JP2013519891A - ピログルタミン酸修飾mcp−1を決定することにより炎症性疾患を診断する方法及びグルタミニルシクラーゼの阻害剤のスクリーニング方法 - Google Patents
ピログルタミン酸修飾mcp−1を決定することにより炎症性疾患を診断する方法及びグルタミニルシクラーゼの阻害剤のスクリーニング方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2013519891A JP2013519891A JP2012553327A JP2012553327A JP2013519891A JP 2013519891 A JP2013519891 A JP 2013519891A JP 2012553327 A JP2012553327 A JP 2012553327A JP 2012553327 A JP2012553327 A JP 2012553327A JP 2013519891 A JP2013519891 A JP 2013519891A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mcp
- antibody
- terminal
- n1pe
- ratio
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
- G01N2800/101—Diffuse connective tissue disease, e.g. Sjögren, Wegener's granulomatosis
- G01N2800/102—Arthritis; Rheumatoid arthritis, i.e. inflammation of peripheral joints
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/28—Neurological disorders
- G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【選択図】 なし
Description
本発明は、生体試料中のN末端ピログルタミン酸修飾MCP-1(MCP-1 N1pE):MCP-1の総濃度の比をバイオマーカーとして使用して、炎症性疾患又は炎症関連疾患の処置をモニタリングする方法に関し、かつ生体試料中のMCP-1の総濃度に対するN末端ピログルタミン酸修飾MCP-1の割合を決定する新規な方法にも関する。本発明はまた、グルタミニルシクラーゼ(QC)阻害剤のスクリーニング又はグルタミニルシクラーゼ(QC)阻害剤の有効性の測定のための診断キット及び方法も提供する。
走化性サイトカイン(ケモカイン)は、白血球を誘引しかつ活性化するタンパク質であり、炎症において基本的な役割を果たすと考えられている。ケモカインは、N末端システイン残基の出現により4つのファミリー(Cケモカイン;CCケモカイン;CXCケモカイン;及びCX3Cケモカイン)に分類される。CCケモカイン(別名:β-ケモカイン)は、炎症部位に優先的に単球を誘引する。単球浸潤は、多数の病態において重要な事象であると考えられる(Gerard, C.及びRollins, B. J.の論文、Nat.Immunol 2, 108-115 (2001);Bhatia, M.らの論文、Pancreatology. 5, 132-144 (2005);Kitamoto, S.、Egashira, K.、及びTakeshita, A.の論文、J Pharmacol Sci. 91, 192-196 (2003))。
ヒトMCP-1(CCL2)(UniProtKB/Swiss-Prot P13500)
タンパク質(シグナル配列(太字):23個のアミノ酸;成熟MCP-1:76個のアミノ酸)
配列番号1
(a)生体試料中のN末端ピログルタミン酸修飾MCP-1の第1の濃度(Ca)を決定する工程;
(b)上記生体試料中の全MCP-1の第2の濃度(Cd)を決定する工程;及び
(c)該第1の濃度(Ca)の値を該第2の濃度(Cd)の値で除して、Ca/Cdの比を決定する工程を含む、前記方法を提供する。
本願で意味する「検出用抗体」は、MCP-1又はN末端ピログルタミン酸修飾MCP-1ペプチドに結合する抗体を包含するものとする。
本明細書で使用される用語「炎症性疾患」及び「炎症関連疾患」は、以下を含む:
(a)神経変性疾患、例えば、軽度認知障害(MCI)、アルツハイマー病、ダウン症における神経変性、家族性イギリス型認知症、家族性デンマーク型認知症、多発性硬化症;
(b)慢性及び急性炎症、例えば、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、膵炎;
(c)線維症、例えば、肺線維症、肝線維症、腎線維症;
(d)癌、例えば、癌/血管内皮腫増殖、胃癌;
(e)代謝病、例えば、高血圧症;
(f)他の炎症性疾患、例えば、神経因性疼痛、移植片拒絶反応/生着不全/移植片血管障害、HIV感染/AIDS、妊娠中毒症、結節硬化症;及び
(g)高インスリン血症及び肥満に関連した病状。
本明細書で使用される用語「QC」は、グルタミニルシクラーゼ(QC)及びQC様酵素を含む。QC及びQC様酵素は、同一又は同様の酵素活性を有し、この活性は、QC活性としてさらに定義される。これに関連して、QC様酵素は、その分子構造がQCとは根本的に異なり得る。
QC阻害との相関を考慮して、好ましい実施態様では、本方法及び医学的使用では、QC阻害のKiが10μM以下、より好ましくは1μM以下、さらに好ましくは0.1μM以下又は0.01μM以下、最も好ましくは0.001μM以下である薬剤を使用する。実際、Ki値が低めのマイクロモル、好ましくはナノモル、さらに好ましくはピコモル範囲である阻害剤が考えられる。従って、活性薬剤を、便宜上、本明細書では「QC阻害剤」として記載するが、このような命名は、いかなる場合も本発明の主題を制限することを意図するものではないことを理解されたい。
ウエスタンブロット分析は、免疫ブロッティング又はタンパク質ブロッティングとしても知られており、不均一試料から特定のタンパク質を検出するために使用される。このプロトコルは、ニトロセルロース膜を使用してHarry Towbinら(1979)によって最初に開発された。
この方法は、4つの主工程からなる、
第1:タンパク質試料のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS PAGE)。
第2:膜への電気泳動転写(ブロッティング)。転写のために、最近の研究者が、単離されたタンパク質の配列決定を可能にする、様々な膜、特にPVDFナイロン様膜を導入した。
第3:標的タンパク質(複数可)の特異的な一次抗体及び二次抗体による標識。非特異的抗体の結合は、膜をブロッキング溶液中で、室温で1時間、又は振盪しながら4℃で一晩インキュベートすることによって防止される。該ブロッキング溶液は、通常は、TBS-T中の5%脱脂乳からなるが、一部の抗体は、乳の代わりにBSAを必要とする。このことは、通常は、試験用抗体の製造業者の取扱説明書に明記されている。一次抗体を一晩、又は室温で2時間インキュベートする。膜を適切な二次抗体(例えば、ペルオキシダーゼが結合した)と共に室温で1時間インキュベートする。
第4:標的タンパク質(複数可)の検出及びイメージング。多数の化学発光試薬が販売されており(Amersham, Pierce, Invitrogen)、各製造業者は、様々な検出感度の試薬を販売している。これらは、典型的には、混合したら即座に膜上で1〜5分間インキュベートされる2つの溶液の形態である。タンパク質シグナル及び化学発光法に応じて、1分〜1時間、膜をX線フィルムに曝露する。二次抗体は、他の酵素(アルカリホスファターゼ)に結合させることができるため、代替のプロトコルを使用して対応する基質により視覚化することができる。
ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)は、最も広く使用されている、高感度かつ再現可能な検体アッセイ用の定量手段である。この技術は、抗体と抗原の相互作用の高い特異性と酵素結合シグナル検出システムとを組み合わせている。
間接ELISAでは、抗原を表面に固定し、続いて特定の抗体と酵素の共役複合体の染色により検出を行う。
「サンドイッチ」ELISAは、抗原を2つの異なる抗体間にサンドイッチする技術である。このELISA技術が機能する原理は、以下の通りである:
・捕捉用抗体を適切な基板に固定する。
・抗原を固定された抗体に結合させる。
・酵素に結合した二次抗体を、結合した抗原に結合させる(免疫複合体の形成)。
・適切な酵素基質を用いて免疫複合体を検出する。
このELISAの工程は以下の通りである:
・非標識抗体を、その抗原の存在下でインキュベートする。
・次いで、これらの抗体/抗原複合体を、抗原が被覆されたウェルに添加する。
・プレートを洗浄して、非結合抗体を除去する。(試料中に抗原が多ければ多いほど、ウェルの該抗原に結合できる抗体が少ない、従って「競合」である。)
・一次抗体に特異的な二次抗体を添加する。この二次抗体が、酵素に結合する。
・基質が添加され、残った酵素が、発色又は蛍光シグナルを生じさせる。
競合ELISAでは、最初の抗原濃度が高ければ高いほど、結果として生じるシグナルが弱い。競合ELISAの主な利点は、粗試料又は不純物が混じった試料を使用でき、存在し得るどの抗原にも選択的になお結合できることである。
一部の競合ELISAキットは、酵素結合抗体ではなく酵素結合抗原を含む。標識抗原は、一次抗体が結合する部位について試料の抗原(非標識)と競合する。試料中に抗原が多ければ多いほど、ウェルに保持される標識抗原が少なく、シグナルが弱い。
この技術は、4〜12の突出オジーブ(ogive)を備えた免疫吸着ポリスチレンロッドからなる固相を使用する。装置全体を、採取試料を含む試験管中に沈め、次の工程(洗浄、複合体でのインキュベーション、及び発色物質(chromogenous)でのインキュベーション)を、予め試薬が満たされた標準的なマクロプレートのマイクロウェルにオジーブを浸漬することによって行う。
酵素結合免疫吸着スポット(ELISPOT)アッセイは、ヒト及び動物における免疫応答をモニタリングする一般的な方法である。このアッセイは、個々の活性化細胞又は応答細胞の分泌産物の視覚化を可能にする。
