EA015629B1 - Пептиды, используемые для лечения и диагностики аутоиммунных заболеваний - Google Patents

Пептиды, используемые для лечения и диагностики аутоиммунных заболеваний Download PDF

Info

Publication number
EA015629B1
EA015629B1 EA200800556A EA200800556A EA015629B1 EA 015629 B1 EA015629 B1 EA 015629B1 EA 200800556 A EA200800556 A EA 200800556A EA 200800556 A EA200800556 A EA 200800556A EA 015629 B1 EA015629 B1 EA 015629B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cells
antibodies
patients
peptides
disease
Prior art date
Application number
EA200800556A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200800556A1 (ru
Inventor
Арпи Матоссиан-Роджерс
Original Assignee
Арпи Матоссиан-Роджерс
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB0516527A external-priority patent/GB0516527D0/en
Priority claimed from GB0609921A external-priority patent/GB0609921D0/en
Priority claimed from GB0609920A external-priority patent/GB0609920D0/en
Application filed by Арпи Матоссиан-Роджерс filed Critical Арпи Матоссиан-Роджерс
Publication of EA200800556A1 publication Critical patent/EA200800556A1/ru
Publication of EA015629B1 publication Critical patent/EA015629B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39566—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against immunoglobulins, e.g. anti-idiotypic antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
    • C07K16/4258—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation

Abstract

Настоящее изобретение относится к пептидам, происходящим от антител, реагирующих с эпитопом, содержащим GPI-якорь, и к их функционально эквивалентным лигандам. Эти пептиды могут быть использованы для лечения и диагностики различных заболеваний, которые, как предполагается, вызываются нежелательным присутствием в организме аутоантител, реагирующих с эпитопами, содержащими GPI-якорь. В настоящем изобретении также описан механизм действия аутоантител, нарушающих функцию организма и вызывающих заболевание, а также способ предупреждения данного заболевания и детектирования указанного аутоантитела.

Description

Настоящее изобретение относится к пептидам, происходящим от антител, направленных против ΟΡΙ-заякоренного эпитопа и функционально-эквивалентных лигандов. Эти пептиды могут быть использованы в целях терапии и диагностики ряда заболеваний, этиологическим фактором которых, как считается, является нерелевантное присутствие в организме аутоантител, реагирующих с ΟΡΙ-заякоренными эпитопами. В настоящем изобретении также описан механизм действия указанных аутоантител, которые нарушают функции организма и, тем самым, вызывают развитие заболеваний; и кроме того, описан способ предупреждения заболевания и обнаружения таких аутоантител.
Все цитируемые здесь публикации, патенты и патентные заявки во всей своей полноте включены в настоящее описание посредством ссылки.
Предшествующий уровень техники
Настоящее изобретение относится к новой концепции этиологии аутоиммунных заболеваний, а также других заболеваний, которые в настоящее время не считаются аутоиммунными. Эта концепция была впервые высказана в Международной патентной заявке \¥О 99/05175, в которой указывалось, что вырабатывание природных аутоантител со специфической активностью ассоциируется с развитием различных аутоиммунных заболеваний, таких как диабет. Указанная концепция заключалась в том, что манифестации или обострения большинства наследственных или ненаследственных, инфекционных или неинфекционных заболеваний, или состояний, ассоциированных с процессом старения, связано с продуцированием мультиспецифических аутоантител. Эти аутоантитела продуцируются у большого числа людей, и вызывают нарушение работы всех систем и органов, функция которых зависит от уровней глюкозы в крови, уровней инсулина, уровней других гормонов, регулируемых инсулином и/или СР1заякоренными молекулами, а также другими регуляторными молекулами, распознаваемыми указанным аутоантителом, и фосфолипидами. Эти аутоантитела могут ускорять процесс старения и вызывать развитие заболеваний, ассоциированных со старением, стимулировать развитие рака, опосредовать манифестацию наследственных или ненаследственных заболеваний и препятствовать защитному действию лекарственных средств первого ряда, направленных против инфекционных патогенов. То есть в основе патогенеза указанных заболеваний лежит продуцирование аутоантитела, которое зависит от восприимчивости индивидуума и приводит к развитию одного или нескольких состояний или заболеваний неясной этиологии. Аналогичным образом любое из указанных лекарственных средств может продуцировать один или несколько побочных эффектов, которые обычно не возникают в отсутствии данного лекарственного средства. Таким образом, считается, что указанные антитела являются этиологическим фактором множества различных расстройств, манифестация которых происходит по одному и тому же механизму.
Патогенное аутоантитело представляет собой моноклональное антитело, которое распознает антиТСК-νβ-антитела, молекулы, способные передавать сигнал; фосфолипиды, включая фосфатидилинозит, вторичный посредник действия инсулина, одноцепочечные и двухцепочечные ДНК и элементы пути ΟΡΙ-заякоривания.
Хотя существуют некоторые методы лечения обсуждаемых здесь заболеваний и состояний, однако большинство из этих заболеваний пока не поддается лечению и являются главной причиной высокой заболеваемости и смертности. Таким образом, необходимость разработки новых способов терапии, которые были бы эффективными для предупреждения, лечения и диагностики указанных состояний, пока остается актуальной. Поэтому, если принять во внимание широкий спектр обсуждаемых здесь заболеваний, то необходимость в разработке способа монотерапии, который был бы эффективен для лечения всех указанных заболеваний, является крайне актуальной.
Заявителями было установлено, что для предупреждения, лечения и диагностики заболеваний и состояний широкого ряда могут быть использованы некоторые пептиды или антитела, называемые пептиднейтрализующими антителами.
Краткое описание сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к пептиду, происходящему от антитела, направленного против ΟΡΙ-заякоренного эпитопа или его функционально эквивалентного лиганда.
Концепция, выдвинутая авторами настоящего изобретения в ходе исследований, заключается в том, что многие заболевания проявляются или обостряются в результате продуцирования определенного аутоантитела. Это антитело реагирует с эпитопом, содержащим ΟΡΙ-якорь, но является мультиспецифическим, то есть оно также реагирует с эпитопами анти-ТСК^в-антител, молекулами, способными передавать сигнал, фосфолипидами, включая фосфатидилинозит, фосфатидилсерин и кардиолипин (диацилглицерин), фосфолипид-гликанами, вторичными посредниками действия инсулина, одноцепочечными и двухцепочечными ДНК и элементами пути ΟΡΙ-заякоривания. Элементы этого изобретения были впервые описаны в Международной патентной заявке \УО99/05175 (А. Ма!о881аи-Кодег8), содержание которой во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Одним из заболеваний, ассоциированных с присутствием указанных аутоантител, является диабет. В настоящее время существует мнение, что причиной развития диабета не является какая-либо механистическая взаимосвязь между инфекциями и теоретически предполагаемой аутоиммунной Т-клеточной
- 1 015629 деструкцией β-клеток (которая затем приводит к продуцированию многих известных аутоантител). Ключевые наблюдения начального повышения уровня продуцирования инсулина и нарушение секреции глюкагона при диабете также не могут быть объяснены существующими теориями.
Опираясь на концепцию, положенную в основу настоящего изобретения и проиллюстрированную на конкретных случаях заболеваемости диабетом, можно утверждать, что инфекции приводят к пролиферации Т-клеток с вырабатыванием моноклональных и поликлональных антител, и к увеличению числа Т-клеток с последующей их гомеостатической регуляцией. Это приводит к гибели Т-клеток, высвобождающих фрагменты Т-клеточных рецепторов (ТСН), генерирующие антитела (против ТСН νβ), с помощью которых могут быть идентифицированы различные Т-клетки(1). Эти антитела могут, в свою очередь, стимулировать вырабатывание антител против анти-ТСК.^в-антител. Такие моноклональные антитела против анти-ТСК.^в-антител связываются не только с анти-ТСК.^в-антителами, а также с человеческими панкреатическими α-клетками, как показали ίη νίίτο исследования (см. ^099/05175). Эти антитела против анти-ТСК^в-антител также реагируют с фосфолипидами, такими как кардиолипин, фосфатидилсерин и фосфатидилинозит.
Считается, что антитела против анти-ТСК.^в-антител распознают ΟΡΙ-заякоренные молекулы на αклетках, благодаря их перекрестному распознаванию фосфатидининозита, то есть, одного из элементов ΟΡΙ-заякоренной молекулы. Выло продемонстрировано, что фосфатидилинозит в высокой степени ингибирует связывание анти-ΟΡΙ антитела с ΟΡΙ-заякоренной молекулой-мишенью(2). ΟΡΙ-якори восприимчивы к действию инсулина, опосредуемому инсулин-активированными фосфолипазами(3,4). Было показано, что ΟΡΙ-заякоренные молекулы, которые быстро гидролизуются фосфолипазами, продуцируют вторичные мессенджеры в культивированных лактотрофах гипофиза(5). Таким образом, можно провести исследования механизма, посредством которого антитела, связывающиеся с ΟΡΙ-заякоренными молекулами на α-клетках, могут нарушать нормальную отрицательную обратную связь между секрецией инсулина и глюкагона этими клетками, и, тем самым, повышать уровень глюкагона.
Глюкагон участвует в секреции инсулина, индуцированного питательным веществом, посредством стимуляции продуциования οΛΜΡ в β-клетках панкреатических островков; при этом, продуцирование инсулина очищенными β-клетками заметно возрастает после добавления глюкагона или а-клеток(6). Было также показано, что глюкагон увеличивает амплитуду периодического высвобождения инсулина в ответ на продуцирование глюкозы(7). Поэтому действие таких антител на панкреотические островковые клетки должно приводить к сверхпродуцированию инсулина.
Этот факт был подтвержден научным описанием и данными, представленными в \У099/05175. При обработке клеток человеческих панкреатических островков, выделенных при аутопсии, моноклональными антителами против анти-ТСК.-Vβ-антител было обнаружено, что в этих клетках, по сравнению с контрольными клетками, наблюдается нарушение секреции инсулина. Таким образом, связывание антител против анти-ТСК.-Vβ-антител с панкреатическими α-клетками ίη νίίτο приводит к нарушению секреции инсулина. Кроме того было обнаружено, что у детей с недавно диагностированным диабетом, аутоантитела связываются с моноклональными анти-ТСК.-Vβ-антителами (см. табл. 2). Эти аутоантитела аналогичны антителам против анти-ТСК.-Vβ-антител. У диабетиков, такие аутоантитела могут быть ответственны за отвутствие восприимчивости α-клеток к нормальным физиологическим раздражителями, что может приводить к развитию гипергликемии и синдрому нарушения регуляции. Было высказано предположение, что определенную роль для этих молекул может играть тот факт, что у индивидуумов с диабетом типа Ι, указанные моноклональные антитела против анти-ТСК-νβ-антител не связываются с островковыми клетками, вероятно, потому, что молекулы-мишени либо были блокированы, либо уже были насыщены этими аутоантителами.
Пептиды
В настоящее время были получены пептиды, созданные на основе структуры моноклональных антител, которые представляют собой полиспецифические аутоантитела, описанные выше. Было показано, что такие пептиды являются иммуногенными у кроликов и стимулируют продуцирование антител, реагирующих с человеческими сыворотками широкого спектра. Было также показано, что такие пептиды оказывают ценное терапевтическое действие на человека.
Поэтому было высказано предположение, что поликлональные или моноклональные антитела, вырабатываемые против этих пептидов или эквивалентных лигандов, и сами пептиды и эквивалентные лиганды могут быть использованы в терапевтических и в аналитических методах качественного или количественного детектирования присутствия аутоантител или нейтрализующих антител, вырабатываемых против этих аутоантител.
Используемый здесь термин пептид включает в себя любую молекулу, содержащую аминокислоты, присоединенные друг к другу пептидными связями или модифицированными пептидными связями, то есть пептидными изостерами. Этот термин включает в себя олигопептиды с короткой цепью (5-20 аминокислот) и с более длинной цепью (20-500 аминокислот). Предпочтительный пептид включает в себя по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, или по меньшей мере 45 амино
- 2 015629 кислот, связанных друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями.
Предпочтительный пептид согласно изобретению содержит аминокислотную последовательность антитела, реагирующего с эпитопом, содержащим СР1-якорь, и с одной или несколькими из следующих молекул, такими как анти-ТСЯ-Ув-антитело; молекула, способная передавать сигнал; фосфолипид (включая фосфатидилинозит, фосфатидилсерин, кардиолипин (диацилглицерин) или фосфолипидгликан), вторичный посредник действия инсулина; и одноцепочечная или двухцепочечная ДНК. Указанное антитело может также реагировать с клетками одного или нескольких типов, включая человеческие панкреатические α-клетки, фолликулярные клетки щитовидной железы, клетки мозгового вещества надпочечника, клетки желудочно-кишечного тракта, клетки слюнных желез, клетки яичника, клетки поперечно-полосатой мышцы и клетки соединительных тканей, и этот список не является исчерпывающим. Термин реактивность означает, что указанные антитела обладают, по существу, более высокой аффинностью к перечисленным антигенам, чем к другим антигенам, с которыми данные антитела не связываются специфически. Такая, по существу, более высокая аффинность по меньшей мере в 1,5 раза, более предпочтительно по меньшей мере в 2 раза, еще более предпочтительно в 5, 10, 100, 1000, 10000, 100000, 106 раз или более превышает аффинность к указанным другим антигенам. При этом следует отметить, что хотя указанные антитела являются в высокой степени специфическими, однако конкретные антитела могут обладать высокой специфичностью к более, чем одному антигену. При описании такого феномена используются различные термины, включая термин перекрестная реактивность. Антигены, с которыми перекрестно реагирует данное антитело, могут иметь структурное сходство или различие. Примерами таких перекрестно реагирующих антител могут служить антитела, реагирующие с СР1-якорьсодержащим эпитопом и с одной или несколькими молекулами или клетками вышеуказанных типов.
Таким образом, пептидом согласно изобретению может быть фрагмент антитела, обладающий вышеуказанными свойствами. Так, например, такие фрагменты могут происходить от различных областей соответствующих антител, и примерами таких фрагментов антител могут служить ЕаЬ-, Е(аЬ')2-, Εν- и 8сЕу-фрагменты, обладающие предпочтительными свойствами. Методы конструирования таких фрагментов антител хорошо описаны в литературе (Мо1еси1аг 1штипо1о§у, Натек, Β.Ό. & С1отег Ό. М. ебк. , ШЬ Ргекк, №\ν Уогк, 1996; Ртас11са1 1ттипо1оду, Нау, Е. & УекЩооб, О. В1асксе11 8с1епсе Ь1б., 2002). Предпочтительные антитела, от которых происходят указанные фрагменты, описаны в Международной патентной заявке УО99/05175.
В частности, в некоторых вариантах изобретения, антитела, эквивалентные лиганды и их применение, описанные в УО99/05175, не входят в объем настоящего изобретения.
Особенно предпочтительными вариабельными областями, от которых могут происходить пептиды согласно изобретению, являются области, последовательности которых представлены в данном описании как 8ЕО ΙΌ ΝΝ: 2 (тяжелая цепь) и 4 (легкая цепь). Гены, кодирующие эти вариабельные области, были выделены из мышиных моноклональных клеток, секретирующих антитело, распознающее анти-ТСЯ-Увантитела. Соответствующие последовательности ДНК представлены в 8ЕО ΙΌ ΝΝ:1 и 3.
Другими предпочтительными вариабельными областями, от которых могут происходить пептиды согласно изобретению, являются области, последовательности которых представлены в данном описании как 8ЕО ΙΌ ΝΝ:18, 20, 34, 36, 50, 52, 66, 68, 82 и 84. Гены, кодирующие эти вариабельные области, были выделены из мышиных моноклональных клеток, секретирующих антитело, распознающее анти-ТСЯ-Увантитела. Соответствующие последовательности ДНК представлены в 8ЕО ΙΌ ΝΝ:17, 19, 33, 35, 49, 51, 65, 67, 81 и 83.
Предпочтительным пептидом согласно изобретению может быть фрагмент гипервариабельной области антитела, обладающего вышеописанными свойствами. Гипервариабельные области антитела представляют собой области, которые непосредственно контактируют с частью поверхности антигена. По этой причине, гипервариабельные области также иногда называют комплементарность-определяющими областями или СЭЯ Каждая из тяжелых и легких цепей имеет три СБЯ, обозначаемых здесь СБЯ-Н1, СБЯ-Н2, СБЯ-Н3, СБЯ-Ь1, СБЯ-Ь2 и СБЯ-Ь3.
Особенно предпочтительными гипервариабельными областями, от которых могут происходить пептиды согласно изобретению, являются области, последовательности которых представлены в данном описании как 8ЕО ΙΌ ΝΝ:6, 8, 10, 12, 14 и 16.
Были сконструированы некоторые пептиды, структура которых соответствует структуре последовательностей указанных гипервариабельных областей, и эти пептиды были протестированы на эффективность в качестве антигенов, способных связываться с анти-ТСЯ-Ув-антителами. Эти пептиды имеют аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕО ΙΌ ΝΝ: 8, 10 и 16, и представляют собой особенно предпочтительные пептиды согласно изобретению.
Другими предпочтительными гипервариабельными областями, от которых могут происходить пептиды согласно изобретению, являются области, последовательности которых представлены в данном описании как 8ЕО ΙΌ ΝΝ:22, 24, 26, 28, 30, 32, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 86, 88, 90, 92, 94 и 96.
Настоящее изобретение также относится к пептидам, которые могут быть связаны друг с другом с
- 3 015629 образованием димеров или мультимеров. Указанными димерами или мультимерами могут быть гомодимеры или гомомультимеры, либо ими могут быть гетеродимеры или гетеромультимеры. Такие связанные молекулы могут быть более эффективными, чем отдельные пептиды, поскольку их эффективность связывания может повышаться благодаря большей доступности сайтов связывания и/или находящихся на них различных эпитопов. Указанные пептиды могут быть присоединены непосредственно друг к другу, либо они могут быть связаны друг с другом посредством линкерных молекул, таких как аминокислоты (а в частности глицин), пептиды или химические линкерные группы.
Предпочтительными мультимерами являются гомодимеры, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕЦ ΙΌ N0:8, 8ЕЦ ΙΌ N0:10 или 8ЕЦ ΙΌ N0:16. Было показано, что гомодимеры, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕЦ ΙΌ N0:8, 8ЕЦ ΙΌ N0:10 или 8Е0 ΙΌ N0:16, и дополнительный ^концевой цистеиновый остаток, оказывают эффективное терапевтическое действие на пациентов (см. примеры 6 и 7). Такими пептидами могут быть также комбинации пептидов, аминокислотные последовательности которых представлены в 8ЕЦ ΙΌ N№6, 8, 10, 12, 14, 16, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 86, 88, 90, 92, 94 и 96. Предпочтительными комбинациями пептидов являются комбинации, включающие пептиды, аминокислотные последовательности которых представлены в 8ЕЦ ΙΌ N№8, 10 и 16 (например, 8ЕЦ ΙΌ N№8 и 10, 8ЕО ΙΌ N№8 и 16, 8ЕО ΙΌ N№10 и 16 и 8ЕО ΙΌ N№8, 10 и 16).
В соответствии с вышеописанными аспектами настоящего изобретения такие пептиды могут содержать аминокислоты, отличающиеся от 20 кодируемых генами незаменимых аминокислот и модифицированные либо под действием природных процессов, таких как посттрансляционный процессинг, либо химическими методами модификации, хорошо известными специалистам. Известными обычно применяемыми модификациями, которым могут быть подвергнуты полипептиды согласно изобретению, являются: гликозилирование, присоединение липида, сульфирование, гамма-карбоксилирование, например, остатков глутаминовой кислоты; гидроксилирование и АДФ-рибозилирование. Другими возможными модификациями являются ацетилирование, ацилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение молекулы тема, ковалентное присоединение нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное присоединение липидного производного, ковалентное присоединение фосфатидилинозита, перекрестное связывание (например, между цистеиновыми остатками), циклизация, образование дисульфидных связей, деметилирование, образование ковалентных поперечных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, образование ΟΡΙ-якоря, иодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизация, селеноилирование, присоединение аминокислот к белкам, опосредуемое переносом РНК, такое как аргинилирование, и убихитинизация. Модификации могут присутствовать в любом участке пептида, включая пептидный остов, аминокислотные боковые цепи и амино- или карбоксиконцы.
Пептиды согласно изобретению могут быть гомологичны пептидам, точно идентифицированным выше в 8ЕО ΙΌ N№2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 и 96. Два полипептида могут быть определены используемым здесь термином гомологичные, если последовательность одного из этих полипептидов имеет достаточно высокую степень идентичности или сходства с последовательностью другого полипептида. Термин идентичность означает, что в любом конкретном положении сопоставляемых последовательностей, эти две последовательности имеют идентичные аминокислотные остатки. Термин сходство означает, что в любом конкретном положении сопоставляемых последовательностей, эти две последовательности имеют аминокислотные остатки аналогичного типа. Степень идентичности и сходства может быть легко вычислена (Сошри1а1юпа1 Мо1еси1аг Βίοίοβν. Ьекк А. М. ей., 0хГогй Ишуегайу Ргекк, №\ν Уогк, 1988; Вюсошрийпд ЕчГопшШск апй Сепоше Рго_)ес!8, 8ιηί11ι И. V. ей., Асайешк Ргекк, №\ν Уогк, 1993; Сошри1ег Апа1у818 оГ 8ес.|иепсе Иа!а, Рай 1, СпГПп А.М. & СпГПп Н.С., ейк., Нитапа Ргекк, №\ν кгнеу, 1994; 8ес.|иепсе Апа1у818 ш Мо1еси1аг Вю1оду, уоп Нещ)е, С. Асайешк Ргекк, 1987; апй 8ес.|иепсе Апа1у818 Рптег, СпЬнкоу М. & Иеуегеих 1. ейк, М. 81оск1оп Ргекк, №\ν Уогк, 1991).
Обычно считается, что два пептида, имеющие идентичность более чем 25% (предпочтительно, в какой-либо определенной области, такой как гипервариабельная область), являются функционально эквивалентными. Предпочтительно функционально эквивалентные полипептиды согласно первому аспекту изобретения имеют степень идентичности последовательностей с пептидами, представленными любой из 8ЕО ΙΌ N№2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44,46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 и 96, или с их активными фрагментами, составляющую более, чем 25%. Более предпочтительные полипептиды имеют степень идентичности с указанными пептидами или с их активными фрагментами, составляющую более чем 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 или 99%, соответственно.
Указанные здесь проценты идентичности определяют с помощью компьютерной программы ВЬА8Т, уегкюп 2.1.3, с использованием параметров по умолчанию, установленных в NСВI (Национальный Центр Биотехнологической информации; 1Шр://\\л\лу.псЫ.п11п.ш11.до\7)|матрица В1окит 62; штраф за пробел-пропуск =11 и штраф за пробел-вставку =1].
- 4 015629
Поэтому гомологичными пептидами являются природные биологические варианты (например, аллельные варианты или варианты пептидов, образованные в результате географического изменения видов, от которых эти пептиды происходят) и мутанты (такие как мутанты, содержащие аминокислотные замены, инсерции, модификации или делеции) пептидов, которые точно идентифицированы выше в БЕО ГО ΝΝ:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 и 96. Такими мутантами могут быть пептиды, в которых один или несколько аминокислотных остатков заменены консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком (предпочтительно, консервативным аминокислотным остатком), и такой замененный аминокислотный остаток может быть, а может и не быть, остатком, кодируемым генетическим кодом. Обычно такие замены осуществляются между А1а, Уа1, Ьеи и Не; между Бег и Тйг; между кислотными остатками Акр и О1и; между Аки и О1и; между основными остатками Ьук и Агд; или между ароматическими остатками Рйе и Туг. Особенно предпочтительными являются варианты, в которых несколько аминокислот, то есть от 1 до 5 аминокислот, от 1 до 3 аминокислот, и 1 или 2 аминокислоты или только 1 аминокислота являются замененными, делетированными или добавленными в любой комбинации. Особенно предпочтительными являются молчащие замены, добавления и делеции, которые не влияют на свойства и активность указанного белка. Такими мутантами также являются пептиды, в которых один или несколько аминокислотных остатков имеют группу-заместитель, описанную выше.
Такими вариантами являются удлиненные или усеченные варианты пептидов, точно идентифицированных в данном описании как БЕО ГО ΝΝ: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 и 96. Что касается удлиненных вариантов, то, по всей вероятности, антигенная область этих пептидов будет иметь правильную укладку и обладать антигенной активностью в том случае, если в С- и/или Ν-концы последовательностей пептидного фрагмента будут включены дополнительные остатки. Так, например, в С-концевые и/или Ν-концевые граничные области пептидов могут быть введены дополнительные 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100 или даже 200 аминокислотных остатков, происходящих от пептидов, точно идентифицированных здесь как БЕО ГО ΝΝ: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 и 96, или происходящих от гомологичных последовательностей, так, чтобы такое введение не оказывало негативного влияния на способность полипептидных фрагментов к правильной укладке.
Что касается усеченных вариантов этих пептидов, то в С-конце и/или Ν-конце этих пептидов или в обоих этих концах могут быть делетированы, в основном, один или несколько аминокислотных остатков, так, чтобы это не оказывало негативного влияния на способность этих пептидов к правильной укладке.
Следовательно, модифицированные, мутированные или замененные пептиды могут быть, например, использованы для продуцирования пептидов, обладающих терапевтическими и/или фармакокинетическими свойствами, аналогичными указанным свойствам пептидов дикого типа, или даже лучшими свойствами. Такие пептиды должны сохранять эффективность пептида дикого типа, например, в отношении его связывания с биологической мишенью. Так, например, если восприимчивость данного пептида к расщеплению пептидазой после его инъекции индивидууму является нарушенной, то замена особенно чувствительной пептидной связи неотщепляемым пептидомиметиком может придавать пептиду большую стабильность, и таким образом, повышать его эффективность в качестве терапевтического средства. Аналогичным образом, замена Ь-аминокислотного остатка представляет собой стандартный метод сообщения данному пептиду меньшей чувствительности к протеолизу и, в конечном счете, большего сходства с органическими соединениями, не являющимися пептидами. Подходящими также являются аминоконцевые блокирующие группы, такие как трет-бутилоксикарбонил, ацетил, теил, сукцинил, метоксисукцинил, суберил, адипил, азелаил, данзил, бензилоксикарбонил, флуоренилметоксикарбонил, метоксиазелаил, метоксиадипил, метоксисуберил и 2,4-динитрофенил. Блокирование заряженных Ν- и Сконцов данных пептидов имеет дополнительное преимущество, заключающееся в улучшении прохождения пептида через гидрофобную клеточную мембрану и проникновения в клетку. Методы синтеза и получения пептидомиметиков и других соединений, не являющихся пептидомиметиками, хорошо известны специалистам (см., например, НтиЬу V. 1. & Ва1ке РМ, Сигг Меб Сйеш 2000, 7:945-70; Со1еЬю\\ък| А е1 а1, Сигг Θρίη Эгид Όίκεον Эете1 2001, 4: 428-34; К1ш НО & Кайл М, СотЬ Сйеш Н1дй Тйтоидйри! Бегееп 2000; 3: 167-8). Так, например, были описаны минибелки и синтетические миметики, обладающие способностью блокировать взаимодействие белок-белок и ингибировать образование белковых комплексов (Сосйгап АО, Сигг Ορίη Сйеш Вю1 2001, 5(6):654-659). Различные методы включения неприродных аминокислот в белки с использованием систем ίη νίΙΐΌ и ίη \Е'о-трансляции для зондирования и/или улучшения структуры и функции белков также описаны в литературе (см., например, Ооидйебу ОА, Сигг Ορίη Сйеш Вю1 2000, 4:645-52).
В литературе описано множество моделей, с помощью которых может быть осуществлен выбор консервативных аминокислотных замен, исходя из статистических и физико-химических исследований последовательности и/или структуры природных белков (см., например, Вогбо & Агдок, 1. Мо1. Вю1. 1991,217:721-9; Κ.οдον & №кгако\'. Рто1еш Епд 2001,14:459-463). Эксперименты по конструированию белков показали, что использование конкретных наборов аминокислот позволяет продуцировать белки с
- 5 015629 соответствующей укладкой и активные белки и облегчать классификацию аминокислотных замен, при которых аминокислоты могут более легко встраиваться в белковую структуру, и могут быть использованы для детектирования функциональных и структурных гомологов и паралогов (Мигрйу ЬВ с1 а1., Рго1с1п Еид. 2000, 13:149-52).
Пептиды согласно изобретению могут образовывать часть гибридных белков. Так, например, в процессе рекомбинантного продуцирования, в большинстве случаев, может оказаться предпочтительным введение одной или нескольких дополнительных аминокислотных последовательностей, которые могут содержать секреторные или лидерные последовательности, про-последовательности, последовательности, облегчающие очистку, или последовательности, повышающие стабильность белка. Альтернативно или дополнительно, зрелый пептид может быть присоединен к другому соединению, такому как соединение, увеличивающее время полужизни полипептида (например, полиэтиленгликоль). Эти пептиды могут быть также присоединены к биологическому или синтетическому веществу и могут быть конъюгированы с такими молекулами, как ферменты, соединения-индикаторы, лекарственные средства, токсины или метки (радиоактивные, флуоресцентные или другие метки).
Пептиды согласно изобретению могут быть получены любым подходящим методом. В частности, такими методами получения пептидов являются рекомбинантный метод, метод синтеза или комбинация этих методов. Методы твердофазного пептидного синтеза могут быть осуществлены с использованием химических групп 1-Вос или ЕМОС (см. 8о11б Рйазе Рерббе 8уи1йе518, ебз. 81е^ай & Уоиид, Йетсе С11сш. Со). Альтернативно, синтез пептидов может быть осуществлен в жидкой фазе (см. Сйеш1са1 Арртоасйез 1о 1Не 8уи1йе518 о! Рерббез аиб Рто1ет8, Ыоуб-^Шатз, Р., А1Ьепсю, Е. аиб 61та11, Е., СВС Ргезз, 1997).
Пептиды согласно изобретению могут иметь значительную структурную гомологию с пептидами, точно идентифицированными в 8ЕЭ ΙΌ ΝΝ:6, 8, 10, 12, 14, 16, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 86, 88, 90, 92, 94 и 96. В частности, пептиды согласно изобретению могут иметь некоторые играющие важную роль остатки гипервариабельных областей, аналогичные остаткам гипервариабельных последовательностей, идентифицированных в 8ЕЭ ΙΌ ΝΝ:6, 8, 10, 12, 14, 16, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 86, 88, 90, 92, 94 и 96. Такие важные остатки гипервариабельных областей, присутствующие в 8ЕЭ ΙΌ ΝΝ:6, 8, 10, 12, 14, 16, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 86, 88, 90, 92, 94 и 96, были идентифицированы путем сравнения последовательностей гипервариабельных областей.
Были клонированы и секвенированы гипервариабельные области шести перекрестно реагирующих мышиных моноклональных антител против анти-ТСВ-Ув-антител 1дМ и 1дС (см. примеры 1 и 5). Анализ последовательностей гипервариабельной области этих антител позволил получить важную информацию об остатках, необходимых для перекрестного связывания с анти-ТСВ-Ув-антителом (то есть о мультиспецифической реактивности с 6Р1-якорь-содержащим эпитопом, описанным в настоящей заявке).
Во-первых, результаты анализа данных последовательностей позволяют предположить, что конкретные аминокислоты могут играть важную роль в некоторых положениях в каждой СЭВ (см. пример 5). В соответствии с этим пептиды согласно изобретению могут содержать одну из нижеследующих последовательностей или состоять из этой последовательности, где х означает любой аминокислотный остаток, означает пептидную связь, и где указанные пептиды представлены в ориентации от Ν-конца к С-концу:
Консенсусная последовательность 1
Ο-Υ-Χ-Γ-Τ-Χ-Χ-Χ-Χ-ΧΉ
Консенсусная последовательность 2 (5Е0 10 N0:162)
Χ-Ι-Χ-Χ-Χ-Χ-Χ-Χ-Χ-Χ-Υ-ΧКонсенсусная оследовательность 3
Консенсусная последовательность 4
Консенсусная последовательность 5
Во-вторых, анализ этих последовательностей позволяет получить общую формулу для каждой СЭВ, исходя из клонированных последовательностей (см. пример 5). В соответствии с этим, пептиды согласно изобретению могут содержать аминокислотную последовательность или состоять из аминокислотной последовательности, соответствующей одной из нижеследующих общих формул, где в каждом из положений, представленных в скобках, выбрана одна из наиболее подходящих аминокислот, и где - означает пептидную связь, а указанные пептиды представлены в ориентации от Ν-конца к С-концу:
- 6 015629
Формула
С-Υ- [ТА] -Г-Т- [ΚΝ3]- [ΥΝ] - [ИСК] ~[1М)- [ΝΓ] -И
Формула [КИУ] -I- [ΥΝϋ] - [РТ] - [ЗУ] - [БИТ) - [35] - [УБЕ] - [ТР] [ΝΚΤ]-У- [Ν3Α] - [ОБ] - [КБ] -Г-К- [БС]
Формула [БКЕ] - [КЕ] - [СМЬ] - [ЬТУ] -[ЬТЕ] - [ΡΕΝ] - [БУ] - [УАУ]
Формула [КН] -А-3- [03] - [ЫБЗ] - [VI]-[БЗС] - [ΤΝ3] - [ΝΥ] [УБУ]-[АЫБ]
Формула [ ЗУК] - [АТ] -3- [ΥΚΙ ] - [ΚΣ] - [ΥΗΑ] -3
Вышеуказанная общая реагирующих антител, которые были клонированы и секвенированы авторами настоящего изобретения.
В третьих, анализ последовательностей позволяет получить аминокислотную формулу для каждой 0ΌΒ. которая включает в себя не только полностью консервативные аминокислоты, но также и наиболее распространенные (преобладающие) аминокислоты для каждого положения СЭЕ (см. пример 5). В соответствии с этим пептиды согласно изобретению могут содержать аминокислотную последовательность или состоять из аминокислотной последовательности, соответствующей одной из нижеследующих общих формул, где в каждом из положений, представленных в скобках, выбрана одна из наиболее подходящих аминокислот, и где - ции от Ν-конца к С-концу:
Формула
0-0-[Υ5] - [Ν3] - [ТЗ] - [ ΥΓ3]-Р-[БТР] - [ТР] формула включает в себя все последовательности СЭЕ перекрестноозначает пептидную связь, а указанные пептиды представлены в ориента-
Формула 7 с-υ-τ-γ-τ-κ-[υν]-и-[хм]-ν-и
Формула 8 Ν-Ι-Υ-Ρ- [3Υ] -ϋ- [35] -Υ-Τ-Ν-Υ-Ν-ϋ-Κ-Ε’-Κ- [ϋΘ]
Формула 9 Ь-[НС]-С-Ь-Ь-Р-[ϋΥ)-Υ
Формула 10 Κ-Α-3-Ο-Ν-ν-[РЗС]-Τ-Ν-ν-Α
Формула 11 3-Α-3-Υ-Β-Υ-3
Формула 12 Ο-Ο-Υ-Ν-5-У-Р-Ъ-Т
Очевидно, что пептиды, содержащие аминокислотную последовательность или состоящие из аминокислотной последовательности, соответствующей одной или нескольких вышеуказанных консенсусных последовательностей и формул, будут иметь биологическую активность, эквивалентную биологической активности пептидов, протестированных ίη νΐνο, как описано в примерах 6 и 7, и могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением.
Последовательности гипервариабельных областей, идентифицированные в примерах 1 и 5, были также использованы для идентификации известных последовательностей гипервариабельных областей, которые имеют высокий уровень идентичности с последовательностями, идентифицированными авторами настоящего изобретения, и обладают соответствующими связывающими свойствами (см. пример 8 и фиг. 12А-12Е). Известные последовательности гипервариабельных областей сравнивали с последовательностями гипервариабельных областей, идентифицированных в примерах 1 и 5, для проведения дополнительного анализа остатков гипервариабельных областей, играющих важную роль в перекрестном связывании с анти-ТСК.-Ув-антителом (т.е., в мультиспецифической реактивности с ОР1-якорьсодержащим эпитопом, описанным в настоящей заявке). С помощью анализа аналогичного типа были идентифицированы дополнительные серии консенсусных последовательностей и формул (см. фиг. 12А12Е).
В соответствии с этим пептиды согласно изобретению могут содержать нижеследующие последовательности или состоять из этих последовательностей, где х означает любой аминокислотный остаток, означает пептидную связь, а указанные пептиды представлены в ориентации от Ν-конца к С-концу:
Консенсусная С-Υ-Τ-Γ-Τ-χ-χ-χ-χ-χ-Κ (ΕΕζ> Ю последовательность 6
Консенсусная последовательность 7
Консенсусная последовательность 8
N0:167)
С-Υ-Χ-Γ-Χ-Χ-ϊ-Χ-Μ-Χ-Ν (БЕС 10
N0:168)
Х-Ι-χ-χ-χ-χ-χ-χ-χ-χ-Υ-χ-χ-χ-Ε-Κ-χ (БЕО Ю N0:169)
- 7 015629
Пептиды согласно изобретению могут содержать аминокислотную последовательность или состоять из аминокислотной последовательности, соответствующей одной из нижеследующих общих формул, где в каждом из положений, представленных в скобках, выбрана одна из наиболее подходящих аминокислот, - означает пептидную связь, а указанные пептиды представлены в ориентации от Νконца к С-концу:
Формула
С-Υ-Τ-Ε-Τ-[КЯУЗТРЕС]-[ΝУК]-[ИОДУ]- [ΙΜν]-[КСЙН]-и
Формула
С-Υ- [АТЗ]-Е- [Т/3] - [5ГХЗ] -У- [ΝΗν) -Μ- [ΡΟΗΝ] -И
Формула [ЯИЕАУ]-I- [ΥΝΡ]-[РТ]-[8УС]-[РТСУ]-[ЗСР]-[ΥΕΞ5] [ТР]-[ЯТУСЗ]-Υ-[ΝΑΙ]-[ΟΡΕ]-[КР]-Г-К-[РСИ]
Формула [УИКЯЬК]-I-[ΡΝ]-Ρ-[ΥΑΕΕ3]-[ΝΥ5]-[СР]-[РЗС]-ТФормула [ΚΕ3ΚΝ]-У-[3ΑΝ]-[ОЗЕР]-К-Е-[КОТ]-С [КК]-А-3-[03]-[Ν3ΡΤ]-[VI]-(РС5В]-[Τ5ΥΝΚ]-[ΝΑΡΥ][УУСЬ]-[АЬР]
Формула [КК] -А-5- [ок 1 - [РЗС] - [IV] - [3Ν] - [Ν3Θ] - [УН] -Ь- [ЯНА]
Формула
Формула
Формула [ΥΧ,ϋΤΚ] -Т-8-[ΚΝΚν]-1>-[НАС] - [ЗР]
0-0- [УСИК] - [Ν5Α6] -5- [УЗРИ] -Р- [ЬРУ!] -Т
0-0-[ΕΝ5ΤΥ]-Ν-[ТЕЗ]-[ГРИУ]-Р-[ТУКЕ]-[ГТ]
Формула
Пептиды согласно изобретению могут содержать аминокислотную последовательность или состоять из аминокислотной последовательности, соответствующей одной из нижеследующих общих формул, где в каждом из положений, представленных в скобках, выбрана одна из наиболее подходящих аминокислот, - означает пептидную связь, а указанные пептиды представлены в ориентации от Νконца к С-концу:
Формула 23 С-У-Т-Г-Т-[ΚΝ5]-Υ-Н-[ΙΜ]-Ν-Η
Формула 24 С-У-Т-Г-Т-З-У-И-М-Н-й
Формула 25 Ν-Ι-Υ-Ρ-5-Ρ-3-Υ-Τ-Ν-Υ-Ν-β-Κ-Γ-Κ-6
Формула 26 [УИ]-Ι-Ν-Ρ-Υ-Ν-Θ-Ρ-Τ-[ЕЗ]-Υ-Ν-0-Κ-Ρ-Κ-6
Формула 27 Κ-Α-3-0-Κ-ν-3-Τ-Ν-ν-Α
Формула 2Θ К-А-3-0-3-1-8-Ы-У-Ь-[ΝΑ]
Формула 29 3-Α-5-Υ-Κ-Υ-3
Формула 30 Υ-Τ-Ξ-Η-1-Α-3
Формула 31 Ο-Ο-Υ-Ν-8-У-Р-Ь-Т
Формула 32 Ο-Ο-Ν-Μ-Ε-Ρ-Ρ-[УК)-Т
Пептиды согласно изобретению могут содержать аминокислотную последовательность или состоять из аминокислотной последовательности, соответствующей одной из нижеследующих общих формул, где в каждом из положений, представленных в скобках, выбрана одна из наиболее важных аминокислот, х означает любой аминокислотный остаток, означает пептидную связь, и где указанные пептиды представлены в ориентации от Ν-конца к С-концу:
- 8 015629
Формула 33
Формула 34
Формула 35 (ЕУИ5Ь]-1~ [ΥΞΝϋ] -[РЗН] - [56ΝΥ] - [СЗНЮ] - [ЗСЦ] ~ [ΥΤ03]- [ΤΙΑ] - [ΝΥ] - [ΥΝ] - [ΝΑΡ] - [0ΌΞΕΡ] - [КЗЬ] [ГУК]-[КОЗ]-[СК]
Е-Ι-[Υ3Ν]-[Ρ5]-[8ΟΝ]-[СЗ]-[8С]-[ТСЗ]-Т-[ΝΥ] Υ- [ΝΑΡ] - [СОЗ] - [КЗ] - [ГУК] - [КО] - [СК] χ-Ι-χ-Ρ-3-Ο-Θ-χ-Τ-Υ-χ-Α-ϋ-[КЗ]- [ГУ]-К-С
Очевидно, что пептиды, содержащие аминокислотную последовательность или состоящие из аминокислотной последовательности, соответствующей одной или нескольким вышеуказанным консенсусным последовательностям и формулам, будут также иметь биологическую активность, эквивалентную биологической активности пептидов, протестированных ίη νίνο, как описано в примерах 6 и 7, и могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением.
