EA025107B1 - Способ диагностирования болезни альцгеймера, нейродегенерации при синдроме дауна или легкого когнитивного нарушения у субъекта (варианты) и набор для осуществления способа - Google Patents

Способ диагностирования болезни альцгеймера, нейродегенерации при синдроме дауна или легкого когнитивного нарушения у субъекта (варианты) и набор для осуществления способа Download PDF

Info

Publication number
EA025107B1
EA025107B1 EA201100253A EA201100253A EA025107B1 EA 025107 B1 EA025107 B1 EA 025107B1 EA 201100253 A EA201100253 A EA 201100253A EA 201100253 A EA201100253 A EA 201100253A EA 025107 B1 EA025107 B1 EA 025107B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
rgo
agd
amount
bie
zeg
Prior art date
Application number
EA201100253A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201100253A1 (ru
Inventor
Ханс-Ульрих Демут
Штефан Шиллинг
Мартин Клайншмидт
Йенс-Ульрих Рафельд
Астрид Келен
Моник Борнак
Original Assignee
Пробиодруг Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=41256108&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA025107(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Пробиодруг Аг filed Critical Пробиодруг Аг
Publication of EA201100253A1 publication Critical patent/EA201100253A1/ru
Publication of EA025107B1 publication Critical patent/EA025107B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/25—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving enzymes not classifiable in groups C12Q1/26 - C12Q1/66
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/521—Chemokines
    • G01N2333/523—Beta-chemokines, e.g. RANTES, I-309/TCA-3, MIP-1alpha, MIP-1beta/ACT-2/LD78/SCIF, MCP-1/MCAF, MCP-2, MCP-3, LDCF-1or LDCF-2
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/91045—Acyltransferases (2.3)
    • G01N2333/91074—Aminoacyltransferases (general) (2.3.2)
    • G01N2333/9108—Aminoacyltransferases (general) (2.3.2) with definite EC number (2.3.2.-)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/38—Pediatrics
    • G01N2800/385—Congenital anomalies
    • G01N2800/387—Down syndrome; Trisomy 18; Trisomy 13

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Приведено описание способов диагностирования нейродегенеративного заболевания, такого как болезнь Альцгеймера, легкое когнитивное нарушение и нейродегенерация при синдроме Дауна, с использованием глутаминилциклазы в качестве диагностического/прогностического индикатора. Кроме того, описан набор для осуществления этих диагностических способов.