捕捉用抗体を、PVDFが設けられたマイクロプレートに無菌状態で被覆する。プレートを、通常は、アッセイのどの抗体とも反応しない血清タンパク質でブロックする。この後、対象となる細胞を、抗原又はマイトジェンと共に、様々な密度でプレーティングし、次いで、加湿された37℃のCO2インキュベータに一定時間入れておく。
(細胞内フローサイトメトリー(ICFC))
ELISAによる分泌サイトカインの検出とは対照的に、細胞内サイトカインの検出では、刺激の最後の2、3時間にわたって、タンパク質輸送阻害剤、例えば、モネンジン又はブレフェルジンAによりサイトカインの分泌をブロックする必要がある。研究者は、様々なタンパク質輸送阻害剤の使用及び効力をそれらに特異的なアッセイシステムで評価することが勧められている。
基本的な免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー分析のプロトコルの改良型を、単一細胞レベルにおける表面分子と細胞内抗原の同時分析に使用することができる。このプロトコルでは、細胞を最初にin vitroで活性化させ、表面抗原プロトコルと同様に表面抗原を染色し、次いでパラホルムアルデヒドで固定して細胞膜を安定化させ、かつ界面活性剤サポニンで透過化処理して抗サイトカイン抗体の細胞内染色を可能にする。細胞のin vitro刺激は、サイトカインレベルが、典型的には静止細胞では低すぎるため、通常はフローサイトメトリーによるサイトカインの検出を必要とする。適切な試薬を用いる細胞の刺激は、細胞型及び実験条件による。
(ルミネックス社のxMAP技術)
xMAP技術は、赤色及び赤外フルオロフォアにより内部が染色された直径5.6μmのポリスチレンマイクロスフィアを使用する。様々なバッチのマイクロスフィアに対して様々な量の2種類の色素を使用して、最大100種類のマクロスフィアのセットを作製することができる。各ビーズは、赤色色素と赤外色素の混合物によって決定される分光的特徴を伴い固有である。ビーズは、2種類の色素が特定の既知の比で満たされている。各マイクロスフィアは、固有の特徴を有するため、xMAP検出システムは、各マイクロスフィアがどのセットに属するかを特定することができる。従って、1つの反応体積で最大100の試験を多重化することが可能である。
ルミネックスシステム(Luminex System)は、フローサイトメトリーの原理に基づいた柔軟な分析器(flexible analyzer)である。該システムでは、極少量の試料を使用して、1つのマイクロプレートのウェルで最大100の検体の多重化(同時に測定)が可能である。1つのウェルでの最大40の異なる検体の多重解の分析が可能である。該システムは、遺伝子発現、転写因子プロファイリング、サイトカインプロファイリングなどを含むバイオアッセイを提供する。
Bio-Plexサイトカインアッセイは、組織培養上清又は血清中のサイトカインの定量に液体懸濁液アレイを利用する。この96ウェルマイクロタイタープレート形式のアッセイを使用すると、1つのウェル内の多数のサイトカインのレベルをプロファイリングすることが可能である。Bio-Plexサイトカインアッセイの原理は、捕捉サンドイッチ免疫測定法に類似している。それぞれの望ましいサイトカインに対する抗体は、異なる色コードのポリスチレンビーズに共有結合する。結合されたビーズは、既知(標準)又は未知の量のサイトカインを含む試料と反応する。非結合サイトカインが除去されたら、それぞれのサイトカイン上の異なるエピトープに対するビオチン化検出用抗体を反応に添加する。この結果、それぞれのサイトカインの周りに抗体のサンドイッチが形成される。これらの複合体は、ビーズとは異なる蛍光特性を有するストレプトアビジン-フィコエリトリン(ストレプトアビジン-PE)の添加により検出される。1つのマイクロタイターウェルでの多重化ビーズ-捕捉免疫測定法の分析を可能にする専用マイクロプレートリーダーにより定量を行う。混合物中のビーズを個々に読み込むことにより、該システムは、それぞれのサイトカインを個別に検出することができる。Bio-Plexソフトウエアは、既知の量のサイトカインの標準混合物から得た標準曲線からサイトカインの濃度を自動的に算出する。
免疫組織化学又はIHCは、組織切片の細胞に抗原(例えば、タンパク質)を局在化させるプロセスを指す。IHCはまた、生体組織の異なる部分におけるバイオマーカー及び差次的に発現されるタンパク質の分布及び局在化を理解するために基礎研究で広く使用されている。抗体-抗原相互作用の可視化は、様々な方法で達成することができる。最も一般的な例では、抗体は、発色反応を触媒できる酵素、例えば、ペルオキシダーゼに結合する。あるいは、抗体に、フルオロフォア、例えば、フルオレセイン、ローダミン、DyLight Fluor、又はAlexa Fluorを標識することもできる。
間接法は、組織抗原と反応する非標識一次抗体(第1の層)、及び該一次抗体と反応する標識二次抗体(第2の層)を必要とする。
免疫沈降では、既知のタンパク質に特異的な抗体を使用して、該タンパク質を様々なタンパク質を含む溶液から単離する。これらの溶液は、植物組織又は動物組織の粗溶解物の形態である場合が多い。他の試料のタイプには、体液又は生物起源の他の試料が考えられる。
本発明の第1の態様に従って、炎症性疾患又は炎症関連疾患を診断又はモニタリングする方法であって、生体試料中のMCP-1の総濃度に対するN末端ピログルタミン酸修飾MCP-1の割合を決定する工程を含む、前記方法を提供する。
(a)生体試料中のN末端ピログルタミン酸修飾MCP-1の第1の濃度(Ca)を決定する工程;
(b)該生体試料中の全MCP-1の第2の濃度(Cd)を決定する工程;及び
(c)該第1の濃度(Ca)の値を該第2の濃度(Cd)の値で除して、Ca/Cdの比を決定する工程。
(i)生体試料をMCP-1に特異的な捕捉用抗体に接触させる工程、
(ii)N末端ピログルタミン酸修飾MCP-1に特異的な検出用抗体を適用する工程、
(iii)得られた免疫複合体を検出する工程、及び
(iii)検出されたN末端ピログルタミン酸修飾MCP-1複合体を定量する工程。
348/1D4 (寄託番号:DSM ACC 2905);
348/2C9 (寄託番号:DSM ACC 2906);
332/4B8 (寄託番号:DSM ACC 2907);及び
332/4F8 (寄託番号:DSM ACC 2908)。
(i)生体試料をMCP-1に特異的な捕捉用抗体に接触させる工程、
(ii)MCP-1に特異的な検出用抗体を適用する工程、
(iii)得られた免疫複合体を検出する工程、及び
(iv)捕捉されたMCP-1複合体を定量する工程。
ポリクローナル抗血清ヤギ抗hMCP1-AF (R&D Systems, Minneapolis, USA);
抗MCP-1ウサギポリクローナル抗体ab18072 (Abcam, Cambridge, UK);
抗MCP-1ウサギポリクローナル抗体ab9669 (Abcam, Cambridge, UK);
抗MCP-1ウサギポリクローナル抗体ab18072 (Abcam, Cambridge, UK);
ヤギMCP-1抗体(C-17): sc-1304 (Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz, USA);
ポリクローナル抗血清ウサギ抗mJE (Peprotech, Hamburg, Germany);
抗mMCP-1ウサギポリクローナル抗体ab9899 (Abcam, Cambridge, UK);
抗MCP-1ウサギポリクローナル抗体ab7202 (Abcam, Cambridge, UK);及び
ラットモノクローナルMCP-1抗体(JJ5): sc-74215 (Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz, USA)。
マウス抗hMCP-1 (Peprotech, Hamburg, Germany);
抗MCP-1マウスモノクローナル抗体ab17715 (Abcam, Cambridge, UK);
マウスモノクローナルMCP-1抗体sc-32819 (Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz, USA);
抗マウスMCP-1 (R&D Systems, Minneapolis, MN USA);
ハムスターモノクローナルMCP-1抗体ab21397 (Abcam, Cambridge, UK);
ラットモノクローナルMCP-1抗体ab8101 (Abcam, Cambridge, UK);及び
ラットモノクローナルMCP-1抗体(JJ5): sc-74215 (Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz, USA)。
(a)放射性同位元素、例えば、35S、14C、125I、3H、及び131I。抗体は、例えば、Current Protocols in Immunology、第1巻及び第2巻、Gutigenら編集、Wiley-Interscience社、New York、New York. Pubs.,(1991)に記載された技術を用いて放射性同位元素により標識することができ、かつ放射能は、シンチレーションカウンティングを用いて測定することができる。
(b)蛍光標識、例えば、希土類キレート(ユーロピウムキレート)又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリトリン、及びテキサスレッドが利用可能である。これらの蛍光標識は、例えば、Current Protocols in Immunology(前出)に開示された技術を用いて抗体に結合させることができる。蛍光は、蛍光光度計を用いて定量することができる。
