EA022096B1

EA022096B1 - Соединения, подходящие для ингибирования chk1

Info

Publication number: EA022096B1
Application number: EA201390499A
Authority: EA
Inventors: Саджан Джосеф; Сусанта Самадждар
Original assignee: Эли Лилли Энд Компани
Priority date: 2010-11-08
Filing date: 2011-11-01
Publication date: 2015-10-30
Also published as: ES2541414T3; EP2638033A1; HRP20150530T1; EP2638033B1; KR101533166B1; ME02119B; WO2012064548A1; EA201390499A1; CA2816944A1; KR20130099146A; JP5792316B2; JP2013541586A; US9067920B2; AU2011326230A1; BR112013010009A2; AR083575A1; CN103180311B; TWI501956B; CA2816944C; TW201305138A

Abstract

В настоящем изобретении предложено аминопиразольное соединение, или его фармацевтически приемлемая соль, которое ингибирует Chk1 и подходит для лечения рака.

Description

Настоящее изобретение относится к аминопиразольному соединению, или его фармацевтически приемлемой соли, которое ингибирует СЬк1 и подходит для лечения раковых заболеваний, характеризующихся нарушениями репликации дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), сегрегации хромосом и/или делении клеток.

СЬк1 представляет собой протеинкиназу, которая расположена ниже А(ш и/или А(г в пути сигнальной трансакции контрольной точки повреждения ДНК В клетках млекопитающих СЬк1 фосфорилируется в ответ на действие агентов, которые вызывают повреждения ДНК, включая ионизирующее излучение (ИИ), ультрафиолетовое (УФ) излучение и гидроксимочевину Указанное фосфорилирование, активирующее СЬк1 в клетках млекопитающих, зависит от А(г СЬк1 участвует в А(г-зависимом контроле повреждений ДНК, приводя к остановке клеточного цикла в фазах 8 и О2М СЬк1 фосфорилирует и инактивирует Сбс25А -фосфатазу двойной специфичности, которая обычно дефосфорилирует циклин Е/Сбк2 и тем самым останавливает клеточный цикл в 8-фазе. СЬк1 также фосфорилирует и инактивирует Сбс25С фосфатазу двойной специфичности, которая дефосфорилирует циклин В/Сбс2 (также известный как Сбк1) и тем самым останавливает клеточный цикл на границе 02 и митоза (Ритай е( а1., 8с1епсе, 277 1495-7, 1997). В обоих случаях регуляция активности Сбк приводит к остановке клеточного цикла и предотвращает митоз клеток при наличии повреждения ДНК или нереплицированной ДНК.

Сообщалось о различных ингибиторах СЬк1. Кроме того, в ГСО 2005/121121 предложены конкретные аминопиразолы, рассматриваемые в качестве модуляторов метаболизма глюкозы.

Тем не менее, сохраняется потребность в ингибиторах СЬк1, являющихся высокоактивными ингибиторами контрольных точек клеточного цикла и способных эффективно действовать в качестве усилителей ДНК-повреждающих агентов. В настоящем изобретении предложены соединения, являющиеся высокоактивными ингибиторами СЬк1, которые могут оказывать положительный эффект при лечении рака. Указанные соединения активно предотвращают опосредованную СЬк1 остановку клеточного цикла, вызванную введением ДНК-повреждающих агентов в тканевую культуру и ίη νίνο. Кроме того, соединения согласно настоящему изобретению обеспечивают ингибирование СЬк2, которое может иметь благоприятный эффект при лечении рака. Кроме того, соединения согласно настоящему изобретению ингибируют пролиферацию раковых клеток за счет механизма, зависимого от ингибирования СЬк1. Указанные новые соединения могут решить проблему безопасного и эффективного способа лечения рака.

В настоящем изобретении предложено соединение, которое представляет собой (К)-[5-(2-метокси6-метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил]-[6-(пиперидин-3-илокси)пиразин-2-ил]амин или его фармацевтически приемлемую соль. Предпочтительными вариантами реализации являются (К)-[5-(2-метокси-6метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил]-[6-(пиперидин-3-илокси)пиразин-2-ил]амин, метансульфокислая соль (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил]-[6-(пиперидин-3-илокси)пиразин-2ил]амина, уксуснокислая соль (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил]-[6-(пиперидин3-илокси)пиразин-2-ил]амина, гемиоксалат (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил][6-(пиперидин-3-илокси)пиразин-2-ил]амина и гемисукцинат (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)2Н-пиразол-3-ил]-[6-(пиперидин-3-илокси)пиразин-2-ил]амина.

В качестве конкретного варианта реализации в настоящем изобретении предложено соединение, которое представляет собой (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил]-[6-(пиперидин-3илокси)пиразин-2-ил]амин.

В настоящем изобретении предложены метансульфокислые соли, уксуснокислые соли, а также гемиоксалаты и гемисукцинаты (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил]-[6-(пиперидин3-илокси)пиразин-2-ил] амина.

Другой вариант реализации представляет собой гидрат (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)2Н-пиразол-3-ил]-[6-(пиперидин-3-илокси)пиразин-2-ил]амина.

В настоящем изобретении предложен гидрат (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол3-ил]-[6-(пиперидин-3-илокси)пиразин-2-ил]амина в кристаллической форме.

В настоящем изобретении также предложен гидрат (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Нпиразол-3-ил]-[6-(пиперидин-3-илокси)пиразин-2-ил]амина в кристаллической форме, характеризующийся порошковой рентгеновской дифрактограммой, имеющей пик 2θ±0,2 при 5,17 в комбинации с одним или более пиками, выбранными из группы, состоящей из 15,73, 17,71 и 20,12.

В настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая (К)-[5-(2метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил]-[6-(пиперидин-3-илокси)пиразин-2-ил]амин или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель.

В настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая (К)-[5-(2метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил]-[6-(пиперидин-3-илокси)пиразин-2-ил]амин или его фармацевтически приемлемую соль совместно с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем и, возможно, с другими терапевтическими ингредиентами.

В настоящем изобретении предложено применение (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Нпиразол-3-ил]-[6-(пиперидин-3-илокси)пиразин-2-ил]амина или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения рака. В дополнение, в настоящем изобретении также

- 1 022096 предложено применение (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил]-[6-(пиперидин-3илокси)пиразин-2-ил]амина или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения рака, где указанное лечение включает комбинированную терапию с применением ионизирующего излучения. Кроме того, в настоящем изобретении предложено применение (К)-[5-(2метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил]-[6-(пиперидин-3-илокси)пиразин-2-ил]амина или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения рака при помощи комбинированной терапии, где указанная комбинированная терапия включает введение указанного лекарственного средства и введение одного или более химиотерапевтических агентов одному пациенту.

В настоящем изобретении предложен (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил][6-(пиперидин-3-илокси)пиразин-2-ил]амин или его фармацевтически приемлемая соль для применения в терапии. В дополнение, в настоящем изобретении также предложены (К)-[5-(2-метокси-6метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил]-[6-(пиперидин-3-илокси)пиразин-2-ил]амин или его фармацевтически приемлемая соль и ионизирующее излучение для применения в терапии. Кроме того, в настоящем изобретении предложены (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил]-16-(пиперидин-3илокси)пиразин-2-ил]амин или его фармацевтически приемлемая соль и один или более химиотерапевтических агентов для применения в терапии.

В настоящем изобретении предложен (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил][6-(пиперидин-3-илокси)пиразин-2-ил]амин или его фармацевтически приемлемая соль для применения для лечения рака. В дополнение, в настоящем изобретении также предложены (К)-[5-(2-метокси-6метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил]-[6-(пиперидин-3-илокси)пиразин-2-ил]амин или его фармацевтически приемлемая соль и ионизирующее излучение для применения для лечения рака. Кроме того, в настоящем изобретении предложены (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил]-[6(пиперидин-3-илокси)пиразин-2-ил]амин или его фармацевтически приемлемая соль и один или более химиотерапевтических агентов для применения для лечения рака.

В настоящем изобретении предложено применение (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Нпиразол-3-ил]-[6-(пиперидин-3-илокси)пиразин-2-ил]амина или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения рака, причем указанное лекарственное средство необходимо вводить одновременно, раздельно или последовательно с ионизирующим излучением.

В настоящем изобретении предложено применение (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Нпиразол-3-ил]-[6-(пиперидин-3-илокси)пиразин-2-ил]амина или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения рака, прчем указанное лекарственное средство также содержит один или более химиотерапевтических агентов, или его необходимо вводить одновременно, раздельно или последовательно с одним или более химиотерапевтическими агентами.

В настоящем изобретении предложен (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил][6-(пиперидин-3-илокси)пиразин-2-ил]амин или его фармацевтически приемлемая соль для одновременного, раздельного или последовательного применения в комбинации с ионизирующим излучением для лечения рака.

