EA018471B1 - Слитые конструкции и конъюгаты лекарственного средства - Google Patents

Слитые конструкции и конъюгаты лекарственного средства Download PDF

Info

Publication number
EA018471B1
EA018471B1 EA201001357A EA201001357A EA018471B1 EA 018471 B1 EA018471 B1 EA 018471B1 EA 201001357 A EA201001357 A EA 201001357A EA 201001357 A EA201001357 A EA 201001357A EA 018471 B1 EA018471 B1 EA 018471B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
composition according
fusion
amino acid
exendin
drug
Prior art date
Application number
EA201001357A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201001357A1 (ru
Inventor
Кристофер Херринг
Люси Дж. Хольт
Лоран Жеспер
Брюс Хамилтон
Original Assignee
Глаксо Груп Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Глаксо Груп Лимитед filed Critical Глаксо Груп Лимитед
Publication of EA201001357A1 publication Critical patent/EA201001357A1/ru
Publication of EA018471B1 publication Critical patent/EA018471B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/57563—Vasoactive intestinal peptide [VIP]; Related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)

Abstract

Изобретение относится к слитым конструкциям лекарственного средства, обладающим улучшенными периодами полувыведения из сыворотки. Эти слитые конструкции и конъюгаты содержат полипептиды, единичные вариабельные домены иммуноглобулинов (антител) и молекулы GLP (глюкагоноподобного пептида) и/или эксендина. Изобретение также относится к применению, препаратам, композициям и устройствам, содержащим такие слитые конструкции и конъюгаты лекарственного средства.

