MX2011001093A - Glutaminil ciclasa como un indicador para el diagnostico / pronostico de enfermedades neurodegenerativas. - Google Patents

Glutaminil ciclasa como un indicador para el diagnostico / pronostico de enfermedades neurodegenerativas.

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Abstract

La presente invención se refiere a un método par predecir, diagnosticar y pronosticar una enfermedad neurodegenerativa, tal como enfermedad de Alzheimer (AD), Deficiencia Cognitiva Leve (MCI) y neurodegeneración en Síndrome de Down (NDS), usando glutaminil ciclasa (QC) como un indicador de diagnóstico / pronóstico. También se proporciona el uso de anticuerpos que se fijan a QC y de estuches para realizar dicho método de diagnóstico.

Description

GLUTAMINIL CICLASA COMO UN INDICADOR PARA EL DIAGNÓSTICO / PRONÓSTICO DE ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS Campo de la invención La presente invención se refiere a un método para predecir, diagnosticar y pronosticar una enfermedad neurodegenerativa, tal como la Enfermedad de Alzheimer (AD, por sus siglas en inglés), Deficiencia Cognitiva Leve (MCI , por sus siglas en inglés), y Neurodegeneración en el Síndrome de Down (NDS, por sus siglas en inglés), usando glutaminil ciclasa (QC, por sus siglas en inglés), como un indicador de diagnóstico / pronóstico.
Antecedentes de la invención La Enfermedad de Alzheimer (AD) es una enfermedad neurodegenerativa que produce demencia. Los términos "Enfermedad de Alzheimer" y "Mal de Alzheimer" se utilizan ambos en la técnica, estos términos son equivalentes y se usan aquí y en todas partes de manera indistinta. El periodo desde la primera detección de la AD hasta la terminación, puede variar desde unos pocos años hasta 15 años, tiempo durante el cual el paciente sufre progresivamente de pérdida de la función mental y del control de las funciones corporales. Hay una variabilidad significativa en el avance de la enfermedad . Si bien la mayor parte de los pacientes tiene un avance gradual, inexorable (perdiendo en promedio de 3 a 4 puntos en la puntuación de 30 puntos del estado mental mínimo de Folstein anual mente), aproximadamente 30% de los casos de AD tienen una fase de meseta estable inicial prolongada que dura varios años (Haxby, J . V. et al. Individual trajectories of cognitive decline in patients with dementia of the Alzheimer type, J. Clin. Exp. Neuropsychol 14: 575-592, 1 992). Un subgrupo de pacientes tiene un curso degenerativo rápidamente progresivo, fulminante, durante varios años (Mann , U ., et al. , Heterogeneity in Alzheimer's Disease: Progression rate segregated by distinct neuropsychological and cerebral metabolic profiles, J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 55: 956-959, 1 992). Otros pacientes (aproximadamente 1 0% de las cohortes) permanecen con avance lento, mostrando solamente una declinación gradual de año en año (Grossi , D. er al. , senile dementias, I I International Symposium (pp. 97-99), Paris: John Libbey Eurotext, 1988). Las bases moleculares, químicas y patológicas de esta heterogeneidad siguen sin determinar. El reconoci miento de la variabilidad del avance de la AD representa u na revelación cl ínica importante, y puede explicar las dificultades para el diagnóstico que presentan los casos "atípleos". Si bien en ciertos casos hay una manifestación familiar de la enfermedad AD, parece que la mayor parte de los casos de AD son no familiares, y hasta hace poco (ver más adelante) no se hab ía determinado un marcador biológico simple para la enfermedad .
Los métodos que se utilizan actualmente para diagnosticar la AD involucran el análisis del líquido cefalorraqu ídeo (CSF, por sus siglas en inglés) o de tejido cerebral obtenido de pacientes post mórtem . Por ello, entre los marcadores actualmente bajo consideración están los que se relacionan con las proteínas, los cuales explican las características encontradas en los cerebros con Alzheimer post mórtem . La maraña neurofibrilar está compuesta principalmente de proteína tau hiperfosforilada , una proteína citoesquelética. La placa neurítica contiene un núcleo de proteína amiloide, mucho del cual está constituido por péptido de 42 aminoácidos (?ß42) derivado de la división proteol ítíca de una proteína precursora más grande. Otra forma de esta proteína derivada del mismo precursor, contiene solamente 40 aminoácidos (?ß40). En los cerebros de las víctimas de Alzheimer se encuentran depósitos de esta proteína. Sin embargo, las alteraciones en tau y en los péptidos beta amiloideos mencionados anteriormente, no ocurren con suficiente frecuencia y magnitud como para tener valor en el diagnóstico, y por lo tanto, las pruebas de sangre basadas en estas proteínas no parecen correlacionarse bien con la AD . Además de la variabilidad en el terminal C, los péptidos ?ß modificados termlnalmente son abundantes (Saido, T. C. et al. Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, ?ß N3(pE), in senile plaques. Neuron 1 4, 457-466 ( 1995); Russo, C. et al. Presenilin-1 mutations in Alzheimer's disease. Nature 405, 531 -532 (2000); Saido, T. C, Yamao, H . , Iwatsubo, T. y Kawashima , S. Amino- and carboxyl- terminal heterogeneity of beta-amyloid peptides deposited i n human brain . Neurosci. Lett. 21 5, 1 73-1 76 ( 1 996)). Parece que una proporción principal de los péptidos ?ß sufre truncamiento en el terminal N en dos aminoácidos, exponiendo un residuo de glutamato, que posteriormente es ciclizado en piroglutamato (pE), lo que da como resultado péptidos ?ß3(??)-42 (Saido, T. C. eí al. Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, ?ß N3(pE), in senile plaques. Neuron 14, 457-466 (1995); Saido, T.C., Yamao, H., Iwatsubo, T. y Kawashima, S. Amino- and carboxyl-terminal heterogeneity of beta-amyloid peptides deposited in human brain. Neurosci. Lett.215, 173-176 (1996)). De manera alternativa, los pE se pueden formar después de la escisión ß' por BACE1, lo que da como resultado ?ß N11(pE)-42 (Naslund, J. et al. Relative abundance of Alzheimer ?ß amyloid peptide variants in Alzheimer disease and normal aging. Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 91, 8378-8382 (1994); Liu, K. et al. Characterization of ?ß? 1-40/42 peptide deposition in Alzheimer's disease and young Down's syndrome brains: implication of N-terminally truncated Abeta species in the pathogenesis of Alzheimer's disease. Acta Neuropathol. 112, 163-174 (2006)). En particular, se ha demostrado que el ?ß N3(pE)-42 es un elemento constituyente principal de los depósitos de ?ß en la AD esporádica y familiar (Saido, T. C. et al. Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, ?ß N3(pE), en las placas seniles. Neuron 14, 457-466 (1995); Miravalle, L. et al. Amino-terminally truncated ?ß peptide species are the main component of cotton wool plaques. Biochemistry 44, 10810-10821 (2005)).
Los péptidos ?ß N3pE-42 coexisten con los péptidos ?ß 1-40/1- 42 (Saido, T.C. et al. Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, Abeta N3pE, in senile plaques. Neuron 14, 457-466 (1995); Saido, T.C, Yamao, H., Iwatsubo, T. y Kawashima, S. Amino- and carboxyl-terminal heterogeneity of beta-amyloid peptides deposited in human brain. Neurosci. Lett. 215, 173-176 (1996)), y, con base en una cantidad de observaciones, podrían jugar un papel prominente en la patogénesis de la AD. Por ejemplo, se ha descrito de forma general una neurotoxicidad particular de los péptidos ?ß N3pE-42 (Russo, C. et al. Pyroglutamate-modified amyloid beta-peptides -AbetaN3(pE)- strongly affect cultured neuron and astrocyte survival. J. Neurochem. 82, 1480- 1489 (2002) y la modificación pE de los péptidos ?ß con truncamiento en N les confiere resistencia a la degradación por la mayoría de las aminopeptidasas, así como también las endopeptidasas de degradación ?ß (Russo, C. et al. Pyroglutamate-modified amyloid beta-peptides —AbetaN3(pE)— strongly affect cultured neuron and astrocyte survival. J. Neurochem. 82, 1480-1489 (2002); Saido, T. C. Alzheimer's disease as proteolytic disorders: anabolism and catabolism of beta-amyloid. Neurobiol. Aging 19, S69-S75 (1998)). La ciclización del ácido glutámico en pE lleva a una pérdida de carga en el terminal N, lo que produce una agregación acelerada de ?ß N3pE en comparación con los péptidos ?ß no modificados (He, W. y Barrow, CJ. The ?ß 3-pyroglutamyl and 11-pyro glutamyl peptides found in senile plaque have greater beta-sheet forming and aggregation propensities in vitro than full-length ?ß. Biochemistry 38, 10871-10877 (1999); Schilling, S. et al. On the seeding and oligomerization of pGlu-amyloid peptides (in vitro). Biochemistry 45, 12393-12399 (2006)). Por ello, la reducción de la formación de ?ß N3pE-42 debe desestabilizar los péptídos, haciéndolos más accesibles a la degradación y podría, a su vez, evitar la formación de agregados ?ß de mayor peso molecular y mejorar la supervivencia neuronal.