(c)様々な酵素-基質標識が利用可能である。酵素は、一般に、様々な技術を用いて測定することができる発色基質の化学的変化を触媒する。例えば、酵素は、基質内の色の変化を触媒することができ、この変化を、分光光度計により測定することができる。あるいは、酵素は、基質の蛍光又は化学発光を変化させることができる。蛍光の変化を定量する技術は、上記されている。化学発光基質は、化学反応により電子的に励起されるようになり、次いで、(例えば、ケミルミノメーターを用いて)測定され得る光を放出し得る、又は蛍光アクセプターにエネルギーを供与し得る。酵素標識の例として、ルシフェラーゼ(例えば、蛍ルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ;米国特許第4,737,456号)、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRPO)、アルカリホスファターゼ、O-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ(例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ)、複素環オキシダーゼ(例えば、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ)、ラクトペルオキシダーゼ、及びミクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。酵素を抗体に結合する技術は、O'Sullivanらの論文、「酵素免疫測定法に使用される酵素-抗体複合体の調製方法(Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay)」、Methods in Enzym (編集Langone及びH. Van Vunakis)、Academic Press社、New York, 73: 147-166 (1981)に説明されている。
(i)西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRPO)と基質としての過酸化水素(hydrogen peroxidase)であり、過酸化水素(hydrogen peroxidase)は、色素前駆体(例えば、オルトフェニレンジアミン(OPD)又は3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン塩酸塩(TMB))を酸化する;
(ii)アルカリホスファターゼ(AP)と発色基質としてのp-ニトロフェニルリン酸;及び
(iii)β-D-ガラクトシダーゼ(β-D-Gal)と発色基質(例えば、p-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシダーゼ)又は発蛍光基質4-メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトシダーゼ。
(a)生体試料中のN末端ピログルタミン酸修飾MCP-1の第1の濃度(Ca)を決定する工程;
(b)該生体試料中の全MCP-1の第2の濃度(Cd)を決定する工程;及び
(c)該第1の濃度(Ca)の値を該第2の濃度(Cd)の値で除して、Ca/Cdの比を決定する工程を含む、前記方法を提供する。
(a)MCP-1及びグルタミニルシクラーゼ(QC)を含む対照試料をインキュベートして、MCP-1の総濃度に対するN末端ピログルタミン酸修飾MCP-1の割合を決定する工程;
(b)MCP-1及びグルタミニルシクラーゼ(QC)を含む混合物並びにグルタミニルシクラーゼ(QC)阻害剤と共に対照試料をインキュベートして、MCP-1の総濃度に対するN末端ピログルタミン酸修飾MCP-1の割合を決定する工程;を含み、
該工程(a)に対する該工程(b)におけるN末端ピログルタミン酸修飾MCP-1:全MCP-1の比の低下が、グルタミニルシクラーゼの阻害を示す、前記方法を提供する。
便宜上、本発明の方法に使用される抗体は、キットとして、すなわち所定量の試薬と診断アッセイを行うための取扱説明書とを組み合わせたパッケージとして提供することができる。
(実施例1:MALDI-TOF質量分析)
マトリックス支援レーザー脱離/イオン化質量分析を、飛行線形時間分析計を備えたVoyager De-Pro (Applied Biosystems, Darmstadt)を用いて行った。該機器は、337nm窒素レーザー、電位加速源、及び1.4mの飛行管を備えていた。検出操作は、正イオンモードであった。サンプル(5μl)を、等量のマトリックス溶液と混合した。マトリックス溶液として、1mlのアセトニトリル/0.1%TFAを含む水(1/1, v/v)に20mgのシナピン酸(Sigma-Aldrich)を溶解することによって調製されたシナピン酸を使用した。少量(≒1μl)のマトリックス-検体-混合物をプローブチップに移した。
(QC特異的阻害剤の非存在下及び存在下での組換えヒトDP4によるMCP-1のN末端分解)
N末端グルタミンで始まる組換えヒトMCP-1(1-76)(配列番号1)(Peprotech)を、25mM トリス/HCl pH 7.6に溶解して10μg/mlの濃度にした。該MCP-1溶液を、組換えヒトQC(0.0006mg/ml)と共に30℃で3時間プレインキュベートしてから組換えヒトDP4(0.0012mg/ml)と共に30℃でインキュベートするか、又は事前のQC適用なしでDP4と共にインキュベートした。加えて、GlN1-MCP-1の組換えヒトQCとのインキュベーションを、10μMの1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-3-(3,4-ジメトキシフェニル)チオ尿素塩酸塩の存在下で行った。得られたDP4分解産物を、0分後、15分後、30分後、1時間後、2時間後、及び4時間後にMaldi-TOF質量分析法を用いて分析した。
ピログルタミル残基の代わりにN末端グルタミニル残基を有するヒト組換えMCP-1(Peprotech)を、25mM トリス/HCl pH 7.6に溶解して10μg/mlの濃度にした。
N末端グルタミニル残基を有するヒト組換えMCP-1(Peprotech)を、25mM トリス/HCl pH 7.6に溶解して100μg/mlの濃度にした。MCP-1を、組換えヒトQC(0.006mg/ml)と共に30℃で3時間プレインキュベートしてからヒト血清と共に30℃でインキュベートするか、又はQCを添加しないでヒト血清と共にインキュベートした。分解産物を、Gln1-MCP-1については、0分後、10分後、30分後、1時間後、2時間後、3時間後、5時間後、及び7時間後に、pGlu1-MCP-1については、0分後、30分後、1時間後、2時間後、3時間後、5時間後、7時間後、及び24時間後にMaldi-TOF質量分析法を用いて分析した。
(DP4によるヒトMCP-2のN末端分解)
ピログルタミル残基の代わりにN末端グルタミニル残基を有するヒト組換えMCP-2(配列番号11)(Peprotech)を、25mM トリス/HCl pH 7.6に溶解して10μg/mlの濃度にした。MCP-2を、組換えヒトQC(0.0006mg/ml)と共に30℃で3時間プレインキュベートしてから組換えヒトDP4(0.0012mg/ml)と共に30℃でインキュベートするか、又はQCとのプレインキュベーションなしで組換えヒトDP4(0.0012mg/ml)と共にインキュベートした。得られたDP4分解産物を、0分後、15分後、30分後、1時間後、2時間後、4時間後、及び24時間後にMaldi-TOF質量分析法を用いて分析した。
ピログルタミル残基の代わりにN末端グルタミニル残基を有するヒト組換えMCP-3(配列番号12)(Peprotech)を、25mM トリス/HCl pH 7.6に溶解して10μg/mlの濃度にした。MCP-3を、組換えヒトQC(0.0006mg/ml)と共に30℃で3時間プレインキュベートしてから組換えヒトDP4(0.00012mg/ml)と共に30℃でインキュベートするか、又は事前のQC適用なしで組換えヒトDP4(0.00012mg/ml)と共にインキュベートした。得られたDP4分解産物を、0分後、15分後、30分後、1時間後、2時間後、4時間後、及び24時間後にMaldi-TOF質量分析法を用いて分析した。
ピログルタミル残基の代わりにN末端グルタミニル残基を有するヒト組換えMCP-4(配列番号13)(Peprotech)を、25mM トリス/HCl pH 7.6に溶解して10μg/mlの濃度にした。MCP-4を、組換えヒトQC(0.0006mg/ml)と共に30℃で3時間プレインキュベートしてから組換えヒトDP4(0.00006mg/ml)と共に30℃でインキュベートするか、又は事前のQC適用なしで組換えヒトDP4(0.00006mg/ml)と共にインキュベートした。得られたDP4分解産物を、0分後、15分後、30分後、1時間後、2時間後、4時間後、及び24時間後にMaldi-TOF質量分析法を用いて分析した。
(TransWell走化性アッセイ)
走化性アッセイを、細孔径が5μmの24ウェルTransWellプレート(Corning)を用いて行った。THP-1細胞を、1×106細胞/100μlの濃度でRPMI1640に懸濁し、上部チャンバに100μlのアリコートを適用した。細胞を、37℃で2時間、化学誘引物質に向けて遊走させた。続いて、上部チャンバの細胞を廃棄し、下部チャンバを、PBS中50μlの70mM EDTAで混合し、15分間37℃でインキュベートして膜に付着した細胞を遊離させた。その後、下部チャンバに遊走した細胞を、細胞カウンターシステム(Scharfe System)を用いてカウントした。走化性指数を、刺激へ遊走した細胞を負の対照へ遊走した細胞で除することによって算出した。
グルタミン1で始まるMCP-1(Gln1-MCP-1)(Peprotech)を、pGlu1-MCP-1を生成するために組換えヒトQCと共にインキュベートするか、又はAsp3-MCP-1を生成するためにヒト組換えDP4と共にインキュベートした。1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、及び1000ng/mlの濃度の生成されたMCP-1変異体を、THP-1走化性アッセイ(n=3)を用いて試験した。
N末端グルタミンを有するMCP-1(Gln1-MCP-1)(Peprotech)を、組換えヒトQC及びDP4(Gln1-MCP-1+QC+DP4)、ヒト組換えDP4のみ(Gln1-MCP+DP4)、並びに10μMのQC阻害剤1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-3-(3,4-ジメトキシフェニル)チオ尿素塩酸塩及びDP4と組み合わせた組換えヒトQC(Gln1-MCP-1+QC+QCI+DP4)と共にインキュベートした。1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、及び1000ng/mlの濃度の生成されたMCP-1変異体を、走化性アッセイ(n=3)を用いて試験した。
