EA023558B1

EA023558B1 - ТЕРМОСТАБИЛЬНЫЙ ПОЛИПЕПТИД С АКТИВНОСТЬЮ β-ЦЕЛЛОБИОГИДРОЛАЗЫ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА САХАРОВ ИЗ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНОГО МАТЕРИАЛА

Info

Publication number: EA023558B1
Application number: EA201101553A
Authority: EA
Inventors: Корнелис Мария Якобус Сагт; Маргот Элизабет Франсуаз Схоневелд-Бергманс; Йоханнес Андрис Раубос; Алрик Питер Лос
Original assignee: ДСМ АйПи АССЕТС Б.В.
Priority date: 2009-04-24
Filing date: 2010-04-23
Publication date: 2016-06-30
Also published as: CN102439145B; MX2011011215A; EP2421965A1; US20130145501A1; EA201101553A1; AU2010240861A1; EP2421965B1; CA2758396C; WO2010122141A1; CN102439145A; CA2758396A1; US9163224B2; AU2010240861B2; BRPI1015536A2; DK2421965T3

Abstract

Изобретение относится к термостабильному полипептиду, обладающему активностью β-целлобиогидролазы, кодирующему его полинуклеотиду, вектору, клетке и трансгенному растению, содержащим указанный полинуклеотид, и применению заявленного полипептида для производства сахара из лигноцеллюлозного материала.

Description

(57) Изобретение относится к термо стабильному полипептиду, обладающему активностью βцеллобиогидролазы, кодирующему его полинуклеотиду, вектору, клетке и трансгенному растению, содержащим указанный полинуклеотид, и применению заявленного полипептида для производства сахара из лигноцеллюлозного материала.

023558 В1

Область техники

Изобретение относится к последовательностям, содержащим гены, которые кодируют полипептиды, обладающие деградирующей активностью по отношению к углеводному материалу. Изобретение описывает кодирующую последовательность нового гена полной длины, а также аминокислотную последовательность функционального белка полной длины и варианты и фрагменты гена или аминокислотной последовательности. Изобретение также относится к способам применения этих белков в промышленных процессах. Кроме того, в изобретение включаются клетки, трансформированные полинуклеотидом, согласно изобретению пригодные для производства этих белков. Кроме того, изобретение относится к успешной экспрессии генов, которые кодируют полипептиды, обладающие деградирующей активностью в отношении углеводного материала в ЛзрегдШиз шдег.

Уровень техники

Углеводы являются наиболее распространенными органическими соединениями на Земле. Тем не менее, большая часть этих углеводов изолирована в сложных полимерах, включая крахмал (главный запасной углевод в семенах и зерне), а также набор углеводов и лигнин, известный как лигноцеллюлоза. Основными углеводными компонентами лигноцеллюлозы являются целлюлоза, гемицеллюлоза и пектины. Эти сложные полимеры часто называют общим названием лигноцеллюлоза.

Биоконверсия возобновляемой лигноцеллюлозной биомассы в способный к брожению сахар, который впоследствии сбраживается в целях получения спирта (например, этанола) в качестве альтернативы жидкому топливу, привлекало пристальное внимание исследователей с 1970-х годов, когда нефтяной кризис разразился из-за снижения выхода нефти ОПЕК. Этанол широко применялся в виде 10% смеси с бензином в США или в виде чистого топлива для автомобилей в Бразилии в последние два десятилетия. В последнее время Е85, смесь 85% этанола, применялся специально для чистых приложений в городах. Важность топливного биоэтанола будет расти параллельно с ростом цен на нефть и постепенным истощением ее источников. Кроме того, ферментируемые сахара используются для производства пластмасс, полимеров и других биопродуктов, и эта отрасль, как ожидается, существенно возрастет, таким образом увеличивая спрос на избыточные, ферментируемые сахара низкой стоимости, которые могут быть применены в качестве сырья вместо сырья на основе нефти.

Изоляция таких больших количеств углеводов в растительной биомассе относится к обильный источник потенциальной энергии в виде сахаров, как пятиуглеродных, так и шестиуглеродных сахаров, которые могут быть применены для многих промышленных и сельскохозяйственных процессов. Тем не менее, огромный потенциал энергии этих углеводов в настоящее время недостаточно используется, потому что сахар заблокированы в сложных полимерах, и, следовательно, не являются легкодоступными для ферментации. Методы, которые генерируют сахара из растительной биомассы, обеспечат обильным, экономически конкурентным сырьем для ферментации в химикаты, пластмассы, такие как, например, янтарная кислота и (био)топлива, включая этанольное, метанольное, бутанольное синтетическое жидкие топлива и биогаз.

Независимо от типа целлюлозного сырья, стоимость и эффективность гидролитических ферментов являются основными факторами, которые ограничивают коммерциализацию процессов биоконверсии биомассы. Себестоимость производства ферментов, получаемых микробиологическим путем, тесно связана с производительностью штамма, продуцирующего фермент, и финальным выходом активности в ферментационном бульоне.

Несмотря на продолжающиеся исследования в течение последних нескольких десятилетий с целью понять ферментативную деградацию лигноцеллюлозной биомассы и производство целлюлазы, остается желательным обнаружить или спроектировать новые высокоактивные целлюлазы и гемицеллюлазы. Также было бы крайне желательно создать высокоэффективную композицию ферментов, способную выполнять быструю и эффективную биодеградацию лигноцеллюлозных материалов, в частности, таких целлюлаз и гемицеллюлаз, которые увеличили бы термостойкость.

Такие ферменты могут быть применены для производства сахара для ферментации в химикаты, пластмассы, такие как, например, янтарная кислота и (био)топлива, включая этанольное, метанольное, бутанольное синтетические жидкие топлива и биогаз, для силосования, а также в качестве фермента в других промышленных процессах, например в пищевой или кормовой, текстильной, целлюлозной или бумажной промышленности или промышленности моющих средств и других отраслях промышленности.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим полипептиды, имеющие способность деградировать (т.е. содействовать в деградации) углеводы (например, полисахариды), в частности, лигноцеллюлозу. Полинуклеотиды по изобретению обычно кодируют полипептид, имеющий целлобиогидролазную активность.

Изобретение также относится к естественно и рекомбинантно производимым полипептидам, имеющим такую активность, а также рекомбинантным клеточным линиям, производящим такие ферменты. Кроме того, предлагаются способы изготовления и применения полинуклеотидов и полипептидов по изобретению.

В соответствии с изобретением предлагается, таким образом, полипептид, обладающий дегради- 1 023558 рующей активностью в отношении углеводного материала или углеводгидролизующей активностью, который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в 8ЕО ГО N0: 2 или аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью 8Е0 ГО N0: 1 или 8Е0 ГО N0: 4, или вариантный полипептид или его вариантный полинуклеотид, причем вариантный полипептид имеет по меньшей мере 96% идентичности последовательности с последовательностью, приведенной в 8Е0 ГО N0: 2, или вариантный полинуклеотид кодирует полипептид, который имеет по меньшей мере 93% идентичности последовательности с последовательностью, приведенной в 8Е0 ГО N0: 2.

Полипептиды согласно изобретению имеют полезные свойства, в частности, высокую ферментативную активность в деградации лигноцеллюлозы. Кроме того, они имеют высокую термостойкость. Полипептиды согласно изобретению сохраняют высокую относительную активность (% от первоначальной активности) как функцию времени инкубации (ч), например 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 ч или более, 20 ч или более, 30 ч или более, в частности, при высоких температурах, например при 65°С или более, 70°С или более.

Изобретение также предлагает полинуклеотид, который содержит:

(a) нуклеотидную последовательность, приведенную в 8Е0 ГО N0: 1 или 8Е0 ГО N0: 4, или (b) нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется выборочно с полинуклеотидом, будучи обратно комплементарной 8Е0 ГО N0: 1; или 8Е0 ГО N0: 4 или (c) нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере около 92% идентичности последовательности с нуклеотидной последовательностью 8Е0 ГО N0: 1; или 8Е0 ГО N0: 4; или (б) фрагмент нуклеотидной последовательности, как это определено в (а), (Ь) или (с), который имеет по меньшей мере около 100 нуклеотидов в длину; или (е) последовательность, которая вырождается в результате генетического кода до последовательности, как это определено в любом из (а), (Ь), (с) или (б); или (£) нуклеотидную последовательность, которая является обратно комплементарной нуклеотидной последовательности, как это определено в (а), (Ь), (с), (б) или (е).

Также в соответствии с изобретением предлагается вектор, такой как вектор экспрессии, включающий полинуклеотидную последовательность по изобретению и клетка, содержащая полипептид, полинуклеотид или вектор по изобретению.

Изобретение также предлагает способ приготовления полипептида, обладающего деградирующей активностью в отношении углеводного материала или углеводгидролизующей активностью, причем способ содержит выращивание клетки по изобретению в условиях, обеспечивающих экспрессию упомянутого полипептида и, при необходимости, восстановление экспрессированного полипептида;

полипептид, получаемый таким методом;

композицию, содержащую (ί) полипептид по изобретению и (ίί) целлюлазу и/или гемицеллюлазу и/или пектиназу.

Полипептиды по изобретению, обладающие деградирующей активностью в отношении углеводного материала или углеводгидролизующей активностью, могут быть применены в промышленных процессах. Таким образом, изобретение относится к способу обработки субстрата, содержащего углеводный материал, и этот способ содержит контактирование субстрата с полипептидом или композицией по изобретению.

В частности, изобретение предлагает способ получения сахара или сахаров из лигноцеллюлозного материала, и этот способ содержит контактирование лигноцеллюлозного материала с полипептидом или композицией по изобретению.

Сахара, произведенные таким образом, могут применяться в процессе ферментации. Таким образом, изобретение предлагает способ получения продукта ферментации, и этот способ содержит производство ферментируемого сахара, используя описанное выше, и ферментирование полученного ферментируемого сахара для того, чтобы произвести продукт ферментации.

Полипептид или композиция по изобретению также могут применяться, например, при приготовлении пищевого продукта, в процессе приготовления моющего средства, при приготовлении кормов для животных, для приготовления пульпы или при производстве бумаги или при приготовлении ткани, или при ее очистке.

Изобретение также предлагает обрабатываемый материал, получаемый при контактировании растительного материала или лигноцеллюлозного материала с полипептидом или композицией по изобретению;

продовольствие или корм, содержащие полипептид или композицию по изобретению;

растение или его часть, которое включает полинуклеотид, полипептид, вектор или клетку в соответствии с изобретением.

- 2 023558

Краткое описание фигур

Фиг. 1. Карта рОВТОР для экспрессии генов у А. тдег. Изображенным является интересующий ген (00Ι), экспрессированный от промотора (Рд1аА). Кроме того, изображен глюкоамилазная сторона (3'д1аА) кассеты экспрессии. В этом приложении интересующим геном является кодирующая последовательность ЕВА205, соответственно ЕВА207, как она определены в дальнейшем.

Фиг. 2. График относительной активности (% от начальной активности) ферментов ЕВА205 и ЕВА6 как функция времени инкубации (ч), при различных температурах (60, 65 и 70°С), в соответствии с примером 5 и сравнительным экспериментом А.

Краткое описание перечня последовательностей

ЗЕЦ ГО N0: 1 устанавливает кодирующую последовательность ЕВА205.

ЗЕЦ ГО N0: 2 устанавливает аминокислотную последовательность ЕВА205.

ЗЕЦ ГО N0: 3 устанавливает сигнальную последовательность ЕВА205.

ЗЕЦ ГО N0: 4 устанавливает кодирующую последовательность ЕВА207.

ЗЕЦ ГО N0: 5 устанавливает аминокислотную последовательность ЕВА207.

ЗЕЦ ГО N0: 6 устанавливает сигнальную последовательность ЕВА207.

Раскрытие изобретения

По всему тексту настоящего описания и прилагаемой формулы по изобретению слова содержать и включать и вариации, такие как содержит, содержащий, включает и включающий, следует понимать включительно. Т.е. эти слова предназначены для передачи возможного включения других элементов или целых чисел, специально не читаемых, где позволяет контекст.

Используемые в описании формы в единственном числе включают также ссылки на них во множественном числе (например, одного или по меньшей мере одного), если контекс не указывает явно иное. К примеру, элемент может означать один элемент или более чем один элемент.

Настоящее изобретение предлагает полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, например, ферменты, которые обладают способностью изменять, например, деградировать, углеводный материал. Углеводный материал является материалом, который содержит, состоит или в значительной степени состоит из одного или более углеводов. Ферменты являются здесь подклассом полипептидов.

Субстрат (также называемый сырьем) здесь используется для обозначения вещества, которое содержит углеводный материал, который можно обрабатывать ферментами в соответствии с изобретением, так что углеводный материал здесь изменяется. В дополнение к углеводному материалу субстрат может содержать любой другой компонент, в том числе, но не ограничиваясь ими, неуглеводный материал и крахмал.

Как правило, полипептид по изобретению кодирует полипептид, имеющий, по меньшей мере, целлобиогидролазную активность, условно названную ЕВА205, имеющий аминокислотную последовательность в соответствии с ЗЕЦ ГО N0: 2, соответственно ЕВА207, имеющий аминокислотную последовательность в соответствии с ЗЕЦ ГО N0: 5, или последовательность, которая является ее вариантом, как правило, функционально эквивалентным полипептиду, имеющему последовательность ЗЕЦ ГО N0: 2, ЗЕЦ ГО N0: 5 или последовательность, которая либо является его фрагментом. Различие между ЕВА205 и ЕВА207 заключается в сигнальной последовательности. ЕВА205 имеет свою собственную сигнальную последовательность, в то время как ЕВА207 имеет РтеА (сигнальную последовательность пектинметилэстеразы из АкрегдШик огу/ае) в качестве сигнальной последовательности. Без сигнальной последовательности ЕВА205 и ЕВА207 идентичны. Зрелый полипептид (фермент) является тем же самым для ЕВА205 и ЕВА207.

При этом, целлобиогидролаза (ЕС 3.2.1.91) является любым полипептидом, который способен катализировать гидролиз 1,4-в-И-глюкозидных связей в целлюлозе или целлотетраозе, высвобождая целлобиозу из невосстановленных концов цепей. Этот фермент также может называться целлюлаза, 1,4-βцеллобиозидаза, 1,4-в-целлобиогидролаза, 1,4-в-И-глюканцеллобиогидролаза, авицелаза, экзо-1,4-3-Иглюканаза, экзоцеллобиогидролаза или экзоглюканаза.

Полипептид по изобретению может иметь одну или несколько альтернативных и/или дополнительных деградирующих углеводы и/или гидролизирующих углеводы активностей, отличных от целлобиогидролазной активности, например, одна из других деградирующих углеводы и/или гидролизирующих углеводы активностей, упомянутых в настоящем документе. Целлобиогидролаза может быть целлобиогидролаза Ι, целлобиогидролаза ΙΙ или любая другая форма.

Углевод в данном контексте включает в себя все сахариды, например полисахариды, олигосахариды, дисахариды и моносахариды.

Полипептид согласно изобретению может изменять углеводный материал химической деградацией или физической деградацией такого материала или гидролизом углеводов. Химическая модификация

- 3 023558 углеводного материала может привести к деградации такого материала, например, путем гидролиза, окисления или другой химической модификации, такой же, как действием лиазы. Физическая модификация может или может не сопровождаться химической модификацией.

Подходящие углеводные материалы.

Некрахмальным углеводом, подходящим для модификации полипептида по изобретению, является лигноцеллюлоза. Основными полисахаридами, содержащими различные лигноцеллюлозные остатки, которые могут рассматриваться в качестве потенциального возобновляемого сырья, являются целлюлоза (глюкан), гемицеллюлозы (ксиланы. гетероксиланы, и ксилоглюканы). Кроме того, некоторые гемицеллюлозы могут присутствовать в виде глюкомананнов, например, в сырье лесного происхождения. Ферментативный гидролиз этих полисахаридов до растворимых сахаров, например, глюкозы, ксилозы, арабинозы, галактозы, фруктозы, маннозы, рамнозы, рибозы, Ό-галактуроновой кислоты и других гексоз и пентоз происходит под действием различных ферментов, действующих совместно.

Кроме того, пектины и другие пектиновые вещества, такие как арабинаны, могут составить значительную долю сухой массы типичных клеточных стенок из недревесных растительных тканей (около четверти до половины сухой массы может быть пектинами).

Целлюлоза линейного полисахарида состоит из остатков глюкозы, связанных в-1,4-связями. Линейный характер целлюлозных волокон, а также стехиометрия β-связанной глюкозы (по отношению к α) создает структуры, более склонные к созданию внуриразветвленных водородных связей, чем сильно разветвленные α-связанные структуры крахмала. Таким образом, полимеры целлюлозы, как правило, менее растворимы и образуют более тесно связанные волокна, чем волокна, найденные в крахмале.

Гемицеллюлоза представляет собой сложный полимер, и его состав часто меняется в широких пределах от организма к организму и от одного типа ткани к другому. В общем, основной компонент гемицеллюлозы является в-1,4-связанная ксилоза, пятиуглеродный сахар. Однако, эта ксилоза часто разветвляется по атомам 0-3 и/или 0-2 и может образовывать связи с арабинозой, галактозой, маннозой, глюкуроновой кислотой, галактуроновой кислотой или этерификацией до уксусной кислоты (и этерификацией феруловой кислоты до арабинозы). Гемицеллюлоза также может содержать глюкан, который является общим термином для β-связанных шестиуглеродных сахаров (например, в-(1,3)(1,4)-глюканы и гетероглюканы, упомянутые выше) и дополнительно глюкомананны (в которых и глюкоза и манноза присутствуют в линейном остове, связанные друг с другом по β-связи).

Состав, характер замещения и степень разветвленности гемицеллюлозы очень отличается в двудольных растений (двудольное, т.е. растение, семена которого имеют две семядоли или зародышевых листа, такие как бобы Лимы, арахис, миндаль, горох, фасоль) по сравнению с однодольными растениями (однодольные, т.е. растения, имеющие одну семядолю или зародышевый лист, такие как кукуруза, пшеница, рис, злаки, ячмень). В двудольных, гемицеллюлоза в основном состоит из ксилоглюканов, которые являются 1,4-в-связанными цепями глюкозы с 1,6-в-связанными боковыми цепями ксилозы. В однодольных, в том числе большинстве зерновых культур, основными компонентами гемицеллюлозы являются гетероксиланы. Они, прежде всего, состоят из полимеров с остовом из 1,4-в-связанной ксилозы, к которым присоединены 1,3-α связями арабиноза, галактоза, манноза и глюкуроновая кислота или 4-Ометил-глюкуроновая кислота, а также ксилозы, модифицированной остатками уксусных кислот, связанными сложноэфирными мостиками. Присутствуют также β-глюканы, состоящие из 1,3- и 1,4-βсвязанных глюкозильных цепей. В однодольных целлюлоза, гетероксиланы и β-глюканы могут находиться в примерно равных количествах, причем каждый из которых содержит около 15-25% сухого вещества клеточных стенок. Кроме того, разные растения могут содержать разное количество и разные композиции пектиновых веществ. Например, сахарная свекла содержит около 19% пектина и около 21% арабинана на основе сухого веса.

Соответственно, композиция по изобретению может быть адаптирована с учетом особенности сырья (также называемого субстрат), который будет применяться. Т.е. спектр активностей в композиции по изобретению может варьироваться в зависимости от исходного сырья в вопросе.

Ферментные комбинации или физические обработки могут применяться одновременно или последовательно. Ферменты могут производиться экзогенно в микроорганизмах, дрожжах, грибах, бактериях и растениях, затем выделяться и добавляться к лигноцеллюлозному сырью. Альтернативно, ферменты производятся, но не изолируются, и ферментативный бульон, содержащий неочищенную клеточную массу или растительный материал (такой, как кукурузный силос), и т.п. добавляются в сырье. Альтернативно, неочищенная клеточная масса или среда продукции фермента или растительный материал могут обрабатываться для предотвращения дальнейшего роста микроорганизмов (например, нагреванием или добавлением антимикробных препаратов), затем добавляться к сырью. Эти неочищенные ферментные смеси могут включать в себя организм, производящий фермент. Альтернативно, фермент можно получать ферментацией, которая использует сырье (такое, как, кукурузный силос), чтобы обеспечить питание для организма, который производит фермент(ы). Таким образом, растения, которые производят ферменты, могут служить лигноцеллюлозным сырьем и добавляться в лигноцеллюлозное сырье.

- 4 023558

Ферментативная активность.

Эндо-1,4-в-глюканазы (ЕС) и экзоцеллобиогидролазы (СВН) катализируют гидролиз нерастворимой целлюлозы до целлоолигосахаридов (целлобиоза как основной продукт), в то время как βглюкозидазы (ВСЬ) преобразуют олигосахариды, в основном целлобиозу и целлотриозу, в глюкозу.

Ксиланазы вместе с другими вспомогательными ферментами, например, α-Ьарабинофуранозидазами, ферулоил- и ацетилксиланэстеразами, глюкоронидазами и β-ксилозидазами катализируют гидролиз части гемицеллюлоз.

Пектиновые вещества включают пектины, арабинаны, галактаны и арабиногалактаны. Пектины являются самыми сложными полисахаридами клеточной стенки растений. Они строятся вокруг основной цепи остатков α (1,4)-связанных Ό-галактуроновой кислоты, перемежающихся до некоторой степени с Ьрамнозой. В любой клеточной стенке имеется ряд структурных единиц, которые соответствуют этому описанию, и, как правило, считается, что в одной пектиновой молекуле основные цепи различных структурных элементов непрерывно соединены друг с другом.

Пектиназы включают, например, эндополигалактуроназу, пектин-метилэстеразу, эндогалактаназу, бета-галактозидазу, пектин-ацетилэстеразу, эндопектинлиазу, пектатлиазу, рамнозидазу, экзогалактуроназу, эксполигалактуронатлиазу, рамногалактуронан-гидролазу, рамногалактуронан-лиазу, рамногалактуронан-ацетилэстеразу, рамногалактуронан-галактурогидролазу, ксилогалактуроназу, αарабинофуранозидазу.

Основными типами структурной единицы являются: галактуронан (гомогалактуронан), в котором карбоксильная группа и ацетат могут быть замещены метанолом по атому 0-2 и 0-3; рамно галактуронан I (ΚΟΙ), в котором остатки галактуроновой кислоты чередуются с остатками рамнозы, несущими боковые цепи (1,4)-связанного галактана и (1,5)-связанного арабинана. Арабинановые боковые цепи могут прикрепляться к рамнозе непосредственно или косвенно, через галактановые цепи; к ксилогалактуронану, с одиночными остатками ксилозила по 0-3 галактуроновой кислоте (тесно связанной с ΚΟΙ), а также к рамногалактуронану II (ΚΟΙΙ), особенно сложной второстепенной единице, содержащей необычные сахара, например апиозу. Единица ΚΟΙΙ может содержать два апиозильных остатка, которые при соответствующих ионных условиях могут обратимо образовывать сложные эфиры с боратом.

Как указано выше, полипептид по изобретению обычно имеет целлобиогидролазную активность. Тем не менее, полипептид по изобретению может иметь одну или более активностей, изложенных выше, в дополнение или как альтернатива этой активности. Кроме того, композиция по изобретению, как описано здесь, может иметь одну или более активностей, упомянутых выше, в дополнение к активности, обеспечиваемой полипептидом по изобретению, имеющим целлобиогидролазную активность.

Полинуклеотидная последовательность.

Изобретение предлагает геномные полинуклеотидные последовательности, содержащие ген, кодирующий ЕВА205 или ЕВА207, а также его кодирующую последовательность. Таким образом, изобретение относится к изолированному полинуклеотиду, содержащему геномную нуклеотидную последовательность в соответствии с кодирующей нуклеотидной последовательностью в соответствии с 8Е0 ГО N0: 1 или 8Е0 ГО N0: 4, а также с их вариантами, такими как функциональные эквиваленты.

В частности, изобретение относится к изолированному полинуклеотиду, который способен к гибридизации выборочно, например, в строгих условиях, желательно при весьма жестких условиях, с обратно комплементарным полинуклеотидом, содержащим последовательность, приведенную в 8Е0 ГО N0: 1 или 8Е0 ГО N0: 4.

Более конкретно, изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему или состоящему в основном из нуклеотидной последовательности в соответствии с 8Е0 ГО N0: 1 или 8Е0 ГО N0: 4.

Изобретение также относится к изолированному полинуклеотиду, содержащему или состоящему в основном из последовательности, которая кодирует, по меньшей мере, одну функциональную область полипептида в соответствии с 8Е0 ГО N0: 2 или 8Е0 ГО N0: 5 или ее вариант, такой как функциональный эквивалент, или либо его фрагмент.