Sin embargo, durante largo tiempo no se sabía cómo ocurre la modificación con pE de los péptidos ?ß. La Solicitante de la presente, descubrió que la glutaminil ciclasa (QC) es capaz de catalizar la formación de ?ß N3pE-42 bajo condiciones levemente ácidas, que los inhibidores específicos de QC evitan la generación in vitro de ?ß N3pE-42 y que, por lo tanto, la inhibición de glutaminil ciclasa es un nuevo concepto terapéutico para el tratamiento de las causas de la enfermedad de Alzheimer (Schilling, S., Hoffmann, T., anhart, S., Hoffmann, M. y Demuth, H. -U. Glutaminyl cyclases unfold glutamyl cyclase activity under mild acid conditions. FEBS Lett. 563, 191-196 (2004); Cynis, H. et al. Inhibition of glutaminyl cyclase alters pyroglutamate formation in mammalian cells. Biochim. Biophys. Acta 1764, 1618-1625 (2006); Schilling et al. Inhibition of glutaminyl cyclase - a novel therapeutic concept for the causative treatment of Alzheimer's disease. Nature Medicine 14, 1106-1111 (2008)).
Hasta el presente, parece no haber un marcador de diagnóstico satisfactorio para la AD existente, o para un sujeto, que aunque tenga respuestas cognitivas normales, inevitablemente, o muy probablemente, desarrollará AD .
La Disminución Cognitiva Asociada con la Edad (AACD) y la Deficiencia Cognitiva Leve ( MCI ) son términos que se usan para identificar individuos que experimentan una disminución cognitiva que cae cerca de la demencia . Estos términos son equivalentes, siendo el de MCI un término adoptado más recientemente, y se usan indistintamente en esta solicitud . La satisfacción de criterios (Organización Mundial de la Salud) para este diagnóstico requiere un informe por parte del individuo o de la familia de una disminución en la función cognitiva , la cual es gradual , y está presente al menos 6 meses. Puede haber dificultades a través de cualquier domi nio cognitivo (aunque la memoria se deteriora en la gran mayoría de los casos), y estas pueden ser apoyadas por desempeño anormal en evaluaciones cognitivas cuantitativas para las cuales hay patrones de edad y educación disponibles para i ndividuos relativamente sanos (es decir, el paciente se compara con sujetos normales de su propia edad). El desempeño debe ser al menos de 1 SD por debajo del valor medio para la población apropiada en estas pruebas. No pueden estar presentes ni demencia , ni depresión significativa o efectos de fármacos. No puede estar presente alguna enfermedad o condición cerebral o sistémica que se sabe que prod uce disfunción cognitiva . En la experiencia de la Solicitante, todos los pacientes que fueron clasificados como CDR.5 ("demencia cuestionable" en la escala de calificación de Demencia Cl ínica y que cumplieron con estas exclusiones, también cumplen con los criterios para AACD/MC I . Aproximadamente 1 /3 de los pacientes con Alzheimer han tenido un periodo claramente definible de déficit de memoria aislada que precedió su disminución cognitiva más general . (Haxby J. V. , et al . , I ndividual trajectories of cognitive decline in patients with dementia of the Alzheimer type, J. Clin. Exp. Neuropsychology 14:575-592, 1 992. ) Usando los criterios de AACD/MCI , que examina otros dominios además de la memoria, el porcentaje con un pródromo identificable es probablemente más alto. Afortunadamente, no todos los i ndivid uos con AACD/MCI parecen deteriorarse. Al parecer, una cantidad significativa de estos sujetos presenta un déficit de memoria estable, no progresivo, en las pruebas.
Los intentos de predecir la aparición de AD, MCI o NDS, o de hacer seguimiento a su avance, han encontrado un éxito limitado . Ha sido descubierto por los inventores de esta solicitud que una cantidad de QC en una muestra biológica obtenida de un sujeto que se desvía de una cantidad de referencia en una persona de control puede ser correlacionado positivamente con un estado de enfermedad neurológica. Por ende, la correlación de la presencia de QC con el estado de enfermedad representa una prueba positiva y más directa para el diagnóstico en un paciente que sufre de una de las enfermedades neurodegenerativas descritas arriba.
De acuerdo con esto, la invención proporciona una prueba de muestra biológica que se administra fácilmente para pred ecir, diagnosticar o pronosticar AD , MCI y NDS usando QC como marcador de diagnóstico.
Breve descripción de la invención La presente invención se basa en el descubrimiento de q ue la cantidad de glutaminil ciclasa (QC) en una muestra biológica obtenida de AD o MCI es elevada en comparación con la cantidad de QC en la muestra biológica obtenida de un sujeto de control normal (es decir, sano).
La indicación de que la cantidad de QC difiere entre estas enfermedades neurológicas y los controles normales, forma la base para el desarrollo de una prueba para diagnosticar AD , MCI o NDS en un sujeto. Como tales, los métodos para diagnosticar AD , MCI o NDS de la presente invención midiendo la cantidad de QC en muestras de pacientes mejorará en gran medida la evaluación de diagnóstico cl ínico actual para pacientes que sufren de estas enfermedades neurodegenerativas.
Con base en las diferencias descubiertas recientemente en la cantidad de QC presente en una muestra biológica obtenida de un paciente en comparación con la de un control normal , se puede hacer una fuerte correlación de la cantidad de QC con un diagnóstico probable de una enfermedad neurodegenerativa. Una elevación significativa estadísticamente en la cantidad de QC con relación a muestras de control es razonablemente predictiva de que el paciente tiene AD , N DS o MCI . La cantidad normal de QC determinada por la cantidad de QC característica de una muestra de control de QC de una población normal con edad similar indica que el paciente no tiene una enfermedad neurodegenerativa , tal como AD , Cl o NDS . Una indicación positiva de una enfermedad neurodegenerativa con base en u na cantidad elevada o red ucida de QC en una muestra biológica con relación a un control normal se considera generalmente junto con otros factores para hacer una determinación defi nitiva de una enfermedad en particular. Por lo tanto, los niveles de QC elevados o reducidos del sujeto que está siendo sometido a prueba usualmente serán considerados junto con otros síntomas cl ínicos aceptados de condiciones relacionadas con AD, MCI o NDS para hacer un diagnóstico determinante de una enfermedad neurodegenerativa .
Así , de acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un método para diagnosticar una probable Enfermedad de Alzheimer (AD), Neurodegeneración en el Síndrome de Down (NDS) o Deficiencia Cognitiva Leve (MCI ) en un sujeto, el método comprende: (a ) detectar la cantidad de glutami nil ciclasa (QC) o sus isoformas, en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto; y (b) comparar la cantidad detectada de QC en la muestra biológica con la cantidad de QC característica de un control normal ; mediante lo cuál la cantidad elevada de QC en dicha muestra biológica con relación al control normal es un indicador positivo de AD o MC I .
De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, la muestra biológica es una muestra de fluido corporal tal como suero, plasma, orina o líquido cefalorraqu ídeo. Más preferiblemente, la muestra de fluido corporal es plasma .
De acuerdo con una modalidad adicional de la presente invención , la cantidad de QC se detecta ya sea con base en el nivel de proteína de QC o en el nivel de ARNm de QC.
La cantidad de QC detectada o cuantificada en una muestra biológica de un sujeto puede ser obtenida por cualquier medio conocido en la técnica. Estos medios pueden incluir, pero no están limitados a ellos, por ejemplo análisis inmunoturbidimétrico, ¡nmunofluorescencia, inmunodifusión, análisis inmunosorbente ligado a enzima (ELISA), radioinmunoanálisis (RIA), Inmunodetección Western , análisis de actividad de proteína, o para la determinación del nivel de ARNm de QC, Inmunodetección Northern o análisis de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), por ejemplo PCR en tiempo real . También son útiles la cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC), la espectrometría de masas (MS ) y la cromatografía de gases (GC), así como también sus diversas configuraciones, incluyendo cromatografía de gases - espectrometría de masas (GS-MS), cromatografía de l íquidos - espectrometría de masas (LC - MS) y sistemas de cromatografía de líquidos ñ espectrometría de masas en tándem (LC - MS/MS).
