EA023612B1

EA023612B1 - Способ оценки эффекта физического воздействия на целостность формируемой пленки

Info

Publication number: EA023612B1
Application number: EA201390907A
Authority: EA
Inventors: Тьерри Бернарди; Паскаль Майер; Жером Грелли
Original assignee: Биофильм Контроль
Priority date: 2010-12-21
Filing date: 2011-12-21
Publication date: 2016-06-30
Also published as: WO2012085468A2; WO2012085468A3; US10006072B2; CN103403176A; FR2969298B1; EP2655652A2; EP2655652B1; US20140051108A1; FR2969298A1; CN103403176B; EA201390907A1; ES2547130T3; PT2655652E

Abstract

Изобретение относится к способу оценки эффекта физического воздействия на целостность формируемой пленки. В частности, изобретение относится к способу оценки эффекта физического воздействия, например механического, гидродинамического, физического, на целостность формируемой пленки, например пленки, образованной микроорганизмами, продуктами питания и/или химическими веществами. Изобретение находит применение, в частности, в области биологии, химии, биотехнологии, агропищевой промышленности. Способ позволяет сократить время, уменьшить количество приборов, используемых для этого способа, снизить стоимость и улучшить детектирование эффекта.

Description

Настоящее изобретение относится к способу оценки эффекта ударного воздействия на пленку. В частности, настоящее изобретение относится к способу оценки эффекта ударного воздействия, например механического, гидродинамического, физического, химического или биологического, на целостность пленки.

Настоящее изобретение находит применение, в частности, в области биологии, химии, биотехнологии.

Известный уровень техники

Существует множество покрытий или тонких слоев инертных или живых (биологических) веществ, связанных с подложками, например краски, лаки, пленки, состоящие из макромолекул, биопленки микроорганизмов и различных клеток, например бактерий, дрожжей, водорослей, клеток многоклеточных организмов. В продолжение обозначим эти слои и покрытия на подложке термином пленка.

Среди этих пленок большое число образуется постепенно, с течением времени, например, в результате полимеризации мономеров, агрегации или взаимопроникновения макромолекул, роста биопленок микроорганизмов, мультипликации клеток и/или продуцирования веществ, соединяющих клетки между собой.

Это образование часто может быть модулировано различными веществами или физическими параметрами, воздействие которых полезно знать. Пленка может быть также модифицирована после ее образования под действием физико-химической обработки, например, поверхностно-активными веществами, растворителями, излучениями, например тепловым воздействием и т.д.

Все эти воздействия могут приводить к пленкам, для которых может быть интересным знать устойчивость к гидродинамическому воздействию, просто интересоваться, может ли эта пленка еще образоваться или она разрушена. В продолжение этого документа эти свойства обозначают термином целостность.

Известные способы позволяют сравнить целостность пленок различной природы, полученных различными способами и полученных в результате различных обработок.

Например, в одном из известных способов используют подложку, цвет которой отличается от цвета пленки. Таким образом, когда пленки образованы на этой подложке, специалисту в данной области легко измерить целостность после, например, гидродинамического воздействия, физико-химической обработки и/или модулирования ее образования путем анализа записи изображения.

Однако существуют также прозрачные пленки или пленки, которые не могут быть окрашены, например живые пленки, пленки, образованные микроорганизмами, пленки, образующиеся в результате полимеризации или агрегации, для которых вещество, используемое для окрашивания, может оказывать влияние на их формирование.

В известном уровне техники существуют способы измерения целостности пленки, исходя, например, из ее физических свойств, таких как ее показатель преломления, например в δίη§Η с1 а1. РЬувюа δοτίρία. Уо1. 65, 167-1 80 (2002): РсГгасОус 1п6ех МеавигешеШ апб Не АррНсайопв [РеГ. 1] и в Уогов с1 а1. Вюрйу5юа1 1оигпа1, Уо1. 87, 553-561 (2004): ТНе бепвйу апб РеГгасНуе 1п6ех оГ АбвогЫпд Рго1ет Ьауегв [КеГ. 2].

Однако эти способы являются дорогими в исполнении и требуют подготовки и высококвалифицированного персонала, а также новейшего и дорогостоящего оборудования.

Есть ситуации, например, в области медицины или в области биологии, в которых необходимо измерять целостность большого числа различных пленок в присутствии химических соединений, биологических молекул, термодинамических модификаций и т.п. Например, бывает необходимо оценить полезное действие соединения на биопленки или воздействие, например разложение, на модификацию или полезное действие фермента на пленку из полимеров.

В этих ситуациях, например, в связи с кампаниями отбора молекул или ферментов, активных в отношении биопленок, например, для оценки эффективности антибиотиков на биопленках в рамках медицинского обслуживания, методики, описанные перед этим, являются неудовлетворительными, так как они не позволяют специалистам в данной области осуществить измерения в достаточно быстром темпе.

Кроме того, известные способы требуют применения большого числа приборов, которые не могут быть одновременно использованы в способе отбора. Кроме того, используемые приборы дорогие и требуют наличия квалифицированного персонала.

Кроме того, время получения результатов известными способами очень значительное и может требовать добавления реагентов, которые могут изменить результат и, следовательно, повлечь за собой их изменение и невоспроизводимость.

Таким образом, существует реальная потребность найти способ измерения эффекта воздействия на пленку, сглаживающий эти недостатки, неудобства и препятствия известного уровня техники, в частности способ, позволяющий сократить время, уменьшить количество приборов, используемых для этого способа, снизить стоимость и улучшить детектирование эффекта.

- 1 023612

Описание изобретения

Способ согласно настоящему изобретению дает возможность устранить недостатки, неудобства и препятствия известного уровня техники, указанные перед этим.

В частности, объектом настоящего изобретения является способ измерения эффекта по меньшей мере одного воздействия на пленку, включающий в себя следующие стадии:

a) введение в раствор по меньшей мере одного вещества, способного образовывать пленку;

b) введение в раствор, полученный на стадии (а), по меньшей мере двух частиц, причем указанные частицы покоятся на поверхности 8, погруженной в указанный раствор;

c) перераспределение частиц на указанной погруженной поверхности 8, при этом указанные частицы образуют на указанной поверхности точку или пятно;

ά) формирование указанной пленки на основе указанного вещества; е) наблюдение точки или пятна на поверхности 8;

1) приложение механического и/или физического воздействия к указанному раствору; д) наблюдение на пленке эффекта воздействия, приложенного на стадии (ί), наблюдением точки или пятна на поверхности 8;

й) определение эффекта воздействия, приложенного к пленке, сравнением наблюдений на вышеупомянутых стадиях (е) и (д).

Согласно изобретению вещество, способное образовывать пленку, может представлять собой, например, микроорганизмы, продукты питания, химические вещества, синтетические макромолекулы, коллоиды и эмульсии, объекты микроскопического и нанометрового размера.

Такими веществами могут быть, например, эукариотические клетки животных, например клетки крови, например лейкоциты, например гранулоциты, полиядерные нейтрофилы; полиядерные эозинофилы; полиядерные базофилы; лимфоциты В, лимфоциты Т; лимфоциты ΝΚ, моноциты, эритроциты, тромбоциты. Равным образом, такими веществами могут быть растительные эукариотические клетки, например клетки растительного эпидермиса, ксилемы, флоэмы, паренхимы, колленхимы, склеренхимы. Равным образом, такими веществами могут быть грибы, дрожжи. Такими веществами могут быть, например, СапШба. Сгур1ососсик, Ма1акке/1а, РШгокрогит, Рпеитосукйк, ЕрШегто-рйуШп, Мюгокрогит ТпсйорйуЮп. Равным образом, такими веществами могут быть, например, протозоэры, например Еи1ашоеЬа Н1к1о1уйса, ЛсаШйашоеЬа сак1е11апи, №-1ед1епа Го^1ег1.