Используемые здесь термины ген и рекомбинантный ген относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые могут быть выделены из хромосомной ДНК, которые включают в себя открытую рамку считывания, кодирующую белок, например, целлобиогидролазу, в соответствии с настоящим изобретением.

Ген может включать в себя кодирующие последовательности, некодирующие последовательности, интроны и/или регуляторные последовательности. Более того, термин ген может относиться к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, как это определено в настоящем документе.

Молекула нуклеиновой кислоты по данному изобретению, такая как молекула нуклеиновой кислоты, имеющая нуклеотидную последовательность 8Е0 ГО N0: 1 или 8Е0 ГО N0: 4 или ее вариант, такой как функциональный эквивалент, можно изолировать с применением стандартных методов молекулярной биологии и информации о последовательности, приведенной в данном документе. Например, применяя всю или часть последовательности нуклеиновой кислоты 8Е0 ГО N0: 1 или 8Е0 ГО N0: 4 в качестве гибридизационного зонда, молекулы нуклеиновой кислоты в соответствии с изобретением можно изоли- 5 023558 ровать с применением стандартных методов гибридизации и клонирования (например, как описано в 8атЬтоок, ί.. Ртйзй, Е.Р., и Машайк, Т. Молекулярное клонирование: Лабораторное руководство. 2'¹. редактор, Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЬога1огу, Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЬога1огу Рте88, Со1б δρτίη^ НагЬог, ΝΥ, 1989).

Более того, молекула нуклеиновой кислоты, охватывающая всю или часть 8ЕО ГО N0: 1 или 8Е0 ГО N0: 4, может быть выделена полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с применением синтетических олигонуклеотидных праймеров, разработанных на основе информации о последовательности, содержащейся в §ЕЦ ГО N0: 1 или §ЕЦ ГО N0: 4.

Нуклеиновая кислота по изобретению может быть амплифицирована с применением кДНК, мРНК или, наоборот, геномной ДНК, в качестве шаблона и соответствующих олигонуклеотидных праймеров, в соответствии со стандартными методами ПЦР-амплификации. Нуклеиновую кислоту, амплифицированную таким образом, можно клонировать в соответствующий вектор и характеризовать анализом последовательности ДНК.

Кроме того, олигонуклеотиды, соответствующие нуклеотидной последовательности в соответствии с изобретением или гибридизуемые с нуклеотидной последовательностью в соответствии с изобретением, могут быть получены стандартными синтетическими методами, например, с применением автоматизированного синтезатора ДНК.

В предпочтительном варианте осуществления изолированная молекула нуклеиновой кислоты по изобретению содержит нуклеотидную последовательность, показанную в §ЕЦ ГО N0: 1 или §ЕЦ ГО N0: 4.

В другом предпочтительном варианте осуществления изолированная молекула нуклеиновой кислоты по изобретению содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая является обратно комплементарной нуклеотидной последовательности, показанной в §ЕЦ ГО N0: 1 или §ЕЦ ГО N0: 4 или варианту, являющемуся функциональным эквивалентом, одной из этих нуклеотидных последовательностей.

Молекулой нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной другой нуклеотидной последовательности, является молекулой нуклеиновой кислоты, которая достаточно комплементарна другой нуклеотидной последовательности, так что она может гибридизоваться с другой нуклеотидной последовательностью, тем самым формируя стабильный дуплекс.

Один аспект по изобретению относится к молекулам изолированной нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептид по изобретению, или вариант, являющийся его функциональным эквивалентом, например, биологически активный фрагмент или домен, а также молекулы нуклеиновой кислоты, достаточные для применения в качестве гибридизационных зондов для идентификации молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих полипептид по изобретению и фрагменты таких молекул нуклеиновой кислоты, пригодные для применения в качестве ПЦР-праймеров для амплификации или мутации молекул нуклеиновой кислоты.

Полинуклеотид в соответствии с изобретением может быть изолирован. В контексте по изобретению изолированным полинуклеотидом или изолированной нуклеиновой кислотой является участок ДНК или РНК, который непосредственно не соединен с одной или обеими кодирующими последовательностями, с которыми он непосредственно граничит (с одной на 5'-конце и одной на З'-конце) в естественно встречающемся геноме организма, из которого он получен. Таким образом, в одном варианте осуществления, выделенная нуклеиновая кислота включает в себя некоторые или все 5'-некодирующие (например, промотор) последовательности, которые непосредственно примыкают к кодирующей последовательности. Данный термин, следовательно, включает, например, рекомбинантную ДНК, которая включена в вектор, в автономно репликацирующуюся плазмиду или вирус, или в геномную ДНК прокариот или эукариот, или которая существует как отдельная молекула (например, кДНК или фрагмент геномной ДНК, производимый ПЦР или обработкой рестрикционной эндонуклеазой) независимо от других последовательностей. Он также включает рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридного гена, кодирующего дополнительный полипептид, который практически не содержит клеточный материал, вирусный материал или культуральную среду (когда производится методом рекомбинантной ДНК), или химические предшественники или других химические вещества (когда химически синтезированные). Более того, изолированный фрагмент нуклеиновой кислоты является фрагментом нуклеиновой кислоты, который не встречается естественно, как фрагмент, и не может быть найден в естественном состоянии.

Используемые здесь термины полинуклеотид или молекула нуклеиновой кислоты предназначены для включения молекул ДНК (например, кДНК или геномных ДНК) и молекул РНК (например, мРНК) и аналогов ДНК или РНК, генерируемых с применением нуклеотидных аналогов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно двухцепочечной ДНК. Нуклеиновая кислота может быть синтезирована с применением олигонуклеотидных аналогов или производных (например, инозин или фосфоротиоатные нуклеотиды). Такие олигонуклеотиды могут быть применены, например, для приготовления нуклеиновых кислот, которые изменили способности спаривания оснований или увеличили устойчивость к нуклеазам.

Другой вариант осуществления изобретения относится к молекуле изолированной нуклеиновой кислоты, которая является антисмысловой по отношению к молекуле нуклеиновой кислоты ЕВА205 или

- 6 023558

ЕВА207, т.е. к кодирующей нити молекулы нуклеиновой кислоты ЕВА205 или ЕВА207. Также в объем изобретения включаются комплементарные нити молекул нуклеиновой кислоты, описанные здесь.

Если не указано иное, все нуклеотидные последовательности, определенные секвенированием молекулы ДНК, определяли здесь с помощью автоматизированного секвенсора ДНК, и все аминокислотные последовательности полипептидов, кодируемые молекулами ДНК, определенные здесь, были предсказаны трансляцией последовательности ДНК, определяемой как указано выше. Поэтому, как известно в данной области для любой последовательности ДНК, определенной настоящим автоматизированным подходом, любая нуклеотидная последовательность, определяемая здесь, может содержать некоторые ошибки. Нуклеотидные последовательности, определяемые автоматически, как правило, по меньшей мере около 90% идентичны, более типично по меньшей мере от около 95%, до по меньшей мере около 99,9% идентичны фактической нуклеотидной последовательности секвенированной молекулы ДНК.

Фактическая последовательность может быть более точно определена другими подходами, включая методы ручного секвенирования ДНК, хорошо известные в данной области. Как также известно в данной области, одна вставка или удаление в определяемой нуклеотидной последовательности по сравнению с фактической последовательностью вызовет такой сдвиг рамки в трансляции нуклеотидной последовательности, что предсказанная аминокислотная последовательность, кодируемая определяемой нуклеотидной последовательностью, будет полностью отличаться от аминокислотной последовательности, на самом деле кодируемой секвенированной молекулой ДНК, начиная с такой точки как вставка или удаление.

Специалист в данной области способен идентифицировать такие ошибочно идентифицированные основания и знает, как исправить такие ошибки.

Молекула нуклеиновой кислоты в соответствии с изобретением может содержать только часть или фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты, показанной в 8ЕЦ ГО N0: 1 или 8ЕЦ ГО N0: 4 (или вариант любого из них), например, фрагмент, который может быть использован в качестве зонда или праймера или фрагмента, кодирующего часть белка ЕВА205 или ЕВА207.

Нуклеотидная последовательность, определяемая из клонирования гена ЕВА205 или гена ЕВА207 и кДНК, позволяет генерировать зонды и праймеры, предназначенные для применения в идентифицировании и/или клонировании других членов семейства ЕВА205 или ЕВА207, а также гомологов ЕВА205 или ЕВА207 из других видов.

Зонд/праймер обычно содержит существенно очищенный олигонуклеотид, который обычно содержит участок нуклеотидной последовательности, который гибридизуется предпочтительно при весьма жестких условиях с, по меньшей мере, от около 12 до около 15, предпочтительно от около 18 до около 20, предпочтительно от около 22 до около 25, более предпочтительно около 30, около 35, около 40, около 45, около 50, около 55, около 60, около 65 или около 75 или более последовательными нуклеотидами нуклеотидной последовательности, показанной в 8ЕЦ ГО N0: 1 или 8ЕЦ ГО N0: 4, или варианта любой из них, являющегося ее функциональным эквивалентом.

Зонды на основе нуклеотидных последовательностей ЕВА205 или ЕВА207 могут применяться для обнаружения транскриптов или геномных последовательностей ЕВА205 или ЕВА207, кодирующих те же или гомологичные белки, например, в других организмах. В предпочтительных вариантах осуществления зонд дополнительно содержит метку, присоединенную к нему, например, меткой может быть радиоизотоп, флуоресцентное соединение, фермент или кофактор фермента. Такие пробы могут также применяться как часть набора диагностических тестов для идентификации клеток, которые экспрессируют белок ЕВА205 или ЕВА207.

Полинуклеотиды здесь могут быть синтетическими полинуклеотидами.

Синтетические полинуклеотиды могут быть оптимизированы по применению кодонов, желательно в соответствии с методами, описанными в \У0 2006/077258 и/или РСТ/ЕР2007/055943, которые здесь включены в качестве ссылки. РСТ/ЕР2007/055943 адресуется оптимизации кодоновой пары. Оптимизация кодоновых пар, в частности, используемых здесь, является способом, при котором нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид, были изменены в связи с их применением в качестве кодонов, чтобы получить улучшенную экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид и/или улучшенное производство кодируемого полипептида. Кодоновые пары определяются как набор двух последующих триплетов (кодонов) в кодирующей последовательности.

Изобретение дополнительно относится к конструкции нуклеиновой кислоте, содержащей полинуклеотид, как описано выше. Конструкция нуклеиновой кислоты определяется здесь как молекула нуклеиновой кислоты, одно- или двухцепочечная, которая изолируется из естественного гена или которую изменили так, чтобы содержать сегменты нуклеиновой кислоты, которые комбинируются и стыкуются способом, не существующим в природе. Термин конструкция нуклеиновой кислоты является синонимом термина кассета экспрессии, когда конструкция нуклеиновой кислоты содержит все контрольные последовательности, необходимые для экспрессии кодирующей последовательности. Термин кодирующая последовательность, как она определяется в настоящем документе, является последовательностью, которая транскрибируется в мРНК и транслируется в транскрипционный активатор промотора протеазы по изобретению. Границы кодирующей последовательности, как правило, определяются стартовым кодо- 7 023558 ном ΑΤΟ на 5'-конце мРНК и последовательностью стоп-кодона трансляции, заканчивающего открытую рамку считывания на 3'-конце мРНК. Кодирующая последовательность может включать, но не ограничиваться этим, ДНК, кДНК и рекомбинантные последовательности нуклеиновой кислоты. Предпочтительно, нуклеиновая кислота имеет высокое содержание ОС. Содержание ОС здесь указывает на количество нуклеотидов О и С в конструкции, деленное на общее число нуклеотидов, выраженное в %. Содержание ОС составляет предпочтительно 56% или более, 57% и более, 58% и более, 59% и более, 60% или более, или в пределах 56-70%, или в пределах 58-65%.

Предпочтительно конструкция ДНК содержит промоторную последовательность ДНК, кодирующую последовательность, управляемую упомянутой промоторной последовательностью ДНК, и контрольные последовательности, такие как:

одна последовательность прекращения трансляции, ориентированная в направлении от 5' к 3', выбранная из следующего списка последовательностей: ΤΑΑΟ, ΤΑΟΑ и ТААА, предпочтительно ТААА, и/или одна последовательность, кодирующая инициатор трансляции, ориентированная в направлении от 5' к 3', выбранная из следующего списка последовательностей:

ССТАССССС; ОСТАССТСС; ОСТАСССТС; ОСТАССТТС;

ОСТСССССС; ОСТСССТСС; ОСТССССТС; ОСТСССТТС; ОСТСССССС; ОСТСССТСС;

ОСТОСССТС; ОСТСССТТС; ОСТТССССС; ОСТТССТСС; ОСТТСССТС и ОСТТССТТС, предпочтительно ОСТ ТСС ΤΤΚ, и/или одна последовательность инициатора трансляции, выбранная из следующего списка последовательностей: $ -шхуСЬкуСААА-З , 5 -ш’Л'СЬкуСАСА-З или 5 - тц/СЬкуСААС-З, используя двусмысленные коды для нуклеотидов: ^т (А/С); λν (А/Т); у (С/Т); к (О/Т); Ь (А/С/Т), предпочтительно 5-САСССТСААА-З 'или 5'-СОСАОТСААС-3'.

В контексте данного изобретения термин последовательность, кодирующая инициатор трансляции, определяется как девять нуклеотидов, расположенных непосредственно за инициатором или стартовым кодоном открытой рамки считывания кодирующей последовательности ДНК. Инициатор или стартовый кодон кодирует метионин АА. Инициаторным кодоном является, как правило, ΑΤΟ, но также может быть любой функциональный стартовый кодон, такой как ΟΤΟ.

В контексте данного изобретения термин последовательность прекращения трансляции определяется как четыре нуклеотида, начиная со стоп-кодона трансляции на З'-конце открытой рамки считывания или кодирующей нуклеотидной последовательности, и ориентированные в направлении от 5'к 3'.

В контексте данного изобретения термин последовательность инициатора трансляции определяется как десять нуклеотидов непосредственно перед инициатором или стартовым кодоном открытой рамки считывания последовательности ДНК, кодирующей полипептид. Инициатор или стартовый кодон кодирует метионин АА. Инициаторным кодоном является, как правило, ΑΤΟ, но также может быть любой функциональный стартовый кодон, такой как ΟΤΟ. Хорошо известно в данной области, что, урацил, и, заменяет дезоксинуклеотид тимин, Т, в РНК.

Г омология.

Термины гомология, идентичность последовательности и т.п. используются как синонимы в данном документе. Для цели настоящего изобретения, здесь определяется, что для того, чтобы определить степень идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновых кислот, последовательности выравниваются для целей оптимального сравнения (например, пробелы могут вводиться в последовательность первой аминокислоты или последовательность нуклеиновой кислоты для оптимального согласования с последовательностью второй аминокислоты или нуклеиновой кислоты). Такое согласование может осуществляться на полной длине сравниваемых последовательностей. Альтернативно, выравнивание может проводиться на более коротком участке сравнения, например, на протяжении около 20, около 50, около 100 или более нуклеиновых кислот/оснований или аминокислот.

Аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих аминокислотных позициях или нуклеотидных позициях затем сравниваются. Если позиция в первой последовательности занимается тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующая позиция во второй последовательности, тогда эти молекулы одинаковы по этой позиции. Степень идентичности двух последовательностей, как правило, выражается в процентах идентичности между двумя последовательностями и является функцией числа одинаковых позиций в обеих последовательностях (т.е. % идентичности = количество идентичных позиций/общее количество позиций (т.е. совпадение позиций) х 100). Предпочтительно две сравниваемые последовательности имеют одну и ту же или существенно ту же длину.

Специалист в данной области знает о том, что несколько различных компьютерных программ являются доступными для определения гомологии между двумя последовательностями. Например, сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может выполняться с применением математического алгоритма. В предпочтительном варианте осущест- 8 023558 вления процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями определяется с применением алгоритма №еб1етаи и ХУшъск (ί. Μοί. ΒίοΙ. (48): 444-453 (1970)), который был включен в программу ΟΆΡ в пакета программного обеспечения Лсее1гу8 ОСО (продается на Ьйр://№№№.ассе1гу8.сот/ргобис18/дс§/), используя или матрицу В1о88от 62 или матрицу РАМ250, и взвешенное значение делеции 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и взвешенное значение удлинения 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Специалисту в данной области понятно, что все эти различные параметры дадут немного разные результаты, но что процент общей идентичности двух последовательностей существенно не изменяется при применении различных алгоритмов.

В еще одном варианте осуществления процент идентичности двух нуклеотидных последовательностей определяется с применением программы ОАР в пакете программного обеспечения Лссе1гу8 ОСО (продается на Ьйр://№№№.ассе1гу5.сот/ргобис15/дс§/), используя матрицу Ы^Здарбиа.СМР и взвешенное значение делеции 40, 50, 60, 70 или 80 и взвешенное значение удлинения 1, 2, 3,4, 5 или 6. В другом варианте осуществления процент идентичности между двумя аминокислотными или нуклеотидными последовательностями определяется с применением алгоритма Е. Мейерс и В. Миллер (САВЮ8, 4:11-17 (1989), который была включен в программу ΑΣΣΟΝ (версия 2.0) (имеется в запросе ΑΣΣΟΝ, используя данные последовательности сервера Оеиек1геат ΣΟΗ Монпелье Франция ЬйрУ/уедалдКспгкТг/Ып/аПдидие88.сд1) с применением таблицы веса остатков РАМ120, пенальти разрыва длиной 12 и пенальти разрыва 4.

Последовательности нуклеиновых кислот и белков по данному изобретению могут также применяться в качестве последовательности запроса для осуществления поиска в публичных базах данных для того чтобы, например, выявить другие члены семейства или родственные последовательности. Такой поиск можно выполнить с помощью программ ΝΒΣΑδΤ и ΧΒΣΑδΤ (версия 2.0) Л115ски1 и соавт. (1990) Т Мо1. Вю1. 215:403-10. Нуклеотидные поиски по ΒΣΑδΤ могут выполняться с программой ΝΒΣΑδΤ, оценка = 100, длина слова = 12 для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновых кислот ЕВА205 или ЕВА207 по изобретению. Поиск белка по ΒΣΑδΤ могут выполняться с программой ΧΒΣΑδΤ, оценка = 50, длина слова = 3 для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных белковым молекулам ЕВА205 или ЕВА207 по изобретению. Для получения прерываемых выравниваний для целей сравнения может применяться Оарреб ΒΣΑδΤ, как описано у Α1Σкски1 и соавт. (1997), №с1ею ΑΟάδ Кек. 25 (17): 3389-3402. При применении программ ΒΣΑδΤ и Оарреб ΒΣΑδΤ, параметры по умолчанию соответствующих программ (например, ΧΒΣΑδΤ и ΝΒΣΑδΤ) могут применяться. См. домашнюю страницу Национального центра биотехнологической информации на Ьйр://№№№.исЫ. п1т. ηίΗ. §оу/. 4.

Используемый здесь термин выборочная гибридизации, гибридизуется выборочно и подобные термины предназначаются для описания условий для гибридизации и промывки, в соответствии с которыми нуклеотидные последовательности, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 55%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 65%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, более предпочтительно по меньшей мере около 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере около 90%, предпочтительно не менее 95%, более предпочтительно по меньшей мере около 98% и более предпочтительно по меньшей мере около 99% гомологичных друг другу, как правило, остаются гибридизированными друг с другом. Т.е. такие гибридизованные последовательности могут иметь по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 55%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 65%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80 %, более предпочтительно по меньшей мере около 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере около 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 98% и более предпочтительно по меньшей мере около 99% идентичности последовательности.

Предпочтительным, неограничивающим примером таких условий гибридизации является гибридизация в 6Х хлориде натрия/цитрате натрия (§§С) при температуре около 45°С, с последующими одной или несколькими промывками в 1 X §§С, 0,1% δΌδ при около 50°С, предпочтительно при около 55°С, предпочтительно при около 60°С и еще более предпочтительно при около 65°С.

Чрезвычайно жесткие условия включают, например, гибридизацию около 68°С в 5х88С/5х растворе Денхардта/1,0% δΌδ и промывку в 0,2х§§С/0.1% δΌδ при комнатной температуре. Кроме того, промывка может быть выполнена при 42°С.

Специалист в данной области знает, какие условия соответствуют жестким и очень жестким условиям гибридизации. Дополнительные руководящие указания в отношении таких условий являются легко доступными в этой области, например, в §атЬгоок и др., 1989, Молекулярное клонирование, лабораторное руководство, Колд Спринг Харбор Ргекк, ΝΥ; и Αιΐ5ΐ^1 и соавт. (ред.), 1995, Сиггей Рго1осо1к ίη Мо1еси1аг Β^ο1ο§у_(^οЬи \УПеу & §оик, Ν.Υ.).

Конечно, полинуклеотид, который гибридизуется только с поли-А-последовательностью (такой как 3'-терминал-поли (А) тракт мРНК), или с комплементарной последовательностью остатков Т (или И), не будет включаться в полинуклеотид по изобретению, который используется для специфической гибриди- 9 023558 зации с частью нуклеиновой кислоты по изобретению, так как такой полинуклеотид гибридизовался бы с любой молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей поли(А) последовательность или ее комплементарную последовательность (например, практически любая двухцепочечная кДНК клона).

В типичном подходе, могут проверяться библиотеки кДНК, построенные из других организмов, например, мицелиальных грибов, в частности из микроорганизмов семейства Тпсйотасеае, например, из рода РетсШшт, такие как РетсШшт беситЬепк.

Например, штаммы РетсШшт могут проверяться на гомологичные полинуклеотиды ЕВА205 или ЕВА207 Норзен-блот анализом. При обнаружении транскриптов, гомологичных полинуклеотидам в соответствии с изобретением, библиотеки кДНК могут строиться из РНК, выделенной из соответствующего штамма, используя стандартные методики, хорошо известные специалистам в данной области. Кроме того, библиотека общей геномной ДНК может проверяться с помощью зонда, способного к гибридизации с полинуклеотидом ЕВА205 или ЕВА207 в соответствии с изобретением.

Гомологичные последовательности гена могут выделяться, например, путем проведения ПЦР с применением двух пулов вырожденных олигонуклеотидных праймеров, разработанных на основе нуклеотидных последовательностей, как показано в настоящем документе.

Шаблоном для реакции может быть кДНК, полученная путем обратной транскрипции мРНК, приготовленной из известных или подозреваемых штаммов, чтобы экспрессировать полинуклеотид в соответствии с изобретением. Продукт ПЦР можно субклонировать и секвенировать, чтобы гарантировать, что амплифицированные последовательности представляют собой последовательности новой последовательности нуклеиновой кислоты ЕВА205 или ЕВА207 или ее функционального эквивалента.

Фрагмент ПЦР можно затем применять для выделения клона кДНК полной длины различными известными методами. Например, амплифицированный фрагмент можно маркировать и применять для скрининга библиотеки кДНК бактериофагов или космид. Кроме того, помеченный фрагмент можно применять для скрининга геномной библиотеки.

ПЦР-технологию также можно применять для выделения последовательностей кДНК полной длины из других организмов. Например, РНК можно выделить в соответствии со стандартными процедурами из соответствующего клеточного или тканевого источника. Реакцию обратной транскрипции можно проводить на РНК с применением олигонуклеотидного праймера, наиболее специфичного для 5'-конца амплифицированного фрагмента для праймирования синтеза первой нити.

Образовавшийся гибрид РНК/ДНК может получить хвосты (например, с гуанинами), используя стандартную реакцию терминальной трансферазы, гибрид можно переварить РНКазой Н, и синтез второй нити можно праймировать (например, с праймером поли-С). Таким образом, последовательности кДНК перед амплифицированным фрагментом можно легко изолировать. Для обзора полезных стратегий клонирования см., например, 8атЬгоок и др., см. выше; Аи8иЬе1 и др., см. выше.

Векторы.

Другой аспект по изобретению относится к векторам, включая клонирование и экспрессию векторов, содержащих полинуклеотид по изобретению, кодирующий белок ЕВА205 или ЕВА207, или их функциональный эквивалент и методы выращивания, трансформации или трансфекции таких векторов в подходящую клетку-хозяина, например, в условиях, при которых происходит экспрессия полипептида по изобретению. Используемый здесь термин вектор относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она была связана.

