MX2012014993A - Polipeptido que tiene actividad degradante de carbohidratos y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID N°: 2 o una secuencia de aminoácidos codificada por la. secuencia de nucleótidos de SEC ID N°: 1, o un polipéptido de variante o polinucleótido de variante del mismo, en el que el polipéptido de variante tiene al menos el 70% de identidad de secuencias con la secuencia expuesta en SEC ID N°: 2 o el polinucleótido de variante codifica un polipéptido que tiene al menos el 70% de identidad de secuencias con la secuencia expuesta en SEC ID N°: 2. La invención pone de relieve la secuencia codificante de longitud completa del gen novedoso, además de la secuencia de aminoácidos del polipéptido funcional de longitud completa y equivalentes funcionales del gen o la secuencia de aminoácidos. La invención también se refiere a procedimientos para usar el polipéptido en procedimientos industriales. También se incluyen en la invención células transformadas con un polinucleótido según la invención adecuadas para producir estas proteínas.

Description

POLIPÉPTIDO QUE TIENE ACTIVIDAD DEGRADANTE DE CARBOHIDRATOS Y USOS DEL MISMO DECLARACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO SUBVENCIONADOS POR EL GOBIERNO FEDERAL Esta invención se hizo con el apoyo del gobierno de Estados Unidos en virtud del n° de concesión DE-FC36-08G018079, otorgado por el Departamento de Energía. El gobierno de Estados Unidos puede tener ciertos derechos en esta invención.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a secuencias que comprenden genes que codifican polipéptidos que tienen actividad degradante de material carbohidrato o ayudan a ello. La invención presenta la secuencia codificante de longitud completa del nuevo gen así como la secuencia de aminoácidos de la proteína funcional de longitud completa, y variantes y fragmentos del gen o la secuencia de aminoácidos. La invención también se refiere a métodos para usar estas proteínas en procesos industriales. También se incluyen en la invención células transformadas con un polinucleótido de acuerdo con la invención adecuadas para producir estas proteínas. Además la invención se refiere a la expresión satisf ctoria de los genes que codifican polipéptidos que tienen actividad degradante de material carbohidrato en un hospedador. El hospedador puede ser cualquier hospedador adecuado, por ejemplo, Aspergillus, por ejemplo, Aspergillus niger o Talaromyces, por ejemplo, Talaromyces emersonii.

Antecedentes de la invención Los carbohidratos constituyen los compuestos orgánicos más abundantes en la tierra. Sin embargo, muchos de estos carbohidratos están secuestrados en polímeros complejos incluyendo el almidón (el carbohidrato principal de almacenamiento en semillas y granos) , y un montón de carbohidratos y lignina conocidos como lignocelulosa . Los componentes principales de carbohidrato de la lignocelulosa son celulosa, hemicelulosa, y pectinas. Estos polímeros complejos a menudo se conocen colectivamente como lignocelulosa .

La bioconversion de biomasa lignocelulósica renovable en un azúcar fermentable que posteriormente se fermenta para producir alcohol (por ejemplo, etanol) como alternativa a los combustibles líquidos ha atraído gran cantidad de atención de los investigadores desde la década de 1970, cuando estalló la crisis del petróleo a causa de la disminución del producción de petróleo por la OPEP. El etanol se ha usado ampliamente como una mezcla al 10% con gasolina en los Estados Unidos o como un combustible puro para vehículos en Brasil en las dos últimas décadas. Más recientemente, el uso de E85, una mezcla de etanol al 85% se ha implementado especialmente para aplicaciones de ciudad limpia. La importancia del combustible bioetanol aumentará en paralelo con los aumentos en los precios para el petróleo y el agotamiento gradual de sus fuentes. Además, se están usando azúcares fermentables para producir plásticos, polímeros y otros productos de base biológica y se espera que esta industria crezca sustancialmente aumentado por lo tanto la demanda de azúcares fermentable abundantes de bajo coste que pueden usarse como materia prima en lugar de materia primas basadas en el petróleo.

El secuestro de dichas grandes cantidades de carbohidratos en biomasa vegetal proporciona una fuente abundante de energía potencial en forma de azúcares, tanto azúcares de cinco carbonos como de seis carbonos que podrían utilizarse para numerosos procesos industriales y agrícolas. Sin embargo, el enorme potencial energético de estos carbohidratos está actualmente infra-utilizado porque los azúcares están bloqueados en polímeros complejos, y por tanto no están fácilmente accesibles para fermentación. Métodos que generen azúcares a partir de biomasa vegetal proporcionarían materias primas abundantes, económicamente competitivas para fermentación en agentes químicos, plásticos, tales como, por ejemplo, ácido succínico y (bio) combustibles, incluyendo etanol, metanol, butanol, combustibles líquidos sintéticos y biogás .

Independientemente del tipo de materia prima celulósica, el coste y la eficacia hidrolítica de las enzimas son los factores principales que restringen la comercialización de los procesos de bioconversión de biomasa. Los costes de producción de enzimas producidas microbiológicamente están muy conectados con la productividad de la cepa productora de enzima y el rendimiento de actividad final en el caldo de fermentación.

A pesar de la investigación continuada de las últimas décadas para comprender la degradación enzimática de biomasa lignocelulósica y la producción de celulasa, sigue siendo deseable descubrir o diseñar nuevas celulasas y hemicelulasas altamente activas . También sería muy deseable construir composiciones enzimáticas altamente eficaces, capaces de realizar una biodegradación rápida y eficaz de materiales lignocelulósicos , en particular aquellas celulasas y hemicelulasas que tienen termoestabilidad aumentada.

Dichas enzimas pueden usarse para producir azúcares para la fermentación en agentes químicos, plásticos, tales como por ejemplo ácido succínico y (bio) combustibles, incluyendo etanol, metanol, butanol, combustibles líquidos sintéticos y biogás,. para ensilado, y también como enzima en otros procesos industriales, por ejemplo en las industrias de alimentos o piensos, textil, pulpa o papel o detergentes y otras industrias. ' DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen la capacidad de degradar (es decir ayudar a la degradación de) , un carbohidrato (por ejemplo polisacáridos) , en particular, lignocelulosa . Los polinucleótidos de la invención típicamente codifican un polipéptido que tienen actividad degradante de carbohidratos.

La invención también proporciona polipéptidos producidos de forma natural o recombinante que tienen dicha actividad, así como líneas celulares recombinantes que producen dichas enzimas. Además, se proporcionan métodos para preparar y usar los polinucleótidos y polipéptidos de la invención.

De acuerdo con la invención, se proporciona, por tanto, un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID N° 2 o una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID N° 1, o un polipéptido variante o polinucleótido variante de las mismas, en que el polipéptido variante tiene al menos un 73% de identidad de secuencia con la secuencia expuesta en la SEC ID N1 2 o el polinucleótido variante codifica un polipéptido que tiene al menos un 73% de identidad de secuencia con la secuencia expuesta en la SEC ID N° 2.

Los polipéptidos de acuerdo con la invención tienen propiedades favorables, en particular una actividad degradante de celulosa. En una realización, el polipéptido de acuerdo con la invención tiene actividad degradante de carbohidratos .

Además, los polipéptidos pueden tener elevada termoestabilidad. Los polipéptidos de acuerdo con la invención pueden retener una elevada actividad relativa (% de la actividad inicial) como función del tiempo de incubación (h) , por ejemplo 2 horas, 3 horas, 4 horas, cinco horas, seis horas, ocho horas, nueve horas, 10 h o más, 20 h o más, 30 h o más, en particular a elevadas temperaturas, por ejemplo a 60°C o más a 65°C o más, o a 70° C o más, por ejemplo 8 horas a 65°C o 72 horas a 60°C.

La invención también proporciona un polinucleótido que comprende : (a) la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID N° 1; o (b) una secuencia de nucleótidos que híbrida selectivamente con un polinucleótido que es el complemento inverso de la SEC ID N° 1; o (c) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID N° 1; o (d) un fragmento de una secuencia de nucleótidos definida en (a) , (b) o (c) que es de al menos aproximadamente 100 nucleótidos de longitud; o (e) una secuencia que está degenerada como resultado del código genético para una secuencia definida en uno cualquiera de (a) , (b) , (c) o (d) ; o (f) una secuencia de nucleótidos que es el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos definida en (a) , (b) , (c) , (d) o (e) .

También se proporciona de acuerdo con la invención un vector, tal como un vector de expresión, que incorpora una secuencia polinucleotídica de la invención y una célula que comprende un polipéptido, un polinucleótido o un .vector de la invención .

La invención también proporciona: un método para la preparación de un polipéptido que tiene actividad degradante de carbohidratos, comprendiendo dicho método cultivar una célula de la invención en condiciones que permitan la expresión de dicho polipéptido y, opcionalmente , recuperar el polipéptido expresado; un polipéptido que se puede obtener por dicho método; y una composición que comprende: (i) un polipéptido de la invención y; (ii) una celulasa y/o una hemicelulasa y/o una pectinasa.

Los polipéptidos de la invención que tienen actividad degradante de carbohidratos pueden usarse en procesos industriales. Por tanto, la invención proporciona un método para el tratamiento de un sustrato que comprende material carbohidrato, comprendiendo dicho método poner en contacto el sustrato con un polipéptido o una composición de la invención .

En particular, la invención proporciona un método para producir un azúcar o azúcares a partir de material lignocelulósico, comprendiendo dicho método poner en contacto el material lignocelulósico con un polipéptido o una composición de la invención.

Los azúcares producidos de este modo pueden usarse en un proceso de fermentación. Por consiguiente, la invención proporciona un método para producir un ; producto de fermentación, comprendiendo dicho método: producir un azúcar fermentable usando lo descrito anteriormente; y fermentar el azúcar fermentable resultante, para producir de este modo un producto de fermentación.

Un polipéptido o una composición de la invención también puede usarse, por ejemplo, en la preparación de un producto alimenticio, en la preparación de un detergente, en la preparación de un pienso animal, en el tratamiento de pulpa o en la fabricación de papel o en la preparación de una tela o textil o en la limpieza de los mismos.

La invención también proporciona: un material procesado que se puede obtener poniendo en contacto un material vegetal o material lignocelulósico con un polipéptido o una composición de la invención; un alimento o pienso que comprende un polipéptido o una composición de la invención y una planta o una parte de la misma que comprende un polinucleótido, un polipéptido, un vector o una célula de acuerdo con la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Fig. 1: Mapa de pGBTOP para la expresión de genes en A. niger. Está representado el gen de interés (GOI del inglés "gene of interest") expresado a partir del promotor de la glucoamilasa (PglaA) . Además, está representado el lado glucoamilasa (3'glaA) del cásete de expresión. En esta solicitud, un gen :de interés es la secuencia codificante de TEMER01170 como se define a continuación en este documento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA LISTA DE SECUENCIAS La SEC ID N° 1 presenta la secuencia codificante de TEMER01170; la SEC ID N° 2 presenta la secuencia de aminoácidos de TEMER01170; la SEC ID N° 3 presenta la secuencia señal de TEMER01170.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En toda la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las palabras "comprende" e "incluye" y variaciones tales como "comprenden", "que comprende", "incluyen" y "que incluye" deben interpretarse inclusivamente. Es decir, estas palabras pretenden comunicar la posible inclusión de otros elementos o enteros no específicamente enumerados, donde el contexto lo permita.

Los artículos "un" y "una" se usan en este documento para hacer referencia a uno o a más de uno (es decir a uno o al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" puede indicar un elemento o más de un elemento. : La presente invención proporciona polinucleótidos que codifican polipéptidos , por ejemplo enzimas que tienen la capacidad de modificar, por ejemplo degradar, un material carbohidrato. Un material carbohidrato es un material que comprende, consta de o consta sustancialmente de uno o más carbohidratos. Las enzimas en este documento son una subclase de polipéptidos.

Sustrato (también llamado materia prima) en este documento se usa para hacer referencia a un sustrato que comprende material carbohidrato, que puede tratarse con enzimas de acuerdo con la invención, de modo que se modifique el material carbohidrato en el mismo. Además del material carbohidrato, el sustrato puede contener cualquier otro componente, incluyendo, aunque sin limitación, material no carbohidrato y almidón.

La presente invención proporciona polinucleótidos que codifican polipéptidos , por ejemplo enzimas que tiene la capacidad de modificar, por ejemplo degradar, un material carbohidrato. Un material carbohidrato es un material que comprende, consta de o consta sustancialmente de uno o más carbohidratos. Las enzimas son en este documento una subclase de polipéptidos.

Típicamente, un polipéptido de la invención codifica un polipéptido que tiene al menos actividad degradante de carbohidratos, en principio llamado TEMER01170, que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N° 2, o una secuencia que es una variante de la misma, típicamente equivalente funcionalmente al polipéptido que tiene la secuencia de la SEC ID N° 2, o una secuencia que es un fragmento de cualquiera de las mismas.

En una realización, un polipéptido de la invención puede tener una o más actividades alternativas y/o adicionales diferentes de la actividad degradante de carbohidratos que se ha mencionado anteriormente, por ejemplo una de las otras actividades degradantes de carbohidrato y/.o hidrolizantes de carbohidrato mencionadas en este documento.

Carbohidrato en este contexto incluye todos los sacáridos, por ejemplo polisacáridos , oligosacáridos , disacáridos o monosacáridos .

Un polipéptido de acuerdo con la invención puede modificar y/o degradar un material carbohidrato degradando químicamente o degradando físicamente dicho material o hidrolizando el carbohidrato. Física incluye por ejemplo interrupción de la interacción entre las microfibrillas de celulosa y/o abertura de la estructura de fibras de celulosa. La modificación química del material carbohidrato puede provocar la degradación de dicho material, por ejemplo, por hidrólisis, oxidación u otra modificación química tal como por la acción de una liasa. La modificación física puede estar acompañada o no por modificación química.

Material carbohidrato adecuados Un carbohidrato no almidón adecuado para modificación por un polipéptido de la invención es lignocelulosa . Los polisacáridos principales que comprenden diferentes restos lignocelulósicos , que pueden considerarse como una materia prima renovable potencial, son celulosa (glucanos) , hemicelulosas (xilanos, heteroxilanos y xiloglucanos) . Además, algo de hemicelulosa puede estar presente como glucomananos , por ejemplo en materia primas derivadas de la madera. La hidrólisis enzimática de estos polisacáridos en azúcares solubles, por ejemplo, glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, fructosa, mañosa, ramnosa, ribosa, Ácido D-galacturónico y otras hexosas y pentosas sucede bajo la acción de diferentes enzimas que actúan en concierto.

Además, las pectinas y otras sustancias pécticas tales como arabinanos pueden componer una proporción considerable de a masa seca de típicamente las paredes celulares de tejidos vegetales no leñosos (aproximadamente de una cuarta parte a la mitad de la masa seca puede ser pectinas) .

La celulosa es un polisacárido lineal compuesto por restos de glucosa unidos por enlaces ß-1,4. La naturaleza lineal de las fibras de celulosa, así como la éstequiometría de la glucosa ß-ligada (relativa a a) genera estructuras más propensas a enlaces de hidrógeno entre cadenas que las estructuras a-ligadas altamente ramificadas del almidón. Por tanto, los polímeros de celulosa son generalmente menos solubles, y forman fibras unidas más firmemente que las fibras encontradas en el almidón.

La hemicelulosa es un polímero complejo, y su composición a menudo varía ampliamente de un organismo a otro, y de un tipo de tejido a otro. En general, un componente principal de la hemicelulosa es xilosa ß-1,4-ligada, un azúcar de cinco carbonos. Sin embargo, esta xilosa a menudo está ramificada en 0-3 y/o 0-2 y puede estar sustituida con enlaces a arabinosa, galactosa, mañosa, ácido glucurónico, ácido galacturónico o por esterificación con ácido acético (y esterificación de ácido ferúlico en arabinosa) . La hemicelulosa también puede contener glucano, que es un término general para azúcares de seis carbonos ß-ligados (tal como los glucanos y heteroglucanos ß-(1,3)(1,4) mencionados previamente) y adicionalmente glucomananos (en los que tanto la glucosa como la mañosa están presentes en la estructura lineal, ligados entre sí por enlaces ß) .

La composición, naturaleza de la sustitución, y el grado de ramificación de la hemicelulosa es muy diferentes en plantas dicotiledóneas (dicots, es decir, plantas cuyas semillas tienen dos cotiledones u hojas de semillas tales como frijoles de lima, cacahuetes, almendras, guisantes, judías) en comparación con plantas monocotiledóneas (monocots es decir, plantas que tienen un único cotiledón u hoja de semilla tales como maíz, trigo, arroz, hierbas, cebada). En dicots, la hemicelulosa está compuesta principalmente de xiloglucanos que son cadenas de glucosa 1, 4^-ligadas con cadenas laterales de xilosilo 1,6-ß-ligadas. En raonocots, incluyendo la mayoría de los cultivos de grano, los componentes principales de la hemicelulosa son heteroxilanos . Estos están principalmente compuestos por polímeros estructurales de xilosa l,4- -ligada con enlaces 1,3-a a arabinosa, galactosa, mañosa y ácido glucurónico o ácido -O-metil-glucurónico así como xilosa modificada por ácido acéticos ligados por éster. También están presentes ß glucanos compuestos por cadenas glucosilo 1,3- y 1,4-ß-ligadas. En monocots, pueden estar presentes celulosa, heteroxilanos y ß-glucanos en cantidades casi iguales, comprendiendo cada uno aproximadamente el 15-25% de la materia seca de las paredes celulares. Además, diferentes plantas pueden comprender diferentes cantidades de, y diferentes composiciones de, sustancias pécticas. Por ejemplo, la caña de azúcar contiene aproximadamente un 19% de pectina y aproximadamente un 21% de arabinano en base al peso seco.

Por consiguiente, una composición de la invención puede adaptarse en vista de la materia prima particular (también llamada sustrato) que tiene que usarse. Es decir, el espectro de actividades en una composición de la invención puede variar dependiendo de la materia prima en cuestión.

Las combinaciones de enzimas o tratamientos físicos pueden administrarse de forma concomitante o secuencialmente .

Las enzimas pueden producirse de forma exógena en microorganismos, levaduras, hongos, bacterias o plantes, después aislarse y añadirse a la materia prima lignocelulósica . Como alternativa, las enzimas se producen, pero no se aislan, y el caldo de fermentación de la masa celular en bruto, o el material vegetal (tal como rastrojo de maíz), y similares se añaden a la materia prima. Como alternativa, la masa celular en bruto o el medio de producción enzimático o el material vegetal pueden tratarse para prevenir el crecimiento microbiano adicional (por ejemplo, por calentamiento o adición de agentes antimicrobianos) , después se añade a la materia prima. Estas mezclas enzimáticas en bruto pueden incluir el organismo que produce la enzima. Como alternativa, la enzima puede producirse en una fermentación que use materia prima (tal como rastrojo de maíz) para proporcionar nutrición a un organismo que produce una o más enzimas. De este modo, las plantas que producen enzimas pueden servir como materia prima lignocelulósica y añadirse en la materia prima lignocelulósica.

Actividad enzimática Las endo-1, 4 - -glucanasas (EG) y exo-celobiohidrolasas (CBH) catalizan la hidrólisis de celulosa insoluble en celooligosacáridos (celobiosa como producto principal) , mientras que las ß-glucosidasas (BGL) convierten los oligosacáridos , principalmente celobiosa y celotriosa en glucosa.

Las xilanasas junto con otras enzimas auxiliares, por ejemplo a-L-arabinofuranosidasas , ' feruloil y acetilxilano esterasas, glucuronidasas , y ß-xilosidasas) catalizan la hidrólisis de parte de las hemicelulosas .

Las sustancias pécticas incluyen pectinas, arabinanos, galactanos y arabinogalactanos . Las pectinas son los polisacáridos más complejos en la pared celular vegetal. Están compuestas en torno a una cadena central de unidades de ácido D-galacturónico a ( 1 , )- ligadas intercaladas en algún grado con L-ramnosa. En una pared celular cualquier, hay varias unidades estructurales que ¦ se ajusta a esta descripción y se ha considerado en líneas generales que en una única molécula péctica, las cadenas centrales de diferentes unidades estructurales son continuas con las otras .

Las pectinasas incluyen, por ejemplo, una endo poligalacturonasa, una pectina metil esterasa, una endo-galactanasa, una beta galactosidasa, una pectina acetil esterasa, una endo-pectina liasa, pectato liasa, alfa ramnosidasa, una exo-galacturonasa, una expoligalacturonato liasa, una ramnogalacturonano hidrolasa, una ramnogalacturonano liasa, una ramnogalacturonano acetil esterasa, una ramnogalacturonano galacturonohidrolasa, una xilogalacturonasa, una -arabinofuranosidasa .

Los tipos principales de unidad estructural son: galacturonano (homogalacturonano) , que puede estar sustituido con metanol en el grupo carboxilo y acetato en 0-2 y 0-3; ramnogalacturonano I ( GI) , en que las unidades ácido galacturónico alternan con unidades ramnosa que portan galactano (1,4) -ligado y cadenas laterales de arabinano ( 1 , 5 )- ligado . Las cadenas laterales de arabinano pueden estar unidas directamente a ramnosa o indirectamente a través de las cadenas galactano; xilogalacturonano, con unidades individuales xilosilo en 0-3 de ácido galacturónico (estrechamente asociado con RGI) ; y ramnogalacturonano II (RGII) , una unidad minoritaria particularmente, compleja que contiene azúcares inusuales, por ejemplo apiosa. Una unidad RGII puede contener dos restos apiosilo que, en condiciones iónicas adecuadas, puede formar de forma reversible ésteres con borato.

Como se ha expuesto anteriormente, un polipéptido de la invención típicamente tendrá actividad degradante de carbohidratos. Sin embargo, un polipéptido de la invención puede tener una o más de las actividades expuestas anteriormente además de o como alternativa a esa actividad.

Además, una composición de la invención como se describe en este documento puede tener una o más de las actividades mencionadas anteriormente además de la proporcionada por un polipéptido de la invención que tiene actividad degradante de carbohidratos .

Secuencia polinucleotídica La invención proporciona secuencias polinucleotídicas genómicas que comprenden el gen que codifica TEMER01170 así como su secuencia codificante. Por consiguiente, la invención se refiere a un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de nucleótidos genómica de acuerdo con la secuencia de nucleótidos codificante de acuerdo con la SEC ID N° 1 y a variantes, tales como equivalentes funcionales, de cualquiera de las mismas.

En particular, la invención se refiere a un polinucleótido aislado que es capaz de hibridar selectivamente, por ejemplo en condiciones rigurosas, preferiblemente en condiciones altamente rigurosas, con el complemento inverso de un polinucleótido que comprende la secuencia expuesta en la SEC ID N" 1.

Más específicamente, la invención se refiere a un polinucleótido que comprende o que consta esencialmente de una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEC ID N° 1.

La invención también se refiere a un polinucleótido aislado que comprende o que consta esencialmente de una se'cuencia que codifica al menos un dominio funcional de un polipéptido de acuerdo con la SEC ID N° 2 o una variante del mismo, tal como un equivalente funcional, o un fragmento de cualquiera de las mismas .