Равным образом, такими веществами могут быть прокариотические клетки, например любая бактерия, известная специалистам в данной области, например бактерии, входящие в группу, без того, чтобы быть ею ограниченной, состоящую из ЛсеЮЬасЮг аигапйик, ЛсйпоЬасйик асйиотусе1етсотйаи5, ЛдгоЬас1егшт ШтегЕашепк, Л/огЫ/оЬшт саийпойапк, Л/о1оЬас1ег уше1апйп, ВасШик апШгаак, ВасШик Ьгеу1к, ВасШиксегеик, ВасШик 1икйогш1к, ВасШик ЕсЬепШогтзк, ВасШик теда1егшт, ВасШик йеагоШгторййик, ВасШик киЫШк, Вас1егоШек дшдуайк, Вас1егоШек ше1аη^ηодеη^сик. Вайопейа йепке1ае, Вайопейа дшйапа, Вогйе1е11а ЬгопсЫкерйса, Вогйе1е11а рейикшк, Воггейа Ьигдйойей, Вгапйате11а са!аггйайк, Вгисе11а аЬойик, Вгисе11а теШепык, Вгисе11а кшк, ВигкйоШейа таПер Вигкйо1йейа ркеийота11е1 Са1утта1оЬас1ейит дгапШотайк, Сатру1оЬас1ег _)е.)иш, Сатру1оЬас1ег ру1оп, СЫапиШа рпеитоша, Сй1аинШа ркШасц СЫапиШа йапсйотайк, Сй1атуйорййа рпеутошае, Сй1атуйорййа ркШасц С1окйтйшт ЬоШйпит, С1окйтйшт ФЕйсйе, С1окйтШит регйшдепк, С1окйтШит 1е1апк С1окйтШит те1сйй, СогупеЬас1егшт Еикйогш, Сох1е11а ЬигпеШ, Ейпс1на сйайеепык, Еп1егососсик аушт, Ейегососсик йигапк, Еп1егососсик Еаесайк, Ейегососсик Еаесшт, Еп1егососсик даШпагит, Ейегососсик та1ога!ик, ЕксйейсЫа сой, Ргапшкейа 1и1агепк1к, РикоЬас1егшт пис1еа1ит, ОагйпегеИа уад1пайк, Наеторййик йисгеуц Наеторййик 1пйиеп7а, Наеторййик рагазпйиеп/ае, Наеторййик рейикык, Наеторййик уад1пайк, НейсоЬасЮг ру1оп, К1еЬк1е11а рпеитоша, К1еЬк1е11а г1нпокс1еготайк- к1еЬкте11а охуЮса, ЙасЮЬасШик асШорййик, ЙасЮЬасШик саке1, ЙасЮсоссик 1асйк, Ьедюпейа рпеиторййа, МеШапоЬасЮгШт ехйодиепк, МеШапоЬасЮгшт тиййогт, Мюгососсик 1и1еик, МюоЬасЮгШт аушт, МюоЬасЮгшт Ьоу1к, МюоЬасЮгшт ШрЫейае, МюоЬасЮгшт ш1гасе11и1аге, МюоЬасЮгшт 1ергае, МюоЬасЮгшт 1ергаетигшт, МюоЬасЮгшт рй1ет, МюоЬасЮгшт ктедтайк, МюоЬасЮгшт шЬегсШоык, Мюор1акта йегтейапк, Мюор1актадепйа1шт, Мюор1акта йотЫк, Мюор1акта рпеитоша, №йкепа допоггйоеае, №1ккейа тетпдШйек, ШсагШа айегоШк, Рак1еиге11а тиЙосШа, Рак1еиге11а 1и1агепк1к, Рогрйуготопак дшд1уайк, Ркеийотопак аегидшока, Ркеийотопак таЙорйШа, ВШ/оЬШт гайюЬасЮг, Рюкейыа рго^а/екЕ, Кюкейыа тоокегк Рюкейыа ркШасц Рюкейыа дшпкапа, Рюкейыа йскейыа, Рюкейыа кгасйотае, Росйайтаеа йепке1ае, Росйайтаеа дшпкапа, Война йепкосапока, 8а1топе11а епкегШШк, 8а1топе11а 1урЫ, 8а1топе11а курЫтигшт, 8еггайа тагсексепк, 8й1де11а йукепкейае, 81арйу1ососсик аигеик, 8карйу1ососсик ерШеткФк, 8йерЮососсик ада1асйае, 8йерЮсоссик аушт, 81гер1оососсик Ьоу1к, 8йерЮососсик сйсекик, 8ΐ^ерΐоососсикίасе^иш, 8йерЮососсик йаесайк, 81герЮососсик Еегик, 8ί^ерΐоососсикдаШηа^иш, 81герЮососсик 1асйк, 81герЮососсик шйюг, 81герЮососсик шШк, 8йерЮососсик тикапк, 8йерЮососсикогаИк, 81герЮососсик рпеитоша, 81гер1оососсик руодепек, 8йерЮососсик гайиа, 8йерЮососсиккайуайик, 81гер1оососсик капдшк, 81гер1оососсик коЬгшик, Тгеропета райШит, УФпо сйо1ега, УФпо сотта, УШйо рагайето1уйсик, УФпо уШшйсик, Хаййотопак таЙорйШа, Уегкйна епкегосоШйса, Уегкйна рекйк и Уегкйна ркеийокиЬегсШоык и т.д.

- 2 023612

Под коллоидами и эмульсиями подразумевают вещество в форме жидкости или полутвердое вещество, которое содержит частицы, достаточно малые для того, чтобы смесь была гомогенной. Этим веществом может быть любой коллоид и любая эмульсия, известные специалистам в данной области. Например, это может быть любое вещество или состав, содержащий две разные фазы. Например, это может быть жидкость, содержащая суспензию частиц, например липосом, капелек, агрегатов, которые могут иметь характерный размер, например от 2 до 200 нм, например от 201 нм до 5 мкм. Например, это могут быть наноэмульсии, молоко, сливки, масло, майонез, увлажняющий крем, глины, коллоидное золото или коллоидное серебро, синтетические эмульсии типа масло-в-воде, феррожидкость-в-воде, вода-в-масле.

Согласно изобретению под синтетическими макромолекулами подразумевают химические и/или модифицированные природные молекулы с высокой молекулярной массой, например молекулярной массой от 1 до 1000 кДа, например полистиролсульфонат, полиэтиленгликоль.

Согласно изобретению под биологическими макромолекулами подразумевают все биологические молекулы с высокой молекулярной массой, например с молекулярной массой от 5 до 1000 кДа. Биологические макромолекулы могут представлять собой, например, сочетания, например, при помощи ковалентных связей, из природных молекул, нуклеиновых кислот, таких как ДНК (ΑΌΝ) и РНК (ΆΚΝ), полисахаридов, таких как декстран, целлюлоза, крахмал, протеинов, таких как актин, фибриноген и фибрин.

Согласно изобретению под объектами микроскопического размера подразумевают любое вещество и/или объект, известный специалистам в данной области, размер которого составляет от 1 до 1000 мкм, предпочтительно от 1 до 100 мкм.

Согласно изобретению под объектами нанометрового размера подразумевают любую частицу, известную специалистам в данной области, размер которой меньше 1 мкм и/или 1000 нм, например от 50 до 950 нм, от 1 до 100 нм.

Согласно изобретению пленка может быть получена, например, полимеризацией мономеров с образованием ковалентных связей, мультимеризацией протеинов с образованием ковалентных связей, например дисульфидных мостиков, пептидных связей, с образованием нековалентных связей, например солевых мостиков, водородных связей, сил Ван дер Вальса, седиментацией микроорганизмов, мультипликацией микрорганизмов на поверхности, секрецией полимеров этими микроорганизмами, например нуклеиновых кислот, протеинов, полисахаридов, полимеризацией протеинов, например плазматических протеинов, клеточных протеинов.

Пленка может быть также получена полимеризацией мономеров, например акриламида, бисакриламида, этилена, пропилена, винила, аминокислот; осаждением эмульсии на поверхность, например краски, лака, образованием гидрогелей или аэрогелей, например агарозы, агара, желатины, например аэрогеля диоксида кремния, оксида алюминия, оксида хрома или оксида олова, ЗеаСе1 ТМ.

Согласно изобретению пленка может быть также получена испарением/лиофилизацией растворов, например раствора протеинов, ДНК, жира, растворенного в растворителе, например эмульсий, например краски, лака, заменой фаз жидкие/твердые, индуцированной, например, изменением температуры, например, с расплавленным маслом, увлажняющим кремом, жиром.

Согласно изобретению оказываемое воздействие может быть механическим, гидродинамическим или физическим воздействием.