Как указано в настоящем описании, пептиды согласно изобретению могут быть связаны друг с другом с образованием димеров или мультимеров. Так, например, настоящее изобретение также относится к димерам или мультимерам пептидов, содержащим аминокислотные последовательности или состоящим из аминокислотных последовательностей, соответствующих одной или нескольких из вышеуказанных консенсусных последовательностей и формул. Так, например, настоящее изобретение относится к гете родимерам, состоящим из двух пептидов, которые включают аминокислотные последовательности, соответствующие двум различным описанным здесь консенсусным последовательностям или формулам. Так, например, настоящее изобретение относится к гомодимерам, состоящим из двух пептидов, которые включают аминокислотные последовательности, соответствующие одинаковым консенсусным последовательностям или формулам.
Настоящее изобретение также относится к пептидам, которые содержат аминокислотную последовательность или состоят из аминокислотной последовательности, соответствующей описанной здесь консенсусной последовательности или формуле, и которые имеют степень идентичности с любой одной из 81Т) ГО ΝΝ:6, 8, 10, 12, 14, 16, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 54, 56, 58, 60, 62, 5 64, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 86, 88, 90, 92, 94 и 96, составляющую более чем 25%. Предпочтительно, такие пептиды имеют степень идентичности с любой одной из 8ЕО ГО ΝΝ:6, 8, 10, 12, 14, 16, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 38, 40, 42,44, 46, 48, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 86, 88, 90, 92, 94 и 96, составляющую более, чем 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 или 99%, соответственно.
Пептидами согласно изобретению также являются пептиды, которые содержат аминокислотную последовательность или состоят из аминокислотной последовательности, соответствующей одной из вышеуказанных консенсусных последовательностей, и которые в одном или нескольких различных положениях (то есть, положениях х, которые не являются полностью консервативными) включают любую одну из аминокислот, присутствующих в данном положении в соответствующей указанной здесь формуле (то есть, в формуле, соответствующей той же самой СЭР).
Так, например, консенсусными последовательностями и общей формулой, идентифицированными здесь исходя из клонированных последовательностей ί.ΌΕ-Η2 (см. пример 5), являются:
Консенсусная χ-1-χ-χ-χ-χ-χ-χ-χ-χ-Υ-χ-χ-χ-Γ-Κ-χ последовательность 2
Формула 2 [ΝΗΥ]-I-[ΥΝϋ]-[РТ]-[3Υ]-[ϋΝΤ]-[ЗС][ΥΟΕ] - [ТР] - [ΝΚΤ] -Υ- [Ν3Α] - [ζ)ϋ] - [Κϋ]Е-К-[ОС]
Таким образом, пептиды согласно изобретению включают комбинации этих последовательностей; так, например, такие пептиды включают нижеследующие последовательности или состоят из этих последовательностей:
- 9 015629
Комбинация 1 [ЫКУ]-Ι-χ-χ-χ-χ-χ-χ-χ-χ-Υ-χ-χ-χ-Ρ-Κ-χ
Комбинация 2 х-1-[ΪΝϋ]-χ-χ-χ-χ-χ-χ-χ-Υ-х-х-х-Г-К-х
Комбинация 3 χ-1-χ-[РТ]-χ-χ-χ-χ-χ-χ-Υ-χ-χ-χ-Γ-Κ-χ
Комбинация 4 χ-1-χ-χ-[3Υ]-χ-χ-χ-χ-χ-Υ-χ-χ-χ-Γ-Κ-χ
Комбинация 5 χ-Ι-χ-χ-χ-[ΌΝΤ]-χ-χ-χ-χ-Υ-χ-χ-χ-Γ-Κ-χ
Комбинация 6 χ-Ι-χ-χ-χ-χ-[8Ε]-χ-χ-χ-Υ-χ-χ-χ-Γ-Κ-χ
Комбинация 7 χ-Ι-χ-χ-χ-χ-χ-[ΥϋΕ]-χ-χ-Υ-χ-χ-χ-Γ-Κ-χ
Комбинация 8 χ-Ι-χ-χ-χ-χ-χ-χ-[ΤΡ]-χ-Υ-χ-χ-χ-Γ-Κ-χ
Комбинация 9 χ-Ι-χ-χ-χ-χ-χ-χ-χ-[ΝΚΤ]-Ύ-.-χ-χ-Ε-Κ-ζ
Комбинация 10 χ-Ι-χ-χ-χ-χ-χ-χ-χ-χ-Υ-[Ν5Α]-χ-χ-Ρ-Κ-χ
Комбинация 11 χ-Ι-χ-χ-χ-χ-χ-χ-χ-χ-Υ-χ-[Οϋ]-χ-Γ-Κ-χ
Комбинация 12 χ-Ι-χ-χ-χ-χ-χ-χ-χ-χ-Υ-χ-χ-[КО]-Γ-Κ-Χ
Пептиды согласно изобретению также включают более сложные комбинации описанных здесь консенсусных последовательностей и формул. Таким образом, настоящее изобретение также относится к пептидам, которые содержат нижеследующие последовательности или состоят из указанных последовательностей, например:
Комбинация 14
Комбинация 15
Комбинация 16
Комбинация 17
Комбинация 18
Комбинация 19
Комбинация 20
Комбинация 21
Комбинация 22
Комбинация 23
Комбинация 24
Комбинация 25
В нижеприведенных примерах 8 и 9 описан анализ известных последовательностей гипервариабельной области, обладающих соответствующей специфичностью связывания. Этот анализ был разработан на основе последовательностей вариабельной области тяжелой и легкой цепей, имеющихся в общедоступных базах данных. В частности, в некоторых вариантах изобретения, одна или несколько последовательностей, депонированных под регистрационными номерами 1921302А, 1921302В, А39276, В39276, ААА20444.1, ААВ46764.1, ААВ58061.1, ААЭ00607.1, АА630429.1, ААЬ59364.1, ААЬ59378.1, ААЬ59371.1, ААЬ67510.1, АА801841.1, ААК.91005.1, ААТ76280.1, САА56180.1, САА63586.1, САВ45251.1,
САС22102.1, САС22102.1, Р30502, 630502, РС4280, РС4283, РС4281, РС4282, 867941, 867940, 869897 и 869898 не входят в объем настоящего изобретения.
Первый аспект настоящего изобретения также включает в себя лиганды, которые и функционально эквивалентные пептиды, точно идентифицированные в настоящей заявке. Функционально эквивалентААА20447.1,
ААВ46760.1,
ААВ58062.1,
ААЕ72083.1,
АА630434.1,
ААЬ59381.1,
ААЬ59368.1,
ААЬ59374.1,
ААЬ67511.1,
ААК90999.1,
ААК91007.1,
ААТ76246.1,
САА52930.1,
САА63587.1,
САВ45252.1,
ААВ32203.1,
ААВ46765.1,
ААС53642.1,
ААЕ72082.1,
АА630430.1,
ААЬ59365.1,
ААЬ59377.1,
ААЬ59372.1,
ААР19642.1,
ААК.91002.1,
АА801847.1,
ААТ76281.1, В30502, С30502, САА46142.1,
САА56181.1,
САА63589.1,
САВ45253.1,
ААВ32202.1,
ААВ46761.1, ААС53642.1, АА630427.1, АА630435.1, ААЬ59380.1, ААЬ59369.1, ААЬ59373.1, ААР19641.1, АА801843.1, ААТ68292.1,
ААВ46758.1,
ААВ46766.1,
ААЭ00604.1, АА630432.1, АА633839.1, ААЬ59366.1, ААЬ59376.1, ААЬ67507.1, ААВ90997.1, ААК.91003.1, ААТ76236.1,
САА52931.1,
САА63590.1,
САВ46481.1,
САА56178.1,
САА84376.1,
САВ46447.1,
ААВ46763.1,
ААВ46762.1,
ААЭ00605.1,
АА630428.1,
АА640815.1,
ААЬ59379.1,
ААЬ59370.1,
ААЬ67508.1,
АА801840.1,
АА801844.1,
ААТ76271.1,
САА51998.1,
САА52932.1,
САА84375.1,
САВ46482.1,
ААВ46759.1, ААВ46767.1, ААЭ00606.1, АА630433.1, ААК11244.1, ААЬ59367.1, ААЬ59375.1, ААЬ67509.1, ААВ90998.1, ААК.91004.1, ААТ76245.1, САА52929.1, САА56179.1, САВ45250.1, САВ46448.1,
- 10 015629 ными лигандами могут быть структуры, которые являются биологическими производными или которые могут быть синтезированы или выбраны из библиотек (таких как рандомизированные или комбинаторные библиотеки химических соединений), и которые могут обладать такими же функциями или связываться с такими же структурами-мишенями, как и аутоантитело или его репрезентативные моноклональные антитела и их производные. Так, например, такие соединения могут иметь значительную структурную гомологию с пептидными последовательностями, точно идентифицированными в ЗЕО ΙΌ ΝΝ:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 25, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 и 96. Эти соединения могут быть идентифицированы такими методами, как метод потокового прогона (см., например, 1опех. Ό. Т. (1997). Ргодгехх ίη рто1еш 81гис1иге ртебкйоп. Сшт. Ορίη. З1тис1. Бю1. 7(3), 377-387). Указанные соединения могут быть также идентифицированы методами скрининга с использованием реагирующих с пептидами антител или их функционально эквивалентных лигандов в соответствии с первым аспектом изобретения.
При этом считается, что любая каркасная молекула, способная сохранять аминокислотные боковые цепи этих пептидов в положениях, необходимых для связывания с антигеном, является подходящей для использования в соответствии с настоящим изобретением. В этом отношении, наиболее подходящими могут быть циклические пептиды, структура которых полностью сохраняется благодаря их линкерным группам и связям. Боковые цепи аминокислот могут присутствовать в положении, по существу, идентичном их положению в пептидах дикого типа. Указанные циклические пептиды предпочтительно содержат от 5 до 30 аминокислот, а более предпочтительно от 7 до 20 аминокислот.
Биологически активные пептиды с антигенсвязывающими сайтами, имитирующими сайты согласно изобретению, могут быть получены с использованием фаговых библиотек. Нуклеиновые кислоты, кодирующие аминокислотные остатки, идентифицированные как остатки, находящиеся в антигенном сайте, и нуклеиновая кислота, кодирующая окружающие каркасные остатки, могут быть присоединены друг к другу с получением молекулы, кодирующей полипептидную цепь, состоящую из 10-1000 остатков, а предпочтительно из 25-100 остатков. Гибридная молекула, полученная путем присоединения этого фрагмента нуклеиновой кислоты к фрагменту, кодирующему фаговый белок, например ρΙΙΙ бактериофага ίά, может быть представлена на поверхности фага. Скрининг фаговой библиотеки с использованием антигена позволяет идентифицировать представляющие интерес клоны. Эти клоны могут быть затем подвергнуты повторным раундам мутагенеза и скрининга в целях повышения аффинности полученных молекул по отношению к антигену.
Помимо пептидных соединений, функционально эквивалентными пептидами, точно идентифицированными в настоящей заявке, могут быть синтетические или органические молекулы. За последние годы наблюдается значительный прогресс в области комбинаторной химии и создания комбинаторных библиотек, что облегчает рациональное конструирование и получение молекул с нужными свойствами. Эти методы могут быть использованы для генерирования молекул, имеющий сайты связывания, которые идентичны или аналогичны сайтам связывания идентифицированных здесь пептидов.
Такие соединения могут быть получены посредством рационального конструирования, например, стандартными методами синтеза в комбинации с методами молекулярного моделирования и с использованием программ компьютерной визуализации. В этих методах ключевое соединение со структурой, аналогичной структуре основного пептида, оптимизируют путем объединения различных каркасных структур и соединений-компонентов.
Альтернативно или в качестве одной стадии структурного конструирования молекулярной частицы для построения или уточнения структуры соединений, которые имитируют антигенный сайт указанных пептидов, может быть использован комбинаторный химический синтез, осуществляемый путем создания однородных комбинаторных массивов на каркасной основе. Такие стадии могут включать стандартный синтез пептида или органической молекулы в комбинации с методами твердофазного разделения и рекомбинации или параллельный комбинированный синтез в сочетании с твердофазным методом разделения или методами разделения в жидкой фазе (см., например, Нодап, 1997 и цитируемые там публикации).
Пептидсодержащие антитела
В соответствии с другим вариантом своего первого аспекта, настоящее изобретение относится к антителу, содержащему вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, представленной в ЗЕО ΙΌ ΝΝ:2, 18, 34, 50, 66 или 82. Настоящее изобретение также относится к антителу, содержащему вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью, представленной в ЗЕО ΙΌ ΝΝ:4, 20, 36, 52, 68 или 84.
Таким образом, настоящее изобретение относится к антителу, содержащему вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, представленной в ЗЕО ΙΌ ΝΟ:2, и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью, представленной в ЗЕО ΙΌ ΝΟ:4. Настоящее изобретение также относится к антителу, содержащему вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, представленной в ЗЕО ΙΌ ΝΟ:18, и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью, представленной в ЗЕО ΙΌ ΝΟ:20. Настоящее изобретение также относится к антителу, содержащему вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, представленной в ЗЕО ΙΌ ΝΟ:34, и вариабельную область легкой цепи с аминокис
- 11 015629 лотной последовательностью, представленной в 8ЕЦ ΙΌ N0:36, Настоящее изобретение также относится к антителу, содержащему вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, представленной в 8ЕЦ ΙΌ N0:52, и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью, представленной в 8ЕЦ ΙΌ N0:54. Настоящее изобретение также относится к антителу, содержащему вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, представленной в 8ЕЦ ΙΌ N0:66, и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью, представленной в 8ЕЦ ΙΌ N0:68. Настоящее изобретение также относится к антителу, содержащему вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, представленной в 8ЕЦ Ш N0:82, и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью, представленной в 8ЕЦ ΙΌ N0:84.
Настоящее изобретение также относится к антителу, содержащему 1, 2, 3, 4, 5 или 6 последовательностей СОК, представленных в 8ЕЦ ΙΌ N№6, 8, 10, 12, 14 и 16. Настоящее изобретение также относится к антителу, содержащему 1, 2, 3, 4, 5 или 6 последовательностей СОК, представленных в 8ЕЦ ΙΌ N№22, 24, 26, 28, 30 и 32. Настоящее изобретение также относится к антителу, содержащему 1, 2, 3, 4, 5 или 6 последовательностей СОК, представленных в 8ЕЦ ΙΌ N0:38, 40, 42, 44, 46 и 48. Настоящее изобретение также относится к антителу, содержащему 1, 2, 3, 4, 5 или 6 последовательностей СОК, представленных в 8ЕЦ ΙΌ N№54, 56, 58, 60, 62 и 64. Настоящее изобретение также относится к антителу, содержащему 1, 2, 3, 4, 5 или 6 последовательностей СОК, представленных в 8ЕЦ ΙΌ N№70, 72, 74, 76, 78 и 80. Настоящее изобретение также относится к антителу, содержащему 1, 2, 3, 4, 5 или 6 последовательностей СОК, представленных в 8ЕЦ ΙΌ N№86, 88, 90, 92, 94 и 96.
Настоящее изобретение также относится к антителу, содержащему последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая более чем на 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, представленной в 8ЕЦ ΙΌ N№2, 18, 34, 50, 66 или 82. Настоящее изобретение также относится к антителу, содержащему последовательность вариабельной области легкой цепи, которая более чем на 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, представленной в 8ЕЦ ΙΌ N№4, 20, 36, 52, 68 или 84.
Настоящее изобретение также относится к антителам, содержащим 1, 2, 3, 4, 5 или 6 СОК, последовательности которых более, чем на 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 или 99% идентичны аминокислотной последовательности, представленной в 8ЕЦ ΙΌ N№6, 8, 10, 12, 14, 16, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 86, 88, 90, 92, 94 и 96.
Настоящее изобретение также относится к антителу, содержащему 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислотных последовательностей, которые соответствуют описанным здесь консенсусным последовательностям и формулам.
Настоящее изобретение также относится к фрагментам этих антител, таким как ЕаЬ-, Е(аЬ')2-, Εν- и 5еЕу-фрагменты. упомянутые в настоящем описании.
Пептиднейтрализующие антитела
В соответствии с другим вариантом своего первого аспекта настоящее изобретение относится к антителу или в функционально эквивалентному лиганду, которые реагируют с пептидом согласно первому аспекту изобретения. Такие антитела или функционально эквивалентные лиганды могут быть использованы для лечения и диагностики заболевания, а в частности, они могут оказывать терапевтическое действие посредством пассивного переноса.
Если предпочтительными являются поликлональные антитела, то выбранное млекопитающее, такое как мышь, кролик, коза или лошадь, может быть иммунизовано пептидом согласно первому аспекту изобретения. Пептид, используемый для иммунизации животного, может быть получен методами рекомбинантных ДНК, либо он может быть синтезирован методом химического синтеза. Если это необходимо, то данный пептид может быть конъюгирован с белком-носителем. Обычно используемыми носителями, к которым могут быть химически присоединены данные пептиды, являются альбумин бычьей сыворотки, тироглобулин и гемоцианин лимфы улитки. Такой связанный пептид может быть затем использован для иммунизации животного. Сыворотку, взятую у иммунизованного животного, собирают и обрабатывают известными методами, например, иммуноаффинной хроматографией.
Моноклональные антитела против пептидов согласно первому аспекту изобретения могут быть также легко получены специалистом в данной области. Общая методика получения моноклональных антител с использованием гибридомной технологии хорошо известна специалистам (см. например, Ко111ег С. & М1к!еш, С. №11иге 256:495-497 (1975); КохЬог е! а1., Ипишпо^ду Тобау 4:72(1983); Со1е е! а1., 7796, Мопос1опа1 АиЕЬоШек апб Сапсег ТЕегару, А1ап К. Ыкк, Ιηο. (1985).
Панели моноклональных антител, продуцированных против пептидов согласно первому аспекту изобретения, могут быть скринированы на различные свойства, то есть на изотип, эпитоп, аффинность и т.п. Моноклональные антитела являются особенно подходящими для очистки отдельных пептидов, против которых они направлены. Альтернативно, гены, кодирующие представляющие интерес моноклональные антитела, могут быть выделены из гибридом, например методами ПЦР, известными специалистам, а также они могут быть клонированы и экспрессированы в соответствующих векторах.
Могут быть также использованы и химерные антитела, в которых нечеловеческие вариабельные
- 12 015629 области были объединены или лигированы с человеческими константными областями (см. например, Ьш е1 а1., Егос. Ναίΐ. Асаб. 8οΐ. И8А, 84, 3439 (1987)).
Эти антитела могут быть модифицированы так, чтобы они были менее иммуногенными для индивидуума, например, путем их гуманизации (см., 1опек еί а1., №11иге. 321, 522 (1986); VеΛοеуеη еί а1., 8с1епсе, 239, 1534 (1988); КаЬа1 еί а1., 1. Iттиηο1., 147, 1709 (1991); Оиееп еί а1., Ργόο. Ναίΐ. Асаб. 8ск, И8А, 86, 10029 (1989); Согтап е1 а1., Ггос. Асаб. 8ск, И8А, 88, 34181 (1991) апб Нобдкоп е1 а1., В1о/Тесйпо1оду, 9,421 (1991)). Используемый здесь термин гуманизованное антитело означает молекулы антитела, в которых аминокислоты СИВ и другие выбранные аминокислоты в вариабельных доменах тяжелой и/или легкой цепей нечеловеческого донорного антитела были заменены эквивалентными аминокислотами человеческого антитела. Таким образом, гуманизованное антитело имеет близкое сходство с человеческим антителом, но при этом оно обладает способностью связываться с донорным антителом.
В другом альтернативном варианте изобретения таким антителом может быть биспецифическое антитело, то есть антитело, имеющее два различных антигенсвязывающих домена, каждый из которых обладает специфичностью к различным эпитопам.
Для отбора генов, кодирующих антитела, обладающие способностью связываться с пептидами согласно изобретению, из набора ПЦР-амплифицированных ν-генов лимфоцитов человека, скринированных на способность вырабатывать соответствующие антитела, или из библиотеки необученных лимфоцитов, может быть использована техника фагового представления (МсСайейу ί. еί а1. (1990), №11иге 348, 552-554; Магкк 1. еί а1., (1992) Вю1ес11по1оду 10, 779-783). Аффинность этих антител может быть также повышена путем перестановки цепей (С1асккоп Т. еί а1. (1991) №1иге 352, 624-628).
Антитела, генерированные вышеописанными методами, независимо от того, являются ли они поликлональными или моноклональными, обладают и другими ценными свойствами, а поэтому они могут быть использованы в качестве реагентов в иммуноанализах, радиоиммуноанализах (РИА) или твердофазных иммуноферментных анализах (ЕЫ8А). Для использования в этих целях такие антитела могут быть помечены аналитически детектируемым реагентом, таким как радиоизотоп, флуоресцентная молекула или фермент.
Молекулы нуклеиновой кислоты
В соответствии со вторым своим аспектом настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, антитело или функционально эквивалентный лиганд согласно одному из вышеописанных вариантов изобретения. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая такие пептиды, может быть идентична кодирующей последовательности молекул нуклеиновой кислоты, представленных в одной из 8ЕО ΙΌ ΝΝ: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 или 95. Эти молекулы могут также иметь различные последовательности, которые, в результате вырожденности генетического кода, кодируют пептид, представленный в 8ЕО ГО ΝΝ:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 или 96, соответственно. Предпочтительно, очищенная молекула нуклеиновой кислоты имеет последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в одной из 8ЕО ГО ΝΝ:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 или 95, или представляет собой избыточный эквивалент или фрагмент любой из этих последовательностей.
Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут присутствовать в форме РНК, такой как мРНК, или в форме ДНК, включая, например, кДНК, синтетическую ДНК или геномную ДНК. Такие молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены методами клонирования, химического синтеза или их комбинацией. Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены, например, методом химического синтеза, например, путем твердофазного фосфорамидитного химического синтеза, путем выделения из геномных или кДНК-библиотек, или путем выделения из соответствующего организма. РНКмолекулы могут быть, в основном, генерированы путем ш уйго- или ш ν^νο-транскрипции ДНКпоследовательностей. Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть двухцепочечными или одноцепочечными. Одноцепочечной ДНК может быть кодирующая цепь, также известная как смысловая цепь, либо некодирующая цепь, также называемая антисмысловой цепью.
Термин молекула нуклеиновой кислоты также включает в себя аналоги ДНК и РНК, такие как аналоги, содержащие модифицированные остовы и связанные с пептидом нуклеиновые кислоты (ΡNА). Используемый здесь термин ΡNА означает антисмысловую молекулу или антиген, который содержит олигонуклеотид, состоящий по меньшей мере из пяти нуклеотидов и присоединенный к пептидному остову, состоящему из аминокислотных остатков, которые предпочтительно заканчиваются лизином. Этот концевой лизин сообщает данной композиции растворимость. ΡNА могут быть ПЭГилированы для продления их времени жизни в клетке, где они предпочтительно, связываются с комплементарной одноцепочечной ДНК и РНК и прекращают элонгацию транскрипта (№е1кеп Ρ.Ε. еί а1. (1993) Апбсапсег Игид Пек. 8:53-63).
Молекулами нуклеиновой кислоты могут быть, но не ограничиваются ими, последовательность, кодирующая только зрелый пептид; последовательность, кодирующая зрелый пептид или само антитело;
- 13 015629 последовательность, кодирующая зрелый пептид или антитело и дополнительные кодирующие последовательности, такие как последовательности, кодирующие лидерную или секреторную последовательность, такую как про-, пре- или препропептидную последовательность полипептида; последовательность, кодирующая зрелый пептид или антитело вместе с вышеупомянутыми дополнительными кодирующими последовательностями или без них, либо вместе с другими дополнительными некодирующими последовательностями, включая некодирующие 5'- и 3'-последовательности, такие как транскрибируемые нетранслируемые последовательности, которые играют определенную роль в транскрипции (включая сигналы терминации), в связывании с рибосомой и в обеспечении стабильности мРНК. Молекулами нуклеиновой кислоты могут быть также вспомогательные последовательности, кодирующие дополнительные аминокислоты, такие как аминокислоты, обладающие дополнительными функциональными свойствами.
В объем настоящего изобретения входят варианты молекул нуклеиновых кислот, кодирующие описанные выше варианты пептидов. Среди рассматриваемых вариантов имеются варианты, которые отличаются от точно идентифицированных здесь молекул нуклеиновой кислоты тем, что они имеют нуклеотидные замены, делеции или инсерции. Такие замены, делеции или инсерции могут быть сделаны в одном или нескольких нуклеотидах. Указанные варианты могут быть модифицированы в кодирующей или в некодирующей области или в той и другой области. Альтерации в кодирующих областях могут приводить к консервативным или неконсервативным аминокислотным заменам, делециям или инсерциям.
Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть также сконструированы методами, в основном, известными специалистам, включая, в зависимости от целей применения, модификацию клонирования, процессинг и/или экспрессию генного продукта (полипептида). Реаранжировка ДНК путем рандомизированной фрагментации и повторной сборки генных фрагментов и синтетических олигонуклеотидов с помощью ПЦР представляет собой технологию, которая может быть использована для конструирования нуклеотидных последовательностей. Сайт-направленный мутагенез может быть использован для введения новых рестрикционных сайтов, изменения характера гликозилирования, изменения предпочтительности кодонов, продуцирования вариантов сплайсинга, введения мутаций и т.п.
Предпочтительными вариантами этого аспекта согласно изобретению являются молекулы нуклеиновой кислоты, которые по всей своей длине по меньшей мере на 25% идентичны молекуле нуклеиновой кислоты, представленной в одной из 8ЕО ΙΌ ΝΝ:1,3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 или 95. Предпочтительно молекула нуклеиновой кислоты согласно этому аспекту изобретения содержит область, которая по всей своей длине по меньшей мере на 30%, а более предпочтительно по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98, 99% или более идентична молекуле нуклеиновой кислоты, имеющей одну из этих последовательностей.
В соответствии со своим третьим аспектом настоящее изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях высокой жесткости с молекулой нуклеиновой кислоты согласно второму аспекту изобретения. Такие молекулы, которые частично или полностью комплементарны молекулам нуклеиновой кислоты согласно второму аспекту изобретения, могут быть использованы для получения антисмысловых последовательностей или для зондирования. В соответствии с методами, известными среднему специалисту в данной области, могут быть сконструированы такие антисмысловые молекулы, например олигонуклеотиды, которые распознают нужную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид согласно изобретению, специфически связываются с этой нуклеиновой кислотой и, тем самым, предотвращают ее транскрипцию (см. например, СоНеи 1.8., Тгеибк ίη РНагт. 8ск, 10, 435 (1989), Окаио, 1. №игоскет. 56, 560 (1991); О'Сопиог, 1. №игос11ет 56, 560 (1991); Ьее е1 а1., ΝιιοΚίο Λοίάκ Кек 6, 3073 (1979); Сооиеу е1 а1., 8е1еиее 241, 456 (1988); Оегуаи е1 а1., 8е1еиее 251, 1360 (1991)). Используемый здесь термин гибридизация означает присоединение двух молекул нуклеиновой кислоты друг к другу посредством водородных связей. Обычно одна молекула может быть фиксирована на твердом носителе, а другая молекула может находиться в растворе в свободном состоянии. Затем эти две молекулы могут быть подвергнуты контактированию друг с другом в условиях, благоприятствующих образованию водородной связи. Ингибирование гибридизации молекулы, полностью комплементарной молекуле-мишени, может быть проанализировано с использованием гибридизационного анализа, известного специалистам (см., например, 8атЬгоок е1 а1. [см. выше]). В высокой степени гомологичная молекула будет затем конкурировать с полностью гомологичной молекулой за связывание с молекулоймишенью и ингибировать это связывание в различных условиях жесткости, как описано у \МаН1 С.М. и 8.Ь. Вегдег (1987; МеОюбк ЕпхутоН 152:399-407) и К1тте1 А.К. (1987; МеШобк ЕпхутоН 152:507-511).
Термин жесткость означает условия реакции гибридизации, которые благоприятствуют связыванию молекул, обладающих высокой степенью сходства, но не способствуют связыванию отличающихся молекул. Условия гибридизации высокой жесткости определяют как условия инкубирования в течение ночи при 42°С в растворе, содержащем 50% формамид, 5х 88С (150 мМ №С1, 15 мМ тринатрийцитрат), 50 мМ фосфат натрия (рН 7,6), 5х раствор Денхардта, 10% сульфат декстрана и 20 мкг/мл денатуриро
- 14 015629 ванной фрагментированной ДНК спермы лосося, с последующей промывкой фильтров в 0,1 х 88С приблизительно при 65°С. Условия низкой жесткости предусматривают реакцию гибридизации, осуществляемую при 35°С (8атЬгоок е1 а1. [см.выше]). Предпочтительными условиями гибридизации являются условия гибридизации высокой жесткости.
Векторы
В своем четвертом аспекте настоящее изобретение относится к вектору, такому как экспрессионный вектор, который включает в себя молекулу нуклеиновой кислоты согласно второму и третьему аспектам изобретения. Векторы согласно изобретению включают молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению и могут представлять собой клонирующие или экспрессирующие векторы. Таким образом, пептиды согласно изобретению могут быть получены в рекомбинантной форме посредством экспрессии кодирующих эти пептиды молекул нуклеиновой кислоты в векторах, содержащихся в клетке-хозяине. Такие методы экспрессии хорошо известны специалистам, и многие их них подробно описаны в руководстве 8атЬтоок е1 а1. (см.выше) и Еегпапбех & НоеШет (1998, ебк. Оепе ехргеккюп кук1етк. Иктд паШге £ог (Не ай о£ ехргеккюп. Асабетю Ргекк, 8ап Б1едо, Ьопбоп, ВокЮп, №\ν Уогк, 8убпеу, Токуо, ТогопЮ).
Для продуцирования полипептида в нужном хозяине могут быть использованы, в основном, любые системы или любые векторы, подходящие для поддержания, амплификации или экспрессии молекул нуклеиновой кислоты. Подходящая нуклеотидная последовательность может быть встроена в экспрессионную систему любым из хорошо известных и рутинных методов, таких как методы, описанные у 8атЬгоок е1 а1. (см. выше). В общих чертах, кодирующий ген может быть помещен под контроль регуляторного элемента, такого как промотор, сайт связывания с рибосомой (для экспрессии в бактериях), и необязательно, оператор, так, чтобы ДНК-последовательность, кодирующая нужный полипептид, транскрибировалась в РНК в трансформированной клетке-хозяине.
Особенно подходящими экспрессионными системами являются микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные рекомбинантным бактериофагом, плазмидными или космидными ДНКэкспрессионными векторами; дрожжи, трансформированные векторами для экспрессии в дрожжах; клеточные системы насекомых, инфицированные вирусными экспрессионными векторами (например, бакуловирусом); клеточные системы растений, трансформированные вирусными экспрессионными векторами (например, вирусом мозаики цветной капусты, СаМУ; вирусом мозаики табака, ТМУ) или векторами для экспрессии в бактериях (например, плазмидами Т1 или рВЯ322); или клеточные системы животных. Для продуцирования пептидов согласно изобретению могут быть также использованы бесклеточные системы трансляции.
Введение молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих пептид согласно изобретению, в клеткихозяева может быть осуществлено методами, описанными во многих известных лабораторных руководствах, таких как руководство Эа^зк е1 а1., Вакю Мебюбк ш Мо1еси1аг Вю1оду (1986) и 8атЬтоок е1 а1. [см. выше]. В эукариотических клетках экспрессионные системы, в зависимости от целей их использования, могут быть либо временными (например, эписомными), либо перманентными (хромосомная интеграция).
Кодирующий вектор может включать последовательность, кодирующую регуляторную последовательность, такую как сигнальный пептид или лидерная последовательность, если это необходимо, например, для секреции транслируемого пептида в просвет эндоплазматического ретикулума, в периплазматическое пространство или во внеклеточное пространство. Эти сигналы могут быть эндогенными по отношению к пептиду, либо они могут быть гетерологичными. Лидерные последовательности могут быть удалены бактериальным хозяином при посттрансляционном процессинге.
Помимо регуляторных последовательностей может оказаться желательным введение регуляторных последовательностей, которые обеспечивают регуляцию экспрессии пептида в зависимости от роста клетки-хозяина. Регуляторными последовательностями являются нетранслируемые области вектора, такие как энхансеры, промоторы и 5'- и 3'-нетранслируемые области. Они взаимодействуют с клеточными белками хозяина, в результате чего осуществляется транскрипция и трансляция. Примерами регуляторных последовательностей являются последовательности, которые вызывают увеличение или снижение уровня экспрессии гена в ответ на химическую или физическую стимуляцию, включая присутствие регуляторного соединения, или в ответ на различные температурные или метаболические условия. Эти регуляторные последовательности и другие регуляторные последовательности, перед их встраиванием в вектор, могут быть лигированы с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты.
Альтернативно, такая кодирующая последовательность может быть клонирована непосредственно в экспрессионный вектор, который уже содержит регуляторные последовательности и соответствующий рестрикционный сайт.
Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть также использованы для создания трансгенных животных, а в частности грызунов. Такие трансгенные животные входят в дополнительный аспект настоящего изобретения. Такие животные могут быть получены путем локальной модификации соматических клеток, либо посредством терапии с использованием клеток зародышевой линии для введения наследуемых модификаций. Указанные трансгенные животные могут быть, в частности, использованы в целях создания животных-моделей для анализа на эффективность молекул лекарствен
- 15 015629 ного средства в качестве модуляторов пептидов согласно изобретению.
Клетки-хозяева
В своем пятом аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированной вектором согласно четвертому аспекту изобретения. Клетки-хозяева согласно изобретению, которые могут быть траснформированы, трансфецированы или трансдуцированы векторами согласно изобретению, могут быть прокариотическими или эукариотическими.
Для продолжительного, высокоэффективного продуцирования рекомбинантного пептида может оказаться предпочтительной стабильная экспрессия. Примеры клеточных млекопитающих, подходящих в качестве хозяев для экспрессии, хорошо известны специалистам, и такими клеточными линиями являются многие иммортализованные клеточные линии, имеющиеся в Американской коллекции типовых культур (АТСС), включая, но не ограничиваясь ими, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки НеЬа, клетки почек детенышей хомячка (ВНК), клетки почек обезьяны (СО8), клетки С127, клетки 3Т3, клетки ВНК, клетки НЕК 293, клетки меланомы Боуэса и клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Нер О2).
Другой предпочтительной системой является бакуловирусная система (коммерчески доступная система, поставляемая в наборе, йИег аба, от Iην^ί^οдеη, 8аη Э1едо СА). Эти методы, по существу, известны специалистам и подробно описаны в публикации 8ишшетк & 8шйй, Техак Адг1си11ига1 ЕхрепшеШ 81а1юг1 Вц11с1т № 1555 (1987). Клетками-хозяевами, особенно подходящими для использования в данной системе, являются клетки насекомых, такие как клетки Огокорййа 82 и клетки 8робор!ета 8£9.
Специалистам известно множество систем экспрессии генов в клеточных культурах растений и в целых растениях. Примерами подходящих систем экспрессии генов в клетках растений являются системы, описанные в патентах США 5693506, 5659122 и 5608143. Другие примеры экспрессии генов в клеточных культурах растений описаны в работе Ζеηк, РйуйсйешГбу 30, 3861-3863 (1991).
Примерами особенно предпочтительных бактериальных клеток-хозяев являются стрептококки, стафилококки, Е.со11, 81тер1ошусек и ВасШик киЫШк. Примерами клеток-хозяев, особенно подходящих для экспрессии в грибках, являются дрожжевые клетки (например, 8. сеге^'Ыае) и клетки АкретдШик.
Способы экспрессии
В соответствии со своим шестым аспектом настоящее изобретение относится к способу экспрессии пептида, антитела или эквивалентного лиганда согласно одному из вариантов первого аспекта изобретения, к способу, включающему экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспектам изобретения или вектора согласно четвертому аспекту изобретения в клетке-хозяине.
Лечение заболевания
В своем седьмом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания у пациента, включающему введение указанному пациенту пептида, антитела или эквивалентного лиганда согласно первому аспекту изобретения, молекулы нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспектам изобретения, вектора согласно четвертому аспекту изобретения, или клетки-хозяина согласно пятому аспекту изобретения. Этот аспект настоящего изобретения также относится к применению пептида, антитела или эквивалентного лиганда согласно первому аспекту изобретения, молекулы нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспектам изобретения, вектора согласно четвертому аспекту изобретения, или клетки-хозяина согласно пятому аспекту изобретения в целях терапии или диагностики заболевания.
Заболевания, которые поддаются лечению или диагностике указанным способом, характеризуются присутствием аутоантител, которые реагируют с эпитопом, содержащим ОР1-якорь, где указанные антитела также предпочтительно, реагирует с эпитопами анти-ТСЯ-νβ-антител, с молекулами, способными передавать сигнал, с фосфолипидами, включая фосфатидилинозит, фосфатидилсерин и кардиолипин (диацилглицерин), с фосфолипид-гликанами, с вторичными посредниками действия инсулина, с одноцепочечными и двухцепочечными ДНК и элементами пути СР1-заякоривания. Эти аутоантитела были идентифицированы авторами настоящего изобретения, которые считают, что присутствие таких антител в организме пациента ускоряет старение и связанное с ним развитие заболеваний, а также стимулирует развитие рака, опосредует манифестации наследственных или ненаследственных заболеваний и препятствует защитному действию лекарственных средств первого ряда, направленных против инфекционных патогенов. Таким образом, присутствие таких антител является общим признаком всех заболеваний, которые являются восприимчивыми к лечению или диагностике способами согласно изобретению. Многие из этих состояний подпадают под общие определения таких заболеваний, как инсулинзависимый сахарный диабет (ИЗСД), инсулиннезависимый сахарный диабет (ИНЗСД), орган-специфическое или органнеспецифическое аутоиммунное заболевание, сердечно-сосудистое заболевание, кахексия при раке и рак, либо любых других заболеваний, которые ассоциируются с присутствием антител против фосфолипидов и/или с гиперинсулинемией и/или с гиперглюкагонемией, и/или с интолерантностью к глюкозе и/или с инсулинорезистентностью. Некоторые из этих состояний описаны ниже; однако при этом следует отметить, что указанные заболевания приводятся лишь в целях иллюстрации, и их список не является исчерпывающим.
Заболеваниями, которые поддаются лечению или диагностике указанным способом, являются, но
- 16 015629 не ограничиваются ими, сахарный диабет типа Ι, сахарный диабет типа ΙΙ, псориаз, экзема, витилиго, черный акантоз, гнездная алопеция, болезнь Альцгеймера, шизофрения, депрессия, болезнь Паркинсона, мигрень, рассеянный склероз, тяжелая миастения, амиотрофический боковой склероз и другие поражения двигательных нейронов, прогрессирующий надъядерный паралич, болезнь Пика и другие нейродегенеративные заболевания, заболевания щитовидной железы, множественная эндокринная неоплазия типа 2А и В, синдром Кушинга, болезнь Адиссона, поликистоз яичника, гипогонадизм, преждевременное облысение у мужчин, ожирение, синдром X, привычная внутриутробная гибель плода, привычный самопроизвольный выкидыш, рецидивирующий тромбоз, системная красная волчанка, глютеновая болезнь, аутоиммунный гастрит, воспалительное заболевание кишечника, ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилит, астма, кистозный фиброз, остеопороз и остеопения, плоский лишай, лейкоплакия, апластическая анемия и другие анемии, ночная пароксизмальная гемоглобинурия, апноэ во сне, бессонница, рак, заболевания, вызываемые вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), инфекции и заболевания, вызываемые нарушением иммунорегуляции.
Эксперименты с участием человека показали, что пептиды согласно изобретению могут быть успешно использованы для повышения толерантности к перорально вводимой глюкозе (см. пример 6), и для ауторегуляции гликемии у пациентов с диабетом (см. пример 7). В соответствии с этим заболеваниями, которые поддаются лечению или диагностике согласно изобретению, являются, но не ограничиваются ими, заболевания, ассоциированные с чувствительностью к глюкозе (то есть заболевания, ассоциированные с неадекватным ответом в пероральном тесте на толерантность к глюкозе) и заболевания, ассоциированные с отсутствием или нарушением ауторегуляции уровней глюкозы в крови.
Подходящий способ лечения может включать использование описанных выше пептидов или функционально эквивалентных лигандов с аналогичной конфигурацией или трехмерной структурой, где механизм, лежащий в основе указанного способа лечения, может приводить к активному или пассивному удалению нежелательных аутоантител или к деструкции клеток-мишеней, продуцирующих аутоантитело. В соответствии с этим аспектом изобретения пептиды могут быть использованы отдельно или в комбинации с агентами, стимулирующими их эффективность, в виде одной, двух или нескольких цепей, содержащих или не содержащих линкерные элементы, и в комбинации с носителями. Один из способов лечения заключается в продуцировании нейтрализующих антител против указанных аутоантител, где такие генерированные антитела связываются с указанными аутоантителами и, тем самым, предотвращают распознавание их клеток-мишеней, молекул или комплексов аутоантителами, что приводит к удалению этих аутоантител или прекращению продуцирования этих аутоантител.
Альтернативно, нейтрализующие антитела или эквивалентные лиганды могут быть использованы для пассивного лечения и могут быть получены путем иммунизации животных, приводящей к продуцированию поликлональных антител или к образованию моноклональных антител, либо они могут быть получены посредством иммортализации человеческих В-клеток, генерирующих человеческие моноклональные антитела или посредством скрининга библиотек. Продуцирование таких антител и их эквивалентных лигандов описано выше.