В настоящем изобретении предложен (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил][6-(пиперидин-3-илокси)пиразин-2-ил]амин или его фармацевтически приемлемая соль для одновременного, раздельного или последовательно применения в комбинации с одним или более химиотерапевтическими агентами для лечения рака.

Кроме того, в настоящем изобретении предложены предпочтительные варианты реализации применений, описанных в настоящей заявке, в которых один или более химиотерапевтических агентов выбраны из группы, состоящей из 5-фторурацила, гидроксимочевины, гемцитабина, метотрексата, пеметрекседа, доксорубицина, этопозида, цисплатина и таксола. В дополнение, в настоящем изобретении предложены более предпочтительные варианты реализации применений, описанных в настоящей заявке, в которых два химиотерапевтических агента выбраны из группы, состоящей из 5-фторурацила. гидроксимочевины, гемцитабина, метотрексата, пеметрекседа, доксорубицина, этопозида, цисплатина и таксола. Также в настоящем изобретении предложены еще более предпочтительные варианты реализации применений, описанных в настоящей заявке, в которых химиотерапевтический агент выбран из группы, состоящей из 5-фторурацила, гидроксимочевины, гемцитабина, метотрексата, пеметрекседа, доксорубицина, этопозида, цисплатина и таксола. Предпочтительные варианты реализации применений, описанных в настоящей заявке, направлены на раковые заболевания, выбранные из группы, состоящей из рака мочевого пузыря, рака толстой кишки, рака желудка, рака печени, рака легкого, рака молочной железы, меланомы, рака яичников, рака поджелудочной железы, мезотелиомы, рака почки и рака матки.

Следует понимать, что используемые выше и далее в описании изобретения следующие термины, если не указано иное, имеют следующие значения:

Фармацевтически приемлемая соль или фармацевтически приемлемые соли относятся к относительно нетоксичным неорганическим и органическим солям соединений согласно настоящему изобретению.

Соединения согласно настоящему изобретению способны взаимодействовать, например, с рядом неорганических и органических кислот, с образованием фармацевтически приемлемых солей. Указанные

- 2 022096 фармацевтически приемлемые соли и общие способы их получения хорошо известны в данной области техники. См., например, Р. 81аЬ1 е! а1., НапйЬоок οί РЬагшасеийса1 8а11з Ргорегйез, 8е1еейои, апй Изе, (УСНАЛУйсу-УСН. 2002), δ. М. Вегде е! а1., Рйагшасеийса1 8а11з, 1оигпа1 оГ Рйагшасеийса1 8с1епсез, Уо1 66, Ыо 1, 1апиагу 1977.

Соединения согласно настоящему изобретению предпочтительно получают в виде фармацевтических композиций с применением одного или более фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или наполнителей и вводят при помощи различных способов. Предпочтительно такие композиции предназначены для перорального, подкожного или внутривенного введения. Такие фармацевтические композиции и способы их получения хорошо известны в данной области техники. См., например, Ретшд!оп Тйе 8аепсе апй Ргасйсе оГ Рйагшасу (А. Сеииаго е! а1., ейз, 2181 ей, Маск РиЬйзЫпд Со, 2005).

Подразумевается, что термины лечение, лечить, излечение и т.д. включают замедление или обращение вспять прогрессирования нарушения. Указанные термины также включают облегчение, улучшение, смягчение, устранение или снижение тяжести одного или более симптомов нарушения или состояния, даже если указанное нарушение или состояние фактически не устраняется и даже если прогрессирование указанного нарушения или состояния как таковое не замедляется или не обращается вспять.

«Терапевтически эффективное количество» или «эффективное количество» означает количество соединения или его фармацевтически приемлемой соли согласно настоящему изобретению или фармацевтической композиции, содержащей соединение или его фармацевтически приемлемую соль, согласно настоящему изобретению, которое будет вызывать биологический или медицинского ответа или желаемое терапевтическое действие на ткань, систему организма, животное, млекопитающее или человека, которого добиваются исследователи, ветеринары, врачи или другие клиницисты.

Фактическое вводимое количество соединения согласно настоящему изобретению будет определяться лечащим врачом с учетом соответствующих условий, включая состояние, требующее лечения, выбранный способ введения, фактическое вводимое соединение согласно настоящему изобретению, возраст, массу тела и реакцию индивидуального пациента и тяжесть симптомов пациента. Ежедневные дозировки, как правило, находятся в диапазоне от примерно 0,1 до примерно 10 мг/кг массы тела. В некоторых случаях дозировки ниже нижнего предела вышеуказанного диапазона могут быть более чем достаточными, в то же время в других случаях необходимо применять дозы, превышающие верхнюю границу указанного диапазона.

Соединения согласно настоящему изобретению можно получать при помощи ряда способов, известных в данной области техники, а также описанных ниже в примерах получения и примерах. Конкретные стадии синтеза каждого описанного способа можно объединять различным образом для получения соединений согласно настоящему изобретению.

Реагенты и исходные вещества, как правило, легкодоступны специалистам в данной области техники. Другие можно получить при помощи традиционных способов органической химии и химии гетероциклических соединений; способов, аналогичных примерам синтеза известных соединений со схожей структурой, и способов, описанных в последующих примерах получения и примерах, включая любые новые способы. Приведенные ниже примеры получения и примеры предложены для подробной дополнительной иллюстрации настоящего изобретения и представляют собой типовые способы синтеза указанных соединений. Названия соединений согласно настоящему изобретению получали в Ιδίδ Эгач 2.5 8Р2 при помощи встроенного инструмента Аи!опот.

Используемые в настоящем описании следующие термины имеют указанные значения: БХК относится к бицинхониновой кислоте; БСА относится к бычьему сывороточному альбумину; ДМСО относится к диметилсульфоксиду; ИРВ8 относится к буферному раствору на основе двухосновного фосфата; ДТТ относится к дитиотреитолу, Е1ОАс относится к этилацетату; ЭБС относится к эмбриональной бычьей сыворотке, НЕРЕ8 относится к Ы-2-гидроксиэтилпиперазин-№-2этансульфокислоте, МЕМ относится к минимально обогащенной среде, МеОН относится к метанолу, ФБР относится к фосфатному буферному раствору, Р1 относится к йодиду пропидия, РНКаза относится к рибонуклеазе А, РРМ1 означает Мемориальный институт Розуэлл-Парка (Розче11 Рагк Метопа1 1пз111и1е), ТВ8Т относится к трис-буферному раствору Тчееп-20, ТГФ относится к тетрагидрофурану, ТР-РРЕТ относится к резонансному переносу энергии флуоресценции с разрешением по времени. Тпз относится к трис(гидроксиметил)аминометану, Тп!оп-Х относится к трет-октилфениловому эфиру 4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенилполиэтиленгликоля и т-октилфеноксиполиэтоксиэтанолполиэтиленгликоля, и Тчееп-20 относится к полисорбату 20.

Пример получения 1. Трет-бутил-(Р)-3-(6-хлорпиразин-2-ил)оксипиперидин-1-карбоксилат

- 3 022096

Гидрид натрия (225,6 г, 5,64 моль) диспергировали в ТГФ (3 л) и температуру понижали до 0-5°С. Раствор (К)-3-гидрокси-1-ВОС-пиперидина (891,6 г, 4,43 моль) в ТГФ (3 л) добавляли в течение 1 ч, поддерживая температуру в диапазоне 0-5°С. Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч. 2,6дихлорпиразин (600 г, 4,03 моль) в виде раствора в ТГФ (3 л) добавляли по каплям в течение 1,5 ч, поддерживая указанную температуру. Реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч при 25-30°С, затем выливали в лед. Смесь разбавляли водой и экстрагировали этилацетатом. Экстракты сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаточную маслянистую жидкость растирали с 5% дихлорметаном в гексане с получением продукта в виде белого твердого вещества. Твердое вещество собирали путем фильтрования и сушили с получением 1538 г неочищенного вещества. Неочищенный продукт снова растирали с 5% дихлорметаном в гексане с получением белого твердого вещества с количественным выходом ИЭР/МС т/ζ 314,1 [М+Н]+.

Пример получения 2. Метиловый эфир 2-метокси-6-метилникотиновой кислоты

В перемешиваемый раствор метилового эфира 2-хлор-6-метилникотиновой кислоты (10,4 г, 56,52 ммоль) в МеОН в атмосфере азота добавляли раствор натрия (2,58 г, 113.04 ммоль) в метаноле (80,0 мл) (металлический натрий растворяли в метаноле в атмосфере азота) при комнатной температуре. Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение ночи. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и рН доводили до 7 при помощи уксусной кислоты. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (100 мл) и водой (30 мл). Органический слой отделяли, а водный слой экстрагировали этилацетатом (2x75 мл). Объединенные органические экстракты сушили над Ыа₂8О₄, фильтровали и концентрировали с получением неочищенного продукта. Выход 7,25 г (71%).