Полинуклеотиды по изобретению могут быть включены в рекомбинантный воспроизводимый вектор, например, вектор клонирования или экспрессии. Вектор может применяться для репликации нуклеиновой кислоты в совместимой клетке хозяина. Таким образом, в следующем варианте осуществления, изобретение относится к способу получения полинуклеотидов по изобретению введением полинуклеотида по изобретению в воспроизводимый вектор, введением вектора в совместимую клетку хозяина, и выращиванием клетки хозяина в условиях, которые приводят к репликации вектора. Вектор можно извлечь из клетки хозяина. Подходящие клетки хозяина описаны ниже.

Вектором, в который вставляется кассета экспрессии или полинуклеотид по изобретению, может быть любой вектор, который можно удобно подвергать процедурам рекомбинантных ДНК, и выбор вектора часто зависит от клетки хозяина, в которую он должен вводиться.

Вектором в соответствии с изобретением может быть автономно реплицирующийся вектор, т.е. вектор, который существует как экстрахромосомный объект, репликация которого не зависит от хромосомной репликации, например, плазмида. Кроме того, вектором может быть тот, который, будучи введенным в клетку хозяина, интегрируется в геном клетки хозяина и реплицируется вместе с хромосомой(ами), в которой он интегрировался.

Один тип вектора является плазмидой, которая относится к круговой двухцепочечной спирали ДНК, в которую дополнительные сегменты ДНК могут лигироваться. Другим типом вектора является вирусный вектор, причем дополнительные сегменты ДНК могут лигироваться в вирусный геном. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке хозяине, в которую они вводятся (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальное происхождение репликации, и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) интегриру- 10 023558 ются в геном клетки хозяина при введении в клетку хозяина, и тем самым реплицируются вместе с геном хозяина. Кроме того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, к которым они оперативно связываются. Такие векторы называются в этом документе как векторы экспрессии. В общем, векторы экспрессии полезности в методах рекомбинантной ДНК часто находятся в форме плазмид. Термины плазмида и вектор могут применяться здесь как взаимозаменяемые, так как плазмида является наиболее часто используемой формой вектора. Тем не менее, изобретение предназначено для того, чтобы включать в себя другие формы векторов экспрессии, такие как космида, вирусные векторы (например, репликационно-дефектные ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы) и фаговые векторы, которые выполняют эквивалентные функции.

Векторы в соответствии с изобретением могут применяться в лабораторных условиях, например, для производства РНК или применяться для трансфекции или трансформации клетки-хозяина.

Вектор по изобретению может содержать два или более, например, три, четыре или пять полинуклеотидов по изобретению, например, для гиперэкспрессии.

Рекомбинантные векторы экспрессии по изобретению содержат нуклеиновую кислоту по изобретению в форме, пригодной для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке хозяина, а это значит, что рекомбинантный вектор экспрессии включает в себя одну или более регуляторных последовательностей, отобранных на основе клеток хозяина, которые будут применяться для экспрессии, и он функционально связывается с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая будет экспрессироваться.

В векторе таком, как вектор экспрессии, функционально связанный должно означать, что интересующая нуклеотидная последовательность связана с регуляторной последовательностью(ями) таким образом, что позволяет экспрессию нуклеотидной последовательности (например, в системе транскрипции/трансляции в лабораторных условиях или в клетке хозяина, когда вектор вводят в клетку хозяина), т.е. термин функционально связанный относится к непосредственному соседству, когда описанные компоненты находятся во взаимоотношении, позволяющем им функционировать по их прямому назначению. Регуляторная последовательность, такая как промотер, усилитель или другой сигнал регуляции экспрессии, функционально связанная с кодирующей последовательностью, позиционируется таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается при условии совместимости с контролирующими последовательностями или последовательности устроены так, что они функционируют согласованно по их прямому назначению, например, транскрипция инициируется на промотере и проходит через последовательность ДНК, кодирующую полипептид.

Вектор или конструкция экспрессии для данной клетки хозяина может, таким образом, содержать следующие элементы, функционально связанные друг с другом в последовательном порядке от 5'-конца к 3'-концу относительно кодирующей нити последовательности, кодирующей полипептид по первому изобретению: (1) последовательность промотора, способная направлять транскрипцию нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид в данной клетке хозяина, (2) при необходимости, сигнальная последовательность, способная направлять секрецию полипептида из данной клетки хозяина в культуральную среду; (3) последовательность ДНК по изобретению, кодирующая зрелую и, желательно, активную форму полипептида, имеющего целлобиогидролазную активность; а также, желательно, (4) область терминации транскрипции (терминатор), способную прекращать транскрипцию за нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид.

За нуклеотидной последовательностью в соответствии с изобретением может быть нетранслируемая 3'-область, содержащая один или несколько сайтов терминации транскрипции (т.е. терминатор). Происхождение терминатора не столь важно. Терминатор может, например, быть нативным для последовательности ДНК, кодирующей полипептид. Тем не менее, желательно, терминатор дрожжей используется в дрожжевых клетках хозяина и терминатор нитчатых грибов используется в хозяйских клетках нитчатых грибов. Более предпочтительно, терминатор является эндогенным к клетке хозяина (в которой нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, должна экспрессироваться). В транскрибируемом участке может присутствовать сайт связывания рибосомы для трансляции. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессированных данными конструкциями, будет включать в себя инициирующий трансляцию ЛИС в начале и терминирующий кодон, надлежащим образом позиционируемый в конце полипептида, который будет транслироваться.

Увеличенная экспрессия полинуклеотида по изобретению может также достигаться за счет выбора гетерологичных регуляторных участков, например, промотера, лидера секреции и/или терминатора участков, которые могут служить для увеличения экспрессии и, при желании, уровня секреция интересующего белка из хозяина экспрессии и/или для обеспечения индуцибельного контроля экспрессии полипептида изобретению.

Специалистам в данной области будет понятно, что дизайн вектора экспрессии может зависеть от таких факторов, как выбор клетки хозяина, которая должны трансформироваться, уровень экспрессии желаемого белка и т.д. Векторы по изобретению, такие как векторы экспрессии, могут вводиться в клетки хозяина, чтобы тем самым производить белки или пептиды, кодируемые нуклеиновыми кислотами, как описано выше (например, белки ЕВА205 или ЕВА207, мутантные формы белков ЕВА205 или ЕВА207, их фрагменты, варианты или функциональные эквиваленты). Векторы по изобретению, такие

- 11 023558 как рекомбинантные векторы экспрессии, могут предназначаться для экспрессии белков ЕВА205 или ЕВА207 в прокариотических или эукариотических клетках.

Например, белки ЕВА205 или ЕВА207 могут экспрессироваться в бактериальных клетках, таких как кишечная палочка Е.соП, клетках насекомых (с помощью бакуловирусных векторов экспрессии), нитчатых грибах, дрожжевых клетках или клетках млекопитающих. Подходящие клетки-хозяева более подробно рассматриваются в Ооеббе1, Технология экспрессии генов: Методы в энзимологии 185, Асабеш1с Ргекк, Сан-Диего, Калифорния (1990). Типичные примеры соответствующих хозяев описываются ниже.

Соответствующие культуральные среды и условия для описанных выше клеток хозяина известны в данной области.

Рекомбинантный вектор экспрессии можно транскрибировать и транслировать в лабораторных условиях, например, с помощью регуляторных последовательностей Т7 промотора и Т7 полимеразы.

Для большинства мицелиальных грибов и дрожжей, вектор или конструкция экспрессии предпочтительно интегрируются в геном клетки хозяина с целью получения стабильных трансформантов. Однако, для некоторых дрожжей доступны также подходящие эписомные векторы, в которых конструкция экспрессии может включаться для стабильного и высокого уровня экспрессии, примеры этому включают в себя векторы на основе плазмид 2ц и ρΚΌ1 ЗассПаготусек и К1иууеготусек, соответственно, или векторы, содержащие последовательность АМА (например, АМА1 из АкрегдШик). В случае конструкций экспрессии, интегрированных в геном клетки хозяина, конструкции интегрируются или в случайных локусах генома, или в заранее определенных целевых локусах с применением гомологичной рекомбинации, в этом случае целевые локусы предпочтительно содержат ген высокой экспрессии.

Соответственно, векторы экспрессии, применяемые в настоящем изобретении, включают в себя векторы хромосомного, эписомного происхождения и векторы, полученные из вирусов, например, векторы на основе бактериальных плазмид, бактериофага, дрожжевой эписомы, дрожжевых хромосомных элементов, вирусов, таких как бакуловирусы, паповавирусы, вакциниавирусы, аденовирусы, вирусы оспы птиц, вирусы псевдобешенства и ретровирусы и векторы на основе их комбинации, полученные из плазмиды и генетических элементов бактериофага, такие как космиды и фагемиды.

Термин контрольные последовательности или регуляторные последовательности определяется здесь, чтобы включить, по меньшей мере, какой-либо компонент, который может быть необходимым и/или выгодным для экспрессии полипептида. Любая контрольная последовательность может быть родной или чужеродной для последовательности нуклеиновых кислот по изобретению, кодирующей полипептид. Такие контрольные последовательности могут включать, но не ограничиваться этим, промотер, лидер, оптимальные последовательности инициации трансляции (как описано в Козак, 1991, ί. Вю1. СНет. 266:19867-19870), секреторную сигнальную последовательность, пропептидную последовательность, последовательность полиаденилирования, терминатор транскрипции. Как минимум, контрольные последовательности обычно включают в себя промотер, а также сигналы остановки транскрипции и трансляции. Как указано выше, термин функционально связанный определяется здесь как конфигурация, в которой контрольная последовательность соответствующим образом располагается по отношению к кодирующей последовательности ДНК так, что контрольная последовательность направляет производство полипептида.

Контрольные последовательности могут снабжаться линкерами с целью внедрения конкретных сайтов рестрикции, облегчающих лигирование управляющих последовательностей с кодирующей областью последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид. Термин функционально связанный определяется здесь как конфигурация, в которой контрольная последовательность соответствующим образом размещается в положение по отношению к кодирующей последовательности ДНК так, что контрольная последовательность направляет производство полипептида.

Контрольная последовательность может быть соответствующей промоторной последовательностью, последовательностью нуклеиновой кислоты, которая узнается клеткой-хозяином для экспрессии нуклеиновой кислоты. Промотерная последовательность содержит транскрипционные контрольные последовательности, которые опосредуют экспрессию полипептида. Промотером может быть любая последовательность нуклеиновой кислоты, которая проявляет транскрипционную активность в клетке, включая мутантные, усеченные, а также гибридные промотеры, и может быть получена из генов, кодирующих внеклеточные или внутриклеточные полипептиды, гомологичные или гетерологичные для клетки.

Контрольная последовательность также может быть подходящей терминирующей транскрипцию последовательностью, последовательностью, узнаваемой клеткой нитчатого гриба для окончания транскрипции. Терминирующая последовательность функционально связывается с З'-концом последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид. Любой терминатор, который функционирует в клетке, может применяться в настоящем изобретении.

Контрольная последовательность также может быть терминатором. Предпочтительные терминаторы для клеток нитчатого гриба получаются из генов, кодирующих амилазу ТАКА из А. огу/ае, глюкоамилазу (д1аА) из А. тдег, антранилатсинтазу из А. тби1аи8, альфа-глюкозидазу из А. тдег, 1грС ген и Рикагшт охукрогит и трипсиноподобную протеазу из Рикагшт охукрогит.

- 12 023558

Контрольная последовательность также может быть подходящей лидерной последовательностью, нетранслируемой областью мРНК, которая имеет важное значение для трансляции клетками нитчатых грибов. Лидерная последовательность функционально связывается с 5'-концом последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид. Любая лидерная последовательность, которая функционирует в клетке, может применяться в настоящем изобретении. Предпочтительные лидеры для клеток нитчатого гриба получаются из генов, кодирующих амилазу ТАКА из А. огу/ае и триозофосфатаизомеразу из А. пМи1ап8 и д1аА из А. тдег.

Другие контрольные последовательности можно выделять из гена ΙΡΝ8 РетсШшт или гена рсЬС, гена бета-тубулина. Все контрольные последовательности, цитируемые в \УО 01/21779, настоящим включаются ссылкой.

Контрольная последовательность также может быть последовательностью полиаденилирования, последовательностью, которая функционально связана с З'-концом последовательности нуклеиновой кислоты, и которая, когда транскрибируется, узнается клеткой нитчатого гриба как сигнал, для того чтобы добавить полиаденозиновые остатки к транскрибируемой мРНК. Любая последовательность полиаденилирования, которая функционирует в клетке, может применяться в настоящем изобретении. Предпочтительные последовательности полиаденилирования для клеток нитчатого гриба получаются из генов, кодирующих амилазу ТАКА из А. огу/ае, глюкоамилазу (д1аА) из А. шдег. антранилатсинтазу из А. пМШапк, трипсиноподобную протеазу из Рикагшт охукрогит и альфа-глюкозидазу из А. тдег.

Когда полипептид по изобретению должен секретироваться из клетки-хозяина в среду культивирования, соответствующую сигнальную последовательность можно добавить к полипептиду, чтобы направить заново синтезированный полипептид по маршруту секреции клетки хозяина. Специалист в данной области знает, как выбрать соответствующую сигнальную последовательность для определенного хозяина. Сигнальная последовательность может быть нативной для клетки хозяина, или может быть чужеродной для клетки хозяина. В качестве примера, может быть использована сигнальная последовательность из белка, нативного для клетки хозяина. Предпочтительно упомянутый нативный белок является высокосекретируемым белком, т.е. белком, который вырабатывается в количестве более 10% от общего количества белка, который секретируется. Сигнальные последовательности, желательно используемые в соответствии с изобретением, являются, например, ртеА.

В качестве альтернативы для сигнальной последовательности, полипептид по изобретению можно фузионировать с секретируемым белком-переносчиком или его частью. Такая химерные конструкция направляется на маршрут секреции с помощью сигнальной последовательности белка-переносчика или его части. Кроме того, белок-переносчик обеспечит стабилизирующий эффект по отношению к полипептиду в соответствии с изобретением и (или) может усилить растворимость. Такой белок-переносчик может быть любым белком. Предпочтительно высокосекретируемый белок используется в качестве белкапереносчика. Белок-переносчик может быть нативный или чужеродный для полипептида в соответствии с изобретением. Белок-переносчик может быть нативный или чужеродный для клетки хозяина. Примерами таких белков-переносчиков являются глюкоамилазы, препропоследовательность фактора альфаспаривания, целлюлозосвязывающий домен целлюлозосвязывающего белка А СШкОгЛит се11и1оуогаи8, глутатион δ-трансфераза, хитинсвязывающий домен хитиназы А1 ВасШик С1гси1ап8, мальтозосвязывающий домен, кодируемый геном та1Е кишечной палочки Е.соП К12, бета-галактозидаза и щелочной фосфатазы. Предпочтительным белком-переносчиком для экспрессии таких химерных конструкций в клетках АкрегдШик является глюкоамилаза. Белок-переносчик и полипептид согласно изобретению могут содержать конкретный аминокислотный мотив для облегчения выделения полипептида; полипептид в соответствии с изобретением может высвобождаться специальным высвобождающим агентом. Высвобождающий агент может быть протеолитическим ферментом или химическим агентом. Примером такого аминокислотного мотива является сайт расщепления КЕХ протеазы, который хорошо известен специалистам в данной области.

Сигнальная последовательность может применяться для облегчения секреции и выделения белка или полипептида по изобретению. Сигнальные последовательности, как правило, характеризуются центром из основных гидрофобных аминокислот, которые, как правило, отщепляется от зрелого белка во время секреции в одном или нескольких событиях расщепления. Такие сигнальные пептиды содержат сайты процессинга, которые делают возможным отщепление сигнальной последовательности от зрелых белков, в то время когда они проходят через секреторный путь. Сигнальная последовательность направляет секрецию белка, например, из эукариотического хозяина, причем трансформируется вектор экспрессии, и сигнальная последовательность впоследствии или одновременно отщепляется. Белок можно затем легко очистить от внеклеточной среды известными способами. Кроме того, сигнальную последовательность можно связать с интересующим белком с помощью последовательности, которая облегчает очистку, например, с помощью домена О8Т. Так, например, последовательность, кодирующую полипептид, можно слить с маркерной последовательностью, например последовательностью, кодирующей пептид, который облегчает очистку слитого полипептида. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления этого аспекта по изобретению маркерная последовательность является гекса-гистидиновым пептидом, таким как Таг, представленный в векторе рЦЕ (Ц1адеп, 1пс), одним из многих, которые имеют- 1З 023558 ся в продаже. Как описано в Οβηΐζ и др., Ргос. №и1. Асай. 8сг США 86:821-824 (1989), например, гексагистидин обеспечивает удобную очистку гибридного белка. НА-Таг является другим пептидом, применяемым для очистки, который соответствует эпитопу, производному белка гемаглютинина гриппа, который был описан, например, Уилсон и соавт., Се11 37:767 (1984).

Предпочтительно слитый белок по изобретению ЕВА205 или ЕВА207 производится стандартными методиками рекомбинантной ДНК. Например, фрагменты ДНК, кодирующие различные полипептидные последовательности, лигируются вместе в рамке, в соответствии с обычными методами, например, применяя для лигирования тупые концы или концы уступом, расщепление ферментов рестрикции, чтобы обеспечить соответствующий конец, заполнение липких концов в случае необходимости, обработку щелочной фосфатазой, чтобы избежать нежелательного присоединения, и ферментативное лигирование. В другом варианте осуществления слитый ген можно синтезировать обычными методами, в том числе автоматизированными синтезаторами ДНК. Кроме того, ПЦР-амплификацию фрагментов гена можно осуществить с применением якорных праймеров, которые порождают дополнительные выступы между двумя последовательными фрагментами гена, которые впоследствии могут быть отожжены и реамплифицированы для получения химерных последовательностей генов (см., например, СиггеШ Рго!осо1з ίη Мо1еси1аг Вю1о§у, ред. Аи5иЬе1 и др. Йо1т \УПеу & 8опз: 1992). Более того, в продаже имеется много векторов экспрессии, которые уже кодируют слившийся фрагмент (например, С8Т полипептид). Нуклеиновая кислота, кодирующая ЕВА205 или ЕВА207, может быть клонирована в таком векторе экспрессии так, что слившийся фрагмент связывается в рамке с белком ЕВА205 или ЕВА207.

Предпочтительно эффективность целевой интеграции в геном клетки-хозяина, т.е. интеграция в предопределенном целевом локусе, увеличивается расширенными способностями гомологичной рекомбинации клетки хозяина. Такой фенотип клетки предпочтительно включает в себя недостаточность генов 1йГА или 1ЙГВ, как описано в \У0 2005/095624. \У0 2005/095624 раскрывает предпочтительный метод получения клетки нитевидных грибов, содержащей повышенную эффективность целевой интеграции.

По выбору, клетка хозяина содержит повышенный ответ развернутого белка (ИРК), по сравнению с клеткой дикого типа, для увеличения способностей производства интересующего полипептида. ИРК можно увеличивать методиками, описанными в И82004/0186070 А1 и/или И82001/0034045 А1 и/или \У0 01/72783 А2 и/или \У0 2005/123763. В частности, модулировался уровень белка НАС1 и/или 1КЕ1 и/или РТС2, и/или белок 8ЕС61 разработали для того, чтобы получить клетку хозяина, имеющую повышенный ИРК.

В качестве альтернативы или в сочетании с повышенным ИРК клетка хозяина модифицируется генетически для получения фенотипа, отображающего низкую экспрессию протеазы и/или протеазную секрецию по сравнению с клеткой дикого типа с целью повышения способностей производства интересующего полипептида. Такой фенотип может быть получен удалением и/или модификацией и/или инактивацией транскрипционного регулятора экспрессии протеаз. Таким транскрипционным регулятором является, например, рйТ. Снижение экспрессии протеаз модуляцией рйТ можно осуществлять методами, описанными в И82004/0191864 А1.

В качестве альтернативы или в сочетании с повышенным ИРК и/или фенотипом, отображающим низкую экспрессию протеазы и/или протеазную секрецию, клетка хозяина отображает оксалатнедостаточный фенотип в целях повышения выхода производства интересующего полипептида. Оксалатнедостаточный фенотип можно получить с помощью методов, описанных в \У0 2004/070022 А2.

В качестве альтернативы или в сочетании с повышенным ИРК и/или фенотипом, отображающим низкую экспрессию протеазы и/или протеазную секрецию и/или недостаточность оксалата, клетка хозяина отображает сочетание фенотипических различий по сравнению с дикой клеткой для повышения выхода производства интересующего полипептида. Эти различия могут включать в себя, но не ограничиваясь этим, снижение экспрессии глюкоамилазы и/или нейтральной альфа-амилазы А и/или нейтральной альфа-амилазы В, протеазы, и гидролазы щавелевой кислоты. Упомянутые фенотипические различия, отображаемые клеткой хозяина, могут быть получены путем генетической модификации согласно методам, описанным в И82004/0191864А1.

В качестве альтернативы или в сочетании с повышенным ИРК и/или фенотипом, отображающим низкую экспрессию протеазы и/или протеазную секрецию и/или недостаточность оксалата и сочетание фенотипических различий по сравнению с дикой клеткой для повышения выхода производства интересующего полипептида, клетка хозяина показывает недостаточность генов токсинов, отключающую способность клетки хозяина нитчатых грибов, экспрессировать токсинов. Такие токсины включают в себя, но не ограничиваясь этим, охратоксины, фумонизины, циклопиазоновую кислоту, 3-нитропропионовую кислоту, эмодин, малформин, афлатоксины и секалоновую кислоту. Такая недостаточность является предпочтительной, как описано в \У0 2000/039322.

(Сверх)экспрессия.

В предпочтительном варианте осуществления полинуклеотиды по данному изобретению, как описано здесь, могут сверхэкспрессироваться в микробном штамме по изобретению по сравнению с родительским микробным штаммом, причем упомянутый ген не является сверхэкспрессированным. Сверхэкспрессия полинуклеотидной последовательности определяется здесь как экспрессия упомянутой по- 14 023558 следовательности гена, которая приводит к активности фермента, кодируемого упомянутой последовательностью в микробном штамме, будучи по меньшей мере 1,5-кратной активности фермента в родительском микробном штамме; предпочтительно, активность упомянутого фермента является, по меньшей мере, около 2-кратной, более предпочтительно по меньшей мере около 3-кратной, более предпочтительно по меньшей мере около 4-кратной, более предпочтительно по меньшей мере около 5-кратной, еще более предпочтительно по меньшей мере около 10-кратной, и наиболее предпочтительно по меньшей мере около 20-кратной активности фермента в родительском микроорганизме.

Вектор может дополнительно включать последовательности, фланкирующие полинуклеотид, что приводит к РНК, которая содержит последовательности, гомологичные эукариотическим геномным последовательностям или вирусным геномным последовательностям. Это позволит введение полинуклеотидов по изобретению в геном клетки хозяина.

Интегративный вектор клонирования может интегрироваться случайно или в заданный целевой локус в хромосоме(ах) клетки-хозяина, в которую он будет интегрирован. В предпочтительном варианте осуществления по изобретению, интегративный вектор клонирования может содержать фрагмент ДНК, который гомологичен последовательности ДНК в предопределенном целевом локусе в геноме клетки хозяина для направления интеграции вектора клонирования в этот предопределенный локус. В целях содействия направленной интеграции, вектор клонирования может быть предпочтительно линеаризован до трансформации клетки-хозяина. Линеаризацию можно предпочтительно выполнять так, что, по меньшей мере, один, а желательно оба конца вектора клонирования фланкировался последовательностями, гомологичными целевому локусу. Длина гомологичных последовательностей, фланкирующих целевой локус, составляет предпочтительно по меньшей мере около 0.1 кЬ, по меньшей мере, около 0.2 кЬ, более предпочтительно по меньшей мере около 0,5 кЬ, еще более предпочтительно по меньшей мере около 1 кЬ, наиболее предпочтительно по меньшей мере около 2 кЬ. Предпочтительно родительские штаммы хозяина можно изменять для повышения частоты направленной интеграции ДНК, как описано в АО 05/095624 и/или АО 2007/115886.

Пример делеции, приведенный в настоящем изобретении, использует промотер гена как 5'-фланг и гена как 3'-фланг, чтобы вставить маркер выбора между промотором и геном, тем самым нарушая (т.е. функционально инактивируя) транскрипцию генов. Генные последовательности, приведенные выше, могут быть применены, чтобы сделать аналогичные функционально инактивированные гены. Гены могут быть разделены на две части, давая 5'-фланг и 3'-фланг, но ген может быть также использован для клонирования большого куска геномной ДНК, содержащего промотор и терминатор участков гена, которые затем могут функционировать как 5'-фланг и 3'-фланги.

Векторная система может быть одним вектором, таким как одна плазмиды, или двумя и более векторами, такими как две или более плазмиды, которые вместе содержат суммарную ДНК, которая должна вводиться в геном клетки хозяина.