N末端グルタミン(Peprotech)又はピログルタミル残基を有するヒトMCP-1、MCP-2、MCP-3、及びMCP-4(Gln1-MCPとヒト組換えQCとの1:100の希釈での30℃で2時間のインキュベーション)を、走化性能について試験した。1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、及び1000ng/mlの濃度の特定のMCPを、走化性アッセイ(n=3)を用いて試験した。
N末端グルタミンで始まるヒトMCP-1、MCP-2、MCP-3、及びMCP-4(Peprotech)を、走化性アッセイに直接適用して、MCP-1、MCP-2、MCP-3、及びMCP-4のDP4分解産物の走化性能と比較した。DP4分解産物の生成のために、それぞれのMCPを、アッセイの前に、ヒト組換えDP4と共に1:100の希釈で、30℃で2時間インキュベートした。1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、及び1000ng/mlの濃度の特定のMCPを、走化性アッセイ(n=3)を用いて試験した。
ヒトMCP-1を捕捉するために、ヒトMCP-1に特異的に結合する捕捉用抗体として、商業的に入手可能なポリクローナル抗血清ヤギ抗hMCP1-AF(R&D Systems, Minneapolis, USA)を、PBSで250ng/mlに希釈し、4℃で一晩、ポリスチレン96ウェルマイクロタイタープレートに固定した。次いで、ELISAブロッカー(Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)により室温で2時間ブロッキングした。標準曲線の作成のために、hMCP-1 N1pEを得るべく、組換えhMCP-1を組換えヒトグルタミニルシクラーゼ(QC)と共にインキュベートした。組換えhMCP-1 N1pE標準ペプチドを、ELISAブロッカーにより1000pg/ml〜15.63pg/mlまで段階希釈し、二連でウェルに加えた。ELISAブロッカーで満たされた2つのウェルは、標準曲線値0pg/mlを表す。室温での2時間のインキュベーション後、プレートを、TBS-Tで少なくとも3回洗浄した。hMCP-1 N1pEの検出のために、MCP-1 N1pE抗体クローン348-2C9とHRP結合抗マウス抗体の両方を、ブロッキング緩衝液で希釈して500ng/mlの最終濃度にした。hMCP-1の検出のために、抗体マウス抗hMCP-1(Peprotech, Hamburg, Germany)とHRP結合抗マウス抗体の両方を、ブロッキング緩衝液で希釈して500ng/mlの最終濃度にした。検出用抗体/共役溶液を、室温で2時間インキュベートした。TBS-Tによる数回の洗浄後、市販のHRP基質TMB(SureBlue Reserve TMBマイクロウェルペルオキシダーゼ基質(1成分), KPL, Gaithersburg, USA)による呈色反応を行い(暗所において室温で30分間インキュベート)、続いて1.2N H2SO4の添加により該反応を停止させた。450/540nmにおける吸光度を、Tecan Sunriseプレートリーダーにより決定した。
標準ペプチドの環化状態の全hMCP-1 ELISAに対する影響を排除するために、環化組換えヒトMCP-1と非環化組換えヒトMCP-1の検出を比較した。
炎症性刺激の後、hMCP-1の発現が、ヒト正常皮膚線維芽細胞(NHDF)において亢進される。従って、hMCP-1及びhMCP-1 N1pEの量が、オンコスタチンM(OSM)及びインターロイキン1β(IL1β)のNHDFへの適用後に増加するはずである。これを立証するために、OSM及びIL1β刺激NHDF細胞培養上清を、2つのELISAで分析した。hMCP-1の量及びhMCP-1 N1pEの部分を分析した。
実施例7は、hMCP-1及びhMCP-1 N1pEの発現が、炎症性刺激の後にNHDFにおいて亢進されることを示している。グルタミニルシクラーゼ(QC)が、N末端ピログルタミン酸残基の形成を触媒するため、QCの阻害は、hMCP-1 N1pEレベルの減少をもたらすはずである。これを立証するために、NHDFを、OSM及びIL1βで刺激し、同時にQCIを用いて、又は用いずに処置した。
実施例8は、QCIの適用が、NHDFにおけるhMCP-1 N1pEレベルを低下させることを示している。QCI濃度依存性のhMCP-1 N1pEの低下を分析するために、癌ヒト肺胞基底上皮細胞株A549を異なる濃度のQCIで処置した。
ヒト血清におけるhMCP-1及びhMCP-1 N1pEの定量的検出を評価するために、スパイク及び回収率の実験を行った。
ELISAプロトコルは、FBS、0.05%Tween、ブロッキングのための10%FBS、及び希釈工程の使用法を除き、実施例5と一致している。スパイク及び回収率の確認のために、様々なレベルの組換えhMCP-1及びhMCP-1 N1pEを、ヒト血清中でスパイクした。回収率を、スパイクされた血清試料において測定された値からスパイクされていない血清試料において測定された値を減じることによって算出した。
実施例5〜10は、組換えヒトMCP-1/MCP-1 N1pE及び未変性ヒトMCP-1/MCP-1 N1pEの定量的検出を説明している。マウス試料中のmMCP-1及びmMCP-1 N1pEレベルを分析するために、マウスMCP-1/MCP-1 N1pEの定量的検出のためにアッセイを開発する必要があった。MCP-1 N1pE抗体クローン348-2C9は、マウスMCP-1 N1pEと交差反応するため、この抗体を、mMCP-1 N1pEの検出のための間接サンドイッチELISAの確立に使用した。サイトカインの両方の型を区別するために、全mMCP-1の検出のための同等の間接サンドイッチELISAを開発した。
実施例6は、ヒト標準ペプチドhMCP-1の環化状態が全hMCP-1 ELISAに対して全く影響がないことを実証している。これをマウス全MCP-1 ELISAについても立証するために、全mMCP-1 ELISAにおける環化組換えマウスMCP-1と非環化組換えマウスMCP-1の定量の比較を行った。
ELISAプロトコルは、実施例6に対応し、標準曲線の作成のために、mMCP-1をQCと共に、又はQCを用いずにインキュベートした。
実施例9は、QCIの適用が、刺激されたA549におけるヒトMCP-1 N1pE/ヒトMCP-1の比を濃度依存的に低下させることを示している。マウスMCP-1 N1pE/マウスMCP-1の比に対するQCIの影響を分析するために、マウスマクロファージ細胞株RAW264.7を、QC阻害剤QCIの非存在下、又は濃度が増加するQCIの存在下でLPSで刺激した。
RAW264.7を、10ng/mlのLPSにより24時間刺激し、異なるQCI濃度で処置した。24時間後に、細胞培養上清を、実施例9のプロトコルに従って分析した。細胞培養上清を、ウェルへの添加の前に、ブロッキング緩衝液で1:1000に希釈した。
RAW246.7の刺激及び阻害剤の適用を、実施例9に従って行った。ウエスタンブロット分析のために、細胞培養上清のタンパク質を、SDSゲル電気泳動法に適用して分離した。分離されたタンパク質を、ニトロセルロース膜に電気的に移動させた。膜を、軽く振盪させながら室温で1時間、TBST-M(=TBST+5%スキムミルク)でブロックした。抗体を、等量のTBST-Mで1μg/mlに希釈した全mMCP-1(ラット抗マウスMCP-1、R&D Systems)用の検出用抗体又はmMCP-1 N1pE(クローン332-4B8)用の検出用抗体と共に、振盪台(rocking platform)で、4℃で一晩インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した二次抗マウス及び抗ラット抗体を、以下の標準手順に従ってシグナルの検出に使用した。
実施例13は、QCIの適用が、マウス細胞培養モデルにおけるmMCP-1 N1pE/mMCP-1の比を低下させることを示した。in vivoでこの結果を立証するために、mMCP-1 N1pE/mMCP-1の比を、QCIの適用後に急性炎症性マウスモデルで測定した。mMCP-1 N1pE/mMCP-1の比の測定の他に、単球浸潤に対するmMCP-1 N1pE濃度の低下の影響を調べた。
実施例11は、組換えmMCP-1/mMCP-1 N1pE及び未変性mMCP-1/mMCP-1 N1pEの定量的検出を説明している。抗マウスIgG-HRP複合体の潜在的な交差反応を起こさずに、マウス液体試料中のmMCP-1 N1pEレベルを分析するために、MCP-1 N1pE抗体クローン348-2C9のビオチン化を行った。
抗MCP-1 N1pE抗体(MCP-1 N1pE抗体2C9及びビオチン化MCP-1 N1pE抗体348/2C9)の抗原hMCP-1(1-38)に対する結合親和性を、VP-ITCマイクロ熱量計(MicroCal)を用いて決定した。両方の抗体クローン及びMCP-1(1-38)ペプチドを、同じ緩衝液条件を保ち、かつプロトン化事象によるバックグラウンド熱を回避するために、2リットルの150mM NaCl、25mM Na2HPO4、25mM KH2PO4、2mM EDTA、pH 7.4に対して4℃で一晩、透析した。この後、抗体及びペプチドの濃度並びにそれぞれの吸光係数を、280nmにおける吸光度から算出した。滴定実験のために、MCP-1 N1pE抗体2C9及びMCP-1(1-38)をそれぞれ、1.87μM及び29.19μMの濃度で使用した。10μlのMCP-1(1-38)の抗MCP-1 N1pE抗体溶液への29回の注入による滴定によって、結合熱を20℃で記録した。MCP-1(1-38)ペプチドの希釈による熱発生を、条件及び機器の設定を用いる透析緩衝液への滴定によって決定した。次いで、このデータを、MicroCal ORIGINソフトウエアによって分析した。算出した結合熱を、ペプチド希釈の熱によって補正した。得られた曲線を「1組の部位(One Set of Sites)」結合モデルに当てはめて、化学量、解離定数、反応エンタルピー、反応エントロピーを算出した。
CSF及び血清試料中のhMCP-1及びhMCP-1 N1pEの測定のために、以下のプロトコルを使用した:
・ヤギ抗hMCP-1抗体(R&D Systems)をPBSで250ng/mlに希釈
・Maxisorp96ウェルプレート(Nunc)上の1ウェルに付き希釈抗体100μlの添加
・プレートのシーリング及び4℃で一晩のインキュベーション
・抗体溶液の除去