Preferiblemente, la cantidad de QC en la muestra biológica se detecta usando un anticuerpo que se fija a QC en un formato de inmunoanálisis. Por ello, de acuerdo con una modalidad preferida de la invención , se proporciona un método para diagnosticar una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto, el método comprende: (a) obtener una muestra biológica de dicho sujeto; (b) poner en contacto dicha muestra biológica con un anticuerpo que se fija a la glutaminil ciclasa (QC) o sus isoformas; (c) permitir que el anticuerpo y la QC formen un complejo ¡nmunitario; y (d) detectar la cantidad de complejo ¡nmunitario formado como una indicación de la cantidad de QC en la muestra biológica; y (e) comparar la cantidad detectada con un control normal ; mediante el cual la cantidad detectada que sea elevada o reducida con relación al control normal es un indicador positivo de una enfermedad neurodegenerativa.
De acuerdo con todavía un aspecto adicional de la invención, se proporciona un estuche de diagnóstico para determinar si un sujeto está sufriendo de una enfermedad neurodegenerativa, que contiene un anticuerpo que se fija a QC y un patrón establecido de la cantidad característica de QC de un control normal. También se pueden incluir reactivos e instrucciones para llevar a cabo los análisis.
Breve descripción de las figuras Figura 1 : La Figura 1 (a) muestra el análisis de los niveles de transcripto de QC aplicando RT-PCR cuantitativa. Se aisló ARN total de muestras de cerebro neocortical humano (Área Brodmann 22) de cerebros con envejecimiento normal y con AD de diferentes etapas de Braak como se indica. El nivel de transcripto de QC se normalizó hasta una concentración de transcripto doméstico. La Figura 1 (b) muestra el análisis de Inmunodetección Western para la QC de los mismos casos y región cerebral utilizados para el análisis de ARNm de QC . La extracción de proteína soluble se normalizó para el peso del tejido. La Figura 1 (c) muestra la cuantificación de las concentraciones de ?ß N3(pE)-42 (que se indica como ?ß3 ( ? ? 2 ) y de ?ß 1 -42 (?ß1 -42) de los mismos casos y región cerebral apl icando análisis ELISA de extractos de SDS y ácido fórmico de muestras cerebrales neocorticales humanas . Nótese el aumento robusto en las concentraciones del péptido ?ß N3(pE)-42 en las etapas iniciales de la AD en comparación con el aumento mucho más moderado en los péptidos ?ß 1 -42. La Figura 1 (d ) muestra la detección inmunohistoqu ímica de péptidos totales ?ß por el anticuerpo 4G8 y de péptidos ?ß N3(pE )-42 en el área 22 de Brodmann de sujetos con envejecimiento normal y de sujetos con diferentes etapas de AD . Se detectaron escasas placas de ?ß en los sujetos con envejecimiento normal , pero estos depósitos carecían de inm unorreactividad a ?ß N3(pE)-42. En todas las etapas de la AD , sin embargo, la mayoría de las placas de ?ß contienen péptidos ?ß N3(pE)-42.
La Figura 2 muestra os resultados de la determinación de la tasa de expresión genética de QC y CCL2 en células estimuladas con THP- 1 .
La Figura 3 muestra los resultados de la determinación de la actividad específica de QC en medio de células THP-1 acondicionado.
Secuencias de péptidos amiloideos v quimiocinas: Descripción detallada de la invención La presente invención proporciona un método eficiente y rápido in vitro para diagnosticar una enfermedad neurodegenerativa detectando directamente una cantidad de QC en una muestra biológica obtenida de un sujeto y comparando la cantidad detectada de QC con la cantidad de QC característica de un control normal . Una cantidad elevada de QC en la muestra biológica del sujeto es una indicación positiva de AD o de MC I o de NDS . Así , tal como se describe aquí , está demostrado que la QC está elevada sistemática y significativamente en una muestra biológica de pacientes con AD , NDS o MCI en comparación con los controles normales . Como tales, los métodos para diagnosticar AD , MCI o NDS de la presente invención , detectando o cuantificando la cantidad de QC en una muestra de un paciente mejorarán en gran medida la evaluación del diagnóstico clínico actual para pacientes que sufren de estas enfermedades neurodegenerativas.
Por lo tanto, se proporciona un método para evaluar si un sujeto puede sufrir de AD, MCI o NDS usando QC como marcador biológico.
La glutaminil ciclasa o glutaminil ciclotransferasa péptida (QC , EC 2.3.2.5) cataliza la ciclización i ntramolecular de los residuos de glutaminilo en el terminal N en ácido piroglutámico (5-oxo-prolina , pGlu*) bajo liberación de amoniaco y la ciclización intramolecular de residuos gl utamilo en el terminal N en ácido piroglutámico bajo liberación de agua.
Una QC fue aislada primero por Messer a partir del Látex de la planta tropical Carica papaya en 1 963 (Messer, M . 1 963 Nature 4874, 1 299). 24 años después, se descubrió una actividad enzimática correspondiente en la pituitaria de los animales (Busby, W. H. J . et al. 1987 J Biol Chem 262, 8532-8536; Fischer, W. H. y Spiess, J . 1 987 Proc Nati Acad Sci U S A 84, 3628-3632). Para las QC de mamífero , se podría mostrar la conversión de G ln en pGlu mediante QC para los precursores de TRH y GnRH (Busby, W. H . J . et al. 1987 J Blol Chem 262, 8532-8536; Fischer, W. H . y Spiess, J. 1987 Proc Nati Acad Sci U S A 84, 3628-3632). Además, los experimentos iniciales de localización de QC revelaron una localización conjunta cuando sus supuestos productos de catálisis en el tracto hipotálamo - hipofisal bovino está aumentando adicionalmente la función sugerida en la maduración de la hormona péptida (Bockers, T. M . et al . 1 995 J Neuroendocrinal 7, 445-453). En contraste, la función fisiológica de la QC vegetal es menos clara. En el caso de la enzima de C. papaya, se sugirió un papel en la defensa de la planta contra microorganismos patógenos( EI Moussaoui, A. et al. 2001 Cell Mol Life Sci 58, 556-570). Las supuestas QC de otras plantas se identificaron recientemente mediante comparaciones de secuencia (Dahl , S. W. et al. 2000 Protein Expr Purif 20, 27-36). La función fisiológica de estas enzimas, sin embargo, es ambigua todavía .
Las QC conocidas de plantas y animales muestran una especificidad estricta para L-Glutamina en la posición del terminal N de los sustratos y se encontró que su comportamiento cinético obedece a la ecuación de Michaelis-Menten (Pohl , T. et al. 1991 Proc Nati Acad Sci USA 88, 1 0059-1 0063; Consalvo, A. P. et al. 1 988 Anal Biochem 175, 131 -1 38; Gololobov, M . Y. et al. 1996 Biol Chem Hoppe Seyler 377, 395-398). Una comparación de las estructuras primarias de las QC de C. papaya y las de las QC altamente conservadas de mamíferos, sin embargo, no reveló homología de secuencia alguna ( Dahl , S . W. et al. (2000) Protein Expr Purif 20, 27-36). Si bien las WC de vegetales parecen pertenecer a una nueva familia de enzimas (Dahl , S . W. et al. (2000) Protein Expr Purif 20, 27- 36), se encontró que las QC de mam ífero tienen una homología de secuencia pronunciada con las aminopeptidasas bacterianas (Bateman , R. C . er al. 2001 Biochemistry 40, 1 246-1 1 250), lo que lleva a la conclusión de que las QC de vegetales y animales tienen diferentes orígenes evolucionarlos.
Gostranova et al. han encontrado que la actividad de la glutaminil ciclasa es una característica del l íquido cefalorraquídeo en los pacientes con esclerosis múltiple y controles (Gostranova et al . , Clin Chim Acta . 2008 389 ( 1 -2), pp. 1 52-1 59).
Se han observado diferentes isoformas de QC, las proteínas similares a ciclotransferasa del péptido glutaminilo (QPCTL) (WO 2008/034891 ). Estas nuevas proteínas tienen similitud de secuencia significativa con la glutaminil ciclasa, por ejemplo, las QPCTL de los seres humanos (a las que se hará referencia en lo sucesivo como isoQC) (N° de acceso a GenBank NM_01 7659).
Se pueden producir varias isoformas de una proteína , tal como QC o isoQC humana , a partir de un solo gen mediante una variedad de mecanismos, incluyendo división de ARN alternativa, procesamiento proteol ítico post traduccional y glicosilación específica para el tipo de célula. Por ello, los términos "glutaminil ciclasa", "QC" e "isoQC" como se usan aqu í, se refieren a QC en su forma natural , así como también a cualquiera de sus isoformas .
Son preferidas para el uso de la presente invención la QC o sus i soformas, que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ I D NO: 1 , 2 , 3, 4 y 5.
Es más preferida para el uso de la presente invención la QPTCL humana que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO. 2, o incl uso se prefiere de SEQ ID NO: 3.
Se prefiere aún para uso en los métodos de la presente invención a las formas divididas de QPCTL humana que tienen una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 4 o de SEQ ID NO: 5.