Согласно изобретению приложение воздействия может осуществляться, например, от 1 до 24 ч, от 1 до 60 мин, от 1 до 5 мин, от 1 до 60 с.

Согласно изобретению под механическими воздействиями подразумевают, например, применение кисти, шпателя, диска, попеременно перемещаемого вдоль поверхности, приводимого во вращательное движение или движение по кругу, приложение давления.

Согласно изобретению под гидродинамическими воздействиями подразумевают, например, приведение во вращательное движение, например, при помощи мешалки, например, со скоростью вращения от 0,1 до 1000 об/мин, от 5 до 300 об/мин и/или применение струи жидкости или газа, например, с насосом, причем струя жидкости или газа может быть, например, под давлением от 1,01 до 10 бар, предпочтительно от 1,1 до 2 бар.

Согласно изобретению под физическими воздействиями подразумевают, например, облучение, например, электромагнитным излучением, например применение светового пучка с длиной волны от 10 нм до 100 мкм, от 100 нм до 1 мкм. Пучок может иметь интенсивность, например, от 0,01 до 100 Вт, от 0,1 до 10 Вт. Равным образом облучение может быть осуществлено, например, бомбардировкой частицами, например ядерными частицами, например нейтронами, электронами, ускоренными частицами, выходящими из ускорителя частиц, радиоактивного источника, например частицами вещества, например песка, например, диаметром от 50 до 500 мкм, соли, например, диаметром от 50 до 500 мкм, металла, например меди, железа, цинка, алюминия, например, диаметром от 10 до мкм.

Предпочтительно указанное по меньшей мере одно воздействие, применяемое в способе, согласно изобретению представляет собой гидродинамическое воздействие.

Согласно изобретению способ может включать в себя, независимо, применение по меньшей мере двух, по меньшей мере трех воздействий, описанных перед этим. Например, способ согласно изобретению может включать в себя применение гидродинамического воздействия и электромагнитного воздей- 3 023612 ствия, например облучение ультрафиолетовыми лучами и последующее, например, приведение во вращательное движение, облучение бета-частицами и последующее, например, применение струи воды.

Раствор, который может быть использован в настоящем изобретении, может представлять собой жидкий раствор или газ. Раствор может представлять собой любой раствор, известный специалистам в данной области. Например, он может представлять собой культуральную среду, например культуральную среду эукариотических и/или прокариотических клеток, буферную среду, например, любую буферную среду, известную специалистам в данной области, например буферную среду, доступную в продаже, например фосфатно-солевой буфер ФСБ (РВ8), биологический образец, например образец крови, плазмы, мочи, спинномозговую жидкость, солевой раствор, например физиологический раствор, культуральную среду, например среду с сердечно-мозговой вытяжкой, доступную в продаже, растворитель, например ацетон, диметилсульфоксид, этанол, метанол, пропанол, ацетонитрил, этилацетат, простой эфир, фенол, хлороформ, тетрагидрофуран, дихлорэтилен и/или углеводород, например гексан, циклогексан, бензол, октан, декан, нефть, бензин, дизельное топливо. Согласно изобретению газ может представлять собой, например, воздух, кислород, азот, неон, аргон, углекислый газ, метан, озон. Согласно изобретению жидкий раствор может иметь плотность от 0,1 до 4 кг/л, от 0,3 до 3 кг/л, газообразный раствор мо15 310 35 3 жет иметь плотность от 10^- до 1000 кг/м , от 10^- до 30 кг/м , от 10^- до 3 кг/м .

Специалист в данной области, исходя из этих общих знаний, сможет легко определить плотность раствора. Например, измерение плотности раствора может быть осуществлено, например, измерением отношения массы к объему, например взвешивая раствор известного объема.

Согласно изобретению раствор может быть предварительно обработан, например раствор может быть очищен, разбавлен, концентрирован.

Согласно изобретению раствор может быть очищен любым способом, известным специалистам в данной области, например диализом, фильтрованием, ультрафильтрованием, осветлением и центрифугированием. Например, процесс фильтрования может включать пропускание раствора через молекулярное сито с порами от 0,2 до 100 мкм, процесс ультрафильтрации может включать, например, центрифугирование со скоростью от 1 до 3000 об/мин в течение времени от 0,1 до 30 мин, процесс диализа может представлять собой, например, процесс, содержащий стадию осаждения раствора на диализной мембране, например, с порогом разделения 500 Да, при этом указанная мембрана плавает на дистиллированной воде, содержащейся в сосуде. Процесс осветления может представлять собой, например, процесс, включающий в себя добавление в раствор 0,1% (мас./мас.) бычьего сывороточного альбумина.

Согласно изобретению очистка раствора может дать возможность благоприятно удалить из раствора любой загрязнитель и/или молекулы, способные повредить определению эффекта, например очистка может дать возможность независимо удалить бактерии, вирусы, протеины, химические молекулы, соли, частицы материалов, агрегаты молекул. Разумеется, специалисты в данной области, опираясь на эти общие знания, будут приспосабливать способ очистки в зависимости от раствора.

Согласно изобретению раствор может быть также разбавлен, например, любым способом, известным специалистам в данной области, например последовательным разбавлением. Разбавление может быть осуществлено любым разбавителем, известным специалистам в данной области. Разбавитель может представлять собой, например, буферный раствор, например фосфатно-солевой буфер, солевой раствор, например физиологическую сыворотку, этанол, ДМСО (ΌΜ8Θ), ацетон, гексан и/или любой растворитель, углеводород или раствор, описанный перед этим.

Раствор может быть разбавлен, например, с коэффициентом от 2 до 20000, от 5 до 500, от 5 до 50.

Разбавление раствора может дать возможность благоприятно изменить концентрацию компонентов, присутствующих в растворе, например уменьшить концентрацию, например разбавление может дать возможность уменьшить концентрацию протеинов. Разбавление может также позволить уменьшить концентрацию возможных мешающих соединений и, таким образом, выгодно улучшить специфичность и/или чувствительность способа согласно изобретению.

Согласно изобретению раствор может быть также концентрирован, например, любым способом, известным специалистам в данной области, например ультрацентрифугированием, ультрафильтрацией, испарением, лиофилизацией.

Согласно изобретению очистка, разбавление и/или концентрирование указанного раствора может благоприятно дать возможность регулировать плотность указанного раствора.

Регулирование плотности раствора дает возможность выгодно улучшить чувствительность способа согласно изобретению, в частности увеличивая, уменьшая или аннулируя действие силы тяжести, которая толкает частицы к поверхности.

Согласно изобретению объем раствора, используемый в способе, может составлять, например, от 0,3 мкл до 100 мл, от 3 мкл до 10 мл, от 30 мкл до 1 мл.

Согласно изобретению инкубирование раствора может быть осуществлено, например, при температуре от -10 до 90°С, от 0 до 40°С, от 15 до 25°С.

Согласно изобретению время инкубирования может составлять, например, от 1 до 72 ч, от 2 до 48 ч, от 1 до 24 ч, от 1 до 60 мин.

- 4 023612

Согласно изобретению под эффектом подразумевают, например, истирание, разрыв, например полный или частичный разрыв, деструктурирование, деструкцию, отрыв, отделение, прокалывание, появление трещин, расщелин, отверстий, пор, вспучивание, сжатие и/или ингибирование образования пленки.

Согласно изобретению способ согласно изобретению может быть использован со множеством частиц, например по меньшей мере с 2 частицами, с количеством частиц, например, от 2 до 10000000, от 1000 до 1000000, от 10000 до 1000000, от 100000 до 1000000, от 10000 до 100000. Множество частиц дает возможность выгодно непосредственно детектировать, без сложного визуализирующего устройства и без красителя, взаимодействие между указанными частицами, в противоположность способам известного уровня техники, использующим одну частицу и нуждающимся для детектирования взаимодействия в сложных визуализирующих устройствах или в красителях.

Согласно изобретению указанные по меньшей мере две частицы могут быть выбраны в группе, включающей в себя электрически заряженные частицы, магнитные частицы, частицы, покрытые по меньшей мере одним магнитным слоем, намагничивающиеся частицы, частицы, покрытые одним намагничивающимся слоем, электрические, электромагнитные, электризующиеся частицы, несущие электрический заряд или смесь из двух или нескольких из этих частиц. В самом деле, это может быть любая частица, дающая возможность применить настоящее изобретение.