・1ウェルに付き200μlのPBS/10%(v/v)FBS/0.05%(v/v)Tween-20の添加による表面のブロッキング、プレートのシーリング、及び室温で2時間のインキュベーション
・標準ペプチドの環化:
16.5μl PBS
2μl hCCL2(100mg/ml)
1μl 22%BSA
0.5μl hQC
37℃で1時間のインキュベーション
・環化標準ペプチド(10μg/ml)をPBS/10%(v/v)FBS/0.05%(v/v)Tween-20で10ng/ml、最終的に1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml...15.6pg/mlに希釈
・血清又はCSF試料をPBS/10%(v/v)FBS/0.05%(v/v)Tween-20で1:4に希釈し、深いウェルプレートに移す
・プレートをTBS/0.5%(v/v)Tween-20で3回洗浄して洗浄緩衝液を除去
・試料及び標準ペプチド溶液を深いウェルプレートからELISAプレートに移す、100μl/ウェル
・プレートのシーリング及び室温で2時間のインキュベーション
・抗体348/2C9の抗マウスIgG-HRP(KPL)との室温で15分間のプレインキュベーション、その後、プレミックスをPBS/10%(v/v)FBS/0.05%(v/v)Tween-20で500ng/ml 348/2C9及び1μg/ml 抗マウスIgG-HRPに希釈
・全hMCP-1抗体(Biolegends)の抗マウスIgG-HRP(KPL)との室温で15分間のプレインキュベーション、その後、プレミックスをPBS/10%(v/v)FBS/0.05%(v/v)Tween-20で500ng/ml 2C9及び1μg/ml 抗マウスIgG-HRPに希釈
・プレートをTBS/0.5%(v/v)Tween-20で3回洗浄して洗浄緩衝液を除去
・抗体溶液をプレートに添加、100μl/ウェル
・プレートのシーリング及び室温で2時間のインキュベーション
・プレートをTBS/0.5%(v/v)Tween-20で3回洗浄して洗浄緩衝液を除去
・発色溶液(SureBlue)をプレートに添加、100μl/ウェル
・暗所において室温で30分間のプレートのインキュベーション
・1ウェルに付き50μlの1.2N H2SO4の添加による反応の停止
・TECAN Sunriseでの450nm/540nmにおける吸光度の測定
これまで、MCP-1レベルの測定は、主にELISAアッセイに基づいた様々な方法によって行われてきた。
これらは、MCP-1ケモカインの完全性、従ってMCP-1ケモカインの受容体活性化機能を検出することができない。
残基7-10は、受容体の脱感作に必須であるが、機能には十分ではなく、機能の活性には残基1-6の完全性が必要であった。MCP-1、1-10に対応するペプチドは、検出可能な受容体結合活性を欠いており、残基1-10がMCP-1の機能に必須であるが、他の残基も関与していることを示唆している。8-76、9-76、及び10-76を含むいくつかの切断類似体は、MCP-1誘導Ca2+誘導を脱感作したが、著しく活性ではなかった。これらの類似体は、MCP-1活性のアンタゴニストであり、最も強力なのは、9-76類似体である(ICs0=20nM)。該9-76は、8.3μMのKaでMCP-1受容体に特異的に結合し、これは、MCP-1(Kd 2.8nM)よりも3倍高かった。9-76類似体は、MCP-1及びMCP-3に対するCa2+応答を脱感作したが、他のCCケモカインに対してはそうではなく、MCP受容体特異的であることを示唆している(Gong, J.-H.及びClark-Lewis, I.の論文、J Exp. Med. 161 631-40 (1995))。
8種の哺乳動物種由来の成熟MCP-1の配列アラインメント(図1)は、最初の76のアミノ酸残基の範囲内で46%の全体の同一性及び79%の類似性を実証している。特に、最初の4個のN末端アミノ酸残基は、完全に保存されて、受容体のアゴニスト/アンタゴニスト作用が確保されている。異なるヒトMCPタンパク質の比較(図2)により、どの成熟タンパク質の場合でも、N末端グルタミンの出現が明らかである。異なる受容体の特異性により、隣接するアミノ酸残基は保存されていない。しかしながら、QCアクセス可能N末端グルタミン残基及びDP4切断可能グルタミン-プロリンモチーフの基本原理は、保存されたままである。
循環内で、MCP-1は、N末端pGlu残基によって保護され、該N末端pGlu残基は、アミノペプチダーゼ、例えば、DP4によるN末端の切断に対する抵抗性を付与する(図3〜図6)。QC阻害剤の投与の結果として、非保護N末端が、DP4によって容易に切断される(図7)。N末端切断は、ヒトMCP-1の不活化をもたらす(図12及び図13)。総合すると、これらの結果は、N末端のpGlu形成が、保護の機構を果たし、ポストプロリン切断酵素、例えば、DP4及びアミノペプチダーゼPによるN末端分解に対する抵抗性を付与することを示唆している(図5)。
ヒトMCP-1のタンパク分解安定性についてのさらなる研究のために、MCP-1の精製プロテアーゼとのインキュベーションにより得られたデータを、ヒトMCP-1のヒト血清とのインキュベーションによって実証した。ヒトGln1-MCP-1のヒト血清とのインキュベーションは、基質のN末端切断及び最初の2個のアミノ酸(Gln1Pro2)の遊離を示している。加えて、血漿中のQC活性は、N末端タンパク分解と競合してMCP-1を安定させ、約60%の切断Asp3-MCP-1と40%の完全長pGlu1-MCP-1の最終比となる(図7A)。さらに、ヒトMCP-1のヒトQCとのプレインキュベーションは、N末端pGlu残基の形成をもたらし、従ってヒトMCP-1が安定化する。少なくとも選択された時間枠及び血清の希釈では、pGlu1-MCP-1の分解は全く観察されなかった(図7B)。加えて、9.6μMのDP4阻害剤イソロイシル-チアゾリジド(Isoleucyl-Thiyzolidide)の存在下での血清中のMCP-1のインキュベーションもまた、N末端の分解を防止し、MCP-1が、ヒト血清中のDP4又はDP4様活性によって分解されることを立証している(図7C)。
ヒトMCP-1のN末端分解と同様に、DP4によるN末端切断に対する他のヒトMCP、すなわちMCP-2、MCP-3、及びMCP-4の感受性を調べた(図8〜図10)。既にMCP-1で観察されたように、N末端pGlu残基が、DP4によるタンパク分解に対してMCP-2(図8B)、MCP-3(図9B)、及びMCP-4(図10B)を保護する。しかしながら、N末端グルタミンで始まる非環化変異体は、Gln1-MCP-2(図8A)、Gln1-MCP-3(図9A)、及びGln1-MCP-4(図10A)で示されているように、DP4によって容易に切断される。従って、N末端pGlu残基は、アミノペプチダーゼ、例えば、DP4による切断に対して全てのMCPを安定化させる。従って、代謝回転の促進並びに走化性及び受容体活性化の低下を誘発するためにin vivoでのQC活性を低下させるという提示された概念は、MCPファミリーの全てのメンバーに当てはまる。
MCP-1の異なるN末端変異体のヒトTHP-1単球を誘引する能力に対する影響を調べるために、Gln1-MCP-1、pGlu1-MCP-1、及びDP4分解産物Asp3-MCP-1を、in vitroでの走化性アッセイで試験した。N末端グルタミニル残基又はピログルタミル残基を有する完全長MCP-1は、THP-1単球の誘引において同等に能力があり、最大応答が50ng/ml〜100ng/mlであることが見出された(図11A)。加えて、N末端グルタミン又はピログルタミン酸を有するMCP-2、MCP-3、及びMCP-4のヒトTHP-1単球を誘引する能力も調べた。MCP-1と同様に、MCP-2及びMCP-3のN末端におけるpGlu形成は、それぞれのグルタミン前駆体と比較して、走化性能に対する影響が全くない(図11B及び図11C)。しかしながら、MCP-4では、pGLU形成は、該ペプチドの走化性能を僅かに高める(図11D)。
生体試料中の両方の型を区別して、全hMCP-1及びhMCP-1 N1pEの定量的な量を決定するために、2つの間接サンドイッチELISAを確立する必要があった。図14は、全hMCP-1(図14A)及びhMCP-1 N1pE(図14B)の検出のための2つの特徴的な標準曲線を示している。
標準ペプチドの環化状態の全hMCP-1 ELISAに対する影響を排除するために、同じアッセイにおいて、環化組換えヒトMCP-1と非環化組換えヒトMCP-1の検出を比較した(図15)。実験により、全hMCP-1 ELISAにおけるhMCP-1ペプチドの検出に対するhMCP-1ペプチド環化状態の影響がゼロ又は最小限であることが明らかである。これは、両方のELISAの捕捉用抗体及び全hMCP-1 ELISAの検出用抗体が、hMCP-1のN末端アミノ酸と相互作用しないことを実証している。この発見は、hMCP-1 N1pEレベルが様々な試料における両方のペプチドの比を決定する能力を調べるhMCP-1及びhMCP-1 N1pE ELISAの検証にとって重要である。
炎症性刺激の後、hMCP-1の発現が、ヒト正常皮膚線維芽細胞(NHDF)において亢進される。従って、hMCP-1及びMCP-1 N1pEの量は、オンコスタチンM(OSM)及びインターロイキン1β(IL1β)のNHDFへの適用後に増加するはずである。これを立証するために、OSM及びIL1β刺激NHDF細胞培養上清を、2つのELISAで分析した。まずhMCP-1の量、次いでhMCP-1 N1pEの部分を分析した。得られたデータは、OSM及びIL1βの適用による炎症性刺激の後に、hMCP-1及びhMCP-1 N1pEの量が、NHDF細胞培養上清中で時間依存的に増加することを示している(図16)。全hMCP-1レベルに対するhMCP-1 N1pEの割合は、70%〜95%の範囲であり、成熟MCP-1のほぼ完全なN末端ピログルタミン酸修飾を示唆している。
グルタミニルシクラーゼ(QC)は、N末端ピログルタミン酸残基の形成を触媒するため、QCの阻害は、hMCP-1 N1pEレベルの低下をもたらすはずである。これを立証するために、NHDFを、OSM及びIL1βで刺激し、同時にQCIを用いて、又は用いずに処置した。
hMCP-1 N1pEのQCI濃度依存性の減少を分析するために、癌ヒト肺胞基底上皮細胞株A549を異なる濃度のQCIで処置した。hMCP-1 N1pEの量は、QCIによって濃度依存的に減少するが、全hMCP-1の量は、ほぼ影響を受けない(図18)。結果として、hMCP-1 N1pE/hMCP-1の比は、阻害剤の濃度の増加と共に減少する(図18B)。