Вектор может содержать полинуклеотид по изобретению, ориентированный в антисмысловом направлении для обеспечения производства антисмысловой РНК.

Векторную ДНК можно вводить в прокариотические или эукариотические клетки с помощью обычных методик трансформации или трансфекции. Используемые здесь термины трансформация и трансфекция предназначаются для обозначения различных признанных в данной области методик для введения чужеродной нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетку хозяина, в том числе коперсипитации фосфатом кальция или хлоридом кальция, ΌΕΛΕ-декстран-опосредованную трансфекции, трансдукции, инфекции, липофекции, катионные липид-опосредованные трансфекции или электропорации. Подходящие методики для трансформации или трансфекции клеток хозяина можно найти в 8атЬгоок и др. (Молекулярное клонирование: лабораторное руководство, 2-й, под ред. Со1Д 8ргшд НагЬог ЬаЬогаФгу, Со1Д 8ргшд НагЬог ЬаЬогаФгу Рге88, Со1Д 8ргшд НагЬог, ΝΥ, 1989), Дэвис и др. Основные методы в молекулярной биологии (1986) и другие лабораторные руководства.

Для стабильной трансфекции клеток млекопитающих известно, что в зависимости от вектора экспрессии и используемого метода трансфекции, только небольшая часть клеток может интегрировать чужеродную ДНК в свой геном. Для того чтобы определить и выбрать эти интегранты, ген, который кодирует селектируемый маркер (например, устойчивость к антибиотикам), как правило, вводят в клетки хозяина вместе с интересующим геном. Предпочтительные селектируемые маркеры, включают, но не ограничиваясь этим, такие маркеры, которые придают устойчивость к лекарственным препаратам или которые дополняют дефект в клетке хозяина. Они включают в себя те универсальные маркерные гены, которые могут применяться для трансформации большинства мицелиальных грибов и дрожжей, таких как гены ацетамидазы или кДНК (гены атД§, таО, ГасА или кДНК из А. тДи1ап8, А. огу/ае или А. тдег), или гены, обеспечивающие устойчивость к антибиотикам, как 0418, гигромицин, блеомицин, канамицин, метотрексат, флеомицин, орбеномил сопротивления (ЬепА). Кроме того, могут быть применены такие специфические селектируемые маркеры, как ауксотрофные маркеры, которые требуют соответствующие мутантные хозяйские штаммы, например, НКА3 (из 8. сегеуыае или аналогичные гены из других дрожжей), ругО или ругА (из А. тДи1ап8 или А. тдег), агдВ (из А. тДи1ап8 или А. тдег) или 1грС. В предпочтительном варианте осуществления селектируемый маркер удаляется из трансформированной клетки

- 15 023558 хозяина после введения конструкции экспрессии так, чтобы получить трансформированные клетки хозяина, способные производить полипептид, которые не содержат гены селектируемого маркера.

Другие маркеры включают АТФ синтетазу, субъединицу 9 (ойС), оротидин-5'фосфатдекарбоксилазу (рутА), ген бактериальной устойчивости С418 (это также может применяться в дрожжах, но не в грибах), ген устойчивости к ампициллину (Е.сой), ген устойчивости к неомицину (ВасШиз) и ген ιιίάΛ (Е.сой), кодирующий β-глюкуронидазу (СИ8). Векторы могут быть применены в лабораторных условиях, например, для производства РНК или для трансфекции или трансформации клетки хозяина.

Экспрессия белков у прокариот часто осуществляется в Е.сой с векторами, содержащими конститутивные или индуцибельные промотеры, направляющие экспрессию слитых или неслитых белков. Векторы слияния добавляют несколько аминокислот к белку, кодируемому здесь, т.е. к Жконцу рекомбинантного белка. Такие векторы слияния обычно служат трем целям: 1) для увеличения экспрессии рекомбинантного белка, 2) для увеличения растворимости рекомбинантного белка и 3) для оказания помощи в очистке рекомбинантного белка, выступая в качестве лиганда в аффинной очистке. Часто в экспрессионных векторах слияния вводится сайт протеолитического расщепления на стыке слившегося фрагмента и рекомбинантного белка, чтобы отделить рекомбинантный белок от слившегося фрагмента после очистки слитого белка.

Как уже отмечалось, векторы экспрессии предпочтительно содержат селектируемые маркеры. Такие маркеры включают дигидрофолатредуктазу или устойчивость к неомицину для культуры эукариотических клеток и устойчивость к тетрациклину или ампициллину для культивирования в Е.сой и других бактериях.

Векторами, предпочтительными для применения у бактерий, являются, например, раскрытые в \У0А1-2004/074468, которые настоящим включены ссылкой. Другие подходящие векторы будут очевидны специалистам в данной области.

Известные бактериальные промоторы, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают промотеры, раскрытые в ^0-А1-2004/074468, которые настоящим включены ссылкой.

Транскрипция ДНК, кодирующей полипептиды по настоящему изобретению высшими эукариотами, может быть увеличена путем введения усиливающей последовательности в вектор. Усилители являются цисдействующими элементами ДНК, обычно около от 10 до 300 Ьр, которые действуют на увеличение транскрипционной активности промотора в данном типе клетки-хозяина. Примеры включают усилитель §У40, который находится в дальней области сайта инициации репликации от 100 до 270 Ьр, усилитель раннего промотора цитомегаловируса, усилитель полиомы в дальней области сайта инициации репликации и усилители аденовируса.

Контрольная последовательность может также включать подходящую лидерную последовательность, нетранслируемую область мРНК, которая является важной для трансляции клетками нитчатых грибов. Лидерная последовательность может быть функционально связана с 5'-концом последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид. Любая лидерная последовательность, которая функционирует в клетке, может применяться в данном изобретении. Предпочтительные лидеры для клеток нитчатого гриба получаются из генов, кодирующих амилазу ТАКА из АзретдШиз огу/ае и триозофосфатизомеразу из АзретдШиз пМи1апз и д1аА из АзретдШиз тдег. Другие предпочтительные инициаторные последовательности изолированы и/или раскрыты в \У0 2006/077258.

Контрольная последовательность может также включать последовательность полиаденилирования, последовательность, которая функционально связана с 3'-концом последовательности нуклеиновой кислоты, и которая, когда транскрибирована, узнается клеткой нитчатого гриба как сигнал, для добавления полиаденозиновых остатков для транскрипции мРНК. Любая последовательность полиаденилирования, которая функционирует в клетке, могут быть использована в настоящем изобретении. Предпочтительные последовательности полиаденилирования для клеток нитчатого гриба могут быть получены, например, из генов, кодирующих амилазу ТАКА из АзретдШиз огу/ае, глюкоамилазу из АзретдШиз П1дег, антранилатсинтазу из АзретдШиз пЛн1апз, трипсиноподобную протеазу из Ризалит охузрогит и альфаглюкозидазу из АзрегдШиз тдег.

Для секреции синтезированного белка в просвет эндоплазматического ретикулума, в периплазматическое пространство или во внеклеточную среду, соответствующий сигнал секреции может быть включен в экспрессированный полипептид. Сигналы могут быть эндогенными для полипептида или они могут быть гетерологичными сигналами.

Полипептид ЕВА205 или ЕВА207 может быть экспрессирован в измененном виде, например, как гибридный белок, и может включать в себя не только сигналы секреции, но и дополнительные гетерологичные функциональные области. Так, например, участок дополнительных аминокислот, в частности заряженных аминокислот, может быть добавлен к Жконцу полипептида для повышения стабильности и устойчивости в клетке хозяина, во время очистки или при последующей обработке и хранении. Кроме того, пептидные фрагменты могут быть добавлены к полипептиду для облегчения очистки.

Изобретение предлагает изолированный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕО ГО N0: 2 или 8ЕО ГО N0: 5 и аминокислотную последовательность, полу- 16 023558 ченную экспрессией полинуклеотида 8ЕЦ ГО N0: 1 или §ЕЦ ГО N0: 4 в соответствующем хозяине. Кроме того, пептид или полипептид, содержащий вариант вышеописанных полипептидов, являющийся функциональным эквивалентом, содержится в настоящем изобретении. Вышеописанные полипептиды коллективно содержатся в понятии полипептиды в соответствии с изобретением.

Термин вариантный пептид или вариантный полипептид определяется здесь как пептид или полипептид, соответственно, содержащий одно или более изменений, таких как замены, вставки, делеции и/или усечения одного или нескольких конкретных аминокислотных остатков в одной или более конкретных позициях в пептиде или полипептиде соответственно. Таким образом, вариантный сигнальный пептид является сигнальным пептидом, содержащим одно или более изменений, таких как замены, вставки, делеции и/или усечения одного или нескольких определенных аминокислотных остатков в одной или более конкретных позициях в сигнальном пептиде.

Термин полинуклеотид идентичен термину молекула нуклеиновой кислоты и может быть здесь прочитан взаимозаменяемо. Термин относится к полинуклеотидной молекуле, которая является молекулой рибонуклеиновой кислоты (РНК) или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), одноцепочечной или двухцепочечной. Полинуклеотид может находиться в изолированном виде или содержаться в рекомбинантных молекулах нуклеиновых кислот или векторов, или содержаться в клетке хозяина.

Термин вариантный полинуклеотид определяется здесь как полинуклеотид, содержащий одно или более изменений, таких как замены, вставки, делеции и/или усечения одного или более нуклеотидов в одной или более конкретных позициях в полинуклеотиде.

Термины пептид и олигопептид считаются синонимами (как это общепризнанно), и каждый термин можно применять взаимозаменяемо, в зависимости от контекста, чтобы указать цепочку, по меньшей мере, двух аминокислот, соединенных пептидными связями. Слово полипептид используется здесь для цепочек, содержащих более чем семь аминокислотных остатков. Все формулы олигопептидов и полипептидов или последовательностей здесь пишутся слева направо и в направлении от Оконца к Сконцу. Однобуквенный код аминокислот, используемый здесь, широко известен в данной области и может быть найден в ЗатЬгоок и др. (Молекулярное клонирование: лабораторное руководство, 2-й, под ред. Сой §ргшд НагЬог ЬаЬогайгу, Сой 8ргшд НагЬог ЬаЬогайгу Рге§8, Сой 8ргшд НагЬог, ΚΥ, 1989).

Полипептид или белок, удаленный из своей родной среды, считается изолированным полипептидом или белком. Например, рекомбинантно произведенные полипептиды и белки, экспрессированные в клетках хозяина, считаются изолированными для целей по изобретению, так как являются нативными или рекомбинантными полипептидами, которые были существенно очищены любым подходящим способом, таким как, например, пошаговый метод очистки, раскрытый в διηίΐΐι аиТ йЬикои, Оепе 67:31-40 (1988).

Целлобиогидролазу ЕВА205 или ЕВА207 в соответствии с изобретением можно регенерировать и очистить от рекомбинантных клеточных культур способами, известными в данной области. Наиболее предпочтительно, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) применяется для очистки.

Полипептиды по данному изобретению включают естественно очищенные продукты, продукты процедур химического синтеза, а также продукты, полученные рекомбинантными методами из прокариотического или эукариотического хозяина, в том числе, например, бактериальных, дрожжевых клеток и клеток высших растений, насекомых и млекопитающих. В зависимости от хозяина, занятого в процедуре рекомбинантного производства, полипептиды по данному изобретению могут быть гликозилированные или могут быть негликозилированные. Кроме того, полипептиды по изобретению могут также включать изначально измененный остаток метионина, в некоторых случаях, в результате хозяинопосредованных процессов.

Изобретение также включает биологически активные фрагменты полипептидов в соответствии с изобретением.

Биологически активные фрагменты полипептида по изобретению включают полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности, достаточно идентичные или полученные из аминокислотной последовательности белка ЕВА205 или белка ЕВА207 (например, аминокислотная последовательность 8Е0 ГО N0: 2 или 8Е0 ГО N0: 5), которые включают в себя меньше аминокислот, чем белок полной длины, но которые обладают, по меньшей мере, одной биологической активностью соответствующего белка полной длины. Как правило, биологически активные фрагменты содержат домен или мотив с, по меньшей мере, одним видом активности белка ЕВА205 или ЕВА207.

Биологически активный фрагмент белка по изобретению может быть полипептид, который имеет, например, около 10, около 25, около 50, около 100 или более аминокислот в длину или по меньшей мере около 100 аминокислот, по меньшей мере, 150, 200, 250, 300, 350, 400 аминокислот в длину, или длину до общего количества аминокислот полипептида по изобретению.

Более того, другие биологически активные участки, в которых другие участки белка удаляются, могут быть получены с помощью рекомбинантных технологий и оценены по одной или более биологической активности родной формы полипептида по изобретению.

Изобретение также имеет фрагменты нуклеиновых кислот, которые кодируют описанные выше биологически активные фрагменты белка ЕВА205 или ЕВА207.

- 17 023558

Белки.

В другом аспекте по изобретению, предоставляются улучшенные белки ЕВА205 или ЕВА207. Улучшенные белки ЕВА205 или ЕВА207 являются белками, где по меньшей мере одна биологическая активность улучшается. Такие белки могут быть получены путем случайного введения мутаций по всей или части последовательности, кодирующей ЕВА205 или ЕВА207, например, путем насыщенного мутагенеза, и в результате мутанты можно экспрессировать рекомбинантно и проверять на биологическую активность. Например, данная область предоставляет стандартные тесты для измерения ферментативной активности целлобиогидролазы и, следовательно, можно легко выбрать улучшенные белки.

Улучшенные варианты аминокислотных последовательностей по данному изобретению, приводящие к улучшению функции целлобиогидролазы, могут быть получены соответствующими генами по данному изобретению. В число таких изменений включаются:

1) ПЦР, склонная к ошибке, для того чтобы ввести случайные мутации, с последующей проверкой полученных вариантов и выделением вариантов с улучшенными кинетическими свойствами;

2) семейная перетасовка родственных вариантов генов, кодирующих целлобиогидролазу, с последующей проверкой полученных вариантов и выделением вариантов с улучшенными кинетическими свойствами.

Варианты генов по данному изобретению, приводящие к повышению уровня мРНК и/или белка, что приводит к более целлобиогидролазной деятельности, могут быть получены полинуклеотидными последовательностями указанных генов. В число таких изменений включаются:

1) улучшение применения кодонов таким образом, что кодоны являются (оптимально) адаптированными к родительскому микробному хозяину;

2) улучшение применения кодонной пары таким образом, что кодоны являются (оптимально) адаптированными к родительскому микробному хозяину;

3) добавление стабилизирующих последовательностей геномной информации, кодирующий целлобиогидролазу, в результате чего имеются молекулы мРНК с увеличенным периодом полураспада.

Предпочтительные способы изолировать варианты с улучшенными каталитическими свойствами или повышенным уровнем мРНК или белка описаны в \У0 03/010183 и \У0 03/01311. Предпочтительные способы оптимизации применения кодонов в родительских микробных штаммах описаны в РСТ/ЕР2007/05594. Предпочтительные методы добавления стабилизирующих элементов к генам, кодирующим целлобиогидролазу по изобретению, описаны в \У0 2005/059149.

В предпочтительном варианте осуществления белок ЕВА205 имеет аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 2. В предпочтительном варианте осуществления белок ЕВА207 имеет аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 5. В другом варианте осуществления полипептид ЕВА205 является существенно гомологичным аминокислотной последовательности в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 2 и сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность полипептида в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 2, но отличается по аминокислотной последовательности из-за естественной изменчивости или мутагенеза, как описано выше, и/или полипептид ЕВА207 является существенно гомологичным аминокислотной последовательности в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 5 и сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность полипептида в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 5, но отличается по аминокислотной последовательности из-за естественных колебаний или мутагенеза, как описано выше.

В другом предпочтительном варианте осуществления белок ЕВА205 имеет аминокислотную последовательность, кодируемую изолированным фрагментом нуклеиновых кислот, способным к гибридизации с нуклеиновой кислотой в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 1 или §ЕЦ ГО N0: 4, предпочтительно при весьма жестких условиях гибридизации.

Соответственно, белок ЕВА205 является предпочтительно белком, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, около 95-92%, предпочтительно по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в §ЕЦ ГО N0: 2 и, как правило, сохраняет по меньшей мере одну функциональную активность полипептида в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 2.

Соответственно, белок ЕВА207 является предпочтительно белком, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере около 92%, предпочтительно по меньшей мере 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной на 8ЕЦ ГО N0: 5, и, как правило, сохраняет по меньшей мере одну функциональную активность полипептида в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 5.

Функциональные эквиваленты белка по изобретению также могут быть определены, например, путем скрининга комбинаторных библиотек мутантов, например, усеченных мутантов, белка по изобретению для целлобиогидролазной активности. В одном из вариантов осуществления разнообразная библиотека вариантов генерируется комбинаторным мутагенезом на уровне нуклеиновых кислот. Разнообразную библиотеку вариантов можно получить, например, ферментативно лигированием смеси синтетических олигонуклеотидов в генетические последовательности, так что вырожденный набор потенциальных

- 18 023558 белковых последовательностей выражается в виде отдельных полипептидов, или, наоборот, в виде набора больших белков слияния (например, для отображения фага). Существуют различные способы, которые могут применяться для производства библиотеки потенциальных вариантов полипептидов по изобретению от вырожденных олигонуклеотидных последовательностей. Методы синтеза вырожденных олигонуклеотидов известны в данной области (см., например, Ыагапд (1983), ΤοίΓαΙκύΐΌη 39:3; Никита с1 а1. (1984), Αηηυ. Кеу. ВюсНет. 53:323; Никита е! а1. (1984), 8аепсе 198:1056; 1ке е! а1. (1983), Ыис1е1с ЛсИ Ке5. 11:477).

Кроме того, библиотеки фрагментов кодирующей последовательности полипептида по изобретению могут применяться для создания разнообразной популяции полипептидов для скрининга последующего отбора вариантов. Например, библиотеку кодирующей последовательности фрагментов можно получить обработкой двухцепочечного ПЦР-фрагмента интересующей кодирующей последовательности нуклеазой в условиях, при которых происходит уменьшение поперечного сечения только около одного раза на одну молекулу, денатурация двухцепочечной ДНК, ренатурация ДНК к форме двухцепочечной ДНК, которая может включать в себя смысловые/антисмысловые пары из разных порезанных продуктов, удаление одноцепочечной части из реформированных дуплексов обработкой 81 нуклеазой и лигирование результирующего фрагмента библиотеки в вектор экспрессии. Этим методом может быть получена библиотека экспрессии, которая кодирует Ν-терминальный и внутренние фрагменты различных размеров интересующего белка.

Некоторые приемы известны в данной области для скрининга генных продуктов комбинаторных библиотек, сделанных точечными мутациями усечения, а также для скрининга кДНК библиотек для генных продуктов, имеющих выбранное свойство. Наиболее широко используемые методы для скрининга больших библиотек генов, которые поддаются высокопропускному анализу, обычно включают в себя клонирование генной библиотеки в воспроизводимые векторы экспрессии, трансформирование соответствующих клеток результирующей библиотекой векторов, и экспрессирование комбинаторных генов в условиях, в которых обнаружение желаемой активности способствует изоляции вектора, кодирующего ген, продукт которого был обнаружен. Рекурсивный ансамблевый мутагенез (КЕМ), техника, которая повышает частоту функциональных мутантов в библиотеках, может быть использована в комбинации со скринингом для выявления вариантов белка по изобретению (Лгкт апН Уоигуап (1992), Ргос. №!1. Αсаά. 8с1. υ8Α 89:7811-7815; Ое1дгауе е! а1. (1993), Рго!еш Епдшеегтд 6(3): 327-331).

В дополнение к последовательности генов ЕВА205, показанной в 8ЕО ГО N0: 1 или последовательности генов ЕВА207, показанной в 8Е0 ГО N0: 4, для специалиста в данной области будет очевидно, что в пределах данной популяции могут существовать полиморфизмы последовательности ДНК, которые могут привести к изменениям в аминокислотной последовательности белка ЕВА205 или ЕВА207. Такие генетические полиморфизмы могут существовать в клетках разных популяций или в пределах популяции за счет естественной аллельной вариации. Аллельные варианты могут также включать функциональные эквиваленты.

Фрагменты полинуклеотида в соответствии с изобретением могут также содержать полинуклеотиды, не кодирующие функциональные полипептиды. Такие полинуклеотиды могут функционировать в качестве зондов или праймеров для ПЦР.

Нуклеиновые кислоты в соответствии с изобретением независимо от того, кодируют ли они функциональные или нефункциональные полипептиды, могут быть применены в качестве зондов гибридизации или праймеров полимеразной цепной реакции (ПЦР). Применение молекул нуклеиновых кислот по данному изобретению, которые не кодируют полипептид, обладающий активность ЕВА205 или ЕВА207, включают, в частности, (1) выделение гена, кодирующего белок ЕВА205 или ЕВА207, или его аллельных вариантов из кДНК библиотеки, например, из подходящих микроорганизмов; (2) ш 8Ни гибридизация (т.е. ΡΙ8Η) с метафазными расходящимися хромосомами для обеспечения точного хромосомного расположения гена ЕВА205 или гена ЕВА207, как описано в Уегта е! а1., Нитап СЬготокотек: а Мапиа1 оГ Ва81с ΤесΗη^^ие8, Регдатоп Рге88, №ν Уогк (1988); (3) норзен-блот анализ для выявления экспрессии ЕВА205 или ЕВА207 мРНК в специфических тканях и/или клетках и 4) зонды и праймеры, которые могут быть применены в качестве диагностического инструмента для анализа наличия нуклеиновой кислоты, гибридизуемой с зондом ЕВА205 или ЕВА207 в данном биологическом (например, ткань) образце.

Также охватываемым изобретением является способ получения функционального эквивалента гена ЕВА205 или ЕВА207. Такой способ влечет за собой получение меченого зонда, который включает выделенную нуклеиновую кислоту, которая кодирует всю или часть белковой последовательности в соответствии с 8Е0 ГО N0: 2 или ее вариант; скрининг библиотеки фрагментов нуклеиновых кислот с меченым зондом в условиях, позволяющих гибридизацию зонда с фрагментами нуклеиновых кислот в библиотеке, тем самым образуя дуплексы нуклеиновых кислот, и подготовку последовательности генов полной длины из фрагментов нуклеиновых кислот в любом меченом дуплексе для получения генов, связанных с геном ЕВА205 или ЕВА207.

В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота ЕВА205 или ЕВА207 по изобретению является по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей

- 19 023558 мере 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичной последовательности нуклеиновых кислот, показанной в 8Е0 ГО N0: 1 или 8Е0 ГО N0: 4, или ее комплементом.

В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота ЕВА207 по изобретению является по меньшей мере 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичной последовательности нуклеиновых кислот показанной в 8Е0 ГО N0: 4, или ее комплементом.

Предусматриваются также клетки хозяина, содержащие полинуклеотид или вектор по изобретению. Полинуклеотид может быть гетерологичным гену клетки хозяина. Термин гетерологичный, обычно по отношению к клетке хозяина, означает, что полинуклеотид не встречаются естественно в геноме клетки хозяина или что полипептид не вырабатывается естественным образом этой клеткой.

В другом варианте осуществления изобретение описывает клетки, например, трансформированные клетки хозяина или рекомбинантные клетки хозяина, которые содержат нуклеиновые кислоты, охватываемые изобретением. Трансформированной клеткой или рекомбинантной клеткой является клетка, в которую (или в предшественник которой) был введена, с помощью методов рекомбинантной ДНК, нуклеиновая кислота в соответствии с изобретением. Обе прокариотическая и эукариотическая клетки включаются, например, бактерии, грибы, дрожжи и т.п., особенно предпочтительными являются клетки нитчатых грибов, таких как АкрегдШик тдег.

Может быть выбрана клетка хозяина, которая модулирует экспрессию вставленных последовательностей или изменяет и обрабатывает продукт гена в определенном, нужном направлении. Такие модификации (например, гликозилирование) и обработка (например, расщепление) белковых продуктов могут способствовать оптимальному функционированию белка.

Различные клетки-хозяева имеют характерные и конкретные механизмы для посттрансляционной обработки и модификации белков и генных продуктов. Соответствующие клеточные линии или хозяйские системы, знакомые специалистам в области молекулярной биологии и/или микробиологии, можно выбрать для обеспечения желаемого и правильного внесения изменений и обработки экспрессированого чужеродного белка. С этой целью можно применять эукариотические клетки-хозяева, которые обладают клеточными механизмами для надлежащей обработки первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования генного продукта. Такие клетки-хозяева хорошо известны в данной области.