La más preferida para uso en los métodos de la presente invención es la QC humana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 .
Así, de acuerdo con un primer aspecto de la presente invención , se proporciona un método para el diagnóstico de probable Enfermedad de Alzheimer (AD), Neurodegeneración en S índrome de Down ( N DS) Deficiencia Cognitiva Leve (MCI) en un sujeto. El método comprende: (a) detectar la cantidad de glutaminil ciclasa (QC ), o una isoforma de ella, en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto; y (b) comparar la cantidad detectada de QC en la muestra biológica con la cantidad de QC característica de un control normal ; mediante el cual una cantidad elevada de QC en dicha muestra biológica con relación al control normal es un indicador positivo de AD , NDS o MC I .
Los i nventores de la presente invención han demostrado que una cantidad elevada de QC en una muestra biológica puede estar correlacionada con una cantidad elevada de péptidos beta amiloideos truncados en el terminal N y piroglutamados , tales como por ejemplo ?ß N3pE-42 y/o ?ß N3pE-40 y/o ?ß N3pE-38.
Así, de acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención , se proporciona un método para diagnosticar probable Enfermedad de Alzheimer (AD), Neurodegeneración en Síndrome de Down (NDS ) Deficiencia Cognitiva Leve (MCI ) en un sujeto. El método comprende: (a) detectar la cantidad de glutaminil ciclasa (QC ), o una isoforma de ella , en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto; y (b) detectar además la cantidad de ?ß N3pE-X, (c) comparar la cantidad detectada de QC y ?ß N3pE-X en la muestra biológica con la cantidad de QC y de ?ß N3pE-X característica de un control normal ; mediante el cual la cantidad elevada de QC y de ?ß N3pE-X en dicha muestra biológica con relación al control normal es un indicador positivo de AD, N DS o MCI , y en donde X es un entero seleccionado de 38, 40 y 42.
En una modalidad preferida, X es 42.
En otra modalidad preferida, X es 40.
En todavía otra modalidad preferida, X es 38.
Son más preferidos los métodos en los que no sólo una única forma de los péptidos beta amiloideos truncados en el terminal N y piroglutamados, sino una combinación de ?ß N3pE-42 y/o ?ß N3pE-40 y/o ?ß N3pE-38 se detecta junto con la QC .
Se prefieren más los métodos en donde no sólo una única forma de los péptidos beta amiloideos truncados en el terminal N y piroglutamados, sino una combinación de ?ß N3pE-42 y/o ?ß N3pE-40 y/o ?ß N3pE-38 y/o péptidos que están presentes en las demencias familiares por Alzheimer, tales como pGluABri o pGluADan , se detecta junto con la QC. "pGlu-?ß" o "?ß N3pE" se refiere a formas de ?ß truncadas en el terminal N , que comienzan en el residuo de ácido glutámico en la posición 3 en la secuencia de aminoácidos de ?ß, y en donde dicho residuo de ácido gl utámico se cicliza para formar un residuo de ácido piroglutámico. En particular, por pGlu-?ß, como se usa aqu í, se quiere decir aquellos fragmentos que están involucrados en o que están asociados con las patolog ías amiloideas , incluyendo, pero sin limitarse a ellos, pGlu-?ß 3-38, pGlu-?ß 3-40, p-Glu-?ß 3-42.
Los inventores de la presente invención han demostrado además que una cantidad elevada de QC en una muestra biológica puede estar correlacionada con una cantidad elevada de una quimiocina, tal como por ejemplo CCL2, CCL7, CCL8, CCL9/1 0, CCL13 , CCL1 5, CCL1 6, CCL25 y Fractalcina .
Así , de acuerdo con otro aspecto de la presente invención , se proporciona un método para diagnosticar Enfermedad de Alzheimer (AD), Neurodegeneración en S índrome de Down (NDS) Deficiencia Cognitiva Leve (M C I ) en un sujeto. El método comprende: (a) detectar la cantidad de glutaminil ciclasa (QC) o una isoforma de ella, en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto; y (b) detectar además la cantidad de una quimiocina, (c) comparar la cantidad detectada de QC y de quimiocina en la muestra biológica con la cantidad de QC y de quimiocina características de un control normal ; mediante el cual la cantidad elevada de QC y de quimioci na en dicha m uestra biológica con relación al control normal es un indicador positivo de AD , NDS o MCI .
En una modalidad preferida , dicha quimiocina es de origen mam ífero. Más prefereriblemente, dicha quimiocina es una quim iocina humana. Mucho más preferiblemente, dicha quimiocina es CCL2 humana .
En otra modalidad preferida, cualquiera de los métodos mencionados anteriormente para d iagnosticar Enfermedad de Alzheimer (AD), Neurodegeneración en Síndrome de Down ( NDS) Deficiencia Cognitiva Leve (MCI), también se puede realizar in vitro en una muestra biológica de un sujeto.
El término "sujeto" se refiere a un mam ífero que está afligido con , o que se sospecha que está afligido con una enfermedad neurodegenerativa tal como AD , MCI o NDS. Preferiblemente, "sujeto" se refiere a un ser humano.
El término "muestra biológica" se refiere a cualquier fuente de material biológico, incluyendo, pero sin limitarse a ellas , sangre periférica , plasma, linfocitos, l íquido cefalorraquídeo, orina , saliva, epitelios, fibroblastos o cualquier otra muestra que contenga proteína QC .
En una modalidad preferida, la cantidad de QC se detecta en una muestra de fluido corporal obtenida de un mamífero, con mayor preferencia un ser humano. El término "fluido corporal" se refiere a todos los fluidos que están presentes en el cuerpo humano, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, sangre , linfa, orina y l íq uido cefalorraqu ídeo (CSF) que contienen QC. La muestra de sangre puede incluir una muestra de plasma o una muestra de suero, o fracciones obtenidas de estas muestras. La muestra se puede tratar antes de su uso , por ejemplo preparando plasma de sangre, diluyendo fl uidos viscosos, y similares. Preferiblemente, la muestra de plasma se trata con un anticoagulante, tal como EDTA.
De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención , la cantidad de QC se detecta en una muestra de sangre tomada del sujeto, más preferiblemente una muestra de plasma . Así, la presente invención preferiblemente se refiere a un método como el descrito anteriormente, que comprende los pasos de: obtener una muestra de plasma de dicho sujeto; detectar la cantidad de QC en la muestra de plasma ; comparar la cantidad detectada de QC en la muestra de plasma con la cantidad de QC en una muestra de plasma de un control normal , mediante el cual una cantidad elevada de QC con relación al control normal es una indicación positiva de AD , NDS o MCI . Se ha demostrado que las cantidades elevadas de QC se correlacionan con el diagnóstico de AD, NDS y MCI , y son útiles para ayudar a diagnosticarlas.
Una "cantidad elevada" de QC (o una isoforma de ella) significa que la cantidad de QC detectada en las muestras de los sujetos es mayor que la cantidad media de QC característica de una persona control normal más allá del rango de error experi mental , tal como se conoce en la técnica . Preferiblemente, la cantidad de QC detectada en las muestras de los sujetos es 10% mayor que dicha cantidad media de QC característica de una persona control normal . Más preferiblemente, la cantidad de QC (o una isoforma de ella) detectada en las muestras de los sujetos es 25% mayor, o aún más preferiblemente, 50% o 75% mayor que dicha cantidad media de QC característica de una persona control normal . Mucho más preferiblemente, la cantidad de QC (o de una isoforma de ella ) detectada en las muestras de los sujetos es varias veces mayor que dicha cantidad media de QC característica de una persona de control normal , por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9, 10 o más veces mayor.
Un "control normal" es una muestra biológica del mismo tipo obtenida del sujeto, por ejemplo que se obtiene de al menos una persona de control normal con edad coincidente o del paciente en otro momento. En una modalidad , el control normal se toma del paciente en un momento anterior. Una muestra de control normal de una población normal de edad coincidente se debe aislar de una muestra de población adecuada de controles sanos con edad coincidente sin historia de AD , MCI o N DS en su familia . A manera de ejemplo, un nivel de QC más alto en plasma que los niveles de QC del control , determinado por un tamaño de muestra de la población de control adecuado , es indicativo de AD , NDS o MC I . Un experto en la técnica se dará cuenta de que una muestra del sujeto que se va a diagnosticar se evalúa contra un control normal de edad coincidente, y que una elevación o una reducción significativa en la cantidad de QC en la muestra de proteína del sujeto se determina con base en la comparación con los controles utilizados en el análisis dado De acuerdo con una modalidad adicional de la presente invención , la cantidad de QC , o una isoforma de ella, se detecta ya sea con base en el nivel de proteína o en el nivel de ARNm de dicha QC o isoforma de ella .