Como se usa en este documento, las expresiones "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácido nucleico que pueden aislarse de ADN cromosómico, que incluyen una fase de lectura abierta que codifica una proteína, por ejemplo la proteína degradante de carbohidratos de acuerdo con la presente invención.

Un gen puede incluir secuencias codificantes, secuencias no codificantes, intrones y/o secuencias reguladoras. Además, el término "gen" puede hacer referencia a una molécula de ácido nucleico aislada como se define en este documento.

Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, tal como una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID N° l o una variante de la misma, tal como un equivalente funcional, puede aislarse usando técnicas convencionales de biología molecular y la información de secuencia proporcionada en este documento. Por ejemplo, usando todo o una parte de la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID N° 1 como sonda de hibridación, pueden aislarse moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención usando técnicas convencionales de hibridación y clonación (por ejemplo, como se describe en Sambrook, J., Fritsh, E. F. , y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a, ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) .

Además, una molécula de ácido nucleico que abarca todo o una parte de la SEC ID N° 1 puede aislarse por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores oligonucleotídicos sintéticos diseñados en base a la información de secuencia contenida en la SEC ID N° 1.

Un ácido nucleico de la invención puede amplificarse usando ADNc, ARNm o como alternativa, ADN genómico, como molde y cebadores oligonucleotídicos apropiados de acuerdo con las técnicas convencionales de amplificación por PCR. El ácido nucleico amplificado de este modo puede clonarse en un vector apropiado y caracterizarse por análisis' de secuencia de ADN.

Además, pueden prepararse oligonucleótidos correspondientes a o que pueden hibridar con una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención por técnicas sintéticos convencionales, por ejemplo, usando un sintetizador automático de ADN.

En una realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende la ' secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID N° 1.

En otra realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una molécula de ácido nucleico que es el complemento inverso de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID N° l o una variante, tal como un equivalente funcional, de cualquiera de dichas secuencias de nucleótidos.

Una molécula de ácido nucleico que es complementaria a otra secuencia de nucleótidos es una que es suficientemente complementaria a la otra secuencia de nucleótidos de modo que pueda hibridar con la otra secuencia de nucleótidos formando de este modo un dúplex estable.

Un aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un polipéptido de la invención o una variante, tal como un equivalente funcional del mismo, por ejemplo un fragmento o dominio biológicamente activo, así como moléculas de ácido nucleico suficientes para su uso como sondas de hibridación para identificar moléculas de ácido . nucleico que codifican un polipéptido de la invención y fragmentos de dichas moléculas de ácido nucleico adecuados para su uso como cebadores de PCR para la amplificación o mutación de moléculas de ácido nucleico.

Un polinucleótido de acuerdo con la invención puede estar "aislado" . En el contexto de esta invención, un "polinucleótido aislado" o "ácido nucleico aislado" es un ADN o ARN que no está inmediatamente contiguo a una o ambas secuencias codificantes con las que está inmediatamente contiguo (una en el extremo 5' y una en el extremo 3') en el genoma de origen natural del organismo del que deriva. Por tanto, en una realización, un ácido nucleico aislado incluye alguna o todas las secuencias no codificantes 5' (por ejemplo, promotor) que están inmediatamente contiguas a la secuencia codificante. El término por lo tanto incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en un vector, en un plásmido o virus de replicación autónoma, o en el ADN genómico de un procariota o eucariota, o que existe como molécula separada (por ejemplo, un ADNc o un fragmento de ADN genómico producido por PCR o tratamiento con endonucleasa de restricción) independiente de otras secuencias. También incluye un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica un polipéptido adicional que está sustancialmente libre de material celular, material viral, o medio de cultivo (cuando se produce por técnicas de ADN recombinante) , o precursores químicos u otros agentes químicos (cuando se sintetiza químicamente) . Además, un "fragmento de ácido nucleico aislado" es un fragmento de ácido nucleico que no existe de forma natural como fragmento y no se encontraría en el estado natural.

Como se usa en este documento, las expresiones "polinucleótido" o "molécula de ácido nucleico" pretenden incluir moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos del ADN o ARN generados usando análogos nucleotídicos . La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es ADN bicatenario. El ácido nucleico puede sintetizarse usando análogos o derivados oligonucleotídicos (por ejemplo, inosina o nucleótidos fosforotioato) . Dichos oligonucleótidos pueden usarse, por ejemplo, para preparar ácidos nucleicos que tienen capacidades alteradas de apareamiento de bases o resistencia aumentada a nucleasas.

Otra realización de la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que es antisentido a una molécula de ácido nucleico TE ER01170, por ejemplo, la cadena codificante de una molécula de ácido nucleico TEMER01170. También se incluyen dentro del alcance de la invención las cadenas complementarias de las moléculas de ácido nucleico descritas en este documento.

Salvo que se indique otra cosa, todas las secuencias de nucleótidos determinadas por secuenciación de una molécula de ADN de este documento se determinaron usando una secuenciador automático de ADN y todas las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos codificados por moléculas de ADN determinadas en este documento se predijeron por traducción de una secuencia de ADN determinada como anteriormente. Por lo tanto, como se sabe en la técnica para cualquier secuencia de ADN determinada por este enfoque automático, cualquier secuencia de nucleótidos determinada en este documento puede contener algunos errores. Las secuencias de nucleótidos determinadas por automatización son típicamente al menos aproximadamente un 90% idénticas, más típicamente de al menos aproximadamente un 95% a al menos aproximadamente un 99,9% idénticas a la secuencia de nucleótidos real de la molécula de ADN secuenciada.

La secuencia real puede determinarse de forma más precisa por otros enfoques incluyendo métodos de secuenciación manual de ADN bien conocidos en la técnica. Como también se sabe en la técnica, una única inserción o deleción en una secuencia de nucleótidos determinada en comparación con la secuencia real causará un desplazamiento de fase en la traducción de la secuencia de nucleótidos de modo que la secuencia de aminoácidos predicha codificada por una secuencia de nucleótidos determinada será completamente diferente de la secuencia de aminoácidos realmente codificada por la molécula de ADN secuenciada, comenzando en el punto de dicha inserción o deleción.

Los especialistas en la técnica son ' capaces de identificar dichas bases identificadas erróneamente y sabe cómo corregir dichos errores .

Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención puede comprender solamente una parte o un fragmento de la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEC ID N° 1 (o de una variante de cualquiera de las mismas) , por ejemplo un fragmento que puede usarse como sonda o cebador o un fragmento que codifica una parte de un polipéptido TEMER01170.

La secuencia de nucleótidos determinada a partir de la clonación del gen y el ADNc de TEME 01170 permite la generación de sondas y cebadores diseñados para su uso en la identificación y/o clonación de otros miembros de la familia TEMER01170 , así como homólogos de TEMER01170 de otras especies.

La sonda/cebador típicamente comprende un oligonucleótido sustancialmente purificado que típicamente comprende una región de la secuencia de nucleótidos que híbrida preferiblemente en condiciones altamente rigurosas con al menos de aproximadamente 12 a aproximadamente 15, preferiblemente de aproximadamente 18 a aproximadamente 20, preferiblemente de aproximadamente 22 a aproximadamente 25, más preferiblemente aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, o aproximadamente 75 o más nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID N" l o de una variante, tal como un equivalente funcional, de cualquiera de las mismas.

Pueden usarse sondas basadas las secuencias de nucleótidos de TEMER01170 para detectar transcritos o secuencias genómicas de TEMER01170 que codifican los mismos polipéptidos u homólogos, por ejemplo en otros organismos. En realizaciones preferidas, la sonda comprende además un grupo marcador unido a la misma, por ejemplo, el grupo marcador puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor enzimático. Dichas sondas también pueden usarse como parte de un kit de ensayo de diagnóstico para identificar células que expresan un polipéptido TEMER01170.

Los polinucleótidos de este documento pueden ser polinucleótidos sintéticos. Los polinucleótidos sintéticos pueden optimizarse en el uso de codones, preferiblemente de acuerdo con los métodos descritos en el documento WO2006/077258 y/o PCT/EP2007/055943 , que se incorporan en este documento por referencia. El documento PCT/EP2007/055943 aborda la optimización de pares de codones. La optimización de pares de codones es un método en que las secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido se han modificado con respecto a su uso de codones, en particular los pares de codones que se usan, para obtener expresión mejorada de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido y/o producción mejorada del polipéptido codificado. Los pares de codones se definen como una serie de dos tripletes (codones) posteriores en una secuencia codificante.

La invención se refiere además a una construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido descrito anteriormente. "Construcción de ácido nucleico" se define en este documento como una molécula de ácido nucleico, mono o bicatenaria, que se aisla de un gen de origen natural o que se ha modificado para que contenga segmentos de ácido nucleico que se combinan y yuxtaponen de un modo que no existiría de otro modo en la naturaleza. La expresión construcción de ácido nucleico es sinónima de la expresión "cásete de expresión" cuando la construcción de ácido nucleico contiene todas las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante. La expresión "secuencia codificante" como se define en este documento es una secuencia, que se transcribe en AR m y se traduce en un activador transcripcional de un promotor de proteasa de la invención. Los límites de la secuencia codificante se determina generalmente por un codón de inicio ATG en el extremo 51 del ARNm y un codón de parada de la transcripción de la secuencia que termina la fase de lectura abierta en el extremo 3' del ARNm. Una secuencia codificante puede incluir, aunque sin limitación, ADN, ADNc, y secuencias de ácido nucleico recombinantes . Preferiblemente, el ácido nucleico tiene elevado contenido de GC. El contenido de GC en este documento indica la cantidad de nucleótidos G y C en la construcción, dividida por la cantidad total de nucleótidos, expresada en % . El contenido de GC es preferiblemente del 56% o más, del 57% o más, del 58% o más, del 59% o más, del 60% o más, o en el intervalo del 56-70% o el intervalo del 58-65%.

Preferiblemente, la construcción de ADN comprende una secuencia promotora de ADN, una secuencia codificante en asociación funcional con dicha secuencia promotora de ADN y secuencias de control tales como: -una secuencia de terminación de la traducción orientada en dirección 5' hacia 3' seleccionad entre la siguiente lista de secuencias: TAAG, TAGA y TAAA, preferiblemente TAAA, y/o -una secuencia codificante de inicio de la traducción orientada en dirección 5' hacia 3' seleccionada entre la siguiente lista de secuencias: GCTACCCCC; GCTACCTCC; GCTACCCTC; GCTACCTTC; GCTCCCCCC; GCTCCCTCC; GCTCCCCTC; GCTCCCTTC; GCTGCCCCC; GCTGCCTCC; GCTGCCCTC; GCTGCCTTC; GCTTCCCCC; GCTTCCTCC; GCTTCCCTC; y GCTTCCTTC, preferiblemente 3 O GCT TCC TTC, y/o -una secuencia de inicio de la traducción seleccionada entre la siguiente lista de secuencias: 5 ' -mwChkyCAAA-3 ' ; 5'-mwChkyCACA- 3 ' o 5 ' -mwChkyCAAG-3 ' , usando códigos de ambigüedad para los nucleótidos: m (A/C) ; w (A/T) ; y (C/T) ; k (G/T) ; h (A/C/T) , preferiblemente 5 ' -CACCGTCAAA-3 ' o 5'-CGCAGTCAAG-3 ' .

En el contexto de esta invención, la expresión "secuencia codificante de inicio de la traducción" se define como los nueve nucleótidos inmediatamente cadena abajo del iniciador o codón de inicio de la fase de lectura abierta de una secuencia codificante de ADN. El iniciador o codón de inicio codifica el AA metionina. El codón iniciador es típicamente ATG, pero también puede ser cualquier codón de inicio funcional tal como GTG.

En el contexto de esta invención, la expresión "secuencia de terminación de la traducción" se define como los cuatro nucleótidos partiendo del codón de terminación de la traducción en el extremo 3' de la fase de lectura abierta o secuencia codificante de nucleótidos y orientada en dirección 5' hacia 3'.

En el contexto de esta invención, la expresión "secuencia de inicio de la traducción" se define como los diez nucleótidos inmediatamente cadena arriba del iniciador o codón de inicio de la fase de lectura abierta de una secuencia de ADN que codifica un polipéptido. El iniciador o codón de inicio codifica el AA metionina. El codón iniciador es típicamente ATG, pero también puede ser cualquier codón de inicio funcional tal como GTG. Es bien sabido en la técnica que el uracilo, U, remplaza el desoxinucleótido timina, T, en el ARN.

Homología e identidad Se dice que las secuencias de aminoácidos o nucleótidos son homologas cuando muestra un cierto nivel de similitud. Dos secuencias que son homologas indican un origen evolutivo común. Que dos secuencias homologas estén estrechamente relacionadas o más distantemente relacionadas se indica por el "porcentaje de identidad" o "porcentaje de similitud", que es alto o bajo respectivamente. Aunque de forma controvertida, para indicar "porcentaje de identidad" o "porcentaje de similitud", se usan frecuentemente de forma intercambiable "nivel de homología" o "porcentaje de homología" .

Las expresiones "homología", "porcentaje de homología", "porcentaje de identidad" o "porcentaje de similitud" se usan de forma intercambiable en este documento. Para los propósitos de esta invención, aquí se define que para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácido nucleico, se alinean las secuencias completas para propósitos de comparación óptima. Para optimizar la alineación entre las dos secuencias, pueden introducirse huecos en cualquiera de las dos secuencias que se comparan. Dicha alineación se realiza sobre la longitud completa de las secuencias que se están comparando. Como alternativa, la alineación puede realizarse sobre una longitud más corta, por ejemplo sobre aproximadamente 20, aproximadamente 50, aproximadamente 100 o más ácidos nucleicos/bases o aminoácidos. La identidad es el porcentaje de apareamientos idénticos entre las dos secuencias sobre la región alineada presentada.

Una comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias pueden realizarse usando un algoritmo matemático. Los especialistas en la técnica serán conscientes del hecho de que están disponibles varios programas informáticos diferentes para alinear dos secuencias y determinar la homología entre dos secuencias (Kruskal, J. B. (1983) An overview of sequence comparison In D. Sankoff and J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules : the theory and practice of sequence comparison, pág. 1-44 Addison esley) . El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse usando el algoritmo de Needleman y Wunsch para la alineación de dos secuencias. (Needleman, s. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453) . El algoritmo alinea secuencias de aminoácidos así como secuencias de nucleótidos. El algoritmo de Needleman-Wunsch se ha implementado en el programa informático NEEDLE . Para los propósitos de esta invención se usó el programa NEEDLE del paquete EMBOSS (versión 2.8.0 o superior, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, P. Longden, I. and Bleasby, A. Trends in Genetics 16, (6) pág. 276-277, htt : //emboss . bioinformatics . ni/ ) . Para secuencias polipeptídicas , se usa BLOSUM62 para la matriz de sustitución. Para secuencias de nucleótidos, se usa EADNFULL. Pueden especificarse otras matrices. Los parámetros opcionales usados para la alineación de secuencias de aminoácidos son una penalización por abertura de hueco de 10 y una penalización por extensión de hueco de 0,5. Los especialistas en la técnica apreciarán que . todos estos parámetros diferentes producirán resultados ligeramente diferentes pero que el porcentaje de identidad global de dos secuencias no se altera significativamente cuando se usan diferentes algoritmos.

Definición de homología global La homología o identidad es el porcentaje de apareamientos idénticos entre las dos secuencias completas sobre la región alineada total incluyendo cualquier hueco o extensión. La homología o identidad entre las dos secuencias alineadas se calcula del siguiente modo: Cantidad de posiciones correspondientes en la alineación que muestran un aminoácido idéntico en ambas secuencias dividida por la longitud total de la alineación incluyendo los huecos. La identidad definida como en este documento puede obtenerse de NEEDLE y se marca en la salida del programa como "IDENTIDAD" . Definición de identidad más larga La homología o identidad entre las dos secuencias alineadas se calcula del siguiente modo: Cantidad de posiciones correspondientes en la alineación que muestran un aminoácido idéntico en ambas secuencias dividida por la longitud total de la alineación después de restar la cantidad total de huecos en la alineación. La identidad definida como en este documento puede obtenerse de NEEDLE usando la opción NOBRIEF y se marca en la salida del programa cómo "identidad más larga" . Para los propósitos de la invención, el nivel de identidad (homología) entre dos secuencias (aminoácido o nucleótido) se calcula de acuerdo con la definición de "identidad más largad" que puede realizarse usando el programa NEEDLE.

Las secuencias polipeptídicas de la presente invención pueden usarse adicionalmente como "secuencia consulta" para realizar una búsqueda frente a bases de datos de secuencias, por ejemplo para identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Dichas búsquedas pueden realizarse usando los programas BLAST. El software para realizar análisis BLAST está disponible al público a través del National Center for Biotechnology Information (http: //www.ncbi .nlm.nih.gov) . BLASTP se usa para secuencias de aminoácidos y BLASTN para secuencias de nucleótidos. El programa BLAST uses como defecto: -Coste por abertura de hueco: defecto = 5 para nucleótidos/ 11 para polipéptidos -Coste por extensión de hueco: defecto = 2 para nucleótidos/ 1 para polipéptidos -Penalizacion por desapareamiento de nucleótido: defecto = -3 -Recompensa por apareamiento de nucleótido: defecto = 1 -Valor esperado: defecto = 10 -Tamaño de palabra: defecto = 11 para nucleótidos/28 para megablast/3 para polipéptidos Además del grado de identidad local (homología) entre la secuencia de aminoácidos consulta o la secuencia de ácido nucleico consulta y las secuencias homologas recuperadas se determina por el programa BLAST. Sin embargo, se comparan solamente los segmentos de secuencia que dan un apareamiento por encima de un cierto umbral. Por consiguiente, el programa calcula la identidad solamente para estos segmentos de apareamiento. Por lo tanto, la identidad calculada de este modo se menciona como identidad local.

Hibridación Como se usa en este documento, la expresión "que híbrida selectivamente", "híbrida selectivamente" y términos similar pretenden describir condiciones para la hibridación y lavado en las que las · secuencias de nucleótidos al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 55%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 65%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 80%, más preferiblemente al menos aproximadamente un 85%, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente un 90%, preferiblemente al menos un 95%, más preferiblemente al menos aproximadamente un 98% o más preferiblemente al menos aproximadamente un 99% homologas entre sí típicamente permanecen hibridadas entre sí. Es decir, dichas secuencias de hibridación pueden compartir al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 55%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 65%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 80%, más preferiblemente al menos aproximadamente un 85%, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente un 90%, más preferiblemente al menos un 95%, más preferiblemente al menos un 98% o más preferiblemente al menos aproximadamente un 99% de identidad de secuencia.

Un ejemplo no limitante preferido de dichas condiciones de hibridación es hibridación en cloruro sódico/citrato sódico (SSC) 6X a aproximadamente 45 °C, seguido de uno o más lavados en SSC IX, SDS al 0,1% a aproximadamente 50°C, preferiblemente a aproximadamente 55 °C, preferiblemente a aproximadamente 60 °C e incluso más preferiblemente a aproximadamente 65 °C.

Las condiciones altamente rigurosas incluyen, por ejemplo, hibridación a aproximadamente 68 °C en SSC 5x/solución de Denhardt 5x/SDS al 1,0% y lavado en SSC 0,2x/SDS al 0,1% a temperatura ambiente. Como alternativa, el lavado puede realizarse a 42°C.

Los especialistas en la técnica sabrán qué condiciones aplicar para condiciones de hibridación rigurosas y altamente rigurosas. Está fácilmente disponible en la técnica una guía adicional sobre dichas condiciones, por ejemplo, en Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; y Ausubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N. Y. ) .

Por supuesto, un polinucleótido que híbrida solamente con una secuencia poli A (tal como la extensión poli (A) 3' terminal de ARNm) , o con un tramo complementario de resto de T (o U) , no se incluiría en un polinucleótido de la invención usado para hibridar específicamente con una parte de un ácido nucleico de la invención, ya que dicho polinucleótido hibridaría con cualquier molécula de ácido nucleico que contuviera un tramo poli (A) o el complemento del mismo (por ejemplo, prácticamente cualquier clon de ADNc bicatenario) .

En un enfoque típico, pueden explorarse bibliotecas de ADNc construidas a partir de otros organismos, por ejemplo un hongo filamentoso, en particular a partir de la familia de microorganismos Trichomaceae, por ejemplo del género Penicillium tal como Penicillium decumbens .

Por ejemplo, pueden explorarse cepas de Penicillium para polinucleótidos TEMER01170 homólogos por análisis de transferencia de Northern. Tras la detección de los transcritos homólogos a los polinucleótidos de acuerdo con la invención, pueden construirse bibliotecas de ADNc a partir del ARN aislado de la cepa apropiada, utilizando técnicas convencionales bien conocidas para los especialistas en la técnica. Como alternativa, puede explorarse una biblioteca de ADN genómico total usando una sonda capaz de hibridar con un polinucleótido TEMER01170 de acuerdo con la invención.

Pueden aislarse secuencias génicas homologas, por ejemplo, realizando PCR usando dos combinaciones de cebadores oligonucleotídicos degenerados diseñados en base a las secuencias de nucleótidos mostradas en este documento.

El molde para la reacción puede ser ADNc obtenido por transcripción inversa de ARNm preparado a partir de cepas que se sabe o se sospecha que expresan un polinucleótido de acuerdo con la invención. El producto de PCR puede subclonarse y secuenciarse para asegurar que las secuencias amplificadas representan secuencias de una nueva secuencia de ácido nucleico de TEMER01170, o un equivalente funcional de la misma.

El fragmento de PCR entonces puede usarse para aislar el clon de ADNc de longitud completa por una diversidad de métodos conocidos. Por ejemplo, el fragmento amplificado puede marcarse y usarse para explorar una biblioteca de ADNc de bacteriófagos o cósmidos. Como alternativa, el fragmento marcado puede usarse para explorar una biblioteca genómica.

También puede usarse tecnología de PCR para aislar secuencias de ADNc de longitud completa a partir de otros organismos. Por ejemplo, puede aislarse ARN, siguiendo procedimientos convencionales, a partir de una fuente celular o tisular apropiada. Puede realizarse una reacción de transcripción inversa sobre el ARN usando un cebador oligonucleotídico específico para el extremo más 5' del fragmento amplificado para el cebador de la síntesis de la primera hebra.

El híbrido ARN/ADN resultante entonces puede "añadírsele una cola" (por ejemplo, con guaninas) usando una reacción convencional de transferasa terminal, el híbrido puede digerirse con RNasa H, y después puede cebarse una síntesis de segunda hebra (por ejemplo, con un cebador poli-C) . Por tanto, pueden aislarse fácilmente las secuencias de ADNc cadena arriba del fragmento amplificado. Para una revisión de las estrategias útiles de clonación, véase, por ejemplo, Sambrook. et al., supra; y Ausubel et al., supra.

Vectores Otro aspecto de la invención se refiere a vectores, incluyendo vectores de clonación y de expresión, que comprenden un polinucleótido de la invención que codifica un polipéptido TEMER01170 o un equivalente funcional del mismos y métodos para cultivar, transformar o transfectar dichos vectores en una célula hospedadora adecuada, por ejemplo en condiciones en que sucede la expresión de un polipéptido de la invención. Como se usa en este documento, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha ligado.