Благоприятно, указанные частицы могут представлять собой частицу любой формы, пригодную для применения настоящего изобретения, например в форме шарика, диска, асимметричной геометрической формы, например с плоской поверхностью и т.д.

Может быть использован любой подходящий размер магнитной частицы. Размер может быть выбран в зависимости от размера вместилища раствора. Например, размер частиц может быть меньше десятой части размера вместилища, предпочтительно меньше сотой части, более предпочтительно меньше тысячной части размера вместилища. Например, частица может иметь размер, например, от 10 нм до 100 мкм, от 0,1 до 10 мкм.

Согласно изобретению частицы могут быть освещены, например, при помощи источника света. Освещение позволяет выгодно увеличить контраст между частицей и раствором.

Изобретение позволяет, благоприятно используя множество частиц, детектировать слабые повреждения, вызванные воздействием, приложенным к пленке. Использование одной магнитной или намагничивающейся частицы и/или шарика не позволяет детектировать эти повреждения. Кроме того, существует непренебрежимо малая опасность детектирования не характерных явлений, например частичного образования пленки.

Согласно изобретению наблюдение может быть осуществлено с использованием любого средства, известного специалистам в данной области. Таким средством может быть, например, оптическое устройство, например микроскоп, фотоаппарат, сканер для документов, например совершенный сканер У750 ΕΡδΘΝ, визуальное наблюдение.

Согласно изобретению наблюдение может дать возможность измерить, например, интенсивность, контраст, изменение изображения, например, при помощи любого средства, известного специалистам в данной области, в частности программного средства для работы с изображениями, такого как 1тадеТ позволяющего, например, измерить контрастность, интенсивность, соответствующие частицам в зонах одного изображения по сравнению с другим. Это программное средство позволяет, например, сравнивать изображения, полученные до и после приложения механического, гидродинамического или физического воздействия, например, путем вычитания изображений, например измеряя коэффициент корреляции между изображениями.

Согласно изобретению применение частиц, испускающих сигнал, например окрашенных, флуоресцирующих, фосфоресцирующих, светящихся, радиоактивных частиц, может дать возможность, например, автоматизированного наблюдения.

Согласно изобретению эффект может быть определен визуализацией распределения частиц. Например, зона без частиц может представлять собой, например, разрыв пленки, отсутствие диспергирования частиц позволяет определить устойчивость пленки к воздействию.

Согласно изобретению перераспределение может быть осуществлено при помощи любого средства, известного специалистам в данной области. Когда частицы являются, например, магнитными, намагничивающимися, этим средством может быть, например, магнит, электрическое или электромагнитное поле, которые позволяют сгруппировать указанные частицы в одну точку.

Согласно изобретению под точкой подразумевают, например, объединение в одном месте множества частиц, образующих, таким образом, на погруженной поверхности точку, диск, кольцо, брусок, правильную геометрическую форму, например квадрат, ромб, треугольник или пятно.

Согласно изобретению под пятном подразумевают, например, темную зону, образованную множеством частиц на погруженной поверхности. Согласно изобретению наблюдение на стадии (е) может быть осуществлено на поверхности §₁, которая может представлять собой поверхность наблюдения, например, на первом изображении, например на поверхности от 1 до 10000, от 10 до 900, от 50 до 700, от 100 до 500 пикселей.

- 5 023612

Согласно настоящему изобретению, размер пикселя определяется его шириной и высотой (ширинахвысота), например шириной от 0,018 до 0,660 мм, высотой от 0,018 до 0,660 мм.

Согласно изобретению наблюдение на стадии (д) может быть осуществлено на поверхности §₂, которая может представлять собой поверхность наблюдения, например, на втором изображении, например поверхность, равная §₁, в 1,1-2,5 раза превышающая поверхность §₁, составляющая 0,5-0,9 от поверхности §₁.

Благоприятно, упомянутое перед этим сравнение может позволить измерить величину эффекта воздействия, например оно может позволить измерить процент и количество пленки, модифицированной воздействием.

Согласно изобретению сравнение наблюдений может позволить выгодно определить процентное содержание дисперсии частиц на погруженной поверхности и, таким образом, величину эффекта воздействия на пленку.

Кроме того, способ согласно изобретению позволяет получить надежный результат с лучшей чувствительностью, чем способы известного уровня техники.

Кроме того, способ согласно изобретению позволяет определить, без химического или биологического реактива, влияние воздействия на пленку и, более того, количественно определить это влияние надежным, воспроизводимым образом за короткое время, причем независимо от оператора и/или конкретного устройства.

Согласно изобретению электрическое поле может быть приложено с момента начала и/или в середине образования пленки.

Согласно изобретению магнитное, или электрическое, или электромагнитное поля могут представлять собой любое поле, дающее возможность привести в движение указанные по меньшей мере две частицы на указанной поверхности, погруженной в указанный раствор, например электромагнитное поле или магнитное поле. Магнитное, или электрическое, или электромагнитное поле может быть создано, например, магнитом или соленоидом. Магнит может быть, например, в форме стержня, точки, бруска и т.д. или в любой форме, подходящей для применения настоящего изобретения. Поле может быть приложено, например, любым способом, известным специалистам в данной области, например импульсно, путем постепенного увеличения электромагнитного поля, путем изменений электромагнитного поля или путем комбинирования этих способов.

Согласно изобретению частицы могут быть нанесены на поверхность в форме капли, содержащей связующее вещество, растворимое в растворе, или которое может разрушаться при приложении воздействия.

Согласно изобретению способ позволяет также количественно оценивать внешний вид пятен и/или точек, наблюдаемых после приложения воздействия.

Способ согласно изобретению может включать после стадии (ί) стадию (ί) количественной оценки (О) внешнего вида пятен и/или точек измерением среднего стандартного отклонения Όί. Определение среднего стандартного отклонения может быть осуществлено любым способом, известным специалистам в данной области. Измерение может быть осуществлено, например, с применением программного средства 1таде1 (1таде Ртосе88шд апб Лпа1у818 ίη 1ауа, ЬПр://г8Ълп&.шЬ.доу.у), например измерением на изображении, наблюдаемом на стадии (д), содержащемся, например, в эллипсе с центром в точке и/или пятне, полученном на стадии (с), по расчету, по приблизительной величине, изменения формы точки или пятна, наблюдаемого на стадии (д), равного

Ο=(ϋΐ*ϋΐ-ϋ0*ϋ0)/(ΐ*ΐ), где I представляет собой меру контраста, интенсивности пятен, такую как определенная перед этим;

Ό0 представляет собой среднее стандартное отклонение, измеренное с применением программного средства 1таде1 по фону поглотителя вокруг пятна, например в эллипсе, расположенном в контакте с пятном, но не содержащем самого пятна.

Благоприятно, настоящее изобретение позволяет определить образование, разрушение биопленок микроорганизмов, пленок, образованных, например, красками, пищевыми продуктами, образцами природных или промышленных сред, биологическими образцами, например биопленками микроорганизмов, которые могут представлять собой пленку, образованную одним или несколькими видами микроорганизмов (бактерии, грибы, водоросли или простейшие), связанных между собой и с поверхностью и не секретирующих, слабо секретирующих или секретирующих в переменном количестве клейкую защитную матрицу, состоящую в основном из полисахаридов.

Кроме того, способ согласно изобретению позволяет получить надежный результат с лучшей чувствительностью и лучшей специфичностью, чем способы известного уровня техники.

Кроме того, способ согласно изобретению позволяет получить воспроизводимый результат и, следовательно, дающий возможность эффективного и полезного сравнения измерений, проведенных с применением способа согласно изобретению.

Другие преимущества могут еще проявиться для специалистов в данной области при чтении следующих ниже примеров, иллюстрированных прилагаемыми фигурами, данными для иллюстрации.

- 6 023612

Краткое описание фигур

Фиг. 1А представляет собой фотографию 6 образцов, обозначенных с 1 по 6, содержащих соответственно в лунках столбцов А и Е - воду и парамагнитные микрошарики, столбцов В и Ρ - ΒΗΙ в концентрации 37 г/л и парамагнитные микрошарики, столбцов С и О - пептон в концентрации 5 г/л и парамагнитные микрошарики, столбцов Б и Н - триптон в концентрации 5 г/л и парамагнитные микрошарики. Ряды соответствуют наблюдению лунок после инкубации в течение 2 ч 30 мин при 37°С соответственно, ряды 1 и 2 - перед перемешиванием, ряды 3 и 4 - после 20 с перемешивания, ряды 5 и 6 - после 60 с перемешивания, ряды 7 и 8 - после 240 с перемешивания.