Description

Настоящее изобретение относится к способу прогнозирования, диагностирования и прогностирования нейродегенеративного заболевания, такого как болезнь Альцгеймера (ΑΌ), легкое (умеренное) когнитивное нарушение (МС1) и нейродегенерация при синдроме Дауна (ΝΏ8), с использованием глутаминилциклазы (ОС) в качестве диагностического/прогностического индикатора.
Предпосылки создания изобретения
Болезнь Альцгеймера (ΑΌ) представляет собой нейродегенеративное заболевание, которое приводит к деменции. Понятия болезнь Альцгеймера и альцгеймеровская болезнь, оба, используются в данной области, они являются эквивалентными и их применяют взаимозаменяемо в настоящем описании и в других местах. Период от первого выявления ΑΌ до конца жизни составляет от нескольких лет до 15 лет, во время которого у пациента происходит прогрессивное развитие потери как умственной функции, так и способности контролировать функции организма. Для прогрессирования заболевания характерна существенная вариабельность. В то время как у большинства пациентов наблюдается постепенное постоянное прогрессирование заболевания (снижение оценки психического статуса ежегодно в среднем на 3-4 балла по 30-балльной краткой шкале оценки психического статуса Фольштейна), примерно для 30% страдающих ΑΌ пациентов характерно наличие пролонгированной начальной фазы плато, которая продолжается в течение нескольких лет (НахЬу 1.У. с1 а1., Ιηάίνίάυαΐ 1га)ес1опе5 оЛ содпфуе йесНпе ίη раОеп15 ипН бетепНа оЛ (Не Α1ζНе^те^ 1уре, 1. С1ш. Ехр. №игор5усНо1, 14, 1992, р. 575-592). Для определенной подгруппы пациентов характерно взрывообразное быстро прогрессирующее ухудшение, приводящее к смерти в течение нескольких лет (Мапп и. е( а1., Нйетодепейу ίη бЬеахе: Ргодге55юп га(е 8едгеда1ей Ьу Ф5Опс1 пеигор8усНо1од1са1 апй сегеЬга1 теЮЬоПс ртой1е8, 1. №ито1. №иго8игд. РзусЫайу, 55, 1992, р. 956-959). У других пациентов (примерно 10% популяции) сохраняется медленно прогрессирующее течение заболевания, характеризующееся лишь постепенным ухудшением от года к году (Ото551 Ό. е( а1., 8еш1е йетепйа5, II 1п1егпаНопа1 8утро5шт, Рап5: 1оНп ЫЬЬеу Еиго1ех1. 1988, р. 97-99.). Патологическая, химическая и молекулярная основа этой гетерогенности остается неясной. Распознавание вариабельности в прогрессировании заболевания ΑΌ является важной клинической оценкой и может объяснять трудности, связанные с диагностикой при нетипичных случаях. Хотя в определенных случаях встречаются семейные проявления ΑΌ, вероятно, в большинстве случаев ΑΌ не является семейной, и до настоящего времени (см. ниже) не выявлено простого биологического маркера этой болезни.
Существующие в настоящее время методы, применяемые для диагностирования ΑΌ, основаны на анализе спинномозговой жидкости (СМЖ) или ткани головного мозга, полученной после смерти пациентов. Так, среди существующих в настоящее время маркеров следует отметить маркеры, относящиеся к белкам, которым присущи особенности, обнаруженные в головном мозге страдающих болезнью Альцгеймера пациентов после их смерти.
Нейрофибриллярные сплетения в основном состоят из гиперфосфорилированного тау-белка, т.е. белка цитоскелета. Нейритная бляшка содержит коровый амилоидный белок, большая часть которого представлена состоящим из 42 аминокислот пептидом (Αβ42), полученным в результате протеолитического расщепления более крупного белка-предшественника. Другая форма этого белка, полученная из этого же белка-предшественника, содержит только 40 аминокислот (Αβ40). Отложения этого белка обнаружены в головном мозге пораженных ΑΌ пациентов. Однако изменения тау- и вышеописанных амилоидных бета-пептидов встречаются недостаточно часто, и их уровень недостаточен для диагностики, и поэтому результаты анализа крови в отношении этих белков, по-видимому, недостаточно точно коррелируют с ΑΌ. Помимо Αβ-пептидов, характеризующихся вариабельным С-концом, часто встречаются модифицированные на Ν-конце Αβ-пептиды (8аИо Т.С. е( а1., Оотшай апй ФЛсгепПа1 йеро5Йюп оЛ Й15Йпс1 Ье1а-ату1о|4 рерППе 5рес1е5, Αβ Ν3φΕ), т 5ет1е р1ацие5. №игоп 14, 1995, р. 457-466; Ки55о С. е( а1. Рге5ет1т-1 тШаОощ ш ЛПНеипеА Ф5еа5е. №1иге, 405, 2000, р. 531-532; 8аИо Т.С., Уатао Н., 1\уа15иЬо Т. и 1<а\уа51йта 8. Лт^ηо- апй сагЬоху1-1егтта1 Не1егодепеНу оЛ Ье1а-ату1о|4 рерППе5 4еро5Пе4 ш Нитап Ьгат. №иго5с1. ЬеО. 215, 1996, р. 173-176). Вероятно, основная часть Αβ-пептидов подвергается Ν-концевому укорочению, затрагивающему две аминокислоты, в результате чего становится доступным глутаматный остаток, который затем циклизуется с формированием пироглутамата (рЕ), что приводит к образованию пептидов Αβ3φΕ)-42 (8а1Йо Т.С. е( а1. ОоттаШ апй ФЛЛетепйа1 йеро5йюп оЛ Й15Йпс1 Ье1аату1оЛ рерНйе 5рес1е5, Αβ Ν3φΕ), ш 5ет1е р1ацие5. №игоп 14, 1995, р. 457-466; 8аИо Т.С., Уатао Н., 1\уа15иЬо Т. и Ка\уа51йта 8. Αήιμ- апй сагЬоху1-1епшпа1 Не1егодепеНу оЛ Ье1а-ату1о|4 рерППе5 4еро5Пе4 ш Нитап Ьгат. №иго5с1. ЬеО. 215, 1996, р. 173-176). В альтернативном варианте рЕ может формироваться в результате β'-расщепления с помощью ВΑСΕ1, что приводит к образованию Αβ Ν11φΕ)-42 (№51ипД 1. е( а1., Ке1аНуе аЬипйапсе оЛ ΑΜ^ιι-κι· Α Ье1а ату1оИ рерОбе уапап15 т ΑΜ^ιι-κι· Ф5еа5е апй погта1 адшд. Ргос. №И. Λсаά. 8ск υ.8.Α. 91, 1994, р. 8378-8382; Пи К. е( а1., СНа^асΐе^^ζаί^оη оЛ Α^ΐ311-40/42 рерОбе 4еро5Шоп ш Ф5еа5е апй уоипд Эоуп'5 5упйготе Ьгаиъ: шрНсаНоп оЛ У-ЮгттаПу 1гипса1еб
Α^ίπ 5рес1е5 ш (Не ра1Нодепе515 оЛ Ф5еа5е. №игора11ю1. 112, 2006, р. 163-174). В частности, установлено, что Αβ Ν3φΕ)-42 является основным компонентом отложений Αβ при спорадической и семейной болезни Αльцгеймера (8аЛо Т.С. е( а1., ОоттаШ апй ФЛЛегепОа1 йеро5йюп оЛ Ф5Рпс1
- 1 025107
Ье!а-ату1о1й рерййе креаек, А Ье!а Ν3(ρΕ), ίη кепйе рккщек. Иеигоп 14, 1995, р. 457-466; МйауаПе Ь. е! а1., Аш1по-1егш1па11у !гипса!ей АЬе!а рерОйе крешек аге 1Не таш сотропеШ оГ со!!оп \\оо1 рккщек. Вюсйепикйу, 44, 2005, р. 10810-10821).
Пептиды Αβ И3рЕ-42 существуют совместно с пептидами Αβ 1-40/1-42 (8аМо Т.С. е! а1., Эоттап! апй ййГегеЩкй йерокйюп о! П1кПпс1 Ье1а-ашу1о1Й рерййе крешек, АЬе!а ИЗрЕ. ίη кепйе рккщек. Иеигоп 14, 1995, р. 457-466; 8а1йо Т.С., Уатао Н., 1\\а!киЬо Т. и Ка\уак1ита 8., Ашто- апй сагЬо.\у1-!егтта1 кеЮгсщепеПу оГ Ье!а-ату1о1й рерППек йерокйей ш йитап Ьгаш. Истока. Ьей. 215, 1996, р. 173-176), и, как установлено в ряде исследований, они могут играть основную роль в патогенезе АО. Например, продемонстрирована нейротоксичность пептидов Αβ И3рЕ-42 (Викко С. е! а1., Ругод1и1ата1е-той1йей ату1о1й Ье1а-рерШек-АЬе1аИ3(рЕ)-к1топд1у аГГес! сийитей пеигоп апй ак!госу!е кшутуаГ 1. Иеигосйет. 82, 2002, р. 1480-1489) и установлен тот факт, что рЕ-модификация укороченных на Ν-конце Αβ-пептидов обусловливает устойчивость к расщеплению большинством аминопептидаз, а также к действию Αβрасщепляющих эндопептидаз (Викко С. е! а1., РугоДШатаЩ-тойШей атуЫй Ье1а-рерййек-АЬе1аИ3(рЕ)к!гоп§1у аГГес! сийитей пеигоп апй ак!госу!е кигущаГ 1. Иеигосйет. 82, 2002, сс, 1480-1489; 8аИо Т.С. А1/йеппег'к ййеаке ак рго!ео1уОс Фкогйегк: апаЬойкт апй са!аЬоПкт оГ Ье!а-ату1о1й. ИеигоЬюГ Адтд 19, 1998, р. 69-75). Циклизация глутаминовой кислоты с образованием рЕ приводит к потере Ν-концевого заряда, что обусловливает усиленную агрегацию Αβ И3рЕ по сравнению с немодифицированными Αβ-пептидами (Не и Ваттом С.1, Тйе АЬе!а 3-ругод1и!ату1 апй 11-ругоДи!ату1 рерОйек Гоипй ш кеш1е рккще йауе дгеа!ег Ье!а-кйее! Гогтпщ апй аддгедайоп рторепыйек ш уйго !йап Ги11-1епДй А Ье!а. ВшсйетШту, 38, 1999, р. 10871-10877; 8сйЛНп§ 8. е! а1., Оп !йе кеейшд апй оПдотеп/айоп оГ рС1п-ату1о1й рерОйек (ш уйго). ВюсйетШгу, 45, 2006, р. 12393-12399). Таким образом, снижение образования Αβ И3рЕ-42 должно дестабилизировать пептиды, делая их более чувствительными к расщеплению, и это, в свою очередь, предупреждает формирование более высокомолекулярных агрегатов Αβ и повышает продолжительность существования нейронов
Однако уже в течение продолжительного времени не удается выяснить, как происходит рЕмодификация Αβ-пептидов. При создании настоящего изобретения было установлено, что глутаминилциклаза (ОС) обладает способностью катализировать образование Αβ И3рЕ-42 в мягких кислотных условиях, и что специфические ингибиторы ОС предупреждают формирование Αβ И3рЕ-42 щ у1Гго и поэтому ингибирование глутаминилциклазы представляет собой новую терапевтическую концепцию лечения причин, вызывающих болезнь Αльцгеймера (8сйЛНп§ 8., НоГГтапп Т., Мапйай 8., НоГГтапп М. и ЭетШй Н.-и., С1Шатту1 сус1акек ипГо1й д1п!ату1 сус1аке асйуйу ипйег тПй ашй сопййюпк. РЕВ8 Ьей. 563, 2004, р. 191-196; Сутк Н. е! а1., ОйпЬйюп оГ ДШатпЮ сус1аке айегк ругоЦШатаЮ ГогтаОоп ш таттаПап се11к. Вюсйш. Вюрйук. Ас!а 1764, 2006, р. 1618-1625; 8сйййп§ е! а1., 1п1пЬйюп оГ ДШатйЮ сус1аке - а поуе1 !йегареиОс сопсер! Гог !йе саикаОуе !геа!теп! оГ А1/йеппег'к ййеаке. Иа!иге Мейюше 14, 2008, р. 1106-1111).
В настоящее время, по-видимому, отсутствует удовлетворительный диагностический маркер для выявления наличия АО или для выявления индивидуума, у которого, хотя и обнаружены нормальные когнитивные ответы, тем не менее, должна неминуемо или с большой долей вероятности развиться АО.
Αссоциированное с возрастом когнитивное хроническое прогрессирующее заболевание (АЛСО) и легкого когнитивное нарушение (МС1) представляют собой понятия, применяемые для идентификации индивидуумов, которые ощущают ухудшение когнитивной способности, что вскоре приводит к деменции. Эти понятия являются эквивалентными, МС1 является в настоящее время в большей степени принятым понятием, и их применяют взаимозаменяемо в настоящем описании. Согласно критериям (Всемирная организация здравоохранения) для установления диагноза требуется регистрация самим индивидуумом или членами его семьи снижения когнитивной функции, которое является постепенным и имеет место по меньшей мере в течение 6 месяцев. Могут существовать трудности с любыми областями познания (хотя ухудшение памяти имеет место в огромном большинстве случаев), и они должны подтверждаться наличием патологической характеристики при количественных оценках когнитивной способности относительно данных, доступных для здоровых индивидуумов соответствующего возраста и уровня образования (т.е. пациента сравнивают со здоровыми индивидуумами такого же возраста). В таких тестах характеристика должна находиться на уровне, который по меньшей мере на 1 единицу 80 (старческая деменция) ниже среднего значения для соответствующей популяции. Может иметь место ситуация, когда не обнаружена ни деменция, или выраженная депрессия, ни реакция на лекарственные средства. Может не присутствовать ни церебральное, ни системное заболевание или состояние, для которых известно, что они вызывают церебральную когнитивную дисфункцию. В экспериментах, проведенных при создании настоящего изобретения, все пациенты, которых классифицировали как СОВ.5 (находящаяся под вопросом деменция по клинической рейтинговой шкале деменции, и которые подпадали под указанные исключения, также рассматривались как удовлетворяющие критериям ААСО/МС1. Примерно у 1/3 страдающих болезнью Αльцгеймера пациентов выявлен четко выраженный обособленный период ухудшения памяти, который предшествовал более глобальному ухудшению умственных способностей. (НахЬу 1.У. е! а1., !пй|у|йиа1 !га)ес!опек оГ сощкОуе йесйпе ш раОеп!к χνίΐΗ йетепОа оГ !йе А^ешет !уре, 1. Сйп. Ехр.
- 2 025107
ΝοιιΐΌρδνοΙιοΙοβγ 14, 1992, ρ. 575-592.) При использовании критериев АЛСО/МСТ в которых рассматриваются другие области помимо ухудшения памяти, процент идентифицируемых предвестников болезни, вероятно, является более высоким. К счастью, не у всех индивидуумов с ААСО/МС1 происходит прогрессирование заболевания. При тестировании установлено, что у значительного числа индивидуумов имеет место стабильные не прогрессирующие расстройства памяти.
Попытки прогнозировать начало АО, МС1 или ΝΟ8 или осуществлять мониторинг их развития предпринимались с ограниченным успехом. При создании настоящего изобретения было установлено, что количество ОС в биологическом образце, полученном из организма индивидуума, которое отклоняется от эталонного количества у контрольного индивидуума, может положительно коррелировать со статусом неврологического заболевания. Таким образом, корреляция присутствия ОС со статусом заболевания представляет собой положительный и более прямой тест, предназначенный для диагностирования пациента, страдающего одним из описанных выше нейродегенеративных заболеваний.
Таким образом, в изобретении предложен легко выполнимый тест, проводимый с использованием биологического образца, который предназначен для прогнозирования, диагностирования и прогностирования АО, МС1 и ΝΟ8 с применением ОС в качестве диагностического маркера.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение основано на открытие того факта, что количество глутаминилциклазы (ОС) в биологическом образце, полученном из организма пациента, страдающего АО или МС1, повышено по сравнению с количеством ОС в биологическом образце, полученном из организма обычного (т.е. здорового) контрольного индивидуума.
Установление того факта, что количество ОС отличается при этих неврологических заболеваниях от количества в образцах из организма здоровых контрольных индивидуумов, является основой для разработки теста, предназначенного для диагностирования АО, МС1 или ΝΟ8 у индивидуума. Таким образом, способы диагностирования АО, МС1 или ΝΟ8, предлагаемые в настоящем изобретении, которые заключаются в оценке количества ОС в образце из организма пациента, представляют собой значительное усовершенствование современной клинической диагностической оценки пациентов, страдающих указанными нейродегенеративными заболеваниями. Основываясь на установленных при создании изобретения различиях в количестве ОС, которое присутствует в биологическом образце, полученном из организма пациента, по сравнению с количеством, обнаруженным в образце из организма здоровых контрольных индивидуумов, можно сделать заключение о выраженной корреляции между количеством ОС и вероятностью диагностирования нейродегенеративного заболевания. Статистически значимое повышение количества ОС относительно контрольных образцов с большей долей вероятности позволяет предположить, что пациент страдает АО, ΝΟ8 или МС1. Нормальное количество ОС, которое определяют как количество ОС, характерное для ОС в контрольном образце, выделенном из здоровой популяции соответствующего возраста, свидетельствует о том, что у пациента нет нейродегенеративного заболевания, такого как АО, МС1 или ΝΟ8. Положительный признак наличия нейродегенеративного заболевания, основанный на выявленном повышенном или пониженном количестве ОС в биологическом образце относительно контрольного образца, полученного из здоровых индивидуумов, как правило, рассматривают в сочетании с другими факторами для окончательного определения конкретного заболевания. Таким образом, повышенные или пониженные уровни ОС у тестируемого индивидуума следует обычно рассматривать в сочетании с другими признанными клиническими симптомами АО-, МС1- или ΝΟδ-связанных состояний для получения окончательного диагноза нейродегенеративного заболевания.
Таким образом, первым объектом данного изобретения является способ диагностирования болезни Альцгеймера (АО), нейродегенерации при синдроме Дауна (ΝΟ8) или легкого когнитивного нарушения (МС1) у субъекта, включающий определение количества глутаминилциклазы (ОС) или ее изоформы в образце мозга или спинномозговой жидкости (СМЖ), полученного от указанного субъекта; и сравнение установленного количества ОС в вышеуказанном образце мозга или СМЖ с количеством ОС, характерным для контрольной группы; где повышение по меньшей мере на 10% количества ОС в тестируемом образце мозга или СМЖ относительно контрольной группы является положительным индикатором наличия АО, ΝΟ8 или МС1.