Другие методы лечения могут быть основаны на принципах индуцирования толерантности, таких как клональная делеция, анергия, супрессия или прекращение генерирования клеток для предотвращения их образования и/или секреции с использованием пептидов согласно изобретению или минимальных реактивных элементов таких пептидов или пептиднейтрализующих антител, которые реагируют с аутоантителами по механизму, приводящему к генерированию клеток-супрессоров, вето-клеток, клональной делеции, клональной анергии, или других механизмов, приводящих к предотвращению, образованию или высвобождению релевантных аутоантител. Эти способы могут включать использование пептидов согласно изобретению, распознаваемых этими аутоантителами, и их фрагментов, которые представляют эти аутоантитела и их последовательности. Связывание аутоантител с их мишенями может быть предотвращено конкурентыми или не-конкурентными ингибиторами, включая пептиды согласно изобретению. Кроме того, для селективного удаления релевантных аутоантител методом плазмафереза, молекулымишени или минимальные реактивные элементы таких молекул могут быть связаны с матрицей.
Связывание аутоантител с их мишенями может быть также предотвращено конкурентными или неконкурентными ингибиторами, сконструированными в целях предотвращения связывания пептидов согласно изобретению или их эквивалентных лигандов с соответствующими сайтами на клетках или молекулах.
Пептиды или их РНК- и кДНК-производные или варианты, сохраняющие свою активность, или другие последовательности, продукты которых действуют по аналогичному механизму, описанному выше, могут быть использованы в описанных выше целях, и могут быть упакованы в подходящие векторы, используемые в качестве вакцин.
Заболевания, которые поддаются лечению и диагностике способами настоящего изобретения, подробно описаны ниже.
Сахарный диабет типа I и II
Диабет типа Ι в высокой степени ассоциирован с генетически наследуемым присутствием локуса НЬА-ЭО-антигена лейкоцитов человека. Хотя у более 90% пациентов с диабетом типа Ι присутствуют
- 17 015629 генетически унаследованные аллели Όφ8 и/или Όφ2(8,9), однако лишь у небольшой части восприимчивых индивидуумов наблюдается развитие заболевания с клиническими проявлениями. Даже у монозиготных близнецов степень конкордантности составляет лишь 50%(10). В патогенезе диабета типа I важную роль играют факторы окружающей среды.(11)
Разрушение β-клеток в панкреатических островках в преклинической стадии заболевания характеризуется вырабатыванием аутоантител, ассоциированных с диабетом. Наиболее изученными антителами являются антитела против инсулина (1АА)(12), антитела против глутамат-декарбоксилазы (САЭА)(13), антитела против молекулы ΙΆ-2, связанной с протеинтирозин-фосфатазой(14) и антитела против цитоплазматических островковых клеток (15).
Исследования, недавно проведенные финскими учеными по выявлению описанных выше ассоциированных с диабетом антител у детей в возрасте от 3 месяцев до 2 лет с наследственной восприимчивостью к диабету, показали, что у этих детей серологическая конверсия постоянно усиливается, начиная с 6-месячного возраста, а в осенние и зимние месяцы наблюдается значительно более высокий показатель сероконверсии, чем в весенние и летние месяцы. Считается, что такую сезонную вариабельность в продуцировании аутоантител и установление диагноза диабета можно отнести за счет более высокой вероятности инфицирования в эти месяцы(9). В этом исследовании первое обнаруженное у детей аутоантитело было направлено против инсулина (ΙΆΆ), на основании чего авторами был сделан вывод, что инсулин может быть главным аутоантигеном у большинства пациентов с аутоиммунным диабетом типа I. В пользу этой гипотезы свидетельствует ряд наблюдений, а именно то, что, во-первых, инсулин является лишь одним антигеном, о котором достоверно известно, что он представляет собой специфический βклеточный аутоантиген; во-вторых, ΙΆΆ наиболее часто встречается у детей с недавно диагностированным диабетом типа I, и в-третьих, диабет типа I может экспериментально передаваться инсулинреактивными Т-клетками .
Было высказано предположение, что развитие антиинсулиновой реактивности обусловлено антигенной мимикрией, однако в настоящее время не существует каких-либо экспериментальных данных, подтверждающих взаимосвязь инфекционных агентов и антигенной инсулинореактивности. При формулировании концепции относительно этиологии диабета типа I, пока еще отсутствовали ключевые наблюдения, проводимые до установления диагноза или во время установления диагноза этого заболевания. Перед диагностикой этого заболевания наблюдается увеличение отношения проинсулина к иммунореактивному инсулину, что указывает на то, что недавно диагностированный диабет типа I ассоциируется с разрушением β-клеток, с периферической инсулинорезистентностью и с нарушением функции секреции контррегуляторных гормонов, таких как глюкагон(18-20). Эти наблюдения показали, что в начале заболевания диабетом типа I достигается наибольший уровень гибели β-клеток. Аналогичные патологии, связанные с возрастанием отношения проинсулина к инсулину, инсулинорезистентностью и нарушением профиля секреции глюкагона, также наблюдаются и при диабете типа П(21,22). Кроме того, оба эти заболевания имеют аналогичный профиль осложнений.
Общая гипотеза относительно индуцирования диабета обоих типов I и II, которая охватывает преддиабетические и постдиабетические состояния, была выдвинута исходя из недавней идентификации аутоантител, которые обладают перекресной специфичностью широкого спектра. Ключевая специфичность этого аутоантитела, которая является показателем его происхождения, заключается в реактивности этого аутоантитела, направленной на антитело против ТСК νβ-цепей. Такие моноклональные антитела, продуцированные против анти-ТСΚ.-Vβ-антител, были использованы в качестве индикатора возможных эффектов аутоантител аналогичной специфичности. Такие моноклональные антитела, вырабатываемые против анти-ТСΚ-Vβ-реагентов, обладают способностью подавлять регуляцию секреции инсулина из человеческих панкреатических островков ίη νΐίτο, что приводит к осуществлению циклов гиперсекреции с последующей гипосекрецией вплоть до полного прекращения секреции инсулина островковыми клетками.
Указанные моноклональные антитела, вырабатываемые против анти-ТСК-νβ-антител, были использованы для скрининга библиотеки кДНК человеческого λ§111 и были идентифицированы клоны, кодирующие белок СР-2 (молекулу, связанную с гликозилфосфатидилинозитом (СМ)), секретогранин I (адгезивный белок, фосфорилированный по серину и сульфированный по тирозину, Огликозилированный дуплекс, который связывается с мембраной посредством пептида петли с Ν’концевым дисульфидными связями), ламинин-связывающий белок (ассоциированный с метастазами 671<Э. адгезивный белок, ацилированный жирными кислотами), Е8НР! (новая идентифицированная молекула с Ν-концевыми дисульфидными связями) и др. Эти молекулы обладают способностью к передаче сигнала.
Моноклональные антитела интенсивно окрашивают человеческие α-клетки панкреатических островков, клетки многих других эндокринных органов, включая щитовидную железу, надпочечник, желудок, кишку и другие ткани, такие как мышца и соединительная ткань. Клоны, продуцирующие моноклональное антитело, были отобраны путем скрининга на моноклональные антитела против анти-ТСК-νβантител и карбиолипин, используемый в качестве индикатора фосфолипидов. Было показано, что супер
- 18 015629 натанты от клонов с перекрестной специфичностью реагируют с другими анионными фосфолипидами, такими как фосфатидилинозит и фосфатидилсерин; причем они также реагируют с одноцепочечной и двухцепочечной ДНК.
Было высказано предположение, что аутоантитела, реагирующие с анти-ТСК-νβ-реагентами, также обладают аналогичной перекрестной реактиностью, описанной выше, а поэтому они вызывают нарушение регуляции секреции инсулина, как было продемонстрировано для моноклонального антитела с аналогичной специфичностью. Было высказано предположение, что механизм, посредством которого эти антитела нарушают секрецию инсулина, обусловлен повышением давления на инсулинсекретирующие β-клетки, вызываемым нарушением регуляции α-клеток, которое приводит к увеличению уровня секреции глюкагона. Потенцирующее действие глюкагона на секрецию инсулина является хорошо известным фактом. При добавлении глюкагона, α-клеток или сАМБ, секреция инсулина отдельными β-клетками усиливается®. Аутоантитела, благодаря их связыванию с инозит-фосфогликановыми молекулами СΡIякорей, могут предотвращать расщепление активированных инсулином фосфолипаз и, тем самым, влиять на передачу сигнала. Способность таких молекул передавать сигнал хорошо описана в литературе(5, 23). Благодаря аналогичной способности связываться с фосфоинозитгликанами, указанные аутоантитела могут блокировать медиаторы действия инсулина, и тем самым вызывать инсулинорезистентность или подавлять действие инсулина. Неадекватное генерирование/высвобождение инозитфосфогликанов наблюдалось у людей с (24) инсулинорезистентностью .
Псориаз
Псориаз представляет собой заболевание, ассоциированное с диабетом(25,26); при этом у пациентов с псориазом, имеющих нормальный или избыточный вес и не имеющих наследственной предрасположенности к диабету, наблюдается инсулинорезистентность(27). При проведении 2-часового перорального теста на толерантность к глюкозе у индивидуумов с псориазом, имеющих нормальный уровень глюкозы в плазме, наблюдались значительно более высокие уровни инсулина по сравнению с уровнями инсулина у индивидуумов контрольной группы. В том же самом исследовании скорость исчезновения глюкозы в 15минутном внутривенном тесте на толерантность к инсулину указывала на наличие инсулинорезистентности у индивидуумов с псориазом по сравнению с индивидуумами контрольной группы. Было продемонстрировано, что при псориазе наблюдаются высокие уровни холестерина и триглицеридов, и пониженные уровни ЛВП-холестерина, что соответствует дислипидемии, ассоциированной с гиперинсулинемией и инсулинорезистентностью(29). Также сообщалось, что при псориазе, гиперактивация системы передачи сигнала фосфолипазы С/протеинкиназы приводит к ожидаемому снижению уровней СΡIзаякоренных молекул в коже пациента с псориазом и к фактическому исчезновению этих молекул в псориатических бляшках(30).
Экзема
У пациентов с экземой наблюдается пониженная толерантность к глюкозе. Тридцать девять пациентов были подвергнуты внутривенному тесту на толерантность к глюкозе, который указывал на значительный уровень интолерантности к глюкозе у этих пациентов .
Витилиго
Витилиго представляет собой приобретенный гипомеланоз, который, в большинстве случаев, ассоциируется с потерей меланоцитов. Хотя меланоциты, локализованные в базальном слое эпидермиса, продуцируют меланин-содержащие органеллы, называемые меланосомами, однако в поступлении антиоксидантных молекул в меланоциты, а также в образовании кофакторов, участвующих в синтезе меланина, определенную роль также играют кератиноциты(32).
Витилиго встречается у 1% населения и у 9% пациентов с ИЗСД(33). Витилиго также ассоциируется с другими аутоиммунными заболеваниями, такими как аутоиммунный тиреоидит, пернициозная анемия, тромбоцитопения и т. п.
Одним из факторов, влияющих на пигментацию кожи, является гормон, стимулирующий альфамеланоциты (а-М8Н). Связывание а-М8Н с его рецептором приводит к повышению тирозиназной активности и к продуцированию эумеланина(34). Продуцирование а-М8Н зависит от уровней инсулина и непосредственно коррелирует с инсулинорезистентностью, с уровнями инсулина натощак и с индексом массы тела(35). Меланосомы, под действием а-М8Н, подвергаются экзоцитозу из меланоцитов и посредством филоподий переносятся в кератиноциты(36,37). Однако было показано, что у выживших меланоцитов в пораженной витилиго коже, пре-меланосомы эктопически слущиваются с их поверхности, что указывает на то, что при витилиго нарушается регуляция созревания меланосом и экзоцитоз. У пациентов с пре-ИЗСД(18) и ИНЗСД(21), слущивание пре-меланосомов происходит параллельно с гиперпроинсулинемией и аналогично поражению β-клеток при диабете.
Трансформирующий фактор роста β1 (ТСЕ-β 1) также играет определенную роль в меланогенезе посредством ингибирования действия тирозиназы, что приводит к гипопигментации(39). ΤСΕβ также блокирует увеличение числа мелоносом под действием а-М8Н. ΤСΕβ стимулируется при состояниях гипергликемии(40), которые часто наблюдаются при диабете. ΤСΕβ1 также оказывает сильное влияние на кератиноциты, которые обеспечивают доставку кофакторов в меланоциты. Кератиноциты имеют рецеп
- 19 015629 торы связывания с ТСЕв на своей поверхности, и ТСЕв-связывающий белок представляет собой СРЕ заякоренную молекулу размером 150 кДа. Было показано, что антитело против этой молекулы представляет собой комплекс всех ТСЕв-связывающих белков, что свидетельствует о том, что СРЕзаякоренный рецептор размером 150 кДа образует гетеромерные комплексы с другими ТСЕв-рецепторами. Кератиноциты отвечают на ТСЕ-бета посредством ингибирования их рецепторов и ингибирования синтеза ДНК11' Поэтому аутоантитела против СРЕякоря таких передающих сигнал молекул могут блокировать передачу сигнала, необходимую для нормального функционирования кератиноцитов.
В эпидермисе пораженной витилиго коже, как в самих участках поражения, так и вокруг этих участков, уровни экспрессии мембранного белка-кофактора и фактора ускорения лизиса клеток, СИ59, ниже, чем в непораженной коже. СИ59 представляет собой СРЕзаякоренную молекулу, которая обеспечивает защиту от аутологичного лизиса клеток комплементом, а ее отсутствие или ингибирование (вызываемое описанными здесь аутоантителами) может быть ассоциировано с действием антимеланоцитов и комплемент-опосредуемой деструкцией меланоцитов при витилиго .
Черный акантоз
Витилиго и черный акантоз подобны ИЗСД и ИНЗСД, а именно черный акантоз характеризуется гиперпигментацией кожи (аналогично гиперинсулинемии при ИНЗСД), а витилиго характеризуется гипопигментацией кожи (аналогично гипоинсулинемии при ИЗСД). Причиной возникновения вышеуказанных состояний являются генетические факторы, которые также являются основными факторами, вызывающими гиперинсулинемию и инсулинорезистентность. Меланоциты, генетически восприимчивые к факторам стресса, таким как увеличение уровней а-М8Н, обусловленное повышением уровня инсулина, могут предотвращать меланогенез или снижать его уровни, а врожденное отсутствие такой восприимчивости может вызывать гиперпигментацию.
У пациентов с черным акантозом часто наблюдается нарушение толерантности к глюкозе и гиперинсулинемия(43). Черный акантоз у подростков с ожирением также часто ассоциируется с гиперинсулинемией и инсулинорезистентностью(44-46). Данные, полученные при обследовании 102733 детей в возрасте от 8 до 15 лет, показали, что 14,4% из них страдают черным акантозом. Считается, что важными факторами, стимулирующими положительную динамику такого состояния, является снижение уровня инсу(47) линорезистентности и гиперинсулинемии .
Кожа
Старение кожи коррелирует с повышенной эластазной активностью, повышенным уровнем экспрессии металлопротеиназ матрикса и нарушением синтеза холестеразы(48-50). СРЕзаякоренный протеогликан, глипикан присутствует в околоклеточном пространстве кератиноцитов, регулирует присутствие факторов роста и действует как матриксный рецептор(51). СРЕзаякоренный рецептор урокиназного активатора плазминогена, иРАК, также присутствует на кератиноцитах и связывается с иРА, секретируемым кератиноцитами. Активация урокиназной системы наблюдается при заживлении ран и при аутоиммунном буллезном заболевании кожи, пузырчатке. Ультрафиолет В активирует эту систему и его действие продолжается до 36 ч(52). Поражение, которое может возникать в случае нарушения функции иРАК под действием антител против элементов СРЕякоря, описано в разделе Артрит и родственные заболевания. Влияние инсулина на экспрессию эластазы и металлопротеиназы матрикса хорошо известно специалистам(53-54). Считается, что антитела согласно изобретению играют определенную роль в стимуляции развития патологических состояний кожи, ассоциированных со старением, УФ-облучением и аутоиммунным заболеванием, а также в замедлении заживления ран.
Гнездная алопеция
Существует мнение, что это аутоиммунное состояние возникает приблизительно у 1% населения в возрасте 50 лет. Пик заболеваемости наблюдается у детей и юношей(55). Гнездная алопеция ассоциируется с различными атопическими и аутоиммунными состояниями. У таких пациентов сахарный диабет встречается не чаще, чем у других пациентов, но гораздо чаще он возникает у родственников(56-58). Обследование мужчин с ранним развитием алопеции выявило взаимосвязь этого заболевания с инсулиноре(59) зистентностью .
Было высказано предположение, что алопеция в ее различных формах представляет собой другое проявление инсулинорезистентности у генетически восприимчивых индивидуумов и является частью всего спектра заболеваний, рассматриваемых в настоящем изобретении.
Болезнь Альцгеймера
Болезнь Альцгеймера ассоциируется с признаками инсулинорезистентности и нарушением толерантности к глюкозе.
Среди 532 индивидуумов, не страдающих диабетом и не имеющих аллеля аполипопротеина Е4, заболеваемость болезнью Альцгеймера у индивидуумов с гиперинсулиномией составляет 7,5%, а у индивидуумов с нормоинсулинемией, она составляет 1,4% (60).
В процессе старения и при ускоренном прогрессировании сахарного диабета происходит образование конечных продуктов глубокого гликозилирования (айуапсей ДусаНоп епйргойис(к) (АСЕ), обусловленное неферментативным ковалентным связыванием нередуцирующих сахаров со свободными амино
- 20 015629 группами. АСЕ изменяют физико-химические свойства молекул, подвергнутых их воздействию, а также индуцируют передачу клеточного сигнала и экспрессию гена, что приводит к осложнению диабета и развитию болезни Альцгеймера(61).
Болезнь Альцгеймера и диабет типа ΙΙ ассоциируются с отложением амилоидных белков, а именно островкового амилоидного полипептида (амилина) в панкреатических островках, и амилоидного бетабелка в головном мозге индивидуума с болезнью Альцгеймера. Как амилин, так и амилоидный бетабелок обычно разлагаются под действием инсулин-разлагающего фермента (ГОЕ). Нарушение разложения обоих указанных амилоидных белков под действием ГОЕ указывает на общий патогенетический механизм(62,63). Белки, связанные посредством СР1-якорей, могут также вносить определенный вклад в нейродегенерацию при болезни Альцгеймера. В коре лобной доли головного мозга и в гиппокампе пациентов с болезнью Альцгеймера, уровни белка, защищающие клетки от лизиса комплементом, СГО59. значительно ниже, чем уровни этого белка у пациентов пожилого возраста, не страдающих деменцией. Анализ срезов коры головного мозга у пациентов с болезнью Альцгеймера показал, что у этих пациентов, уровень СЭ59, высвобождаемого под действием РГРЬС, значительно ниже, чем у пациентов, не страдающих деменцией. Было обнаружено, что амилоидный бета-белок ингибирует СО59(64). Аутоантитела против СР1-якоря могут вызывать негативную регуляцию и повышение восприимчивости нейронов к лизису комплементом.
Другим СР1-заякоренным белком является ассоциированный с лимбической структурой мембранный белок (ЪАМР), экспрессируемый в соме и в дендритах субпопуляций зрелых нейронов головного мозга, которые ассоциируются с лимбическими структурами. В коре головного мозга ЬАМР-транскрипт наиболее распространен в областях, ответственных за познавательную способность и память, при этом они слабо экспрессируется в областях переднего мозга и промежуточного мозга, которые считаются классическими лимбическими системами, и почти не экспрессируются в нелимбических областях, в областях среднего мозга и в областях ромбовидного мозга. Было показано, что этот транскрипт присутствует в головном мозге взрослого индивидуума, как было установлено методами гибридиазции ш зйи(65). Ингибирование или нарушение регуляции этих ЬАМР-молекул, вызываемое аутоантителами против СР1, может ассоциироваться с утратой познавательных способностей у пациентов с болезнью Альцгеймера или с другими возрастными психическими нарушениями, включая нарушения познавательной способности и памяти.
Катепсин Ό, СР1-заякоренный лизосомный фермент (аспартат-протеиназа)(66), может также играть определенную роль в развитии болезни Альцгеймера. Очевидно, что у пациентов с болезнью Альцгеймера, по сравнению с индивидуумами контрольной группы, не страдающими болезнью Альцгеймера, катепсин Ό ингибируется в коре лобной доли головного мозга(67). Некоторыми последствиями дефицита катепсина Ό у мышей, дефицитных по этому ферменту, являются высокая степень аккумуляции липофусцина нервных клеток восковой железы и атрофия слизистой тонкого кишечника и лимфоидных органов, что позволяет предположить, что катепсин Ό играет важную роль в гомеостазе ткани(68).
Гепарансульфатные протеогликаны (Н8РС), которые представляют собой СР1-заякоренные молекулы, присутствуют повсюду в базальных мембранах и клеточных мембранах, и было показано, что они участвуют в развитии болезни Альцгеймера. Один из таких Н8РС, глипикан-1, в избытке экспрессируется у пациентов с церебральной амилоидной ангиопатией и болезнью Альцгеймера(69). Н8РС локализуются в амилоидных фибриллах, присутствующих в нейритных бляшках, и в сосудистой бляшке при конгофильной ангиопатии в головном мозге пациентов с болезнью Альцгеймера. Было продемонстрировано, что Н8РС также присутствуют в примитивных бляшках, что позволяет предположить, что они играют определенную роль на ранних стадиях образования бляшек(70). Н8РС взаимодействуют с НОЬ и Аро Е с удалением избытка холестерина из головного мозга(71), что способствует формированию целостности сосудов головного мозга. Старческие бляшки часто наблюдаются поблизости от капилляров, что позволяет предположить, что необходимым условием для образования бляшек может быть нарушение гематоэнцефалического барьера(72). Разрушение сосудов является важным фактором патогенеза болезни Альцгеймера и соответствует роли патогенных антител, описанных в настоящем изобретении.
И наконец, изменение метаболизма глюкозы/энергетического метаболизма в стареющем мозге и снижение чувствительности рецепторов инсулина на нервных клетках (инсулинорезистентность), наблюдаемое при диабете типа ΙΙ, а также одновременное нарушение регуляции передачи сигнала и нейротропных молекул способствуют запуску каскада амилоидогенных реакций и образованию гиперфосфорилированного белка 1аи, а также формированию нейрофибриллярных клубков в пораженных нейронах у пациентов с болезнью Альцгеймера.
Шизофрения и депрессия
Шизофрения описана в литературе как церебральный диабет вследствии происходящих при этом заболевании нарушений метаболизма глюкозы в головном мозге в сочетании с инсулинорезистентностью(73,74). У пациентов этой группы, в отличие от нормальных индивидуумов, более часто наблюдается интолерантность к глюкозе и диабет типа II (ТЬе Βπΐίδΐι 1оитиа1 о! РзусЫайу (2004) 184: 8112-8114) (ΌίηЬе1е8 Саге 28:1063-1067, 2005). Мании и позитивные симптомы шизофрении ассоциируются с гипергликемией, гипердопаминергией и гиперсеротонергией, а депрессия и негативные симптомы шизофрении
- 21 015629 ассоциируются с гипогликемией, гиподопаминергией и гипосеротонергией. Эти два состояния находятся на противоположных сторонах спектра заболеваний этого типа(74). Приблизительно у 50% пациентов с эндогенной депрессией наблюдается прямая корреляция между инсулинорезистентностью и продолжительностью заболевания. У таких пациентов также наблюдается гиперсекреция кортизола(75).
Болезнь Паркинсона
Болезнь Паркинсона (БП) характеризуется прогрессирующей потерей 70-80% допаминергических нейронов в черном веществе(76). Считается, что дегенерация нейронов обусловлена окислительным стрессом из-за высоких уровней допамина (76).
Паталогоанатомические исследования тканей головного мозга пациентов с БП, выявили повышение уровня окислительного стресса и нарушение поглощения глюкозы в популяции нейронов .
Сообщалось, что у 50-80% пациентов с БП наблюдается нарушение толерантности к глюкозе(78). Результатом такого нарушения является гипергликемия, а следовательно гиперинсулинемия. Известно, что инсулин играет важную роль в регуляции метаболизма в нейронах и в передаче сигнала. Было показано, что инъекция возрастающих количеств инсулина крысам приводит к повышению уровня секреции допамина(79). Кроме того, было продемонстрировано, что инсулин регулирует синтез и активность переносчика допамина(80) и было обнаружено, что нонапептид, находящийся у С-конца β-цепи инсулина, в высокой степени ингибирует поглощение допамина переносчиком допамина у крыс(81). Такие молекулыпереносчики прекращают передачу допаминергического сигнала путем выведения нейромедиаторов из синаптического пространства. Известно, что сам допамин вызывает гипергликемию в результате непосредственного высвобождения глюкозы из гепатоцитов(82). Это может способствовать нарушению толерантности к глюкозе у пациентов с БП.
Было показано, что нейротрофический фактор, происходящий от головного мозга и глиальных клеточных линий, представляет собой сильнодействующий фактор выживания допаминергических нейронов, которые разрушаются при БП, и других нейронов симпатической, сенсорной и центральной нервной системы, которые разрушаются при других нервных расстройствах, включая амиотрофический боковой склероз, расстройство сна, шизофрению и болезнь Альцгеймера. В 1и уЦго системе, нейротрофический фактор глиальных клеток (ΟΌΝΓ) снижает индуцированную допамином клеточную гибель на 60-70%(83).
Было также показано, что структурно родственный полипептид, называемый нейтурином (ΝΤΝ), представляет собой сильнодействующий фактор выживания допаминергических, двигательных, симпатических и сенсорных нейронов. Оба рецептора для 6ΌΝΓ (ΟΌΝΡΕ-α) и ΝΤΝ (ΝΤΝΚ-α) представляют собой ΟΡΙ-заякоренные белки, которые являются частью трансмембранного тирозинкиназного рецептора Ке(84). Антитела против элементов ΟΡΙ-якоря этих рецепторных белков могут блокировать их активность в передаче сигнала и, тем самым, нейтрализовать их нейротропную функцию.
Мигрень
Сообщалось, что антифосфолипидные антитела и нарушение регуляции глюкозы наблюдаются при мигрени (85,86) .
Рассеянный склероз
При параллельном обследовании 357 пациентов с РС в клинических отделениях для больных с РС, проводимом в целях определения взаимосвязи РС с другими аутоиммунными заболеваниями, было обнаружено, что 15,4% пациентов имели родственников первой степени, страдающих РС и другими аутоиммунными заболеваниями. Наиболее часто встречающимися аутоиммунными заболеваниями, которые обычно ассоциируются с РС, являются болезнь Грейвса, ревматоидный артрит, инсулинзависимый сахарный диабет типа Ι и увеит(87).
Аутореактивные Т-клетки пациентов с диабетом и РС отвечали на классические аутоантигены панкреатических островков, а также аутоантигены ЦНС. В анализах на пролиферацию Т-клеток приблизительно 90% из 38 пациентов с РС оказались восприимчивыми к базальному белку миелину (МРВ).
Восприимчивость к проинсулину и аутоантигенам островковых клеток ΙΑ-2 была почти такой же, как при диабете, имела такие же показатели, как ответы на МРВ(88). Такие ответы редко наблюдались у индивидуумов контрольной группы. Исследования Т-клеточных ответов у 54 детей с недавно диагностированным диабетом показали, что у 53% детей наблюдалась восприимчивость к МРВ(88). Хотя эти перекрывающиеся Т-клеточные ответы не являются показателем вторичного клинического заболевания, однако они в значительной степени позволяют предположить о наличии общего механизма развития обоих заболеваний.
У пациентов с РС наблюдалась повышенная восприимчивость к гипергликемии натощак, что указывает на снижение контррегуляторного ответа, в котором участвуют глюкагон и кортизол(89). Механизм гиперпроинсулинемии был уже описан в литературе, и тот факт, что пациенты с РС обнаруживают Т-клеточные ответы на проинсулин, указывает на то, что у пациентов с РС, разрушение β-клеток, в основном, происходит на субклиническом уровне. Те же самые аутоантитела, которые распознают анти-ТСК-Ув-антитела и СР1заякоренные молекулы, могут вызывать разрушение β-клеток посредством нарушения регуляции панкреатических α-клеток и разрушение миелиновой оболочки под действием СР1-заякоренных белков, которые распределяются по миелиновой оболочке в процессе созревания олигодендроцитов(90).
- 22 015629
Тяжелая миастения
Сообщалось, что тяжелая миастения (ТМ) является компонентом полигландулярных синдромов типа Ι и типа ΙΙ(91,92). Считается, что в патогенезе ТМ определенную роль играют антитела против ацетилходинового рецептора (АСНВ) и ацетилхолинэстеразы(93,94). Однако были выявлены пациенты с генерализованной ТМ, которые обнаруживали серонегативную реакцию на эти антитела, что указывает на то, что в индуцировании заболевания участвуют и другие аутоантитела или факторы. Сообщалось, что при генерализованной ТМ, у пациентов с ТМ наблюдались повышенные уровни аутоантител против ДНК(95) и высокие уровни волчаночных антикоагулянтных антител(96).
ТМ представляет собой заболевание нервномышечного соединения, характеризующееся связыванием ацетилхолина (АСН) с АСНК. Ацетилхолинэстераза гидролизует ацетилхолин, освобождая, тем самым, рецепторы для связывания с новыми молекулами и передачи сигнала. АСН и ацетилхолинэстераза восприимчивы к регуляции уровнями инсулина и глюкозы. Сообщалось, что инсулин индуцирует гипогликемию, что приводит к значительному снижению ацетихолинэстеразной активности в головном мозге крыс(97). В головном мозге крыс с гипергликемией уровень ацетилхолина обычно снижен, а инсулин повышает эти уровни(98). У крыс с диабетом также наблюдается снижение чувствительности ацетил(99) холинового рецептора .
С точки зрения настоящего изобретения аутоантитела, которые распознают сигнальные молекулы, ДНК и фосфолипиды, ответственны за нейромышечные патологии при ТМ, вызываемые нарушением регуляции метаболизма глюкозы и функций передачи сигнала молекулами. Ацетилхолинэстераза представляет собой ΟΡΙ-заякоренную молекулу(100), и ее функция может быть нарушена под действием молекул, повышающих уровни АСН, и тем самым разрушающих АСН-рецептор. Было показано, что экспрессия рецептора для цилиарного нейротрофного фактора (который также является ΟΡΙ-заякоренным) способствует развитию диабетической ретинопатии(101). Уровни этого рецептора в мышцах у серопозитивных пациентов с ТМ(102) являются показателем этиологической взаимосвязи между ТМ и диабетической невропатией.
Амиотрофический боковой склероз, заболевания двигательных нейронов и родственные заболевания
Большое число пациентов с амиотрофическим боковым склерозом (АБС) являются интолерантными к глюкозе. Однако существуют разногласия относительно того, является ли нарушение метаболизма первичной патологией, либо оно возникает вследствие мышечной атрофии. Исследования эугликемической аглютинации инсулина, проводимые с участием пациентов с АБС и с участием двух контрольных групп индивидуумов, имеющих соответствующее заболевание и соответствующую массу тела, выявили, что чувствительность к инсулину у пациентов с АБС, по сравнению с контрольными группами, снижалась(103). Было продемонстрировано, что у пациентов с АБС, по сравнению с индивидуумами контрольных групп, наблюдались аномальные уровни глюкагона в плазме. Было показано, что у пациентов, которые два раза принимали экспериментальную пищу с перерывом в 1 неделю, обнаруживалась гиперглюкагонемия натощак через 1/2 и 2 ч после приема пищи, по сравнению с индивидуумами контрольных групп(104). Сообщалось, что у многих пациентов с АБС наблюдались признаки сахарного диабета типа ΙΙ(105).
Также сообщалось, что конечные продукты глубокого гликозилирования (абνаηсеб §1уса1юп епб ргобисй) (АСЕ), которые вызывают хронические осложнения диабета, играют определенную роль в патогенезе нейродегенеративных заболеваний, таких как прогрессирующий надъядерный паралич, болезнь Пика, гуамский комплекс амиотрофический боковой склероз/парксинсонизм-деменция(106). Известно, что выживание и рост двигательный нейронов зависит от нейротрофических факторов. Сильнодействующими нейротрофическими факторами/факторами выживания двигательных нейронов являются инсулиноподобный фактор роста 1 (ΙΟΕ-Ι) и глиальный нейротрофический фактор (ΟΌΝΡ) (107). Очевидно, что отсутствие трофических факторов приводит к дегенерации зрелых нейронов. Хотя у пациентов с АБС было обнаружено повышение уровня некоторых ЮЕ-связывающих белков, однако у таких пациентов сывороточные уровни ΙΟΕ-Ι и инсулина были значительно снижены(108). Поэтому усиление метаболизма глюкозы/инсулина/глюкагона должно иметь важное значение для выживания и роста двигательных нейронов.
Помимо инсулина и ΙΟΕ-Ι важную роль в выживании нейронов также играют ΟΌΝΡ и нейтурин. ΟΌΝΡ стимулирует выживание двигательных нейронов ш νί\Ό и ш уйго и спасает их от гибели. Наивысший уровень экспрессии ΟΌΝΡ наблюдается в человеческой скелетной мышце, а в частности в нервно-мышечных соединениях. ΟΌΝΡ был также обнаружен в аксонах и в окружающих их швановских клетках периферических нервов(109).
Иммуногистологический анализ показал, что ΟΌΝΕ-рецептор, СЕКа-1, локализуется в миелинизированных периферических нервах и в нервно-мышечных соединениях. Анализ, проводимый с помощью 0Т-ПЦР, также показал, что мРНК СЕКа-1 присутствует в переднем роге спинного мозга, но отсутствует в скелетных мышцах, что позволяет предположить, что такая молекула играет главную роль в поглощении и интернализации ΟΌΝΡ в нервно-мышечном соединении(110). Нейтурин, нейротрофический фактор, родственный фактору ΟΌΝΕ, связывается с его рецептором СЕКа-2, а также способствует выжива
- 23 015629 нию нейронов(111). Все идентифицированные таким образом СЕКа1-а4-рецепторы, с которыми связываются лиганды семейства ΟΌΝΕ, являются ΟΡΙ-заякоренными и передают сигнал посредством взаимодействия Ре1 с членами киназ семейства Згс, а поэтому являются необходимым для роста и выживания нейритов(112).
В процессе нейродегенерации участвуют генетические факторы, и в этот процесс также вовлечены гены не-МНС(113). Поэтому предполагается, что у индивидуумов с генетическими нарушениями антитела против элементов ΟΡΙ-якоря могут значительно влиять на передачу сигнала ΟΡΙ-заякоренных молекул, и тем самым препятствовать выживанию нервных клеток.
Заболевания щитовидной железы
Заболевания щитовидной железы охватывают спектр состояний от гиперсекреции, наблюдаемой при болезни Грейвса, до гипосекреции, наблюдаемой при тиреоидите Хашимото. Риск развития заболеваний щитовидной железы значительно возрастает у пациентов с диабетом. Произвольно отобранную группу, состоящую из 1310 взрослых индивидуумов с диабетом, обследовали на наличие заболеваний щитовидной железы путем определения концентраций свободного тироксина и тиреотропного гормона (ТЗН). Общая заболеваемость составляла 13,4%, а самый высокий уровень заболеваемости, а именно 31,4% наблюдался у женщин с диабетом типа Ι(114).
Стадии синтеза и секреции гормонов щитовидной железы регулируются ТЗН. Его регуляторная функция заключается в передаче сигнала посредством вторичных мессенджеров инозитфосфогликана (ΙΡΟ). ТЗН стимулирует высвобождение полярной головной группы ΙΡΟ. Было показано, что такой растворимый ΙΡΟ модулирует метаболизм иода в тироцитах(115). ΙΡΟ, выделенный из свиных тироцитов, индуцировал пролиферацию фибробластов и свиных тироцитов(116).
Тироциты богаты ΟΡΙ-заякоренными молекулами, которые имеют апикальное и базолатеральное распределение1-117/ Некоторые ΟΡΙ-заякоренные молекулы, такие как №ΡΟ, участвуют в транспорте тироглобулина (Тд) из фолликулярного просвета в базолатеральную мембрану тироцитов, из которых Тд высвобождается в кровоток. Тироглобулин взаимодействует с поверхностными №ΡΟ посредством сайта, функционально связанного с мегалинсвязывающим сайтом. Мегалин представляет собой эндоцитный рецептор липопротеина низкой плотности, который переносит НЗΡΟ-связанный Тд через эпителиальные клетки (118,119).
Иммуногистохимические исследования функций №ΡΟ и других компонентов базальных мембран выявили патологические изменения в базальных мембранах при тиреоидите Хашимото, при гиалинизирующих трабекулярных аденомах, папиллярных карциномах, анапластических карциномах и других гистопаталогических вариантах заболеваний щитовидной железы(120). Семейство ΟΡΙ-заякоренных молекул (ΟΕΚα.1-4) представляет собой рецепторы для глиального нейротрофического фактора (ΟΌΝΕ). Эти молекулы присутствуют в нормальных тканях и в опухолях щитовидной железы, в медуллярных карциномах щитовидной железы (ΟΕΚα.4), в феохромоцитомах, в области паратиреоидной гиперплазии, в ганглионевромах кишечника, в пораженных участках скелета, и в невромах слизистой, которые известны под общим названием множественная эндокринная неоплазия типа 2А и В(21).
Синдром Кушинга и болезнь Аддисона
Болезнь Кушинга обычно ассоциируется с интолерантностью к глюкозе, диабетом, центральным ожирением, волосатостью и повышенным артериальным давлением. Главным диагностическим признаком этого заболевания является гиперкортицизм, который может возникать в результате длительной гиперсекреции АСТН у 20-40% пациентов(122); причем он может возникать и в отсутствие аденомы гипофиза, а повышенная секреция кортизола может быть обусловлена односторонней или двусторонней гиперплазией надпочечника в присутствии или в отсутствии автономно секретирующихся микро- или макроузелков(123).
В недавно проведенном одновременном перекрестном обследовании 90 пациентов с ожирением и диабетом сообщалось, что заболеваемость синдромом Кушинга составляет 3,3%(124). К этому числу следует добавить множество преклинических и субклинических случаев заболевания синдромом Кушинга, которые были представлены как сахарный диабет в фазе декомпенсации. Аналогичным образом сообщалось, что хронический гиперкортицизм в легкой степени при диабете типа Ι характеризуется увеличением уровня кортизола натощак и свободного кортизола в моче, а также повышением восприимчивости к овечьему кортикотропин-релизинг гормону(125).
Гиперсекреция АСТН может происходить и в отсутствии адономы гипофиза, но при наличии гиперкортизолинемии(126), что дает основание предположить о нарушении нормальной негативной регуляции с обратной связью. В некоторых работах была показана роль ΟΡΙ-заякоренных молекул и инозитфосфогликанов, высвобождаемых посредством активации фосфолипазы С, в регуляции секреции гормонов гипофиза и секреции гормонов, стимулируемых этими гормонами из надпочечников, щитовидной железы, гонад и т.п. (127-129). Поскольку было также показано, что антитела против ΟΡΙ-заякоренных молекул индуцируют пролиферацию клеток посредством индуцирования потери активности, ингибирующей активацию сигналов, то было высказано предположение, что описанные здесь аутоантитела обладают патогенным действием, варьирующимся от нарушения периодической секреции гормонов до ингиби
- 24 015629 рования или усиления секреции, и даже образования опухолей (130,131).
Болезнь Аддисона также является компонентом аутоиммунного полигландулярного синдрома типа ΙΙ с повышенным риском развития инсулинзависимого сахарного диабета, витилиго, алопеции, пернициозной анемии, глютеновой болезни, тяжелой миастении и первичного гипогонадизма(91) . Как и синдром Кушинга, болезнь Аддисона представляет собой другой пример последствий эндокринной стимуляции, вызываемой аутоантителами. При этом здоровая эндокринная железа будет постоянно осуществлять сверхсекрецию гормонов, а железа с генетическими нарушениями утратит эту способность, в результате чего будет наблюдаться гипосекреция гормонов.
СПКЯ, гипогонадизм и преждевременное облысение у мужчин
Синдром поликистоза яичника (СПКЯ) является причиной гиперадрогении у 95% женщин и обычно проявляется волосатостью, акне, центральным ожирением, облысением по мужскому типу и другими физическими изменениями по типу маскулинизации. Дифференциальный диагноз СПКЯ направлен на исключение синдрома Кушинга и опухолей андроген-продуцирующего яичника и надпочечника. Андрогенными расстройствами являются наиболее распространенные эндокринопатии, встречающиеся у 1020% женщин(132).
Гиперандрогения развивается в результате генерализованного нарушения регуляции стероидогенеза, которое может происходить в яичниках или надпочечниках. Такое нарушение регуляции, очевидно, является следствием модуляции центральных и периферических факторов, регулирующих действие гормонов. Повышенные уровни ОпЯН и ЬН и недостаточные уровни Е8Н являются провоцирующими факторами, вызывающими хроническую ановуляцию при СПКЯ(133). Однако, очевидно, что гиперинсулинемия играет важную роль в стимуляции скрытых нарушений регуляции стероидогенеза у индивидуумов с генетическими отклонениями. При облысении по мужскому типу как у женщин, так и у мужчин с генетическими нарушениями инсулин взаимодействует с андрогенами, что приводит к регуляции образования волосяных фолликулов и ассоциированных с ними сальных желез(134).
При обследовании 5 семей в целях выявления нарушений секреции инсулина у мужчин и женщин с СПКЯ, являющихся членами семейств, к которым принадлежали индивидуумы с СПКЯ, было обнаружено, что 69% из 24 женщин, членов этих семейств, имели гиперинсулинемию, а 79% из них имели СПКЯ. Среди восьми мужчин, членов этих семейств, у 88% наблюдалось преждевременное облысение(135).