Фиг. 1В представляет схему изменения интенсивности, которая может быть приписана пятнам (1ай) (ордината) в зависимости от времени (Т) гидродинамического воздействия в секундах (абсцисса). Сплошные квадраты представляют величины, полученные для лунок, содержащих среду с сердечномозговой вытяжкой (или Вгат Нсаг! Ιηίπδίοη, называемую обычно ΒΗΙ), сплошные треугольники представляют величины, полученные для лунок, содержащих пептон, сплошные кружки представляют величины, полученные для лунок, содержащих триптон, и сплошные ромбы представляют величины, полученные для лунок, содержащих воду.

Фиг. 2А и 2В представляют фотографии лунок с образцами.

Фиг. 2А представляет фотографию 4 образцов, обозначенных с ку1 по ку4, содержащих соответственно следующие бактерии: Ык1епа шопосу!одепек, ЕксйейсЫа сой ΌΗ5 а, 81арйу1ососсик ху1о8И8, 81арйу1ососик сагпокик и магнитные частицы перед гидродинамическим воздействием.

Фиг. 2В представляет фотографию 4 образцов, обозначенных с ку1 по ку4, содержащих соответственно следующие бактерии: Ык1епа топосуЮдепек, ЕксйейсЫа сой ΌΗ5 а, 81арйу1ососсик ху1о8И8, 81арйу1ососи8 сатпокик и магнитные частицы после гидродинамического воздействия.

Фиг. 3А представляет собой столбиковую диаграмму, представляющую результаты измерения интенсивности (Ι) (ордината) в зависимости от бактерии (абсцисса), ΒΗΙ представляет собой лунки без бактерий, Ьт: Ык1епа топосуЮдепек, Ес: ЕксйейсЫа сой ΌΗ5 а, 8х: 81арйу1ососсик ху1окик, 8е: 81арйу1ососик сагпокик. Черные столбики - величины перед перемешиванием, белые столбики - величины после перемешивания.

Фиг. 3В представляет собой столбиковую диаграмму, представляющую нормирование величин, полученных в 3А, соответствующее содержанию неповрежденных биопленок (Рторотйоп йе Вюй1ш Ыоп БеГай (РВЫБ)) после гидродинамического воздействия (ордината) в зависимости от бактерии (абсцисса). ΒΗΙ представляет лунки без бактерий, Ьт: Ык1епа топосу!одепек, Ес: ЕксйейсЫа сой БИ5 а, 8х: 81арйу1ососсик ху1окик, 8е: 81арйу1ососнк сагпокик.

Фиг. 3С представляет собой столбиковую диаграмму, представляющую количественную оценку О (ордината) в зависимости от бактерий. ΒΗΙ представляет лунки без бактерий, Ьт: Ык1епа топосу!одепек, Ес: ЕксйейсЫа сой БИ5 а, 8х: 81арйу1ососснк ху1окик, 8е: 81арйу1ососик сагпокик.

Фиг. 4А представляет собой фотографию 6 образцов, обозначенных к\у 0, к\у 2, к\у 4, к\у 6, к\у 8 и ку 24 (соответственно после 0, 2, 4, 6, 8 и 24 ч культивирования при 37°С), содержащих в лунках Е среду ΒΗΙ и магнитные частицы и в лунках Ρ, О и Н бактерии Ык1епа топосуЮдепек в среде ΒΗΙ с магнитными частицами перед гидродинамическим воздействием.

Фиг. 4В представляет собой фотографию 6 образцов, обозначенных ку 0, ку 2, ку 4, ку 6, ку 8 и ку 2 4 (соответственно после 0, 2, 4, 6, 8 и 24 ч культивирования при 37°С), содержащих в лунках Е среду ΒΗΙ и магнитные частицы и в лунках Ρ, О и Н бактерии Ык1епа топосуЮдепек в среде ΒΗΙ с магнитными частицами - после гидродинамического воздействия.

Фиг. 5А представляет собой столбиковую диаграмму, представляющую результаты измерения интенсивности (Ι) (ордината) в зависимости от времени (абсцисса) через 0, 2, 4, 6, 8 или 24 ч. Белые столбики соответствуют результатам, полученным с Ык1ет1а топосуЮдепек (Ьт), черные столбики - результатам без бактерий (ΒΗΙ).

Фиг. 5В представляет собой столбиковую диаграмму, представляющую содержание неповрежденных биопленок (Рторотйоп йе Вюй1ш Ыоп БеГай (ΡΒΝβ)) после гидродинамического воздействия (ордината) в зависимости от времени (абсцисса) через 0, 2, 4, 6, 8 или 24 ч. Белые столбики соответствуют результатам, полученным с Ык1епа топосуЮдепек (Ьт), черные столбики - результатам без бактерий (ΒΗΙ).

Фиг. 5С представляет собой столбиковую диаграмму, представляющую количественную оценку О (ордината) в зависимости от времени (абсцисса) через 0, 2, 4, 6, 8 или 24 ч. Белые столбики соответствуют результатам, полученным с Ык1епа топосуЮдепек (Ьт), черные столбики - результатам без бактерий (ΒΗΙ).

Фиг. 6А представляет собой фотографию 9 образцов в 8 лунках, обозначенных с 1 по 9, содержащих бактерии 81арйу1ососснк аигеик СЬР 76.25А (засеянные в лунки с культуральной средой в столбцах В, С, Б, Е, Ρ и О), содержащих в культуральной среде соответственно ампициллин (ряд 1), цефтазидим (ряд 2), хлорамфеникол (ряд 3), эритромицин (ряд 4), пиперациллин (ряд 5), тетрациклин (ряд 6), гентамицин (ряд 7), ципрофлоксацин (ряд 8) или триметоприм (ряд 9), в зависимости от концентрации: без антибиотиков (столбец А=контрольный образец стерильности культуральной среды с магнитными час- 7 023612 тицами без бактерий и столбец О=контрольный образец культуральной среды с бактериями и с магнитными частицами), 4-кратная исходная концентрация антибиотика (столбцы Р и Н), 2-кратная исходная концентрация антибиотика (столбец О), исходная концентрация антибиотика (столбец И), 0,5-кратная исходная концентрация антибиотика (столбец С) или 0,25-кратная исходная концентрация антибиотика (столбец В) и магнитных частиц перед гидродинамическим воздействием.

Фиг. 6В представляет конфигурацию фиг. 6А, но после гидродинамического воздействия.

Примеры

Пример 1. Измерение эффекта гидродинамического воздействия на пленки протеинов.

В этом примере способ применяли к изучению прочности пленок, полученных, исходя из растворов, обогащенных протеинами.

Готовили 2,4 мл растворов, соответственно воды, ΒΗΙ (ВИ-И1РСО, Франция) с концентрацией 37 г/л, пептона (Р1ика) с концентрацией 5 г/л и Вас1о (зарегистрированный товарный знак) триптона (ВИ-И1РСО, Франция) с концентрацией 5 г/л. К этим растворам добавляли раствор парамагнитных микрошариков (Τοη006Ν, Вюй1шСои1го1, Франция) из расчета 10 мкл/мл. Затем эти растворы помещали, исходя из расчета 100 мкл/лунку, в лунки соответственно А и Е, В и Р, С и О, И и Н двух образцов лунок с плоским дном (ссылка: М8^002В, ВюРйт Сои1го1. Франция). Образцы помещали на намагниченные испытательные блоки (ВКТ-М8^002 ВюРйт Сои1го1, Франция) и все вместе помещали в термостатированный сушильный шкаф (ссылка: ВС240, Рие1аЪо, Франция), стабилизированный при 37°С, на 2 ч 30 мин.