Кроме того, в данном изобретении описан способ диагностирования болезни Альцгеймера (АО), нейродегенерации при синдроме Дауна (ΝΟ8) или легкого когнитивного нарушения (МС1) у субъекта, включающий определение количества глутаминилциклазы (ОС) или ее изоформы в образце мозга или СМЖ, полученного от указанного субъекта; и дополнительное определение количества Αβ Ν3ρΕ-Χ в данном образце, где X обозначает целое число, выбранное из 38, 40 и 42; сравнение установленного количества ОС и Αβ Ν3ρΕ-Χ в вышеуказанном образце мозга или СМЖ с количеством ОС и Αβ Ν3ρΕ-Χ, характерным для контрольной группы; где повышение по меньшей мере на 10% количества ОС и Αβ Ν3ρΕ-Χ в тестируемом образце мозга или СМЖ относительно контрольной группы является положительным индикатором наличия АО, ΝΟ8 или МС1.
И, наконец, третьим объектом данного изобретения является способ диагностирования болезни Альцгеймера (АО), нейродегенерации при синдроме Дауна (ΝΟ8) или легкого когнитивного нарушения
- 3 025107 (МС1) у субъекта, включающий определение количества глутаминилциклазы (ОС) или ее изоформы в образце мозга или СМЖ, полученном от указанного субъекта; и дополнительное определение количество хемокина, где хемокин выбирают из сСь2, ССЬ7, ССЬ8, ССБ9/10, ССБ13, ССБ15, ССЬ16, ССЬ25 и фракталкина; сравнение установленного количества ОС и хемокина в вышеуказанном образце мозга или СМЖ с количеством ОС и хемокина, характерным для контрольной группы; повышение по меньшей мере на 10% количества ОС и хемокина в тестируемом образце относительно контрольной группы является положительным индикатором наличия АО, ΝΟ8 или МС1.
В предпочтительном варианте осуществления заявленных изобретений ОС представляет собой человеческую ОС или ее изоформу, которая имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8ΕΟ ГО N0: 1, 2, 3, 4 и 5, в наиболее предпочтительном человеческая ОС имеет аминокислотную последовательность 8Ε0 ГО N0: 1.
При этом количество ОС можно определять иммунотурбидиметрическим анализом, иммунофлуоресцентным анализом, иммунодиффузионным анализом, твердофазным иммуноферментным анализом (ЕЬ1§А), радиоиммуноанализом (РИА), вестерн-блоттингом, анализом активности белка, нозернблоттингом, ПЦР, жидкостной хроматографией высокого разрешения (ЖХВР), масс-спектрометрией (МС), газовой хроматографией (ГХ), газовой хроматографией-масс-спектрометрией (ГХ-МС), жидкостной хроматографией - масс-спектрометрией (ЖХ-МС) и жидкостной хроматографией-тандемной массспектрометрией (ЖХ-МС/МС). Причем в одном из предпочтительных вариантов осуществления заявленных способов ее количество определяют с помощью антитела, которое специфически связывается с ОС или ее изоформой, или путем измерения ферментативной активности ОС или ее изоформы, или на основе уровня мРНК ОС или ее изоформы.
При определении количества Αβ Ν3ρΕ-Χ в образце X может быть равно 42, или 40, или же 38.
Возможен вариант осуществления заявленных изобретений, когда комбинацию Αβ Ν3ρΕ-42, и/или Αβ Ν3ρΕ-40, и/или Αβ Ν3ρΕ-38 определяют одновременно с ОС.
В случае предпочтительного осуществления способа дополнительно определяемый хемокин представляет собой ССЬ2.
Четвертым объектом данного изобретения является способ диагностирования болезни Альцгеймера (АО), нейродегенерации при синдроме Дауна (ΝΟ8) или легкого когнитивного нарушения (МС1) у субъекта, который включает биологический образец мозга или СМЖ указанного субъекта; приводят в контакт биологический образец с антителом, которое связывается с глутаминилциклазой (ОС) или ее изоформой; определяют количество образовавшегося иммунного комплекса в качестве показателя количества ОС в биологическом образце и сравнивают установленное количество в вышеуказанном образце с количеством ОС. характерным для контрольной группы субъектов; повышение по меньшей мере на 10% количества ОС в тестируемом образце относительно контрольной группы является положительным индикатором наличия АО, ΝΟ8 или МС1.
И, наконец, для осуществления последнего способа заявлен набор, предназначенный для диагностирования болезни Альцгеймера (АО), нейродегенерации при синдроме Дауна (ΝΟ8) или легкого когнитивного нарушения (МС1), который включает антитело, связывающееся с ОС или его изоформой, и принятый стандарт количества ОС характерного для контрольной группы.
Краткое описание чертежей
На чертежах показано следующее.
На фиг. 1а) показаны результаты анализа уровней транскриптов ОС полученные с помощью количественной ОТ-ПЦР. Общую РНК выделяли из образцов человеческой новой коры головного мозга (неокортекс) (область 22 по Бродманну) из здоровых престарелых индивидуумов и из головного мозга АОпациентов с различными указанными стадиями (этапами) заболевания по Брааку. Уровень транскриптов ОС стандартизовали относительно концентрации гена домашнего хозяйства.
На фиг. 1б) показаны результаты анализа ОС полученные методом вестерн-блоттинга, из тех же вариантов и областей головного мозга, которые использовались для анализа мРНК ОС. Количество экстрагированного растворимого белка стандартизовали относительно массы ткани.
На фиг. 1в) показаны результаты количественной оценки концентраций Αβ Ν3(ρΕ)-42 (обозначен как Αβ3(ρΕ)-42) и Αβ 1-42 (Αβ1-42) из тех же вариантов и областей головного мозга, полученные с помощью ΕΕΙ8Λ при анализе экстрактов, которые получали с использованием ДСН и муравьиной кислоты, образцов человеческого неокортекса. Обнаружено значительное повышение концентраций пептида Аβ Ν3(ρΕ)-42 на ранних стадиях АО по сравнению с существенно более умеренным повышением концентраций пептидов Αβ 1-42.
На фиг. 1г) показаны результаты выявления методом иммуногистохимии общего содержания Αβ-пептидов с помощью антитела 408 и Αβ И3(рЕ)-42-пептидов в области 22 по Бродманну в образцах из организма здоровых престарелых индивидуумов и страдающих разными стадиями АО индивидуумов. В образцах из организма здоровых престарелых индивидуумов обнаружены редкие Αβ-бляшки, но в этих отложениях отсутствовала иммунореактивность в отношении Αβ Ν3(ρΕ)-42. Однако при всех стадиях АО основное большинство Αβ-бляшек содержали Αβ И3(рЕ)-42-пептиды.
- 4 025107
На фиг. 2 приведены результаты определения уровня генной экспрессии ОС и ССЬ2 в стимулированных ТНР-1-клетках.
На фиг. 3 приведены - результаты определения удельной активности ОС в кондиционированной среде ТНР-1-клеток.
Последовательности амилоидных пептидов и хемокинов
Αβ(Ι -42) (5Ер ΙΟ ΝΟ; 6) Азр-А1а-01и-Р11е-Аг5-Н|8-А5р-8ег-01у-Туг-01и-\га1-Н15-Н15-(31п-Ьу5-Ееи- Уа]-РЬе'РЬе-А1а-О1и-А5р-\га1-О1у-8ег-А5й'Ьу5-О1у*А1а-[1е-11е-О1у-Ееи- МеХ-Уа1-01у-01у-Уа1-Уа1-Г1е-А]а
Αβ(1-40) (8Е<3 Ю ΝΟ: 7) А$р-А1а-О1и-РЬе-Аг£’-Н1з-А$р-8ег-С;1у-Туг-ОЬ-Уз1-Н|$-Н|$-ОН-Ъу5-ЕецУа1-РНе-РЬе-А1а-С 1и-А5р-Уа1-01у-8ег-А$п-Ьу5-О1у-А1а-Пе-11е-01у-Ьегь МеХ- Уа1-01у-01у-Уа1-Уа1
Αβ(3-42) (8Ες Ш N0; 8) С1и-РЬе-Аг£-Н15'А&р-8ег-О1у-Туг-С|14-УаЕ-Н1£“Н|5-С1п-Ьу5-Ьец-Уа1Р11еРЬе-А1а-С1и-А5р-Уа1-О1у-Зег-Аап-Еу&-01у-А [а-Пе-Пе-СНу-Ьеи-Мех-Уз 1О!у-О1у-Уа1-Уа1-!1е-А1а
Αβ(3-40) (5Ер 10 N0: 9) С1и-РЬе-Аг^-Н|5-Азр-5еГ’О1у-Туг-О1и-Уа1-Н15-Н15-С1п-Еу5-Ееи-Уа1’РЬе- Р11е-А1а-О1и-А5р-Уа1-С1у-8ег-А5п-Еу5-С1у-А1а-11е-11е-О1у-Ееи-МеХ-Уа1- 01у-0Еу-Уа1-Уа1
Αβ( 1-38) (5Ε0 Ю N0; 10) А8р-А1а-01и-Р11е-Аг£-Н15-А5р-5ег-01у-Туг-01и-Уа1-Н1&-Н18-01п-Еу5-Ееи- Уа1-РЬе-РЬе-А1а-О1и-А8р-Уа1-С1у-Зег-А8П-Еу5-ОЗу-А1а-11е-11е-51у-Ееи- Мех-Уа1-С1у-С1у
Αβ(3-38) (8Ε<3 ΪΟΝΟ: 11) О1и-РЬе-Агё-Н|5-А8р-Зег-О1у-Туг-О1и-Уа1-Н18-Н15-О]п-Еу5-Ееи-Уа1-РЬе- РЪе-А1а-О1и-А8р-Уа1-О1у-Зег-А8П-Еу5-С1у-А1а-Не-11е-О1у-Ееи-Ме1-Уа!- 01у-<31у
АВп (5Е9 Ю N0: 12) ΕΑ8ΝΟΓΑ№ΗΡΕΝΚΓΑνΕΤΕΙΟ3ΡΤνΚΚΝΙΙΕΕΝ
АОап (5Ер Ю ΝΟ: 13) ΕΑ5ΝεΡΑΙΚΗΡΕΝΚΡΑνΕΤΕΙ0ΡΝΙ_ΡΙ_Ν8ΟΕΚΗΥ
ССЕ2 (малый индуцибельный цитокин А2) (5Е0 Ю N0: 14) $»158-РгоХ: Ρ13 500 9ΡΟΑΙΝΑΡνΤΟΟΥΝΡΤΝΚΚΙ5ν9Κ.ΕΑ8ΥΚΚ1Τ58ΚΟΡΚΕΑνΐΕΚΤ1 УАК.Е1С АОРКркХУУООЗМОНЕОКрТрТРКТ
ССЬ7 (мальзй индуцибельный цитокин А7) (5Ер 10 N0: 15) 3ννί$$-Ρι*οΐ: Р80098 9ΡνθΙΝΤ5ΤΤΟ0ΥΚ.Ρ1ΝΚΚΙΡΚ9Κ.ΕΕ3ΥΚ.ΚΤΤ53Η€ΡΚΕΑνΐΓΚΤΚΕυΚΕ1Ο Α0ΡΤρΚ\νν90ΡΜΚΗΕ0ΚΚΤ9ΤΡΚΕ
ССЕ8 (малый индуцибельный цитокин А8) (8Еф 10 N0: 16) 5ж|&&-Рго1: Р80075 9ΡΟ5ν8ΐΡΙΤΟΟΓΝνΐΝΚΚΙΡΐ9Κ.ΕΕ5ΥΤΚΪΤΝΐ90ΡΚΕΑνΐΓΚΤΚΚΟΚΕν0Α ΟΡΚΕ ΚίννΚΟΒΜΚΗΕΟρίΡΟΝΕΚΡ
<4X9/10 (малый индуцибельный цитокин А9) (5Бр Ю N0: 17) 5ху|зз-РгоХ: Р51670 9ΙΤΗΑΤΕΤΚΕν958ΕΚΑ990ΕΕΙΕΜΡΗΜΟΡ9Ο55ΟΟ0Ε5ΥΝ5ΚΙ905ΚΡΙΟ ΥΡΡΤδΟΟΟΤΚΡΟΙΙΕΙδΚΚΟΓΟνΟΑΝΡΒΟΚΚνςιΚΟΙΕΚΕΕρΝδςιΡΚΤΥΚΟ
ССБ13 (малый индуцибельный цитокин А13)(5Е9 10 ΝΟ: 18) 8»155-Рго1: 999616 9ΡΟΑΕΝνΡ5ΤΟΟΡΤΡ38ΚΚΙ8Ε9ΚΕΚ3ΥνΐΤΤ3ΚΟΡ9ΚΑνΐΡΡΤΚΕΟΚΕ1ΟΑ ΟΡΚΕΚΧΥνρΝΥΜΚΗΕΟΚΚΑΗΤΕΚΤ
ССЬ15 (малый индуцибельный цитокин А15) (5Е9 ΙΟΝΟ: 19) 8ννί«8-Ρτοΐ: 916663 9Ρ1ΝΟΑΕΤΕΕΜΜ8Κ.Ι.ΡΕΕΝΡννΕΝ5ΡΗΡΑΑΟΟ<7Τ3ΥΙ393ΙΡ08ΕΜΚεΥΡΕ Т53ЕСЗКР0У1РЬТККСК9УСАКР8ОР0У90СМККЬКРУ81
<4X16 (малый индуцибельный цитокин А16)(5Е9 10 N0: 20) $ινΪ55-ΡΓοχ; 015467 9ΡΚνΡΕ\ννΝΤΡ5Τ<4ΧΚΥΥΕΚνΕΡΚΚΧνν0ΥΚΚΑΕΝ0ΗΕΡΑΙΙΡνΤΚΚ.ΝΚ ΕνθΤΝΡΝΟΟΑνν9ΕΥίΚΟΡΝΕΡΕΕΡΤΚΝΕ8ΤνΚΙ1ΤΑΚΝΟΟΡ9ΕΕΝ59
фракталкил (нейротактин) ($Е9 Ю ΝΟ: 21) δ\νί88-ΡΓ0Χ: Р78423 9ΗΗθνΤΚΟΝΪΤ03ΚΜΤ5ΚΙΡνΑΕΕΙΗΥ99Ν9Α30ΟΚΚΑ11ΕΕΤΚ9ΗΡΕΡΟ ΑΟΡΚΕΟΙΥ νΚΟΑΜ9ΗΕΟΚ9ΑΑΑΕΤΚΝΟΟΤΡΕΚ9ΙΟΕνΚΡΚΤΤΡΑΑΟΟΜ ОЕЗУУЕЕРЕАТОЕЗБЗЬЕРТРЗБОЕАОЕАЕОТЗРЕЕРТОУТСЗЗОТКЬРРТР ΚΑ9ΟΟΟΡνθΤΕΕΡΚνΡΡν3ΤΑΑΤ\ν088ΑΡΗ9ΡΟΡ5ΕλνΑΕΑΚΤ5ΕΑΡ3Τ9 ΟΡ5Τ9Α3ΤΑ55ΡΑΡΕΕΝΑΡ5Ε09Κν\ν09Ο95ΡΚΡΕΝ5ΕΕΚΕΕΜ0ΡνΡΑΗΤ ОАР90\У0РС5МАНУ5УУРУ58ЕСТР5КЕРУА508\УТРКАЕЕР1НАТМ0Р 9К.ЕОУЕ1ТРУРОА9ААТКК9АУОЕЕАРЬОЕЕРСЬОУАМЕТУ98Ь0бСРК КМАОЕМАЕСЕКУ1РКЗСС51Ч5УУЕУРУ
ССХ25 (малый индуцибельный цитокин А25)(ЗЕ9 ΙΟ N0: 22) δλνίδδ-Ρτοΐ: 015444 ρΟνΡΕΟΟΟίΑΥΗΥΡΙΟίνΑνΕΚΚΑΧνΤΥΚίρΕνδΟδΟΝΕΡΑΑΐΡΥΕΡΚΚΗΚ Κν06ΝΡΚ5ΚΕν9ΚΑΜΚΕΕΟΑΚΝΚνΡΑΚΕΗΗΝΤ9ΤΡ9ΑΟΡΗΑ УККЬЗЗО Ν5ΚΕ538ΚΡ8ΝΡ1538ΚΚΝν3ΙΧΙ3ΑΝ8ΟΙ_.
- 5 025107
Описание вариантов осуществления изобретения
Настоящее изобретение относится к эффективному и быстрому способу диагностирования ίη νίΐτο нейродегенеративного заболевания путем непосредственного определения количества ОС в биологическом образце, взятом из организма пациента, и сравнения установленного количества ОС с количеством ОС. характерным для контрольного образца из организма здоровых индивидуумов. Повышенный уровень ОС. выявленный в биологическом образце, взятом из организма индивидуума, является положительным индикатором ΛΌ или МС1, или ΝΏδ. Таким образом, в настоящем изобретении продемонстрировано, что уровень ОС последовательно и значительно повышен в биологических образцах, взятых из организма страдающих ΛΏ, ΝΏδ или МС1 пациентов, по сравнению с контрольным образцом, взятом из организма здоровых индивидуумов. Таким образом, способы диагностирования АО, МС1 или ΝΏδ, предлагаемые в настоящем изобретении, заключающиеся в оценке количества ОС в образце, взятом из организма пациента, представляют собой значительное усовершенствование современной клинической диагностической оценки пациентов, страдающих указанными нейродегенеративными заболеваниями.
Таким образом, в изобретении предложен способ решения вопроса, может или индивидуум страдать АО, МС1 или ΝΏδ, с использованием ОС в качестве биологического маркера.
Глутаминилциклаза или глутаминил-пептидциклотрансфераза (ОС КФ 2.3.2.5) катализирует внутримолекулярную циклизацию Ν-концевых остатков глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты (5-оксопролин, рО1и*) и выделением в свободном состоянии аммиака и внутримолекулярную циклизацию Ν-концевых остатков глугамата с образованием пироглутаминовой кислоты и выделением в свободном состоянии воды.
ОС впервые была выделена Мессером (Ме88ег) из латекса тропического растения Санса рарауа в 1963 г. (Ме88ег М., №1иге, 4874, 1963, р. 1299). Спустя 24 года соответствующая ферментативная активность была обнаружена в гипофизе животных (ВизЬу \ν.Η.Τ е! а1., 1. Βίο1. СЬет. 262, 1987, р. 8532-8536; р18сЬег \У.Н. и §р1е88 1., Ргос. №Ф АсаФ. δα. И8А, 84, 1987, р. 3628-3632). Для ОС млекопитающих превращение Ο1η в рО1и с помощью ОС было обнаружено для предшественников ΤΚΉ (тиреолиберин) и ОпКН (гонадолиберин) (Ви8Ьу \ν.Η.Τ е! а1., 1. Βίο1. СЬет. 262, 1987, р. 8532-8536; р18сЬег \ν.Η. и 8р1е88 1., Ргос. №Ф АсаФ. δα. И8А, 84, 1987, р. 3628-3632). Кроме того, предварительные эксперименты по выявлению локализации ОС позволили выявить ее совместную локализацию с предполагаемыми продуктами катализа в бычьем гипофизе, что является дополнительным доказательством ее функции в синтезе пептидных гормонов (Воскег8 Т.М. е! а1., 1. №игоепФосгшо1. 7, 1995, р. 445-453). В противоположность этому физиологическая функция растительной ОС все еще остается неясной. Предполагается, что фермент из С.рарауа играет роль в защите растений от патогенных микроорганизмов (Е1 Мои88аош А. е! а1., Се11 Мо1. ЫГе δα. 58, 2001, р. 556-570). В настоящее время на основе сравнительного анализа последовательностей были выявлены предполагаемые ОС из других растений (ЭаЫ δ.ν. е! а1., Рго!еш Ехрг. РштГ, 20, 2000, р. 27-36). Однако физиологическая функция этих ферментов все еще остается неясной.
Известные выделенные из растений и животных ОС обладают строгой специфичностью в отношении Ь-глутамина в Ν-концевом положении субстратов, и было установлено, что их кинетические характеристики описываются уравнением Михаэлиса-Ментена (РоЬ1 Т. е! а1., Ргос. ИаИ. АсаФ δα. И8А, 88, 1991, р. 10059-10063; Соп8аКо А.Р. е! а1., Апа1. ВюсЬет. 175, 1988, р. 131-138; Οο1ο1οЬον М.У. е! а1., Вю1. СЬет. Норре 8еу1ег, 377, 1996, р. 395-398). Однако сравнение первичной структуры ОС из С.рарауа и высококонсервативных ОС млекопитающих не выявило никакой гомологии последовательностей (ИаЬ1 δ.ν. е! а1., Рго!еш Ехрг. РипГ, 20, 2000, р. 27-36). В то время как растительные ОС вероятно, принадлежат к новому семейству ферментов (ИаЬ1 δ.ν. е! а1., Рго!еш Ехрг Риг1Г, 20, 2000, р. 27-36), установлено, что ОС млекопитающих обладают выраженной гомологией последовательностей с бактериальными аминопептидазами (Ва!етап КС. е! а1., ВюсЬет18йу, 40, 2001, р. 11246-11250), что позволило сделать заключение о различном эволюционном происхождении ОС из растений и животных.
Гостранова (Οο8!^аηονа) и соавторы обнаружили, что глутаминилциклазная активность является характерной особенностью спинномозговой жидкости у пациентов, страдающих рассеянным склерозом, и контрольных пациентов (Οο8ί^аηονа е! а1., С1ш. С1йт Ас!а., 389 (1-2), 2008, р. 152-159).
Обнаружены различные изоформы ОС т.е. белки, подобные глутаминил-пептидциклотрансферазе (ОРСТЬ) (\νθ 2008/034891). Для этих новых белков характерно выраженное сходство последовательностей с последовательностью глутаминилциклазы, например, для ОРСТЬ из организма человека (обозначена далее как изо-ОС) (ОепВапк, регистрационный номер ПМ 017659).
Различные изоформы белка, такие как ОС или человеческий изо-ОС, можно получать также из одного гена с помощью разнообразных механизмов, включая альтернативный сплайсинг РНК, посттрансляционный протеолитический процессинг и специфический для клетки тип гликозилирования. Таким образом, понятия глутаминилциклаза, ОС и изо-ОС в контексте настоящего описания относятся к ОС в ее нативной форме, а также к любой из ее изоформ.
Предпочтительными для применения согласно настоящему изобретению являются человеческая ОС или ее изоформы, которые имеют аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей δΞΟ ГО ΝΟ: 1, 2, 3, 4 и 5.
- 6 025107
Более предпочтительным для применения в способах, предлагаемых в настоящем изобретении, является человеческий белок ОРСТБ. который имеет аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕО ГО N0: 2 или еще более предпочтительно в 8Е0 ГО N0: 3.
Еще более предпочтительными для применения в способах, предлагаемых в настоящем изобретении, являются сплайсинговые формы человеческого белка ОРСТБ, которые имеют аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 4 или 8Е0 ГО N0: 5.
Наиболее предпочтительной для применения в способах, предлагаемых в настоящем изобретении, является человеческая ОС, которая имеет аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕО ГО N0: 1.
Таким образом, первым объектом изобретения является способ диагностирования вероятности наличия болезни Альцгеймера (АО), нейродегенерации при синдроме Дауна (N08) или легкого когнитивного нарушения (МС1) у индивидуума, заключающийся в том, что:
(а) определяют количество глутаминилциклазы (ОС) или ее изоформы в биологическом образце из организма указанного индивидуума;
(б) сравнивают установленное количество ОС в биологическом образце с количеством ОС, характерным для контрольного образца из организма здоровых индивидуумов, где повышенное количество ОС в указанном биологическом образце относительно контрольного образца из организма здоровых индивидуумов является положительным индикатором наличия АО, N08 или МС1.