Description

Настоящее изобретение относится к слитым конструкциям и конъюгатам лекарственного средства, обладающим улучшенными периодами полувыведения из сыворотки. Эти слитые конструкции и конъюгаты содержат единичные вариабельные домены иммуноглобулинов (антител) и молекулы СЬР и/или эксендина. Изобретение также относится к применению, препаратам, композициям и устройствам, содержащим такие слитые конструкции и конъюгаты лекарственного средства.
Предшествующий уровень техники
Многие лекарственные средства, обладающие активностями, которые могли бы быть полезны для терапевтических и/или диагностических целей, имеют ограниченную ценность, поскольку они быстро выводятся из организма после введения. Например, многие полипептиды, обладающие терапевтически полезными активностями, быстро выводятся из кровотока через почки. Соответственно для достижения желаемого терапевтического эффекта должна быть введена большая доза. Существует потребность в улучшенных терапевтических и диагностических агентах, обладающих улучшенными фармакокинетическими свойствами.
Одним из таких классов лекарственных средств, характеризующихся коротким периодом полувыведения из организма или системного кровотока, являются инкретиновые гормоны, такие как глюкагоноподобный пептид 1 (СЬР) или пептид ΥΥ (ΡΥΥ), а также эксендин, например эксендин-4.
Глюкагоноподобный пептид (СЬР)-1 представляет собой инкретиновый гормон, обладающий мощными глюкозозависимым инсулинотропным и глюкагоностатическим действиями, оказывающий трофические эффекты на β-клетки поджелудочной железы и ингибирующие эффекты на желудочно-кишечную секрецию и моторику, совместно понижающие содержание глюкозы в плазме крови и ослабляющие гликемическую подвижность. Кроме того, благодаря своей способности усиливать чувство насыщения СЬР1 снижает потребление пищи, ограничивая тем самым прирост массы, и может даже вызывать уменьшение массы. Взятые вместе, эти действия придают СЬР-1 уникальный статус, считающийся весьма желательным для противодиабетического средства, в особенности ввиду глюкозозависимого характера его антигипергликемического действия, что должно свести к минимуму любой риск развития тяжелой гипогликемии. Однако фармакокинетический/фармакодинамический профиль таков, что природный СЬР-1 не является терапевтически полезным. Так, в то время как СЬР-1 является наиболее эффективным при непрерывном введении, единичные подкожные инъекции оказывают кратковременные эффекты. СЬР-1 крайне чувствителен к ферментативному расщеплению ίη νίνο и наиболее релевантным является расщепление под действием дипептидилпептидазы IV (ЭРР-ΐν), поскольку оно происходит быстро, и в результате образуется неинсулинотропный метаболит. Поэтому стратегии использования терапевтического потенциала СЬР-1, основанные на понимании факторов, влияющих на его метаболическую стабильность и фармакокинетический/фармакодинамический профиль, находятся в центре интенсивных исследований.
Проведена обширная работа с целью ингибирования пептидазы или модификации СЬР-1 таким образом, чтобы замедлить его расщепление с сохранением при этом биологической активности. В νθ 05/027978 описываются производные СЬР-1, имеющие продолжительный профиль действия. В νθ 02/46227 описываются гетерологичные слитые белки, содержащие полипептид (например, альбумин), слитый с СЬР-1 или его аналогами (описание этих аналогов включено в данное описание посредством ссылки в качестве примеров аналогов СЬР-1, которые могут быть использованы в настоящем изобретении). В νθ 05/003296, νθ 03/060071, νθ 03/059934 описывается амино-слитый белок, в котором СЬР1 слит с альбумином с целью увеличения периода полувыведения данного гормона.
Однако, несмотря на эти усилия, СЬР-1, активный в течение продолжительного периода времени, получен не был.
В силу этого, особенно в отношении диабета и ожирения, существует огромная потребность в получении улучшенных пептидов СЬР-1 или других агентов, таких как эксендин-4, которые аналогичным образом обладают инсулинотропным действием, пригодным для лечения диабета и ожирения, в частности. Таким образом, существует потребность в модификации СЬР-1, эксендина-4 и других инсулинотропных пептидов для обеспечения более длительного периода действия ίη νίνο при сохранении их низкой токсичности и терапевтических преимуществ.
Краткое изложение сущности изобретения
Согласно настоящему изобретению предложена композиция, которая представляет собой слитую конструкцию или конъюгат и которая содержит или состоит из следующего: (а) инсулинотропный(ая) агент или молекула либо лекарственное средство или молекула с инкретиновым эффектом, которыми могут быть, например, эксендин-4 или СЬР-1, например А8С мутант СЬР-1 (7-37), присутствующие в виде слитой конструкции или конъюгата с (б) однодоменным антителом (ЙАЬ) Ό0Μ 71-14 (νΚ). которое специфически связывает сывороточный альбумин (аминокислотная последовательность ΌΘΜ 71-14 показана на фиг. 1(11): 8ЕС ΙΌ N0: 8).
Также, возможно, может присутствовать аминокислотный или химический линкер, соединяющий инсулинотропный агент или лекарственное средство с инкретиновым эффектом, например эксендин-4 и/или СЬР-1, с ЙАЬ, например с Ό0Μ71-14 ЙАЬ. Линкер может представлять собой, например, спиральный линкер, например спиральный линкер с последовательностью, показанной на фиг. 1(к): 8ЕС ΙΌ N0: 11, или он может представлять собой д1у-§ег-линкер, например, с аминокислотной последовательностью,
- 1 018471 показанной на фиг. 1(ί): 8ЕО ГО N0: 12.
В некоторых воплощениях слитые конструкции (или конъюгаты) по изобретению могут содержать дополнительные молекулы, например дополнительные пептиды или полипептиды.
Инсулинотропный агент или лекарственное средство с инкретиновым эффектом (например, эксендин и/или СЬР-1) могут присутствовать в виде конструкции, слитой с Ν-концом или С-концом бЛЬ (или конъюгата).
В некоторых воплощениях изобретения предложен полипептид, содержащий слитую молекулу или состоящий из молекулы, которая выбрана из следующего:
(а) слитая конструкция 2хСЬР-1 (7-37) Л86 Ό0Μ7Ε-14 бЛЬ (ΌΆΤ0114, аминокислотная последовательность показана на фиг. 1(а): 8Е0 ΙΌ N0: 1), (б) слитая конструкция эксендин-4 (64§-линкер)3 Ό0Μ7Ε-14 бЛЬ (ΌΆΤ0115, аминокислотная последовательность показана на фиг. 1(Ь): 8Е0 ΙΌ N0: 2), (в) слитая конструкция эксендин-4 Ό0Μ7Ε-14 бЛЬ (ΟΛΤ0116, аминокислотная последовательность показана на фиг. 1(с): 8Е0 ΙΌ N0: 3), (г) слитая конструкция эксендин-4, спиральный линкер, Ό0Μ7Ε-14 бЛЬ (ΌΆΤ0117, аминокислотная последовательность показана на фиг. 1(6): 8Е0 ΙΌ N0: 4), (д) слитая конструкция СЬР-1 (7-37) Л86 (64§-линкер)3 Ό0Μ7Ε-14 бЛЬ (ΌΆΤ0118, аминокислотная последовательность показана на фиг. 1(е): 8Е0 ΙΌ N0: 5), (е) слитая конструкция СЬР-1 (7-37) Л86 Ό0Μ7Η-14 бЛЬ (ΌΆΤ0119, аминокислотная последовательность показана на фиг. 1(ί): 8Е0 ΙΌ N0: 6), (ж) слитая конструкция СЬР-1 (7-37) Л86, спиральный линкер, Ό0Μ7Η-14 бЛЬ (ΌΆΤ0120, аминокислотная последовательность показана на фиг. 1(д): 8Е0 ΙΌ N0: 7).
Кроме того, согласно изобретению предложены конъюгированные молекулы, содержащие аминокислотные последовательности из числа описанных выше, то есть молекулы с аминокислотными последовательностями, показанными на 8Е0 ΙΌ N0: 1-7, или состоящие из них.
Ω0Μ711-14 представляет собой единичный вариабельный домен иммуноглобулина человека, или бЛЬ (Ук), который связывает сывороточный альбумин, и его аминокислотная последовательность показана на фиг. 1(1ι): 8Е0 ΙΌ N0: 8. СЭР-участки Ό0Μ71-14 бЛЬ подчеркнуты в аминокислотной последовательности, показанной на фиг. 1(11): 8Е0 ΙΌ N0: 8.
Как использовано в данном описании, слитая конструкция относится к слитому белку, содержащему в качестве первой группировки Ό0Μ7Ε-14 бЛЬ. которое связывает сывороточный альбумин, и в качестве второй группировки инсулинотропный агент или лекарственное средство с инкретиновым эффектом. бЛЬ, которое связывает сывороточный альбумин, и лекарственное средство или агент присутствуют в виде отдельных частей (группировок) единой непрерывной полипептидной цепи. Первая (бЛЬ) и вторая (лекарственное средство с инкретиновым эффектом или инсулинотропный агент) группировки могут быть напрямую связаны друг с другом пептидной связью или соединены через подходящий аминокислотный либо пептидный или полипептидный линкер. При необходимости могут присутствовать дополнительные группировки, например пептиды или полипептиды (например, третий, четвертый), и/или линкерные последовательности. Первая группировка может находиться в ^концевом положении, С-концевом положении или внутри по отношению ко второй группировке. В некоторых воплощениях слитый белок содержит одну или более чем одну (например, от одной до примерно 20) группировку бЛЬ.
Как использовано в данном описании, конъюгат относится к композиции, содержащей бЛЬ, связывающее сывороточный альбумин, к которому присоединен(о) ковалентной или нековалентной связью инсулинотропный агент или лекарственное средство с инкретиновым эффектом. Инсулинотропный агент или лекарственное средство с инкретиновым эффектом могут быть ковалентно связаны с 6ЛЬ напрямую или опосредованно через подходящую линкерную группировку. Лекарственное средство или агент могут быть связаны с 6ЛЬ в любом подходящем положении, таком как аминоконец, карбоксильный конец или через подходящие боковые цепи аминокислот (например, ε-аминогруппу лизина или тиольную группу цистеина). Альтернативно, лекарственное средство или агент могут быть нековалентно связаны с бАЬ напрямую (например, в результате электростатического взаимодействия, гидрофобного взаимодействия) или опосредованно (например, в результате нековалентного связывания между партнерами по комплементарному связыванию (например, биотин и авидин), при этом один из партнеров ковалентно связан с лекарственным средством или агентом, а партнер по комплементарному связыванию ковалентно связан с бАЬ).
Кроме того, согласно изобретению предложен (по существу) чистый мономер любого из конъюгатов или любой из слитых конструкций по изобретению, например ΌΑΤ0114, ΌΑΤ0115, ΌΑΤ0116, ΌΑΤ0117, ΌΑΤ0118, ΌΑΤ0119 и ΌΑΤ0120. В одном из воплощений он представляет собой по меньшей мере на 98, 99, 99,5% чистый или на 100% чистый мономер.
Согласно изобретению также предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие слитые конструкции, раскрытые в данном описании, например нуклеиновые кислоты, кодирующие ΌΑΤ0114, ΌΑΤ0115, ΌΑΤ0116, ΌΑΤ0117, ΌΑΤ0118, ΌΑΤ0119 и ΌΑΤ0120 и, например, нуклеиновокислотные последователь
- 2 018471 ности которых показаны на фиг. 2 (8ЕЦ ΙΌ N0: 13-23). Также предложены клетки-хозяева, содержащие эти нуклеиновые кислоты.
Кроме того, согласно изобретению предложен способ получения слитой конструкции по настоящему изобретению, включающий поддержание клетки-хозяина, которая содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту и/или конструкцию, кодирующую слитую конструкцию по изобретению, в условиях, подходящих для экспрессии указанной рекомбинантной нуклеиновой кислоты, в результате чего продуцируется слитая конструкция.
Согласно изобретению также предложены композиции (например, фармацевтические композиции), содержащие слитую конструкцию или конъюгат по изобретению.
Согласно изобретению также предложен способ лечения индивидуума, имеющего такое заболевание или расстройство, как раскрыто в данном описании, например метаболическое заболевание, такое как гипергликемия, нарушенная толерантность к глюкозе, бета-клеточная недостаточность, диабет (например, диабет 1-го типа или 2-го типа или гестационный диабет) или ожирение, или заболевания, характеризующиеся перееданием, например, его можно применять для подавления аппетита, например, при синдроме Прадера-Вилли, и который включает введение указанному индивидууму терапевтически эффективного количества слитой конструкции или конъюгата по изобретению.
Другие метаболические расстройства включают, но не ограничиваются этим, инсулинорезистентность, инсулиновую недостаточность, гиперинсулинемию, гипергликемию, дислипидемию, гиперлипидемию, гиперкетонемию, гипертензию, ишемическую болезнь сердца, атеросклероз, почечную недостаточность, невропатию (например, автономную невропатию, парасимпатическую невропатию и полиневропатию), ретинопатию, катаракты, метаболические расстройства (например, нарушения метаболизма инсулина и/или глюкозы), эндокринные расстройства, ожирение, уменьшение массы, расстройства печени (например, болезнь печени, цирроз печени и расстройства, ассоциированные с трансплантацией печени) и состояния, ассоциированные с этими заболеваниями или расстройствами.
Кроме того, состояния, ассоциированные с диабетом, которые могут быть предупреждены или подвергнуты лечению соединениями по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются этим, гипергликемию, ожирение, диабетическую ретинопатию, мононевропатию, полиневропатию, атеросклероз, язвы, болезнь сердца, инсульт, анемию, гангрену (например, ног и рук), импотенцию, инфекцию, катаракту, ослабленную функцию почек, нарушенное функционирование автономной нервной системы, нарушенную функцию лейкоцитов, запястный синдром, контрактуру Дюпюитрена и диабетический кетоацидоз.
Согласно изобретению также предложены способы лечения или предупреждения заболеваний, ассоциированных с повышенным содержанием глюкозы в крови, включающие введение по меньшей мере одной дозы слитых конструкций или конъюгатов и/или фармацевтических композиций по настоящему изобретению пациенту или субъекту.
Кроме того, изобретение относится к способам регулирования чувствительности к инсулину у пациента, а также способам увеличения захвата глюкозы клеткой и способам регулирования чувствительности клетки к инсулину с использованием конъюгатов или слитых конструкций по изобретению. Также предложены способы стимулирования синтеза и высвобождения инсулина, повышения чувствительности жировой, мышечной или печеночной ткани в отношении захвата инсулина, стимулирования захвата глюкозы, замедления процесса переваривания пищи или блокирования секреции глюкагона у пациента, включающие введение указанному пациенту слитой конструкции или конъюгата по изобретению, например включающие введение по меньшей мере одной дозы лекарственного конъюгата или слитой конструкции и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению.
Слитые конструкции или конъюгаты и/или фармацевтические композиции по изобретению могут быть введены сами по себе или в комбинации с другими молекулами или группировками, например полипептидами, терапевтическими белками и/или молекулами (например, инсулином и/или другими белками (включая антитела)), пептидами или небольшими молекулами, которые регулируют чувствительность к инсулину, массу, болезнь сердца, гипертензию, невропатию, клеточный метаболизм и/или уровни глюкозы, инсулина или других гормонов у пациента. В конкретных воплощениях конъюгаты или слитые конструкции по изобретению вводят в комбинации с инсулином (или производным инсулина, аналогом, слитым белком или средством, усиливающим секрецию инсулина).
Согласно изобретению также предложено применение конъюгата или слитой конструкции по изобретению для изготовления лекарственного средства для лечения заболевания или расстройства, например, любого из упомянутых выше, например метаболического расстройства, такого как гипергликемия, диабет (диабет 1-го или 2-го типа или гестационный диабет) или ожирение.
Изобретение также относится к применению слитой конструкции или конъюгата, как они раскрыты в данном описании, для использования в терапии, диагностике или профилактике.
Слитые конструкции или конъюгаты по изобретению, например бЛЬ компонент слитой конструкции, далее могут быть представлены в формате с большим гидродинамическим размером для дополнительного увеличения периода полувыведения, например, посредством присоединения группы ПЭГ (полиэтиленгликоля), сывороточного альбумина, трансферрина, рецептора трансферрина или, по меньшей
- 3 018471 мере, его трансферринсвязывающей части, Ес-области антитела, или посредством конъюгирования с доменом антитела. Например, ЙАЬ. которое связывает сывороточный альбумин, может быть переведено в формат большего по размеру антигенсвязывающего фрагмента антитела (например, переведено в формат ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ)2, Е(аЬ')2, 1§С, 8сЕу).
В других воплощениях изобретения, изложенных на протяжении всего данного описания, вместо использования ЙАЬ в слитой конструкции по изобретению предполагается, что квалифицированный специалист может использовать домен, который содержит СЭВ из ЙАЬ, например СЭР из Пош7й-14, связывающий сывороточный альбумин (например, СОВ, привитый на подходящий белковый каркас или остов, например аффитело, каркас 8рА (белок А 81арйу1ососси5 аитеиз), домен класса А рецепторов ЬПЬ (липопротеины низкой плотности) или домен ЕСЕ (эпидермального фактора роста). Соответственно данное описание в целом следует истолковывать в отношении описания таких доменов вместо ЙАЬ.
В некоторых воплощениях изобретения предложены слитая конструкция или конъюгат по изобретению, которые содержат инсулинотропный агент или лекарственное средство с инкретиновым эффектом и лиганд с двойной специфичностью или лиганд с множественной специфичностью, содержащие первое ЙАЬ по изобретению, которое связывает сывороточный альбумин, например Пош7й-14, и второе ЙАЬ, которое имеет такую же или другую специфичность связывания по сравнению с первым ЙАЬ и возможно, в случае лигандов с множественной специфичностью, дополнительные ЙАЬ. Второе ЙАЬ (или дополнительные ЙАЬ) возможно может(гут) связываться с другой мишенью, например мишенью ЕдЕг 1с или СЭ5.
Таким образом, в одном из аспектов изобретения предложены слитые конструкции или конъюгаты по изобретению для доставки посредством парентерального введения, например, путем подкожной, внутримышечной или внутривенной инъекций, ингаляции, назальной доставки, трансмукозальной доставки, пероральной доставки, доставки в ЖК (желудочно-кишечный) тракт пациента, ректальной доставки или глазной доставки. В одном из аспектов изобретения предложено применение слитых конструкций или конъюгатов по изобретению в изготовлении лекарственного средства для доставки посредством подкожной инъекции, ингаляции, внутривенной доставки, назальной доставки, трансмукозальной доставки, пероральной доставки, доставки в ЖК тракт пациента, ректальной доставки или глазной доставки.
В одном из аспектов изобретения предложен способ доставки пациенту посредством подкожной инъекции, легочной доставки, внутривенной доставки, назальной доставки, трансмукозальной доставки, пероральной доставки, доставки в ЖК тракт пациента, ректальной или глазной доставки, включающий введение пациенту фармацевтически эффективного количества слитой конструкции или конъюгата по изобретению.
В одном из аспектов изобретения предложен пероральный, инъекционный, ингалируемый, распыляемый или глазной препарат, содержащий слитую конструкцию или конъюгат по изобретению. Такой препарат может представлять собой таблетку, пилюлю, капсулу, жидкость или сироп. В одном из аспектов композиции могут быть введены перорально, например в виде напитка, например, продаваемого в качестве напитка для уменьшения массы для лечения ожирения. В одном из аспектов изобретения предложен препарат для ректальной доставки пациенту, где этот препарат может быть представлен, например, в виде суппозитория.
Композиция для парентерального введения СЬР-1-содержащего соединения может быть изготовлена, например, как описано в νΟ 03/002136 (включенной в данное описание посредством ссылки).
Композиция для назального введения некоторых пептидов может быть изготовлена, например, как описано в европейском патенте № 272097 (принадлежащем Ыоуо Шгйгек А/8) или в νθ 93/18785 (все это включено в данное описание посредством ссылки).
Термин субъект или индивидуум определен в данном описании как включающий таких животных, как млекопитающие, в том числе, но этим не ограничиваясь, приматы (например, люди), крупный рогатый скот, овцы, козы, лошади, собаки, кошки, кролики, морские свинки, крысы, мыши или другие виды жвачных животных, овец, лошадей, псовых, кошачьих, грызунов или мышей.
Согласно изобретению также предложен набор для применения при введении композиций по изобретению (например, конъюгатов или слитых конструкций по изобретению) субъекту (например, пациенту), содержащий композицию (например, конъюгат или слитую конструкцию по изобретению), устройство доставки лекарственного средства и, возможно, инструкции по применению. Композиция (например, конъюгат или слитая конструкция) может быть представлена в виде препарата, такого как лиофилизированный препарат. В некоторых воплощениях устройство доставки лекарственного средства выбрано из группы, состоящей из шприца, ингалятора, устройства для интраназального или глазного введения (например, капельницы с насадкой для мелкокапельного введения, пипетки для глаз или носа) и безыгольного инъекционного устройства.
Композиции (например, конъюгаты или слитые конструкции) по данному изобретению могут быть лиофилизированы с целью хранения и повторного разведения в подходящем носителе перед применением. Можно использовать любой подходящий метод лиофилизации (например, распылительную сушку, сушку в слое) и/или любые подходящие методики повторного разведения.
Специалистам в данной области техники будет очевидно, что лиофилизация и повторное разведе