Затем образцы помещали в орбитальную мешалку (Уапотад МоиакНаке, Η+Ρ ЬаЪопесЬтк, А11етадие), отрегулированную на 30±10% от ее максимальной скорости вращения, чтобы подвергнуть гидродинамическому воздействию последовательно в течение 0, 5, 5, 10, 10, 10, 10, 10, 20, 20, 20, 30, 30, 30 с, суммируя, таким образом, общее время перемешивания 0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120, 150, 180, 210 и 240 с.

После каждого перемешивания образцы помещали на сканер документов (марка У-750 РРО, Еркои, США), запись изображения с которого осуществляли с применением программного средства ЕркоиЗсаи (Еркои, США).

Изображения, воспроизведенные на фиг. 1А для длительностей перемешивания 0, 20, 60 и 240 с, были получены, складывая красные, зеленые и синие компоненты цветных изображений, полученных с использованием сканера с привлечением программного средства 1шаде1 (ЬйрУ/щЪ.ш&.тЬ.доу.г)), и разделения полученных изображений с различными регулировками контраста. Хорошо определенные точки видны во всех лунках.

Точки и пятна количественно определяли, осуществляя два измерения, соответственно β и Ι₂, средней интенсивности изображения, находящегося в эллипсе с центром в точке или в пятне на поверхности соответственно 8₁=100-500 пикселей и 8₂=от 1,1x8, до 2,5x8;, при помощи программного средства йпадеТ Приблизительную величину интенсивности (1ай), приписываемой точке или темному пятну, наблюдаемому в изображениях, получали, осуществляя следующее вычисление:

1ай=8₁х (Ι₂χ 8₂-1,1χ 8₁)/(8₂-8₁)-Ι; х 8₁.

Средние значения интенсивностей, полученные таким образом, воспроизведены на фиг. 1 и в табл. 1.

- 8 023612

Таблица 1

Результаты измерения интенсивности

Продолжительность приложения гидродинамического воздействия в секундах	Интенсивность пятен
Вода	ΒΗΙ	Пептон	Триптон
0	15356	19650	18068	21335
5	11538	14306	16421	14074
10	6878	13273	17179	10715
20	6975	9803	17081	8701
30	63 61	7180	16995	4907
40	7494	5137	13027	2978
50	5031	4368	13421	2176
60	6772	5012	11587	2627
80	5823	4391	11498	1378
100	3983	2825	11777	1017
120	4287	2771	9509	993
150	6495	3777	8523	2285
180	5942	3304	7575	1799
210	5668	2114	5242	607
240	6338	2644	1993	337

Как представлено на фиг. 1В и в табл. 1, интенсивность изменяется в зависимости от времени перемешивания и позволяет измерить, например, стойкость пленок. Как показано в этом примере, способ согласно изобретению позволяет определить эффект воздействия, например гидродинамического воздействия на пленку. В частности, способ согласно изобретению позволяет определить стойкость одних пленок по отношению к другим.

Пример 2. Измерение эффекта гидродинамического воздействия на биопленки различных веществ.

В этом примере способ согласно изобретению позволяет изучить стойкость биопленок, образованных разными бактериальными видами.

Культивированные в течение 16 ч в сердечно-мозговой вытяжке культуры следующих 4 микроорганизмов: Пйепа топосуЮдспсх. ЕксЬсйсЫа сой ΌΗ5 а, 81арЬу1ососсик ху1о8И8, 81арЬу1ососик сагпокик доводили до оптической плотности на длине волны 600 нм ОП₆₀о _нм=0,004 разбавлением стерильной ΒΗΙ и добавляли раствор парамагнитных микрошариков (Тои005Ы, ВюЕПтСоШгок Франция) в концентрации 10 мкл/мл. Измерение оптической плотности осуществляли на спектрофотометре (Вютакс, Тйегто 8сюиййс, Егапсс). Доведенную культуру, содержащую парамагнитные микрошарики, помещали в лунки с плоским дном (ссылка: М8^002В, ВюЕПтСопкго1, Франция) из расчета 200 мкл/лунку в лунки сравнения Е, О и Н четырех образцов, обозначенных соответственно 1, 2, 3 и 4. В лунки Е каждого из образцов были помещены 200 мкл стерильной ΒΗΙ, дополненной раствором парамагнитных микрошариков (Топ005Ы, ВюЕПтСоп1го1, Франция), из расчета 10 мкл/мл.

Распределение различных осадков представлено в табл. 2.

Таблица 2

	Е	Е	С	н
	ΒΗΙ	£2деег4а	ЫзРегла	ЗссбесТа
Зм 1	стерильная	топосуСодепез	топосу£одепее	люпосуСодепез
	ΒΗΙ	ЕзсРеглсЫа	ЕзсРеглсРла	ЕзсРеглсЫа
		соН	соН	соН
Зм 2	стерильная	ОН5 а	ОН5 а	ОН5 а
	ΒΗΙ	5^а.рпу1ососс:из	5^а.рпу1ососсив	5£ар&у1ососсиз
Зм 3	стерильная	хуЕозиз	хуЕозиз	ху!озиз

	ΒΗΙ	5£арГ1у1ососиз	5(лрЛу1ососиз	3 Сарру!ососиз
Зм 4	стерильная	саглоаиа	сагпозиз	сагповиз

- 9 023612

Каждый образец независимо помещали на намагниченный испытательный блок (ВКТ-М8А002 ВюРйт Сои1го1, Франция), помещенный в прямоугольные коробки с крышкой 18x12x7 см, содержащий две колбы Бехера объемом 25 мл, содержащие 20 мл воды. Затем все вместе помещали в термостатированный сушильный шкаф (ссылка: ВС240, Нгс1аЬо. Франция), стабилизированный при 30°С для образцов 1 и 2 и стабилизированный при 37°С для образцов 5\ν 3 и 5\ν 4, на 8 ч.

Образцы затем помещали независимо на сканер документов (марка У-750 ΡΚΌ, Еркои, США), запись изображения с которого осуществляли с применением программного средства Еркои 8саи (Еркои, США). Конечные изображения, воспроизведенные на фиг. 2А, были получены путем сложения красных, зеленых и синих компонентов цветных изображений, полученных с использованием сканера с привлечением программного средства 1таде1 (1таде Ргосекктд апб Лпа1у818 ίη 1ауа, ЬПр://г8ЪлпРо.тЬ.доу.у) и разделения полученных изображений с различными регулировками контраста. Хорошо определенные точки видны во всех лунках. Затем образцы помещали на орбитальную мешалку (Уагютад МоиозПаке, Н+Р ЬаЪойесЬтк, Германия), настроенную на 60±20% ее максимальной скорости вращения, на 10 с. Эта стадия соответствовала оказанию на пленку, образовавшуюся в культуре, гидродинамического воздействия.

Вторую запись изображения осуществляли в тех же самых условиях, что и запись первого изображения. Изображение, полученное таким образом, соответствует фиг. 2В. На этой фигуре видны более или менее хорошо определенные точки и пятна, и их внешний вид зависит от бактериального штамма, образовавшего биопленку. Точки в ряду Е определенно менее интенсивные, что соответствует максимальному диспергированию парамагнитных микрошариков при гидродинамическом воздействии.

Точки и пятна количественно определяли, осуществляя два измерения, соответственно ф и 1₂, средней интенсивности изображения, находящегося в эллипсе с центром в точке или в пятне на поверхности, соответственно δ]=100-500 пикселей и 8₂=от 1-1x5] до 2,5x8], при помощи программного средства БпадеТ

Приблизительную величину интенсивности (1а11), приписываемой точке или темному пятну, наблюдаемому в изображениях, получали, осуществляя следующее вычисление:

1ай=8₁х (Ι₂χ 8₂-1_;х δ₁)/(δ₂-δ₁)-Ι₁ х δ₁.

Средние значения интенсивностей, полученные таким образом, воспроизведены на фиг. 3А и в табл. 3, при этом погрешность измерений соответствует стандартным отклонениям проведенных измерений.