При создании настоящего изобретения было продемонстрировано, что повышенное количество ОС в биологическом образце может коррелировать с повышенным количеством укороченных на Оконце и пироглутаминированных пептидов амилоида-бета, таких, например, как Αβ №рЕ-42, и/или Αβ №рЕ-40, и/или Αβ ШрЕ-38.
Таким образом, еще одним объектом изобретения является способ диагностирования вероятности наличия болезни Альцгеймера (АО), нейродегенерации при синдроме Дауна (N08) или легкого когнитивного нарушения (МС1) у индивидуума, заключающийся в том, что:
(а) определяют количество глутаминилциклазы (ОС) или ее изоформы в биологическом образце из организма указанного индивидуума;
(б) дополнительно определяют количество Αβ ШрЕ-Х;
(в) сравнивают установленное количество ОС и Αβ ШрЕ-Х в биологическом образце с количеством ОС и Αβ ШрЕ-Х, характерным для контрольного образца из организма здоровых индивидуумов, где повышенное количество ОС и Αβ ШрЕ-Х в указанном биологическом образце относительно контрольного образца из организма здоровых индивидуумов является положительным индикатором наличия АО, N08 или МС1 и где X обозначает целое число, выбранное из 38, 40 и 42.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения X обозначает 42.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения X обозначает 40.
Еще в одном предпочтительном варианте осуществления изобретения Х обозначает 38.
Предпочтительными являются также способы, в которых не только одну форму укороченных на Оконце и пироглутамированных пептидов амилоида бета, но и комбинацию Αβ №рЕ-42, и/или Αβ №рЕ-40, и/или Αβ ШрЕ-38 выявляют в сочетании с ОС.
Предпочтительными являются также способы, в которых не только одну форму укороченных на Оконце и пироглутамированных пептидов амилоида бета, но и комбинацию Αβ №рЕ-42, и/или Αβ Н3рЕ-40, и/или Αβ №рЕ-38, и/или пептидов, встречающиеся при семейных деменциях альцгеймеровского типа, таких как рО1иАВп или р01иАОап, выявляют в сочетании с помощью ОС.
Понятие '^β^Αβ или Αβ Н3рЕ относится к укороченным на Оконце формам Αβ, которые начинаются на остатке глутаминовой кислоты в положении 3 в аминокислотной последовательности Αβ и в которых указанный остаток глутаминовой кислоты циклизован с образованием остатка пироглутаминовой кислоты. В частности, рΟ1и-Аβ в контексте настоящего описания означает те фрагменты, которые участвуют в или которые ассоциированы с амилоидными патологиями, включая (но не ограничиваясь только ими) рΟ1и-Аβ3-38, рΟ1и-Αβ3-40, р-Ο1и-Аβ3-42.
При создании настоящего изобретения продемонстрировано также, что повышенные уровни ОС в биологическом образце могут коррелировать с повышенным уровнем хемокина, такого, например, как ССЬ2, ССЬ7, ССЬ8, ССЬ9/10, ССЬ13, ССЬ15, ССЬ16, ССЬ25 и фракталкин.
Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ диагностирования болезни Αльцгеймера (АО), нейродегенерации при синдроме Дауна (N08) или легкого когнитивного нарушения (МС1) у индивидуума, заключающийся в том, что:
(а) определяют количество глутаминилциклазы (ОС) или ее изоформы в биологическом образце из организма указанного индивидуума;
(б) дополнительно определяют количество хемокина;
(в) сравнивают установленное количество ОС и хемокина в биологическом образце с количеством ОС и хемокина, характерным для контрольного образца из организма здоровых индивидуумов,
- 7 025107 где повышенное количество ОС и хемокина в указанном биологическом образце относительно контрольного образца из организма здоровых индивидуумов является положительным индикатором наличия АО, N08 или МС1.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения хемокин имеет происхождение из организма млекопитающих. Более предпочтительно хемокин представляет собой человеческий хемокин. Более предпочтительно хемокин представляет собой человеческий ССЬ2.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения любой из указанных выше способов диагностирования болезни Альцгеймера (АО), нейродегенерации при синдроме Дауна (N08) или легкого когнитивного нарушения (МС1) можно осуществлять также ίη νίίτο в биологическом образце из организма индивидуума.
Понятие индивидуум относится к млекопитающему, которое поражено или может быть поражено нейродегенеративным заболеванием, таким как АО, МС1 или N08. Предпочтительно понятие индивидуум относится к человеку.
Понятие биологический образец относится к любому источнику биологического материала, включая (но не ограничиваясь только ими) периферическую кровь, плазму, лимфоциты, спинномозговую жидкость, мочу, слюну, эпителий, фибробласты или любой другой образец, содержащий белок ОС.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения уровень ОС определяют в образце общей воды, полученном из организма млекопитающего, наиболее предпочтительно человека. Понятие общая вода организма относится ко всем жидкостям, которые присутствуют в организме человека, включая (но не ограничиваясь только ими) кровь, лимфу, мочу и спинномозговую жидкость (СМЖ), содержащим ОС. Образцом крови может служить образец плазмы или образец сыворотки или фракции, полученные из этих образцов. Образец можно обрабатывать до применения, как в случае получения плазмы из крови, разведения вязких жидкостей и т.п.
Предпочтительно образец плазмы обрабатывают антикоагулянтом, таким как ЭДТК.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения количество ОС определяют в образце крови, полученном из организма индивидуума, более предпочтительно в образце плазмы. Таким образом, настоящее изобретение предпочтительно относится к описанному выше способу, заключающемуся в том, что осуществляют следующие стадии: получают образец плазмы из организма индивидуума; определяют количество ОС в образце плазмы; сравнивают установленное количество ОС в образце плазмы с количеством ОС в контрольном образце плазмы из организма здоровых индивидуумов, где повышенное количество ОС относительно контрольного образца из организма здоровых индивидуумов является положительным индикатором наличия АО, N08 или МС1. Установлено, что повышенные количества ОС коррелируют с наличием АО, N08 и МС1 и их можно применять для диагностирования указанных заболеваний.
Повышенное количество ОС (или ее изоформы) означает, что количество ОС, определенное в образцах из организма индивидуумов, выше среднего количества ОС, характерного для контрольного образца из организма здорового индивидуума, с учетом диапазона ошибок эксперимента, известного специалисту в данной области. Предпочтительно количество ОС, определенное в образцах из организма индивидуумов, превышает на 10% среднее количество ОС, характерное для контрольного образца из организма здорового индивидуума. Более предпочтительно количество ОС (или ее изоформы), определенное в образцах из организма индивидуумов, превышает на 25% или еще более предпочтительно на 50% или 75 % среднее количество ОС, характерное для контрольного образца из организма здорового индивидуума. Наиболее предпочтительно количество ОС (или ее изоформы), определенное в образцах из организма индивидуумов, в несколько раз превышает среднее количество ОС, характерное для контрольного образца из организма здорового индивидуума, например в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более раз.
Контрольный образец из организма здорового(ых) индивидуума(ов) означает биологический образец такого же типа, полученный из организма индивидуума, например полученный по меньшей мере из одного здорового контрольного индивидуума соответствующего возраста или из организма пациента в более ранний момент времени. В одном из вариантов осуществления изобретения контрольный образец из организма здорового индивидуума получают из организма пациента в более ранний момент времени. Контрольный образец из здоровой популяции соответствующего возраста можно выделять из образцов требуемой популяции здоровых, имеющих соответствующий возраст контрольных индивидуумов, в семейном анамнезе которых отсутствуют АО, МС1 или N08. Например, уровень ОС в плазме, более высокий, чем уровни ОС в контроле, при определении в образцах соответствующей контрольной популяции определенного размера, свидетельствует о наличии АО, N08 или МС1. Специалисту в данной области должно быть очевидно, что образец из организма индивидуума, подлежащего диагностированию, оценивают относительно образцов из здоровых контрольных индивидуумов соответствующего возраста и что существенное повышение или понижение количества ОС в образце белков из организма индивидуума определяют на основе сравнения с контрольными образцами, применяемыми в данном анализе.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения количество ОС или ее изоформы определяют на основе либо уровня белка, либо уровня мРНК указанной ОС или ее изоформы.
- 8 025107
Определение или количественную оценку уровня ОС в биологическом образце из организма можно осуществлять любыми методами, известными в данной области. Такие методы включают, например (но не ограничиваясь только ими), иммунотурбидиметрический анализ, анализ на основе иммунофлуоресценции, иммунодиффузии, твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЬ18А), радиоиммуноанализ (РИА), вестерн-блоттинг, анализ активности белка или для определения уровня мРНК ОС нозернблоттинг или анализ с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), например, ПЦР в реальном времени. Можно применять также жидкостную хроматографию высокого разрешения (ЖХВР), массспектрометрию (МС) и газовую хроматографию (ГХ), а также их различные конфигурации, включая такие системы, как газовая хроматография-масс-спектрометрия (ГХ-МС), жидкостная хроматографиямасс-спектрометрия (ЖХ-МС) и жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия (ЖХМС/МС).
Когда определение ОС осуществляют методами, известными в данной области для выявления пептидов, предпочтительным является применение методов иммунологического выявления с использованием антител, фрагментов антител, рекомбинантных антител и т.п. Таким образом, такое определение ОС включает (но не ограничиваясь только ими) применение антител, которые специфически связываются с ОС или ее изоформами, с получением иммунного комплекса, а также реагентов, предназначенных для выявления образования иммунного комплекса. Наиболее предпочтительными методами выявления, основанными на применении одного или нескольких антител, являются иммунотурбидиметрический анализ, анализ на основе иммунофлуоресценции, иммунодиффузии, ЕЬ18А, РИА и т.п.
Указанные антитела могут быть поликлональными или моноклональными. Методы получения поликлональных или моноклональных антител хорошо известны в данной области. Обзор см. у Нат1оте и Ьаие (Нат1о№ Е. и Ьаие Ό., АийЪоФек: А ЬаЬога1огу Мапиа1, изд-во СоМ Зртшд НатЬот ЬаЬога1огу Рге88, СоМ 8ρτίη§ НагЪог, ΝΥ, 1988) и УеИоп е! а1. (УеИоп Ό.Ε. и ЗейагГГ Μ.Ό. Мопос1опа1 АпиЪоШез: а ро\уегГи1 пе\у !оо1 щ Ью1о§у апб тексте. Апп. Кеу. Вюсйет. 50, 1981, р. 657-680), обе публикации включены в настоящее описание в качестве ссылки. Получение моноклональных антител описано у КоЫег и МЙ81ет (КоЫет О. и МЙ81еш С., Сопйпиош си11ите8 оГ Ги8еб се118 8естейпд апйЬобу оГ ртебейпеб 8рес1Пс11у. №1ите, 256, 1975, р. 495-497), публикация включена в настоящее описание в качестве ссылки. Антитела, предлагаемые в изобретении, могут относиться к любому изотипу, например 1дО или 1дА, а поликлональные антитела представляют собой антитела одного изотипа или смеси изотипов.
Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения антитело к ОС представляет собой моноклональное антитело. Хотя антитела к ОС доступны от широкого разнообразия коммерческих поставщиков, антитела, предназначенные для применения в различных иммуноанализах, которые представлены в настоящем описании, можно получать стандартными методами.
Кроме того, моноклональное антитело к ОС обладает способностью распознавать ОС в ее нативной форме, а также любую из ее изоформ. Таким образом, любое моноклональное антитело, которое специфически распознает ОС, включая ее изоформы, можно применять в указанном способе для количественной оценки ОС.
Предпочтительными являются моноклональные антитела, которые специфически распознают ОС, но дают слабую перекрестную реакцию с изоформами ОС или вообще не обладают перекрестной реактивностью. В альтернативном варианте предпочтительными являются моноклональные антитела, которые специфически распознают конкретную изоформу ОС, но дают слабую перекрестную реакцию с ОС или вообще не обладают перекрестной реактивностью.
Приемлемыми антителами к ОС являются, например, антитела, которые поступают в продажу от фирмы АЬпоуа (Тайпей-Сити, Тайвань), например мышиное поликлональное антитело (каталожный № Н00025797-В01Р) и кроличье поликлональное антитело (каталожный № Н00025797-И01Р).
Приемлемым антителом к СРСТЬ является, например, мышиное поликлональное антитело, которое поступает в продажу от фирмы АЬпоуа (Тайпей-Сити, Тайвань, каталожный № Н00054814-В01Р).
Кроме того, в способе, предлагаемом в настоящем изобретении, можно применять фрагменты, выведенные из этих моноклональных антител, такие как РаЬ, Р(аЬ)2, 88Ρν (одноцепочечный фрагмент вариабельной области) и другие напоминающие антитело конструкции, которые сохраняют вариабельную область антитела, при условии, что они обладают способностью к связыванию, характерной для исходного антитела. Такие фрагменты, как правило, получают, например, путем ферментативного расщепления антител папаином, пепсином или другими протеазами. Специалисту в данной области хорошо известно, что моноклональные антитела или их фрагменты можно модифицировать с целью их различного применения. Так, антитела, предлагаемые в изобретении, могут представлять собой рекомбинантные, например химерные (например, сконструированные на основе мышиной вариабельной области, ассоциированной с человеческой константной областью), гуманизированные (каркас константной области человеческого иммуноглобулина в сочетании с гипервариабельным участком антитела животного, например, полученным из мышиного антитела), и/или одноцепочечные антитела.
Антитело, специфическое в отношении ОС или ее изоформ, применяемое в способе, предлагаемом в настоящем изобретении, можно метить с помощью соответствующей метки и идентифицировать в биологическом образце на основе присутствия метки. Метка позволяет выявлять антитело, когда оно
- 9 025107 связано с ОС. Примерами меток являются (но не ограничиваясь только ими) следующие метки: радиоизотопы (например, Н, С, δ, I, I), флуоресцентные метки (например, ФИТЦ, родамин, фосфат лантанида), люминесцентные метки, ферментативные метки (например, пероксидаза хрена, бетагалактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза), хемилюминесцентные метки и биотинильные группы.
Методы конъюгации или мечения антител, указанные выше, может легко осуществлять обычный специалист в данной области (см., например, 1птап, Ме1коб5 1п Еп/уто1оду, т. 34, ΑΓΠηίΙν Тескпищез, Еп/уте Рипйсакоп: часть В, под ред. 1акоЬу и ХУюкек, изд-во Асабенис Ргезз, Уогк, 1974, с. 30 и
ХУПскек и Вауег, Тке АПбт-ВюОп Сотр1ех ш Вюапа1у0са1 Аррксакопз, Апа1. Вюскет 171, 1988, р. 132).
Для диагностических применений антитело к ОС находится либо в свободном состоянии или является иммобилизованным на твердой подложке, такой как пробирка, гранула или любая другая общепринятая подложка, применяемая в данной области. Для осуществления иммобилизации применяют прямые или косвенные методы. Прямые методы включают пассивную адсорбцию (нековалентное связывание) или ковалентное связывание между подложкой и реагентом. Под косвенными методами подразумевают, что сначала к твердой подложке присоединяют антитело к реагенту, которое взаимодействует с реагентом. В косвенных методах можно применять также систему лиганд-рецептор, например молекулу, такую как витамин, связывают с реагентом и соответствующим рецептором, иммобилизованным на твердой фазе. Иллюстрацией такой системы является биотин-стрептавидин.