表2は、ヒト血清に添加されたhMCP-1で得られたスパイク及び回収率を示している。スパイクされた組換えhMCP-1ペプチドの回収率は66%〜81%であった。
マウス試料中のmMCP-1及びmMCP-1 N1pEレベルを分析するために、マウスMCP-1及びマウスMCP-1 N1pEの定量分析のためのアッセイを開発する必要があった。MCP-1 N1pE抗体クローン348-2C9は、マウスMCP-1 N1pEと交差反応するため、この抗体を、mMCP-1 N1pEの検出のための間接サンドイッチELISAの確立に使用した。加えて、全mMCP-1を検出して、サイトカインの両方の型を区別するために同等の間接サンドイッチELISAを開発した。図19は、mMCP-1 N1pE及び全mMCP-1の検出のための2つの特徴的な標準曲線を示している。
図20は、mMCP-1ペプチド環化状態が、全mMCP-1のELISA検出を妨げなかったことを実証している。このことは、全マウスMCP-1及びマウスMCP-1 N-1pE ELISA測定の両方の独立性を裏付け、かつ決定されたmMCP-1 N1pE/mMCP-1の比の正確さを立証している。
マウスMCP-1 N1pE/マウスMCP-1の比に対するQCIの影響を分析するために、マウスマクロファージ細胞株RAW264.7を、QC阻害剤QCIの非存在下、又は濃度が増加するQCIの存在下でLPAにより刺激した。mMCP-1 N1pEの量は、QCIによって濃度依存的に減少するが、全mMCP-1の量は、影響を受けないままである。結果として、実施例9の結果と同様に、mMCP-1 N1pE/mMCP-1の比は、阻害剤の濃度の増加と共に増加する(図21を参照されたい)。
QCIの適用後にmMCP-1 N1pEレベルの低下がELISA実験で確認されたことを立証するためにウエスタンブロット分析を行った。この実験は、異なるQCIで処置したRAW264.7細胞培養上清を使用して行った。全mMCP-1を検出する抗体ラット抗マウスMCP-1によって生成されるウエスタンブロットシグナルの強度に変化がない(図22B)。しかしながら、mMCP-1 N1pEのウエスタンブロットシグナルは、濃度依存性であり(図22A)、対応するELISAデータに相関し(図22C)、異なる量のmMCP-1 N1pEを示している。この実験は、代替のアッセイを使用したELISAデータの正確さを実証している。
MCP-1 N1pE抗体348/2C9の抗原hMCP-1(1-38)に対する結合は以下の通りである:
化学量:1.83
解離定数:151nM
反応エンタルピー:-7.679kcal/mol
反応エントロピー:5.01cal/mol・K
ビオチン化反応後、誘導抗体(derivated antibody)の特性は以下のようにシフトした:
化学量:1.41
解離定数:444nM
反応エンタルピー:-11.44kcal/mol
反応エントロピー:-9.96cal/mol・K
活性な抗体タンパク質の消失及び親和性の低下が、ELISA実験(実施例16)に使用された抗体濃度の増加によって補償された。
ビオチン化MCP-1-N1pE抗体の適用により、マウス液体試料中の未知の抗原に対する抗マウスIgG-HRP複合体の潜在的な交差反応性が低下する。ビオチン化MCP-1 N1pE抗体は、活性が30%低下した(図25)。これは、標準ペプチド濃度を3000pg/mlに増加させることによって補償することができる(図24)。
in vivoでのmMCP-1 N1pE/mMCP-1の比に対するQC阻害剤投与の影響をさらに調べるために、QCIを、チオグリコール酸誘発腹膜炎に適用した。
mMCP-1 N1pE/mMCP-1の比の決定の他、腹腔洗浄液の細胞成分を、浸潤する単球(Moma2陽性単球/マクロファージ)を特に重点を置いて決定した。
この実験では、QCIの適用後に、mMCP-1 N1pE/mMCP-1の比が用量依存的に低下した(図23に示されている)。さらに、mMCP-1 N1pEレベルと単球の腹膜への侵入との関係を実証した(図23B)。mMCP-1 N1pE/mMCP-1の比の低下により、腹膜に浸潤する単球の数が減少した。
MCP-1及びMCP-1 N1pEの濃度を、アッセイ内変動が1.8%の1枚のプレート及びアッセイ内変動が2.8%の2枚のプレートで決定した。これは、ヒトCSF及び血清試料の分析についてロバスト性が高いことを示している。得られたELISAシグナルは、全hMCP-1 ELISAのLOQよりも12倍高く、かつhMCP-1 N1pE ELISAのLOQよりも6倍高く、処置又は疾患関連効果を観察する際の、QC阻害剤の存在下又は非存在下での基準MCP-1レベルの尺度を提供する。
Claims (32)
- 炎症性疾患もしくは炎症関連疾患の診断もしくはモニタリング、又はそれらの治療に対する応答の方法であって、生体試料中のMCP-1の総濃度に対するN末端ピログルタミン酸修飾MCP-1の割合を決定する工程を含む、前記方法。
- 前記決定する工程が:
(a)生体試料中のN末端ピログルタミン酸修飾MCP-1の第1の濃度(Ca)を決定する工程;
(b)該生体試料中の全MCP-1の第2の濃度(Cd)を決定する工程;及び
(a)該第1の濃度(Ca)の値を該第2の濃度(Cd)の値で除して、Ca/Cdの比を決定する工程を含む、請求項1記載の方法。 - 前記Ca/Cdの比が、50%、70%、又は85%である、請求項2記載の方法。
- 前記工程(a)が:
(i)生体試料をMCP-1に特異的な捕捉用抗体に接触させる工程、
(i)N末端ピログルタミン酸修飾MCP-1に特異的な検出用抗体を適用する工程、
(iii)得られた免疫複合体を検出する工程、及び
(ii)捕捉されたN末端ピログルタミン酸修飾MCP-1複合体を定量する工程を含む、請求項2記載の方法。 - N末端ピログルタミン酸修飾MCP-1に特異的な前記検出用抗体が:
348/1D4 (寄託番号:DSM ACC 2905);
348/2C9 (寄託番号:DSM ACC 2906);
332/4B8 (寄託番号:DSM ACC 2907);及び
332/4F8 (寄託番号:DSM ACC 2908)からなる群から選択されるハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体を含む、請求項4記載の方法。 - N末端ピログルタミン酸修飾MCP-1に特異的な前記検出用抗体が、348/2C9 (寄託番号:DSM ACC 2906)から選択されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体を含む、請求項5記載の方法。
- 前記工程(b)が:
(i)生体試料をMCP-1に特異的な捕捉用抗体に接触させる工程、
(ii)MCP-1に特異的な検出用抗体を適用する工程、
(iii)得られた免疫複合体を検出する工程、及び
(iv)捕捉されたMCP-1複合体を定量する工程を含む、請求項2記載の方法。 - MCP-1に特異的な前記捕捉用抗体が:
ポリクローナル抗血清ヤギ抗hMCP1-AF (R&D Systems, Minneapolis, USA);
抗MCP-1ウサギポリクローナル抗体ab18072 (Abcam, Cambridge, UK);
抗MCP-1ウサギポリクローナル抗体ab9669 (Abcam, Cambridge, UK);
抗MCP-1ウサギポリクローナル抗体ab18072 (Abcam, Cambridge, UK);
ヤギMCP-1抗体(C-17): sc-1304 (Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz, USA);
ポリクローナル抗血清ウサギ抗mJE (Peprotech, Hamburg, Germany);
抗mMCP-1ウサギポリクローナル抗体ab9899 (Abcam, Cambridge, UK);
抗MCP-1ウサギポリクローナル抗体ab7202 (Abcam, Cambridge, UK);及び
ラットモノクローナルMCP-1抗体(JJ5): sc-74215 (Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz, USA)を含む、請求項7記載の方法。 - MCP-1に特異的な前記捕捉用抗体が、ポリクローナル抗血清ヤギ抗hMCP1-AFを含む、請求項8記載の方法。
- MCP-1に特異的な前記検出用抗体が:
マウス抗hMCP-1 (Peprotech, Hamburg, Germany);
抗MCP-1マウスモノクローナル抗体ab17715 (Abcam, Cambridge, UK);
マウスモノクローナルMCP-1抗体sc-32819 (Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz, USA);
抗マウスMCP-1 (R&D Systems, Minneapolis, MN USA);
ハムスターモノクローナルMCP-1抗体ab21397 (Abcam, Cambridge, UK);
ラットモノクローナルMCP-1抗体ab8101 (Abcam, Cambridge, UK);及び
ラットモノクローナルMCP-1抗体(JJ5): sc-74215 (Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz, USA)を含む、請求項7記載の方法。 - 前記複合体の前記検出工程が、特に各検出用抗体と反応する二次抗体を使用して行われる、請求項4〜10のいずれか1項記載の方法。
- 前記二次抗体が、抗マウス抗体又は抗ウサギ抗体である、請求項11記載の方法。
- 前記二次抗体が抗マウス抗体である、請求項12記載の方法。
- 前記二次抗体が標識されている、請求項11〜13のいずれか1項記載の方法。
- 前記二次抗体が、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)で標識されている、請求項14記載の方法。
- 前記検出された免疫複合体が定量される、請求項4〜15のいずれか1項記載の方法。
- 前記捕捉された複合体が:ELISA、例えば、間接ELISA、サンドイッチELISA、競合ELISA、逆ELISA、酵素結合免疫吸着スポットアッセイ;フローサイトメトリー;Multiplex Assay Systems;免疫組織化学;免疫沈降;及びウエスタンブロット分析からなる群から選択される定量手段によって定量される、請求項4〜16のいずれか1項記載の方法。