При желании, клетка, как описано выше, может быть использована в подготовке полипептида в соответствии с изобретением. Такой метод обычно содержит культивирование клетки хозяина (т.е. трансформированной или трансфицированной вектором экспрессии, как описано выше) в условиях, обеспечивающих экспрессию (вектором) кодирующей последовательности, кодирующей полипептид, и, возможно, восстановление экспрессированого полипептида. Полинуклеотиды по изобретению можно включать в рекомбинантный реплицируемый вектор, т.е. вектор экспрессии. Вектор можно применять для репликации нуклеиновой кислоты в совместимой клетке хозяина. Таким образом, в следующем варианте осуществления, изобретение предлагает способ изготовления полинуклеотида по изобретению введением полинуклеотида по изобретению в реплицируемый вектор, введением вектора в совместимую клетку хозяина и выращиванием клетки хозяина в условиях, которые вызывают репликацию вектора. Вектор можно извлечь из клетки хозяина.

Предпочтительно полипептид производится в виде выделенного белка, и в этом случае нуклеотидная последовательность, кодирующая зрелую форму полипептида в конструкции экспрессии, является функционально связанной с нуклеотидной последовательностью, кодирующей сигнальную последовательность. Предпочтительно сигнальная последовательность является нативной (гомологичной) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид. Альтернативно, сигнальная последовательность является чужеродной (гетерологичной) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, в этом случае сигнальная последовательность является предпочтительно эндогенной клетке хозяина, в которой экспрессируется нуклеотидная последовательность в соответствии с изобретением. Примерами подходящих сигнальных последовательностей для дрожжевых хозяйских клеток являются сигнальные последовательности, происходящие от дрожжевых генов α-фактора. Точно так же подходящей сигнальной последовательностью для хозяйских клеток нитчатого гриба является, например, сигнальная последовательность, происходящая от гена амилоглюкозидазы (АО) нитчатых грибов, например, гена д1аА из А. тдег. Это можно применять в комбинации с промотером самой амилоглюкозидазы (также называемой (глюко)амилазой), а также в комбинации с другими промотерами. Гибридные сигнальные последовательности также могут быть применены в контексте настоящего изобретения.

Предпочтительные гетерологичные лидерные последовательности секреции является теми, которые происходят от гена амилоглюкозидазы (АО) грибов (обе д1аА - 18 и 24 аминокислотные версии, например, из АкрегдШик), гена α-фактора (например, дрожжи §ассйаготусек и К1иууеготусек) или гена αамилазы (ВасШик).

Векторы можно трансформировать или трансфицировать в подходящую клетку хозяина, как описано выше, чтобы обеспечить для экспрессии полипептида по изобретению. Этот процесс может содержать культивирование клетки-хозяина, трансформированной вектором экспрессии, как описано выше, в условиях, обеспечивающий для экспрессии вектором кодирующей последовательности, кодирующей поли- 20 023558 пептид.

Хозяйские клетки.

Таким образом, изобретение относится к клеткам хозяина, трансформированным или трансфицированным или содержащим полинуклеотид или вектор по изобретению. Предпочтительно полинуклеотид переносится в вектор для репликации и экспрессии полинуклеотида. Клетки выбираются, чтобы быть совместимыми с указанным вектором и могут быть, например, прокариотическими (например, бактериальными), грибковыми, дрожжевыми или клетками растений.

Можно также выбрать гетерологичного хозяина, причем полипептид по изобретению производится в форме, которая в значительной степени свободна от других ферментов, деградирующих целлюлозу или гемицеллюлозу. Это может быть достигнуто выбором хозяина, который, как правило, не производит такие ферменты.

Изобретение охватывает процессы производства полипептида по изобретению с помощью рекомбинантной экспрессии последовательности ДНК, кодирующей полипептид. Для этого последовательность ДНК по изобретению может применяться для усиления генов и/или обмена сигналов экспрессии, таких как промоторы, сигнальные последовательности секреции, с тем, чтобы позволить экономическое производство полипептида в подходящей гомологичной или гетерологичной клетке хозяина. Гомологичной клеткой хозяина является клетка-хозяин, которая является того же вида или которая является вариантом в пределах того же вида, что и вид, из которого происходит последовательность ДНК.

Подходящие хозяйские клетки предпочтительно являются прокариотическими микроорганизмами, такими как бактерии, или более предпочтительно эукариотическими организмами, например грибами, такими как дрожжи или мицелиальные грибы, или клетками растений. В общем, дрожжевые клетки являются предпочтительнее грибковых клеток, потому что ими легче манипулировать. Однако некоторые белки либо плохо секретируются из дрожжей или в некоторых случаях не обрабатываются должным образом (например, гипергликозилирование в дрожжах). В этих случаях нужно выбрать грибковый хозяйский организм.

Клетка-хозяин может сверхэкспрессировать полипептид, и методы инженерной сверхэкспрессии хорошо известны. Хозяин может, таким образом, иметь две или более копий кодирующего полинуклеотида (и вектор, таким образом, может иметь две или более копий, соответственно).

Бактерии из рода ВасШиз очень подходят в качестве гетерологичных хозяев из-за их способности секретировать белки в культуральную среду. Другими, подходящими в качестве хозяина, являются бактерии из родов 81гер1отусез и Рзеийотопаз. Предпочтительной для экспрессии последовательности ДНК, кодирующей полипептид, является дрожжевая клетка-хозяин из родов 8ассНаготусез, К1иууетотусез, Напзепи1а, Р1сЫа, УалоМа и 8с1й/озасс11аготусез.

Более предпочтительно дрожжевая клетка-хозяин выбирается из группы, состоящей из вида 8ассНаготусез сетеу1з1ае, К1иууетотусез 1асйз (также известный как К1иууетотусез татаииз уаг.1асйз), Напзепи1аро1утогрНа, РюЫаразФлз, УалоМа йро1уйса и 8сН|/озассНаготусез ротЬе.

Наиболее предпочтительными являются, однако, (например, нитчатые) грибковые клетки-хозяева. Предпочтительные клетки-хозяева нитчатого гриба выбирают из группы, состоящей из родов АзретдШиз, ТпсНойегта/Нуросгеа, Ризалит, О1зрого1пс1шт, РетсШшт, Асгетотит, Ыеигозрога, ТНегтоазсиз, МусеПорЫога, 8рого1г1сНит, ТШе1ау1а, СНтуозролит, Ризалит, Нитюо1а, Ыеигозрога и Та1аготусез.

Более предпочтительной является клетка-хозяин из нитчатого гриба видов АзретдШиз огугае, АзретдШиз зо.)ае, АзретдШиз тйШаиз или видов из группы АзретдШиз шдег. Они включают, но не ограничиваются этим, АзретдШиз тдег, АзретдШиз а\уатоп, АзретдШиз шЬтдегМз, АзретдШиз аси1еаШз, Азретдй1из Гоеййиз, АзретдШиз пШи1апз, АзретдШиз аротсиз, АзретдШиз огугае и АзретдШиз йсиит и далее, состоящая из видов ТпсНойегта теезе1/Нуростеа .(асолпа, Ризалит дтаттеатит, Та1аготусез етегзопи, РепюШтт йеситЬепз, Асгетотит а1аЬатепзе, Ыеигозрога сгазза, МусейорЫога 1НегпаорЫ1игг1, 8рогойтсЬит се11и1орЫ1ит, О1зрого1пс1шт ШтогрНозрогит, Та1аготусез етегзопй, Та1аготусез зйрйаШз и ТЫе1ау1а Телезйгз.

Примерами предпочтительных хозяев экспрессии в рамках настоящего изобретения являются такие грибы, как вид АзретдШиз, вид РетсШшт и вид ТпсНойегта; такие бактерии, как вид ВасШиз, например, ВасШиз зиЬййз, ВасШиз 1|сНеп|Гогт1з, ВасШиз ату1о1|диеГас1епз, вид Рзеийотопаз; и такие дрожжи, как вид К1иууетотусез, например, К1иууетотусез 1асйз и вид 8ассНаготусез, например, 8ассНаготусез сегеУ1з1ае.

Клетки-хозяева в соответствии с изобретением включают растительные клетки, а также изобретение, следовательно, распространяется на трансгенные организмы, такие как растения и их части, которые содержат одну или более клеток по изобретению. Клетки могут гетерологично экспрессировать полипептид по изобретению или могут гетерологично содержать один или более полинуклеотидов по изобретению. Трансгенное (или генетически модифицированное) растение может, следовательно, иметь встроенную (например, стабильно) в свой геном последовательность, кодирующую один или более полипептидов по изобретению. Трансформация растительных клеток может выполняться с применением известных методов, например, с помощью плазмиды Ή и Κι из АдтоЬаШелит ШтеГааепз. Плазмида (или вектор) может, таким образом, содержать последовательности, необходимые для заражения растения, и произ- 21 023558 водные плазмид Τι и/или Κι могут применяться.

Альтернативно, может осуществляться прямое заражение части растения, такой, как лист, корень или стебель. Согласно этой методике, заражаемое растение может быть повреждено, например, разрезанием растения бритвой или прокалыванием растения иглой или трением растения абразивом. Рану потом прививают Α§^οЬасΐе^^ит. Растение или часть растения могут затем выращиваться на подходящей культуральной среде и развиваться в зрелые растения. Регенерация трансформированных клеток в генетически модифицированные растения может достигаться с помощью известных методик, например, выбирая трансформированные побеги, используя антибиотик, и высевая побеги на среде, содержащей соответствующие питательные вещества, растительные гормоны и т.п.

Изобретение также включает в себя клетки, которые были изменены, чтобы экспрессировать целлобиогидролазу по изобретению или ее вариант. Такие клетки включают временные, или, предпочтительно, стабильные клеточные линии высших эукариотов, таких как клетки млекопитающих или клетки насекомых, клетки низших эукариотов, таких как дрожжи и (например, нитчатые) грибковые клетки или прокариотические клетки, такие как бактериальные клетки.

Возможно также, что белки по изобретению временно экспрессируются в клеточной линии или на мембране, такой как, например, в системе экспрессии бакуловируса. Такие системы, которые приспособлены для экспрессии белков в соответствии с изобретением, также включены в рамки настоящего изобретения.

В соответствии с настоящим изобретением, производство полипептида по изобретению может осуществляться путем культивирования микробных экспрессионных хозяев, которые были преобразованы одним или более полинуклеотидами по изобретению в обычной питательной среде ферментации.

Производство полипептида/фермента.

Рекомбинантные клетки-хозяева в соответствии с изобретением можно культивировать с применением процедур, известных в данной области. Для каждой комбинации промотера и клетки-хозяина доступны культуральные условия, которые способствуют экспрессии последовательности ДНК, кодирующей полипептид. После достижения требуемой плотности клеток или титра полипептида, культура останавливается, и полипептид получают с помощью известных процедур.

Ферментационная среда может содержать известную культуральную среду, содержащую источник углерода (например, глюкозу, мальтозу, патоку, крахмал, клетчатку, ксилан, пектин, гидролизат лигноцеллюлитической биомассы и т.д.), источник азота (например, сульфат аммония, нитрат аммония, хлорид аммония и др.), источник органического азота (например, дрожжевой экстракт, солодовый экстракт, пептон и т.п.) и источники неорганических питательных веществ (например, фосфаты, магний, калий, цинк, железо и др.). При желании, можно добавлять индуктор (например, целлюлоза, пектин, ксилан, мальтоза, мальтодекстрин или ксилогалактуронан).

Выбор подходящей среды может основываться на выборе хозяина экспрессии и/или на основе нормативных требований конструкции экспрессии. Такие среды известны специалистам в данной области. Среда может, при желании, содержать дополнительные компоненты в пользу трансформированных хозяев экспрессии по сравнению с другими потенциально загрязняющими микроорганизмами.

Ферментация может проводиться в течение периода времени от около 0,5 до около 30 дней. Это может быть периодический, непрерывный или фед-периодический способ получения соответствующим образом при температуре в диапазоне 0-100°С или 0-80°С, например от около 0 до около 45°С, и/или при рН, например, от около 2 до около 10. Предпочтительные условия ферментации находятся при температуре в диапазоне от около 20 до около 37°С и/или при рН от около 3 до около 9. Соответствующие условия обычно выбираются в зависимости от выбора хозяина экспрессии и белков, которые будут экспрессироваться.

После ферментации, при необходимости, клетки можно удалить из ферментационного бульона центрифугированием или фильтрацией. После остановки ферментации или после удаления клеток полипептид по изобретению можно регенерировать и, при желании, очистить и изолировать с помощью традиционных процедур.

Полипептидный/ферментный состав.

Изобретение относится к композиции, содержащей полипептид по изобретению и целлюлазу и/или гемицеллюлазу и/или пектиназу.

Когда полипептид по изобретению является целлюлазой, композиция по изобретению, как правило, содержит гемицеллюлазу и/или пектиназу в дополнение к полипептиду по изобретению.

Когда полипептид по изобретению является гемицеллюлазой, композиция по изобретению, как правило, содержит целлюлазу и/или пектиназу в дополнение к полипептиду по изобретению.

Когда полипептид по изобретению является пектиназой, композиция по изобретению, как правило, содержит целлюлазу и/или гемицеллюлазу в дополнение к полипептиду по изобретению.

Композиция по изобретению может содержать один, два или три или более классов целлюлазы, например, один, два или все эндо-1,4-в-глюканазы (ЕО), экзоцеллобиогидролазы (СВН) и β-глюкозидазы (ΒΟΣ).

Композиция по изобретению может содержать полипептид, который имеет ту же ферментативную

- 22 023558 активность, например, тот же тип целлюлазной, гемицеллюлазной и/или пектиназной активности, которая относится к полипептиду по изобретению.

Композиция по изобретению может содержать полипептид, который имеет другой тип целлюлазной активности и/или гемицеллюлазной активности и/или пектиназной активности, чем это предусмотрено для полипептида по изобретению. Например, композиция по изобретению может содержать один вид целлюлазной и/или гемицеллюлазной активности и/или пектиназной деятельности, предусмотренной для полипептида по изобретению и второй тип целлюлазной и/или гемицеллюлазной активности и/или пектиназной активности, обеспечиваемой дополнительной гемицеллюлазой/пектиназой.

Здесь целлюлаза является любым полипептидом, который способен деградировать целлюлозу. Полипептид, который способен деградировать целлюлозу, является полипептидом, который способен катализировать процесс разрушения целлюлозы на более мелкие части, либо частично, например, на целлодекстрины, либо полностью на мономеры глюкозы. Целлюлаза в соответствии с изобретением может привести к смеси целлодекстринов и мономеров глюкозы при контакте с целлюлазой. Такая деградация, как правило, идет, как реакция гидролиза.

Здесь гемицеллюлаза является любым полипептидом, который способен деградировать гемицеллюлозу. Т.е. гемицеллюлаза может деградировать или один или более ксилана, глюкуроноксилана, арабиноксилана, глюкоманнана и ксилоглюкана. Полипептид, способный деградировать гемицеллюлозу, является полипептидом, который способен катализировать процесс разрушения гемицеллюлозы на более мелкие полисахариды, либо частично, например, на олигосахариды, или полностью на мономеры сахаров, например, на мономеры сахаров гексозы или пентозы. Г емицеллюлаза в соответствии с изобретением могут привести к смеси олигосахаридов и мономеров сахаров при контакте с гемицеллюлазой. Такая деградация, как правило, идет, как реакция гидролиза.

Здесь пектиназа является любым полипептидом, который способен деградировать пектин. Полипептид, который способен деградировать пектин, является полипептидом, который способен катализировать процесс разрушения пектина на более мелкие части, либо частично, например, на олигосахариды, или полностью на мономеры сахаров. Пектиназа в соответствии с изобретением может привести к смеси олигосахаридов и мономеров сахаров при контакте с пектиназой. Такая деградация, как правило, идет, как реакция гидролиза.

Соответственно, композиция по изобретению может содержать любую целлюлазу, например, целлобиогидролазу, эндо-в-1,4-глюканазу, β-глюкозидазу или в-(1,3)(1,4)-глюканазу.

Здесь целлобиогидролаза (ЕС 3.2.1.91) является любым полипептидом, который способен катализировать гидролиз 1,4-в-О-глюкозидных связей в целлюлозе или целлотетраозе, высвобождая целлобиозу от невосстановленных концов цепей. Этот фермент также может называться целлюлазой, 1,4-βцеллобиозидазой, 1,4-в-целлобиогидролазой, 1,4-в-Э-глюканцеллобиогидролазой, авицелазой, экзо-1,4β-Ό-глюканазой, экзоцеллобиогидролазой или экзоглюканазой. Он может иметь ЕС код ЕС 3.2.1.91.

Здесь эндо-в-1,4-глюканаза (ЕС 3.2.1.4) является любым полипептидом, который способен катализировать эндогидролиз 1,4-в-О-глюкозидных связей в целлюлозе, лихенине или β-Ό-глюкане зерновых. Также полипептид может также быть способен гидролизовать 1,4-связи в β-Ό-глюканах, также содержащих 1,3-связи. Этот фермент также может называться целлюлазой, авицелазой, β-1,4эндоглюкангидролазой, β-1,4-глюканазой, карбоксиметилцеллюлазой, целлюдекстриназой, эндо-1.4-β-^глюканазой, эндо-1,4-β-^-глюканогидролазой, эндо-1,4-β-глюканазой или эндоглюканазой.

Здесь β-глюкозидаза (ЕС 3.2.1.21) является любым полипептидом, который способен катализировать гидролиз терминальных, невосстановленных остатков β-Ό-глюкозы с высвобождением β-Όглюкозы. Такой полипептид может иметь широкую специфичность для β-Ό-глюкозидов, а также может гидролизовать один или более из следующего: β-Ό-галактозид, α-Ь-арабинозид, β-Ό-ксилозид или β-Όфукозид. Этот фермент также может называться амигдалазой, β-Ό-глюкозидглюкогидролазой, целлобиазой или гентобиазегентиобиазой.

Здесь β-(1,3)(1,4)-глюканаза (ЕС 3.2.1.73) является любым полипептидом, который способен катализировать гидролиз 1,4-β-^-глюкозидный связей в β-Ό-глюканах, содержащих 1,3- и 1,4-связи. Такой полипептид может действовать на лихенин и β-Ό-глюканы зерновых, но не на β-Ό-глюканы, содержащие только 1,3- или 1,4-связи. Этот фермент также может называться лихениназой, 1,3-1,4-β-^-глюкан 4глюканогидролазой, β-глюканазой, эндо-β-1,3-1,4-глюканазой, лихеназой или β-глюканазой со смешанными связями. Альтернативой для этого типа является фермент ЕС 3.2.1.6, который описывается как эндо-1,3(4)-бета-глюканаза. Этот тип фермента гидролизует 1,3- или 1,4-связи в бета-О-глюканах, когда остаток глюкозы, чья восстановленная группа участвует в связи, подвергающейся гидролизу, сам заменяется на С-3. Альтернативные названия включают эндо-1,3-бета-глюканазу, ламинариназу, 1,3-(1,3;1,4)бета-О-глюкан 3 (4) глюканогидролазу; субстраты включают ламинарин, лихенин и бета-О-глюканы зерновых.

Композиция по изобретению может содержать любую гемицеллюлазу, например эндоксиланазу, βксилозидазу, α-Ь-арабионофуранозидазу, α-Ό-глюкуронидазу, целлобиогидролазу, ферулоилэстеразу,

- 23 023558 кумароил-эстеразу, α-галактозидазу, β-галактозидазу, β-маннаназу или β-маннозидазу.

Здесь эндоксиланаза (ЕС 3.2.1.8) является любым полипептидом, который способен катализировать эндогидролиз 1,4-в-О-ксилозидных связей в ксиланах. Этот фермент также может называться эндо-1,4-вксиланаза или 1,4-Р-О-ксилангидролаза. Альтернативой является фермент ЕС 3.2.1.136, глюкуроноарабиноксиланэндоксиланаза, фермент, который способен гидролизовать 1,4-ксилозидные связи в глюкуроноарабиноксиланах.

Здесь β-ксилозидаза (ЕС 3.2.1.37) является любым полипептидом, который способен катализировать гидролиз 1,4-в-Э-ксиланов, чтобы удалить следующие один за другим остатки Ό-ксилозы от невосстановленных концов. Такие ферменты могут также гидролизовать ксилобиозу. Этот фермент также может называться ксилан1,4-в-ксилозидаза, 1,4-в-О-ксиланксилогидролазой, экзо-1,4-в-ксилозидаза или ксилобиаза.

Здесь α-Ь-арабинофуранозидаза (ЕС 3.2.1.55) является любым полипептидом, который способен действовать на α-Ь-арабинофуранозиды, α-Ь-арабинаны, содержащие (1,2) и/или (1,3) - и/или (1,5)-связи, арабиноксиланы и арабиногалактаны. Этот фермент также может называться α-Ν-арабинофуранозидаза, арабинофуранозидаза или арабинозидаза.

Здесь α-Ό-глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.139) является любым полипептидом, который способен катализировать реакцию следующего вида: альфа-О-глюкуронозид + Н(2)О = спирт + Ό-глюкуронат. Этот фермент может также называться альфа-глюкуронидаза или альфа-глюкозидуроназа. Эти ферменты могут также гидролизовать 4-О-метилированную глюкороновую кислоту, которая также может присутствовать в качестве заместителя в ксиланах. Альтернативой является ЕС 3.2.1.131: ксилан-альфа-1,2глюкоронозидаза, которая катализирует гидролиз альфа-1,2-(4-О-метил)глюкоронозильных связей.

Здесь ацетилксиланацетилксиланэстераза (ЕС 3.1.1.72) является любым полипептидом, который способен катализировать деацетилирование ксиланов и ксило-олигосахаридов. Также полипептид может катализировать гидролиз ацетильных групп полимерного ксилана, ацетилированной ксилозы, ацетилированной глюкозы, альфа-нафтилацетата или р-нитрофенилацетата, но, как правило, не триацетилглицерола. Такой полипептид обычно не действует на ацетилированный маннан или пектин.

Здесь ферулоилэстераза (ЕС 3.1.1.73) является любым полипептидом, который способен катализировать реакцию типа: ферулоил-сахарид + Н(2)О = ферулат + сахарид. Сахарид может быть, например, олигосахаридом или полисахаридом. Он может обычно катализировать гидролиз 4-гидрокси-3метоксициннамоильной (ферулоильной) группы эстерифицированного сахара, который, как правило, является арабинозой в естественных субстратах. р-Нитрофенолацетат и метилферулат являются типичными бедными субстратами. Этот фермент может также называться гидролаза циннамоильного эфира, эстераза феруловой кислоты или гидроксициннамоилэстераза. Он также может называться дополнительным ферментом гемицеллюлазы, так как он может помочь ксиланазам и пектиназам разрушить клетку растения гемицеллюлозу и пектин растительной клеточной стенки.

Здесь кумароил-эстераза (ЕС 3.1.1.73) является любым полипептидом, который способен катализировать реакцию типа: кумароил-сахарид + Н(2)О = кумарат + сахарид. Сахарид может быть, например, олигосахаридом или полисахаридом. Этот фермент может также называться транс-4-кумароил-эстераза, транс-р-кумароил-эстераза, р-кумароил-эстераза или эстераза р-кумаровой кислоты. Этот фермент также входит в ЕС 3.1.1.73, поэтому может также называться ферулоилэстеразой.

Здесь α-галактозидаза (ЕС 3.2.1.22) является любым полипептидом, который способен катализировать гидролиз терминальных невосстановленных остатков α-Ό-галактозы в α-Ό-галактозидах, в том числе галактозы олигосахаридов, галактоманнанов, галактанов и арабиногалактанов. Также полипептид может также быть способным гидролизовать α-Ό-фукозиды. Этот фермент может также называться мелибиазой.

Здесь β-галактозидаза (ЕС 3.2.1.23) является любым полипептидом, который способен катализировать гидролиз терминальных невосстановленных остатков β-Ό-галактозы в β-Ό-галактозидах. Также полипептид может также быть способным гидролизовать α-Ь-арабинозиды. Этот фермент может также называться экзо-(1^4)-β-^-галактаназа или лактаза.

Здесь β-маннаназа (ЕС 3.2.1.78) является любым полипептидом, который способен катализировать случайный гидролиз 1,4-β-^-маннозидных связей в маннанах, галактоманнанах и глюкоманнанах. Этот фермент может также называться маннан-эндо-1,4-β-маннозидаза или эндо-1,4-маннаназа.

Здесь β-маннозидаза (ЕС 3.2.1.25) является любым полипептидом, который способен катализировать гидролиз терминальных невосстановленных остатков β-Ό-маннозы в β-Ό-маннозидах. Этот фермент может также называться маннаназа или манназа.