- 4 018471 ние могут приводить к потере антителами активности в различной степени и что используемые уровни, возможно, следует подводить с целью компенсации. В конкретном воплощении изобретения предложена композиция, содержащая лиофилизированную (подвергнутую сублимационной сушке) композицию (например, конъюгат лекарственного средства, слитую конструкцию лекарственного средства), которая раскрыта в данном описании. Предпочтительно лиофилизированная (подвергнутая сублимационной сушке) композиция (например, конъюгат лекарственного средства, слитая конструкция лекарственного средства) теряет не более чем примерно 20%, или не более чем примерно 25%, или не более чем примерно 30%, или не более чем примерно 35%, или не более чем примерно 40%, или не более чем примерно 45%, или не более чем примерно 50% своей активности (например, связывающей активности в отношении сывороточного альбумина), когда ее подвергают регидратированию. Активность соответствует количеству композиции (например, конъюгата лекарственного средства, слитой конструкции лекарственного средства), необходимому для получения эффекта этой композиции до того, как она была подвергнута лиофилизации. Например, количеству конъюгата или слитой конструкции, необходимому для достижения и поддержания желаемой концентрации в сыворотке в течение желаемого периода времени. Активность композиции (например, конъюгата лекарственного средства, слитой конструкции лекарственного средства) можно определить, используя любой подходящий метод перед лиофилизацией, и активность можно определить, используя тот же метод после регидратации для определения количества потерянной активности.
Согласно изобретению также предложены препараты с непрерывным высвобождением, содержащие слитые конструкции или конъюгаты по изобретению, причем такие препараты с непрерывным высвобождением могут содержать слитую конструкцию или конъюгат по изобретению в комбинации, например, с гиалуроновой кислотой, микросферами или липосомами и другими фармацевтически или фармакологически приемлемыми носителями, эксципиентами и/или разбавителями. Такие препараты с непрерывным высвобождением могут быть в форме, например, суппозиториев.
В одном из аспектов изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая слитую конструкцию или конъюгат по изобретению и фармацевтически или физиологически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 представляет аминокислотные последовательности: (а) ΌΑΤ0114 (8ЕО ΙΌ N0: 1), (Ь) ΌΑΤ0115 (51Т) ΙΌ N0: 2), (с) ΌΑΤ0116 (8Ер ГО N0: 3), (б) ΌΑΤ0117 (51Т) ГО N0: 4), (е) ΌΑΤ0118 (51Т) ГО N0: 5), (ί) ΌΑΤ0119 (51Т) ГО N0: 6), (д) ΌΑΤ0120 (51Т) ГО N0: 7), (й) Пош7й-14 (51Т) ГО N0: 8) (6Α^ (СОВ подчеркнуты), (ί) СЬР-1 7-37 Α(8)0 (8Е0 ΙΌ N0: 9), (]) эксендин-4 (8Е0 ΙΌ N0: 10), (к) спиральный линкер (8Е0 ГО N0: 11), (1) С1у-§ег-линкер (8Е0 ГО N0: 12).
Фиг. 2 представляет нуклеиновокислотные последовательности: (а) ΌΑΤ0114 (конструкция для млекопитающих) (8Е0 ГО N0: 13), (Ь) ΌΑΤ0115 (конструкция для млекопитающих) (8Е0 ГО N0: 14), (с) ΌΑΤ0115 (конструкция, оптимизированная для Е. сой) (8Е0 ГО N0: 15), (б) ΌΑΤ0116 (конструкция для млекопитающих) (8Е0 ГО N0: 16), (е) ΌΑΤ0116 (конструкция, оптимизированная для Е. сой) (8Е0 ГО N0: 17), (ί) ΌΑΤ0117 (конструкция для млекопитающих) (8Е0 ГО N0: 18), (д) ΌΑΤ0117 (конструкция, оптимизированная для Е. сой) (8Е0 ГО N0: 19), (й) ΌΑΤ0118 (конструкция для млекопитающих) (8Е0 ГО N0: 20), (ί) ΌΑΤ0119 (конструкция для млекопитающих) (8Е0 ГО N0: 21), (|) ΌΑΤ0120 (конструкция для млекопитающих) (8Е0 ГО N0: 22), (к) Оош7й-14 (8Е0 ГО N0: 23).
На фиг. 3(а) показано дозозависимое уменьшение массы тела в мышиной модели ожирения в результате введения ΌΑΤ0115; (Ь) показано суточное потребление пищи в мышиной модели ожирения в результате введения ΌΑΤ0115.
На фиг. 4 показаны результаты Э8С (дифференциальной сканирующей калориметрии) для ΌΑΤ0115: сплошная линия - кривая для ΌΑΤ0115, пунктирная линия - подгонка к модели поп-2-йа1е.
На фиг. 5 показаны результаты Э8С для лизоцима: сплошная линия - кривая для лизоцима, пунктирная линия - подгонка к модели поп-2-йа1е (кривые перекрываются, поэтому пунктирную кривую увидеть невозможно).
На фиг. 6 показаны результаты БЕС-МЛЕТБ (стерической эксклюзионной хроматографии/многоуглового лазерного светорассеяния) для ΌΑΤ0115 (М\г - средневзвешенная молекулярная масса; Мп - среднечисленная молекулярная масса; Μζ - ζ-средняя молекулярная масса).
На фиг. 7 показаны результаты δΒ^ΜΑΤΕδ для ΌΑΤ0117.
На фиг. 8 показаны результаты 8ΒС-ΜЛ^^8 для ΌΑΤ0120.
Подробное описание изобретения
Данное изобретение раскрыто до известной степени в рамках этого описания со ссылкой на воплощения, что делает возможным составление ясного и четкого описания. Предполагается и должно быть очевидным, что данные воплощения можно различным образом комбинировать или разделять, не выходя за рамки изобретения.
Если не указано иное, все технические и научные термины, применяемые в настоящем описании, используют то же значение, какое обычно понимается средним специалистом в данной области техники (например, в культивировании клеток, молекулярной генетике, химии нуклеиновых кислот, гибридиза
- 5 018471 ционных методиках и биохимии). Для молекулярных, генетических и биохимических методов (в целом см. 8ашЬгоок е( а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаФгу Мапиа1, 26 еб. (1989) Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬогаФгу Рге§8, Со1б 8ргшд НагЬог, Ν.Υ. и Лн5нЬе1 е( а1., 81юг( РгоЮсоЬ ίη Мо1еси1аг Вю1оду (1999) 4‘Ь Еб, 1оЬп ЭД11еу & 8оп5. 1пс., которые включены в данное описание посредством ссылки), и химических методов используют стандартные методики.
Термин инсулинотропный агент, как он использован в данном описании, означает соединение, которое способно стимулировать или вызывать стимуляцию синтеза или экспрессии либо активности гормона инсулина. Известные примеры инсулинотропных агентов включают, например, глюкозу, С1Р (глюкозозависимый инсулинотропный полипептид), СЕР, эксендин (например, эксендин-4 и эксендин3), ΡΥΥ и ОХМ (окситомодулин), но не ограничиваются этим.
Термин инкретин, как он использован в данном описании, означает тип желудочно-кишечного гормона, который вызывает увеличение количества инсулина, высвобожденного, когда уровни глюкозы находятся в норме или, в особенности, когда они повышены. Примеры включают СЬР-1, С1Р, ОХМ, ΡΥΥ, УГР (вазоактивный интестинальный пептид) и РР (панкреатический полипептид).
Термин аналог, как он использован в данном описании в отношении полипептида, означает модифицированный пептид, где один или более аминокислотных остатков пептида заменены на другие аминокислотные остатки, и/или где один или более аминокислотных остатков делетированы из пептида, и/или где один или более аминокислотных остатков добавлены к пептиду. Такие вставка или делеция аминокислотных остатков могут происходить на Ν-конце пептида и/или на С-конце пептида или они могут быть внутри пептида. Для описания аналогов СЬР-1 используют простую систему: например, СЬР-1 А8С (аминокислоты 7-37) обозначает аналог СЬР-1, в котором природный аланин в положении 8 заменен на остаток глицина. Формулы пептидных аналогов и производных изображают, используя стандартное однобуквенное обозначение для аминокислот, применяемое в соответствии с номенклатурой ГОРАС-ГОВ (Международный союз теоретической и прикладной химии/Международный биохимический союз).
Как он использован в данном описании, термин фрагмент, когда его используют в отношении полипептида, представляет собой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая является такой же, как часть, но не вся аминокислотная последовательность целого природного полипептида. Фрагменты могут быть автономными или могут содержаться внутри большего по размеру полипептида, где они образуют часть или область в виде единой непрерывной области в едином большем по размеру полипептиде. В качестве примера фрагмент существующего в природе СЬР-1 будет включать аминокислоты 7-36 природных аминокислот 1-36. Кроме того, фрагменты полипептида также могут представлять собой варианты природной частичной последовательности. Например, фрагмент СЬР-1, содержащий аминокислоты 7-30 природного СЬР-1, также может представлять собой вариант, имеющий аминокислотные замены внутри его частичной последовательности.
Примеры подходящих инсулинотропных агентов по изобретению включают СЬР-1, производные СЬР-1, аналоги СЬР-1 или производное аналога СЬР-1. В дополнение к этому они включают эксендин-4, аналоги эксендина-4 и производные или фрагменты эксендина-4 и эксендин-3, производные эксендина-3 и аналоги эксендина-3.
Термин СЬР-1, как он использован в данном описании, означает СЬР-1 (7-37), СЬР-1 (7-36), СЬР1 (7-35), СЬР-1 (7-38), СЬР-1 (7-39), СЬР-1 (7-40), СЬР-1 (7-41), аналог СЬР-1, пептид СЬР-1, производное или мутант СЬР-1 или фрагмент или производное аналога СЬР-1. Такие пептиды, мутанты, аналоги и производные представляют собой инсулинотропные агенты.
Например, СЬР-1 может представлять собой А8С мутант СЬР-1 (7-37) с аминокислотной последовательностью, показанной на фиг. 1(1): 8ЕС ΙΌ N0: 9.
Другие аналоги СЬР-1 описаны в международной заявке на патент № 90/11296 (ТЬе Сепега1 Но§рЬа1 СогрогаЬоп), которая относится к пептидным фрагментам, содержащим СЬР-1 (7-36) и его функциональные производные и обладающим инсулинотропной активностью, превышающей инсулинотропную активность СЬР-1 (1-36) или СЬР-1 (1-37), и к их применению в качестве инсулинотропных агентов (включена в данное описание посредством ссылки, в частности, путем предоставления примеров лекарственных средств для применения в настоящем изобретении).
В международной заявке на патент № ЭД0 91/11457 (Виск1еу е( а1.) описываются аналоги активных пептидов 7-34, 7-35, 7-36 и 7-37 СЬР1, которые также могут быть полезны в качестве СЬР-1-содержащих лекарственных средств по настоящему изобретению (включена в данное описание посредством ссылки, в частности, путем предоставления примеров лекарственных средств или агентов для применения в настоящем изобретении).
Термин пептид эксендин-4, как он использован в данном описании, означает эксендин-4 (1-39), аналог эксендина-4, фрагмент пептида эксендина-4, производное эксендина-4 или производное аналога эксендина-4. Такие пептиды, фрагменты, аналоги и производные представляют собой инсулинотропные агенты. Аминокислотная последовательность эксендина-4 (1-39) показана на фиг. 1()): 8ЕС ΙΌ N0: 10.
Другие аналоги эксендина, которые полезны для настоящего изобретения, описаны в РСТ публикациях патентов \У0 99/25728 (Вее1еу е1 а1.), ЭД0 99/25727 (Вее1еу е1 а1.), ЭД0 98/05351 (Уонну е1 а1.), ЭД0
- 6 018471
99/40788 (Уоипд е! а1.), \¥О 99/07404 (Вее1еу е! а1.) и \УО 99/43708 (Кпибкеп е! а1.) (все они включены в данное описание посредством ссылки, в частности, путем предоставления примеров лекарственных средств для применения в настоящем изобретении).
Как использовано в данном описании, пептид относится к аминокислотам в количестве от примерно двух до примерно 50, соединенным вместе посредством пептидных связей.
Как использовано в данном описании, полипептид относится по меньшей мере к примерно 50 аминокислотам, соединенным вместе посредством пептидных связей. В большинстве случаев полипептиды имеют третичную структуру и свернуты в функциональные домены.
Как использовано в данном описании, дисплейная система относится к системе, в которой коллекция полипептидов или пептидов доступна для селекции на основании желаемой характеристики, такой как физическая, химическая или функциональная характеристика. Дисплейная система может представлять собой подходящий репертуар полипептидов или пептидов (например, в растворе, иммобилизованный на подходящей подложке). Дисплейная система также может представлять собой систему, которая использует клеточную экспрессирующую систему (например, экспрессию библиотеки нуклеиновых кислот, например, в трансформированных, инфицированных, трансфицированных или трансдуцированных клетках, и экспонирование кодируемых полипептидов на поверхности этих клеток) или неклеточную экспрессирующую систему (например, компартментализацию с использованием эмульсии и дисплей). Типичные дисплейные системы связывают кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и физические, химические и/или функциональные характеристики полипептида или пептида, кодируемого данной нуклеиновой кислотой. В случае использования такой дисплейной системы могут быть отобраны полипептиды или пептиды, имеющие желаемую физическую, химическую и/или функциональную характеристику, а нуклеиновая кислота, кодирующая выбранный полипептид или пептид, легко может быть выделена или извлечена. В данной области техники известен ряд дисплейных систем, которые связывают кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и физические, химические и/или функциональные характеристики полипептида или пептида, например дисплей на основе бактериофагов (фаговый дисплей, например фагмидный дисплей), рибосомный дисплей, компартментализация с использованием эмульсии и дисплей, дисплей на основе дрожжевых клеток, дисплей с использованием пуромицина, дисплей на основе бактерий, дисплей на плазмиде, ковалентный дисплей и тому подобное (см., например, ЕР 0436597 (Буах), патент США № 6172197 (МеСайейу е! а1.), патент США № 6489103 (Стйййк е! а1.)).
Как использовано в данном описании, термин функциональный описывает полипептид или пептид, обладающий биологической активностью, такой как специфическая связывающая активность. Например, термин функциональный полипептид включает в себя антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с целевым антигеном посредством своего антигенсвязывающего сайта.
Как использовано в данном описании, целевой лиганд относится к лиганду, который специфически или селективно связывается полипептидом или пептидом. Например, если полипептид представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, то целевым лигандом может быть любой желаемый антиген или эпитоп. Связывание с целевым антигеном зависит от функциональности данного полипептида или пептида.
Как использовано в данном описании, антитело относится к 1дС, 1дМ, 1дА, 1дЭ или 1дЕ или фрагменту (такому как ЕаЬ, Е(аЬ')2, Εν, связанный дисульфидной связью Εν, 5θΡν. полиспецифическое антитело с закрытой конформацией, связанный дисульфидной связью 5θΡν, диатело), независимо от того, происходят ли они из какого-либо вида естественным образом продуцируемого антитела или созданы с использованием технологии рекомбинантной ДНК; независимо от того, выделены ли они из сыворотки крови, В-клеток, гибридом, трансфектом, дрожжей или бактерий.
Как использовано в данном описании, формат антитела относится к любой подходящей полипептидной структуре, в которую могут быть инкорпорированы один или более вариабельных доменов антитела с тем, чтобы придать данной структуре специфичность связывания с антигеном. В данной области техники известен ряд подходящих форматов антител, таких как химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, одноцепочечные антитела, биспецифические антитела, тяжелые цепи антител, легкие цепи антител, гомодимеры и гетеродимеры тяжелых цепей и/или легких цепей антител, антигенсвязывающие фрагменты любого из перечисленного выше (например, Εν-фрагмент (например, одноцепочечный Εν (8θΕν), связанный дисульфидной связью Εν), ЕаЬ-фрагмент, ЕаЬ'-фрагмент, Е(аЬ')2фрагмент), единичный вариабельный домен антитела (например, бАЬ, νΗ, νΗΗ, Уь) и модифицированные версии любого из перечисленного выше (например, модифицированные посредством ковалентного присоединения полиэтиленгликоля или другого подходящего полимера или гуманизированные νΗΗ).
Фраза иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен относится к вариабельному домену антитела (νΗ, νΗΗ, ν^, специфически связывающемуся с антигеном или эпитопом независимо от других ν-областей или доменов. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен может быть представлен в формате (например, гомо- или гетеромультимер) с другими вариабельными областями или вариабельными доменами, где другие области или домены не требуются для связывания антигена с единичным иммуноглобулиновым вариабельным доменом (т.е. когда иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен связывается с антигеном независимо от дополнительных вариабельных доменов). Одно
- 7 018471 доменное антитело или бЛЬ представляет собой то же, что и иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, как этот термин используется в данном описании. Единичный иммуноглобулиновый вариабельный домен представляет собой то же, что и иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, как этот термин используется в данном описании. Единичный вариабельный домен антитела представляет собой то же, что и иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, как этот термин используется в данном описании. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен в одном из воплощений представляет собой вариабельный домен антитела человека, но также включает единичные вариабельные домены антител из других видов, как, например, Унн ЙЛЬ грызунов (например, как описано в 4О 00/29004, содержание которой включено в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки), усатых акул и верблюдов. Верблюжьи Унн представляют собой полипептиды иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, происходящие из видов, включающих верблюда, ламу, альпаку, дромедара и гуанако, которые продуцируют состоящие из тяжелых цепей антитела, по своей природе лишенные легких цепей. Унн может быть гуманизирован.
Домен представляет собой свернутую белковую структуру, сохраняющую свою третичную структуру независимо от остальной части белка. В большинстве случаев домены ответственны за отдельные функциональные свойства белков и во многих случаях могут быть добавлены, удалены или перенесены в другие белки без потери функции оставшейся части белка и/или домена. Единичный вариабельный домен антитела представляет собой свернутый полипептидный домен, содержащий последовательности, характерные для вариабельных доменов антител. Следовательно, он включает полные вариабельные домены антител и модифицированные вариабельные домены, например, в которых одна или более петель заменены на последовательности, нехарактерные для вариабельных доменов антител, или вариабельные домены антител, которые укорочены или содержат Ν- или С-концевые удлиняющие сегменты, а также свернутые фрагменты вариабельных доменов, которые сохраняют, по меньшей мере частично, связывающую активность и специфичность полноразмерного домена.
Термин библиотека относится к смеси гетерогенных полипептидов или нуклеиновых кислот. Библиотека состоит из членов, каждый из которых имеет отдельную полипептидную или нуклеиновокислотную последовательность. До некоторой степени библиотека является синонимом репертуару. Различия в последовательностях среди членов библиотеки ответственны за разнообразие, представленное в этой библиотеке. Библиотека может принимать форму простой смеси полипептидов или нуклеиновых кислот или может быть в форме микроорганизмов или клеток, например бактерий, вирусов, клеток животных и растений и т.п., трансформированных с использованием библиотеки нуклеиновых кислот. В одном из воплощений каждый индивидуальный микроорганизм или клетка содержит только один член библиотеки или ограниченное их количество. В одном из воплощений нуклеиновые кислоты инкорпорированы в экспрессирующие векторы для того, чтобы способствовать экспрессии полипептидов, кодируемых данными нуклеиновыми кислотами. Следовательно, в одном аспекте библиотека может принимать форму популяции микроорганизмов хозяина, при этом каждый микроорганизм содержит одну или более копий экспрессирующего вектора, содержащего единичный член библиотеки в форме нуклеиновой кислоты, которая может быть экспрессирована с целью получения соответствующего ей полипептидного члена. Таким образом, популяция микроорганизмов хозяина имеет возможность кодировать большой репертуар различающихся полипептидов.
Как использовано в данном описании, термин доза относится к количеству слитой конструкции или конъюгата, вводимому субъекту полностью за один раз (стандартная доза) или посредством двух или более введений в течение определенного временного интервала. Например, доза может обозначать количество слитой конструкции или конъюгата, вводимое субъекту курсом, продолжающимся в течение одних суток (24 ч) (суточная доза), двух суток, одной недели, двух недель, трех недель или одного или более месяцев (например, путем однократного введения или путем двух или более введений). Интервал между дозами может быть равен любому желаемому количеству времени.
Фраза период полувыведения относится ко времени, необходимому для уменьшения концентрации слитой конструкции или конъюгата в сыворотке или плазме крови на 50% ίη νίνο, например, вследствие разрушения и/или выведения или удаления под действием природных механизмов. В результате связывания с молекулами сывороточного альбумина, например сывороточного альбумина человека (н§Л), что препятствует разрушению и/или выведению или удалению, слитые конструкции или конъюгаты по изобретению стабилизируются ίη νίνο, и их период полувыведения увеличивается. Эти молекулы сывороточного альбумина представляют собой природные белки, которые сами имеют длительный период полувыведения ίη νίνο. Период полувыведения молекулы увеличивается, если ее функциональная активность продолжает сохраняться ίη νίνο в течение более длительного периода времени по сравнению с похожей молекулой, которая не обладает специфичностью к молекуле, увеличивающей период полувыведения. Например, слитая конструкция или конъюгат по изобретению, содержащие бЛЬ. специфичное к сывороточному альбумину человека (н§Л), и лекарственное средство с инкретиновым эффектом или инсулинотропный агент, такой как СЕР-1 или эксендин, сравнивают с тем же самым лигандом, где специфичность к н§Л не присутствует, то есть который не связывается с н§Л, а связывается с другой молекулой. Например, он может связываться с третьей мишенью на данной клетке. Обычно период по