- 前記捕捉された複合体が、定量手段としてサンドイッチELISAによって定量される、請求項17記載の方法。
- 前記生体試料が、血液、血清、尿、脳脊髄液(CSF)、血漿、リンパ液、唾液、汗、胸膜液、滑液、涙液、胆汁、及び膵臓分泌液からなる群から選択される、請求項1〜18のいずれか1項記載の使用又は方法。
- 前記生体試料が血清である、請求項19記載の方法。
- 生体試料中のグルタミニルシクラーゼ(QC)阻害剤の有効性、並びにQC阻害剤の適用による治療におけるグルタミニルシクラーゼ(QC)阻害剤の代理マーカーとしての有効性を決定する方法。
- 生体試料中のMCP-1の総濃度に対するN末端ピログルタミン酸修飾MCP-1の割合を決定する方法であって:
(a)生体試料中のN末端ピログルタミン酸修飾MCP-1の第1の濃度(Ca)を決定する工程;
(b)該生体試料中の全MCP-1の第2の濃度(Cd)を決定する工程;及び
(c)該第1の濃度(Ca)の値を該第2の濃度(Cd)の値で除して、Ca/Cdの比を決定する工程を含む、前記方法。 - グルタミニルシクラーゼ(QC)阻害剤をスクリーニングする方法であって:
(a)MCP-1及びグルタミニルシクラーゼ(QC)を含む対照試料をインキュベートして、MCP-1の総濃度に対するN末端ピログルタミン酸修飾MCP-1の割合を決定する工程;
(b)MCP-1及びグルタミニルシクラーゼ(QC)を含む混合物並びにグルタミニルシクラーゼ(QC)阻害剤と共に対照試料をインキュベートして、MCP-1の総濃度に対するN末端ピログルタミン酸修飾MCP-1の割合を決定する工程を含み;
該工程(a)に対する該工程(b)におけるN末端ピログルタミン酸修飾MCP-1:全MCP-1の比の低下が、グルタミニルシクラーゼの阻害を示す、前記方法。 - グルタミニルシクラーゼ(QC)阻害剤の有効性を測定する方法であって、MCP-1及びグルタミニルシクラーゼ(QC)を含む混合物と共にグルタミニルシクラーゼ(QC)阻害剤をインキュベートして、MCP-1の総濃度に対するN末端ピログルタミン酸修飾MCP-1の割合を決定する工程を含む、前記方法。
- 炎症性疾患又は炎症関連疾患を診断するキットであって、N末端ピログルタミン酸修飾MCP-1に特異的な捕捉用抗体、MCP-1に特異的な捕捉用抗体、及び請求項1〜20のいずれか1項記載の方法に従って該キットを使用するための取扱説明書を含む、前記キット。
- 炎症性疾患もしくは炎症関連疾患を有する、該疾患の疑いがある、又は該疾患に罹りやすい対象における治療効果をモニタリングする方法であって、被験者由来の生体試料において、請求項1〜20のいずれか1項記載の、MCP-1の総濃度に対するN末端ピログルタミン酸修飾MCP-1の割合を決定する工程を含む、前記方法。
- 被験者から2回以上にわたって採取された生体試料において、MCP-1の総濃度に対するN末端ピログルタミン酸修飾MCP-1の割合を決定する工程を含む、請求項1〜20又は26のいずれか1項記載の診断又はモニタリング方法。
- 2回以上にわたって採取された前記生体試料において、MCP-1の総濃度に対するN末端ピログルタミン酸修飾MCP-1の割合を比較する工程を含む、請求項27記載の診断又はモニタリング方法。
- 前記炎症性疾患又は前記炎症関連疾患が、神経変性疾患、慢性及び急性炎症、線維症、癌、代謝病、他の炎症性疾患、又は高血圧症及び肥満に関連した病状から選択される、請求項1〜28のいずれか1項記載の使用、方法、又はキット。
- アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、喘息、遅延型過敏反応、膵炎、アルツハイマー病、肺線維症、腎線維症、妊娠中毒症、移植片拒絶反応、神経因性疼痛、糖尿病性ネフロパシー、大腸炎、脳卒中、AIDS、及び腫瘍の検出並びに診断のための請求項29記載の使用、方法、又はキット。
- アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、再狭窄、及び膵炎の検出並びに診断のための請求項29又は30記載の使用、方法、又はキット。
- アルツハイマー病又は関節リウマチの検出及び診断のための請求項29〜31のいずれか1項記載の使用、方法、又はキット。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US30572110P | 2010-02-18 | 2010-02-18 | |
US61/305,721 | 2010-02-18 | ||
PCT/EP2011/052398 WO2011101433A1 (en) | 2010-02-18 | 2011-02-18 | Methods of diagnosing inflammatory diseases by determining pyroglutamate-modified mcp-1 and screening methods for inhibitors of glutaminyl cyclase |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013519891A true JP2013519891A (ja) | 2013-05-30 |
Family
ID=43663595
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012553327A Pending JP2013519891A (ja) | 2010-02-18 | 2011-02-18 | ピログルタミン酸修飾mcp−1を決定することにより炎症性疾患を診断する方法及びグルタミニルシクラーゼの阻害剤のスクリーニング方法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20110212853A1 (ja) |
EP (1) | EP2537029A1 (ja) |
JP (1) | JP2013519891A (ja) |
CN (1) | CN102947705A (ja) |
CA (1) | CA2789091A1 (ja) |
SG (1) | SG182615A1 (ja) |
WO (1) | WO2011101433A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017170993A1 (ja) * | 2016-03-31 | 2017-10-05 | 古河電気工業株式会社 | 細胞収容チップ及び該細胞収容チップを用いたスクリーニング方法 |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8338120B2 (en) * | 2003-05-05 | 2012-12-25 | Probiodrug Ag | Method of treating inflammation with glutaminyl cyclase inhibitors |
WO2013067420A1 (en) * | 2011-11-03 | 2013-05-10 | Tumlin James A | Acth for treatment of kidney disease |
DE102015011780A1 (de) | 2015-09-16 | 2017-03-16 | Hochschule Anhalt | Neue Glutaminylcyclase-lnhibitoren |
SE543211C2 (en) * | 2017-06-29 | 2020-10-27 | Mabtech Production Ab | Method and system for analyzing Fluorospot assays |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005536534A (ja) * | 2002-08-19 | 2005-12-02 | アブジェニックス・インコーポレーテッド | 単球走化性タンパク質−1(mcp−1)に対する抗体、およびその使用 |
JP2006525278A (ja) * | 2003-05-05 | 2006-11-09 | プロビオドルグ エージー | グルタミニル、及びグルタミン酸シクラーゼのエフェクターの使用 |
JP2007508347A (ja) * | 2003-10-15 | 2007-04-05 | プロビオドルグ エージー | グルタミニル、及びグルタミン酸シクラーゼのエフェクターの使用 |
WO2008104580A1 (en) * | 2007-03-01 | 2008-09-04 | Probiodrug Ag | New use of glutaminyl cyclase inhibitors |
JP2010504088A (ja) * | 2006-09-21 | 2010-02-12 | プロビオドルグ エージー | グルタミニルシクラーゼに関連した新規遺伝子 |
Family Cites Families (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4737456A (en) | 1985-05-09 | 1988-04-12 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Reducing interference in ligand-receptor binding assays |
US20050148507A1 (en) * | 2003-05-02 | 2005-07-07 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Method for the production of an N-terminally modified chemotactic factor |
JP4806628B2 (ja) | 2003-05-05 | 2011-11-02 | プロビオドルグ エージー | グルタミニルシクラーゼ阻害剤 |
AU2005210004B2 (en) | 2004-02-05 | 2010-10-28 | Probiodrug Ag | Novel inhibitors of glutaminyl cyclase |
EP2089383B1 (en) | 2006-11-09 | 2015-09-16 | Probiodrug AG | 3-hydr0xy-1,5-dihydr0-pyrr0l-2-one derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase for the treatment of ulcer, cancer and other diseases |
US7741354B2 (en) | 2006-11-09 | 2010-06-22 | Probiodrug Ag | Inhibitors of glutaminyl cyclase |
JP5456479B2 (ja) | 2006-11-09 | 2014-03-26 | プロビオドルグ エージー | グルタミニルシクラーゼの新規阻害剤 |
US9126987B2 (en) | 2006-11-30 | 2015-09-08 | Probiodrug Ag | Inhibitors of glutaminyl cyclase |
EP2118101B1 (en) | 2007-03-09 | 2012-09-26 | Probiodrug AG | Imidazo [1,5-a] pyridine derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase |
EP2160380B1 (en) | 2007-04-18 | 2014-04-02 | Probiodrug AG | Cyano-guanidine derivatives as glutaminyl cyclase inhibitors |
US9656991B2 (en) | 2007-04-18 | 2017-05-23 | Probiodrug Ag | Inhibitors of glutaminyl cyclase |
EP2142513B1 (en) | 2007-04-18 | 2014-03-12 | Probiodrug AG | Nitrovinyl-diamine derivatives as glutaminyl cyclase inhibitors |
WO2008128986A1 (en) | 2007-04-18 | 2008-10-30 | Probiodrug Ag | Urea derivatives as glutaminyl cyclase inhibitors |
EP2160389B1 (en) | 2007-04-18 | 2014-03-12 | Probiodrug AG | Thioxoquinazolinone derivatives as glutaminyl cyclase inhibitors |
EP2142536B1 (en) | 2007-04-20 | 2015-10-21 | Probiodrug AG | Aminopyrimidine derivatives as glutaminyl cyclase inhibitors |
SG193148A1 (en) * | 2008-07-31 | 2013-09-30 | Probiodrug Ag | Glutaminyl cyclase as a diagnostic / prognostic indicator for neurodegenerative diseases |
PL2328930T3 (pl) * | 2008-08-20 | 2015-05-29 | Probiodrug Ag | Przeciwciała skierowane przeciwko piroglutaminianowi białka chemotaktycznego monocytów typu 1 (MCP-1 N1pE) |
-
2011
- 2011-02-18 CN CN2011800099562A patent/CN102947705A/zh active Pending
- 2011-02-18 CA CA2789091A patent/CA2789091A1/en not_active Abandoned
- 2011-02-18 US US13/030,258 patent/US20110212853A1/en not_active Abandoned
- 2011-02-18 JP JP2012553327A patent/JP2013519891A/ja active Pending
- 2011-02-18 EP EP11703712A patent/EP2537029A1/en not_active Withdrawn
- 2011-02-18 WO PCT/EP2011/052398 patent/WO2011101433A1/en active Application Filing
- 2011-02-18 SG SG2012053518A patent/SG182615A1/en unknown
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005536534A (ja) * | 2002-08-19 | 2005-12-02 | アブジェニックス・インコーポレーテッド | 単球走化性タンパク質−1(mcp−1)に対する抗体、およびその使用 |
JP2006525278A (ja) * | 2003-05-05 | 2006-11-09 | プロビオドルグ エージー | グルタミニル、及びグルタミン酸シクラーゼのエフェクターの使用 |
JP2007508347A (ja) * | 2003-10-15 | 2007-04-05 | プロビオドルグ エージー | グルタミニル、及びグルタミン酸シクラーゼのエフェクターの使用 |
JP2010504088A (ja) * | 2006-09-21 | 2010-02-12 | プロビオドルグ エージー | グルタミニルシクラーゼに関連した新規遺伝子 |
WO2008104580A1 (en) * | 2007-03-01 | 2008-09-04 | Probiodrug Ag | New use of glutaminyl cyclase inhibitors |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017170993A1 (ja) * | 2016-03-31 | 2017-10-05 | 古河電気工業株式会社 | 細胞収容チップ及び該細胞収容チップを用いたスクリーニング方法 |
CN108885211A (zh) * | 2016-03-31 | 2018-11-23 | 古河电气工业株式会社 | 细胞收纳芯片和使用该细胞收纳芯片的筛选方法 |
JPWO2017170993A1 (ja) * | 2016-03-31 | 2019-02-14 | 古河電気工業株式会社 | 細胞収容チップ及び該細胞収容チップを用いたスクリーニング方法 |
US11975326B2 (en) | 2016-03-31 | 2024-05-07 | Yamato Scientific Co., Ltd. | Cell accommodating chip and screening method using the cell accommodating chip |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102947705A (zh) | 2013-02-27 |
WO2011101433A1 (en) | 2011-08-25 |
US20110212853A1 (en) | 2011-09-01 |
SG182615A1 (en) | 2012-08-30 |
EP2537029A1 (en) | 2012-12-26 |
CA2789091A1 (en) | 2011-08-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6772237B2 (ja) | ブラジキニン媒介障害の評価および治療 | |
JP7135039B2 (ja) | 血漿カリクレイン系バイオマーカーを決定するためのアッセイ | |
CN110208533B (zh) | Pkal-介导的病症的评估、测定和治疗 | |
Zhao et al. | Chemerin158K protein is the dominant chemerin isoform in synovial and cerebrospinal fluids but not in plasma | |
JP5819194B2 (ja) | ピログルタミン酸化単球走化性タンパク質−1(MCP−1N1pE)に対する抗体 | |
JP7399096B2 (ja) | 神経変性を検出するためのアッセイ | |
JP2014521098A (ja) | 病理学バイオマーカーアッセイ | |
JP2013519891A (ja) | ピログルタミン酸修飾mcp−1を決定することにより炎症性疾患を診断する方法及びグルタミニルシクラーゼの阻害剤のスクリーニング方法 | |
CN108291917B (zh) | 检测裂解的高分子量激肽原的免疫测定方法 | |
US9657089B2 (en) | Diagnostic antibody assay | |
KR20220145866A (ko) | ADM-Gly/bio-ADM 비가 한계값 초과인 환자에서 ADM-Gly의 bio-ADM으로의 전환 가속화를 위한, 유리 N-말단에 결합하는 항-ADM-항체 및 이와 비타민 C의 조합물 | |
CN114364984A (zh) | 一种诊断或监测儿科患者的肾功能或诊断肾功能障碍的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20140206 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20140926 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20141028 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20150123 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20150901 |