Ή ЯМР (400 МГц, СНС1₃), δ 8,066-8,047 (й,1 = 7,6 Гц, 1Н), 6,782-6,764 (й, 1 = 7,2 Гц, 1Н), 4,029 (5, 3Н), 3,879 (5, 3Н), 2,483 (5, 3Н), ИЭР/МС т/ζ 182,2 [М+Н]+.

Пример получения 3. 5-(2-Метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-иламин

и-ВиЫ (1,2М, 96,0 мл, 115,6 ммоль) добавляли в раствор ацетонитрила (6,08 мл, 115,4 ммоль) в ТГФ (300 мл) при -78°С и оставляли перемешиваться в течение 30 мин при -78°С. Метиловый эфир 2-метокси6-метилникотиновой кислоты (20 г. 105,1 ммоль) в ТГФ (200 мл) добавляли и перемешивали при -78°С в течение еще 30 мин. Реакцию гасили при -78°С водой (500 мл) и смесь промывали Е1ОАс (2x250 мл). Водный слой отделяли и упаривали. Полученное вещество дважды перегоняли с толуолом с получением 3-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)-3-оксопропионитрила. Выход = 21,4 г (неочищенное вещество) ИЭР/МС т/ζ 191,1 [М+Н]+.

Раствор 3-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)-3-оксопропионитрила (21 г, 110,4 ммоль) в этаноле (200 мл) помещали в герметичную пробирку. Гидрат гидразина (32,1 мл. 662,4 ммоль), уксусную кислоту (21,0 мл) добавляли и реакционную смесь грели при 100°С в течение 2 ч. Растворитель выпаривали и реакционную смесь разбавляли ЕЮАс (500 мл) и насыщенным раствором бикарбоната натрия (100 мл). Органический слой отделяли и водный слой экстрагировали ЕЮАс (2x250 мл). Объединенные органические экстракты сушили над Ыа₂8О₄, фильтровали и концентрировали с получением неочищенного продукта, который использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. Выход = 16,5 г (73%).

Ή ЯМР (400 МГц, ДМСО-й₆) δ 11,50 (Ь5, 1Н), 7,90 (й, 1 =7,6 Гц, 1Н), 6,86 (й, 1 = 7,6 Гц, 1Н), 5,88 (5, 1Н), 4,64 (5, 2Н), 3,91 (5, 3Н), 2,38 (5, 3Н).

Пример получения 4. Трет-бутиловый эфир 5-амино-3-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)пиразол-1карбоновой кислоты

Раствор 5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-иламина (16,0 г, 78,3 ммоль) в ТГФ (200 мл) медленно добавляли в перемешиваемую суспензию ЫаН (60% в минеральном масле, 3,4 г, 85,0 ммоль) в ТГФ (200 мл) при 0°С. Через 15 мин выдерживания при 0°С ди-трет-бутилдикарбонат (19,8 мл, 86 ммоль) медленно добавляли в реакционную смесь и перемешивали при 0°С в течение 30 мин. Реакцию гасили ледяной водой (примерно 250 мл) и продукт экстрагировали этилацетатом (2x500 мл). Объединенные органические фракции промывали водой и насыщенным раствором ЫаС1 (200 мл), сушили над

- 4 022096 безводным Ν^ρδΟ.-ι. фильтровали и концентрировали в вакууме с получением неочищенного вещества. Полученное вещество дважды растирали с гексаном с получением 18,5 г (78%) соединения, указанного в заголовке.

¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆) δ 8,05 (б, 1= 7,6 Гц, 1Н), 6,90 (б, 1= 7.2 Гц, 1Н), 6,28 (к, 2Н), 5,85 (к, 1Н), 3,90 (к, 3Н), 2,40 (к, 3Н), 1,56 (к, 9Н).

Пример получения 5. Трет-бутиловый эфир (К)-3-{6-[2-трет-бутоксикарбонил-5-(2-метокси-6метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-иламино]пиразин-2-илокси}пиперидин-1-карбоновой кислоты

Смесь трет-бутилового эфира 5-амино-3-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)пиразол-1-карбоновой кислоты (50,0 г, 164,5 ммоль), трет-бутил-(К)-3-(6-хлорпиразин-2-ил)оксипиперидин-1-карбоксилата (56,6 г, 180,9 ммоль), 4,5-бис-дифенилфосфанил-9,9-диметил-9Н-ксантена (14,2 г, 24,6 ммоль) и Ск₂СО₃(85,5 г, 263 ммоль) в 1,4-диоксане (1,4 л) в равных частях помещали в две круглодонные колбы, расположенных рядом, и каждую из них продували аргоном в течение 2 ч Рб(ОАс)₂ (5,4 г, 24,6 ммоль) добавляли (по половине от этого количества в каждый сосуд) и продували в течение еще 1 ч. Реакционные смеси затем нагревали при 90-95°С в течение 1 ч. Реакционные смеси охлаждали до комнатной температуры, объединяли и разбавляли этилацетатом (1 л). Смесь затем фильтровали через диатомитовую землю, промывали этилацетатом и фильтрат концентрировали. Неочищенный продукт очищали на силикагеле с применением 15% ЕЮАс/гексан в качестве элюента с получением 55 г (выход 57%) белого порошка 55 г очищенного продукта, объединяли с 15 г аналогично полученного и очищенного вещества (полученного из 20 г трет-бутилового эфира 5-амино-3-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)пиразол-1карбоновой кислоты). Объединенное вещество (70 г) растворяли в смеси ТГФ и метанола 4:1 (1,4 л) и обрабатывали ЦиабгаЗб™ АР (140 г) в течение 2 ч. Реакционную смесь фильтровали через диатомитовую землю и промывали этилацетатом (4x100 мл). Фильтрат снова перемешивали с ЦиабгаЗб™ АР (140 г) в течение 2 ч и фильтровали, как указано выше. Растворитель выпаривали с получением соединения, указанного в заголовке, в виде белого твердого вещества. Выход = 70 г (47%). ИЭР/МС т/ζ 582,5 [М+Н]+.

Пример 1. (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил]-[6-(пиперидин-3илокси)пиразин-2 -ил] амин

В перемешиваемый раствор трет-бутилового эфира (К)-3-{6-[2-трет-бутоксикарбонил-5-(2-метокси6-метилпиридин-3 -ил)-2Н-пиразол-3 -иламино]пиразин-2-илокси}пиперидин-1-карбоновой кислоты (13,0 г, 22,3 ммоль) в дихлорметане (150 мл) добавляли раствор трифторуксусной кислоты (12,4 мл, 167 ммоль) в дихлорметане (20 мл) в течение 5 мин при 0°С. Реакционную смесь оставляли нагреваться до комнатной температуры и перемешивали в течение 3 ч. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном (1000 мл), затем добавляли насыщенный раствор бикарбоната натрия (250 мл), а затем перемешивали в течение 4 ч. Органическую фракцию отделяли и сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и упаривали. Полученное вещество кристаллизовали из изопропанола с получением целевого продукта. Выход = 7,2 г (85%).

Ή ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆) δ 12,40 (к, 1Н), 9,71 (к, 1Н), 8,02 (б, 1 =7,6 Гц, 1Н), 7,97 (к, 1Н), 7,46 (к, 1Н), 6,93 (б, 1 =7,6 Гц, 1Н), 6,91 (к, 1Н), 4,94-4,86 (т, 1Н), 3,97 (к, 3Н), 3,20-3,13 (т, 1Н), 2,83-2,75 (т, 1Н), 2,57 (бб, 1 = 12,0, 8,4 Гц, 1Н), 2,53-2,45 (т. размыт, 1Н), 2,42 (к, 3Н), 2,15-2,05 (т, 1Н), 1,71-1,63 (т, 1Н), 1,60-1,49 (т, 1Н), 1,49-1,40 (т, 1Н); ИЭР/МС т/ζ 382,5 [М+Н]+

Пример 2. Метансульфокислая соль (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил]-[6(пиперидин-3 -илокси)пиразин-2-ил] амина

Метансульфокислоту (0,247 г, 2,57 ммоль) добавляли в перемешиваемый раствор (К)-[5-(2-метокси6-метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил]-[6-(пиперидин-3-илокси)пиразин-2-ил]амина (0,982 г, 2,57

- 5 022096 ммоль) в дихлорметане (25 мл) при 0°С. Реакционную смесь оставляли нагреваться до комнатной температуры и встряхивали в течение 45 мин. Растворитель выпаривали и полученную соль последовательно промывали диэтиловым эфиром (10 мл) и пентаном (10 мл) с получением целевого продукта. Выход = 1,139 г (92,6%).

¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-Ф), δ 12,5 (Ьз, 1Н), 9,81 (5, 1Н), 8,73 (Ьз, 1Н), 8,54 (Ьз, 1Н), 8,07 (5, 1Н), 7,96 (ά, 1 = 7,6 Гц, 1Н), 7,56 (з, 1Н), 6,95 (ά, 1 = 7,6 Гц, 1Н), 6,81 (з, 1Н), 5,31-5,24 (т, 1Н), 3,97 (з, 3Н), 3,48-3,39 (т, 1Н), 3,39-3,30 (т, 1Н), 3,18-3,10 (т, 1Н), 3,10-3,01 (т, 1Н), 2,43 (з, 3Н), 2,32 (з, 3Н), 2,031,85 (т, 3Н), 1,73-1,65 (т, 1Н); ИЭР/МС т/ζ 382,4 [М+Н]+.

Пример 3. Соль (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил]-[6-(пиперидин-3илокси)пиразин-2-ил]амина и уксусной кислоты

В раствор (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил]-[6-(пиперидин-3-илокси)пиразин-2-ил]амина (0,100 г, 0,26 ммоль) в дихлорметане (10 мл) добавляли уксусную кислоту (0,015 мл, 0,26 ммоль), растворенную в дихлорметане (1 мл), при 0°С. Реакционную смесь перемешивали в течение 60 мин при комнатной температуре, а затем растворитель выпаривали с получением остатка. Остаток растирали с диэтиловым эфиром (20 мл), затем с н-пентаном (20 мл). Вещество сушили в глубоком вакууме в течение 4 ч с получением целевого продукта. Выход = 0,060 г (51,8%).

' Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-а₆) δ 12,40 (Ьз, 1Н), 9,70 (з, 1Н), 8.02 (ά, 1 = 7,6 Гц, 1Н), 7,98 (з, 1Н), 7,46 (з, 1Н), 6,94 (ά, 1 = 7,6 Гц, 1Н), 6,90 (з, 1Н), 4,97-4,38 (т, 1Н), 3,98 (з, 3Н), 3,20-3,13 (т, 1Н), 2,83-2,74 (т. 1Н), 2,66-2,56 (т, 1Н), 2,42 (з, 3Н), 2,14-2,03 (т, 1Н), 1.89 (з, 3Н), 1,74-1,62 (т. 1Н), 1,61-1,51 (т, 1Н), 1,50-1.40 (т, 1Н), 1,30-1,20 (т, 1Н), ИЭР/МС т/ζ 382,5 [М+Н]+.

Пример 4. Гемиоксалат (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил]-[6-(пиперидин3-илокси)пиразин-2-ил]амина

В раствор (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил]-[6-(пиперидин-3-илокси)пиразин-2-ил]амина (0,100 г, 0,26 ммоль) в дихлорметане (10 мл) добавляли щавелевую кислоту (0,012 мг, 0,13 ммоль), растворенную в МеОН (0,1 мл), при 0°С. Реакционную смесь перемешивали в течение 60 мин при комнатной температуре, а затем растворитель выпаривали с получением остатка. Остаток растирали с диэтиловым эфиром (20 мл), затем с н-пентаном (20 мл). Вещество сушили в глубоком вакууме в течение 4 ч с получением соединения, указанного в заголовке. Выход = 0,095 г (77%).

'Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-άβ) δ 9,77 (з, 1Н), 8,07 (з, 1Н), 7,95 (ά, 1=7,6 Гц, 1Н), 7,55 (з, 1Н), 6,95 (ά, 1=7,6 Гц, 1Н), 6,79 (з, 1Н), 5,33-5,24 (т, 1Н), 3,97 (з, 3Н), 3,45-3,30 (т, 2Н), 3,18-3,09 (т, 1Н), 3,08-2,98 (т, 1Н), 2,42 (з, 3Н), 2,05-1,85 (т, 2Н), 1,74-1,63 (т, 1Н), 1,18-1,10 (т, 1Н); ИЭР/МС т/ζ 382,4 [М+Н]+.

Пример 5. Гемисукцинат (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил]-[6-(пиперидин-

В раствор (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил]-[6-(пиперидин-3-илокси)пиразин-2-ил]амина (0,1 г, 0,26 ммоль) в дихлорметане (10 мл) добавляли янтарную кислоту (0,015 г, 0,13 ммоль), растворенную в этаноле (1 мл, растворение проводили при 50°С) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре. Растворитель выпаривали и полученный остаток растирали с диэтиловым эфиром (20 мл), затем с н-пентаном (20 мл). Вещество сушили в глубоком вакууме в течение 8 ч с получением соединения, указанного в заголовке. Выход = 0,102 г (78%).

'Н ЯМР (400 МГц, ДМС’О-ά,·,) δ 12,4 (Ьз, 1Н), 9,72 (з, 1Н), 8,05-7,96 (т, 2Н), 7,48 (з, 1Н), 6,93 (ά, 1=7,6 Гц, 1Н), 6,86 (з, 1Н), 5,06-4,97 (т, 1Н), 3,97 (з, 3Н), 2,90-2,81 (т, 1Н), 2,74-2,62 (т, 1Н), 2,42 (з, 3Н),

2,30 (з, 2Н), 2,09-2,01 (т, 1Н), 1,80-1,60 (т, 2Н), 1,57-1,46 (т, 1Н), 1,14-1,10 (т, 1Н), 1,10-1,00 (т, 1Н); ИЭР/МС т/ζ 382,4 [М+Н]+

- 6 022096

Пример 6. Гидрат (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил]-[6-(пиперидин-3илокси)пиразин-2 -ил] амина

Суспендировали (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил]-[6-(пиперидин-3-илокси)пиразин-2-ил]амин (52,1 мг; ИЭР/МС т/ζ 382,2 [М+Н]+) в 5:95 смеси вода-этанол (10 мл) при температуре окружающей среды в течение 48 ч. Белое кристаллическое твердое вещество выделяли путем вакуумного фильтрования.

Порошковые рентгеновские дифрактограммы (ΧΡΌ) кристаллических твердых веществ получали на порошковом рентгеновском дифрактометре Вгикег Ό4 Епйсауог. оборудованном источником СиКа (λ=1,54060 А) и детектором Уайек, с рабочими характеристиками 35 кВ и 50 мА. Образец сканировали в диапазоне от 4 до 40°С 2Θ с шагом 0,009° 2Θ. Сухой порошок помещали на кварцевый держатель образца и получали гладкую поверхность при помощи предметного стекла. Для данного анализа в ошибке положения пика ±0,2 2Θ учтены возможные отклонения, при этом она не препятствует однозначной идентификации указанной кристаллической формы. Подтверждение типа кристаллической формы можно проводить на основании уникальной комбинации отличительных пиков (в °2θ), как правило, являющихся наиболее выраженными пиками. Дифрактограммы кристаллической формы, полученные при температуре и относительной влажности окружающей среды, нормировали с применением стандарта ΝΙδΤ 675 с пиками при 8,85 и 26,77 градусов 2-тета.

Таким образом, кристаллическая форма соединения характеризуется ΧΡΌ-дифрактограммой, полученной с применением излучения СиКа и имеющей пики дифракции (2-тета), описанные ниже в табл. 1. В частности, дифрактограмма имеет пик при 5.17 в комбинации с одним или более пиками, выбранными из группы, состоящей из 15,73, 17,71 и 20,12, с допустимым отклонением угла дифрации, равным 0,2 градуса.

Таблица 1. Пики рентгеновской порошковой дифракции соединения согласно примеру 6.

Биохимическое исследование СЬк1

Влияние соединений на биохимическую активность СЬк1 можно определять при помощи исследования связывания СНК1/пептидного субстрата на фильтрах. В этом исследовании синтетический пептид, соответствующий последовательности аминокислотных остатков 206-225 Сбс25, применяли в качестве субстрата-акцептора фосфора рекомбинантной протеинкиназы СЬк1. При применении γ-³³Ρ-ΑΤΦ в качестве субстрата-донора фосфора СЬк1 переносит радиоактивную γ-³³фосфатную группу на синтетический пептид. Прохождение реакции измеряли путем поглощения пептидного субстрата в планшетах с катионообменными бумажными фильтрами и определения числа испускаемых бета-частиц при помощи сцинтилляционного анализа.

Киназные реакции (реакционный объем 40 мкл) проводили в 96-луночных планшетах из полистирола с У-образным дном. Реакции иницировали путем добавления фермента СЬк1. Конечные условия реакций: 67 мМ натриевой соли ΗΕΡΕδ с рН 7,4, 0,007% (об./об.) ΤΡΙΤΟΝ™ Х-100, 2,7 мМ ДТТ, 2,7 мМ М§С1₂, 12 мкМ пептидного субстрата, 60 мкМ динатриевой соли АТФ, 0,75 мкКи γ-³³Ρ-ΑΤΦ, 0,75 нМ активного фермента СЬк1, 4% (об./об.) ДМСО и последовательное разведение соединения (серийное разведение 1:3, начиная с 20 мкМ, 10 точек).