Композиция по изобретению может содержать любую пектиназу, например эндополигалактуроназу, пектинметилэстеразу, эндогалактаназу, бета-галактозидазу, пектинацетилэстеразу, эндопектинлиазу, пектатлиазу, альфа-рамнозидазу, экзогалактуроназу, экзополигалактуронатлиазу, рамногалактуронангидролазу, рамногалактуронанлиазу, рамногалактуронанацетилэстеразу, рамногалактуронангалактуроногидролазу или ксилогалактуроназу.

- 24 023558

Здесь эндополигалактуроназа (ЕС 3.2.1.15) является любым полипептидом, который способен катализировать случайный гидролиз 1,4-а-О-галактозидуроновых связей в пектате и других галактуронах. Этот фермент может также называться полигалактуроназа, пектиндеполимераза, пектиназа, эндополигалактуроназа, пектолаза, пектингидролаза, пектинполигалактуроназа, поли-а-1,4галактуронидоглюканогидролаза, эндогалактуроназа; эндо-О-галактуроназа или поли(1,4-а-0галактуронид) глюканогидролаза.

Здесь пектинметилэстераза (ЕС 3.1.1.11) является любым ферментом, способным катализировать реакцию: пектин + η Н₂0 = η метанол + пектат. Фермент может также был известен как пектинэстераза, пектиндеметоксилаза, пектинметоксилаза, пектинметилэстераза, пектаза, пектиноэстераза или пектинпектилгидролаза.

Здесь эндогалактаназа (ЕС 3.2.1.89) является любым ферментом, способным катализировать эндогидролиз из 1,4-в-Э-галактозидных связей в арабиногалактанах. Фермент может быть также известен как арабиногалактан-эндо-1,4-в-галактозидаза, эндо-1,4-в-галактаназа, галактаназа, арабиногалактаназа или арабиногалактан-4-в-О-галактаногидролаза.

Здесь пектинацетилэстераза определяется как любой фермент, который имеет ацетилэстеразную активность, которая катализирует деацетилирование ацетильных групп от гидроксильных групп остатков ОаША пектина.

Здесь эндопектинлиаза (ЕС 4.2.2.10) является любым ферментом, способным катализировать выделительное расщепление (1^4)-а-О-галактуронанметилового эфира, до олигосахаридов с 4-дезокси-6-Ометил-а-О-галакт-4-энуронозильными группами на их невосстановленных концах. Фермент может быть также известен как пектинлиаза, пектин-трансэлиминаза; эндопектинлиаза, полиметилгалактуронтрансэлиминаза, пектинметил-трансэлиминаза, пектолиаза, РЬ, РИЬ или РМСЬ или (1^4)-6-О-метил-аΌ-галактуронанлиаза.

Здесь пектатлиаза (ЕС 4.2.2.2) является любым ферментом, способным катализировать выделительное расщепление (№4)-а-О-галактуронана до олигосахаридов с 4-дезокси-а-О-галакт-4энуронозильными группами на их невосстановленных концах. Фермент может быть также известен как полигалактуроновая трансэлиминаза, трансэлиминаза пектиновой кислоты, полигалактуронат-лиаза, эндопектинметил-трансэлиминаза, пектат-трансэлиминаза, эндополигалактуронат-трансэлиминаза, лиаза пектиновой кислоты, пектинлиаза, лиаза а-1,4-О-эндополигалактуроновой кислоты, РСА-лиаза, РРаза-И, лиаза эндо-а-1,4-полигалактуроновой кислоты, лиаза полигалактуроновой кислоты, пектинтрансэлиминаза, трансэлиминаза полигалактуроновой кислоты или (1^4)-а-О-галактуронанлиаза.

Здесь альфа-рамнозидаза (ЕС 3.2.1.40) является любым полипептидом, который способен катализировать гидролиз терминальных невосстановленных остатков α-Ь-рамнозы в α-Ь-рамнозидах или же в рамногалактуронане. Фермент может быть также известен как α-Ь-рамнозидаза Т, а-Ь-рамнозидаза N или а-Ь-рамнозид-рамногидролаза.

Здесь экзогалактуроназа (ЕС 3.2.1.82) является любым полипептидом, который способен катализировать гидролиз пектиновой кислоты из невосстановленного конца, высвобождая дигалактуронат. Фермент может быть также известен как экзополи-а-галактуронозидаза, экзополигалактуронозидаза или экзополигалактуранозидаза.

Здесь экзогалактуроназа (ЕС 3.2.1.67) является любым полипептидом, способным катализировать: (1,4-а-О-галактуронид),, + Н₂0 = ОА-а-О-галактуронид),^ + О-галактуронат. Фермент может быть также известен как галактуран-1,4-а-галактуронидаза, экзополигалактуроназа, поли(галактуронат)гидролаза, экзо-О-галактуроназа, экзо-О-галактуронаназа, экзополи-О-галактуроназа или поли(1,4-а-Огалактуронид)галактуроногидролаза.

Здесь экзополигалактуронатлиаза (ЕС 4.2.2.9) является любым полипептидом, способным катализировать выделительное расщепление 4-(4-дезокси-а-О-галакт-4-энуронозил)-О-галактуроната из восстановленного конца пектата, т.е. де-эстерифицированного пектина. Этот фермент может быть известен как пектат-дисахарид-лиаза, пектат-экзолиаза, трансэлиминаза экзопектиновой кислоты, экзопектатлиаза, трансэлиминаза экзополигалактуроновой кислоты, РАТЕ, экзо-РАТЕ, экзо-РСЬ или (1^4)-а-Огалактуронан-восстановленного-конца-дисахарид- лиаза.

Здесь рамногалактуронангидролаза является любым полипептидом, способным гидролизовать связи между галактосулуроновой кислотой и рамнопиранозилом в эндоположении в строго чередующихся рамногалактуронановых структурах, состоящих из дисахарид[(1,2-альфа-Ь-рамноил-(1,4)-альфагалактосулуроновой кислоты].

Здесь рамногалактуронан-лиаза является любым полипептидом, способным расщеплять а-Ь-КЪар(1^4)-а-О-Са1рА связи в эндоположении в рамногалактуронане бета-элиминацией.

При этом рамногалактуронанацетилэстераза является любым полипептидом, который катализирует деацетилирование остова чередующихся остатков рамнозы и галактуроновой кислоты в рамногалактуронане.

Здесь рамногалактуронангалактуроногидролаза является любым полипептидом, способным гидро- 25 023558 лизовать галактуроновую кислоту из невосстановленного конца строго чередующихся структур рамногалактуронана в экзоположении.

Здесь ксилогалактуроназа является любым полипептидом, который действует на ксилогалактуронан расщеплением эндообразом остова галактуроновой кислоты, замещенной β-ксилозой. Этот фермент может быть также известен как ксилогалактуронангидролаза.

Здесь α-Ь-арабинофуранозидаза (ЕС 3.2.1.55) является любым полипептидом, способным действовать на а-Ь-арабинофуранозиды, α-Ь-арабинаны, содержащие (1,2) и/или (1,3) - и/или (1,5)-связи, арабиноксиланы и арабиногалактаны. Этот фермент также может называться а-И-арабинофуранозидазой, арабинофуранозидазой или арабинозидазой.

Здесь эндоарабинаназа (ЕС 3.2.1.99) является любым полипептидом, способным катализировать эндогидролиз 1,5-а-арабинофуранозидных связей в 1,5-арабинанах. Фермент может быть также известен как эндоарабиназа, арабинан-эндо-1,5-а-Ь-арабинозидаза, эндо-1,5-а-Ь-арабинаназа, эндо-а-1,5арабаназа; эндоарабаназа или 1,5-а-Ь-арабинан-1,5-а-Ь-арабинаногидролаза.

Композиция по изобретению, как правило, содержит, по меньшей мере, одну целлюлозу и/или, по меньшей мере, одну гемицеллюлазу и/или по меньшей мере одну пектиназу (одна из которых представляет собой полипептид в соответствии с изобретением). Композиция по изобретению может содержать целлобиогидролазу, эндоглюканазу и/или β-глюкозидазу. Такая композиция может также содержать одну или более гемицеллюлаз и/или одну или более пектиназ.

Одна или более (например, два, три, четыре или все) амилаза, протеаза, липаза, лигниназа, гексозилтрансфераза или глюкуронидаза могут присутствовать в композиции по изобретению.

Протеаза включает в себя ферменты, которые гидролизуют пептидные связи (пептидазы), а также ферменты, которые гидролизуют связи между пептидами и другими фрагментами, такими как сахар (гликопептидазы). Многие протеазы характеризуются ЕС 3.4 и подходят для применения в изобретении, будучи включенными здесь в качестве ссылки. Некоторые конкретные виды протеаз включают цистеиновые протеазы, в том числе пепсин, папаин, и сериновые протеазы, включая химотрипсины, карбоксипептидазы и металлоэндопептидазы.

Липаза включает в себя ферменты, которые гидролизуют липиды, жирные кислоты, и ацилглицериды, в том числе фосфоглицериды, липопротеиды, диацилглицерины и т.п. В растениях липиды используются в качестве конструктивных элементов для ограничения потерь воды и патогенной инфекции. Эти липиды включают воски, полученные из жирных кислот, а также кутин и суберин.

Лигниназа включает в себя ферменты, которые могут гидролизовать или деградировать структуру полимеров лигнина. Ферменты, которые могут деградировать лигнин, включают лигнинпероксидазы, марганец-пероксидазы, лакказы и ферулоилэстеразы и другие ферменты, описанные в данной области и известные способностью деполимеризовать или иным образом разрывать полимеры лигнина. Кроме того, включаются ферменты, способные гидролизовать связи, образуемые между гемицеллюлозными сахарами (в частности, арабинозой) и лигнином. Лигниназы включают, но не ограничиваясь этим, следующую группу ферментов: лигнинпероксидазы (ЕС 1.11.14), марганец-пероксидазы (ЕС 1.11.1.13), лакказы (ЕС 1.10.3.2) и ферулоилэстеразы (ЕС 3.1.1.73).

Гексозилтрансфераза (2.4.1-) включает в себя ферменты, которые способны переносить гликозильные группы, в частности, гексозильные группы. В дополнение к переносу гликозильной группы из гликозил-содержащего донора на другое гликозил-содержащие соединение, акцептор, ферменты могут также переносить гликозильную группу на воду в качестве акцептора. Эта реакция также известна как реакция гидролиза, а не реакция переноса. Примером гексозилтрансферазы, которую можно применять в изобретении, является β-глюканозилтрансфераза. Такой фермент может катализировать деградацию (1,3)(1,4) глюкана и/или целлюлозы и/или продукта деградации целлюлозы.

Глюкуронидазы включает в себя ферменты, которые катализируют гидролиз глюкоронозидглюкоронозида, например β-глюкоронозида для получения спирта. Многие глюкуронидазы были охарактеризованы и могут быть пригодны для применения в изобретении, например, β-глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.31), хиалуроно-глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.36), глюкуронозил-дисульфоглюкозаминглюкуронидаза (3.2.1.56), глицирризинат-в-глюкуронидаза (3.2.1.128) или α-Ό-глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.139).

Композиция по изобретению может содержать экспансин или экспансин-подобный белок, такой как сволленин (см. ЗаПгеипо и соавт., Еиг. ί. ВюНет. 269, 4202-4211, 2002) или сволленин-подобный белок.

Экспансины причастны к расшатыванию структуры клеточной стенки во время роста растений клетки. Было предложено, что экспансины нарушают образование водородных связей между целлюлозой и другими полисахаридами клеточной стенки, не имея гидролитической активности. Таким образом, они, как считается, допускают скольжение целлюлозных волокон и рост клеточной стенки. Сволленин, экспансин-подобный белок, содержит ^концевой домен Углевод-Связывающий Модуль Семейства 1 (СагЬоНуТгаГе ВшТшд МоТи1е РатПу 1 Тоташ (СВЭ)) и С-концевой экспансин-подобный домен. Для целей по изобретению экспансин-подобный белок или сволленин-подобный белок могут содержать один или оба таких домена и/или могут нарушать структуру клеточных стенок (например, нарушая структуру целлюлозы), по выбору, не производя обнаруживаемые количества восстановленных сахаров.

- 26 023558

Композиция по изобретению может содержать полипептидный продукт интегрирующего целлюлозу белка, скаффолдин или скаффолдин-подобный белок, например, СарА или СарС из С1о51пбшт (Негтосе11ит или С1о51пбшт се11и1о1уЬсит соответственно.

Скаффолдины и интегрирующие целлюлозу белки являются мультифункциональными интегрирующими субъединицами, которые могут организовать целлюлолитические субъединицы в мультиферментный комплекс. Это достигается за счет взаимодействия двух дополнительных классов доменов, т.е. когезионного домена на скаффолдине и докерин-домена на каждой ферментативной субъединице. Субъединица скаффолдина также несет целлюлозосвязывающий модуль (СВМ), который служит посредником прикрепления целлюлозомы к субстрату. Скаффолдин или интегрирующий целлюлозу белок для целей данного по изобретению могут содержать один или оба таких доменов.

Композиция по изобретению может содержать индуцирующий целлюлозу белок или модулирующий белок, например белок, кодируемый геном щр1 или ср2 или аналогичными генами из ТпсНобегта гееке1/Нуросгеа )асогта (см. Форман и соавт., ί. Вю1. СНет. 278 (34), 31988-31997, 2003). Полипептидный продукт этих генов является бимодулярными белками, которые содержат целлюлозосвязывающий модуль и домен, чьи функция или активность не могут быть родственными с известными гликозилгидролазными семействами. Тем не менее, присутствие целлюлозосвязывающего модуля и корегуляция экспрессии этих генов целлюлазными компонентами указывает на ранее неузнанные активности с потенциальной ролью в деградации биомассы.

Композиция по изобретению может состоять из членов каждого из классов полипептидов, упомянутых выше, нескольких членов одного полипептидного класса, или любой комбинации этих полипептидных классов.

Композиция по изобретению может состоять из полипептидов, например, ферментов, из (1) коммерческих поставок; (2) клонированных генов, экспрессирующих полипептиды, например, ферменты, (3) комплексного бульона (например, в результате роста микробного штамма в среде, причем штаммы выделяют белки и ферменты в среду; (4) клеточных лизатов штаммов выросших как указано в (3); и/или (5) растительного материала, экспрессирующего полипептиды, например, ферменты. Различные полипептиды, например, ферменты в композиции по изобретению могут быть получены из различных источников.

Применение полипептидов.

Полипептиды и полипептидные композиции по изобретению могут применяться в различных приложениях. Например, они могут применяться для производства ферментных сахаров. Ферментные сахара могут затем, как часть биотопливного процесса, преобразовываться в биогаз или этанол, бутанол, изобутанол, 2-бутанол или другие подходящие вещества. Альтернативно, полипептиды и их композиции могут применяться в качестве фермента, например, в производстве пищевых продуктов, в моющих композициях, в бумажной и целлюлозной промышленности, и в антибактериальных препаратах, фармацевтических продуктах, таких как леденцы для горла, зубные пасты и жидкости для полоскания рта. Некоторые применения будут проиллюстрированы более подробно ниже.

В применениях и способах, описанных ниже, компоненты композиций, описанные выше, могут предоставляться одновременно (т.е. в одной композиции как таковой), либо по отдельности или последовательно.

Изобретение относится также к применению целлобиогидролазы в соответствии с изобретением и композициям, содержащим такой фермент в промышленных процессах.

Несмотря на многолетний опыт, полученный с этими процессами, целлобиогидролаза в соответствии с изобретением может показать ряд существенных преимуществ по сравнению с ферментами, используемыми в настоящее время. В зависимости от конкретного применения, эти преимущества могут включать в себя такие аспекты, как сниженные издержки производства, более высокая специфичность к субстрату, снижение антигенности, меньше нежелательных побочных действий, более высокие выходы при производстве в подходящем микроорганизме, при более подходящем рН и температуре, без ингибирования гидрофобными, лигнин-производными продуктами или меньшее ингибирование продуктом или, в случае пищевой промышленности, лучший вкус и текстура конечного продукта, а также полноценное питание и кошерные аспекты.

В принципе, целлобиогидролаза или композиция по изобретению могут быть применены в любом процессе, который требует обработки материала, который содержит полисахарид. Таким образом, полипептид или композиция по изобретению могут быть применены при обработке полисахаридного материала. При этом полисахаридный материал является материалом, который содержит или состоит существенно из одного или, что чаще, более чем одного полисахарида.

Как правило, растения и материал, полученный из него, составляют значительные количества некрахмального полисахаридного материала. Соответственно, полипептид по изобретению может применяться при обработке растительного или грибкового материала или материала, полученного из них.

Лигноцеллюлоза.

Важным компонентом растительного некрахмального полисахаридного материала является лигноцеллюлоза (также называемая здесь лигноцеллюлолитической биомассой). Лигноцеллюлоза является растительным материалом, который состоит из целлюлозы и гемицеллюлозы и лигнина. Углеводные

- 27 023558 полимеры (целлюлоза и гемицеллюлоза) тесно связываются с лигнином водородными и ковалентными связями. Соответственно, полипептид по изобретению может применяться при обработке лигноцеллюлолитического материала. При этом лигноцеллюлолитический материал является материалом, который содержит или состоит существенно из лигноцеллюлозы. Таким образом, в способе по изобретению для обработки некрахмального полисахарида, некрахмальный полисахарид может быть лигноцеллюлозным материалом/биомассой.

Таким образом, изобретение относится к способу обработки субстрата, содержащего некрахмальный полисахарид, при этом обработка содержит деградацию и/или гидролиз и/или модификацию целлюлозы и/или гемицеллюлозы и/или обработку пектиновых веществ.

Деградация в данном контексте означает, что обработка приводит к поколению продуктов гидролиза целлюлозы и/или гемицеллюлозы и/или пектинового вещества, т.е. в результате обработки присутствуют сахариды меньшей длины, чем в аналогичном необработанном некрахмальном полисахариде. Таким образом, деградация в этом контексте может привести к освобождению олигосахаридов и/или мономеров сахаров.

Все растения содержат некрахмальный полисахарид как, в прочем, и практически все полисахаридные материалы растительного происхождения. Таким образом, в способе по изобретению обработки субстрата, содержащего некрахмальный полисахарид, упомянутый субстрат может иметься в виде растения или материала растительного происхождения или материала, содержащего растение или содержащего материал растительного происхождения, например, растительная целлюлоза, растительный экстракт, пищевые продукты и их ингредиенты, ткани, текстиль или предмет одежды.

Лигноцеллюлотическая биомасса, пригодная для применения в настоящем изобретении, включает биомассу и может включать в себя первичную биомассу и/или непервичную биомассу, такую как сельскохозяйственная биомасса, коммерческие органические вещества, строительный лом и мусор, твердые бытовые отходы, бумажные отходы и дворовые отходы. Общие виды биомассы включают в себя деревья, кустарники и травы, пшеницу, пшеничную солому, жом сахарного тростника, кукурузу, кукурузную лузгу, стержни кукурузных початков, кукурузные зерна, в том числе волокна от зерен, продукты и побочные продукты помола зерна, такого как кукуруза, пшеница и ячмень (в том числе мокрого помола и сухого помола), часто называемые отруби или волокна, а также твердые бытовые отходы, бумажные отходы и дворовые отходы. Биомасса может быть, но не ограничиваясь этим, травянистыми материалами, отходами сельского хозяйства, отходами лесного хозяйства, твердыми бытовыми отходами, бумажными отходами и остатками целлюлозного и бумажного комбината. Сельскохозяйственная биомасса включает ветки, кусты, камыши, кукурузу и кукурузную шелуху, энергетические зерновые культуры, леса, фрукты, цветы, зерно, травы, травянистые культуры, листья, кору, хвою, корни, корни саженцев, культуры лесные культуры с коротким оборотом, кустарники, просо, деревья, овощи, кожицу фруктов, виноградные лозы, мякоть сахарной свеклы, отбросы пшеницы, шелуху овса, а также леса твердых и мягких пород дерева (не включая леса с вредными материалами). Кроме того, сельскохозяйственная биомасса включает отходы органических материалов, образующихся из сельскохозяйственных процессов, включая сельское хозяйство и лесное хозяйство, в частности, древесные отходы лесного хозяйства. Сельскохозяйственная биомасса может быть любой из изложенного самостоятельно или в любой комбинации или их смеси. Дальнейшими примерами подходящих биомассы являются садовые грунты, чапараль, мельничные отходы, городские древесные отходы, бытовые отходы, отходы лесозаготовки, лесные вырубки, древесные культуры с коротким оборотом, промышленные отходы, солома пшеницы, овсяная солома, рисовая солома, ячменная солома, ржаная солома, льняная солома, соевая шелуха, рисовая шелуха, рисовая солома, кукурузная кормовая клейковина, овсяная шелуха, сахарный тростник, кукурузный жмых, стебли кукурузы, кукурузные початки, кукурузная шелуха, луговые травы, трипсакум ежевидный, лисохвост, жом, мякоть цитрусовых, шелуха семян, целлюлозные животные отходы, срезанные лужайки, хлопок, морские водоросли, деревья, кустарники, травы, пшеница, пшеничная солома, жом сахарного тростника, кукуруза, кукурузная шелуха, стержни кукурузных початков, кукурузные зерна, волокна от зерен, продукты и побочные продукты влажного или сухого помола зерна, твердые бытовые отходы, бумажные отходы, дворовые отходы, травянистые материалы, отходы сельского хозяйства, отходы лесного хозяйства, твердые бытовые отходы, отходы бумаги, целлюлозы, отходы бумажных фабрик, ветки, кусты, камыши, кукуруза, кукурузная шелуха, энергетические зерновые культуры, лес, фрукты, цветы, зерно, трава, травянистые культуры, листья, кора, иглы, корни, корень, саженцы, кустарники, просо, дерево, овощи, фруктовая кожура, виноградная лоза, мякоть сахарной свеклы, отходы пшеницы, овсяная шелуха, твердые или мягкие породы дерева, отходы органического материала, образующиеся из сельскохозяйственного процесса, древесные отходы лесного хозяйства, или сочетание любых двух или более из них.

Помимо первичной биомассы или сырья, уже обработанных в пищевых продуктах и кормах или бумажной и целлюлозной промышленности, биомасса/сырье могут дополнительно подвергаться предварительной тепловой, механической и/или химической модификации или любой комбинации этих методов с целью увеличения ферментативной деградации.

- 28 023558

Предварительная обработка.

Перед ферментной обработкой лигноцеллюлозный материал можно предварительно обработать. Предварительная обработка может содержать экспонирование лигноцеллюлозных материала кислоте, основанию, растворителю, теплу, перекиси, озону, механическому измельчению, шлифованию, фрезерованию или быстрой разгерметизации, или сочетанию любых двух или более из них. Такая химическая предварительная обработка часто сочетается с тепловой предварительной обработкой, например, между 150-220°С продолжительностью от 1 до 30 мин.

Преосахаривание.

После стадии предварительной обработки, могут применяться сжижение/гидролиз или шаг преосахаривания, включающий инкубацию с участием фермента или смеси ферментов. Шаг преосахаривания может выполняться при различных температурах, но предпочтительно, что шаг преосахаривания происходит при температуре, лучше всего подходящей для смеси ферментов, проходящих испытания, или предсказанного ферментного оптимума испытываемых ферментов. Температура шага преосахаривания может находиться в диапазоне от около 10 до около 95°С, от около 20 до около 85°С, от около 30 до около 70°С, от около 40 до около 60°С, от около 37 до около 50°С, предпочтительно от около 37 до около 80°С, более предпочтительно около 60-70°С, еще более предпочтительно около 65°С. Значение рН смеси преосахаривания может варьироваться от около 2,0 до около 10,0, но предпочтительно около 3,0 до около 7,0, более предпочтительно от около 4,0 до около 6,0, даже более предпочтительно от около 4,0 до около 5,0. Опять же, рН можно скорректировать, чтобы максимизировать активность ферментов и можно скорректировать с добавлением ферментов. Сравнение результатов анализа результатов этого теста дают возможность изменить метод для лучшего соответствия испытываемых ферментов.

Реакция сжижения/гидролиза или шага преосахаривания может происходить от нескольких минут до нескольких часов, например от 1 до около 120 ч, предпочтительно от около 2 до около 48 ч, более предпочтительно от около 2 до около 24 ч, наиболее предпочтительно от около 2 до около 6 ч. Целлюлазная обработка может происходить от нескольких минут до нескольких часов, например, от около 6 до около 120 ч, предпочтительно около 12 до около 72 ч, более предпочтительно от около 24 до 48 ч.

Осахаривание.