- 8 018471 лувыведения увеличивается на 10, 20, 30, 40, 50% или более. Возможны увеличения периода полувыведения в диапазоне 2х, 3х, 4х, 5х, 10х, 20х, 30х, 40х, 50х или более. Альтернативно или в дополнение к этому, возможны увеличения периода полувыведения в диапазоне до 30х, 40х, 50х, 60х, 70х, 80х, 90х, 100 х, 150 х включительно.
Как использовано в данном описании, гидродинамический размер относится к кажущемуся размеру молекулы (например, белковой молекулы, лиганда), основанному на диффузии молекулы через водный раствор. Можно провести анализ диффузии или движения белка через раствор для выявления кажущегося размера белка, который задается радиусом Стокса или гидродинамическим радиусом белковой частицы. Гидродинамический размер белка зависит как от массы, так и формы (конформации), так что два белка, имеющие одну и ту же молекулярную массу, могут иметь различные гидродинамические размеры, если исходить из общей конформации белка.
Вычисления гомологии или идентичности либо сходства между двумя последовательностями (эти термины используются в данном описании взаимозаменяемо) выполняют следующим образом. Последовательности выравнивают в целях оптимального сравнения (например, могут быть введены разрывы в одну или обе первую и вторую аминокислотную или нуклеиновокислотную последовательность для оптимального выравнивания, а негомологичными последовательностями можно пренебречь для сравнительных целей). В одном воплощении длина сравниваемой последовательности, выравненной для сравнительных целей, равна по меньшей мере 30%, или по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 50%, или по меньшей мере 60%, или по меньшей мере 70, 80, 90, 100% длины последовательности сравнения. Затем проводят сравнение аминокислотных остатков или нуклеотидов в соответствующих аминокислотных положениях или нуклеотидных положениях. Если какое-либо положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующее положение во второй последовательности, тогда молекулы являются идентичными по этому положению (как использовано в данном описании, аминокислотная или нуклеиновокислотная гомология эквивалентна аминокислотной или нуклеиновокислотной идентичности). Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией количества идентичных положений, общих для этих последовательностей, с учетом количества разрывов и длины каждого разрыва, которые необходимы для введения с целью оптимального выравнивания двух последовательностей. Выравнивания аминокислотной и нуклеотидной последовательности и их гомология, сходство или идентичность, как определено в данном описании, могут быть проведены и определены с применением алгоритма ВЬА8Т 2 8сциспсс5. используя параметры по умолчанию (Та1и8оуа, Т.А. с1 а1., ГЕМ8 М1стоЫо1. Ьей, 174: 187-188 (1999)).
Нуклеиновые кислоты, клетки-хозяева.
Данное изобретение относится к выделенным и/или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, кодирующим слитые конструкции по изобретению, раскрытые в данном описании, например кодируемые 8ЕС ΙΌ N0: 13-23.
Нуклеиновыми кислотами, обозначаемыми в данном описании как выделенные, являются нуклеиновые кислоты, которые были отделены от другого материала (например, других нуклеиновых кислот, таких как геномная ДНК, кДНК и/или РНК) в их первоначальном окружении (например, в клетках или в смеси нуклеиновых кислот, такой как библиотека). Выделенная нуклеиновая кислота может быть выделена в виде части вектора (например, плазмиды).
Нуклеиновыми кислотами, обозначенными в данном описании как рекомбинантные, являются нуклеиновые кислоты, которые были получены с использованием методологии рекомбинантной ДНК, включая способы, в основе которых лежит искусственная рекомбинация, такая как клонирование в вектор или хромосому с использованием, например, рестрикционных ферментов, гомологичная рекомбинация, использование вирусов и т.п., и нуклеиновые кислоты, полученные с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Изобретение также относится к рекомбинантной клетке-хозяину, например клетке млекопитающих или микробной клетке, которая содержит (одну или более) рекомбинантную нуклеиновую кислоту или экспрессирующую конструкцию, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую слитую конструкцию по изобретению, которая раскрыта в данном описании. Также предложен способ получения слитой конструкции по изобретению, которая раскрыта в данном описании, включающий поддержание рекомбинантной клетки-хозяина, например клетки млекопитающего или микробной клетки, по изобретению в условиях, подходящих для экспрессии слитого полипептида. Этот способ может дополнительно включать стадию выделения или извлечения слитой конструкции, если желательно.
Например, молекулу нуклеиновой кислоты (то есть одну или более чем одну молекулу нуклеиновой кислоты), кодирующую слитый полипептид по изобретению, или экспрессирующую конструкцию (то есть одну или более чем одну конструкцию), содержащую такую(ие) молекулу(ы) нуклеиновой кислоты, можно ввести в подходящую клетку-хозяина для создания рекомбинантной клетки-хозяина, используя любой способ, соответствующий выбранной клетке-хозяину (например, трансформацию, трансфекцию, электропорацию, инфекцию), с тем чтобы данные молекулы нуклеиновой кислоты были функциональным образом связаны с одним или более элементами контроля экспрессии (например, в векторе, в конст
- 9 018471 рукции, созданной в результате процессов, протекающих в клетке, интегрированной в геном клеткихозяина). Полученную рекомбинантную клетку-хозяина можно поддерживать в условиях, подходящих для экспрессии (например, в присутствии индуктора, в подходящем животном, в подходящих культуральных средах, дополненных соответствующими солями, ростовыми факторами, антибиотиками, пищевыми добавками и т.д.), в результате чего продуцируется кодируемый пептид или полипептид. Если желательно, кодируемый пептид или полипептид может быть выделен или извлечен (например, из животного, клетки-хозяина, среды, молока). Этот способ охватывает экспрессию в клетке-хозяине трансгенного животного (см., например, кО 92/03918, СеиРйатт 1п1егпайопа1).
Слитые полипептиды по изобретению, раскрытые в данном описании, также могут продуцироваться в подходящей экспрессирующей системе ш νίΐτο, например, путем химического синтеза или посредством любого другого подходящего метода.
Как изложено и приведено в качестве примера в данном описании, слитые конструкции или конъюгаты по изобретению обычно связывают сывороточный альбумин с высокой аффинностью.
Например, слитые конструкции или конъюгаты по изобретению могут связывать сывороточный альбумин человека с аффинностью (ΚΌ; ΚΌ = Ко££(кб)/Кои(ка) (как определено поверхностным плазмонным резонансом) от примерно 5 мкМ до примерно 100 пМ, например от примерно 1 мкМ до примерно 100 пМ, например 400-800 нМ, например примерно 600 нМ.
Слитая конструкция или конъюгаты по изобретению могут быть экспрессированы в Е. сой или в видах Р1сЫа (например, Р. раЧопх). В одном из воплощений слитая конструкция секретируется в количестве по меньшей мере примерно 0,5 мг/л при экспрессии в Е. сой или в видах Р1сй1а (например, Р. раЧопх); или в культуре клеток млекопитающего (например, клетках СНО (яичника китайского хомячка) или НЕК293 (почки человеческого эмбриона)). Несмотря на то что слитые конструкции или конъюгаты, раскрытые в данном описании, могут секретироваться при экспрессии их в Е. сой, или в видах Р1сй1а, или в клетках млекопитающих, они могут быть получены с использованием любого подходящего метода, такого как методы химического синтеза или методы биологического продуцирования, в которых не используют Е. сой или виды Р1сй1а.
В некоторых воплощениях слитые конструкции и конъюгаты по изобретению эффективны в таких животных моделях, как описанные в кО 2006/059106 (например, на с. 104, 105 опубликованной кО 2006/059106), или таких, которые раскрыты в данном описании в разделе Примеры, когда вводят эффективное количество. Обычно эффективное количество составляет от примерно 0,0001 до примерно 10 мг/кг (например, от примерно 0,001 до примерно 10 мг/кг, например, от примерно 0,001 до примерно 1 мг/кг, например, от примерно 0,01 до примерно 1 мг/кг, например, от примерно 0,01 до примерно 0,1 мг/кг). Данные модели заболевания знакомы специалистам в данной области техники в качестве моделей, прогнозирующих терапевтическую эффективность у людей.
В общем, представленные слитые конструкции и конъюгаты по изобретению будут использованы в очищенной форме вместе с фармакологически или физиологически приемлемыми носителями. Обычно эти носители могут включать водные или спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, каждое из которых включает физиологический раствор и/или буферные среды. Парентеральные разбавители могут включать раствор хлорида натрия, декстрозный раствор Рингера, декстрозу и хлорид натрия и раствор Рингера с лактатом. Подходящие физиологически приемлемые адъюванты, при необходимости хранения полипептидного комплекса в суспензии, могут быть выбраны из таких загустителей, как карбоксиметилцеллюлоза, поливинилпирролидон, желатин и альгинаты.
Внутривенные разбавители включают жидкость, питательные добавки и электролитные добавки, например, на основе декстрозного раствора Рингера. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как антимикробные средства, антиоксиданты, хелатирующие агенты и инертные газы (Маск (1982) РетйщЮп'х Рйаттасеийса1 Баеисез, 16-е изд.). Можно использовать ряд подходящих композиций, включая композиции с продолжительным высвобождением.
Способ введения фармацевтических композиций по изобретению может быть любым из способов, общеизвестных средним специалистам в данной области техники. Что касается терапии, то слитые конструкции или конъюгаты лекарственного средства по изобретению могут быть введены любому пациенту в соответствии со стандартными методиками.
Введение может быть осуществлено любым приемлемым способом, в том числе парентерально, внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно, перорально, трансдермально, через легочный путь или также соответственно посредством прямой инфузии с использованием катетера. Дозировка и частота введения будут зависеть от возраста, пола и состояния пациента, совместного введения с другими лекарственными средствами, противопоказаний и других параметров, которые должны быть учтены практикующим врачом. Введение может быть локальным или системным, по показаниям.
В одном из воплощений изобретения предложена легочная композиция для доставки в легкое, содержащая (а) конъюгаты и слитые конструкции по изобретению и (б) фармацевтически приемлемый буфер, и где эта композиция содержит капельки жидкости и примерно 40% или более, например 50% или более, из этих капелек жидкости, присутствующих в композиции, имеют размер в диапазоне менее 6 мкм, например от примерно 1 до примерно 6 мкм, например менее примерно 5 мкм, например от при
- 10 018471 мерно 1 до примерно 5 мкм. Эти композиции особенно подходят для введения субъекту путем прямой доставки локально в легкое. Например, эти композиции могут быть введены непосредственно в легкое, например, путем ингаляции, например, с использованием распылительного устройства. Эти композиции для легочной доставки могут содержать физиологически приемлемый буфер, который имеет рН в диапазоне от примерно 4 до примерно 8, например от примерно 7 до примерно 7,5, и вязкость, примерно равную вязкости раствора ПЭГ 1000 в концентрации от примерно 2 до примерно 10% в 50 мМ фосфатном буфере, содержащем 1,2% (мас./об.) сахарозы.
Слитые конструкции или конъюгаты по данному изобретению могут быть лиофилизированы с целью хранения и повторного разведения в подходящем носителе перед применением. Показано, что эта методика эффективна для традиционных иммуноглобулинов и что можно использовать известные в данной области методики лиофилизации и повторного разведения. Специалистам в данной области техники будет очевидно, что лиофилизация и повторное разведение могут приводить к потере антителами активности в различной степени (например, что касается традиционных иммуноглобулинов, то антитела 1дМ имеют тенденцию к большей потере активности, нежели антитела 1дС), и что используемые уровни возможно следует увеличить с целью компенсации.
Что касается профилактических применений, например, при введении индивидуумам с диагнозом предшествующего диабету состояния или инсулинорезистентности, то композиции, содержащие слитые конструкции или конъюгаты по настоящему изобретению, также можно вводить в аналогичных или немного пониженных дозировках для предупреждения, торможения или задержки начала заболевания (например, для поддержания ремиссии или состояния покоя либо для предупреждения острой фазы). Квалифицированный врач-клиницист будет способен определить соответствующий интервал дозирования для лечения, подавления или предупреждения заболевания. Если слитую конструкцию или конъюгат по изобретению вводят для лечения, подавления или предупреждения заболевания, то их можно вводить до четырех раз в сутки, два раза в неделю, один раз в неделю, один раз каждые две недели, один раз в месяц или один раз каждые два месяца в дозе, например, от примерно 0,0001 до примерно 10 мг/кг (например, от примерно 0,001 до примерно 10 мг/кг, например, от примерно 0,001 до примерно 1 мг/кг, например, от примерно 0,01 до примерно 1 мг/кг, например, от примерно 0,01 до примерно 0,1 мг/кг).
Лечение или терапия, осуществляемые с использованием композиций, раскрытых в данном описании, считаются эффективными, если происходит ослабление одного или более симптомов (например, по меньшей мере на 10% или по меньшей мере на один пункт по клинической оценочной шкале) по сравнению с такими симптомами, присутствующими до лечения, или по сравнению с такими симптомами у индивидуума (человека или модельного животного), не подвергаемого лечению такой композицией, или с другим подходящим контролем. Несомненно, симптомы будут варьировать в зависимости от точной природы заболевания или расстройства, на которое направлено лечение, но они могут быть определены врачом-клиницистом или специалистом средней квалификации.
Аналогично, профилактика, осуществляемая с использованием композиций, раскрытых в данном описании, является эффективной, если происходит задержка начала одного или более симптомов или тяжесть одного или более симптомов ослабляется или аннулируется по сравнению с таковыми симптомами у схожего индивидуума (человека или модельного животного), который не подвергается лечению композицией.
Слитые конструкции и конъюгаты по настоящему изобретению могут быть использованы в виде отдельно вводимых композиций или они могут быть введены вместе с другими терапевтическими или активными агентами, например другими полипептидами или пептидами или небольшими молекулами. Эти дополнительные агенты могут включать различные лекарственные средства, такие как, например, метформин, инсулин, глитазоны (например, розаглитазон), иммуносупрессивные средства, иммуностимуляторы.
Слитые конструкции и конъюгаты по изобретению могут быть введены и/или изготовлены вместе с одним или более чем одним дополнительным терапевтическим или активным агентом. Если слитую конструкцию или конъюгат по изобретению вводят вместе с дополнительным терапевтическим агентом, то слитая конструкция или конъюгат могут быть введены перед введением, одновременно с введением или после введения дополнительного агента. В большинстве случаев слитую конструкцию или конъюгат по изобретению и дополнительный агент вводят способом, который обеспечивает перекрывание терапевтического эффекта.
Период полувыведения.
Увеличенный период полувыведения инсулинотропного агента или лекарственного средства с инкретиновым эффектом, например лиганда СЬР-1 или эксендина, полезен для применений ίη νίνο. Эта проблема решается данным изобретением путем обеспечения увеличенного периода полувыведения ίη νίνο инсулинотропного агента или лекарственного средства с инкретиновым эффектом, например СЬР и эксендина, и вследствие этого более продолжительного времени сохранения в организме функциональной активности этих молекул.
Как раскрыто в данном описании, композиции по изобретению (то есть содержащие слитые конструкции или конъюгаты, раскрытые в данном описании) могут иметь значительно более пролонгирован
- 11 018471 ный период полувыведения из сыворотки или плазмы крови ίη νίνο, и/или увеличенную ЛИС, и/или увеличенное среднее время удержания (МКТ) по сравнению с одним инсулинотропным агентом или лекарственным средством с инкретиновым эффектом. К тому же, активность инсулинотропного агента или лекарственного средства с инкретиновым эффектом в большинстве случаев не изменяется в значительной степени в композиции по изобретению (например, конъюгате или слитой конструкции). Тем не менее, некоторое изменение в активности композиций по изобретению по сравнению с одним инсулинотропным агентом или лекарственным средством с инкретиновым эффектом приемлемо и в большинстве случаев компенсируется улучшенными фармакокинетическими свойствами конъюгатов или слитых конструкций по изобретению. Например, конъюгаты или слитые конструкции лекарственного средства по изобретению могут связываться с мишенью этого лекарственного средства с более низкой аффинностью, чем само лекарственное средство, но они имеют примерно эквивалентную или более высокую эффективность по сравнению с самим лекарственным средством благодаря улучшенным фармакокинетическим свойствам (например, пролонгированному периоду полувыведения из сыворотки крови ίη νίνο, большей ЛИС) лекарственной композиции. Кроме того, благодаря увеличенному периоду полувыведения конъюгаты или слитые конструкции по изобретению можно вводить реже, чем один инсулинотропный агент или лекарственное средство с инкретиновым эффектом, например их можно давать пациентам один раз в месяц или один раз в неделю, и при их использовании также можно получить более постоянный уровень инсулинотропного агента или лекарственного средства с инкретиновым эффектом в крови, чем при введении одного инсулинотропного агента или лекарственного средства с инкретиновым эффектом, тем самым достигая желаемого терапевтического или профилактического эффекта.
Методы фармакокинетического анализа и определения периода полувыведения лиганда знакомы специалистам в данной области техники. Подробности можно найти в Ксппс111. А. с1 а1. СЬешюа1 81аЫ1Цу οί РЬаттасеийсай: А НапбЬоок Гот РЬагтасйБ и в Рс1сг5 с1 а1., РЬаттасокшейс апа1уз1з: А Ргас(1са1 АрргоасЬ (1996). Также приведена ссылка на книгу РЬаттасокшейсз, М. С1Ьа1б1 & Ό. Реггоп, опубликованную Магсе1 Эеккет, 2-е перераб. и испр. изд. (1982), где описаны такие фармакокинетические параметры, как периоды полувыведения ΐ-альфа и ΐ-бета и площадь под кривой (АИС).
Периоды полувыведения (ΐ1/2 альфа и ΐ1/2 бета), и АИС, и МКТ можно определить из кривой зависимости концентрации лиганда в плазме или сыворотке крови от времени. Для определения формы кривой можно использовать аналитическое программное обеспечение МшЛопНп (поставляемое РЬагадЙ Согр., Моийаш У1ете, СА94040, И8А). На первой фазе (фазе альфа) происходит главным образом распределение лиганда в организме пациента с некоторым элиминированием. Вторая фаза (фаза бета) представляет собой конечную фазу, когда лиганд уже распределен и концентрация в сыворотке уменьшается по мере выведения лиганда из организма пациента. Период полувыведения ΐ-альфа есть период полувыведения в первой фазе, а период полувыведения ΐ-бета есть период полувыведения во второй фазе. Кроме того, для определения периода полувыведения также можно использовать некомпартментную модель подгонки, известную в данной области техники.
В одном из воплощений настоящего изобретения предложены слитая конструкция или конъюгат по изобретению с периодом полувыведения, например, у людей в диапазоне от приблизительно 12 ч или более, например от приблизительно 12 ч до приблизительно 21 суток, например от приблизительно 24 ч до приблизительно 21 суток, например приблизительно 2-8 суток, например приблизительно 3-4 суток.
Слитые конструкции или конъюгаты по изобретению далее могут быть представлены в формате с большим гидродинамическим размером, например, посредством присоединения группы ПЭГ, сывороточного альбумина, трансферрина, рецептора трансферрина или, по меньшей мере, его трансферринсвязывающей части, Ес-области антитела, или посредством конъюгирования с доменом антитела.
Гидродинамический размер может быть определен с использованием способов, общеизвестных в данной области техники. Например, для определения гидродинамического размера лиганда можно использовать гельфильтрационную хроматографию. Матрицы, подходящие для гельфильтрационного определения гидродинамических размеров лигандов, такие как перекрестно сшитые агарозные матрицы, общеизвестны и легкодоступны.