Гиперинсулинемия при СПКЯ ассоциируется с интолерантностью к глюкозе, с повышенными уровнями инсулина натощак и инсулинорезистентностью. При этом может также наблюдаться атерогенный липидный профиль. Пациенты с СПКЯ обнаруживают повышенную заболеваемость диабетом типа ΙΙ и сердечно-сосудистыми заболеваниями(136).
Считается, что гиперандрогения у инсулинорезистентных женщин обусловлена стимулирующим действием инсулина на продуцирование стероидных гормонов яичника. Инсулин и инсулиноподобный фактор роста Ι (ЮЕ-Ι) могут усиливать стимулируемый гонадотропином стероидогенез посредством увеличения уровня экспрессии ключевых стеролрегулирующих генов в клетках яичника(137). Инсулин и ΙΟΕ1 также обнаруживают синергическое действие с лютеинизирующим гормоном, что приводит к увеличению активности цитохрома Р4 50с17 в надпочечниках. Инсулин индуцирует ингибирование продуцирования ЮЕ-1-связывающего белка (ЮЕВР-Ι) из культивируемых человеческих гранулезных клеток(138). Снижение уровней ΙΟΕ-Ι и рецепторов ΙΟΕ-Ι на гранулезных клетках приводит к снижению уровня ароматизации стероидов(139). Недостаточная ароматизация андростендиона и тестостерона с образованием эстрона и эстрадиола, помимо других факторов, включая повышенный уровень стероидогенеза в клетках оболочки, вызываемый гиперинсулинемией, приводит к избыточному образованию свободных андрогенных гормонов в кровотоке. Кроме того, в клетках яичника, культивированных в присутствии инсулина, концентрация прогестерона, по сравнению с контролем, резко повышалась от 2,5 ± 0,2 нг/мл до 5,4 ± 0,3 мг/мл(138). Этот гормон взаимодействует с генераторами импульсов гонадотропин-рилизинг-гормонов (ОпЯН) в гипоталамусе по типу обратной связи, что приводит к стимуляции секреции ЬН и Е8Н из передней доли гипофиза. В противоположность этому, пациенты с гипогонадотропным гипогонадизмом имели пониженную чувствительность к инсулину
Помимо множества механизмов, в которых инсулин играет свою регуляторную роль, в процессе овуляции также участвуют ОРЕзаякоренные молекулы. Гранулезные клетки богаты протеогликанами, содержащими сульфат гепарана (Н8РО), которые являются ОРЕзаякоренными. Эксперименты по мечению продемонстрировали, что 20-30% протеогликанов, содержащих сульфат гепарана на клеточной поверхности, являются ОРЕзаякоренными и удаляются под действием фосфатидилинозит-специфической фосфорилазы С(141). Фолликулостимулирующий гормон (Е8Н) и человеческий хорионический гонадотропин индуцирует изменения концентрации ОРЕ что указывает на то, что эти молекулы являются вос(142) приимчивыми к действию гормонов .
Было показано, что сигнал-трансдуцирующее действие рецепторов пролактина на гранулезные клетки в присутствии пролактина опосредуется генерированием растворимых молекул гликозилфосфатидилинозита. В Е8Н-примированных гранулезных клетках, пролактин и ОРЕмолекулы блокируют стимулируемую гонадотропином 3в-Н8Б-активность(143). 3в-Н8Б осуществляет поступление холе
- 25 015629 стерина на тестостероновый путь, а следовательно, механизм отрицательной обратной связи регулируется ОР1-молекулами.
Н8РО также обладают антикоагулирующим действием и экспрессируются в фолликулах перед овуляцией, после чего их уровень в фолликулах временно снижается. Они взаимодействуют с ингибиторами протеазы, что позволяет предположить, что они участвуют в регуляции отложения фибрина в фолликулах(144). Поскольку для овуляции требуется ремоделирование ткани и протеолиз, то дизрупция Н8РО может приводить к ановуляции.
Н8РО могут также играть определенную роль в развитии фолликулов. Исследования, проводимые на клеточных линях гепатомы, продемонстрировали, что экзогенно добавленные Н8РО были интернализованы, и их свободные цепи наблюдались в ядре. Это приводило к прекращению развития клеток на фазе О1(145). Аналогичное нарушение регуляции роста может наблюдаться в фолликулярных клетках, и такое нарушение вызывается антителами против таких ОР1-заякоренных молекул.
Ожирение
Инсулин и лептин сообщают координированные сигналы гипоталамусу, который регулирует энергетический баланс и массу тела. Было показано, что повышение уровней инсулина стимулирует продуцирование лептина(146). Рецепторы лептина присутствуют на нейронах гипоталамуса, которые также экспрессируют нейропептид-Υ (Ν₽Υ) и проопиомеланокортин (РОМС). Было показано, что повышение уровня лептина в плазме ингибирует продуцирование ΝΈΥ, что приводит к снижению потребления пищи(147). Лептин также повышает уровень экспрессии РОМС, предшественника α-меланоцитстимулирующего гормона (аМ8Н) (148). а-М8Н действует в гипоталамусе, где он способствует снижению потребления пищи и сообщает чувство сытости(149).
При ожирении гиперинсулинемия и гиперлептинемия сочетаются с инсулинорезистентностью и резистентностью к лептину(150). С увеличением инсулинорезистентности снижается влияние инсулина на продуцирование лептина(151). Исследования на животных также продемонстрировали, что предварительная обработка инсулином в течение 3 дней приводит к блокированию индуцированных лептином ответов(150). Очевидно, что гиперинсулинемия и инсулинорезистентность играют решающую роль в регуляции индуцированного лептином потребления пищи и массы тела. Кроме того, во время физиологической гиперинсулинемии подавляются уровни свободных жирных кислот в плазме(152). Поэтому лечение такого состояния в соответствии с настоящим изобретением позволит решить проблемы ожирения, ассоциированного с инсулинорезистентностью.
Синдром X
Синдром X представляет собой метаболическое расстройство, характеризующееся гиперинсулинемией, гиперхолестеринемией, гипертензией и ишемической болезнью сердца(153). В атеросклеротических повреждениях участвуют ОР1-заякоренные молекулы, такие как Т-кадгерин(154), Считается, что первичной патологией является гиперинсулинемия, которая приводит к инсулинорезистентности, являющейся причиной родственных патологий(155). С того времени, когда впервые появилось описание этого синдрома, стало очевидным, что спектр заболеваний, охватываемых таким синдромом, гораздо шире, чем это предполагалось сначала. Было обнаружено, что у пациентов мужчин со стенокардией, которые не страдали ожирением и ишемической болезнью сердца, наблюдалась инсулинорезистентность, гиперинсулинемия и более высокие уровни триглицеридов и липопротеинов менее высокой плотности, чем у здоровых индивидуумов контрольной группы, а поэтому был сделан вывод, что ишемия миокарда также является компонентом синдрома Х(156). Очевидно, что гиперурикемия и первичный неалкогольный стеатогепатит(158) коррелируют с гиперинсулинемией и инсулинорезистентностью, а поэтому их можно рассматривать как компоненты метаболического синдрома.
Инсулинорезистентность и гиперинсулинемия наблюдается у 70% индивидуумов, не страдающих ожирением и диабетом, но страдающих наследственной гипертензией. Кровяное давление коррелирует с инсулинорезистентностью, которая также коррелирует с чувствительностью к соли и с концентрацией ангиотензина 11(159). Было показано, что изменение концентрации инсулина в ίη ν^ΐ^ο-экспериментах и изменение чувствительности к инсулину в ίη νί\Ό экспериментах влияет на транспорт противоионов Ы'/№1' и Νη'/Н' (СТ). При гипертензии, ИЗСД и при гипертрофической кардиомиопатии, высокий уровень СТ ассоциируется с ремоделированием сердечной мышцы и сосудов(160). Обычно гипертрофическая кардиомиопатия в легкой форме и преходящая гипертрофическая кардиомиопатия наблюдаются у детей, рожденных от матерей, страдающих диабетом. Имеются также сообщения о смерти плода, вызванной таким состоянием(161). Хотя обычно события, ассоциированные с синдромом X, наблюдаются в пожилом возрасте, однако имеются данные, свидетельствующие о том, что такое состояние может возникать в детстве и в юности(162,164).
Заболевания, ассоциированные с вырабатыванием антител против фосфолипидов и волчаночными антикоагулянтами
Антитела против фосфолипидов и волчаночные антикоагулянты ассоциируются с привычной внутриутробной гибелью плода, самопроизвольными выкидышами и тромбозом. Описанные ниже исследования были проведены с участием 51 пациента, у которых были обнаружены антитела против фосфоли
- 26 015629 пидов, и 53 беременных женщин. У 90,0% из 33 беременных женщин, агрессивная терапия, давала благоприятный эффект, однако из всех случаев с благоприятным исходом у 48,6% наблюдалось развитие сахарного диабета беременных1-165-1. Это указывает на то, что антитела против фосфолипидов могут быть провоцирующими факторами восприимчивости к развитию диабета, которые были обнаружены при стрессах, возникающих во время беременности. При исследовании 1698 произвольно выбранных беременных женщин детородного возраста, то есть от 16 до 37 лет, уровни антител против кардиолипина, превышающие нормальные уровни, были обнаружены у пациенток с гипертензией, преэклампсией, диабетом беременных, сахарным диабетом типа I, венозным тромбозом, тромбоцитопенией и ревматическими заболеваниями1-166-1.
При обследовании 29 детей и подростков с диабетом было обнаружено, что антитела против антикардиолипина чаще всего встречаются у пациентов с ИЗСД, чем у здоровых пациентов. Эти антитела чаще обнаруживались у пациентов, которым был поставлен диагноз диабета в последние менее, чем 6 месяцев, чем у пациентов, которым был поставлен диагноз диабета более, чем 5 лет назад. Этот факт объясняется аномальным иммунологическим ответом на ранних стадиях сахарного диабета(167). В других исследованиях диабета, уровень антител против кардиолипина у пациентов с осложнениями диабета был выше, чем у группы индивидуумов без осложнений1-168-1, что дает основание предполагать, что такие антитела могут играть определенную роль в развитии осложнений диабета.
Известно, что на ранней стадии развития осложнений диабета возникает дисфункция сосудистого эндотелия. При обследовании 45 пациентов с ИЗСД без видимых клинических признаков сосудистых осложнений, у одной трети пациентов, по сравнению с индивидуумами контрольной группы, наблюдались более высокие уровни антител против кардиолипина, положительно коррелирующие с уровнями эндотелина-1(169).
Кардиолипин обычно используется в качестве индикатора присутствия различных родственных фосфолипидов, таких как фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозит, фосфатидиновая кислота и фосфатидилхолин. Исследование 70 образцов показало, что реактивность кардиолипина носит индивидуальный характер. Уровни антител против кардиолипинов или антикоагулянтов не коррелировали с уровнями антител против других фосфолипидов1-170-1. Анализ большого числа сывороток, взятых у беременных с токсикозами, показал, что среди пациенток с положительным результатом анализа на антитело против кардиолипина, 28,6% имели также положительный результат анализа на антитело против фосфатидилсерина и антитело против фосфатидилинозита; 23,8% из этих пациенток имели положительный результат анализа на антитело против фосфатидилинозита, а 19% имели положительный результат анализа на антитело против фосфатидилэтаноламина. При этом наибольший процент приходился на женщин, у которых обнаруживались антитела 1дМ против кардиолипина (171).
В аналогичных исследованиях с участием пациентов с СКВ, наиболее высокий % реактивности пациентов наблюдался у пациентов с антителами против кардиолипина, а после них следовали пациенты с антителами против фосфатидилсерина, против фосфатидиновой кислоты и против фосфатидилинозита(172). Было обнаружено, что реактивность по отношению к последнему фосфолипиду преобладала в группе из 77 пациентов в возрасте 51 год, страдающих сердечно-сосудистым заболеванием неясной этиологии, но не страдающих СКВ(173).
Проводимые в течение 10 лет наблюдения 39 пациентов, страдающих первичным антифосфолипидным синдромом, и не страдающих СКВ или другими заболеваниями соединительных тканей, выявили, что у 15 из этих пациентов, через 10 лет наблюдалось поражение органов. У восьми из этих пациентов развивался гемипарез, а у 3 пациентов наблюдалась деменция; причем у каждого из этих пациентов наблюдалось одно из таких нарушений, как квадриплегия, застойная кардиомиопатия, инфаркт миокарда, инфаркт легких и почечное заболевание на конечной стадии(174).
Глютеновая болезнь
Глютеновая болезнь без симптомов или с клиническими симптомами обычно ассоциируется с диабетом типа I. В надавно проведенных исследованиях было обнаружено, что глютеновая болезнь встречается у 5,7% больных с диабетом, и у 1,9% среди их родственников1-175-1.
Высокий уровень заболеваемости глютеновой болезнью в субклинической или бессимптомной форме также наблюдался у пациентов с желудочно-кишечными расстройствами неясной этиологии или не поддающимися лечению; при этом было показано, что из 108 таких пациентов, 42,8% имели субклиническую или бессимптомную форму глютеновой болезни1-176-1.
Экстраинтестинальными признаками субклинической формы глютеновой болезни является железодефицитная анемия (27%-, алопеция и герпетиформный дерматит (11,3%- и ИЗСД (20%-. При этом сообщалось, что у больных с диабетом и у их родственников первой степени родства часто наблюдаются повышенные уровни антитела, ассоциированные с глютеновой болезнью(177-. В отсутствии глютеновой болезни, преобладание антител против трансглутаминазы наблюдалось у 13,4% пациентов с диабетом и у 7% их родственников, не страдающих диабетом; причем у 3,5% из 913 родственников были обнаружены антитела 1дС против трансглутаминазы, а у 44% из них обнаруживались эндомизиальные антитела 1дА(177-. Аналогичным образом, у пациентов с глютеновой болезнью наблюдался повышенный уровень антител, ассоциированных с диабетом. Из обследованных 15 детей с глютеновой болезнью, у 27% были
- 27 015629 обнаружены антитела против инсулина, и у 20% из них глютеновое заболевание развивалось после приема пищи, не содержащей глютен(178). У 23% пациентов с глютеновой болезнью также присутствовали антитела против фермента (глутаминовая кислота)декарбоксилаза(179).
Малабсорбция является главным признаком глютеновой болезни. Молекулой, которая может быть ответственна за дефицит железа при глютеновой болезни, является меланотрансферрин (р97), который представляет собой железосвязывающий мембранный гликопротеин, имеющий 40%-ную гомологию с трансферрином. Эта молекула является СΡI-заякоренной и имеет апикальное распределение в эпителиальных клетках тонкого кишечника(180). Муцинсвязывающий белок, являющийся другой СΡI-заякоренной молекулой, представляет собой общий компонент апикального желудочно-кишечного эндотелия слизистой, образующего защитный барьер(181). За нарушение регуляции этой молекулы и подобных ей молекул ответственны антитела, которые распознают эпитопы с СΡI-якорем и которые могут влиять на связывание с муцином и разрушать указанный защитный барьер, что приводит к разрушению слизистой желудочно-кишечного тракта и к интолерантности к глиадиновым пептидам у генетически восприимчивых индивидуумов.
Гастрит
При диабете типа Ι, который может сопровождаться аутоиммунным желудочным заболеванием, наблюдается высокий уровень антител против париетальных клеток желудка (ΡСА)(182,183). Париетальные клетки имеют на своей поверхности СΡI-заякоренные молекулы(184), а поэтому в развитии такого состояния могут участвовать антитела, распознающие эпитопы с СΡI-якорем.
Воспалительное заболевание кишечника
Хроническое воспалительное заболевание кишечника представляет собой парадоксальное состояние, при котором у пациента в течение нескольких лет наблюдается замедление роста в присутствии избыточного количества гормонов роста, после чего происходит нарушение секреции, что приводит к развитию симптомов заболевания брюшной полости(185). Окисление липидов натощак и после приема пищи наблюдается гораздо чаще у пациентов с активной формой болезни Крона, чем у пациентов с неактивным заболеванием(186). У таких пациентов также наблюдается значительно более высокий уровень продуцирования кетоновых телец(187). В исследованиях по эугликемической агглютинации при гиперинсулинемии было также показано, что у пациентов с болезнью Крона общий уровень утилизации глюкозы в организме выше, чем у нормальных индивидуумов контрольной группы(188). Однако по мере окисления глюкозы у этих пациентов артериальные концентрации были на 10% ниже, чем у индивидуумов контрольной группы (186,187).
Метаболический профиль повышенного уровня окисления жиров и продуцирования кетоновых телец, очевидно, регулируется глюкагоном. Дислипидемия, характеризующаяся низкими уровнями холестерина ЛНП и высокими уровнями триглицеридов в плазме, также хорошо описана в литературе(189) и по своему характеру аналогична состояниям гиперинсулинемии и инсулинорезистентности. У животных, а именно у крыс ВВ с моделью диабета и у собак с моделью глютеновой болезни, перед началом развития заболевания также наблюдалась повышенная проницаемость тонкого кишечника149'0' Повышенная проницаемость тонкого кишечника также наблюдалась у пациентов с болезнью Крона и их родственников, не страдающих этим заболеванием(191). Кроме того, у пациентов с высоким риском развития болезни Крона наблюдается повышенная фоновая проницаемость или увеличение проницаемости кишечника в ответ на воздействие вредных факторов(192).
СΡI-заякоренные молекулы с функциями, направленными на сохранение целостности тканей и структуры, в избытке присутствуют в ткани желудочно-кишечного тракта. Это было продемонстрировано высокой степенью окрашивания кишечных срезов моноклональным антителом против анти-ТСК-νβантител. СΡI-заякоренной молекулой в эпителии тонкого кишечника(193) и в клетках гладких мышц является Т-кадгерин, который представляет собой адгезивную молекулу, связывающуюся с ЛНП(194). Ткадгерин также является негативным регулятором роста клеток гладкой мышцы(195). Потеря хромосомного сегмента, содержащего ген Т-кадгерина коррелирует с развитием рака, а трансфекция опухолевых клеток к ДНК Т-кадгерина приводит к снижению пролиферативной активности и к потере восприимчивости клеток к действию факторов роста(196). Другой СΡI-заякоренной молекулой 0С.Ч-5 является гепарансульфатный протеогликан, родственный глипикану и цереброгликану(197). Гепарансульфатные протеогликаны связываются с ламинином. Частичный протеолиз цереброгликана приводит к более, чем 400кратному снижению аффинности связывания с ламинином(198). Связывание аутоантител с СΡIэлементами таких молекул, может, как предполагается, разрушать эпителиальный барьер и повышать проницаемость тонкой кишки, что, вероятно, является необходимым условием для развития данного заболевания.
Утолщение кишечной стенки, а в частности слизистой оболочки мышцы кишечника, является признаком активной формы болезни Крона(199). Нарушение регуляции вышеупомянутых СΡI-заякоренных молекул, помимо прочих молекул, которые экспрессируются в кишечнике, можно объяснить повышенной проницаемостью, пролиферацией гладких мышц, утолщением стенок кишечника и усилением синтеза коллагена клетками гладких мышц(200).
Воспалительное заболевание кишечника, язвенный колит и болезнь Крона ассоциируются с повы
- 28 015629 шенным риском венозного и артериального тромбоза. При обследовании 83 пациентов с язвенным колитом и 45 пациентов с болезнью Крона по сравнению с 100 индивидуумами контрольной группы было обнаружено, что у данных пациентов по сравнению со здоровыми индивидуумами контрольной группы наблюдался более высокий уровень антител против кардиолипина(201). В аналогичных исследованиях, в которых участвовали 137 пациентов и 137 индивидуумов контрольной группы, у обследуемых пациентов с болезнью Крона и с язвенным колитом, по сравнению с индивидуумами контрольной группы, наблю(202) далось значительное увеличение титров антител против кардиолинина .
Артриты и родственные заболевания
Ревматоидный артрит (РА) представляет собой прогрессирующее хроническое воспалительное заболевание, поражающее синовиальные соединения и приводящее к разрушению сустава. Синовиальная оболочка, состоящая обычно только из 2-3 клеточных слоев макрофагов и фибробласт-подобных клеток, подвергается гиперплазии с одновременным развитием ангиогенеза и увеличением локальной инвазивной активности в синовиальной оболочке на границе между хрящем и костью. Повышенная смертность пациентов с РА ассоциируется с ускоренным развитием атеросклероза и сердечно-сосудистым заболеванием.
Этиологическими факторами, осложняющими течение РА, также являются многие инфекционные (54) агенты .
У пациентов с РА и родственными заболеваниями, такими как системная красная волчанка, системный склероз и подагра, наблюдается инсулинорезистентность и нарушение толераности к глюкозе(203,204). В исследованиях по эугликемической аглютинации у пациентов с артритом, имеющих нормальный вес и ранее не подвергавшихся лечению, наблюдались усиление инсулинового ответа и снижение скорости утилизации глюкозы по сравнению с индивидуумами контрольной группы(205). Поэтому гиперинсулинемия и инсулинорезистентность являются патогенными признаками заболеваний этой группы.
При проведении внутривенного теста на толерантность к глюкозе, в котором участвовали 45 пациентов с активной формой РА, ранее не подвергавшихся лечению, было обнаружено, что у этих пациентов, по сравнению с индивидуумами контрольной группы, уровни глюкагона в плазме значительно снижались, что указывает на нарушение функций регуляторных гормонов протитивоположного действия(206).
В пероральных тестах на толерантность к глюкозе (0СТТ), проводимых с участием 14 пациентов с активной формой анкилозирующего спондилита (АС), было обнаружено, что у этих пациентов, по сравнению с индивидуумами контрольной группы, наблюдались значительно более высокие уровни инсулина, измеренные по площади под кривой, построенной по результатам теста 0СТТ(207). Как при РА, так и при спондилоартропатиях инсулинорезистентность коррелировала с дислипидемией(208).
О существовании общего этиологического фактора, ответственного за развитие РА и других аутоиммунных расстройств, также свидетельствует присутствие антител против антигена островковых клеток 69 ЦСА69) у 31% пациентов с РА, тогда как эти антитела были обнаружены лишь у 6% здоровых доноров(209), а антитела против тироглобулина присутствовали у большинства детей с ювенильным хроническим артритом и СКВ(210).
Пролиферация клеток синовиальной оболочки, сопровождаемая ангиогенезом, является ключевым фактором в образовании паннуса и эрозии кости при артрите. Урокиназный активатор плазминогена (иРА) и связанный с иРА поверхностный рецептор иРАК играет важную роль в деградации матрикса и ремоделировании ткани. иРА, связанный со своим рецептором иРАК, катализирует образование протеолитического фермента плазмина из плазминогена и направляет его на клеточную поверхность(211). Плазминоген опосредует протеолиз белков внеклеточного матрикса, что облегчает клеточную инвазию. Рецептор урокиназного активатора плазминогена представляет собой СРЕзаякоренную молекулу и является лигандом для интегринов. Взаимодействие иРАК с интегрином обеспечивает передачу сигналов пролиферации или миграции клеток после связывания с иРА(212). Урокиназа обладает способностью отщеплять его рецептор и, тем самым, инактивировать его способность связываться с иРА и с витронектином. Однако такое отщепление происходит только в том случае, когда СРЕякорь иРАК является интактным, даже если сайт расщепления находится между 1 и 2 доменами данной молекулы, а СРЕякорь находится в 3 домене (213). Интактный рецептор урокиназы также необходим для эффективного связывания с интегрином витронектином(214). ανβ3 и другие рецепторы витронектина участвуют в ангиогенезе, в клеточной адгезии и в миграции клеток, а следовательно, и в образовании паннуса(215). В нормальных условиях расщепление иРАК под действием иРА должно приводить к нарушению регуляции связывания иРА с его рецептором и связывания иРАК с витронектином и РАЕ1, и, тем самым, к снижению уровня продуцирования плазмина под действием иРА и передачи сигналов пролиферации и ангиогенеза посредством рецепторов витронектина и РАЕ1. Такое изменение аффинности связывания иРА с иРАК может приводить к делипидизации СРЕякоря. Антитела против пептидов иРАК в линкерной области СРЕякоря распознают только СРЕзаякоренный, но не растворимый иРАК. Эти и аналогичные изменения антигенных свойств других СРЕзаякоренных молекул, таких как Тйу-1, Ьу-6 и карциноэмбриональный антиген, также были отнесены за счет конформационных изменений(213). В настоящем изобретении было высказано предположение, что антитела против СРЕзаякоренных элементов могут значительно изменять конфор
- 29 015629 мацию таких молекул, а также их реактивность со специфическими цис- и транс-действующими лигандами, как это было показано для взаимодействий иРАЯ с иРА и витронектином, и, тем самым, вызывать аутоиммунные заболевания, рак и ангиогенные заболевания, такие как эндометриоз.
иРАЯ стимулирует клеточную адгезию посредством взаимодействия с витронектином и, тем самым, облегчает миграцию и инвазию клеток посредством транспорта иРА к клеточной поверхности1-213-1. Баланс между клеточной адгезией и миграцией регулируется РА1-1, который связывается с тем же сайтом на витронектине, с которым связывается иРАЯ(216). РА1-1, помимо своей функции как ингибитора протеазы, играет главную роль в разрастании капилляров в процессе ангиогенеза(217).
В этой системе и при состояниях инсулинорезистентности или интолерантности к глюкозе определенную роль играет гиперинсулинемия и гипергликемия и было показано, что инсулин и гипергликемия способствуют увеличению уровня транскрипции гена РА1-1; причем инсулин также стимулирует продуцирование метоллопротеиназ матрикса, таких как ММР-1. Они продуцируются фибробластподобными (54) синовиоцитами и участвуют в ремоделировании и деструкции внеклеточного матрикса .
Астма
В последних исследованиях финских ученых были проведены сравнения общей заболеваемости астмой у детей с глютеновой болезнью, ревматоидным артритом (РА) и ИЗСД в течение первых 7 лет жизни. Было обнаружено, что астма чаще всего встречается у детей с глютеновой болезнью, РА и ИЗСД, чем у детей, не страдающих такими заболеваниями(218). В недавно опубликованных исследованиях, в которых проводилось сравнение результатов анализа 23 опубликованных геномов, ассоциированных с аутоиммунными или иммуноопосредованными заболеваниями, было продемонстрировано, что на генетической карте, из позитивно сцепленных генов, ассоциированных с этими заболеваниями, приблизительно 65% неслучайным образом распределены по 18 отдельным кластерам(219). Ряд генов, ответственных за развитие астмы, ИЗСД и глютеновой болезни, составляют небольшой кластер, который также включает в себя и другие гены, вызывающих аутоиммунные заболевания(220).
Пациенты с астмой страдают от повышенного бронхостеноза и подвержены воздействию факторов окружающей среды, и кроме того, у астматиков наблюдается более высокий тонус дыхательных путей в состоянии покоя, чем у здоровых индивидуумов. Тонус дыхательных путей в состоянии покоя и бронхостеноз регулируются ацетилхолином, высвобождаемым из блуждающих нервов легких, посредством стимуляции мускариновых рецепторов М3, присутствующих на клетках гладких мышц дыхательных путей, с последующим сокращением этих мышц. Ацетилхолин также стимулирует петлю отрицательной обратной связи посредством мускариновых рецепторов М2, присутствующих на постганглионарных нейронах, что предотвращает последующее высвобождение ацетилхолина(221).
Было продемонстрировано, что усиление бронхостеноза у больных астмой, опосредованное блуждающим нервом, вызывается нарушением функции мускаринового рецептора М2. Роль инсулина в индуцировании такого нарушения была тщательно исследована путем оценки ответного бронхостеноза у животных с диабетом и у животных с диабетом, подвергаемых лечению инсулином(222). Животные с диабетом, не подвергавшиеся лечению, у которых наблюдалась пониженная чувствительность к раздражителям, вызывающим бронхостеноз, становились сверхчувствительными к этим раздражителям после введения им инсулина. Такая гипочувствительность ассоциировалась с пониженным уровнем аккумуляции воспалительных клеток (эозинофилов) в бронхах, а также в нервной ткани у животных с диабетом. Лечение инсулином приводило к восстановлению потока эозинофилов и к гиперчувствительности. Утрата функции мускариновых рецепторов М2 на нейронах обусловлена действием крупного основного эозинофильного белка, который связывается с рецепторами М2 посредством электростатических взаимодействий. Таким образом, очевидно, что инсулин играет важную роль в развитии воспаления дыхательных путей. Гиперинсулинемия также приводит к повышению тонуса дыхательных путей в состоянии покоя у пациентов с астмой, что может быть обусловлено повышенными остаточными уровнями ацетилхолина, поскольку инсулин, вводимый в головной мозг крыс, вызывает заметное увеличение уровней ацетилхолина(98).
Гистопатологический анализ показал, что в развитии хронической астмы важную роль играет гиперплазия гладкой мышцы дыхательных путей(223). Такое заболевание сопровождается увеличением уровня коллагена, секретируемого клетками гладких мышц, и очень напоминает гиперплазию клеток гладких мышц и утолщение стенок кишечника при болезни Крона(200). Следовательно, СР1-заякоренная молекула Т-кадгерина, ингибирующая адгезию и пролиферацию клеток и присутствующая на клетках гладких мышц, действует по такому же пути, как и путь развития обсуждаемой выше болезни Крона.
Механизмы, в которых участвуют ЮР и ЮРВР, вызывающие болезнь Крона, также приводят к ингибированию ЮРВР. Инсулин индуцирует ингибирование продуцирования ЮРВР-1 в культивированных клетках человеческого яичника. Следовательно, нарушение регуляции секреции инсулина будет аналогичным образом приводить к ингибированию уровней ЮРВР в клетках гладких мышц дыхательных путей, и, тем самым, к увеличению биологической доступности свободного ЮР, стимулирующего пролиферацию клеток гладких мышц.
- 30 015629
Кистозный фиброз
Кистозный фиброз (КФ) представляет собой заболевание, поражающее респираторную, пищеварительную, эндокринную и репродуктивную системы. В манифестации заболеваний, таких как первичная хроническая обструктивная болезнь легких, фиброз печени, сахарный диабет, холелитиаз и артрит, определенную роль могут играть различные мутации. Главной патологией при КФ является нарушение регуляции транспорта ионов посредством кистозно-фиброзного регулятора трансмембранной проводимости (СРТК), который представляет собой белок, ответственный за трансэпителиальный транспорт хлорида, опосредуемый циклическим АМР, в апикальные мембраны секреторного эпителия(224). Недостаточная функция СРТК при КФ приводит к сверхэкспрессии муцина по механизму действия тирозинкиназы-8гс, который обеспечивает взаимосвязь образования СРТР-канала со сверхэкспрессией гена МИС 1(225). Нарушение высвобождения хлорида вызывает обезвоживание выстилки дыхательных путей (и слизистой тонкого кишечника), что приводит к образованию вязкой слизи, закупоривающей дыхательные пути.
Организация актинового цитоскелета играет решающую роль в функционировании молекул СРТК. Было показано, что частичная дизрупция актинового цитоскелета под действием цитохалазина Ό индуцирует активацию СРТК(226). Анализ, проводимый с помощью атомно-силовой микроскопии, показал, что актиновые филаменты непосредственно ассоциированы с молекулами СРТК(227).
Очевидно, что на физиологическую регуляцию актинового цитоскелета, с точки зрения подвижности и адгезии клеток, в значительной степени влияет экспрессия рецептора урокиназного активатора плазминогена (иРАК). Для этого требуется связывание иРАК с витронектином, которое инициирует передачу сигнала по р130Сак/Кас-зависимому пути(228). Взаимодействие иРАК со структурами, ассоциированными с цитоскелетом, такими как интегрины и небольшие ГТФазы К1о семейства К1о, Кас и С0с4/, приводит к регуляции актинового цитоскелета, участвующего в сборке стресс-волокна, ламеллоподий, микроворсинок и филоподий.
Связывание иРАК с иРА и витронектином требует целостности полноразмерного рецептора, а в частности, его СРРякоря, даже если связывание с витронектином происходит через его домен Ό1(213).
иРАК и другие СРРзаякоренные молекулы, которые, как было показано, ассоциируются с актиновой сетчатой структурой(229), могут быть ответственны за сохранение цитоскелета для оптимального функционирования СРТК. Связывание антител согласно изобретению с эпитопами СРРякоря может приводить к значительному нарушению организации цитоскелета и, тем самым, к дополнительному нарушению функций генетически модифицированной молекулы СРТК.
Экспрессия иРАК в эпителиальных клетках легких и нарушение его регуляции посредством иРА, а также участие этой системы в ремоделировании воспалительных тканей легких после повреждения и неоплазии легких описана в литературе(230). Кроме того, считается, что иРАК играет определенную роль в рекрутинге нейтрофилов в ответ на инфицирование бактерией Ркеийотопак аегидтока. При кистозном фиброзе Р. аегидтока образует устойчивые колонии в легких и вызывает ослабление легочной функции, приводящее к летальному исходу. Недавно было продемонстрировано, что у мышей, дефицитных по иРАК (иРАК-/-), в отличие от мышей дикого типа, наблюдается значительное снижение уровня рекрутинга нейтрофилов в ответ на Р. аегидтока. Рекрутинг нейтрофилов у мышей дикого типа зависит от механизма, регулируемого интегрином р2(231). Поэтому можно предположить, что иРАК, модифицированный анти-СРI антителом, может значительно нарушать способность нейтрофилов к рекрутингу, опосредуемому интегрином β2.
Патологии легких при кистозном фиброзе осложняются недостаточным удалением апоптотических воспалительных клеток. Мокрота, взятая у пациентов с бронхоэктазом, страдающих КФ, и у пациентов с бронхоэктазом, не страдающих КФ, содержит избыточное количество апоптотических клеток, что дает (232) основание предполагать о нарушении нормальных механизмов удаления апоптотических клеток .
СРРзаякоренный гликопротеин СО 14, присутствующий на поверхности макрофагов, опосредует узнавание и клиренс апоптотических клеток(233). Удаление апоптотических клеток, приводящее к прекращению воспаления, играет решающую роль в формировании нормальной структуры и функции тканей. Апоптотические клетки подвергаются поверхностным изменениям, которые открывают доступ к фосфатидилсерину, который является важным поверхностным маркером, распознаваемым фагоцитарными макрофагами(234). Распознавание фосфатидилсерина на апоптотических клетках и распознавание фасфатидилинозита приводит к их интернализации посредством СРРякоря СЭ14. Бактериальный липополисахарид (ЛПС) также связывается с тем же сайтом, с которым связывается фосфолипид, или с сайтом, расположенным возле этого сайта(235). Сами макрофаги могут подвергаться апоптозу, который происходит перед ингибированием СО14(236). Поэтому антитела против элементов СРРякоря могут нарушать регуляцию фагоцитоза апоптотических клеток посредством блокирования сайтов узнавания и интернализации апоптотических клеток и могут также ингибировать СО 14. Эти механизмы могут приводить к серьезному нарушению функции очень важного компонента системы фагоцитоза. Нейтрофилы также участвуют в фагоцитозе и мигрируют в участки воспаления в ответ на хемотаксические раздражители. А СРРзаякоренная молекула, моно-АДФ-рибозил-трансфераза, была идентифицирована на поверхности нейтрофилов, и эта молекула участвует в пути передачи сигнала. Такая молекула также участвует в реконструкции цитоскелета в процессе хемотаксиса(237). СРРякорь участвует в связывании СР!
- 31 015629 заякоренных молекул с актином. Поэтому модифицированные антителом ОР1-заякоренные молекулы не могут эффективно функционировать как регуляторы хемотаксиса.
Кистозный фиброз ассоциируется к экзокринной и эндокринной дисфункцией поджелудочной железы. Экзокринная дисфункция ацинарных клеток у СЕТИ (-/-) -мышей ассоциируется с нарушением эндоцитоза в апикальной плазматической мембране ацинарных клеток поджелудочной железы. Этот процесс связан с секрецией бикарбоната из протоков в просвет. Эндоцитоз ассоциируется с расщеплением СР-2. ОР1-заякоренным белком на поверхности ацинарных клеткок, которые непосредственно связаны с активацией эндоцитоза. У СЕТИ (-/-)-мышей наблюдается пониженный уровень расщепления ОР-2(238). Это указывает на то, что нарушение регуляции ОР-2, вызванное анти-СР1 антителами и/или блокированием сайтов расщепления ОР1, может приводить к нарушению эндоцитоза, как это наблюдается при кистозном фиброзе.
У пациентов с КФ и эндокринной недостаточностью первая фаза С-пептидного ответа на внутривенное введение глюкозы значительно подавляется. У этих пациентов также наблюдается пониженная функция α-клеток, измеренная по пику секреции глюкагона в ответ на гипогликемию(239). У пациентов с КФ, по сравнению с контрольной группой, наблюдается снижение чувствительности к инсулину, а также снижение толерантности к глюкозе, наблюдаемой при диабете(240).
Хотя болезни легких являются главной причиной заболеваемости КФ и смертности от КФ, однако тяжесть этого заболевания не всегда можно предсказать по СЕТК-фенотипу. Продолжительные исследования всех больных с КФ в возрасте свыше 7 лет, проводимых в Швеции в целях установления корреляции генетических и клинических показателей с уровнем снижения функции легких, показали, что одновременное развитие сахарного диабета у пациентов с КФ чаще всего коррелирует с быстрым нарушением функции легких, чем с колонизацией Ркеиботоиак и недостаточностью поджелудочной железы(241). Было также показано, что отсутствие мутаций или большое число мутаций приводят к прекращению продуцирования СЕТК, что коррелирует с экзокринной недостаточностью поджелудочной железы, и в меньшей степени с тяжестью заболевания легких. У части пациентов КФ не была диагностирована до возраста 10-15 лет. Пациенты постарше, страдающие легкой формой заболевания легких, включая бронхоэктаз могли не иметь симптомов заболевания типа КФ, однако исследования показали, что у этих пациентов присутствовали мутации СЕТК(242). Кроме того, стало очевидным, что респираторные симптомы и воспаление необязательно коррелируют с легочной инфекцией(243). Было показано, что бронхопатология при КФ, обнаруженная с помощью компьютерной томографии высокого разрешения, и коррелирующая с легочной функцией, не коррелирует с цитологической картиной мокроты и присутствием воспали(244) тельных маркеров .
Полученные результаты продемонстрировали, что при КФ легочные патологии прогрессируют, и хотя они осложняются легочными инфекциями, однако зависимости таких патологий не было установлено. Патологии поджелудочной железы, а в частности, сахарный диабет являются наиболее серьезным предвестником серьезного нарушения легочной функции. Артропатии также одновременно развиваются при КФ, при этом, функция легких и инфекции не коррелируют с наличием артрита(245). Авторами настоящего изобретения было высказано предположение, что мутации СЕТК сообщают пациентам с КФ значительную восприимчивость к воздействию антител против эпитопов ОР1-якоря, которые вызывают воспаление легких и патологии других органов, включая сахарный диабет, который часто наблюдается при КФ.
Остеопороз и остеопения
Инсулин и инсулиноподобные факторы роста оказывают влияние на метаболизм костной ткани. При диабете наблюдается снижение остеогенеза, что может быть вызвано остеопенией, а также микроангиопатиеи в костной ткани(246,247). Повышенная активность остеокластов ответственна за усиление деструкции кости при остеопорозе, развитие болезни Педжета, метастазов в кости и злокачесвтенной гиперкальциемии. Было показано, что ОР1-заякоренная молекула, остеокласт-ингибирующий пептид-1 (О1Р-1), выделенная из остеокласт-подобных многоядерных клеток, ингибирует активность остеокластов(248). Предполагается, что антитела согласно изобретению нарушают регуляцию секреции инсулина и блокируют действие О1Р-1 или аналогичных молекул, что приводит к снижению уровня остеогенеза и к повышению активности остеокластов.
Плоский лишай и лейкоплакия
В нескольких исследованиях было показано, что у 42% пациентов, страдающих активной формой плоского лишая, но не имеющих диабета в семейном анамнезе, наблюдается нарушение толерантности к глюкозе. У этих пациентов наблюдалось вырабатывание инсулина в ответ на глюкозу, что типично для легкой формы диабета типа 2(249,250).
Лейкоплакия полости рта также ассоциируется с нарушением метаболизма глюкозы. Это заболевание чаще встречается у больных диабетом, чем у индивидуумов контрольной группы(251). Другими менее распространенными манифестациями, наблюдаемыми в полости рта пациентов с ранее не диагностированным диабетом, являются синдром жжения во рту, грибковые и бактериальные инфекции, изменения вкусовых ощущуний, сиалоз и сиалорея, которые обычно ослабляются при лечении, применяемом для нормализации уровня глюкозы в крови(252).
- 32 015629
Анемия
Апластическая анемия ассоциируется с гиперинсулинемией и инсулинорезистентностью. Из обследованных 29 пациентов, 14 пациентов, ранее проходивших лечение, имели нормальную толерантность к глюкозе, 8 пациентов имели нарушенную толерантность к глюкозе, причем 6 из этих пациентов имели диабет, а 7 пациентов с недавно диагностированным указанным заболеванием имели нормальную толерантность к глюкозе. У всех этих пациентов наблюдалась инсулинорезистентность и гиперинсулинемия. Пациенты с нарушенной толерантностью к глюкозе имели пониженный уровень секреции инсулина, что указывало на снижение аккумуляции инсулина в в-клетках(253).
Из 26 пациентов с апластической анемией у 5 пациентов обнаруживалось отсутствие СР1заякоренного белка на тромбоцитах и эритроцитах, а у 10 пациентов обнаруживалось отсутствие СР1 на полиморфонуклеарных клетках(254).
Другие типы анемии ассоциировались с явным диабетом. У пятнадцати пациентов, имеющих диабет типа 1 и серьезные его осложнения, то есть, нефропатию, нейропатию, ортостатическую гипотензию, и т. п., в отличие от пациентов, не страдающих такими осложениями, наблюдалась анемия. Эти данные не выявили другой причины анемии, кроме истощения эритропоэтина(255). При диабете в отсутствии тяжелой нефропатии наблюдалось аналогичное снижение чувствительности к эритропоэтину, приводящее к развитию анемии, которая отмечалась у 28 индивидуумов и имела неясную этиологию(256).