Изобретение относится к способу получения сахара из лигноцеллюлозного материала, при этом способ содержит контактирование полипептида по изобретению с композицией по изобретению с лигноцеллюлозным материалом.

Такой способ позволяет получать свободные сахара (мономеры) и/или олигосахариды из лигноцеллюлозной биомассы. Эти способы включают преобразование лигноцеллюлозной биомассы в свободные сахара и малые олигосахариды полипептидом или композицией по изобретению.

Процесс преобразования таких сложных углеводов, как лигноцеллюлоза, в сахар предпочтительно позволяет превращение в ферментируемые сахара. Такой процесс называют осахариванием. Соответственно, способ по изобретению может привести к освобождению одного или более гексозных и/или пентозных сахаров, таких как одна или более глюкоза, ксилоза, арабиноза, галактоза, галактуроновая кислота, глюкуроновая кислота, манноза, рамноза, рибоза и фруктоза.

Соответственно, еще один аспект по изобретению включает в себя методы, которые используют полипептид композиции по изобретению, описанный выше вместе с дальнейшими ферментами или физическими обработками, такими как температура и рН для преобразования лигноцеллюлозной растительной биомассы в сахара и олигосахариды.

Несмотря на то что композиция обсуждалась как единая смесь, следует признать, что ферменты могут быть добавлены последовательно, причем температура, рН и другие условия можно изменять, чтобы повысить активность каждого отдельного фермента. Кроме того, оптимум рН и температура можно определять для смеси ферментов.

Ферментов реагирует с субстратом при соответствующих условиях. Например, ферменты могут быть инкубированы при около 25, около 30, около 35, около 37, около 40, около 45, около 50, около 55, около 60, около 65, около 70, около 75, около 80, около 85, около 90°С или выше. Т.е. они могут быть инкубированы при температуре от около 20 до около 95°С, например, в буферах от низкой до средней ионной силы и/или от низкого до нейтрального рН. Под средней ионной силой имеется в виду, что буфер имеет концентрацию ионов около 200 мМ (мМ) или меньше для любого одного ионного компонента. рН может изменяться от рН около 2,5, рН около 3,0, рН около 3.5, рН около 4,0, рН около 4,5, рН около 5, рН около 5,5, рН около 6, рН около 6,5, рН около 7, рН около 7,5, рН около 8,0, до около рН 8,5. Как правило, диапазон рН будет составлять от рН около 3,0 до около рН 7. Для производства этанола кислая среда является предпочтительной, например, рН 4, тогда как для производства биогаза нейтральный рН, например, рН 7 является желательным. Инкубация комбинаций ферментов в этих условиях приводит к высвобождению или освобождению значительных количеств сахара из лигноцеллюлозы. Под значительным количеством имеется в виду по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95% или более свободного сахара.

Полипептиды, такие как ферменты, можно производить экзогенно в микроорганизмах, дрожжах, грибах, бактериях и растениях, затем выделять и добавлять, например, к лигноцеллюлозному сырью.

- 29 023558

Альтернативно, ферменты производят, но не изолируют, и бульон ферментации неочищенной клеточной массы или растительных материалов (таких, как кукурузный силос), и т.п. могут быть добавлены, например, к сырью. Альтернативно, неочищенная клеточная масса или среда продукции ферментов или растительный материал могут обрабатываться для предотвращения дальнейшего роста микроорганизмов (например, нагреванием или добавлением антимикробных препаратов) и затем добавляться, например, к сырью. Эти смеси неочищенных ферментов могут включать в себя организм, производящий фермент. Альтернативно, фермент можно получать ферментацией, которая использует сырье (например, кукурузный силос), чтобы обеспечить питание для организма, который производит фермент(ы). Таким образом, растения, производящие ферменты, сами по себе могут служить лигноцеллюлозным сырьем и добавляться в лигноцеллюлозное сырье.

Ферментация сахаров.

Ферментируемые сахара можно преобразовывать в полезные продукты ферментации с добавленной ценностью, не ограничивающие примеры которые включают в себя аминокислоты, витамины, лекарственные средства, кормовую добавку для животных, специальные химикаты, химическое сырье, пластмассы, растворители, топлива, или другие органические полимеры, молочную кислоту и этиловый спирт, в том числе топливный этанол. В частности, сахара могут быть применены в качестве сырья для ферментации в химикаты, пластмассы, такие как, например, янтарная кислота и(био)топлива, включая этанол, метанол, бутанол, синтетические жидкие топлива и биогаз.

Например, в способе по изобретению, фермент или комбинация ферментов действует на лигноцеллюлозный субстрат или растительную биомассу, служащую сырьем, таким образом, чтобы преобразовать этот сложный субстрат в простые сахара и олигосахариды для производства этанола и других полезных продуктов ферментации.

Сахара, высвобождаемые из биомассы, могут быть преобразованы в полезные продукты ферментации, включающие, но не ограничиваясь этим, аминокислоты, витамины, лекарственные средства, кормовые добавки для животных, специальные химикаты, химическое сырье, пластмассы, и этанол, в том числе топливный этанол.

Таким образом, изобретение относится к способу подготовки продукта ферментации, который содержит:

a) деградацию лигноцеллюлозы, применяя способ, как описано здесь; и

b) ферментацию полученного материала, таким образом, чтобы подготовить продукт ферментации.

Ферментация может проводиться в аэробных или анаэробных условиях. Предпочтительно процесс осуществляется в микроаэробных или кислород-лимитирующих условиях.

Процесс анаэробного ферментации определяется здесь как процесс ферментации, проходящий в отсутствие кислорода или причем кислород не потребляется существенно, предпочтительно, около 5 или меньше, около 2,5 или менее или около 1 ммоль/л/ч или менее, и причем органические молекулы служат как донором электронов, так и акцепторов электронов.

Кислород-лимитирующий процесс ферментации является процессом, при котором потребление кислорода ограничено переносом кислорода из газа в жидкость. Степень ограничения кислорода определяется количеством и составом входящего газового потока, а также фактическими свойствами смешивание/перенос массы используемого для ферментации оборудования. Предпочтительно в процессе при кислород-лимитирующих условиях, скорость потребления кислорода составляет, по меньшей мере, около 5,5, более предпочтительно по меньшей мере около 6 и даже более предпочтительно по меньшей мере около 7 ммоль/л/ч.

Метод подготовки ферментации продукта может необязательно содержать восстановление продукта ферментации.

88Р.

Ферментация и осахаривание также может выполняться в режиме одновременного осахаривания и ферментации (§§Р). Одним из преимуществ этого способа является снижение сахарного ингибирования ферментативного гидролиза (сахарное ингибирование целлюлаз описывается Сатша1 В & В Том XXVII, с. 1282-1290).

Продукты ферментации.

Продукты ферментации, которые могут производиться в соответствии с изобретением, включают в себя аминокислоты, витамины, лекарственные средства, кормовую добавку для животных, специальные химикаты, химическое сырье, пластмассы, растворители, топлива, или других органические полимеры, молочную кислоту и этанол, в том числе топливный этанол (термин этанол понимается как включающий этиловый спирт или смесь этилового спирта и воды).

Конкретные продукты с добавленной ценностью, которые могут быть получены способами по изобретению, включают в себя, но не ограничиваясь этим, биотоплива (в том числе этанол и бутанол и биогаз); молочную кислоту; пластик; специальные химикаты, органическую кислоту, в том числе лимонную кислоту, янтарную кислоту, фумаровую кислоту, итаконовую кислоту и малеиновую кислоту, 3гидрокси-пропионовую кислоту, акриловую кислоту, уксусную кислоту, 1,3-пропан-диол; этилен, глице- 30 023558 рин; растворитель; кормовую добавку для животных, фармацевтические препараты, такие как βлактамный антибиотик и цефалоспорин, витамины, аминокислоту, такую, как лизин, метионин, триптофан, треонин, и аспарагиновая кислота; промышленный фермент, такой как протеаза, целлюлаза, амилаза, глюканаза, лактаза, липаза, лиаза, оксидоредуктаза, трансфераза или ксиланаза; и химическое сырье.

Биогаз.

Изобретение также относится к применению полипептида или композиции, описанной здесь в способе получения биогаза. Биогазом обычно называется газ, получаемый биологическим распадом органического вещества, например, материала, содержащего некрахмальные углеводы, в отсутствие кислорода. Биогаз происходит от биогенного материала и является одним из видов биотоплива. Один тип биогаза производится анаэробным усвоением или ферментацией биоразлагаемых материалов, таких как биомасса, навоз или сточные воды, бытовые отходы и энергетические культуры. Этот тип биогаза состоит в основном из метана и углекислого газа. Газ метан можно сжигать или окислять кислородом. Воздух содержит 21% кислорода. Это высвобождение энергии позволяет применять биогаз в качестве топлива. Биогаз может быть использован в качестве недорогого топлива в любой стране для каких-либо нагревательных целей, таких как приготовление пищи. Он также может применяться в современных устройствах по обращению с отходами, где он может применяться для запуска любого типа теплового двигателя, для выработки либо механической или электрической энергии.

Первый шаг в микробном производстве биогаза состоит в ферментативном разложении полимеров и сложных субстратов (например, некрахмальных углеводов). Таким образом, изобретение относится к способу получения биогаза, причем субстрат, содержащий некрахмальный углевод, взаимодействует с полипептидом или композицией по изобретению таким образом, чтобы получить способный к брожению материал, который может быть преобразован в биогаз организмом, таким как микроорганизм. В таком способе полипептид по изобретению может предоставляться в рамках организма, например микроорганизма, который экспрессирует такой полипептид.

Применение ферментов в пищевых продуктах.

Полипептиды и композиции по изобретению могут быть применены в способе обработки растительного материала, чтобы разрушить или изменить целлюлозу или гемицеллюлозу или пектиновые составные части клеточных стенок растений или грибкового материала. Такие методы могут быть полезны при подготовке пищевого продукта. Таким образом, изобретение относится к способу получения пищевого продукта, и данный способ содержит включение полипептида или композиции по изобретению при подготовке пищевого продукта.

Изобретение также относится к способу обработки растительного материала, и такой способ содержит контактирование растительного материала с полипептидом или композицией по изобретению для того, чтобы разрушить или изменить целлюлозу в (растительном) материале. Предпочтительно растительный материал является растительной целлюлозой или растительным экстрактом, таким как соки.

Настоящее изобретение также относится к способу снижения вязкости, ясности и/или фильтруемости из растительного экстракта, такой способ содержит контактирование растительного экстракта с полипептидом или композицией по изобретению в количестве, эффективном в разложении целлюлозы или гемицеллюлозы или пектиновых веществ, содержащихся в растительном экстракте.

Растительные и содержащие целлюлозу/гемицеллюлозу/пектиновые вещества материалы включают в себя растительную целлюлозу, части растений и растительные экстракты. В контексте настоящего изобретения экстрактом из растительного материала является любое вещество, которое может быть получено из растительного сырья путем экстракции (механической и/или химической), переработки или с помощью других методов разделения. Экстрактом может быть сок, нектар, база, или концентраты из него. Растительный материал может содержать или происходить из овощей, например, моркови, сельдерей, луки, бобовые и зернобобовые культуры (соя, соевые, горох) или фрукты, например, семечковые плоды или фруктовые семена (яблоки, груши, айва и др.), виноград, томаты, цитрусовые (апельсин, лимон, лайм, мандарин), дыни, сливы, вишни, черные смородины, красные смородины, малины, клубники, клюквы, ананас и другие тропические фрукты, деревья и их части (например, пыльца из сосны), или зерновые (овес, ячмень, пшеница, кукуруза, рис). Материалом (который нужно гидролизовать) также могут быть сельскохозяйственные отходы, такие как жом сахарной свеклы, обертка кукурузных початков, солома пшеницы, (основная) ореховая скорлупа, или перерабатываемые материалы, например, (отходы) бумага.

Полипептиды по изобретению могут применяться для обработки растительного материала, включая растительную целлюлозу и растительные экстракты. Они также могут применяться для обработки жидких или твердых продуктов питания или съедобных ингредиентов продуктов питания, или применяться в экстракции кофе, растительных масел, крахмала или как загуститель в пищевых продуктах.

Как правило, полипептиды по изобретению используются как композиция/ферментный препарат, как описано выше. Композиция, как правило, добавляется к растительной целлюлозе, получаемой, например, механической обработкой, такой как дробление или измельчение растительного материала. Инкубация композиции с растением, как правило, осуществляется в течение промежутка времени от 10 мин до 5 ч, такого как от 30 мин до 2 ч, предпочтительно в течение около 1 ч. Температура обработки состав- 31 023558 ляет предпочтительно от около 10 до около 55°С, например, около с 15 до 25°С, оптимально около 20°С, и можно применять от около 10 до около 300 г, предпочтительно от около 30 до около 70 г, оптимально около 50 г фермента на тонну материала, подлежащего обработке.

Все фермент(ы) или их используемые композиции, могут быть добавлены последовательно или одновременно к растительной целлюлозе. В зависимости от композиции ферментных препаратов растительный материал можно сначала вымочить (например, для чистоты) или сжижить. Применяя параметры обработки полипептидов по изобретению, такие как выход экстракции, можно улучшить вязкость экстракта и/или качество экстракта.

Альтернативно или в дополнение к вышесказанному, полипептид по изобретению можно добавить к сырому соку, полученному выдавливанием или сжижением растительной целлюлозы. Обработка сырого сока будет осуществляться сходным с растительной целлюлозой образом в отношении дозировки, температуры и времени. Опять же, другие ферменты, такие как те, которые обсуждались ранее, могут быть включены. Типичные условия инкубации являются условиями, описанными в предыдущем абзаце.

После того как сырой сок проинкубировали с полипептидами по изобретению, сок затем центрифугируют или (ультра) фильтруют для производства конечного продукта.

После обработки полипептид по изобретению (конец) продукт может быть подвергнут тепловой обработке, т.е. около 100°С в течение времени, примерно, от 1 мин до 1 ч, при условиях, которые частично или полностью инактивирует полипептид(ы) по изобретению.

Композиция, содержащая полипептид по изобретению, может быть также использована при подготовке фруктового или овощного пюре.

Полипептид по изобретению может быть также использован в пивоварении, виноделии, дистилляции или выпечке. Он может поэтому применяться в подготовке алкогольных напитков, таких как вино и пиво. Например, это может улучшить фильтруемость или ясность, например пива, сусла (например, содержащие ячмень и/или сорговый солод) или вино.

Кроме того, полипептид или композиция по изобретению может применяться для обработки пивоварной пивной дробины, т.е. остатков от производства пивного сусла, содержащего ячмень или солодовый ячмень или другие злаки, с тем чтобы повысить эффективность применения остатков для, например, корма для животных.

Белок может помочь в удалении растворенных органических веществ из бульона или питательных сред, например, когда отходы органического происхождения винокуренного завода биоконвертируются в микробную биомассу. Полипептид по изобретению может улучшить фильтруемость и/или уменьшить вязкость в глюкозных сиропах, например, из злаков, произведенных сжижением (например, с αамилазой).

В выпечке полипептид может улучшить структуру теста, изменять ее жесткость или мягкость, улучшить объем хлеба и/или структуру крошки или придать лучшие текстурные характеристики, такие как качество разлома или крошки.

Настоящее изобретение относится к способам получения теста или пищевого продукта на зерновой основе, содержащим включение в тесто полипептида или композиция по настоящему изобретению. Это может улучшить одно или более свойств теста или пищевого продукта на зерновой основе, полученного из теста, относительно теста или пищевого продукта на зерновой основе, причем полипептид не включен.

Подготовка пищевого продукта на зерновой основе согласно изобретению дополнительно может содержать шаги, известные в данной области, такие как кипячение, сушка, жарка, обработка паром или выпечка полученного теста.

Продуктами, сделанными из теста, которое варят, являются, например, вареная лапша, пельмени, продуктами, которые сделаны из жареного теста, являются, например, пончики, бублики, жареная лапша, продукты, которые сделаны для пару из теста, являются, например, паровые булочки и паровая лапша, примерами продуктов, изготовленных из сухого теста, являются макаронные изделия и сушеная лапша, и примерами продуктов из печеного теста являются хлеб, печенье, торт.

Термин улучшенное качество определяется здесь как какое-либо качество из теста и/или продукта, полученного из теста, в частности, пищевого продукта на зерновой основе, которое улучшается за счет действия полипептида согласно изобретению по отношению к тесту или продукту, в который полипептид согласно изобретению не включен. Улучшенное качество может включать, но не ограничиваясь этим, повышенную прочность теста, увеличение эластичности теста, повышенную стабильность теста, улучшение машинообрабатываемости теста, повышенную проверяемую стойкость теста, сниженную вязкость теста, улучшенную расширяемость теста, увеличение объема пищевого продукта на зерновой основе, снижение образования пузырей в пищевом продукте на зерновой основе, улучшение структуры крошки испеченного продукта, улучшение мягкости пищевого продукта на зерновой основе, улучшение вкуса пищевого продукта на зерновой основе, улучшение нечерствения пищевого продукта на зерновой основе. Улучшенными качествами, связанными с продуктами на зерновой основе типа макароны и лапша, являются, например, улучшенная прочность, снижение жесткости, повышение когезионной способности и сокращение потерь приготовления пищи.

- 32 023558

Улучшенное качество можно определить путем сравнения теста и/или пищевых продуктов на зерновой основе, приготовленных с применением и без добавления полипептида по настоящему изобретению. Органолептические качества могут быть оценены с применением процедур, хорошо зарекомендовавших себя в выпечной промышленности, и может включать, например, применение панели подготовленных дегустаторов.

Термин тесто определяется здесь как смесь муки зерновых и других ингредиентов достаточно твердых, чтобы месить или катать. Примерами зерновых культур являются пшеница, рожь, кукуруза, кукуруза, ячмень, рис, крупы, гречка и овес. Пшеница здесь и далее должна охватывать все известные виды рода ΤπΙίαιιη. например аекбуит, бигит и/или крека. Примерами других подходящих ингредиентов являются целлобиогидролаза в соответствии с настоящим изобретением, дополнительные ферменты, химические добавки и/или технологические добавки. Тесто может быть свежим, замороженным, подготовленным, или препеченным. Подготовка теста из ингредиентов, описанных выше, хорошо известна в данной области и содержит смешивание указанных ингредиентов и технологических добавок и один или более шагов заливки, при необходимости, ферментации. Подготовка замороженного теста описывается Ки1р и Богеп/ в Его/еп аиб КеГгщегаЮб ОоидЬк аиб Β31Νγ5.

Термин пищевой продукт на зерновой основе определяется здесь как любой продукт, приготовленный из теста, мягкого или хрустящего характера. Примерами пищевых продуктов на зерновой основе белого, светлого или темного типа, которые могут с успехом производиться по настоящему изобретению, являются хлеб (в частности, белый, полностью мучной мука или ржаной хлеб), как правило, в виде буханки или батона, хлеб типа французский багет, макароны, лапша, пончики, рогалики, пирожные, лаваш, лепешки, тако, пироги, блины, бисквиты, печенье, пирог с коркой, приготовленный на пару хлеб и свежий хлеб, и т.п.

Термин печеный продукт определяется здесь как любой пищевой продукт на зерновой основе, приготовленный печением теста.

Некрахмальные полисахариды (ΝδΡ) могут увеличить вязкость пищеварительной добавки, которая может, в свою очередь, снижать наличие питательных веществ и продуктивность животных. Применение целлобиогидролазы по настоящему изобретению может улучшить усвоение фосфора, а также катионных минералов и белка во время пищеварения животных.

Добавление отдельных питательных веществ к корму улучшает пищеварение животных и тем самым снижает затраты на корма. Много кормовых добавок используются в настоящее время, и новые концепции постоянно развиваются. Применение таких специфических ферментов, как ферменты, разлагающие некрахмальные углеводы, может разрушить запасенную в волокне энергию, а также повысить усвояемость белка благодаря лучшей доступности белка при разрушении волокна. Таким образом, стоимость кормов может уменьшиться, а также уровни белка в кормах также могут быть сокращены.

Некрахмальные полисахариды (ΝδΡκ) также присутствуют практически во всех кормовых добавках растительного происхождения. ΝδΡκ плохо усваиваются и могут, будучи растворенными, оказывать неблагоприятное воздействие на пищеварение. Экзогенные ферменты могут способствовать более эффективному усваиванию этих ΝδΡκ и, как следствие, сократить любые антипитательные эффекты. Ферменты, разлагающие некрахмальные углеводы, по изобретению могут быть применены для этой цели в диетах на зерновой основе для птиц и, в меньшей степени, для свиней и других видов.

Полипептид/фермент, разлагающие некрахмальные углеводы по изобретению (композиции, содержащей полипептид/фермент по изобретению) могут применяться в моющих средствах, например, для удаления из белья пятен на углеводной основе. Композиция моющего средства могут содержать полипептид/фермент по изобретению и, кроме того, один или более целлюлозы, гемицеллюлазы, пектиназы, протеазы, липазы, кутиназы, амилазы или карбогидразы.

Применение ферментов в моющих составах.

Композиция моющего средства, содержащая полипептид или композицию по изобретению, может быть в любой удобной форме, например, паста, гель, порошок или жидкость. Жидкое моющее средство может быть водным, как правило, содержащим до около 70% воды и от около 0 до около 30% органического растворителя или неводного материала.

Такая композиция моющего средства может формулироваться, например, как композиция ручного или машинного стирального порошка, включающая композицию прачечной добавки, подходящей для предварительной обработки окрашенных тканей и композицию добавленного смягчителя ткани при промывке, или может формулироваться как композиция моющего средства для применения в операциях общего домашнего хозяйства по очистке твердой поверхности, или может формулироваться для операций по ручному или машинному мытью посуды.

В целом свойства фермента должны быть совместимы с выбранным моющим средством (например, рН-оптимум, совместимость с другими ферментативными и/или неферментативными ингредиентами и т.д.), и фермента(ы) должен присутствовать в эффективной количестве.

Композиция моющего средства может содержать поверхностно-активное вещество, например анионное или неионное поверхностно-активное вещество, строитель и комплексообразователь моющих средств, один или более полимеров, отбеливающую систему (например, источник Н₂О₂) или стабилиза- 33 023558 тор фермента. Композиция моющего средства может также содержать любые другие обычные ингредиенты моющих средств, такие как, например, кондиционер, в том числе глина, стимулятор образования мыльной пены, подавитель грязной пены, антикоррозионное средство, почвенно-приостанавливающий агент, агент переотложения почвенного покрова, краситель, бактерицид, оптический отбеливатель, гидротропы, ингибитора очернения или духи.

Применение ферментов в обработке бумаги и целлюлозы.

Полипептид или композиция настоящего изобретения могут быть применены в целлюлознобумажной промышленности, в частности в процесс отбеливания для повышения яркости беленой целлюлозы, силу чего количество хлора, используемое на этапах отбеливании, может быть уменьшено, а также увеличения свободы целлюлозы в процессе переработанной бумаги (Епкззоп, К.Е.Ь., \Уоой §аепсе апй Тесйпо1оду 24 (1990): 79-101; Раюе, е! а1., Вю1есЬпо1. апй Вюепд. 32 (1988): 235-239 апй Ротпнег е! а1., Тарр1 1оигпа1 (1989): 187-191). Кроме того, полипептид или композиция по изобретению может применяться для обработки лигноцеллюлозной целлюлозы, с тем чтобы повысить их отбеливаемость. Тем самым количество хлора, необходимое для получения удовлетворительного отбеливания целлюлозы, может быть уменьшено.

Полипептид или композиция по изобретению могут быть применены в способе снижения скорости, с которой содержащие целлюлозу ткани становятся грубыми, или снижения грубости содержащих целлюлозу тканей, причем способ содержит обработку, содержащих целлюлозу тканей полипептидом или композицией по изобретению, описанную выше. Настоящее изобретение также относится к способу, обеспечивающему осветление цветных, содержащих целлюлозу тканей, причем способ включает обработку цветных, содержащих целлюлозу тканей полипептидом или композицией по изобретению, как описано выше, и к способу, обеспечивающему местное изменение в цвете цветных, содержащих целлюлозу тканей, причем способ включает обработку цветных, содержащих целлюлозу тканей полипептидом или композицией по изобретению, как описано выше. Способы изобретение может осуществляться обработкой содержащих целлюлозу тканей во время стирки. Однако, по желанию, обработка тканей может также осуществляться во время замачивания или промывки или просто добавлением полипептида или композиции по изобретению, как описано выше, к воде, в которой ткани находятся или будут погружены.

Другие применения фермента.

Кроме того, полипептид или композиция настоящего изобретения могут также применяться в разработке антибактериальных препаратов, а также в фармацевтических продуктах, таких как леденцы, зубные пасты и полоскания рта.