Специалистам в данной области должно быть очевидно, что иммунный комплекс образуется между ОС в биологическом образце и антителом и что любой несвязанный материал удаляют до выявления комплекса. Очевидно, что антитело, предлагаемое в изобретении, применяют для определения количества ОС в биологическом образце, таком, например, как кровь, плазма, лимфоциты, спинномозговая жидкость, моча, слюна, эпителий и фибробласты.
Как известно, в данной области, определение связывания указанного антитела можно осуществлять с использованием широкого разнообразия форматов иммуноанализов, включая (но не ограничиваясь только ими) иммунотурбидиметрический анализ (агглютинация), твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫЗА) и радиоиммуноанализ (РИА) (см., например, Рппар1е5 апб Ргасйсе оГ 1ттипоаззау, под ред. СкгМоркег Р. Рпсе и Όανίά 1. №отап, изд-во З!оск!оп Ргезз, №ν Уогк, Ν.Υ., 1991 и Сиггей Рго1осо1з ш Мо1еси1аг Вю1оду, под ред. АизиЬе1 е! а1., изд-во 1окп ХУкеу апб Зопз, №ν Уогк, Ν.Υ., 1987, обе публикации включены в настоящее описание в качестве ссылки). Выявление можно осуществлять с помощью колориметрических или радиоактивных методов или других общепринятых методов, известных специалисту в данной области. Другие стандартные методы, известные в данной области, описаны в Ме!кобз ш 1ттипоФадпоз1з, 2-е изд., под ред. Козе и Вща//г изд-во 1окп ХУкеу апб Зопз, №ν Υо^к, 1980 и у СатрЬе11 е! а1., Ме!кобз оГ 1ттипо1оду, изд-во У. А. Вефатт, 1пс., 1964; ИЗ 4366241; 4376110; 4517288 и 4837168, описание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки. Обзор общих методов иммуноанализов см. также в МеОюЛ 1п Се11 Вю1оду, т. 37, под ред. Азар изд-во Асабенис Ргезз, 1пс. №ν Υо^к, 1993, Вазю Апб Сктса1 1ттипо1оду, 7-е изд., под ред. ЗШез и Тегг, 1991).
Указанные анализы, предназначенные для определения ОС, могут представлять собой прямые, косвенные, конкурентные или неконкурентные иммуноанализы, известные в данной области (см., например, Ргттр1ез апб Ргасйсе оГ 1ттипоаззау, под ред. Скпз1оркег Р. Рпсе и Эа\аб 1. №отап, изд-во ЗЮскЮп Ргезз, №ν Уогк, Ν.Υ., 1991; Сиггей Рго1осо1з ш Мо1еси1аг Вю1оду, под ред. АизиЬе1 е! а1., изд-во 1окп ХУПеу апб Зопз, №ν Уогк, Ν.Υ., 1987 и Оекшск М., 1. С1ш. Скет. Скп. Вюскет. 22, 1984, р. 895-904, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки).
Неконкурентные иммуноанализы представляют собой анализы, в которых количество ОС определяют непосредственно. В сэндвич-анализе, например, антитела к ОС можно связывать прямо с твердым субстратом, на котором они иммобилизованы. Эти иммобилизованные антитела затем захватывают ОС, которая присутствует в биологическом образце. Иммобилизованную таким путем ОС затем связывают с несущим метку агентом, таким как вторичное антитело к человеческой ОС, несущее метку.
В конкурентом иммунном анализе количество антигена, присутствующее в биологическом образце, определяют косвенно после добавления известного количества меченого антигена в образец и определения количества меченого антигена, связанного с антителами. Например, известное количество в данном случае меченой ОС добавляют в биологический образец, затем образец приводят в контакт с антителами к ОС. Количество меченой ОС, связанной с антителом к ОС, обратно пропорционально концентрации ОС в биологическом образце. Это является результатом того, что чем большее количество меченой ОС выявлено, тем меньшее количество ОС в биологическом образце может конкурировать с меченой ОС.
Изобретение относится также к диагностическим наборам, предназначенным для осуществления анализов с целью диагностирования АО, МС1 или ΝΏ3 у индивидуума. Так, настоящее изобретение можно воплощать на практике с помощью диагностического набора, который включает по меньшей мере одно антитело, специфическое в отношении ОС и ее изоформ, которые представлены в настоящем описании, а также любые реагенты, предназначенные для выявления иммунных комплексов, которые содержат антитело, связанное с ОС. Как правило, набор может включать индивидуальное антитело, кото- 10 025107 рое специфически распознает ОС и ее изоформы. С одной стороны, набор может включать первичное антитело, которое специфически распознает ОС и ее изоформы, а также вторичное антитело, конъюгированное с дающей сигнал меткой и обладающее способностью связываться с первичным антителом или в сайте, отличном от сайта, с которым связывается первичное антитело. Дающая сигнал метка, связанная с вторичным антителом, может представлять собой (но не ограничиваясь только ими) фермент, такой как пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза. Наборы могут включать также другие реагенты, предназначенные для осуществления анализа, такие как буферы, твердая подложка, растворы и т.п. Набор может содержать также инструкции по осуществлению метода с использованием одного или несколько антител для диагностических анализов.
Примеры
Пример 1. Образование Αβ Ν3ρΕ-42 и экспрессия ОС ίη νίνο.
В головном мозге млекопитающих обнаружено широкое распространение ОС. при этом значительная экспрессия выявлена в гиппокампе и коре головного мозга. Для оценки того, может ли коррелировать уровень экспрессии ОС при АО с образованием Αβ Ν3ρΕ-42, анализировали уровень мРНК ОС и концентрации белка в образцах новой коры головного мозга после смерти (фиг. 1а, б). Важно отметить, что при создании изобретения обнаружена повышающая регуляция мРНК ОС и белка в образцах головного мозга страдавших АО пациентов по сравнению со здоровыми престарелыми людьми. Более того, значительные концентрации Αβ Ν3ρΕ-42 обнаружены в образцах, полученных из страдавших АО пациентов, в отличие от не имеющих деменции индивидуумов, что подтверждает роль ОС в образовании Αβ Ν3ρΕ-42 (фиг. 1в). С другой стороны, ЕЫ§А-анализ позволил выявить высокие концентрации Αβ х-42 в образцах, полученных из здоровых контрольных индивидуумов соответствующего возраста, и их существенно меньшее повышение на ранних стадиях АО (фиг. 1в). Эти данные подтверждались результатами иммуногистохимического анализа с использованием антител, которые выявляют общий Αβ (408), или специфическими для Αβ Ν3ρΕ-42 (фиг. 1г). Заметная иммунореактивность в отношении Αβ обнаружена в срезах головного мозга, полученных из всех групп. В отличие от этого, окрашивание в отношении Αβ Ν3ρΕ-42 отсутствовало в образцах, полученных из организма здоровых престарелых людей, но оказалось специфическим для тканей головного мозга страдавших АО пациентов, у которых уровень загрузки Αβ №рЕ-42-иммунореактивным бляшками оказался практически таким же высоким, что и общая плотность Αβ-бляшек.
Материалы и методы.
Человеческая ткань головного мозга.
Точный диагноз АО во всех случаях, описанных в этом исследовании, базировался на присутствии нейрофибриллярных сплетений и нейритных бляшек в гиппокампальном образовании и неокортикальных областях и на соответствии критериям Национального института неврологических и коммуникативных расстройств и инсульта (Ναΐίοηαΐ ΙηκίίΙυΙο οί №иго1одю апй СоттишсаШе ЭЕогйсп, апй §1гоке (ΝΙΝΟδ)) и ассоциации болезни Αльцгеймера и родственных нарушений (АОкепнеУ О15еа5е апй Ре1а1ей Э15огйег5 АззоОаБоп (АОКОА)). Ткань головного мозга (область 22 по Бродманну) из таких же вариантов применяли для количественной оценки концентраций мРНК ОС белка ОС и Αβ Ν3ρΕ-42. В целом, анализировали 10 контрольных вариантов и 10 АО-случаев, каждый на стадиях по Брааку Ι-ΙΙ и У-УТ Группы подбирали по полу и возрасту (контроль: в среднем 72±6,6 года; АО Ι-ΙΙ: в среднем 73±3,1 года; АО У-УР в среднем 77±6,6 года). Средний промежуток времени до взятия образца после смерти (ΡΜΙ) был аналогичным для всех групп и составлял от 26 до 96 ч. Продолжительность ΡΜΙ никогда не влияла ни на выявление ОС с помощью анализа методом вестерн-блоттинга, ни на количественную оценку Αβ с помощью Εί-Ι^. Для обнаружения мРНК ОС с помощью кОТ-ПЦР использовали только образцы ткани, для которых ΡΜΙ составлял менее 48 ч.
Количественная оценка мРНК и ОС методом вестерн-блоттинга.
Образцы тканей гомогенизировали с использованием гомогенизатора типа Ргесе11у5 с помощью керамических гранул диаметром 1,4 мм (5000 об/мин, 30 с, фирма Рес|1аЬ). РНК выделяли с помощью набора Ν^^δρίη КЫА ΙΙ (фирма Маскегеу №ще1) согласно инструкциям производителя. Αликвоты по 100 нг РНК подвергали обратной транскрипции с получением кДНК с помощью произвольных праймеров (фирма Коске) и δиρе^5С^^ρΐ ΙΙ (фирма ШуПгодеп). Количественную ПЦР в реальном времени осуществляли с помощью устройства типа КоФт^е^ 3000 (фирма СогЬеН Ке5еагск) с использованием набора для анализа ОРСТ ОнапОТес! Рптег А55ау (ОТ00013881, фирма Р1адец), а также набора флатТес! δΎΒΚ Огееп КТ-РСК (фирма 01адеп). Αбсолютные количества ОС определяли, используя 6 разведений ДНК ОС применяемой в качестве внешнего стандарта (полноразмерная ОС клонированная в векторе ρс^NА3) с дублированием. Для подтверждения результатов ПЦР получали кривые плавления продукта и подтверждали строение отдельных ампликонов с помощью электрофореза на агарозном геле. Αбсолютные количества определяли с использованием программы КоФт^е^, версия 4.6 в режиме количественного определения. Для стандартизации использовали два наиболее стабильно экспрессируемых гена домашнего хозяйства НРКТ и ОАРОН (фирма деШгт). Для анализа методом вестерн-блоттинга образцы головного мозга (50 мг) гомогенизировали в буфере (1 мл), содержащем 10 мМ Трис, рН 7,5, 100 мМ
- 11 025107
ΝαΟ. 5 мМ ЭДТК и 0,5% Тритон Х-100 и 10% глицерина. Ткань гомогенизировали путем нескольких ходов поршня в гомогенизаторе Эозущ и подвергали ультразвуковому шоку (3x10 с). Полученный гомогенат осветляли центрифугированием при 2000хд в течение 25 мин. В целом 12 мкг белка из каждого образца разделяли с помощью ДСН-ПААГ в трис-глициновом буфере. ОС выявляли с помощью очищенных кроличьих антител к рекомбинантной человеческой ОС. Для визуализации мембраны с блотами инкубировали с вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (фирма Се11 8щпаПпд) в ТВ8-Т, содержащем 5% (мас./об.) сухого молока, и затем проявляли с помощью системы 8ирег8щпа1 Аек! Рюо §У51ет (фирма Р1егсе) согласно протоколу производителя.
Пример 2. Определение уровня генной экспрессии ОС и ССЬ2 в стимулированных клетках ТНР-1.
Клетки клеточной линии человеческого моноцитарного лейкоза ТНР-1 культивировали в суспензии (5х 105 клеток/мл среды) в РРМ1-1640 (среда Ро5е\\е11 Рагк Метопа1 ПъОЦЦе 1640 (фирма 1пуйгодеп)), содержащей 10% РС8 (=РВ§, фетальная бычья сыворотка (фирма 1пуйгодеп)) и 60 мкг/мл гентамицина (фирма 1пуйгодеп) при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО2 и 95% воздуха.
Для изучения стимулирующего действия ОС и ССЬ2 высевали 2х106 клеток в 24-луночный планшет (фирма Огешег) в 1 мл культуральной среды без РС8, содержащей различные концентрации липополисахаридов (ЬР8; фирма §1дта). После инкубации в течение 24 ч среду удаляли из клеток центрифугированием (5 мин 300х§).
Выделение РНК осуществляли с помощью набора №с1ео-8рш® ΚΝΑ II (фирма Масйегеу & №ще1) с последующим определением концентрации РНК. С использованием набора 8ирег8С1тр1™ II Реуегке Тгап5спр1а5е фирмы Шуйгодеп 1 мкг РНК транскрибировали в кДНК.
Уровень генной экспрессии ОС и ССЬ2 определяли с помощью количественной ПЦР в реальном времени с использованием циклера РоЮг-Оепе™ 3000. С помощью операционной программы, применяемой в методе сравнения, можно осуществлять сравнение изменения уровня генной экспрессии стимулированных зондов и нестимулрованного контроля. Для стандартизации использовали эталонный ген Υ\νΗΑΖ (активирующий белок тирозин-3-монооксигеназы/триптофан-5-монооксигеназы). Результаты представлены на фиг. 2.
Пример 3. Определение удельной активности ОС в кондиционированной среде ТНР-1-клеток.
5х106 ТНР-1-клеток высевали в 5 мл среды РРММ640 (фирма Шуйгодеп) без фенолового красного и РС8 в колбы для суспензий с площадью дна 25 см2 (фирма Огешег) и стимулировали различными концентрациями ЬР8 (фирма 8щта). После инкубации в течение 24 ч при 37°С и в атмосфере, содержащей 5% СО2, клетки отделяли от среды, количество которой снижали центрифугированием (4000хд), используя концентраторы И-ТиЪе™ 6-10 (фирма Мегск, Шуадеп) с МАСО (номинально отсекаемая молекулярная масса) 10 кДа, до конечного объема 250 мкл. Для анализа концентрации белка использовали метод Брэдфорда. Для определения удельной активности ОС применяли предназначенный для внутреннего пользования метод ЖХВР. Результаты представлены на фиг. 3.
Пример 4. Определение активности ОС.
Флуориметрические анализы.
Все измерения осуществляли с помощью устройства ВюАккау Реабег НТ8-7000Р1и8 для микропланшетов (фирма Регкт Е1тег) при 30°С. Активность ОС оценивали флуориметрически с помощью Η-Ο^ΦΝΑ. Образцы включали 0,2 мМ флуорогенный субстрат, 0,25 ед. пироглутамиламинопептидазы (фирма ит/уте, Хоршам, Дания) в 0,2 М Трис/НС1, рН 8,0, содержащем 20 мМ ЭДТК, и аликвоту, соответствующим образом разведенную ОС в конечном объеме 250 мкл. Длины волн возбуждения/испускания составляли 320/410 нм. Реакции анализа инициировали, добавляя глутаминилциклазу. Активность ОС определяли с помощью стандартной кривой для Ъ-нафтиламина, полученной в условиях анализа. Одну единицу определяли как количество ОС, которое катализирует образование 1 мкмоль рΟ1и-ЪNΑ из Η-Ο^ΦΝΑ в минуту в описанных условиях.
Во втором флуорометрическом анализе активность ОС определяли с использованием в качестве субстрата Н-О1п-АМС. Реакции осуществляли при 30°С, используя ридер для микропланшетов ΝΟУО81аг (фирма ВМО 1аЪ1есЬио1од1е8). Образцы включали флуорогенный субстрат в различных концентрациях, 0,1 ед. пироглутамиламинопептидазы (фирма 01адеп) в 0,05 М Трис/НС1, рН 8,0, содержащем 5 мМ ЭДТК и аликвоту, соответствующим образом разведенную ОС в конечном объеме 250 мкл. Длины волн возбуждения/испускания составляли 380/460 нм. Реакции анализа инициировали, добавляя глутаминилциклазу. Активность ОС определяли с помощью стандартной кривой для 7-амино-4метилкумарина, полученной в условиях анализа. Кинетические данные оценивали с помощью программы ОгаРИ.
Спектрофотометрический анализ ОС.
В этом анализе активность ОС определяли спектрофотометрически с помощью непрерывного метода анализа, который был разработан путем адаптации ранее описанного прерывистого анализа (Ва1етап Р.С.Т, I. Хигокск МеШобк, 30, 1989, р. 23-28) с использованием глутаматдегидрогеназы в качестве вспомогательного фермента. Образцы включали соответствующий субстрат ОС, 0,3 мМ НАД-Н, 14 мМ α-кетоглутаровую кислоту и 30 ед./мл глутаматдегидрогеназы в конечном объеме 250 мкл. Реак- 12 025107 ции инициировали, добавляя ОС. и осуществляли мониторинг снижения абсорбции при 340 нм в течение 8-15 мин.
Начальные скорости оценивали и ферментативную активность определяли с помощью стандартной кривой для аммиака, полученной в условиях анализа. Оценку всех образцов осуществляли при 30°С с помощью ридера для микропланшетов либо ЗРЕСТКАР1иот Р1и8, либо Зиипке (оба прибора фирмы ТЕСАН). Кинетические данные оценивали с помощью программы ОтаРК
- 13 025107
Перечень последовательностей <110> ПРОБИОДРУГ АГ <120> Глутаминилциклаза в качестве диагностического/прогностического индикатора нейродогенеративных заболеваний
<130> РВО 00072/ΝΟ
<150> из 61/085,154
<151> 2008-07-31
<160> 22
<170> РаСепЫп, вер
<210> 1
<211> 361
<212> РЕТ
<213> Ното зархепв
<400> 1
Меб А1а <31у <31у Агд
ьеи ъеи Уа1 А1а А1а ьеи Рго Тгр А1а 5ег Агд С1у \/а1 5ег Рго 5ег 20 25 30
А1а 5ег А1а Тгр Рго О1и С1и Ьуз Азп Туг нхз σΐη Рго А1а Не Ьеи 35 40 45
Азп Зег Зег А1а Ьеи Агд С1п Не А1а О1и <31у ТЬг Зег Не Зег (31и 50 55 60
Мее Тгр С1п Азп. Аар Ьеи О1п Рго Ьеи Ьеи Не <31и Агд Туг Рго О1у 65 70 75 80
Зег Рго <31у Зег Туг А1а А1а Агд <31η Нхз Не МеС С1п Агд Не С1п 55 90 95
- 14 025107
Агд Ьеи С1п А1а Авр Тгр Уа1 Ьеи С1и Не Авр ТЬг РЬе Ьеи Зег Э1п 100 105 110
ТЬг Рго Туг С1у Туг Агд Зег РЬе Зег Авп Не Не Зег ТЬг Ьеи Авп 115 120 125
Рго ТЬг А1а Ьуз Агд Ηίβ Ьеи Уа1 Ьеи А1а Суз Ηίβ Туг Авр Зег Ьув 130 135 140
Туг РЬе Зег Ηίε Тгр Авп Авп Агд Уа1 РЬе Уа1 О1у А1а ТЬг Авр Зег 145 150 155 160
А1а ν&1 Рго Суз А1а меС МеЬ Ьеи О1и Ьеи А1а Агд А1а Ьеи Авр Ьуэ 165 170 175
Ьув Ьеи Ьеи Зег Ьеи Ьуз ТЬг Уа1 Зег Азр Зег Ьуз Рго Азр Ьеи Зег 180 185 190