La cantidad de QC detectada o cuantificada en una muestra biológica del sujeto se puede lograr por cualquier medio conocido en la técnica. Estos medios pueden incluir, pero sin limitarse a ellos, por ejemplo, análisis inmunoturbidimétrico, inmunofluorescencia, inmunodifusion , análisis inmunosorbente ligado a enzima (ELI SA), radioinm unoanálisis (RIA), Inmunodetección Western , análisis de actividad de proteína , o, para la determinación del nivel de ARN m de QC, análisis con Inmunodetección Northern o reacción en cadena de la polimerasa (PCR), por ejemplo PCR en tiempo real. También son útiles la cromatografía de l íquidos de alto rendimiento (HPLC), la espectrometría de masas (MS), y la cromatografía de gases (GC), así como también sus diversas configuraciones, incluyendo cromatografía de gases - espectrometría de masas (GC-MS), cromatografía de l íquidos - espectrometría de masas ( LC-MS) y sistemas de cromatografía de l íquidos - espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS ), por nombrar unas cuantas.
Aunque la detección de QC se puede lograr por métodos conocidos en la técnica para detectar péptidos, se prefiere et uso de técnicas de detección inmunológica usando anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, anticuerpos recombinantes, y similares. En consecuencia, esta detección de QC incluye, pero no se limita a ello, el uso de anticuerpos, que se fijan específicamente a QC, o sus isoformas, para formar un complejo inmunitario, as í como también reactivos para detectar la formación del complejo inmunitario. Las técnicas de detección particularmente adecuadas que emplean uno o más anticuerpos incluyen análisis inmunoturbidimétrico, inmunofluorescencia, inmunodifusión , ELISA, RIA y similares.
Estos anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. Los métodos para producir anticuerpos policlonales o monoclonales son bien conocidos en la técnica . Para una revisión , ver Harlow y Lañe ( Harlow, E . y Lañe, D . , Antibodies: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1 988) y Yelton et al. (Yelton D. E. y Scharff M . D . Monoclonal Antibodies: a powerful new tool in biology and medicine. Ann. Rev. Biochem. 50:657-680, 1 981 ), ambos incorporados aquí mediante referencia . Para los anticuerpos monoclonales, ver Kohler y Milstein (Kohler G . y Milstein C , Conti nuous cultures of fused cells secreti ng antibody of predefi ned specificity, Nature 256:495-497, 1 975), incorporados aqu í mediante referencia. Los anticuerpos de la invención son de cualquier isotipo , por ejemplo, IgG o IgA, y los anticuerpos policlonales son de un solo isotipo o de una mezcla de isotipos.
De acuerdo con u na modalidad preferida de la invención , el anticuerpo anti-QC es un anticuerpo monoclonal. Si bien los anticuerpos anti-QC están ampliamente disponibles de forma comercial , los anticuerpos para uso en los diversos inmunoanálisis descritos aquí se pueden producir de acuerdo con métodos estándar.
Adicionalmente, el anticuerpo monoclonal anti-QC es capaz de reconocer a la QC en su forma natural , así como también cualquiera de sus isoformas. Por ello, cualquier anticuerpo monoclonal que reconozca específicamente a la QC , incluyendo sus isoformas, se puede usar en dicho método para la cuantificación de QC.
Son preferidos los anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente a la QC, pero que muestran baja, o más preferiblemente ninguna reactividad cruzada con las isoformas de QC. Alternativamente se prefieren los anticuerpos monoclonales que reconocen significativamente una isoforma particular de QC, pero que presentan menor reactividad cruzada con QC , o más preferiblemente, ninguna .
Los anticuerpos anti-QC adecuados, por ejemplo, son los que están disponibles de forma comercial en Abnova (Ciudad de Tai pei , Taiwán), por ejemplo, un anticuerpo policlonal de ratón (N° de Cgt.
H00025797-B01 P) y un anticuerpo policlonal de conejo (N° de Cat. H00025797-D01 P).
Un anticuerpo anti-QPCTL adecuado, por ejemplo, es el anticuerpo policlonal de ratón disponi ble de forma comercian en Abnova (Ciudad de Taipei, Taiwán , N° de Cat. H00054814-B01 P).
También se pueden usar fragmentos derivados de estos anticuerpos monoclonales, tales como Fab, F(ab)2/ ssFv (fragmento variable de cadena simple) y otras construcciones similares a anticuerpo que retienen la región variable del anticuerpo, siempre que conserven las propiedades de unión originales, en un método de la presente invención. Estos fragmentos son generados común mente, por ejemplo, por digestión enzimática de los anticuerpos con papaína , pepsina u otras proteasas. Es bien conocido por el experto en la técnica que los anticuerpos monoclonales, o fragmentos de ellos, se pueden modificar para diversos usos. Así , los anticuerpos de la invención , pueden ser recombinantes, por ejemplo, quiméricos (por ejemplo, constituidos por una región variable de origen murino asociada con una región constante), humanizados (una estructura principal constante de inmunoglobulina humana junto con la región hipervariable de origen animal , por ejemplo, murino), y/o de cadena simple.
Un anticuerpo específico para QC, o sus isoformas, que se utiliza en un método de la presente invención , puede ser marcado mediante una etiqueta apropiada e identificada en la muestra biológica con base en la presencia de la etiqueta. La etiqueta permite la detección del anticuerpo cuando éste está unido a QC. Los ejemplos de etiquetas incluyen, pero no se limitan a ellos, radioisótopos (por ejemplo, 3H, 14C, 35S, 1251, 1311), etiquetas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos lantánidos), etiquetas luminiscentes, etiquetas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, beta-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), quimioluminiscentes, y grupos biotinilo.
Los métodos para conjugar o etiquetar los anticuerpos discutidos anteriormente, pueden ser llevados a cabo fácilmente por una persona con conocimientos ordinarios en la técnica (ver por ejemplo, Inman, "Methods In Enzymology" , Vol. 34, Affinity Techniques, Enzyme Purification: Parte B, Jakoby y Wichek (eds.), Academic Press, New York, p. 30, 1974; y Wilchek y Bayer, "The Avidin-Biotin Complex in Bioanalytical Applications," Anal. Biochem. 171 :1-32, 1988).
Para aplicaciones en diagnóstico, el anticuerpo anti-QC está en un estado libre o inmovilizado en un soporte sólido, tai como un tubo, una perla u otro soporte convencional utilizado en el campo. La inmovilización se logra usando medios directos o indirectos. Los "medios directos" incluyen adsorción pasiva (unión no covalente) o unión covalente entre el soporte y el reactivo. Por "medios indirectos" se quiere decir que un compuesto anti-reactivo que interactúa con un reactivo se une primero al soporte sólido. Los medios indirectos también pueden emplear un sistema ligando - receptor, por ejemplo, en donde una molécula tal como una vitamina está injertada en el reactivo y el correspondiente receptor está inmovilizado en la fase sólida . Esto se ilustra mediante el sistema biotina - estreptavid i na.
Los expertos en la técnica entenderán fácilmente que se forma un complejo inmunitarío entre QC en la muestra biológica y el anticuerpo, y que cualquier material no unido es eliminado antes de detectar el complejo. Se entiende que un anticuerpo de la invención se usa para cuantificar la cantidad de QC en una muestra biológica, tal como por ejemplo, sangre, plasma, linfocitos, l íquido cefalorraquídeo, orina, saliva, epitelios y fibroblastos.
Tal como se conoce en la técnica, la determinación de esta unión al anticuerpo se puede realizar usando una gran variedad de formatos de inmunoanálisis, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, análisis inmunoturbidimétrico (aglutinación), análisis inmunosorbente ligado a enzima (ELISA), y radioinmunoanálisis (RIA) (ver, por ejemplo, "Principies and Practice of Immunoassay" ( 1 991 ) Christopher P. Price y David J . Neoman (eds) , Stockton Press, New York, N . Y. y Ausubel et al . (eds) (1987) in "Current Protocole in Molecular Biology" John Wiley and Sons, New York, N . Y. , ambos incorporados aquí mediante referencia). La detección puede ser mediante métodos colorimétricos o radiactivos o por cualq uier otro método convencional conocido para un experto en la materia . Otras técnicas estándar conocidas en la técnica se describen en "Methods in I mmunodiagnosis" , 2a . Edición, Rose y Bigazzi , eds. , John Wiley and Sons, New York 1980 y en Campbell et al.; "Methods of Immunology", W. A. Benjamín, Inc., 1964; en las Patentes Estadounidenses N° 4,366,241; 4,376,110; 4,517,288; y 4,837,168, cuyas descripciones están incorporadas a la presente mediante referencia. Para una revisión de los inmunoanálisis generales, ver también "Methods In Cell Biology", Vol. 37, Asai, ed. Academic Press, Inc. New York (1993) ; "Basic And Clinical Immunology" 7a Edición, Stites & Terr, eds. (1991) .