Los polinucleótidos de la invención pueden incorporarse en un vector replicable recombinante, por ejemplo un vector de clonación o de expresión. El vector puede usarse para replicar el ácido nucleico en una célula hospedadora compatible. Por tanto, en una realización adicional, la invención proporciona un método para preparar polinucleótidos de la invención introduciendo un polinucleótido de la invención en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula hospedadora compatible, y cultivando la célula hospedadora en condiciones que provocan la replicación del vector. El vector puede recuperarse de la célula hospedadora. A continuación se describen células hospedadoras adecuadas .

El vector en que se inserta el cásete de expresión o polinucleótido de la invención puede ser cualquier vector que pueda someterse convenientemente a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector a menudo dependerá de la célula hospedadora en que tiene que introducirse.

Un . vector de acuerdo con la invención puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como entidad extra-cromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido. Como alternativa, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra en el genoma de la célula hospedadora y se replica junto con cromosoma o cromosomas en que se ha integrado.

Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales . Otro tipo de vector es un vector viral, en que pueden ligarse segmentos adicionales de ADN en el genoma viral. Ciertos vectores tienen capacidad de replicación autónoma en una célula hospedadora en que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores episómicos de mamífero) . Otros vectores (por ejemplo, vectores no episódicos de mamífero) se integran en el genoma de una célula hospedadora tras su introducción en la célula hospedadora, y de este modo se replican junto con el genoma del hospedador. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los que están unidos de forma funcional. Dichos vectores se mencionan en este documento como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante a menudo están en forma de plásmidos . Las expresiones "plásmido" y "vector" pueden usarse de forma intercambiable en este documento ya que el plásmido es la forma más habitualmente usada de vector. Sin embargo, la invención pretende incluir dichas otras formas de vectores de expresión, tales como cósmidos, vectores virales (por ejemplo, retrovirus, adenovirus y virus adeno-asociados de replicación defectuosa) y vectores fágicos que tienen funciones equivalentes.

Para la mayoría de los hongos filamentosos y levaduras, el vector o la construcción de expresión preferiblemente se integra en el genoma de la célula hospedadora para obtener transformantes estables. Sin embargo, para ciertas levaduras también están disponibles vectores episódicos adecuados en que puede incorporarse la construcción de expresión para una expresión estable y de alto nivel, ejemplos de los mismos incluyen vectores derivados de los plásmidos 2µ y pKDl de Saccharomyces y Kluyveromyces , respectivamente, o vectores que contienen una secuencia AMA (por ejemplo, AMA1 de Aspergillus) . En caso de que las construcciones de expresión se integren en el genoma de las células hosp.edadoras , las construcciones se integran en loci aleatorios en el genoma, o en loci diana predeterminados usando recombinación homologa, en cuyo caso los loci diana preferiblemente comprenden un gen altamente expresado.

Por consiguiente, los vectores de expresión útiles en la presente invención incluyen vectores derivados de cromosomas, episomas y virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, bacteriófagos, episomas 'de levaduras, elementos cromosómicos de levaduras, virus tales como baculovirus, papovavirus, virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de la pseudorrabia y retrovirus, y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como los derivados de elementos genéticos plasmídicos y de bacteriófagos, tales como cósmidos y fagómidos.

Los vectores de acuerdo con la invención pueden usarse in vitro, por ejemplo para la producción de ARN o pueden usarse para transfectar o transformar una célula hospedadora. El vector de expresión recombinante puede transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo usando secuencias reguladoras del promotor T7 y la polimerasa T7.

Un vector de la invención puede comprender dos o más, por ejemplo tres, cuatro o cinco, polinucleótidos de la invención, por ejemplo para sobre-exprésión .

Los vectores de expresión recombinantes de, la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora, que significa que el vector de expresión recombinante incluye una o más secuencias reguladoras, seleccionadas en base a las células hospedadoras a usar para la expresión, que están unidas de forma funcional a la secuencia de ácido nucleico a expresar.

En un vector, tal como un vector de expresión, "unido de forma funcional" pretende indicar que la ¡secuencia de nucleótidos de interés está unida a la secuencia o secuencias reguladoras de un modo que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula hospedadora cuando el vector se introduce en la célula hospedadora) , es decir la expresión "unido de forma funcional" se refiere a una yuxtaposición en que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de su modo pretendido. Una secuencia reguladora tal como un promotor, potenciador u otra señal de regulación de la expresión "unida de forma funcional" a una secuencia codificante se coloca de tal modo que se consigue la expresión de la secuencia codificante en condiciones compatibles con las secuencias de control o las secuencias se disponen de modo que funcionen en concierto para su propósito pretendido, por ejemplo inicia la transcripción en un promotor y procede a través de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido.

Un vector o construcción de expresión para una célula hospedadora dada puede por tanto comprender los siguientes elementos unidos de forma funcional entre sí en un orden consecutivo del extremo 51 al extremo 31 con relación a la hebra codificante de la secuencia que codifica el polipéptido de la primera invención: (1) una secuencia promotora capaz de dirigir la transcripción de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido en la célula hospedadora dada; (2) opcionalmente , una secuencia señal capaz de dirigir la secreción del polipéptido desde la célula hospedadora dada en un medio de cultivo; (3) una secuencia de ADN de la invención que codifica una forma madura y preferiblemente activa de un polipéptido que tiene actividad degradante de carbohidratos; y preferiblemente también (4) una región de terminación de la transcripción (terminador) capaz de terminar la transcripción cadena abajo de la secuencia de nucleotidos que codifica el polipéptido.

Cadena abajo de la secuencia de nucleotidos de acuerdo con la invención puede haber una región no traducida 31 que contiene uno o más sitios de terminación de la transcripción (por e emplo, un terminador) . El origen del terminador es menos crítico. El terminador puede ser, por ej.emplo, nativa para la secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Sin embargo, preferiblemente se usa un terminador de levaduras en células hospedadoras de levadura y se usa un terminador de hongos filamentosos en célula hospedadoras de hongos filamentosos. Más preferiblemente, el terminador es endógeno para la célula hospedadora (en que tiene que expresarse la secuencia de nucleotidos que codifica el polipéptido) . En la región transcrita, puede estar presente un sitio de unión del ribosoma para la traducción. La parte codificante de los transcritos maduros expresados por las construcciones incluirán un AUG de inicio de la traducción al comienzo y un codón de terminación posicionado apropiadamente el final del polipéptido a traducir.

La expresión potenciada del polinucleótido de la invención también puede conseguirse por la selección de regiones reguladoras heterólogas, por ejemplo, promotor, líder de secreción y/o regiones terminadoras , que pueden servir para aumentar la expresión y, si se desea, los niveles de secreción del polipéptido de interés a partir del hospedador de expresión y/o para proporcionar el control inducible de la expresión de un polipéptido de la invención.

Los especialistas en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora a transformar, el nivel de expresión del polipéptido deseado, etc. Los vectores, tales como vectores de expresión, de la invención pueden introducirse en células hospedadoras para producir de este modo proteínas o péptidos, codificados por los ácidos nucleicos descritos en este documento (por ejemplo, polipéptidos TEMER01170, formas mutantes de polipéptidos TEMER01170, fragmentos, variantes o equivalentes funcionales de los mismos. Los vectores, tales como vectores de expresión recombinante, de la invención pueden diseñarse para la expresión de polipéptidos TEMER01170 en células procariotas o eucariotas .

Por ejemplo, los polipéptidos TEMER01170 pueden expresarse en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto (usando vectores de expresión de baculovirus) , hongos filamentosos, células de levadura o células de mamífero. Las células hospedadoras adecuadas se analizan adicionalmente en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) . Se describen a continuación en este documento ejemplos representativos de hospedadores apropiados.

Se conocen en la técnica medios y condiciones de cultivos apropiados para las células hospedadoras descritas anteriormente .

La expresión "secuencias de control" o "secuencias reguladoras" se define en este documento para incluir al menos cualquier componente que pueda ser necesario y/o ventajoso para la expresión de un polipéptido. Cualquier secuencia de control puede ser be nativa o foránea a la secuencia de ácido nucleico de la invención que codifica un polipéptido. Dichas secuencias de control pueden incluir, aunque sin limitación, un promotor, un líder, secuencias óptimas de inicio de la traducción (como se describe en Kozak, 1991, J. Biol . Chenv. 266:19867-19870), una secuencia señal de secreción, una secuencia de pro-péptido, una secuencia de poliadenilación, un terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control típicamente incluyen un promotor, y señales de terminación de la transcripción y la traducción. Como se ha expuesto anteriormente, la expresión "unido de forma funcional" se define en este documento como una configuración en que una secuencia de control se coloca apropiadamente en una posición relativa a la secuencia codificante de la secuencia de ADN de modo que la secuencia de control dirige la producción de un polipéptido .

Las secuencias de control pueden proporcionarse con enlazadores para el propósito de introducir sitios de restricción específicos que faciliten el ligamiento de las secuencias de control con la región codificante de la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido. La expresión "unido de forma funcional" se define en este documento como una configuración en que una secuencia de control se coloca apropiadamente en una posición relativa a la secuencia codificante de la secuencia de ADN de modo que la secuencia de control dirige la producción de un polipéptido .

La secuencia de control puede ser una secuencia promotora apropiada, una secuencia de ácido nucleico, que se reconoce por una célula hospedadora para la expresión de la secuencia de ácido nucleico. La secuencia promotora contiene secuencias de control de la transcripción, que median la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico, que muestre actividad transcripcional en la célula incluyendo promotores mutantes, truncados, e híbridos, y pueda obtenerse be de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares homólogos o heterólogos para la célula.

La secuencia de control también puede ser una secuencia terminadora de la transcripción adecuada, una secuencia reconocida por una célula de hongo filamentoso para terminar la transcripción. La secuencia terminadora está unida de forma funcional al extremo 3 ' de la secuencia de ácido nucleico que codifica él polipéptido. Cualquier terminador, que sea funcional en la célula, puede usarse en la presente invención. [ La secuencia de control también puede ser un terminador. Los terminadores preferidos para células de hongos filamentosos se obtienen de los genes que codifican la TAKA amilasa de A. oryzae, la glucoamilasa de A. niger (glaA) , la antranilato sintasa de A. nidulans, la alfa-glucosidasa de A. niger, el gen trpC y la proteasa tipo tripsina de Fusarium oxisporum.

La secuencia de control también puede ser una secuencia líder adecuada, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula de hongo filamentoso. La secuencia líder está unida de forma funcional al extremo 5' de la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido. Puede usarse cualquier secuencia líder, que sea funcional en la célula, en la presente invención. Los líderes preferidos para células de hongos filamentosos se obtienen de los genes que codifican la TAKA amilasa de A. oryzae y la triosa fosfato isomerasa de A. nidulans y la gla_A de A. niger .

Otras secuencias de control pueden aislarse del gen IPNS de Penicillium, o el gen pcbC, el gen de la beta tubulina. Todas las secuencias de control citadas en el documento O 01/21779 se incorporan adjuntas por referencia.

La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliade'nilación, una secuencia que está unida de forma funcional al extremo 31 de la secuencia de ácido nucleico y que, cuando se transcribe, se reconoce por la célula de hongo filamentoso como una señal para añadir restos de poliadenosina al ARNm transcrito. Puede usarse cualquier secuencia de poliadenilación, que sea funcional en la célula, en la presente invención. Las secuencias preferidas de poliadenilación para células de hongos filamentosos se obtienen de los genes que codifican la TAKA amilasa de A. oryzae, la glucoamilasa de A. niger, la antranilato sintasa de A. nidulans, la proteasa tipo tripsina de Fusarium oxisporum y la alfa-glucosidasa de A. niger.

Cuando el polipéptido de acuerdo con la invención tiene que secretarse desde la célula hospedadora en el medio de cultivo, puede añadirse una secuencia señal apropiada al polipéptido para dirigir el polipéptido sintetizado de de novo a la vía de secreción de la célula hospedadora. Los especialistas en la técnica saben seleccionar una secuencia señal apropiada para un hospedador específico. La secuencia señal puede ser nativa para la célula hospedadora, o puede ser foránea para la célula hospedadora. Como ejemplo, puede usarse una secuencia señal de un polipéptido nativo para la célula hospedadora. Preferiblemente, dicho polipéptido nativo es un polipéptido muy secretado, es decir un polipéptido que se secreta en cantidades mayores del 10% de la cantidad total del polipéptido que se está secretando. Las secuencias señal preferiblemente usadas de acuerdo con la invención son, por ejemplo: pmeA.

Como alternativa a una secuencia señal, el polipéptido de la invención puede fusionarse a un polipéptido vehículo secretado, o parte del mismo. Dicha construcción quimérica se refiere a la vía de secreción mediante la secuencia señal del polipéptido vehículo, o parte del mismo. Además, el polipéptido vehículo proporcionará un efecto estabilizador al polipéptido de acuerdo con la invención y/o puede potenciar la solubilidad. Dicho polipéptido vehículo puede ser cualquier polipéptido. Preferiblemente, se usa un polipéptido muy secretado como polipéptido vehículo. El polipéptido vehículo puede ser nativo o foráneo para el polipéptido dé acuerdo con la invención. El polipéptido vehículo puede ser nativo o puede ser foráneo para la célula hospedadora. Ejemplos de dichos polipéptidos vehículo son glucoamilasa, secuencia prepro del factor alfa-Mating, el dominio de unión a celulosa de la proteína de unión a celulosa A de Clostridium cellulovorans , la glutatión S-transferasa, el dominio de unión a quitina de la quitinasa Al de Bacillus circulans, el dominio de unión a maltosa codificado por el gen malE de E. coli K12, la beta-galactosidasa, y la fosfatasa alcalina. Un polipéptido vehículo preferido para la expresión de dicha construcción quimérica en células de Aspergillus es la glucoamilasa. La proteína y polipéptido vehículo pueden contener un motivo específico de aminoácidos para facilitar el aislamiento del polipéptido; el polipéptido de acuerdo con la invención puede liberarse por un agente de liberación especial. El agente de liberación puede ser una enzima proteolítica o un agente químico. Un ejemplo de dicho motivo de aminoácidos es el sitio de escisión de proteasa KEX, que es bien conocido para los especialistas en la técnica.

Puede usarse una secuencia señal para facilitar la secreción y aislamiento de una proteína o polipéptido de la invención. Las secuencias señal se caracterizan típicamente por un núcleo de aminoácidos hidrófobos, que generalmente se éscinden de la proteína madura durante la secreción en uno o más acontecimientos de escisión. Dichos péptidos señal contienen sitios de procesamiento que permite la escisión de la secuencia señal de las proteínas maduras ya que pasan a través de la vía secretora. La secuencia señal dirige la secreción de la proteína, tal como desde un hospedador eucariota en que se introduce por transformación el vector de expresión, y la secuencia señal se escinde de forma posterior o concurrente. La proteína entonces puede purificarse fácilmente del medio extracelular por métodos conocidos. Como alternativa, la secuencia señal puede ligarse a la proteína de interés usando una secuencia, que facilita la purificación, tal como con un dominio GST. Por tanto, por ejemplo, la secuencia que codifica el polipéptido puede fusionarse a una secuencia marcadora, tal como una secuencia que codifica un péptido, que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En ciertas realizaciones preferidas de este aspecto de la invención, la secuencia marcadora es un péptido de hexa-histidina, tal como la marca proporcionada en un vector pQE (Qiagen, Inc.), entre otros, muchos de los cuales están disponibles en el mercado. Como se describe en Gentz et al, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989), por ejemplo, la hexa-histidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. La marca HA es otro péptido útil para la purificación que corresponde a un epítope derivado de la proteína hemaglutinina de la influenza, que se ha descrito por Wilson et al., Cell 37:767 (1984), por ejemplo.

Preferiblemente, una proteína de fusión TEMER01170 de la invención se produce por técnicas convencionales de ADN recombinante . Por ejemplo, fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias polipeptídicas se ligan juntas en fase de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo empleando extremos de puntas romas o puntas escalonadas para ligamiento, digestión con enzimas de restricción para proporcionar extremos apropiados, rellenado t de extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar una unión indeseable, y ligamiento enzimático. En otra realización, el gen de fusión puede sintetizarse por técnicas convencionales incluyendo sintetizadores automáticos de ADN. Como alternativa, puede realizarse amplificación por PCR de fragmentos génicos · usando cebadores de anclaje, que dan lugar a proyecciones complementarias entre dos fragmentos génicos consecutivos que posteriormente pueden hibridarse y reamplificarse para , generar una secuencia génica quimérica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Además, están disponibles en el mercado muchos vectores de expresión que ya codifican un resto de fusión (por ejemplo, un polipéptido GST) . Un ácido nucleico que codifique TEMER01170 puede clonarse en dicho vector de expresión de modo que el resto de fusión se ligue en fase con la proteína TEMER01170.

Preferiblemente, la eficacia de integración dirigida en el genoma de la célula hospedadora, es decir la integración en un locus diana predeterminado, se aumenta por capacidades aumentadas de recombinación homologa de la célula hospedadora. Dicho fenotipo de la célula preferiblemente implica un gen hdfA o hdfB deficiente como se describe en el documento O2005/095624. El documento WO2005/095624 describe un método preferido para obtener una célula de hongo filamentoso que comprende eficacia aumentada de integración dirigida .

Opcionalmente , la célula hospedadora comprende una respuesta de proteína no plegada (UPR) elevada en comparación con la célula de tipo silvestre para potenciar las capacidades de producción de un polipéptido de interés. La UPR puede aumentarse por técnicas descritas en el documento US2004/0186070A1 y/o el documento US2001/0034045A1 y/o el documento WO01/72783A2 y/o el documento O2005/123763. Más específicamente, el nivel de proteína de HACl y/o IREl y/o PTC2 se ha modulado, y/o se ha modificado por ingeniería la proteína SEC61 para obtener una célula hospedadora que tenga una elevada UPR.

Como alternativa, o en combinación con una UPR elevada, la célula hospedadora se modifica genéticamente para obtener un fenotipo que presente inferior expresión de proteasa y/o secreción de proteasa en comparación con la célula de tipo silvestre para potenciar las capacidades de producción de un polipéptido de interés. Dicho fenotipo puede obtenerse por deleción y/o modificación y/o inactivación de un regulador transcripcional de la expresión de proteasas . Dichos regulador transcripcional es, por ejemplo prtT. La disminución de la expresión de proteasas por modulación de prtT puede realizarse por técnicas descritas en el documento US2004/0191864A1.

Como alternativa, o en combinación con una elevada UPR y/o un fenotipo que presenta inferior expresión de proteasa y/o secreción de proteasa, la célula hospedadora presentan un fenotipo oxalato deficiente para potenciar el rendimiento de producción de un polipéptido de interés. Un fenotipo oxalato deficiente puede obtenerse .por técnicas descritas en el documento O2004/070022A2.

Como alternativa, o en combinación con una elevada UPR y/o un fenotipo que presenta inferior expresión de proteasa y/o secreción de proteasa y/o deficiencia de oxalato, la célula hospedadora presenta una combinación de diferencias fenotípicas en comparación con la célula de tipo silvestre para potenciar el rendimiento de producción del polipéptido de interés. Estas diferencias pueden incluir, aunque sin limitación, expresión disminuida de glucoamilasa y/o alfa-amilasa neutra A y/o alfa-amilasa neutra B, proteasa, y ácido oxálico hidrolasa. Dichas diferencias fenotípicas presentadas por la célula hospedadora pueden obtenerse por modificación genética de acuerdo con las técnicas descritas en el documento US2004/0191864A1.

Como alternativa, o en combinación con una elevada UPR y/o un fenotipo que presenta inferior expresión de proteasa y/o secreción de proteasa y/o deficiencia de oxalato y una combinación de diferencias fenotípicas en comparación con la célula de tipo silvestre para potenciar el rendimiento de producción del polipéptido de interés, la célula hospedadora presenta una deficiencia en genes de toxina, deshabilitando la capacidad de la célula hospedadora de hongo filamentosos de expresar toxinas. Dichas toxinas incluyen, aunque sin limitación, ocratoxinas, fumonisinas, ácido ciclapiazónico, ácido 3 -nitropropiónico, emodina, malformina, aflatoxinas y ácidos secalónicos . Dicha deficiencia es preferiblemente tal como la descrita en el documento WO2000/039322.

(Sobre) expresión En una realización preferida, los polinucleótidos de la presente invención ' descritos en este documento pueden sóbreexpresarse en una cepa microbiana de la invención en comparación con la cepa microbiana parental en que dicho gen no se sobre -expresa . La sobre-expresión de una secuencia polinucleotídica se define en este documento como la expresión de dicha secuencia génica que produce una actividad de la enzima codificada por dicha secuencia, en una cepa microbiana que es al menos aproximadamente 1,5 veces la actividad de la enzima en la cepa microbiana parental; preferiblemente la actividad de dicha enzima es al menos aproximadamente 2 veces, más preferiblemente al menos aproximadamente 3 veces, más preferiblemente al menos aproximadamente 4 veces, más preferiblemente al menos aproximadamente 5 veces, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 10 veces y mucho más preferiblemente al menos aproximadamente 20 veces la actividad de la enzima en la cepa microbiana parental .

El vector puede incluir adicionalmente secuencias que flanquean el polinucleótido dando lugar a AR que comprende secuencias homologas a secuencias genómicas eucariotas o secuencias genómicas virales. Esto permitirá la introducción de los polinucleótidos de la invención en el genoma de una célula hospedadora.

Un vector de clonación integrante puede integrarse aleatoriamente o en un locus diana predeterminado en el cromosoma o cromosomas de la célula hospedadora en que tiene que integrarse. En una realización preferida de la invención, un vector de clonación integrante puede comprender un fragmento de ADN que es homólogo a una secuencia de ADN en un locus, diana predeterminado en el genoma de la célula hospedadora para dirigir la integración del vector de clonación en este locus predeterminado. Para promover la integración dirigida, el vector de clonación puede preferiblemente linealizarse antes de la transformación de la célula hospedadora. La linealización puede realizarse preferiblemente de tal modo que al menos uno pero preferiblemente ambos extremos del vector de clonación estén flanqueados por secuencias homologas al locus diana. La longitud de las secuencias homologas que flanquean el locus diana es de preferiblemente al menos aproximadamente 0,1 kb, tal como aproximadamente al menos 0,2 kb, más preferiblemente al menos aproximadamente 0,5 kb, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 1 kb, mucho más preferiblemente al menos aproximadamente 2 kb. Preferiblemente, las cepas hospedadoras parentales pueden modificarse para una frecuencia mejorada de integración dirigida de ADN como se describe en el documento WO05/095624 y/o WO2007/115886.

El ejemplo de deleción proporcionado en la presente invención, usa el promotor del gen como flanco 5' y el gen como flanco 3' para insertar un marcador de selección entre el promotor y el gen, alterando de este modo (es decir, inactivando funcionalmente) la transcripción génica. La secuencia génica dada anteriormente puede usarse para preparar genes funcionalmente inactivados similares. Los genes pueden dividirse en dos, produciendo un flanco 5' y un flanco 3', pero el gen también puede usarse para clonar un trozo más grande de ADN genómico que contenga el promotor y regiones terminadoras del gen, que puedan funcionar como flanco 5' y flanco 3' .