Ьеи С1п Ьеи Не РЬе РЬе Авр С1у С1и С1и А1а РЬе Ьеи Ηίβ Тгр Зег 195 200 205
Рго 01п Авр Зег Ьеи Туг С1у Зег Агд Ηίβ Ьеи А1а А1а Ьув МеЬ А1а 210 215 220
Зег ТЬг Рго Ηίβ Рго Рго О1у А1а Агд С1у ТЬг Зег С1п Ьеи Ηίβ С1у 225 230 235 240
Мее Азр Ьеи Ьеи Уа1 Ьеи Ьеи Аэр Ьеи Не <31у А1а Рго Авп Рго ТЬг 245 250 255
РЬе Рго Авп РЬе РЬе Рго Авп Зег А1а Агд Тгр РЬе С1и Агд Ьеи <31п 260 265 270
А1а 11е <31и Ηίβ С1и Ьеи Ηίβ С1и Ьеи С1у Ьеи Ьеи Ьув Авр Н1з Зег 275 280 285
- 15 025107
Ьеи С1и 290 <31у Агд Туг РЬе О1п 295 Азп Туг Зег Туг С1у 300 С1у ν&ι Не С1п
Азр Азр ΗΪΞ Не Рго РЬе Ьеи Агд Агд С1у Уа1 Рго Уа1 Ьеи ΗΪ3 Ьеи
ЗОБ 310 315 320
Не РГО Зег Рго РЬе Рго С1и Уа1 Тгр н!з ТЬг Меб Авр Авр Авп О1и
325 330 335
С1и Авп Ьеи Азр <31и Зег ТЬг Не Азр Азп Ьеи Азп Ьуз Не Ьеи С1п
340 345 350
Уа1 РЬе Уа1 Ьеи <31и Туг Ьеи Шз Ьеи
355 360
<210> 2
<211 > 382
<212 РЕТ
<213> Нотпо зархепз
<400 2
меЕ Агд Зег □ 1у О1у Агд С1у Агд Рго Агд Ьеи Агд Ьеи С1у С1и Агд
1 5 10 15
С1у Ьеи МеЬ С1и Рго Ьеи Ьеи Рго Рго Ьув Агд Агд Ьеи Ьеи Рго Агд
20 25 30
Уа1 Агд Ьеи Ьеи Рго Ьеи Ьеи Ьеи А1а Ьеи А1а Уа1 01у Зег А1а РЬе
35 40 45
Туг ТЬг 11 е Тгр Зег С1у Тгр ΗΪ3 Агд Агд ТЫ С1и С1и Ьеи Рго Ьеи
50 55 60
<31у Агд С1и Ьеи Агд Уа1 Рго Ьеи 11е С1у Зег Ьеи Рго С1и А1а Агд
65 70 75 80
- 16 025107
Ьеи Агд Агд Уа1 ν&1 С1у С1п Ьеи 85
Азр Рго С1п Агд Ьеи Тгр Бег ТЪг 90 95
Туг Ьеи Агд Рго Ьеи Ьеи Уа1 Уа1 100
Агд ТЪг Рго О1у Зег Рго С1у Азп 105 110 ьеи С1п Уа1 Агд Ьуз РЪе Ьеи С1и 115 120
А1а ТЪг Ьеи Агд Бег Ьеи ТЪг А1а 125
С1у Тгр Ηΐβ Уа1 С1и Ьеи Азр Рго 130 135
РЪе ТЪг А1а Зег ТЪг Рго Ьеи С1у 140
Рго Уа1 Азр РЪе О1у Азп Уа1 Уа1 145 150
А1а ТЪг Ьеи Авр Рго Агд А1а А1а 155 160
Агд Ηΐ5 Ьеи ТЪг Ьеи А1а Су5 ΗΪΞ 165
Туг Азр Зег Ьуз Ьеи РЪе Рго Рго 170 175
С1у Бег ТЪг Рго РЪе \га1 <31у А1а 180
ТЪг Азр Зег А1а Уа1 Рго Суз А1а 185 190
Ьеи Ьеи Ьеи <31и Ьеи А1а <31п А1а 195 200
Ьеи Азр Ьеи С1и Ьеи Зег Агд А1а 205
Ьуз Ьуз <31п А1а А1а Рго Уа1 ТЪг 210 215
Ьеи Οίη Ьеи Ьеи РЪе Ьеи Азр С1у 220 <31и С1и А1а Ьеи Ьуэ 31и Тгр О1у 225 230
Рго Ьуз Азр Бег Ьеи Туг С1у Бег 235 240
Агд Нд.5 Ьеи А1а С1п Ьеи МеЬ С1и 245
Бег Не Рго Н1з Бег Рго С1у Рго 250 255
ТЪг Агд Не Θΐη А1а Не О1и Ьеи 260
РЪе МеЬ Ьеи Ьеи Азр Ьеи Ьеи <31у 265 270
- 17 025107
А1а Рго Авп 275 Рго ТЫ РЬе Туг Зег 280 ΗΪ8 РЬе Рго Агд ТЬг 285 Уа1 Агд ТГр
РНе Ηίβ Агд Ьеи Агд Зег Не С1и Ьуз Агд Ьеи Ηίδ Агд Ьеи Азп Ьеи
290 295 300
Ьеи 01п Зег И1з Рго 01п С1и ν&ι МеГ Туг РНе С1п Рго 01у С1и Рго
305 ЗЮ 315 320
РНе С1у Зег νβΐ С1и Аар Аар ΗΪ3 Не Рго РНе Ьеи Агд Агд С1у Уа1
325 330 335
Рго Уа1 Ьеи Н13 Ьеи Не Зег ТЫ Рго РНе Рго А1а Ча1 Тгр ΗΪ3 ТЬг
340 345 350
РГО А1а Аар ты С31и Уа1 Аап ьеи ΗΪ3 РГО РГО ТЬг Уа1 ΗΪΞ Аап Ьеи
355 360 365
Сув Агд Не Ьеи А1а Уа1 РЬе Ьеи А1а С1и Туг Ьеи <31у Ьеи
370 375 380
<210 > 3
<211> 364
<212 > РРТ
<213 ΗΟΠΊΟ зархепз
<400 > 3
МеЬ <31и Рго Ьеи Ьеи Рго Рго Ьув Агд Агд Ьеи Ьеи Рго Агд Уа1 Агд
1 5 10 15
Ьеи Ьеи Рго Ьеи Ьеи Ьеи А1а Ьеи А1а Уа1 С1у Зег А1а РНе Туг ТЬг
20 25 30
Не Тгр Зег С1у Тгр н!а Агд Агд ТЫ О1и О1и Ьеи Рго Ьеи С1у Агд
35 40 45
- 18 025107
С1и Ьеи 50 Ахд Уа1 Рго Ьеи Не 55 О1у Зег Ьеи Рго С1и 60 А1а Агд Ьеи Агд
Агд Уа1 Уа1 С1у С1п Ьеи Азр Рго О1п Агд Ьеи Тгр Зег ТЬг Туг Ьеи
£5 70 75 80
Агд Рго Ьеи Ьеи Уа1 Уа1 Агд ТЬг РГО С1у Зег Рго <31у АЗП Ьеи <31п
85 90 95
Уа1 Агд Ьуз РЬе Ьеи <31и А1а ТЬг Ьеи Агд Зег Ьеи ТЬг А1а О1у Тгр
100 105 110
Нгз Уа1 С1и ьеи Азр Рго РЬе ТЬг А1а Зег ТЬг Рго Ьеи С1у Рго Уа1
115 120 125
Азр РЬе С1у Аеп Уа1 Уа1 А1а ТЬг Ьеи Азр Рго Агд А1а А1а Агд ΗΪ3
130 135 140
ьеи ТЬг ьеи А1а Суз Нгз Туг Азр Зег Ьуз Ьеи РЬе Рго Рго <31у Зег
145 150 155 160
ТЬг Рго РЬе Уа1 О1у А1а ТЬг Азр Зег А1а Уа1 Рго Суз А1а Ьеи Ьеи
165 170 175
Ьеи 01и Ьеи А1а О1п А1а Ьеи Азр Ьеи С1и Ьеи Зег Агд А1а Ьуз Ьуз
180 185 190
οίη А1а А1а Рго Уа1 ТЬг Ьеи С1п Ьеи Ьеи РЬе Ьеи Азр С1у О1и С1и
195 200 205
А1а Ьеи ьуз С1и Тгр 31у Рго Ьуз Азр Зег Ьеи Туг С1у Зег Агд Нхз
210 215 220
Ьеи А1а О1п Ьеи Мес С1и Зег Не Рго Нхз Зег Рго <31у Рго ТЬг Агд
- 19 025107
225 230 235 240
Не <31п А1а Не С1и 24 5 Ьеи РЪе МеЬ Ьеи Ьеи 250 Азр Ьеи Ьеи С1у А1а 255 Рго
Αδη РГО ТЪГ РЪе туг Бег ΗΪ3 РЪе РГО Агд ТЪг ν&ι Агд Тгр РЪе Нхе
260 265 270
Агд Ьеи Агд Бег Не С1и Ьуз Агд Ьеи Н1в Агд Ьеи Азп Ьеи Ьеи С1п
275 280 285
Бег ΗΪ3 Рго €1п <31и Уа1 МеЪ Туг РЪе Θΐη Рго С1у <31и Рго РЪе <31у
290 295 300
Бег Уа1 С1и Азр Азр Нга Не Рго РЪе Ьеи Агд Агд О1у Уа1 Рго Уа1
305 310 315 320
Ьеи Нг з Ьеи Не Бег ТЪг РГО РЪе Рго А1а ν&ι Тгр Ηίε ТЪг Рго А1а
325 330 335
Азр ТЪг 01и Уа1 АЗП Ьеи Н1г Рго Рго ТЬг Уа1 ΗΪ5 Азп Ьеи Суз Агд
340 345 350
Не Ьеи А1а Уа1 РЪе Ьеи А1а С1и Туг Ьеи С1у Ьеи
355 360
<210 4
<211> 481
<212 > РКТ
<213 > ното еархепз
<400 > 4
Уа1 Тгр Туг Агд РЪе С1п С1у Ьуз А1а А1а МеЬ Агд Бег <31у С1у Агд
1 5 10 15
Ст1у Агд РГО Агд Ьеи Агд Ьеи С1у С1и Агд С1у Ьеи МеЪ С1и Рго Ьеи
- 20 025107
25 30
Ьеи Рго Рго Ьуз Агд Агд Ьеи Ьеи Рго Агд Уа1 Агд Ьеи Ьеи Рго Ьеи 35 40 45
Ьеи Ьеи А1а Ьеи А1а Уа1 <31у Зег А1а РЬе Туг ТЬг Не Тгр Зег О1у 50 55 60
Тгр Н1з Агд Агд ТЬг С1и С1и Ьеи Рго Ьеи С1у Агд С1и Ьеи Агд Уа1 65 70 75 80
Рго Ьеи Не 01у Зег Ьеи Рго О1и А1а Агд Ьеи Агд Агд Уа1 Уа1 О1у 85 90 95
СЯп Ьеи Азр Рго С1п Агд Ьеи Тгр Зег ТЬг Туг Ьеи Агд Рго Ьеи Ьеи 100 105 110
Уа1 \/а1 Агд ТЬг Рго 01у Зег Рго С1у Азп Ьеи С1п Уа1 Агд Ьуз РЬе 115 120 125
Ьеи С1и А1а ТЬг Ьеи Агд Зег Ьеи ТЬг А1а С1у Тгр Н1з Уа1 С1и Ьеи 130 135 140
Азр Рго РЬе ТЬг А1а Зег ТЬг Рго Ьеи <31у Рго Уа1 Азр РЬе С1у Азп 145 150 155 160
Уа1 ν»1 А1а ТЬг Ьеи Азр Рго Агд А1а А1а Агд нгз ьеи ТЬг Ьеи А1а 165 170 175
Суз ΗΪ3 Туг Азр Зег Ьуз Ьеи РЬе Рго Рго С1у Бег ТЬг Рго РЬе Уа1 180 185 190
С1у А1а ТЬг Азр Зег А1а Уа1 Рго Суз А1а Ьеи Ьеи Ьеи 01и Ьеи А1а 195 200 205
- 21 025107
С1п А1а ьеи Азр Ьеи С1и Ьеи Зег Агд А1а Ьуд Ьув С1п А1а А1а Рго 210 215 220 \7а1 ТЬг Ьеи О1п Ьеи Ьеи РЬе Ьеи Азр <31у О1и 01и А1а Ьеи Ьуз О1и 225 230 235 240 тгр 01у Рго Ьуз Азр Зег Ьеи Туг 01у Зег Агд Н1з Ьеи А1а С1п Ьеи 245 250 255
МеЬ С1и Зег Не Рго Ηϊβ Зег Рго О1у Рго ТЬг Агд Не <31п А1а 11е 260 265 270 <31и Ьеи РЬе МеЬ Ьеи Ьеи Адр Ьеи Ьеи С1у А1а Рго Азп Рго ТЬг РЬе 275 280 285
Туг Зег Ша РЬе Рго Агд ТЬг Уа1 Агд Тгр РЬе ΗΪ3 Агд Ьеи Агд Зег 290 295 300
11е С1и Ьуе Агд Ьеи Нхз Агд Ьеи Азп Ьеи Ьеи С1п Бег Ηί® Рго О1п 305 310 315 320
С1и Уа1 МеС Туг РЬе С1п Рго <31у С1и Рго РЬе С1у Зег Уа1 О1и Аар 325 330 335
Азр ΗΪ3 Не Рго РЬе Ьеи Агд Агд С1у Уа1 Рго V©! Ьеи Ηΐβ Ьеи Не 340 345 350
Зег ТЬг Рго РЬе Рго А1а Уа1 Тгр Нхз ТЬг Рго А1а Аар ТЬг <31и Уа1 355 360 365
Азп Ьеи ΗΪ3 Рго Рго ТЬг Уа1 Нхз Азп Ьеи Суд Агд Не Ьеи А1а Уа1 370 375 380
РЬе Ьеи А1а 01и Туг Ьеи <31у Ьеи Агд А1а Тгр Рго МеС ТЬг Уа1 С1и 385 390 395 400
- 22 025107
Агд Τϊιγ Уа1 Агд (31и Ьуз ν*1 Рго А1а С1у А1а Зег С1и А1а С1п А1а 405 410 415
О1у Зег А1а С1у Уа1 Ьеи Уа1 Суз Рго РЬе Н1з ТЬг РЬе Уа1 5ег Ьеи 420 425 430
Суз Туг Азп Тгр Ьуз ТЬг РЬе РЬе Ьеи Ьеи Не Уа1 Зег Зег Суз Нгз 435 440 445
Рго Зег Агд ТЬг С1у Ьуз Агд Рго Ьеи Тгр Аэр Азр Зег С1п Агд Азп 450 455 460
Ьуз Азп Ьеи Ьеи Рго Рго Й1п Агд ТЬг Ьеи С1у Рго Ьуз Уа1 Суз Агд 465 470 475 480
Азр
<210> 5
<211> 359
<212> РЕТ
<213> Ното
<400> 5
А1а А1а Меб Агд Зег 31у С1у Агд С1у Агд Рго Агд Ьеи Агд Ьеи С1у 15 10 15
С1и Агд С1у Ьеи МеС. <31и Рго Ьеи Ьеи Рго Рго Ьуз Агд Агд Ьеи Ьеи 20 25 30
Рго Агд Уа1 Агд Ьеи Ьеи Рго ьеи Ьеи ьеи А1а Ьеи А1а Уа1 С1у Зег 35 40 45
А1а РЬе Туг ТЬг Не Тгр Зег С1у Тгр Ηίβ Агд Агд ТЬг С1и <31и Ьеи 50 55 60
- 23 025107
Рго 65 Ьеи <31у Агд <31и ьеи 70 Агд Уа1 Рго Ьеи 11е 75 01у Зег Ьеи Рго С1и 80
А1а Агд Ьеи Агд Агд Уа1 Уа1 <31у <3ΐη Ьеи Азр Рго С1п Агд Ьеи Тгр
85 90 95
Зег ТЬг Туг Ьеи Агд Рго ьеи ьеи νβΐ Уа1 Агд ТЬг Рго С1у Зег Рго
100 105 110
□ 1у Аеп Ьеи О1п Уа1 Агд Ьуз А1а А1а Рго \7а1 ТЬг Ьеи С1п Ьеи Ьеи
115 120 125
РЬе Ьеи Азр С1у С1и □1и А1а Ьеи Ьуз 61и Тгр О1у Рго Ьуе Азр Зег
130 135 140
Ьеи Туг С1у Зег Агд Н±з Ьеи А1а ΰΐη Ьеи Мес. С1и Зег Не Рго Н13
14 5 150 155 160
Зег РГО С31у Рго ТЬг Агд Не <31п А1а Не О1и Ьеи РЬе МеС Ьеи Ьеи
165 170 175
Азр Ьеи Ьеи <31у А1а Рго Азп Рго ТЬг РЬе Туг Зег ΗΪ5 РЬе Рго Агд
180 185 190
ТЬг Уа1 Агд Тгр РЬе ΗΐΒ Агд Ьеи Агд Зег Не С1и Ьуз Агд Ьеи ΗΪ3
195 200 205
Агд Ьеи Азп Ьеи Ьеи Θΐη Зег Ηΐ3 Рго С1п С1и Уа1 МеС Туг РЬе С1п
210 215 220
Рго С1у О1и РГО РЬе С1у Бег νπ О1и Азр Азр Ηί з Не Рго РЬе Ьеи
225 230 235 24 0
Агд Агд <31у Уа1 РГО Уа1 Ьеи Η15 Ьеи Не Зег ТЬг Рго РЬе Рго А1а
245 250 255
- 24 025107 \Га1 Тгр Шз ТЪг Рго А1а Азр ТЪг О1и Уа1 Азп Ьеи Шз Рго Рго ТЪг 260 265 270
Уа1 Шз Азп Ьеи Суз Агд Не Ьеи А1а \Га1 РЪе Ьеи А1а С1и Туг Ьеи 275 280 285
С1у Ьеи Агд А1а Тгр Рго НеЬ ТЪг Уа1 С1и Агд ТЪг Уа1 Агд С1и Ьуз 290 295 300 ν&1 Рго А1а С1у А1а зег С1и А1а <51п А1а С1у Зег А1а С1у Уа1 ьеи 305 310 315 320
Уа1 Суз Рго РЪе Шз ТЪг РЪе Уа1 Зег ьеи Суз туг Азп тгр ьуз ТЪг 325 330 335
РЪе РЪе Ьеи Ьеи Не Уа1 Зег Зег Суз Нгз Рго Зег Агд ТЪг С1у Ьуз 340 345 350
Агд Рго Ьеи Тгр Азр Азр Зег 355 <210> 6 <211> 42 <212> РЕТ <213> ното зар1епз <400> б
Азр А1а С1и РЪе Агд Шз Азр Зег <31у Туг <31и Уа1 Шз Шз <31п Ьуз 15 10 15
Ьеи Уа1 РЪе РЪе А1а О1и Азр Уа1 <31у Зег Азп Ьуз С1у А1а 11е Не 20 25 30
С1у Ьеи МеЪ Уа1 С1у <31у Уа1 ν*1 Не А1а 35 40
- 25 025107
<210>
<211>
<212 > <213 >
за
РНТ
Ногпо ззрхепз
- 26 025107 с400> 9 <31и РЬе Агд Н1е Аер Бег О1у Туг 31и Уа1 Ηίβ Н1е О1п Ьуз Ьеи 5/а1
РНе РЬе АЗ а С1и Аер Уа1 С1у Бег Азп Ьуз С1у А1а Не 11е С1у Ьеи 20 25 30
МеЦ Уа1 С1у <31у Уа1 Уа1 35 <210> 10 <2ΐι> за <212? РЕТ <213> Ното зархепе <400> 10
Аер А1а <31и Рке Агд Нге Аер Бег О1у Туг О1и Уа1 Нхе Н1з О1п Ьуз 15 10 15
Ьеи Уа1 РЬе РНе А1а <31и Аер Уа1 <31у Бег Азп Ьуз С1у А1а 11е 11е 20 25 30
С1у Ьеи МеЬ Уа1 С1у <31у 35 <210> 11 <211> 36 <212? РЕТ <213> Ното зардепз <400> 11
С1и РНе Агд Нхе Аер Зег 01у Туг О1и А/а1 ΗΪ3 Нхз <31п Ьуз Ьеи Уа1 15 10 15
РНе РНе А1а О1и Аер Уа1 <31у Зег Аеп Ьуз О1у А1а Не Не О1у Ьеи 20 25 30
- 27 025107
- 28 025107 <400> 14
С1п Рго Азр А1а 11е Азп А1а Рго Уа1 ТЬг Суз Суз Туг Азп РЬе ТЬг 15 10 15
Азп Агд Ьуз Не Зег Уа1 <31п Агд ьеи А1а Зег Туг Агд Агд Не ТЬг 20 25 30
Зег Зег Ьуз Суз Рго Ьуз <31и А1а Уа1 Не РЬе Ьуз ТЬг 11е \Га1 А1а 35 40 45
Ьуз <31и Не Суз А1а Азр Рго Ьуз С1п Ьуз Тгр νβΐ О1п Азр 5ег МеЪ 50 55 60
Азр Н1з Ьеи Азр Ьуз С1п ТЬг С1п ТЬг Рго Ьуз ТЬг 65 70 75 <210> 15 <211> 76 <212> РКТ <213> Ногпо зархепз <400> 15
С1п Рго \7а1 01у Не Азп ТЬг Зег ТЬг ТЬг Суз Суз Туг Агд РЬе Не 15 10 15
Азп Ьуз Ьуз Не Рго Ьуз <31п Агд Ьеи <31и Зег Туг Агд Агд ТЬг ТЬг 20 25 30
Зег Зег ΗΪ3 Суз Рго Агд <31и А1а ναΐ Не РЬе Ьуз ТЬг ьуз Ьеи Аер 35 40 45
Ьуз <31и Не Суз А1а Азр Рго ТЬг <31п Ьуз Тгр Уа1 С1п Азр РЬе МеЬ 50 55 60
- 29 025107
Ьуз Ηίβ 65 Ьеи Азр Ьуз Ьув 70 ТЬг С1п ТЬг РГО Ьув 75 ьеи
<210> 16
<211> 76
<212 > РЕТ
<213> Ното заргепз
<400> 16
<31п Рго Азр Бег Уа1 Бег Не Рго Не ТЬг Сув Сув РЬе Авп Уа1 Не
1 5 10 15
Азп Агд Ьуз Не Рго Не С1п Агд Ьеи <31и Бег Туг ТЬг Агд Не ТЬг
20 25 30
Авп Не О1п Суб РгО Ьув <31и А1а Уа1 Не РЬе Ьуз ТЬг Ьуз Агд С1у
35 40 45
Ьуз С1и Уа1 Суз А1а Азр Рго Ьуз С1и Агд Тгр Уа1 Агд Азр Бег МеЬ
50 55 60
Ьуз ΗΪ3 Ьеи Азр О1п 11е РЬе С1п Азп Ьеи Ьуз Рго
65 70 75
<210> 17
<211> 101
<212> РЕТ
<213э Ми$ тпизси1ие
<400> 17
С1п 11е ТЬг ΗΪΞ А1а ТЬг С1и ТЬг Ьуз О1и Уа1 С1п Бег Бег Ьеи Ьуз
1 5 10 15
А1а Θΐη О1п С1у Ьеи С1и Не <31и МеЦ РЬе Ηί 3 мее О1у РЬе <31п Азр
20 25 30
- 30 025107
Зег Бег Αερ Суе Суе Ьеи Бег Туг Азл Зег Агд Не С1п Суз Зег Агд 35 40 45
РЬе 11е <31у Туг РЬе Рго ТЬг Зег О1у С1у Суз ТЬг Агд Рго С1у 11е 50 55 60
Т1е РЬе 11е Зег Ьуз Агд С1у РЬе <31п Уа1 Суз А1а Авп Рго Зег АЗр 65 70 75 80
Агд Агд Уа1 С1п Агд Суз Не <31и Агд Ьеи Э1и <31п Азл Зег О1п Рго 85 90 95
Агд ТЬг Туг ьуз αΐη 100
<210> 18
<211> 75
<212> РЕТ
<2 13> Ногао
<400> 18
С1п Рго Азр А1а Ьеи Азл \7а1 Рго Зег ТЬг Суз Суз РЬе ТЬг РЬе Зег 15 10 15
Зег ьуз ьуз Не зег ьеи οίη Агд ьеи Ьуз зег Туг Уа1 Не ТЬг ТЬг 20 25 30
Зег Агд Суз Рго αΐη Ьуз А1а Уа1 Не РЬе Агд ТЬг Ьуз Ьеи (31у Ьуз 35 40 45
С1и Т1е Суз А1а Азр Рго Ьуз С1и Ьуз Тгр \?а1 С1п Азл Туг МеЬ Ьуз 50 55 60
Н1з Ьеи С1у Агд Ьуз А1а Нгз ТЬг Ьеи Ьуз ТЬг 65 70 75
- 31 025107 <210> 19 <211> 92 <212> РЕТ <213> Ноте· зархепз <400> 19
αΐη РЬе 1 Не Азп Азр 5 А1а С1и ТЬг <31и Ьеи 10 МеЬ Меб Зег Ьуз Ьеи 15 Рго
Ьеи С1и Азп Рго ЛГа1 Уа1 Ьеи Азп Зег РЬе Нхз РЬе А1а А1а Азр Суз
20 25 30
Суе ТЬг Зег Туг Не Зег С1п Зег Не Рго Суз Зег Ьеи меъ Ьуз Зег
35 40 45
Туг РЬе С1и ТЬг Зег Зег С1и Суз Зег Ьуз Рго С1у 7а1 Не РЬе Ьеи
50 55 60
ТЬг Ьуз Ьуз С1у Агд □ 1п Уа1 Суз А1а Ьуз Рго Зег <31у Рго О1у Уа1
65 70 75 80
<31п Авр Суз МеЬ Ьуз Ьуз Ьеи Ьуз Рго Туг Зег 11е
85 90
<210> 20
<211> 97
<212> РЕТ
<213> Ното зархепз
<400> 20
С1п Рго Ьуз ν3ΐ Рго С1и Тгр Уа1 Азп ТЬг Рго Зег ТЬг Суз Сув Ьеи
1 5 10 15
Ьуз Туг Туг С1и Ьуз Уа1 Ьеи Рго Агд Агд Ьеи Уа1 Уа1 С1у Туг Агд
20 25 30
- 32 025107
Ьуз А1а Ьеи Азп Суз Н1з Ьеи Рго А1а 11е Не РЬе Уа1 ТЬг Ьуз Агд 35 40 45
Азп Агд С1и Уа1 Суз ТЬг Азп Рго Азп Азр Азр Тгр Уа1 ОХп <31и Туг 50 55 60
Не Ьуз Азр Рго Азп Ьеи Рго Ьеи Ьеи Рго ТЬг Агд Азп Ьеи Зег ТЬг 65 70 75 80
Уа1 Ьув Не Не ТЬг А1а Ьуз Азп С1у С1п Рго <31п Ьеи Ьеи Азп Зег 85 90 95
С1п
- 33 025107
ЬуЗ С1п Не СПу <31и 85 Уа1 Ьуз Рго Агд ТЬг 90 ТЬг Рго А1а А1а 01у 95 О1у
Мее Азр С1и Зег Уа1 Уа1 Ьеи С1и Рго О1и А1а ТЬг С1у СПи Зег Зег
100 105 110
Зег Ьеи С1и Ргс ТЬг Рго Зег Зег С1п С1и А1а С31п Агд А1а ьеи С1у
115 120 125
ТЬг Зег Рго О1и Ьеи Рго ТЬг О1у Уа1 ТЬг СПу Зег Зег СПу ТЬг Агд
130 135 140
Ьеи Рго Рго ТЬг Рго Ьуз А1а С1п Аер С1у С1у Рго Уа1 СПу ТЬг С1и
14 5 150 155 160
Ьеи РЬе Агд Уа1 Рго Рго 7а1 Зег ТЬг А1а А1а ТЬг Тгр <31п Зег Зег
165 170 175
А1а Рго ΗΪ5 Θΐη Рго <31у Рго Зег Ьеи Тгр А1а С1и А1а Ьуз ТЬг Зег
180 185 190
С1и А1а Рго Зег ТЬг С1п Азр Рго зег ТЬг □ 1п А1а Зег ТЬг А1а Зег
195 200 205
Зег Рго А1а Рго О1и С1и Азп А1а Рго Зег 01и С1у С1п Агд Уа1 Тгр
210 215 220
С1у С1п С1у О1п Зег Рго Агд Рго <31и Аеп Зег Ьеи С1и Агд С1и С1и
225 230 235 240
МеЬ С1у Рго Уа1 Рго А1а Ηί э ТЬг Азр А1а РЬе С1п Азр Тгр О1у Рго
245 250 255
С1у Зег Мее А1а Н1з Уа1 Зег Уа1 ναΐ РГО Уа1 зег Зег <31и С1у ТЬг
260 265 270
- 34 025107
РГО Зег Агд 275 С1и Рго Уа1 А1а Зег 280 С1у Зег Тгр ТЪг Рго 285 Ьуз А1а С1и
С1и Рго 11е Н1з А1а ТЪг МеЬ Азр Рго С1п Агд Ьеи О1у Уа1 Ьеи Не
290 295 300
ТЪг Рго Уа1 Рго Азр Л1а С1п А1а А1а ТЪг Агд Агд <31п А1а Уа1 С1у
305 310 315 320
Ьеи Ьеи А1а РЪе Ьеи С1у Ьеи Ьеи РЪе Суз Ьеи С1у Уа1 А1а МеС РЪе
325 330 335
ТЪг Туг О1п Зег Ьеи С1п С1у Суз Рго Агд Ьуз МеЪ А1а С1у С1и МеС
340 345 350
А1а С1и С1у Ьеи Агд Туг 11е Рго Агд Зег Суз С1у Зег Азп Зег Туг
355 360 365
Уе1 Ьеи \7а1 Рго ν&ι
370
<2Ю> : 22
<211> 127
<212> РЕТ
<213> 1 4 ото еархепз
<400> : 22
<31п С31у Уа1 РЪе <31и Азр Суз Суз Ьеи А1а Туг Нхз Туг Рго Не 31у
1 5 10 15
Тгр А1а Уа! Ьеи Агд Агд А1а Тгр ТЪг Туг Агд Не С1п С1и Уа1 Зег
20 25 30
С1у Зег Суз Азп Ьеи Рго А1а А1а Не РЪе Туг Ьеи Рго Ьуз Агд ΗΪ3
35 4 0 45
Агд Ьуз Уа1 Суз С1у АЗП РГО Ьуз Зег Агд С1и Уа1 С1п Агд А1а МеС
50 55 60
Ьуз Ьеи Ьеи Азр А1а Агд АЗП ьуз Уа1 РЪе А1а Ьуз Ьеи ΗΪ3 ΗΪ3 Азп
65 70 75 80
ТЪг С1п ТЪг РЪе С1п А1а С1у Рго Н1з А1а Уа1 Ьуз Ьуз Ьеи Зег Зег
85 90 95
С1у Азп Зег Ьуз Ьеи Зег Зег Зег Ьуз РЪе Зег Азп Рго Не Зег Зег
100 105 110
Зег Ьуз Агд Азп Уа1 Зег Ьеи Ьеи Не Зег А1а Азп Зег О1у Ьеи
115 120 125
- 35 025107
ΦΟΡΜΥΠΑ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ диагностирования болезни Αльцгеймера (ΑΌ), нейродегенерации при синдроме Дауна (ΝΏ8) или легкого когнитивного нарушения (МС1) у субъекта, включающий:
(а) определение количества глутаминилциклазы (ОС) или ее изоформы в образце мозга или спинномозговой жидкости (СМЖ), полученного от указанного субъекта;
(б) сравнение установленного количества ОС в вышеуказанном образце мозга или СМЖ с количеством ОС, характерным для контрольной группы, где повышение по меньшей мере на 10% количества ОС в тестируемом образце мозга или СМЖ относительно контрольной группы является положительным индикатором наличия ΑΌ, ΝΏ8 или МС1.
2. Способ диагностирования болезни Αльцгеймера (ΑΌ), нейродегенерации при синдроме Дауна (ΝΏ8) или легкого когнитивного нарушения (МС1) у субъекта, включающий:
(а) определение количества глутаминилциклазы (ОС) или ее изоформы в образце мозга или СМЖ, полученного от указанного субъекта, и дополнительное определение количества Αβ ШрЕ-Х в данном образце, где X обозначает целое число, выбранное из 38, 40 и 42;