Композиции по изобретению, то есть композиции, содержащие слитые конструкции и конъюгаты, раскрытые в данном описании, дают несколько дополнительных преимуществ. Компонент однодоменное антитело является очень стабильным, небольшим по сравнению с антителами и другими антигенсвязывающими фрагментами антител, может быть получен с высокими выходами путем экспрессии в Е. со11 или дрожжах (например, РюЫа разЮпз), и антигенсвязывающие фрагменты антител, которые связываются с сывороточным альбумином, могут быть легко отобраны из библиотек человеческого происхождения или из любого желаемого вида. Соответственно композиции по изобретению, содержащие бАЬ, которое связывается с сывороточным альбумином, могут быть получены с большей легкостью, чем терапевтические вещества, которые обычно получают в клетках млекопитающих (например, человеческие, гуманизированные или химерные антитела), и могут быть использованы бАЬ, которые не являются иммуногенными (например, человеческое бАЬ можно использовать для лечения или диагностирования заболевания у людей).
Иммуногенность инсулинотропного агента или лекарственного средства с инкретиновым эффектом
- 12 018471 может быть снижена в том случае, когда инсулинотропный агент или инкретин представляет собой часть лекарственной композиции, содержащей бАЬ, которое связывается с сывороточным альбумином. Соответственно согласно изобретению предложены композиции конъюгатов или слитых конструкций, которые могут быть менее иммуногенными (чем, например, сам инсулинотропный агент или инкретин) или которые могут быть менее, по существу, неиммуногенными в контексте лекарственной композиции, содержащей бАЬ, которое связывается с сывороточным альбумином. Поэтому такие композиции можно вводить субъекту неоднократно с минимальной потерей эффективности из-за наработки антител против лекарственного средства иммунной системой субъекта.
В дополнение к этому, композиции конъюгатов или слитых конструкций, раскрытые в данном описании, могут иметь повышенный профиль безопасности и меньше побочных эффектов по сравнению с самим инсулинотропным агентом или инкретином. Например, в результате того, что бАЬ обладает связывающей активностью в отношении сывороточного альбумина, слитые конструкции и конъюгаты по изобретению имеют увеличенное время удержания в сосудистом кровотоке. К тому же, слитые конструкции и конъюгаты по изобретению, по существу, не способны проникать через гематоэнцефалический барьер и аккумулироваться в центральной нервной системе после системного введения (например, внутрисосудистого введения). Соответственно слитые конструкции или конъюгаты по изобретению могут быть введены с большей безопасностью и сниженными побочными эффектами по сравнению с одним инсулинотропным агентом или лекарственным средством с инкретиновым эффектом. Аналогично, слитые конструкции или конъюгаты могут иметь сниженную токсичность в отношении конкретных органов (например, почки или печени), чем само лекарственное средство.
Примеры
Пример 1. Экспрессия слитых генетических конструкций СЬР-1 (А8С) или эксендина-4 и ΌΘΜ7Ε14 А1ЬибАЬ.
Эксендин-4 или СЬР-1 (7-37) с заменой аланина в положении 8 на глицин ([С1у8] СЬР-1) клонировали в виде слитой конструкции с ΌΘΜ7Ε-14 (однодоменным антителом (бАЬ), которое связывается с сывороточным альбумином (а1ЬибаЬ) с аминокислотной последовательностью, показанной ниже) в вектор рТТ-5 (который можно получить в СИКС, Саиаба). В каждом случае СЬР-1 или эксендин-4 находился на 5'-конце конструкции, а бАЬ на З'-конце. Всего было получено 7 конструкций (ЛАТ0114, ЛАТ0115, ЛАТ0116, ЛАТ0117, ЛАТ0118, ЛАТ0119, ЭАТ0120) с аминокислотными последовательностями, показанными на фиг. 1(а-д).
Между СЬР-1 или эксендином-4 и бАЬ либо не было никакого линкера, либо имелся д1у-8ет-линкер (С48 линкер) или спиральный линкер (Ага1, К., Н. Иеба, е1 а1. (2001) Эебдп οί 1шкег5 \ν1ιίο1ι еГГесЕуе1у кератаЕе бошаиъ οί а ЫГипс1юпа1 Гибоп рго1еш, Рто1еш Еид. 14(8): 529-32.456), или линкер, состоящий из второй группировки СЬР-1. Линкеры были введены в качестве спейсеров для пространственного отделения СЬР-1 или эксендина-4 от бАЬ с целью предотвращения стерических препятствий связыванию между СЬР-1 или эксендином-4 и рецептором СЬР-1. Последовательности конструкций показаны на фиг. 1 (а-ё).
ДНК, не содержащую эндотоксина, получали в Е. сой, используя щелочной лизис (с применением Сща-набора для выделения не содержащей эндотоксина плазмиды, который можно получить в Р1адеи, СА), и использовали для трансфекции клеток НЕК293Е (которые можно получить в СИКС, Саиаба). Трансфекцию осуществляли в колбе с 250 мл суспензии клеток НЕК293Е в концентрации 1,75х106 клеток/мл, используя 333 мкл 293фектина (293Гес1ш) (1иуйтодеи) и 250 мкг ДНК на одну колбу, и экспрессию проводили при 30°С в течение 5 суток. Супернатант собирали центрифугированием и очистку осуществляли, используя аффинную очистку на белке Ь. Белок подвергали серийному связыванию со смолой, упаковывали в колонку и промывали РВ8 (забуференным фосфатом физиологическим раствором) в количестве 10 об. колонки. Белок элюировали 50 мл 0,1 М глицина, рН 2, и нейтрализовали трис, рН 8. Белок ожидаемого размера идентифицировали на геле после 8Л8-РАСЕ (электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия), и размеры показаны ниже в табл. 1.
Таблица 1
Молекулярные массы (Μν) конструкций ЛАТ0114, ЛАТ0115, ЛАТ0116, ЛАТ0117, ЛАТ0118, ЛАТ0119, ЛАТ0120
Слитый белок Ожидаемая Му/
ϋΑΤ0114 18256
ϋΑΤ0115 16896
ϋΑΤ0116 15950
0АТ0117 19798
ОАТ0118 15936
ОАТ0119 15318
ϋΑΤ0120 18895
- 13 018471
Пример 2. Демонстрация того, что слитые конструкции Л1ЬибЛЬ с СЬР-1 и эксендином-4 связываются с сывороточным альбумином.
С целью получения информации об аффинности слитые конструкции СЬР-1 и эксендин-4 А1ЬикЛЬ анализировали посредством поверхностного плазмонного резонанса (на приборе В1асоге АВ, доступном в СЕ НеаИйсаге). Анализ проводили, используя чип СМ5 В1асоге (матрица из карбоксиметилированного декстрана), который был покрыт сывороточным альбумином. Проводили иммобилизацию примерно 1000 единиц резонанса (КП) каждого из тестируемых сывороточных альбуминов (человека, крысы и мыши) в ацетатном буфере, рН 5,5. Проточную ячейку 1 прибора В1асоге АВ не покрывали ничем (блокированный отрицательный контроль), проточную ячейку 2 покрывали сывороточным альбумином человека (Н8Л) (815 КП), проточную ячейку 3 покрывали сывороточным альбумином крысы (К8Л) (826 КП) и проточную ячейку 4 покрывали сывороточным альбумином мыши (М8Л) (938 КП). Каждую тестируемую слитую молекулу экспрессировали в культуре тканей млекопитающих, как описано в приведенном выше примере.
Готовили несколько концентраций слитой молекулы (в диапазоне от 16 нМ до 2 мкМ) путем разведения в НВ8-ЕР-буфере (В1ЛСОКЕ) (0,01 М НЕРЕ8 (М-2-гидроксиэтилпиперазин-Ы-2-этансульфоновая кислота); рН 7,4; 0,15 М ЫаС1; 3 мМ ЕОТЛ (этилендиаминтетрауксусная кислота); 0,005% поверхностноактивного вещества Р20) и пропускали через чип В1ЛСОКЕ. Аффинность (ΚΌ) рассчитывали из В1ЛСОКЕ-кривых подгонкой кривых констант скоростей ассоциации и диссоциации к кривым, образованным бЛЬ с концентрациями, лежащими в области ΚΌ. Величины аффинности (ΚΌ) суммированы в следующей далее табл. 2.
Таблица 2
Связывание конструкций СЬР-1- и эксендин-4-Л1ЬибЛЬ с сывороточным альбумином человека, крысы и мыши
Слитая конструкция СЬР-1 (7-37) А8С, спиральный линкер, ϋΟΜ7Ιτ-14 Слитая конструкция 2χΘίΡ-1 (7-37) А86, ООМ7М4
НЗА 110нМ 150 нМ
В8А 800 нМ 700 нМ
МЗА 110 нМ 130 нМ
Приведенные выше результаты демонстрируют, что слитые молекулы сохраняют способность связываться со всеми типами сывороточного альбумина, и это указывает на то, что они, очевидно, обладают увеличенным периодом полувыведения ίη νίνο.
Пример 3. Слитые конструкции СЬР-1 и эксендин-4 Л1ЬибЛЬ активны в анализе связывания с рецептором СЬР-1 (СЬР-1К ВА).
Слитые конструкции переводили в буфер, содержащий 100 мМ №1С1. 20 мМ цитрата, рН 6,2. Одновременно клетки СНО 6СКЕ СЬР1К (клетки СНО Κ1 (которые можно получить из Американской коллекции типовых культур (АТСС)), стабильно трансфицированые 6 цАМФ-чувствительным элементом, управляющим люциферазным репортерным геном, а также рецептором СЬР-1 человека) высевали в концентрации 2х105 клеток/мл в суспендирующие среды. Суспензионную культуру поддерживали в течение 24 ч. Затем клетки разбавляли 15 мМ НЕРЕ8-буфером (который можно получить у 81дша), содержащим 2 мМ Ь-глутамина (2,5х105 клеток/мл), и разливали по 384-луночным планшетам, содержащим анализируемое соединение в количестве 10 мкл/лунка. После добавления контроля для анализа планшеты возвращали в инкубатор на 3 ч при 37°С и 5% СО2. После инкубации в лунки добавляли субстрат для люциферазы из набора 81еабу-С1о® Ьнс|Гега5е (который можно получить у Рготеда) в соответствии с описанием набора и планшеты герметично закрывали самоклеющимися уплотнительными крышками (№ по каталогу ХУеЬег Магкшд ЗуЧеиъ 1пс. 607780). Планшеты помещали в ридер (У1еМих, Регкш Е1тег), проводили предварительную инкубацию в течение 5 мин, после чего прочитывали данные флуоресценции и результаты представляли в графическом виде. Соединение анализировали в диапазоне концентраций в присутствии и в отсутствие 10 мкМ альбумина, что позволяло провести подгонку кривой зависимости доза-эффект в присутствии и в отсутствие альбумина. Рассчитывали величины ЕС50 и суммировали в приведенной далее табл. 3.
- 14 018471
Таблица 3
Активность слитых конструкций с СЬР-1 и эксендин-4 Л1ЬийЛЬ в анализе связывания с рецептором СЬР-1 (СЬР-1В ВА)
СЬР-1 РВА ЕС30 (пМ), η = 3 СЬР-1 К ВА (10 мкМ альбумин) ЕС50 (пМ), п = 2
Слитая конструкция эксендин-4 (С48)3 ϋΟΜ7Ιτ14 8,9 35
Слитая конструкция эксендин-4 ΟΟΜ7Ι1-14 12 72
Слитая конструкция эксендин-4, спиральный линкер, ООМ7М-14 4,3 15
Слитая конструкция СЬР-1 А8С, спиральный линкер, ϋΟΜ7ίι-14 17 130
СЬР-1 (7-36) 21 19
Эксендин-4 1,0 0,82
Приведенные выше результаты демонстрируют, что все протестированные слитые молекулы сохраняют способность к связыванию с рецептором СЬР-1. Результаты также демонстрируют, что эта способность сохраняется в присутствии сывороточного альбумина. Следовательно, эти слитые молекулы с очевидностью сохраняют способность связываться с рецептором СЬР-1 ίη νίνο.
Пример 4. Экспрессия ΌΑΤ0115, ΌΑΤ0116, ΌΑΤ0117 и ΌΑΤ0120 в культуре ткани млекопитающих НЕК293 с последующей очисткой посредством аффинного связывания с белком Ь и ионообменной хроматографии.
Цель этого эксперимента заключалась в получении белка для исследования ίη νίνο и ίη νίίτο. Белок экспрессировали в культуре ткани млекопитающих в НЕК293Е-клетках из вектора рТТ-5, как описано ранее. Кратко, не содержащую эндотоксина ДНК получали, очищали и использовали для трансфекции НЕК293Е-клеток. Экспрессию белка проводили в течение 5 суток при 30°С в инкубаторе со встряхиванием, культуры осаждали центрифугированием и супернатант (содержащий интересующий белок) собирали. Белок очищали из супернатанта посредством аффинного захвата на белок Ь-аффинной агарозной смоле Чгсатйпс (смола от СЕ НеаДйсаге, белок Ь пришит по месту). Затем смолу промывали РВ8 в количестве 10 об. колонки и после этого белок элюировали 0,1 М глицином, рН 2,0, в количестве 5 об. колонки. Нейтрализовали 1 М трис-глициновым буфером, рН 8,0, в количестве 1 об. колонки. В этом случае (в отличие от предыдущего примера) далее осуществляли дополнительную очистку белка. Белок (в трис-глициновом буфере) переводили в 20 мМ ацетат, рН 5,0, после чего наносили, используя устройство для нанесения Айа, на 1 (или 2, одновременно) 6 мл колонку ВеБОигсе 8 (СЕ НсаШюагс), предварительно уравновешенную 20 мМ ацетатом, рН 5,0. После промывки тем же буфером белок элюировали с использованием градиента №1С1 0-0,75 М или 0-1 М в 20 мМ ацетате, рН 5,0. Фракции надлежащей молекулярной массы далее идентифицировали посредством 8Э8-РАСЕ элетрофореза и масс-спектрометрии (М8) и затем объединяли, получая окончательный образец белка. Затем белок переводили в 20-мМ цитрат, рН 6,2, 100 мМ №1С1 и концентрировали до 0,5-5 мг/мл. Раствор белка фильтровали через 0,2-мкм фильтр для обеспечения стерильности. Далее белок использовали в описанных ниже примерах.
Пример 5. Сравнение стабильности ΌΑΤ0115, ΌΑΤ0116, ΌΑΤ0117 и ΌΑΤ0120 после 1, 3 и 6 циклов замораживания-оттаивания.
Цель этого исследования заключалась в сравнении стабильности ΌΑΤ0115, ΌΑΤ0116, ΌΑΤ0117 и ΌΑΤ0120 после 1, 3 и 6 циклов замораживания-оттаивания. Каждый белок экспрессировали в культуре ткани млекопитающих в НЕК293Е-клетках из вектора рТТ-5 и очищали на белок Ь-аффинной смоле с последующей ионообменной хроматографией, как описано выше. Белок переносили в 20-мМ цитратный буфер с 100 мМ №С1 и разбавляли до 0,5 мг/мл, используя тот же буфер. Аликвоты каждого белка по 0,5 мл (в пробирках Эппендорф) далее подвергали 0, 1, 3 или 6 циклам замораживания-оттаивания, при этом каждый цикл включал в себя 3 мин на сухом льду, затем 2 мин в водяной бане при 37°С (во время эксперимента было отмечено, что 2 мин при 37°С было достаточно, чтобы раствор белка полностью оттаял). После завершения необходимого количества циклов замораживания-оттаивания образцы белка хранили при 2-8°С до проведения последующего анализа. Затем белки анализировали посредством 8^8-РΑСЕэлектрофореза, анализа связывания с СЬР-1В, гель-хроматографии на колонке с 8ирегйех 75 и массспектрометрии. Было установлено, что 8^8-РΑСЕ-профиль, эффективность в СЬР-1В ВА и массспектрометрический профиль для всех четырех белков не изменялись существенным образом по сравне
- 15 018471 нию с исходными в результате 1, 3 или 6 циклов замораживания-оттаивания. После 6 циклов замораживания-оттаивания максимальная высота пика в 8ЕС-анализе составляла 78, 86, 104 и 57% для ΌΆΤ0115, ΌΆΤ0116, ΌΆΤ0117 и ΌΆΤ0120 соответственно. Было сделано заключение, что ΌΆΤ0120 менее стабилен в циклах замораживания-оттаивания, чем остальные три белка.
Таблица 4
Результаты сравнения стабильности ΌΆΤ0115, ΌΆΤ0116, ΌΆΤ0117 и ΌΆΤ0120 после 1, 3 и 6 циклов замораживания-оттаивания
Пример 6. Демонстрация продолжительности действия ΌΆΤ0115 в модели диабета II типа на 6Ь/6Ь мышах.
Цель этого исследования заключалась в определении продолжительности действия ΌΆΤ0115 на толерантность к перорально вводимой глюкозе у 6Ь/6Ь мышей. Животных сортировали в соответствии с понижением уровня глюкозы за три дня до начала эксперимента и затем их объединяли в группы. По одному животному из каждой группы далее включали в состав каждой из 26 исследуемых групп. Это обеспечивало близкий средний начальный уровень глюкозы в каждой из исследуемых групп.
ΌΆΤ0115 (полученную в НЕК293-клетках и очищенную, как описано выше) вводили подкожно в дозе 1, 0,3 или 0,1 мг/кг либо за 5, 24, 48, 72, 96 ч, либо за 120 ч перед пероральным приемом глюкозы (не все дозы вводили в каждую временную точку; для подробного изучения см. приведенную ниже таблицу). ΌΆΤ0115 вызывала значительное уменьшение ЛИС для глюкозы в течение 2-часового периода времени прохождения теста на толерантность к глюкозе при пероральном приеме (00ΤΤ) по сравнению с ЛИС в случае получавших растворитель 6Ь/6Ь мышей во временные точки до 24 ч и включая 24 ч для доз 0,1 и 0,3 мг/кг и до 72 ч, и включая временную точку 72 ч для дозы 1 мг/кг. Эксендин-4, введенный в качестве положительного контроля в дозе 42 мкг/кг, также вызывал значительное уменьшение АИС для глюкозы согласно 00ΤΤ при введении его за 5 ч перед пероральным введением болюса глюкозы. В приведенной ниже табл. 5 показано процентное уменьшение АИС для каждой из исследуемых групп с обработкой ΌΑΤ0115 по сравнению с растворителем. Звездочкой отмечены случаи Р<0,05, полученные при сравнении ΌΑΤ0115 с растворителем с использованием коррекции по показателю ошибочных событий.
- 16 018471
Таблица 5 Демонстрация процента уменьшения АИС для каждой из исследуемых групп с обработкой ЭАТ0115 по сравнению с растворителем (звездочкой отмечены случаи Р<0,05, полученные при сравнении ЭАТ0115 с растворителем с использованием коррекции по показателю ошибочных событий)
Время 06ТТ (часы относительно момента введения} 0,1 мг/кг ЦАТ0115 0,3 мг/кг ЦАТ0115 1 мг/кг 0АТ0115
+5 60%* Не делали 76%*
+24 36%* 59%* 50%*
+48 28% 26% 37%*
+72 16% 26% 41%*
+96 -12% Не делали 12%
Пример 7. Демонстрация эффективности ЭАТ0115 в мышиной модели индуцированного диетой ожирения (ΌΙ0).
Цель этого исследования заключалась в применении традиционной модели кормления мышей (мыши с индуцированным диетой ожирением) для определения того, воздействует ли обработка ЭАТ0115 на потребление пищи и, как следствие, на массу тела. Это может иметь предсказательную ценность для людей. Самцов С57В1/6-мышей (приобретенных у Тасошс) в течение 12 недель откармливали с помощью диеты с высоким содержанием жиров (до 60% ккал) и затем переносили в лабораторную установку собственного производства. По прибытии мышей размещали по отдельности на подстилке Альфа-Эл в комнате с контролируемой температурой и влажностью (70-72°Р (39-40°С), влажность = 48-50%, световой цикл (5 утра/5 вечера)). Диету меняли на диету с содержанием жиров 45% и животным давали акклиматизироваться в течение 18 суток. Перед введением тестируемого соединения мышам вводили подкожно физиологический раствор один раз в сутки в течение трех суток и проводили мониторинг потребления пищи. Мышей объединяли в группы и группы составляли таким образом, чтобы между группами или внутри групп не было различия в массе тела и потреблении пищи. В день исследования группам из 8 мышей делали подкожные инъекции в дозе 5 мл/кг, как указано ниже: трем группам вводили ЭАТ0115 (низкая, средняя и высокая доза), одной группе отрицательный контроль (молекулу А1ЬийАЬ Ό0Μ71-14, но в отсутствие в составе конъюгата эксендина-4) и одной - эксендин-4 в качестве положительного контроля.
Таблица 6
Протокол установления эффективности ЭАТ0115 в мышиной модели индуцированного диетой ожирения (ЭЮ)
Г руппа Вводимое соединение Уровень дозы
1 Отрицательный контроль: ϋΟΜ7Ιτ-14 в 100 мМ ЦаС!, 20 мМ цитрат/цитрат натрия, рН 6,2 1 мг/кг
2 Эксендин-4 0,01 мг/кг
3 ОАТ0115 в 100 мМ Г4аС1 20 мМ цитрат/цитрат натрия, рН 6,2 0,01 мг/кг
4 ОАТ0115 в 100 мМ ИаС1, 20 мМ цитрат/цитрат натрия, рН 6,2 0,1 мг/кг
5 ОАТ0115 в 100 мМ ЫаС1, 20 мМ цитрат/цитрат натрия, рН 6,2 1 мг/кг
Ежедневное потребление пищи и массу тела измеряли каждые сутки в течение 10 суток. Для ЭАТ0115 показано дозозависимое уменьшение массы тела и потребления пищи по сравнению с Ό0Μ7114 в качестве контроля (см. фиг. 3а и 3Ь). Поэтому было сделано заключение, что данные, полученные в этом исследовании на мышах, подтверждают гипотезу о том, что ЭАТ0115 может быть хорошим кандидатом для применения в клинике.
Пример 8. Определение периода полувыведения ЭАТ0115, ЭАТ0116 и ЭАТ0117 из плазмы крови в мышиной модели диабета ΙΙ типа.
Цель этого исследования заключалась в определении профиля элиминирования ЭАТ0115, ЭАТ0116 и ЭАТ0117 из плазмы крови в мышиной модели диабета II типа (ЙЬ/ЙЬ мыши) и расчете ФК (фармакокинетических) параметров на основании этих результатов. Белок ЭАТ0115, ЭАТ0116 и ЭАТ0117 получали, как описано ранее. Кратко, проводили экспрессию белка в культуре ткани млекопитающих, используя клетки НЕК293Е, и очищали, используя серийную абсорбцию на белок Ь-агарозной аффинной смоле с последующим элюированием глицином при рН 2,0 и нейтрализацией Трис, рН 8,0. Затем проводили ионообменную хроматографию на колонке Еекоигсе 8 с использованием 0-1 М градиента соли в 20 мМ ацетате, рН 5,0. Фракции, содержащие желаемый белок, далее объединяли и проводили замену буфера на 100 мМ №С1, 20 мМ цитрат, рН 6,2. Белок подвергали стерилизации фильтрованием, проводили замену
- 17 018471 буфера, эндотоксин удаляли и тестировали перед использованием ίη у1уо. Группам не подвергавшихся голоданию самцов ЙЬ/ЙЬ мышей (ЬЕРг йЬ-гомозиготных мышей, дефицитных по лептиновому рецептору с мутациями в гене лептинового рецептора (1ерг)) вводили либо подкожно (п/к), либо внутривенно (в/в) ΌΑΤ0115, ΌΑΤ0116 или ΌΑΤ0117 по 1 мг/кг. Перед введением через 0,25, 0,5, 1, 4, 7, 12, 24, 36, 48 и 60 ч после введения в/в доз и перед введением через 0,5, 1, 4, 7, 12, 24, 36, 48 и 60 ч после введения п/к доз собирали образцы крови путем полного обескровливания и готовили плазму. Образцы плазмы замораживали и позднее размораживали для анализа уровней ΌΑΤ0115, ΌΑΤ0116 или ΌΑΤ0117, как целесообразно, посредством твердофазной экстракции и ЬС (жидкостная хроматография)/М8/М8 для детекции наличия фрагмента белка (из участка эксендин-4 белка). Рассчитанные уровни в плазме крови затем использовали для подгонки фармакокинетических параметров с применением программного обеспечения V^ηNоη^^η. Период полувыведения после подкожного и внутривенного введения и биодоступность приведены ниже в таблице. На основании данных результатов (см. табл. 7 ниже) было сделано заключение, что все три соединения показывают желаемые фармакокинетические параметры в мышиной модели диабета II типа. Следовательно, эти молекулы демонстрируют потенциал для получения хороших ФК параметров у людей с диабетом, при этом в данном исследовании предпочтителен выбор ΌΑΤ0115 или ΌΑΤ0116 по сравнению с ΌΑΤ0117.
Таблица 7
Период полувыведения ΌΑΤ0115, ΌΑΤ0116 и ΌΑΤ0117 из плазмы крови в мышиной модели диабета II типа
Соединение Период полувыведения после внутривенного введения Период полувыведения после подкожного введения Биодоступность
ϋΑΤ0115 13,8 18,6 65%
ЙАТ0116 14,3 20,1 61%
ϋΑΤ0117 11,4 11,2 25%
Пример 9. Определение периода полувыведения ΌΑΤ0115, ΌΑΤ0116, ΌΑΤ0117 из плазмы крови крысы.