El sistema de vector puede ser un único vector, tal como un único plásmido, o dos o más vectores, tal como dos o más plásmidos, que juntos contienen el ADN total a introducir en el genoma de la célula hospedadora.

El vector puede contener un polinucleótido de la invención orientado en una dirección antisentido para proporcionar la producción de ARN antisentido.

El ADN del vector puede introducirse en células procariotas o eucariotas mediante técnicas convencionales de transformación o transíección. Como se usa en este documento, los términos "transformación" y "transfección" pretenden hacer referencia a una diversidad de técnicas reconocidas en la técnica para introducir ácido nucleico foráneo (por ejemplo, ADN) en una célula hospedadora, incluyendo co-precipitación con fosfato cálcico o cloruro calcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, transducción, infección, lipofección, transfección mediada por lípidos catiónicos o electroporación . Pueden encontrarse métodos adecuados para transformar o transfectar células hospedadoras en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a, ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) , Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) y otros manuales de laboratorio.

Para una transfección estable de células de mamífero, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transfección usados, solamente una pequeña fracción de las células puede integrar el ADN foráneo en su genoma. Para identificar y seleccionar estos integrantes, generalmente se introduce un gen que codifica un marcador de selección (por ejemplo, resistencia a antibióticos) en las células hospedadoras junto con el gen de interés. Los marcadores de selección · preferidos incluyen, aunque sin limitación, aquellos que confieren resistencia a fármacos o que complementan un defecto en la célula hospedadora. Incluyen, por ejemplo, genes marcadores versátiles que pueden usarse para la transformación de la mayoría de los hongos filamentosos y levaduras tales como genes o ADNc de acetamidasa (los genes o ADNc de amdS, niaD, facA de A. nidulans, A. oryzae o A. niger) , o genes que proporcionan resistencia a antibióticos como resistencia a G418, higromicina, bleomicina, kanamicina, metotrexato, fleomicina o benomilo (benA) . Como alternativa, pueden usarse marcadores de selección específicos tales como marcadores auxotróficos que requieren cepas hospedadoras mutantes correspondientes: por ejemplo, URA3 (de S. cerevisiae o genes análogos de otras levaduras) , pyrG o pyrA (de A. nidulans o A. niger) , argB (de A. nidulans o A. niger) o trpC. En una realización preferida, el marcador de selección se elimina de la célula hospedadora transformada después de la introducción de la construcción de expresión para obtener células hospedadoras transformadas capaces de producir el polipéptido que estén libres de genes marcadores de selección.

Otros marcadores incluyen el gen de la ATP sintetasa, subunidad 9 (oliC) , orotidina-5 ' -fosfatodescarboxilasa (pvrA) , el gen de resistencia a G418 bacteriano (éste también puede usarse en levaduras, pero no en hongos) , el gen de resistencia a ampicilina (E. coli) , el gen de resistencia a neomicina (Bacillus) , el gen de resistencia a nourseotricina natl de Streptomyces nursei, el gen de resistencia a piritiamina ptrA de Aspergillus oryzae y el gen uidA de E. coli, que codifica la ß-glucuronidasa (GUS) . Los vectores pueden usarse in vitro, por ejemplo para la producción de ARN o usarse para transfectar o transformar una célula hospedadora .

La expresión de proteínas en procariotas a menudo se realiza en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas de fusión o no de fusión. Los vectores de fusión añaden varios aminoácidos a una proteína codificada en los mismos, por ejemplo al extremo amino de la proteína recombinante . Dichos vectores de fusión típicamente tienen tres propósitos: 1) aumentar la expresión de la proteína recombinante; 2) aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) ayudar en la purificación de la proteína recombinante actuando como ligando en purificación de afinidad. A menudo, en vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión del motivo de fusión y la proteína recombinante para posibilitar la separación de la proteína recombinante del motivo de fusión después de la purificación de la proteína de fusión.

Como se ha indicado, los vectores de expresión preferiblemente contendrán marcadores de selección. Dichos marcadores incluyen resistencia a la dihidrofolato reductasa o neomicina para cultivo de células eucariotas y resistencia a tetraciclina o ampicilina para el cultivo en E. coli y otras bacterias.

Los vectores preferidos para su uso en bacterias se describen, por ejemplo, en el documento WO-A1-2004/074468 , que se incluye por la presente por referencia. Otros vectores adecuados serán fácilmente evidentes para los especialistas en la técnica.

Para la secreción de la proteína traducida en la luz del retículo endoplasmático, en el espacio periplásmico o en el entorno extracelular, pueden incorporarse señales de secreción apropiadas en el polipéptido expresado. Las señales pueden ser endógenas para el polipéptido o pueden ser señales heterólogas .

El polipéptido TEMER01170 puede expresarse en una forma modificada, tal como una proteína de fusión, y puede incluir no solamente señales . de secreción sino también regiones funcionales heterologas adicionales. Por tanto, por ejemplo, puede añadirse una región de aminoácidos adicionales, particularmente aminoácidos cargados, al extremo N-terminal del polipéptido para mejorar la estabilidad y persistencia en la célula hospedadora, durante la purificación o durante la manipulación y almacenamiento posteriores. Además, pueden añadirse motivos peptídicos al polipéptido para facilitar la purificación.

La invención proporciona un polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N° 2, y una secuencia de aminoácidos que se puede obtener expresando el polinucleótido de la SEC ID N° 1 en un hospedador apropiado. Además, un péptido o polipéptido que comprende una variante de los polipéptidos anteriores, tal como un equivalente funcional, está comprendido dentro de la presente invención. Los polipéptidos anteriores están comprendidos colectivamente en la expresión "polipéptidos de acuerdo con la invención" .

La expresión "péptido variante" o "polipéptido variante" se define en este documento como un péptido o polipéptido, respectivamente, que comprenden una o más alteraciones, tales como sustituciones, inserciones, deleciones y/o truncamientos de uno o más restos aminoacídicos específicos en una o más posiciones específicas en el péptido o polipéptido, respectivamente. Por consiguiente, un péptido señal variante es un péptido señal que comprende una o más alteraciones, tales como sustituciones, inserciones, deleciones y/o truncamientos de uno o más restos aminoacídicos específicos en una o más posiciones específicas en el péptido señal.

El término "polinucleótido" se idéntico a la expresión "molécula de ácido nucleico" y en este documento pueden leerse de forma intercambiable. El término se refiere a una molécula polinucleotídica, que es una molécula de ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN) , monocatenario o bicatenario. Un polinucleótido puede estar presente en forma aislada, o está comprendido en moléculas de ácido nucleico o vectores recombinantes , o estar comprendido en una célula hospedadora.

La expresión "polinucleótido variante" se define en este documento como un polinucleótido que comprende una o más alteraciones, tales como sustituciones, inserciones, deleciones y/o truncamientos de uno o más nucleótidos en una o más posiciones específicas en el polinucleótido.

Los términos "péptido" y "oligopéptido" se consideran sinónimos (como está habitualmente reconocido) y cada término puede usarse de forma intercambiable, según lo requiera el contexto, para indicar una cadena de al menos dos aminoácidos acoplados por enlaces peptidilo. La palabra "polipéptido" se usa en este documento para cadenas que contiene más de siete restos aminoacídicos . Todas las fórmulas o secuencias de oligopéptido y polipéptido de este documento se escriben de izquierda a derecha y en la dirección de extremo amino a extremo carboxi . El código de una letra de aminoácidos usado en este documento es comúnmente conocido en la técnica y puede encontrarse en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) .

Por polipéptido o proteína "aislada" se entiende un polipéptido o proteína retirada de su entorno nativo. Por ejemplo, polipéptidos y proteínas producidos de forma recombinante expresados en células hospedadoras se consideran aislados para los propósitos de la invención ya que son polipéptidos nativos o recombinantes que se han purificado sustancialmente por cualquier técnica adecuada tal como, por ejemplo, el método de purificación de una etapa descrito en Smith y Johnson, Gene 67:31-40 (1988).

El polipéptido degradante de carbohidratos TEMER01170 de acuerdo con la invención puede recuperarse y purificarse de cultivos celulares recombinantes por métodos conocidos en la técnica. Más preferiblemente, se emplea cromatografía líquida de alto rendimiento ("HPLC") para la purificacióh.

Los polipéptidos de la presente invención incluyen productos purificados de forma natural, productos de procedimientos sintéticos químicos, y productos producidos por técnicas recombinantes de un hospedador procariota o eucariota, incluyendo, por ejemplo, células bacterianas, de levaduras, de plantas superiores, de insecto y de mamífero. Dependiendo del hospedador empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden estar glucosilados o puede estar no glucosilados. Además, los polipéptidos de la invención también pueden incluir un resto de metionina modificado inicial, en algunos casos como resultado de procesos mediados por el hospedador.

La invención también presenta fragmentos biológicamente activos de los polipéptidos de acuerdo con la invención.

Los fragmentos biológicamente activos de un polipéptido de la invención incluyen polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas a o derivadas de la secuencia de aminoácidos del polipéptido TEMER01170 (por ejemplo, . la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° 2) , que incluyen menos aminoácidos que el polipéptido de longitud completa pero que muestran al menos una actividad biológica del polipéptido de longitud completa correspondiente. Típicamente, los fragmentos biológicamente activos comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad del polipéptido TEMER01170.

Un fragmento biológicamente activo de un polipéptido de la invención puede ser un polipéptido que es de, por ejemplo, aproximadamente 10, aproximadamente 25, aproximadamente 50, aproximadamente 100 o más aminoácidos de longitud o de al menos aproximadamente 100 aminoácidos, al menos 150, 200, 250, 300, 350, 400 aminoácidos de longitud, o de una longitud hasta la cantidad total de aminoácidos del polipéptido de la invención.

Además, pueden prepararse otras partes biológicamente activas, en que están eliminadas otras regiones del polipéptido, por técnicas recombinantes y evaluarse para una o más de las actividades biológicas de la forma nativa de un polipéptido de la invención.

La invención también presenta fragmentos de ácido nucleico que codifican los fragmentos biológicamente activos anteriores del polipéptido TEMER01170.

Polipéptidos En otro aspecto de la invención, se · proporcionan polipéptidos TEMER01170 mejorados. Los polipéptidos TEMER01170 mejorados son polipéptidos en que está mejorada al menos una actividad biológica. Dichos polipéptidos pueden obtenerse introduciendo aleatoriamente mutaciones a lo largo de toda o parte de la secuencia codificante de TEMER01170, tal como por mutagénesis por saturación, y los mutantes resultantes pueden expresarse de forma recombinante y explorarse para la actividad biológica.

Pueden obtenerse variantes mejoradas de las secuencias de aminoácidos de la presente invención que conducen a una función degradante de carbohidratos mejorada por los genes correspondientes de la presente invención. Entre dichas modificaciones se incluyen: 1. PCR propensa a error para introducir mutaciones aleatorias, seguida de una exploración de las variantes obtenidas y aislamiento de las variantes con propiedades cinéticas mejoradas 2. Redistribución familiar de variantes relacionadas de los genes que codifican la enzima degradante de carbohidratos, seguida de una exploración de las variantes obtenidas y aislamiento de las variantes con propiedades cinéticas mejoradas Pueden obtenerse variantes de los genes de la presente invención que conducen a un nivel aumentado de ARNm y/o polipéptido, que producen mayor actividad degradante de carbohidratos por las secuencias polinucleotídicas de dichos genes. Entre dichas modificaciones se incluyen: ; 1. Mejora del uso de codones de tal modo que los codones se adapten (óptimamente) al hospedador microbiano parental . •2. Mejora del uso de pares de codones de tal modo que los codones se adapten (óptimamente) al hospedadora microbiano parental 3. Adición de secuencias estabilizadoras a la información genómica que codifica el polipéptido degradante de carbohidratos produciendo moléculas de AR m con una vida media aumentada Los métodos preferidos para aislar variantes con propiedades catalíticas mejoradas o niveles aumentados de ARNm o polipéptido se describen en el documento WO03/010183 y el documento WO03/01311. Los métodos preferidos para optimizar el uso de codones en cepas microbianas parentales se describen en el documento PCT/EP2007/05594. Los métodos preferidos para la adición de elementos estabilizadores a los genes que codifican el polipéptido degradante de carbohidratos de la invención se describen en el documento WO2005/059149.

En una realización preferida el polipéptido TEMER01170 tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N° 2. En otra realización, el polipéptido TEMER01170 es sustancialmente homólogo a la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N° 2 y retiene al menos una actividad biológica de un polipéptido de acuerdo con la SEC ID N" 2, aún difiere en la secuencia de aminoácidos debido a la variación natural o mutagénesis descrita.

En una realización preferida más, el polipéptido TEMER01170 tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un fragmento de ácido nucleico aislado capaz de. hibridar con un ácido nucleico de acuerdo con la SEC ID N° 1, preferiblemente en condiciones de hibridación altamente rigurosas .

Por consiguiente, el polipéptido TEMER01170 es preferiblemente un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 73%, al menos un 74%, al menos un 75%, al menos un 76%, al menos un 77%, al menos un 78%, al menos un 79%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o más homologa a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N° 2 y, típicamente, retiene al menos una actividad funcional del polipéptido de acuerdo con la SEC ID N° 2. ; También pueden identificarse equivalentes funcionales de un polipéptido de acuerdo con la invención, por ejemplo, explorando bibliotecas combinatorias de mutantes, por ejemplo mutantes de truncamiento, del polipéptido de la invención para la actividad degradante de carbohidratos . En una realización, se genera una biblioteca variegada de variantes por mutagénesis combinatoria a nivel de ácido nucleico. Una biblioteca variegada de variantes puede producirse por, por ejemplo, ligamiento enzimático de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias génicas de modo que una serie degenerada de secuencias polipeptídicas potenciales se pueda expresar como polipéptidos individuales, o como alternativa, como una serie de proteínas de fusión más grandes (por ejemplo, para presentación en fagos). Hay una diversidad de métodos que pueden usarse para producir bibliotecas de variantes potenciales de los polipéptidos de la invención a partir de una secuencia oligonucleotídica degenerada. Los métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477).

Además, pueden usarse bibliotecas de fragmentos de la secuencia codificante de un polipéptido de la invención para generar una población variegada de polipéptidos para exploración una posterior selección de variantes. Por ejemplo, pude generarse una biblioteca de fragmentos de secuencia codificante tratando un fragmento bicatenario de PCR de la secuencia codificante de interés con una nucleasa en condiciones en que sucede la formación de mellas solamente aproximadamente una vez por molécula, desnaturalizando el ADN bicatenario, renaturalizando el ADN para formar ADN bicatenario que puede incluir pares con sentido/antisentido de diferentes productos con mella, retirando las partes monocatenarias de los dúplex reformados por tratamiento con nucleasa SI, y ligando la biblioteca resultante de fragmentos en un vector de expresión. Por este método, puede obtenerse una biblioteca de expresión que codifica fragmentos N-terminales e internos de diversos tamaños de la proteína de interés.

Se conocen en la técnica varias técnicas para explorar productos génicos de bibliotecas combinatorias preparadas por mutaciones puntuales de truncamiento, y para explorar bibliotecas de ADNc para productos génicos que tienen una propiedad seleccionada. Las técnicas más ampliamente usadas, que son susceptibles a análisis de alto rendimiento, para explorar genotecas grandes típicamente incluyen clonación de la genoteca en vectores de expresión replicable, transformación de las células apropiadas con la biblioteca resultante de vectores, y expresión de los genes combinatorios en condiciones en que la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detectó. La mutagénesis de conjunto recursivo (REM) , una técnica que potencia la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, puede usarse en combinación con los ensayos de exploración para identificar variantes de un polipéptido de la invención (Arkin y Yourvan (1992) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3): 327-331) .

Además de la secuencia génica de TEMER01170 mostrada en la SEC ID N° 1, será evidente para los especialistas en la técnica que pueden existir polimorfismos de secuencia de ADN dentro de una población dada, que pueden conducir a cambios en la secuencia de aminoácidos del polipéptido TEMER01170. Dichos polimorfismos genéticos pueden existir en células de diferentes poblaciones o dentro de una población debido a la variación alélicas natural. Las variantes alélicas también pueden incluir equivalentes funcionales.

Los fragmentos de un polinucleótido de acuerdo con la invención también pueden comprender polinucleótidos que no codifican polipéptidos funcionales. Dichos polinucleótidos pueden funcionar como sondas o cebadores para una reacción de PCR.

Los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, independientemente de si codifican polipéptidos funcionales o no funcionales, pueden usarse como sondas de hibridación o cebadores de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Los usos de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que no codifican un polipéptido que tiene una actividad TEMER01170 incluyen, entre otros, (1) aislamiento del gen que codifica el polipéptido TEMER01170, o variantes alélicas del mismo a partir de una biblioteca de ADNc, por ejemplo, de microorganismos adecuados; (2) hibridación in situ (por ejemplo, FISH) con propagaciones cromosómicas en metafase para proporcionar la localización cromosómica precisa del gen TEMER01170 como se describe en Verma et al., Human Chromosomes : a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988) ; (3) análisis de transferencia de Northern para detectar la expresión del ARNm de TEMER01170 en tejidos y/o células específicas y 4) sondas y cebadores que pueden usarse como herramienta de diagnóstico para anali2ar la presencia de un ácido nucleico que puede hibridar con la sonda TEMER01170 en una muestra biológica dada (por ejemplo, tejido) .

También se incluye por la invención un1 método para obtener un equivalente funcional de un gen TEMER01170. Dicho método implica obtener una sonda marcada que incluye un ácido nucleico aislado que codifica toda o una parte de la secuencia polipeptídica de acuerdo con la SEC ID N° 2 o una variante de la misma; explorar una biblioteca de fragmentos de ácido nucleico con la sonda marcada en condiciones que permite la hibridación de la sonda con los fragmentos de ácido nucleico en la biblioteca, formando de este modo dúplex de ácido nucleico, y preparar una secuencia génica de longitud completa a partir de los fragmentos de ácido nucleico en cualquier dúplex marcado para obtener un gen relacionado con el gen TEMER01170.

En una realización, un ácido nucleico TEMER01170 de la invención es al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, o más homólogo a una secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEC ID N° l o el complemento de la misma.

Se proporcionan adicionalmente : células hospedadoras que comprenden un polinucleótido o vector de la invención. El polinucleótido puede ser heterólogo al genoma de la célula hospedadora. El término "heterólogo", habitualmente con respecto a la célula hospedadora, significa que el polinucleótido no existe de forma natural en el genoma de la célula hospedadora o que el polipéptido no se produce de forma natural por esa célula.

En otra realización, la invención presenta células, por ejemplo, células hospedadoras transformadas o células hospedadoras recombinantes que contienen un ácido nucleico incluido por la invención. Una "célula transformada" o "célula recombinante" es una célula en que (o en un ascendiente de la misma) se ha introducido, mediante técnicas de ADN recombinante, un ácido nucleico de acuerdo con la invención. Se incluyen células tanto procariotas como eucariotas, por ejemplo, bacterias, hongos, levaduras, y similares, especialmente se prefieren células de hongos filamentosos, tales como Aspergillus niger o Talaromyces emersonii .

Puede elegirse una célula hospedadora que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y procese el producto génico de un modo especifico, deseado. Dichas modificaciones (por ejemplo, glucosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de los productos proteicos pueden facilitar el funcionamiento óptimo de la proteína.

Dichas células hospedadoras tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento post-traduccional y modificación de proteínas y productos génicos. Las líneas celulares apropiadas o sistemas hospedadores familiares para los especialistas en la técnica de biología molecular y/o microbiología pueden elegirse para asegurar la modificación y procesamiento deseados y correctos de la proteína foránea expresada. Para este fin, pueden usarse células hospedadoras eucariotas que tienen la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcrito primario, glucosilación, y fosforilación del producto génico. Dichas células hospedadoras son bien conocidas en la técnica.

Si se desea, puede usarse una célula como se ha descrito anteriormente para la preparación de un polipéptido de acuerdo con la invención. Dicho método típicamente comprende cultivar una célula hospedadora (por ejemplo, transformada o transfectada con un vector de expresión como se ha descrito anteriormente) en condiciones para proporcionar' la expresión (por el vector) de una secuencia codificante que codifica el polipéptido, y opcionalmente recuperar el polipéptido expresado. Los polinucleótidos de la invención pueden incorporarse en un vector replicable recombinante, por ejemplo, un vector de expresión. El vector puede usarse para replicar el ácido nucleico en una célula hospedadora compatible. Por tanto, en una realización adicional, la invención proporciona un método para preparar un polinucleótido de la invención introduciendo un polinucleótido de la invención en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula hospedadora compatible, y cultivando la célula hospedadora en condiciones que provocan la replicación del vector. El vector puede recuperarse de la célula hospedadora.

Preferiblemente, el polipéptido se produce como una proteína secretada en cuyo caso la secuencia de nucleótidos que codifica una forma madura del polipéptido en la construcción de expresión está unida de forma funcional a una -secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia señal. Preferiblemente, la secuencia señal es nativa (homologa) a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Como alternativa, la secuencia señal es foránea (heteróloga) a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido, en cuyo caso la secuencia señal es preferiblemente endógena a la célula hospedadora en que se expresa la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención. Ejemplos de secuencias señal adecuadas para células hospedadoras de levadura son las secuencias señal derivadas de genes de factor-a de levaduras. Asimismo, una secuencia señal adecuada para célula hospedadoras de hongos filamentosos es, por ejemplo, una secuencia señal derivada de un gen de amiloglucosidasa (AG) de hongos filamentosos, por ejemplo, el gen glaA de A. niger. Éste puede usarse en combinación con el propio promotor de la amiloglucosidasa (también llamada (gluco) amilasa) , así como en combinación con otros promotores. También pueden usarse secuencias señal híbridas con el contexto de la presente invención.

Las secuencias líder de secreción heterologas preferidas son aquellas que se originan a partir del gen de la amiloglucosidasa (AG) fúngica (versiones de glaA tanto de 18 como de 24 aminoácidos, por ejemplo, de Aspergillus) , el gen del factor-a (levaduras, por ejemplo, Saccharomyces y Kluyverómyces ) o el gen de la a-amilasa (Bacillus) .

Los vectores pueden introducirse por transformación o transfección en una célula hospedadora adecuada como se ha descrito anteriormente para proporcionar la expresión de un polipéptido de la invención. Este proceso puede comprender el cultivo de una célula hospedadora transformada con un vector de expresión como se ha descrito anteriormente en condiciones para proporcionar la expresión por el vector de una secuencia codificante que codifica el polipéptido.

Células hospedadoras La invención por tanto proporciona células hospedadoras transformadas o transíectadas con o que comprenden un polinucleótido o vector de la invención. Preferiblemente el polinucleótido se porta en un vector para la replicación y expresión del polinucleótido . Las células se elegirán para que sean compatibles con dicho vector y pueden ser, por ejemplo, células procariotas (por ejemplo bacterianas) , fúngicas, de levaduras o vegetales.

También puede elegirse un hospedador heterólogo en que el polipéptido de la invención se produzca en una forma que está sustancialmente libre de otras enzimas degradantes de celulosa o degradantes de hemicelulosa . Esto puede conseguirse eligiendo un hospedador que no produzca de forma normal dichas enzimas.