Estos análisis para detectar QC puede ser un inmunoanálisis directo, indirecto, competitivo o no competitivo, que se describe en la técnica (ver, por ejemplo, "Principies and Practice of Immunoassay" (1991) Christopher P. Price y David J. Neoman (eds), Stockton Press, New York, N.Y.; Ausubel et al . (eds) (1987) en "Current Protocols in Molecular Biology" John Wiley and Sons, New York, N. Y.; y Oellirich, M. 1984. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22: 895-904, incorporados a la presente mediante referencia) .
Los inmunoanálisis no competitivos son análisis en los cuales se detecta la cantidad de QC. En el análisis "Sándwich", por ejemplo, los anticuerpos anti-QC se pueden unir directamente a un sustrato sólido en donde son inmovilizados. Estos anticuerpos inmovilizados luego capturan la QC presente en la muestra biológica. La QC así inmovilizada es unida luego mediante un agente de etiquetado, tal como un segundo anticuerpo humano de QC que porta una etiqueta.
En un inmunoanálisis competitivo, la cantidad de antígeno presente en la muestra biológica se determina ind irectamente después de la adición de una cantidad conocida de antígeno marcado a la muestra y detectando la cantidad de antígeno marcado unido con anticuerpos. Por ejemplo , una cantidad conocida , en este caso, de QC marcada se le añade a la muestra biológica , y luego la muestra se pone en contacto con anticuerpos anti QC . La cantidad de QC marcada unida al anticuerpo anti-QC es inversamente proporcional a la concentración de QC en la muestra biológica. Esto se debe a que mientras mayor es la cantidad de QC marcada detectada , es menor la cantidad de QC que estaba disponible en la muestra biológica para com petir con la QC marcada .
También se proporcionan estuches de diagnóstico para llevar a cabo los análisis para diagnosticar AD , MCI o NDS en u n sujeto. Así, la presente invención se puede practicar usando un estuche de diagnóstico que incluye al menos un anticuerpo específico para QC , y sus i soformas , tal como se describe aqu í, así como también cualquier reactivo necesario para la detección de complejos inmunitarios de fijación anticuerpo - QC. Generalmente, el estuche puede incluir un solo anticuerpo que reconoce específicamente a QC , y sus isoformas. Por otra parte, el estuche puede incluir un anticuerpo primario que reconoce específicamente a QC, y sus isoformas, así como también un anticuerpo secundario que está conjugado con una etiqueta que produce una señal y que es capaz de fijarse al anticuerpo primario, o en un sitio diferente del sitio en donde se une el anticuerpo primario . La etiqueta productora de señal ligada al anticuerpo secundario puede ser una enzima , tal como peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina, pero no está limitada a ellas. Los estuches pueden contener además otros reactivos para llevar a cabo el análisis, tales como amortiguadores, un soporte sólido, soluciones y similares. El estuche también puede contener instrucciones para llevar a cabo el método de la invención usando uno o más anticuerpos en los análisis de diagnóstico.
Ejemplos de la invención Ejemplo 1 : Formación de expresión de AB N3pE-42 y QC in vivo Se ha observado una amplia distribución de QC en el cerebro de los mamíferos con expresión considerable en el hipocampo y en la corteza. Con el fin de evaluar si la expresión de QC en la AD puede estar correlacionada con la generación de ?ß N3pE-42, se analizaron las concentraciones de ARNm de QC y de proteína en muestras de cerebro neocortical de seres humanos post mórtem (Figura 1 a, b). Curiosamente, los inventores encontraron una regulación hacia arriba de ARNm de QC y proteína en las muestras de cerebro con AD, en comparación con las de envejecimiento normal. Además, se detectaron concentraciones significativas de ?ß N3pE-42 en muestras de pacientes con AD en contraste con individuos sin demencia que apoyaron el papel de la QC en la generación de ?ß N3pE-42 (Figura 1 c). Por otra parte, los análisis ELISA revelaron altas concentraciones de ?ß x-42 en sujetos de control con envejecimiento normal y un aumento mucho menor en etapas de AD iniciales (Figura 1 c). Esta observación fue corroborada mediante inmunohistoquímica aplicando anticuerpos que detectan ?ß total (4G8) o específicamente ?ß N3pE-42 (Figura 1 d). Se detectó inmunorreactividad conspicua para ?ß en secciones del cerebro de todos los grupos. En contraste, la tinción de ?ß N3pE-42 estuvo ausente en los de envejecimiento normal, pero fue específica para el tejido cerebral con AD, en donde la carga de placa inmunorreactiva a ?ß N3pE-42 fue casi tan alta como la densidad de placa total de ?ß.
Materiales y Métodos Tejido cerebral humano El diagnóstico definitivo de AD para todos los casos usados en este estudio se basó en la presenciad e marañas neurofibrilares y placas neuríticas en la formación del hipocampo y en las áreas neocorticales, y cumplió con los criterios del National Institute of Neurologic and Communicative Disorders and Stroke (N INDS) y de la Alzheimer's Disease and Related Disorders Association (ADRDA). El tejido cortical (área de Brodmann 22) de los mismos casos se uso para la cuantificación de concentraciones de ?ß N3pE-42. En total , se analizaron 10 casos de control y 10 casos con AD, cada uno de etapas de Braak l-l l y V-VI. Los grupos se hicieron coincidir en género y edad (control: media 72 años ± 6.6 años; AD l-ll: media 73 años ± 3.1 años; AD V-VI: media 77 años ± 6.6 años). El intervalo post mórtem medio (P I) fue similar entre los grupos y varió desde 26 hasta 96 horas. La duración de PMI no estuvo relacionada con la detección de QC por análisis de inmunodetección Western ni con la cuantificación de ?ß mediante ELISA. Para la detección del ARNm de QC mediante qRT- PCR, solamente se incluyeron muestras de tejido con un PM I menor a 48 horas.
Cuantificación de ARNm de QC v análisis de inmunodetección Western Se homogenizaron muestras de tejido por medio del homogenizador Preceilys con perlas de cerámica de 1 .4 mm ( 5000 rpm , 30 seg . , peqlab). Se aisló el ADN usando el estuche NucleoSpin RNA I I (Macherey Nagel ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se transcribieron inversamente 1 00 ng de ARN en ADNc usando cebadores aleatorios (Roche) y Superscript I I ( I nvitrogen). Se realizó PCR cuantitativa en tiempo real en un Rotorgene3000 (Corbett Research) usando el Análisis con Cebador QuantiTect para QPCT (QTOOO 1 3881 , Qiagen) así como también el estuche para RT-PCR QuantiTect SYBR Green (Qiagen). Se determinaron las cantidades absolutas de QC usando seis diluciones del ADN patrón de QC externo (QC de longitud completa clonada en el vector pcDNA3) por duplicado. Para la verificación de la PCR, se generaron curvas de fusión del producto y se confirmaron los amplicones simples mediante electroforesis en gel de agarosa . Se determinaron la cantidades absolutas con el software Rotorgene versión 4.6 en modo de cuantificación . Se realizó la normalización contra los dos genes domésticos expresados más establemente, HPRT y GAPDH (geNorm). Para el análisis de inmunodetección Western , las muestras de cerebro (50 mg) se homogeneizaron en amortiguador ( 1 mi) que contenía Tris 1 0 mM con pH 7.5 , NaCI 1 00 mM , EDTA 5 mM y Tritón X-100 al 0.5% y glicerol al 10% . El tejido se homogenizó mediante varios recorridos en la homogenizadora Downsy se sometió a 3x de 10 seg. de choque ultrasónico. El homogenado resultante se aclaró mediante centrifugación a 20000xg durante 25 min. Se separó un total de 12 g de proteína de cada muestra en SDS-PAGE en Tris-Glicina. Se detectó la QC usando anticuerpos policlonales de conejo enfrentados contra QC recombinante humana. Para la visualización , se incubaron las membranas teñidas con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (Cell Signaling) en TBS-T que contenía leche seca al 5 % (p/v) y se desarrollaron posteriormente con el sistema SuperSignal West Pico System (Pierce) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Ejemplo 2: Determinación de índice de expresión genética de QC y CCL2 en células THP-1 estimuladas Se cultivaron células THP-1 de la línea de células de leucemia monocítica en suspensión (5x105 células por mi de medio) en RPMI-1640 (Rosewell Park Memorial Institute Médium 1640 (Invitrogen)) que contenía FCS al 10% (=FBS, Suero Fetal Bovino (Invitrogen)) y 60 pg/ml de gentamicina (Invitrogen) a 37 °C en C02 al 5% y atmósfera de aire humidificado al 95%. Para investigar los efectos de la estimulación de QC y se sembraron 2x106 células CCL2 en placas de 24 pocilios (Greiner) en medio de cultivo de 1 mi sin FCS que contiene diferentes concentraciones de lipopolisacáridos (LPS ; Sigma). Después de 24 horas de incubación , el medio se eliminó de las células por centrifugación (5 min 300 x g).