После добавления фермента СЬк1 реакционные смеси инкубировали при комнатной температуре в течение 90 мин, затем реакции останавливали путем добавления 140 мкл фосфорной кислоты. Реакционную смесь переносили в соответствующие лунки непрозрачного фильтровального планшета с фосфоцеллюлозными катионообменными бумажными фильтрами и отстаивали в течение 30 мин. Фильтровальный планшет промывали в вакуумном коллекторе пять раз 200 мкл 0,5% фосфорной кислоты (об./об.) Фильтровальный планшет сушили в течение ночи, после чего добавляли 40 мкл Мюто8С1й™-20 в каждую лунку планшета. После отстаивания в течение 4 ч при комнатной температуре радиоактивность в планшете

- 7 022096 измеряли при помощи сцинтиллятора микропланшетов М1сгоВе!а Тгйих (Регкш Е1тег).

Для определения 1С₅₀ ингибирование в процентах для каждой концентрации вычисляли на основании числа сцинтилляций, отнесенного к данным контрольных лунок каждого планшета. Данные для десяти точек концентрации соединения затем подставляли в четырехпараметровое логистическое уравнение с применением ΛαΙίνίΙν Ваве 4.0. Абсолютные значения 1С₅₀ вычисляли при помощи полученной кривой. Соединения согласно настоящему изобретению исследовали по существу согласно приведенному выше описанию. Например, по результатам исследования соединение согласно примеру 1 имело значение 1С₅₀ <0,001 мкМ (п=6). Кроме того, по результатам исследования соединение согласно примеру 2 имело значение 1С₅₀ <0,001 мкМ (п=3). Эти результаты показывают, что соединения, включенные в объем настоящего изобретения, являются высокоактивными ингибиторами СЬк1.

Биохимическое исследование СЬк2

Влияние соединений на биохимическую активность СЬк2 можно определять при помощи исследования связывания СНК2/пептидного субстрата на фильтрах. В данном исследовании синтетический пептид, соответствующий последовательности аминокислотных остатков 206-225 Сбс25С. применяли в качестве субстрата-акцептора фосфора рекомбинантной протеинкиназы СЬк2. При применении γ-³³Ρ-ΑΤΦ в качестве субстрата-донора фосфора СЬк2 переносит радиоактивную γ-³³фосфатную группу на синтетический пептид. Прохождение реакции измеряли путем поглощения пептидного субстрата в планшетах с катионообменными бумажными фильтрами и определения числа испускаемых бета-частиц при помощи сцинтилляционного анализа.

Киназные реакции (реакционный объем 40 мкл) проводили в 96-луночных планшетах из полистирола с У-образным дном. Реакции инициировали путем добавления фермента СЬк2. Конечные условия реакций: 67 мМ натриевой соли НЕРЕ8 с рН 7,4, 0,007% (об./об.) ΤΡΙΤΟΝ™ Х-100, 2,7 мМ ДТТ, 2,7 мМ М§С1₂, 12 мкМ пептидного субстрата, 60 мкМ динатриевой соли АТФ, 0,75 мкКи λ-³³Ρ-ΑΤΦ, 1,4 нМ активного фермента СЬк2, 4% (об./об.) ДМСО и последовательное разведение соединения (серийное разведение 1:3, начиная с 20 мкМ, 10 точек).

После добавления фермента СЬк2 реакционные смеси инкубировали при комнатной температуре в течение 90 мин, затем реакции останавливали путем добавления 140 мкл фосфорной кислоты. Реакционную смесь переносили в соответствующие лунки непрозрачного фильтровального планшета с фосфоцеллюлозными катионообменными бумажными фильтрами и отстаивали в течение 30 мин. Фильтровальный планшет промывали в вакуумном коллекторе пять раз 200 мкл 0,5% фосфорной кислоты (об./об.). Фильтровальный планшет сушили в течение ночи, после чего добавляли 40 мкл Мюго5ст!™-20 в каждую лунку планшета. После отстаивания в течение 4 ч при комнатной температуре радиоактивность в планшете измеряли при помощи сцинтиллятора микропланшетов МюгоВе!а ТгЛих (Регкш Е1тег).

Для определения 1С₅₀ ингибирование в процентах для каждой концентрации вычисляли при помощи значения ТР-РРЕТ, отнесенного к данным контрольных лунок каждого планшета. Данные для десяти точек концентрации соединения затем подставляли в четырехпараметровое логистическое уравнение с применением ЛсЙУЙуВаве 4.0. Абсолютные значения 1С₅₀ вычисляли при помощи полученной кривой. Соединения согласно настоящему изобретению исследовали по существу согласно приведенному выше описанию. Например, по результатам исследования соединение согласно примеру 1 имело значение 1С₅₀, равное 0,011 мкМ (СКО=0,002, п=6). Кроме того, по результатам исследования соединение согласно примеру 2 имело значение 1С₅₀, равное 0,012 мкМ (СКО=0,008, п=3). Эти результаты показывают, что соединения, включенные в объем настоящего изобретения, являются высокоактивными ингибиторами СЬк2.

Клеточное исследование аутофосфорилирования СЬк1

Ингибитор СЬк1 препятствует фосфорилированию субстратов, обусловленному киназной активностью белка, в клетках, в которых активирован ответ на повреждение ДНК. Легко поддающимся обнаружению субстратом СЬк1 является участок аутофосфорилирования самой СЬк1, серин 296. Следующий иммуноблот можно применять для измерения уровня фосфорилирования серина 296 в СЬк1 и непрямого определения активности СЬк1 протеинкиназы. Клетки НеЬа выращивали в МЕМ/сбалансированном солевом растворе Эрла с Ь-глутамином, содержащем 10% (об./об.) инактивированной нагреванием эмбриональной бычьей сыворотки, 1х аминокислоты, заменимые для МЕМ, 1х пируват натрия и 1х 10⁵ клеток в 600 мкл питательной среды МЕМ на лунку 24-луночного планшета для клеточных культур. Клетки инкубировали в течение 24 ч при 37°С, 5% СО₂ и относительной влажности 95-100%. 16 мкл 4 мкМ маточного раствора доксорубицина в питательной среде добавляли в каждую соответствующую лунку для достижения конечной концентрации доксорубицина 100 нМ. Планшеты возвращали в инкубатор еще на 24 ч, после чего добавляли ингибитор СЬк1. Соединения растворяли в концентрации 10 мМ в 100% ДМСО, затем разбавляли до 2 мМ в 40% (об./об.) ДМСО, а затем разбавляли до 100 мкМ в питательной среде, содержащей 4% (об./об.) ДМСО. Затем проводили серийные разбавления соединений (1:3) для получения концентраций в диапазоне от 100 мкМ до 0,005 мкМ. 66 мкл маточного раствора соединения добавляли в соответствующие лунки планшета для достижения конечной концентрации ДМСО, равной 0,4% (об./об.), и конечной концентрации соединения в диапазоне от 1 до 0,0005 мкМ. Планшеты возвра- 8 022096 щали в инкубатор еще на 2 ч, а затем удаляли для проведения клеточного лизиса и процессинга в клетке. Среду затем удаляли из планшета, каждую лунку промывали один раз 0,5 мл ледяного фосфатного буферного раствора Дульбекко (ΌΡΒ8), все жидкости удаляли и планшет помещали в лед до окончания процедуры. В каждую лунку добавляли 75 мкл ледяного лизисного буфера, состоящего из буфера для экстракции клеток, содержащего коктейль ингибиторов фосфатаз (81дта, кат № Р0044 + Р5725) и таблетки с коктейлем ингибиторов протеаз (КосЬе О|аупо511С5, кат № 11836153001). Через 10 мин содержимое каждой лунки соскребали со стенок и лизат переносили в 1,5 мл полипропиленовую пробирку для микроцентрифугирования, помещенную в лед. Каждый лизат обрабатывали ультразвуком в течение 45 с в чашечном ультразвуковом гомогенизаторе планшетов (Μΐ5οηίχ) в виде суспензии на бане лед/вода. 50 мкл каждого образца переносили в 0,5 мл полипропиленовую пробирку для микроцентрифугирования, содержащую 25 мкл 4х буфера для образцов ЬаетшЬ, грели при 95°С в течение 5 мин и хранили в замороженном виде при -80°С. Оставшийся лизат применяли для определения концентрации белка (набор для исследования белков с БХК, ТЬегто 8аеп1тйс). Пять мкг каждого клеточного лизата в буфере для образцов наносили в гель в 96-луночный планшет Е-Раде и проводили электрофорез. Белки под действием электрофореза перемещались из геля в ПВДФ мембрану 1ттоЫ1оп-Р (0,45 мкм) в соответствии со способами, хорошо известными в данной области техники (То\\Ьт е1 а1., ΡΝΑ8 (1979) 76(9), 4350-4). Мембрану быстро промывали 10 мМ ТП5/НС1, рН 8,0, 150 мМ №-1С1 и 0,05% (об./об.) Т\уееп 20 (ТВ8Т) и выдерживали для пропитки в течение 1 ч при 25°С в ТВ8Т/5% (об./об.) восстановленного сухого молока СатпаЬоп®. Мембрану промывали четыре раза ТВ8Т в течение 5 мин, затем выдерживали для пропитки при 4°С в течение 24 ч в ТВ8Т/5% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина и соответствующем разбавленном антителе кролика к фосфо-СЬк1 (серин 296). Мембрану промывали 4х ТВ8Т в течение 5 мин при 25°С, а затем выдерживали для пропитки при 25°С в течение 2 ч в ТВ8Т/5% молока, содержащем соответствующий разбавленный ослиный антикроличий 1дО, конъюгированный с пероксидазой хрена (ОЕ НеаЬсате, кат № ΝΑ9340) для детектирования аутофосфорилированного белка СЬк1. Мембрану промывали снова 4х ТВ8Т в течение 5 мин при 25°С. Конъюгаты антиген-антитело-репортер, иммобилизованные на мембране, детектировали при помощи реагента 8ирег 81дпа1 \Уе51егп РеиЛо для детектирования НКР (пероксидазы хрена) с применением системы визуализации РИЛ БА8-4000. Интенсивности полос фосфо-СЬк1 (5ег296) вычисляли при помощи программного обеспечения То1а1 ЬаЬ (ШпЬпеаг Эупат1с5). Ингибирование в процентах индуцированного доксорубицином аутофосфорилирования СЬк1 вычисляли при помощи следующей формулы ингибирование в % = (интенсивность полосы образецфосфо-СЬк1-интенсивность полосы отрицательный контроль без доксорубицина-фосфоСЬк1)/(интенсивность полосы положительный контроль с доксорубицином-фосфо-СЬк1 - отрицательный контроль без доксорубицина-фосфо-СЬк1) х 100 Соединения согласно настоящему изобретению исследовали по существу согласно приведенному выше описанию. По результатам указанного исследования соединение согласно примеру 1 имело значение ЕС₅₀ <0,001 мкМ (п=1). По результатам указанного исследования соединение согласно примеру 3 имело значение ЕС₅₀ <0,001 мкМ (п=1). Эти результаты показывают, что соединения, включенные в объем настоящего изобретения, являются высокоактивными ингибиторами СЬк1.