Цель этого исследования заключалась в определении профиля элиминирования ΌΑΤ0115, ΌΑΤ0116 и ΌΑΤ0117 из плазмы крови крысы и расчете ФК параметров на основании этих результатов. Белок ΌΑΤ0115, ΌΑΤ0116 и ΌΑΤ0117 получали, как описано ранее. Кратко, проводили экспрессию белка в культуре ткани млекопитающих, используя НЕК293Е-клетки, и очищали, используя серийную абсорбцию на белок Ь-агарозной аффинной смоле с последующим элюированием глицином при рН 2,0 и нейтрализацией с помощью Трис, рН 8,0. После этого проводили ионообменную хроматографию на колонке Векоигсе 8 с использованием 0-1 М градиента соли в 20 мМ ацетата, рН 5,0. Фракции, содержащие желаемый белок, далее объединяли и проводили замену буфера на 100 мМ №С1, 20 мМ цитрат, рН 6,2. Белок подвергали стерилизации фильтрованием, проводили замену буфера и осуществляли ОС (контроль качества) перед использованием ίη у1уо. Для определения периода полувыведения из плазмы группы из 3 крыс получали разовую в/в или п/к инъекцию ΌΑΤ0115, ΌΑΤ0116 или ΌΑΤ0117 в дозе 0,3 мг/кг (в/в) или 1,0 мг/кг (п/к). Образцы плазмы получали путем периодических отборов крови из хвостовой вены в течение периода времени 72 ч и анализировали посредством БС/М8/М8 для детекции наличия фрагмента слитой конструкции (из участка эксендин-4 белка). Рассчитанные уровни в плазме крови затем использовали для подгонки фармакокинетических параметров с применением программного обеспечения \V^ηNоη^^η. Период полувыведения после подкожного и внутривенного введения и биодоступность приведены ниже в табл. 8. На основании данных результатов было сделано заключение, что все три соединения показывают желаемые фармакокинетические параметры у крысы. Следовательно, все эти молекулы демонстрируют потенциал для получения хороших ФК параметров у людей, при этом в данном исследовании предпочтителен выбор ΌΑΤ0115 по сравнению с ΌΑΤ0116 или ΌΑΤ0117.
Таблица 8
Период полувыведения после подкожного и внутривенного введения и биодоступность
Соединение Период полувыведения после внутривенного введения Период полувыведения после подкожного введения Биодоступность
ОАТ0115 4,9 ч 11,1 ч 81%
ОАТ0116 4,1 ч 8,7 ч 32%
ОАТ0117 4,9 ч 10,2 ч 15%
Пример 10. Определение периода полувыведения ΌΑΤ0115 из плазмы крови яванского макака.
Цель этого исследования заключалась в определении фармакокинетических параметров для
- 18 018471
ΌΑΤ0115 у примата, не являющегося человеком (яванский макак), чтобы иметь возможность аллометрической балльной оценки параметров и дать наилучшее возможное указание на то, будет ли ΌΑΤ0115 иметь хороший ФК профиль у людей. Слитую конструкцию ΌΑΤ0115 эксендин-4 А1Ьи6АЬ экспрессировали в НЕК293Е-клетках в культуре ткани млекопитающих и очищали, как описано ранее. Кратко, белок очищали, используя серийную абсорбцию на белок Ь-аффинной агарозной смоле с последующим элюированием глицином при рН 2,0 и нейтрализацией Трис, рН 8,0. Затем проводили ионообменную хроматографию на колонке Кезоигсе 8 с использованием 0-1 М градиента соли в 20 мМ ацетате, рН 5,0. Фракции, содержащие желаемый белок, далее объединяли и проводили замену буфера на 100 мМ №С1, 20 мМ цитрат, рН 6,2.
Белок подвергали тщательному ОС (контроль качества, включая 8Э8-РАСЕ, масс-спектрометрию, анализ активности (СЬР-1К-ВА), контроль рН, контроль осмомолярности), подвергали стерилизации фильтрованием и удаляли эндотоксин. Белок с подтвержденным низким содержанием эндотоксина (менее 0,05 ЕЙ (эндотоксиновых единиц) на 1 мг белка) использовали далее для исследования ίη νίνο.
В этом исследовании использовали шесть самок яванского макака (Масаса Га8С1си1аг18; Сйаг1ез Кгчег ЬаЬога1опе8 ВКЕ, НоиЧоп, ΤΧ, РпшЩе РгобисК Μίαιηί, ЕЬ и/или Сονаηсе Кезеагсй РгобисК Шс., Айсе, ΤΧ). Возраст макак составлял приблизительно 2-9 лет (с диапазоном массы тела приблизительно 2-5 кг) на момент начала введения доз. Макак размещали по отдельности в клетки из нержавеющей стали в комнате(ах) с регулируемыми параметрами окружающей среды (от 64 до 84 Е (от 36 до 47°С); относительная влажность 30-70%) с 12-часовым циклом свет/темнота. Самкам макак два раза в сутки давали приблизительно 6 галет корма для макак № 5038 (ΕΜΙ МЦгШоп йИегпаЦопаГ КГсйтопб, Ш) и один раз в сутки выделяли свежие фрукты. Каждому животному вводили тестируемое соединение ГОАННЕт) либо подкожно, либо внутривенно в соответствии с группой введения дозы (3 п/к и 3 в/в). Доза составляла 0,1 мг/кг. В дни введения доз первое кормление осуществляли приблизительно через 1 ч после введения дозы каждой макаке (и до 2,5 ч после введения дозы, если для проведения связанных с исследованием процедур животным необходимо было находиться вне мест их размещения в течение продолжительного периода времени). Второе кормление выполняли не раньше, чем через два часа после первого кормления. В целях улучшения качества жизни каждой макаке предоставляли дополнительные фрукты, бобовые и/или овощи (например, виноград, морковь для цельноплодного консервирования, арахис) во время теста или приблизительно во время теста на жизнеспособность или в качестве способа поощрения после акклиматизации или связанных с исследованием процедур. Фильтрованная водопроводная вода (поставляемая Леща Репп8у1уаша, Ιηα и периодически анализируемая) была доступна без ограничения.
Отбирали образцы плазмы крови (приблизительно 2 мл) из бедренного сосуда перед введением (0 ч) и в пределах допустимой погрешности через 5 мин (только для в/в группы), 0,5, 4, 8, 24, 48, 96, 144, 192, 288, 336, 504 и 672 ч после введения (ФК образцы от одного из животных в группе в/в доз были собраны только для 24 ч, поэтому это животное было исключено из подгонки ФК параметров). Анализ образцов осуществляли посредством масс-спектрометрии и подгонку данных выполняли, используя программное обеспечение для подгонки ХУтШий-ю. Получали следующие ФК параметры для в/в введения (η=2): Τ1/2 67 ч, ΜΚΤ (среднее время удержания в организме) 46 ч, νζ (объем распределения) 327 мл/кг и С1 (клиренс) 3,3 мл/ч/кг; и для п/к введения (п=3): Т1/2 68 ч, ΜΚΤ 98 ч, νζ 306 мл/кг и С1 3,1 мл/ч/кг. Рассчитанная биодоступность составила 99%.
На основании этого исследования (и на основании Ыасоге-данных связывания с сывороточным альбумином яванского макака и человека) было сделано заключение, что период полувыведения □АНИЕХ при п/к введении, равный 68 ч у яванского макака (как описано выше), дает уверенность в том, что продолжительность периода полувыведения той же молекулы у людей с вероятностью будет достаточной, чтобы коррелировать с необходимостью введения один раз в неделю (или менее часто).
Пример 11. Определение ФД (фармакодинамики) □АННЕл у яванского макака.
ФК исследование на яванском макаке проводили, как описано выше. Г лавная цель этого исследования заключалась в определении фармакокинетических параметров □АГОНЕХ на яванском макаке (как описано в предшествующем примере), а вторая цель заключалась в получении показания эффективности соединения □АННЕл на этих макаках (без применения в данном исследовании усилий, достаточных для получения статистически значимых результатов). Для достижения этой второй цели проводили мониторинг потребления пищи макаками на протяжении всего исследования. Было отмечено, что в следующие после введения сутки имелась тенденция к уменьшению потребления пищи у всех макак. Было сделано заключение, что это вероятно происходило вследствие известного документально подтвержденного эффекта, вызываемого относящейся к эксендину-4 частью молекулы как средству, подавляющему аппетит. Следовательно, показано, что □АННЕл обладает активностью ш νί\Ό. С целью обеспечения улучшения здоровья животных в большинство из дней помимо потребления галет животные получали фрукты и лакомства.
- 19 018471
Таблица 9
Измерение количества галет, потребляемых ежесуточно яванским макаком (с введением ΌΑΤ0115 на 1-е сутки)
Доза Сут -2 Сут-1 Сут 1 Сут 2 СутЗ Сут 4 Сут 5 Сут 6 Сут 7
0,1 мг/кг (в/в) 12 12 6 3 9 12 12 12 12
0,1 мг/кг (в/в) 12 12 0 1 0 4 6 10 11
0,1 мг/кг (в/в) 12 12 0 0 0 0 1 6 6
0,1 мг/кг (п/к) 12 12 5 0 4 11 7 11 12
0,1 мг/кг (п/к) 12 12 12 0 2 12 12 12 12
0,1 мг/кг (п/к) 12 12 11 12 11 12 8 12 12
Пример 12. Согласно данным поверхностного плазмонного резонанса ΌΆΤ0115 слитая конструкция эксендин-4 Л1ЬийЛЬ связывается с сывороточным альбумином крысы, яванского макака и человека.
Проводили экспрессию ΌΆΤ0115, очищали и затем анализировали с использованием поверхностного плазмонного резонанса (В1асоге, СЕ Неаййсаге) для получения информации по аффинности. Анализ проводили, используя стрептавидиновый (8Α) чип, покрытый биотинилированным сывороточным альбумином. На этом чипе было иммобилизовано 200-1000 единиц резонанса (КИ) каждого сывороточного альбумина. Проточная ячейка 1 оставалась непокрытой, проточную ячейку 2 покрывали Н8Л, проточную ячейку 3 покрывали Β8Α и проточную ячейку 4 покрывали С8Л (сывороточный альбумин яванского макака). Готовили несколько концентраций слитой конструкции (в диапазоне от 15,6 нМ до 2 мкМ) путем разведения в НВ8-ЕР-буфере (В1АСОКЕ) (0,01 М НЕРЕ8, рН 7,4; 0,15 М ЫаС1; 3 мМ ΕΌΤΑ; 0,005% поверхностно-активного вещества Р20) и пропускали через В1АСОКЕ-чип. Аффинность (ΚΌ) рассчитывали из В1АСОКЕ-кривых подгонкой кривых констант скоростей ассоциации и диссоциации к кривым, образованным ЙАЬ с концентрациями, лежащими в области ΚΌ. Величины аффинности (ΚΌ) суммированы в следующей далее таблице.
Таблица 10
Аффинность (ΚΌ) ΌΑΤ0115
Типы сывороточного альбумина ОАТ0115
Н8А 600 нМ
К8А 2 мкМ
С8А 2 мкМ
Пример 13. Характеристика тепловой денатурации ΌΑΤ0115 посредством дифференциальной сканирующей калориметрии (И8С).
Цель этого эксперимента заключалась в мониторинге тепловой денатурации ΌΑΤ0115 посредством Э8С (дифференциальной сканирующей калориметрии) с использованием микрокалориметра с капиллярной ячейкой УР-Э8С (М1сгоса1), оборудованного автосэмплером. Белок подвергали диализу в течение ночи, переводя в 20 мМ цитрат, рН 6,2, с 100 мМ №1С1. фильтровали и затем готовили растворы в концентрации 1 мг/мл, что определяли по поглощению на 280 нм. Отфильтрованный буфер для диализа использовали в качестве раствора сравнения для всех образцов. Э8С проводили при скорости нагревания 180°С/ч. Перед пропусканием каждого образца вводили раствор 1%-ного декона (бесоп) и затем буфер для промывки ячеек и получения базовой линии прибора. Полученные кривые анализировали, используя программное обеспечение Опфп 7 от МюгосаБ И8С-кривую, полученную для буфера сравнения, вычитали из кривой для образца. Для расчетов (осуществленных автоматически с применением Опдт) использовали точную молярную концентрацию образца. Подбирали установочные параметры базовой линии как для верхних, так и нижних линейных участков базовых линий до/после перехода и соединяли, используя кривую 3-го порядка. Полученный график подгоняли к модели для независимых переходов поп-1\уо-51а1е, получая кажущуюся т.пл. и величины АН/АНу.
Кривую для ΌΑΤ0115 подгоняли к модели для независимых переходов поп-1\уо-51а1е с кажущейся т.пл. 56,3°С. Было получено удовлетворительное соответствие (см. фиг. 4). Контрольная кривая с лизоцимом, полученная с использованием того же оборудования, позволила получить данные хорошего качества, ожидаемые при идеальной подгонке (кажущаяся т.пл., полученная для лизоцима, составляла 76,2°С, что согласуется с приведенной в литературе (см. фиг. 5)). Поэтому было сделано заключение, что в результате этого эксперимента были получены достоверные данные, указывающие на то, что ΌΑΤ0115
- 20 018471 представляет собой молекулу с температурой плавления 56,3°С, что является приемлемым для кандидата для применения в клинике.
Пример 14. Характеристика ΌΑΤ0115, ΌΑΤ0117 и ΌΑΤ0120 в растворенном состоянии посредством 8ЕС-МАЙЙ8.
Цель этого эксперимента заключалась в определении состояния ΌΑΤ0115, ΌΑΤ0117 и ΌΑΤ0120 в растворе посредством 8ЕС-МАЬЬ8. Образцы очищали и подвергали диализу, переводя в соответствующий буфер (РВ8), и фильтровали после диализа, определяли концентрацию и подводили до 1 мг/мл. В8А (бычий сывороточный альбумин) и Н8А закупали у 8Цта и использовали без дополнительной очистки.
Подробное описание оборудования.
НРЬС-система ЗЫшабхи ЬС-20АЭ Рготшепсе с автосэмплером (81Б-20А) и υν/νίδ-детектором (детектор для ультрафиолетовой/видимой области спектра) 8ΡΌ-20Α Рготшепсе подсоединяли к МАЬЬ8детектору (детектору многоуглового лазерного светорассеяния) Μίηί Οα\νπ ΤΐΌΟβ от \Ууа(1 и ΌΒΙдетектору (дифференциальному рефрактометрическому детектору) ОрШаЬ гЕХ от \Ууа1Е Детекторы подсоединяли в следующем порядке - ЬЗ-ПУ-Ш. Как ΡΙ-. так и Ь8-приборы работали на длине волны 488 нм. Использовали колонки Τ8Κ2000 (Τοβοΐι согрогайоп) или Вю8ер2000 (Рйепотепех) (обе представляют собой НРЬС-колонки с носителем на основе диоксида кремния и со схожим диапазоном разделения 1300 кДа) с подвижной фазой в виде 50 или 200 мМ фосфатного буфера (с солью или без нее), рН 7,4, или 1хРВ8. Используемая скорость потока составляет 0,5 или 1 мл/мин, время прогона регулировали в соответствии с разными скоростям потока (45 или 23 мин), и ожидается, что это не окажет существенного воздействия на разделение молекул. Белки готовили в РВ8 в концентрации 1 мг/мл, и вводимый объем составлял 100 мкл. Детектор светорассеяния калибровали с использованием толуола в соответствии с инструкциями производителя. Выход υν-детектора и выход Ш-детектора подсоединяли к прибору для измерения светорассеяния с тем, чтобы сигналы со всех трех детекторов можно было собирать одновременно с помощью программного обеспечения Α8ΤΚ.Α от \Ууа11. Через колонку Τοβοΐι Τ8Κ2000 пропускают несколько инъекций В8А в подвижной фазе РВ8 (0,5 или 1 мл/мин), при этом υν-, Ь8- и ΡΙсигналы собирают с помощью программного обеспечения \Ууа11. Затем кривые анализируют, используя программное обеспечение Α8ΤΚΑ, и сигналы нормируют, выравнивают и корректируют с учетом уширения зон, следуя инструкциям производителя. Калибровочные константы затем усредняют и вводят в матрицу, которую используют для анализа последующих прогонов образцов.
Вычисления абсолютной молекулярной массы.
100 мкл образца (1 мг/мл) вводят в соответствующую предварительно уравновешенную колонку. После 8ЕС-колонки образец проходит через 3 соединенных он-лайн детектора - υν, МАЕЬ8 (детектор многоуглового лазерного светорассеяния) и ΌΒΙ (дифференциальный рефрактометрический детектор), что позволяет определить абсолютную молекулярную массу. Разбавление, которое происходит в колонке, является примерно 10-кратным, поэтому концентрация, при которой определяют состояние в растворе, составляет 100 мкг/мл или примерно 8 мкМ бАЬ.
Основу для вычислений в Α8ΤΚΑ, а также в методе построения графиков зависимостей по Ζίιηιη, который часто задействуют в режиме пакетной обработки образцов (а Ьа1сй ватр1е тобе), составляет уравнение из статьи Ζίηιηι, Σ. Сйет. Рйуч 16, 1093-1099 (1948) р
^А- = МР(0)-2А2сМгР2(6) (Уравнение 1) где с представляет собой массовую концентрацию молекул растворенного вещества в растворителе (г/мл);
М представляет собой средневзвешенную молярную массу (г/моль);
А2 представляет собой второй вириальный коэффициент (моль-мл/г2);
К* = 4ρ2Πο2(6η/6^210-4ΝΑ-1 является оптической постоянной, где п0 представляет собой коэффициент преломления растворителя при длине волны (вакуум) падающего излучения, 10 представляет собой длину волны (вакуум) падающего излучения, выраженную в нанометрах, ΝΑ представляет собой число Авогадро, равное 6,022х1023 моль-1, и бп/бс представляет собой дифференциальное приращение коэффициента преломления раствора растворенное вещество - растворитель относительно изменения концентрации растворенного вещества, выраженное в мл/г (этот фактор должен быть измерен независимо с использованием бК1-детектора);
Р(с|) представляет собой теоретически выведенный фактор формы, приблизительно равный 1 - 2μ2 «г2:» / 3! +..., где μ = (4π/λ)δίη(θ/2) и <г2> представляет собой средний квадрат радиуса; Р(с|) является функцией ζ - среднего размера, формы и структуры;
К,:| представляет собой избыточный коэффициент Релея (см-1).
Это уравнение допустимо для вертикально поляризованного падающего света и справедливо до порядка с2.
Чтобы провести вычисления с использованием метода подгонки по Ζημι!!, которая представляет собой подгонку к зависимости Р,|/К*с от 5ίη2(ς/2), авторам изобретения необходимо произвести обращение уравнения для приведения к первому порядку по с:
- 21 018471
Соответствующими результатами в этом случае являются (Уравнение 3)
И / 2\ Зт„Х2М (г )—-т—2— (Уравнение 4) ' 16л где то = ά [К с / Κβ] / ά [5ΐη2(θ/2)]„ .ο (Уравнение 5).
Данные расчеты осуществляли автоматически, используя программное обеспечение Α8ΤΚΑ, с получением графического изображения для молекулярной массы, определенной для каждого из секторов в диаграмме (инструкция Айга).
Молекулярную массу, полученную из графика для каждого из пиков, наблюдаемых на хроматограмме, сравнивают с ожидаемой молекулярной массой единичного мономера белка. Это позволяет авторам делать выводы относительно состояния белка в растворе.
Экспериментальные данные ΌΑΤ0115.
100 мкл ΌΑΤ0115 в концентрации 1 мг/мл наносили на колонку 8ирегбех 200, уравновешенную 20 мМ цитрата, 0,1 М №С1, рн 6,2. Скорость потока устанавливали на 0,5 мл/мин. Белок элюировался в виде одного пика, при этом М\х была определена по всей ширине пика как 17,4 кДа (ожидаемая М\х для мономера составляет 16,9 кДа). Эффективность элюирования составляет 100%, см. фиг. 6. (И8Аконтроль вел себя, как и ожидалось, подтверждая экспериментальные результаты для ΌΑΤ0115. Он элюируется двумя пиками с М\х 64 кДа (мономер) и 110 кДа (димер). М\х димера н§А невозможно определить очень точно вследствие весьма малого количества белка в этом пике).
ΌΑΤ0117.
100 мкл ΌΑΤ0117 в концентрации 1 мг/мл наносили на колонку Τ8Κ2000, уравновешенную 50 мМ фосфатным буфером, рН 7,4. Скорость потока устанавливали на 1 мл/мин. Примерно 50% вводимого количества ΌΑΤ0117 элюировалось с колонки в виде двух перекрывающихся пиков с М\х около 35-45 кДа (димер и более), что указывает на сильную самоассоциацию в тестируемых в данной работе условиях (ΒδΑ-контроль вел себя, как и ожидалось, подтверждая экспериментальные результаты для ΌΑΤ0117, давая два пика с молекулярной массой 61 и 146 кДа (мономер и димер)); см. фиг. 7 для 8ЕС-Ма1 результатов.
ΌΑΤ0120.
100 мкл ΌΑΤ0120 в концентрации 1 мг/мл наносили на колонку Τ8Κ2000, уравновешенную 50 мМ фосфатным буфером, рН 7,4. Скорость потока устанавливали на 1 мл/мин. Примерно 50% вводимого количества ΌΑΤ0120 элюировалось с гель-фильтрационной (СЕ) колонки в виде немного асимметричного пика с Мте, определенной как примерно 25 кДа. Это указывает на самоассоциацию ΌΑΤ0120 в тестируемых в данной работе условиях, по-видимому, белок находится в быстроустанавливающемся равновесии между мономером и димером (ΒδΑ-контроль вел себя, как и ожидалось, подтверждая экспериментальные результаты для ΌΑΤ0120, давая два пика с молекулярной массой 61 и 146 кДа (мономер и димер)); см. фиг. 8 для 8ЕС-Ма1-результатов.
Из этих приведенных выше экспериментов было сделано заключение, что ΌΑΤ0115 демонстрирует значительно меньшую самоассоциацию (и возможно никакой) в используемых в данной работе условиях по сравнению с другими двумя молекулами, которые показывают значительную самоассоциацию. Мономерное состояние в растворе может быть предпочтительным в плане действия ίη νίνο и в плане предшествующего и последующего процесса при изготовлении (лекарственного средства), поэтому благодаря своему состоянию в растворе ΌΑΤ0115 может представлять собой наиболее идеальную молекулу для продвижения к применению в клинике.
Пример 15. Очистка после экспрессии в клетках млекопитающих без использования аффинной матрицы с белком Ь.
Проводили очистку как ΌΑΤ0120, так и ΌΑΤ0115 из НЕК293-супернатантов. Проводили экспрессию каждого белка в культуре ткани млекопитающих в НЕК293Е-клетках из вектора рТТ-5. Колонку с 1 мл носителя МЕР нурегсе1 уравновешивали РВ8, промывали 0,1 М гидроксидом натрия и затем вновь уравновешивали РВ8. По 200 мл супернатанта наносили на колонку при скорости 2,5 мл/мин, затем колонку промывали РВ8 и проводили элюирование 0,1 М глицином, рН 2.
Полученный после элюирования образец нейтрализовали путем добавления 1 М Трис, рН 8, в количестве 1/5 об. и хранили при комнатной температуре. После хранения в образце было отмечено незначительное количество осадка, и его фильтровали, используя устройство ЛепГНр, после чего обессоливали.
Две колонки для обессоливания 26/10 ШРгер уравновешивали 20-мМ ацетатом натрия, рН 5 (измерено рН 5,3) при 10 мл/мин, очищали путем добавления 0,1 М №1ОИ и повторно уравновешивали 20 мМ ацетатом натрия, рН5.
- 22 018471
Обессоливание ΌΑΤ0115 проводили, используя 20 мМ ацетат натрия, рН 5, после чего наносили на 1 мл Н1Тгар 8РРР, уравновешенной 20 мМ ацетатом натрия, рН 5 (в действительности 5,2). После промывки колонки ее подвергали обработке 0-100%-ным градиентом 20 мМ ацетата натрия, рН 5, с 1 М №С1, и элюируемые фракции с величиной поглощения более 5 тАи собирали и анализировали посредством 8Ό8-ΡΑΟΕ.
После хранения 8Р-РР-фракций в течение ночи образец фильтровали через 0,2-мкм фильтр и наносили на 2Х колонки для обессоливания 26/10 Н1Ргер, уравновешенные 20 мМ цитратом натрия, рН 6,2, 100 мМ №С1. Элюат концентрировали с использованием центрифужного концентратора (20 мл), подвергали стерилизации фильтрованием и тестировали эндотоксин в разведениях 1/10 и 1/200. Эндотоксин тестировали в двух разведениях, для разведения 1/10 получали величину 30 Еи/мл со степенью извлечения 250. Для теста с 1/200 получали величину менее 10,8 Еи/мл со степенью извлечения 126%. Образец передавали для проведения М8-анализа, используя ΙΌ 27823. Наблюдается низкий уровень примесей, отмечаемых ниже маркера 80 кДа и в диапазоне маркеров 110-160 кДа при большой загрузке. Ожидается, что чистота образца будет превышать 95%.