СР1-заякоренной молекулой, которая может играть определенную роль в развитии анемии неясной этиологии у индивидуумов с инсулинорезистентностью или с диабетом, является фолатный рецептор. Фолатный рецептор подвергается интернализации и рециклу в процессе транспорта фолата(257).
Однако антитела против элементов СР1-якоря могут значительно затруднять транспорт фолата. Фолат вместе с кобаламином участвует в совместных реакциях, которые обеспечивают доступ к метильным группам, необходимым для конверсии дезоксиуриидилата в дезокситимидилат при синтезе ДНК, требуемой для эритропоэза. Эти реакции могут быть прекращены из-за недостаточного поступления фолата в развивающиеся эритроциты.
Ночная пароксизмальная гемоглобинурия
Известно, что ночная пароксизмальная гемоглобинурия (НПГ) возникает в результате дефицита ингибиторов СР1-заякоренного комплемента, СЭ55 и СЭ59, которые сообщают эритроцитам предрасположенность к лизису. Дефицит этих ингибиторов на эритроцитах и лейкоцитах, а также на большей части популяции тромбоцитов(258), обусловлен мутацией гена (Р1С-А), продукт которого гликозилтрансфераза, участвует в первой стадии биосинтеза СР1-якоря(259). Причина преимущественного роста СР1дефицитного клона пока еще не выяснена.
Было продемонстрировано, что Сатрай-1Н может служить для отбора клеток, которые являются дефицитными по СР1-заякоренной молекуле СО52(260). В настоящей заявке было высказано предположение, что присутствие антител против элементов СР1-якоря может аналогичным образом служить для отбора СР1-дефицитных клонов при НПГ. Однако дефектом гена Р1С-А может быть приобретенная соматическая мутация(261). Действительно, у 3 пациентов с НПГ был обнаружен ряд мутаций в генах Р1С-А, причем у 2 из этих пациентов были обнаружены различные нарушения функций гранулоцитов и эритробластов(262). Поэтому возможно, что длительное присутствие аутоантител против элементов СР1-якоря приводит к соматическим изменениям уровней гемопоэтических стволовых клеток.
Был описан случай быстро прогрессирующей гемолитической анемии и тромбоцитопении у мужчины 38 лет, который 12 лет наблюдался по поводу ИНСД. Кроме диабета другие причины возникновения микроангиопатической анемии отсутствовали. У этого пациента был также обнаружен волчаночный антикоагулянт и антитела 1дС против фосфолипида. Гемодиализ приводил к спонтанному улучшению состояния при гемолизе и тромбоцитопении(262). По всей вероятности, гемодиализ приводит к выведению патогенных анти-СР1 антител, а также антител, описанных в данном исследовании.
Апноэ во сне
Нарушение дыхания во сне является распространенным явлением, которое может вызывать у индивидуумов нарушение дневного ритма жизни и метаболических нарушений. При обследовании 150 здоровых мужчин, не страдающих диабетом или сердечно-легочными заболеваниями, случаи апноэ во сне составляют 40-60% в зависимости от предельной величины индекса апноэ-гипопноэ (АН1). Тяжесть этих состояний коррелируют с нарушенной или с диабетической толерантностью к глюкозе. Увеличение АН1 также ассоциируется с ухудшением инсулинорезистентности независимо от наличия ожирения(263). В других исследованиях, проводимых с участием 270 индивидуумов, у которых не был диагностирован сахарный диабет, было высказано мнение, что 185 из них имели апноэ во сне. Была установлена явная зависимость случаев апноэ во сне с инсулинорезистентностью как у индивидуумов с ожирением, так и у индивидуумов, не страдающих ожирением. Другие анализы по взаимосвязи между инсулинорезистентностью и гипертензией у этих индивидуумов подтвердили, что такая взаимосвязь действительно существует.
Бессоница
Нарушением сна страдают как молодые, так и пожилые люди. Люди, страдающие таким расстройством, плохо засыпают, часто просыпаются во сне и просыпаются рано утром. Было показано, что гор
- 33 015629 мон шишковидного тела, мелатонина, который секретируется у человека только ночью, вызывает дневную сонливость при его введении в дозе, которая обычно вырабатывается ночью. Было показано, что уровень мелатонина снижается у пожилых людей, а его коррекция до физиологических уровней способствует восстановлению сна (265).
Секреция мелатонина регулируется сигналами, поступающими из нейронов верхнего шейного узла, которые обеспечивают синаптический контакт с шиковидным телом и индуцирует высвобождение норадреналина из везикул. Норадреналин стимулирует синтез мелатонина посредством образования сАМР(266). сАМР действует на предпоследний фермент пути синтеза мелатонина, то есть пути арилалкиламин-М-ацетилтрансферазы (ЛАТ) (267). Таким ферментом является полиморфный фермент, характер мутации которого влияет на метаболизм лекарственных средств и сообщает повышенную восприимчи(268,271) вость к некоторым видам рака, к пищевым аллергиям и к другим состояниям .
На секрецию норадреналина влияют концентрации инсулина в плазме. Индуцирование базальной гиперинсулинемии и усиления инсулинового ответа на глюкозу посредством введения липидов здоровым волонтерам приводило к значительному снижению уровней норадреналина в плазме, по сравнению с уровнями, наблюдаемыми у индивидуумов контрольной группы(272).
Поэтому предполагается, что состояние гиперинсулинемии, обусловленное физиологическими причинами, такими как инсулинорезистентность, коррелирует с пониженными уровнями норадреналина в плазме. Пациенты с диабетом, по сравнению с пациентами, не страдающими диабетом, имели более низкие уровни норадреналина во время декомпенсированной сердечной недостаточности(273). У пациентов с диабетом типа Ι, диагностированным лишь год назад, наблюдалась 50% снижение норадреналинового ответа на гипогликемию.
Вышеописанное обследование людей пожилого возраста дает основание предположить, что возрастное снижение уровня секреции мелатонина может быть ассоциировано с гиперинсулинемией, что обусловлено повышением интолерантности к глюкозе и инсулинорезистентностью(275). Считается, что возрастное снижение уровня продуцирования мелатонина шишковидного тела обусловлено дегенеративными изменениями в иннервации серотонергических и норадренергических нейронов в шишковидном теле, а не дегенерацией ткани шишковидного тела(276). Это соответствует недостататочности норадреналина, вызываемой изменениями метаболизма глюкозы у людей пожилого возраста.
Другим фактором, который нарушает регуляцию сна, является белок прион (ΡγΡ). ΡγΡ представляет собой ΟΡΙ-заякоренный гликопротеин(277). Этот белок присутствует в ткани головного мозга и в тканях других органов и имеет высокий уровень синаптического распределения, что указывает на его важную роль в функционировании нейронов, причем, такой белок был также обнаружен на поверхности разветвляющихся аксонов(278,279). Нормальный белок связывает медь и образует комплекс, обладающий противоокислительной активностью(281). Известно, что белок прион вызывает нейродегенеративные заболевания, включая злокачественную наследственную бессоницу, при которой происходят значительные изменения уровней многих гормонов, ответственных за ритмы сна и бодрствования(281). У мышей, дефицитных по белку приону, было обнаружено изменение уровней мелатонина, а также и наблюдалось прерывание сна, и почти в два раза большее число коротких эпизодов пробуждения, что указывало на роль этого белка в регуляции сна(282,283).
Антитела согласно изобретению могут эффективно предотвращать нарушение сна и патологические индуцированные прионом состояния посредством изменения метаболизма глюкозы и его влияния на секрецию норадреналина и мелатонина, а также посредством воздействия на белок прион, а именно на его способность связываться с ΟΡΙ-якорем. Кроме того, эти антитела распознают секретогранин 1 и хромогранин В, который являются компонентом везикул, содержащих норадреналин(284). Это может также приводить к нарушению регуляции секреции норадреналина.
Рак
Известно, что многие виды рака, включая рак молочной железы, рак толстой кишки, рак желудочно-кишечного тракта, саркомы, рак матки, рак предстательной железы, рак головы и шеи и рак легких, ассоциируются с гиперинсулинемией, интолорантностью к глюкозе, инсулинорезистентностью и повышенным уровнем продуцирования глюкозы в печени (285,289). Проводимые в 1992 г. обсследования 223 женщин с раком молочной железы на стадии 1 или 2, показали, что у этих женщин, в отличие от 441 женщины контрольной группы, наблюдались значительно более высокие уровни С-пептида в сыворотке.
Логарифм относительного риска развития рака молочной железы прямо пропорционален логарифму уровня С-пептида независимо от индекса массы тела или отношения размера талии к размеру бедер(290). Более поздние исследования, в которых участвовало 2569 женщин с гистологически подтвержденным раком молочной железы и 2588 женщин контрольной группы, продемонстрировали взаимосвязь развития рака молочной железы с диабетом взрослых(291), и полученные данные дают основание предположить, что инсулин является фактором, способствующим образованию опухолей(292).
Кахексия при раке также характеризуется интолерантностью к глюкозе, повышенным уровнем метаболизма глюкозы во всем организме, повышенным уровнем глюконеогенеза и инсулинорезистентностью, приводящей к снижению скорости потребления и утилизации глюкозы(293). Увеличение отношения инсулин/глюкагон после проведения гормональной терапии способствует селективному поддержанию
- 34 015629 процесса анаболизма у хозяина и ингибированию кинетики роста опухоли у крыс с моделью заболевания(294). Поэтому предупреждение развития диабетогенного комплекса метатаболических расстройств будет способствовать снижению заболеваемости раком и ослаблению сипмтомов кахексии при раке.
Участие ОРЕзаякоренных молекул в ангиогенезе, в образовании метастазов, прогрессировании рака и даже в подавлении развития рака становится все более очевидным. Одной из таких молекул является рецептор урокиназного активатора плазминогена иРАЯ. Существует очень высокая корреляция между экспрессией иРАЯ и фенотипом инвазивных раковых клеток(295). Присоединение неотщепленного ОРЕ заякоренного иРАЯ, связанного со своим лигандом иРА, к гепарансульфатным протеогликанам (Н8РО) и к интегрину витронектину, приводит к переносу плазмина на клеточную поверхность, и, тем самым, к индуцированию протеолиза, к связыванию витронектина со своим рецептором аУв3, и к стимуляции ангиогенеза(211-217). иРАЯ также взаимодействует с актиновым цитоскелетом, что приводит к образованию ламеллоподий, микроворсинок и филоподий и, тем самым, к повышению клеточной подвижности(228).
Нормальные физиологические функции, в которых участвует иРАЯ, регулируются посредством отщепления иРАЯ под действием иРА, и для такого отщепления требуется интактный ОРЕякорь(213). Было высказано предположение, что индуцирующие заболевание свойства иРАЯ могут быть обусловлены блокированием ОРЕякоря антителами согласно изобретению.
Гиперинсулинемия играет определенную роль в потенцировании иРАЯ-регулируемых механизмов посредством усиления экспрессии ассоциированных с клетками Н8РО(296) и ингибитора-1 активатора плазминогена (РАЕ1)(297). Помимо связывания с иРА, РАЕ1 связывается с витронектином и облегчает миграцию и инвазию опухолевых клеток (298). Комплекс иРАЯ-иРА-РАI-1 также связывается с белком, родственным липопротеину низкой плотности (ЬКР), и этот комплекс целиком интернализуется в мигрирующие раковые клетки. Было показано, что РАЕ1 стимулирует образование филоподий и миграцию раковых клеток(299). РАЕ1 также участвует в ангиогенезе. Ангиогенез полностью отсутствует в кольце аорты у РЛЫ-’/’-мышей, и может быть восстановлен путем добавления очищенного рекомбинантного РАЕ1(300).
Высокие уровни иРА и иРАЯ ассоциируются с повышенным риском рецидивов у пациентов с раком молочной железы(301). иРАЯ также в высокой степени экспрессируется в раковых опухолях щитовидной железы(302) и яичника(303). Активация Н8РО, а в частности ОРЕзаякоренных глипиканов, ассоциируется с некоторыми раковыми опухолями. Глипикан 1 активируется в раковых опухолях поджелудочной железы и молочной железы(304,305). Глипикан 3 экспрессируется в опухолях Вильмса, нейробластомах и гепатобластомах(306,307). Считается, что глипиканы являются потенциальными регуляторами гепаринсвязывающих факторов роста и стимулируются ЮЕ-1 и ЮЕ-2(308). Инсулин подавляет ЮЕ-связывающие белки, в результате чего они становятся более доступными(309). ЮЕ участвуют в прогрессировании различных раковых опухолей(310). ОРЕзаякоренные молекулы также участвуют в патофизиологии онкогенеза в качестве негативных регуляторов роста опухоли. ОРЕзаякоренный Т-кадгерин подвергается негативной модуляции под действием факторов роста, включая ЮЕ(311). Потеря гена Т-кадгерина коррелирует с развитием рака поджелудочной железы, легких, желудка и яичника, а трансфекция опухолевых клеток посредством кДНК Т-кадгерина приводит к снижению пролиферативной и инвазивной активности при воспалительном заболевании кишечника(308). Ингибирование или нарушение регуляции Т-кадгерина под действием анти-ОРI антител согласно изобретению должно подавлять негативно-регуляторную роль Т-кадгерина и аналогичных молекул, благоприятствующих росту опухолей.
ОРЕзаякоренные молекулы могут участвовать в распознавании опухолевых клеток природными клетками-киллерами. ИЬ16-связывающие белки (ИЬВР) представляют собой ОРЕзаякоренные молекулы, которые индуцируются или активируются после разрушения клеток, вызываемого тепловым шоком, вирусами, перерождением опухолей, канцерогенами, УФ-облучением и т. п. Такими молекулами являются лиганды для рецептора ΝΚΌ2-0 на ΝΚ-клетках, ИКТ-клетках, γδ-Т-клетках, а также на СБ8+-Т-клетках. Маскировка этих ОРЕзаякоренных ИЬВР может вызывать ускользание трансформированных клеток от их распознавания ΝΚ-или Т-клетками(312).
Вич
Вирус иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-Ι) является преимущественно моноцит/макрофагтропным и не индуцирует синцитий (Ν8Ι) во время начальной стадии инфицирования(313). ΝδΙ-вирусы используют β-хемокиновый рецептор 5 (ССЯ5) в качестве корецептора и инфицируют только ССЯ5+-Тклетки(313). В 50% случаях прогрессирование заболевания ассоциируется с появлением вариантов, которые являются синцитий-индуцирующими (8Ι) и инфицируют и уничтожают все СБ4+-Т-клеткн, включая необученные Т-клетки(313). Это действие основано на способности δΙ-вирусов использовать ССЯ5- и СХСЯ4-рецепторы, которые в высокой степени экспрессруются на Т-клетках-предшественниках и незрелых тимоцитах(314). Было показано, что вирусы ΝδΙ-фенотипа ингибируются ССЯ8-связывающими рхемокинами ЯАNТЕδ, МГР-1а и МГР-1в; и инфицирование Ν8Ι -штаммами коррелирует с повышением уровней продуцирования этих в-хемокинов(315). Хемокинами, которые связываются с основными корецепторами ВИЧ, ССЯ5 и СХСЯ4, являются сильные природные ингибиторы ВИЧ. Недавно полученные
- 35 015629 данные показали, что способность хемокинов блокировать ВИЧ-инфекцию может существовать независимо от их способности связываться с рецептором (316).
Хемокины обеспечивают хемотаксис (по градиенту концентраций) через внеклеточный матрикс посредством их связывания с гепарансульфатными протеогликанами и полимеризации гликозаминогликанов, таких как гликозаминогликаны, присутствующие на поверхности эндотелиальных клеток и других клеток в тканевом матриксе (317,318). Гепарансульфатные протеогликаны (№ΡΟ) также взаимодействуют с мембраносвязанным доменом гликопротеина др41РС ВИЧ. Такое взаимодействие происходит со специфическим доменом, связывающимся с гепарансульфатным протеогликаном и присутствующим на поверхности Т-клеток, и является пространственно неравномерным, ограничиваясь предпочтительными сайтами на мембране(319). Удаление гепарансульфат-связывающих сайтов путем их физического устранения или блокирования под действием ГЬ-8 приводит к прекращению взаимодействия др41РС с Тклеточной мембраной. Растворимый гепарансульфат связывается с др41РС, но не способствует его локализации в мембране. Поэтому для связывания др41го с клеточной мембраной необходимо присутствие мембраносвязанного №ΡΟ. Поскольку для репликации вируса требуется активация клеток, а взаимодействие с мембраной происходит в отдельно локализованных сайтах, то ΟΡΙ-заякоренный глипикан является наиболее вероятным кандидатом на взаимодействие дρ41^^-НЗΡΟ.
Преимущественное связывание ВИЧ и хемокинов с №ΡΟ должно направлять ингибирующее действие хемокинов на участки аккумуляции вирусных частиц. В настоящем изобретении было высказано предположение, что связывание антител против элементов ΟΡΙ-якоря может в достаточной степени изменять конформацию ΟΡΙ-заякоренных №ΡΟ и, тем самым, делать их неэффективными в связывании с ингибирующими хемокинами и в нацеливании их действия на вирусы. Кроме того, ΟΡΙ-заякоренный рецептор урокиназного активатора плазминогена (υΡΑΚ) и его лиганд (υΡΑ) играют значительную роль в прогрессировании ВИЧ-инфекций. Было показано, что высокие уровни сывороточного υΡΑΚ (δυΡΑΚ) являются индикаторами низкой продолжительности жизни пациентов со СПИДом(320). Было показано, что урокиназный активатор плазминогена υΡΑ связывается с др120 ВИЧ-Ι и стимулирует ВИЧ-1инфицирование макрофагов(321). Взаимодействие υΡΑ с др120 приводит к образованию функционально важной петли У-3 др120 и каталитического домена υΡΑ, что обеспечивает доступность его лигандсвязывающего домена для взаимодействия с υΡΑΚ(321). Образование мостиковой связи др120 с υΡΑΚ посредством υΡΑ может быть обусловлено связыванием корецептора ВИЧ с υΡΑΚ.
Клеточным рецептором для др120 является СО4(322), и оба др120 и СЭ4 связываются с витронектином посредством взаимодействия с гепарансульфатными протеогликанами(323). υΡΑΚ также связывается с витронектином(214). Рецептор ανβ3 для витронектина представляет собой костимулирующую молекулу, которая определяет исход связывания с Т-клеточным рецептором (ТСК). Связывание витронектина с ανβ3 эффективно индуцирует апоптоз Т-клеток(324). Это обеспечивается механизмом, посредством которого взаимодействие вируса ВИЧ с υΡΑ посредством др120, связанного с его рецептором υΡΑΚ, будет посылать сигнал апоптоза Т-клеткам через интегрин ανβ3.
Как было описано ранее, υΡΑ обладает способностью отщеплять υΡΑΚ после его связывания с этим рецептором. Отщепленный υΡΑΚ не связывается с витронектином(214). Несвязанный витронектин больше не будет связываться со своим рецептором ανβ3. Однако υΡΑ будет отщеплять только интактные молекулы υΡΑΚ, и даже несмотря на то, что сайт расщепления находится на некотором расстоянии от ΟΡΙякоря, для осуществления такого процесса требуется интактный якорь. Было показано, что υΡΑΚ, обработанный фосфолипазой С, является резистентным к отщеплению под действием υΡΑ(323). Поэтому в настоящем изобретении было высказано предположение, что антитела против элементов ΟΡΙ-якоря должны конформационно изменять структуру υΡΑΚ и индуцировать резистентность к отщеплению под действием υΡΑ. Связывание υΡΑ с υΡΑΚ приводит к позитивной регуляции экспрессии υΡΑΚ, которая коррелирует с увеличением уровня специфической мРНК υΡΑΚ(325).
Неспособность υΡΑ отщеплять конформационно модифицированный υΡΑΚ может приводить к активации υΡΑΚ, обладающего способностью связываться с витронектином, к обеспечению сайтов связывания для присоединения вируса ВИЧ, и к передаче сигнала посредством апоптоз-индуцирующего рецептора ανβ3. Усиленный апоптоз Т-клеток является известным и, по существу, необъяснимым признаком ВИЧ-инфекции (326).
Другим аспектом участия ΟΡΙ-заякоренных молекул в ВИЧ-инфицировании является уровень высвобождения вирусных частиц. Было продемонстрировано, что вирус ВИЧ, продуцируемый инфицированными Т-клетками, преимущественно приобретает на своей поверхности ΟΡΙ-заякоренные белки, которые, как известно, подвергаются секвестрации в липидные остовы на клеточных мембранах(327). Эти молекулы, например, такие как СЭ55 и СЭ59. и другие молекулы сообщают резистентность к опосредуемой комплементом деструкции(328,329) в ίη νίίτο тестах. Вирусы с ΟΡΙ-оболочкой, находящиеся на поверхности инфицированных Т-клеток, могут взаимодействовать с антителами и связываться с другими инфицированными Т-клетками, что облегчает образование синцития ЗЬвирусами.
И наконец, ВИЧ-1-инфекции ассоциируются с дислипидемией, с повышенными уровнями глюкозы и со снижением чувствительности к инсулину. Такие метаболические нарушения обостряются при про- 36 015629 ведении высокоактивной антиретровирусной терапии (НААКТ)(330). Также не является неожиданностью тот факт, что у ВИЧ-инфицированных пациентов присутствуют высокие уровни антител против фосфолипидов (331).
Инфекции
Инфекционные микроорганизмы, включая бактерии, грибки и простейшие микроорганизмы, экспрессируют на своей поверхности ОР1-заякоренные молекулы. Такими микроорганизмами являются МусоЬаЛепа, СаМхба, Ьещйшаша, 8сЫк1окоша, 61агб1а, Тохор1акша, ^ра^коша, Р1акшобшш и другие(332,339).
Недавно было продемонстрировано, что активированные ОР1-муцинами макрофаги трипомастиготных бактерий Тгурашкоша Ο'πιζί ίη νίΙΐΌ продуцируют цитокины, хемокины и окись азота (337).
Добавление экзогенных β-хемокинов М1Р-1а, М1Р-1 β, К.АЯТЕ8 приводит к дозо-зависимому индуцированию увеличения уровня инвазии Т. стид и, тем самым, к увеличению уровней продуцирования ΝΟ и к подавлению размножения паразитов(340).
Хемокины играют важную роль в сообщении хозяину резистентности к другим микробным патогенам, таким как вирусы, микоплазмы, грибки и гельминты(341,345). Хемокины обеспечивают хемотаксис (по градиенту концентраций) через внеклеточный матрикс посредством их связывания с гепарансульфатными протеогликанами (Н8РО) и их полимеризации, что приводит к повышению их доступности на поверхности клеток и тканевом матриксе(317,318). Н8РО являются либо трансмембранными, например, синдекан, либо ОР1-заякоренными, например глипикан.
Поверхностные белки возбудителей инфекции взаимодействуют с Н8РО хозяев, которые обеспечивают защиту первой степени путем аккумуляции воспалительных хемокинов и цитокинов для борьбы с инфекцией (346,347) .
Существует большое количество данных, указывающих на то, что инфекционные агенты могут быть подвергнуты неопсонической интернализации посредством присоединения к ОР1-заякоренным молекулам в липидных остовах. Было показано, что патогенный штамм Е.соН присоединяется к ОР1заякоренной молекуле СЭ55 на эпителиальных клетках тонкого кишечника и индуцирует перестройку цитоскелета и инфицирование клеток(348). Этот процесс может быть блокирован путем обработки клеток фосфолипазой С, которая, как известно, отщепляет ОР1-якорь(347). Очевидно, что реорганизация стрессволокна, обусловленная связыванием и инфицированием бактерией Е.соН, будет приводить к отделению клеток от конфлюентных монослоев клеток тонкого кишечника.
В настоящем изобретении было высказано предположение, что антитела, распознающие элементы ОР1-якоря на Н8РО, могут препятствовать транспорту хемокинов на инфекционные агенты, что будет приводить к ослаблению защиты первой степени у хозяина. Неопсоническая интернализация микроорганизмов также является компонентом защиты первой степени, в результате чего микроорганизмы могут интернализоваться и разрушаться, либо инфицированные клетки могут отделяться от поверхностей просвета благодаря реорганизации актина, индуцированной передачей ОР1-сигнала. Блокирование СР1 должно приводить к предотвращению такого поглощения и к уничтожению микроорганизмов.
Токсины инфекционных агентов также связываются с ОР1-заякоренными молекулами. Известно, что аэролизин, канал-образующий белок, происходящий от Ае^οшοηак крр., связывается с СР1заякоренными белками, и, по своей структуре и функции, является родственным альфа-токсину С1ок1пб1иш керНсиш. Мутантные клеточные линии, которые не могут синтезировть ОР1-якорь, являются нечувствительными к аэролизинну и альфа-токсину(349). Токсин νасА НеНсоЬасЮг ру1оп и столбнячный нейротоксин (ТеКГ), продуцируемый С1ок1пбшш 1е1аш, также связываются и интернализуются по пути клатрин-зависимого эндоцитоза, инактивируемого СР1-якорем (350,351).
ОР1-заякоренные молекулы не только участвуют в пути эндоцитоза, но также образуют часть эндоцитозных везикул, например, в гепатоцитах желчных канальцев(352). Сообщалось, что фосфатидилинозит3-фосфат является частью эндозомной мембраны, в которой происходит связывание раннего эндосомного аутоантигена ЕЕА1, который взаимодействует с ГТФазами, участвующими в созревании эндосом. Фагосомы, содержащие М. ШЬегси1ок1к, не развиваются в фаголизосомы и представляют собой незрелую промежуточную форму катепсина э(353).
Авторами настоящей заявки было высказано предположение, что поглощение токсинов, опосредуемое ОР1-якорями, представляет собой защитный механизм, обеспечивающий удаление токсинов из кровотока и тканей и что антитела согласно изобретению могут препятствовать этому процессу, позволяя токсинам достигать органов-мишеней. Кроме того, интернализация покрытых антителом СР1молекул может приводить к контактированию антител в соответствии с внутриклеточными механизмами созревания фагосом и направлять их на эндоцитозный путь, что будет препятствовать уничтожению микроорганизмов внутри клеток и инактивации токсинов.
Предположение о том, что антитела против анти-ТСК^в-антител и против ОР1-элементов вырабатываются благодаря пролиферации Т-клеток, продуцирующих поликлональные или моноклональные антитела, в ответ на инфекции или непосредственно в ответ на образование ОР1-заякоренных молекул на поверхности микроорганизмов, может быть подтверждено тем фактом, что при инфицировании, в част
- 37 015629 ности, СΡI-содержащими паразитами, метаболизм глюкозы у хозяина нарушается. У ранее не подвергавшихся лечению мужчин с неосложненной малярией, вызываемой Ρ. £а1с1рагит, уровни глюкозы и инсулина в плазме натощак были более высокими во время острой фазы заболевания, чем в фазе выздоравливания. В исследовании, проводимом путем 2-часового вливания глюкозы, концентрации глюкозы и инсулина в плазме были значительно выше в процессе течения заболевания, чем во время выздоравливания(354). Во время ί.ν.теста на толерантность к глюкозе, у детей с шистосомозом, по сравнению с сибсами, страдающими диабетом, наблюдался более высокий уровень антител К'А (антител против островковых клеток), а инсулиновый ответ в первой фазе заболевания подавлялся(355). Уровни инсулина натощак и уровни инсулина через 60 мин после вливания глюкозы были также выше, чем уровни у здоровых индивидуумов контрольной группы. У таких пациентов наблюдалось нарушение толерантности к глюкозе (356).
У пациентов с болезнью Чагаса гипергликемия и диабет наблюдались чаще, чем у индивидуумов (357) контрольной группы .
Гликемические расстройства также преобладали у индивидуумов со стоматитом, вызываемым Сапб1ба. Из всех обследованных пациентов в возрасте свыше 50 лет 35% пациентов имели ранее недиагностированный диабет типа 2, а 36% имели нарушенную толерантность к глюкозе (358).
При протекающих длительное время инфекциях, вызываемых МусоЬас!епа1 !иЬегси1о818, наблюдались повышенная секреция инсулина, персистентная гипергликемия и развитие сахарного диабета в тяжелой форме(359). Аналогичным образом, при лепре, протекающей более, чем 2 года, обычно наблюдалось характерное для диабета изменение толерантности к глюкозе (360).
Иммунорегуляция
Ряд СΡI-заякоренных молекул участвуют в регуляции иммунных ответов. Такими молекулами являются СΡI-80, присутствующие на нейтрофилах и моноцитах(361); СЭ16, присутствующие на нейтрофилах(362); СО 160, присутствующие на интраэпителиальных лимфоцитах тонкого кишечника и субпопуляциях циркулирующих лимфоцитов, включая ИК-клетки(363); ЬРА-3, лимфоцитарный функциональный антиген(364); СЭ48, регулирующие ΙΕ-2-индуцируемые сигналы(365), и СЭ^109, присутствующие на васкулярных эндотелиальных клетках(366), и т.п. С возрастом иммунные ответы нарушаются(367), и определенную роль в таком нарушении могут играть антитела против элементов СΡI-якоря.
Выводы
Исходя из вышеуказанного описания можно прийти к общему заключению, что большинство наследственных или ненаследственных заболеваний инфекционного или неинфекционного происхождения или состояний, ассоциированных с процессом старения, проявляются или обостряются в результате вырабатывания мультиспецифических аутоантител, описанных выше. У большого числа людей генерируются аутоантитела, разрушающие все системы и органы, функции которых зависят от уровней глюкозы, уровней инсулина, уровней других гормонов в крови, регулируемых инсулином и/или СΡI-заякоренными молекулами, и/или другими распознаваемыми аутоантителами регуляторными молекулами и фосфолипидами, и/или подверженных влиянию вышеуказанных молекул. Эти аутоантитела могут ускорять старение и развитие возрастных заболеваний, стимулировать развитие рака, опосредовать манифестации наследственных или ненаследственных заболеваний и блокировать защиту первой степени от инфекционных агентов. То есть в основе патогенеза этих заболеваний лежит продуцирование аутоантитела, которое зависит от восприимчивости индивидуума и приводит к развитию одного или нескольких состояний, некоторые из которых были описаны выше. Аналогичным образом, любое из указанных лекарственных средств может давать один или несколько побочных эффектов, которые обычно не возникают в отсутствии данного лекарственного средства.
В нижеследующей таблице систематизированы заболевания, которые поддаются лечению или диагностике в соответствии с настоящим изобретением, а также указана взаимосвязь между такими заболеваниями, и кроме того, указан общий механизм заболеваний, описанный в настоящей заявке и в \У099/05175. В этой таблице оценка ( + ) в столбце А указывает на то, что данное заболевание ассоциируется с нарушением толерантности к перорально вводимой глюкозе (в 0СТТ), оценка (+) в столбце В указывает на то, что данным заболеванием является заболевание, при котором вырабатываются антитела против фосфолипидов; оценка (+) в столбце С указывает на то, что данным заболеванием является заболевание, в котором участвуют СΡI-заякоренные молекулы; оценка (+) в столбце Ό указывает на то, что данным заболеванием является заболевание, которое ассоциируется с аномальными уровнями инсулина или инсулинорезистентностью; оценка (+) в столбце Е указывает на то, что данное заболевание чаще встречается при диабете; а оценка (+) в столбце Р указывает на то, что данное заболевание ассоциируется с повышенным риском развития диабета типа 1 или 2.
Следует отметить, что если в нижеследующей таблице оценка (+) отсутствует, то это не означает, что соответствующая взаимосвязь не была установлена или не существует, а просто означает, что у авторов настоящего изобретения пока отсутствуют какие-либо сообщаемые в литературе данные о такой взаимосвязи.
- 38 015629
Заболевание А в с Ц Е ΐ
Псориаз + + + +
Экзема +
Витилиго + Ψ 4-
Черньтй акантоз 4- 4-
Гнездная алопеция 4-
Болезнь Альцгеймера + 4- +
Шизофрения + 4- +
Депрессия 4- +
Болезнь Паркинсона + + +
Мигрень +
Рассеянный склероз + + Я
Тяжелая миастения + +
Амиотрофический боковой склероз и другие расстройства двигательных нейронов + + + +
Прогрессирующий надъядерный паралич, болезнь Пика и другие нейродегенеративные заболевания
Заболевания щитовидной железы + +
Множественная эндокринная неоплазия типа 2А и В 4-
Синдром Кушинга + + +
Болезнь Адиссона + +
СПКЯ, гипогонадизм 4- + 4-
Преждевременное облысение у мужчин +
Ожирение 4-
Синдром X + 4-
Привычная внутриутробная гибель плода 4- 4- 4-
Привычный самопроизвольный выкидыш + + +
Рецидивирующий тромбоз + 4-
Системная красная волчанка + 4-
Глютеновая болезнь 4- + 4-
Аутоиммунный гастрит + 4-
- 39 015629
Воспалительное заболевание кишечника + +
Ревматоидный артрит + + +
Анкилозирующий спондилит
Астма + + 4-
Кистозный фиброз +
Остеопороз и остеопения + +
Плоский лишай + +
Лейкоплакия + Ί-
Апластическая анемия и другие анемии + + +
Пароксизмальная ночная гемоглобинурия +
Апноэ во сне +
Бессонница + 4- + Ч-
Рак + + + + +
ВИЧ-инфекция + + + +
Инфекции + +
Заболевания, вызываемые нарушением иммунорегуляции +
Фармацевтические композиции
В своем восьмом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей пептид, антитело или эквивалентный лиганд согласно первому аспекту изобретения, или молекулу нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспекту изобретения, или вектор согласно четвертому аспекту изобретения, или клетку-хозяина согласно пятому аспекту изобретения в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Эти композиции могут быть использованы в качестве терапевтических или диагностических реагентов, в качестве вакцин или в качестве других иммуногенных композиций, подробно описанных ниже.
Фармацевтическая композиция может включать комбинацию пептидов согласно изобретению (см., например, примеры 6 и 7). Такие пептиды могут быть включены в композицию в виде мономерных звеньев, либо они могут быть присоединены друг к другу так, чтобы они образовывали двойные или мультимерные цепи. Такие цепи могут включать, а могут и не включать, линкерные элементы, расположенные между молекулами мономерных компонентов.
Предпочтительно, фармацевтические композиции должны содержать терапевтически эффективное количество пептида, антитела или эквивалентного лиганда, молекулы нуклеиновой кислоты, вектора или клетки-хозяина согласно изобретению. Используемый здесь термин терапевтически эффективное количество означает количество терапевтического средства, необходимое для лечения, ослабления или предупреждения рассматриваемого заболевания или состояния, или для достижения детектируемого терапевтического или профилактического эффекта. Для каждого соединения терапевтически эффективная доза может быть сначала оценена либо в анализе клеточной культуры, например опухолевых клеток, либо на животных-моделях, обычно на мышах, кроликах, собаках или свиньях. С использованием животного-модели может быть также определен соответствующий интервал концентраций и способ их введения. Полученная информация может быть затем использована для определения подходящих доз и способов их введения человеку.
Точное эффективное количество соединения для введения человеку будет зависеть от тяжести патологического состояния, общего состояния здоровья индивидуума, его возраста, веса, пола и режима питания, от времени и частоты введения лекарственного средства, от комбинации(й- лекарственных средств, а также от реактивной чувствительности и толерантности/восприимчивости данного индивидуума к проводимой терапии. Такое количество может быть определено путем рутинного экспериментирования и может быть установлено врачом-клиницистом. В общих чертах, эффективная доза может составлять от 0,0001 до 50 мг/кг, предпочтительно от 0,001 до 10 мг/кг, более предпочтительно от 0,05 до 10 мг/кг, а еще более предпочтительно от 0,1 до 10 мг/кг. Композиции могут быть введены пациенту либо отдельно, либо в комбинации с другими агентами, лекарственными средствами или гормонами.
Было показано, что композиции, содержащие пептиды согласно изобретению в дозах, составляющих от 0,005 до 0,05 мг/кг, оказывают благоприятное терапевтическое действие на человека (см. ниже
- 40 015629 примеры 6 и 7), и при этом, не вызывают каких-либо явных нежелательных побочных эффектов. В соответствии с этим, авторы настоящей заявки считают, что в композициях согласно изобретению могут быть использованы малые дозы, эквивалентные дозы или более высокие дозы пептидов. В соответствии с этим, предпочтительные дозы пептидов согласно изобретению могут составлять по меньшей мере 0,001 мг/кг по меньшей мере 0,002 мг/кг по меньшей мере 0,003 мг/кг по меньшей мере 0,00 4 мг/кг, по меньшей мере 0,005 мг/кг, по меньшей мере 0,006 мг/кг, по меньшей мере 0,007 мг/кг, по меньшей мере 0,008 мг/кг, по меньшей мере 0,009 мг/кг, по меньшей мере 0,01 мг/кг, по меньшей мере 0,015 мг/кг, по меньшей мере 0,02 мг/кг, по меньшей мере 0,03 мг/кг, по меньшей мере 0,04 мг/кг, или по меньшей мере 0,05 мг/кг. Предпочтительные дозы пептидов согласно изобретению могут также составлять менее чем 1 мг/кг, менее чем 0,9 мг/кг, менее чем 0,08 мг/кг, менее чем 0,07 мг/кг, менее чем 0,06 мг/кг, или менее чем 0,05 мг/кг. Предпочтительные дозы пептидов согласно изобретению могут также составлять от 0,001 до 1,0 мг/кг, от 0,0025 до 0,07 5 мг/кг, или от 0,00 5 до 0,05 мг/кг.
Фармацевтическая композиция может также содержать фармацевтически приемлемый носитель, подходящий для введения терапевтического средства. Такими носителями являются антитела и другие полипептиды, гены и другие терапевтические средства, такие как липосомы, при условии, что данный носитель сам по себе не индуцирует вырабатывание антител, оказывающих негативное воздействие на индивидуума, которому вводят указанную композицию, и не является чрезмерно токсичным. Подходящими носителями могут быть крупные макромолекулы с замедленным метаболизмом, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и неактивные вирусные частицы.
Используемыми здесь фармацевтически приемлемыми солями могут быть, например, соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и т.п., и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.п. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых носителей можно найти в руководстве Кешшд!оп'8 Рйагтасеийса1 Заепсек (Маск РиЬ. Со., N.1. 1991).
Фармацевтически приемлемые носители в терапевтических композициях могут, кроме того, содержать жидкости, такие как вода, физиологический раствор, глицерин и этанол. Кроме того, в указанных композициях могут присутствовать и вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты, рН-забуферивающие вещества и т. п. С помощью таких носителей могут быть получены фармацевтические композиции в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и т. п. для перорального приема пациентом.
Композиции согласно изобретению после их приготовления могут быть непосредственно введены индивидууму. Индивидуумами, подвергаемыми лечению, могут быть животные, а в частности, человек.
Фармацевтические композиции, используемые в настоящем изобретении, могут быть введены различными способами, включая, но не ограничиваясь ими, пероральное, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, интрамедуллярное, интратекальное, интравентрикулярное, трансдермальное, чрезкожное, подкожное, внутрибрюшинное, интраназальное, внутрикишечное, местное, подъязычное, интравагинальное или ректальное введение. Для введения фармацевтических композиций согласно изобретению могут быть также использованы аппараты для выстреливания генов или безыгольные шприцы (см., например, \у\у\у.ро\уйег|ес1.сот.). В основном, терапевтические композиции могут быть приготовлены в виде растворов для инъекций, либо в виде жидких растворов или суспензий, либо они могут быть получены в виде твердых форм, подходящих для приготовления растворов или суспензий в жидких носителях перед их инъекцией.
Указанные композиции могут быть непосредственно доставлены, в основном, путем подкожной, внутрибрюшинной, внутривенной или внутримышечной инъекции, либо они могут быть доставлены в интерстициальное пространство ткани. При этом лечение может быть проведено по схеме введения разовой дозы или дробных доз.
В одном из подходов экспрессия генов, кодирующих обсуждаемые аутоантитела, описанные выше, может быть ингибирована методами блокирования экспрессии, такими как использование молекул антисмысловой нуклеиновой кислоты (описанных выше), которые могут быть генерированы эндогенно или введены отдельно. Модификации экспрессии генов могут быть достигнуты путем конструирования комплементарных последовательностей или антисмысловых молекул (ДНК, РНК или РЫА) для осуществления регуляции экспрессии 5'-областей или регуляторных областей (сигнальной последовательности, промоторов, энхансеров и интронов) генов, кодирующих данное аутоантитело. Аналогичным образом такое ингибирование может быть осуществлено с использованием методики спаривания оснований с образованием тройной спирали (см. Сее 1.Е. е! а1. (1994): НиЬег В.Е. & В.Ь Сагг, Мо1еси1аг апй Iттипо1офс Арргоасйек, Еи!ига РиЫЕЫпд Со., М! КЕсо, НУ). Комплементарная последовательность или антисмысловая молекула могут быть также сконструированы в целях блокирования трансляции мРНК посредством предотвращения связывания транскрипта с рибосомами. Такие олигонуклеотиды могут быть введены или генерированы ш κίΐιι в результате экспрессии ш у1уо.
Генотерапия может быть применена для эндогенного продуцирования пептидов согласно изобретению соответствующими клетками индивидуума. Такая генотерапия может быть осуществлена ш у1уо или
- 41 015629 ех νΐνο. Для генотерапии ех νΐνο требуются выделение и очистка клеток, взятых у пациента, введение терапевтического гена и введение генетически модифицированных клеток обратно пациенту. В противоположность этому, генотерапия ίη νΐνο не требует выделения и очистки клеток пациентов.