Прогностическое исследование индуцируемой доксорубицином нейтрализации контрольной точки С2М в клетках ИеЬа

Ингибитор СЬк1 отключает контрольную точку О2М повреждения ДНК в опухолевых клетках р53минус, обработанных ингибитором топоизомеразы II, доксорубицином. Мерой нейтрализации контрольной точки О2М является фосфорилирование серина 10 гистона Н3, которое происходит после прохождения клетки через контрольную точку О2М и вступления клетки в митоз. Следующее многопараметрическое визуализирующее исследование можно применять для измерения уровня фосфорилирования гистона Н3 в клетках. Клетки НеЬа выращивали в среде МЕМ, содержащей 10% (об./об.) ЭБС и помещали в количестве 2000 клеток на лунку в черные планшеты с прозрачным дном, покрытые поли-Э-лизином, до достижения объема 100 мкл на лунку. Планшеты затем инкубировали в инкубаторе клеточных культур в течение 18-24 ч (37°С, 5% СО₂, относительная влажность 95%). После начальной инкубации 20 мкл среды МЕМ, содержащей 10% ЭБС и 625 нМ доксорубицин, добавляли в соответствующие лунки планшета до конечной концентрации 125 нМ. Планшеты возвращали в инкубатор на 24 ч для остановки клеточного цикла в контрольной точке О2М. На следующий день клетки обрабатывали соединениями. Соединения растворяли в концентрации 10 мМ в 100% ДМСО, а затем разбавляли с получением 10х маточного раствора с концентрацией 50 мкМ в МЕМ и 4% (об./об.) ДМСО. Затем проводили серийные разбавления соединений (1:2) с получением концентраций в диапазоне от 50 мкМ до 0,39 мкМ. Тринадцать мкл маточного раствора соединения добавляли в соответствующие лунки планшета до достижения конечной концентрации ДМСО, равной 0,4%, и конечной концентрации соединения в диапазоне от 5 мкМ до 0,039 мкМ. Планшеты возвращали в инкубатор еще на 7 ч, а затем удаляли для фиксации клеток. Жидкость осторожно удаляли из каждой лунки и 100 мкл фиксатора РКЕРЕК™ добавляли. Планшеты выдерживали при комнатной температуре в течение 20 мин, фиксатор удаляли и клетки затем пермеабилизировали путем добавления 100 мкл/лунку 0,1% (об./об.) ТтЪоп® X 100 в ЭРВ8 в течение 10 мин. Раствор удаляли

- 9 022096 и планшет дважды промывали 100 мкл ΌΡΒ8 на лунку, затем добавляли 100 мкл ΌΡΒ8, содержащего 50 мкг/мл рибонуклеазы А (РНКаза поджелудочной железы быка), в течение одного часа при комнатной температуре. Раствор РНКазы удаляли и клетки окрашивали для определения наличия гистона Н3, фосфорилированного по серину 10 (рНН3), путем добавления в каждую лунку 50 мкл раствора РНКазы, содержащего разбавленное 1:500 кроличье антитело к рНН3 (8ег10) и 1% (мас./об.) БСА. Планшеты запечатывали и выдерживали при 4°С в течение ночи. Первичное антитело удаляли путем двукратной промывки каждого планшета 100 мкл ΌΡΒ8 на лунку и заменяли его 50 мкл разбавленного 1:750 козьего антикроличьего 1дС А1еха Р1иог® 488 (Н+Ь) (2 мг/мл) в ΌΡΒ8, содержащем 1% (мас./об.) БСА. Планшеты закрывали алюминиевой фольгой для защиты от света и выдерживали в течение одного часа при комнатной температуре. Планшеты снова промывали дважды 100 мкл ΌΡΒ8 на лунку и заменяли на 100 мкл 15 нМ йодида пропидия (разбавление 1:100 исходного раствора в ФБР). Планшеты закрывали черной крышкой для защиты от света. Планшеты инкубировали в течение 30 мин для окрашивания ядер. Планшеты сканировали в лазерных сканирующих цитометрах флуоресценции микропланшетов АСИМЕЫ ΕΧΡΕΟΚΕΚ™ с длиной волны возбуждения 488 нм (ТТР ЬАБТЕСН ЬТС) для измерения содержания рНН3 и ДНК, включая 2Ν и 4Ν. рНН3-положительные клетки определяли по средней интенсивности А1еха 488 при 519 нм. Общую интенсивность йодида пропидия/ДНК при 655-705 нм использовали для определения индивидуальных клеток и субпопуляций клеток в различных фазах клеточного цикла (клетки 2Ν, клетки 4Ν). Конечное число каждой популяции определяли путем нормализации к % от общего числа клеток с получением следующих конечных результатов исследования % рНН3, %2Ν и %4Ν 100% активность затем определяли путем обработки клеток контрольным ингибитором в максимальной концентрации 100 нМ для определения конечной активности (в %) каждого соединения 0% активность определяли в отсутствие введения соединения. Относительную ЕС₅₀ определяли при помощи АСТГУГТУ ΒΑ8Ε™ с использованием Ехсе1 Ρίΐ путем построения кривой с применением подстановки в четырехпараметровое логистическое уравнение 205, для определения % рНН3 относительно контрольного максимального значения, принятого за 100%. Соединения согласно настоящему изобретению исследовали, по существу, согласно приведенному выше описанию. По результатам указанного исследования соединение согласно примеру 1 имело значение ЕС₅₀, равное 0,029 мкМ (п=1). По результатам указанного исследования соединения согласно примерам 2 и 3 имели значения ЕС₅₀, равные 0,033 мкМ (п=1) и 0,019 мкМ (п=1) соответственно. Эти результаты показывают, что соединения, включенные в объем настоящего изобретения, отключают контрольную точку повреждения ДНК О2М.