Se llevó a cabo el aislamiento de ARN con el estuche Nucleo-Spin® RNA I I (Macherey y Nagel) seguido por la determinación de la concentración de ARN . Usando el estuche Superscript™ I I Reverse Transcriptase de Invitrogen se transcribió 1 pg de ARN en ADNc.
El índice de expresión genética de QC y CCL2 se determinó por medio de PCR cuantitativa con el ciclador de tiempo real Rotor-Gene™ 3000. Usando el método comparativo del software de operación se pudo mostrar el cambio del índice de expresión genética de las sondas estimuladas en comparación con el control no estimulado. La normalización se realizó contra el gen de referencia YWHAZ (proteína de activación tirosina 3-monooxigenasa/triptófano 5-monooxigenasa). Los resultados se presentan en la Figura 2.
Ejemplo 3: Determinación de la actividad específica de QC en medio acondicionado de células THP-1 Se sembraron 5x106 células THP-1 en 5 mi de RPMI-1640 (Invitrogen) sin rojo fenol y sin FCS en matraces para suspensión de 25 cm2 (Greiner) y se estimularon con diferentes concentraciones de LPS (Sigma). Después de 24 h de incubación a 37 °C y C02 al 5 %, las células se separaron del medio, el cual se redujo por centrifugación (4000 x g) usando 6-10 concentradores U-Tube™ (Merck, Novagen) con un MWCO (Corte de Peso Molecular) de 10 kDa hasta un volumen final de 250 µ?. Siguió el análisis de la concentración de proteina mediante el método Bradford. La determinación de la actividad de QC específica se realizó usando un método de H PLC establecido en la empresa. Los resultados se muestran en la Figura 3.
Ejemplo 4: Determinación de la actividad de QC Análisis f luorométricos Todas las mediciones se realizaron con un lector de Bioanálisis HTS-7000Plus para microplacas (Perkin Elmer) a 30 °C. Se evaluó la actividad de QC fluorométricamente usando H-GIn-bNA. Las muestras consistieron en sustrato fluorógeno 0.2 mM , 0.25 U de piroglutamil aminopeptidasa ( Unizyme, Horsholm , Dinamarca) en Tris/HCI 0.2 M , pH 8.0 que contenía EDTA 20 m M y una al ícuota de QC diluida apropiadamente en un volumen final de 250 µ? . Las longitudes de onda de excitación / emisión fueron de 320/41 0 nm . Las reacciones del análisis se iniciaron mediante la adición de glutaminil ciclasa . Se determinó la actividad de QC a partir de una curva estándar de b-naftilamina bajo las condiciones de análisis. Una unidad se define como la cantidad de QC que cataliza la formación de 1 pmol de pGlu-bNA a partir de H-GIn-bNA por minuto bajo las condiciones descritas.
En un segundo análisis fluorométrico, se determinó la actividad de QC usando H-G In-AMC como sustrato. Las reacciones se l levaron a cabo a 30 °C utilizando el lector de microplacas NOVOStar (BMG labtechnologies). Las muestras consistieron en concentraciones variables del sustrato fluorógeno, 0.1 U de piroglutamil aminopeptidasa (Qiagen) en Tris/HCI 0.05 M, pH 8.0 que conten ía EDTA 5 mM y una al ícuota de QC diluida apropiadamente en un volumen final de 250 µ?. Las longitudes de onda de excitación / emisión fueron de 380/460 nm . Las reacciones del análi sis fueron iniciadas mediante la adición de glutaminil ciclasa . Se determi nó la actividad de QC a parti r de una curva normal de 7-amino-4-metilcumarina bajo las condiciones de análisis. Los datos cinéticos se evaluaron usando el software GraFit.
Análisis espectrofotométrico de QC En este análisis, se analizó la actividad de QC espectrofotométricamente usando un método continuo, que se obtuvo adaptando un análisis discontinuo previo (Bateman, R. C. J . 1 989 J Neurosci Methods 30, 23-28) utilizando glutamato deshidrogenasa como enzima auxiliar. Las muestras consistieron en el sustrato de QC respectivo, NADH 0.3 mM , ácido a-cetoglutárico 14 mM y 30 U/ml de gl utamato deshidrogenasa en un volumen final de 250 µ?. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de QC y se les hizo seguimiento vigilando la disminución de la absorbancia en 340 nm durante 8 - 1 5 min .
Las velocidades iniciales se evaluaron , y se determinó la actividad enzimática a partir de una curva normal de amoniaco bajo las condiciones de análisis . Todas las muestras se midieron a 30 °C, usando el lector de microplacas SPECTRAFluor Plus o el Sunrise (ambos de TECAN ). Los datos cinéticos se evaluaron usando el sofware GraFit.

Claims (50)

REIVINDICACIONES
1 . Un método para diagnosticar Enfermedad de Alzheimer (AD), Neurodegeneración en el S índrome de Down (NDS) o Deficiencia Cognitiva Leve ( MC I ) en un sujeto, el método comprende: (a) detectar la cantidad de glutaminil ciclasa (QC) o sus isoformas, en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto; y (b) comparar la cantidad detectada de QC en la muestra biológica con la cantidad de QC característica de un control normal ; mediante el cual la cantidad elevada de QC en dicha muestra biológica con relación al control normal es un indicador positivo de AD, NDS o MCI .
2. Un método para diagnosticar Enfermedad de Alzheimer (AD), Neurodegeneración en el Síndrome de Down (NDS) o Deficiencia Cognitiva Leve (MCI) en un sujeto, el método comprende: a) detectar la cantidad de glutaminil ciclasa (QC), o una isoforma de ella, en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto; y (b) detectar además la cantidad de ?ß N3pE-X, (c) comparar la cantidad detectada de QC y ?ß N3pE-X en la muestra biológica con la cantidad de QC y de ?ß N3pE-X característica de un control normal ; media nte el cual la cantidad elevada de QC y de ?ß N3pE-X en dicha muestra biológica con relación al control normal es un indicador positivo de AD, N DS o MCI , y en donde X es un entero seleccionado de 38, 40 y 42.
3. Un método para diagnosticar Enfermedad de Alzheimer (AD), Neurodegeneración en el S índrome de Down ( NDS) o Deficiencia Cognitiva Leve (MCI) en un sujeto, el método comprende: (a) detectar la cantidad de glutaminil ciclasa (QC) o una isoforma de ella, en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto; y (b) detectar además la cantidad de una quimiocina , (c) comparar la cantidad detectada de QC y la quimiocina en la muestra biológica con la cantidad de QC y la quimiocina características de un control normal ; mediante el cual la cantidad elevada de QC y de quimiocina en dicha m uestra biológica con relación al control normal es un indicador positivo de AD, NDS o MCI .
4. El método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque dicha QC es QC humana o una isoforma de ella , que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEQ I D NO: 1 , 2, 3 , 4 y 5
5. El método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque dicha QC es QC humana de SEQ ID NO: 1 .
6. El método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque dicha muestra biológica es suero, plasma, orina o líq uido cefalorraquídeo .
7. El método tal y como se descri be en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque dicha muestra biológica es plasma.
8. El método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque la cantidad de QC se detecta mediante análisis inmunoturbidimétrico , inmunofluorescencia , inmunodifusión, análisis inmunosorbente ligado a enzima (ELISA), radioinmunoanálisis (RIA), inmunodetección Western , análisis de actividad de proteína, inmunodetección Western, PCR, cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC), espectrometría de masas (MS ), cromatografía de gases (GC), GC-MS , LC-MS o LC- S/MS.
9. El método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque la cantidad de QC , o una isoforma de ella , se detecta sobre la base del nivel de proteína de dicha QC o isoforma de ella .
1 0. El método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque la cantidad de QC se detecta usando un anticuerpo que se une específicamente a QC, o a una isoforma de ella.
1 1 . El método tal y como se describe en cualquiera d e las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque la cantidad de QC se detecta midiendo la actividad enzimática de QC , o de u na isoforma de ella .
1 2. El método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 8, caracterizado además porque la cantidad de QC, o de una isoforma de ella, se detecta con base en el nivel de ARNm de dicha QC o isoforma de ella.
13. El método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4 hasta 12, caracterizado además porque X es 42.
14. El método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4 hasta 12, caracterizado además porque X es 40.
15. El método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4 hasta 12, caracterizado además porque X es 38.
16. El método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4 hasta 12, caracterizado además porque no sólo una única forma de los péptidos beta amiloideos, sino una combinación de ?ß N3pE-42 y/o ?ß N3pE-40 y/o ?ß N3pE-38 y pGluABri y/o pGluADan, se detecta junto con la QC.