Claims (15)

  1. (б) сравнение установленного количества ОС и Αβ Ν3μΕ-Χ в вышеуказанном образце мозга или СМЖ с количеством ОС и Αβ Ν3μΕ-Χ, характерным для контрольной группы, где повышение по меньшей мере на 10% количества ОС и Αβ Ν3μΕ-Χ в тестируемом образце мозга или СМЖ относительно контрольной группы является положительным индикатором наличия ΑΌ, ΝΏ8 или МС1.
  2. 3. Способ диагностирования болезни Αльцгеймера (ΑΌ), нейродегенерации при синдроме Дауна (ΝΏ8) или легкого когнитивного нарушения (МС1) у субъекта, включающий:
    (а) определение количества глугаминилциклазы (ОС) или ее изоформы в образце мозга или СМЖ, полученном от указанного субъекта, и дополнительное определение количества хемокина, где хемокин выбирают из ССЬ2, ССЬ7, ССЬ8, ССЬ9/10, ССЬ13, ССЬ15, ССЬ16, ССЬ25 и фракталкина;
    (б) сравнение установленного количества ОС и хемокина в вышеуказанном образце мозга или СМЖ с количеством ОС и хемокина, характерным для контрольной группы, где повышение по меньшей мере на 10% количества ОС и хемокина в тестируемом образце относительно контрольной группы является положительным индикатором наличия ΑΌ, ΝΏ8 или МС1.
  3. 4. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором ОС представляет собой человеческую ОС или ее изоформу, которая имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1, 2, 3, 4 и 5.
  4. 5. Способ по п.4, в котором ОС представляет собой человеческую ОС, которая имеет аминокислотную последовательность 8ΕΟ ГО ΝΟ: 1.
  5. 6. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором количество ОС определяют иммунотурбидиметрическим анализом, иммунофлуоресцентным анализом, иммунодиффузионным анализом, твердофазным иммуноферментным анализом (Εί-ΙδΑ), радиоиммуноанализом (ΡИΑ), вестерн-блоттингом, анализом активности белка, нозерн-блоттингом, ПЦР, жидкостной хроматографией высокого разрешения (ЖХВР), масс-спектрометрией (МС), газовой хроматографией (ГХ), газовой хроматографией-массспектрометрией (ГХ-МС), жидкостной хроматографией-масс-спектрометрией (ЖХ-МС) и жидкостной хроматографией-тандемной масс-спектрометрией (ЖХ-МС/МС).
  6. 7. Способ по любому из пп.1-3, в котором количество ОС определяют с помощью антитела, которое специфически связывается с ОС или ее изоформой.
  7. 8. Способ по любому из пп.1-3, в котором количество ОС определяют путем измерения ферментативной активности ОС или ее изоформы.
  8. 9. Способ по любому из пп.1-3, в котором количество ОС или ее изоформы определяют на основе уровня мРНК ОС или ее изоформы.
  9. 10. Способ по п.2, в котором X равно 42.
  10. 11. Способ по п.2, в котором X равно 40.
  11. 12. Способ по п.2, в котором X равно 38.
  12. 13. Способ по п.2, в котором комбинацию Αβ N3рΕ-42, и/или Αβ N3рΕ-40, и/или Αβ N3рΕ-38 определяют одновременно с ОС.
  13. 14. Способ по одному из пп.3-9, в котором хемокин представляет собой ССЬ2.
  14. 15. Способ диагностирования болезни Αльцгеймера (ΑΌ), нейродегенерации при синдроме Дауна (ΝΏ8) или легкого когнитивного нарушения (МС1) у субъекта, в котором:
    (а) получают биологический образец мозга или СМЖ указанного субъекта;
    (б) приводят в контакт биологический образец с антителом, которое связывается с глутаминилциклазой (ОС) или ее изоформой;
    (в) определяют количество образовавшегося иммунного комплекса в качестве показателя количества ОС в биологическом образце;
    (г) сравнивают установленное количество в вышеуказанном образце с количеством ОС, характер- 36 025107 ным для контрольной группы субъектов, где повышение по меньшей мере на 10% количества ОС в тестируемом образце относительно контрольной группы является положительным индикатором наличия АО, ΝΏ8 или МС1.
  15. 16. Набор, предназначенный для диагностирования болезни Αльцгеймера (АО), нейродегенерации при синдроме Дауна (ΝΏ8) или легкого когнитивного нарушения (МС1) способом по п. 15, который включает антитело, связывающееся с ОС или его изоформой, и принятый стандарт количества ОС, характерного для контрольной группы.
    Фиг. 1
    Фиг. 2
    - 37 025107
    Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
EA201100253A 2008-07-31 2009-07-31 Способ диагностирования болезни альцгеймера, нейродегенерации при синдроме дауна или легкого когнитивного нарушения у субъекта (варианты) и набор для осуществления способа EA025107B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8515408P 2008-07-31 2008-07-31
PCT/EP2009/059951 WO2010012828A2 (en) 2008-07-31 2009-07-31 Glutaminyl cyclase as a diagnostic / prognostic indicator for neurodegenerative diseases