Исследование ЕС_Й8 (двойная сенсибилизация)

Ингибитор СЬк1 может увеличивать антипролиферативную активность гемцитабина (или других цитотоксических средств) за счет нейтрализации контрольной точки в 8 фазе, приводя к продолжительному и увеличенному повреждению ДНК. Уровень непрерывной пролиферации опухолевых клеток после повреждения ДНК можно анализировать путем определения способности клеток реплицировать свою ДНК. В этом исследовании определяют способность клеток реплицировать свою ДНК после возникновения возможности репарации повреждения ДНК клетками. В этом исследовании клетки обрабатывати последовательно разбавленным гемцитабином, а затем через 22 ч соединением согласно примеру

3. Еще через 44 ч относительное число клеток определяли при помощи исследования восстановления красителя МТ8 (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Нтетразолий). Параметр ЕСщ является мерой концентрации ингибитора СЬк1, необходимой для снижения в два раза концентрации ОГ90 гемцитабина, измеренной в этом же исследовании в отсутствие ингибирования СЬк1. Клетки НТ-29 (получали из АТСС) выращивали в ΚΡΜΓ 1640, содержащей 10% (об./об.) ЭБС, инактивированной нагреванием. Клетки помещали в количестве 2,5х10³ на лунку до достижения объема 100 мкл в 96-луночные планшеты для тканевых культур и инкубировали в течение 24 ч. Проводили серийные разбавления гемцитабина в 6х концентрациях в среде МакКоя 5А (модифицированной) (1 х) и добавляли в лунки в количестве 20 мкл на лунку. Проводили разбавления гемцитабина, начиная с максимальной конечной концентрации гемцитабина, равной 1,0 мкМ, до достижения концентрации 0,5 нМ.

Ингибитор СЬк1 получали путем разбавления в ДМСО до 4000х конечной концентрации, а затем разбавляли в 666 раз в среде МакКоя с получением 6х маточных растворов. Проводили разбавления ингибитора СЬк1 в 2,5 раза, начиная с 25 до 0,3 нМ. Через 22 часа после добавления гемцитабина добавляли 24 мкл ингибитора СЬк1 в лунки, содержащие 120 мкл среды и гемцитабин. В каждую лунку, содержащую разбавленный гемцитабин, разбавленный ингибитор СЬк1 вводили один раз. В контрольные лунки вводили по отдельности ДМСО, гемцитабин или ингибитор СЬк1. Через 44 часа после добавления ингибитора СЬк1 30 мкл реагента для исследования Се11ТПег 96® АО,_|ео1К добавляли в каждую лунку и выдерживали при комнатной температуре в течение 1 ч 45 мин. Определяли поглощение при 490 нм на спектрофотометре 8рес!гаМах (Мо1еси1аг Иеуюек). Данные, полученные на спектрофотометре 8рес1гаМах, анализировали при помощи Огар№аб Ρπδΐη 4.0. Сначала усредненное контрольное поглощение в отсутствие клеток вычитали из всех других значений матрицы данных каждого планшета. Затем усредняли данные, полученных в двух повторностях. Получали нормированные данные для каждой концен- 10 022096 трации ингибитора СЬк1, где 0% числа клеток соответствовали А4₉₀=0, а 100% числа клеток соответствовали среднему значению при концентрации гемцитабина, равной 0 нМ. Эти результаты затем преобразовывали. Концентрации гемцитабина переводили в логарифмические концентрации, нормированное число клеток переводили в ингибирование в процентах (ингибирование в процентах = 100 - нормированное число клеток). Строили график по преобразованным данным, использовали нелинейную регрессию для оценки значения ЕС₅₀ гемцитабина для каждой концентрации ингибитора СЬк1. Нелинейную регрессию рассчитывали с учетом изменения наклона кривой в отсутствие ограничений для максимума или минимума кривых зависимостей доза-ответ. Значение ЕС_|[к рассчитывали следующим образом: определяли значения С1₅₀ гемцитабина для каждой концентрации ингибитора СЬк1, строили график и концентрацию ингибитора СЬк1, необходимую для снижения О1₅₀ гемцитабина в два раза, определяли путем интерполяции.

Соединения согласно настоящему изобретению исследовали по существу согласно приведенному выше описанию. По результатам исследования соединение согласно примеру 3 имело значение ЕС*, равное 1,0 нМ (СКО=0,1, п=3). Кроме того, соединение в 25 нМ концентрации снижало значение ЕС₅₀гемцитабина в 7 раз с 22 нМ до 3 нМ в случае клеток карциномы толстой кишки НТ-29. Само по себе соединение согласно примеру 3 оказывало незначительное действие на пролиферацию клеток НТ-29. Эти результаты показывают, что соединения, включенные в объем настоящего изобретения, эффективно увеличивают антипролиферативную активность гемцитабина в низких концентрациях.

Значения 1С₅₀ гемцитабина, полученные при введении различных концентраций соединения согласно примеру 3

[Пример 3], нМ	/Сзо (нМ)
0	22
0,256	23
0,64	19
1,60	14
4,0	10
10	4
25	3

Исследование направленного ингибирования СЬк1 ΐη νίνο

Клетки Са1и-6 помещали в питательную среду (МЕМ и сбалансированный солевой раствор Эрла с Ь-глутамином, содержащий 10% (об./об.) инактивированной нагреванием ЭБС, 1х заменимые аминокислоты для МЕМ, 1х пируват натрия) и выращивали. Клетки собирали и промывали дважды фосфатным буферным раствором, и 1 х 10⁶ клеток в питательной среде (не содержащей сыворотку) смешивали с равным объемом матрицы ΒΌ МаЬтде1™, затем вводили подкожную инъекцию в бок предварительно облученных (4,5 Гр) голых мышей (бестимусных мышей). Через 15 дней после введения имплантата (размер опухоли = 150-200 мм³) дозу 150 мг/кг гемцитабина в виде свежеприготовленного в день введения состава в солевом растворе интраперитонеально вводили животным. Через 6 ч животным перорально вводили соединение-ингибитор СЬк1 в виде состава в 0,2% Тгееп-80/0,5% метилцеллюлозы, рН доводили до 6,8 путем добавления разбавленного №ЮН. Животных умерщвляли через 2 ч после введения дозы ингибитора СЬк1, опухоли собирали и немедленно помещали в ледяной буфер для экстракции клеток, содержащий коктейль ингибиторов фосфатаз (З1дта, кат. № Р0044 + Р5725) и таблетки с коктейлем ингибиторов протеаз (КосЬе П1адпокЬск, кат. № 11836153001). Опухоли обрабатывали в 1,5-2,0 мл лизисного буфера в 15 мл полипропиленовую коническую пробирку, охлаждаемую льдом, при помощи электрического гомогенизатора тканей с продолжительностью максимального уровня нагрузки, равной 15 с. Выдерживая образец во льду, лизат отбирати четыре раза при помощи 1 мл шприца с иглой 25 калибра. 0,35 мл лизата опухоли переносили в 1,5 мл полипропиленовую пробирку для микроцентрифугирования, содержащую 0,15 мл 4х буфера для образцов ЬаеттЪ. Образец затем перемешивали и нагревали в течение 5 мин при 95°С, обрабатывали ультразвуком на высокой мощности в течение 1 мин с применением чашечного ультразвукового гомогенизатора М1кошх 3000. Образцы затем хранили во льду или при -80°С для определения направленного ингибирования при помощи вестерн-блот анализа. 5 мкг каждого лизата опухоли в буфере для образцов вводили в гель в 96-луночный планшет Е-Раде и проводили электрофорез. Белки перемещались в нитроцеллюлозную мембрану ВА83 Рго1гап (УЬа1тап, кат № 10402405) в соответствии с процессами, хорошо известными в данной области техники (То\\Ып е! а1., ΡΝΑ3 (1979) 76(9), 4350-4). Мембрану затем обрабатывали для измерения содержания белка СЬк1, аутофосфорилированного по серину 296. Мембрану быстро промывали водой, затем 10 мМ Тпк/НСк рН 8,0, 150 мМ №С1 и 0,05% (об./об.), Т\уееп 20 (ТВЗТ) и выдерживали для пропитки в течение одного часа при 25°С в ТВЗТ/5% (масс./об.) восстановленного сухого молока СагпаЬоп. Мембрану затем промывали четыре раза ТВЗТ в течение 5 минут. Мембрану выдерживали для пропитки при 4°С в течение 16 ч в ТВЗТ/5% (масс./об.) БСА и соответствующем разбавленном кроличьем антителе фосфо-СЬк1 к фосфо-СЬк1 (серин 296). Затем мембрану промывали четыре раза ТВЗТ в течение 5 мин при 25°С, а затем выдерживали для

- 11 022096 пропитки при 25°С в течение 2 ч в ТВ§Т/5% молока, содержащем соответствующим образом разбавленный ослиный антикроличий 1дС, конъюгированный с пероксидазой хрена, для детектирования фосфоСЬк1 (8ег296). Мембрану промывали снова 4 раза ТВ8Т в течение 5 мин при 25°С. Конъюгаты антигенантитело-репортер, иммобилизованные на мембране, детектировали при помощи реагента 8ирег §1дпа1 ХУеЧегп Рет!о для детектирования НКР.