17. El método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 3 hasta 12, caracterizado además porque dicha quimiocina se selecciona de CCL2, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCL13, CCL15, CCL16, CCL25 y Fractalcina.
18. El método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 3 hasta 12, caracterizado además porque dicha quimiocina es CCL2.
19. Un método para diagnosticar una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto, el método comprende: (a) obtener una muestra biológica de dicho sujeto; (b) poner en contacto dicha muestra biológica con un anticuerpo que se fija a la glutaminil ciclasa (QC) o a sus isoformas; (c) permitir que el anticuerpo y la QC formen un complejo inmunitario; y (d) detectar la cantidad de complejo inmunitario formado como una indicación de la cantidad de QC en la muestra biológica; y (e) comparar la cantidad detectada con un control normal; mediante el cual la cantidad detectada que sea elevada o reducida con relación al control normal es un indicador positivo de una enfermedad neurodegenerativa.
20. El método tal y como se describe en la reivindicación 19, caracterizado además porque la cantidad detectada qué está elevada con relación al control normal es un indicador positivo de AD.
21. El método tal y como se describe en la reivindicación 19, caracterizado además porque la cantidad detectada que está elevada con relación al control normal es un indicador positivo de MCI.
22. El método tal y como se describe en la reivindicación 19, caracterizado además porque la cantidad detectada que está elevada con relación al control normal es un indicador positivo de NDS.
23. Un método in vitro para diagnosticar Enfermedad de Alzheimer (AD), Neurodegeneración en el Síndrome de Down (NDS) o Deficiencia Cognitiva Leve (MCI) en un sujeto, el método comprende: (a) detectar la cantidad de glutaminil ciclasa (QC) o sus isoformas, en una muestra biológica; y (b) comparar la cantidad detectada de QC en la muestra biológica con la cantidad de QC característica de un control normal; mediante el cual la cantidad elevada de QC en dicha muestra biológica con relación al control normal es un indicador positivo de AD, NDS o MCI.
24. Un método in vitro para diagnosticar Enfermedad de Alzheimer (AD), Neurodegeneración en el Síndrome de Down (NDS) o Deficiencia Cognitiva Leve (MCI) en un sujeto, el método comprende: a) detectar la cantidad de glutaminil ciclasa (QC), o una isoforma de ella, en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto; y (b) detectar además la cantidad de ?ß N3pE-X, (c) comparar la cantidad detectada de QC y ?ß N3pE-X en la muestra biológica con la cantidad de QC y de ?ß N3pE-X característica de un control normal; mediante el cual la cantidad elevada de QC y de ?ß N3pE-X en dicha muestra biológica con relación al control normal es un indicador positivo de AD, NDS o MCI, y en donde X es un entero seleccionado de 38, 40 y 42.
25. Un método in vitro para diagnosticar Enfermedad de Alzheimer (AD), Neurodegeneración en el Síndrome de Down (NDS) o Deficiencia Cognitiva Leve (MCI) en un sujeto, el método comprende: (a) detectar la cantidad de glutaminil ciclasa (QC) o una isoforma de ella, en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto; y (b) detectar además la cantidad de una quimiocina, (c) comparar la cantidad detectada de QC y la quimiocina en la muestra biológica con la cantidad de QC y la quimiocina características de un control normal; mediante el cual la cantidad elevada de QC y de quimiocina en dicha muestra biológica con relación al control normal es un indicador positivo de AD, NDS o MCI.
26. El método in vitro tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 23, 24 o 25, caracterizado además porque dicha QC es QC humana o una isoforma de ella, que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 y 5.
27. El método in vitro tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 23 hasta 26, caracterizado además porque dicha QC es QC humana de la SEQ ID NO: 1.
28. El método in vitro tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 23 hasta 27, caracterizado además porque dicha muestra biológica es suero, plasma, orina o líquido cefalorraquídeo.
29. El método in vitro tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 23 hasta 28, caracterizado además porque dicha muestra biológica es plasma .
30. El método in vitro tal y como se describe en cualq uiera de las reivindicaciones 23 hasta 29, caracterizado además porque la cantidad de QC se detecta mediante análisis inmunoturbidimétrico, inmunofluorescencia, inmunodifusión , análisis ¡nmunosorbente ligado a enzima (ELISA), radioinmunoanálisis (RIA), inmunodetección Western, análisis de actividad de proteína , inmunodetección Western , PCR, cromatografía de l íquidos de alto rendi miento (HPLC), espectrometría de masas (MS), cromatografía de gases (GC), GC- S, LC- S o LC-MS/MS.
31 . El método in vitro tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 23 hasta 30, caracterizado además porque la cantidad de QC, o de una ¡soforma de ella, se detecta con base en el nivel de proteína de dicha QC o isoforma de ella .
32. El método in vitro tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 23 hasta o 31 , caracterizado además porque la cantidad de QC se detecta usando un anticuerpo que se fija específicamente a QC, o a una isoforma de ella .
33. El método in vitro tal y como se descri be en cualq uiera de las reivindicaciones 23 hasta 30, caracterizado además porque la cantidad de QC se detecta midiendo la actividad enzimática de QC, o una isoforma de ella .
34. El método in vitro tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 23 hasta 30 , caracterizado además porque la cantidad de QC, o una isoforma de ella, se detecta con base en el nivel de ARNm de dicha QC o isoforma de ella.
35. El método in vitro tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 24, y 26 hasta 34, caracterizado además porque X es 42.
36. El método in vitro tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 24, y 26 hasta 34, caracterizado además porque X es 40.
37. El método in vitro tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 24, y 26 hasta 34, caracterizado además porque X es 38.
38. El método in vitro tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 24, y 26 hasta 34, caracterizado además porque no sólo una única forma de los péptídos beta amiloideos, sino una combinación de ?ß N3pE-42 y/o ?ß N3pE-40 y/o ?ß N3pE-38 y pGluABri y/o pGluADan, se detecta junto con la QC.
39. El método in vitro tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 25 hasta 34, caracterizado además porque la quimiocina se selecciona de CCL2, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCL13, CCL15, CCL16, CCL25 y Fractalcina.
40. El método in vitro tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 25 hasta 34, caracterizado además porque la quimiocina es CCL2.
41. Un método in vitro para diagnosticar una enfermedad neurodegenerativa en una muestra biológica de un sujeto, el método incl uye: (a ) poner en contacto dicha muestra biológica con un anticuerpo que se une a la glutaminil ciclasa (QC), o a una isoforma de ella ; (b) dejar que el anticuerpo y la QC formen un complejo inmunitario; y (c) detectar la cantidad de complejo inmunitario formada como una indicación de la cantidad de QC en dicha muestra biológica ; y (d ) comparar la cantidad detectada con una muestra de un sujeto de control normal ; mediante el cual la cantidad detectada que es elevada o reducida con relación al control normal es un indicador positivo de una enfermedad neurodegenerativa.
42. El método in vitro tal y como se describe en la reivindicación 41 , caracterizado además porque la cantidad detectada que es elevada con relación al control normal es un indicador positivo de AD.
43. El método in vitro tal y como se describe en la reivindicación 41 , caracterizado además porq ue la cantidad detectada que es elevada con relación al control normal es un indicador positivo de MCI .
44. El método in vitro tal y como se describe en la reivindicación 41 , caracterizado además porque la cantidad detectada que es elevada con relación al control normal es un indicador positivo de NDS .
45. Un estuche para diagnosticar una enfermedad neurodegenerativa , que contiene un anticuerpo que se fija a la QC y un patrón establecido de la cantidad de QC característica de un control normal .
46. U n método para usar un anticuerpo que se fija a la glutamini l ciclasa (QC) o a una ¡soforma de ella como marcador biológico , para diagnosticar una enfermedad neurodegenerativa , dicho método de uso comprende poner en contacto una muestra biológica obtenida de un sujeto con dicho anticuerpo para determinar la cantidad de QC en la muestra.
47. Uso de un anticuerpo que se fija a la glutaminil ciclasa (QC) o a una isoforma de ella como marcador biológico, para diagnosticar una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto.
48. El estuche, método o uso tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 45 hasta 47, caracterizado además porque la enfermedad neurodegenerativa es AD.
49. El estuche, método o uso tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 45 hasta 47, caracterizado además porque la enfermedad neurodegenerativa es MCI .
50. El estuche, método o uso tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 45 hasta 47, caracterizado además porque la enfermedad neurodegenerativa es N DS. RESU MEN La presente invención se refiere a un método par predeci r, diagnosticar y pronosticar una enfermedad neurodegenerativa , tal como enfermedad de Alzheimer (AD), Deficiencia Cognitiva Leve (MCI ) y neurodegeneración en Síndrome de Down (NDS ), usando glutaminil ciclasa (QC) como un indicador de diagnóstico / pronóstico. También se proporciona el uso de anticuerpos que se fijan a QC y de estuches para realizar dicho método de diagnóstico.
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