Для введения пациенту обычно используют упакованный терапевтический ген. Носители для доставки генов могут быть невирусными, такие как липосомы, либо они могут представлять собой дефектные по репликации вирусы, такие как аденовирус (см. Вегкпег К.Ь., Сигг. Тор. МюгоЬю1. 1ттипо1., 158, 39-66 (1992)), или векторы на основе аденоассоциированного вируса (АЛУ) (см. Мнхусхка N. Сигг. Тор. М1сгоЫо1. 1ттипо1., 158, 97-129 (1992) и патент США № 5252479). Так, например, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая пептид согласно изобретению, может быть сконструирована для экспрессии в дефектном по репликации ретровирусном векторе. Затем эта экспрессионная конструкция может быть выделена и введена в упаковывающую клетку, трансдуцированную ретровирусным плазмидным вектором, содержащим РНК, кодирующую указанный пептид, так, чтобы указанная упаковывающая клетка продуцировала инфекционные вирусные частицы, содержащие представляющий интерес ген. Эти клетки-продуценты могут быть введены индивидууму для конструирования клеток ίη νί\Ό и экспрессии полипептида ίη νί\Ό (см. С11ар1ег 20 Оепе ТРегару апб о1Рег Мо1еси1аг Сепейс-ЬазеР ТРегареиРс АрргоасРез (и цитируемые там работы), Нитап Мо1еси1аг Сепейсз (1996), Т. 81гасРап & А.Р.КеаР, В1О8 8с1еп11Г1с РиЬ11зРегз ПР).
Другим подходом является введение оголенной ДНК, где терапевтический ген непосредственно инъецируют в кровоток или в мышечную ткань.
Настоящее изобретение также относится к пептидам, молекулам нуклеиновой кислоты, векторам и к клеткам-хозяевам согласно изобретению, которые могут быть использованы в вакцинах для вырабатывания антител против аутоантител, вызывающих заболевание. В соответствии с этим аспектом настоящее изобретение относится к вакцинной композиции, содержащей пептид, молекулу нуклеиновой кислоты, вектор или клетку-хозяина согласно одному из вышеописанных вариантов изобретения. Вакцины согласно изобретению могут быть либо профилактическими (то есть предназначенными для предупреждения заболевания), либо терапевтическими (то есть предназначенными для лечения заболевания после его диагностирования). Такие вакцины содержат иммунизирующий пептид или нуклеиновую кислоту, обычно в комбинации с описанными выше фармацевтически приемлемыми носителями, где указанным носителем может быть любой носитель, который сам по себе не индуцирует вырабатывание антител, оказывающих негативное воздействие на индивидуума, которому вводят указанную композицию. Такие носители могут действовать как иммуностимуляторы (адъюванты). Адъювантами, которые могут быть использованы в вакцинных композициях согласно изобретению, являются, но не ограничиваются ими, адъюванты, содержащие микроэлементы (включая минеральные соли, такие как соли алюминия и соли кальция, которыми могут быть гидроксиды, фосфаты, сульфаты и т.п.), масляные эмульсии, сапониновые препараты, виросомы и вирусоподобные частицы, бактериальные и микробные производные, человеческие иммуномодуляторы, биоадгезивы и мукоадгезивы, микрочастицы, липосомы, препараты на основе простого полиоксиэтиленового эфира и сложного полиоксиэтиленового эфира, полифосфазен (РСРР), мурамиловые пептиды, имидазохинолоновые соединения, тиосемикарбазоновые соединения и триптантриновые соединения или их комбинации.
Кроме того, указанный пептид может быть конъюгирован с бактериальным токсоидом, таким как токсоид дифтерии, столбняка, холеры, Н. ру1оп. и с другими патогенами. Пептиды согласно изобретению могут быть использованы отдельно или в комбинации друг с другом, либо отдельно или в комбинации с веществами, стимулирующими их эффективность, в виде одной, двух или множества цепей, содержащих или не содержащих линкерные элементы, и с носителями.
Поскольку пептиды могут разлагаться в желудке, то вакцины, содержащие такие пептиды, предпочтительно, вводят парентерально (например, путем подкожной, внутримышечной, внутривенной или чрезкожной инъекции). Композициями, подходящими для парентерального введения, являются водные и безводные стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты и растворенные вещества, сообщающие данной композиции изотоничность с кровью реципиента, а также водные и безводные стерильные суспензии, которые могут содержать суспендирующие агенты или загустители.
Вакцинные композиции согласно изобретению могут быть помещены в емкости для разовых лекарственных форм или для дробных лекарственных форм. Так, например, эти лекарственные формы могут быть помещены в запаянные ампулы и сосуды, которые могут храниться в замороженном виде и в которые непосредственно перед их использованием, необходимо добавить лишь стерильный жидкий носитель. Конкретная доза будет зависеть от удельной активности данной вакцины и может быть легко определена путем рутинного экспериментирования.
Этот аспект изобретения также включает в себя способ вакцинации индивидуума в целях предупреждения у него заболевания или расстройств, где указанный способ включает в себя введение индивидууму пептидной или вакцинной композиции в соответствии с одним из вышеописанных вариантов настоящего изобретения.
Может оказаться желательным введение пациенту композиции согласно изобретению в течение
- 42 015629 длительного периода времени, например в течение одного дня, в течение одной недели, в течение одного месяца или в течение нескольких месяцев, начиная с первого дня введения. Авторами настоящего изобретения рассматриваются различные лекарственные формы пролонгированного высвобождения, депо или имплантаты. Так, например, лекарственная форма может содержать фармацевтически приемлемую нетоксичную соль пептида, которая имеет низкую степень растворимости в физиологических жидкостях. Кроме того, пептид может быть получен в виде геля, например геля моностеарата алюминия, содержащего, например, кунжутное масло и подходящего для инъекции. Депо-препарат пролонгированного высвобождения другого типа, подходящий для инъекции, может содержать пептид или соль, диспергированные для инкапсуляции в медленно разлагающемся нетоксичном неантигенном полимере, таком как полимер полимолочной кислоты/полигликолевой кислоты, например, описанный в патенте США 3773919. Специалистам могут быть известны и другие подходящие препарты пролонгированного высвобождения типа депо или имплантатов.
В соответствии с еще одним своим аспектом настоящее изобретение относится к способу диагностики присутствия у индивидуума аутоиммунных антител или определения их уровней, где указанный способ включает в себя контактирование пробы крови, плазмы или сыворотки, или другой физиологической жидкости с пептидом согласно одному из описанных выше вариантов настоящего изобретения в присутствии мишени для аутоиммунных антител, и оценку количества природного аутоантитела, которое специфически связывается с указанной мишенью. Такой способ включает в себя анализ на конкурентное связывание, в котором молекулы-мишени, способные связываться с аутоиммунными антителами, специфически конкурируют за связывание с пептидом. В этом способе пептиды могут быть использованы для детектирования присутствия и оценки количества аутоиммунных антител у индивидуума. Такой анализ может быть разработан на основе радиоиммуноанализа, вестерн-блот-анализа, клеточного сортинга с активацией флуоресценции (РАС8) или ЕЬ18А-технологии. Количество аутоантитела, экспрессируемого у индивидуума, в контрольном образце и образце пораженной ткани, взятом путем биопсии, сравнивают со стандартными величинами. Отклонение величин, полученных для данного индивидуума, от стандартных величин позволяет определить параметры, необходимые для диагностики заболевания. Диагностические анализы могут быть проведены для выявления отсутствия, присутствия и избыточной экспрессии аутоиммунного антитела и для мониторинга регуляции уровней полипептида во время терапевтического лечения. Такие анализы могут быть также проведены для оценки эффективности конкретного курса терапевтического лечения при исследовании животных, в клинических испытаниях или для наблюдения за процессом лечения отдельного пациента.
В вышеуказанном способе может быть использован меченный пептид, который конкурирует с аутоантителами за связывание с молекулами-мишенями с образованием комплексов. В таком анализе количество связанной метки в комплексах обратно пропорционально концентрации аутоантител, присутствующих в образце. Этот пептид может быть помечен ферментом так, чтобы образование комплексов приводило к ингибированию или инактивации активности фермента. Альтернативно, этот пептид может быть помечен радиоактивной или флуоресцентной меткой. В альтернативном варианте молекулымишени могут быть связаны с ферментом, присоединенным к субстрату так, чтобы связывание аутоиммунного антитела с молекулами-мишенями приводило к активации фермента и вызывало изменение цвета, которое может быть измерено с помощью спектрофотометрии. Молекулы-мишени могут быть присоединены к ферменту, связанному с субстратом и присутствующему на тест-полоске, которая может контактировать с образцом.
Во всех этих способах молекулой-мишенью может быть предпочтительно поликлональная или моноклональная молекула иммуноглобулина против анти-ТСЯ-Ув-антител, или любая ее часть, которая позволяет идентифицировать по меньшей мере один эпитоп на цепях Т-клеточного рецептора νβ у человека или у любого животного.
Настоящее изобретение относится к диагностическому набору, разработанному для облегчения обнаружения аутоантитела и содержащему пептид согласно одному из описанных выше вариантов настоящего изобретения; поликлональную или моноклональную молекулу-мишень иммуноглобулина против анти-ТСЯ-Ув-антител или любую ее часть, которая позволяет идентифицировать по меньшей мере один эпитоп на цепи Т-клеточного рецептора νβ- и реагент, используемый для детектирования реакции связывания аутоиммунного антитела с молекулой-мишенью иммуноглобулина. Такие наборы могут быть с успехом использованы для диагностики заболевания или для определения степени восприимчивости индивидуума к развитию данного заболевания.
В соответствии с другим своим аспектом настоящее изобретение относится к массиву, включающему один или несколько пептидов согласно первому аспекту изобретения. Такие массивы могут быть использованы для диагностики заболевания или для определения степени восприимчивости индивидуума к развитию данного заболевания. Последние разработки в области технологии изготовления массивов пептидов, белков и антител позволяют проводить одновременное детектирование большого числа полипептидов. Массивы белков низкой плотности на фильтрующих мембранах, такие как универсальная система массива белков (Се Н, (2000) Νιιοίοίο Λοίάδ Яез. 28(2), е3) позволяет визуализировать массивы анти
- 43 015629 генов с примененеим стандартной ЕБ1БА-технологии и сканирующего детектора с зарядовой связью (00Ό) на оптически плоской стеклянной пластине, содержащей 96 лунок. Были также разработаны иммуносенсорные массивы, позволяющие проводить одновременное детектирование клинических аналитов. С использованием таких массивов белков может быть определен профиль экспрессии белка (такого как аутоантитело) в физиологических жидкостях, например, в сыворотке здоровых или больных индивидуумов, а также пациентов перед и после введения им лекарственного средства.
В альтернативном варианте поликлональные или моноклональные антитела против биологически экспрессируемых или синтезированных пептидов согласно первому аспекту изобретения или эквивалентных лигандов могут быть использованы в аналитических методах качественного или количественного анализа на присутствие аутоантител или антител, нейтрализующих эти аутоантитела.
Различные аспекты и варианты настоящего изобретения будут более подробно проиллюстрированы на примерах, в которых описаны эталонные и конкретно рассматриваемые пептиды. При этом следует отметить, что в настоящее изобретение могут быть внесены конкретные модификации, не выходящие за рамки объема изобретения.
Краткое описание графического материала
Фиг. 1А и 1В. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности областей УН и УБ клонированных антител.
Фиг. 2. Человеческая опухолевая клеточная линия в присутствии контрольного иррелевантного моноклонального антитела.
Фиг. ЗА и 3В. Человеческая опухолевая клеточная линия в присутствии антител против анти-ТСЯУв-антител, иллюстрирующая типичную морфологию актинового цитоскелета и протрузию клеток.
Фиг. 4А-4Е. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности областей УН и УБ клонированных антител.
Фиг. 5. Уровень глюкагона в сыворотке (среднее ± ср. кв.от.) до и после перорального введения 75 г глюкозы пациентам группы, которым вводили ΝΏΧ-1 на день 01 и день 43.
Фиг. 6. Уровни НЬА1с у пациентов с сахарным диабетом типа 2 после прекращения приема антидиабетических средств. Указаны средние величины для всех пациентов; вертикальные линии обозначают стандартные ошибки среднего. Данные, полученные от пациентов после возобновления лечения антидиабетическими средствами, были исключены.
Фиг. 7. Уровни глюкозы натощак в капиллярах у пациентов с сахарным диабетом типа 2 после прекращения приема антидиабетических средств. Указаны средние величины для всех пациентов; вертикальные линии обозначают стандартные ошибки среднего. Данные, полученные от пациентов после возобновления лечения антидиабетическими средствами, были исключены.
Фиг. 8. Уровни фруктозамина в сыворотке, скорректированные в расчете на альбумин у пациентов с сахарным диабетом типа 2, после прекращения приема антидиабетических средств. Указаны средние величины для всех пациентов; вертикальные линии обозначают стандартные ошибки среднего. Данные, полученные от пациентов после возобновления лечения антидиабетическими средствами, были исключены.
Фиг. 9. Уровни НЬА1с у мужчин с сахарным диабетом типа 2 после прекращения приема антидиабетических средств. Указаны средние величины для всех пациентов; вертикальные линии обозначают стандартные ошибки среднего. Данные, полученные от пациентов после возобновления лечения антидиабетическими средствами, были исключены.
Фиг. 10. Уровни глюкозы натощак в капиллярах у мужчин с сахарным диабетом типа 2 после прекращения ими приема антидиабетических средств. Указаны средние величины для всех пациентов; вертикальные линии обозначают стандартные ошибки среднего. Данные, полученные от пациентов после возобновления лечения антидиабетическими средствами, были исключены.
Фиг. 11. Уровни фруктозамина в сыворотке, скорректированные по альбумину у мужчин с сахарным диабетом типа 2, после прекращения приема антидиабетических средств. Указаны средние величины для всех пациентов; вертикальные линии обозначают стандартные ошибки среднего. Данные, полученные от пациентов после возобновления лечения антидиабетическими средствами, были исключены.
Фиг. 12А-12Е. Сопоставление путем выравнивания известных последовательностей гипервариабельных областей для УН и УБ с идентифицированными здесь последовательностями гипервариабельных областей.
Примеры
Пример 1. Секвенирование антител
Методы
Выделение полноразмерной РНК
Ро1у А+-мРНК экстрагировали из 109 замороженных клеток, которые секретировали моноклональные антитела, распознающие анти-ТСЯ-Ув-антитела и элемент СР1-якоря. методом с использованием изотиоцианата гуанидиния. Выделение полноразмерной РНК проводили с использованием набора АтЬюи ЯNА^еои8 Κίΐ (Са! Νο.1912, Бо1 Νο.019Κ0158). Приблизительно 0,3 мг замороженных гибридомных
- 44 015629 клеток ресуспендировали в 5 мл буфера для лизиса/связывания. После лизиса добавляли 5 мл 64% этанола, а затем перемешивали, и смесь лизата/этанола наносили на РНК-фильтры и центрифугировали для связывания РНК с матрицей фильтра. Затем фильтры один раз промывали 700 мкл промывочного раствора №. 1 и два раза 500 мкл промывочного раствора 2/3, и после каждой стадии промывки, центрифугировали, причем после последней промывки проводили последнюю стадию центрифугирования. РНК элюировали с фильтров путем нанесения 2х 60 мкл предварительно нагретого (95°С) элюирующего раствора в центр фильтра и центрифугирования. Элюированную РНК осаждали 0,5 объема хлорида лития в течение ночи при -20°С. После промывки в холодном 70% этаноле, РНК-осадок сушили воздухом и ресуспендировали в 20 мкл стерильной воды, а затем хранили при -70°С.
Обратная транскрипция РНК в первую цепь кДНК
Комплементарную цепь ДНК конструировали с использованием 1 мкг РНК, выделенной, как описано выше.
Реакцию обратной транскрипции проводили, как описано ниже с использованием набора АтЫои Ке1гокепр1 кй (Са1. № 1710, Йо1 №. 078К0262):
мкл
РНК (1 мкг)
Смесь бЭТР (2,5 мМ каждого)
Праймеры для первой цепи о1що-бТ
Стерильная вода
Полученный раствор инкубировали при 75°С в течение 3 мин, а затем помещали на лед. После этого добавляли следующие компоненты:
мкл
10 х альтернативный ОТ-ПЦР-буфер
Ингибитор РНКазы плаценты
Обратная транскриптаза М-МЬУ
Эту реакцию проводили при 42°С в течение 90 мин и реакционную смесь инактивировали путем инкубирования при 92°С в течение 10 мин. Затем реакционную смесь хранили при -20°С.
Полимеразная цепная реакция фрагментов тяжелой и легкой цепей 1д
ПЦР-реакцию фрагментов тяжелой и легкой цепей 1д проводили в соответствии с инструкциями производителя с использованием первой цепи кДНК, полученной, как описано выше, и набора праймеров для мышиных 1д (Арреиб1х I, №уадеи, Са1. №. 69831-3, Йо1 №. Ν14754).
Реакционные смеси хранили при -20°С до их использования.
Клонирование ПЦР-продуктов
Все ПЦР-продукты клонировали в клонирующую систему с затупленными концами (В1ии!-еиб) для облегчения секвенирования. В качестве таких систем использовали набор для клонирования р8ТВ1ие-1 РегГесбу В1ии! ™ С1ошид (№уадеи, Са1. №. 70191-3) и набор для ПЦР-клонирования 2его В1ии! ™ РСК С1ошид Кй Циуйгодеи, 25-0162). Полученные продукты секвенировали в соответствии со стандартными процедурами.
Результаты
Нуклеотидные и аминокислотные последовательности, полученные для вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, представлены на фиг. 1А и 1В (8Е0 ΙΌ ΝΝ:1-4). Исходя из этих последовательностей, были получены гипервариабельные области (8Е0 ΙΌ NО: 6-16), которые на фиг. 1А и 1В подчеркнуты.
Пример 2. Гомодимерные СЭК-пептиды
Ν-концевой цистеин присоединяли к каждой из последовательностей гипервариабельной области (СЭК-Е1-3 и СОК-Н1-3, 8Е0 ΙΌ ΝΝ:6-16), которые были синтезированы путем пептидного Етос-синтеза и димеризованы с образованием гомодимеров. Некоторые из этих гомодимеров были биотинилированы, а затем эти биотинилированные гомодимеры тестировали с помощью флуоресцентной микроскопии на их способность связываться с человеческими панкреатическими α-клетками (используемыми в качестве индикаторной человеческой ткани) с использованием меченного флуоресцеином антитела против биотина в качестве реагента второй стадии. Было обнаружено, что гомодимеры, происходящие от СЭК-Н2 (8Е0 ΙΌ NО:8), СЭК-Н3 (8Е0 ΙΌ NО:10) и СОК-Ь3 (8Е0 ΙΌ NО:16), связывались с панкреатическими αклетками. Затем небиотинилированные гомодимерные пептиды тестировали с помощью ЕЫ8А на их способность связываться с анти-ТСК-Ув-антителом и кардиолипином, используемым в качестве индикатора фосфолипидов (табл. 1).
- 45 015629
Таблица 1
Данные оптической плотности для ЕЫЗА, указывающие на связывание моноклональных антител против анти-ТСК-Ур-антител или гомодимерных пептидов, СОК-Н2, СЭК-НЗ и СОВ-ЬЗ с анти-ТСЕ νβ-антителаии
Антиген Антитело против антитск-νβантител СОК-Н2 СЙК-НЗ СРК-ЬЗ
Анти-ТСРУр антитело 0, 806+0, 056* 0,307+0,018* 0,182+0,009* 0,243+0, 008*
Культуральная средая/РВЗ* 0,372+0, 037* 0,168±0,010* 0,091±0,020* 0, 140±0, 018*
Отношение тест/контроль 2, 17 1,83 2,00 1,74
Кардиолипин* * 0,142±0,070 0,151±0,020 0,132+0,009 0,254+0,012
Спирт** 0,038+0,014 0,063+0,012 0,061+0,006 0,114±0,021
Отношение тест/контроль 3, 74 2, 40 2, 16 2, 23
# Микротитрационный планшет покрывали анти-ТСЕ-Ур-антителом или культуральной средой и тестировали на антитела против анти-ТСЙ-Ур-антител.
* Микротитрационный планшет покрывали СОЕ-Н2, СОЕ-НЗ и СОЕ-ДЗ или культуральной средой и тестировали на антитела против анти-ТСЕ-Ур-антител.
** Микротитрационный планшет покрывали либо кардиолипином в этиловом спирте, либо этиловым спиртом, и тестировали на присутствие антител против анти-'С?.-7р-антител или С0К-Н2, СОК-НЗ и СОЕ-ЬЗ.
Каждое среднее и стандартное отклонение даны для трех наблюдений.
Пример 3. Идентификация аутоантител ш νίΐΌ
В табл. 2 представлены данные анализа на присутствие аутоантител в человеческой сыворотке (то есть антител против анти-ТСЯ-Vβ-антител и пептидов согласно изобретению), которые связываются с анти-ТСЯ-Vβ-антителами. Очевидно, что поскольку аутоантитела встречаются повсеместно у взрослых индивидуумов, то, по всей вероятности, они имеются и у детей на недетектируемых уровнях. Это подтверждается данными, представленными в табл. 2, где показано, что у детей с недавно диагностированным диабетом типа Ι, наблюдаются высокие уровни антител по сравнению с уровнем антител у индивидуумов группы позитивного и негативного контроля, у которых обнаруживались антитела Ιί.Ά.
- 46 015629
Таблица 2
Реактивность сыворотки против моноклональных анти-ТСЕ-νβантител у детей с недавно диагностированным диабетом и у детей, не страдающих диабетом
Тип индивидуума Общее число индивидуумов Число индивидуумов, сыворотка которых реагирует на анти-ТСН-νβантитела Интервал значения индекса тест/контроль* Средний индекс
Индивидуум с недавно диагностированным диабетом 8 7 1,8-3,8 2,7 ± 0, 8
ХСА-позитивный индивидуум, не страдающий диабетом 10 5 1,2-1,5 1.3 ± 0, 1
1СА-негативный индивидуум, не страдающий диабетом 10 3 1,2-2,1 1,6 ± 0,5
★ Интервал индексов вычисляют по отношению величин оптической плотности тестируемой сыворотки, разведенной 1:30, с величиной оптической плотности, полученной только с использованием разбавителя (культуральной среды).
• Микротитрационный планшет покрывали анти-ТСК-νβантителом.
• Сыворотку разводили 1:30 в культуральной среде.
• Связывание детектировали с использованием конъюгированного с пероксидазой антитела против человеческих 1д и соответствующего субстрата.
Пример 4. Метастазы рака
Аутоантитела также участвуют в развитии метастазов рака посредством связывания с СР1заякоренными молекулами, такими как иРАК, которые взаимодействуют с актиновым цитоскелетом и стимулируют клеточную подвижность (см. стр. 51 англ. текста). Другими примерами, где иРАК или аналогичные молекулы могут быть ответственны за сохранение цитоскелета, являются нарушение оптимальной функции СЕТК при кистозном фиброзе (см. стр. 54 англ. текста) или артрите, где синовиальные клетки, несущие такие молекулы, проникают в хрящ и в кость (см. стр. 50 англ. текста).
На фиг. 2 показана человеческая опухолевая клеточная линия в присутствии иррелевантного антитела, а на фиг. 3а и 3Ь проиллюстрировано воздействие моноклонального антитела против анти-ТСК-νβантител на ту же самую опухолевую клеточную линию, обнаруживающую изменение актинового цитоскелета и клеточную протрузию, указывающую на подвижность клеток после 30-минутного инкубирования.
Пример 5. Секвенирование других антител
Гены, кодирующие пять дополнительных перекрестно реагирующих мышиных моноклональных антител против анти-ТСК^в-антител, клонировали и секвенировали методами, описанными выше в примере 1. Клеточные линии, из которых были выделены последовательности моноклональных антител, представляют собой клеточные линии, обозначенные здесь 13.42а, 32.15, 32.17, 32.75 и 32.2. Антителами, продуцируемыми клеточными линиями 32.15, 32.17, 32.75 и 32.2, являются антитела 1дМ, то есть антитела, которые были клонированы и секвенированы, как описано в примере 1. Антителом, продуцируемым клеточной линией 13.42а, является антитело 1дС.
Результаты
Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей представлены на фиг. 4А-4Е. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности νΗ и νΕ антитела, продуцируемого клеточной линией 13.42а, представлены на фиг. 4А (8ЕЦ ГО ΝΝ:17-20). Нуклеотидные и аминокислотные последовательности νΗ и νΕ антитела, продуцируемого клеточной линией 32.15, представлены на фиг. 4В (8ЕЦ ГО ΝΝ:33-36). Нуклеотидные и аминокислотные последовательности νΗ и \Е антитела, продуцируемого клеточной линией 32.17, представлены на фиг. 4С (8ЕЦ ГО ΝΝ:49-52). Нуклеотидные и аминокислотные последовательности ΥΗ и νΕ антитела, продуцируемого клеточной линией 32.75, представлены на фиг. 4Ό (8ЕЦ ГО ΝΝ:65-68). Нуклеотидные и аминокислотные последовательности νΗ и νΕ антитела, продуцируемого клеточной линией 32.2, представлены на фиг. 4Е (8ЕС) ГО ΝΝ:81-84).
Исходя из этих последовательностей были получены гипервариабельные области, которые на фиг. 4А-4Е подчеркнуты. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности гипервариабельной области
- 47 015629 антитела, продуцируемого клеточной линией 32.42а, представлены на фиг. 4А (8Е0 ΙΌ ΝΝ: 21-32). Нуклеотидные и аминокислотные последовательности гипервариабельной области антитела, продуцируемого клеточной линией 32.15, представлены на фиг. 4В (8Е0 ΙΌ ΝΝ-.37-48). Нуклеотидные и аминокислотные последовательности гипервариабельной области антитела, продуцируемого клеточной линией 32.17, представлены на фиг. 4С (8Е0 ΙΌ ΝΝ:53-64). Нуклеотидные и аминокислотные последовательности гипервариабельной области антитела, продуцируемого клеточной линией 32.75, представлены на фиг. 4Ό (8Е0 ΙΌ ΝΝ-.69-80). Нуклеотидные и аминокислотные последовательности гипервариабельной области антитела, продуцируемого клеточной линией 32.2, представлены на фиг. 4Е (8ЕО ΙΌ ΝΝ:85-96).
Последовательности гипервариабельных областей, определенные для клеточных линий 13.42а, 32.15, 32.17, 32.75 и 32.2, сравнивали с последовательностями гипервариабельных областей, идентифицированных, как описано в примере 1, для того, чтобы определить, какие именно остатки гипервариабельной области играют важную роль в перекрестном связывании с анти-ТСВ-Ув-антителом (то есть какие именно остатки гипервариабельных областей играют важную роль в мультиспецифической реактивности с эпитопом, содержащим бй-якорь; с анти-ТСВ-Ув-антителами; с молекулами, способными передавать сигнал; с фосфолипидами, включая фосфатидилинозит, фосфатидилсерин и кардиолипин (диацилглицерин); с фосфолипид-гликанами; с вторичными посредниками действия инсулина и с одноцепочечными или двухцепочечными ДНК). Сравниваемые гипервариабельные области представлены ниже в табл. 3 и 4.
Таблица 3
Последовательности гипервариабельной области (СОК) тяжелой цепи
СРК-Н1 СРЕ-Н2 СРЕ-НЗ
Пример 1 ΟΥΤΡΤΕΝΝΙΝΜ ΝΙΥΡ3Ρ3ΥΤΝΥΝ0ΚΓΚΡ ЬЕСЬЬРОУ
Клеточная линия 13.42а 3ΥΑΕΤ3ΥΝΜΕΗ ΥΙΡΡΥΝ3ΡΤΚΥ30ΚΓΚΟ Κ6ΜΤΤ3ΥΑ
Клеточная линия 32.15 ΟΥΤΕΤΝΥΟΜΝΝ ΗΙΝΤΥΤΟΕΡΤΪΑϋΟΕΚΟ Ε&ΡΥΟΝΥΕ
Клеточная линия 32.17 ΟΥΤΕΤΕΝΝΙΝΗ ΝΙΥΡ3Ρ3ΥΤΝΥΝ0ΚΓΚΡ ЬКСЬКРРУ
Клеточная линия 32.75 ΟΥΤΕΤΕΝΚΙΝΜ ΝΙΥΡ5ϋ5ΥΤΝΥ№ΚΓΚΡ ЬКСЬЬРР¥
Клеточная линия 32.2 6ΥΤΓΤΝΥεΜΝΗ ΝΙΝΤΥΤΟΕΡΤΥΑΡΟΓΚΟ Ε3ΠΥ6ΝΥΓ
Консервативные остатки 6Υ-ΓΤ -и -I Υ---ΓΚ-
Таблица 4
Последовательности гипервариабельной области (СРЕ) легкой цепи
СРЕ-Ы СРЕ-Ь2 СРК-ЬЗ
Пример 1 КАЗОЫУРТПУА 3Α3ΥΕΥ3 ΟΟΥΝ3ΥΡΕΤ
Клеточная линия 13.42а ΕΑ30ΡΙ3ΝΥΠΝ УТЗКЬНЗ 003ΝΤΓΡΤΕ
Клеточная линия 32.15 ΚΆ3ζ)Νν(3ΤΝνΑ 3Α3ΥΚΥ3 00ΥΝ3ΥΡΚΤ
Клеточная линия 32.17 ЕА333133МУЬ ΚΤ5Ι1Α3 ООСЗЗЗРЬТ
Клеточная линия 32.75 ΚΑ3ζ)ΝνΡΤΝνΆ 3Α5ΥΚΥ3 ΟΟΥν^υρρτ
Клеточная линия 32.2 КАЗОЙУСТИУА 3Α3ΥΚΥ3 ООУМЗУРЬТ
Консервативные остатки -АЗ - — 3 -3 00 р—
Анализ указанных последовательностей гипервариабельных областей выявил важную информацию об остатках, необходимых для перекрестного связывания с анти-ТСЯ-Ув-антителами (то есть о мультиспецифической реактивности с описанным здесь бй-якорь-содержащим эпитопом).
Во-первых, анализ этих последовательностей позволяет предположить, что конкретные аминокислоты могут играть важную роль в некоторых положениях каждой СОВ. Консенсусная последовательность, генерированная для каждой СОВ и включающая в себя аминокислоты, которые являются полностью консервативными для всех шести антител, была клонирована и секвенирована авторами настоящего изобретения. В нижеследующих консенсусных последовательностях х может означать любую аминокислоту, а означает пептидную связь.
- 48 015629
С0В-Н1 Ο-Υ-х-Г-Т-х-х-х-х-х-И
С0К-Н2 χ-Ι-χ-χ-χ-χ-χ-χ-χ-χ-Υ-χ-χ-χ-Γ-Κ-χ
СОК-НЗ Не полностью консервативные остатки
ΟϋΒ-Ы х-А-З-х-х-х-х-х-х-х-х
СОК-Ь2 х-х-З-х-х-х-З
СРВ-ЬЗ О-С-х-х-х-х-Р-х-х
Во-вторых, анализ последовательностей позволяет получить общую формулу для каждой СЭВ. В нижеследующих формулах, где, как было обнаружено, в данном положении в СОК присутствуют два или более аминокислотных остатков, эти остатки указаны в скобках.
ΟϋΚ-ΗΙ е-Υ-[ТА]-Г-Τ'[ΚΝ3]-[ΥΝ]-[№3Ν]- [ΙΜ]-[ΝΓ]-И
СОВ-Н2 [ΝΗΥ]-I-[ΥΝϋ]-[ΡΤ]-[5Υ]-[ΡΝΤ]-[30]-[ΥϋΕ]-[ΤΡ] -[ΝΚΤ]
Υ-[Ν3Α]-[00]-[Κϋ]-Г-К-[РС]
СОВ-НЗ [ОКЕ]-[ВС]-[СМЬ]-[ЬТУ]-[ЬТС]-[Ρ3Ν]-[ϋΥ]-[ΥΑΓ]
СОВ-Ы [КВ] -Α-8~[ζ>3] - [N03] -[VI]-[ϋ53]-[ΤΝ3]-[ΝΥ]~[ΥΕΥ] [АЫЪ]
С0Е-Ь2 [3ΥΒ]-[АТ]-5-[ΥΚΙ]~[КЬ]-[ΥΗΑ]-3
СОВ-ЪЗ 0-0-[Υ0]-[Ν5]-[ТЗ]-[ΥΓ5)-₽-[ЬТР]-[ТЕ]
Таким образом, вышеуказанные общие формулы охватывают каждую из последовательностей СОК для шести моноклональных антител 1дМ и 1§С. которые были клонированы и секвенированы авторами настоящего изобретения.
В-третьих, анализ последовательностей позволяет получить аминокислотную формулу для каждой СОК с учетом не только консервативных аминокислот, но также и большого числа обычно встречающихся (преобладающих- аминокислот в каждом положении СОК. В нижеследующих формулах перечислены консервативные или численно преобладающие аминокислоты, за исключением тех аминокислот, которые, как было обнаружено, являются одинаково преобладающими в данном положении (то есть аминокислот, число которых, как было обнаружено, встречается одинаковое число раз в клонированных и секвенированных СПК-, где эти одинаково преобладающие аминокислоты даны в скобках.
С0К-Н1 Ο-Υ-Τ-Γ-Τ-Β-[ΥΝ]-И-[ΙΜ]-Ν-Η
С0К-Н2 Ν-Ι-Ϊ-Ρ-[3Υ]-ϋ-[ЗС]-Υ-Τ-Ν-Υ-Ν-φ-Κ-Γ-Κ-[ϋθ]
0ΌΚ-Η3 Ь-[КЗ]-С-Ь-Ь-Р-[ϋΥ]-Υ
ΟϋΚ-ΙΖ Κ-Ά-5-Ο-Ν-ν-[Ρ5Ο]-Τ-Ν-ν-Α
3ΌΚ-Τ2 3-Α-3-Υ-Β-Υ-3
СОК-ТЗ ΰ-Ο-Υ-Ν-3-Υ-Ρ-Ι,-Τ
Очевидно, что пептиды, которые содержат аминокислотную последовательность или состоят из аминокислотной последовательности, соответствующей одной или нескольких из вышеуказанных консенсусных последовательностей и формул, будут обладать биологической активностью, эквивалентной биологической активности пептидов, протестированных ίη νΐνο, как описано ниже в примерах 6 и 7, и могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением.
Пример 6. Испытания фазы Ι/Па
Клинические испытания фазы 1/11а с участием двенадцати мужчин с интолерантностью к глюкозе были проведены методом двойного слепого контроля с введением плацебо в целях анализа на безопасность и переносимость ΝΌΧ-Ι. ΝΏΧ-Ι представляет собой смесь из трех пептидов согласно изобретению (В71, С80 и Е90-, смешанных в отношении 2:1:1. В71 представляет собой гомодимер из мономерных пептидов, происходящих от СПК-Н2, где каждый из мономеров содержит аминокислотную последовательность, представленную в 8Еф ΙΌ N0:8, и дополнительный Ν-концевой цистеиновый остаток. Аминокислотная последовательность мономерного пептида В71 представлена в 8Еф ΙΌ N0:159. С80 представляет собой гомодимер из мономерных пептидов, происходящих от СПК-Н3, где каждый из мономеров содержит аминокислотную последовательность, представленную в 8Еф ΙΌ N0:10, и дополнительный Ν-концевой цистеиновый остаток. Аминокислотная последовательность мономерного пептида С80 представлена в 8Е0 ΙΌ N0:160. Е90 представляет собой гомодимер из мономерных пептидов, происходящих от СПК-Е3, где каждый из мономеров содержит аминокислотную последовательность, представленную в 8Еф ΙΌ N0:16, и дополнительный ^концевой цистеиновый остаток. Аминокислотная последовательность мономерного пептида Е90 представлена в 8Еф ΙΌ N0:161. Пациентам произвольно вводили всего 4 внутримышечных (1.т.- инъекции тестируемого вещества, пептидной смеси N0X4 или плацебо, начиная со дня 1 и с перерывом в одну неделю. Трем индивидуумам вводили инъекцию плацебо, состоящего из 0,1% альгидрогеля в 1,1 мл физиологического раствора. Девяти индивидуумам вводили 0,99 мг пеп
- 49 015629 тидной смеси ΝΏΧ-1 в 1,1 мл физиологического раствора, содержащего 0,1% альгидрогеля. Инъекции плацебо и тестируемого вещества визуально не отличались друг от друга.
Пептидная смесь ΝΏΧ-1 хорошо переносилась пациентами. У индивидуумов, подвергаемых лечению, по сравнению с индивидуумами до лечения, концентрации глюкозы, инсулина и глюкагона натощак значительно не отличались. Пероральный тест на толерантность к глюкозе (ОСТТ) проводили за 1 день до первой инъекции и на день 43 после инъекции. В обоих случаях пробу крови брали до приема 75 г глюкозы и через 30, 60, 90 и 120 мин после приема глюкозы.
У индивидуумов, которым вводили пептидную смесь ΝΏΧ-1, через два часа наблюдалось значимое снижение концентрации глюкозы в сыворотке, по сравнению с концентрацией глюкозы у индивидуумов, которым давали плацебо (р = 0,03). Время, необходимое для достижения наименьших уровней глюкагона у индивидуумов ΝΏΧ-1-группы, на день 1 составляло 113,3 ± 13,2 мин, которое затем на день 43 снижалось до 63,3 ± 41 мин (р=0,0027; см. фиг. 5). По окончании испытаний, у индивидуумов, которым вводили ΚΟΧΗ, и у индивидуумов, которым вводили плацебо, также наблюдалось значимое различие в процентах изменения уровней креатинина (р=0,0009), натрия (р=0,0344), хлорида (р=0,0041) и мочевины (р=0,0156) в плазме по сравнению с базовыми уровнями. Эти изменения соответствовали прогрессированию заболевания у индивидуумов, которым вводили плацебо, но не у индивидуумов тест-группы. Кроме того, в этих ОСТТ-исследованиях, у индивидуумов тест-группы, результаты, полученные для уровней глюкозы и глюкагона через 2 ч после введения пептидной смеси ΝΏΧ-1, продемонстрировали эффективность этой смеси в ауторегуляции гликемии.
Пример 7. Испытания фазы ПЬ, в которых участвовали пациенты с диабетом типа 2
В рандомизированном испытании, проводимом в течение 16 недель двойным слепым методом, участвовали 31 пациент (21 мужчина и 10 женщин) с сахарным диабетом типа 2, которые перорально принимали одно или несколько антидиабетических средств. На день 1 прием всех антидиабетических средств был прекращен. Пациентов произвольно помещали либо в группу, которая получала плацебо (группа С), либо в одну из трех тест-групп, описанных как группы А, В или Ώ. Начиная со дня 1, пациентам всех групп вводили всего 4 1.т. инъекции с перерывом в одну неделю. Пациентам плацебо-группы (8 индивидуумов) вводили 1,2 мл физиологического раствора, содержащего 0,1% альгидрогеля. Пациентам группы А (7 индивидуумов) вводили 1,51 мг пептида согласно изобретению (обозначенного здесь ΝΏΧ71) в 1,2 мл физиологического раствора, содержащего 0,1% альгидрогеля. Пациентам группы В (8 индивидуумов) вводили 0,86 мг ΝΏΧ-71 в 1,2 мл физиологического раствора, содержащего 0,1% альгидрогеля. Пациентам группы Ώ (8 индивидуумов) вводили смесь из 3 пептидов согласно изобретению (0,92 мг ΝΏΧ-71, 0,68 мг С80 и 0,71 мг Р90) в 1,2 мл физиологического раствора, содержащего 0,1% альгидрогеля. Плацебо и исследуемые препараты визуально не отличались друг от друга. Пептид ΝΏΧ-71, используемый в этом примере, представляет собой пептид В71, описанный в примере 6. Пептиды С80 и Р90, используемые в этом примере, представляют собой пептиды С80 и Р90, описанные в примере 6.
Во время всего исследования пробы крови, взятые у пациентов через регулярные интервалы времени, анализировали на клиническую безопасность и на их эффективность в улучшении гликемических параметров. Все тестируемые вещества хорошо переносились пациентами. Во всех группах параметры, относящиеся к клинической безопасности, не отличались от базовых параметров. В данном исследовании каких-либо побочных эффектов, вызываемых тестируемыми веществами, не наблюдалось.
В течение 4 месяцев после прекращения приема лекарственных средств, у индивидуумов плацебогруппы наблюдалось заметное ухудшение регуляции уровней глюкозы в крови, как было определено по уровням НЬА1с, по уровням глюкозы в крови натощак и по уровням фруктозамина (см. фиг. 6-8). На день 113, средние уровни НЬА1с повышались от базового уровня, составляющего 6,3%, до уровня 8,3%. Однако у пациентов тест-группы, которым вводили высокие дозы, уровни НЬА1с почти не изменялись со времением, то есть на день 113, эти уровни повышались всего до 6,9 (от базового уровня 6,3) и значительно отличались от уровней, наблюдаемых у индивидуумов плацебо-группы (р=0,02; см. фиг. 6).
В серии анализов, проводимых с участием 21 мужчины-волонтера, была выявлена общезначимость и высокая значимость различий между результатами, полученными для плацебо-группы (группы С), и результатами, полученными для групп А, В и Ώ, объединенных по всем исследуемым гликемическим параметрам, то есть по уровню НЬА1с (р=0,004; см. фиг. 9), уровню глюкозы в крови натощак (р=0,024; см. фиг. 10) и скорректированному уровню фруктозамина (р=0,015; см. фиг. 11). Статистически значимые различия между плацебо-группой (группой С) и тест-группой, которой вводили высокие дозы вещества (группа А), по различным параметрам составляли: НЬА1с р < 0,001, глюкоза натощак, р=0,005 и скорректированный фруктозамин, р=0,001. Лечение, направленное на снижение уровней глюкозы в крови у тест-групп по сравнению с плацебо-группой, обеспечивало нужный эффект в ауторегуляции гликемии.