La invención abarca procesos para la producción del polipéptido de la invención mediante expresión recombinante de una secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Para este propósito, puede usarse la secuencia de ADN de la invención para amplificación génica y/o intercambio de señales de expresión, tales como promotores, secuencias señal de secreción, para permitir la producción económica del polipéptido en una célula hospedadora homologa o heteróloga adecuada. Una célula hospedadora homologa es una célula hospedadora que es de la misma especie o que es una variante dentro de la misma especie que la especie de la que se obtiene la secuencia de ADN.

Las células hospedadoras adecuadas son preferiblemente microorganismos procariotas tales como bacterias, o más preferiblemente organismos eucariotas, por ejemplo hongos, tales como levaduras u hongos filamentosos, o células vegetales. En general, se prefieren células de levadura sobre las células fúngicas porque son más fáciles de manipular. Sin embargo, algunas proteínas se secretan mal desde levaduras, o en algunos casos, no se procesan apropiadamente (por ejemplo, hiperglucosilación en levaduras) . En estos casos, debe seleccionarse un organismo hospedador fúngico.

La célula hospedadora puede sobre-expresa el polipéptido, y son bien conocidas técnicas para diseñar por ingeniería la sobre-expresión. El hospedador puede por tanto, tener dos o más copias del polinucleótido codificante (y el vector por tanto puede tener dos o más copias en consecuencia) .

Bacterias del género Bacillus son muy adecuadas como hospedadores heterólogos a causa de su capacidad de secretar proteínas en el medio de cultivo. Otras bacterias adecuadas como hospedadores son aquellas de los géneros Streptomyces y Pseudomonas . Una célula hospedadora de levadura preferida para la expresión de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido es de los géneros Saccharomyces , Kluyveromyces , Hansenula, Pichia, Yarrowia, y Schizosaccharomyces .

Más preferiblemente una célula hospedadora de levadura se selecciona entre el grupo compuesto por las especies Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis (también conocida como Kluyveromyces marxianus var. lactis), Hansenula polimorpha, Pichia pastoris, Yarrowia lipolitica y Schizosaccharomyces pombe.

Son más preferidas, sin embargo células hospedadoras fúngicas (por ejemplo, filamentosas) . Células hospedadoras preferidas de hongos filamentosos se seleccionan entre el grupo compuesto por los géneros Aspergillus, Trichoderma/Hypocrea, Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium, Neurospora, Thermoascus, Myceliophtora, Sporotrichum, Thielavia, Chryosporium, Fusarium, Humicola, Neurospora y Talaromyces.

Más preferiblemente una célula hospedadora de hongo filamentoso es de las especies que incluyen, aunque sin limitación Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus tubingensis, Aspergillus aculeatus; Aspergillus foetidus, Aspergillus nidulans, Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae y Aspergillus ficuum, Trichoderma reesei/Hypocrea jecorina, Fusarium graminaarum, Talaromyces emersonii, Penicillium decumbens, Acremonium alabamense, Neurospora crassa, Myceliophtora thernaophilurri , Sporotrichum cellulophilum, Disporotrichum dimorphosporum, Talaromyces emersonii, Talaromyces stipitatus y Thielavia terrestris .

Células hospedadoras de acuerdo con la invención incluyen células vegetales, y la invención por lo tanto se extiende a organismos transgénicos , tales como plantas y partes de las mismas, que contienen una o más células de la invención. Las células pueden expresar de forma heterologa el polipéptido de la invención o puede contener de forma heterologa uno o más de los polinucleótidos de la invención. La planta transgénica (o genéticamente modificada) puede, por lo tanto, tener insertado (por ejemplo, de forma estable) en su genoma una secuencia que codifica uno o más de los polipéptidos de la invención. La transformación de células vegetales puede realizarse usando técnicas conocidas, por ejemplo usando un plásmido Ti o Ri de Agrobacterium tumefaciens. El plásmido (o vector) puede por tanto contener secuencias necesarias para infectar una planta, y pueden emplearse derivados de los plásmidos Ti y/o Ri .

Como alternativa puede realizarse infección directa de una parte de una planta, tal como una hoja, raíz o tallo. En esta técnica, puede hacerse una herida en la planta a infectar, por ejemplo cortando la planta con ana cuchilla o perforando la planta con una aguja o frotando la planta con un abrasivo. La herida después se inocula con Agrobacterium. La planta o la parte de la planta después puede cultivarse en un medio de cultivo adecuado y dejarse desarrollar en una planta madura. La regeneración de las células transformadas en plantas genéticamente modificadas puede conseguirse usando técnicas conocidas, por ejemplo, seleccionando brotes transformados usando un antibiótico y sub-cultivando los brotes en un medio que contiene los nutrientes, hormonas vegetales y similares apropiados.

La invención también incluye células se han modificado para expresar el polipéptido degradante de carbohidratos de la invención o una variante del mismo. Dichas células incluyen líneas celulares eucariotas superiores transitorias, o preferiblemente estable, tales como células de mamífero o células de insecto, células eucariotas inferiores, tales como levaduras y células fúngicas (por ejemplo, filamentosas) o células procariotas tales como células bacterianas.

También es posible que los polipéptidos de la invención se expresen de forma transitoria en una línea celular o en una membrana, tal como, por ejemplo, en un sistema de expresión de baculovirus. Dichos sistemas, que están adaptados para expresar los polipéptidos de acuerdo con la invención, también se incluyen dentro del alcance de la presente invención.

De acuerdo con la presente invención, la producción del polipéptido de la invención puede realizarse cultivando hospedadores microbianos de expresión, que se han transformado con uno o más polinucleótidos de la presente invención, en un medio de fermentación nutriente convencional .

Producción de polipéptido/enzima Las células hospedadoras recombinantes de acuerdo con la invención pueden cultivarse usando procedimientos conocidos en la técnica. Para cada combinación de un promotor y una célula hospedadora, están disponibles condiciones de cultivo que conducen a la expresión de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Después de alcanzar la densidad celular o el título deseado del polipéptido, se detiene el cultivo y se recupera el polipéptido usando procedimientos conocidos .

El medio de fermentación puede comprenden un medio de cultivo conocido que contiene una fuente de carbono (por ejemplo, glucosa, maltosa, melazas, almidón, celulosa, xilano, pectina, hidrolizado de biomasa lignocelulolítica, etc.), una fuente de nitrógeno (por ejemplo, sulfato de amonio, nitrato de amonio, cloruro de amonio, etc.), una fuente de nitrógeno orgánico (por ejemplo, extracto de levaduras, extracto de malta, peptona, etc.) y fuentes de nutrientes inorgánicos (por ejemplo, fosfato, magnesio, potasio, zinc, hierro, etc.). Opcionalmente , puede incluirse un inductor (por ejemplo, celulosa, pectina, xilano, maltosa, maltodextrina o xilogalacturonano) .

La selección del medio apropiado puede basarse en la elección del hospedador de expresión y/o basarse en las necesidades reguladoras de la construcción de expresión. Dichos medios son conocidos para los especialistas en la técnica. El medio puede contener, si se desea, componentes adicionales que favorecen los hospedadores de expresión transformados sobre otros microorganismos potencialmente contaminantes .

La producción de polipéptido por el hospedador transformado (fermentación) puede realizarse de acuerdo con cualquier procedimiento conocido. El tiempo de producción puede prolongarse durante un periodo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 30 días. Puede ser un proceso discontinuo, continuo o semicontinuo, adecuadamente a una temperatura en el intervalo de 0-100°C o 0-80oC, por ejemplo, de aproximadamente 0 a aproximadamente 60 °C y/o a un pH, por ejemplo, de aproximadamente 2 a aproximadamente 10, o de aproximadamente 3 a aproximadamente 9. Las condiciones preferidas de fermentación son una temperatura en el intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 55 °C y/o a un pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 5. Las condiciones apropiadas se seleccionan habitualmente en base a la elección del hospedador de expresión y el polipéptido a expresar .

Después de la fermentación, si es necesario, las células pueden retirarse del caldo de fermentación mediante centrifugación o filtración. Después de haber detenido la fermentación o después de retirar las células, el polipéptido de la invención puede después recuperar y, si se desea, purificarse y aislarse por medios convencionales.

Composiciones de polipéptido/enzima La' invención proporciona una composición que comprende un polipéptido de la invención y una celulasa y/o una hemicelulasa y/o una pectinasa.

Cuando el polipéptido de la invención es una celulasa, una composición de la invención típicamente comprenderá una hemicelulasa y/o una pectinasa además del polipéptido de la invención.

Cuando el polipéptido de la invención es una hemicelulasa, una composición de la invención típicamente comprenderá una celulasa y/o una pectinasa además del polipéptido de la invención.

Cuando el polipéptido de la invención es una pectinasa, una composición de la invención típicamente comprenderá una celulasa y/o una hemicelulasa además del polipéptido de la invención .

Una composición de la invención puede comprender una, dos o tres o más clases de celulasa, por ejemplo una, dos o todas de endo-l, 4- ß-glucanasa (EG) , exo-celobiohidrolasa (CBH) y ß-glucosidasa (BG) .

Una composición de la invención puede comprender un polipéptido que tiene la misma actividad enzimática, por ejemplo el mismo tipo de actividad celulasa, hemicelulasa y/o pectinasa que la proporcionada por un polipéptido de la invención.

Una composición de la invención puede comprender un polipéptido que tiene un tipo diferente de actividad celulasa y/o actividad hemicelulasa y/o actividad pectinasa que la proporcionada por un polipéptido de la invención. Por ejemplo, una composición de la invención puede comprender un tipo de celulasa y/o actividad hemicelulasa y/o actividad pectinasa proporcionada por un polipéptido de la invención y un segundo tipo de celulasa y/o actividad hemicelulasa y/o actividad pectinasa proporcionada por una hemicelulasa/pectinasa adicional.

En este documento, una celulasa es cualquier polipéptido que sea capaz de degradar la celulosa. Un polipéptido que es capaz de degradar la celulosa es uno que es capaz de catalizar el proceso de descomposición de la celulosa en unidades más pequeñas, ya sea parcialmente, por ejemplo en celodextrinas , o completamente en monómeros de glucosa. Una celulasa de acuerdo con la invención puede dar lugar a una población mixta de celodextrinas y monómeros de glucosa cuando se pone en contacto con la celulasa. Dicha degradación típicamente tendrá lugar mediante una reacción de hidrólisis.

En este documento, una hemicelulasa es cualquier polipéptido que sea capaz de degradar la hemicelulosa . Es decir, una hemicelulasa puede ser capaz de degradar uno o más de xilano, glucuronoxilano, arabinoxilano, glucomanano y xiloglucano. Un polipéptido que es capaz de degradar una hemicelulosa es uno que es capaz de catalizar el proceso de descomposición de la hemicelulosa en polisacáridos más pequeños, ya sea parcialmente, por ejemplo en oligosacáridos , o completamente en monómeros de azúcar, por ejemplo monómeros de azúcar hexosa o pentosa. Una hemicelulasa de acuerdo con la invención puede dar lugar a una población mixta de oligosacáridos y monómeros de azúcar cuando se pone en contacto con la hemicelulasa. Dicha degradación típicamente tendrá lugar mediante una reacción de hidrólisis.

En este documento, una pectinasa es cualquier polipéptido que sea ' capaz de degradar la pectina. Un polipéptido que es capaz de degradar la pectina es uno que es capaz de catalizar el proceso de descomposición de la pectina en unidades más pequeñas, ya sea parcialmente, por ejemplo en oligosacáridos, o completamente en monómeros de azúcar. Una pectinasa de acuerdo con la invención puede dar lugar a una población mixta de oligosacáridos y monómeros de azúcar cuando se pone en contacto con la pectinasa. Dicha degradación típicamente tendrá lugar mediante una reacción de hidrólisis.

Por consiguiente, una composición de la invención puede comprender cualquier celulasa, por ejemplo, una celobiohidrolasa, una endo-ß-?, 4-glucanasa, una ß-glucosidasa o una ß- (1, 3) (1, 4) -glucanasa.

En este documento, una celobiohidrolasa es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis de enlaces 1, 4^-D-glucosídicos en celulosa o celotetraosa, liberando celobiosa de los extremos de las cadenas. Esta enzima también puede mencionarse como celulasa 1,4-ß-celobiosidasa, 1 , 4 - ß-celobiohidrolasa, 1 , 4 - ß -D-glucano celobiohidrolasa, avicelasa, exo-1, 4- -D-glucanasa, exo-glucanasa o exoglucanasa . Puede tener el código EC EC 3.2.1.91.

En este documento, una endo- ß-1 , 4 -glucanasa (EC 3.2.1.4) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la endohidrólisis de enlaces 1 , 4 - ß-D-glucosídicos en celulosa, liquenina o ß-D-glucanos de cereales. Dicho polipéptido también puede ser capaz de hidrolizar enlaces 1,4 en ß-D-glucanos que también contienen enlaces 1,3. Esta enzima también puede mencionarse como celulasa, avicelasa, ß-1,4-endoglucano hidrolasa, ß-l, 4-glucanasa, carboximetil celulasa, celudextrinasa, endo-1, 4^-D-glucanasa, endo-1, 4-ß-D-glucanohidrolasa, endo-1, 4- -glucanasa o endoglucanasa. CEA es en este documento una endoglucanasa EC 3.2.1.4 que en base a su estructura 3D se clasifica en la familia de la glucosil hidrolasa 5 (GH5). Actividades conocidas para miembros de la familia GH5 incluyen actividad quitosanasa (EC 3.2.1.132); ß-manosidasa (EC 3.2.1.25); celulasa (EC 3.2.1.4); glucano 1,3-ß-glucosidasa (EC 3.2.1.58); liqueninasa (EC 3.2.1.73); glucano endo- 1 , 6 - ß -glucosidasa (EC 3.2.1.75); mañano endo-ß-1 , 4-manosidasa (EC 3.2.1.78); endo- ß- 1 , 4 -xilanasa (EC 3.2.1.8); celulosa ß-1, 4 -celobiosidasa (EC 3.2.1.91); endo-ß-1, 6-galactanasa (EC 3.2.1.-); ß-1 , 3 -mananasa (EC 3.2.1.-); endo- ß-l, 4-glucanasa específica de xiloglucano (EC 3.2.1.151); mañano transglucosilasa (EC 2.4.1.-). CEB es en este documento una endoglucanasa EC 3.2.1.4 que en base a su estructura 3D se clasifica en la familia de la glucosil hidrolasa 7 (GH7) . Actividades conocidas para miembros de la familia GH7 incluyen actividad endo- ß-l, 4-glucanasa (EC 3.2.1.4); [reducción de acción en los extremos] celobiohidrolasa (EC 3.2.1.-); quitosanasa (EC 3.2.1.132); endo- ß-1, 3-1, 4-glucanasa (EC 3.2.1.73).

En este documento, una ß-glucosidasa (abreviada BG) (EC 3.2.1.21) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis de restos terminales, no reductores de ß-D-glucosa con liberación de ß-D-glucosa. Dicho polipéptido puede tener una amplia especificidad por ß-D-glucósidos y también puede hidrolizar uno o más de los siguientes: un ß-D-galactósido, un a-L-arabinósido, un ß-D-xilósido o un ß-D-fucósido. Esta enzima también puede mencionarse como amigdalasa, ß-D-glucósido glucohidrolasa, celobiasa o gentiobiasa .

En este documento, una ß- (1, 3) (1, 4) -glucanasa (EC 3.2.1.73) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis de enlaces 1, 4^-D-glucosídicos en ß-D-glucanos que contienen enlaces 1,3 y 1,4. Dicho polipéptido puede actuar sobre liquenina y ß-D-glucanos de cereales, pero no sobre ß-D-glucanos que contienen solamente enlaces 1,3 o 1,4. Esta enzima también puede mencionarse como liqueninasa, 1,3-1 , 4 - ß-D-glucano 4 -glucanohidrolasa , ß-glucanasa, ß???-ß-1,3-1,4 glucanasa, liquenasa o ß-glucanasa de enlaces mixtos. Una alternativa para este tipo de enzima es EC 3.2.1.6, que se describe como endo-1 , 3 (4 ) -beta-glucanasa . Este tipo de enzima hidroliza enlaces 1,3 o 1,4 en beta-D-glucanos cuando el resto de glucosa cuyo grupo reductor está implicado en el enlace a hidrolizar está en sí mismo sustituido en C-3. Nombres alternativos incluyen endo-1, 3-beta-glucanasa, laminarinasa, 1, 3- (1, 3 ; 1, 4) -beta-D-glucano 3 (4) glucanohidrolasa; los sustratos incluyen laminarina, liquenina y beta-D-glucanos de cereales.

Una composición de acuerdo con la invención puede comprender una enzima de la familia GH61 o cualquier otra enzima que tenga actividad potenciadora de celulasa.

La actividad potenciadora de celulasa se define en este documento como la potenciación de la actividad de al menos una celulasa. Cuando la proteína degradante de carbohidratos de la invención está presente en una mezcla con una o más celulasas, por ejemplo en una mezcla con celobiohidrolasa (CBH) y beta-glucosidasa (BG) , potenciará la actividad de estas celulasas, que provocará una actividad mator de la mezcla para degradar la celulosa. Las enzimas en la familia GH61 se clarificaron originalmente como la familia de la glucósido hidrolasa en base a la medición de actividad endo-1 , -b-D-glucanasa muy débil en un miembro de la familia (endoglucanasa (EC 3.2.1.4)). La estructura y modo de acción de estas enzimas son ciertamente no canónicos y no pueden considerarse como glucosidasas auténticas. Sin embargo, se mantienen en la clasificación CÁZy e base a su capacidad de potenciar la descomposición de la lignocelulosa cuando se usan junto con una celulasa o una mezcla de celulasas. Se da un resumen de miembros conocidos de la familia GH61 en la figura 5 de Harris, PV et al, Biochemistry 2010, 49, 3305-3316.

Una composición de la invención puede comprender cualquier hemicelulasa, por ejemplo, una endoxilanasa, una ß-xilosidasa, una -L-arabionofuranosidasa, una a-D-glucuronidasa, una acetil xilano esterasa, una feruloil esterasa, una cumaroil esterasa, una a-galactosidasa, una ß-galactosidasa, una ß-mananasa o una ß-manosidasa .

En este documento, una endoxilanasa (EC 3.2.1.8) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la endohidrólisis de enlaces 1 , 4 - ß-D-xilosídicos en xilanos. Esta enzima también puede mencionarse como endo-?,?-ß-xilanasa o 1, 4^-D-xilano xilanohidrolasa . Una alternativa es EC 3.2.1.136, una glucuronoarabinoxilano endoxilanasa, una enzima que es capaz de hidrolizar enlaces 1,4 xilosídicos en glucuronoarabinoxilanos.

En este documento, una ß-xilosidasa (EC 3.2.1.37) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis de 1, ^-D-xilanos, para retirar restos sucesivos de D-xilosa de los extremos no reductores. Dichas enzimas también pueden hidrolizar xilobiosa. Esta enzima también puede mencionarse como xilano 1, 4^-xilosidasa, 1,4-ß-?-xilano xilohidrolasa, exo-1, 4 - ß-xilosidasa o xilobiasa.

En este documento, una -L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) es cualquier polipéptido que sea capaz de actuar sobre a-L-arabinofuranósidos , a-L-arabinanos que contienen enlaces (1,2) y/o (1,3) y/o (1,5)-, arabinoxilanos y arabinogalactanos . Esta enzima también puede mencionarse como oí-N-arabinofuranosidasa, arabinofuranosidasa o arabinosidasa .

En este documento, una -D-glucuronidasa (EC 3.2.1.139) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar una reacción de la siguiente forma: alfa-D-glucuronósido + H(2)0 = un alcohol + D-glucuronato . Esta enzima también puede mencionarse como alfa-glucuronidasa o alfa-glucosiduronasa . Estas enzimas también pueden hidrolizar ácido glucurónico 4-O-metilado, que también puede estar presente como sustituyente en xilanos. Una alternativa es EC 3.2.1.131: xilano alfa-1, 2-glucuronosidasa, que cataliza la hidrólisis de enlaces alfa-1 , 2 - (4 -O-metil) glucuronosilo .

En este documento, una acetil xilano esterasa (EC 3.1.1.72) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la desacetilación de xilanos y xilo-oligosacáridos . Dicho polipéptido puede catalizar la hidrólisis de grupos acetilo de xilano polimérico, xilosa acetilada, glucosa acetilada, alfa-naftil acetato o p-nitrofenil acetato pero, típicamente, no de triacilglicerol . Dicho polipéptido típicamente no actúa sobre mañano o pectina acetilada.

En este documento, una feruloil esterasa (EC 3.1.1.73) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar una reacción de la forma: feruloil-sacárido + H(2)0 = ferulato + sacarido. El sacarido puede ser, por ejemplo, un oligosacárido o un polisacárido. Puede catalizar típicamente la hidrólisis del grupo 4-hidroxi-3-metoxicinamoilo (feruloilo) de un azúcar esterificado, que es habitualmente arabinosa en sustratos 'naturales'. El acetato de p-nitrofenol y ferulato de metilo son típicamente sustratos más pobres. Esta enzima también puede mencionarse como cinamoil éster hidrolasa, ácido ferúlico esterasa o hidroxicinamoil esterasa. También puede mencionarse como una enzima accesoria de hemicelulasa, ya que puede ayudar a las xilanasas y pectinasas a descomponer la hemicelulosa y pectina de la pared celular vegetal .

En este documento, a cumaroil esterasa (EC 3.1.1.73) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar una reacción de la forma: cumaroil-sacárido + H(2)0 = cumarato + sacárido. El sacárido puede ser, por ejemplo, un oligosacárido o un polisacárido. Esta enzima también puede mencionarse como trans-4 -cumaroil esterasa, trans-p-cumaroil esterasa, p-cumaroil esterasa o ácido p-cumérico esterasa. Esta enzima también está dentro de EC 3.1.1.73 de modo que también puede mencionarse como feruloil esterasa.

En este documento, una a-galactosidasa (EC 3.2.1.22) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis de restos terminales de a-D-galactosa no reductores en -D-galactósidos , incluyendo oligosacáridos de galactosa, galactomananos , galactaños y arabinogalactaños . Dicho polipéptido también puede ser capaz de hidrolizar a-D-fucósidos. Esta enzima también puede mencionarse como melibiasa .

En este documento, una ß-galactosidasa (EC 3.2.1.23) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis de restos terminales de ß-D-galactosa no reductores en ß -D-galactósidos . Dicho polipéptido también puede ser capaz de hidrolizar a-L-arabinósidos . Esta enzima también puede mencionarse como exo- (l->4) - ß-D-galactanasa o lactasa.

En este documento, una ß-mananasa (EC ,3.2.1.78) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis aleatoria de enlaces 1 , 4 - ß-D-manosídicos en mananos, galactomananos y glucomananos . Esta enzima también puede mencionarse como mañano endo-1, 4-^-manosidasa o endo-l, 4-mananasa.

En este documento, una ß-manosidasa (EC 3.2.1.25) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis de restos terminales de ß-D-manosa no reductores en ß-D-manósidos . Esta enzima también puede mencionarse como mañanasa o manasa.