Таблица 3

Результаты измерения интенсивности

1а01	Перед намагничиванием	После намагничивания
	Среднее	Стандартное отклонение	Среднее	Стандартное отклонение
ΒΗΙ	5,40Е+03	3,45Е+02	8,86Е+02	2,49Е+02
Ьт	4,24Е+03	4,72Е+02	2,69Е+02	2,16Е+02
Ес	4,24Е+03	4,50Е+02	3,80Е+02	7,41Е+02
Зх	3,82Е+03	3,03Е+02	9,49Е+02	8,20Е+02
5с	5,57Е+03	2,30Е+02	1,04Е+02	4,23Е+02

Необработанные интенсивности после намагничивания нормированы путем их деления на необработанные интенсивности перед намагничиванием и позволяют получить приблизительную величину доли биопленки, которая не повреждена гидродинамическим воздействием (ΡΒΝΏ). Результаты, полученные для этого примера, воспроизведены на фиг. 3В и в табл. 4, погрешность измерений соответствует стандартным отклонениям измерений.

Таблица 4

Среда	Среднее	Стандартное отклонение
ΒΗΙ	0,16393578	0,05648906
Ьт	0,63556509	0,12167536
Ес	0,08963821	0,0269836

5х

0,24868618

0,2345908

5с

0,1874682

0,08374593

- 10 023612

Равным образом, внешний вид точек и пятен может быть количественно оценен (величина О), делая вывод из среднего стандартного отклонения Ό1, измеренного с применением программного средства 1шаде1 из изображения, находящегося в эллипсе с центром в точке или в пятне, вычислением приблизительной величины изменения формы точки или пятна, равной

Ρ=(Ό1*Ό1-Ό0*Ό0)/Ι*Ι), где I - интенсивность, вычисленная, как описано выше;

Ό0 - среднее стандартное отклонение, измеренное с применением программного средства 1таде1 фона точки вокруг пятна.

Результаты, полученные для этого примера, воспроизведены на фиг. 3С и в табл. 5, погрешность измерений соответствует стандартным отклонениям измерений.

Таблица 5

Нормированные изменения	Перед намагничиванием	После намагничивания
	Среднее	Стандартное отклонение	Среднее	Стандартное отклонение
ΒΗΙ	1,88Е-04	7,63Е-05	3,38Е-05	8,57Е-06
Ьт	1,98Е-05	9,43Е-05	3,54Е-05	1,11Е-06
ЕС	6,ЗЗЕ-04	2,29Е-04	3,97Е-05	7,11Е-06
Зх	2,91Е-03	2,61Е-03	2,80Е-05	9,39Е-06
Зс	2,17Е-04	2,98Е-04	2,84Е-05	8,56Ξ-06

Как показано в этом примере, способ согласно изобретению позволяет определить эффект воздействия, например гидродинамического воздействия на биопленку. В частности, способ согласно изобретению позволяет определить стойкость одних пленок по отношению к другим.

Кроме того, способ согласно изобретению позволяет очень чувствительно и быстро детектировать смещение частиц и эффект воздействия на пленку.

Пример 3. Измерение эффекта гидродинамического воздействия на биопленки во время образования.

В этом примере используемые устройства и продукты идентичны устройствам и продуктам предыдущего примера.

Культивированную в течение 16 ч в среде ΒΗΙ (ВИ-И1РСО, (Франция)) культуру Ь151ет1а тоиосу1одеие8 доводили до ОП_{600 нм}=0,004 разбавлением стерильной ΒΗΙ и добавляли раствор парамагнитных микрошариков (Τοη005Ν, ВюРйтСои1то1, Франция), затем 200 ΜΙ/лунку помещали в лунки с плоским дном (ссылка: Μ8Α002Β, ВюР11тСои1то1, Франция), обозначенные Р, С и Н, 6 образцов, соответственно 0, 2, 4, 6, 8 и 24. В лунки Е каждого из образцов были помещены 200 мкл стерильной ΒΗΙ, дополненной 10 мкл/мл раствора парамагнитных микрошариков (Топ005Н ВюРПтСойток Франция).

Распределение различных осадков представлено в табл. 6.

Таблица 6

	Е	Е	С	н
0	вш стерильная	ί,ί всегда топосукодепез	ЪпзСеппа шопосуСодепез	ЫзСегпа шопосуСодепез
Зи 2	ΒΗΙ стерильная	ЬазСегаа шопосуСодепез	ЬпзСегпа шопосуСодепез	ЬпзСегпа шопосуСодепез
Зи 4	внт с т ер иль на я	1ЛзСег1а шопосуСодепез	Ц-зСеппа шопосуСодепез	ЫзСегпа шопосуСодепез
Зи 8	внт стерильная	1ЛзСег1а пюпосуСодепез	Ц-зСеппа шопосуСодепез	ЫзСегпа шопосуСодепез
Зи 2 4	ΒΗΙ стерильная	ЬазСегаа шопосуСодепез	ЬпзСегпа шопосуСодепез	ЬпзСегпа шопосуСодепез

Образцы помещали на намагниченные испытательные блоки (ΒΚΤ-Μ8Α002 РюРПт Сойго1, Франция), помещенные в прямоугольные коробки с крышкой 18x12x7 см, содержащие две колбы Бехера объемом 25 мл, содержащие 20 мл воды, и все вместе помещали в термостатированный сушильный шкаф (ссылка: ВС240, Рие1аЪо, Франция), стабилизированный при 30°С, на время соответственно 0, 2, 4, 6, 8, 24 ч.

- 11 023612

Образцы затем помещали на сканер документов (марка У-750 РКО, Еркои, США), запись изображения с которого осуществляли с применением программного средства Ер8оп§саи (Еркои, США). Конечные изображения, воспроизведенные на фиг. 4А, были получены, складывая красные, зеленые и синие компоненты цветных изображений, полученных с использованием сканера с привлечением программного средства 1таде1 (НирУ/геЪ.тГо.шкдоущ) и разделения полученных изображений с различными регулировками контраста. Полученное изображение представлено на фиг. 4А. Хорошо определенные точки видны во всех лунках.

Затем образцы помещали на орбитальную мешалку (Уагюшад Моиоккаке, Н+Р ЬаЪопесЬшк, Германия), настроенную на 60±20% ее максимальной скорости вращения, на 10 с, чтобы подвергнуть их гидродинамическому воздействию.

Вторую запись изображения осуществляли в тех же самых условиях, что и запись первого изображения, и конечное изображение воспроизведено на фиг. 4 В. Видны более или менее хорошо определенные точки и пятна, и их внешний вид зависит от бактериального штамма, образовавшего биопленку.

Точки и пятна количественно определяли, осуществляя два измерения с применением программного средства 1таде1, соответственно 1₁ и 1₂, средней интенсивности изображения, находящегося в эллипсе с центром в точке или в пятне на поверхности соответственно, §₁=100-500 пикселей и §₂=от 1,1х§₁ до 2,5χδι.

ΙηΙΙ=δ_ι χ (Ι₂χ δ₂-Ι;χ δ₁)/(δ₂-δ₁)-1χ δ!.

Средние значения интенсивностей, полученные таким образом, воспроизведены на фиг. 5А и в табл. 7, при этом погрешность измерений соответствует стандартным отклонениям проведенных измерений.

Таблица 7

Время	ΒΗΙ	Ьт	Стандартное отклонение Ьт
0 ч	-1,72Е+01	-5,82Е+00	3,55Е+01
2 ч	3,74Е+02	7,94Е+02	9,81Е+01
4 ч	8,14Е+02	6,02Е+02	1,95Е+02
6 ч	6,64Е+02	2,54Е+03	3,29Е+02
8 ч	7,52Е+02	2,44Е+03	1,79Е+02
24 ч	8,26Е+02	2,07Е+03	2,19Е+01-

Необработанные интенсивности после намагничивания были нормированы путем их деления на необработанные интенсивности перед намагничиванием и позволили получить приблизительную величину доли биопленки, которая не повреждена гидродинамическим воздействием (ΡΒΝΏ). Эти результаты воспроизведены на фиг. 5В и в табл. 8.

Таблица 8

Время	ΒΗΙ	Ьт	Стандартное отклонение Ьт
0 ч	0,00360422	-0,0011256	1,04Е-03
2 ч	0,6975705	0,13379324	1,05Е-01
4 ч	0,15521974	0,11969938	1,34Е-01
б ч	0,11833857	0,533572	1,52Е-01
8 ч	0,1325017	0,5516224	2,17Е-01
24 ч	0,16997323	0,5647522	1,72Е-01

Равным образом, внешний вид точек и пятен может быть количественно оценен О. делая вывод из среднего стандартного отклонения Ό1, измеренного с применением программного средства 1таде1 из изображения, находящегося в эллипсе с центром в точке или в пятне, вычислением приблизительной величины изменения формы точки или пятна согласно следующей формуле:

0=(ϋ1*ϋ1-ϋ0*ϋ0)/Ι*Ι), где I - интенсивность, вычисленная, как описано выше;

Ό0 - среднее стандартное отклонение, измеренное с применением программного средства 1таде1 фона точки вокруг пятна или изъяна.