В этом примере продемонстрировано, что после прекращения перорального приема антидиабетических средств, у пациентов, которые получали дозу 1,51 мг ΝΏΧ-71, сохранялась высокая способность к регуляции уровней глюкозы в крови. Кроме того, действие ΝΏΧ-71 было продолжительным, то есть нужный эффект наблюдался даже через 3 месяца после приема последней дозы ΝΏΧ-71. У индивидуу
- 50 015629 мов, которые принимали более низкую дозу, то есть 0,86 мг ΧΏΧ-71 и смеси из трех пептидов, также наблюдалось улучшение, по сравнению с плацебо-группой, что указывало на то, что ΧΏΧ-71 давал нужный дозозависимый эффект, а следовательно введение более высоких доз или более частых инъекций может давать еще лучшие результаты.
Пример 8. Анализ известных последовательностей
С использованием последовательностей гипервариабельных областей, идентифицированных, как описано в примерах 1 и 5, были идентифицированы последовательности гипервариабельных областей, присутствующих в известных УН- и УЪ-областях с соответствующими связывающими свойствами. Затем последовательности гипервариабельных областей, присутствующих в известных УН- и УЪ-областях, сравнивали с последовательностями гипервариабельных областей, идентифицированных в примерах 1 и 5, для проведения анализа остатков гипервариабельных областей, играющих важную роль в перекрестном связывании анти-ΤСК-Vβ-антител (то есть остатков гипервариабельных областей, играющих важную роль в мультиспецифической реактивности антитела с СΡI-якорь-содержащим эпитом, описанным в настоящей заявке). С помощью того же самого анализа последовательностей, описанного в примере 5, были идентифицированы и другие наборы консенсусных последовательностей и формул, проиллюстрированных на фиг. 12А-12Е.
Регистрационные номера известных УН- и УЪ-областей, которые были идентифицированы, указаны на фиг. 12А-12Е. Специфичности связывания, описанные ранее для указанных УН- и УЪ-областей, также проиллюстрированы на фиг. 12А-12Е, где были использованы следующие сокращения:
Анти-КР Анти-СЪ Анти-РНК Анти-оцДНК Анти-ИА Анти-УА Анти-СО8 Анти-ТС Анти-3Н1 Анти-К0 Анти-ТККА
Последовательности гипервариабельных областей ЦС и ЦМ, идентифицированные в примерах 1 и 5, были проанализированы отдельно, как описано в этом примере, поскольку они имели, как было обнаружено, другие консенсусные последовательности и формулы.
Для последовательностей СОК-Н1 ЦМ были идентифицированы нижеследующие консенсусные последовательности и формулы (см. фиг. 12А):
Антитело против ревматоидного фактора
Антитело против кардиолипина
Антитело против РНК
Антитело против одноцепочечной ДНК Антинуклеарное антитело
Антитело против альфа-цепи вариабельной области
Антитело против СЭ8
Антитело против тироглобулина
Антитело против идиотиптического антитела 3Н1
Антитело против К0
Антитело против ТгкА (высокоаффинного рецептора ЫСР)
Для последовательностей СОК-Н1 ЦС были идентифицированы нижеследующие консенсусные последовательности и формулы (см. фиг. 12А):
1дС
1дС
1дС
Для последовательностей СОК-Н2 ЦМ были идентифицированы нижеследующие консенсусные последовательности и формулы (см. фиг. 12В):
СЭН-Н2
СОВ-Н1
СБР.-Н1
СОК-Н1
С-Υ-[ΆΤ3]-г-[Т/3]-[3ϋσ]-Υ-[ЫИУ]-Μ-[ΡΟΗΝ]-и
3-Υ-Τ-Γ-Τ-3-Υ-Η-Μ-Η-Η
СОЕ-Н2
1дМ
1дМ χ-Ι-χ-χ-χ-χ—χ-χ-χ-χ-Υ-χ-χ—χ—Е—К—х [ΝΗΕΑΥ]-I-[ΥΝΩ]-[РТ]-[5Υ6]-[βΤΟΥ]- [560]-[УЕС5] [ТР] - [ΝΤΥ63] -Υ- [ΝΑΙ]- [<2ОЕ] - [КО] -Е-К- [ОСЫ]
Ν-Ι-Υ-Ρ-3-Ο-3-Υ-Τ-Ν-Υ-Ν-0-Κ-Ε-Κ-6
1дМ
Для последовательностей СОК-Н2 ЦС были идентифицированы нижеследующие консенсусные последовательности и формулы (см. фиг. 12В):
СС+.-Н2
СЭК-Н2
ΟΏΚ-Η2
1дС
1дС χ-Ι-χ-Ρ-χ-χ-χ-χ-Τ-χ-Υ-χ-χ-Κ-Е-х-С [ΥΗΚΝΟΚ]-I- [ϋΝ]-Ρ-[ΥΑΕΕ3]-[ΝΥ3]-[Οϋ)-[ϋ36]-Τ[ΚΕΞΚΝ]-Υ-[3ΑΝ]-[ОЗЕР]-Κ-Ε-[КОТ]-С [ΥΗ]-Ι-Ν-Ρ-Υ-Ν-6-ϋ-Τ-[Ε3]-Υ-Ν-0-К-Е-К-С
1дС
Для СОК-Н3 консенсусные последовательности или формулы не были идентифицированы, поскольку в этой СОК была обнаружена высокая степень вариабельности последовательностей и их длин.
СОКН2
- 51 015629
Для последовательностей СОЯ-Ы Ι§Μ были идентифицированы нижеследующие консенсусные последовательности и формулы (см. фиг. 12С):
1дМ х-А-З-х-х-х-х-х-х-х-х сов-и
С0Н-Ъ1
1дМ [КК]-А-3-[03]-[Ν3βΤ]-[VI]-[ϋ63Κ]-[Τ3ΥΝΚ]-[ΝΑΡΥ][УУСЬ]-[АЬО)
СОВ-Ь!
Κ-Α-5-0-Ν-ν-3-Τ-Ν-ν-Α
1дМ
Для последовательностей СОЯ-Ы Ι§Ο были идентифицированы нижеследующие консенсусные последовательности и формулы (см. фиг. 12С):
Для последовательностей СОЯ-Ь2 Ι§Μ были идентифицированы нижеследующие консенсусные последовательности и формулы (см. фиг. 12Ό):
СОН-02 1дН х-х-З-х-х-х-З
С0В-Ь2 1дМ [ЗВИ]- [АТ]-3-[ΥΙΤ]-[НЫ-[ΥΑΕ]-3
СБК-Ь2 1дМ З-А-5-Υ-Κ-Υ-3
Для последовательностей СОЯ-Ь2 Ι§Ο были идентифицированы нижеследующие консенсусные последовательности и формулы (см. фиг. 12Ό) :
1дС х-Т-5-х-Ь-х-х
СОК-02
СОК-02
1дС [ΥΟβΤΚ]-Τ-3-[ΚΝΚν]-Ъ-[НАС]-[ЗР]
С0К-Ь2
1дс
Для последовательностей СОЯ-Ь3 последовательности и формулы (см. фиг. 12Е):
Υ-Τ-5-Ы-Ь-А-З !дМ были идентифицированы нижеследующие консенсусные
Для последовательностей СОЯ-Ь3 Ι§Ο были идентифицированы нижеследующие консенсусные последовательности и формулы (см. фиг. 12Е):
Известно, что все последовательности областей Ун и УЬ, проанализированные, как описано в этом примере, связываются с молекулами, участвующими в централизованном механизме патогенеза заболеваний, описанных в настоящей заявке и в νΟ99/05175, как проиллюстрировано на фиг. 12Α-12Β. Кроме того, последовательности проанализированных гипервариабельных областей имеют значительную структурную гомологию с последовательностями гипервариабельных областей, идентифицированных авторами настоящего изобретения, как описано в примерах 1 и 5. В соответствии с этим, очевидно, что пептиды, которые содержат аминокислотную последовательность или состоят из аминокислотной последовательности, соответствующей одной или нескольких из вышеуказанных консенсусных последовательностей и формул, будут обладать биологической активностью, эквивалентной биологической активности пептидов, протестированных ίη νίνο, как описано выше в примерах 6 и 7, и могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением.
Пример 9. Дополнительный анализ последовательностей СОЯ-Н2
Был проведен дополнительный анализ последовательностей СОЯ-Н2 в известных последовательностях областей Ун и ΫΕ, который показал, что в перекрестном связывании анти-ТСЯ-Vβ-антител, вероятно, участвуют дополнительные аминокислотные остатки. В частности, для определения остатков, которые наиболее часто встречаются в каждом положении СОЯ-Н2 и обладают специфичностью связывания, последовательности СПЯ-Н2, происходящие от 67 известных последовательностей νΉ-областей с релевантной специфичностью связывания, сравнивали с последовательностями СПЯ-Н2, идентифицированными авторами настоящего изобретения.
Были идентифицированы нижеследующие формулы, которые в каждом положении СОЯ-Н2 включают любой остаток, который, как было обнаружено, встречается в этом положении в шести или более последовательностях из 67 проанализированных последовательностей СОЯ-Н2.
С0К-Н2 [ЕУИЗЬ]-I-[Υ3ΝΡ]-[РЗН]-[5ΘΝΥ]-[ΟΞΝΤϋ]-[3Εϋ][УТСЗ] - [ΤΙΑ] - [ΝΥ] - [ΥΝ] - [ΝΆΡ] - [ΟϋΞΕΡ] - [КЗЬ] -[РУК] - 52 015629
Были идентифицированы нижеследующие формулы, которые, в каждом положении СЭЯ-Н2 включают любой остаток, который, как было обнаружено, встречается в этом положении в десяти или более последовательностях из 67 проанализированных последовательностей СЭЯ-Н2.
СЭК-Н2 Е-Ι- [Υ3Ν] - [РЗ] - [30Ν] - [СЗ] - [ЗС] - [ТСЗ ] -Т- [ΝΥ] -Υ[ΝΆΡ] - [ОРЗ] - [КЗ] - [ГУК] - [К<2] - [<ЗК]
Были идентифицированы нижеследующие формулы, которые в каждом положении СЭЯ-Н2 включают любой остаток, который, как было обнаружено, встречается в этом положении в двадцати или более последовательностях из 67 проанализированных последовательностей СЭЯ-Н2. Положения, в которых, как было обнаружено, данная аминокислота не встречается двадцать или более раз в 67 проанализированных последовательностях СОЯ-Н2, обозначены х, что означает, что в этом положении может присутствовать любая аминокислота:
СПК-Н2 х-1-х-Р-3-С-С-Х-Т-У-х-А-Р- [КЗ] - [ГУ] -К-С
Очевидно, что пептиды, которые содержат аминокислотную последовательность или состоят из аминокислотной последовательности, соответствующей одной или нескольким из вышеуказанных формул, будут обладать биологической активностью, эквивалентной биологической активности пептидов, протестированных ίη νίνο, как описано выше в примерах 6 и 7, и могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением.
Библиография
1. Раупе 1., НиЬет В. Т., Саппоп Ν. А., 8сЬпе1бег Я., 8сЫ1йат М. ^., АсЬа-ОтЬеа Н., МасЭопа1б Н. Я. апб Непдайпет Н. (1988). Ргос. №111. Асаб. 8сБ, 85:7695-7 698.
2. Ноорег Ν. М., ВгоотПе1б 8. 1. апб Тигпег А. 1. (1991). ВюсЬет. 1. 273:301-306.
3. 8а1йе1 А. Я. (1990). 1)1№е1ез Саге 13:244-256.
4. Яотего С., Бийте11 Б., Яодо1 А., 2е11ет К., Неи1ей Е. апб Батет 1. (1988). 8с1епсе 240:509-511.
5. Рете/ Р. Я., СазаЬ1е1 X., Сашта 1. Р., 2ида7а 1. Б. апб Сазаηиеνа Р. Р. (1997). Епбосппо1оду 138: 264-272.
6. Р1ре1еегз Ό. С., 8сЬиН Р. С, ш' ΐ Уе1б Р. А., НоодЬе-Ре!ет8 Е. Б., Уап бе \Утке1 М. апб Сер1з ^. (1985). Епбосппо1оду 117:824-833.
7. МатсЬеШ Р., 8сЬагр Ό. ^., Мс1еаг М., СтдепсЬ Я., Р1пке Е., О1аск В., 8иапзоп С, С1аппатеШ Я. апб Баасу Р. Е. (1994). 01аЬе1ез 43:827-830.
8. Тобб 1., Ве11 1. апб МсБемИ Н. О. (1989). №Пиге 329:599-604.
9. К1тр1так1 Т., Кирба А., Натататеп А-М., Кикко М., Ки1ата Р., 8аео1а К., 81те11 Т., Кезктеп Р., 11опеп 1., 81те11 О. апб Кшр М. (2001). 1. С1т. Епбоспп. Ме1аЬ. 86:4782-4788.
10. Вагпей А. Н., ЕГГ С, Безйе Я. Ό. С. апб Руке Ό. А. (1981). 01аЬе1о1од1а 20:404-409.
11. Т1зс1 Я. апб МсБемИ Н. (1996). Немей Се11 85:291-297.
12. Саз1апо Б. апб Е1зепЬаг111 С. 8. (1990). Апп. Яеν. 1ттипо1. 8:647-680.
13. Надор1ап ^. А., Каг1зеп А. Е., Сойза1ет А., Бапбт-О1ззоп М., СтиЬт С Е., 8ипбку1з1 С., Ре1егзеп ί. 8., Вое1 Е., ЭузЬегд Т. апб Ьетптатк А. (1993). 1. Сйп. 1пеезБ 91:368-374.
14. Раззш1 Ν., Бапдап ί. Ό., Сепоеезе 8., Аре11а Е., 81шдад11а Р. апб Яодде Ь. (1995). Ргос. №111. Асаб. 8сБ 92:9412-9416.
15. Яоие Я. Е., БеесБ Ν. 1., №рот С. Т. апб МсСи11осЬ Ό. К. (1994). 01аЬе1ез 43:87-94.
16. ЕЦепЬайй С. 8. (1994). 1)1№е1ез Саге 17:605-607.
17. Оаше1 Ό., С111 Я. С., 8с111оо( Ν. апб Уедтапп Ό. (1995). Еиг. 1. 1ттипо1. 25:1056-1062.
18. Яобег М. Е., Ктр М., НагШпд 8. С., Када1атеп 1., АкегЬ1от Н. К., Втбег С. апб 111е С1и1б1юоб б1аЬе1ез шРш1апб 8й.1бу Сгоир (1994). 1. С1т. ЕпбосппоБ Ме1аЬ. 79:1570-1575.
19. Ошпееп 8., Ака1б А., Тигк Ό. апб Βίζζη Я. (1995). 01аЬе1о1од1а 38:337-343.
20. К1етЬаит 1. апб 81атооп Н. (1983). 01аЬе1ез 32:493-498.
21. КаЬп 8. апб На1Ьап Р. (1997). 1)1№е1ез 46:1725-1731.
22. ВоШ, С. В., Тза11к1ап Е., Наутопб М. ^., Сгуег Р. Е. апб СепсЬ 1. Е. (1984). 1. С1т. 1^ез1, 73:1532-1541.
23. Бои М. С. (1989). РА8ЕВ 1. 3:1600-1608.
24. 8ЬазЬкт Р. Ν., 8ЬазЬкта Е. Е., Еегпс.|шз1-ЕогЬез Е.. ΖΙμι! Υ-Р., СгШ V. апб КаМ А. (1997). 01аЬеЮ1од1а 40:557-563.
25. Бтбедатб В. (1986). Оегта1о1одюа 172:298-304.
26. СБпзЮрБегз Е. (2001). С1т. Ехр. Эегта1о1. 26:314-320.
27. 1исс1 А., У1дшш М., Ре1Бт1 С, Спйо А. апб Ргайпо Р. (1977). Агс1. Эегта!о1. Яез. 257:239-246.
28. ВгепеШ 8. Б., Могаез А. М., Моп1е-А1едте 8., СагеаПю О. М. апб 8ааб М. 1. (1995). Вш. 1. Меб. Вю1. Яез. 28:297-301.
29. Епа Р., Мабебби Р., С1опозо Ν., Септе1е Ό апб ЯарреШ А. (1985). Ас1а СатбюБ 40:199-205.
30. Уеппекег С. Т., Эаз Р. К., Метатб1 М. М., νаη Мапе 1., νаη Уееп Н. А., Воз 1. Ό. апб АздЬат 8. 8. (1994). 1. РаШо1. 172: 189-197.
- 53 015629
31. Натха 8. Н., е1-Махпу Н. К. апй АЬйайай М. А. (1978). Вг. 1. Пегта!о1. 99:289-292.
32. Та1еЬ А. (2000). Р1дтеп! Се11 Кек. 13 8ирр1 8:41-47.
33. Котапо С., МогеШ С., Όί Вепейе!!о А., СюГге С, Όί Секаге Е., Кикко С., СайГапо Ь апй Систойа Ό. (1998) И1аЬе!ек Кек. С1т. Ргас!. 39: 101-106.
34. Тка!тай М., Апсапк 1. апй ТЕойу А. 1. (2002). 1. НЩосЕет. Су!осйет. 50:125-134.
35. Ка!кик1 А., 8ит1йа Υ., МигакЫта 8., Еиги!а М., Агак1-8акак1 К., ТкисЫйакЫ К., Ной Υ., Уапо Υ. апй АйасЫ Υ. (2000). Ш!. 1. 0Ьек. Ке1а!. Ме!аЬ. И1когй. 24:1260-1264.
36. 8сой С., Ьеорагй1 8., РгЕ'Иир 8. апй Маййеп В.С. (2002). 1. Се11 8с1. 115:1441-1451.
37. ^гайог V. М., Ми11ег 1., Уи X., АЬйе1-Ма1ек Ζ. А., Υυ Ζ. X., Ееггапк V. 1., КоЬауакЫ К, Уаката!ки К., Йо 8., Наттег 1. А. апй Неаппд V. 1. (2002). ЕакеЬ 1. 16:105-107.
38. ТоЬш Ό. 1., 8\гапкоп N. К, Рй!е1коте М. К., Ре!егк Е. М. апй 8сйа11геи!ег К. и. (2000). 1. Ра!йо1. 191:407-416.
39. МаПтех-Екрагха М., Ееггег С, Сак!е11к М. Т., Сагаа-Воггоп 1. С. апй Ζ^-ιΛί А. (2001). Ен. 1. Вюсйет. Се11 Вю1. 33:971-983.
40. Сгапйе 1. Р., Уагпег С. М., Уа1кег Н. 1., УикиП А. №, СЕепд 1., Сгау С Е., Корр 1. В. апй N311 К. А. (2002). Ехр. Вю1. Мей. 227:171-181.
41. Тат В. Υ., Сегтат Ь. апй РЫйр А. (1998). 1. Се11. Вюсйет. 70:573-586.
42. уап йеп Уупдаагй К. М., Акдйаг 8. 8., РупепЬогд А. С, Т1ддек А. 1., Уек!егйоГ V. апй Иак Р. К. (2002). Вг. 1. Иегта!о1. 146:80-87. 43. Вепег А., Ьекйшдап! С. С., ЫуотЬа В. Ь., Егоккагй Р. апй 8аагй1 Н. (2000). Еак!. Меййегг. Неа1!1 1. 6:416-424.
43. Вепег А., Ьекйшдап! С. С., ЫуотЬа В.Ь., Егоккагй Р. апй 8аагй1 Н. (2000). Еак!. Меййегг. Неайй 1. 6:416-424.
44. Негтаппк-Ье Т., Негтаппк 1. Е. апй Р1егагй С. Е. (2002). Рей1а!г. Иегта!о1. 19:12-14
45. Ка1х А. 8., СоГГ Ό. С апй Ее1йтап 8. К. (2000). Иегта!о1. 0п1ше 1. 6:1.
46. \ди\еп Т. Т. апй Ке11 М. Е. (2001). 1. Рей1а!г. 138:453-454.
47. Кшд-Тгусе К., Сагха Ь. апй 0х1ак 1. М. (2002). Техак Иерайтеп! оГ Неайй И1кеаке Ргеуепйоп \е«к 62(2): 1-3.
48. Вокке! 8., Вагге Р., С1а1оп А., КигГигк! К., Воп!е Е., Апйге Р., Ретег Р., И1кап! Е., Ье Vа^1е! В. апй №со1ак 1. Е. (2002). Еиг. 1. Пегта!о1. 12:247-252.
49. СЕипд 1. Н., 8ео 1. Υ., СЬо1 Н. К., Ьее М. К., Υοип С 8., КЫе С., С1о К. Н., К1т К. Н., Рагк К. С апй Еип Н. С (2001). 1. Шуек!. Пегта!о1. 117:1218-1224.
50. Ейак Р. М. апй С1ай1а11у К. (2002). С1ш. Сейай. Мей. 18:103-120.
51. Ьипйуу1к! К. апй 8сЕпЕй1сЕеп А. (2001). Вг. 1. Иегта!о1. 144:254-259.
52. Магксйай С, Ьепдуе1 Е., ЫоЬи!ой Т., Вгаипдай Е., Ьои^ек К., 81топ А., Мадйо1еп V., Кеишпд и. апй ЬедЕх К. (1999). 1. Екекк Иегта!о1. 113:69-76.
53. С1айа М. V., ВосаагеШ А., Όί Сгедопо 8., Тогй1 А., Со!гопео Р., Магга С., СЫг1апйа С. апй 8!гот К. (2001). А!йегокс1егок1к 158:241-246.
54. Вис! М. апй Етегу Р. (2002). Нокрйа1 Рйагтаак! 9:5-10.
55. 8а1п Е. Е. (1995). 8етш. Иегта!о1. 14:9-14
56. Китаг В., 8йагта V. К. апй 8е1да1 8. (1995). Еп. 1. Иегта!о1. 34:542-545.
57. 811е11о\\ У. V., Ей^агйк 1. Е. апй Коо 1. Υ. (1992). Ш!. 1. Пегта!о1. 31:186-189.
58. Уапд 8. 1., 8йойа! Т., Vаййе^т С, 8Ее11о\\' У., Ей\гагйк 1. апй Койег 1. Ь. (1994). Ат. 1. Мей. Сепе!. 51 :234-239.
59. МаШашеп V., Кокке1а Р. апй КеЕншеп-Каикаапшепи 8. (2000). Ьапсе! 356:1165- 1166.
60. КиикМо 1., Ко1У1к!о К., Муккапеп Ь., Не1ка1а Е. 1., Vапйапеп М., Наптпеп Т., Кегушеп К., Кекашеии Υ. А., К1еккшеп Р. 1. апй Ьаакко М. (1997). ВМЬ 315:1045-1049.
61. В1егйаик А., НоГтапп М. А., Ζ^ед1е^ К. апй Ыа^го!! Р. Р. (1998). Сагйюуакс. Кек. 37:586-600.
62. Веппе!! К. С., 1)иск\\ог111 У. С. апй Нате1 Е. С. (2000). 1. Вю1. Сйет. 275:36621- 36625.
63. Vек^е11^к К., Υе Ζ., Ош У. О., Уа1к1 Ό., Най1еу Ό., СЕекпеаи V., Кокпег М. К. апй 8е1кое Ό. 1. (2000). 1. №игокск 20:1657-1665.
64. Υапд Ь. В., Ь1 К., Мей 8., Кодегк 1 апй 81еп Υ. (2000). 1. №игоксг 20:7505-7509.
65. Кешоко В. 8., Р1теп!а А. Е. апй Ьеуй! Р. (1996). 1. Сотр. №иго1. 375:274-288.
66. 0д1ег-Эешк Е., Ваиуу С, Соиутеаи А., Ье 8!еГашк Ό., Ι к кого С. апй Сойодпо Р. (1995). Вюсйет.Вюрйук. Кек. Соттип. 211:935-942.
67. Наак и апй 8рагкк Ό. Ь. (1996). Мо1. Сйет. №игора!йо1. 29:1-14.
68. ТкикиЬа Т., 0като!о К., Υаκийа у,т Мопка\га У., №капЫи Н. апй Υататο!ο К. (2000). Мо1. Се11к 10:601-611.
69. уап Ногккеп 1., 0!!е-Но11ег Ь, Иау1й С., Маа!-8сЫетап М. Ь., уап йеп Неиуе1 Ь. Р., Уеккейпд Р., йе Уаа1 К. М. апй Vе^Ьеек М. М. (2001). Ас!а №игора!йо1. 102:604- 614.
70. 8по\г А. Ό., Маг Н., №сЕЕп Ό., КЕпа1а К.,- Ка!о М., 8ихик| 8., Накке11 1. апй У1дй! Т. N. (1988). Ат. 1. Ра!1о1. 133:456-463.
71. Ми1йег М. апй Тег\ге1 Ό. (1998). Наеток!ак1к 28:174-194.
- 54 015629
72. ЭопаРие 1. Е., Вегап Т. М., КаГл М. 8., С1азз Ό. 1., Уапсорои1оз С. Ό., Ра11оп 1. К. апР 81ора Е. С. (1999). Ргос. №ΐ. АсаР. 8ск 6468-6472.
73. Но1Реп К. I. апР Моопеу Р. А. (1994). МеР. Нуро!Резез 43:420-435.
74. Но1Реп К, I. (1995). МеР. Нуро!Резез 44:379-391.
75. №1Ьап К. 8., 8асРаг Е. I., Азшз С. М., На1Ьге1сР и. апР На1регп Р. 8. (1981). РзусР1айу Кез. 4:291300.
76. ОГГеп Ό., 8Ыа1Г В., НаРаР Ό., \Уе1/тап А., Ме1атеР Е. апР С11-АР I. (2001). №игозск Ьей. 316:129-132.
77. Майзоп М. Р., РеРегзеп ^. А., Ьиап ^., Си1тзее С. апР СатапРо1а 8. (1999). Апп. Ν. Υ. АсаР. 8с1. 893:154-175.
78. 8апРук К. (1993). 1пк I. №игозск 69:125-130.
79. Ройег С. М., МозЫгГаг А. апР Саз!опдиау Т. ^. (1999). РРузю1. ВеРау. 65:811-816.
80. Р|д1еч1сх Ό. Р., Райегзоп Т. А., 2ацозй А., Вго! М. Ό., Койтап М. апР 8хо1 Р. (1999). Ногт. Ме!аЬ. Кез. 31:335-339.
81. Ьш Ζ., \Уапд Υ., 2Рао ^., Отд I., Ме1 Ζ., Сио Ь., Сш Ό. апР Ре1 I. (2001). №игорРагтасо1оду 41:464-471.
82. 8Ыгоуата К., Мопчак1 К. апР Υиде О. (1998). 1п νί\Ό 12:527-529.
83. Сопд Ь., ^уай К. I., Вакег I. апР Маззегапо I. М. (1999). №игозск Ьей. 263:153- 156.
84. К1еш К. Ό., 8Регтап Ό., Но ^. Н., 81опе Ό., Веппей С. Ь., Мойа! В., УапР1еп К., 81ттопз Ь., Си р., Нопдо I. А., Ьеуаих В., Рои1зеп К., Агташш М., №хак| С, Аза1 Ν., СоРРагР А., РРРРрз Н., НепРегзоп С. Е., ТакайазЫ М. апР Козеп!Ра А. (1998). №11иге 387:717-721.
85. Т1е1)еп С. Е., Ьау М., Мгпз Ь., Аигога 8., Накогзеп А., 8сРи11х Ь. К. апР ЬеуРге 8. К. (1998). №иго1оду 50:1433-1440.
86. 1асоте Ό. Е. (2001). НеаРасРе 41: 895-898.
87. Не1пх1еГ 0., А1аточйсР 8., 8аζРονйсР У., СРР1е1 Р., Лои(е1 А., Тоигшег- Ьаззегуе Е. апР Кои11е!Е. (2000). Ас1а №иго1од. 8сапР. 101:36-40.
88. \УР1ег 8., Аз^заШют Ь, СРеипд К. К., СипагаШат Ь., КиЫак У., Сойех М. А., Мозсаге11о М., О'Соппог Р. У!, МсКегРе С, Вескег Ό. I. апР ПозсР Н-М. (2001). I. 1ттипо1. 166:2831-2841.
89. Ргосаса У., АРацШа К. А., КоЬей, М. С., СЫссо Ό., Ап1опасс1 Ν., УепРет1а1е С. апР АРотаге Е. (1990). Во11ейшо-8ос1е1а РаРапа В1о1од1а 8рептеШа1е. 66:795-802.
90. Кгатег Е. М., КосР Т., МеРаиз А. апР Тгойег I. (1997). I. Вю1. СРет. 272:8937- 8945.
91. 81ечей Е., 8Иуез1п А., К1еР1 I. апР Мейепз Р. К. (2001). Еиг. I. МеР. Кез. 6:21-26.
92. Сгееп 8. Т., Ν§ I. Р. апР СРап-Ьат Ό. (1988). 8сой. МеР. I. 33:213-214.
93. НосР ^., МсСопуШе I., Не1тз 8., №чзот-Эау1з I., Ме1тз А. апР Ушсеп! А. (2001). МеР. 7:365-368.
94. Тапд I., Υиаη I. апР Нао Н. (1997). СРш. МеР. I. (Епд1.) 110:698-700.
95. ΖРти^кο У. А. (1999). Ь1к. 8ргауа Маг:67-69
96. 1зР|кача 8., Котуата Υ., КоЬауазЫ Н., Тзиуихак! Р, Токипада 8., М|уахак| А., Напуи Ν. апР 1кеРа 8. (2001). 1п!ет. МеР. 40:952-955.
97. Каиг С. апР Агога 8. К. (1994). Мо1. СРет. №игора1Ро1. 21:83-93.
98. ВРайасРагуа 8. К. апР 8агазчай М. (1991). 1пР1ап I. Ехр. Вю1. 29:1095-1100.
99. К1зз С., 8отоду1 I., Сзегте1у Р., 8хе1епу| I. апР Уег А. (2001). О|аЬеЮ1од1а 44:220- 223
100. Ноорег Ν. М. (1997). С1ш. СР1т. Ас!а 266:3-12
101. М|х1зР1 А. Р., Са1сий Ν. А., О181ерРапо Р. 8., АсРезоп А. апР Ьопдо Р. М. (1997). Ь|аЬе1ез 46:647-652.
102. Роса 8., Сиуоп Т., Ьеуаззеиг Р. апР ВетР-Акит 8. (2001). I. №иго1штипо1. 120:180-189.
103. Кеуез Е. Т., Регигепа О. Н., Реез!оГГ В. ^., .Гогдепзеп К. апР Мооге ^. У. (1984). I. №иго1. 8сЬ 63:317-324.
104. НиЬЬагР К. ^., \УШ А. Ό., Ре!егзоп С. ^., 8апсРех А., СШап ^. ^. апР Тап 8. А. (1992). №иго1оду 42:1532-1534.
105. РезЮГГ В. ^., Υаηд 8. X., УаидР! I., Вгуап С апР Ма I. Υ. (1995): I. №иго1. 8ск 129 8ирр1.1 14121.
106. 8азак1 Ν., Рика!зи К., Тзихик! К., НауазР1 Υ., УозЫРа Т., Рщи Ν., Ко1ке Т., ^акауата I., УападР Рага К., Сагги1о К., Атапо Ν. апР Макйа Ζ. (1998). Ат. I. Ра!Р. 153:1149-1155.
107. В11ак М. М., Согзе А. М. апР Кипс1 К. ^. (2001). АтуойорР. Ьа1ега1 8с1ег. О1Рег Мо!ог Ь|зогР. 2:83-91.
108. Тоггез-А1етап Ь., Ватоз У. апР Вегаапо I. (1998). №иго1оду 50:772-776.
109. 8ихик| Н., Назе А., М1уа1а Υ., АгаРа1а К. апР Акахача С (1998). I. Сотр. №иго1. 402:303-312.
110. Назе А., 8ихик| Н., АгаРа1а К. апР Акахача С (1999). №игозск Ьей. 269:55-57.
111. Нопдо I. А., Тза1 8. Р., МоГГа! В., 8сРгоеРег К. А., к.тд С, СРип1Рагара А., Ьатре Р. А., .ГоРпзоп Е. М. 1г., Ре 8аиуаде Р. I., Агташш М., РР1Шрз Н. апР Ьеуаих В. (2000). НуЬпРота 19:303-315.
112. Епсшаз М., Тапзеу М. С., Тзш-Р1егсРа1а В. А., СогпеРа к X., МйЬгапР! к апР 1оРпзоп Е. М. 1г. (2001). I. №игозск 21 :1464-1472.
- 55 015629
113. ЬипбЬегд С, Ыбтап О., Но1тбак1 Я., О1ккоп Т. апб Р1ек1 Е. (2001). 1. Сотр. №иго1. 431:75-87.
114. Реггок Р., МсСпттоп Я. 1., 8кас О. апб Епег В. М. (1995). Б1аЬе1. Меб. 12:622-627.
115. 1асдиет1п С (1991). ВюсЫте 73:37-40
116. РеШГгеге Е., 8аг(е1е( Н., УМеп Б., Уаге1а-№е1о Ι., Е1Ыаоип Н., Магйпу Ь. апб Науе В. (1998). ВюсЫте. 80:1106-1067.
117. 2иг/о1о С, Ыкапб М. Р., Сагак Ι. У., №1кск Ь. апб Яобпдие/-Вои1ап Е. (1993). 1. Се11 Вю1. 121:1031-9.
118. Маппо М., Рккега А., МсС1иккеу Я. Т. апб С1иота1о Ь. (2001). Ткуго1б 11:47-56.
119. Маппо М., Апбгеск Б. апб МсС1иккеу Я. Т. (2000). Ткуго1б 10:551-559.
120. КаЮк Я., Мигатайи А., Касао1 А., Котуата А., 8ιιζι.ι1<ί К., Нетт А. апб КаНуата 8. (1993). 423:417-424.
121. ЬтбаЫ М., Ро1егуает Б., Υυ Ь., Агитае и., Т1ттикк Т., Вопдаг/опе Ь, А1е11о А., Р1егой1 М. А., Айаккшеп М. 8. апб 8аагта М. (2001). 1. Вю1. Скет. 276:9344-9351.
122. Борртап 1. Ь., МШег Б. Ь., Бсуег А. 1., Ьоидккп Т., №етап Ь., СиЙег О. В., Скгоикок О. Р., О1бЙе1б Е. апб Ьопаих Б. Ь. (1988). Яабю1оду 166:347-352.
123. Негтик А. Я., Р1е1егк О. Е., 8та1к А. О., Ректап О. 1., ЬатЬейк 8. У., Вепгааб Т. 1., νап Нае1к( и. 1. апб К1оррепЬогд Р. У. (1988). Ν. Епд1. 1. Меб. 318:966-970.
124. ЬеФосйг О., Ткиг А., Скауеп 8. Б., 8а1атек М., Ρηζ Ь, Сегак1 Е. апб Огокк Б. 1. (1996). С1ш. Епбосппо1. 44:717-722.
125. Яоу М. 8., Яоу А., Оа11исс1 У. Т., СоШег В., Уоипд К., Катйапк Т. С апб Скгоикок О. Р. (1993). Ме1аЬо11кт 42:696-700
126. Огап! У. апб Ь1бб1е М. Б. (1960). 1. С1ш. Епбосппо1. Ме!аЬ. 20:1539-1560.
127. Еап)и1 Ь. Е., Маггего Ь, Ек1е\'ех Е., Ооп/аЯх к, ОшгИапа 1., 8ап(апа Р. апб Ριιίζ бе Оа1агге1а С. М. (1993). 1. Се11 Ркукю1. 155:273-281.
128. 8катег 1. К., Теζе1тап 8., 81регк1ет А. Е., Бик О. Υ. апб С1агк О. Н. (1993). 8игдегу 114:10641069.
129. У11а М. С, Соζζа Е. Ν., Ыта С, ΡηιηίΐΌζ М. Ι. апб Бе Ьебегкгетег Я. М. (1995). Се11. 81дпа1. 7:331-339.
130. ЯоЬшкоп Р. апб Небегег Я. (1994). Вг;п. I. Меб. Вю1. Яек. 27:263-267.
131. Вепйе/ Ь., Еап)и1 Ь. Е., Ριιίζ бе Оа1агге1а С. М., ОшгИапа Адшаг к, Ооп/а1е/ Яеуек 1., Нетапбе/ Ь, 8ап(апа Бе1дабо Р., СаЬгега О1Яа 1., А1опко 8ойк Я. апб Ек1ете/ Яокак Е. (1995). №игокск Ьей. 187:3740.
132. Яебтопб О. Р. (1998). Ιπΐ. 1. Еегй1. Уотепк Меб, 43:91-97.
133. Ка1го В. Ν., Ьоискк Т. Ь апб Вегда 8. Ь. (2001). ОЬк1е1. Оупесо1. С1ш. №г1к Ат. 28:35-62.
134. Яокепйе1б Я. Ь. (2001). 1. Ат. Асаб. Бегта1о1. 45(3 8ирр1.):895-104.
135. №гтап Я. 1., Мак(егк 8. апб Надие У. (1996). Еейй. 81еп1. 66:942-947.
136. Ридеа( М., Бис1и/еаи Р. Н. апб Ма1коп-Бопаб1еи.М. (2000). Ногт. Яек. 54:322-326.
137. 8екаг Ν. апб Уе1бкшк 1. Б. (2001). Епбосппо1оду 142:2921-2928.
138. Роге1кку Ь., 8е1о-Уоипд Б., 8кгек1ка А., БЫ11оп 8., Мщапу М., Б-ш Н. С, ΥίΗ М. С. апб Яокепсакк Ζ. (2001). 1. С1ш. Епбосппо1. Ме!аЬ. 86:3115-3119.
139. Кге/е А. 1г., Нтс1аг 1., ЭоЬакота М. апб Рекагота Е. (1997). Вгайк1. Ьек. Б1к1у 98:555-558.
140. Магкбеп Р. 1., Мигбоск А. Р. апб Тау1ог Я. (2000). Нит. Яергоб. 15:1672-1678.
141. Уапад1к11Па М. (1992). 1. Вю1. Скет. 267:9499-9504.
142. Еап)и1 Ь. Е., Маггего Ь., Ек1ете/ Е., Ооп/а1е/ 1., ОикИапа 1., 8ап(апа Р. апб Ριιίζ бе Оа1агге1а СМ. (1993). 1. Се11. Ркукю1. 155:273-281.
143. Еап)и1 Ь. Е., Маггего Ь., Ооп/а1е/ 1., ОикИапа 1., 8ап(апа Р., Ек1ете/ Е., Ма(о 1. М. апб Ριιίζ бе Оа1агге1а СМ. (1993). Еиг. 1. Вюскет. 216:747-755.
144. Накап 8., Ноккеш1 О., РппсЯаке М., Бопд 1. С5 Вйкап Б., Сад1бе С. апб бе Адокйш А. Ι. (2002). Вю1. Яергоб. 66:144-158.
145. Еебагко Ν. 8., НЫкага М. апб Сопгаб Н. Е. (1989). 1. Се11. Ркукю1. 139:287-294.
146. 8ааб М. Е., Ккап А., 8кагта А., М1скае1 Я., Я1аб-ОаЬпе1 М. О., Воуабцап Я., Йпдадоиба 8. Б., 81ей О. М. апб Катбаг У. (1998). Б1аЬе1ек 47:544-549.
147. 81еркепк Т. У., Вакшкк1 М., ВпкЮ\\' Р. К., Вие-Уа11еккеу 1. М., Вигдей 8. О., Сгай Ь., На1е 1., НоГГтап 1., Нкшпд Н. М. апб Кпаисшпак А. (1995). Еа1иге 377: 530-532.
148. Ваккш Б. О., Е1д1ес1с/ Ьайетапп Б., 8ее1еу Я. 1., Уообк 8. С., Ройе Б. 1г. апб 8ск\уагЦ М. У. (1999). Вгаш Яек. 848:114-123.
149. ОЮе\\'кк| Р. К., У1йк М. М., 8кас Т. 1., Огасе М. К., ВШшд1оп С 1., Ойаибо 8. О. апб Бетте А. 8. (2001). Ат. 1. Ркукю1. 281:Я673-680.
150. БипЬаг 1. С. апб Ьи Н. (2000). Вгаш Яек. Ви11. 52:123-126.
151. МаГГе1 М., На1аак 1., Яатиккт Е., РгаЙеу Я. Е., Ьее О. Н., Ζΐιηι^ Υ., Ее1 Н., К1т 8., Ьа11опе Я., Яапдапа!кап 8., Кет Р. А. апб Епебтап 1. М. (1995). №11. Меб. 1:1155-1161.
152. Еебагко Ν. 8., НЫкага М. апб Сопгаб Н. Е. (1989). 1. Се11. Ркукю1. 139:287-294.
- 56 015629
153. Яеауеп 6. Μ. (1988). 1)1аЬе1ек Ме!аЬ. Яеу. 37:1595-1597.
154. 1уапоу Ό., РЫНрроуа Μ., ΛηΙορονα 1., СиЬаеуа Р., Прпккауа О., Тагагак Е.,.Восйоу У., Егпе Р., Яекгпк Т. апб Ткасйик У. (2001). Нгк!осйет. Се11. Вю1. 115:231-242.
155. Яеауеп 6. М. (1991). Ат. Неай 1. 121:1283-1288.
156. 8\\'ап 1. ^., \Уа11оп С, 6обк1апб I. Р., Сгоок Ό., Ойуег М. Р. апб 8!еуепкоп 1. С (1994). Вг. Неай 1. 71:41-44.
157. Уиогшеп-Магкко1а Н. апб УИЧагушеп Н. (1994). 1. С1ш. Епбосппо1. Ме!аЬ. 78:25- 29.
158. Радапо 6., Расгш 6., Микко 6., 6атЬшо Я., Месса Р., Оере1лк Ν., Саккабег М., Оаугб Е., Сауа11оРелп Р. апб Я17/ейо М. (2002). Нера!о1оду 35:367-372.
159. Нагапо Υ., 8ιιζι.ι1<ί М., Коуата Υ., Капба М., Υакиба 8., 8ιιζι.ι1<ί Κ. апб Такат1/а\\'а I. (2002). 1. Э|аЬе1е8 Сотрйсайопк 16:19-23.