Una composición de la invención puede comprender cualquier pectinasa, por ejemplo una endo poligalacturonasa, una pectina metil esterasa, una endo-galactanasa, una beta galactosidasa, una pectina acetil esterasa, una endo-pectina liasa, pectato liasa, alfa ramnosidasa, una exo-galacturonasa, una exo-poligalacturonato liasa, una ramnogalacturonano hidrolasa, una ramnogalacturonano liasa, una ramnogalacturonano acetil esterasa, una ramnogalacturonano galacturonohidrolasa o una xilogalacturonasa .

En este documento, una endo-poligalacturonasa (EC 3.2.1.15) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis aleatoria de enlaces 1, 4- -D-galactosidurónicos en pectato y otros galacturonanos . Esta enzima también puede mencionarse como poligalacturonasa pectina despolimerasa, pectinasa, endopoligalacturonasa, pectolasa, pectina hidrolasa, pectina poligalacturonasa, poli-a-1,4-galacturónido glucanohidrolasa, endogalacturonasa; endo-D-galacturonasa o poli ( 1 , 4 -a-D-galacturónido) glucanohidrolasa.

En este documento, una pectina metil esterasa (EC 3.1.1.11) es cualquier enzima que sea capaz de catalizar la reacción: pectina + n H20 = n metanol + pectato. La enzima también puede conocerse como pectinaesterasa, pectina desmetoxilasa, pectina metoxilasa, pectina metilesterasa, pectasa, pectinoesterasa o pectina pectilhidrolasa.

En este documento, una endo-galactanasa (EC 3.2.1.89) es cualquier enzima capaz de catalizar la endohidrólisis de enlaces 1 , 4 - ß-D-galactosídicos en arabinogalactanos . La enzima también puede conocerse como arabinogalactano endo-1 , 4 - ß-galactosidasa, endo-1 , 4 - -galactanasa, galactanasa, arabinogalactanasa o arabinogalactano 4-ß-?-galactanohidrolasa .

En este documento, una pectina acetil esterasa se define en este documento como cualquier enzima que tiene actividad acetil esterasa que cataliza la desacetilación de los grupos acetilo en los grupos hidroxilo de restos GalUA de pectina.

En este documento, una endo-pectina liasa (EC 4.2.2.10) es cualquier enzima capaz de catalizar la escisión de eliminación de ( 1?4 ) -a-D-galacturonano metil éster para dar oligosacáridos con grupos 4-desoxi-6-0-metil-o¡-D-galact-4-enuronosilo en sus extremos no reductores. La enzima también puede conocerse como pectina liasa, pectina trans-eliminasa; endo-pectina liasa, polimetilgalacturónico transeliminasa, pectina metiltranseliminasa, pectoliasa, PL, PNL o PMGL o (1?4) -6-O-metil- -D-galacturonano liasa.

En este documento, una pectato liasa (EG 4.2.2.2) es cualquier enzima capaz de catalizar la escisión de eliminación de (l->4) -a-D-galacturonano para dar oligosacáridos con grupos 4-desoxi-oí-D-galact-4-enuronosilo en sus extremos no reductores . La enzima también puede conocerse como poligalacturónico transeliminasa, ácido péctico transeliminasa, poligalacturonato liasa, endopectina metiltranseliminasa, pectato transeliminasa, endogalacturonato transeliminasa, ácido péctico liasa, péctico liasa, ácido a-1, 4-D-endopoligalacturónico liasa, PGA liasa, PPasa-N, ácido endo- -? , 4 -poligalacturónico liasa, ácido poligalacturónico liasa, pectina trans-eliminasa, ácido poligalacturónico trans-eliminasa o ( 1?4) -a-D-galacturonano liasa .

En este documento, una alfa ramnosidasa (EC 3.2.1.40) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis de restos terminales de -L-ramnosa no reductores en a-L-ramnósidos o como alternativa en ramnogalacturonano . Esta enzima también puede conocerse como a-L-ramnosidasa T, Oí-L-ramnosidasa N o -L-ramnósido ramnohidrolasa .

En este documento, exo-galacturonasa (EC 3.2.1.82) es cualquier polipéptido con capacidad de hidrólisis de ácido péctico del extremo no reductor, liberando digalacturonato . La enzima también puede conocerse como exo-poli-a-galacturonosidasa, exopoligalacturonosidasa o exopoligalacturanosidasa .

En este documento, exo-galacturonasa (EC 3.2.1.67) es cualquier polipéptido capaz de catalizar: (1,4- -D-galacturónido) n + H20 = (1 , 4 -a-D-galacturónido) n-i + D-galacturonato . La enzima también puede conocerse como galacturano 1 , 4 - -galacturonidasa, exopoligalacturonasa, poli (galacturonato) hidrolasa, exo-D-galacturonasa, exo-D-galacturonanasa, exopoli-D-galacturonasa o poli ( 1 , 4 -a-D-galacturónido) galacturonohidrolasa.

En este documento, exopoligalacturonato liasa (EC 4.2.2.9) es cualquier polipéptido capaz de catalizar la escisión de eliminación de 4- (4-desoxi-a-D-galact-4-enuronosil) -D-galacturonato del extremo reductor de pectato, es decir pectina des-esterificada . Esta enzima puede conocerse como pectato disacárido-liasa, pectato exo-liasa, ácido exopéctico transeliminasa, exopectato liasa, ácido exopoligalacturónico trans-eliminasa, PATE, exo-PATE, exo-PGL o (1?4) -a-D-galacturonano disacárido de extremo reductor-liasa.

En este documento, ramnogalacturonano hidrolasa es cualquier polipéptido que sea capaz de hidrolizar el enlace entre ácido galactosilurónico y ramnopiranosilo de un modo endo en estructuras de ramnogalacturonano estrictamente alternantes, que consiste en el disacárido [ácido (1,2-alfa-L-ramnoil- (1,4) -alfa-galactosilurónico] .

En este documento, ramnogalacturonano liasa es cualquier polipéptido que sea cualquier polipéptido que sea capaz de escindir enlaces a-L-Rhap- (1?4 ) - -D-GalpA de un modo endo en ramnogalacturonano por beta-eliminación.

En este documento, ramnogalacturonano acetil esterasa es cualquier polipéptido que catalice la desacetilación de la estructura de restos alternantes de ramnosa y ácido galacturónico en ramnogalacturonano.

En este documento, ramnogalacturonano galacturonohidrolasa es cualquier polipéptido que sea capaz de hidrolizar el ácido galacturónico del extremo no reductor de estructuras de ramnogalacturonano estrictamente alternantes de un modo exo .

En este documento, xilogalacturonasa es cualquier polipéptido que actúe sobre xilogalacturonano escindiendo la estructura de ácido galacturónico sustituido con ß-xilosa de un modo endo. Esta enzima también puede conocerse como xilogalacturonano hidrolasa.

En este documento, una oí-L-arabinofura osidasa (EC 3.2.1.55) es cualquier polipéptido que sea capaz de actuar sobre a-L-arabinofuranósidos , -L-arabinanos que contienen enlaces (1,2) y/o (1,3) y/o (1,5), arabinoxilanos y arabinogalactanos . Esta enzima también puede mencionarse como a-N-arabinofuranosidasa, arabinofuranosidasa o arabinosidasa .

En este documento, endo-arabinanasa (EC 3.2.1.99) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la endohidrólisis de enlaces 1 , 5-a-arabinofuranosídicos en 1,5-arabinanos. La enzima también puede conocerse como endo-arabinasa, arabinano endo-1, 5-a-L-arabinosidasa, endo-l,5-a-L-arabinanasa, endo-a-? , 5-arabanasa; endo-arabanasa o 1,5- -L-arabinano 1, 5-a-L-arabinanohidrolasa.

Una composición de la invención típicamente comprenderá al menos una celulasa y/o al menos una hemicelulasa y/o al menos una pectinasa (una de las cuales es un polipéptido de acuerdo con la invención) . Una composición de la invención puede comprender una celobiohidrolasa, una endoglucanasa y/o una ß-glucosidasa. Dicha composición también puede comprender una o más hemicelulasas y/o una o más pectinasas .

Puede estar presente una o más (por ejemplo dos, tres, cuatro o todas) de una amilasa, una proteasa, una lipasa, una ligninasa, una hexosiltransferasa o una glucuronidasa en una composición de la invención.

"Proteasa" incluye enzimas que hidrolizan enlaces peptídicos (peptidasas) , así como enzimas que hidrolizan enlaces entre péptidos y otros motivos, tales como azúcares (glucopeptidasas) . Muchas proteasas están caracterizadas en EC 3.4, y son adecuadas para su uso en la invención incorporadas en este documento por referencia. Algunos tipos específicos de ' proteasas incluyen, cisteína proteasas incluyendo pepsina, papaína y serina proteasas incluyendo quimotripsinas , carboxipeptidasas y metaloendopeptidasas.

"Lipasa" incluye enzimas que hidrolizan lípidos, ácidos grasos, y acilglicéridos, incluyendo fosfoglicéridos , lipoproteínas , diacilgliceroles , y similares. En plantas, se usan lípidos como componentes estructurales para limitar la pérdida de agua y la infección por patógenos. Estos lípidos incluyen ceras derivadas de ácidos grasos, así como cutina y suberina.

"Ligninasa" incluye enzimas que pueden hidrolizar o descomponer la estructura de polímero de lignina. Las enzimas que pueden descomponer la lignina incluyen lignina peroxidasas, manganeso peroxidasas, lacasas y feruloil esterasas, y otras enzimas descritas en la técnica que se sabe que despolimerizan o rompen de otro modo los polímeros de lignina. También se incluyen enzimas capaces de hidrolizar los enlaces formados entre azúcares hemicelulósicos (especialmente arabinosa) y lignina. Las ligninasas incluyen aunque sin limitación el siguiente grupo de enzimas: lignina peroxidasas (EC 1.11.14), manganeso peroxidasas (EC 1.11.1.13), lacasas (EC 1.10.3.2) y feruloil esterasas (EC 3.1.1.73) .

"Hexosiltransferasa" (2.4.1-) incluye enzimas que son capaces de transferir grupos glucosilo, más específicamente grupos hexosilo. Además de transferir un grupo glucosilo desde un donante que contiene glucosilo a otro compuesto que contiene glucosilo, el aceptor, las enzimas también pueden transferir el grupo glucosilo al agua como aceptor. Esta reacción también se conoce como reacción de hidrólisis, en lugar de una reacción de transferencia. Un ejemplo de una hexosiltransferasa que puede usarse en la invención es una ß-glucanosiltransferasa . Dicha enzima puede ser capaz de catalizar la degradación de (1, 3) (1, 4) glucano y/o celulosa y/o un producto de degradación de la celulosa.

"Glucuronidasa" incluye enzimas que catalizan la hidrólisis de un glucuronósido, por ejemplo ß-glucuronósido para producir un alcohol. Muchas glucuronidasas se han caracterizado y pueden ser adecuadas para su uso en la invención, por ejemplo ß-glucuronidasa (EC 3.2.1.31), hialurono-glucuronidasa (EC 3.2.1.36), glucuronosil-disulfoglucosamina glucuronidasa (3.2.1.56), glicirrizinato ß-glucuronidasa (3.2.1.128) o a-D-glucuronidasa (EC 3.2.1.139) .

Una composición de la invención puede comprender una expansina o proteína tipo expansina, tal como swollenina (véase Salheimo et al., Eur. J. Biohem. 269, 4202-4211, 2002) o una proteína tipo swollenina.

Las expansinas están implicadas en la relajación de la estructura de la pared celular durante el crecimiento de la célula vegetal. Se ha propuesto que las expansinas alteran los enlaces de hidrógeno entre la celulosa y otros polisacáridos de pared celular sin tener actividad hidrolítica. De este modo, se cree que permiten el deslizamiento de las fibras de celulosa y el agrandamiento de la pared celular. La swollenina, una proteína tipo expansina contiene un dominio de la familia 1 de módulos de unión a carbohidratos (CBD) N-terminal y un dominio tipo expansina C-terminal . Para los propósitos de esta invención, una proteína tipo expansina o proteína tipo swollenina puede comprender uno o ambos de dichos dominios y/o puede alterar la estructura de las paredes celulares (tal como alterar la estructura de celulosa) , opcionalmente sin producir cantidades detectables de azúcares reductores.

Una composición de la invención puede comprender el producto polipeptídico de una proteína integrante de celulosa, escafoldina o una proteína tipo escafoldina, por ejemplo CipA o CipC de Clostridium thermocellum o Clostridium cellulolyticum respectivamente.

Las escafoldinas y proteínas de integración de celulosa son subunidades integrantes multi-funcionales que pueden organizar las subunidades celulolíticas en un complejo multi-enzimático. Esto se consigue por la interacción de dos clases complementarias de dominio, es decir, un dominio de cohesión en la escafoldina y un dominio acoplador en cada unidad enzimática. La subunidad escafoldina también alberga un módulo de unión a celulosa (CBM) que media la adhesión del celulosoma a su sustrato. Una escafoldina o proteína de integración de celulosa para los propósitos de esta invención puede comprender uno o ambos de dichos dominios .

Una composición de la invención puede comprender una proteína inducida por o moduladora de celulosa, por ejemplo codificada por el gen cipl o cip2 o genes similares de Trichoderma reesei / Hypocrea jecorina (véase Foreman et al., J. Biol. Chem. 278 (34) , 31988-31997, 2003) . El producto polipeptídico de estos genes es proteínas bimodulares, que contienen un módulo de unión a celulosa y un, dominio cuya función o actividad no puede relacionarse con familias conocidas de glucosil hidrolasa. Además, la presencia de un módulo de unión a celulosa y la co-regulación de la expresión de estos genes con componentes de celulasas indica actividades previamente no reconocidas con una tarea potencial en la degradación de biomasa.

Una composición de la invención puede estar compuesta por un miembro de cada una de las clases de los polipéptidos mencionados anteriormente, varios miembros de una clase de polipéptido, o cualquier combinación de estas clases de polipéptido .

Una composición de la invención puede estar compuesta de polipéptidos, por ejemplo enzimas, de (1) proveedores comerciales; (2) genes clonados que expresan polipéptidos, por ejemplo enzimas; (3) caldo complejo (tal como el resultante del cultivo de una cepa microbiana en el medio, en que las cepas secretan proteínas y enzimas en el medio; (4) lisados celulares de cepas cultivas como en (3) ; y/o (5) material vegetal que expresa polipéptidos, por ejemplo enzimas. Pueden obtenerse diferentes polipéptidos, por ejemplo, enzimas en una composición de la invención de diferentes fuentes.

Uso de los polipéptidos Los polipéptidos y composiciones polipeptídicas de acuerdo con la invención pueden usarse en muchas aplicaciones diferentes. Por ejemplo pueden usarse para producir azúcares fermentables . Los azúcares fermentables después pueden, como parte de un proceso de biocombustible, convertirse en biogás o etanol, butanol, isobutanol, 2 butanol u otras sustancias adecuadas. Como alternativa, los polipéptidos y sus composiciones pueden usarse como enzima, por ejemplo, en la producción de productos alimenticios, en composiciones detergentes, en la industria del papel y la pulpa y en formulaciones antibacterianas, en productos farmacéuticos tales como pastillas para la garganta, dentífricos, y enjuagues bucales. Algunos de los usos se ilustrarán a continuación en más detalle.

En los usos y métodos descritos a continuación, los componentes de las composiciones descritas anteriormente pueden proporcionarse de forma concomitante (es decir, en forma de una única composición per se) o por separado o secuencialmente .

La invención también se refiere al uso del polipéptido degradante de carbohidratos de acuerdo con la invención y composiciones que comprende dicha enzima en procesos industriales .

A pesar de la experiencia a largo plazo obtenida con estos procesos, el polipéptido degradante de carbohidratos de acuerdo con la invención puede presentar varias ventajas significativas sobre las enzimas usadas actualmente. Dependiendo de la aplicación específica, estas ventajas pueden incluir aspectos tales como inferiores costes de producción, mayor especificidad hacia el sustrato, antigenicidad reducida, menos actividades secundarias indeseables, mayores rendimientos cuando se producen en un microorganismo adecuado, intervalos de pH y temperatura más adecuados, no inhibición por productos hidrófobos, derivados de lignina o menos inhibición de producto o, en el caso de la industria alimentaria un mejor sabor o textura de una producto final así como aspectos de calidad alimentaria y kosher .

En principio, un polipéptido degradante de carbohidratos o composición de la invención puede usarse en cualquier proceso que requiera el tratamiento de un material que comprende polisacárido . Por tanto, un polipéptido o composición de la invención puede usarse en el tratamiento de material polisacárido. En este documento, material polisacárido es un material que comprende o consta esencialmente de uno o, más típicamente, más de un polisacárido .

Típicamente, las plantas y el material derivado de las mismas comprenden cantidades significativas , de material polisacárido no de almidón. Por consiguiente, un polipéptido de la invención puede usarse en el tratamiento de una planta o material fúngico o un material derivado de los mismos .

Lignocelulosa Un componente importante del material polisacárido vegetal no de almidón es la lignocelulosa (también mencionado en este documento como biomasa lignocelulolítica) . La lignocelulosa es material vegetal que comprende celulosa y hemicelulosa y lignina. Los polímeros de carbohidrato (celulosa y heraicelulosas) están estrechamente unidos a la lignina por enlaces de hidrógeno y covalentes. Por consiguiente, un polipéptido de la invención puede usarse en el tratamiento de material lignocelulolítico . En este documento, el material lignocelulolítico es un material que comprende o consta esencialmente de lignocelulosa. Por tanto, en un método de la invención para el tratamiento de un polisacárido no de almidón, el polisacárido no de almidón puede ser un material/biomasa lignocelulósica .

Por consiguiente, la invención proporciona un método para tratar un sustrato que comprende polisacárido no de almidón en que el tratamiento comprende la degradación y/o hidrólisis y/o modificación de celulosa y/o hemicelulosa y/o una sustancia péctica.

La degradación en este contexto indica que el tratamiento provoca la generación de productos de hidrólisis de celulosa y/o hemicelulosa y/o una sustancia péctica, es decir, está presentes sacáridos de longitud más corta como resultado del tratamiento que los que están presentes en un polisacárido no tratado similar no de almidón. Por tanto, la degradación en este contexto puede provocar la liberación de oligosacáridos y/o monómeros de azúcar.

Todas las plantas contienen polisacárido rio de almidón como casi todos los materiales polisacáridos derivados de plantas. Por consiguiente, en un método de la invención para el tratamiento de un sustrato que comprende un polisacárido no de almidón, dicho sustrato puede proporcionarse en forma de una planta o un material derivado de plantas o un material que comprende una planta o material derivado de plantas, por ejemplo, una pulpa vegetal, un extracto vegetal, un producto alimenticio o ingrediente del mismo, una tela, un textil o un artículo de ropa.

La biomasa lignocelulolítica adecuada para su uso en la invención incluye biomasa y puede incluir biomasa virgen y/o biomasa no virgen tal como biomasa agrícola, compuestos orgánicos comerciales, desechos de construcción y demolición, residuos sólidos urbanos, papel usado y residuos de jardinería. Las formas comunes de biomasa incluyen árboles, arbustos y hierbas, trigo, paja del trigo, bagazo de la caña de azúcar, maíz, hojas de maíz, mazorcas de maíz, granos de maíz incluyendo la fibra de los granos, productos y subproductos de la molienda de cereales tales como el maíz, el trigo y la cebada (incluyendo molienda en húmedo y molienda en seco) a menudo llamados "salvado o fibra" así como residuos sólidos urbanos, papel usado y residuos de jardinería. La biomasa también puede ser, aunque sin limitación, material herbáceo, residuos agrícolas, residuos forestales, residuos sólidos urbanos, papel usado, y residuos de la molienda de pulpa y papel. "La biomasa agrícola" incluye ramas, matorrales, cañas, maíz y hojas de maíz, cultivos energéticos, bosques, frutos, flores, granos, hierbas, cultivos herbáceos, hojas, corteza, agujas, troncos, raíces, árboles jóvenes, cultivos de madera de rotación corta, arbustos, pasto varilla, árboles, verduras, pieles de frutos, parras, pulpa de remolacha azucarera,, moliendas de trigo, salvado de avena, y maderas duras y blandas (no incluyendo maderas con materiales nocivos) . Además, la biomasa agrícola incluye materiales residuales orgánicos generados a partir de proceso agrícolas incluyendo actividades agricultura y silvicultura, específicamente incluyendo residuos de madera procedentes de silvicultura. La biomasa agrícola puede ser cualquiera de los mencionados anteriormente de forma individual o en cualquier combinación o mezcla de los mismos. Ejemplos adicionales de biomasa adecuada son preparaciones hortícolas, chaparral, residuos de almazara, residuos urbanos de madera, residuos urbanos, desechos del madereo, rastrojos forestales, cultivos de madera de corta rotación, residuos industriales, paja del trigo, forraje de avena, forraje de arroz, forraje de cebada, forraje de centeno, forraje de lino, salvado de soja, salvado de arroz, forraje de arroz, pienso con gluten de maíz, salvado de avena, caña de azúcar, rastrojo de maíz, tallos de maíz, mazorcas de maíz, hojas de maíz, pasto de praderas, maíz forrajero perenne, cola de zorra; pulpa de remolacha azucarera, pulpa de frutos cítricos, cascaras de semillas, residuos celulósicos de animales, hierba cortada, algodón, algas, árboles, arbustos, hierbas, trigo, paja del trigo, bagazo de la caña de azúcar, maíz, hojas de maíz, cáscaras de maíz, granos de maíz, fibra de granos, productos y sub-productos de la molienda en húmedo o seco de granos, residuos sólidos urbanos, papel usado, residuos de jardinería, material herbáceo, residuos agrícolas, residuos forestales, residuos sólidos urbanos, papel usado, pulpa, residuos de la fabricación de papel, ramas, matorrales, cañas, maíz, hojas de maíz, un cultivo energético, bosque, un fruto, una flor, una semilla, una hierba, un cultivo herbáceo, una hoja, corteza, una aguja, un tronco, una raíz, un árbol joven, un arbusto, pasto varilla, un árbol, una verdura, piel de frutos, una parra, pulpa de remolacha azucarera, moliendas de trigo, salvado de avena, madera dura o blanda, material residual orgánico generado a partir de un proceso agrícola, residuos de madera procedentes de silvicultura, o una combinación de dos cualesquiera o más de los mismos .

Aparte de la biomasa virgen o las materias primas ya procesadas en las industrias de la alimentación y piensos o del papel y la pulpa, la biomasa/materia prima puede pretratarse adicionalmente con calor, modificación mecánica y/o química o cualquier combinación de dichos métodos para potenciar la degradación enzimática.

Pretratamiento Antes del tratamiento enzimático, la materia prima puede pretratarse opcionalmente con calor, modificación mecánica y/o química o cualquier combinación de dichos métodos para potenciar la accesibilidad del sustrato a la hidrólisis enzimática y/o para hidrolizar la hemicelulosa y/o solubilizar la hemicelulosa y/o la celulosa y/o la lignina, de cualquier modo conocido en la técnica. El pretratamiento puede comprender exponer el material lignocelulósico a agua (caliente) , vapor (explosión de vapor) , un ácido, una base, un disolvente, calor, un peróxido, ozono, trituración mecánica, pulverización, molienda o despresurización rápida, o una combinación de dos cualesquiera o más de los mismos. Un pretratamiento química a menudo se combina con pretratamiento por calor, por ejemplo entre 150-220°C durante 1 a 30 minutos .