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201100253A1 EA201100253A1 (ru) 2011-10-31
EA025107B1 true EA025107B1 (ru) 2016-11-30

Family

ID=41256108

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201100253A EA025107B1 (ru) 2008-07-31 2009-07-31 Способ диагностирования болезни альцгеймера, нейродегенерации при синдроме дауна или легкого когнитивного нарушения у субъекта (варианты) и набор для осуществления способа

Country Status (16)

Country Link
US (3) US20100028918A1 (ru)
EP (1) EP2329274B1 (ru)
JP (1) JP5677297B2 (ru)
KR (1) KR101682728B1 (ru)
CN (2) CN103983787A (ru)
AU (1) AU2009275869B2 (ru)
BR (1) BRPI0916601B1 (ru)
CA (1) CA2731933A1 (ru)
EA (1) EA025107B1 (ru)
HK (1) HK1155813A1 (ru)
IL (1) IL210266A (ru)
MX (1) MX2011001093A (ru)
NZ (1) NZ590658A (ru)
SG (1) SG193148A1 (ru)
WO (1) WO2010012828A2 (ru)
ZA (1) ZA201100177B (ru)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013519891A (ja) * 2010-02-18 2013-05-30 プロビオドルグ エージー ピログルタミン酸修飾ｍｃｐ−１を決定することにより炎症性疾患を診断する方法及びグルタミニルシクラーゼの阻害剤のスクリーニング方法
SG10201604304RA (en) * 2011-05-27 2016-07-28 Probiodrug Ag Radiolabelled glutaminyl cyclase inhibitors
JP2018501482A (ja) 2014-12-19 2018-01-18 プロビオドルグ エージー ｐＧｌｕ−Ａｂｅｔａペプチドの検出のための新規の方法
CN104946680A (zh) * 2015-06-11 2015-09-30 深圳大学 用于表达qc的重组载体及其制备方法、引物、基因工程菌
WO2018008764A1 (ja) * 2016-07-08 2018-01-11 味の素株式会社 軽度認知障害又はアルツハイマー型認知症の評価方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070191366A1 (en) * 2003-05-05 2007-08-16 Torsten Hoffmann Use of effectors of glutaminyl and glutamate cyclases
WO2008034891A2 (en) * 2006-09-21 2008-03-27 Probiodrug Ag Novel genes related to glutaminyl cyclase

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4374316B2 (ja) * 1993-01-25 2009-12-02 武田薬品工業株式会社 β−アミロイドまたはその誘導体に対する抗体およびその用途
JP3590468B2 (ja) * 1996-01-22 2004-11-17 財団法人 東京都医学研究機構 アルツハイマー病診断薬
CA2487528A1 (en) * 2002-07-24 2004-02-12 Innogenetics N.V. Prevention, treatment and diagnosis of diseases associated with beta-amyloid formation and/or aggregation
EP1620082B9 (en) * 2003-05-05 2010-08-25 Probiodrug AG Medical use of inhibitors of glutaminyl and glutamate cyclases for treating alzheimer's disease and down syndrome
JP5707014B2 (ja) * 2003-10-15 2015-04-22 プロビオドルグ エージー グルタミニル、及びグルタミン酸シクラーゼのエフェクターの使用
US20060094064A1 (en) * 2003-11-19 2006-05-04 Sandip Ray Methods and compositions for diagnosis, stratification, and monitoring of alzheimer's disease and other neurological disorders in body fluids
EP1713780B1 (en) * 2004-02-05 2012-01-18 Probiodrug AG Novel inhibitors of glutaminyl cyclase
EP1869008A1 (en) * 2005-04-11 2007-12-26 Probiodrug AG Inhibitors of prolyl endopeptidase
ES2373048T3 (es) * 2006-06-08 2012-01-30 Fu Berlin Análisis para el diagnóstico de la enfermedad de alzheimer basado en la determinación de la proporción de productos de escisión ab de secretasa.
SI2121944T1 (sl) 2007-01-19 2011-12-30 Probiodrug Ag In vivo presejalni modeli za zdravljenje Alzheimerjeve bolezni in drugih motenj, povezanih s QPCT

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070191366A1 (en) * 2003-05-05 2007-08-16 Torsten Hoffmann Use of effectors of glutaminyl and glutamate cyclases
WO2008034891A2 (en) * 2006-09-21 2008-03-27 Probiodrug Ag Novel genes related to glutaminyl cyclase

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CYNIS HOLGER ET AL: "Amyloidogenic processing of amyloid precursor protein: Evidence of a pivotal role of glutaminyl cyclase in generation of pyroglutamate-modified amyloid-beta", BIOCHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, US, vol. 47, no. 28, 1 July 2008 (2008-07-01), US, pages 7405 - 7413, XP002568788, ISSN: 0006-2960, DOI: 10.1021/BI800250P *
CYNIS, H. ; SCHILLING, S. ; BODNAR, M. ; HOFFMANN, T. ; HEISER, U. ; SAIDO, T.C. ; DEMUTH, H.U.: "Inhibition of glutaminyl cyclase alters pyroglutamate formation in mammalian cells", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA (BBA) - PROTEINS & PROTEOMICS, ELSEVIER, NETHERLANDS, vol. 1764, no. 10, 1 October 2006 (2006-10-01), Netherlands, pages 1618 - 1625, XP025123183, ISSN: 1570-9639, DOI: 10.1016/j.bbapap.2006.08.003 *
GONTSAROVA ANASTASSIA, ET AL: "Glutaminyl cyclase activity is a characteristic feature of human cerebrospinal fluid", CLINICA CHIMICA ACTA, ELSEVIER BV, AMSTERDAM, NL, vol. 389, no. 1-2, 1 March 2008 (2008-03-01), AMSTERDAM, NL, pages 152 - 159, XP002559604, ISSN: 0009-8981, DOI: 10.1016/j.cca.2007.12.010 *
GÜNTERT A, ET AL: "High sensitivity analysis of amyloid-beta peptide composition in amyloid deposits from human and PS2APP mouse brain.", NEUROSCIENCE, NEW YORK, NY, US, vol. 143, no. 2, 1 December 2006 (2006-12-01), US, pages 461 - 475, XP002568789, ISSN: 0306-4522, DOI: 10.1016/J.NEUROSCIENCE.2006.08.027 *
SCHILLING STEPHAN, ET AL: "Glutaminyl cyclase inhibition attenuates pyroglutamate A beta and Alzheimer's disease-like pathology", NATURE MEDICINE., NATURE PUBLISHING GROUP, NEW YORK, NY., US, vol. 14, no. 10, 1 October 2008 (2008-10-01), US, pages 1106 - 1111, XP002559603, ISSN: 1078-8956, DOI: 10.1038/nm.1872 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2329274A2 (en) 2011-06-08
EP2329274B1 (en) 2015-12-02
CA2731933A1 (en) 2010-02-04
CN102112880B (zh) 2014-06-25
US20150247180A1 (en) 2015-09-03
CN103983787A (zh) 2014-08-13
US20100028918A1 (en) 2010-02-04
JP5677297B2 (ja) 2015-02-25
MX2011001093A (es) 2011-03-15
BRPI0916601A2 (pt) 2015-11-10
KR101682728B1 (ko) 2016-12-05
NZ590658A (en) 2012-07-27
CN102112880A (zh) 2011-06-29
KR20110049781A (ko) 2011-05-12
ZA201100177B (en) 2012-02-29
AU2009275869A1 (en) 2010-02-04
IL210266A0 (en) 2011-03-31
US20170097365A1 (en) 2017-04-06
JP2011529571A (ja) 2011-12-08
WO2010012828A3 (en) 2010-05-06
WO2010012828A2 (en) 2010-02-04
SG193148A1 (en) 2013-09-30
EA201100253A1 (ru) 2011-10-31
IL210266A (en) 2016-04-21
HK1155813A1 (en) 2012-05-25
AU2009275869B2 (en) 2015-05-21
BRPI0916601B1 (pt) 2021-05-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Li et al. Plasma α-synuclein is decreased in subjects with Parkinson's disease
US20170097365A1 (en) Glutaminyl cyclase as a diagnostic/prognostic indicator for neurodegenerative diseases
US8592223B2 (en) Use of periostin as a novel biomarker
Semba et al. Relationship of circulating growth and differentiation factors 8 and 11 and their antagonists as measured using liquid chromatography–tandem mass spectrometry with age and skeletal muscle strength in healthy adults
US9778250B2 (en) Detecting inclusion body myositis
Zhong et al. A strategy for discovery and verification of candidate biomarkers in cerebrospinal fluid of preclinical Alzheimer’s disease
Huang et al. Heparan sulfated glypican-4 is released from astrocytes by proteolytic shedding and GPI-anchor cleavage mechanisms
US8460884B2 (en) Use of hematopoietic growth factor inducible neurokinin-1 (HGFIN) as a biomarker for renal injury or renal disease
Mattsson et al. Converging pathways of chromogranin and amyloid metabolism in the brain
US20140273032A1 (en) Compositions and methods for diagnosis of schizophrenia
JP2012510614A (ja) オピオルフィン等の塩基性プロリンリッチ涙液遺伝子産物のバイオマーカーとしての使用
WO2019133854A1 (en) Methods of quantifying cftr protein expression
JP7384365B2 (ja) 口腔乾燥症を診断するための唾液バイオマーカー及びその用途
US20170030929A1 (en) Diagnosis of chronic kidney disease by quantitative analysis of post-translational modifications of plasma proteins
Walker et al. Proteomics in the characterization of new target therapies in pediatric obesity treatment
Schmidt et al. The Alzheimer’s disease-linked protease BACE2 cleaves VEGFR3 and modulates its signaling
WO2021180636A1 (en) Detection of klotho
Griffiths Novel biomarkers for arthritis: The role of P2X7 receptor in transglutaminase 2 export and activation
RU2009130183A (ru) Способ прогнозирования тяжелого течения атопического дерматита по уровню специфических igg-аутоантител у детей старше 3-х лет
WO2017198554A1 (en) Method for the diagnosis of neurodegenerative diseases

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

TC4A Change in name of a patent proprietor in a eurasian patent
PD4A Registration of transfer of a eurasian patent in accordance with the succession in title