Результаты, полученные для этого примера, воспроизведены на фиг. 5С, погрешность измерений соответствует стандартному отклонению измерений.

- 12 023612

Таблица 9

Время	ΒΗΙ	Ьт	Стандартное отклонение Ьт
0 ч	-4,25Е-03	-3,30Е-03	0,003635176
2 ч	1,06Е-03	3,20Е-04	0,000216958
4 ч	5,36Е-04	6, 81Е-04	0,000686718
б ч	4,35Е-04	9,43Е-05	1,33109Е-05
8 ч	4,63Е-04	1,08Е-04	3,16769Е-05
24 ч	6,71Е-04	1,64Е-04	3,72707Е-05

Пример 4. Измерение эффекта антибиотика и гидродинамического воздействия на биопленки.

Культивированную в течение 16 ч в среде ΒΗΙ (ΒΌ-ΌΙΡΟΟ, (Франция)) культуру §1арйу1ососси5 аитеик С1Р 76.25А доводили до ОП_{600 нм}=0,004 разбавлением стерильной ΒΗΙ, добавляли 10 мкл/мл раствора парамагнитных микрошариков (Τοη005Ν, ВюН1тСоп1го1. Франция) и затем 200 ΜΙ/лунку помещали в лунки с плоским дном, соответственно ряды с 1 по 9 и соответственно столбцы от О до В, планшета (ссылка: ММВ002В, ΒίοΡΠιη Соп1то1, Франция). В каждый раствор добавляли антибиотики, соответственно ампициллин С=0,5 пг/мл, цефтазидим С=16 мг/мл, хлорамфеникол С=16 мг/мл, эритромицин С=0,5 мг/мл, пиперациллин С=1 мг/мл, тетрациклин С=2 пг/мл, гентамицин С=16 мг/мл, ципрофлоксацин С=2 пг/мл, триметоприм С=64 пг/мл в различных концентрациях, соответственно 0хС, 4хС, 2хС, С, 0,5хС, 0,25хС.

В лунки столбца Н, ряды соответственно с 1 по 9, помещали 200 мкл ΒΗΙ, добавляли 10 мкл/мл раствора парамагнитных микрошариков (Топ005Н Β^οΡ^1тСοηΐ^ο1, Франция) и антибиотик в концентрации 4хС, соответственно ампициллин С=0,5 пг/мл, цефтазидим С=16 мг/мл, хлорамфеникол С=16 мг/мл, эритромицин С=0,5 мг/мл, пиперациллин С=1 мг/мл, тетрациклин С=2 пг/мл, гентамицин С=16 мг/мл, ципрофлоксацин С=2 пг/мл, триметоприм С=64 пг/мл.

Столбец А соответствовал контрольным лункам стерильной ΒΗΙ, в которую был добавлен только раствор парамагнитных шариков.

Столбец О соответствовал контрольным образцам выживаемости §1арйу1ососсик аитеик СГР 76.25А. Столбец Н соответствовал контрольным лункам стерильной ΒΗΙ, в которую был добавлен раствор парамагнитных шариков в присутствии максимальной дозы антибиотиков.

Распределение различных осадков представлено в табл. 10.

Таблица 10

	Н	С	Г	Е	ϋ	с	В	А
5£арЪу1ососсиз аигеиз		+	+	+	+	+	+
1 Ампициллин	4хС	ОхС	4хС	2хС	С	0, 5хС	0, 25хС	ОхС
2 Цефтазидим	4хС	ОхС	4хС	2хС	с	0, 5хС	0,25хС	ОхС
3 Хлорамфеникол	4хС	ОхС	4хС	2хС	с	0, 5хС	0, 25хС	ОхС
4 Эритромицин	4хС	ОхС	4хС	2хС	с	0, 5хС	0,25хС	ОхС
5 Пиперациллин	4хС	ОхС	4хС	2хС	с	0, 5хС	0, 25хС	ОхС
б тетрациклин	4хС	ОхС	4хС	2хС	с	0, 5хС	0,25хС	ОхС
7 Гентамицин	4хС	ОхС	4хС	2хС	с	0, 5хС	0, 25хС	ОхС
8 Ципрофлоксацин	4хС	ОхС	4хС	2хС	с	0, 5хС	0,25хС	ОхС
9 Триметоприм	4хС	ОхС	4хС	2хС	с	0, 5хС	0, 25хС	ОхС

Образцы помещали на намагниченные испытательные блоки (ΒΚΤ-Μδ^002 БюРПт Соп1то1, Франция), помещенные в прямоугольные коробки с крышкой 18х12х7 см, содержащие две колбы Бехера объемом 25 мл, содержащие 20 мл воды. Все вместе помещали в термостатированный сушильный шкаф (ссылка: ВС240, Иге1аЬо, Франция), стабилизированный при 37°С, на 16 ч.

Образцы затем помещали на сканер документов (марка У-750 РКО, Еркоп, США), запись изображения с которого осуществляли с применением программного средства Еркоп§сап (Еркоп, США). Полученные конечные изображения представлены на фиг. 6А. Они были получены, складывая красные, зеленые

- 13 023612 и синие компоненты изображений с красным компонентом цветных изображений, полученных с использованием сканера с привлечением программного средства 1таде1 (1Шр://г5Ъ.тГо.ш11.доу.р) и разделения полученных изображений с различными регулировками контраста.

Как представлено на фиг. 6А, точки хорошо определены и видны во всех лунках.

Затем образцы помещали на орбитальную мешалку (Уапотад МоповЬаке, Н+Р ЬаЪопесЬшк, Германия), настроенную на 60±20% ее максимальной скорости вращения, на 10 с, чтобы подвергнуть их гидродинамическому воздействию.

Вторую запись изображения осуществляли в тех же самых условиях, что и запись первого изображения, и полученное конечное изображение представлено на фиг. 6В.

Как представлено на фиг. 6В, видны более или менее хорошо определенные точки и пятна, и их внешний вид зависит от антибиотика и концентрации использованного антибиотика.

Как показано в этом примере, способ согласно изобретению позволяет определить эффект воздействия, например гидродинамического воздействия на биопленку. В частности, способ согласно изобретению позволяет определить стойкость одних пленок по отношению к другим в присутствии и в отсутствие агентов.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ оценки эффекта физического воздействия на целостность формируемой пленки, в котором последовательно:

a) вводят в раствор по меньшей мере одно вещество, способное образовывать пленку;

b) вводят в раствор, полученный на стадии (а), по меньшей мере две частицы, причем указанные частицы покоятся на поверхности 8, погруженной в указанный раствор;

c) перераспределяют частицы на указанной погруженной поверхности 8, при этом указанные частицы образуют на указанной поверхности точку или пятно;

б) обеспечивают формирование на поверхности 8 пленки на основе указанного вещества, причем указанные точка или пятно включены в пленку;

е) наблюдают точку или пятно на поверхности 8;

Г) прикладывают физическое воздействие к указанному раствору;

д) наблюдают точку или пятно на поверхности 8, сравнивают результаты наблюдения точки или пятна на пленке до и после воздействия и оценивают целостность пленки по отношению к указанному эффекту от физического воздействия посредством оценки состояния точки или пятна на ней;

Ь) определяют эффект воздействия, приложенного к пленке, сравнением наблюдений на вышеупомянутых стадиях (е) и (д).
2. Способ по п.1, в котором указанное физическое воздействие представляет собой механическое воздействие.
3. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором вещество, способное образовывать пленку или биопленку, выбрано среди микроорганизмов, продуктов питания, химических веществ.
4. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором частицы представляют собой магнитные или намагничивающиеся частицы, указанные частицы представляют собой, независимо, магнитную или намагничивающуюся электрически заряженную частицу или частицу, покрытую по меньшей мере одним магнитным или намагничивающимся слоем.
5. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором указанные по меньшей мере две частицы освещают источником света с целью увеличения контраста между частицей и раствором.