Следующие примеры иллюстрируют настоящее изобретение.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Материалы и методы.

ДНК.

Стандартные методики работы с ДНК проводились, как описано в другом месте (8атЬтоок и др., 1989, Молекулярное клонирование: Лабораторное руководство, 2-е изд, Со1й §ртшд НагЬог ЬаЬотаЮту Ргезз, Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк), если не указано иное. ДНК амплифицировали с применением корректирующей фермент Рйузюп полимеразы (Ппп/утез). Ферменты рестрикции были получены из Шуйтодеп или №ν Епд1апй Вю1аЬз.

Метод определения гидролиза целлюлозы.

Раствор субстрата сухого вещества (йт) предварительно обработанной промыванием 2% кислотой пшеничной соломы (Р^§) делается в 50 мМ буферного раствора ацетата натрия рН 4,5, изготовленного из воды, которой предварительно промывали солому пшеницы. Для инкубации используются 96луночные микропланшеты. В каждую лунку пипетируется 1 мл субстрата. Базовый уровень 1 мг ΡΪ11газе® ИЪ белка/г клетчатки йт добавляется в каждую лунку. Кроме белка РШтазе® ИЪ количество 0,8 и 2,4 мг полипептида добавляется на грамм йт волокна Р\У8.

Образцы предварительно обрабатываются ультрафильтрацией (Утьазрш 2, §атЮтшз, 10000 М\УС0 ПЭУ). 2 мл пробы фермента пипетируется в ультрафильтрационную трубку. Трубка затем центрифугируется в течение 20 мин при 3220 КСР (относительная центробежная сила). Ретентат дважды промывают 2 мл буферного раствора ацетата натрия (и центрифугируют в течение 20 мин при 3220 КСР).

Планшет выдерживают при температуре 40°С в течение 18-20 ч. После инкубации ферментативная реакция останавливается добавлением 50 мкл 1 М раствора гидроксида натрия. Планшет затем центрифугируют в течение 15 мин при 3220 КСР и супернатант разбавляют до концентрации глюкозы между 40 и 100 мкМ.

мкл разбавленного образца пипетируют в планшет ПЦР и добавляют 150 мкл реагента ВСА. ВСА реагент свежеприготавливается смешением двух растворов А и В 1:1 об./об. Раствор А состоит из 54,3 г №₂С0₃, NаНС0з 24,2 и 1,9 г №ьВСА (§1§та Ό8284) на литр воды (МЦ). Раствор В содержит 31,24 мл Си80₄-5Н₂0 раствор 4% (Р1етсе 185 9078) и 1,26 г Ь-лизина (81дта Ь5501) на литр воды (МЦ) (конечная концентрация: 2,5 мМ ВСА, 2,5 мМ Си, 4,3 мМ Ь-лизин, 400 мМ карбонат). Планшет нагревают до

- 34 023558

80°С в течение 60 мин. После охлаждения 150 мкл пипетируют во второй планшет и поглощение измеряют при 560 нм.

В каждом планшете анализируют фон субстрата с помощью инкубации субстрата без добавления ферментов ЕШгазе® ΝΣ. Для каждого измерения глюкозный стандарт 55 мкм анализируют против ацетатного буфера для расчета молярного коэффициента экстинкции глюкозы.

Инкубации выполняют с помощью термоциклера Пельтье ПЦР блока (РТС200) и измерения выполняют с помощью микропланшетного ридера (Тесап §ипг18е).

Степень гидролиза целлюлозы рассчитывали, как показано ниже: ψρινϊ * кт *глюкан * 1,11 * 1000 * 1000 ** Потенциальная глюкоза в субстрате (ммоль / л) = (№гте * кт *глюкан * 1,11 * 1000 * 1000) /<* * У„у_НКИ) ν/ρν/я = Потребление Р%^г8 субстрата (г) кт = содержание сухого вещества волокна Р1УЗ субстрата глюкан = глюкановое содержание субстрата

1,11= поправка на связанную глюкозу к свободной глюкозе

1У»_В1 = общий вес субстрата (г)

Μ.* = Молекулярный вес глюкозы (г / моль)

Удуши = Объем субстрата / лунку (мл)

1000 = коррекции мл —»Ь

1000 = коррекции мол —* ммоль * Высвободившаяся глюкоза (ммоль / л) 1 ⁺ ε *

Аз = поглощение образца при 560 нм

Аык = поглощение бланка субстрата при 560пт

Оа^ау = разведение в пробе

Уаззау = ОбЩИЙ Объем Пробы (МКЛ)

ОтсиЬавг = разведение инкубанов Ь = длина пути (см) ε = молярный коэффициент экстинкции глюкозо-ВСА (ммоль * Ь-1 * см-1)

У_зиьа(га15⁼ общий объем субстрата (мкл)

Это значение должно быть скорректировано с учетом снижающегося содержания сахара/белка в образце (проанализированного анализом ВСА).

Из этих значений степень гидролиза может быть рассчитана по следующей формуле: Высвободившаяся глюкоза (ммоль/л)

Степень гидролиза (%) = Потенциальная глюкоза в субстрате (ммоль / л) * 100%

Пример 1.

1.1. Конструкция плазмид экспрессии.

Последовательность, имеющую §ЕЦ ГО ΝΟ: 1, клонировали в векторе рСВТОР (фиг. 1) с помощью сайтов ЕсоК1 и §паВ1, содержащем промотор глюкоамилазы и терминатор последовательности. Часть Е.сой удаляли перевариванием ΝοΐΙ до трансформации А. тдег СВ§ 513.88.

1.2. Трансформация А. №дег.

А. тдег ^Т-1: этот штамм А. тдег является СВ8513.88, содержащим делеции генов, кодирующих глюкоамилазу (д1аА), грибковую амилазу и кислотную амилазу. А. тдег \УТ 1 конструируют с помощью подхода ΜΑΡΚΕΡ-ΟΕΝΕ РКЕЕ, как описано в ЕР 0635574 В1.

Экспрессированные конструкции совместно трансформируют в штамм А. тдег ^Т-1 в соответствии с методом, описанным ТПЪит, 1. и др. (1983), Сепе 26, 205-221 и Ке11у, 1. & Нупез, М. (1985), ЕМВО 1., 4, 475-479, со следующими изменениями:

споры прорастают и культивируют в течение 16 ч при 30°С во встряхиваемой колбе, помещенном в ротационном шейкере со скоростью 300 об/мин в минимальной среде для АзрегдШиз (100 мл). Минимальная среда для АзрегдШиз содержит на 1 л: 6 г Ν;·ιΝΟ₃,. 0,52 г КС1, 1,52 г КН₂РО₄, 1,12 мл 4 М КОН, 0,52 г М§§О₄-7Н₂О, 10 г глюкозы, 1 г казаминокислот, 22 мг 2п§О₄-7Н₂О, 11 Н₃ВО₃ мг, 5 Ре8О₄-7Н₂О мг, 1,7 мг СоС1₂-6Н₂О, 1,6 мг Си8О₄-5Н₂О, 5 мг МпС1₂-2Н₂О, 1,5 мг №₂МоО₄-2Н₂О, 50 мг ЭДТА, 2 мг рибофлавина, 2 мг тиамина-НС1, 2 мг никотинамида, 1 мг пиридоксина-НС1, 0,2 мг пантотеновой кислоты, 4 г биотина, 10 мл раствора пенициллина (5000 МЕ/мл) и стрептомицина (5000 мкг/мл) (СтЪсо);

№уо/уш 234ТМ (Цоуо Шкизйтез) вместо геликазы используют для подготовки протопластов;

- 35 023558 после образования протопластов (60-90 мин) КС буфер (0,8 М КС1, 9,5 мМ лимонной кислоты, рН 6,2) добавляют до конечного объема 45 мл, суспензию протопластов центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об/мин при 4°С в бакет-роторе. Протопласты ресуспендируют в 20 мл буфера КС, а затем добавляют 25 мл 8ТС буфера (1,2 М сорбит, 10 мМ Трис-НС1, рН 7,5, 50 мМ СаС1₂). Суспензию протопластов центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об/мин при 4°С в бакет-роторе, промывают в 8ТСбуфере и ресуспендируют в 8ТС-буфере при концентрации 10Е8 протопластов/мл;

к 200 мкл суспензии протопластов добавляют фрагмент ДНК, растворенный в 10 мкл ТЕ-буфера (10 мМ Трис-НС1, рН 7,5, 0,1 мМ ЭДТА) и 100 мкл раствора ПЭГ (20% ПЭГ 4000 (Мегск), 0,8 М сорбит, 10 мМ Трис-НС1, рН 7,5, 50 мМ СаС1₂);

после инкубации суспензии ДНК-протопластов в течение 10 мин при комнатной температуре, 1,5 мл раствора ПЭГ (60% ПЭГ 4000 (Мегск), 10 мМ Трис-НС1, рН 7,5, 50 мМ СаС1₂) добавляют медленно, с повторным перемешиванием пробирок. После инкубации в течение 20 мин при комнатной температуре, суспензии разбавляют 5 мл 1,2 М сорбита, смешивают перевертыванием и центрифугируют в течение 10 мин при 4000 об/мин при комнатной температуре. Протопласты осторожно ресуспендируют в 1 мл 1,2 М сорбита и высевают на твердую селективную среду регенерации, состоящую из минимальной среды для Л8рег§Ши8 без рибофлавина, тиамина -НСЬ, никотинамида, пиридоксина, пантотеновой кислоты, биотина, казаминокислот и глюкозы. В случае селекции по ацетамиду среда содержит 10 мМ ацетамида в качестве единственного источника азота и 1 М сахарозы, в качестве осмотикума и источника углерода. Альтернативно, протопласты высевают на ΡΌΆ (картофель-декстроза-агар, Οχοίά) с добавлением 1-50 мкг/мл флеомицина и 1 М сахарозы в качестве осмотикума. Регенерационные планшеты затвердевают с применением 2% агара (агар № 1, Θχοίά Ь11). После инкубации в течение 6-10 дней при температуре 30°С, конидиоспоры трансформантов переносят на планшеты, состоящие из селективной среды для ΑδретдШик (минимальной среды, содержащей ацетамид в качестве единственного источника азота в случае селекции по ацетамиду или среды ΡΌΆ с добавлением 1-50 мкг/мл флеомицина в случае селекции по флеомицину) с 2% глюкозы и 1,5% агарозы (1пуйгодеп) и инкубируют в течение 5-10 дней при температуре 30°С. Одиночные трансформанты изолируют, и это селективную стадию очистки повторяют еще один раз, после чего очищенные трансформанты хранят.

После трансформации трансформанты отбирали на среде, содержащей ацетамид в качестве единственного источника азота, и колонию очищали. Количество копий определяли количественной ПЦР и трансформанты с низким и высоким числом копий отбирали. Трансформанты с высоким числом копий культивировали во встряхиваемых колбах в 100 мл среды С8М-МЕ8, как описано в ЕР 635574 при 34°С при 170 об/мин в инкубаторе-шейкере с применением 500 мл встряхиваемой колбы с плоским дном. После 3-х и 4-х дней ферментации образцы супернатантов собирали для определения экспрессии с помощью δΌδ-ΡΑΟΕ.

1.3. Содержание белка.

Супернатанты ферментации трансформантов, экспрессирующих СВН-1 (ЕВА205 = собственная δδ; ЕВА207 = РтеА δδ) во встряхиваемых колбах, собирали через 6 дней, биомассу и супернатант отделяли центрифугированием и супернатант фильтровали через 0,2 мкм бутылочный фильтр (№1§епе).

Содержание белка в полученном супернатанте определяли по методу Брэдфорда. Количество белка в образцах фермента определяли анализом ВгабТогб Рго1еш, используя Кумасси-белковый реагент. 25 мкл должным образом разбавленного образца фермента смешивали с 1,2 мл реагента Кумасси. После инкубации 10 мин при комнатной температуре поглощение смеси при 595 нм определяли с помощью спектрофотометра (Иу1коп ХЬ). Содержание белка рассчитывали, сравнивая со стандартом ΒδΑ. Содержание белка в ЕВА205 составило 2 мг/мл, а в ЕВА207 составило 3 мг/мл.

Пример 2.

Влияние добавки полипептида СВН-1 на гидролиз соломы пшеницы.

Продукт фермента Та1а^οтусеδ етегеопл, известный на рынке как Рбб^е® ЫЬ продукт ^δМ, использовали для гидролиза предварительно обработанной промыванием кислотой пшеничной соломы (далее сокращенно Ρνδ).

Дозы фермента, применяемые для этого классического продукта, составляли 1 и 3 мг белка по Брэдфорду на г ЭМ. Кроме того, ЕВА205 добавляли к гидролизной смеси, содержащей 1 мг белка по Брэдфорду ПНгазе® ΝΣ на грамм сухой массы Ρνδ, в концентрации 0,8 и 2,84 мг белка по Брэдфорду на грамм сухой массы Ρνδ. Степень гидролиза целлюлозы в промытой Ρνδ определяли с помощью анализа уменьшения количества сахара, как описано выше.

Степень гидролиза определяли для И1б^е® ЫЪ, на 1 мг белка по Брэдфорду она составила 12%. Добавка 0,8 мг белка по Брэдфорду к ферменту примера 1 приводила к степени гидролиза 15%, а добавка 2,4 мг белка по Брэдфорду к ферменту примера 1 приводила к степени гидролиза 19%.

Пример 3.

Повторяли пример 1, кроме того, что вместо последовательности ЕВА205, последовательность нуклеотидов ЕВА207 с δΕΘ ΙΌ ΝΟ: 4 клонировали в вектор рΟΒТΟΡ (фиг. 1). Белок, который производился, обозначили ЕВА207. Содержание белка в ЕВА207 составило 3 мг/мл.

- 36 023558

Пример 4.

Пример 4 выполняли как пример 2. Вместо белка ЕВА205, теперь белок ЕВА207 добавляли к гидролизной смеси, содержащей 1 мг белка по Брэдфорду РШгаке® ΝΡ на грамм сухой массы РА8, в концентрации 0,8 и 2,4 мг белка по Брэдфорду на грамм сухой массы РА8.

Добавка 2,4 мг белка по Брэдфорду фермента ЕВА207 примера 3 приводило к степени гидролиза

19%.

Метод определения целлобиогидролазной активности.

мкл раствора фермента инкубировали с 10 мМ пара-нитрофенил-β-^-целлобиозида и 10 мМ глюконолактона в 0,2 М натрий-ацетатном буфере рН 4,5 при 40°С. Пробы брали с интервалом в 10 мин до 30 мин. Реакцию останавливали добавлением холодного раствора 1 М карбоната натрия в соотношении 1:1. Поглощение финальных растворов измеряли при 405 нм. Изменение поглощения за минуту инкубации в линейной части кривой временной зависимости использовали в качестве меры активности фермента.

Пример 5 и сравнительный эксперимент А.

В примере 5 (ЕВА205) и сравнительном эксперименте (ЕВА6) стабильность ЕВА205 сопоставляли с ЕВА6. ЕВА6 конструировали в соответствии с примером 1, однако использовали ген СВН 1В гена, показанный на фиг. 2: Огагаск, Еиг. I. Вюсйет, 271, 4495-4506 (2004). Последовательность СВН 1В, как указано в Огагаск, имеет идентичность 92% с 8ЕЦ ГО N0: 2, описанной здесь.

Фильтрованный супернатант ферментаций трансформантов, экспрессирующих СВН-Ι (штаммы ЕВА205 и ЕВА6) во встряхиваемых колбах, обессоливали с применением спин-колонки. Обессоленные растворы инкубировали при 60, 65 и 70°С в течение 24 ч. Пробы отбирали во времени при 0, 2, 4, 8 и 24 ч и хранили в морозильнике до анализа активности. Относительную активность фермента во времени выражали как активность при х часов к активности при 0 ч инкубации (в процентах) при определенной температуре.

Результаты приведены в таблице и на фиг. 2.

Из фиг. 2 видно, что стабильность ЕВА205 при температуре 65-70°С значительно выше, чем стабильность ЕВА6.

Относительная активность (в % от исходной активности) ферментов ЕВА205 и ЕВА6 как функция времени инкубации (ч), при различных температурах (60, 65 и 70°С)

Время инкубации	ЕВА6 6О°С	ЕВА6 65°С	ЕВАб 70°С	ЕВА205 60°С	ЕВА205 65°С	ЕВА205 70°С
0	100	100	100	100	100	100
2	99	101	40	96	105	92
4	103	101	0	100	99	75
8	104	101	0	97	104	66
24	99	80	0	100	88	17

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Полипептид, обладающий активностью β-целлобиогидролазы, термостабильный в течение 4 ч при температуре около 70°С, который содержит аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0: 2 или идентичную ей на 96% последовательность.
2. Полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность 8ЕЦ ГО N0: 1 или ее обратно комплементарную последовательность, который кодирует полипептид по п.1.
3. Полинуклеотид по п.2, представляющий собой ДНК.
4. Конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая полинуклеотид по любому из пп.2, 3.
5. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.4, где содержание СС составляет 56-65%.
6. Вектор, содержащий полинуклеотид по любому из пп.2, 3.
7. Клетка, содержащая полипептид по п.1.
8. Клетка, содержащая полинуклеотид по любому из пп.2, 3.
9. Клетка, содержащая конструкцию нуклеиновой кислоты по любому из пп.4, 5.
10. Клетка, содержащая вектор по п.6.
11. Клетка по любому из пп.7-10, являющаяся эукариотической клеткой.
12. Клетка по любому из пп.7-10, являющаяся клеткой гриба.
13. Клетка по п.12, которая выбрана из группы, состоящей из родов АзретдШиз, ТпсНойегта, Нуросгеа, Ризатшт, 0|зрого1г1сНит, РетсШшт, Асгетотит, №игозрога, ТНегтоазсиз, МусеНорйЬога, 8рого1пс1шт, Т1йе1а\аа, СЬтуозротшт, Нитюо1а и Та1аготусез.
14. Клетка по п.13, которая выбрана из группы, состоящей из видов АзретдШиз огу/ае, АзретдШиз зо.)ае, АзретдШиз пШи1апз или АзретдШиз тдег.
15. Клетка по любому из пп.7-14, в которой один или несколько генов, кодирующих протеазу, удалены, нокаутированы или разрушены полностью или частично.
16. Трансгенное растение, содержащее полинуклеотид по любому из пп.2, 3, представляющее собой кукурузу, сорго, томат, пшеницу, масличное растение, рапс, сою, ячмень, табак или растение родов АпасагШит, АтасЫз, Кадиз, А1гора, Дуема, Вгаззюа, СИтиз, СйтиНиз, Сарзюит, СатШатиз, Сосоз, СоГГеа, Ре- 43 023558 гае, Сиситк, СисигЬНа, Оаисик, Е1аек, Егадапа, О1усше, Ооккуршт, НеПапбшк, 0са11к, Ногбеит, Нуоксуатик, ЬасЫса, Ыпит, ЬоНит, Ьиршик, Ьусорегкюоп, Ма1ик, Ма]огапа, Мебюадо, №соНапа, 01еа, 0гу/а, Ратеит, РаппкеЫт, Регкеа, Ео1ик, РкЫсЫо, Ркит, Ругик, Ргипик, РарНапик, Рюшик, 8еса1е, 8епесю, 8тарк, 8огдНит, ТНеоЬготик, ТпдопеПа, ТгЫсит, УШа, УЫк, У1дпа или 2еа или часть указанного растения.
17. Трансгенное растение, содержащее конструкцию нуклеиновой кислоты по любому из пп.4, 5, представляющее собой кукурузу, сорго, томат, пшеницу, масличное растение, рапс, сою, ячмень, табак или растение родов АпасагбЫт, АгасЫк, Радик, Л1гора, Ауепа, Вгакыса, СНгик, СНгиПик, Саркюит, Саг(Натик, Сосок, СоГГеа, Регае, Сиситк, СисигЬНа, Оапспк, Е1аек, Егадапа, О1усше, Ооккуршт, НеПапбшк, 0саШк, Ногбеит, Нуоксуатик, ЬасЫса, Ьтит, ЬоНит, Ьиршик, Ьусорегкюоп, Ма1ик, Ма]огапа, Мебюадо, №собапа, 01еа, 0гу/а, Ратеит, РаппкеЫт, Регкеа, Ео1ик, Р1к1асН1о, Ркит, Ругик, Ргипик, РарНапик, Рюк пик, 8еса1е, 8епесю, 8тарк, 8огдНит, ТНеоЬготик, ТпдопеПа, ТгЫсит, УШа, УЫк, У1дпа или 2еа, или часть указанного растения.
18. Трансгенное растение, содержащее вектор по п.6, представляющее собой кукурузу, сорго, томат, пшеницу, масличное растение, рапс, сою, ячмень, табак или растение родов Лпасагбшт, ЛгасЫк, Радик, А(гора, Ауепа, Вгаккюа, СНгик, СЫиПик, Саркюит, СаПНатпк, Сосок, СоГГеа, Еегае, Сиситк, СисигЬНа, Оапспк, Е1аек, Егадапа, О1усше, Ооккуршт, НеПапбшк, 0саШк, Ногбеит, Нуоксуатик, ЬасЫса, Ьтит, ЬоНит, Ьиршик, Ьусорегкюоп, Ма1ик, Ма]огапа, Мебюадо, №соНапа, 01еа, 0гу/а, Ратеит, РаппкеЫт, Регкеа, Ео1ик, Рк1асЫо, Ркит, Ругик, Ргипик, РарНапик, Рюшик, 8еса1е, 8епесю, 8тарк, 8огдНит, ТНеоЬготик, ТпдопеПа, ТгЫсит, УШа, УЫк, У1дпа или 2еа или часть указанного растения.
19. Трансгенное растение, содержащее клетки по любому из пп.7-15, представляющее собой кукурузу, сорго, томат, пшеницу, масличное растение, рапс, сою, ячмень, табак или растение родов АпасагбЫт, АгасЫк, Радик, А(гора, Ауепа, Вгаккюа, СНгик, СНгиПик, Саркюит, СаННатик, Сосок, СоГГеа, Еегае, Сиситк, СисигЬНа, Оапспк, Е1аек, Егадапа, О1усте, Ооккуршт, НеПапЫик, 0саШк, Ногбеит, Нуоксуатик, ЬасЫса, Ьтит, ЬоНит, Ьиршик, Ьусорегкюоп, Ма1ик, Ма]огапа, Мебюадо, №соНапа, 01еа, 0гу/а, Ратеит, РаппкеЫт, Регкеа, Ео1ик, РкЫсЫо, Ркит, Ругик, Ргипик, РарНапик, Рюшик, §еса1е, 8епесю, 8Ыарк, 8огдНит, ТНеоЬготик, ТпдопеПа, ТгЫсит, УЮа, УЫк, У1дпа или 2еа или часть указанного растения.
20. Способ получения полипептида по п.1, включающий культивирование клетки по любому из пп.9-17 в условиях, обеспечивающих синтез указанного полипептида, и получение синтезированного полипептида.
21. Композиция для производства сахара из лигноцеллюлозного материала, содержащая полипептид по п.1 и целлюлазу, и/или гемицеллюлазу, и/или пектиназу.
22. Композиция по п.21, где целлюлаза является целлобиогидролазой, в частности целлобиогидролазой I или целлобиогидролазой II, эндо-β-1,4-глюканазой, β-глюкозидазой или β-(1,3)(1,4)-глюканазой.
23. Композиция по любому из пп.21, 22, где гемицеллюлаза является экдоксиланазой, βксилозидазой, α-Ь-арабинофуранозидазой, α-Ό-глюкуронидазой, целлобиогидролазой, ферулоилэстеразой, кумароил-эстеразой, α-галактозидазой, β-галактозидазой, β-маннаназой или β-маннозидазой.
24. Композиция по любому из пп.21-23, где пектиназа является эндополигалактуроназой, пектинметилэстеразой, эндогалактаназой, β-галактозидазой, пектин-ацетилэстеразой, эндопектинлиазой, пектатлиазой, α-рамнозидазой, экзогалактуроназой, эксполигалактуронатлиазой, рамногалактуронангидролазой, рамногалактуронан-лиазой, рамногалактуронан-ацетилэстеразой, рамногалактуронангалактурогидролазой, ксилогалактуроназой, α-арабинофуранозидазой и эндоарабиназой.
25. Композиция по любому из пп.21-24, которая дополнительно содержит лигниназу, экспансин, экспансин-подобный полипептид или сволленин.
26. Применение полипептида по п.1 для производства сахара из лигноцеллюлозного материала.
27. Применение композиции по любому из пп.21-25 для производства сахара из лигноцеллюлозного материала.