Claims (31)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Композиция слитой конструкции или конъюгата, содержащая или состоящая из следующего: (а) лекарственное средство, выбранное из эксендинов, ΡΥΥ (пептида ΥΥ), СЬР (глюкагоноподобного пептида), ОХМ (окситомодулина), У!Р (вазоактивного интестинального пептида) или РР (панкреатического полипептида), присутствующее в виде слитой конструкции или конъюгата с (б) однодоменным антителом (4АЬ) Ό0Μ 71-14, которое связывает сывороточный альбумин и которое имеет аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 1(11) (8ЕО ΙΌ N0: 8).
  2. 2. Композиция по п.1, где лекарственным средством является молекула эксендина-4 или ОЬР-1 (глюкагоноподобного пептида 1).
  3. 3. Композиция по п.1 или 2, где лекарственное средство выбрано из (а) ОЬР-1 (7-37) А8О мутанта, который имеет аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 1(1) (8ЕО ΙΌ N0: 9), или (б) молекулы эксендина-4, которая имеет аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 1(|) (8ЕО ΙΌ N0: 10).
  4. 4. Композиция по любому из пп.1-3, которая содержит аминокислотный или химический линкер, соединяющий лекарственное средство и 4АЬ.
  5. 5. Композиция по п.4, где аминокислотный линкер представляет собой спиральный линкер с аминокислотной последовательностью, показанной на фиг. 1(к) (8Е0 ΙΌ N0: 11), или д1у-8ег-линкер с аминокислотной последовательностью, показанной на фиг. 1(1) (8Е0 ΙΌ N0: 12).
  6. 6. Композиция по любому из пп.1-5, где лекарственное средство присутствует в качестве части слитой конструкции либо на Юконце, либо на С-конце ЙАЬ.
  7. 7. Композиция по п.6, которая содержит аминокислотную последовательность или состоит из аминокислотной последовательности, которая выбрана из следующего:
    (а) слитая конструкция 2хОЬР-1 А8О Ό0Μ71-14 (ЭАТ0114)
    ΗΟΕΟΤΡΤδΟνδδΥίΕΟΟΑΑΚΕΕΙΑννίνΚΟΗΗΟΕΟΤΕΤδΟνδδΥΙΕΟΟ ААКЕЕ1АМ1_УКОЕ010МТС18Р881-ЗА5\/СОР\/Т|ТСРА8С1\Л/1(3301_3 ννΥααΚΡΟΚΑΡΚΙΙΙΜννΒ83ΐα8ΘνΡ8ΡΕ8Ο8Ο8ΟΤ0ΕΤίΤ18δίΟΡΕ0 ΡΑΤΥΥΟΑαΟΑΑΙΡΡΤΕΟΟΟΤΚνΕΙΚΕ (ЗЕО Ю N0 1);
    (б) слитая конструкция эксендин 4, (О48)3-линкер, Ό0Μ71-14 (ЭАТ0115)
    Η<3Ε<3ΤΕΤ30ί-8ΚΟΜΕΕΕΑνΚΙΕΙΕν\/1-ΚΝΘ(3Ρ88ΟΑΡΡΡ8<3Θ8<3(38(3Ο
    0С8О6вС80ЮМТ08Р38к8А8У80Р\Я1ТСРА8<ЖЮ8О1-3\Л/У00К ΡΟΚΑΡΚΐυΜννΚ88ία8θνΡδΚΕ80δΟδΟΤΟΕΤί.ΤΙ881.αΡΕΟΕΑΤΥΥ ΟΑΟΘΑΑίΡΒΤΕΟΟΟΤΚνΕΙΚΕ (8ЕО Ю N0 2);
    (в) слитая конструкция эксендин 4 Ω0Μ711-14 (ЭАТ0116)
    Η6ΕΟΤΕΤ8013Κ0ΜΕΕΕΑνΡΙΡΙΕν\/ίΚΝ6ΘΡ556ΑΡΡΡ5Θ0Ι0ΜΤ08Ρ
    3318Α3νΘΟΕ\/ΤΙΤΟΡΑ8θννΐΘ8013νννΌαΚΡΟΚΑΡΚΙΕΙΜννΡ88ίΟ 8ΘνΡ3ΚΕ3Θ3030ΤΟΕΤΙΤΙ83ίΟΡΕΟΕΑΤΥΥΟΑ06ΑΑΙΡΡΤΕΘ06ΤΚ νΕΙΚΕ (8ΕΟ Ю ΝΟ 3);
    (г) слитая конструкция эксендин 4, спиральный линкер, Э0М711-14 (ЭАТ0117)
    - 23 018471
    ΗΘΕΘΤΕΤ5015Κ0ΜΕΕΕΑνΒΙ_ΗΕννΐΚΝ6ΘΡδ56ΑΡΡΡδ<3ΚΕΑΑΑΚΕ
    ΑΑΑΚΕΑΑΑΚΕΙ_ΑΑΚΕΑΑΑΚΕΑΑΑΚΕΑΑΑΚΕίΑΑ0Ι0ΜΤ08Ρ88ίδ
    ΑδνΘΟΒνΤΙΤΟΗΑδΟννίΘδΟΙδννΥΟαΚΡΟΚΑΡΚίίΙΜννΚδδίαδΘν ρδΚΕδΘδΘδοτϋΡΤίτίδδίαΡΕΟΕΑΤΥΥΟΑαοΑΑΐΡΒΤΕΟοατκνΕί κκ (δΕΟ ΙϋΝΟ4);
    (д) слитая конструкция 6ЬР-1 А86, (648)3 линкер, ЭОМ711-14 (ЭАТ0118)
    ΗΟΕβΤΕΤ80ν83ΥΙΕ60ΑΑΚΕΡΙΑννΐνΚΘΚ6ΟΟΘ8(30ΘΘδ66ΘΘδ0
    ΙΟΜΤΟ8Ρ88ί8Α8νθΟΚνΤΙΤ0ΡΑ3θνν[Ο3Οί3ννΥΟ0ΚΡΘΚΑΡΚΙΙΙ
    ΜννΕ?33ίΟ86νΡ3ΡΕ3Ο8Ο3ΟΤ0ΡΤΙΤΙ381ΟΡΕΟΕΑΤΥΥΟΑΟΟΑΑίΡΚ
    ΤΡΟΟΟΤΚνΕΙΚΡ (8ΕΟ Ю ΝΟ 5);
    (е) слитая конструкция 6ЬР-1 А86, Р88 линкер, ЭОМ711-14 (ΌΑΤ0119)
    ΗΟΕΘΤΡΤ8θν88ΥΕΕΟΟΑΑΚΕΠΑννΐνΚΘΚ6Ρ330[ΟΜΤΟ3Ρ8313Α3
    УООКХ/Т1ТСКА8а\ЛЛ63013^00КР<ЗКАРКШМ\Л/К331.03ОУРЗК
    Ρ8(38<33ΟΤ0ΡΤΙ_ΤΙ881.0ΡΕ0ΕΑΤΥΥ0ΑΟΟΑΑΙ_ΡΡΤΡ<30<3ΤΚνΕΙΚΡ (8Е0 Ю N0 6) (ж) слитая конструкция 6ЬР-1А86, спиральный линкер, ЭОМ711-14 (ЭАТ0120)
    ΗΟΕΘΤΡΤΒΟνββΥίΕΘΟΑΑΚΕΡΙΑννίνΚΘΚΟΚΕΑΑΑΚΕΑΑΑΚΕΑΑ
    ΑΚΕίΑΑΚΕΑΑΑΚΕΑΑΑΚΕΑΑΑΚΕΙ-ΑΑΟΙ0ΜΤ08Ρ38ί8Α8νθΟΚ\/Τ
    ΙΤ0ΚΑ8θννΐΟ8Οί8ννΥ0ΟΚΡΟΚΑΡΚΙΙΙΜννΚ38ίΟ8ΘνΡ8ΚΕ8Θ8Ο8 ΘΤΟΕΤίΤΙβδίΟΡΕΟΕΑΤΥΥΟΑΩΟΑΑίΡΕΤΕΟΟΘΤΚνΕΙΚΚ (8Ε0 Ю N0 7).
  8. 8. Композиция по любому из пп.1-7, где бАЬ дополнительно отформатировано для увеличения его гидродинамического размера посредством присоединения к бАЬ молекул(ы), выбранных(ой) из следующего: группа ПЭГ (полиэтиленгликоль), сывороточный альбумин, трансферрин, рецептор трансферрина или, по меньшей мере, его трансферринсвязывающий участок, Ре-область антитела, или посредством конъюгирования с доменом антитела.
  9. 9. Композиция по любому из пп.1-8, содержащая дополнительную пептидную или полипептидную группировку.
  10. 10. Композиция по любому из пп.1-9, содержащая дополнительные группировки бАЬ, которые имеют одинаковые или разные специфичности связывания с бАЬ Эот711-14.
  11. 11. Композиция по любому из пп.1-10, имеющая период полувыведения из организма человека 12 ч или больше, например 12-21 день.
  12. 12. Композиция по любому из пп.1-11, которая связывает человеческий сывороточный альбумин с КО в диапазоне от примерно 5 мкмоль до примерно 1 пкмоль.
  13. 13. Фармацевтическая композиция, содержащая композицию по любому из пп.1-12 в комбинации с фармацевтически или физиологически приемлемым носителем, эксципиентом или разбавителем.
  14. 14. Фармацевтическая композиция по п.13, содержащая дополнительные терапевтические или активные агенты.
  15. 15. Композиция, содержащая (а) композицию по любому из пп.1-12 и (б) дополнительные терапевтические или активные агенты, для раздельного, последовательного или одновременного введения субъекту.
  16. 16. Композиция по любому из пп.1-15 для применения в лечении или предупреждении метаболического заболевания или расстройства.
  17. 17. Композиция по п.16, где заболевание или расстройство выбрано из гипергликемии, нарушенной толерантности к глюкозе, бета-клеточной недостаточности, диабета (диабета I или II типа или гестационного диабета), ожирения, заболеваний, характеризующихся перееданием.
  18. 18. Применение композиции по любому из пп.1-15 в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения метаболического заболевания или расстройства.
  19. 19. Применение композиции по любому из пп.1-15 в изготовлении лекарственного средства для доставки субъекту путем подкожной, внутривенной или внутримышечной инъекции.
  20. 20. Применение композиции по любому из пп.1-15 в изготовлении лекарственного средства для парентеральной, пероральной, ректальной, трансмукозальной, глазной, легочной доставки или доставки через ЖК (желудочно-кишечный) тракт.
  21. 21. Способ лечения или предупреждения метаболического заболевания, включающий введение пациенту терапевтически или профилактически эффективного количества композиции по любому из пп.115.
    - 24 018471
  22. 22. Пероральный, инъекционный, ингалируемый или распыляемый препарат, содержащий композицию по любому из пп.1-15.
  23. 23. Препарат с длительным высвобождением, например, в форме суппозитория, содержащий композицию по любому из пп.1-15.
  24. 24. Лиофильно высушенный препарат, содержащий композицию по любому из пп.1-15.
  25. 25. Выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая композицию по любому из пп.1-7.
  26. 26. Нуклеиновая кислота, кодирующая композицию по п.7.
  27. 27. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.25 или 26.
  28. 28. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.25 или 26 или вектор по п.27.
  29. 29. Способ получения слитого полипептида, содержащего или состоящего из следующего: (а) лекарственное средство, выбранное из эксендинов, ΡΥΥ (пептида ΥΥ), СЬР (глюкагоноподобного пептида), ОХМ (окситомодулина), νΙΡ (вазоактивного интестинального пептида) или РР (панкреатического полипептида), присутствующее в виде слитой конструкции с (б) однодоменным антителом (6Α^ Ω0Μ711-14. которое связывает сывороточный альбумин и которое имеет аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 1(й), включающий поддержание клетки-хозяина по п.28 в условиях, подходящих для экспрессии указанных нуклеиновой кислоты или вектора, в результате чего продуцируется слитый полипептид.
  30. 30. Способ лечения или предупреждения заболевания или расстройства, ассоциированного с повышенным содержанием глюкозы в крови у пациента, например пациента-человека, включающий введение указанному пациенту терапевтически или профилактически эффективного количества композиции по любому из пп.1-15.
  31. 31. Способ стимулирования продуцирования инсулина и/или увеличения чувствительности к инсулину у пациента, например пациента-человека, включающий введение указанному пациенту по меньшей мере одной дозы композиции по любому из пп.1-15.
EA201001357A 2008-03-31 2009-03-27 Слитые конструкции и конъюгаты лекарственного средства EA018471B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US4079608P 2008-03-31 2008-03-31
US8689108P 2008-08-07 2008-08-07
PCT/EP2009/053640 WO2009121804A1 (en) 2008-03-31 2009-03-27 Drug fusions and conjugates