Presacarificación Después de la etapa de pretratamiento, pude utilizarse una etapa de licuefacción/hidrólisis o presacarificación que implica incubación con una enzima o mezcla enzimática. La etapa de pre- sacarificación puede realizarse a muchas diferentes temperaturas pero se prefiere que la etapa de presacarificación suceda a la temperatura más apropiada para la mezcla enzimática que se está aplicando, o la enzima óptima predicha de las enzimas a aplicar. La temperatura de la etapa de presacarificación puede variar de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 95°C, de aproximadamente 20°C a aproximadamente 85°C, de aproximadamente 30°C a aproximadamente 70°C, de aproximadamente 40°C a aproximadamente 60°C, de aproximadamente 37°C a aproximadamente 50°C, preferiblemente de aproximadamente 37°C a aproximadamente 80 °C, más preferiblemente de aproximadamente 60-70 °C incluso más preferiblemente de aproximadamente 65 °C. El pH de la mezcla de presacarificación puede variar de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 10,0, pero es preferiblemente de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 7,0, más preferiblemente de aproximadamente 4,0 a. aproximadamente 6,0, incluso más preferiblemente de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 5,0. De : nuevo, el pH puede ajustarse para maximizar la actividad enzimática y puede ajustarse con la adición de la enzima.

La reacción de la etapa de licuefacción/hidrólisis o presacarificación puede suceder de varios minutos a varias horas , tal como de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 120 horas, preferiblemente de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 48 horas, más preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 24 horas, mucho más preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 horas . El tratamiento con celulasa puede suceder de varios minutos a varias horas, tal como de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 120 horas, preferiblemente de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 72 horas, más preferiblemente de aproximadamente 24 a 48 horas.

Sacarificación La invención proporciona un método para producir un azúcar a partir de un material lignocelulósico , comprendiendo dicho método poner en contacto un polipéptido de la invención o una composición de la invención con el material lignocelulósico .

Dicho a método permite que se generen azúcares libres (monómeros) y/u oligosacáridos a partir de biomasa lignocelulósica . Estos métodos implican convertir biomasa lignocelulósica en azúcares libres y oligosacáridos pequeños con un polipéptido o composición de la invención.

El proceso para convertir un carbohidrato complejo tal como lignocelulosa en azúcares preferiblemente permite la conversión en azúcares fermentables . Dicho proceso puede mencionarse como "sacarificación". Por consiguiente, un método de la invención puede provocar la liberación de uno o más azúcares hexosa y/o pentosa, tal como uno o más de glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, ácido galacturónico, ácido glucurónico, mañosa, ramnosa, ribosa y fructosa.

Por consiguiente, otro aspecto de la invención incluye métodos que utilizan el polipéptido o composición de la invención descrito anteriormente junto con enzimas o tratamiento físicos adicionales tales como temperatura y pH para convertir la biomasa vegetal lignocelulósica en azúcares y oligosacáridos .

Aunque la composición se ha analizado como una mezcla individual, está reconocido que las enzimas pueden añadirse secuencialmente mientras que pueden alterarse la temperatura, pH, y otras condiciones para aumentar la actividad de cada enzima individual. Como alternativa, puede determinarse un pH y temperatura óptimos para la mezcla enzimática.

Las enzimas se hacen reaccionar con el sustrato en cualquier condición apropiada. Por ejemplo, las enzimas pueden incubarse a aproximadamente 25 °C, aproximadamente 30 °C, aproximadamente 35 °C, aproximadamente 37 °C, aproximadamente 40° , aproximadamente 45 °C, aproximadamente 50 °C, aproximadamente 55 °C, aproximadamente 60 °C, aproximadamente 65 °C, aproximadamente 70 °C, aproximadamente 75 °C, aproximadamente 80 °C, aproximadamente 85 °C, aproximadamente 90 °C o superior. Es decir, pueden incubarse a una temperatura de aproximadamente 20°C a aproximadamente 95 °C, por ejemplo en támpones de baja a media fuerza iónica ¦ y/o de pH bajo a neutro. Por "fuerza iónica media" se entiende que el tampón tiene una concentración de iones de aproximadamente 200 milimolar (mM) o menor para cualquier componente iónico individual . El pH puede variar de aproximadamente pH 2,5, aproximadamente pH 3,0, aproximadamente pH 3,5, aproximadamente pH 4,0, aproximadamente pH 4,5, aproximadamente pH 5, aproximadamente pH 5,5, aproximadamente pH 6, aproximadamente pH 6,5, aproximadamente pH 7 , aproximadamente pH 7,5, aproximadamente pH 8,0, a aproximadamente pH 8,5. Generalmente, el intervalo de pH será de aproximadamente pH 3,0 a aproximadamente pH 7. Para la producción de etanol medio ácido se prefiere, por ejemplo pH=4 , mientras que para la producción de biogás es deseable pH neutro, por ejemplo pH=7. La incubación de las combinaciones de enzimas en estas · condiciones provoca la emisión o liberación de cantidades sustanciales de azúcar a partir de la lignocelulosa . Por cantidad sustancial se entiende al menos el 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más de azúcar disponible.

Los polipéptidos , tales como enzimas, pueden producirse de forma exógena en microorganismos, levaduras, hongos, bacterias o plantes, después aislarse y añadirse, por ejemplo, a la materia prima lignocelulósica . Como alternativa, las enzimas se producen, pero no se aislan, y puede añadirse caldo de fermentación de masa celular en bruto, o material vegetal (tal como rastrojo de maíz) , y similares a, por ejemplo, la materia prima. Como alternativa, la masa celular en bruto o el medio de producción de enzimas o el material vegetal puede tratarse para evitar el crecimiento microbiano adicional (por ejemplo, por calentamiento o adición de agentes antimicrobianos) , después añadirse a, por ejemplo, una materia prima. Estas mezclas enzimáticas en bruto pueden incluir el organismo productos de la enzima. Como alternativa, la enzima puede producirse en una fermentación que usa materia prima (tal como rastrojo de maíz) para proporcionar nutrición a un organismo que produce una o más enzimas. De este modo, las plantas que producen las enzimas pueden servir en sí mismas como materia prima lignocelulósica y añadirse en la materia prima lignocelulósica .

Fermentación de azúcares Los azúcares fermentables pueden convertirse en productos de fermentación de valor añadido útiles, cuyos ejemplos no limitantes incluyen aminoácidos, vitaminas, agentes farmacéuticos, suplementos de pienso animal, agentes químicos especializados, materias primas químicas, plásticos, disolventes, combustibles, u otros polímeros orgánicos, ácido láctico, y etanol, incluyendo etanol carburante. En particular los azúcares pueden usarse como materias primas para la fermentación en agentes químicos, plásticos, tales como, por ejemplo ácido succínico y (bio) combustibles, incluyendo etanol, metanol, butanol, combustibles líquidos sintéticos y biogás .

Por ejemplo, en el método de la invención, una enzima o combinación de enzimas actúa sobre un sustrato lignocelulósico o biomasa vegetal, que sirve de materia prima, para convertir este sustrato complejo en azúcares simples y oligosacáridos para la producción de etanol u otros productos de fermentación útiles.

Los azúcares liberados de la biomasa pueden convertir en productos de fermentación útiles tal como un de aquellos que incluyen, aunque sin limitación, aminoácidos, vitaminas, agentes farmacéuticos, suplementos de pienso animal, agentes químicos especializados, materias primas químicas, plásticos, y etanol, incluyendo etanol carburante.

Por consiguiente, la invención proporciona un método para la preparación de un producto de fermentación, comprendiendo dicho método: a. la degradación de lignocelulosa usando un método descrito en este documento; y b. la fermentación del material resultante, para preparar de este modo un producto de fermentación.

La fermentación puede realizarse en condiciones aeróbicas o anaeróbicas . Preferiblemente, el proceso se realiza en condiciones micro-aerófilas o de oxígeno limitado.

Un proceso de fermentación anaeróbico se define en este documento como un proceso de fermentación ejecutado en ausencia de oxígeno o en que no se consume sustancialmente oxígeno, preferiblemente aproximadamente 5 o menos, aproximadamente 2,5 o menos o aproximadamente 1 mmol/l/h o menos, y en que las moléculas orgánicas sirven como donantes de electrones y también como aceptores de electrones.

Un proceso de fermentación de oxígeno limitado es un proceso en que el consumo de oxígeno está limitado por la transferencia de oxígeno del gas al líquido. El grado de limitación de oxígeno se determina por la cantidad y composición del flujo de gas entrante así como las propiedades reales de mezcla/transferencia de masa del equipo de fermentación usado. Preferiblemente, en un proceso en condiciones de oxígeno limitado, la tasa de consumo de oxígeno es de al menos aproximadamente 5,5, más preferiblemente de al menos aproximadamente 6 e incluso más preferiblemente de al menos aproximadamente 7 mmol/l/h.

Un método para la preparación de un producto de fermentación puede comprender opcionalmente la recuperación del producto de fermentación.

SSF La fermentación y sacarificación también pueden ejecutarse en modo de sacarificación y fermentación simultánea (SSF) . Una de las ventajas de este modo es la reducción de la inhibición de azúcar en hidrólisis enzimática (la inhibición de azúcar sobre celulasas se describe por Caminal B&B Vol XXVII Pág. 1282-1290) .

Productos de fermentación Los productos de fermentación que pueden producirse de acuerdo con la invención incluyen aminoácidos, vitaminas, agentes farmacéuticos, suplementos de pienso animal, agentes químicos especializados, materias primas químicas, plásticos, disolventes, combustibles, o otros polímeros orgánicos, ácido láctico, y etanol, incluyendo etanol carburante (se entiende que el término "etanol" incluye alcohol etílico o mezclas de alcohol etílico y agua) .

Productos de valor añadido específicos que pueden producirse por los métodos de la invención incluyen, aunque sin limitación, biocombustibles (incluyendo etanol y butanol y un biogás) ; ácido láctico; un plástico; un agente químico especializado; un ácido orgánico, incluyendo ácido cítrico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido itacónico y ácido maleico; ácido 3 -hidroxi-propiónico, ácido acrílico; ácido acético; 1, 3-propano-diol; etileno, glicerol; un disolvente; un suplemento de pienso animal; un agente farmacéutico, tal como un antibiótico ß-lactama o una cefalosporina; vitaminas; un. aminoácido, tal como lisina, metionina, triptófano, treonina, y ácido aspártico; una enzima industrial, tal como una proteasa, una celulasa, una amilasa, una glucanasa, una lactasa, una lipasa, una liasa, una oxidorreductasa, una transferasa o una xilanasa; y una materia prima química.

Biogás La invención también proporciona el uso de un polipéptido o composición descrita en este documento en un método para la preparación de biogás. Biogás típicamente se refiere a un gas producido por la descomposición biológica de materia orgánica, por ejemplo material que contiene carbohidrato no de almidón, en ausencia de oxígeno. El biogás se origina a partir de material biogénico y es un tipo de biocombustible . Un tipo de biogás se produce por digestión anaeróbica o fermentación de materiales biodegradable tales como biomasa, estiércol o aguas residuales, residuos urbanos, y cultivos energéticos. Este tipo de biogás está compuesto principalmente de metano y dióxido de carbono. El gas metano puede quemarse u oxidarse con oxígeno. El aire contiene un 21% de oxígeno. Esta liberación de energía permite que el biogás se use como combustible. El biogás puede usarse como combustible de bajo coste en cualquier país para cualquier propósito de calentamiento, tal como cocinar. También puede utilizarse en instalaciones modernas de tratamiento de residuos donde puede usarse para hacer funcionar cualquier tipo de motor térmico, para generar energía mecánica o eléctrica .

La primera etapa en la producción microbiana de biogás consta de la degradación enzimática de polímeros y sustratos complejos (por ejemplo carbohidrato no de almidón) . Por consiguiente, la invención proporciona un método para la preparación de un biogás en que se pone en contacto un sustrato que comprende carbohidrato no de almidón con un polipéptido o composición de la invención, para producir de este modo material fermentable que puede convertirse en un biogás por un organismo tal como un microorganismo. En dicho método, puede proporcionarse un polipéptido de la invención mediante un organismo, por ejemplo un microorganismo que expresa dicho polipéptido.

Uso de enzimas en productos alimenticios Los polipéptidos y composiciones de la invención pueden usarse en un método para procesar material vegetal para degradar o modificar los constituyentes de celulosa o hemicelulosa o sustancia péctica de las paredes celulares del material vegetal o fúngico. Dichos métodos pueden ser útiles en la preparación de productos alimenticios. Por consiguiente, la invención proporciona un método para preparar un producto alimenticio comprendiendo dicho método incorporar un polipéptido o composición de la invención durante la preparación del producto alimenticio.

La invención también proporciona un método para procesar un material vegetal comprendiendo dicho método poner en contacto el material vegetal con un polipéptido o composición de la invención para degradar o modificar la celulosa en el material (vegetal) . Preferiblemente, el material vegetal es una pulpa vegetal o extracto vegetal, tal como jugos.

Los materiales vegetales y que contienen celulosa/hemicelulosa/sustancia péctica incluyen pulpa vegetal, partes de plantas y extractos vegetales. En el contexto de esta invención un extracto de un material vegetal es cualquier sustancia que puede obtenerse de material vegetal por extracción (mecánica y/o química) , procesamiento o por otras técnicas de separación. El extracto puede ser jugo, néctar, base, o concentrados preparados a partir de los mismos . El material vegetal puede comprender u obtenerse de verduras, por ejemplo, zanahorias, apio, cebollas, legumbres o plantas leguminosas (soja, semilla de soja, guisantes) o frutos, por ejemplo, frutas de pepita o semilla (manzanas, peras, membrillo etc.), uvas, tomates, cítricos (naranja, limón, lima, mandarina) , melones, ciruelas, cerezas, grosellas negras, grosellas rojas, frambuesas, fresas, arándonos, piña y otros frutos tropicales, árboles y partes de los mismos (por ejemplo, polen, de pinos) , o cereal (avena, cebada, trigo, maíz, arroz) . El material (a hidrolizar) también puede ser residuos agrícolas, tales como pulpa de remolacha azucarera, mazorcas de maíz, paja del trigo, cascaras de nuez (molidas) , o materiales reciclables, por ejemplo papel (usado) .

Los polipéptidos de la invención por tanto pueden usarse para tratar material vegetal incluyendo pulpa vegetal y extractos vegetales. También pueden usarse para tratar productos alimenticios o ingredientes comestibles de productos alimenticios líquidos o sólidos, o usarse en la extracción de aceites vegetales, almidón o como espesante en alimentos .

Típicamente, los polipéptidos de la invención se usan como composición/preparación enzimática como se ha descrito anteriormente. La composición generalmente se añadirá a la pulpa vegetal que se puede obtener por, por ejemplo, procesamiento mecánico tal como trituración o molienda del material vegetal. La incubación de la composición con la planta típicamente se realizará durante un tiempo de 10 minutos a 5 horas, tal como de 30 minutos a 2 horas, preferiblemente durante aproximadamente 1 hora. La temperatura de procesamiento es preferiblemente de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 55 °C, por ejemplo, de aproximadamente 15°C a aproximadamente 25°C, óptimamente a aproximadamente 20 °C y pueden usarse de aproximadamente 10 g a aproximadamente 300 g, preferiblemente, de aproximadamente 30 g a aproximadamente 70 g, óptimamente aproximadamente 50 g de enzima por tonelada de material a tratar.

Todas las enzimas o sus composiciones usadas pueden añadirse secuencialmente o al mismo tiempo a la pulpa vegetal. Dependiendo de la composición de la preparación enzimática, el material vegetal primero puede macerarse (por ejemplo, a un puré) o licuarse. Usando los polipéptidos de la invención pueden mejorarse los parámetros de procesamiento tales como el rendimiento de la extracción, la viscosidad del extracto y/o la calidad del extracto.

Como alternativa, o además de lo anterior, un polipéptido de la invención puede añadirse al jugo sin procesar del prensado o licuado de la pulpa vegetal. El tratamiento del jugo sin procesar se realizará de una manera similar a la pulpa vegetal respecto a la dosificación, temperatura y tiempo de retención. De nuevo, pueden incluirse otras enzimas tales como las analizadas previamente. Las condiciones típicas de incubación son como las descritas en el párrafo previo.

Una vez se ha incubado el jugo sin procesar con los polipéptidos de la invención, después se centrifuga el jugo o (ultra) filtra para producir el producto final.

Después del tratamiento con el polipéptido de la invención, el producto (final) puede tratarse por calor, por ejemplo a aproximadamente 100 °C durante un tiempo de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 1 hora, en condiciones para inactivar parcial o completamente el o los polipéptidos de la invención.

También puede usarse una composición que contenga un polipéptido de la invención durante la preparación de purés de frutos o verduras .

En panadería, el polipéptido puede mejorar la estructura de la pasta, modificar su adherencia o flexibilidad, mejorar el volumen de hogaza y/o la estructura de la miga o conferir mejores características de textura tales como rotura, desmenuzamiento o calidad de la miga.

La presente invención por tanto se refiere a métodos para preparar una pasta o un producto alimenticio basado en cereales que comprende incorporar en la pasta un polipéptido o composición de la presente invención. Esto puede mejorar una o más propiedades de la pasta o el producto alimenticio basado en cereales obtenido de la pasta en relación a una pasta o un producto alimenticio basado en cereales en que no se ha incorporado el polipéptido.

La preparación del producto alimenticio basado en cereales de acuerdo con la invención puede comprender adicionalmente etapas conocidas en la técnica tales como hervir, secar, freír, cocer al vapor o cocer la pasta obtenida .

Los productos que están hechos a partir de una pasta que se hierve son, por ejemplo, fideos hervidos, guisos, los productos que están hechos a partir de pasta frita son, por ejemplo, rosquillas, buñuelos, fideos fritos, los productos que están hechos a partir de pasta cocida al vapor son, por ejemplo, bollo cocidos al vapor y fideos cocidos al vapor, los ejemplos de productos hechos a partir de pasta seca son pasta y fideos secos y los ejemplos de productos hechos a partir de pasta cocida son pan, galletas, tarta.

La expresión "propiedad mejorada" se define en este documento como cualquier propiedad de una pasta y/o un producto obtenido a partir de la pasta, particularmente un producto alimenticio basado en cereales, que está mejorara por la acción del polipéptido de acuerdo con la invención con relación a una pasta o producto en que no se ha incorporado el polipéptido de acuerdo con la invención. La propiedad mejorada puede incluir, aunque sin limitación, resistencia aumentada de la pasta, elasticidad aumentada de la pasta, estabilidad aumentada de la pasta, capacidad mejorada de mecanizado de la pasta, resistencia de protección mejorada de la pasta, adherencia reducida de la pasta, extensibilidad mejorada de la pasta, volumen aumentado del producto alimenticio basado en cereales, formación reducida de burbujas del producto alimenticio basado en cereales, estructura mejorada de la miga del producto cocido, suavidad mejorada del producto alimenticio basado en cereales, aroma mejorado del producto alimenticio basado en cereales, anti-endurecimiento mejorado del producto alimenticio basado en cereales. Las propiedades mejoradas relacionadas con productos basados en cereales tipo pasta y fideos son, por ejemplo, dureza mejorada, adherencia reducida, cohesión mejorada y pérdida reducida al cocinarse.

La propiedad mejorada puede determinarse por comparación de una pasta y/o un producto alimenticio basado en cereales preparado con y sin adición de un polipéptido de la presente invención. Las cualidades organolépticas pueden evaluarse usando procedimientos bien establecidos en la industria panadera, y pueden incluir, por ejemplo, el uso de un panel de catadores cualificados.

El término "pasta" se define en este documento como una mezcla de harina de cereales y otros ingredientes suficientemente firme para amasar o enrollar. Ejemplos de cereales son trigo, centeno, mies, maíz, cebada, arroz, grañones, alforfón y avena. Se pretende que trigo aquí y a partir de ahora abarque todas las especies conocidas del género Triticum, por ejemplo aestivum, durum y/o spelta. Ejemplos de otros ingredientes adecuados son: el polipéptido degradante de carbohidratos de acuerdo con la presente invención, enzimas adicionales, aditivos químicos y/o auxiliares de procesamiento. La pasta puede ser fresca, congelada, pre-cortada, o pre-cocida. La preparación de una pasta a partir de los ingredientes descritos anteriormente es bien conocida en la técnica y comprende mezclar dichos ingredientes y auxiliares de procesamiento y una o más etapas de moldeo y opcionalmente fermentación. La preparación de pasta congelada se describe por Kulp y Lorenz en Frozen and Refrigerated Doughs and Batters.

La expresión "producto alimenticio basado en cereales" se define en este documento como cualquier producto preparado a partir de una pasta, de carácter blando o crujiente. Ejemplos de productos alimenticios basados en cereales, sean de tipo blanco, ligero u oscuro, que pueden producirse ventajosamente por la presente invención son pan (en particular pan blando, integral o de centeno) , típicamente en forma de hogazas o panecillos, pan tipo baguette francés, pasta, fideos, rosquillas, bollos, tarta, pan pita, tortillas, tacos, tartas, panqueques, galletas, galletitas, pastas de hojaldre, pan cocido al vapor, y pan crujiente, y similares.

La expresión "producto cocido" se define en este documento como cualquier producto alimenticio basado en cereales preparado por cocción de la pasta.

Los polisacáridos no de almidón (NSP) pueden aumentar la viscosidad del alimento digerido que puede, a su vez, disminuir la disponibilidad de nutrientes y el rendimiento animal. El uso del polipéptido degradante de carbohidratos de la presente invención puede mejorar la utilización de fósforo así como los minerales catiónicos y polipéptidos durante la digestión animal.

Añadir nutrientes específicos a piensos mejora la digestión animal y de este modo reduce los costes del pienso. Actualmente se están usando un montón de aditivos de pienso y se están desarrollando continuamente nuevos conceptos . El uso de enzimas específicas como enzimas degradantes de carbohidratos no de almidón podría descomponer la fibra liberando energía así como aumentado la digestibilidad de las proteínas debido a una mejor accesibilidad de la proteína cuando la fibra se descompone. De este modo, el coste de los piensos podría descenderse y además los niveles de proteínas en el pienso también podrían reducirse.

Los polisacáridos no de almidón (NSP) también están presentes en casi todos los ingredientes de pienso de origen vegetal. Los NSP se utilizan muy mal y pueden, cuando se solubilizan, ejercer efectos adversos sobre la digestión. Las enzimas exógenas pueden contribuir a una mejor utilización de estos NSP y como consecuencia reducir cualquier efecto anti-nutricional. Las enzimas degradantes de carbohidratos no de almidón de la presente invención pueden usarse para este propósito en dietas basadas en cereales para aves de corral y, a un mejor grado, para cerdos y otras especies.

Un polipéptido/enzima degradante de carbohidratos no de almidón de la invención (de una composición que comprende el polipéptido/enzima de la invención) puede usarse en la industria de detergentes, por ejemplo para eliminar de las coladas los tintes basados en carbohidrato. Una composición detergente puede comprender un polipéptido/enzima de la invención y, además, una o más de una celulosa, una hemicelulasa, una pectinasa, una proteasa, una lipasa, una cutinasa, una amilasa o una carbohidrasa .

Uso de enzimas en composiciones detergentes Una composición detergente que comprende un polipéptido o composición de la invención puede, estar en cualquier forma conveniente, por ejemplo, una pasta, un gel, un polvo o un líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, típicamente conteniendo hasta aproximadamente un 70% de agua y de aproximadamente 0 a aproximadamente el 30% de disolvente orgánico o material no acuoso.

Dicha composición detergente puede, por ejemplo, formularse como una composición detergente de lavado a mano o a máquina que incluye una composición aditiva de lavado adecuada para el pretratamiento de telas teñidas y una composición suavizantes de las telas añadida al aclarado, o puede formularse como una composición detergente para su uso en operaciones generales de limpieza de superficies duras del hogar, o puede formularse para operaciones de lavado de platos a mano o a máquina.

En general, las propiedades de la enzima deben ser compatibles con el detergente seleccionado (por ejemplo, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y/o no enzimáticos, etc.) y la enzima o enzimas deben estar presentes en una cantidad eficaz.

Una composición detergente puede comprender un tensioactivo, por ejemplo un tensioactivo aniónico o no iónico, un adyuvante detergente o agente de formación de complejos, uno o más polímeros, un sistema blanqueante (por ejemplo una fuente de H202) o un estabilizador enzimático. Una composición detergente también puede comprender cualquier otro ingrediente convencional de detergentes tales como, por ejemplo, un acondicionador incluyendo una arcilla, un aumentado de espuma, un supresor de agua jabonosa, un agente anti-corrosión, un agente de eliminación de restos, un agente de redeposición de la suciedad, un colorante, un bactericida, un abrillantador óptico, un hidrótropo, un inhibidor de manchas o un perfume .

Uso de enzimas en procesamiento de papel y pulpa Un polipéptido o composición de la presente invención puede usarse en la industria del papel y la pulpa, entre otros en los procesos de blanqueado para potenciar el brillo de las pulpas blanqueadas mediante lo cual puede reducirse la cantidad de cloro usada en las fases de blanqueado, y para aumentar el refino de las pulpas en el proceso de papel reciclado (Eriksson, K. E. L. , Wood Science and Technology 24 (1990) : 79-101 ; Paice, et al., Biotechnol. and Bioeng. 32 (1988) :235-239 y Pommier et al., Tappi Journal (1989) :187-191). Además, un polipéptido o composición de la invención puede usarse para el tratamiento de pulpa lignocelulósica para mejorar la capacidad blanqueante de la misma. De este modo puede reducirse la cantidad de cloro necesaria para obtener un blanqueado satisfactorio de la pulpa.

Un polipéptido o composición de la invención puede usarse en un método para reducir la tasa a la que telas que contienen celulosa llegan a ponerse ásperas o para reducir la aspereza de telas que contienen celulosa, comprendiendo el método tratar telas que contienen celulosa con un polipéptido o composición como se ha descrito anteriormente. La presente invención se refiere adicionalmente a un método que proporciona aclaramiento del color de telas coloreadas que contienen celulosa, comprendiendo el método tratar telas coloreadas que contienen celulosa con un polipéptido o composición como se ha descrito anteriormente, y un método para proporcionar una variación localizada en el color de telas coloreadas que contienen celulosa, comprendiendo el método tratar telas coloreadas que contienen celulosa con un polipéptido o composición como se ha descrito anteriormente. Los métodos de la invención pueden realizarse tratando telas que contienen celulosa durante el lavado. Sin embargo, si se desea, el tratamiento de las telas también puede realizarse durante el remojado o aclarado o simplemente añadiendo el polipéptido o composición como se ha descrito anteriormente al agua en que se sumergirán las telas.

Otros usos de la enzima Además, un polipéptido o composición de la presente invención también puede usarse en formulación antibacteriana así como en productos farmacéuticos tales como pastillas para la garganta, dentífricos, y enjuagues bucales.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención: Ejemplos Materiales y métodos Procedimientos de ADN Se realizaron procedimientos convencionales de ADN como se describe en otra parte (Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) salvo que se indique otra cosa. El ADN se amplificó usando la enzima con actividad de corrección polimerasa Physion (Finnzymes) . Las enzimas de restricción fueron de Invitrogen o New England Biolabs .

Preparación de muestras de celulasa Se expresaron celulasas originarias de Talaromyces emersonii en Aspergillus niger. Se produjeron filtrados concentrados de las enzimas como se describe en el documento O2004/030468. Después de cultivar Aspergillus niger que contiene los plasmidos de expresión apropiados, se prepararon sobrenadantes sin células por centrifugación del caldo de fermentación a 5000 x g durante 30 minutos a 4°C. Opcionalmente el sobrenadante puede ajustarse a pH=5 con KOH 4 N y filtrarse a esterilidad sobre un filtro de 2 µp? (de cuello de botella) con succión para retirar cualquier material fúngico. Además, los sobrenadantes pueden filtrarse adicionalmente sobre un filtro de microfibra de vidrio GF/A Whatmann (150 mm de diámetro) para retirar cualquier sólido. Los sobrenadantes se ultrafiltraron, concentraron, y almacenaron hasta su' uso a 4°C o se congelaron a -20°C.

Método para la determinación de proteína total El método fue una combinación de precipitación de proteína usando ácido tricloroacético (TCA) para retirar sustancias molestas y permitir la determinación de la concentración de proteína con la reacción colorimétrica de Biure . En la reacción de Biuret, un ión cobre (II) se reduce a cobre (I) , que forma un complejo con los nitrógenos y carbonos de los enlaces peptídicos en una solución alcalina. Un color violeta indica la presencia de proteínas. La intensidad del color, y por tanto la absorción a 546 nm, es directamente proporcional a la concentración de proteína, de acuerdo con la ley de Beer-Lambert . La normalización se realizó usando BSA (albúmina sérica bovina) y el contenido de proteína se expresó en g de proteína como equivalente de BSA/1 o mg de proteína como equivalente de BSA/ml . El contenido de proteína se calculó usando protocolos convencionales de cálculo conocidos en la técnica, representando la OD5 6 frente a la concentración de muestras con concentración conocida, seguido del cálculo de la concentración de las muestras desconocidas usando la ecuación generada a partir de la curva de calibrado.

Preparación de sustrato de paja del trigo pretratada y lavada Puede obtenerse paja del trigo pretratada con ácido diluido como se describe en Linde, M. et al, Biomass and Bioenergy 32 (2008) , 326-332 y puede usarse el equipo descrito en Schell, D.J., Applied Biochemistry and Biotechnology (2003), vol . 105-108, pág. 69-85. La paja del trigo pretratada se 'lavó con agua hasta que la solución con paja del trigo fue de pH 6,0 o superior. El agua de lavado se retiró por filtración.

Hidrólisis de celulosa Se realizaron incubaciones de combinaciones enzimáticas sobre soluciones de sustrato de materia seca (dm) de paja del trigo pretratada (PWS) con ácido y lavada al 2% en tampón acetato sódico 50 mM pH 4,5, a escala de 10 mi. Las combinaciones enzimáticas se añadieron a dosis fijas de proteína por gramo de materia seca de sustrato. Las muestras se recogieron a tiempo, hasta 24 horas de incubación a 65 °C. Las reacciones se terminaron en el momento dado, sedimentando por centrifugación el residuo, pipeteando el sobrenadante y congelando las muestras hasta su análisis.

El análisis de la cantidad de glucosa liberada se realizó usando RMN de flujo. Los espectros de XH R N se registraron en un sistema de RMN Bruker AVANCE II BEST NMR manejado a una frecuencia de protones de 500 MHz y temperatura de sonda de 27 °C.

Ejemplo 1 1.1. Construcción de plásmidos de expresión Se clonó la secuencia que tiene la SEC ID N° 1 en el vector pGBTOP (Fig. 1) usando los sitios EcoRI y SnaBI, que comprenden el promotor y la secuencia terminadora de la glucoamilasa . La parte de E. coli se retiró por digestión con Notl antes de la transformación de A. niger CBS 513.88. 1.2. Transformación de A. niger A. niger WT-1: Esta cepa de A. niger es CBS513.88 que comprende deleciones de los genes que codifican la glucoamilasa (glaA) , la amilasa. fúngica y la amilasa ácida. A. niger WT 1 se construye usando el procedimiento "SIN MARCADOR GÉNICO" descrito en el documento EP 0 635 574 Bl.

Las construcciones de expresión se introdujeron por co-transformación en la cepa A. niger WT-1 de acuerdo con el método descrito por Tilburn, J. et al. (1983) Gene 26, 205-221 y Kelly, J. & Hynes, M. (1985) EMBO J. , 4, 475-479 con las siguientes modificaciones: - Las esporas se germinan y cultivan durante 16 horas a 30 grados Celsius en un matraz de agitación colocado en un agitado rotatorio a 300 rpm en medio mínimo de Aspergillus (100 mi). El medio mínimo de Aspergillus contiene por litro: 6 g de NaN03, 0,52 g de KC1, 1,52 g de KH2P04, 1,12 mi de OH 4 M, 0,52 g de MgS04.7H20, 10 g de glucosa, 1 g de casaminoácidos , 22 mg de ZnS04.7H20, 11 mg de H3B03, 5 mg de FeS04.7H20, 1,7 mg de CoCl2.6H20, 1,6 mg de CuS04.5H20, 5 mg de MnCl2.2H20, 1,5 mg de Na2Mo04.2H20, 50 mg de EDTA, 2 mg de riboflavina, 2 mg de tiamina-HCl, 2 mg de nicotinamida, 1 mg de piridoxina-HCl , 0,2 mg de ácido pantoténico, 4 g de biotina, 10 mi de solución de penicilina (5000 Ul/ml) y estreptomicina (5000 UG/ml) (Gibco) .

Se usa Novozym 234™ (Novo Industries) en lugar de helicasa se usa para la preparación de protoplastos; Después de la formación de protoplastos (60-90 minutos), se añade tampón KC (KC1 0,8 M, ácido cítrico 9,5 mM, pH 6,2) a un volumen final de 45 mi, se centrifuga la suspensión de protoplastos durante 10 minutos a 3000 rpm a 4 grados Celsius en un rotor de cubo de balanceo. Los protoplastos se resuspenden en 20 mi de tampón KC y posteriormente se añaden 25 mi de tampón STC (sorbitol 1,2 M, Tris-HCl 10 mM pH 7,5, CaCl2 50 mM) . La suspensión de protoplastos se centrifuga durante 10 minutos a 3000 rpm a 4 grados Celsius en un rotor de cubo de balanceo, se lava en tampón STC y se resuspende en tampón STC a una concentración de 10E8 protoplastos/ml ; - A 200 microlitros de la suspensión de protoplastos, se añade el fragmento de ADN, disuelto en 10 microlitros de tampón TE (Tris-HCl 10 mM pH 7,5, EDTA 0,1 mM) y 100 microlitros de solución de PEG (PEG 4000 (Merck) al 20%, sorbitol 0,8 M, Tris-HCl 10 mM pH 7,5, CaCl250 mM) ; Después de incubación de la suspensión de ADN-protoplastos durante 10 minutos a temperatura ambiente, se añaden 1,5 mi de Solución de PEG (PEG 4000 (Merck) al 60%, Tris-HCl 10 mM pH 7,5, CaCl2 50 mM) lentamente, con mezcla repetida de los tubos. Después de incubación durante 20 minutos a temperatura ambiente, las suspensiones se diluyen con 5 mi de sorbitol 1,2 M, se mezclan por inversión y se centrifugan durante 10 minutos a 4000 rpm a temperatura ambiente. Los protoplastos se resuspenden suavemente en 1 mi de sorbitol 1,2 M y se siembran en placas en medio de regeneración selectivo sólido que consta de medio mínimo de Aspergillus sin riboflavina, tiamina.HCl, nicotinamida, piridoxina, ácido pantoténico, biotina, casaminoácidos y glucosa. En caso de selección con acetamida, el medio contiene acetamida 10 mM como única fuente de nitrógeno y sacarosa 1 M como agente osmótico y fuente de C. Como alternativa, los protoplastos se siembran en placa en PDA (Agar Dextrosa de patada, Oxoid) suplementadó con 1-50 microgramos/ml de fleomicina y sacarosa 1 M como agente osmótico. Las placas de regeneración se solidifican usando agar al 2% (agar N° 1, Oxoid Lll) . Después de incubación durante 6-10 días a 30 grados Celsius, las conidiosporas de los transformantes se transfieren a placas que .constan de medio selectivo de Aspergillus (medio mínimo que contiene acetamida como única fuente de nitrógeno en el caso de selección con acetamida o PDA suplementado con 1-50 microgramos/ml de fleomicina en el caso de selección con fleomicina) con glucosa al 2% y agarosa al 1,5% (Invitrogen) y se incubaron durante 5-10 días a 30 grados Celsius. Los transformantes individuales se aislan y esta etapa de purificación selectiva se repite una vez después de lo cual se almacenan los transformantes purificados.

Después de la transformación, los transformantes se seleccionaron en medio que comprendía acetamida como única fuente de nitrógeno y se purificaron las colonias . Se estimaron los números de copias por PCR cuantitativa y se seleccionaron los transformantes con bajos y altos números de copias. Los transformantes de alto número de copias se cultivaron en matraces de agitación en 100 mi de medio CSM-MES como se describe en el documento EP 635 574 a 34 °C a 170 rpm en un agitador incubador usando un matraz de agitación de 500 mi con tabiques. Después de 3 y 4 días de fermentación, se recogieron las muestras de sobrenadante para determinar la expresión por SDS-PAGE. 1.3 Contenido de proteínas Los sobrenadantes ultrafiltrados y concentrados de las fermentaciones en matraz de agitación de los transformantes que expresan la proteína de actividad no caracterizada (TEMER01170) se analizaron para el contenido de proteínas. El contenido de proteínas se determinó en 5 mg de proteína como equivalente de BSA/ml .

Ejemplo 2 2.1 Preparación de muestras de celulasa Se prepararon una proteína potenciada de celulasa, TEMER07589 (como se describe en la solicitud de patente en trámite junto con la presente DSM Caso 27666, presentada el mismo día que esta solicitud) y dos exoglucanasas, que son CBHI, como se describe en la solicitud de patente EP09158739,4 y CBHII (como se describe en la solicitud de patente en trámite junto con la presente DSM Caso 27829, presentada el mismo día que esta solicitud) respectivamente, y una beta-glucosidasa conocida a partir de Murray et al., Protein expression and Purification, 2004, 38, 248-257·, todas de Talaromyces emersonii , como se ha descrito en el Ejemplo 1 para TEMER01170. Los contenidos de proteínas de estas muestras se determinaron y establecieron en intervalos de 20 a 60 mg de proteína como equivalente de BSA/ml. 2.2 Hidrólisis de celulosa de una mezcla de celulasa con suplementación de TEMER1170 Se mezclaron las 4 proteínas celulolíticas , que son beta-glucosidasa (BG) , CBHI, CBHII y proteína potenciadora de celulasa TEMER07589, en cantidades relativas del 9% de BG, 37% de TEMER07589, 30% de CBHI y 24% de CBHII, de las proteínas totales en la mezcla. Esta mezcla se aplicó en hidrólisis extendida a escala de 10 mi con paja del trigo DM pretratada al 2%, a pH 4,5 y 65 °C, a una dosis de proteína de 2,5 o 5 mg de proteína como equivalente de BSA por gramo de materia seca de paja del trigo pretratada. La mezcla también se aplicó a estas mismas dosis de proteína en incubaciones diferentes, en que se añadieron 2 mg de proteína TEMER01170 como equivalente de BSA por gramo de materia seca de paja del trigo pretratada. Como comparación, también se incubó Filtrase® NL, un producto clásico de celulasa de Talaro yces emersonii , a la misma concentración de sustrato, pH y temperatura, también a una dosis de proteína de 2,5 ó 5 mg de proteína como equivalente de BSA por gramo de materia seca de paja del trigo pretratada, con y sin adición de 2 mg de proteína TEMER01170 como equivalente de BSA por gramo de materia seca de paja del trigo pretratada. Las incubaciones duraron 24 horas y se tomaron muestras en varios intervalos de tiempo. Las muestras se retiraron por centrifugación, y se congeló el sobrenadante hasta su análisis por R N. La liberación de glucosa en el tiempo se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1. Liberación de glucosa, expresada como mmol/1, durante la incubación de paja del trigo DM pretratada y lavada al 2%, a pH 4,5 y 65 °C, por una mezcla de 4 enzimas (=4E) que contenía 1 BG, 1 CBHI, 1 CBHII y 1 proteína potenciadora de celulasa (TEMER07589) , a cantidades relativas del 9%, 30%, 24% y 37% de proteína total de la mezcla, y Filtrase® NL, a ambas dosis de proteína de 2,5 y 5 mg por g de paja del trigo DM pretratada, con o sin adición de 2 mg de proteína de actividad no caracterizada (TEMER01170) por g de paja del trigo DM pretratada.

A partir de este experimento, queda claro que una baja dosis de una mezcla enzimática celulolítica, la adición de la proteína de actividad no caracterizada TEMER01170, provoca una liberación aumentada de glucosa en 24 h de tiempo.

Claims (25)

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES

1. - Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID N° 2 o una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID N °1, o un polipéptido variante o polinucleótido variante de las mismas, caracterizado porque el polipéptido variante tiene al menos un 73% de identidad de secuencia con la secuencia expuesta en la SEC ID N° 2 o el polinucleótido variante codifica un polipéptido que tiene al menos un 73% de identidad de secuencia con la secuencia expuesta en la SEC ID N° 2.

2. - Un polipéptido según la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido tiene actividad degradante de carbohidratos .

3. - Un polinucleótido que comprende: (a) la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID N° 1; o (b) una secuencia de nucleótidos que híbrida selectivamente con un polinucleótido que es el complemento inverso de la SEC ID N° 1; o (c) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID N° 1; o (d) un fragmento que es de al menos aproximadamente 100 nucleótidos de longitud de una secuencia de nucleótidos definida en (a) , (b) o (c) que es de al menos aproximadamente 100 nucleótidos de longitud; o (e) una secuencia que está degenerada como resultado del código genético de una secuencia definida en uno cualquiera de (a) , (b) , (c) o (d) ; o (f) una secuencia de nucleótidos que es el com lemento inverso de una secuencia de nucleótidos definida en (a) , (b) , (c) , (d) o (e) .

4. - Un polinucleótido según la reivindicación 3 que codifica un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 ó 2.

5. - Un polinucleótido según una de las reivindicaciones 3 ó 4 que es una secuencia de ADN.

6. - Una construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

7. - Una construcción de ácido nucleico según la reivindicación 6, caracterizada porque el contenido de GC es del 56% o más, del 58% o más, o del 58-65%.

8. - Un vector que incorpora una secuencia polinucleotídica según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

9. - Una célula que comprende un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 ó 2, un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, una construcción de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 6 ó 7 o un vector según la reivindicación 8.

10. - Una célula según la reivindicación 9, caracterizada porque la célula es una célula eucariota.

11. - Una célula según la reivindicación 10 caracterizada porque la célula es una célula fúngica.

12. - Una célula según la reivindicación 11 caracterizada porque la célula fúngica se selecciona entre el grupo compuesto por los géneros Aspergillus, Trichoderma/Hypocrea, Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium, Neurospora, Thermoascus, Myceliophtora, Sporotrichum, Thielavia, Chryospórium, Fusarium, Humicola, Neurospora y Talaromyces .

13.- Una célula según la reivindicación 12, caracterizada porque la célula fúngica es de la especie Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus nidulans, o Aspergillus niger.

14. - Una célula según cualquiera de las reivindicaciones 9-13, caracterizada porque uno o más genes están delecionados, eliminados o alterados por completo o en parte, caracterizada porque opcionalmente el gen codifica una proteasa.

15. - Una planta transgénica o parte de la misma que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 3-5, una construcción de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 6 ó 7, un vector según la reivindicación 8 o una célula según cualquiera de las reivindicaciones 9-14, caracterizada porque opcionalmente la planta es una planta de maíz, una planta de sorgo, una planta de tomate, una planta de trigo, una planta oleaginosa, una planta de colza, una planta de soja, una planta de cebada, una hierba, o una planta de tabaco; o una planta de los géneros Anacardium, Arachis, ragus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, ferae, Cucumis, Cucúrbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Ocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, , Lycopersicon, Malus, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannisetum, Persea, eolus, Pistachio, Pisum, Pirus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Sécale, Senecio, Sinapis, Sorghum, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna o Zea.

16. - Un método para la preparación de un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 ó 2, que tiene actividad degradante de material carbohidrato y/o hidrolizante de carbohidratos, comprendiendo dicho método cultivar una célula según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 en condiciones que permitan la expresión de dicho polipéptido y, opcionalmente , recuperar el polipéptido expresado.

17. - Una composición que comprende: (i) un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 ó 2 y; (ii) una celulasa y/o una hemicelulasa y/o una pectinasa y/o un polipéptido que pertenece a la familia GH61.

18. - Una composición según la reivindicación 17, caracterizada porque la celulasa es un celobiohidrolasa, celobiohidrolasa I, celobiohidrolasa II, una e???-ß-1,4-glucanasa, una ß-glucosidasa o una ß- ( 1 , 3 ) ( 1 , 4 ) -glucanasa .

19. - Una composición según una de las reivindicaciones 17 ó 18, caracterizada porqué la hemicelulasa es una endoxilanasa, una ß-xilosidasa, una a-L-arabinofuranosidasa, una a-D-glucuronidasa, una acetil xilano esterasa, una feruloil esterasa, una cumaroil esterasa, una -galactosidasa, una ß-galactosidasa, una ß-mananasa o una ß-manosidasa .

20. - Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, caracterizada porque la pectinasa es una endo poligalacturonasa, una pectina metil esterasa, una endo-galactanasa, una beta galactosidasa, una pectina acetil esterasa, una endo-pectina liasa, una pectato liasa, alfa ramnosidasa, una exo-galacturonasa, una expoligalacturonato liasa, una ramnogalacturonano hidrolasa, una ramnogalacturonano liasa, una ramnogalacturonano acetil esterasa, una ramnogalacturonano galacturonohidrolasa, una xilogalacturonasa, una alfa-arabinofuranosidasa o una endo-arabinanasa .

21.- Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20 que comprende una ligninasa, una expansina, un polipéptido tipo . expansina, una swollenina o el producto polipeptídico de un gen que codifica una proteína integrante de celulosa o una proteína inducida por celulosa.

22.- Un método para el tratamiento de un sustrato que comprende material carbohidrato, opcionalmente un material vegetal, comprendiendo dicho método poner en contacto el sustrato con un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 ó 2 y/o una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21.

23.- Un método según la reivindicación 22, caracterizado porque el sustrato es un material vegetal y el material vegetal se proporciona en forma de una planta, una pulpa vegetal, un extracto vegetal, un producto alimenticio o ingrediente derivado del mismo o una tela, textil o artículo de ropa que comprende un material vegetal .

24. - Un método según una de las reivindicaciones 22 y/o 23, caracterizado porque el tratamiento comprende la degradación y/o modificación de celulosa y/o hemicelulosa y/o una sustancia péctica.

25. - Uso de un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 ó 2 y/o una composición según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21 para producir azúcar a partir de un material lignocelulósico .