Сигналы детектировали и фиксировали при помощи системы визуализации РИЛ БА8-4000. Интенсивности полос фосфо-СЬк1 (кег296) вычисляли при помощи программного обеспечения То1а1 ЬаЬ (Ыопйпеаг Эупатюк). Ингибирование в процентах индуцированного гемцитабином аутофосфорилирования СЬк1 вычисляли при помощи следующей формулы: ингибирование в % = (интенсивность полосы образец-фосфо-СЬк1 - средняя интенсивность полосы положительный контроль с гемцитабином (Мах)фосфо-СЬк1)/(средняя интенсивность полосы отрицательный контроль (Мш)-фосфо-СЬк1 - средняя интенсивность полосы положительный контроль с гемцитабином (Мах)-фосфо-СЬк1) х 100.

Соединения, включенные в объем настоящего изобретения, исследовали по существу согласно приведенному выше описанию. Например, по результатам исследования соединение согласно примеру 3 имело значение эффективной дозы направленной модуляции (Тагде! Моби1а1огу ЕЛЛесБуе Эоке, ТМЕЭ₅₀) аутофосфорилирования СЬк1, равное 1.3 мг/кг (п=1). Полученный результат показывает, что соединения, включенные в объем настоящего изобретения, эффективно ингибируют активацию протеинкиназы СЬк1 ίη У1Уо.

Модели ксенотрансплантатов опухолей человека

Способность ингибиторов СЬк1 усиливать уничтожение опухолей ДНК-повреждающими агентами можно определять ίη У1уо при помощи эффективных моделей ксенотрансплантатов опухолей легкого Са1и-6 и толстой кишки НТ-29. Клетки рака легкого Са1и-6 помещали в питательную среду (МЕМ и сбалансированный солевой раствор Эрла с Ь-глутамином, содержащий 10% (об./об.) инактивированной нагреванием ЭБС, 1х заменимые аминокислоты для МЕМ, 1х пируват натрия), а клетки рака толстой кишки НТ-29 (АТСС) помещали в питательную среду (среда МакКоя 5А, содержащая 10% ЭБС) и выращивали.

Клетки собирали и промывали дважды фосфатным буферным раствором, и 5х10⁶ клеток (НТ-29) или 1 х 10⁶ клеток (Са1и-6) в питательной среде (не содержащей сыворотку) смешивали с равным объемом матрицы ΒΌ Майтде1™, затем вводили подкожную инъекцию в бок бестимусных мышей (СЭ-Ι пп/пц).

Подкожное введение ингибитора СЬк1

Примерно на 16 день после введения имплантата (150-200 мм³) 60 мг/кг дозу гемцитабина в виде свежеприготовленного в день введения состава в солевом растворе интраперитонеально вводили животным Через 24 ч животным вводили соединение согласно примеру 3 в 0,2% Т\уееп-80/0.5% метилцеллюлозы подкожно два раза в сутки. Через два дня, в которые введение не проводили, повторно проводили три дополнительных цикла дозирования (Ц4Эх4 и соединение согласно примеру 3 с интервалами +24 ч). Подавление роста опухоли (ТС1, (итог дгоМй шЫЬИюп) вычисляли в виде снижения в процентах среднего размера опухоли в группе животных, которым вводили соединение, относительно среднего размера опухоли в контрольной группе животных, которым вводили носитель. Соединения, включенные в объем настоящего изобретения, исследовали по существу согласно приведенному выше описанию. Например, показано, что соединение согласно примеру 3, которое вводили в комбинации с гемцитабином, имело высокую дозозависимую противоопухолевую активность в моделях ксенотрансплантатов опухолей НТ29 и Са1и-6, при этом происходило шестикратное увеличение подавления роста опухоли по сравнению с гемцитабином при его отдельном введении. Полученный результат показывает, что соединения, включенные в объем настоящего изобретения, при подкожном введении значительно увеличивают противоопухолевую активность гемцитабина в моделях ксенотрансплантатов опухолей человека.

НТ29, подкожное введение

Способ лечения	% ТС1 в лень 38	% относительно гемцитабина
Носитель	0	н/в
Гемцитяби и 60 мг/кг	11	-
Пример 3 40 мг/кг	26	н/в
Гем/Пр.З б мг/кг	47	0,0226
Гем/Пр.З 10 мг/кг	55	0,0024
Гем/Пр.З 20 мг/кг	58	0,0008
Гем/Пр.З 40 мг/кг	72	<0,0001

н/в = статистически незначимая величина

- 12 022096

Са1и 6, подкожное введение

Способ лечения	% ТС1 в день 47	% относительно гемцитабина
Носитель	0	н/в
Гемцитаблн 60 мг/кг	-41	-
Пример 3 40 мг/кг	-19	н/в
Гем/Пр.З 5 мг/кг	40	0,0049
Гем/Пр.З 10 мг/кг	32	0,0156
Гем/Пр.З 20 мг/кг	68	<0,0001

н/в = статистически незначимая величина

Пероральное введение ингибитора СЬк1

Примерно на 16 день после введения имплантата (150-200 мм³) 40 мг/кг дозу гемцитабина в виде свежеприготовленного в день введения состава в солевом растворе интраперитонеально вводили животным. Через 24 ч животным вводили соединение-ингибитор СЬк1 в 0,2% Тетееп-80/0,5% метилцеллюлозы перорально два раза в сутки. Через три дня, в которые введение не проводили, повторно проводили три дополнительных цикла дозирования (Ο5Ό/4 и соединение согласно примеру 3 с интервалами +24 ч). Подавление роста опухоли (Τ0Ι) вычисляли согласно описанию, приведенному в предыдущем абзаце. Соединения, включенные в объем настоящего изобретения, исследовали по существу аналогично приведенному выше описанию. Например, показано, что соединение согласно примеру 3, которое вводили в комбинации с гемцитабином, имело высокую дозозависимую противоопухолевую активность в моделях ксенотрансплантатов опухолей НТ-29 и Са1и-6, при этом происходило увеличение подавления роста опухоли в 2,9 раза по сравнению с гемцитабином при его отдельном введении. Полученный результат показывает, что соединения, включенные в объем настоящего изобретения, при пероральном введении значительно увеличивают противоопухолевую активность гемцитабина в моделях ксенотрансплантатов опухолей человека.

Са1и-6, пероральное введение

Способ лечения	% ТС1 в день 37	% относительно гемцитабина
Носитель	0	0,0171
Гем 40 мг/кг	32	-
Пример 3 30 мг/кг	37	н/в
Гем/Пр.З 15 мг/кг	48	0,0652
Гем/Пр.З 30 мг/кг	75	<0,0001

н/в = статистически незначимая величина НТ29, пероральное введение

Способ лечения	% ГС1 в день 50	% относительно гемцитабина
Носитель	0	н/в
Гем 40 мг/кг	25	-
Пример 3 30 мг/кг	39	н/в
Гем/Пр.З 15 мг/кг	68	<0,0001
Гем/Пр.З 30 мг/кг	73	<0,0001

н/в = статистически незначимая величина

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Соединение, представляющее собой (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил][6-(пиперидин-3-илокси)пиразин-2-ил]амин или его фармацевтически приемлемую соль.
2. Соединение по п.1, представляющее собой (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол3-ил]-[6-(пиперидин-3-илокси)пиразин-2-ил]амин.
3. Соединение по п.1, представляющее собой метансульфокислую соль (К)-[5-(2-метокси-6метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил]-[6-(пиперидин-3-илокси)пиразин-2-ил]амина.
4. Соединение по п.1, представляющее собой уксуснокислую соль (К)-[5-(2-метокси-6- 13 022096 метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил]-[6-(пиперидин-3-илокси)пиразин-2-ил]амина.
5. Соединение по п.1, представляющее собой гемиоксалат (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3-ил)2Н-пиразол-3-ил]-[6-(пиперидин-3-илокси)пиразин-2-ил]амина.
6. Соединение по п.1, представляющее собой гемисукцинат (К)-[5-(2-метокси-6-метилпиридин-3ил)-2Н-пиразол-3-ил]-[6-(пиперидин-3-илокси)пиразин-2-ил]амина.
7. Фармацевтическая композиция для ингибирования СЬк1, содержащая соединение или фармацевтически приемлемую соль по любому из пп.1-6 и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель.
8. Применение соединения или фармацевтически приемлемой соли по любому из пп.1-6 для лечения рака.
9. Применение по п.8, где лечение осуществляется одновременно, раздельно или последовательно в комбинации с ионизирующим излучением.
10. Применение по п.8, где лечение осуществляется одновременно, раздельно или последовательно в комбинации с одним или более химиотерапевтическими агентами.
11. Применение по п.10, отличающееся тем, что один или более химиотерапевтических агентов выбраны из группы, состоящей из 5-фторурацила, гидроксимочевины, гемцитабина, метотрексата, пеметрекседа, доксорубицина, этопозида, цисплатина и таксола.
12. Применение по любому из пп.8-11, отличающееся тем, что рак выбран из группы, состоящей из рака мочевого пузыря, рака толстой кишки, рака желудка, рака печени, рака легкого, рака молочной железы, меланомы, рака яичников, рака поджелудочной железы, мезотелиомы, рака почки и рака матки.