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201001357A1 EA201001357A1 (ru) 2011-04-29
EA018471B1 true EA018471B1 (ru) 2013-08-30

Family

ID=40683717

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201001357A EA018471B1 (ru) 2008-03-31 2009-03-27 Слитые конструкции и конъюгаты лекарственного средства

Country Status (13)

Country Link
US (2) US20110020345A1 (ru)
EP (1) EP2259802A1 (ru)
JP (1) JP2011517561A (ru)
KR (1) KR20100132535A (ru)
CN (1) CN102046207B (ru)
AU (1) AU2009231439A1 (ru)
BR (1) BRPI0909397A2 (ru)
CA (1) CA2718480A1 (ru)
EA (1) EA018471B1 (ru)
MX (1) MX2010010776A (ru)
SG (1) SG189682A1 (ru)
WO (1) WO2009121804A1 (ru)
ZA (1) ZA201006763B (ru)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2364326B1 (en) 2008-12-05 2018-07-04 Glaxo Group Limited Methods for selecting protease resistant polypeptides
KR20110137819A (ko) * 2009-03-27 2011-12-23 글락소 그룹 리미티드 약물 융합체 및 컨쥬게이트
SG10201406063XA (en) * 2009-09-30 2014-11-27 Glaxo Group Ltd Drug fusions and conjugates with extended half life
US9835416B1 (en) 2010-04-12 2017-12-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy Multi-ply heterogeneous armor with viscoelastic layers
MX2013002055A (es) * 2010-08-20 2013-07-22 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Variantes anti-enlace de albumina de suero mejodas.
CN103370083B (zh) * 2010-09-28 2016-11-16 艾米琳制药有限责任公司 具有增强的作用持续时间的工程化多肽
CN102010473A (zh) * 2010-11-10 2011-04-13 曹鹏 重组胃泌酸调节素融合蛋白及其制备和应用
US20120171120A1 (en) 2010-11-30 2012-07-05 Genentech, Inc. Low affinity blood brain barrier receptor antibodies and uses therefor
WO2012136792A2 (en) * 2011-04-07 2012-10-11 Glaxo Group Limited Cck compositions
WO2012136790A1 (en) * 2011-04-07 2012-10-11 Glaxo Group Limited Compositions comprising fusion proteins or conjugates with an improved half -life
UA113626C2 (xx) * 2011-06-02 2017-02-27 Композиція для лікування діабету, що містить кон'югат інсуліну тривалої дії та кон'югат інсулінотропного пептиду тривалої дії
AU2013201303C1 (en) * 2011-10-06 2016-06-23 MiRagen Therapeutics, Inc. Control of whole body energy homeostasis by microRNA regulation
WO2013138338A2 (en) 2012-03-12 2013-09-19 Massachusetts Institute Of Technology Methods for treating tissue damage associated with ischemia with apoliporotein d
WO2013148117A1 (en) 2012-03-27 2013-10-03 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
US9844582B2 (en) 2012-05-22 2017-12-19 Massachusetts Institute Of Technology Synergistic tumor treatment with extended-PK IL-2 and therapeutic agents
CN104371019B (zh) * 2013-08-13 2019-09-10 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 一种能与glp-1r特异性结合的抗体及其与glp-1的融合蛋白质
ES2815572T3 (es) 2014-05-16 2021-03-30 Ablynx Nv Dominios variables de inmunoglobulina
CR20170027A (es) * 2014-07-30 2017-05-09 Ngm Biopharmaceuticals Inc Composiciones y métodos de uso para tratar trastornos metabólicos
JP6800141B2 (ja) 2014-08-12 2020-12-16 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー Ｉｌ−２およびインテグリン結合性ｆｃ融合タンパク質による相乗的な腫瘍処置
WO2016025647A1 (en) 2014-08-12 2016-02-18 Massachusetts Institute Of Technology Synergistic tumor treatment with il-2, a therapeutic antibody, and a cancer vaccine
CN104327187B (zh) * 2014-10-11 2018-06-08 上海兴迪金生物技术有限公司 一种重组人GLP-1-Fc融合蛋白
TWI703161B (zh) 2014-10-31 2020-09-01 美商Ｎｇｍ生物製藥公司 用於治療代謝病症之組合物及方法
EP3257524B1 (en) 2015-02-11 2020-08-26 Gmax Biopharm LLC Stabilized solution preparation of pharmaceutical glp-1r antibody fusion protein
RU2636044C1 (ru) * 2016-05-26 2017-11-17 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольберга" Средство для стимуляции дифференцировки панкреатических предшественников бета-клеток в продуцирующие и секретирующие инсулин бета-клетки при инсулинзависимом сахарном диабете
US10350266B2 (en) 2017-01-10 2019-07-16 Nodus Therapeutics, Inc. Method of treating cancer with a multiple integrin binding Fc fusion protein
EP3568150A4 (en) 2017-01-10 2020-12-02 Xcella Biosciences, Inc. POLYTHERAPY FOR TUMOR TREATMENT WITH INTEGRIN-BOUND FC FUSION PROTEIN AND IMMUNE MODULATOR
EP3684816B1 (en) 2017-09-22 2024-05-29 Kite Pharma, Inc. Chimeric polypeptides and uses thereof
US11753455B2 (en) 2018-06-21 2023-09-12 Novo Nordisk A/S Compounds for treatment of obesity
CA3113618A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Massachusetts Institute Of Technology Collagen-localized immunomodulatory molecules and methods thereof
EP3914289A1 (en) 2019-01-23 2021-12-01 Massachusetts Institute of Technology Combination immunotherapy dosing regimen for immune checkpoint blockade
EP3990491A1 (en) 2019-06-26 2022-05-04 Massachusetts Institute of Technology Immunomodulatory fusion protein-metal hydroxide complexes and methods thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006059106A2 (en) * 2004-12-02 2006-06-08 Domantis Limited Bispecific domain antibodies targeting serum albumin and glp-1 or pyy
WO2007066106A1 (en) * 2005-12-06 2007-06-14 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for egfr and/or vegf and methods of use therefor
WO2008096158A2 (en) * 2007-02-08 2008-08-14 Domantis Limited Antibody single variable domains against serum albumin

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ222907A (en) 1986-12-16 1990-08-28 Novo Industri As Preparation for intranasal administration containing a phospholipid absorption enhancing system
EP1892296A1 (en) 1988-09-02 2008-02-27 Dyax Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
JPH04504246A (ja) 1989-03-20 1992-07-30 ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレーション インシュリン刺激ホルモン
ATE164852T1 (de) 1990-01-24 1998-04-15 Douglas I Buckley Glp-1-analoga verwendbar in der diabetesbehandlung
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
DK36492D0 (da) 1992-03-19 1992-03-19 Novo Nordisk As Praeparat
ES2319936T5 (es) 1996-08-08 2013-06-24 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Regulación de la motilidad gastrointestinal
DK1801214T3 (da) 1997-07-07 2011-01-24 Medical Res Council In vitro sorteringsfremgangsmåde
PT1019077E (pt) 1997-08-08 2008-02-21 Amylin Pharmaceuticals Inc Novos compostos agonistas de exendina
BR9814189A (pt) 1997-11-14 2000-10-03 Amylin Pharmaceuticals Inc "compostos agonistas da exendina"
EP1066314B1 (en) 1997-11-14 2007-12-26 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Novel exendin agonist compounds
CA2320371C (en) 1998-02-13 2012-01-17 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Inotropic and diuretic effects of exendin and glp-1
EP1056775B1 (en) 1998-02-27 2010-04-28 Novo Nordisk A/S Glp-1 derivatives of glp-1 and exendin with protracted profile of action
IL127127A0 (en) 1998-11-18 1999-09-22 Peptor Ltd Small functional units of antibody heavy chain variable regions
IL155812A0 (en) 2000-12-07 2003-12-23 Lilly Co Eli Glp-1 fusion proteins
DK1412384T3 (da) 2001-06-28 2008-04-28 Novo Nordisk As Stabil formulering af modificeret GLP-1
EP1463751B1 (en) 2001-12-21 2013-05-22 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
WO2003059934A2 (en) 2001-12-21 2003-07-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP1594530A4 (en) 2003-01-22 2006-10-11 Human Genome Sciences Inc HYBRID PROTEINS OF ALBUMIN
TW200526254A (en) 2003-09-19 2005-08-16 Novo Nordisk As Novel GLP-1 derivatives
US8921528B2 (en) * 2004-06-01 2014-12-30 Domantis Limited Bispecific fusion antibodies with enhanced serum half-life
JP5072848B2 (ja) * 2005-09-20 2012-11-14 ノバルティス アーゲー 低血糖イベントを低減するためのｄｐｐ−ｉｖ阻害剤の使用
GB0621513D0 (en) * 2006-10-30 2006-12-06 Domantis Ltd Novel polypeptides and uses thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006059106A2 (en) * 2004-12-02 2006-06-08 Domantis Limited Bispecific domain antibodies targeting serum albumin and glp-1 or pyy
WO2007066106A1 (en) * 2005-12-06 2007-06-14 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for egfr and/or vegf and methods of use therefor
WO2008096158A2 (en) * 2007-02-08 2008-08-14 Domantis Limited Antibody single variable domains against serum albumin

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HOLT L.J. ET AL.: "Domain antibodies: proteins for therapy", TRENDS IN BIOTECHNOLOGY, ELSEVIER PUBLICATIONS, CAMBRIDGE, GB, vol. 21, no. 11, 1 November 2003 (2003-11-01), pages 484-490, XP004467495, ISSN: 0167-7799, the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2259802A1 (en) 2010-12-15
BRPI0909397A2 (pt) 2015-12-15
CN102046207A (zh) 2011-05-04
SG189682A1 (en) 2013-05-31
JP2011517561A (ja) 2011-06-16
CA2718480A1 (en) 2009-10-08
MX2010010776A (es) 2010-10-26
WO2009121804A1 (en) 2009-10-08
EA201001357A1 (ru) 2011-04-29
KR20100132535A (ko) 2010-12-17
US20110020345A1 (en) 2011-01-27
CN102046207B (zh) 2013-08-28
US20130189255A1 (en) 2013-07-25
AU2009231439A1 (en) 2009-10-08
ZA201006763B (en) 2012-03-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA018471B1 (ru) Слитые конструкции и конъюгаты лекарственного средства
US10406230B2 (en) Exendin-4 analogue pegylated with polyethylene glycol or derivative thereof, preparation method thereof, and pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes, containing same as active ingredient
KR102449145B1 (ko) 지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 당뇨병 치료용 조성물
US8779103B2 (en) Drug fusions and conjugates
JP6704358B2 (ja) 代謝障害を治療するための組成物および使用方法
US20140227264A1 (en) Drug fusions and conjugates with extended half life
CN114853908A (zh) 一种治疗代谢疾病的融合蛋白
WO2012136792A2 (en) Cck compositions

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU