базу для требуемого дополнения свойств, скрещивают, используя простое или сложное скрещивание. Скрещивание (или перекрестное опыление) относится к переносу пыльцы с одного растения на другое растение. Потомство от скрещивания выращивают и микроспоры (незрелые пыльцевые зерна) отделяют и фильтруют, используя методики, известные специалистам в данной области [(например, 8\\ап5оп. Е. В. е! а1., Е£йс1еи1 ίδοίαΐίοη о£ тюгокрогек апб 1йе ргобисйои о£ писгокроге-бепуеб етЬгуок ίη Вгаккюа парик, Ь. Р1ап! Се11 Керойк, 6: 94-97 (1987); и 8^апкоп, Е. В., Мюгокроге сиНиге ίη Вгаккюа, рр. 159-169 ίη МеОюбк ίη Мо1еси1аг Вю1о§у, уо1. 6, Р1ап! Се11 апб Нккие СиИиге, Нитапа Ргекк, (1990)]. В указанные микроспорах наблюдается расщепление генов. Микроспоры культивируют в присутствии подходящего АНА8ингибирующего гербицида, такого как имазетапир (например, РНКБШТТМ.) или имазамокс (например, КАРТОК.ТМ.) или смесь 50/50 имазетапира и имазамокса (например, ОНУ88Е¥.ТМ.), который убивает микроспоры, в которых отсутствуют мутации, ответственные за резистентность к гербициду.
Микроспоры, несущие гены, ответственные за резистентность к гербициду, выживают и дают зародыши, которые образуют гаплоидные растения. Затем их хромосомы удваивают, получая удвоенные гаплоиды.
Другие способы селекции также используют согласно настоящему изобретению. Например, отбор способом педигри можно использовать для улучшения в основном самоопыляющихся культур, таких как Вгаккюа и канола. Селекцию педигри начинают со скрещивания двух генотипов, каждый из которых может иметь одно или несколько требуемых свойств, которые отсутствуют в другом или которые дополняют другое свойство. Если два исходных родителя не обеспечивают всех требуемых свойств, то в план скрещиваний можно включать дополнительных родителей.
Таких родителей можно скрещивать в виде простого или сложного скрещивания, чтобы получить простые или сложные гибриды Р1. Популяцию Р2 получают из Р1 в результате самоопыления одного или нескольких растений Р1 или взаимного скрещивания двух растений Р1 (т.е. скрещивания между сибсами).
Отбор наилучших вариантов можно начинать в Р2-поколении, и начиная с Р3, отбирают лучшие семьи, и наилучших представителей в наилучших семьях. Повторное тестирование семей можно начинать в Р4-поколении, чтобы повысить эффективность селекции в отношении свойств с низкой наследуемостью. На поздней стадии инбридинга (т.е. Р6 и Р7) наилучшие линии или смеси фенотипически сходных линий можно тестировать в отношении возможного выпуска новых сортов. Однако способ селекции педигри более трудоемок, чем способ на основе гаплоидии, для создания улучшенных растений с резистентной к гербицидам АНА8, поскольку растения дают расщепление в течение нескольких поколений и выход требуемых свойств является относительно низким.
Способ отбора одного семени в потомстве (88Ό) также можно использовать для селекции улучшенных сортов. Способ 88Ό в строгом смысле относится к посадке сегрегирующей популяции, сбора образца в виде одного семени от растения и использование популяции из одиночных семян для посадки с целью получения следующего поколения. Когда популяция будет доведена от Р2 до требуемого уровня инбридинга, каждое из растений, из которых получены линии, можно будет проследить до разных особей Р2. Количество растений в популяции снижается в каждом поколении вследствие неспособности некоторых семян прорасти или неспособности некоторых растений дать по меньшей мере одно семя. В результате не все растения, образцы которых были исходно взяты в популяции Р2, будут представлены потомством, когда продвижение поколений будет завершено.
В случае способа, основанного на использовании нескольких семян, селекционеры канолы обычно
- 12 025843 собирают один или несколько стручков с каждого растения в популяции и молотят их вместе, получая общую массу. Часть общей массы используют для посадки следующего поколения, а часть откладывают в запас. Способ был назван модифицированным способом отбора одного семени в потомстве или способом отбора массы семян одного стручка в потомстве. Способ отбора нескольких семян использовали для того, чтобы уменьшить трудозатраты на сбор. Значительно быстрее обмолотить стручки машиной, чем извлекать одно семя из каждого стручка вручную в случае способом отбора одного семени в потомстве. Способ отбора нескольких семян также позволяет высаживать одинаковое количество семян в популяции каждого поколения при инбридинге. Собирают достаточное количество семян, чтобы компенсировать растения, которые не прорастают или не дают семян.
Возвратное скрещивание можно использовать для переноса гена или генов легко и в высокой степени наследуемого признака от исходного сорта или линии (родитель-донор) в другой требуемый культурный сорт или инбредную линию (рекуррентного родителя, т.е. родительскую форму, с которой гибрид скрещивается вновь). После начального скрещивания особи, имеющие фенотип родителя-донора, отбирают и повторно скрещивают (подвергают возвратному скрещиванию) с рекуррентным родителем. Ожидается, что после выполнения возвратного скрещивания полученное растение будет обладать признаками рекуррентного родителя и требуемым свойством, перенесенным от родителя-донора.
В результате повторяющегося отбора также могут быть созданы улучшенные сорта. Генетически разнообразную популяцию гетерозиготных особей либо идентифицируют, либо создают в результате взаимного скрещивания нескольких разных родителей. Наилучшие растения отбирают на основании их собственного превосходства, выдающегося потомства или превосходной способности к скрещиванию. Отобранные растения подвергают взаимному скрещиванию, получая новую популяцию, в которой продолжают последующие циклы селекции.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения растения Вга881са, обладающего резистентностью к ΑΗΑδ-гербицидам, включающему в себя: (а) скрещивание первой линии Вга881са со второй линией Вгаккюа, чтобы получить сегрегирующую популяцию, при этом первая линия Вга881са представлена резистентным к ΛΗΆδ-гербицидам растением Вга881са; (Ь) скрининг популяции в отношении повышенной резистентности к ΑΗΑδ-гербицидам; и (с) отбор одного или нескольких представителей популяции, имеющих повышенную резистентсноть ΑΗΑδ по сравнению с растением Вгаккюа дикого типа.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу интрогрессии признака резистентности к гербицидам, действующим на ΑΗΑδ, в растение Вгаккюа, включающему в себя: (а) скрещивание, по меньшей мере, первой линии Вгаккюа, резистентной к гербицидам, действующим на ΑΗΑδ, со второй линией Вга881са с получением сегрегирующей популяции; (Ь) скрининг популяции в отношении повышенной резистентности к гербицидам, действующим на ΑΗΑδ; и (с) отбор по меньшей мере одного представителя популяции, обладающего резистентностью к действующим на ΑΗΑδ гербицидам.
Альтернативно в другом аспекте изобретения и первое и второе родительские растения Вгаккюа могут быть резистентными к действующему на ΑΗΑδ гербициду растениями Вгаккюа, которые описаны в настоящей публикации. Таким образом, любое растение Вгаккюа, полученное с использованием растения Вга881са, обладающего повышенной резистентностью к действующему на ΑΗΑδ гербициду, которое описано в настоящей публикации, составляет часть изобретения. В используемом в настоящем описании смысле скрещивание может означать самоопыление, скрещивание сибсов, возвратное скрещивание, скрещивание с другой или той же самой родительской линией, скрещивание с популяциями и тому подобное.
Настоящее изобретение также относится к способам получения резистентного к гербицидам растения, в частности резистентного к гербицидам растения Вгаккюа, посредством обычной селекции растений, основанной на половом размножении. Способы включают в себя скрещивание первого растения, которое является резистентным к гербициду, со вторым растением, которое не является резистентным к гербициду. Первое растение может быть любым резистентным к гербицидам растением согласно настоящему изобретению, включая, например, трансгенные растения, содержащие по меньшей мере один из полинуклеотидов согласно настоящему изобретению, которые кодируют резистентную к гербицидам ΑΗΑδΤ, и нетрансгенные растения Вгаккюа, которые обладают свойствами резистентности к гербицидам растения Вгаккюа Ι05Ζ-07801, 104Е-0139. Ю4Е-0130 или Ю4Е-0122. Второе растение может быть любым растением, которое способно давать жизнеспособное потомство (т.е. семена) при скрещивании с первым растением. Обычно, но не обязательно, первое и второе растения относятся к одному и тому же виду. Способы согласно изобретению дополнительно могут включать в себя одно или несколько возвратных скрещиваний растений-потомков от первого скрещивания с растением такой же линии или генотипа, как и первое или второе растение. Альтернативно, потомство от первого скрещивания или любого последующего скрещивания может быть скрещено с третьим растением, которое является растением другой линии или другого генотипа, чем в случае первого или второго растения. Способы согласно изобретению дополнительно могут включать в себя отбор растений, которые обладают свойствами резистентности к гербицидам первого растения.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам повышения резистентности к гербици- 13 025843 дам растения, в частности, резистентного к гербицидам растения Вгакк1са, посредством обычной селекции растений, основанной на половом размножении. Способы включают в себя скрещивание первого растения, которое является резистентным к гербициду, со вторым растением, которое может являться или не являться резистентным к гербициду или может быть резистентным к другому гербициду или гербицидам, отличным от гербицида, к которому резистентно первое растение. Первое растение может представлять собой любое резистентное к гербицидам растение согласно настоящему изобретению, включая, например, трансгенные растения, содержащие по меньшей мере один из полинуклеотидов согласно настоящему изобретению, которые кодируют резистентную к гербициду ЛНЛБЬ, и нетрансгенные растения Вгаккюа, которые обладают свойствами резистентности к гербицидам растения Вгакк1са Ι05Ζ-07801, Ι04Ε-0139, Ι04Ε-0130 или Ι04Ε-0122. Вторым растением может быть любое растение, которое способно давать жизнеспособные растения-потомки (т.е. семена) при скрещивании с первым растением. Обычно, но не обязательно, первое и второе растения относятся к одному и тому же виду; а также первое и второе растения могут относится к разными, видам, но в пределах одного рода (пример: Вгаккюа .(ипсеа х Вгаккюа парик, Вгаккюа .(ипсеа х Вгаккюа гара, Вгаккюа .(ипсеа х Вгаккюа о1егасеа, Вгаккюа .(ипсеах Вгаккюа шдга и т.д.), а также первое и второе растения относятся к разным родам (пример: Вгаккюа х 8тар1к). Растения-потомки, полученные таким способом согласно настоящему изобретению, обладают повышенной резистентностью к гербициду по сравнению либо с первым, либо со вторым растением, либо с обоими растениями. В том случае, когда первое и второе растения резистентны к разным гербицидам, растения-потомки будут обладать комбинированными свойствами резистентности к гербицидам первого и второго растений. Способы согласно изобретению дополнительно могут включать в себя одно или несколько возвратных скрещиваний растений-потомков от первого скрещивания с растением такой же линии или генотипа, как и первое или второе растение. Альтернативно, потомство от первого скрещивания или любого последующего скрещивания может быть скрещено с третьим растением, которое является растением другой линии или другого генотипа, чем в случае первого или второго растения. Способы согласно изобретению дополнительно могут включать в себя отбор растений, которые обладают свойствами резистентности к гербицидам первого растения, второго растения или обоих растений.
Растения согласно настоящему изобретению могут быть трансгенными или нетрансгенными. Примером нетрансгенного растения Вгаккюа, обладающего повышенной резистентностью к имидазолиноновым и/или сульфонилмочевинным гербицидам является растение Вгаккюа Ι05Ζ-07801, 104Ε-0139, 104Е0130 или Ι04Ε-0122; или мутантное, рекомбинантное или генетически сконструированное производное растения Ι05Ζ-07801, 104Ε-0139, Д04Е-0130 или Ι04Ε-0122; или любое потомство растения 105Ζ-07801, Ι04Ε-0139, Д04Е-0130 или Ι04Ε-0122; или растение, которое является потомком любого из указанных растений; или растение, которое обладает свойствами резистентности к гербицидам растения 105Ζ07801, Ι04Ε-0139, Ι04Ε-0130 или Ι04Ε-0122.
Настоящее изобретение также относится к растениям, органам растения, растительным тканям, растительным клеткам, семенам и клеткам-хозяевам, отличным от клеток человека, которые трансформированы по меньшей мере одной молекулой полинуклеотида, кассетой экспрессии или вектором для трансформации согласно изобретению. Такие трансформированные растения, органы растений, растительные ткани, растительные клетки, семена и клетки-хозяева, отличные от клеток человека, обладают повышенной устойчивостью или резистентностью по меньшей мере к одному гербициду, при использовании уровней гербицида, которые убивают или ингибируют рост нетрансформированного растения, растительной ткани, растительной клетки или клетки-хозяина, отличной от клетки человека, соответственно. Предпочтительно трансформированные растения, растительные ткани, растительные клетки и семена согласно изобретению представляют собой растения Вгаккюа и сельскохозяйственные растения.
Настоящее изобретение также относится к семени растения Вгаккюа, способного давать растение Вгаккюа, обладающее резистентностью к ΑΗΑδ-гербициду, полученному из растений Вгаккюа, которые получены способами согласно настоящему изобретению.
В другом аспекте настоящее изобретение также относится к растению, выращенному из семени растения Вгаккюа, обладающего резистентностью к ΑΗΑδ-гербициду, полученному из растений Вгаккюа, выращенных для получения семян, обладающих свойством резистентности к гербицидам, а также частям растений и культурам тканей из таких растений.
Также в настоящем изобретении предлагаются емкости с семенами Вгаккюа, при этом семена способны производить резистентное к ΑΗΑδ-гербициду растение Вгаккюа. Емкость с семенами Вгаккюа может содержать любое количество, массу или объем семян. Например, емкость может содержать, по меньшей мере или больше чем примерно 10, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 или больше семян. Альтернативно емкость может содержать, по меньшей мере или больше чем примерно 1 унцию (28,3 г), 5 унций (141,5 г), 10 унций (283 г), 1 фунт (0,453 кг), 2 фунта (0,906 кг), 3 фунта (1,359 кг), 4 фунта (1,812 кг), 5 фунтов (22665 кг) или большую массу семян.
Емкости с семенами Вгаккюа могут представлять собой любую емкость, имеющуюся в данной области. В качестве не ограничивающего примера емкость может представлять собой коробку, мешок, пач- 14 025843 ку, пакет, ленточный рулон, ведро, крышку чашки Петри или пробирку.
В другом аспекте семена, находящиеся в емкостях с семенами Вга881са, могут представлять собой обработанные или необработанные семена. В одном аспекте семена могут быть обработаны для улучшения прорастания, например, с помощью проращивания семян, или посредством дезинфекции, чтобы защитить против имеющихся в семенах патогенов. В другом аспекте семена могут быть покрыты любым доступным покрытием, чтобы улучшить, например, посев, прорастание семян и защиту от патогенов, имеющихся на семенах. Покрытие семян может представлять собой любую форму покрытия для семян, включая без ограничения дражирование, пленочное покрытие и инкрустацию.
Настоящее изобретение также относится к способам повышения активности АНАЗ в растении, включающим в себя трансформацию растения полинуклеотидной конструкцией, содержащей промотор, оперативно связанный с нуклеотидной последовательностью АНАЗЫ согласно изобретению. Способы включают в себя введение полинуклеотидной конструкции согласно изобретению по меньшей мере в одну растительную клетку и регенерацию из нее трансформированного растения. Полинуклеотидная конструкция содержит по меньшей мере один нуклеотид, который кодирует резистентный к гербицидам белок АНАЗЬ согласно изобретению, в частности нуклеотидную последовательность, указанную в ЗЕО ГО N0:13, 14 или 15, нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотную последовательность, указанную в ЗЕО ГО N0:3, 4 или 5, и их фрагменты и варианты. Способы, кроме того, включают в себя использованием промотора, который способен управлять экспрессией генов в растительной клетке. Предпочтительно такой промотор является конститутивным промотором или тканеспецифичным промотором. Растение, полученное указанным способом, обладает повышенной активностью АНАЗ, в частности, устойчивой к гербицидам активностью АНАЗ, по сравнению с ^трансформированным растением. Таким образом, способы применимы для усиления или повышения резистентности растения по меньшей мере к одному гербициду, который препятствует проявлению каталитической активности фермента АНАЗ, в частности к имидазолиноновому гербициду.
Настоящее изобретение относится к способу получения резистентного к гербицидам растения, включающему в себя трансформацию растительной клетки полинуклеотидной конструкцией, содержащей нуклеотидную последовательность, оперативно связанную с промотором, который управляет экспрессией в растительной клетке, и регенерацию трансформированного растения из указанной трансформированной растительной клетки. Нуклеотидная последовательность выбрана из таких нуклеотидных последовательностей, которые кодируют резистентные к гербицидам белки АНАЗЬ согласно изобретению, в частности, нуклеотидных последовательностей, указанных в ЗЕО ГО N0:13, 14 или 15, нуклеотидных последовательностей, кодирующих аминокислотную последовательность, указанную в ЗЕО ГО N0:3, 4 или 5, и их фрагментов и вариантов. Резистентное к гербицидам растение, полученное таким способом, обладает повышенной резистентностью по сравнению с нетрансформированным растением по меньшей мере к одному гербициду, в частности к гербициду, который препятствует проявлению активности фермента АНАЗ, такому как, например, имидазолиноновый гербицид или сульфонилмочевинный гербицид.
Настоящее изобретение относится к кассетам экспрессии для экспрессии полинуклеотидных молекул согласно изобретению в растениях, растительных клетках и других клетках-хозяевах, отличных от клеток человека. Кассеты экспрессии содержат промотор, экспрессируемый в растении, растительной клетке или других представляющих интерес клетках-хозяевах, оперативно связанный с молекулой полинуклеотида согласно изобретению, которая кодирует резистентный к гербицидам белок АНАЗЬ. В случае необходимости целенаправленной экспрессии в хлоропласте кассета экспрессии также может содержать оперативно связанную направляющую в хлоропласт последовательность, которая кодирует транзитный пептид хлоропласта, чтобы направить экспрессированный белок АНАЗЬ в хлоропласт.
Кассеты экспрессии согласно изобретению применимы в способе повышения устойчивости к гербицидам растения или клетки-хозяина. Способ заключается в трансформации растения или клеткихозяина кассетой экспрессии согласно изобретению, при этом кассета экспрессии содержит промотор, экспрессируемый в представляющем интерес растения или клетке-хозяине, и промотор оперативно связан с полинуклеотидом согласно изобретению, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую резистентный к гербицидам белок АНАЗЫ согласно изобретению. Кроме того, способ включает в себя регенерацию трансформированного растения из трансформированной растительной клетки.
Использование в настоящем описании термина полинуклеотидные конструкции не означает ограничение настоящего изобретения полинуклеотидными конструкциями, содержащими ДНК. Специалистам в данной области будет понятно, что полинуклеотидные конструкции, в частности, полинуклеотиды и олигонуклеотиды, состоящие из рибонуклеотидов и сочетаний рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов также могут быть использованы в способах, раскрытых в настоящем описании. Таким образом, полинуклеотидные конструкции согласно настоящему изобретению охватывают все полинуклеотидные конструкции, которые могут быть использованы в способах согласно настоящему изобретению для трансформации растений, включая без ограничения полинуклеотидные конструкции, состоящие из дезоксирибонуклеотидов, рибонуклеотидов и их сочетаний. Такие дезоксирибонуклеотиды и рибонуклео- 15 025843 тиды включают как встречающиеся в природе молекулы, так и синтетические аналоги. Полинуклеотидные конструкции согласно изобретению также охватывают все формы полинуклеотидных конструкций, включая без ограничения однонитевые формы, двунитевые формы, шпильки, структуры типа «стебельпетля» и тому подобное. Кроме того, специалистам в данной области понятно, что каждая из нуклеотидных последовательностей, описанных в настоящей публикации, также охватывает комплемент такой описанной нуклеотидной последовательности.
Кроме того, понятно, что в способах согласно изобретению может быть использована полинуклеотидная конструкция, которая способна в трансформированном растении управлять экспрессией по меньшей мере одного белка или по меньшей мере одной РНК, такой как, например, антисмысловая РНК, которая комплементарна по меньшей мере части мРНК. Обычно такая полинуклеотидная конструкция состоит из последовательности, кодирующей белок или РНК, оперативно связанной с 5'- и 3'-областями регуляции транскрипции. Альтернативно также понятно, что в способах согласно изобретению можно использовать полинуклеотидную конструкцию, которая не способна управлять экспрессией белка или РНК в трансформированном растении.
Кроме того, понятно что для экспрессии полинуклеотидов согласно изобретению в представляющей интерес клетке-хозяине полинуклеотид обычно оперативно связан с промотором, который способен управлять экспрессией гена в представляющей интерес клетке-хозяине. Способы согласно изобретению для экспрессии полинуклеотидов в клетках-хозяевах не зависят от конкретного промотора. Способы охватывают применение любого промотора, который известен в данной области и который способен управлять экспрессией гена в представляющей интерес клетке-хозяине.
Настоящее изобретение охватывает молекулы полинуклеотидов ΑΗΑδΕ1 и их фрагменты и варианты. Молекулы полинуклеотидов, которые представляют собой фрагменты таких нуклеотидных последовательностей, также входят в объем настоящего изобретения. Фрагмент означает часть нуклеотидной последовательности, кодирующую белок ΑΗΑδΕ1 согласно изобретению. Фрагмент нуклеотидной последовательности ΑΗΑδΕ1 согласно изобретению может кодировать биологически активную часть белка ΑΗΑδΕ1 или может представлять собой фрагмент, который может быть использован в качестве зонда для гибридизации или праймера ПЦР с использованием описанных ниже способов. Биологически активная часть белка ΑΗΑδΕ1 может быть получена посредством выделения части одной из нуклеотидных последовательностей ΑΗΑδΕ1 согласно изобретению, экспрессии кодируемой части белка ΑΗΑδΕ1 (например, в результате экспрессии рекомбинантов ш νίΙΐΌ) и оценки активности кодируемой части белка ΑΗΑδΕΕ Молекулы полинуклеотидов, которые представляют собой фрагменты нуклеотидной последовательности ΑΗΑδΕ1, содержат по меньшей мере примерно 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 или 900 нуклеотидов, или вплоть до количества нуклеотидов, присутствующих в полноразмерной нуклеотидной последовательности, раскрытой в настоящем описании, в зависимости от предполагаемого применения.
Фрагмент нуклеотидной последовательности ΑΗΑδΕ1, которая кодирует биологически активную часть белка ΑΗΑδΕ1 согласно изобретению будет кодировать по меньшей мере примерно 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225 или 250 соседних аминокислот или вплоть до общего количества аминокислот, присутствующих в полноразмерном белке ΑΗΑδΕ1 согласно изобретению. Фрагменты нуклеотидной последовательности ΑΗΑδΕ1, которые применимы в качестве зондов гибридизации для ПЦРпраймеров обычно не должны кодировать биологически активную часть белка ΑΗΑδΕΕ
Молекулы полинуклеотидов, которые представляют собой варианты нуклеотидных последовательностей, описанных в настоящей публикации, также входят в объем настоящего изобретения. К «вариантам» нуклеотидных последовательностей ΑΗΑδΕ1 согласно изобретению относятся последовательности, которые кодируют белки ΑΗΑδΕ1, описанные в настоящей публикации, но которые имеют консервативные отличия вследствие вырожденности генетического кода. Такие встречающиеся в природе аллельные варианты могут быть идентифицированы с использованием хорошо известных способов молекулярной биологии, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и способы гибридизации, которые описаны ниже. Варианты нуклеотидных последовательностей также включают синтетически полученные нуклеотидные последовательности, которые были созданы, например, с использованием сайт-специфичного мутагенеза, но которые все еще кодируют белок ΑΗΑδΕ1, раскрытый в настоящем изобретении, как обсуждается ниже. Обычно варианты нуклеотидных последовательностей согласно изобретению будут, по меньшей мере, примерно на 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичны конкретной нуклеотидной последовательности, раскрытой в настоящем описании. Вариант нуклеотидной последовательности ΑΗΑδΕ1 будет кодировать белок ΑΗΑδΕ1, соответственно, который имеет аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности белка ΑΗΑδΕ1, раскрытого в настоящем описании.
Кроме того, специалисту будет понятно, что изменения могут быть введены в результате мутации в нуклеотидных последовательностях согласно изобретению, таким образом приводящих к изменениям в аминокислотной последовательности кодируемых белков ΑΗΑδΕ1 без изменения биологической активности белков ΑΗΑδΕΕ Таким образом, изолированная молекула полинуклеотида, кодирующего белок
- 16 025843
АНАБЫ, имеющий последовательность, которая отличается от последовательности, указанной в БЕО ГО N0:11, может быть создана введением одной или нескольких нуклеотидных замен, добавлений или делеций в соответствующую нуклеотидную последовательность, описанную в настоящей публикации, так что одна или несколько аминокислотных замен, добавлений или делеций вводится в кодируемый белок. Мутации могут быть введены стандартными способами, такими как сайт-специфичный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Такие варианты нуклеотидных последовательностей также входят в объем настоящего изобретения.
Например, предпочтительно консервативные аминокислотные замены могут быть осуществлены в одном или нескольких вычисленных несущественных аминокислотных остатках.
Несущественным аминокислотным остатком является остаток, который может быть изменен по сравнению с последовательностью дикого типа белка АНАБЬ1 (например, последовательностью БЕО ГО N0:1) без изменения биологической активности, тогда как существенный аминокислотный остаток необходим для биологической активности. Консервативная аминокислотная замена представляет собой замену, в случае которой аминокислотный остаток заменяют аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, определены в данной области. Такие семейства включают в себя аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Такие замены не могут быть осуществлены в случае консервативных аминокислотных остатков или в случае аминокислотных остатков, находящихся в консервативном мотиве.
Белки согласно изобретению могут быть изменены различными путями, включая аминокислотные замены, делеции, укорочения и инсерции. Способы таких обработок, в общем, известны в данной области. Например, варианты аминокислотных последовательностей белков АНАБЬ1 могут быть получены в результате мутаций в ДНК. Способы мутагенеза и изменений нуклеотидных последовательностей хорошо известны в данной области. Смотрите, например, Кипке1 (1985) Ргос. №·ιΐ1. АсаО. Бс1. ИБА 82: 488-492; Кипке1 е( а1. (1987) Ме1йоОк ίη Еп/уто1. 154: 367-382; патент США № 4873192; \Уа1кег и ОаакКа, еОк. (1983) ТесНпкщек ίη Мо1еси1аг Вю1оду (МасМШап РиЪНкЫпд Сотрапу, №ν Уогк) и приведенные в указанных публикациях ссылки. Инструкции по поводу соответствующих аминокислотных замен, которые не влияют на биологическую активность представляющего интерес белка, можно найти в описании модели ОауНоГГ е! а1. (1978) АИак оГ Рго1еш Бесщепсе апО Б1гпс1пге (№л1. ВютеО. Кек. РоипО., ХУаШтдЮп, Ό.Ο), включенном в настоящее описание в виде ссылки. Предпочтительными могут быть консервативные замены, такие как замена одной аминокислоты другой аминокислотой, имеющей сходные свойства.
Альтернативно варианты нуклеотидных последовательностей АНАБЫ могут быть получены в результате случайного введения мутаций на протяжении всей или части кодирующей последовательности АНАБЫ, например с помощью насыщающего мутагенеза, и полученные мутанты могут быть подвергнуты скринингу в отношении активности АНАБ, чтобы идентифицировать мутанты, которые сохраняют активность АНАБ, включая резистентную к гербицидам активность АНАБ. После мутагенеза кодируемый белок может быть экспрессирован рекомбинантно, и активность белка может быть определена стандартными способами анализа.
Таким образом, нуклеотидные последовательности согласно изобретению включают последовательности, раскрытые в настоящем описании, а также их фрагменты и варианты. Нуклеотидные последовательности АНАБЫ согласно изобретению и их фрагменты и варианты могут быть использованы в качестве зондов и/или праймеров для идентификации и/или клонирования гомологов АНАБЬ в других растениях. Такие зонды могут быть использованы для выявления транскриптов или геномных последовательностей, кодирующих одинаковые или идентичные белки.
Таким образом, способы, таки как ПЦР, гибридизация и тому подобные, могут быть использованы для идентификации таких последовательностей, имеющих значительную идентичность с последовательностями согласно изобретению. Смотрите, например, БатЪгоок е( а1. (1989) Мо1еси1аг С1опШ§: ЬаЪогаФгу Мапиа1 (2О еО., Со1О Брппд НагЪог ЬаЪогаШгу Ргекк, Р1ат\ае\у, NΥ) и 1птк, е! а1. (1990) РСК РгоЮсоЬ: А СшОе !о МеШоОк апО Аррйсайопк (АсаОепис Ргекк, NΥ). Нуклеотидные последовательности АНАБЬ, выделенные на основе идентичности их последовательности с нуклеотидными последовательностями АНАБЬ1, указанными в настоящем описании, или их фрагменты и варианты входят в объем настоящего изобретения.
В способе гибридизации вся или часть известной нуклеотидной последовательности АНАБЬ1 может быть использована для скрининга кДНК или геномных библиотек. Способы конструирования такой кДНК и геномных библиотек, в общем, известны в данной области и описаны в БатЪгоок е( а1. (1989) Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЪогаШгу Мапиа1 (2О еО., Со1О Брппд НагЪог ЬаЪогаШгу Ргекк, Р1ашу1е№, NΥ). Так называемые зонды гибридизации могут представлять собой фрагменты геномной ДНК, фрагменты
- 17 025843 кДНК, фрагменты РНК или другие олигонуклеотиды, и их можно метить регистрируемой группой, такой как 32Р или любым другим регистрируемым маркером, таким как другие радиоизотопы, флуоресцирующее соединение, фермент или кофактор фермента. Зонды для гибридизации могут быть получены мечением синтетических олигонуклеотидов, основанных на известной нуклеотидной последовательностью АНАЗЫ, описанной в настоящей публикации. Кроме того, могут быть использованы вырожденные праймеры, сконструированные на основе консервативных нуклеотидов или аминокислотных остатков в известной нуклеотидной последовательности ДИАЗЫ. Зонд обычно содержит область нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в жестких условиях, по меньшей мере, примерно с 12, предпочтительно примерно с 25, более предпочтительно примерно с 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800 или 900 следующих друг за другом нуклеотидов нуклеотидной последовательности АНАЗЫ согласно изобретению или ее фрагмента или варианта. Получение зондов для гибридизации в общем известно в данной области и описано в публикации ЗатЬгоок е1 а1. (1989) Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1 (2й ей., Со1й Зрппд НагЬог ЬаЬогаЮгу Ргекк, Ркип\'1е\у„ №ν Уогк), включенной в настоящее описание в виде ссылки.
Например, полная последовательность АНАЗЫ, описанная в настоящей публикации, или одна или несколько из ее частей могут быть использованы в качестве зонда, способного специфично гибридизоваться с соответствующими последовательностями АНАЗЫ и матричными РНК. Способы гибридизации включают основанный на гибридизации скрининг посеянных на чашках библиотек ДНК (либо бляшек, либо колоний; смотрите, например, ЗатЬгоок е1 а1. (1989) Мо1еси1аг С1отид: А ЬаЬогаФгу Мапиа1 (2й ей., Со1й Зрппд НагЬог ЬаЬогаЮгу Ргекк, Р1ашу1е№, №ν Уогк).
Гибридизацию таких последовательностей можно осуществлять в жестких условиях. Под жесткими условиями или жесткими условиями гибридизации подразумевают условия, в которых зонд будет гибридизоваться с совей последовательностью-мишенью в регистрируемо более высокой степени, чем с другими последовательностями (например, по меньшей мере в 2 раза выше фона). Условия жесткости зависят от последовательности и будут отличаться в разных случаях.
Обычно жесткие условия могут представлять собой условия, при которых концентрация соли меньше, чем примерно 1,5 М иона N3, обычно концентрация соли составляет примерно от 0,01 до 1,0 М ионов №-1 (или других солей) при рН от 7,0 до 8,3, и температура составляет по меньшей мере примерно 30°С в случае коротких зондов (например, от 10 до 50 нуклеотидов) и по меньшей мере примерно 60°С в случае длинных зондов (например, больше 50 нуклеотидов). Жестких условий также можно достичь с помощью добавления дестабилизирующих средств, таких как формамид. Примеры условий низкой жесткости включают гибридизацию с использованием буферного раствора, содержащего от 30 до 35% формамида, 1 М №С1, 1% ЗЭЗ (додецилсульфат натрия), при 37°С и промывку в 1х-2х дЗС (20х ЗЗС=3,0 М №С1/0,3 М цитрат тринатрия) при 50-55°С. Примеры условий умеренной жесткости включают гибридизацию в 40-45% формамиде, 1,0 М №С1, 1% ЗЭЗ при 37°С и промывку в 0,5х-1х ЗЗС при 55-60°. Примеры условий высокой жесткости включают гибридизацию в 50% формамиде, 1 М №С1, 1% ЗЭЗ при 37°С и промывку в 0,1 х ЗЗС при 60-65°С. Необязательно буферы для промывки содержат примерно от 0,1% до примерно 1% ЗЭЗ. Продолжительность гибридизации обычно составляет менее чем примерно 2 4 часа, обычно примерно от 4 до примерно 12 ч.
Специфичность обычно зависит от промывок после гибридизации, при этом решающими факторами являются ионная сила и температура конечного раствора для промывки. В случае гибридов ДНК-ДНК Тт может быть аппроксимирована из уравнения Меткой! и \Уак1 (1984) Апа1. Вюскет. 138: 267-284: Тт=81,5°С+16,6 (1од М)+0,41 (%ОС)-0,61 (% £огт)-500/Ь; где М означает молярность одновалентных катионов, %ОС означает процентное содержание гуанозиновых и цитозиновых нуклеотидов в ДНК, % £огт означает процентное содержание формамида в растворе для гибридизации, и Ь означает длину гибрида в парах нуклеотидов. Тт означает температуру (при определенной ионной силе и рН), при которой 50% комплементарной последовательности-мишени гибридизуется с идеально совпадающим зондом. Тт снижают примерно на 1°С для каждого 1% ошибочных спариваний; таким образом, Тт, условия гибридизации и/или промывки можно корректировать для последовательностей, имеющих требуемую идентичность. Например, если необходимо найти последовательности с >90% идентичностью, то Тт может быть снижена на 10°С. Обычно условия жесткости выбирают так, чтобы температура была на 5°С ниже, чем температура точки плавления (Тт) для конкретной последовательности и ее комплемента при определенной ионной силе и рН. Однако при очень жестких условиях можно использовать гибридизацию и/или промывку при температуре на 1, 2, 3 или 4°С ниже, чем температура точки плавления (Тт); в случае умеренно жестких условиях можно использовать гибридизацию и/или промывку при температуре на 6, 7, 8, 9 или 10°С ниже, чем температура точки плавления (Тт); в случае условий низкой жесткости можно использовать гибридизацию и/или промывку при температуре на 11, 12, 13, 14, 15 или 20°С ниже, чем температура точки плавления (Тт). При использовании уравнения, составов для гибридизации и промывки и требуемой Тт специалистам в данной области будет понятно, что варианты жесткости растворов для гибридизации и/или промывки по сути описаны. Если требуемая степень ошибочного спаривания приводит к Тт менее чем 45°С (водный раствор) или 32°С (раствор формамида), то предпочти- 18 025843 тельно увеличить концентрацию 88С так, чтобы можно было использовать более высокую температуру.
Всестороннее руководство по гибридизации нуклеиновых кислот приведено в публикации Туккеп (1993) ЬаЬога!огу ТесНпкщек ш ВюсНепийгу и Мо1еси1аг В1о1оду - НуЬпШ/айоп νίΐΐι ШсЮс Аай РгоЬек, Рай I, СНар1ег 2 (Е1кеу1ег, №ν Уогк); и АикиЬе1 е! а1., ейк. (1995) Сштей Рго!осо1к т Мо1еси1аг Вю1оду, СНар1ег 2 (Огеепе РиЬНкБтд апй ХУПеу-Биегкаепсе, №ν Уогк). Смотрите 8атЬгоок е! а1. (1989) Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1 (2й ей., Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, Р1ату1е№, №ν Уогк).
Понятно, что молекулы полинуклеотидов и белки согласно изобретению охватывают молекулы полинуклеотидов и белки, содержащие нуклеотидную или аминокислотную последовательность, которая в достаточной степени идентична нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО N0:13, 14 и/или 15 или аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0:3, 4 и/или 5. Термин в значительной степени идентичный используют в настоящем описании по отношению к первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности, которая содержит, достаточное или минимальное количество идентичных или эквивалентных (например, со сходной боковой цепью) аминокислотных остатков или нуклеотидов по сравнению со второй аминокислотной или нуклеотидной последовательностью, так что первая и вторая аминокислотные или нуклеотидные последовательности имеют общий структурный домен и/или обладают общей функциональной активностью. Например, аминокислотные или нуклеотидные последовательности, которые содержат общий структурный домен, имеющие, по меньшей мере примерно 45, 55 или 65% идентичность, предпочтительно 75% идентичность, более предпочтительно 85, 95 или 98% идентичность, определяют в настоящем описании как идентичные в достаточной степени.
Чтобы определить идентичность в процентах двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеиновых кислот, последовательности выравнивают в целях оптимального сравнения. Идентичность в процентах между двумя последовательностями является функцией количества идентичных положений, имеющихся в последовательностях (т.е. идентичность в процентах равно количество идентичных положений/общее количество положений (например, перекрывающихся положений) х 100). В одном варианте две последовательности имеют одинаковую длину. Идентичность в процентах между двумя последовательностями может быть определена с помощью способов, подобных способам, описанным ниже, с учетом или без учета пробелов. При расчете идентичности в процентах обычно подсчитывают точные совпадения.
Определение идентичности в процентах между двумя последовательностями можно осуществить, используя математический алгоритм. Предпочтительным не ограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения двух последовательностей, является алгоритм, описанный в КагНи и А11кс1ш1 (1990) Ргос. ИаИ. Асай. 8сг И8А 87: 2264, модифицированный как описано в Каг1ш и А11кс1ш1 (1993) Ргос. Асай. 8сг И8А 90: 5873-5877. Такой алгоритм включен в программы УВЕА8Т и ХВЬА8Т АИксБи1 е! а1. (1990) 1. Мо1. Вю1. 215: 403. Поиски нуклеотидов ВЬА8Т могут быть осуществлены с использованием программы УВк-А8Т, счет равен 100, длина слова равна 12, чтобы получить нуклеотидные последовательности, гомологичные молекулам полинуклеотидов согласно изобретению. Поиски белков ВЬА8Т могут быть осуществлены с использованием программы ХВЬА8Т, счет равен 50, длина слова равна 3, чтобы получить аминокислотные последовательности, гомологичные молекулам белков согласно изобретению. Чтобы получить выравнивания с пробелами в целях сравнения, можно использовать Оаррей ВЬА8Т, который описан в А11кс1ш1 е! а1. (1997) №.1с1ею Ас1йк Кек. 25: 3389. Альтернативно можно использовать Р81-В1ак!, чтобы осуществить итерационный поиск, который позволяет выявлять отдаленные взаимосвязи между молекулами. Смотрите А11кс1ш1 е! а1. (1997) выше. В случае применения программ ВЬА8Т, Оаррей ВЬА8Т и Р81-В1ак! можно использовать параметры по умолчанию соответствующих программ (например, ХВЬА8Т и ИВЬА8Т). Другим предпочтительным не ограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения последовательностей, является алгоритм, описанный в Муегк и Мй1ег (1988) САВ108 4: 11-17. Такой алгоритм включен в программу ЛЬЮИ (версия 2.0), которая является частью пакета компьютерных программ для выравнивания последовательностей ОСО. В случае применения программы АЫОЫ для сравнения аминокислотных последовательностей можно использовать матрицу весов остатков РАМ120, штраф за длину пробела 12 и штраф за пробел 4. Выравнивание также можно осуществлять вручную с помощью просмотра.
Если не указано иное, значения идентичности/сходства последовательностей, приведенные в настоящем описании, относятся к значению, полученному с использованием полноразмерных последовательностей согласно изобретению и с использованием множественного выравнивания с помощью алгоритма С1ик!а1 (ШОею Аай КекеагсБ, 22(22): 4673-4680, 1994), используя программу АЕдпХ, входящую в пакет компьютерных программ УесЮг N41, версия 9 ОпуПгодеп, Саг1кЬай, СА, И8А) с параметрами по умолчанию; или любую эквивалентную программу. Под эквивалентной программой подразумевают любую программу для сравнения последовательностей, которая в случае любых двух рассматриваемых последовательностей осуществляет выравнивание, дающее идентичные совпадения нуклеотидов или аминокислотных остатков и одинаковую идентичность последовательностей в процентах в сравнении с соответствующим выравниванием, осуществляемым с помощью АНдпХ, входящей в пакет компьютерных программ Уес!ог N71, версия 9.
Нуклеотидные последовательности АНА8Ь1 согласно изобретению включают как встречающиеся в
- 19 025843 природе последовательности, так и мутантные формы, в частности, мутантные формы, которые кодируют белки АНА8Ь1, обладающие резистентной к гербицидам АНАЗ-активностью. Подобным образом белки согласно изобретению охватывают как встречающиеся в природе белки, так и их варианты и модифицированные формы. Такие варианты продолжают обладать требуемой АНАЗ-активностью. Очевидно что мутации, которые могут быть осуществлены в ДНК, кодирующей вариант, не должны выводить последовательность из рамки считывания и предпочтительно не будут создавать комплементарные области, которые могут вызывать образование вторичной структуры мРНК. Смотрите заявку на выдачу патента ЕР № 75444.
Предполагается, что делеции, инсерции и замены последовательностей белков, входящих в настоящее изобретение, не вызывают коренных изменений свойств белка. Однако в том случае, когда трудно предсказать точный эффект замены, делеции или инсерции до их осуществления, специалисту в данной области будет понятно, что эффект можно оценить в обычных скрининговых анализах. То есть активность можно оценить с помощью анализов активности АНАЗ. Смотрите, например, публикацию ЗшдЕ е( а1. (1988) Апа1. ВюсНет. 171: 173-179, включенную в настоящее описание в виде ссылки.
Варианты нуклеотидной последовательности и белки также охватывают последовательности и белки, полученные с помощью способов мутагенеза и рекомбинации, таких как перетасовка ДНК. В случае такого способа одну или несколько разных кодирующих последовательностей АНАЗЬ можно подвергнуть обработки, чтобы создать новый белок АНА§Ь, обладающий требуемыми свойствами. Таким образом создают библиотеки рекомбинантных полинуклеотидов из популяции родственных полинуклеотидных последовательностей, содержащих области последовательности, которые обладают существенной идентичностью и могут быть подвергнуты гомологичной рекомбинации ш νίΐΓΟ или ш νίνο. Например, с использованием указанного способа мотивы последовательности, кодирующие представляющий интерес домен, могут быть перетасованы между геном ЛНА8Ь1 согласно изобретению и другими известными генами АНАЗЕ, чтобы получить новый ген, кодирующий белок с улучшенным представляющим интерес свойством, таким как повышенный Кт в случае фермента. Методики такой перетасовки ДНК известны в данной области. Смотрите, например, ЗЮттег (1994) Ргос. Ыаб. Асаб. Зск ИЗА 91: 10747-10751; З!еттег (1994) ЫаШге 370: 389-391; Сгатеп е! а1. (1997) ЫаШге Вю!есЬ. 15: 436-438; Мооге е! а1. (1997) 1. Мо1. Вю1. 272: 336-347; Ζΐκπίβ е! а1. (1997) Ргос. Ыаб. Асаб. Зсг ИЗА 94: 4504-4509; Сгатеп е! а1. (1998) ЫаШге 391: 288-291 и патенты США № 5605793 и 5837458.
Нуклеотидные последовательности согласно изобретению могут быть использованы для выделения соответствующих последовательностей из других организмов, в частности, из других растений, более конкретно других двудольных растений. Таким образом, способы, такие как ПЦР, гибридизация и тому подобные, могут быть использованы для идентификации таких последовательностей на основе гомологии их последовательностей с последовательностями, указанными в настоящем описании. Последовательности, выделенные на основе идентичности их последовательностей с полными последовательностями АНАЗЫ, указанными в настоящем описании, или с их фрагментами, входят в объем настоящего изобретения. Таким образом, изолированные последовательности, которые кодируют белок АНАЗЬ и которые гибридизуются в жестких условиях с последовательностью, описанной в настоящей публикации, или с ее фрагментами, входят в объем настоящего изобретения.
В случае применения способа ПЦР могут быть сконструированы олигонуклеотидные праймеры для использования в реакциях ПЦР, чтобы амплифицировать соответствующие последовательности ДНК из кДНК или геномной ДНК, экстрагированной из любого представляющего интерес растения. Способы конструирования праймеров для ПЦР и ПЦР-клонирования, в общем, известны в данной области и описаны в ЗатЬгоок е( а1. (1989) Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1 (2б еб., Со1б Зрппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, Р1а1пу1е^, №\ν Уогк). Зее а1ко 1птк е! а1., ебк. (1990) РСК РгоЮсо1к: А Ошбе !о Мебюбк апб АррНсабопк (Асабетю Ргекк, №\ν Уогк); 1птк и Се1£апб, ебк. (1995) РСК ЗЕаЮщек (Асабетю Ргекк, №\ν Уогк); и 1итк и Ое1£апб, ебк. (1999) РСК Мебюбк Мапиа1 (Асабетю Ргекк, №\ν Уогк). Известные способы ПЦР включают без ограничения способы с использованием спаренных праймеров, вложенных праймеров, отдельных специфичных праймеров, вырожденных праймеров, специфичных для гена праймеров, специфичных для вектора праймеров, частично ошибочно спариваемых праймеров и тому подобных.
Полинуклеотидные последовательности АНАЗЫ согласно изобретению предлагаются в кассетах экспрессии для экспрессии в представляющем интерес растении. Кассета будет содержать 5'- и 3'регуляторные последовательности, оперативно связанные с полинуклеотидной последовательностью АНАЗЫ согласно изобретению. Под оперативно связанной подразумевается функциональная связь между промотором и второй последовательностью, при этом промоторная последовательность инициирует и опосредует транскрипцию последовательности ДНК, соответствующей второй последовательности. Обычно оперативно связанная означает, что связанные последовательности нуклеиновой кислоты являются соседними и, в случае необходимости связать две кодирующие белки области, являются соседними и находящимися в одной и той же рамке считывания. Кассета дополнительно может содержать по меньшей мере один дополнительный ген, который необходим для котрансформации организма. Альтернативно дополнительный ген (гены) может находится в кассетах для множественной экспрессии.
Такая кассета экспрессии снабжена множеством сайтов рестрикции для инсерции полинуклеотид- 20 025843 ной последовательности АНА8Ь1 под транскрипционным контролем регуляторных областей. Кассета экспрессии дополнительно может содержать гены селектируемых маркеров.
Кассета экспрессии может содержать в 5'-3'-направлении транскрипции область инициации транскрипции и трансляции (т.е. промотор), полинуклеотидную последовательность АНА8Ь1 согласно изобретению и область терминации транскрипции и трансляции (т.е. область терминации), функционирующие в растениях. Промотор может быть нативным или аналогичным или чужеродным или гетерологичным по отношению к растению-хозяину и/или полинуклеотидной последовательности АНА8Ь1 согласно изобретению. Кроме того, промотор может представлять собой природную последовательность или альтернативно синтетическую последовательность. В том случае, когда промотор является чужеродным или гетерологичным по отношению к растению-хозяину, подразумевается, что промотор не встречается в нативном растении, в которое вводят промотор. В то случае, когда промотор является чужеродным или гетерологичным по отношению к полинуклеотидной последовательности АНА8Ь1 согласно изобретению, подразумевается, что промотор не является нативным или встречающимся в природе промотором для оперативно связанной полинуклеотидной последовательности АНА8Ь1 согласно изобретению. В используемом в настоящем описании смысле химерный ген содержит кодирующую последовательность оперативно, связанную с областью инициации транскрипции, которая является гетерологичной по отношению к кодирующей последовательности.
Хотя предпочтительно можно экспрессировать полинуклеотиды АНА8Ь1 согласно изобретению с использованием гетерологичных промоторов, можно использовать нативные промоторные последовательности. Такие конструкции могут изменять уровни экспрессии белка АНА8Ь1 в растении или растительной клетке. Таким образом, изменяется фенотип растения или растительной клетки.
Область терминации может быть нативной по отношению к области инициации транскрипции, может быть нативной по отношению к оперативно связанной представляющей интерес последовательности АНА8Ь1, может быть нативной по отношению к растению-хозяину или может быть получена из другого источника (т.е. быть чужеродной или гетерологичной по отношению к промотору, представляющей интерес полинуклеотидной последовательности АНА8Ь1, растению-хозяину или любому их сочетанию). Подходящие области терминации доступны из Τί-плазмиды А. ШтеГаиепк, такие как области терминации октопинситазы и нопалинсинтазы. Смотрите также Оиегшеаи е1 а1. (1991) Мо1. Оеп. Оепек 262: 141144; РгоибГоо! (1991) Се11 64: 671-674; 8апГасоп е1 а1. (1991) Оепек 1)е\. 5: 141-149; Модеп е1 а1. (1990) Р1аШ Се11 2: 1261-1272; Мипгое е1 а1. (1990) Оепе 91: 151-158; Ва11ак е1 а1. (1989) №с1ек Άοΐάδ Кек. 17: 7891-7903; и .ТокЫ е1 а1. (1987) №с1ек АшбКек. 15: 9627-9639.
В подходящих случаях ген (гены) могут быть оптимизированы для повышенной экспрессии в трансформированном растении. То есть гены могут быть синтезированы с использованием предпочтительных для растения кодонов для повышенной экспрессия. Смотрите, например, публикацию СатрЬе11 и Со\уп (1990) Р1ап1 Рйукю1. 92: 1-11, в которой обсуждается предпочтительное для хозяина использованием кодонов. В данной области имеются способы синтеза предпочтительных для растения генов. Смотрите, например, патенты США № 5380831 и 5436391 и Миггау е1 а1. (1989) ШсЫс Аабк Кек. 17: 477-498, включенные в настоящее описание в виде ссылки.
Известно, что дополнительные модификации последовательности усиливают экспрессию генов в клетке-хозяине. Такие модификации включают исключение последовательностей, кодирующих ложные сигналы полиаденилирования, сигналов сайтов экзон-интронного сплайсинга, подобных транспозонам повторов и других хорошо охарактеризованных последовательностей, которые вредить экспрессии генов. Содержание О-С в последовательности можно корректировать до средних уровней для данной клетки-хозяина, которые рассчитывают на основании известных генов, экспрессируемых в клетке-хозяине. Когда это возможно, последовательность модифицируют так, чтобы избежать образования предполагаемых вторичных структур мРНК в виде шпилек.
Нуклеотидные последовательности для усиления экспрессии генов также могут быть использованы в экспрессирующих векторах растений. К таким последовательностям относятся интроны гена Абй1 ш1гоп1 кукурузы (СаШк е1 а1. Оепек апб Эеуе1ортеп1 1: 1183-1200, 1987) и лидерные последовательности (^-последовательность) из вируса мозаики табака (ТМУ), вируса хлоротической пятнистости кукурузы и вируса мозаики люцерны (ОаШе е1 а1. №.1с1ею Ааб Кек. 15: 8693-8711, 1987 и 8кп/екк| е1 а1. Растение Мо1. Вю1. 15: 65-79, 1990). Показано, что первый интрон из локуса ккгппкеШ-1 кукурузы увеличивает экспрессию генов в химерных генных конструкциях. В патентах США № 5424412 и 5593874 раскрыто применение специфичных интронов в экспрессирующих генных конструкциях, и в ОаШе е1 а1. (Р1ап1 РЬукю1. 106: 929-939, 1994) также показано, что интроны применимы для регуляции экспрессии генов на тканеспецифичной основе. Чтобы дополнительно усилить или оптимизировать экспрессию гена малой субъединицы АНА8, экспрессирующие векторы растений согласно изобретению также могут содержать последовательности ДНК, содержащие области прикрепления к матриксу (МАК). Растительные клетки, трансформированные такими модифицированными системами экспрессии, затем могут осуществлять сверхэкспрессию или конститутивную экспрессию нуклеотидной последовательности согласно изобретению.
Кассеты экспрессии дополнительно могут содержать 5'-лидерные последовательности в конструк- 21 025843 ции кассеты экспрессии. Такие лидерные последовательности могут действовать, усиливая трансляцию. Лидеры трансляции известны в данной области и включают: лидеры пикорнавирусов, например, лидер ЕМСУ (5'-некодирующая область энцефаломиокардита) (Е1гоу-81е1п е! а1. (1989) Ргос. Νη!ί. Асаб. 8а. И8А 86: 6126-6130); лидеры потивирусов, например, лидер ТЕУ (вируса гравировки табака) (ОаШе е! а1. (1995) Оепе 165(2): 233-238), лидер МЭМУ (вируса карликовой мозаики кукурузы) (У1го1оду 154: 9-20) и белок, связывающий тяжелую цепь иммуноглобулина человека (В1Р) (Масе]ак е! а1. (1991) №йиге 353: 9094); нетранслируемый лидер из мРНК белка оболочки вируса мозаики люцерны (АМУ КNА 4) (ЛоЬНпд е! а1. (1987) №-Ииге 325: 622-625); лидер вируса мозаики табака (ТМУ) (ОаШе е! а1. (1989) в Мо1еси1аг Вю1оду о£ КNА, еб. СесЬ (Ыкк, Νον Уогк), рр. 237-256); и лидер вируса хлоротической пятнистости кукурузы (МСМУ) (Ьотте1 е! а1. (1991) У1го1оду 81: 382-385). Также смотрите Оеба-Сюрра е! а1. (1987) Р1ап! РЬук1о1. 84: 965-968. Также можно использовать другие способы, которые как известно усиливают трансляцию, например, с использованием интронов и тому подобного.
При получении кассеты экспрессии можно подвергать обработке различные фрагменты ДНК так, чтобы получить последовательности ДНК в правильной ориентации и, в соответствующем случае, в правильной рамке считывания. Для этой цели можно использовать адаптеры и линкеры, чтобы связать фрагменты ДНК, или можно использовать другие манипуляции, чтобы ввести подходящие сайты рестрикции, удалить избыточную ДНК, удалить сайты рестрикции или тому подобное. Для указанной цели можно использовать мутагенез ίη уйго, репарацию с праймерами, рестрикцию, отжиг, повторные замены, например, транзиции и трансверсии.
Ряд промоторов можно использовать при практическом осуществлении изобретения. Промоторы могут быть выбраны на основе требуемого результата. Нуклеиновые кислоты можно сочетать с конститутивными, предпочтительными для определенной ткани или другими промоторами для экспрессия в растениях.
Такие конститутивные промоторы включают, например, коровый промотор промотора Ккуп7 и другие конститутивные промоторы, описанные в \УО 99/43838 и патенте США № 6072050; коровый промотор СаМУ 358 (Обе11 е! а1. (1985) №Циге 313: 810-812); промотор актина риса (МсЕ1гоу е! а1. (1990) Р1ап! Се11 2: 163-171); убиквитина (СЬг1к!епкеп е! а1. (1989) Р1ап! Мо1. Вю1. 12: 619-632 и СЬг1к!епкеп е! а1. (1992) Р1ап! Мо1. Вю1. 18: 675-689); рЕМИ (Ьак! е! а1. (1991) ТЬеог. Арр1. Оепе!. 81: 581-588); МА8 (Уе1!еп е! а1. (1984) ЕМВО 1. 3: 2723-2730); промотор АЬ8 (патент США № 5659026) и тому подобные. Другие конститутивные промоторы включают, например, промоторы, описанные в патентах США № 5608149, 5608144,5604121, 5569597, 5466785,5399680, 5268463, 5608142 и 6177611.
Предпочтительные для ткани промоторы могут быть использованы для обеспечения целенаправленной усиленной экспрессии АНА8Ь1 в конкретной растительной ткани. Такие предпочтительные для ткани промоторы включают без ограничения предпочтительные для листьев промоторы, предпочтительные для корней промоторы, предпочтительные для семян промоторы и предпочтительные для стебля промоторы. Предпочтительные для ткани промоторы описаны в Уатато!о е! а1. (1997) Р1ап! ί. 12(2):255265; Ка\\ата!а е! а1. (1997) Р1ап! Се11 РЬукю1. 38 (7):792-803; Напкеп е! а1. (1997) Мо1. Оеп Оепе!. 254(3):337-343; Кикке11 е! а1. (1997) Тгапкдетс Кек. 6 (2):157-168; КтеЬай е! а1. (1996) Р1ап! РЬукю1. 112 (3) :1331-1341; Уап Сатр е! а1. (1996) Р1ап! РЬукю1. 112 (2):525-535; Сапеуакат е! а1. (1996) Р1ап! РЬукю1. 112 (2):513-524; Уатато!о е! а1. (1994) Р1ап! Се11 РЬузю1. 35(5):773-778; Ьат (1994) Кеки1!к РгоЬ1. Се11 ΌίΓία. 20:181-196; Ого/со е! а1. (1993) Р1ап! Мо I Вю1. 23 (6): 1129-1138; Ма!киока е! а1. (1993) Ргос №И. Асаб. 8а. И8А 90(20):9586-9590; и Оиеуага-Оагаа е! а1. (1993) Р1ап! 1. 4 (3) :495-505. Такие промоторы при необходимости могут быть модифицированы в отношении слабой экспрессии.
В одном варианте представляющие интерес нуклеиновые кислоты направляют в мишень - хлоропласт, для экспрессии. Таким образом, когда представляющая интерес нуклеиновая кислота непосредственно не встроена в хлоропласт, кассета экспрессии будет дополнительно содержать направляющую в хлоропласт последовательность, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует транзитный пептид хлоропласта, для того, чтобы направить продукт представляющего интерес гена в хлоропласты. Такие транзитные пептиды известны в данной области. Что касается направляющих в хлоропласт последовательностей, то оперативно связанная означает, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая транзитный пептид (т.е. направляющая в хлоропласт последовательность), связана с полинуклеотидом АНА8Ь согласно изобретению так, что две последовательности непосредственно следуют друг за другом и находятся в одной и той же рамке считывания. Смотрите, например, Уоп Не1_)пе е! а1. (1991) Р1ап! Мо1. Вю1. Кер. 9: 104-126; С1агк е! а1. (1989) 1. Вю1. СЬет. 264: 17544-17550; Пе11аСюрра е! а1. (1987) Р1ап! РЬукю1. 84: 965-968; Котег е! а1. (1993) ВюсЬет. ВюрЬук. Кек. Соттип. 196: 1414-1421; и 8ЬаЬ е! а1. (1986) 8аепсе 233: 478-481. Хотя белки АНА8Ь1 согласно изобретению включают в себя нативный транзитный пептид хлоропласта, любой транзитный пептид хлоропласта, известный в данной области, может быть слит с аминокислотной последовательностью зрелого белка АНА8Ь1 согласно изобретению посредством оперативного связывания направляющей в хлоропласт последовательности с 5'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей зрелый белок АНА8Ь1 согласно изобретению.
Направляющие в хлоропласт последовательности известны в данной области и включают малую
- 22 025843 субъединицу рибулозо-1,5-бифосфаткарбоксилазы хлоропласта (КиЫксо) (бе СаЧго δίΐνη ЕПНо е! а1. (1996) Р1ап! Мо1. Вю1. 30: 769-780; 8сЬпс11 е1 а1. (1991) 1. Вю1. СЬет. 266(5): 3335-3342); 5-(енолпирувил)шикимат-3-фосфатсинтазу (ΕΡδΡδ) (ЛгсЬег е! а1. (1990) 1. Вюепегд. ВютетЬ. 22(6): 789-810); триптофансинтазу (Ζΐιηο е! а1. (1995) 1. Вю1. СЬет. 270(11): 6081-6087); пластоцианин (Ьаотепсе е! а1. (1997) 1. Вю1. СЬет. 272(33): 20357-20363); хоризматсинтазу (ЪсНпиб! е! а1. (1993) 1. Вю1 СЬет. 268(36): 27447-27457); и светособирающий хлорофилл а/Ь-связывающий белок (ΈΗΕΡ) (Ьатрра е! а1. (1988) 1. Вю1. СЬет. 263:14996-14999). Смотрите также Уоп Ыецпе е! а1. (1991) Р1ап! Мо1. Вю1. Кер. 9: 104-126; С1агк е! а1. (1989) 1. Вю1. СЬет. 264: 17544-17550; Пе11а-Сюрра е! а1. (1987) Р1ап! РЬувю1. 84: 965-968; Котег е! а1. (1993) ВюсЬет. ВюрЬук. Кек. Соттип. 196: 1414-1421; и 8ЬиЬ е! а1. (1986) 8с1спсс 233: 478481.
Способы трансформации хлоропластов известны в данной области. Смотрите, например, δνаЬ е! а1. (1990) Ргос. Ыа!1. Αсаб. 8сЪ υδΑ 87: 8526-8530; δνаЬ и МаНда (1993) Ргос. Ыаб. Αсаб. 8οΐ. υδΑ 90: 913917; δνаЬ и МаНда (1993) ЕМВОЬ 12: 601-606. Способ основан на использовании пушки для частиц для доставки ДНК, содержащей селектируемый маркер, и целенаправленном встраивании ДНК в геном пластид с помощью гомологичной рекомбинации. Кроме того, трансформация пластид может быть осуществлена посредством трансактивации молчащего трансгена, который несут пластиды, в результате тканеспецифичной экспрессии кодируемой в ядре и направленной в пластиды РНК-полимеразы. Такая система описана в МсВпбе е! а1. (1994) Ргос. Ν;·ιΐ1. Αсаб. 8сЕ υδΑ 91: 7301-7305.
Представляющие интерес нуклеиновые кислоты, которые необходимо направить в хлоропласт, могут быть оптимизированы для экспрессии в хлоропласте с учетом различий в использовании кодонов между ядром растения и данным органоидом. Таким образом, представляющие интерес нуклеиновые кислоты могут быть синтезированы с использованием предпочтительных для хлоропластов кодонов. Смотрите, например, патент США № 5380831, включенный в настоящее описание в виде ссылки.
Как указано в настоящем описании, нуклеотидные последовательности ΑΒΑδΕΊ согласно изобретению применимы для усиления устойчивости к гербицидам растений, которые содержат в своих геномах ген, кодирующий устойчивый к гербицидам белок ΑΒΑδη. Такой ген может представлять собой эндогенный ген или трансген. Кроме того, в некоторых вариантах последовательности нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению можно комплектовать с любым сочетанием представляющих интерес полинуклеотидных последовательностей, чтобы создать растения с требуемым фенотипом. Например, полинуклеотиды согласно настоящему изобретению можно сочетать с любыми другими полинуклеотидами, кодирующими полипептиды, обладающие пестицидной и/или инсектицидной активностью, такие как, например, белки токсины Васй1и8 11шппд1еп515 (описанные в патентах США № 5366892, 5747450, 5737514, 5723756, 5593881 и Ое18ег е! а1. (1986) Оепе 48: 109). Полученные комбинации также могут включать в себя множественные копии любого одного из представляющих интерес полинуклеотидов.
Понятно, что наряду с такими нуклеотидными последовательностями могут быть сконструированы антисмысловые конструкции, комплементарные, по меньшей мере, части полинуклеотидных последовательностей матричной РНК (мРНК) для ЛΒЛδ^1. Антисмысловые нуклеотиды конструируют для гибридизации с соответствующими мРНК. Могут быть осуществлены модификации антисмысловых последовательностей при условии, что последовательности гибридизуются и препятствуют экспрессии соответствующей мРНК. Таким образом, могут быть использованы антисмысловые конструкции, имеющие 70%, предпочтительно 80%, более предпочтительно 85% идентичность последовательности с соответствующими антисмысловыми последовательностями. Кроме того, части антисмысловых нуклеотидов могут быть использованы для нарушения экспрессии гена-мишени. Обычно можно использовать последовательности длиной, по меньшей мере, 50 нуклеотидов, 100 нуклеотидов, 200 нуклеотидов или больше.
Нуклеотидные последовательности согласно настоящему изобретению также можно использовать в смысловой ориентации, чтобы подавить экспрессию эндогенных генов в растениях. Способы подавления экспрессии генов в растениях с использованием нуклеотидных последовательностей в смысловой ориентации известны в данной области. Способы обычно включают в себя трансформацию растений конструкцией ДНК, содержащей промотор, который управляет экспрессией в растении, оперативно связанный, по меньшей мере, с частью нуклеотидной последовательности, которая соответствует транскрипту эндогенного гена. Обычно такая нуклеотидная последовательность имеет значительную идентичность последовательности с последовательностью транскрипта эндогенного гена, предпочтительно больше чем примерно 65% идентичность последовательности, более предпочтительно больше чем примерно 85% идентичность последовательность, наиболее предпочтительно больше чем примерно 95% идентичность последовательности. Смотрите патенты США № 5283184 и 5034323, включенные в настоящее описание в виде ссылки.
Хотя резистентные к гербицидам полинуклеотиды ЛΗЛδ^1 согласно изобретению применимы в качестве генов селектируемых маркеров для трансформации растений, кассеты экспрессии согласно изобретению могут содержать другой ген селектируемого маркера для селекции трансформированных клеток. Гены селектируемых маркеров, включая гены согласно настоящему изобретению, применяют для селекции трансформированных клеток или тканей. Маркерные гены включают без ограничения гены,
- 23 025843 кодирующие резистентность к антибиотикам, такие как гены, кодирующие неомицинфосфотрансферазу II (ΝΕΟ) и гигромицинфосфотрансферазу (НРТ), а также гены, придающие резистентность к гербицидным соединениям, таким как глюфосинат аммония, бромоксинил, имидазолиноны и 2,4-дихлорфеноксиацетат (2,4-Ό). В общем, смотрите Уаггап!оп(1992) Сшт. Орш. Вю!есй. 3:506-511; СНпкЮрНегкоп е! а1. (1992) Ргос. N311. Лсаа. δοΐ. υδΑ 89:6314-6318; Уао е! а1. (1992) Се11 71:63-72; Ке/шкоП' (1992) Мо1. ΜίсгоЫо1. 6:2419-2422; Вагк1еу е! а1. (1980) ш ТНе Орегоп, рр. 177-220; Ни е! а1. (1987) Се11 48:555-566; Вгомп е! а1. (1987) Се11 49:603-612; Идде е! а1. (1988) Се11 52:713-722; ВеиксЫе е! а1. (1989) Ргос. №И. Αсаά. Αα. υδΑ 86:5400-5404; Риегк! е! а1. (1989) Ргос. №И. Αсаά. δ^. υδΑ 86:2549-2553; ЭеиксЫе е! а1. (1990) δ^ι^ 248:480-483; Ооккеп (1993) РНГО. ТНеык, ишуегкИу оГ Не1ае1Ьег§; Кешек е! а1. (1993) Ргос. №И. Αсаά. δοΐ. υδΑ 90:1917-1921; ЬаЬом е! а1. (1990) Мо1. Се11. Вю1. 10:3343-3356; ХитЬкеЮ е! а1. (1992) Ргос. №И. Αсаά. δοΐ. υδΑ 89:3952-3956; Ват е! а1. (1991) Ргос. Νη11. Лсаа. δοΐ. υδΑ 88:5072-5076; \Υ\Ьогкк1 е! а1. (1991) №с1ею Лс^ак Кек. 19:4647-4653; НШепапа-ХУВктап (1989) Торюк Мо1. δίπκ:. Вю1. 10:143-162; Эедепко1Ь е! а1. (1991) Αп!^т^с^оЬ. Лдейк СНето!Нег. 35:1591-1595; К1етксНта! е! а1. (1988) ВюсНет1к1гу 27:1094-1104; Вотп (1993) РН.Э. ТНеык, υώνοΓδΐ^ оГ Не1ае1Ьег§; Ооккеп е! а1. (1992) Ргос. №!1. Αсаа. δ^. υδΑ 89:5547-5551; О1Ка е! а1. (1992) Лпί^т^с^оЬ. Α§еп!к СНето!Нег. 36:913-919; Н1а\'ка е! а1. (1985) НапаЬоок оГ Εxре^^теп!а1 РНагтасо1оду. Уо1. 78 ^ргшдег-Уег1ад, ВегНп); ОШ е! а1. (1988) №!иге 334:721-724. Указанные публикации включены в настоящее описание в виде ссылки.
Приведенный выше список генов селектируемых маркеров не следует рассматривать как ограничивающий. В настоящем изобретении можно использовать любой ген селектируемого маркера.
Изолированные молекулы полинуклеотидов, содержащие нуклеотидную последовательность, которая кодирует белки ΑΒΑδΜ согласно изобретению, можно использовать в векторах для трансформации растений, для того чтобы созданные растения имели повышенную резистентность к гербицидам, в частности, к имидазолиноновым гербицидам. Изолированные молекулы полинуклеотидов ΑΒΑδΜ согласно изобретению можно использовать в векторах отдельно или в сочетании с нуклеотидной последовательностью, кодирующей малую субъединицу фермента ЛΗЛδ (ЛΗЛδδ), для придания растениям резистентности к гербицидам. Смотрите патент США № 6348643, который включен в настоящее описание в виде ссылки.
Таким образом, настоящее изобретение относится к векторам для трансформации, содержащим ген селектируемого маркера согласно изобретению. Ген селектируемого маркера содержит промотор, который управляет экспрессией в клетке-хозяине, оперативно связанный с полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, которая кодирует резистентный к гербицидам белок ЛΗЛδ^ согласно изобретению. Вектор для трансформации дополнительно может содержать представляющий интерес ген, который необходимо экспрессировать в клетке-хозяине, а также, при необходимости, может содержать направляющую в хлоропласт последовательность, которая оперативно связана с полинуклеотидом согласно изобретению.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам применения векторов для трансформации согласно изобретению для селекции в отношении клеток, трансформированных представляющим интерес геном. Такие способы заключаются в трансформации клетки-хозяина трансформирующим вектором, воздействии на клетку определенным уровнем имидазолинонового или сульфонилмочевинного гербицида, который может убивать или ингибировать рост нетрансформированной клетки-хозяина, и идентификации трансформированной клетки-хозяина по ее способности расти в присутствии гербицида. В одном варианте согласно изобретению клетка-хозяин представляет собой растительную клетку, и ген селектируемого маркера содержит промотор, который управляет экспрессией в растительной клетке.
Векторы для трансформации согласно изобретению можно применять для получения растений, трансформированных представляющим интерес геном. Векторы для трансформации будут содержать ген селектируемого маркера согласно изобретению и представляющий интерес ген, который необходимо ввести и, как правило, экспрессировать в трансформированном растении. Такой ген селектируемого маркера содержит резистентный гербицидам полинуклеотид ЛΗЛδ^1 согласно изобретению, оперативно связанный с промотором, который управляет экспрессией в клетке-хозяине. В случае применения в растениях и растительных клетках вектор для трансформации содержит ген селектируемого маркера, включающий в себя резистентный к гербицидам полинуклеотид ЛΗЛδ^1 полинуклеотид согласно изобретению, оперативно связанный с промотором, который управляет экспрессией в растительной клетке.
Изобретение также относится к экспрессирующему вектору растений, содержащему промотор, который управляет экспрессией в растении, оперативно связанный с изолированной молекулой полинуклеотида согласно изобретению. Изолированная молекула полинуклеотида содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ЛΗЛδ^1, в частности белок ЛΗЛδ^1, содержащий аминокислотную последовательность, которая указана в δΕΟ ГО ΝΟ:2, 3, 4, 5 или 6, или ее функциональный фрагмент и вариант. Экспрессирующий вектор растений согласно изобретению не зависит от конкретного промотора, за исключением того, что такой промотор должен обладать способностью управлять экспрессией генов в растительной клетке. Предпочтительные промоторы включают конститутивные промоторы и предпочтительные для тканей промоторы.
Представляющие интерес гены согласно изобретению варьируют в зависимости от требуемого ре- 24 025843 зультата. Например, интерес могут представлять различные изменения фенотипа, включая модификацию состава жирных кислот в растении, изменение содержания аминокислот в растении, изменение механизмов защиты растения от насекомых и/или патогенов и тому подобные. Указанные результаты могут быть достигнуты в результате экспрессии гетерологичных продуктов или повышенной экспрессии эндогенных продуктов в растениях. Альтернативно результаты могут быть достигнуты в результате снижения экспрессии одного или нескольких эндогенных продуктов в растении, в частности, ферментов или кофакторов. Такие изменения приводят к изменению фенотипа трансформированного растения.
В одном варианте осуществления изобретения представляющими интерес генами являются гены резистентности к насекомым, например, такие как гены белка токсина ВасШик 1йиг1пд1епк1к (патенты США № 5366892, 5747450, 5736514, 5723756, 5593881 и Се1кег е! а1. (1986) Сепе 48: 109).
Белки или полипептиды АНΛ8^1 согласно изобретению могут быть очищены, например, из растений Втакыса и могут быть использованы в композициях. Также изолированная молекула полинуклеотида, кодирующего белок ΛНΛ8^1 согласно изобретению, может быть использована для экспрессии белка АНΛ8^1 согласно изобретению в микроорганизме, таком как Е. сой или дрожжи. Экспрессированный белок АНΛ8^1 можно очистить из экстрактов Е. сой или дрожжей любым способом, известным специалисту в данной области.
Изобретение также относится к способу создания трансгенного растения, которое резистентно к гербицидам, включающему в себя трансформацию растения экспрессирующим вектором растений, содержащим промотор, который управляет экспрессией в растении, оперативно связанный с изолированной молекулой полинуклеотида согласно изобретению. Изолированная молекула полинуклеотида содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ΛНΛ8^1 согласно изобретению, в частности, белок ΛНΛ8^1. содержащий аминокислотную последовательность, которая указана в 8ЕО ГО N0:2, 3, 4, 5 или 6, аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью 8Е0 ГО N0:12, 13, 14, 15 или 16, или функциональный фрагмент и вариант указанных аминокислотных последовательностей.
Изобретение также относится к нетрансгенным растениям Втакыса, трансгенным растениям, полученным способами согласно изобретению, и потомству и другим потомкам таких нетрансгенных и трансгенных растений, при этом растения обладают усиленной или повышенной резистентностью к гербицидам, которые отрицательно влияют на фермент АНА8, в частности, имидазолиноновым и сульфонилмочевинным гербицидам.
Полинуклеотиды ΛНΛ8^1 согласно изобретению, в частности, полинуклеотиды, кодирующие резистентные к гербицидам белки ΛНΛ8^1. применимы в способах усиления резистентности устойчивых к гербицидам растений. В одном варианте осуществления изобретения устойчивые к гербицидам растения содержат устойчивый к гербицидам или резистентный к гербицидам белок АНА8Е. Устойчивые к гербицидам растения включают как растения, трансформированные устойчивыми к гербицидам нуклеотидными последовательностями АНА8Е, так и растения, которые содержат в своих геномах эндогенный ген, который кодирует устойчивый к гербицидам белок АНА8Е. Такое устойчивое к гербицидам растение может представлять собой устойчивое к гербицидам растение, которое было генетически сконструировано для получения устойчивости к гербицидам, или устойчивое к гербицидам растение, которое было создано способами, в которых не используют рекомбинантную ДНК, например, такие как растения ВгакК1са согласно настоящему изобретению. Нуклеотидные последовательности, кодирующие устойчивые к гербицидам белки АНА8Е, и устойчивые к гербицидам растения, содержащие эндогенный ген, который кодирует устойчивый к гербицидам белок ΛНΛ8^. включают полинуклеотиды и растения согласно настоящему изобретению или полинуклеотиды и растения, которые известны в данной области. Смотрите, например, патенты США № 5013659, 5731180, 5767361, 5545822, 5736629, 5773703, 5773704, 5952553 и 6274796, которые все включены в настоящее описание в виде ссылки. Такие способы усиления резистентности устойчивых к гербицидам растений включают в себя трансформацию устойчивого к гербицидам растения по меньшей мере одной полинуклеотидной конструкцией, содержащей промотор, который управляет экспрессией в растительной клетке, который оперативно связан с резистентным к гербицидам полинуклеотидом АНА8Ы согласно изобретению, в частности полинуклеотидом, кодирующим резистентный к гербицидам белок АНА8Ы, указанный в 8Е0 ГО N0:12, 13, 14, 15 или 16, полинуклеотидами, кодирующими аминокислотную последовательность, указанную в 8Е0 ГО N0:2, 3, 4, 5 или 6, и фрагментами и вариантами указанных полинуклеотидов, которые кодируют полипептиды, обладающие резистентной к гербицидам активностью АНА8. Растение, полученное таким способом обладает повышенной резистентностью, по меньшей мере. к одному гербициду по сравнению с резистентным к гербицидам растением до трансформации полинуклеотидной конструкцией согласно изобретению.
Доступны многочисленные векторы для трансформации растений и способы трансформации растений. Смотрите, например, Ап, С. е! а1. (1986) Р1ап! Рукю1, 81: 301-305; Рту, 1., е! а1. (1987) Р1ап! Се11 Кер. 6: 321-325; В1оск, М. (1988) Тйеот. Арр1 Сепе!. 16: 161-114; Ншсйее, е! а1. (1990) 81аб1ет. Сепе!. 8утр. 203212.203-212; Соикшк, е! а1. (1991) Айк!. 1. Р1ап! Рйукю1. 18: 481-494; Сйее, Р.Р. и 8йдй!от, ТЬ. (1992) Сепе. 118: 255-260; Сйпк!ои, е! а1. (1992) Тгепбк. ВюКсйпой 10: 239-246; В'НаИшп, е! а1. (1992) Вю/Тесйпо1. 10: 309-314; Όΐίτ, е! а1. (1992) Р1ап! Рйукю1. 99: 81-88; Сакак е! а1. (1993) Ргос. №й. Асаб 8сь
- 25 025843
И8А 90: 11212-11216; СЬпк!ои, Р. (1993) 1п Уйго Се11. Эе\. Вю1.-Р1ап!; 29Р: 119-124; Оамек, е! а1. (1993) Р1ап! Се11 Кер. 12: 180-183; Эопд, РА. и МсЬидЬеп, А. (1993) Р1ап! 8ск 91: 139-148; Ргапкйп, С.1. и Тпеи, Т.К (1993) Р1ап!. РЬу8ю1. 102: 167; Оо1оукш, е! а1. (1993) Р1ап! 8ск 90: 41-52; Оио СЫп 8οΐ. Ви11. 38: 20722078; Акапо, е! а1. (1994) Р1ап! Се11 Кер. 13; Ауегек КМ. и Рагк, \У.Э. (1994) Сгй. Кеу. Р1ап!. 8ск 13: 219239; Вагсе1о, е! а1. (1994) Р1ап!. 1. 5: 583-592; Вескег, е! а1. (1994) Р1ап!. 1. 5: 299-307; Вогко\гкка е! а1. (1994) Ас!а. РЬукю1 Р1ап!. 16: 225-230; СЬпк!ои, Р. (1994) Адго. Рооб. 1пб. Н1 ТесЬ. 5: 17-27; Еареп е! а1. (1994) Р1ап! Се11 Кер. 13: 582-586; Найтап, е! а1. (1994) Вю-ТесЬпо1о§у 12: 919923; Кйа1а, е! а1. (1994) Р1ап!. Мо1. Вю1. 24: 317-325; и Уап, У.С. и Ьетаих, Р.О. (1994) Р1ап! РЬувю1. 104: 3748.
Способы согласно изобретению заключаются во введении полинуклеотидной конструкции в растение. Под введением подразумевают воздействие на растение полинуклеотидной конструкцией таким образом, чтобы конструкция получила доступ внутрь клетки растения. Способы согласно изобретению не зависят от конкретного способа введения полинуклеотидной конструкции в растение при условии, что полинуклеотидная конструкция получает доступ внутрь по меньшей мере одной клетки растения. Способы введения полинуклеотидных конструкций в растения известны в данной области, включая без ограничения способы стабильной трансформации, способы временной трансформации и опосредованные вирусами способы.
Под стабильной трансформацией подразумевают, что полинуклеотидная конструкция, введенная в растение, интегрируется в геном растения и может наследоваться его потомством. Под временной трансформацией подразумевают, что полинуклеотидная конструкция, введенная в растение, не интегрируется в геном растения.
Для трансформации растений и растительных клеток нуклеотидные последовательности согласно изобретению встраивают, используя стандартные методики, в любой вектор, известный в данной области, который подходит для экспрессии нуклеотидных последовательностей в растении или растительной клетке. Выбор вектора зависит от предпочтительной методики трансформации и вида растения-мишени, которое необходимо трансформировать. В одном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность АНА8Ь1 оперативно связана с промотором растений, который, как известно, обеспечивает высокие уровни экспрессии в растительной клетке, и такую конструкцию затем вводят в растение, которое является чувствительным к имидазолиноновому гербициду, и регенерируют трансформированное растение. Трансформированное растение устойчиво к воздействию такого уровня имидазолинонового гербицида, который убивает или в значительной степени повреждает нетрансформированное растение. Указанный способ может быть применим для любого вида растения; однако он наиболее полезен для применения по отношению к культурным растениям, в частности культурным растениям, которые обычно выращивают в присутствии по меньшей мере одного гербицида, в частности имидазолинонового гербицида.
Методики конструирования кассет экспрессии в растениях и введения чужеродных нуклеиновых кислот в растения, в общем, известны в данной области и описаны ранее. Например, чужеродную ДНК можно вводить в растения, используя векторы на основе индуцирующих опухоли (П)-плазмид. Способы трансформации на основе АдгоЬас!егшт хорошо известны в данной области. Штамм АдгоЬас!егшт (например, АдгоЬас!егшт йппеГааепк или АдгоЬас!ейит гЫ/одепек) содержит плазмиду (Тй или К1плазмиду) и элемент Т-ДНК, который переносят в растение в результате инфекции АдгоЬас!егшт. ТДНК (переносимая ДНК) интегрируется в геном растительной клетки. Т-ДНК может быть локализована в К1- или Тйплазмиде или содержится отдельно в так называемом бинарном векторе. Способы опосредованной АдгоЬас!ейит трансформации описаны, например, в НогксЬ КВ е! а1. (1985) 8с1епсе 225: 1229Г. Опосредованная АдгоЬас!егшт трансформация может быть использована как для двудольных растений, так и для однодольных растений. Трансформация растений с помощью АдгоЬас!ейа описана в ^Ы!е РР, Уес!огк Гог Оепе ТгапкГег ш ШдЬег Р1ап!к; ш Тгапкдешс Р1ап!к, Уо1. 1, Епдшеегшд апб ИйЬ/айоп, ебйеб Ьу 8.Ό. Кипд и К. \Уи, Асабетю Ргекк, 1993, рр. 15-38; 1епек В е! а1. (1993) ТесЫисщек Гог Оепе ТгапкГег, ш: Тгапкдешс Р1ап!к, Уо1. 1, Епдшеегшд апб ИйЬ/айоп, ебйеб Ьу 8.Ό. Кипд и К. \Уи, Асабетю Ргекк, рр. 128143; Ро!гукик (1991) Аппи. Кеу. Р1ап! РЬукю1. Р1ап! Мо1ес. Вю1 42: 205-225. Другие способы, используемые для доставки чужеродной ДНК, включают в себя применение опосредованной ПЭГ трансформации протопластов, электропорацию, микроинъекцию нитевидных кристаллов и баллистические способы или бомбардировку микрочастицами для прямого захвата ДНК. Такие способы известны в данной области (патент США № 5405765, Уакб е! а1.; Вбапд е! а1. (1991) Оепе 100: 247-250; 8сЬе1б е! а1., (1991) Мо1 Оеп. Оепе!, 228: 104-112; ОиегсЬе е! а1., (1987) Р1ап! 8с1епсе 52: 111-116; №иЬаике е! а1., (1987) ТЬеог. Арр1 Оепе!. 75: 30-36; К1еш е! а1., (1987) УПиге 327: 70-73; Номюб е! а1., (1980) 8Ыепсе 208:1265; НогксЬ е! а1., (1985) 8с1епсе 227: 1229-1231; ЭеВ1оск е! а1., (1989) Р1ап! РЬукю1оду 91: 694-701; Ме!Ьобк Гог Р1ап! Мо1еси1аг Вю1оду (ХУейкЬасЬ и ХУейкЬасЬ, ебк.) Асабепис Ргекк, 1пс. (1988) и Ме!Ьобк ш Р1ап! Мо1еси1аг Вю1оду (8сЬи1ег и Ζ^е1^пкк^. ебк.) Асабепис Ргекк, 1пс. (1989). Способ трансформации зависит от растительной клетки, которую необходимо трансформировать, стабильности используемых векторов, уровня экспрессии генных продуктов и других параметров.
Другие подходящие способы введения нуклеотидных последовательностей в растительные клетки и последующего встраивания в геном растения, включают микроинъекцию, как описано в Сгокк^ау е! а1.
- 26 025843 (1986) В1о!есйтдие5 4: 320-334, электропорацию, как описано в К1дд5 е! а1. (1986) Ргос. Ыа!1. Αοηύ. δα. υδΑ 83: 5602-5606, опосредованную Άд^οЪас!е^^ит трансформацию, как описано Тоуп5епй е! а1. в патенте США № 5563055, 2йао е! а1. в патенте США № 5981840, прямой перенос генов, как описано в Ра5ζко\\'5к1 е! а1. (1984) ЕМВО ί. 3: 2717-2722, и баллистическое ускорение частиц, как описано, например, δаηΓο^й е! а1. в патенте США № 4945050; Тоте5 е! а1. в патенте США № 5879918; Тоте5 е! а1. в патенте США № 5886244; ВМпеу е! а1. в патенте США № 5932782; Тоте5 е! а1. (1995) Ойес! ΌΝΑ ТнпъГег т!о 1п!ас! Р1ап! Се115 У1а М1сгорго.)есШе ВотЪагйтеп!, ш Р1ап! Се11, Т155ие, апй Огдап Си1!иге: Рипйатеп!а1 Ме!йой5, ей. ОатЪогд и РЫШр5 (δρ^^пде^-Vе^1ад. Вегйп); МсСаЪе е! а1. (1988) Вю!есйпо1оду 6: 923-926); и трансформацию Ьес1 (\УО 00/28058). Также смотрите \Уе155тдег е! а1. (1988) Αпп. Кеу. Оепе!. 22: 421477; δапΓο^й е! а1. (1987) Ратси1а!е δ^ΐ'^ апй Тесйпо1оду 5: 27-37 (лук); Сйп5!ои е! а1. (1988) Р1ап! Рйу51о1. 87: 671-674 (соя); МсСаЪе е! а1. (1988) Вю/Тесйпо1оду 6: 923-926 (соя); Ршег и МсМи11еп (1991) 1п Уйго Се11 Эеу. Вю1. 27Р: 175-182 (соя); δίπ^,Η е! а1. (1998) Тйеог. Αρρ1 Оепе!. 96: 319-324 (соя); ЭаНа е! а1. (1990) В1о!есйпо1оду 8: 736-740 (рис); К1еш е! а1. (1988) Ргос. Ыа!1. ^ай. δ^. υδΑ 85: 4305-4309 (кукуруза); К1еш е! а1. (1988) В1о!есйпо1оду 6: 559-563 (кукуруза); Тоте5, патент США № 5240855; Вш5ш§ е! а1., патенты США №№ 5322783 и 5324646; Тоте5 е! а1. (1995) Эйес! ΌΝΑ Тгап5£ег ш!о 1п!ас! Р1ап! Се115 У1а М^с^ορ^ο^ес!^1е ВотЪагйтеп!, в Р1ап! Се11, Т155ие, апй Огдап Си1!иге: Рипйатеп1а1 Ме!йой5, ей. ОатЪогд (δρ^^пде^-Уе^1ад. Вегйп) (кукуруза); К1еш е! а1. (1988) Р1ап! Рйу5ю1. 91: 440-444 (кукуруза); Ргогат е! а1. (1990) Вю!есйпо1оду 8: 833-839 (кукуруза); Иооукаа5-Уап δ1οд!е^еп е! а1. (1984) Ыа!иге (Ьопйоп) 311: 763764; Во\уеп е! а1., патент США № 5736369 (злаковые); Ву!еЫег е! а1. (1987) Ргос. №й1. ^ай. δ^. υδΑ 84: 5345-5349 (лилейные); Эе ^е! е! а1. (1985) в Тйе Еxρе^^теп!а1 Матρи1аύοп о£ Оуи1е Т155ие5, ей. Сйаρтап е! а1. (Ьопдтап, Ыеу Уогк), ρρ. 197-209 (пыльца); Каеρρ1е^ е! а1. (1990) Р1ап! Се11 ^зог^ 9: 415-418 и Каеρρ1е^ е! а1. (1992) Тйеог. Αρρ1. Оепе!. 84: 560-566 (опосредованная нитевидными кристаллами трансформация); Э'ИаЛшп е! а1. (1992) Р1ап! Се11 4: 1495-1505 (электропорация); Ы е! а1. (1993) Р1ап! Се11 ^зог^ 12: 250-255 и Сйп5!ои и Рогй (1995) Утай о£ Во!апу 75: 407-413 (рис); Оуойа е! а1. (1996) Ыа!иге Вю!есйпо1оду 14: 745-750 (кукуруза посредством Ά§^οЪас!е^^ит !ите£ас1еп5); все публикации включены в настоящее описание в виде ссылки.
Полинуклеотиды согласно изобретению могут быть введены в растения в результате контактирования растений с вирусом или вирусными нуклеиновыми кислотами. В общем, такие способы заключаются во введении полинуклеотидной конструкции согласно изобретению в молекулу вирусной ДНК или РНК. Понятно, что белок ΑΗΑδΡ1 согласно изобретению может быть исходно синтезирован в виде части вирусного полибелка, который позднее процессируется в результате протеолиза ш У1уо или ш уйго с образованием требуемого рекомбинантного белка. Кроме того, понятно, что промоторы согласно изобретению также охватывают промоторы, используемые для транскрипции вирусными РНК-полимеразами. Способы введения полинуклеотидных конструкций в растения и экспрессии в растениях кодируемого белка, включая введение молекул вирусных ДНК или РНК, известны в данной области. Смотрите, например, патенты США № 5889191, 5889190, 5866785, 5589367 и 5316931, включенные в настоящее описание в виде ссылки.
Из клеток, которые были трансформированы, можно вырастить растения согласно обычным способам. Смотрите, например, МсСогтск е! а1. (1986) Р1ап! Се11 ^зог^ 5: 81-84. Такие растения затем могут быть выращены и опылены либо такой же трансформированной линией, либо другой линией, и может быть идентифицирован полученный гибрид, имеющий конститутивную экспрессию требуемого фенотипического признака. Могут быть выращены два или больше поколений, чтобы удостовериться, что экспрессия требуемого фенотипического признака стабильно поддерживается и наследуется, и затем могут быть собраны семена, чтобы гарантировать, что достигнута экспрессия требуемого фенотипического признака. Таким образом, настоящее изобретение относится к трансформированному семени (также называемому трансгенным семенем), содержащему полинуклеотидную конструкцию согласно изобретению, например, кассету экспрессии согласно изобретению, стабильно внедренную в его геном.
Настоящее изобретение можно применять для трансформации любого вида растения, включая без ограничения однодольные и двудольные растения. Примеры представляющих интерес видов растений включают без ограничения кукурузу (2еа тау5), виды Вга551са (например, В. ^ρ^, В. нфа, В. _|ипсеа), в частности, виды Вга551са, применимые в качестве источников масла, получаемого из семян, люцерну (Меййадо 5айуа), рис (Огууа 5айуа), рожь ^еса1е сегеа1е), сорго (Ьогдйнт Ысо1ог, δο^дйит уи1даге), просо (например, просо африканское (Реппйе!ит д1аисит), просо обыкновенное (Рашсит тШасеит), просо итальянское (Ье1апа йайса), элевзине (Е1еи5те согасапа)), подсолнечник (^^^^5 аппии5), сафлор (Саг!йати5 !шс!огш5), пшеницу (ТгШсит ае5Йуит, Т. Тигщйит 55ρ. йигит), сою (О1усте тах), табак (№сойапа !аЪасит), картофель (Ьокйшт !иЪего5ит), арахис (Мисйй йуροдаеа), хлопчатник (Оο55уρ^ит ЪагЪайеп5е, Оο55уρ^ит йиъиШт), батат (фотоеа Ъа!а!и5), маниок (Матйо! е5си1еп!а), кофе (Со££еа 5ρρ.), кокос (Сосо5 писйега), ананас (Άпапа5 сото5И5), цитрусовые деревья (Сйги5 5ρρ.), какое (ТйеоЪгота сасао), чай (СатеШа 5шеп5Й), бананы (Ми5а 5ρρ.), авокадо (Рег5еа атепсапа), смоковницу (Р1си5 са51са), гуаву (Р51йшт диа.|ауа), манго (Мапдйега шйюа), оливу (О1еа еи^ορаеа), папайю (Санса ρаρауа), кешью (Αικιсагйшт осс1йеп!а1е), макадамию (Масайапиа ш!едп£ойа), миндаль (Ргипи5 атудйа1и5), сахарную свеклу (Ве!а уи1дагй), сахарный тростник (Ьассйагит 5ρρ.), овес, ячмень, овощи, декоративные растения и хвой- 27 025843 ные. Предпочтительно растения согласно настоящему изобретению представляют собой сельскохозяйственные растения (например, подсолнечник, виды Вта881са, хлопчатник, сахарный тростник, свеклу, сою, арахис, люцерну, сафлор, табак, кукурузу, рис, пшеницу, рожь, ячмень, тритикале, сорго, просо и т.д.).
Резистентные к гербицидам растения согласно изобретению применимы в способах борьбы с сорняками. Таким образом, настоящее изобретение, кроме того, относится к способу борьбы с сорняками, растущими рядом с резистентным к гербицидам растением согласно изобретению. Способ включает в себя нанесение эффективного количества гербицида на сорняки и резистентное к гербициду растение, при этом растение обладает повышенной резистентностью по меньшей мере к одному гербициду, в частности, к имидазолиноновому или сульфонилмочевинному гербициду, по сравнению с растением дикого типа. В таком способе борьбы с сорняками резистентные к гербицидам растения согласно изобретению предпочтительно являются сельскохозяйственными растениями, включая без ограничения подсолнечник, люцерну, виды Вта881са, сою, хлопчатник, сафлор, арахис, табак, томат, картофель, пшеницу, рис, кукурузу, сорго, ячмень, рожь, просо и сорго.
Благодаря получению растений, обладающих повышенной резистентностью к гербицидам, в частности, имидазолиноновым и сульфонилмочевинным гербицидам, можно использовать широкое множество препаратов для защиты растений от сорняков, для того чтобы ускорить рост растений и снизить конкуренцию за питательные вещества. Гербицид можно использовать отдельно для довсходовой, послевсходовой, предпосевной и осуществляемой при посеве борьбы с сорняками на площадях, окружающих растения, описанные в настоящей публикации, или можно использовать препараты имидазолиноновых гербицидов, которые содержат другие добавки. Гербицид также можно применять для обработки семян. То есть эффективную концентрацию или эффективное количество гербицида или композиции, содержащей эффективную концентрацию или эффективное количество гербицида можно вносить непосредственно в семена перед или во время посева семян. Добавки, имеющиеся в препарате или композиции имидазолинонового или сульфонилмочевинного гербицида, включают другие гербициды, детергенты, адъюванты, средства для распыления, склеивающие средства, стабилизаторы или тому подобное. Гербицидный препарат может представлять собой влажный или сухой препарат, и такие препараты включают без ограничения сыпучие порошки, эмульгируемые концентраты и жидкие концентраты. Гербицид и гербицидные препараты можно применять согласно обычным способам, например, опрыскиванием, орошением, опылением, нанесением покрытия и тому подобными способами.
Настоящее изобретение относится к способам, которые заключаются в применении ΑΗΑδингибирующего гербицида. В таких способах ΑΗΑδ-ингибирующий гербицид можно применять, используя любой способ, известный в данной области, включая без ограничения обработку семян, обработку почвы и внекорневую обработку.
Настоящее изобретение относится к способам повышения устойчивости или резистентности растения, растительной ткани, растительной клетки или другой клетки-хозяина по меньшей мере к одному гербициду, который препятствует проявлению активности Фермента ΑΗΑ8. Предпочтительно такой ингибирующий ΑΗΑ8 гербицид является имидазолиноновым гербицидом, сульфонилмочевинным гербицидом, триазолопиримидиновым гербицидом, пиримидинилоксибензоатным гербицидом, сульфониламинокарбонилтриазолиноновым гербицидом или их смесью. Более предпочтительно такой гербицид является имидазолиноновым гербицидом, сульфонилмочевинным гербицидом или их смесью. В случае настоящего изобретения имидазолиноновые гербициды включают без ограничения РПКВиГТ® (имазетапир), СЛОВЕ® (имазапик), ΚΑΡΤΘΚ® (имазамокс), 8СЕРТЕВ® (имазахин), ΑδδΕΚΤ® (имазетабенз), ΑΚδΕΝΑΕ® (имазапир), производное любого из вышеназванных гербицидов и смесь двух или более из вышеназванных гербицидов, например, имазапир/имазамокс (ΘΌΥδδΕΥ®). Более конкретно имидазолиноновый гербицид может быть выбран из группы, без ограничения состоящей из 2-(4-изопропил-4метил-5-оксо-2-имидиазолин-2-ил)никотиновой кислоты, [2-(4-изопропил)-4-][метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-3-хинолинкарбоновой] кислоты, [5-этил-2-(4-изопропил-]-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2ил)никотиновой кислоты, 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-5-(метоксиметил)никотиновой кислоты, [2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-]имидазолин-2-ил)-5-метилникотиновой кислоты и смеси метил[6-(4-изопропил-4-]метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-м-толуата и метил[2-(4-изопропил-4метил-5-]оксо-2-имидазолин-2-ил)-п-толуата. Применение 5-этил-2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)никотиновой кислоты и [2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-]ил)-5-(метоксиметил)никотиновой кислоты является предпочтительным. В частности, предпочтительно применение [2(4-изопропил-4-]метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-5-(метоксиметил)никотиновой кислоты.
В случае настоящего изобретения к сульфонилмочевинным гербицидам относятся без ограничения хлорсульфурон, метсульфуронметил, сульфометуронметил, хлоримуронэтил, трифенсульфуронметил, трибенуронметил, бенсульфуронметил, никосульфурон, этаметсульфуронметил, римсульфурон, трифлусульфуронметил, триасульфурон, примисульфуронметил, циносульфурон, амидосульфурон, флузасульфурон, имазосульфурон, пиразосульфуронэтил, галосульфурон, азимсульфурон, циклосульфурон, этоксисульфурон, флазасульфурон, флупирсульфуронметил, форамсульфурон, йодсульфурон, оксасульфурон, мезосульфурон, просульфурон, сульфосульфурон, трифлоксисульфурон, тритосульфурон, произ- 28 025843 водное любого из вышеуказанных гербицидов и смесь двух или более из вышеуказанных гербицидов. Триазолопиримидиновые гербициды согласно изобретению включают без ограничения клорансулам, диклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам и пенокссулам. Пиримидинилоксибензоатные гербициды согласно изобретению включают без ограничения биспирибак, пиритиобак, пириминобак, пирибензоксим и пирифталид.
Сульфониламинокарбонилтриазолиноновые гербициды включают без ограничения флукарбазон и пропоксикарбазон.
Понятно, что пиримидинилоксибензоатные гербициды являются близко родственными пиримидинилтиобензоатным гербицидам, и Американским научным обществом по исследованию сорняков указанным гербицидам присвоено одно общее последнее название. Соответственно к гербицидам согласно настоящему изобретению дополнительно относятся пиримидинилтиобензоатные гербициды, включая без ограничения пиримидинилоксибензоатные гербициды, описанные выше.
Перед применением АНАЗ-ингибирующий гербицид может быть превращен в обычные препараты, например растворы, эмульсии, суспензии, пылевидные препараты, порошки, пасты и гранулы. Форма применения зависит от конкретной предполагаемой цели; в каждом случае она должна гарантировать тонкодисперсное и равномерное распределение соединения согласно изобретению.
Препараты готовят известным способом (смотрите, например обзор в ИЗ 3060084, ЕР-А707445 (жидкие концентраты), Вгоутид, Адд^тегаИои, СЬетка1 Еидтеегшд, 4 декабря 1967 г., 147-48, Реггу'8 СЬеш1са1 Еидтеег'з НаиДЬоок, 4Ф ЕД., МсОгау-НШ, №у Уогк, 1963, с. 8-57 и е! веер \У0 91/13546, ИЗ 4172714, ИЗ 4144050, ИЗ 3920442, ИЗ 5180587, ИЗ 5232701, ИЗ 5208030, ОВ 2095558, ИЗ 3299566, КПидтаи, \УееД Сои!го1 аз а Заеисе, 1о1т \УПеу и Зоиз, 1ис., Уогк, 1961, Наисе е! а1., \УееД Сои!го1 НапДЬоок, 811 ЕД., В1аскуе11 Заеиййс РиЬНсайоиз, 0хГогД, 1989 и Мо11е!, Н., ОгиЬетаии, А., Рогти1айои 1есЬио1оду, \УПеу УСН Уег1ад ОтЬН, ХУеткеип (Оегтаиу), 2001, 2. Ό. А. Киоу1ез, СНетМгу аиД Тес1ио1оду оГ Лд^осЬет^са1 Рогти1айоиз, К1иуег АсаДетк РиЬкзкегз, ОогДгесШ, 1998 (IЗВN 0-7514-0443-8), например, посредством введения вместе с активным соединением вспомогательных средств, подходящих для приготовления агрохимикатов, таких как растворители и/или носители, при необходимости эмульгаторов, поверхностно-активных веществ и диспергирующих агентов, консервантов, противопенных средств, антифризы, в случае препарата для обработки семян также необязательно красители и/или связывающие средства и/или гелеобразующие средства.
Примерами подходящих растворителей являются вода, ароматические растворители (например продукты Зо1уеззо, ксилен), парафины (например фракции минерального масла), спирты (например, метанол, бутанол, пентанол, бензиловый спирт), кетоны (например, циклогексанон, гамма-бутиролактон), пирролидоны АМР, N0Р), ацетаты (гликольдиацетат), гликоли, диметиламиды жирных кислот, жирные кислоты и сложные эфиры жирных кислот. В принципе, также можно использовать смеси растворителей.
Примерами подходящих носителей являются измельченные природные минералы (например, каолины, глины, тальк, мел) и измельченные синтетические минералы (например, высокодисперсный диоксид кремния, силикаты).
Подходящими эмульгаторами являются неионные и анионные эмульгаторы (например, эфиры полиоксиэтилена и жирных спиртов, алкилсульфонаты и арилсульфонаты). Примерами диспергирующих средств являются лигнин-отработанный сульфитный щелок и метилцеллюлоза.
Подходящими используемыми поверхностно-активными веществами являются соли щелочных металлов, щелочно-земельных металлов и аммония и лигносульфоновой кислоты, нафталинсульфоновой кислоты, фенолсульфоновой кислоты, дибутилнафталинсульфоновой кислоты, алкиларилсульфонаты, алкилсульфаты, алкилсульфонаты, сульфаты жирных спиртов, жирных кислот и сульфатированные гликолевые эфиры жирных спиртов, а также конденсаты сульфонированного нафталина и производных нафталина с формальдегидом, конденсаты нафталина или нафталинсульфоновой кислоты с фенолом и формальдегидом, полиоксиэтиленоктилфеноловый эфир, этоксилированный изооктилфенол, октилфенол, нонилфенол, эфиры алкилфенолполигликоля, эфир трибутилфенилполигликоля, эфир тристеарилфенилполигликоля, алкиларилполиэфирные спирты, конденсаты этиленоксида со спиртами и жирными спиртами, этоксилированное касторовое масло, полиоксиэтиленалкиловые эфиры, этоксилированный полиоксипропилен, ацеталь полигликолевого эфира лаурилового спирта, сложные эфиры сорбита, лигносульфитный отработанный щелок и метилцеллюлоза.
Веществами, которые подходят для получения непосредственно разбрызгиваемых растворов, эмульсий, паст или масляных дисперсий, являются фракции минерального масла с точкой кипения от среднего до высокого значения, такие как керосин или дизельное топливо, кроме того, каменноугольные смолы и масла растительного или животного происхождения, алифатические, циклические и ароматические углеводороды, например, толуол, ксилол, парафин, тетрагидронафталин, алкилированные нафталины или их производные, метанол, этанол, пропанол, бутанол, циклогенсанол, циклогексанон, изофорон, высоко полярные растворители, например, диметилсульфоксид, ^метилпирролидон или вода.
Также в препарат могут быть добавлены антифризы, такие как глицерин, этиленгликоль, пропиленгликоль и бактерицидные средства.
Подходящими противопенными средствами являются, например, противопенные средства на осно- 29 025843 ве кремния или стеарата магния. Препараты для обработки семян дополнительно могут содержать связывающие средства и необязательно красители.
Связывающие средства могут быть добавлены для улучшения адгезии активных вещества на семенах после обработки. Подходящими связывающими средствами являются поверхностно-активные вещества на основе блок-сополимеров ЕО/РО, а также поливиниловые спирты, поливинилпирролидоны, полиакрилаты, полиметакрилаты, полибутены, полиизобутилены, полистирол, полиэтиленамины, полиэтиленамиды, полиэтиленимины (Ьирако1®, Ро1утш®), полиэфиры, полиуретаны, поливинилацетат, тилоза и сополимеры, полученные из таких полимеров.
Необязательно в препарат также могут быть включены красители. Подходящими красителями для препаратов, используемых для обработки семян, являются родамин В, С.1. пигмент красный 112, С.1. растворитель-красный 1, пигмент синий 15:4, пигмент синий 15:3, пигмент синий 15:2, пигмент синий 15:1, пигмент синий 80, пигмент желтый 1, пигмент желтый 13, пигмент красный 112, пигмент красный 48:2, пигмент красный 48:1, пигмент красный 57:1, пигмент красный 53:1, пигмент оранжевый 43, пигмент оранжевый 34, пигмент оранжевый 5, пигмент зеленый 36, пигмент зеленый 7, пигмент белый 6, пигмент коричневый 25, основной фиолетовый 10, основной фиолетовый 49, кислый красный 51, кислый красный 52, кислый красный 14, кислый синий 9, кислый желтый 23, основной красный 10, основной красный 108.
Примером подходящего гелеобразующего средства является карраген (8аДаде1®). Порошки, вещества для рассеивания и распыляемые продукты могут быть получены смешиванием или совместным измельчением активных веществ с твердым носителем.
Гранулы, например, гранулы с покрытием, гранулы пропиткой и гомогенные гранулы, могут быть получены связыванием активных соединений с твердыми носителями. Примерами твердых носителей являются минералы, такие как силикагели, силикаты, тальк, каолин, аттапульгит, известняк, известь, мел, железистая известковая глина, лесс, глина, доломит, диатомовая земля, сульфат кальция, сульфат магния, оксид магния, измельченные синтетические материалы, удобрения, такие как, например, сульфат аммония, фосфат аммония, нитрат аммония, мочевины и продукты растительного происхождения, такие как мука из злаков, мука из древесной коры, древесная мука и мука из ореховой скорлупы, целлюлозные порошки и другие твердые носители.
В общем, препараты содержат от 0,01 до 95 мас.%, предпочтительно от 0,1 до 90 мас.% АНА8ингибирующего гербицида. В данном случае применяют АНА8-ингибирующие гербициды с чистотой от 90 до 100 мас.%, предпочтительно от 95 до 100 мас.% (согласно ЯМР-спектру). В целях обработки семян соответствующие препараты можно разбавить в 2-10 раз, получая концентрации в готовых к применению препаратах от 0,01 до 60 мас.% активного соединения, предпочтительно от 0,1 до 40 мас.%.
АНА8-ингибирующий гербицид может быть использован как таковой, в форме препаратов или в виде полученных из них форм для применения, например в форме непосредственно разбрызгиваемых растворов, порошков, суспензий или дисперсий, эмульсий, масляных дисперсий, паст, распыляемых продуктов, веществ для рассеивания или гранул, с помощью разбрызгивания, распыления, опыливания, рассеивания или заливки. Формы для применения полностью зависят от предполагаемых целей; они должны в каждом случае гарантировать наилучшее распределение АНА8-ингибирующего гербицида согласно изобретению.
Применяемые водные формы могут быть получены из концентратов эмульсий, паст или смачиваемых порошков (распыляемых порошков, масляных дисперсий) посредством добавления воды. Чтобы получить эмульсии, пасты или масляные дисперсии вещества как таковые или растворенные в масле или растворителе могут быть гомогенизированы в воде с использованием увлажнителя, вещества для повышения клейкости, диспергирующего средства или эмульгатора. Однако также можно получать концентраты, состоящие из активного вещества, увлажнителя, вещества для повышения клейкости, диспергирующего средства или эмульгатора, и в соответствующем случае растворителя или масла, и такие концентраты являются подходящими для разбавления водой.
Количества концентратов активного соединения в готовых к применению препаратах могут варьировать в относительно широких диапазонах. В общем они составляют от 0,0001 до 10%, предпочтительно от 0,01 до 1 мас.%.
АНА8-ингибирующий гербицид также можно успешно применять в способе, основанном на использовании сверхмалых объемов (ЦЬУ), и при этом можно применять препараты, содержащие более 95 мас.% активного соединения, или даже применять активное соединение без добавок.
Далее приведены примеры препаратов
1. Продукты для разбавления водой в случае внекорневой обработки. В целях обработки семян такие продукты можно наносить на семена разбавленными или неразбавленными.
А) Растворимые в воде концентраты (8Ь, Ь8)
Десять частей по массу АНА8-ингибирующего гербицида растворяют в 90 массовых частей воды или водорастворимого растворителя. В качестве альтернативы добавляют увлажнители или другие вспомогательные вещества. АНА8-ингибирующий гербицид растворяется при разбавлении водой, при этом
- 30 025843 получают препарат, содержащий 10% (мас./мас.) АНАЗ-ингибирующего гербицида.
B) Диспергируемые концентраты (ЭС)
Двадцать массовых частей АНАЗ-ингибирующего гербицида растворяют в 70 массовых частях циклогексанона с добавлением 10 массовых частей диспергирующего агента, например поливинилпирролидона. Разбавление водой дает дисперсию, при этом получают препарат, содержащий 20% (мас./мас.) АНАЗ-ингибирующего гербицида.
C) Эмульгируемые концентраты (ЕС)
Пятнадцать массовых частей АНАЗ-ингибирующего гербицида растворяют в 7 массовых частях ксилена с добавлением додецилбензолсульфоната кальция и этоксилата касторового масла (в каждом случае 5 массовых частей). Разбавление водой дает эмульсию, при этом получают препарат, содержащий 15% (мас./мас.) АНАЗ-ингибирующего гербицида.
Ό) Эмульсии (Е\У. ЕО, ЕЗ) Двадцать пять массовых частей АНАЗ-ингибирующего гербицида растворяют в 35 массовых частях ксилена с добавлением с добавлением додецилбензолсульфоната кальция и этоксилата касторового масла (в каждом случае 5 массовых частей). Полученную смесь вводят в 30 массовых частей воды с помощью эмульгирующего устройства (например, И1!га!иггах) и получают гомогенную эмульсию. Разбавление водой дает эмульсию, при этом получают препарат, содержащий 25% (мас./мас.) АНАЗ- ингибирующего гербицида.
Е) Суспензии (ЗС, 0Ό, РЗ)
Во встряхиваемой шаровой мельнице измельчают 20 массовых частей АНАЗ-ингибирующего гербицида с добавлением 10 массовых частей диспергирующих средств, увлажнителей и 70 массовых частей воды или органического растворителя, получая тонкодисперсную суспензию АНАЗ-ингибирующего гербицида. Разбавление водой дает стабильную суспензию АНАЗ-ингибирующего гербицида, при этом получают препарат, содержащий 20% (мас./мас.) АНАЗ-ингибирующего гербицида.
Р) Диспергируемые в воде гранулы и водорастворимые гранулы (\УС, ЗС)
Пятьдесят массовых частей АНАЗ-ингибирующего гербицида тонко измельчают с добавлением 50 массовых частей диспергирующих средств и увлажнителей и получают в виде диспергируемых в воде или водорастворимых гранул с помощью технических устройств (например, с помощью экструзии, скруббера с разбрызгивающим устройством, псевдоожиженного слоя). Разбавление водой дает стабильную дисперсию или раствор АНАЗ-ингибирующего гербицида, при этом получают препарат, содержащий 50% (мас./мас.) АНАЗ-ингибирующего гербицида.
С) Диспергируемые в воде порошки и водорастворимые порошки (\УР, ЗР, ЗЗ, \УЗ)
Семьдесят пять массовых частей АНАЗ-ингибирующего гербицида измельчают в роторностаторной мельнице с добавлением 2 5 массовых частей диспергирующих средств, увлажнителей и силикагеля. Разбавление водой дает стабильную дисперсию или раствор АНАЗ-ингибирующего гербицида, при этом получают препарат, содержащий 75% (мас./мас.) АНАЗ-ингибирующего гербицида.
I) Гелевый препарат (СР)
Во встряхиваемой шаровой мельнице измельчают 20 массовых частей АНАЗ-ингибирующего гербицида с добавлением 10 массовых частей диспергирующих средств, 1 массовой части гелеобразующих средств и 70 массовых частей воды или органического растворителя, получая тонкодисперсную суспензию АНАЗ- ингибирующего гербицида. Разбавление водой дает стабильную суспензию АНАЗингибирующего гербицида, при этом получают препарат, содержащий 20% (мас./мас.) АНАЗингибирующего гербицида. Указанный гелевый препарат подходит для применения при обработке семян.
2. Продукты, применяемые неразбавленными для некорневых обработок. В целях обработки семян такие продукты можно наносить на семена разбавленными.
A) Распыляемые порошки (ΌΡ, ОЗ)
Пять массовых частей АНАЗ-ингибирующего гербицида тонко измельчают и тщательно смешивают с 95 массовыми частями тонкодисперсного каолина. При этом получают распыляемый продукт, содержащий 5% (мас./мас.) АНАЗ-ингибирующего гербицида.
B) Гранулы (СК, РС, СС, МС)
Половину массовой части АНАЗ-ингибирующего гербицида тонко измельчают и объединяют с 95,5 массовыми частями носителей, при этом получают препарат, содержащий 0,5% (мас./мас.) АНАЗ- ингибирующего гербицида. Используют имеющиеся в настоящее время способы экструзии, сушки с распылением или ожиженного слоя. При этом получают гранулы, которые используют неразбавленными при внекорневой обработке.
Обычные препараты для обработки семян включают, например, текучие концентраты РЗ, растворы ЬЗ, порошки для сухой обработки ОЗ, диспергируемые в воде порошки для обработки взвесями \УЗ, растворимые в воде порошки ЗЗ и эмульсии ЕЗ и ЕС и гелевый препарат СР. Такие препараты можно использовать для обработки семян разбавленными или неразбавленными. Обработку семян осуществляют перед посевом или непосредственно наносят на семена.
В предпочтительном варианте для обработки семян используют препарат РЗ. Обычно препарат РЗ может содержать 1-800 г/л активного ингредиента, 1-200 г/л поверхностно-активного вещества, от 0 до
- 31 025843
200 г/л антифриза, от 0 до 400 г/л связывающего средства, от 0 до 200 г/л пигмента и до 1 л растворителя, предпочтительно воды.
Настоящее изобретение относится к нетрансгенным и трансгенным семенам резистентных гербицидам растений согласно настоящему изобретению. Такие семена включают, например, нетрансгенные семена Вгаккюа, обладающие признаками резистентности к гербицидам растения 105Ζ-07801, Й04Е-0139, 104Е-0130 или Й04Е-0122, и трансгенные семена, содержащие молекулу полинуклеотида согласно изобретению, которая кодирует резистентный к гербицидам белок АНАЗЫ.
В случае обработки семян семена резистентных к гербицидам растений согласно настоящему изобретению обрабатывают гербицидами, предпочтительно гербицидами, выбранными из группы, состоящей из АНАЗ-ингибирующих гербицидов, таких как амидосульфурон, азимсульфурон, бенсульфурон, хлоримурон, хлорсульфурон, циносульфурон, циклосульфамурон, этаметсульфурон, этоксисульфурон, флазасульфурон, флупирсульфурон, форамсульфурон, галосульфурон, имазосульфурон, йодсульфурон, мезосульфурон, метсульфурон, никосульфурон, оксасульфурон, примисульфурон, просульфурон, пиразосульфурон, римсульфурон, сульфометурон, сульфосульфурон, тифенсульфурон, триасульфурон, трибенурон, трифтоксисульфурон, трифлусульфурон, тритосульфурон, имазаметабенз, имазамокс, имазапик, имазапир, имазахин, имазетапир, клорансулам, диклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам, пенокссулам, биспирибак, пириминобак, пропоксикарбазон, флукарбазон, пирибензоксим, пирифталид, пиритиобак и их смеси, или препаратом, содержащим АНАЗ-ингибирующий гербицид.
Термин обработка семян включает в себя все подходящие способы обработки семян, известные в данной области, такие как протравливание семян, дражирование семян, опудривание семян, намачивание семян и пеллетирование семян.
Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения дополнительным объектом изобретения является способ обработки почвы, в частности внесением в рядовую сеялку: либо гранулярного препарата, содержащего АНАЗ-ингибирующий гербицид, в виде композиции/препарат, например, гранулярного препарата, необязательно с одним или несколькими твердыми или жидкими приемлемыми для сельского хозяйства носителями и/или необязательно с одним или несколькими приемлемыми для сельского хозяйства поверхностно-активными веществами. Такой способ преимущественно применяют, например, для обработки почвы, приготовленной для посева зерновых, кукурузы, хлопчатника и подсолнечника.
Настоящее изобретение также относится к семенам, покрытым или содержащим препарат для обработки семян, содержащий по меньшей мере один АЬЗ-ингибитор, выбранный из группы, состоящей из амидосульфурона, азимсульфурона, бенсульфурона, хлоримурона, хлорсульфурона, циносульфурона, циклосульфамурона, этаметсульфурона, этоксисульфурона, флазасульфурона, флупирсульфурона, форамсульфурона, галосульфурона, имазосульфурона, йодсульфурона, мезосульфурона, метсульфурона, никосульфурона, оксасульфурона, примисульфурона, просульфурона, пиразосульфурона, римсульфурона, сульфометурона, сульфосульфурона, тифенсульфурона, триасульфурона, трибенурона, трифтоксисульфурона, трифлусульфурона, тритосульфурона, имазаметабенза, имазамокса, имазапика, имазапира, имазахина, имазетапира, клорансулама, диклосулама, флорасулама, флуметсулама, метосулама, пенокссулама, биспирибака, пириминобака, пропоксикарбазона, флукарбазона, пирибензоксима, пирифталида, пиритиобака.
Термин семя охватывает семена и участвующие в размножении части растений всех видов, включая без ограничения настоящие семена, кусочки семян, корневые отпрыски, клубнелуковицы, луковицы, плоды, клубни, зерно, черенки, отрезки и тому подобное, и в предпочтительном варианте термин означает настоящие семена.
Термин покрытый и/или содержащий, в общем, означает, что активный ингредиент главным образом находится на поверхности продукта размножения во время применения, хотя большая или меньшая часть ингредиента может проникать в продукт размножения, в зависимости от способа применения. Когда указанный продукт размножения снова высевают, он может поглощать активный ингредиент.
Проведение обработки семян АНАЗ-ингибирующим гербицидом или препаратом, содержащим АНАЗ-ингибирующий гербицид, осуществляют опрыскиванием или опудриванием семян перед посевом растений и перед всходами растений.
При обработке семян соответствующие препараты применяют в виде обработки семян эффективным количеством АНАЗ-ингибирующего гербицида или препарата, содержащего АНАЗ-ингибирующий гербицид. В данном случае нормы внесения обычно составляют от 0,1 г до 10 кг активного ингредиента (или смеси активного ингредиента или препарата) на 100 кг семян, предпочтительно от 1 г до 5 кг на 100 кг семян, в частности, от 1 г до 2,5 кг на 100 кг семян. В случае конкретных сельскохозяйственных культур, таких как салат-латук, норма может быть выше.
Настоящее изобретение относится к способу борьбы с нежелательными растениями или борьбы с сорняками, включающему в себя осуществление контакта семян резистентных растений согласно настоящему изобретению перед посевом и/или после предварительного проращивания АНАЗингибирующим гербицидом.
Способ дополнительно может включать в себя посев семян, например, в почву на поле или в среду
- 32 025843 для горшечных культур в теплице. Способ имеет особое применение для борьбы с нежелательными растениями или борьбы с сорняками, находящимися в непосредственной близости с семенами.
Подразумевается, что борьба с нежелательными растениями означает уничтожение сорняков и/или иным образом замедление или ингибирование нормального роста сорняков. Подразумевают, что сорняки в широком смысле означают все растения, которые растут с тех местах, где они нежелательны.
Сорняки согласно настоящему изобретению включают, например, двудольные и однодольные сорняками. К двудольным сорнякам без ограничения относятся сорняки родов: БитарС, Ьерйшт, СаПит, Б1е11апа, МаПасапа, АтНетк, СаПпкода, СНепороОшт, ИгПса, Бепесю, Атагаййик, Ройи1аса, ХаШНтт, Сопуо1уи1ик, 1ротоеа, Ро1удопит, БекЪата, ЛтЪго51а, Сшкшт, СагОиик, БопсНик, Бо1апит, Копрра, Ко1а1а, ЬшОегта, Ьатшт, Уеготса, ЛЪиί^1ои, Етех, Эа1ига, Ую1а, Са1еорк1к, Рарауег, СеШаигеа, ТпГоПит, Капипси1ик и Тагахасит. К однодольным сорнякам без ограничения относятся сорняки родов: ЕсЫпосЫоа, Бе1апа, Рашсит, О1дПапа, РН1еит, Роа, ЕекШса, Е1еикше, ВгасЫапа, Ьо1шт, Вготик, Ауепа, Сурегик, БогдНит, Адгоругоп, СупоОоп, МопосНопа, ЕНпЬпк1укПк, БадШапа, Е1еосНапк, Багрик, Ракра1ит, 1ксНаетит, БрНепос1еа, Оас1у1ос1ешит, АдгокИк, А1оресигик и Арега.
Кроме того, сорняки согласно настоящему изобретению могут включать, например, культурные растения, которые растут в нежелательном месте. Например, самосевное растение кукурузы, которое находится на поле, на котором преимущественно растут растения сои, можно считать сорняком, если растение кукурузу нежелательно на поле с растениями сои.
Упоминание слов в единственном числе используют в настоящем описании по отношению к одному или больше чем одному (т.е. по меньшей мере к одному) грамматическому объекту в описании. В качестве примера, элемент означает один или несколько элементов.
В используемом в настоящем описании смысле слово содержащие или его варианты, такие как содержит или содержащий следует понимать как означающее включение указанного элемента, целого числа или стадии или группы элементов, целых чисел или стадий, но не исключение какого-либо другого элемента, целого числа или стадии, или группы элементов, целых чисел или стадий.
Следующие примеры предлагаются в целях иллюстрации, но не в целях ограничения.
Пример 1. Анализ фермента АНАБ ш уйго Анализ фермента АНАБ представляет собой быстрый колориметрический способ, который используют для количественной оценки уровней устойчивости разных образцов посредством измерения уровня активности фермента АНАБ в присутствии ингибиторов АНАБ, как описано в Бшдй е( а1. (Апа1. Вюсйет. 171: 173-179, 1988). Применяют два типа тестов: основной тест с использованием только одного ингибитора и усиленный тест, который требует использования двух ингибиторов. Оба теста показывают уровни устойчивости к имидазолинону, при этом усиленный тест дает возможность точно определять незначительные различия в уровнях устойчивости между некоторыми линиями растений. Исходный раствор для анализа АНАБ содержит: 0,2 М однозамещенный фосфат натрия+0,2 М двузамещенный фосфат натрия+50 мМ 1,1-циклопропандикарбоновую кислоту (СРСА)+полный состав основных солей Мурасиге и Скуга+1 мМ имазамокс (АС 299263 технической чистоты)+5% Н2Б04+2 М №0Н+2,5% а-нафтол+0,25% креатин в 1 М фосфатном буфере, рН 6,0.
Конечные растворы для анализа АНАБ представляют собой три типа растворов: Раствор А содержит: 10 мМ фосфатный буфер+10% среда М & Б+500 мкМ СРСА+0,5% Ь-аланин+50 мМ пируват. Раствор В содержит: раствор А+2,5 мкМ имазамокс. Раствор С содержит: раствор В+0,2 мкМ хлорсульфурон.
Основной тест АНАБ: Ингибитор имазамокс
Тест проводили в 96-луночных планшетах. Каждый 96-луночный планшет находился в камере на 19-21 образцов, включая контроли. Каждая лунка содержала 100 мкл АНАБ-буфера, который описан ниже. В вытяжном шкафу с ламинарным потоком стерильный АНАБ-буфер асептически переносили в две лунки для растворов, промаркированных А и В. В лунку В добавляли имазамокс из исходного раствора, который имел концентрацию 2,5 мкМ. 100 мкл раствора А переносили во все нечетные ряды на каждом планшете, и 100 мкл раствора В переносили во все четные ряды.
Фаза 1. Отбор образцов
Четыре диска вырезали с нижней части наименьшей листовой пластинки десятидневных саженцев, используя сверло для пробок. Образцы растений брали перед стадией стрелкования, так как после указанной стадии роста активируется другой ген АНАБ, следовательно, потенциально возможно получение ложных результатов. После вырезания диски переносили в лунки планшета для микротитрования, содержащие растворы А и В.
После заполнения всего планшета для микротитрования его инкубировали при люминесцентном освещении и комнатной температуре в течение 14-18 ч. Для остановки инкубации после указанного периода времени планшеты замораживали в морозильной камере при -80°С.
Фаза 2. Реакция
АН^АБ-планшеты вынимали из морозильной камеры с температурой -80°С и размораживали при комнатной температуре или при 60°С в инкубаторе. В каждую лунку добавляли двадцать пять микролитров 5% Н2Б04. Планшеты после подкисления инкубировали при 60°С до тех пор, пока все диски не становились коричневыми, примерно в течение 15 мин. В течение этого периода времени готовили раствор
- 33 025843 нафтола и затем в каждую лунку добавляли 150 мкл раствора α-нафтола/креатина. Каждый планшет инкубировали при 60°С в течение 15 мин. После инкубации визуально сравнивали различия в активности АНАЗ между образцами, обработанными имидазолиноном, и образцами, не обработанными имидазолиноном. Интенсивность красной окраски в результате проявления активности АНАЗ измеряли, используя считывающее устройство для планшетов для микротитрования, получая количественное значение для образцов, обработанных и не обработанных имидазолиноном.
Оптическую плотность в каждой лунке регистрировали при 530 нм. При таких параметрах получали значение, которое отображает интенсивность красного. Полученную интенсивность красного переводили в количественное значение активности АНАЗ в каждой лунке. Когда активность АНАЗ в лунке, содержащей данный образец с добавлением имазамокса, делили на активность АНАЗ в контроле, то получали отношение в виде активности АНАЗ в процентах от контроля.
Усиленный тест АНАЗ: Ингибиторы имазамокс и хлорсульфурон
Введение хлорсульфурона, ЗИ, в тесте АНАЗ основано на свойстве устойчивости генов РМ1 и ЬК. РМ1 и ЬК не устойчивы к ЗИ, тогда как РМ2 проявляет определенную устойчивость ко ЗИ. Отношение, полученное при делении активности ЗИ на активность имазамокса дает уникальное значение для всех четырех уровней устойчивости (РМ1/РМ2, РМ2, РМ1, ^Т).
Результаты показаны на фиг. 3 для ЬК, РМ2 и ЬК/РМ2 у В. _)ипсеа при ингибировании имазамоксом и хлорсульфуроном.
Активность фермента АНАЗ для разных сочетаний мутаций у В. _)ипсеа в присутствии имазамокса Активность фермента АНАЗ в белковых экстрактах гомозиготных дигаплоидных (ИН) линий В. _)ипсеа, содержащих разные сочетания мутаций (аК х ЬК, РМ2 х А107Т, РМ2 х ЬК, А104Т х ЬК) измеряли в виде процента активности от активности в необработанном (0 мкМ имазамокса) образце. В качестве контроля также были включены белковые экстракты из трех линий В. парик: В. парик РМ1, В. парик РМ2 и В. парик РМ1/РМ2. Результаты для указанных мутантных сочетаний и проверки при концентрации имазамокса 100 мкМ показаны на фиг. 6.
Пример 2. Тестирование устойчивости к гербицидам в теплице
Проведение первого эксперимента планировалось для определения того, имеются ли различи в устойчивости к гербициду имидазолинону между линиями В. _)ипсеа, содержащими один ген (ЬК или РМ2) и два гена (ЬК/РМ2), и линией В. парик, содержащей два гена (РМ1/РМ2).
Шесть отдельных растений из каждой линии подвергали обработке опрыскиванием. Имидазолиноновый гербицид Обуккеу® наносили в дозе 1х (17 г активного ингредиента/акр (0,4 га)), 2х (34 г активного ингредиента/акр (0,4 га)) и 3х (51 г активного ингредиента/акр (0,4 га)) на стадии 2-3 листьев. Растения опрыскивали на стадии 2-3 листьев примерно через 14 дней после посадки. Давление в камере для опрыскивания устанавливали при 40 фунтах на кв. дюйм (0,279 МПа) и скорость устанавливали на значении 80 (34,98 л/акр (0,4 га)). Для получения 25 мл исходного раствора Обуккеу® проводили следующий расчет: 17х0,025/34,98=0,1215 г гранул Обуккеу®. Расчет был основан на следующих допущениях: количество Обуккеу®, необходимого на акр (0,4 га) составляло 17 г; и 8,33 мл раствора подается за каждый проход из камеры для опрыскивания. Мегде® добавляли в соотношении 0,5 л/100 л или 0,000125 л или 125 мкл. После опрыскивания растения случайным образом распределяли на поддонах. Растения оценивали по визуальному повреждению (через 7-10 дней после опрыскивания) согласно следующему рейтингу:
1) растения, у которых не наблюдается никакого повреждения;
2) растения, у которых наблюдается обесцвечивание листьев или небольшое скручивание листьев;
3) растения, у которых наблюдается сильное обесцвечивание листьев (например, листья становятся желтыми или багровыми), а также наблюдается некоторое базальное ветвление;
4) растения, у которых наблюдается сильное повреждение, приводящее к гибели или тяжелой задержке развития Рост растения и биомассу (массу растения) измеряли после появления повреждения. Проводили сравнения между растениями после обработки опрыскиванием и контролями для каждого сорта. Результаты показаны в табл. 1.
- 34 025843
Таблица 1. Измерения повреждений гербицидом линий В. _)ипсеа, содержащих ЪК и/или РМ2, по сравнению с контролем В. парик РМ1/РМ2
N=6 для всех точек получения данных
Опрыскивание Повреждение Высота растений Масса растений
Сорт Норма внесения (1-4) (см) (% от хонтроля) (г) (% от контроля)
Коммерческий В. парие 0 1,0 1,3 100,0 1,120 100,0
(РМ1+РМ2) 1,0 6,0 81,4 1,020 91, 1
3 1,1 5,5 75, 4 1,130 1,200 100,9
В. зипсеа σ03Ζ-16413 0 1,0 8, 1 100,0 100,0
(РМ2) 1,0 7,3 90, 4 1,160 96, 7
В. зипсеа .Ι05Ζ-00791 (ЬК+РМ2) В. зипсеа ХД04-057-034 (ЬК+Ш2) В. зипсеа 304Е-0044 (ЬК) В. зипсеа Ατίύ 3 0 3 0 3 0 1 3 0 1,6 1,0 1,0 1, 1 1,0 1,0 1,2 1,0 1,4 2,6 1,0 6,4 6, 1 6,2 5.6 7.6 7,0 5,3 7,0 6.6 3.1 7.2 78, 8 100,0 101,0 91,0 100,0 92,2 70,5 100,0 94,1 44, 3 100,0 1,200 0,690 0,750 0,850 1,230 1, 210 1,250 0,780 0,750 0, 290 1, 080 100,0 100,0 108,7 123.2 100,0 98, 4 101,6 100,0 96, 2 37.2 100,0
(дикий тип) 1 3,3 2,7 37, 5 0,090 8,3
3 3,8 2,7 37, 1 0,040 3, 7
Проведение второго эксперимента планировалось для сравнения разных мутаций, ЪК, ЪК/РМ2, РМ2, аК, А104Т и А107Т у В. _)ипсеа при обработке разными дозами имазамокса в теплице. Образцы, используемые для тестирования опрыскивания имазамоксом (второй эксперимент в теплице), показаны в табл. 2 ниже.
Таблица 2. Линии В. )ипсеа, используемые во втором эксперименте в теплице
Двенадцать отдельных растений каждой линии подвергали обработке на определенном уровне, как показано в табл. 3. Проводили 7 обработок имазамоксом (Кар!ог®)+0,5% об./об Мегде®. Растения обрабатывали на стадии 1-2 настоящих листьев. Результаты показаны на фиг. 4.
Таблица 3. Уровни обработки
В другом эксперимента в теплице получали линии ОН В. _)ипсеа в результате скрещивания между линиями В. _)ипсеа, которые содержал мутацию АНА8 в геноме А (аК, А104Т или РМ2), и линиями В. _)ипсеа, которые содержали мутацию АНА8 в геноме В (ЪК, А107Т). Линии ОН, которые, как было подтверждено, были гомозиготными по мутациям как в геноме А, так и в геноме В (например, аК/ЪК или А104Т/ЪК и т.д.), отбирали для последующего тестирования устойчивости к гербициду в теплице с использованием 0, 35, 70 и 100 г активного ингредиента/га имазамокса (Кар!ог®+0,75% Мегде®). Фитоксичность оценивали по шкале от 0 до 9, где значение 0 эквивалентно отсутствию повреждения культуры,
- 35 025843 а 9 эквивалентно наличию тяжелого некроза растения, приводящего к гибели растения. Результаты в виде графиков фитотоксичности показаны на фиг. 8.
В случае таких сочетаний, при которых не идентифицировали дважды гомозиготной линии ОН (как в случае сочетания мутаций аК/А107Т), в теплице высевали сегрегирующую популяцию Р2. Каждую особь Р2 подвергали секвенированию, чтобы определить природу мутации и зиготность, и затем опрыскивали 35 г активного ингредиента/га имазамокса, чтобы определить соответствующий фенотип повреждения. Результаты определения взаимосвязи между генотипом и фенотипом повреждения культуры в случае мутаций аК и А107Т показаны на фиг. 7.
Пример 3. Тестирование устойчивости к гербицидам на поле
Четыре объекта В. _)цпсеа и один объект В. парик тестировали в испытаниях на основе плана с рандомизированными расщепленными блоками (4 повтора) в четырех местах в Северной Дакоте в отношении устойчивости к гербицидам (различные обработки смотрите в табл. 4) и урожайности. Делянки имели размер минимум 1,5 х 5 м, и на отдельных делянках проводили валкование и при созревании собирали урожай. Из четырех объектов исследования В. _)ипсеа один объект представлял собой линию РМ1/РМ2 В. _)ипсеа, которую получали в результате интрогрессии обеих мутаций РМ1 и РМ2 из Вгаккюа парик в Вгаккюа _)ипсеа с использованием обычной методики возвратного скрещивания с последующим самоопылением на протяжении двух поколений, чтобы получить гомозиготную линию В. _)ипсеа РМ1/РМ2. Другие три объекта В. _)ипсеа имели разные генотипы В. _)ипсеа, содержащие мутацию ЬК в геноме В вместе с мутацией РМ2. все линии ЬК/РМ2 В. _)цпсеа были гомозиготными по обеим мутациям. Объект В. парик представлял собой коммерческий контрольный сорт СЬЕАКИЕЬП®, гомозиготный по мутациям РМ1/РМ2. Оценку повреждения культур (% фитотоксичности) проводили через 5-7 дней после обработки (ЭЛТ) и через 18-24 ЭЛТ. Средняя фитотоксичность в процентах для одного из четырех местоположений представлена в табл. 5.
_ Таблица 4
Обработки: 1, Необработанные 2. 1х норма внесения следующих
гербицидных продуктов С1еаг£1е1с1®: 30 г активного Ос1у5зеу®+0, 5% (об./об.) для канолы ингредиента/га Мегде®
Объем опрыскивания: 100 литров/га
Стадия роста: 2-4 листа
СЕЕАКР1ЕЕП® и уникальное название СЕЕАКИЕЕП являются зарегистрированными торговыми марками ВАЗР
Таблица 5. Средняя фитотоксичность в процентах и средняя урожайность объектов исследования В. цтсеа РМ1/РМ2 и В. _)ипсеа ЬК/РМ2 после 1х обработки гербицидом 0йуккеу в одном местоположении в Велва, Северная Дакота
Средняя фитотоксичность Средняя фитотоксичность Средняя
Объект исследования Обработка в % через 5-7 дней после в % через 18-24 дня после урожайность
обработки обработки кг/га
В. ]11псеа РМ1/РМ2 Необработанные 0,00 0,00 896
В. париз РМ1/РМ2 Необработанные 0,00 0,00 1119
В.|ипсеа ЬКУРМ2 (5006) Необработанные 0,00 0,00 1217
В.рпсеа 6К/РМ2 (5007) Необработанные 0,00 0,00 1382
В.рпсеа ЬК?РМ2 (5008) Необработанные 0,00 0,00 1343
В. ]ипсеа РМ1/РМ2 1 х Одуззеу 48,75 50,00 351
В. париз РМ1/РМ2 1 х СМуззеу 13,75 3,75 910
В.)ипсеа ЬК/РМ2 (5006) 1 х Одуззеу 3,75 1,25 1231
В.)ипсеа ЬК/РМ2 (5007) 1 х Одуззеу 6,25 1,25 1334
В.]ипсеа ЬК/РМ2 (5008) 1 х О4уззеу 5,00 2,50 1527
5,01 3,40 254 ЬСО (Р=0,05)
13,96 СУ
Результаты в табл. 5 показывают, что мутации РМ1/РМ2, интрогрессированные в В. _)ипсеа, не обеспечивают устойчивости, достаточной для коммерческого применения. Значение фитотоксичности после обработки гербицидом (0йуккеу®) для линии РМ1/РМ2 В. _)ипсеа было в диапазоне от 25 до 50% во всех тестированных местоположениях (Уе1уа, Мойа11, Рагдо, НеШпдег), тогда как урожайность обработанного 0йуккеу® объекта РМ1/РМ2 В. _)ипсеа была снижена в среднем на 50% по сравнению с не опрыскиваемым объектом РМ1/РМ2 В. _)ипсеа. В случае объектов ЬК/РМ2 В. _)ипсеа (З006, З007, З008) не показана фитотоксичность при обработке 1х 0йуккеу® во всех тестированных местоположениях и не показано какое-либо существенное снижение урожайности. В случае объектов ЬК/РМ2 В. _)ипсеа также показана более низкие значения фитотоксичности, чем для объекта РМ1/РМ2 В. парик во всех местоположениях.
Подобным образом двадцать восемь разных объектов (генотипов) В. _)ипсеа, содержащих сочетан- 36 025843 ную мутацию ЬК/РМ2, вместе только с одним объектом В. ]ипсеа РМ2 (Ι03Ζ-16413) и одним коммерческим контрольным сортом СЬЕАКИЕЬО® В. парик, содержащим сочетанные мутации РМ1/РМ2, тестировали на поле в трех местоположениях, использовали план с рандомизированными целостными блоками (1 обработка) с 2 повторами, при этом средний размер делянки составлял 1,5 х 5 м. Использовали региональные нормы высева канолы, и нормы высева на отдельных делянках корректировали для достижения одинаковой плотности посева в каждом местоположении на основании массы 1000 семян каждого объекта. В данном испытании гербицид применяли по отношению ко всем объектам, как показано в таблице ниже.
Таблица 6. Обработка гербицидом
Обработки: 2х норна внесения следующего гербицидного продукта для канолы С1еаг£хеШ®: 70 г активного ингредиента/га ВеуопЛВиО, 5% (об./об.) Мегде®
Объем опрыскивания: 100 литров/га
Стадия роста: 2-4 листа
СЬЕАКИЕЬБ® и уникальное название СЬЕАКИЕЬБ являются зарегистрированными торговыми марками ВА8Р
Таблица 7. Агрономическая оценка кг/га % от контролем кг/га
Агрономическая
Повреждение
Дни цветения
Продолжительно сть цветения
Созревание
Высота
Полегание
Урожайность в килограммах на гектар, преобразованная из данных в граммах/делянку с использованием площади сбора урожая - 7% расчетная влажность
Относительная урожайность по сравнению средним значением для 4 контролем со
Урожайность в килограммах на гектар, преобразованная из данных в граммах/делянку с использованием площади сбора урожая - 7% расчетная влажность
Агрономическая оценка по шкале от 0 до 9, О означает очень плохо, 9 означает очень хорошо
Визуальная оценка повреждения в % на ранней стадии - 7-10 дней после опрыскивания ВеуоНс!®
Дни от посева до первого цветка
Дни от первого цветка до конца цветения
Дни от посева до созревания
Высота при созревании в см
Оценка полегания по шкале от 1 до 5, 1 означает отсутствие полегания, 5 означает значительное полегание
Таблица 8. Результаты тестирования на поле
Предварительное полевое испытание устойчивых к имидазолинону растений В^ипсеа
Суммарные данные для 3 местоположений (Канада, год 1), 2 повтора для каждого местоположения, все делянки опрыскивали 2 < Веуопб
Контроль равен объект 2 (коммерческая линия С1еагЯе1<№>, СЬ. В. парив: РМ1/РМ2)
Гербицид 7
Агрон. Повреждение Цветение Созревание Высота Полегание Урожайность
Название Мутационное событие Вид Объект (1-9) (%) (дни) (продолжи тельность.) (дни) (см) (1-5) (кг/га) (% от контроля: объект 2)
103Ζ-16413 РМ2 В. (ипсеа 1 3,6 19,2 48,7 20,0 95,5 127,7 2,2 2661,8 78,2
Коммерческий СЬВ. пария РМ1/РМ2 В. парий 2 6,8 12,3 47,2 14,9 91,5 120,9 1,8 3402,9 100,0
105Ζ-08310 Ы7РМ2 В. }ипсеа 3 5,6 2,7 45,3 17,1 91,8 142,6 1,2 3468,4 103,9
.Ι05Ζ-08333 ЪК/РМ2 В. }ипсеа 4 5,3 2.0 46,2 16,8 92,1 142,7 1,5 3696,9 108.6
.Ι05Ζ-Ο8347 ЫГРМ2 В.^ипсеа 5 6,0 2.0 45,0 17,7 90,0 137,6 1,6 3685,3 108,3
105Ζ-08433 6К/РМ2 В. }ипсеа 6 6,3 1,7 44,2 18,1 89,3 139,8 1,3 3555,9 104,5
305Ζ-07317 ЫГРМ2 В. рпсеа 7 5,2 2,7 45,3 17,1 92,3 147,9 1-4 3492,4 102,6
Ι05Ζ-07322 6К/РМ2 В. рпсеа 8 5,0 з,} Ц,0 17,5 88,9 143,4 1,8 3248,3 95,5
305Ζ-07366 6К/РМ2 ВПипсеа 9 5,7 2,3 43,4 18,5 91,3 150,6 1,5 4082,3 120,0
105Ζ-09273 6К/РМ2 В. рпсеа 10 6,5 2,7 44,2 15,2 89,7 148,2 1,5 3754,5 110,3
105Ζ-06609 ЬК/РМ2 В. ]ипсеа и 5,7 2,3 43,1 17,3 90,4 146,4 1,6 4315,7 126,8
105Ζ-07756 6К/РМ2 В. (ипсеа 12 6,1 7,7 44,2 17,7 89,5 136,6 1,2 3537,0 103,9
- 37 025843
105Ζ-07814 ЫСРМ2 В. }ипсеа 13 6,1 8,7 42,0 !8,2 87,7 137,0 1,7 3758,0 110,4
1Ο5Ζ-Ο783Ο 6К/РМ2 В. рпсеа 14 6,5 2,8 ,44,8 18,2 90,6 143,7 1,1 3642,5 107,0
1052-07848 6К/РМ2 В. )ипсеа 15 5,7 7.3 43,0 18,8 88,3 133,7 1,4 3570,0 104,9
105Ζ-07937 6К/РМ2 В. [ипсеа 16 6,2 5,0 43,2 17,2 89,7 132,7 1,6 3570,6 104,9
305Ζ-07952 ЫЗ/РМ2 В. )ипсеа 17 6,8 4,7 44,6 16,9 91,8 136,3 1,4 3545,1 104,2
.Ι05Ζ-07957 ιΑιγμ: В. ]ипсеа 18 5,9 2,0 44,4 18,3 89,9 139,6 1,2 3839,5 112,8
105Ζ-07975 ЫСРМ2 В. .(’ипсеа 19 5,3 3.0 41,8 16,9 89,9 128,6 2,0 3642,1 107,0
105Ζ-07984 ЬК/РМ2 В. ]ипсел 20 5,4 9,5 43,9 17,8 90,2 130,1 1,5 3637,3 106,9
105Ζ-07989 ЫЗ/РМ2 В. |ипсеа 21 7,3 2,3 44,3 18,0 89,9 134,0 1,2 3989,5 117,2
105Ζ-07994 ЫСНМ2 В. )ипсса 22 6,7 6,0 43,2 18,6 89,3 129,7 1,4 3710,6 109,0
105Ζ-08018 ЫСРМ2 В. рпсеа 23 7,3 1,7 43,3 18,6 88,8 129,2 1,4 3977,1 116,9
105Ζ-08029 ЫСРМ2 В. )ипсеа 24 6,5 2,0 45,0 18,3 92,2 143,1 1,1 3469,5 102,0
ί05Ζ-08045 ЬРУРМ2 В. ]ипсеа 25 5,9 2,3 43,0 182 92,1 131,2 1,5 3304,2 97,1
105Ζ-08122 ЬМ>М2 В. )ирсеа 26 6,8 2,3 43,4 16,0 87,9 131,6 1,2 3760,7 110,5
105Ζ-08131 5К/РМ2 В. ]ипсеа 27 5.2 4,7 42.3 15,5 88,1 129,7 2,0 3411,9 100,3
105Ζ-08Ι33 ЫСРМ2 В. }ипсеа 28 7.2 6,0 42,3 17,2 91,4 134,9 1,1 3947,6 116,0
105Ζ-08159 МСРМ2 В. ^илееа 29 6,8 4,7 43,2 17,6 88,4 135,1 1,3 3959,5 116,4
305Ζ-Ο819Ο ЬК/РМ2 В. ]ипсеа 30 7,1 4,3 43,5 16,1 88,6 123,3 12 3883,3 114,1
Средняя генеральная 6,0 4,7 44,1 17,5 90,2 136,2 м 3650,7
СУ 12,5 58,7 0,8 5,6 2,3 3,0 23.0 8,1
ьда 1,3 3,7 0,6 1,7 2,8 6,9 0,6 401,9
Два дополнительные разных объекта В. _)ипсеа (генотипы), содержащих сочетанные мутации ЬВ/РМ2. и один коммерческий контроль ^ΕΑΚΡΊΕΤΌ® В. парик, содержащий сочетанные мутации РМ1/РМ2, подвергали полевому испытанию в нескольких местоположениях на протяжении двух следующих друг за другом лет. Использовали региональные нормы высева канолы, и нормы высева на отдельных делянках корректировали для достижения одинаковой плотности посева в каждом местоположении на основании массы 1000 семян каждого объекта. В данном испытании гербицид (Веуопй®) применяли по отношению ко всем объектам, как показано в табл. 9 ниже.
__ ___Таблица 9
Повреждение Цветение Созревание Высота Урожайность
Местоположение Сорт Норма внесения 7-10 день 14-21 день (дни) (дни) (см) (кг/га)
Уеаг1
ОДЛгои$ В, париз контроль РМ1/РМ2 0,0 0,0 46 89,8 134,5 3867,1
^аггоиз В, париз контроль РМ1/РМ2 1* 8,3 0.0 46,3 87,8 132,5 4463,8*
АУа1гоиз В, париз контроль РМ1/РМ2 2* 12,5
5Уа1гоиз ,1057-08376 БК/РМ2 0,0 0,0 44.8 94,8 158,8 4661,7
5№игои$ .105Ζ-08376 БКУРМ2 1χ 0,0 0,0 45 93 156,8 4807,8
ЧУайоиз .1Ο5Ζ-Ο8376 БК/РМ2 2* 3,0
\¥аггоиз .1057-07784 БК/РМ2 0,0 0,0 43,8 94,3 151,3 4571,6
№а1го(1$ .Ϊ05Ζ-07784 БК/РМ2 1* 0,5 0,0 44,3 95,3 157,5 4870,7
\Уа1гоиз .Ϊ05Ζ-07784 БК/РМ2 2* 2,0
СУ (%) 7,4
Ь8О (0,05) 1,6 1,4 0,64 3,12 10,1 450,6
Ауопка В. париз контроль РМ1/РМ2 0,0 0,0 50,5 90,8 117,8 2940,7
ΑνοηΙββ В. париз контроль РМ1/РМ2 1* 2,5 0,0 50,5 90,5 115,8 3150,7
Ανοηίβα В. париз контроль РМ1/РМ2 2χ 7,0
А\оп1еа Д057-08376 ЫСРМ2 0,0 0,0 48,5 89,3 138,8 3295,4
Атоп1еа .1057-08376 БК/РМ2 1χ 1,5 0,5 48,3 90,3* 140,8 3608,4*
- 38 025843
- 39 025843
ЕуеЬгол' 305Ζ-08376 ЬК/РМ2 2χ 2,8 ι,ο 38,0 71,8 133,8* 2131,2
ЕуеЬгсм .Ι05Ζ-07784 ЬК/РМ2 0,0 0,0 39,0 72,3 134,8 1909,5
ЕуеЬгоху 105Ζ-07784 ЬК/РМ2 2χ 3,3 1,8 39,3 74,8 124,8* 1903.7
ЕуеЬгоку РМ2 РМ2 0,0 0,0 44,0 78,7 113,5 1434,4
ЕуеЬго\\ РМ2 РМ2 2χ 1,9 2,8 49,5* 82,3* 97,0* 742,4*
СУ (%) 9,7
ί,δϋ (0,05) 1,5 1,1 1,0 2,9 7,8 277,7
Уикап В. парик контроль РМ1/РМ2 0,0 0,0 88,0 103,8 3527,5
Уикап В. парик контроль РМ1/РМ2 2χ 1,0 0,5 88,0 101,9 3202,4
Уикап 5052-08376 ЬК/РМ2 0,0 0,0 89,8 123,8 4177,0
Уикап .Ι05Ζ-08376 ЬК/РМ2 2χ 6,3 2,8 85,0 118,8 3807,9
Уикап 5052-07784 ϋ-Κ/ΡΜ2 0,0 0,0 89,8 115,0 2995,2
Уикап 505Ζ-07784 ЬК/РМ2 2χ 13,8 н,з 88,5 108,8 2672,5
Уикап РМ2 РМ2 0,0 0,0 88,0 108,8 2566,2
Уикап РМ2 РМ2 2χ 42,5 26,3 91,5 100,6 2357,2
СУ (%) 13,3
ЕЗЭ (0,05) 12,0 9,6 5,2 16,4 619,6
Огкпеу В. парик контроль РМ1/РМ2 0,0 0,0 46,3 88,8 87,5 1407,3
Огкпеу В. парик контроль РМ1/РМ2 2χ 3,0 0,5 47,5 90,0 77,8* 1398,0
Огкпеу 505Ζ-08376 6КУРМ2 0,0 0,0 46,8 88,5 89,0 2028,8
Огкпеу 505Ζ-08376 6К/РМ2 2χ 9,3 5,0 47,3 92,0* 93,3 2000,8
Огкпеу 505Ζ-07784 ЬК/РМ2 0,0 0,0 47,3 91,3 91,3 2002,3
Огкпеу 505Ζ-07784 6К/РМ2 2χ 13,8 6:8 48,3 91,5 93,3 2062,8
Огкпеу РМ2 РМ2 0,0 0,0 49,0 90,3 80,3 1315,1
Огкпеу РМ2 РМ2 2χ 10,0 11,3 51,5* 99,5* 73,5 316,4*
СУ (%) 10,5
Ь50(0,05) 29,2 12,7 2,2 3,5 9,0 256,4
Напку В. парик контроль РМ1/РМ2 0,0 0,0 85,3 133,0 1084,6
Напку В. парик контроль РМ1/РМ2 5χ 16,5 14,8 89,5* 117,5* 1287,3
Напку 505Ζ-08376 ЬК/РМ2 0,0 0,0 90,3 144,0 1808,8
Напку 505Ζ-08376 6К/РМ2 5χ 41,5 21,5 88,5 143,0 1866,3
Напку 505Ζ-07784 ЬК/РМ2 0,0 0,0 90,8 134,0 1909,0
Напку 505Ζ-07784 6К/РМ2 5χ 24,3 14,3 91,0 129,3 1761,1
Напку РМ2 РМ2 0,0 0,0 94,0 122,3 1249,6
Напку РМ2 РМ2 5χ 26,5 74,5 99,5* 92,5* 746,2*
СУ (%) 16,0
Ь5О (0,05) 21,3 14,9 4,2 7,4 404,7
Данные о фитотоксичности в полевых условиях также получали для 3 разных линий, содержащих обе мутации ЬК и РМ2 (гомозиготных по ЬК/РМ2), и сравнивали с фитотоксичностью в полевых условиях для коммерческой линии В. парик, содержащей обе мутации РМ1 и РМ2 (гомозиготной по РМ1/РМ2). Указанные линии опрыскивали 1х ВΕΥΟN^® (35 г активного ингредиента/га имазамокса) и оценивали в отношении фитотоксичности через 7-10 дней после обработки (БАТ). Линию В. ]ипсеа дикого типа (т.е. не имеющую мутаций АНА8) также опрыскивали 1х ВΕΥΟN^® в качестве контроля. Результаты представлены в табл. 10 ниже.
___ Таблица 10
Полевой сезон 1 года - агрономические характеристики в. ^ипсеа, опрыскиваемых Ιχ Веуопй®
Фитотоксичность в % на 7-10 день после обработки
В. париз РМ1/РМ2 5,7
В. ^ипсеа ЬЕ/РМ2 5 002 1,2
В. эипсеа 6К/РМ2 3 003 2,4
В. ^ипсеа ЪВ/РМ2 3 006 2,8
- 40 025843
Сходную группу экспериментов проводили на четырех дополнительных линии В. щпсеа со средним содержанием олеиновой кислоты, которые содержали обе мутации ЬК и РМ2 (гомозиготные по ЬК/РМ2), опрыскиваемых 2х ВЕУ0НЭ®. Результаты представлены в табл. 11 ниже.
Таблица 11
Полевой сезон 1 года - агрономические характеристики линий В, Эипсеа, опрыскиваемых 2* Ββγοηό®
Фитотоксичность в % на 7-10 день после обработки
В. париз РМ1/РМ2 13,2
В. Щпсеа ЬК/РМ2 σ05Ζ-5105 4,2
В. Щпсеа 0Е/РМ2 305Ζ-7146 1,3
В. Щпсеа ЬЕ/РМ2 305Ζ07154 2,2
В. Щпсеа ЬЕ/РМ2 σθ5Ζ07160 2,3
Чтобы исследовать влияние сочетания мутаций ЬК и РМ2 вместе по сравнению с соответствующими отдельными мутациями проводили полевые испытания устойчивости к гербицидам на объектах В. щпсеа, содержащих либо мутацию РМ2 отдельно, либо мутацию ЬК отдельно, или объекты, содержащие обе мутации ЬК и РМ2. Все мутации были гомозиготными у всех объектов. Использовали план с рандомизированными полными блоками (4 обработки), состоящий из 3 повторов, со средним размером делянок 1,5 х 5 м. Использовали региональные нормы высева канолы, и нормы высева на отдельных делянках корректировали для достижения одинаковой плотности посева в каждом местоположении на основании массы 1000 семян каждого объекта. В данном испытании гербицид (Веуопй®, 1х доза составляла 35 г активного ингредиента/га) применяли по отношению ко всем объектам как показано в табл. 10 ниже. Линии В. щпсеа, имеющие одиночные или комбинированные признаки, обрабатывали гербицидом на уровне 0х, 1х, 2х или 4х, и оценивали на 10, 12, 14 или 28 день после обработки (ИАТ). Два разных человека оценивали фитотоксичность на 10, 12, 14 и/или 28 день после обработки соответствующими количествами гербицида (как показано в табл. 12: исследователь 1 по сравнению с исследователем 2). Результаты представлены в табл. 12 ниже.
Таблица 12
Средняя фитотоксичность в процентах (3 повтора)
Исследователь 1 Исследователь 2 Исследователь 1 Исследователь 1
Объект и доза гербицида 10 ВАТ 12 ОАТ 14 ϋΑΤ 2 8 ОАТ
ВК/РМ2 0х 0, 0 0, 0 0, 0 0, 0
ВК/РМ2 1* 4,0 7, 5 2,3 0,7
ЬЕ/РМ2 2* 11,7 10,8 10, 0 3,0
ВЕ/РМ2 4* 25, 0 21,7 28, 3 15, 0
РМ2 0х 0,0 0, 0 0, 0 0,7
РМ2 1« 11,7 17,5 6, 7 5,7
9М2 2* 35,0 28,3 35,0 33, 3
РМ2 4* 53, 3 36, 7 56, 7 65, 0
ЬЕ 0, 0 0, 0 0,0 0, 0
ЬЕ 1* 98,7 81,7 99, 3 99, 0
ЬЕ 2χ 100,0 85,0 99, 7 99, 3
ЬЕ 4χ 100,0 93,3 100, 0 73,3
СУ 16, 4 9, 5 19,0 48, 3
ьзо 10,2 5, 1 11,8 26, 9
Чтобы более четко продемонстрировать, что устойчивость линии с сочетанными мутациями ЬК/РМ2 выше, чем сумма устойчивости отдельных мутантных линий (повреждение культур или фитотоксичность показана в табл. 12), фактически полученную устойчивость к гербициду в процентах для сочетания ЬК/РМ2 сравнивали с суммой устойчивости к гербицидам в процентах линии с отдельной му- 41 025843 тацией ЬК и линии с отдельной мутацией РМ2 (предполагаемая устойчивость к гербициду) (табл. 13). При уровнях гербицида, которые ограничивают или подавляют отдельные мутации (наиболее заметно при 2х- и 4х-дозах), уровни устойчивости к гербицидам, наблюдаемые для линии с сочетанными мутациями ЬК/РМ2, превышают устойчивость к гербициду, получаемую при сложении двух отдельных значений устойчивости ЬК+РМ2 вместе. В линии с сочетанными мутациями ЬК/РМ2 наблюдается синергетический уровень устойчивости к гербициду, а не аддитивный уровень. Такой повышенный (синергетический) уровень устойчивости к имидазолинону наблюдали у более чем 30 разных генотипов В. _)ипсеа, содержащих сочетанные мутации ЬК/РМ2.
Таблица 13
Устойчивость к имидазолинону в процентах
Описание объекта 10 βΑΤ 12 βΑΤ 14 ОАТ 28 βΑΤ
ЬК/РМ2 Ох 100, 0 100,0 100, 0 100,0
БК/РМ2 1* 96, 0 92, 5 97,7 99, 3
ЬК/РМ2 2» 88,3 89, 2 90, 0 97,0
ЬК/РМ2 4* 75,0 78,3 71,7 85,0
РМ2 Ох 100, 0 100,0 100, 0 99, 3
РМ2 1х 88,3 82,5 93,3 94,3
РМ2 2 х 65,0 71,7 65,0 66,7
ΡΜΞ 4х 46,7 63, 3 43,3 35,0
ЬК Οχ 100,0 100,0 100, 0 100, 0
ЬК 1* 1,3 18,3 0, 7 1,0
ЬК 2* 0,0 15,0 0, 3 0,7
ЬК 4* 0,0 6,7 0, 0 26, 7
Устойчивость к имидазолинону, предполагаемая на основании отдельных испытаний
РМ2+ЬК 1* 89, 6 100,8 94,0 95, 3
РМ2+БК 2* 65, 0 86, 7 65, 3 67, 4
РН2+ЬК 4* 46, 7 70,0 43, 3 61,7
В заключение, показано, что синергетический или повышенный уровень устойчивости линий В. _)ипсеа ЬК/РМ2 больше, чем уровень устойчивости, наблюдаемый в линиях В. парик с сочетанными мутациями РМ1/РМ2, а также намного больше, чем устойчивость, наблюдаемая в линиях В. _)ипсеа с сочетанными мутациями РМ1/РМ2 (табл. 5). В линиях В. _)ипсеа ЬК/РМ2 не обнаружено какого-либо снижения урожайности при обработке имидазолиноновыми гербицидами, тогда как в линии В. _)ипсеа РМ1/РМ2 обнаружено значительное снижение урожайности при обработке коммерческими дозами имидазолинонового гербицида.
Все публикации и заявки на выдачу патента, упоминаемые в описании, являются показателем уровня специалистов в области, к которой относится изобретение. Все публикации и заявки на выдачу патентов включены в настоящее описание в виде ссылки в такой же степени, как в случае, когда специально и отдельно указано, что каждая отдельная публикация или заявка на выдачу патента включена в виде ссылки.
Хотя раскрытое выше изобретение описано подробно в качестве иллюстрации и примера в целях для лучшего понимания, будет очевидно, что в объеме прилагаемой формулы изобретения на практике могут быть осуществлены некоторые изменения и модификации.
- 42 025843
Список последовательностей <110> ВАЗЕ ЗЕ <120> РЕЗИСТЕНТНЫЕ К ГЕРБИЦИДАМ РАСТЕНИЯ ВКА551СА И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ <130> ВАЗЕЦЗ. Ю015МО <140> РСТ/0508/059241 .
<141> 2003-04-03 <150> 60/910008 <151> 2007-04-04 <160> 20 <170> РасепС1п Уег. 3.3 <210> 1 <211> 670 <212> Белок <213> АгаЫборзЬз сЬаНапа <400> 1
МеС А1а А1а А1а ТЬг ТЬг ТЬг ТЬг ТЬг ТЬе Зег Зег Зег Не Зег РЬе 15 10 15
Зег ТЬг Ьуз Рго Зег Рго Зег Зег Зег Ьуз Зег Рго Ьеи Рго 11е Зег 20 25 30
Агд РЬе Зег Ьеи Рго РЬе Зег Ьеи Азп Рго Азп Ьуз Зег Зег Зег Зег 35 40 45
Зег Агд Агд Агд С1у 11е Ьуз Зег Зег Зег Рго Зег Зег Не Зег А1а 50 55 60
Уа1 Ьеи Азп ТЬг ТЬг ТЬг Азп Уа1 ТЫ ТЬг ТЬг Рго Зег Рго ТЬг Ьуз 65 70 75 80
Рго ТЬг Ьуз Рго С1и ТЬг РЬе Не Зег Агд РЬе А1а Рго Азр С1п Рго 85 90 95
Агд Ьуз С1у А1а Азр Не Ьеи Уа1 С1и А1а Ьеи С1и Агд С1п С1у Уа1 100 105 110
С1и ТЬг Уа1 РЬе А1а Туг Рео С1у С1у А1а Зег Мес С1и Не Ηί5 С1п 115 120 125
А1а Ьеи ТЬг Агд Зег Зег Зег Не Агд Азп Уа1 Ьеи Рго Агд НЬз С1и 130 135 140
С1п С1у С1у Уа1 РЬе А1а А1а С1и С1у Туг А1а Агд Зег Зег С1у Ьуз
145 150 155 160
Рго С1у Не Суз Не А1а ТЬг Зег С1у Рго С1у А1а ТЬг Азп Ьеи Уа1
165 170 175
Зег С1у Ьеи А1а Азр А1а Ьеи Ьеи Азр Зег Уа1 Рго Ьеи Уа1 А1а Не 180 185 190
ТЬг С1у С1п Уа1 Рго Агд Агд МеС Не С1у ТЬг Азр А1а РЬе С1п С1и
195 2 00 20 5
ТЬг Рго Не Уа1 С1и Уа1 ТЬг Агд Бег Не ТЬг Ьуз Ηίδ Азп Туг Ьеи
210 215 220
Уа1 МеС Азр Уа1 С1и Азр Не Рго Агд Пе Не 61и С1и А1а РЬе РЬе
225 230 235 240
Ьеи А1а ТЬг Зег С1у Агд Рго 01 у Рго Уа1 Ьеи 7а 1 Азр Уа1 Рго Ьуз
245 250 255
Азр Не С1п С1п С1п Ьеи А1а Не Рго Азп Тгр С1и С1п А1а Мес Агд
260 265 270
Ьеи Рго О1у Туг МеС Зег Агд Мес Рго Ьуз Рго Рго С1и Азр Зег НЬЗ
275 280 285
Ьеи 01и СЬп Не Уа1 Агд Ьеи Пе Зег С1и Зег Ьуз Ьуз Рго Уа1 Ьеи
290 295 300
Туг Уа1 С1у С1у С1у Суз Ьеи Азп Зег Зег Азр С1и Ьеи С1у Агд РЬе
305 310 315 320
Уа1 С1и Ьеи ТЬг С1у Не Рго Уа1 А1а Зег ТЬг Ьеи Мес С1у Ьеи С1у
325 330 335
Зег Туг Рго Суз Азр Азр С1и Ьеи Зег Ьеи ΗΪ5 МеС Ьеи С1у Мес НЬз
340 345 350
С1у ТЬг Уа1 Туг А1а Азп Туг А1а Уа1 С1и ΗΪ5 Зег Азр Ьеи Ьеи Ьеи
355 360 365
А1а РЬе С1у Уа1 Агд РЬе Азр Азр Агд Уа1 ТЬг С1у Ьуз Ьеи С1и А1а
370 375 380
РЬе А1а Зег Агд А1а Ьуз 11е 7а1 ΗΪ5 Не Азр Не Азр Зег А1а С1и
385 390 395 4 0 0
Не С1у Ьуз Азп Ьуз ТЬг Рго Н1з Уа1 Зег Уа1 Суз С1у Азр Уа1 Ьуз
405 410 415
Ьеи А1а Ьеи С1п С1у МеС Азп Ьуз Уа1 Ьеи С1и Азп Агд А1а С1и С1и
42 0 425 430
Ьеи Ьуз Ьеи Азр РЬе 61у Уа1 Тгр Агд АЗП О1и Ьеи Азп Уа1 С1п Ьуз
435 440 445
С1п Ьуз РЬе Рго Ьеи Зег РЬе Ьуз ТЬг РЬе С1у С1и А1а Не Рго Рго
450 455 460
С1п Туе А1а 11е Ьуз Уа1 Ьеи Азр СИи Ьеи ТЬг Азр £1у Ьуз А1а 11е
465 470 475 480
Не Зег ТЬг С1у Уа1 С1у С1п НЬз С1п МеС Тгр А1а А1а С1п РЬе Туг
485 490 495
Азп Туг Ьуз Ьуз Рго Агд С1п Тер Ьеи Зег 5ег С1у О1у Ьеи С1у А1а
500 505 510
МеС С1у РЬе С1у Ьеи Рго А1а А1а Пе С1у А1а Зег Уа1 А1а Азп Рго
515 520 525
Азр А1а Не Уа1 Уа1 Азр Не Азр 31у Азр С1у Зег РЬе Не МеС Азп
530 535 540
- 44 025843
Рго Азр А1а Не Уа1 Уа1 Азр 11е Азр С1у Азр С1у 2ег РЬе Не Мес
515 520 525
Азп Уа1 С1п СЬи Ьеи А1а ТЬг Не Агд Уа1 <31и Азп Ьеи Рго Уа1 Ьуз
530 535 540
Уа1 Ьеи Ьеи Ьеи Азп Азп С1п Ηί3 Ьеи 01у Мес 7а1 Мес С1п Тгр ОН
545 550 555 560
Азр Агд РЬе Туг Ьуз А1а Азп Агд А1а Н1з ТЬг Туг Ьеи С1у Азр Рго
565 570 575
А1а Ьуз СН Азп СП 11е РЬе Рго А5П МеС Ьеи С1п РЬе А1а С1у А1а
580 585 590
Суз С1у Не Рго А1а А1а Агд Уа1 ТЬг Ьуз Ьуз С1и С1и Ьеи Агд Азр
595 600 605
А1а Не С1п ТЬг МеС Ьеи Азр ТЬг Рго С1у Рго Туг Ьеи Ьеи Азр Уа1
610 615 620
Не Суз Рго НЬз О1п 01и Ыз Уа1 Ьеи Рго МеС 11е Рго Азп С1у С1у
625 630 635 640
ТЬг РЬе Ьуз Азр Уа1 Не ТЫ СП С1у Азр С1у Агд ТЬг Ьуз Туг
645 650 655 <210> 3 <211> 652 <212> Белок <213> ВгаззЬса дипсеа <400> 3
Мес А1а А1а А1а ТЬг Зег
5
5ег Зег Ьуз Зег Рго Леи 20
Ьеи ТЬг Рго 01п Ьуз Рго 35
5ег А1а УаЬ Ьеи Азл Зег 50
Ьуз Не Ьуз ТЬг РЬе 11е 65 70
О1у А1а Азр Не Ьеи Уа1 85
Зег Зег Рго 11е Зег Ьеи ТЬг А1а Ьуз Рго 10 15
Рго Не Зег Агд РЬе Зег Ьеи Рго РЬе Зег 25 30
Зег Зег Агд Ьеи Н1з Агд Рго Ьеи А1а Не 40 45
Рго Уа1 Азп Уа1 А1а Рго С1и Ьуз ТЬг Азр 55 60
Зег Агд Туг А1а Рго Азр С1и Рго Агд Ьуз 75 80
С1и А1а Ьеи С1и Агд С1п С1у Уа1 С1и ТЬг
95
С1у А1а Зег МеС С1и Не Нгз С1п А1а Ьеи 105 110
ТЬг Агд Зег Зег ТЬг Не 115
С1у νβΐ РЬе А1а А1а С1и 130
Не Суз Не А1а ТЬс Зег 145 150
О1у Рго С1у А1а ТЬг Азп Ьеи Уа1 Зег С1у 155 160 : Азр Зег Уа1 Рго Ьеи Уа1 А1а Не ТЬг С1у 170 175
Не С1у ТЬг Азр А1а РЬе С1п С1и ТЬг Рг< 185 190
Ьеи С1п С1у МеС Азп Ьуз
I С1и Ьеи ТЬг С1п С1у Ьуз А1а Не 11е Зег
- 45 025843
РЬе С1у Ьеи Рго А1а А1а 500 11е С1у А1а Зег 505 Уа1 А1а Азп Рго 510 Азр А1а
Пе Уа1 Уа1 Азр Пе Азр С1у Азр С1у Зег РЬе 11е МеС Азп Уа1 С1п
515 520 525
С1и Ьеи А1а ТЬс Не Агд Уа1 С1и Азп Ьеи Рго Уа1 Ьуз Не Ьеи Ьеи
530 535 540
Ьеи Азп Азп 01п Нхз Ьеи 01у Мес Уа1 Мес С1п Тгр С1и Азр Агд РЬе
545 550 555 560
Туг Ьуз А1а Азп Агд А1а ΗΪ3 ТЬг Туг Ьеи С1у Азр Рго А1а Агд С1и
565 570 575
Азп С1и Не РЬе Рго Азп МеС Ьеи С1п РЬе А1а С1у А1а Суз С1у Не
580 585 590
Рго А1а А1а Агд Уа1 ТЬг Ьуз Ьуз 01а С1и Ьеи Агд С1и А1а 11е С1п
595 600 605
ТЬг Мес Ьеи Азр ТЬг Рго С1у Рго Туг Ьеи Ьеи Азр Уа1 Пе Суз Рго
610 615 620
ΗΪ5 С1п С1и ЙХ5 Уа1 Ьеи Рго МеС 11е Рго Азп С1у С1у Т|тг РЬе Ьуз
625 630 635 640
Азр Уа1 Пе ТЬг С1и С1у Азр С1у Агд ТЬг Ьуз Туг
5 650 <210> 4 <211> 655 <212> Белок
<213> Вгазз! са ;)ипсеа
<400 > 4
МеС А1а А1а А1а ТЬг Зег Зег Зег Рго 11е Зег РЬе ТЬг А1а Ьуз Рго
1 5 10 15
Зег Зег Ьуз Зег Ьеи Ьеи Рго 11е Зег Агд РЬе Зег Ьеи Рго РЬе Зег
20 25 30
Ьеи Пе Рго С1п Ьуз Рго Зег Зег Ьеи Агд ΗΪ5 Зег Рго Ьеи Зег Пе
35 40 45
Зег А1а Уа1 Ьеи Азп ТЬг Рго Уа1 Азп Уа1 А1а Рго Рго Зег Рго С1и
50 55 60
Ьуз Пе С1и Ьуз Азп Ьуз ТЬг РЬе Пе Зег Агд Туг А1а Рго Азр С1и
65 70 75 80
Рго Агд Ьуз С1у А1а Азр Пе Ьеи Уа1 С1и А1а Ьеи 61и Агд С1п С1у
85 90 95
νβΐ С1и ТЬг Уа1 РЬе А1а Туг Рго С1у С1у ТЬг Зег Мес С1и 11е Н13
100 105 110
αΐη А1а Ьеи ТЬг Агд Зег Зег ТЬг Пе Агд Азп Уа1 Ьеи Рго Агд Ηίδ
115 120 125
61и С1п С1у 01у Уа1 РЬе А1а А1а αία С1у Туг А1а Агд Зег Зег С1у
130 135 14 0
Ьуз Рго С1у Пе Суз Пе А1а ТЬг Зег С1у Рго С1у А1а ТЬг Азп Ьеи
145 150 155 160
Уа1 Зег С1у Ьеи А1а Азр А1а Мес Ьеи Азр Зег Уа1 Рго Ьеи Уа1 А1а
165 170 175
11е ТЬг С1у 61п Уа1 Рго Агд Агд Мес Пе С1у ТЬг Азр А1а РЬе С1п
180 185 190
С1и ТЬг Рго Пе Уа1 С1и Уа1 ТЬг Агд Зег Пе ТЬг Ьуз Н1з Азп Туг
195 200 205
Ьеи Уа1 МеС Азр Уа1 Азр Азр Не Рго Агд Пе Уа1 С1п С1и А1а РЬе
210 215 220
РЬе Ьеи А1а ТЬг Зег С1у Агд Рго С1у Рго Уа1 Ьеи Уа1 Азр Уа1 Рго
225 230 235 240
Ьуз Азр 11е С1п С1п С1п Ьеи А1а 11е Рго Азп Тгр Азр С1п Рго МеС
245 250 255
Агд Ьеи Рго С1у Туг МеС Зег Агд Ьеи Рго 31п Рго Рго С1и Уа1 Зег
260 265 270
С1п Ьеи С1у С1п Пе Уа1 Агд Ьеи Пе Зег С1и Зег Ьуз Агд Рго Уа1
275 280 285
Ьеи Туг Уа1 С1у С1у С1у Зег Ьеи Азп Зег Зег Азр С1и Ьеи С1у Агд
290 295 300
РЬе Уа1 С1и Ьеи ТЬг С1у Пе Рго νβΐ А1а Зег ТЬг Ьеи МеС С1у Ьеи
305 310 315 320
С1у Зег Туг Рго Суз Азп Азр С1и Ьеи Зег Ьеи С1п МеС Ьеи С1у Мес
325 330 335
ΗΪ3 С1у ТЬг Уа1 Туг А1а Азп Туг А1а Уа1 С1и ΗΪ3 Зег Азр Ьеи Ьеи
340 345 350
Ьеи А1а РЬе 61у Уа1 Агд РЬе Азр Азр Агд Уа1 ТЬг С1у Ьуз Ьеи С1и
355 360 365
А1а РЬе А1а Зег Агд А1а Ьуз 11е Уа1 ΗΪ5 Пе Азр Пе Азр Зег А1а
370 375 380
С1и Пе С1у Ьуз Азп Ьуз ТЬг Рго ΗΪ5 νβΐ Зег Уа1 Суз С1у Азр Уа1
385 390 395 400
Ьуз Ьеи А1а Ьеи С1п С1у Мес Азп Ьуз νβΐ Ьеи С1и Азп Агд А1а С1и
405 410 415
С1и Ьеи Ьуз Ьеи Азр РЬе С1у Уа1 Тгр Агд Зег С1и Ьеи Зег С1и С1п
420 425 430
Ьуз С1п Ьуз РЬе Рго Ьеи Зег РЬе Ьуз ТЬг РЬе С1у С1и А1а Пе Рго
435 440 445
Рго С1п Туг А1а Пе С1п Уа1 Ьеи Азр С1и Ьеи ТЬг Азр С1у Ьуз А1а
450 455 460
Пе Пе Зег ТЬг С1у Уа1 С1у С1п Ыз С1п МеС Тгр А1а А1а С1п РЬе
465 470 475 480
- 46 025843
ТЬг С1у νβΐ С1у 01η ΗΪ5 С1п МеС Тгр А1а А1а С1п РЬе Туг Ьуз Туг 465 470 475 480
Агд Ьуз Рго Агд С1п Тгр Ьеи Зег Зег Зег С1у Ьеи С1у А1а МеС С1у 485 490 495
РЬе С1у Ьеи Рго А1а А1а Не С1у А1а Зег Уа1 А1а Азп Рго Азр А1а 500 505 510
11е Уа1 Уа1 Азр 11е Азр С1у Азр С1у Зег РЬе 11е Мес Азп Уа1 С1п 515 520 525
С1и Ьеи А1а ТЬг 11е Агд Уа1 С1и Азп Ьеи Рго Уа1 Ьуз 11е Ьеи Те 530 535 540
Беи Азп Азп С1п (Из Ьеи С1у МеС Уа1- Мес С1п Тгр С1и Азр Агд РЬе 545 550 555 560
Туг Ьуз А1а Азп Агд А1а Ηί3 ТЬг Туг Ьеи С1у Азр Рго А1а Агд С1и 565 570 575
Азп С1и 11е РЬе Рго Азп МеС Ьеи С1п РЬе А1а С1у А1а Су5 СЬу 11е 580 585 590
Рго А1а А1а Агд Уа1 ТЬг Ьуз Ьуз С1и С1и Ьеи Агд С1и А1а 11е· С1п 595 600 605
ТЬг МеС Ьеи Азр ТЬг Рго С1у Рго Туг Ьеи Ьеи Азр Уа1 Не Суз Рго 610 615 620
ΗΪ3 С1п С1и Нгз Уа1 Ьеи Рго Мес Не Рго Зег С1у С1у ТЬг РЬе Ьуз 625 630 635 ' 640
Азр Уа1 11е ТЬг С1и С1у Азр С1у Агд ТЬг Ьуз Туг 645 650 <210> 6 <2И> 652 <212> Белок <213> ВгаззЬса париз <400> 6
Мес А1а А1а А1а ТЬг 5ег Зег Зег Рго Не Зег Ьеи ТЬг А1а Ьуз Рг
5ег Зег Ьуз Зег Рго Ьеи Рго Не Зег Агд РЬе Зег Ьеи Рго РЬе Зег 20 25 30
Ьеи ТЬг Рго С1п Ьуз Рго Зег Зег Агд Ьеи Шз Агд Рго Ьеи А1а Не
Зег А1а Уа1 Ьеи Азп Зе
Уа1 Азп Уа1 А1а Рго С1и Ьуз ТЬг Азр 60
Ьуз Не Ьуз ТЬг РЬе 11е Зег Агд Туг А1а Рго Азр С1и Рго Агд Ьуз
С1у А1а Азр Не Ьеи Уа1 С1и А1а Ьеи С1и Агд С1п С1у Уа1 С1и ТЬг
90 95
Уа1 РЬе А1а Туг Рго 01у С1у А1а Зег МеС С1и Не Ηίδ С1п А1а Ьеи 100 105 110
ТЬг Агд Зег Зег ТЬг 11е Агд Азп Уа1 Ьеи Рго Агд Нгз С1и С1п С1у 115 120 125
С1у Уа1 РЬе А1а А1а С1и С1у Туг А1а Агд Зег Зег С1у Ьуз Рго С1у 130 135 140
11е Суз 11е А1а ТЬг Зег С1у Рго С1у А1а ТЬг Азп Ьеи Уа1 Зег 61у 145 150 155 160
Ьеи А1а Азр А1а МеС Ьеи Азр Зег Уа1 Рго Ьеи Уа1 А1а 11е ТЬг С1у 165 170 175
С1у С1у С1у Зег Ьеи Азп Зег Зег С1и С1и Ьеи С1у Агд РЬе Уа1 С1и 290 295 300
Ьеи ТЬг С1у 11е Рго Уа1 А1а Зег ТЬг Ьеи МеС С1у Ьеи С1у Зег Туг 305 310 315 320
А1а Не 450 С1п Уа1 Ьеи Азр Ии 455 Ьеи ТЬг Пп Иу Ьуз 4 60 А1а Не Не 5ег
ТЬг С1у Уа1 С1у С1п ΗΪ3 С1п Мес Тгр А1а А1а С1п РЬе Туг Ьуз Туг
465 470 475 480
Агд Ьуз Рго Агд С1п Тгр Ьеи 5ег 5ег 5ег О1у Ьеи Иу А1а МеС 01 у
485 490 495
РЬе С1у Ьеи Рго А1а А1а Не С1у А1а 5ег Уа1 А1а Азп Рго Азр А1а
500 505 510
Не Уа1 Уа1 АЗр Не Агр Пу Азр Пу 5ег РЬе Не Мес Азп Уа1 С1п
515 520 525
С1и Ьеи А1а ТО г Не Агд Уа1 С1и Азп Ьеи Рго Уа1 Ьуз Не Ьеи Ьеи
530 535 540
Ьеи Азп Азп С1п Шз Ьеи Ну Мес Уа1 Мес С1п Ьеи С1и Азр Агд РЬе
545 550 555 560
Туг Ьуз А1а Азп Агд А1а НЬз ТЬг Туе Ьеи О1у Азр Рго А1а Агд Пи
565 570 575
Азп С1и 11е РЬе Рго Азп МеС Ьеи С1п РЬе А1а Пу А1а Суз Иу 11е
580 585 590
Рго А1а А1а Агд Уа1 ТЬг Ьуз Ьуз Ии Ии Ьеи Агд Ии А1а Не С1п
595 600 605
ТЬг МеС Ьеи Азр ТЬг Рго С1у Рго Туг Ьеи Ьеи Азр Уа1 Не Суз Рго
610 615 620
ΗΪ5 С1п Ни ΗΪ5 Уа1 Ьеи Рго МеС Х1е Рго 5ег Пу Иу ТЬг РЬе Ьуз
625 630 635 640
Азр Уа1 Не ТЬг Пи С1у Азр С1у Агд ТЬг Ьуз Туг
645 650
- 49 025843
- 50 025843
С1и Ьеи Ьуз Ьеи Азр РЬе С1у Уа1 Тгр Агд Зег С1и Ьеи Зег С1и С1п
420 425 430
Ьуз С1п Ьуз РЬе Рго Ьеи Зег РЬе Ьуз ТЬг РЬе О1у С1и А1а Не Рго
435 440 445
Рго 01п Туг А1а Не С1п Уа1 Ьеи Азр С1и Ьеи ТЬГ Азр С1у Ьуз А1а
450 455 460
Не Не Зег ТЬг С1у Уа1 С1у С1п ΗΪ5 С1п Мер Тгр А1а А1а С1п РЬе
465 470 475 480
Туг Ьуз Туг Агд Ьуз Рго Агд С1п Тгр Ьеи Зег Зег Зег С1у Ьеи С1у
485 490 495
А1а Мер С1у РЬе С1у Ьеи Рго А1а А1а Не С1у А1а Зег Уа1 А1а Азп
500 505 510
Рго Азр А1а Не Уэ1 Уа1 Азр Не Азр С1у Азр 31у Зег РЬе Не Мер
515 520 525
Азп Уа1 С1п С1и Ьеи А1а ТЬг 11е Агд Уа1 С1и Азп Ьеи Рго Уа1 Ьуз
530 535 540
Уа1 Ьеи Ьеи Ьеи Азп Азп С1п Ηίδ Ьеи С1у МеР Уа1 МеР С1п Тгр С1и
545 550 555 560
Азр Агд РЬе Туг Ьуз А1а Азп Агд А1а ΗΪ5 ТЬг Туг Ьеи 61у Азр Рго
565 570 575
А1а Ьуз С1и Азп С1и Не РЬе Рго Азп Мес Ьеи С1п РЬе А1а С1у А1а
580 585 590
Суз С1у Не Рго А1а А1а Агд Уа1 ТЬг Ьуз Ьу5 С1и С1и Ьеи Агд Азр
595 600 605
А1а Не С1п ТЬг Мер Ьеи Азр ТЬг Рго С1у Рго Туг Ьеи Ьеи Азр Уа1
610 615 620
Не Суз Рго Ηί5 С1п С1и ΗΪ5 Уа1 Ьеи Рго Мер Не Рго Зег С1у О1у
625 630 635 640
ТЬг РЬе Ьуз Азр Уа1 Не ТЬг С1и С1у Азр С1у Агд ТЬг Ьуз Туг
645 650 655 <210> 9 <211> 652 <212> Белок <213> Вгазз1са париз <400> 9
мер А1а А1а А1а ТЫ Зег Зег Зег Рго Не Зег Ьеи ТЬг А1а Ьуз Рго
1 5 10 15
Зег Зег Ьуз Зег Рго Ьеи Рго Не Зег Агд РЬе Зег Ьеи Рго РЬе Зег
20 25 30
Ьеи ТЬг Рго С1п Ьуз Рго Зег Зег Агд Ьеи Ηίδ Агд Рго Ьеи А1а Не
35 40 45
Зег А1а Уа1 Ьеи Азп Зег Рго Уа1 Азп Уа1 А1а Рго С1и Ьуз ТЬг Азр
50 55 60
Ьуз 11е Ьуз ТЬг РЬе Не Зег Агд Туг А1а Рго Азр С1и Рго Агд Ьуз 65 10 75 80
С1у А1а Азр 11е Ьеи Уа1 61и А1а Ьеи С1и Агд С1п С1у Уа1 С1и ТЬг 85 90 95
Уа1 РЬе А1а Туг Рго С1у С1у А1а Зег МеР С1и 11е Шз С1п А1а Беи 100 105 110
ТЬг Агд 5ег 5ег ТЬг Не Агд Азп Уа1 Ьеи Рго Агд Ηί3 С1и С1п С1у 115 120 125
01у Уа1 РЬе А1а А1а С1и С1у Туг А1а Агд Зег Зег С1у Ьуз Рго С1у 130 135 140
11е Суз Не А1а ТЬг Зег С1у Рго С1у А1а ТЬг Азп Ьеи Уа1 Зег 31у
145 150 155 160
Ьеи А1а Азр А1а Мер Ьеи Азр Зег Уа1 Рго Ьеи Уа1 А1а Не ТЬг 31у
165 170 175
С1п Уа1 Рго Агд Агд Мер Не С1у ТЬг Азр А1а РЬе С1п С1и ТЬг Рго 180 185 190
Не Уа1 С1и Уа1 ТЬг Агд Зег Не ТЬг Ьуз Шз Азп Туг Ьеи Уа1 МеР 195 200 205
Азр Уа1 Азр Азр Не Рго Агд Не Уа1 С1п С1и А1а РЬе РЬе Ьеи А1а 210 215 220
ТЬг Зег С1у Агд Рго С1у Рго Уа1 Ьеи Уа1 Азр Уа1 Рго Ьуз Азр 11е
225 230 235 240
С1п С1п С1п Ьеи А1а Не Рго Азп Тгр Азр С1п Рго Мер Агд Ьеи Рго
245 250 255
С1у Туг Мер Зег Агд Ьеи Рго С1п Рго Рго С1и Уа1 Зег С1п Ьеи С1у 260 265 270
С1п Не Уа1 Агд Ьеи Не Зег С1и Зег Ьуз Агд Рго Уа1 Ьеи Туг Уа1 275 280 285
С1у С1у С1у Зег Ьеи Азп Зег Зег С1и С1и Ьеи С1у Агд РЬе Уа1 С1и 290 295 300
Ьеи ТЬг С1у 11е Рго Уа1 А1а Зег ТЬг Ьеи Мер С1у Ьеи С1у Зег Туг
305 310 315 320
Рго Суз Азп Азр С1и Ьеи Зег Ьеи С1п Мер Ьеи С1у Мер Н1з С1у ТЬг
325 330 335
Уа1 Туг А1а Азп Туг А1а Уа1 С1и Шз Зег Азр Ьеи Ьеи Ьеи А1а РЬе 340 345 350
С1у Уа1 Агд РЬе Азр Азр Агд Уа1 ТЬг С1у Ьуз Ьеи С1и А1а РЬе А1а 355 360 365
Зег Агд А1а Ьуз Не Уа1 Шз Не Азр 11е Азр Зег А1а С1и Не С1у 370 375 380
Ьуз Азп Ьуз ТЬг Рго Шз Уа1 Зег Уа1 Суз С1у Азр Уа1 Ьуз Ьеи А1а 385 390 395 400
Ьеи С1п СЬу Мес Азп 405 Ьуз Уа1 Ьеи СЬи Азп 410 Агд АЬа СЬи СЬи Ьеи 4 15 Ьуз
Ьеи Азр РЪе СЬу Уа1 Тгр Агд Зег СЬи Ьеи Зег СЬи С1п Ьуз СЬп Ьуз
420 425 430
РЪе Рго Ьеи Зег РЪе Ьуз ТЪг РЪе СЬу СЬи АЬа Не Рго Рго С1п Туг
435 440 445
А1а Не СЬп УаЬ Ьеи Азр СЬи Ьеи ТЪг С1п СЬу Ьуз А1а Не Не Зег
450 455 460
ТЪг СЬу νβΐ СЬу СЬп Шз СЬп Мес Тгр АЬа А1а СЬп РЪе Туг Ьуз Туг
465 470 475 480
Агд Ьуз Рго Агд СЬп Тгр Ьеи Зег Зег Зег СЬу Ьеи СЬу АЬа МеС СЬу
485 490 4 95
РЪе СЬу Ьеи Рго АЬа АЬа Не СЬу АЬа Зег Уа1 АЬа Азп Рго Азр АЬа
500 505 510
Не Уа1 УаЬ Азр Не Азр СЬу Азр С1у Зег РЪе Не МеС Азп Уа1 СЬп
515 520 525
СЬи Ьеи А1а ТЪг Не Агд Уа1 31и Азп Ьеи Рго \/а1 Ьуз Не Ьеи Ьеи
530 535 540
Ьеи Азп Азп СЬп Шз Ьеи СЬу Мес Уа1 МеС СЬп Тгр СЬи Азр Агд РЪе
545 550 555 560
Туг Ьуз АЬа Азп Агд АЬа ΗΪ5 ТЪг Туе Ьеи 01у Азр Рго АЬа Агд СЬи
565 570 575
Азп СЬи Не РЪе Рго Азп МеС Ьеи СЬп РЪе АЬа СЬу А1а Суз С1у Не
580 585 590
Рго АЬа АЬа Агд УаЬ ТЪг Ьуз Ьуз С1и СЬи Ьеи Агд СЬи АЬа 11е СЬп
595 600 605
ТЪг Мес Ьеи Азр ТЪг Рго СЬу Рго Туг Ьеи Ьеи Азр \/а1 Не Суз Рго
610 615 620
Н13 СЬп СЬи ΗΪ5 УаЬ Ьеи Рго Мес Не Рго Зег СЬу СЬу ТЪг РЪе Ьуз
62 5 630 635 640
Азр Уа1 11е ТЪг СЬи 31у Азр СЬу Агд ТЪг Ьуз Туг
645 650 <210> 10 <211> 655 <212> Велок
<213> Вгаззз .са г гарие
<400> 10
Мес АЬа АЬа А1а ТЪг 5 Зег Зег Зег Рго Не 10 Зег Ьеи ТЪг АЬа Ьуз 15 Рго
Зег Зег Ьуз Зег 20 Рго Ьеи Рго Не Зег 25 Агд РЪе Зег Ьеи Рго 30 РЪе Зег
Ьеи ТЪг Рго 35 СЬп Ьуз Азр Зег Зег 40 Агд Ьеи Шз Агд Рго 45 Ьеи А1а Не
Зег А1а Уа1 Ьеи Азп Зег Рго Уа1 Азп Уа1 А1а Рго Рго 5ег Рго С1и 50 55 60
Ьуз ТЪг Азр Ьуз Азп Ьуз ТЪг РЪе Уа1 Зег Агд Туг А1а Рго Азр С1и 65 70 75 80
Рго Агд Ьуз С1у А1а Азр Не Ьеи Уа1 С1и А1а Ьеи С1и Агд С1п 01у 85 90 95
Уа1 С1и ТЪг Уа1 РЪе А1а Туг Рго С1у СЬу А1а Зег Мес С1и Не Шз 100 105 110
С1п А1а Ьеи ТЪг Агд Зег Зег ТЪг Не Агд Азп Уа1 Ьеи Рго Агд Шз 115 120 125
С1и С1п С1у С1у Уа1 РЪе А1а А1а С1и СЬу Туг А1а Агд Зег Зег С1у 130 135 140
Ьуз Рго СЬу Не Суз Не А1а ТЪг Зег С1у Рго С1у А1а ТЪг Азп Ьеи
145 150 155 160
5/а1 Зег С1у Ьеи А1а Азр А1а МеС Ьеи Азр Зег Уа1 Рго Ьеи Уа1 А1а
165 170 175
Не ТЪг С1у С1п Уа1 Рго Агд Агд МеС Не С1у ТЪг Азр А1а РЪе С1п 180 185 190
С1и ТЪг Рго Не Уа1 С1и Уа1 ТЪг Агд Зег Не ТЪг Ьуз Шз Азп Туг 195 200 205
Ьеи Уа1 МеС Азр Уа1 Азр Азр Не Рго Агд Не Уа1 01п С1и А1а РЪе 210 215 220
РЪе Ьеи А1а ТЪг Зег СЬу Агд Рго СЬу Рго УаЬ Ьеи УаЬ Азр УаЬ Рго
225 230 235 240
Ьуз Азр Не СЬп С1п СЬп Ьеи А1а Не Рго Азп Тгр Азр СЬп Рго МеС
245 250 255
Агд Ьеи Рго СЬу Туг МеС Зег Агд Ьеи Рго С1п Рго Рго С1и Уа1 Зег 260 265 270
СЬп Ьеи СЬу СЬп Не УаЬ Агд Ьеи Не Зег СЬи Зег Ьуз Агд Рго Уа1 275 280 285
Ьеи Туг УаЬ СЬу СЬу СЬу Зег Ьеи Азп Зег Зег С1и СЬи Ьеи С1у Агд 290 295 300
РЪе УаЬ СЬи Ьеи ТЪг СЬу Не Рго УаЬ А1а Зег ТЪг Ьеи МеС СЬу Ьеи
305 310 315 320
СЬу Зег Туг Рго Суз Азп Азр С1и Ьеи Зег Ьеи С1п МеС Ьеи СЬу МеС
325 330 335
Шз СЬу ТЪг УаЬ Туг А1а Азп Туг А1а Уа1 СЬи Шз Зег Азр Ьеи Ьеи 340 345 350
Ьеи АЬа РЪе С1у УаЬ Агд РЪе Азр Азр Агд УаЬ ТЪг СЬу Ьуз Ьеи С1и 355 360 365
А1а РЪе АЬа Зег Агд А1а Ьуз Не Уа1 Н1з Не Азр Не Азр Зег А1а 370 375 380
С1и Не С1у Ьуз 385 Азп Ьуз ТЬг Рго 390 ΗίΞ Уа1 Зег Уа1 Суз С1у Азр Уа1
395 400
Ьуз Ьеи А1а Ьеи С1п С1у МеС Азп Ьуз Уа1 Ьеи С1и Азп Агд А1а С1и
405 410 415
С1и Ьеи Ьуз Ьеи Азр РЬе С1у Уа1 Тгр Агд Зег С1и Ьеи Зег С1и С1п
420 425 430
Ьуз С1п Ьуз РЬе Рго Ьеи Зег РЬе Ьуз ТЬг РЬе О1у С1и А1а Не Рго
435 440 445
Рго С1п Туг А1а Не С1п Не Ьеи Азр С1и Ьеи ТЬг С1и О1у Ьуз А1а
450 455 460
Не Не Зег ТЬг О1у Уа1 С1у С1п НЬз С1п Мес Тгр А1а А1а С1п РЬе
465 470 475 480
Туг Ьуз Туг Агд Ьуз Рго Агд С1п Тгр Ьеи Зег Зег Зег С1у Ьеи С1у
485 490 495
А1а Мес С1у РЬе С1у Ьеи Рго А1а А1а Не С1у А1а Зег Уа1 А1а Азп
500 505 510
Рго Азр А1а Не Уа1 Уа1 Азр Не Азр С1у Азр С1у Зег РЬе Не МеС
515 520 525
Азп \7а 1 61п С1и Ьеи А1а ТЬг Не Агд Уа1 С1и Азп Ьеи Рго Уа1 Ьуз
530 535 540
Не Ьеи Ьеи Ьеи Азп Азп С1п НЬз Ьеи С1у МеС Уа1 МеС О1п Тгр О1и
545 550 555 560
Азр Агд РЬе Туг Ьуз А1а Азп Агд А1а ΗΪ3 ТЬг Туг Ьеи С1у Азр Рго
565 570 575
А1а Агд С1и Азп С1и Не РЬе Рго Азп Мес Ьеи С1п РЬе А1а С1у А1а
580 585 590
Суз С1у Не Рго А1а А1а Агд Уа1 ТЬг Ьуз Ьуз О1и О1и Ьеи Агд С1и
595 600 605
А1а Не С1п ТЬг МеС Ьеи Азр ТЬг Рго 01 у Рго Туг Ьеи Ьеи Азр Уа1
610 615 620
Не Суз Рго Н1з С1п С1и Ηί5 Уа1 Ьеи Рго МеС 11е Рго Зег С1у С1у
625 630 635 640
ТЬг РЬе Ьуз Азр Уа1 Не ТЬг С1и С1у Азр С1у Агд ТЬг Ьуз Туг
645 650 655
<210> 11 <211> 2013 <212> ДНК <213> АгаЫЬорзЬз сЬаПапа <400> 11 асддсддсдд сссссССссС аассссааса
СссаСсСссд сссассааас саасаасаас ссСссаааСс ааСсаСссСс ссдСдсСсаа ссдааасасс аасаасааса ассаСсасса сСссСсссдс сасаассасс саСсСсссда
СсССсССсда аСсСссадаС сдссдсддСа аасдссасаа сссдссссад сссссссесс
СсСсссСссс
СсаааСссад ссассссссс ассаассссд сассааасса асссссссСа сСсСсссСсс
Сссаассааа саааддсдсС
120
180
240
300 даСасссСсд СсдаадсССС адаасдссаа ддедсадааа ссдсаССсдс ссассссдда 360 ддСдсассаа СддадасСса ссаадсссса асссдсСсСС ссСсаасссд саасдСссСЛ 420 ссСсдСсасд аасааддадд СдСаССсдса дсадааддаС асдсСсдаСс сСсаддСааа 480 ссаддСассс дСаСадссас ССсаддСссс ддадсСасаа аСсСсдССад сддаСсадсс 540 даСдсдССдС садасадсдс СссссССдСа дсаассасад дасаадСссс СсдссдСасд 600 ассддсасад аСдсдСССса ададассссд ассдссдадд Саасдсдссс даССасдаад 660 саСаасСаСс ССдСдаСдда СдССдаадас ассссСадда ССаССдадда адсСССсссс 720 ССадсСасСС сСддсадасс СддасссдСС ССддССдаСд ССссСааада саССсаасаа 780 садссСдсда ССссСааССд ддаасаддсс асдадассас сСддССасаС дСсСаддасд 840 ссСааасссс сддаадаССс СсаСССддад садаССдССа ддссдасссс СдадСсСаад 900 аадссСдСдс СдсасдССдд сддсддссдс ССдааССсСа дсдаСдаасс дддсаддссс 960 дССдадсССа сддддасссс СдССдсдадС асдССдаСдд ддсСдддаСс ССаСссССдС 1020 дасдасдадс СдСсдССаса ЬаСдсССдда аСдсаСддда сСдСдСаСдс ааасСасдсС 1080 дСддадсаСа дСдаСССдСС дссддедссс ддддсааддс ссдасдассд сдссасдддс 1140 аадсССдадд сССССдссад СадддсСаад ассдсссаса ссдасассда сСсддссдад 1200 аССдддаада аСаадасСсс СсаСдСдСсС дСдСдСддСд аСдССаадсС ддсСССдсаа 1260 дддасдааса аддССсССда даассдадсд даддадсССа адсЬЬдассс сддадсссдд 1320 аддаасдадс сдаасдсаса дааасадаад СССссдССда дсСССаадас дсссддддаа 1380 дссасссссс сасадСаСдс даССааддСс сССдаСдадс СдасСдасдд аааадссаса 1440 асаадсассд дсдСсдддса асаСсаааСд Сдддсддсдс адССсСасаа ссасаадааа 1500 ссааддсадс ддсСаСсаСс аддаддссСС ддадсСаСдд даСССддасС СсссдсСдсд 1560 аССддадсдС сСдССдсСаа сссСдаСдсд аСадссдСдд аСаССдасдд адасддаадс 1620 СССаСаасда аСдсдсаада дссадссасс асссдсдсад адааСсССсс адсдааддса 1680 сССССаСсаа асаассадса Ссссддсасд дссасдсаас дддаадассд дССсСасааа 1740 дсСаассдад сСсасасаСС ЬсСсддддаС ссддсссадд аддасдадаС аССсссдаас 1800 аСдССдсСдС ССдсадсадс ССдсдддаСС ссадсддсда дддСдасааа дааадсадаС 1860 сСссдадаад сСаСссадас ааСдсСддаС асассаддас сССассСдСС ддасдсдасс 1920 СдСссдсасс аадаасасдс дССдссдаСд аСсссдадСд дСддсасССС саасдаСдСс 1980 аСаасддаад дадасддссд даССаааСас сда 2013
<210> 12 <211> 2024 <212> ДНК <213> Вгаззхса зипсеа
<400> 12
сасдсссаса аасссасСса СсаСсСсСсд сСсаСССсСО сссссссссС сСаассаСдд 60
сддсддсаас аСсдСсССсС осаасссссс ссассдсСаа ассссссссс ааассссссс 120
сасооасссс садасссСсс ссссссг.ссС ооссааСссс дсадааассс СссссссССс 180
дссасадСсс ссссСосасс СсадссдССс Ссаасасасс едссаасдсс дсассссссс 240
ссссСдаааа аассдаааад аасаадасСС СсаСсСсссд сСасдсСссс дасдадсссс 300
дсаадддсдс сдаСаСссСс дСсдаадссс СсдадсдСса аддсдСсдаа ассдСсССсд 360
сССасссддд аддсдсССсс аСддадаСсс ассаадссСС аасСсдаСсс Сссассассс 420
дсаасдсссС сссссдСсас даасааддад дадСсСССдс сдссдадддс сасдсссдсс 480
ссСсСддСаа ассдддаасс сдсаСадсса сдссаддссс сддадссасс аассСсдССа 540
дсддСССадс сдасдсдасд сСсдасадСд СсссСсСсдс сдсСаССаса ддасаддСсс 600
сСсдСсддас даССддСасС даодсдсссс аддадасдсс аассдссдад дСаасдаддс 660
сСаССасдаа асаСаасСаС ссддссасдд асдссдасда саСасссадд аСсдСдсаад 720
аддсСССсСС ссСадсСасс СссддСадас ссддассддс сссадссдас дССссСаадд 780
аСаССсадса дсадсССдсд аССссСаасС дддаСсадсс СаСдсдсССа ссСддССаса 840
СдсссаддсС дссСсадссС ссддаадССС сСсадССадд дсадаСсдСС аддССдаСсс 900
ссдаасссаа даддоссдсс ссдсасдссд дсддсддаад сССдаасссд адсдасдаас 960
СддддаддСС сдсддадссс асСдддассс ссдссдсдад СасСССдаСд дддсссддСС 1020
сССаСссССд саасдасдад ССдСсСсСдс адасдсССдд СаСдсасддд асСдСдСасд 1080
ссаассасдс сдсддадсас адсдасссдс СдоСддсдСС СддСдссадд СССдаСдасс 1140
дсдссассдд ааадсссдад дсССССдсда дсадддсСаа даССдСдсас аССдасаСсд 1200
аССсСдсСда даССдддаад аасаадасдс сСсаСдСдСс СдСдСдСддС дасдССаадс 1260
сддссссдса адддаСдаас ааддссессд адаассдадс ададдадссс аадссСдасС 1320
СсддадСССд даддадсдаа ССдадсдадс адааасаааа дССсссдССд адССССаааа 1380
сдсссддада адсСассссс ссасадСасд сдаССсаддС ссСсдасдад сСаассдасд 1440
ддааддсаас саСсадсасС ддсдссдддс аасаСсадаС дсдддсддсд садССССаса 1500
адСасаддаа дссдаддсад СддССдСсаС саСсаддссС Сддадссасд ддССССддас 1560
ЕЕссЕдсЕдс саЕЕддадсд ЕседЕддсда асссЕдаСдс даЕЕдЕЕдЕд дасаЕЕдасд 1620
дСдасддаад сЕЕсаЕсаЕд ааЕдсссаад адсЕддссас ааЕссдЕдЕа дадааЕсЕЕс 1680
сЕдЕдааддЕ асЕсЕЕдЕЕа аасаассадс аЕсЕСддсаЕ ддЕЕаЕдсаа ЕдддаадаЕс 1740
ддЕЕсЕасаа адсЕаасада дсЕсасасЕЕ аЕсЕсдддда Ессддсааад дадаасдада 1800
ЕсЕЕсссааа саЕдсЕдсад ЕЕЕдсаддад ссЕдЕдддаЕ ЕссадсЕдсд адддЕдасда 1860
адааадаада ассссдадас дсЕаЕЕсада сааЕдсЕдда Еасассадда ссаЕассЕдЕ 1920
ЕддаЕдЕдаЕ сЕдЕссдсас саададсаЕд ЕдЕЕассдаЕ даЕсссаааЕ ддЕддЕасЕЕ 1980
ЕсааадаЕдЕ саЕаасадаа ддддаЕддЕс дсасЕаадЕа сЕда 2024
<210> 13
<211> 2015
<212> ДНК
<213> Вгазз1са дипсеа
<400> 13
сасдЕЕсаса аасссассса ЕсаЕсЕсЕсЕ сЕсаЕЕЕсЕс ЕсЕсЕсЕсаС сЕаассаЕдд 60
сддсддсаас аЕсдЕсЕЕсЕ ссдаЕсЕссЕ ЕаассдсЕаа ассЕЕсЕЕсс аааЕссссЕс 120
СасссаЕЕЕс садаЕЕсЕсс сЕЕсссЕЕсЕ ссЕЕаасссс асадааассс ЕссЕсссдЕс 180
ЕссассдЕсс ЕсЕсдссасс ЕссдссдЕЕс ЕсаасЕсасс сдЕсааЕдЕс дсассЕдааа 240
ааассдасаа даЕсаадасЕ ЕЕсаЕсЕссс дсЕасдсЕсс сдасдадссс сдсаадддЕд 300
сЕдаЕаЕссЕ сдЕддаадсс сЕсдадсдЕс ааддсдЕсда аассдЕсЕЕс дсЕЕаЕсссд 360
даддЕдссЕС саЕддадаЕс сассаадссЕ ЕдасЕсдсЕс сЕссассаЕс сдЕаасдЕсс 420
ЕсссссдЕса сдаасаадда ддадЕсЕЕсд ссдссдаддд ЕЕасдсЕсдЕ ЕссЕссддса 480
аассдддааЕ сЕдсаЕЕдсс асЕЕсдддЕс ссддадсЕас саассЕсдЕс адсдддЕЕад 540
ссдасдсдаЕ дсЕЕдасадЕ дЕЕссЕсЕсд ЕсдссаЕЕас аддасаддЕс ссЕсдссдда 600
ЕдассддЕас ЕдасдссЕЕс саададасдс сааЕсдЕЕда ддЕаасдадд ЕсЕаЕЕасда 660
аасаЕаасЕа ЕсЕддЕдаЕд даЕдЕЕдаЕд асаЕассЕад даЕсдЕЕсаа даадсЕЕЕсЕ 720
ЕЕсЕадсЕас ЕЕссддЕада сссддассдд ЕЕЕЕддЕЕда сдЕЕссЕаад даЕаЕЕсадс 780
адсадсЕЕдс даЕЕссЕаас ЕдддаЕсаас сЕаЕдсдсЕЕ дссЕддсЕас аЕдЕсЕаддс 840
ЕдссЕсадсс ассддаадЕЕ ЕсЕсадЕЕад дЕсадаЕсдЕ ЕаддЕЕдаЕс ЕсддадЕсЕа 900
ададдссЕдЕ ЕЕЕдЕасдЕЕ ддЕддЕддаа дсЕЕдаасЕс дадЕдаадаа сЕддддадаЕ 960
ЕЕдЕсдадсЕ ЕасЕдддаЕс ссЕдЕЕдсда дЕасдЕЕдаЕ ддддсЕЕддс ЕсЕЕаЕссЕЕ 1020
дЕаасдаЕда дЕЕдЕсссЕд садаЕдсЕЕд дсаЕдсасдд дасЕдЕдЕаЕ дсЕаасЕасд 1080
сЕдЕддадса ЕадЕдаЕЕЕд ЕЕдсЕддсдЕ ЕЕддЕдЕЕад дЕЕЕдаЕдас сд ЕдЕсасдд 1140
дааадсЕсда ддсдЕЕЕдсд адсадддсЕа адаЕЕдЕдса саЕадасаЕЕ даЕЕсЕдсЕд 1200
адаЕЕдддаа дааЕаадаса ссЕсасдЕдЕ сЕдЕдЕдЕдд ЕдаЕдЕааад сЕддсЕЕЕдс 1260
аадддаЕдаа сааддЕЕсЕЕ дадаассддд сддаддадсЕ саадсЕЕдаЕ ЕЕеддЕдЕЕЕ 1320
ддаддадсда дЕЕдадсдад садааасада адЕЕсссдЕЕ дадсЕЕсааа асдЕЕЕддад 1380
аадссаЕЕсс ЕссдсадЕас дсдаЕСсадд ЕссЕадасда дсЕаасссаа дддааддсаа 1440
ЕЕаЕсадсас ЕддЕдЕЕдда садсассада ЕдЕдддсддс дсадЕЕЕЕас аадЕасадда 1500
адссдаддса дЕддсЕдЕсд ЕссЕсаддас ЕсддадсЕаЕ дддИСсдда сЕСссЕдсСд 1560
сдассддадс дЕсЕдЕддсд аасссЕдаЕд сдаЕЕдЕЕдЕ ддасаЕЕдас ддЕдаЕддаа 1620
дсЕСсаЕааЕ даасдСЕсаа дадсЕддсса сааЕссдЕдЕ ададааЕсЕЕ ссЕдЕдаада 1680
ЕасЕсЕЕдЕЕ ааасаассад саЕсЕЕддда ЕддЕсаЕдса аЕдддаадаЕ сддЕЕсЕаса 1740
аадсЕаасад адсСсасасЕ СаЕсЕсдддд асссддсаад ддадаасдад аЕсЕЕсссЕа 1800
асаЕдсЕдса дЕЕЕдсадда дсЕЕдсддда ЕЕссадсЕдс дададЕдасд аадааадаад 1860
аасЕссдада адсЕаЕСсад асааЕдсЕдд аЕасассЕдд ассдЕассЕд ЕЕддаСдЕса 1920
ЕсЕдЕссдса ссаадаасаЕ дЕдЕЕассда ЕдаЕсссааа ЕддЕддсасЕ сссааадасд 1980
ЕааЕаассда аддддаЕддЕ сдсасЕаадЕ асЕда 2015
<210> 14
<211> 2024
<212> ДНК
<213> Вгаз 31са ]ипсеа
<400> 14
сасдЕЕсаса аасЕсаЕЕса бсабсбсбсд ССсаЬСЕсЕс ЕсссйсЕссС сбаассабдд 60
сддсддсаас аЕсдЕсЕЕсЕ ссааЕсЬссС ЕсассдсЕаа ассЬЕсСССс аааЕссс661 120
ЕасссаЕЕЕс : садаЕЕсЕсс ссссссЫст ссССааЬссс дсадааассс СссгсссССс 180
дссасадссс ЕсЕсЕссаЕс ссадссдссс ссаасасасс сдьсаасдсс дсассСссСС 240
ссссЕдаааа ааЕЕдаааад аасаадасЕС сеассссссд сбасдссссс дасдадсссс 300
дсаадддсдс сдаЕаЕссЕс дрсдаадссс Ссдадсдсса аддсдесдаа ассдссСЕсд 360
сЕЕасссддд аддЕасЕЕсс аСддадаСсс ассаадссСС аасСсдабсс СсСассаСсс 420
дСаасдбссС сссссдСсас даасааддад дадссСССдс сдссдаддд£ гасдсссдьь 480
ссЕсЕддЕаа ассдддааЕс сдсасадсса сдСсаддСсс сддадссасс аассСсдСЕа 540
дсддЕЕЕадс сдасдсдаЕд сСсдасадСд СсссСсСсдС сдсбатиаса ддасаддСсс 600
сЕсдЕсддаЕ дассддсасс дасдсдбЬсс аддадасдсс ааСсдсъдад дЬаасдаддС 660
сЕаЕЕасдаа асаЕаасЕаЕ сСддйсабдд абдЬЬдаЬда саЬасссадд абсдбдсаад 720
аддсЕЬЕсЕЕ ЕсЕадсЕасЕ сссддСадас ссддассддй ЬЬЬадссдас дсссссаадд 780
аьаЕЕсадса дсадсСЕдсд абСссСаасс дддаСсадсс бабдсдсЬка ссСддббаса 840
ЕдЕсЕаддсЕ дссЕсадссЕ ссддаадССС сСсадССадд дсадассдтс аддССдаесС 900
сЕдааЕсЕаа даддссЕдЕЕ ССдСаСдССд дСддСддаад сССдаасСсд адСдасдаас 960
ЕддддаддЕЕ ЕдЕддадсЕЕ асСдддаСсс сСдСсдсдад СасССЪдаСд дддсЪСддСС 1020
сЕЕаЕссЕЕд ЕаасдаСдад ССдСсСсСдс адаСдсССдд СаСдсасддд асЬдСдЕасд 1080
сЕааЕЕасдс СдСддадсаС адСдаСТРдС СдсСддсдСС СддЕдсиадд РССдасдасс 1140
дЕдЕсасЕдд ааадсЕсдад дсбСЪЪдсда дсадддсЬаа даЬбдСдсас ассдасассд 1200
аЕЕсЕдсЕда даССдддаад аасаадасдс с1саСдСдСс сдсдтдбддс дабдббаадс 1260
ЕддсЕЕЕдса адддабдаас ааддЪбсбЛд адаассдадс ададдадсСс аадсСЕдасс 1320
ЕеддадЕЕЕд даддадсдаа ССдадсдадс адааасаааа дСГсссдбИд адсчссаааа 1380
сдЕЕЕддада адсСаСЕссС ссасадйасд сдаЪЬсаддС ссбсдасдад сСаассдаСд 1440
ддааддсааЕ саЪсадСасЬ ддбдсддддс аасаЬсадаС дедддеддед садЕСССаса 1500
адЕасаддаа дссдаддсад СддССдСсаЬ сассаддссс сддадссасд ддССССддас 1560
ЕЕссЕдсЕдс сассддадсд СсЕдЕддсда асссЬдаЬдс дабРдгЕдсд дасаСЬдасд 1620
дкдаеддаад сЕСсассаСд аа^дССсаад адскддссас аасссдьдса дадаассссс 1680
сЕдЕдааддЕ асЕсЕСдЪСа аасаассадс ассЕЕддсаб ддССаСдсаа бдддаадаСс 1740
ддЕЕсЕасаа адсЬаасада дсЕсасассс абсбсдддда Ьссддсааад дадаасдада 1800
Сссссссааа сасдссдсад сссдсаддад сссдСдддай Сссадссдсд адддсдасда 1860
адааадаада асСссдадаС дсСасьсада сааЕдсСдда Сасассадда ссасассидс 1920
ЕддаЕдЕдаЕ сСдгссдсас саададсабд сдссассдас дассссаадС. ддСддСасСС 1980
ЕсааадаЕдЕ сабаасадаа ддддаЕддЕс дсасЪаадба сбда 2024
<210> 15
<211> 2015
<212> ДНК
<213> Вгаззгса дипсеа
<400> 15
сасдССсаса аасСсаССса ссассссссг сЕсаСЕЕСЕС ЕсЕсЕсЕсаС сЕаассаЕдд 60
сддсддсаас ассдсссссь ссдаСсСссЕ ЕаассдсЕаа ассЕЕсЕЕсс аааЕссссЕс 120
расссассбс садагссссс ситсссЕСсС ссЕЕаасссс асадааассс ЕссЕсссдЕс 180
сссассдтсс Ссбсдссабс сссдссдЬЬс ЕсаасЕсасс сдЕсааЕдЕс дсассЕдааа 240
ааассдасаа дассаадасб ИсаСсСссс дсЕасдсЕсс сдасдадссс сдсаадддЕд 300
ссдасасссс сдсддаадсс сСсдадсдбс ааддсдЕсда аассдЕсЕЕс дсЕЕаЕсссд 360
даддбассСс саЬддадаСс сассаадссс ЕдасЕсдсЕс сЕссассаЕс сдЕаасдссс 420
Ссссссдбса сдаасаадда ддадссЕСсд ссдссдаддд ЕЕасдсЕсдЕ ЕссЕссддса 480
аассдддааС сХдсаСбдсс ассссдддСс ссддадсЕас саассЕсдЕс адсдддЕЕад 540
ссдасдсдаС дсССдэсадЬ дссссбсЕсд ЕсдссаЕЕас аддасаддгс ссЕсдссдда 600
цдассддеас цдасдссссс саададасдс сааЕсдЕЕда ддЕаасдадд ЕсЕаЕЕасда 660
аасабаасса ЬссддСдасд даЕдСЕдасд асаЕассЕад даЕсдЕЕсаа даадсЕЕЕсЕ 720
ССссадсбас ССссддСада сссддассдд ЕЕЕЕддЕЕда сдЕЕссЕаад даЕаЕЕсадс 780
адсадсССдс даССссСаас Едддассаас сЕаЕдсдсЕЕ дссЕддсЕас аЕдЕсЕаддс 840
сдссбсадсс ассддаадСЬ ссссадссад дЕсадаЕсдЕ ЕаддЕЕдаЕс ЕсддадЕсЕа 900
ададдсссдЕ ьссдсасдсл ддСддСддаа дсЕЕдаасЕс дадЕдаадаа сЕддддадаЕ 960
ббдбедадег бассдддабс ссбдЬбдсда дЕасдЕЕдаЕ ддддсЕЕддс ЕсЕЕаЕссЕ Е 1020
дьаасдагда дССдСсссЕд садаСдсЕСд дсаЬдсасдд дасЕдЕдЕаЕ дсЕаасЕасд 1080
ссдсддадса Радсдасссд ССдсСддсдЕ ЕЕддСдЕЕад дЕЕСдаЕдас сдЕдЕсасдд 1140
дааадсЬсда ддедстгдед адсадддсЕа адаЕЕдЕдса саЕадасаЕЕ даЕЕсЕдсЕд 1200
адагедддаа даасаадаса ссСсасдСдЕ сЕдЕдЕдЕдд ЕдаЕдЕааад сЕддсЕЕЕдс 1260
аадддасдаа сааддссссс дадаассддд сддаддадсЕ саадсЕЕдаЕ ЕЕеддЕдЕЕЕ 1320
ддаддадсда дССдадсдад садааасада адЕЕсссдЕЕ дадсЕЕсааа асдЕСЕддад 1380
аадссаССсс СссдсадСас дсдаСЕсадд ЕссЕадасда дссаасссаа дддааддсаа 1440
СбаСсадсас ЕддСдббдда садсассада ЕдЕдддсддс дсадЕЕЕЕас аадсасадда 1500
адссдаддса сдаССддадс дсССсаСаас
СасСсССдСС аадссаасад асаСдссдса аасСссдада сссдсссдса саасаассдэ дСддсСдСсд дСсСдСддсд даасдССсаа ааасаассад адсСсасасС дсссдсадда адсСаССсад ссаадаасаС аддддаСддс
Сссссаддас аасссСдаСд дадсСддсса сассссддда сассссдддд дсссдсддда асааСдсСдд дСдССассда сдсассаадс ссддадссас сдаССдССдС сааСссдСдС
СддСсаСдса асссддсаад ссссадсссс аСасассСдд
Сдассссаад аседа дддСССсдда ддасассдас ададааСсСС аСдддаадас ддадаасдад дададСдасд ассдСасссд
СддСддсасС сССссСдсСд ддСдаСддаа ссСдСдаада сддССсСаса аСсССсссСа аадааадаад
ССддаСдСса
ССсааадаСд
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2015 <210> 16 <211> 1959 <212> ДНК <213> Вгазз <400> 16 асддсддсдд сссссассса сдСсСссасс даааааассд ддСдсСдаСа сссддаддСд дСсссссссс ддсааассдд ссадссдасд сддаСдаСсд асдааасаСа
ССсСССсСад садсадсадс аддссдсссс сссаададдс адаСССдСсд ссССдСаасд сасдсСдСдд асдддааадс дссдадассд ссдсааддда дСССддадда ддадаадсса дсаассасса аддаадссда дсСдсдаССд ддаадсССса аадасасСсС сасааадсса ссСаасаСдс даадаасСсс дссаСсСдСс даСдСааСаа
1са париз саасассдСс сссссадасс дСссасссдс асаадаСсаа сссссдСдда ссСссаСдда дСсасдааса дааСсСдсаС сдасдсссда дСасСдасдс асСассСддС ссасССссдд ссдсдасссс адссассдда ссдссссдса адсССассдд аСдадССдСс адсасадсда
СсдаддсдСС ддаадаасаа сдаасааддс дсдадссдад
ССссСссдса дСассддСдС ддсадСддсС дадсдсссдс саасдаасдс сдссааасаа асададсСса
СдсадСССдс дадаадссас сдсассаада ссдаадддда ссссссдасс ссссссСссс саСсСссдсс дасСССсаСс адсссСсдад дасссассаа аддаддадсс адссасССсд садСдССссС дссссаадад дасддаСдсс
Садасссдда
Саассдддас адСССсСсад сдССддСддС даСсссСдСС ссСдсадаСд
СССдССдсСд сдсдадсадд дасассссас ссССдадаас сдадсадааа дСасдсдаСС
Сддасадсас дСсдСсссса ддсдаасссС ссаададссд ссадсаСсСС сасссасссс аддадсССдс
СсадасааСд асаСдСдССа сддСсдсасС сссссаассд ссссссссаа дССсСсаасС
СсссдсСасд сдСсааддсд дссССдасСс сссдссдссд ддСсссддад сСсдСсдсса асдссааСсд даСдасаСас ссддССССдд саасссаСдс
ССаддссада ддаадсССда дсдадСасдС сССддсасдс дсдСССддСд дссаадассд дсдсссдсдс сдддсддадд садаадССсс саддСссСад садасдсддд ддасСсддад даСдсдаССд дссасааСсс дддавддЬса ддддасссдд дддаССссад свддасасас ссдаСдаСсс аадвасЕда сВааассСЕс ссссасадаа сасссдЪсаа сСсссдасда дсдааассдС дсьсссссас адддЕсасдс сСассаасс!
Ьсасаддаса
ССдаддСаас сСаддаСсдс ъсдаСдСЕсс дсслдсседд
СсдСЕаддИ:
асСсдадсда
Едасддддсс асдддасьд!
ссаддЕисда
Вдсасасада дСддЕдаЕдС адсЬсаадс!
сдССдадсСС асдадсСаас сддсдсадСС съасдддьсл
ССдЬддаса!
дСдСададаа
ЕдсааСВдда саадддадаа сЕдсдададЕ сСддассдВа саадсддсдд
ССссаааСсс асссСссбсс
СдссдсассС дссссдсаад ссссдсЕЕаС сасссдбаас
СсдвсссСсс сдСсадсддд ддг.ссс5сдс даддСсЬаСС
Есаадаадса ьааддасаНЕ сСасаСдгсС дабсссддад адааседддд
ЬддсСсССаС дсасдссаас
СдассдСдСс сассдасссс ааадсВддсС сдаСИсддС саааасдсСС ссаадддаад ссасаадсас сддасЬсссС сдасддСда!
СсССссЕдСд адавсддИс сдадассСЪс дасдаадааа ссСдЕВддаС сассстсааа
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1959 <210> 17 <211> 2015 <212> ДНК <213> Вгаззгса ^ипсеа <400> 17 сасдССсаса сддсддсаас сасссасссс сссассдссс аасСсаССса аСсдсссссС садаССсСсс ссСсдссасс
ЕсаЬсЬсгс! сксаЬСЕсЕс ьсЕсссссаб ссаассабдд 60 ссдаСсСсс! ЬаассдсЬаа ассВЕсЕСсс аааЕссссСс 120 сССсссВЬсС ссСТаасссс асадааассс СссСсссдСс 180 СссдссдСЕс ссаасссасс сдЕсаасдес дсасссдааа 240 ааассдасаа ссдасасссс даддсдссСс ίсссссдсса аассдддаа с ссдасдсдаС Сдассддсас аасасаасса ссссадссас адсадсссдс сдссссадсс ададдсссдс ССдСсдадсс дСаасдасда сСдСддадса дааадсСсда адассдддаа аадддасдаа ддаддадСда аадсса сссс ССаСсадсас адссдаддса сдаССддадс дсССсаСааС СасСсССдСС аадссаасад асаСдсСдса аасСссдада СсСдСссдса саасаассда даСсаадасС сдСддаадсс саСддадасс сдаасаадда сСдсаССдсс дсссдасадС
СдасдссССс
СсСддСдаСд ссссддсада даССсссаас ассддаадсс сссдсасдсс сассдддасс дССдсссссд
СадСдаСССд ддсдСССдсд дааСаадаса сааддссссс дССдадсдад сссдсадсас
СддСдССдда дСддсСдСсд дСсСдСддсд даасдССсаа ааасаассад адсссасасС дСССдсадда адсСаССсад ссаадаасаС аддддаСддс иссасссссс дсбасдсссс сдасдадссс сдсаадддсд 300 сссдадсдис ааддсдСсда аассдтсссс дсСЕаСсссд 360 сассаадссб ЬдасЬсдсКс сСссассаЕс сдбаасдСсс 420 ддадКсССсд ссдссдаддд ЫасдсЕсд! Ссстссддса 480 асЛЪсдддГс ссддадсЕас саассГсдСс адсдддССад 540 диссбсссд ЬсдссаССас аддасаддсс ссЕсдссдда 600 саададасдс сааЕсдИда ддваасдадд СсВаССасда 660 дагдСЕдасд асаЕассЕад даЬсдЪСсаа даадсссссс 720 сссддассдд ССССддИда сдИссСаад дасаЬСсадс 780 сдддассаас сСаСдсдсЫ дссСддссас асдсссаддс 840 СсссадЕсад дс.сада1сд1 ЕаддтЕдаЕс СсддадгсСа 900 ддЬддЕддаа дсссдааскс дадСдаадаа сбддддадас 960 ссСдСЪдсда дсасдССдаС ддддсстддс ссССаСссСС 1020 садаСдсЪСд дсаСдсасдд дасСдСдса! дсСаасСасд 1080 ссдссддсдс ССддсдбСад дСббдабдас сдСдСсасдд 1140 адсадддсСа адаССдСдса саЬадасаС!: даЕЕсЕдсСд 1200 СОСсасдЬдЬ сЬдбдКдЬдд КдаКдЬааад скддсЬСЬдс 1260 дадаассддд сддаддадсС саадсССдаВ СЕсддСдЕбб 1320 садааасада адССсссдСС дадсССсааа асдСССддад 1380 дсдаЫсадд 1ссСадасда дссаасссаа дддааддсаа 1440 садсаСсада ЬдЪдддсддс дсадССЕСас аадСасадда 1500 СссЬсаддас СсддадсСаС дддСССсдда сССссСдсЬд 1560 аасссСдасд сдассдИдс ддасаССдас ддсдасддаа 1620 дадсСддсса сааСссдСдС ададааСсСС ссСдСдаада 1680 саСсССддда СддСсаСдса аСдддаадас сддССсСаса 1740 сассссдддд асссддсаад ддадаасдад аСссссссса 1800 дсССдсддда ССссадсСдс дададСдасд аадааадаад 1860 асааСдсСдд аСасассСдд ассдСассСд ССддаСдСса 1920 дсдссассда сдассссаад СддСддсасс сссааадасд 1980 сдсасСаадС аседа 2015 <210> 18 <211> 2024 <212> ДНК <213> Вгаззиса эипсеа <400> 18 сасдССсаса сддсддсаас сасссасссс дссасадСсс ссссСдаааа дсаадддсдс сссасссддд дсаасдсссС ссСссддсаа дсддсссадс сСсдСсддас сСаССасдаа аддсССССС С аСаССсадса СдСсСаддсС сСдааСссаа СддддаддСС сссасссссд ссаассасдс дСдссассдд аССсСдсСда СддсСССдса СсддадСССд сдСССддада ддааддсаас аасСсаССса а ссдСссссС. садаССсСсс СсссСссаСс аасСдаааад сдаСаСссСс аддсдес Ссс сссссдСсас ассдддааСс сдасдсдаСд дассддсасс асаСаасСаС сссадссасс дсадсССдсд дссссадссс даддсссдсс СдСддадсСС СаасдаСдад сдсддадсас ааадсесдад даССдддаад адддаСдаас даддадсдаа адссассссс сассадсасс
СсаСсссссд ссааСсСссС ессссссссс
СсадссдССс аасаадасСС дСсдаадссс асддадаСсс даасааддад
СдсаСадсса сссдасадсд дасдсдсссс сСддСсаСдд сссддсадас аССссСаасС ссддаадССС ссдсасдссд асСдддаСсс
ССдСсСсСдс адсдаСССдС дсССССдсда аасаадасдс ааддССсССд ссдадсдадс ссасадСасд ддСдССдддс ессасссссс ссассдссаа ссссаасссс
Ссаасасасс
СсаСсСсссд ссдадсдСса ассаадссСС дадСсСССдс сдСсаддСсс ссссСсСсдС аддадасдсс аСдССдаСда ссддассддс дддаСсадсс сСсадсСадд дсддсддаад сСдСсдсдад адаСдсССдд
СдссддсдСС дсадддсСаа сСсаСдСдЬс адаассдадс адааасаааа сдаССсаддС аасаСсадаС ессссссссс ассЫссссс дсадааассс сдСсааСдСс сСасдсСссс аддсдСсдаа аасСсдассс сдссдадддс сддадссасс сдсСаССаса аассдссдад саСасссадд СССадССдас СаСдсдсССа дсадассдс с сССдаасссд СасСССдасд СаСдсасддд СддСдССадд даССдСдсас СдСдСдСддС ададдадсСс дССсссдссд ссСсдасдад дСдддсддсд сСаассаСдд аааСсссССС СссСсссССс дсасссссСС дасдадсссс ассдсссссд СссассаСсс СасдсссдСС аассссдССа ддасаддСсс дсаасдаддс ассдСдсаад дсссссаадд ссСддССаса аддссдассс адсдасдаас дддессддсс асед сдсасд сссдасдасс ассдасассд даСдССаадс аадсССдасС адссссаааа ссаассдасд садССССаса
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
- 55 025843 адЕасаддаа дссдаддсад ЕддЕЕдЕсаЕ саСсаддссЕ ЕддадсЕаЕд СЕссЕдсСдс саЕЕддадсд ЕсЕдЕддсда асссЕдаЕдс даЕЕдЕЬдЕд дЕдасддаад сСЕсаЕсаЕд ааЕдЕЕсаад адсЕддссас ааЕссдЕдЕа сЕдЕдааддЕ асЕсЕЕдЕЕа аасаассадс аЕсЕЕддсаЕ ддЕЕаЕдсаа ддЕЕсЕасаа адсЕаасада дсЕсасасЕЕ аЕСЕсдддда Ессддсааад ЕсЕЕсссааа саЕдсЕдсад ЕЕЕдсаддад сссдЕдддаЕ ЕссадсЕдсд адааадаада асЕссдадаЕ дсЕаЕЕсада сааЕдсЕдда Еасассадда ЕддаЕдЕдаЕ сЕдЕссдсас саададсаЕд ЕдЕЕассдаЕ даЕсссаадЕ ЕсааадаЕдЕ саЕаасадаа ддддаЕддЕс дсасЕаадЕа седа ддЕЕЕЕддас дасаЕЕдасд дадааЕсЕЕс
ЕдддаадаЕс дадаасдада адддЕдасда ссаЕассЕдЕ ддЕддЕасЕЕ
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2024 <210> 19 <211> 2017 <212> ДНК <213> Вгаззтса париз <4ОО> 19 сасдЕЕсаса ддсддсддса ЕсЕасссаЕЕ ЕсЕссассдЕ ааааассдас ЕдсЕдаЕаЕс сддаддЕдсс ссЕсссссдЕ сааассддда адссдасдсд даЕдаЕсддЕ дааасаЕаас сЕЕЕсЕадсЕ дсадсадсЕЕ дсЕдссЕсад ЕаададдссЕ аЕЕЕдЕсдад ЕЕдЕаасдаЕ сдсЕдЕддад дддааадсЕс ЕдадаЕЕддд дсаадддаЕд ЕЕддаддадЕ адаадссаЕЕ ааЕЕаЕсадЕ даадссдадд ЕдсдаЕЕдда аадсЕ ЕсаЕа даЕасЕсЕЕд сааадсЕаас ЕаасаЕдсЕд адаасЕссда саЕсЕдЕссд СдСааСаасс аасЕсаЕЕса асаЕсдЕсЕЕ ЕссадаЕЕсЕ ссасЕсдсса аадаСсаада сЕсдЕддаад ЕссаЕддада сасдаасаад аЕсЕдсаЕад аЕдсЕЕдаса асЕдасдсдЕ ЕаЕсЕддЕда асССссддСа дсдаЕЕссЕа ссассддаад дЕЕЕЕдЕасд сЕЕасЕддда дадс ЕдЕссс са С а дЕ да С Е даддсдЕЕЕд аадаасаада аасааддЕЕс дадЕ Едадсд ссЕссдсадЕ аседдЕдЕЕд садЕддсЕдС дсдЕсЕдЕдд аЕдаасдЕЕс СЕааасаасс ададсЕсаса садЕЕЕдсад даадсЕаЕЕс сассаадаас дааддддаСд
ЕсаЕсСсСсС ссссдаСсСс сссССсссСС
ЕсСссдссдС сСССсаСсСс сссСсдадсд сссассаадс даддадСсСС ссасЕСсддд дЕдЕЕссЕсЕ
Ессаададас
ЕддаЕдЕЕда дасссддасс асЕдддаЕса
ЕЕЕсЕсадЕЕ
ЕЕддЕддЕдд
ЕсссЕдЕЕдс
ЕдсадаСдсЕ
ЕдЕЕдсЕддс сдадсадддс сассЕсасдЕ
ЕЕдадаассд адсадаааса асдсдаЕЕса дасадсаЕса сдсссЕсадд сдаасссЕда аададсЕддс адсаЕсЕЕдд сЕЕаЕсЕсдд дадсЕЕдсдд адасааЕдсЕ аЕдЕдЕЕасс дСсдсасЕаа сЕсаЕЕЕсЕс сЕЕаассдсЕ сЕссЕЕаасс
ЕсСсаасЕса ссдсСасдсс
ЬсааддсдЕс сЕЕдасЕсдс сдссдссдад
ЕсссддадсЕ сдЕсдссаСс дссааЕсдЕЕ
ЕдасаЕассЕ ддСЕЕСддСС ассЕаЕдсдс аддссадаЕс аадсЕЕдаас дадЕасдЕЕд
ЕддсаЕдсас дЕЕЕддЕдЕЕ
ЕаадаЕЕдЕд дссЕдСдСдЕ ддсддаддад даадЕЕсссд ддЕссЕадас даЕдЕдддсд асссддадсЕ
ЕдсдаЕЕдЕЕ сасааЕссдЕ даЕддСсаЕд ддасссддса даЕЕссадсЕ ддаЕасассЕ даСдаСссса дсассда
ЕсЕсЕсЕсЕс ааассЕЕсЕЕ ссасадааас сссдЕсааЕд сссдасдадс дааассдЕсЕ
ЕссЕссасса ддЕЕасдсЕс ассаассЕсд асаддасадд даддЕаасда аддаЕсдЕЕс даЕдСЕссЕа
ЕЕдссЕддсЕ дЕЕаддЕЕда
ЕсдадЕдаад аЕддддсЕЕд дддасЕдЕдЕ аддЕЕЕдаЕд сасаЕадаса ддЕдаЕдЕаа сЕсаадсЕЕд
ЕЕдадсЕЕса дадсЕаассс дсдсадЕЕЕЕ асдддЕЕЕсд дЕддасаЕЕд дЕададааЕс сааЬдддаад адддадаасд дсдададЕда ддассдЕасс адЕддЕддса аЕсЕаассаЕ ссаааЕсссс ссЕссЕсссд
ЕсдсассЕда сссдсааддд
ЕсдсЕЕаЕсс
ЕссдЕаасдЕ дЕЕссЕссдд
ЕсадсдддЕЕ
ЕсссЕсдссд ддЕсЕаЕЕас аадаадсаЕЕ аддаЕаЕЕса асаЕдЕсЕад
ЕсЕсддадЕс аасЕддддад дсЕсЕЕаЕсс аЕдсЕаасЕа ассдЕдЕсас
ЕЕдаЕЕсЕдс адсЕддсЕЕЕ аЕЕЕсддЕдЕ ааасдЕЕЕдд аадддааддс асаадЕасад дасЕЕссЕдс асддЕдаЕдд
ЕЕссЕдЕдаа аЕсддЕЕсЕа адаЕсЕЕссс сдаадааада
ЕдЕЕддаЕдЕ сЕЕЕсааада
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2017 <210> 20 <211> 2009 <212> ДНК <213> Вгаз:
Аса париз <400> 20 сасдЕЕсаса сЕЕсЕссдаЕ
ЕсЕсссЕЕсс аасЕсаЕЕса сЕссЕЕаасс
СЕЕСЕССЕЕа
ЕсаЕсЕсЕсЕ дсЕааассЕЕ ассссасада сЕссЕсЕаас сЕЕссаааЕс аадасЕссЕс саЕддсддсд сссЕсЕассс ссдЕсЕссас дсаасаЕсдЕ аЕЕЕссадаЕ сдЕссЕсЕсд
120
180 ссаЕсЕссдс сдЕЕсЕсаас ЕсасссдЕса аЕдЕсдсасс ЕссЕЕссссЕ даааааассд 240 асаадаасаа дасЕЕЕсдЕс ЕсссдсЕасд сЕсссдасда дссссдсаад ддЕдсЕдаЕа 300 СссЕсдЕсда адсссЕсдад сдЕсааддсд ЕсдааассдЕ сЕЕЕдсЕЕаЕ сссддаддЕд 360 сЕЕссаЕдда даЕссассаа дссЕЕдасЕс дсЕссЕссас саЕссдЕаас дЕссЕЕсссс 420 дЕсасдааса аддаддадЕс ЕЕсдссдссд адддЕЕасдс ЕсдЕЕссЕсс ддсааассдд 480 дааЕсЕдсаС адссасЕЕсд ддЕсссддад сЕассаассЕ сдЕсадсддд ЕЕадсадасд 540 сдаЕдсСЕда садЕдСЕссЕ сЕЕдЕсдсса ЕЕасаддаса ддЕсссЕсдс сддаЕдаЕсд 600 дЕасЕдасдс сЕЕссаадад асассааЕсд ЕЕдаддЕаас даддЕсЕаЕЕ асдааасаЕа 660 асЕаЕСЕддЕ даЕддаЕдЕЕ даЕдасаЕас сЕаддаЕсдЕ ЕсаадаадсЕ ЕЕсЕЕЕсЕад 720 СЕасЕЕссдд Еадасссдда ссддЕЕЕЕдд ЕСдаЕдЕЕсс ЕааддаЕаЕЕ садсадсадс 780 ЕЕдсдаЕЕсс ЕаасЕдддаЕ саассЕаЕдс дсЕЕассЕдд сЕасаЕдЕсЕ аддЕЕдссЕс 840 адссЕссдда адЕЕСсЕсад ЕЕаддЕсада ЕсдЕЕаддЕЕ даЕсЕсддад ЕсЕаададдс 900 СЕдЕЕЕЕдЕа сдССддСддС ддаадсЕЕда асЕсдадЕда адаасЕдддд адаЕЕЕдЕсд 960 адсЕЕасЕдд даЕссссдЕЕ дсдадЕасЕЕ ЕдаЕддддсЕ ЕддсЕсЕЕаЕ ссЕЕдЕаасд 1020 аЕдадЕЕдЕс ссЕдсадаЕд сЕЕддсаЕдс асдддасЕдЕ дЕаЕдсЕаас ЕасдсЕдЕдд 1080 адсаЕадЕда ЕЕЕдСЕдсЕд дсдСЕСддЕд ЕЕаддЕЕЕда ЕдассдСдЕс асдддааадс 1140 ЕсдаддсЕЕЕ сдсЕадсадд дсЕааааЕЕд ЕдсасаЕада саЕЕдаЕЕсЕ дсЕдадаЕЕд 1200 ддаадааЕаа дасассЕсас дЕдЕсЕдЕдЕ дЕддЕдаЕдЕ ааадсЕддсЕ ЕЕдсааддда 1260 ЕдаасааддЕ ЕСЕЕдадаас сдддсддадд адсЕсаадсЕ СдаСССсддС дЕЕЕддадда 1320 дЕдадЕЕдад сдадсадааа садаадЕЕсс сСЕЕдадсЕЕ саааасдЕЕЕ ддадаадсса 1380 ЕЕссЕссдса дЕасдсдаЕЕ садаЕссЕсд асдадсЕаас сдаадддаад дсааЕЕаЕса 1440 дЕасЕддЕдЕ ЕддасадсаЕ садаЕдЕддд сддсдсадЕЕ ЕЕасаадЕас аддаадссда 1500 дасадЕддсЕ дЕсдЕсаЕса ддссЕсддад сЕаЕдддЕЕЕ ЕддасЕЕссЕ дсЕдсдаЕЕд 1560 дадсдЕсЕдЕ ддсдаасссЕ даЕдсдаЕЕд ЕЕдЕддаЕаЕ ЕдасддЕдаЕ ддаадсЕЕса 1620 ЕааЕдаасдЕ ЕсаададсЕд дссасааЕсс дЕдЕададаа ЕсЕЕссЕдЕд аадаЕасСсЕ 1680 ЕдЕЕааасаа ссадсаЕсЕЕ дддаЕддЕса ЕдсааЕддда адаЕсддЕЕс ЕасааадсЕа 1740 асададсЕса сасЕЕаЕсЕс ддддасссдд саадддадаа сдадаЕсЕЕс ссЕаасаЕдс 1800 ЕдсадЕЕЕдс аддадсЕЕдс дддаЕЕссад сЕдсдададЕ дасдаадааа даадаасЕсс 1860 дадаадсЕаЕ ЕсадасааЕд сЕддаЕасас саддассаЕа ссЕдЕЕддаЕ дЕдаЕаЕдЕс 1920 сдсассаада асаЕдЕдЕЕа ссдаЕдаЕсс саадЕддЕдд сасЕЕЕсааа даЕдЕааЕаа 1980 садаадддда ЕддЕсдсасЕ аадЕасЕда 2009

Claims (47)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Устойчивое к гербициду растение Втаккюа щпсеа, содержащее геном А, включающий ген большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (АНА8Б) генома А Втаккюа, кодирующий первый устойчивый к гербициду полипептид (АНА8Б), имеющий замещение на лейцин в положении 556 в последовательности 8Е() II) N0:6, и геном В, включающий ген АНА8Б генома В Втаккюа, кодирующий второй устойчивый к гербициду полипептид АНА8Б, который имеет замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности 8Е() ГО N0:2, где первый и второй устойчивые к гербициду полипептиды АНА8Б, оба вместе, обеспечивают синергический уровень резистентности к АНА8-ингибирующему гербициду указанному растению Втаккюа щпсеа.
  2. 2. Устойчивое к гербициду растение Втаккюа щпсеа, содержащее геном А, включающий ген большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (АНА8Б), кодирующий первый устойчивый к гербициду полипептид субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (АНА8Б), который имеет замещение на треонин в положении 104 в последовательности 8Е() ГО N0:5, и геном В, включающий ген АНА8Б генома
    - 56 025843
    В Вгаккюа, кодирующий второй устойчивый к гербициду полипептид (АНАЗЬ), который имеет замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности ЗЕО ГО N0:2, где первый и второй устойчивые к гербициду полипептиды АНАЗЬ, оба вместе, предоставляют указанному растению Вгаккюа _)ипсеа синергический уровень резистентности к АНАЗ-ингибирующему гербициду.
  3. 3. Устойчивое к гербициду растение Вгаккюа _)ипсеа по п.2, где ген АНАЗЬ в геноме А локализирован в локусе АНАЗЬ генома А.
  4. 4. Устойчивое к гербициду растение Вгаккюа _)ипсеа по любому из пп.1-3, где устойчивое к гербициду растение Вгаккюа .щпсеа обладает по меньшей мере или примерно на 10% более высокой резистентностью по сравнению с аддитивными уровнями резистентности для растения Вгаккюа _)ипсеа, содержащего первый ген АНАЗЬ, и растения Вгаккюа .щпсеа, содержащего второй ген АНАЗЬ.
  5. 5. Устойчивое к гербициду растение Вгаккюа _)ипсеа по п.4, где устойчивое к гербициду растение Вгаккюа _)ипсеа обладает по меньшей мере или примерно на 20% более высокой резистентностью по сравнению с аддитивными уровнями резистентности для растения Вгаккюа _)ипсеа, содержащего первый ген АНАЗЬ, и растения Вгаккюа .щпсеа, содержащего второй ген АНАЗЬ.
  6. 6. Устойчивое к гербициду растение Вгаккюа _)ипсеа по п.5, где устойчивое к гербициду растение Вгаккюа .щпсеа обладает по меньшей мере или примерно на 30% более высокой резистентностью по сравнению с аддитивными уровнями резистентности для растения Вгаккюа _)ипсеа, содержащего первый ген АНАЗЬ, и растения Вгаккюа .(ипсеа, содержащего второй ген АНАЗЬ.
  7. 7. Часть устойчивого к гербициду растения Вгаккюа .щпсеа по любому из пп.1-6, где часть растения содержит гены АНАЗЬ, кодирующие устойчивые к гербициду полипептиды АНАЗЬ, раскрытые в пп.1, 2, и часть растения выбрана из каллусов растений, протопластов растений, культур растительных клеток, стеблей, листьев, корней, соцветий, цветов, цветов компактного соцветия, плодов, цветоножек, плодоножек, тычинок, пыльников, рылец, столбиков, завязей, лепестков, чашелистиков, плодолистиков, кончиков корня, корневых чехликов, корневых волосков, волосков семени, пыльцевых зерен, микроспор, зародышей, семяпочек, семядолей, гипокотилей, эпикотилей, ксилем, флоэм, паренхим, эндоспермов, клетокспутниц, замыкающих клеток.
  8. 8. Часть растения по п.7, где часть растения выбрана из пыльцы, протопластов и завязей.
  9. 9. Клетка устойчивого к гербициду растения Вгаккюа .щпсеа по любому из пп.1-6, где клетка растения содержит гены АНАЗЬ, кодирующие устойчивые к гербициду полипептиды АНАЗЬ, раскрытые в пп.1, 2.
  10. 10. Семя устойчивого к гербициду растения Вгаккюа .щпсеа по любому из пп.1-6, где семя растения содержит гены АНАЗЬ, кодирующие устойчивые к гербициду полипептиды АНАЗЬ, раскрытые в пп.1, 2.
  11. 11. Семя по п.10, где семя обработано препаратом для обработки семян, содержащим АНАЗингибирующий гербицид.
  12. 12. Семя по п.11, где препарат для обработки семян включает один или несколько гербицидов, выбранных из имидазолинонового гербицида, сульфонилмочевиного гербицида, триазолопиримидинового гербицида и пиримидинилоксибензоатового гербицида.
  13. 13. Семя по п.12, где препарат для обработки семян включает имидазолиноновый гербицид.
  14. 14. Семя по п.13, где имидазолиноновый гербицид включает один или несколько гербицидов, выбранных из имазетапира, имазапика, имазамокса, имазахина и имазапира.
  15. 15. Способ борьбы с сорняками, растущими на поле с растениями рода Вгаккюа, где указанный способ включает выращивание на поле устойчивого к гербициду растения Вгаккюа _)ипсеа по любому из пп.1-6 и приведение в контакт указанного растения Вгаккюа .щпсеа и сорняков, растущих на поле, с эффективным количеством гербицида, ингибирующего АНАЗ, к которому растение Вгаккюа .щпсеа является устойчивым, осуществляя тем самым борьбу с сорняками.
  16. 16. Способ по п.15, в котором гербицид включает один или несколько гербицидов, выбранных из имидазолинонового гербицида, сульфонилмочевинного гербицида, триазолопиримидинового гербицида и пиримидинилоксибензоатного гербицида.
  17. 17. Способ по п.16, в котором гербицид включает имидазолиноновый гербицид.
  18. 18. Способ по п.17, где имидазолиноновый гербицид включает один или несколько гербицидов, выбранных из имазетапира, имазапика, имазамокса, имазахина и имазапира.
  19. 19. Способ борьбы с сорняками, растущими на поле в непосредственной близости от семян растений рода Вгаккюа, где указанный способ включает посев обработанного семени по любому из пп. 11-13.
  20. 20. Способ по п.19, в котором гербицид, ингибирующий АНАЗ, включает один или несколько гербицидов, выбранных из имидазолинонового гербицида, сульфонилмочевиного гербицида, триазолопиримидиного гербицида и пиримидинилоксибензоатного гербицида.
  21. 21. Способ по п.20, в котором гербицид включает имидазолиноновый гербицид.
  22. 22. Способ по п.21, где имидазолиноновый гербицид включает один или несколько гербицидов, выбранных из имазетапира, имазапика, имазамокса, имазахина и имазапира.
  23. 23. Семя по п.11, где семя обработано одним из следующих способов: опрыскивание семени, нанесение покрытия на семя, окатывание семени, опыление семени, пропитка семени, пеллетизация семени,
    - 57 025843 или их комбинация.
  24. 24. Семя по п.11, где семя обработано перед посевом семени и/или после проращивания семени.
  25. 25. Способ отбора устойчивого к гербициду растения Вгаккюа .(ипсеа из множества растений Вгаккюа, включающий предоставление множества растений Вгаккюа, которое может включать устойчивое к гербициду растение Вгаккюа .(ипсеа по любому из пп.1-6;
    нанесение эффективного количества АНА8-ингибирующего гербицида на указанное растение Вгаккюа .(ипсеа и идентификацию растения Вгаккюа .(ипсеа, способного расти в присутствии указанного гербицида, осуществляя тем самым отбор растения Вгаккюа .(ипсеа, устойчивого к гербициду.
  26. 26. Способ по п.25, в котором гербицид включает один или несколько гербицидов, выбранных из имидазолинонового гербицида, сульфонилмочевинного гербицида, триазолопиримидинового гербицида и пиримидинилоксибензоатного гербицида.
  27. 27. Способ по п.26, в котором гербицид включает имидазолиноновый гербицид.
  28. 28. Способ по п.27, где имидазолиноновый гербицид включает один или несколько гербицидов, выбранных из имазетапира, имазапика, имазамокса, имазахина и имазапира.
  29. 29. Экспрессирующий вектор, содержащий:
    (a) первую молекулу полинуклеотида, большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (АНА8Ь), кодирующую первый устойчивый к гербициду полипептид АНА8Ь, имеющий замещение на лейцин в положении 556 в последовательности 8Е0 ГО NО:6, и вторую молекулу полинуклеотида АНА8Ь, кодирующую второй устойчивый к гербициду полипептид АНА8Ь, который имеет замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности 8Е0 ГО NО:2, или (b) первую молекулу полинуклеотида большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (АНА8Ь), кодирующую первый устойчивый к гербициду полипептид АНА8Ь, имеющий замещение на треонин в положении 104 в последовательности 8ЕО ГО NО:5, и вторую молекулу полинуклеотида АНА8Ь, кодирующую второй устойчивый к гербициду полипептид АНА8Ь, который имеет замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности 8ЕО ГО NО:2.
  30. 30. Трансформированное растение, которое трансформировано экспрессирующим вектором по п.29 и имеет повышенную устойчивость к АНА8-ингибирующему гербициду.
  31. 31. Растение по п.30, где гербицид выбран из группы, состоящей из имидазолиноновых гербицидов, сульфонилмочевинных гербицидов, триазолопиримидиновых гербицидов и пиримидинилоксибензоатовых гербицидов.
  32. 32. Растение по п.31, где растение выбрано из В. .(ипсеа, В. парик, В. гара, В. саппаШ В. о1егасеа и В.
    И1§га.
  33. 33. Способ получения трансгенного растения, имеющего повышенную устойчивость к АНА8ингибирующим гербицидам, включающий стадии трансформации растительной клетки экспрессирующим вектором по п.29 и регенерации из растительной клетки трансгенного растения, которое экспрессирует полипептиды АНА8Ь.
  34. 34. Способ идентификации или отбора устойчивой к гербициду трансформированной растительной клетки, растительной ткани или растения или его части из множества трансформированных растительных клеток, растительной тканей или растений или его частей, включающий получение множества трансформированных растительных клеток, растительной ткани или растений или его частей, которые могут включать трансформированную растительную клетку, растительную ткань или растение или его часть, которые содержат полинуклеотиды АНА8Ь экспрессирующего вектора по п.29, причем полинуклеотиды АНА8Ь кодируют мутантные полипептиды АНА8Ь, которые обеспечивают устойчивость к АНА8-ингибирующему гербициду трансформированной растительной клетке, растительной ткани или растению или его части, экспрессирующие данные полипептиды, причем полипептиды используются в качестве селективных маркеров;
    осуществление контакта трансформированных растительных клеток, растительных тканей, растений или их частей по меньшей мере с одним АНА8-ингибирующим гербицидом;
    определение того, подвергается ли растительная клетка, растительная ткань, растение или его часть действию АНА8-ингибирующего гербицида; и идентификацию или отбор устойчивой к гербициду трансформированной растительной клетки, растигельной ткани, растения или его части, которые содержат полинуклеотиды АНА8Ь экспрессирующего вектора по п.29.
  35. 35. Способ получения устойчивого к АНА8-ингибирующему гербициду растения, включающий скрещивание первого растения, которое является резистентным к гербициду, со вторым растением, которое не является устойчивым к гербициду, при этом первое растение является растением по любому из пп.1-6, и отбор растения-потомка, которое устойчиво к гербициду.
  36. 36. Устойчивое к АНА8-ингибирующему гербициду растение, полученное способом по п.35.
  37. 37. Семя растения по п.36, где семя содержит гены АНА8Ь первого растения.
    - 58 025843
  38. 38. Способ получения устойчивого к АНА8-ингибирующему гербициду семени растения Вгакыса, при этом способ включает скрещивание первого растения Вгакыса со вторым растением Вгакыса с получением растенияпотомка, где первое растение Вгакыса представляет собой устойчивое к гербициду растение Вгакыса цтсеа по любому из пп.1-6;
    получение семян от растения-потомка.
  39. 39. Применение семени по любому из пп.10 и 37 для получения масла из семени.
  40. 40. Применение семени по любому из пп.10 и 37 для получения пищевого продукта на основе семени.
  41. 41. Способ идентификации растения по любому из пп.1-6, включающий:
    a) получение биологического материала из растения,
    b) осуществление ПЦР или исследования на основе гибридизации генов АНА8Ь указанного биологического материала с целью определения (ί) содержит ли его геном А ген АНА8Ь, который кодирует первый полипептид АНА8Ь, раскрытый в любом из пп.1-6, и (ίί) содержит ли его геномом В ген АНА8Ь, который кодирует второй полипептид АНА8Ь, раскрытый в любом из пп.1, 2, и
    c) идентификацию растения, упомянутого на стадии а), имеющего признаки растения по любому из пп.1-6, основываясь на полученных результатах стадии Ь).
  42. 42. Способ по п.41, где указанным биологическим материалом является семя растения.
  43. 43. Способ по п.42, где гербицид включает один или несколько гербицидов, выбранных из имидазолинонового гербицида, сульфонилмочевиного гербицида, триазолопиримидинового гербицида, пиримидинилоксибензоатного гербицида.
  44. 44. Способ по п.43, где гербицид включает имидазолиноновый гербицид.
  45. 45. Способ по п.44, где имидазолиноновый гербицид включает один или несколько гербицидов, выбранных из имазетапира, имазапика, имазамокса, имазахина и имазапира.
  46. 46. Способ получения устойчивого к гербициду растения Вгакыса цтсеа, где способ включает трансформацию клетки растения Вгакыса:
    (a) первым экспрессирующим вектором, содержащим первую молекулу полинуклеотида большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (АНА8Ь), кодирующую первый устойчивый к гербициду полипептид АНА8Ь, имеющий замещение на лейцин в положении 556 в последовательности 8Еф ГО N0:6, и вторым экспрессирующим вектором, содержащим вторую молекулу полинуклеотида АНА8Ь, кодирующую второй устойчивый к гербициду полипептид АНА8Ь, который имеет замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности 8Еф ГО N0:2, или (b) первым экспрессирующим вектором, содержащим первую молекулу полинуклеотида большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (АНА8Ь), кодирующую первый устойчивый к гербициду полипептид АНА8Ь, имеющий замещение на лейцин в положении 104 в последовательности 8Еф ГО N0:5, и вторым экспрессирующим вектором, содержащим вторую молекулу полинуклеотида АНА8Ь, кодирующую второй устойчивый к гербициду полипептид АНА8Ь, который имеет замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности 8Еф ГО N0:2, и регенерацию из растительной клетки растения Вгакыса, которое экспрессирует первый и второй полипептиды АНА8Ь.
  47. 47. Способ получения устойчивого к гербициду растения Вгакыса цтсеа, где способ включает трансформацию клетки растения Вгакыса экспрессирующим вектором и регенерацию из растительной клетки Вгакыса растения Вгакыса, которое экспрессирует по крайней мере два устойчивых к гербициду полинуклеотида, представляющие собой большую субъединицу синтазы ацетогидроксикислот (АНА8Ь), где:
    (a) растительная клетка изначально содержит молекулу полинуклеотида АНА8Ь, кодирующую устойчивый к гербициду полипептид АНА8Ь, имеющий замещение на лейцин в положении 556 в последовательности 8Еф ГО N0:6, и указанная клетка трансформирована экспрессирующим вектором, содержащим молекулу полинуклеотида АНА8Ь, кодирующую устойчивый к гербициду полипептид АНА8Ь, который имеет замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности 8Еф ГО N0:2, (b) растительная клетка изначально содержит молекулу полинуклеотида АНА8Ь, кодирующую устойчивый к гербициду полипептид АНА8Ь, имеющий замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности 8Еф ГО N0:2, и указанная клетка трансформирована экспрессирующим вектором, содержащим молекулу полинуклеотида АНА8Ь, кодирующую устойчивый к гербициду полипептид АНА8Ь, который имеет замещение на лейцин в положении 556 в последовательности 8Еф ГО N0:6, (c) растительная клетка изначально содержит молекулу полинуклеотида АНА8Ь, кодирующую устойчивый к гербициду полипептид АНА8Ь, имеющий замещение на треонин в положении 104 в последовательности 8Еф ГО N0:5, и указанная клетка трансформирована экспрессирующим вектором, содержащим молекулу полинуклеотида АНА8Ь, кодирующую устойчивый к гербициду полипептид АНА8Ь, который имеет замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности 8Еф ГО N0:2, или (й) растительная клетка изначально содержит молекулу полинуклеотида АНА8Ь, кодирующую устойчивый к гербициду полипептид АНА8Ь, имеющий замещение на аспарагин в положении 638 в после- 59 025843 довательности ЗЕф ΙΌ N0:2, и указанная клетка трансформирована экспрессирующим вектором, содержащим молекулу полинуклеотида АНАЗЬ, кодирующую устойчивый к гербициду полипептид АНАЗЬ, который имеет замещение на треонин в положении 104 в последовательности ЗЕф ГО N0:5.
EA200970925A 2007-04-04 2008-04-03 Устойчивое к гербициду растение brassica juncea, способ борьбы с сорняками и способы получения и идентификации устойчивого к гербициду растения brassica juncea EA025843B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US91000807P 2007-04-04 2007-04-04
PCT/IB2008/002645 WO2009031031A2 (en) 2007-04-04 2008-04-03 Herbicide-resistant brassica plants and methods of use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200970925A1 EA200970925A1 (ru) 2010-04-30
EA025843B1 true EA025843B1 (ru) 2017-02-28

Family

ID=40429466

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201691453A EA036108B1 (ru) 2007-04-04 2008-04-03 Резистентные к гербицидам растения brassica и способы применения
EA200970925A EA025843B1 (ru) 2007-04-04 2008-04-03 Устойчивое к гербициду растение brassica juncea, способ борьбы с сорняками и способы получения и идентификации устойчивого к гербициду растения brassica juncea

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201691453A EA036108B1 (ru) 2007-04-04 2008-04-03 Резистентные к гербицидам растения brassica и способы применения

Country Status (18)

Country Link
US (4) US20100115650A1 (ru)
EP (6) EP2543731B1 (ru)
JP (2) JP5965582B2 (ru)
KR (2) KR20150023919A (ru)
CN (3) CN103992986A (ru)
AR (1) AR066209A1 (ru)
AU (1) AU2008294493C1 (ru)
BR (1) BRPI0822358B1 (ru)
CA (2) CA2682331C (ru)
CL (3) CL2008000991A1 (ru)
EA (2) EA036108B1 (ru)
GE (1) GEP20146128B (ru)
HU (1) HUE032487T2 (ru)
MX (3) MX2009010644A (ru)
NZ (3) NZ580107A (ru)
PL (1) PL3243905T3 (ru)
UA (1) UA100122C2 (ru)
WO (1) WO2009031031A2 (ru)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100115650A1 (en) 2007-04-04 2010-05-06 Kening Yao Herbicide-Resistant Brassica Plants and Methods of Use
BRPI0919380A2 (pt) * 2008-09-26 2015-08-18 Basf Agrochemical Products Bv Moléculas de ácido nucleico, vetores de expressão, bom como métodos para controlar ervas daninhas e para produzir uma planta brassica
JP2011083260A (ja) * 2009-10-19 2011-04-28 Chubu Electric Power Co Inc キク属植物およびその作出方法
EP2516651A1 (en) 2009-12-22 2012-10-31 Bayer CropScience NV Herbicide tolerant plants
PL2627183T5 (pl) * 2010-10-15 2024-02-05 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Zastosowanie herbicydów inhibitorów ALS do kontroli niechcianej roślinności w roślinach Beta vulgaris z tolerancją herbicydów inhibitorów ALS
EA029716B1 (ru) 2011-05-04 2018-05-31 Байер Интеллектчуал Проперти Гмбх Применение гербицидов ингибиторов als для борьбы с нежелательными растениями среди растений brassica, таких как b. napus, толерантных к гербицидам ингибиторов als
EP2704555A1 (en) * 2011-05-04 2014-03-12 Bayer Intellectual Property GmbH Als inhibitor herbicide tolerant b. napus mutants
WO2013081987A1 (en) * 2011-11-29 2013-06-06 Agrigenetics, Inc. High throughput single nucleotide polymorphism assay
WO2013127766A1 (en) 2012-02-29 2013-09-06 Bayer Cropscience Nv Als inhibitor herbicide tolerant b. napus mutants
EP4019640A1 (en) * 2012-04-05 2022-06-29 Advanta Holdings BV Sorghum plants having a mutant polynucleotide encoding the large subunit of mutated acetohydroxyacid synthase protein and increased resistance to herbicides
WO2015004242A1 (en) 2013-07-12 2015-01-15 Bayer Cropscience Nv Als inhibitor herbicide tolerant mutant plants
US10676755B2 (en) * 2015-01-10 2020-06-09 Cibus Us Llc Mutated acetohydroxyacid synthase genes in euphorbiaceae and plant material comprising such genes
AU2016279764B2 (en) * 2015-06-16 2020-09-10 Basf Agrochemical Products B.V. Method for managing flea beetles of the family Chrysomelidae in Brassica crops
JP2017118878A (ja) * 2017-01-16 2017-07-06 アドヴァンタ・ホールディングス・ベスローテン・フェンノートシャップ 突然変異アセトヒドロキシ酸合成酵素タンパク質のラージサブユニットをコードする突然変異ポリヌクレオチドを有し、除草剤耐性が増大したソルガム植物
CN107058350A (zh) * 2017-03-20 2017-08-18 江苏省农业科学院 基于体外定点突变获得的油菜抗多种als抑制剂类除草剂基因及应用
DE112018006097T5 (de) * 2018-08-24 2020-09-03 Jiangsu Academy Of Agricultural Sciences Gegen Triazolpyrimidin-Herbizid resistentes Rapsgen und seine Verwendung
JP2019141045A (ja) * 2019-03-04 2019-08-29 アドヴァンタ・ホールディングス・ベスローテン・フェンノートシャップ 突然変異アセトヒドロキシ酸合成酵素タンパク質のラージサブユニットをコードする突然変異ポリヌクレオチドを有し、除草剤耐性が増大したソルガム植物

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020138866A1 (en) * 2000-03-10 2002-09-26 Gingera Gregory R. Herbicide tolerant brassica juncea and method of production
WO2003014357A1 (en) * 2001-08-09 2003-02-20 University Of Saskatchewan Wheat plants having increased resistance to imidazolinone herbicides
US20040171027A1 (en) * 2002-10-29 2004-09-02 Stephen Barnes Assay for imidazolinone resistance mutations in Brassica species
US20050283858A1 (en) * 2004-06-22 2005-12-22 Kening Yao Brassica AHAS genes and gene alleles that provide resistance to imidazolinone herbicides
WO2006007373A2 (en) * 2004-06-16 2006-01-19 Basf Plant Science Gmbh Polynucleotides encoding mature ahasl proteins for creating imidazolinone-tolerant plants
WO2009046334A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-09 Cibus Llc Mutated acetohydroxyacid synthase genes in brassica

Family Cites Families (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2080506A (en) 1933-04-14 1937-05-18 Western Electric Co Process of and apparatus for electroplating articles
US3060084A (en) 1961-06-09 1962-10-23 Du Pont Improved homogeneous, readily dispersed, pesticidal concentrate
US3299566A (en) 1964-06-01 1967-01-24 Olin Mathieson Water soluble film containing agricultural chemicals
US4144050A (en) 1969-02-05 1979-03-13 Hoechst Aktiengesellschaft Micro granules for pesticides and process for their manufacture
US3920442A (en) 1972-09-18 1975-11-18 Du Pont Water-dispersible pesticide aggregates
US4172714A (en) 1976-12-20 1979-10-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Dry compactible, swellable herbicidal compositions and pellets produced therefrom
GB2095558B (en) 1981-03-30 1984-10-24 Avon Packers Ltd Formulation of agricultural chemicals
NZ201918A (en) 1981-09-18 1987-04-30 Genentech Inc N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone
US5380831A (en) 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
US4761373A (en) 1984-03-06 1988-08-02 Molecular Genetics, Inc. Herbicide resistance in plants
US5304732A (en) 1984-03-06 1994-04-19 Mgi Pharma, Inc. Herbicide resistance in plants
US5331107A (en) 1984-03-06 1994-07-19 Mgi Pharma, Inc. Herbicide resistance in plants
US6211439B1 (en) 1984-08-10 2001-04-03 Mgi Pharma, Inc Herbicide resistance in plants
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5569597A (en) 1985-05-13 1996-10-29 Ciba Geigy Corp. Methods of inserting viral DNA into plant material
US5013659A (en) 1987-07-27 1991-05-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
US5268463A (en) 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
US5608142A (en) 1986-12-03 1997-03-04 Agracetus, Inc. Insecticidal cotton plants
US4873192A (en) 1987-02-17 1989-10-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection
US5316931A (en) 1988-02-26 1994-05-31 Biosource Genetics Corp. Plant viral vectors having heterologous subgenomic promoters for systemic expression of foreign genes
US5990387A (en) 1988-06-10 1999-11-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stable transformation of plant cells
US5180587A (en) 1988-06-28 1993-01-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Tablet formulations of pesticides
US5034323A (en) 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5231020A (en) 1989-03-30 1993-07-27 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5240855A (en) 1989-05-12 1993-08-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Particle gun
US5879918A (en) 1989-05-12 1999-03-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Pretreatment of microprojectiles prior to using in a particle gun
DK0415688T3 (da) 1989-08-30 1999-08-23 Aeci Ltd Fremgangsmåde til fremstilling af et doseringssystem samt fremgangsmåde til behandling af en genstand eller et locus
US5322783A (en) 1989-10-17 1994-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean transformation by microparticle bombardment
US5372989A (en) 1990-03-12 1994-12-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Water-dispersible or water-soluble pesticide grandules from heat-activated binders
DE69133128T2 (de) 1990-04-12 2003-06-18 Syngenta Participations Ag Gewebe-spezifische Promotoren
JP3387495B2 (ja) 1990-04-26 2003-03-17 プラント・ジエネテイツク・システムズ・エヌ・ベー 新規のＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ株及び殺虫毒素をコードするそれらの遺伝子
US5498830A (en) 1990-06-18 1996-03-12 Monsanto Company Decreased oil content in plant seeds
DE69122201T2 (de) 1990-10-11 1997-02-06 Sumitomo Chemical Co Pestizide Zusammensetzung
US5932782A (en) 1990-11-14 1999-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transformation method using agrobacterium species adhered to microprojectiles
US5277905A (en) 1991-01-16 1994-01-11 Mycogen Corporation Coleopteran-active bacillus thuringiensis isolate
US5399680A (en) 1991-05-22 1995-03-21 The Salk Institute For Biological Studies Rice chitinase promoter
US5731180A (en) 1991-07-31 1998-03-24 American Cyanamid Company Imidazolinone resistant AHAS mutants
AU675628B2 (en) 1991-08-02 1997-02-13 Sumitomo Chemical Company, Limited Novel microorganism and insecticide
AU2515592A (en) 1991-08-23 1993-03-16 University Of Florida A novel method for the production of transgenic plants
DE69230290T2 (de) 1991-08-27 2000-07-20 Novartis Ag Proteine mit insektiziden eigenschaften gegen homopteran insekten und ihre verwendung im pflanzenschutz
TW261517B (ru) 1991-11-29 1995-11-01 Mitsubishi Shozi Kk
US5324646A (en) 1992-01-06 1994-06-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of regeneration of Medicago sativa and expressing foreign DNA in same
US5593874A (en) 1992-03-19 1997-01-14 Monsanto Company Enhanced expression in plants
JP2952041B2 (ja) 1992-07-27 1999-09-20 パイオニア ハイ−ブレッド インターナショナル，インコーポレイテッド 培養ダイズ細胞のａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換の改良法
US5545822A (en) 1992-08-21 1996-08-13 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Herbicide resistant rice
IL108241A (en) 1992-12-30 2000-08-13 Biosource Genetics Corp Plant expression system comprising a defective tobamovirus replicon integrated into the plant chromosome and a helper virus
DE4322211A1 (de) 1993-07-03 1995-01-12 Basf Ag Wäßrige, mehrphasige, stabile Fertigformulierung für Pflanzenschutz-Wirkstoffe und Verfahren zu ihrer Herstellung
AU692791B2 (en) * 1993-10-12 1998-06-18 Agrigenetics, Inc. Brassica napus variety AG019
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5593881A (en) 1994-05-06 1997-01-14 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis delta-endotoxin
US5736369A (en) 1994-07-29 1998-04-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for producing transgenic cereal plants
US5608144A (en) 1994-08-12 1997-03-04 Dna Plant Technology Corp. Plant group 2 promoters and uses thereof
CA2160529A1 (en) 1994-10-14 1996-04-15 Toshihiko Iizuka Bacillus strain and harmful organism controlling agents
US5659026A (en) 1995-03-24 1997-08-19 Pioneer Hi-Bred International ALS3 promoter
US5737514A (en) 1995-11-29 1998-04-07 Texas Micro, Inc. Remote checkpoint memory system and protocol for fault-tolerant computer system
US5773704A (en) 1996-04-29 1998-06-30 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Herbicide resistant rice
US5731181A (en) * 1996-06-17 1998-03-24 Thomas Jefferson University Chimeric mutational vectors having non-natural nucleotides
US6072050A (en) 1996-06-11 2000-06-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Synthetic promoters
US5859348A (en) 1996-07-17 1999-01-12 Board Of Trustees Operating Michigan State University Imidazolinone and sulfonyl urea herbicide resistant sugar beet plants
US5773702A (en) 1996-07-17 1998-06-30 Board Of Trustees Operating Michigan State University Imidazolinone herbicide resistant sugar beet plants
US5981840A (en) 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
JP2001512687A (ja) * 1997-08-05 2001-08-28 キメラジェン，インコーポレーテッド 植物に局在性遺伝子変化を生じさせるための混合二本鎖オリゴヌクレオチドの使用
AR014072A1 (es) 1998-02-26 2001-01-31 Pioneer Hi Bred Int Molecula de acido nucleico aislada que tiene una secuencia nucleotidica para un promotor que es capaz de iniciar una transcripcion constitutiva en unacelula de planta, construccion adn, vector, celula huesped, metodo para expresar en forma constitutiva una secuencia nucleotidica heteroloca en una
US6348643B1 (en) 1998-10-29 2002-02-19 American Cyanamid Company DNA sequences encoding the arabidopsis acetohydroxy-acid synthase small subunit and methods of use
WO2000028058A2 (en) 1998-11-09 2000-05-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Transcriptional activator lec1 nucleic acids, polypeptides and their uses
US6936467B2 (en) * 2000-03-27 2005-08-30 University Of Delaware Targeted chromosomal genomic alterations with modified single stranded oligonucleotides
US20030097692A1 (en) * 2000-12-21 2003-05-22 Georg Jander Plants with imidazolinone-resistant ALS
JP4275538B2 (ja) * 2002-03-29 2009-06-10 クミアイ化学工業株式会社 アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子
EP1558767A2 (en) 2002-10-29 2005-08-03 BASF Plant Science GmbH Compositions and methods for identifying plants having increased tolerance to imidazolinone herbicides
US7432082B2 (en) 2004-03-22 2008-10-07 Basf Ag Methods and compositions for analyzing AHASL genes
CN101031646B (zh) * 2004-07-30 2013-09-25 巴斯夫农业化学产品公司 抗除草剂的向日葵植物、编码抗除草剂的乙酰羟酸合酶大亚基蛋白的多核苷酸和使用方法
AR051690A1 (es) * 2004-12-01 2007-01-31 Basf Agrochemical Products Bv Mutacion implicada en el aumento de la tolerancia a los herbicidas imidazolinona en las plantas
UA99091C2 (ru) * 2005-07-01 2012-07-25 Басф Се Резистентное к гербициду растение подсолнечника, полинуклеотид, кодирующий резистентную к гербициду большую субъединицу белка ацетогидроксикислотной синтазы
US20100115650A1 (en) 2007-04-04 2010-05-06 Kening Yao Herbicide-Resistant Brassica Plants and Methods of Use

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020138866A1 (en) * 2000-03-10 2002-09-26 Gingera Gregory R. Herbicide tolerant brassica juncea and method of production
WO2003014357A1 (en) * 2001-08-09 2003-02-20 University Of Saskatchewan Wheat plants having increased resistance to imidazolinone herbicides
US20040171027A1 (en) * 2002-10-29 2004-09-02 Stephen Barnes Assay for imidazolinone resistance mutations in Brassica species
WO2006007373A2 (en) * 2004-06-16 2006-01-19 Basf Plant Science Gmbh Polynucleotides encoding mature ahasl proteins for creating imidazolinone-tolerant plants
US20050283858A1 (en) * 2004-06-22 2005-12-22 Kening Yao Brassica AHAS genes and gene alleles that provide resistance to imidazolinone herbicides
WO2009046334A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-09 Cibus Llc Mutated acetohydroxyacid synthase genes in brassica

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DUGGLEBY R G, SIEW SIEW PANG: "ACETOHYDROXYACID SYNTHASE", JOURNAL OF BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, KOREAN SOCIETY FOR BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, KR, vol. 33, no. 01, 1 January 2000 (2000-01-01), KR, pages 01 - 36, XP001119823, ISSN: 1225-8687 *
RAY, K. JAGANNATH, A. GANGWANI, S.A. BURMA, P.K. PENTAL, D.: "Mutant acetolactate synthase gene is an efficient in vitro selectable marker for the genetic transformation of Brassica juncea (oilseed mustard)", JOURNAL OF PLANT PHYSIOLOGY, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 161, no. 9, 20 September 2004 (2004-09-20), AMSTERDAM, NL, pages 1079 - 1083, XP004955445, ISSN: 0176-1617, DOI: 10.1016/j.jplph.2004.02.001 *
S. TAN ; R. EVANS ; B. SINGH: "Herbicidal inhibitors of amino acid biosynthesis and herbicide-tolerant crops", AMINO ACIDS ; THE FORUM FOR AMINO ACID AND PROTEIN RESEARCH, SPRINGER-VERLAG, VI, vol. 30, no. 2, 1 March 2006 (2006-03-01), Vi, pages 195 - 204, XP019379389, ISSN: 1438-2199, DOI: 10.1007/s00726-005-0254-1 *
TAN S, ET AL.: "IMIDAZOLINONE-TOLERANT CROPS: HISTORY, CURRENT STATUS AND FUTURE", PEST MANAGEMENT SCIENCE, WILEY & SONS, BOGNOR REGIS; GB, vol. 61, no. 03, 1 January 2005 (2005-01-01), BOGNOR REGIS; GB, pages 246 - 257, XP009058795, ISSN: 1526-498X, DOI: 10.1002/ps.993 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3243905A1 (en) 2017-11-15
CA3047293A1 (en) 2009-03-12
UA100122C2 (ru) 2012-11-26
JP2010523103A (ja) 2010-07-15
JP2014195467A (ja) 2014-10-16
EP2392661A1 (en) 2011-12-07
US20140143901A1 (en) 2014-05-22
CN103667193B (zh) 2017-07-21
KR20150023919A (ko) 2015-03-05
AR066209A1 (es) 2009-08-05
CN101711283A (zh) 2010-05-19
NZ597328A (en) 2014-03-28
EA036108B1 (ru) 2020-09-29
CL2012003269A1 (es) 2013-09-06
AU2008294493B2 (en) 2014-11-06
WO2009031031A3 (en) 2009-11-19
JP5965582B2 (ja) 2016-08-10
EP2546348A1 (en) 2013-01-16
GEP20146128B (en) 2014-08-11
PL3243905T3 (pl) 2023-01-09
EP2392661B1 (en) 2016-11-09
EP2543731A1 (en) 2013-01-09
MX2009010644A (es) 2010-03-26
HUE032487T2 (en) 2017-09-28
AU2008294493A1 (en) 2009-03-12
KR20100016165A (ko) 2010-02-12
EP2543731B1 (en) 2018-08-22
EP3243905B1 (en) 2022-11-16
CN103992986A (zh) 2014-08-20
BRPI0822358A2 (pt) 2014-10-07
EA200970925A1 (ru) 2010-04-30
BRPI0822358B1 (pt) 2020-10-13
CL2008000991A1 (es) 2009-11-27
MX340399B (es) 2016-07-07
US20200377905A1 (en) 2020-12-03
EA201691453A1 (ru) 2017-03-31
EP2140013A2 (en) 2010-01-06
CA2682331A1 (en) 2009-03-12
NZ580107A (en) 2012-08-31
CA2682331C (en) 2019-08-06
MX340398B (es) 2016-07-07
WO2009031031A2 (en) 2009-03-12
US20140143902A1 (en) 2014-05-22
NZ597327A (en) 2014-02-28
CN103667193A (zh) 2014-03-26
AU2008294493C1 (en) 2015-04-02
US20100115650A1 (en) 2010-05-06
CL2012003268A1 (es) 2013-09-06
CN101711283B (zh) 2013-11-06
EP2395090A1 (en) 2011-12-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA025843B1 (ru) Устойчивое к гербициду растение brassica juncea, способ борьбы с сорняками и способы получения и идентификации устойчивого к гербициду растения brassica juncea
RU2337531C2 (ru) Растения пшеницы с повышенной устойчивостью к имидазолиноновым гербицидам
RU2337532C2 (ru) Растения пшеницы с повышенной устойчивостью к имидазолиноновым гербицидам
CN109136210B (zh) Ahas突变体
ES2389767T3 (es) Plantas de trigo que tienen mayor tolerancia a herbicidas de imidazolinona
EP1902136B1 (en) Herbicide-resistant sunflower plants, polynucleotides encoding herbicide-resistant acetohydroxyacid synthase large subunit proteins, and methods of use
EA025732B1 (ru) Резистентные к гербицидам ahas-мутанты и способы применения
US20170166919A1 (en) Acetyl co-enzyme a carboxylase herbicide resistant plants
WO1997041218A1 (en) Herbicide resistant rice
CN102666859A (zh) 耐除草剂的植物
EA023348B1 (ru) Способ определения генотипа ahasl1, набор для определения генотипа ahasl1 и изолированные полинуклеотиды устойчивых к гербицидам растений подсолнечника с множественными устойчивыми к гербицидам аллелями ahasl1
US10647991B2 (en) Acetolactate synthase herbicide resistant sorghum
JP2010512157A (ja) 除草剤抵抗性ヒマワリ植物および使用方法
US20190032029A1 (en) Herbicide-resistant rice plants, polynucleotides encoding herbicide-resistant acetohydroxyacid synthase large subunit proteins, and methods of use
AU2013245576B2 (en) Herbicide-resistant brassica plants and methods of use
BRPI0608264A2 (pt) planta, semente da planta, método para controlar ervas daninhas na vizinhança de uma planta, molécula de polinucleotìdeo isolada, cassete de expressão, célula hospedeira não humana, vetor de transformação, semente transformada, célula vegetal transformada, métodos para aumentar atividade de ahas resistente a herbicida em uma planta, para produzir uma planta resistente a herbicida, para aumentar toleráncia a herbicida em uma planta, e para selecionar para uma célula vegetal transformada, polipeptìdeo isolado, e, métodos para aumentar a resistência a herbicida de uma planta, e para combater vegetação indesejada

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU

NF4A Restoration of lapsed right to a eurasian patent

Designated state(s): RU