160. 8етр1гсгш А., Сео1ойо 6., Маккгтгпо М., Уа11е Я., 8егепа Ь., Ое Тош Я., Реккша А. С. апб Όη1 Ра1и С. (1994). Ат. 1. Меб. 8ск 307 8ирр1.1 :843-46.
161. 8агбекаг М. 6., 6гау А. А., Мс6га!й М. М. апб Рогб 8. Е. (2001). ОЬк!е!. 6упесо1. 98:925-927.
162. Нагбш Ό. 8., НеЬей 1. Ό., Ваубеп Т., Оейай М. апб Махиг Ь. (1997). Ребгайгск 100(2):Е5.
163. ВегдкРот Е., Нете11 О., Регккоп Ь. А. апб УеккЬу В. (1996). Ме!аЬо1гкт 45:908-914.
164. РассЫш Р. 8., Ниа Ν., АЬЬакг Р. апб Яеауеп 6. М. (2001). 1. С1ш. Епбосппо1. Ме!аЬ. 86:35743578.
165. Ьапбу Н. 1., Кекк1ег С, Ке11у ^. К. апб \Уешдо1б А. В. (1992). Ат. 1. Регша!о1. 9:146-151.
166. Апбе1оуа К., 8и1а К. апб Уе1еЬг1 Р. (1998). Секка 6упеко1. 63:446-449.
167. Ьогш1 Я., бАппин/ш 6., Моп!есиссо С, СарогаИ Я., Уйай Ь., Реккшо Р. апб 8еуел Р. (1995). Еиг 1. Ребга!г. 154:105-108.
168. 6аЙ1ег-0егеиге Р., Вггоп С, Угек М., Вошдеогк У., 8сйуеб 1. Р. апб Вгшдег 1. (1998). Ьирик 7:469474.
169. Сгаг1а М. У., ВоссгагеШ А., Όί 6гедогю 8., Тогбг А., СоРопео Р., Магга 6., 6йгг1апба 6. апб 81гот Я. (2001). А!йегокс1егокгк 158:241-246.
170. бе Магк!ге Е., 6оЬей В., Вепе М. С, Влс.|ие1 М. Е., Ьесотр!е Т. апб Раиге 6. С. (1996). 1. С1ш. ЬаЬ. Апа1. 10:6-12.
171. Рга1оуа Ь., М1кийкоуа Ь., Ма!оик-Ма1Ьойап Ь, Вепекоуа О. апб 2\ушдег А. (2000). Рйукю1. Яек. 49:299-305.
172. Ьоре/-8о1о А., Сегуега Я., Роп! 1., Воуе А., Яеуейег 1. С, Мипо/ Р. 1., Мие! С, Екршока 6., Огбгпак А. апб 1пде1то М. (1997). С1ш. Ехр. Яйеита!о1. 15:143-149.
173. Токсйг У., Мо!!а А., Сак!е1й С, РагассЫш М. Ь., 2егЬ1 Ό. апб 61Ье1й А. (1998). 8!гоке 29: 17591764.
174. Егкап Ό., Υηζία Υ., 8оЬе1. Я. апб ЬосккЫп М. Ό. (2000). 1. Яйеита!о1. 27:2817- 2821.
175. №1 Т., Тоттакгш А., Тошш 6., Вигайг Е., Росессо М., Тог1и1 С, Уа1иккг М., Спсйшйг 6., Вегй I., Тгеу1кю1 С, Аζζοп^ Е., Νοπ Е., Тогге 6., Майе1оккг 8., 8оЬап М., Ьепйагб! А., Сайт Ь. апб Уеп!ига А. (2001). ОгаЬе!о1одга. 44:151-155.
176. Тигкг А., 6годе!й 6., Вгапбгтайе 6., ЯиЬшо Е., ЬотЬагбг Ό. апб 6акЬатш 6. (2001). Нера!о6ак!гоеп!его1. 48:462-464
177. ^1Шатк А. 1., Шгсгокк А. 1., Ьоск Я. 1., Ипк^ойй Ό. 1., 6а1е Е. А. апб Втд1еу Р. 1. (2001). ОгаЬе!ек Саге 24:504-509.
178. Όί Мало и., Апак!акг Е., Малаш Р., Ва11а!1 6., РегГеШ Я., Тлдкопе Р., МогеШш М. апб Вопапйсо М. (1992). Ас!а Ребга!г. 81:593-597.
179. 6аШ-Ткшорои1о, А., №икга-Агуапйакгк 8., Огасои1асок Ό., ХеПел М. апб КагатогШк М. (1999). Ногтопе Яек. 52:119-124.
180. А1етапу Я., У11а М. Я., Ргапсг С, Едеа 6., Яеа1 Р. X. апб Тйоткоп Т. М. (1993). 1. Се11 8ск 104:1155-1162.
181. 81отгапу А., 6гаЬкка М. апб 81отгапу В. Ь. (2001). Мо1. Меб. 7:1-10.
182. Я11еу ^. 1., \Ушег А. апб 6о1бк!еш Ό. (1983). ОгаЬе!о1одга 24:418-421.
183. Ьапбш-О1ккоп М., Каг1ккоп Р. А., Ьегптагк А. апб 8ипбкугк! 6. (1992). ОгаЬе!ек 41:1022-1027.
184. Когке 8.; Такеба Υ., Нοζит^ Υ., О1чиак| 8., Аоуадг М. апб 8епбо Р. (2002). Се11 Тгккие Яек. 307:91-99.
185. Тепоге А., Вегтап ^. Р., Рагкк 1. 8. апб Вопдюуапш А. М. (1977). 1. С1ш. Епбосгшо1. Ме!аЬ. 44:622-628.
186. А1-1аоипг Я., НеЬи!ете X., Роиде! I. апб Яатра1 Р. (2000). МПлРоп 16: 173-178.
187. Епкккоп Ь. 8. (1983). 6и! 24:1161-1168.
188. Мшдгопе 6., Ое6ае!апо А., Ридеа! М., СарлкЮ Е., 6гесо А. У. апб 6акЬатш 6. (1999). 1. ШуекЙд. Меб. 47:319-325.
189. Ьеуу Е., Яг^ап Υ., ТЫЬаи1! Ь., Ьераде 6., Вгипе! 8., ВоибпШег Ь. апб 8егбтап Е. (2000). Ат. 1. С1ш. Νυ!τ. 71:807-815.
190. Меббшдк 1. В. 1агапб 1., ИгЬапккг 8. 1., Нагбш 1. апб 6а11 Ό. 6. (1999). Ат. 1. Рйукю1. 276: 6951- 57 015629
957.
191. НоПапбег Ό., Vабйе^ш СМ., Вгебйок Е., РеГегкел О. М., Эе1айип!у Т. апб Койег 1. I. (1986). Алл. Шет Меб. 105:883-885.
192. Н11кбел К. I., Меббтдк I. В. алб 8иГйег1алб Ь. К. (1996). Сак1гоеп1его1оду 110:1395- 1403.
193. Ко11ег Е. апб КалксйГ В. (1996). I. Вю1. Сйеш. 271:30061-30067.
194. Кебпк Т. I., Киζшеηкο Υ. 8., Кет Е., 81ашЬо1кку Ό., Вοсйкον V. Ν., Ткасйик V. А., Ете Р. албМегшалп Т. (1999). ЕЕВ8 Ьеб. 463:29-34.
195. К^шелеко Υ. 8., Кет Е., Вοсйкον V. Ν., Ткасйик V. А. апб Кебпк Т. I. (1998). ЕЕВ8 Ьей. 434:183-187.
196. й;1по\' Ό. В., Рй^1^ρρονа М. Р. апб Ткасйик V. А. (2001). Вюсйешщйу (Мокс.) 66:1174-1186.
197. Ебшик I., 8й У., \\опд Ζ. М. алб Уолд М. I. (1995). Вюсйеш. I. 311:561-565.
198. Нетбол М. Е., 8брр С 8. апб йапбег А. Ό. (1999). О1усоЬю1оду 9:143-155.
199. Кой Ό. М., М1ао Υ., Сйтл К. I., Атл Ζ., Ζеедеη К., УекГаЬу Ό. алб Неа1у I. С. (2001). Аш. I. КоелГдело1. 177:1325-1332.
200. Огайаш М. Е., П1еде1шалп К. Е., Е1кол С. О., ЬтбЫаб У. I., ОоГксйа1к Ν., Оау 8. алб Оау К. (1988). ОакГгоелГего1оду 94:257-265.
201. Кои1гоиЬак1к I. Е., Реблак1 Е., АладлокГорои1ои Е., КгШкок й., Мо^ак I. А., Коигоишайк Е. А. алб Малоикок О. Ν. (1998). Ωίβ. О1к. 8ск 43:2507-2512.
202. А1сйЫсй1ег В. У., Ребгбксй У., КеюйГ О. А., УегШ Н. Н., Ейегег А. I., НШейейлег Т. А., АиегОгишЬасй Р. алб Кгс)к О. I. (1999). Ωίβ. ЭЕ. 8с1. 44:852-856.
203. РаоНкко О., Vа1елбш О., Ошдйало Ό., Ма^^аζζο О., Т1т К., Оа11о М., Тип О., Vа^^^ссй^ο М. алб Э'ОпоГпо Е. (1991). МеГаЬоНкш 40:902-907.
204. Такайакй 8., Могтай Υ., ТкШкиий Ζ., Υашак^ίа I, Υашашοΐο Т. алб Наба Т. (2001). МеГаЬоНкш 50:393-398.
205. 8νеηкοη К. Ь., Ро11аге Т., Ьййе11 Н. алб НаНдгел К. (1988). МеГаЬойкш 37:125-130.
206. 8νеηкοη К. Ь., ^иηб^ν^кΐ О., У1бе Ь. алб Найдгел К. (1987). МеГаЬоНкш 36:940- 943.
207. ^^шеηеζ-Ва1бе^ак Е. I., 8ойк I. Ь. алб М^ηΐζ О. (1991). Агсй. биекГ Меб. (Мех.) 22:121-125.
208. Оеккет Р. Н., .Гойе В. I., 8ΐηη\νίχ А., ВоГйа А. 8. алб Мооша1 Ζ. (2002). I. КйеишаГо1. 29:462-466.
209. Майш 8., Кагбой I., 8сйийе В., ЬашреГег Е. Е., Опек Е. А., Ме1сйегк Ь, Уадлег К., Вейгашк I., Коер В. О. алб РГиГхлег А. (1995). П1аЬеГо1од1а 38:351-355.
210. М|йаПо\'а Ό., Обдоюуа К., Vакк^1еνа В., М1абелονа О., Iνалονа Ν., 8ΐеρйаηον 8., Ыккйсйку К. алб ^^шονа Е. (1999). Абν. Ехр. Меб. Вю1. 455:55-60.
211. 81оГ О., Вгиппег Ν., ЬосйГ Н., Охйо1т Р. алб 81ерйепк К. У. (1999). Апп. Кйеиш. ΌΑ 58:488-492.
212. Таги1 Т., Χΐιιζ.ιιΐ’ А. Р., Сшек Ό. В. алб Такаба Υ. (2001). I. Вю1. Сйеш. 276:3983-3990.
213. Ноуег-Налкел О., Реккага и., Но1ш А., Ракк I., Уе1б1е и., Эапо К. алб ВейгелбГ Ν. (2001). Вюсйеш. I. 358:673-679.
214. Ноуег-Напкел О., ВейгелбГ Ν., Р1оид М., Эапо К. апб Рге1кклег К. Т. (1997). ЕЕВ8 Ьей. 420:79-85.
215. МсКео^л-Ьолдо Р. I. алб РалеГб Т. 8. (1996). Тгелбк О1усокс1. О1усоГесйпо1. 8:327- 340.
216. Эепд О., Ситбел 8. А., Уапд 8., КокелЬегд 8. алб ЬоккиГой Ό. I. (1996). I. Се11 Вю1. 134:15631571.
217. Ва)ои К., Эе^у Ь., Маккол V., А1ЬегГ V., Егапкеппе Е., №е1 А. алб Ео1баб I. М. (2001). Тйегар1е. 56:465-472.
218. Кего I., О1к1ег М., Нетш^ηк^ Е. апб кокип Е. (2001). I. А11егду СНл. Iттилο1. 108:781-783.
219. Вескег К. О., 81шол К. М., Вабеу- УПкоп I. Е., Еге1б1т В., В1бб1кол У. Е., МсЕаг1апб Н. Е. алб ТгелГ I. М. (1998). Ргос. №1. Асаб. 8с1. 95:9979-9984.
220. Вескег К. О. (1999). 1)и1Ье1ек 48:1353-1358.
221. СокГе11о К. У., ксоЬу Ό. В. алб Егуег А. Ό. (1998). Тйогах 53:613-618.
222. Ве1шолГе К. Е., Егуег А. Ό. алб СокГейо К. У. (1998). I. Арр1. Рйукю1. 85:1708- 1718.
223. Ка_)ай К., №1сйа)оп К. V., Со1йлк М. Н., Наколагкол Н., ОгилкГет М. М. апб Сойел Р. (1999). Аш.
I. Кекрй. Се11 Мо1. Вю1. 20:199-208.
224. Вий Р. Ь. (1997). А11. Меб. Кет. 2:104-115.
225. Оοηζаеζ-Оиетсο А. М., СайегаГа Е. О., Каб^^ζζал^ ш., Магсисс1 Е., ОгиепегГ Ό., РАеНа О. Н., Еауа1ого К. К., Ьадиепк К., Регголе 8. V., Оа11о О. С. апб 8апГа- Со1оша Т. А. (2002). I. Вю1. Сйеш. 277:17239-17247.
226. Салбе11о Н. Е. (2001). Рйидегк Агсй. 443:875-80.
227 Сйакал В., Ое1кке Ν. А., РебаГейа К., УоокГег Ό. О., ТетГхе М., СагаГбло М. Ό., Оо1бшалп У. Н. апб Сапбейо Н. Е. (2002). Еиг. Вюрйук. I. 30:617-624.
228. Ко11ег Ь. апб На11. А. (2001). I. Се11 Вю1. 152:1145-1157.
229. 8ιιζ.ιιΚί К. апб 8йееΐζ М. Р. (2001). Вюрйук. I. 81:2181-2189.
230. 8йебу. 8. апб Ие11 8. (2001). I. Вю1. Сйеш. 276:24549-24556.
231. Оуегко М. К., 8иб 8., Келба11 Т., Еи11ег I. А., №\\'к1еаб М. У. алб 8Галбйогб Т. I. (2000). I. [1111111.1ло1. 165:1513-1519.
- 58 015629
232. ЬеИат М. I., 1атек 8. Ь., Мато! С. апб Вигке 1. Р. (1990). Еиг. Кекр1г. 1. 3:19-23
233. ^еν^й А., МоГГай О. Ό., Каукипбайа С, Сарга 1. Ό., 81ттопк Ό. Ь. апб Сгедогу С. Ό. (1998). Ыа1иге 392:442-443.
234. Рабок V. А., беСаЛеИпеаи А., Оа1еке Ό. Ь., Непкоп Р. М. апб Вгайоп Ό. Ь. (2001). 1. Вю1. СЫет. 276:1071-1077.
235. \\'апд Р., КйсЫепк К. Ь. апб МипГогб К. 8. (1998). 1. Вю1. СЫет. 273:24309-24313.
236. Не1бепге1сй 8. (1999). 1. Ьеикос. Вю1. 65:737-743.
237. А11рой 1. К., Поппе11у Ь. Е., КеГа1ак Р., Ьо С., Мипп А., УабоЙаЫ-Рагкат М., Кепба11 Ν. В., Миггау 8., Тау1ог С. ^. апб МасЭегто! 1. (1996). Вг. 1. С1т. РЫагтасоР 42:99-106.
238. Ргеебтап 8. Ό., Кет Н. Р. апб 8сЫее1е С. А. (2001). Сакйоеп1его1оду 121:950-957.
239. Могап А., Э1ет Р., К1ет Ό. 1., Ие\'Ш М. Ό. апб КоЬейкоп К. Р. (1991). 1. Реб1а1г. 118:715-723.
240. Ьаппд 8., Т1югк1етккоп В., Кобег М. Е., Огкко\' С., НоМ 1., №гир 1. апб КосЫ С (1993). Ас!а Епбосйпо1. (СорепЫ.) 128:207-214.
241. 8сЫаебе1 С, Ое Мопек1го1 I., Н)е11е Ь., 1ойаппеккоп М., КогпГаЙ К., ЬтбЫаб А., 81гапб\'|к В., ^аЫдгеп Ь. апб Но1тЬегд Ь. (2002). Реб1ай. Ри1топо1. 33:483-491.
242. №опе Р. С. апб Кпо\\'1ек М. К. (2001). Кекрй. Кек. 2:328-332.
243. Агткйопд Ό. 8., Сйт^ооб К., Сагапо К., Сайт 1. В., О1ткку А. апб РЫе1ап Р. Ό. (1995). ВМ1 310:1571-1572.
244. Пакт С 1., Ретта 1. К., Непгу К. Ь., \Уапд Н. апб Мойоп 1. К. (2002). Реб1а1г. Ри1топо1. 33:475482.
245. \Уи1ГГгаа1 Ν. М., бе СгаеГГ-Меебег Е. К., Кукегк С. Т., νаη бег Ьаад Н. апб Кшк ^. (1994). 1. Реб1аИ. 125:374-378.
246. Ье1б1д-Вгискпег С. апб 21ед1ег К. (2001). Ехр. С1т. Епбосйпо1. Э|аЬе1ек 109 8ирр1. 2:8493-514.
247. ИорехАЬагга Р. 1., Рак1ог М. М., ЕксоЬаг-йтепех Р., Рагбо М. Ό., Сопха1ех А. С., Ьипа 1. Ό., Кедиепа М. Е. апб Эюкбабо М. А. (2001). Епбосг. РгасИ 7:346-351.
248. С1кн 8. 1., Ое\'1т К. Ό., Мепаа С, СЫипд Н., Кообтап С. Ό. апб Кеббу 8. V. (1998). 1. С1т. ИтекИ 102:1360-1368.
249. Ьо^е Ν. 1., Сиб\\'ог111 А. С., С1оидЫ 8. А. апб Ви11еп М. Р. (1976). Вг. 1. Эегта1о1. 95:9-12.
250. №дат Р. К., 8Ыагта Ь., Адга^а1 1. К., 8тдй С. апб КЫигапа 8. К. (1987). Оегта1о1офса 175:284289.
251. А1ЬгесЫ М., Вапосху 1., Этуа Е. апб Татак С. 1г. (1992). 1. Ога1 Ра!Ыо1. Меб. 21:364-366.
252. С1Ькоп 1., Ьатеу Р. 1., ЬеЮк М. апб Рпег В. (1990). 1. Ога1 Ра11ю1. Меб. 19:284-287.
253. ЕкагаадпкП 8., Vаηηакаеηд 8. апб Р1акуадит А. (1989). Ме!аЬо11кт 38:204-207.
254. νυ Т., СйксеШ-Веппасеиг А., С1исктап Е., 81даих Р., Сагоке11а Е. Ό., Мешег С, 8сгоЬойас1 М.Ь. апб 8ос1е С. (1996). Вг. 1. Наета!о1. 93:586-589.
255. ^1пк1ег А. 8., Магкбеп 1., СЫаибЫип К. К., НатЬ1еу Н. апб \Уа1ктк Р. 1. (2000). 10 Э|аЬе1. Меб. 17:410.
256. Уип У. 8., Ьее Н. С, Уоо Ν. С, 8опд У. Ό., Ыт 8. К., Кта К. К., НаЫп 1. 8. апб НиЫ К. В. (1999). Э|аЬе1ек Кек. С1т. РгасИ 46:223-229.
257. \\и М., Рап 1., Сипптд №. апб Ка!пат М. (1997). 1, МетЬг. Вю1. 159:137-147.
258. Лига Н. апб Мей 8. (1999). 8сапб. 1. ^типок 49:119-125.
259. Мас1е)е\\'кк| 1. Р., Уоипд Ν. 8., Уи М., Апбегкоп 8. М. апб 81оапб Е. М. (1996). ТЫготЬ. Кек. 83:433-447.
260. Ка^кйоп А. С, КоШпкоп 8. 1., ШсЫагбк 8., 81ой М. А., Епдйкй А., Могдап С. 1., На1е С. апб НШтеп Р. (1999). Вг. 1. Наета!о1. 107:148-153.
261. Ракбееки\\'ап К., Миапдкир №., Рга1уа У. и., Икагадйкй 8. апб \Уапас1т\'апа\ут №. О (2001). Ий. 1. Наета!о1. 73:64-70.
262. Ной Н., 8ЫсЫкЫта Т., 8айой У., Ка1 Т., Уатато!о Т., Ода^а К., ОкатоЮ М., ^еба К. апб Магиуата У. (2001). Ехр. Нета!о1. 29:391-400.
263. Рип_)аЬ1 Ν. М., 8огкт 1. Ό., Ка1хе1 Ь. I., Со1бЬегд А. Р., 8с11\\'аг1х А. К. апб 8тйЫ Р. Ь. (2002). Ат. 1. Кекрй. Сгй. Саге Меб. 165:677-682.
264. ф М. 8., Ьат В., М. М., Ьат №. К., Ткапд К. №. апб Ьат К. 8. (2002). Ат. 1. Кекрй. Сгй.
Саге Меб. 165:670-676.
265. 211бапо\га I. V., №ийтап К. 1., Кедап М. М., Тау1ог 1. А., 81ί 1. Р. апб Ьес1а1г О. и. (2001). 1. С1т. Епбосйпо1. Ме!аЬ. 86:4727-4730.
266. Вги1к Е., Сгаккоп М. апб Ьедгок 1. 1. (2000). Ке\'. Меб. Ыеде 55:785-792.
267. Сапди1у 8., Сак!е1 1. А., №е11ег 1. Ь., 8с11\\'аг1х С, ЛаГГе Н., №1тЬообт М. А. А., Сооп 8. Ь., Н1сктап А. В., Ко11ад М., ОЬкй Т., Веатаегдег Р., Репу С., Воийп 1. А. апб К1ет Ό. С. (2001). Ргос. ИаЙ. Асаб. 8с1. 98:8083-8088.
268. Ме1ке1 Р., Агпб! Ό., 8сЫеисЫ Е., К1еЬтда1 К. 1. апб 81едтипб №. (2001). ТЫег. Огид Мопй. 23:9-14.
269. Ьабего 1. М., Адипбех 1. А., О1тега М., Иохапо Ь., Кобйдиех-Ьексиге А., Э|ах- КиЫо М. апб Вепйех 1. (2002). Еиг. 1. С1т. РЫагтасоИ 58:115-118.
- 59 015629
270. Уаг/ίιη 6., Мои!е1го Е., 8йуа К., Ршкейо С аиб Ьорек С (2002). 1. О!огЫио1агуидо1. Ке1а1. 8рес. 64:206-212.
271. 6а^гоикка-8хк1аагх В., Ра\\йк А., Сха)а-Ви1ка 6., 6огшк ^., кикха\\'кка-Ки1гхеЬа Т. аиб ХУгхекше\\'кка 1. (2001). С1ш. Ркагтасо1. Ткег. 69:372-378.
272. Мадиаи С, Сгис1ат С, С1етеи! Ь., Абио1 Р., Утсеи! М., Кегдоа! М., 61гагб А., Е1д1ю/1 1. Ь., Уе1ко 6., Вегекк1 Ν., Вгеккои 1. Ь. аиб Κϊθιζη А. (2001). 1. С1т. Еибосгток Ме!аЬ. 86:4901-4907.
273. Вигдег А. 1. аиб Агоикои Ό. (2001). Ιπί. 1. Сагбю1. 81:243-249.
274. Ваткой М. В., Скпк!еикеи Ν. 1. аиб Нйк!еб 1. (2001). 8саиб. 1. С1т. ЬаЬ. Шуек!. (2001).61 :531537.
275. Е1ак Ό. аиб Мийег Ό. С (2000). Еиг. 1. С1т. ΝπΙτ. 54 8ирр1.3:81 12-120.
276. Кихкак С аиб Мекк В. (2000). №игоеибосгто1. Ьей. 21:17-23.
277. Яибб Р. М., \Уогта1б М. К., XV тд Ό. К., Ргиктег 8. В. аиб Ό\\ό1< К. А. (2001). Вюсйетййу 40:3759-3766.
278. Моуа К. Ь., 8а1ек Ν., Накк1д К., Сгеттои С, 6гакк1 1. аиб Όί 61атЬегагбто Ь. (2000). Мкгокс. Кек. Теск. 50:58-65.
279. 8а1ек Ν., Накк1д К., Кобо1Го К., Όί 61атЬегагбто Ь., ТгайГой Е., Киа! М., Егейег Р. аиб Моуа К. Ь. (2002). Еиг. 1. №игокск 15:1163-1167.
280. Вго^и Ό. К. (2001). Тгеибк №токск 24:85-90.
281. ТоЬ1ег Ь., 6аик 8. Е., ВеЬоег Т., Аскегтаии Р., Екскег М., Кикске Т., Мокег М., Оекск В., МсВпбе Р. А. аиб Маикои 1. С. (1996). №11те 380:639-642.
282. Вго^и Ό. К., №ско1ак К. 8. аиб Саиеуап Ь. (2002). 1. №игокск Кек. 67:211-224.
283. ТоЬ1ег Ι., ВеЬоег Т. аиб Е1кскег М. (1997). 1. №игокск 17:1869-1879.
284. Вагйей 8. Е., Ьадегсгаи12 Н. аиб 8тйк А. Ό. (1976). №игокскисе 1:339-344.
285. Тауек 1. А. (1992). 1. Ат. Со11. №й, 11:445-456.
286. Соре1аиб 6. Р., Ьетккг 8. 1., Вау1к 1. С. аиб Н1ркт Ь. 1. (1987). Вг. 1. 8шд. 74:1031-1035.
287. Соре1аиб 6. Р., А1-8ит1ба1е А. М., Ьетккг 8. 1., Вау1к 1. С аиб Н1ркт Ь. Н. (1987). Еиг. 1. 8игд. Оисо1. 13:11-16.
288. Тауек 1. А. (1995). 1. Ат. Со11. №йг. 14:341-348.
289. №1даташ М., Наитдаи Е. У., Вшк Т. У. аиб 81иаг1 С А. (1988). 1. Ски. Еибосгток Ме!аЬ. 67:144-148.
290. Вгишид Р. Е., ВооиГгег 1. М., уаи №огб Р. А., Най А. А., бе 1оид-Ваккаг М. аиб №оуеи ^. 1. (1992). Ιώ. 1. Саисег 52:511-516.
291. Та1атш1 К., ЕгаисексЫ 8., Еауего А., №дп Е., Рагаххйи Е. аиб Ьа УессЫа С (1997). Вг. 1. Саисег 75:1699-1703.
292. Тгаи Т. Т., Мебкие а. аиб Вгисе ^. К. (1996). Саисег Ер1бетк1. Вктагкегк Ргеу. 5:1013-1015.
293. НеЬег Ό., Вуег1еу Ь. О. аиб Тскектебу1аи Ν. 8. (1992). 1. Рагеи!ег. Еи!ега1 ки!г. 16:608-648.
294. Вагйей Ό. Ь., Скаг1аиб 8. Ь. аиб Тогойаи М. Н. (1995). 8игдегу 118:87-97.
295. ^аид Υ. (2001). Меб. Кек. Кеу. 21:146-170. 296. Ткодегкеи У. В., НеккеибогГГ Ь. аиб Ьебе! Т. (1996). Еиг. 1. Еибосгток 134:326- 330. Ткодегкеи У.В., НеккеибогГГ Ь. аиб Ьебе! Т. (1996).Еиг. 1. Еибоспио1. 134:326-330.
297. АиГокко Е., Скот1к1 Ν., А1екк1 М. С, Уадие Р. аиб 1икаи- Уадие Ι. (1993). 1. Ски. Шуей. 91:21852193.
298. Аггоуо Ве Ргаба Ν., 8скгоеск Е., 81ииег Е. К., Миек1еи^ед В., Т\ге11теуег 1., 8рег1 8., ^йке1т О. 6., 8сктй! М. аиб Мадбо1еи У. (2002). Еиг. 1. Вкскет. 269:184-192.
299. Скахаиб В., Ккоих К., Скпк!оу С, Р1оицие! А., 6кегагб1 К. К. аиб Ваг1оуа1х- Ме1тои 6. (2002). Ат. 1. Ра!ко1. 160:237-246.
300. Оеуу Ь., В1аскег 8., 6пдие!-ВеЬгик С, Ва_)ои К., Маккои У., 6егагб К. Ό., 6йк А., Сагтеке! Р., Вескгск Р. 1., Ыое1 А. аиб Ео1бай 1. М. (2002). ЕА8ЕВ 1. 16:147-154.
301. НагЬеск Ν., Ка!ек К. Е. аиб 8сктй! М. (2002). 1. Ски. Оисо1. 20:1000-1007.
302. К1т 8. 1., 8к1Ьа Е., ТадисЫ Т., Ткикато!о Е., М1уокк1 Υ., Таир Υ., Така1 8. аиб №диск1 8. (2002). Аийсаисег Кек. 22:387-393.
303. ^йке1т О.6., ^йке1т 8., Ексой 6. М., ЙШх У., Мадбо1еи У., ксктй!., М., Кйкт Ό. В., ^йкои Е. Ь., 6гае£Г Н. аиб Вгиииег 6. (1999). 1. Се11. Ркукк1. 180:225-235.
304. К1ее£Г 1., ΧνίΗί 8., КитЬакаг А., Епекк Н., Ьаибег А. Ό. аиб Когс М. (1999). Раисгеак 19:281-288.
305. Ма!киба К., Магиуата Н., 6ио Е., К1ее£Г 1., Пакта 1., Ма!кито!о Υ., Ьаибег А. Ό. аиб Когс М. (2001). Саисег Кек. 61:5562-5569.
306. 8а1ка11 Ζ. аиб 8шие!! Ό. (2000). Ш!. 1. Саисег 89:418-422.
307. Тоге!кку 1. А., Ζйоте^кку Ν. Ь., Еккеиах! А. Е., Уо1д! К. ^., 8йаиск Е. Ό., 8ии С. С, НиЬег К., МеПхег 8. 1. аиб 8ск1екктдег Ό. (2001). 1. Реб1а!г. Нета!о1. Оисо1. 23:496-499.
308. Ваг К. 8., Ваке В. Ь. аиб 8!иеск 8. (1987). Ат. 1. Ркукк1. 253:Е21-27.
309. Каакк К. (2001). 6уиесо1. ОЬк!е!. Еейй. 29:185-191.
310. Υυ Н., Ьеуекдие М. А., Ккокгау! М. 1., Рараиак1акки-В1атаиб1 А., С1агк 6. М. аиб В1атаиб1к Е.
- 60 015629
Р. (1996). Вг. 1. Сапсег 74:1242-1247.
311. Кихтенко Υ. 8., 8!атЬо1зку Ό., Кет Е., Вос11ко\' ν. Ν., Ткаскик ν. А. апб Кезюк Т. 1. (1998). Вюскет. Вюркуз. Кез. Соттип. 246:489-494.
312. УМег Е., Тотазе11о Е. апб Раи1 Р. (2002). Сигг. Ορίη. 1ттипо1. 14:306-311.
313. К\уа Ό., Утдегкоеб 1., Воезег-Ыиппшк В., Вгоегзеп 8. апб 8скийетакег Η. (2001). 1. У1го1. 75:10455-10459.
314. Соггеа К. апб Мипох-Еегпапбех М. А. (2001). АГО8 15:1959-1963.
315. Маске\\чсх С. Е., Вагкег Е., 6гесо 6., Кеуез-Тегап 6. апб Ьеуу 1. А. (1997). 1. С1т. Етсезк 100:921-930.
316. Ьиззо Р. (2002). Уассте 20:1964-1967.
317. Ьаигепсе 1. 8., В1апраш С, Ре Ьеепег А., Рагтепбег М. апб Ь1 \Уап§ Р. 1. (2001). Вюскетазбу 40:4990-4999.
318. Иоо^уегГ А. 1., Кизскеб 6. 8., РгоибГоо! А. Е., Вогкй Е., С1агк-Ьеу1з Ь., Ро\уег С. А. апб ^е11з Т. Ν. (1997). Вюскепнзц 36:13570-13578.
319. С1абега 1., Магйп I. апб О'8кеа Р. (2001). ЕМВО 1. 20:19-26.
320. 81бешиз, Ν., 81ег С. Е. С., И11ит Η., Ребегзеп В. К., Ьерг1 А. С, В1аз1 Е. апб Еидеп- О1зеп 1. (2000). В1ооб 96:4091-4095.
321. Ηаηб1еу М. А., 8(е1дЫде1 К. Т. апб Мотзоп 8. А. (1996). 1. У1го1. 70:4451-4456.
322. 8скге1ег Η., Могап Р. апб Сагаз I. №. (1994). 1. Вю1. Скет. 269:9090-9098.
323. 8и Η. К. апб Воаск1е К. 1. (1994). 611. Агск. А11егду 1ттипо1. 105:238-244.
324. Аб1ег В., Азккаг 8., Сап1ог Η. апб №еЬег 6. Е. (2001). Се11. 1ттипо1. 210:30-40.
325. МогИоип Ν., 8а1хапо 8., Козз1 6. апб Кадпо Р. (2000). ЕЕВ8 Ьей. 476:166-170.
326. Рш1о Ь. М., Ьесоеиг Η., Ьебги Е., Карр С, Ра!еу О. апб 6оидеоп М. Ь. (2002). АГО8 16:329-339.
327. Каи1т 1. (2002). Ргод. ЫрИ Кез. 41 :27-65.
328. Ндиуеп Ό. Η. апб ШИгеШ 1. Е. (2000). 1. У1го1. 74:3264-3272.
329. 8айиббш М., Иебауаи Т., Аббпзоп 1. Р., М. Η., Рагкег С. 1. апб 8реаг 6. Т. (1997). 1. 6еп.
¥1го1. 78:1907-1911.
330. №аге Ь. 1., №оо1оп 8. А., Мог1езе 1. М., Оаххагб В. 6. апб 1аскзоп А. А. (2002). Ргос. ΝιιΙγ. 8ос. 61:131-136.
331. Сопз!апз 1., 6иегш У., Соискоигоп А., 8ещпеиг М., Кутап А., В1апп А. Р., Ат1га1 1., Мага А., Реискап! Е., Могеаи 1. Е., Ре11едг1п Ь, Ре11едг1п 1. Ь., Е1еигу Η., Ьепд В. апб Сопл С (1998). Еиг. 1. С1т. 1пνезΐ. 28:115-122.
332. 11апдитагап 8., Ат1 8., Ротсе1е1 М., Тке1ег 1. М., Вгеппап Р. 1., №1зб-иб-Рб1 апб ИоеззН Р. С (1995). 1. 1ттипо1. 155:1334-1342.
333. Кюкагб М., 1Ьа!а-ОтЬейа 8., Рготег Е., Вогбоп-РаШег Е., 1оиаиЙ Т. апб 6аП1агбт С (2002). Мо1. МюгоЬюк 44:841-853.
334. Ка1!оп 1. Е., МиШп К. А. апб МсСотаШе М. 1. (2002). Вюскет. 1. 363:365-375.
335. 8аита 8. Υ., Тапака Т. М. апб 8йапб М. (1991). Мо1. Вюскет. Рагазйо1. 46:73-80.
336. Раз 8., Тгаупог-Кар1ап А., КасЫп1от и., А1еу 8. В. апб 6111т Е. Р. (1994). Вгах. 1. Меб. Вю1. Кез. 27:463-469.
337. Тотауо 8., РиЬгетеР 1. Е. апб 8с11\уагх К. Т. (1992). 1. Вю1. Скет. 267:21446-21458.
338. Сое1ко Р. 8., К1еш А., Такат А., Соибпко 8. Е., ТакеисЫ О., Акта 8., 81ка 1. 8., Сатххаго Η., ОагапеШ К. Т. апб Те1хета М. М. (2002). 1. Ьеикос. Вю1. 71:837:844.
339. В1аск С. 6., Вагп\уе11 1. №., ИиЬег С. 8., 6а1тззк1 М. К. апб Сорре1 К. Ь. (2002). Мо1. Вюскет. Рагазйо1. 120:215-224.
340. АбЬегб 1. С, Маскабо Е. 8., 8ои!о 1. Р., СатрапеШ А. Р., Те1хета М. М., ОаххтеШ К. Т. апб 8ί1νη 1. 8. (1999). 1пЕес1. 1ттип. 67:4819-4826.
341. кос К. Η., Сепс1агеШ С, Моуег 8. А., Ко!а Р. А. апб 8Ып М. Ь. (1999). 1. У1го1. 73:3117-3124.
342. Каζасйкον М. Υ., Ηυ Р. С, Сагзоп 1. Ь., Мигрку Р. С, Иепбевоп Е. №. апб №а11 Т. Ь. (2002). Ехр. Вю1. Меб. 227:330-335.
343. Соок Р. Ν., Веск М. А., Сойтапп Т. М., КйЬу 8. Ь., 8кепбап 1. Е., Ргадпе11 I. В. апб 8тйк1ез О. (1995). 8с1епсе 269:1583-1585.
344. Роу1е Η. А. апб Мигрку 1. №. (1997). 1. Ьеикос Вю1. 61:147-155.
345. 6ао Е-Ь., №упп Т. А., Скапд Υ., Ьее Е. 1., Вгохтеуег Η. Е., Соорег 8., ТйЕапу Η. Ь., №ез!рка1 Η., Куоп-Скипд 1. апб Мигрку Р. М. (1997). 1. Ехр. Меб. 185:1959-1968.
346. №абзбот Т апб Ь)ипдк А. (1999). 1. Меб. МкгоЬю1. 48:223-233.
347. 6шЬшда 6. Η., М1уапокага А., Езко 1. Р. апб Ебебтапп Т. (2002). Мо1. Ткег. 5:538-546.
348. РейЕег Ь., 8егуб1 А. Ь. апб ВетеРСатагб М. Е. (1998). 1пГеск 1ттип. 66:4036-4042.
349. 6огбоп У. М., №1зоп К. Ь., Виск1еу 1. Т., 8ΐеνеηз У. Ь., Т\уе1еп К. К., Е1\уооб Р. С апб Ьерр1а 8. Η. (1999). 1. Вю1. Скет. 274:27274-27280.
350. К1сс1 У., 6а1т1ске А., Роуе А., №ссЫ У., 8о1с1а Е. апб Вос.|ие1 Р. (2000). Мо1. Вю1. Се11 11:38973909.
- 61 015629
351. Мипго Ρ., Коуша Н., Вирой 1. Ь., Вокки 1. Ь., Еои1а1п В. апб Воуие) Ρ. (2001). Вюсйет. Вюрйук. Век. Соттип. 289:623-629.
352. АЙ Ν. апб Еνаηк V. Н. (1990). Вюсйет. 1. 271:193-199.
353. ЕгаШ В. А., Васкег 1. М., СгиепЬегд 1., Согуега 8. апб Вегейс V. (2001). 1. Се11 Вю1. 154:631-644.
354. Иаую Т. М., Ρик^^ίίауакатее 8., 8ирапагапопб V., Ьооагеекиетап 8., Кпкйпа 8., №дасййа В., Тигпег В. С. апб Χνΐιί^ Ν. 1. (1990). Сйп. Епбосйпой 33:739-749.
355. 8ойтап А. Т., Е1-№1\уа\\у А. А., Е1-А/7оиш О. Е., Атег Е. А., Вепйт 8. В. апб Е1- 8ауеб М. Н. (1996). 1. Тгор. ЕебюИ. 42:46-49.
356. 2ак1 К., Кайоокй М., Натат М. А., 8йойе1Ь 8., М1кйай Ν., №иг Н. апб 2а1б Е. (1980). НераЮдакйоейего1оду 27:417-422.
357. бок 8ап)ок V. М., ба Сипйа 8. Е., Те1хейа V. бе Ρ., Мойейо 1. Ρ., бок 8айок 1. А., бок 8айок Т. А., бок 8айок Ь. А. апб ба Сипйа Ό. Е. (1999). Веу. 8ос. Вгак. Меб. Тгор. 32:489-496.
358. νίί^ν Ь., ^е!1даккег В., Ьидйет А., №аск М. 1., Еисйк К. апб Кгайдайпег XV. Ό. (1999). ί. Ога1 ГаШок Меб. 28:406-409.
359. Кагасйипкки М. А., Ва1аЬо1кт М. Ι. апб Вед1апап Ν. В. (1995). Vеκίη. Вокк. Акаб. Меб. №шк. С7):18-21.
360. Сагд В., Адга^а1 1. К., Ва)ра) Н. 8., 8тдй С. апб 8пуак1ауа Ρ. К. (1990). ййап 1. Ьерг. 62:50-54.
361. Уокййаке Н., Такеба Υ., ΝίίΦ Т. апб 8епбо Е. (2002). 1. Ьеикос. Вю1. 71 :205-211.
362. М1ббе1йоуеп Ρ. 1., νаη Вии1 1. Ό., К1етег М., Воок Ό. апб Ногбук Ρ. Ь. (1999). Вюсйет. Вюрйук. Век. Соттип. 255:568-574.
363. №ко1оуа М., Майе-Сагбте А., Воитке11 Ь. апб Вепкиккап А. (2002). йй Iттиηο1. 14:445-451.
364. К1гЬу А, С, Н111 V., О1кеп Ι. апб ВоПе)· 8. В. (1995). Вюсйет. Вюрйук. Век. Соттип. 214:200-205.
365. Ма1ко 1., Вобпаг А., Vе^еЬ С., Вепе Ь., Vаатοк^ С., 8хейек1 С., 8хо11ок) 1., Сакраг В., Ногещ V., Vа1бтаηη Т. А. апб Вапуапоуюй 8. (2002). Еиг. 1. Вюсйет. 269:1199-1208.
366. Нагеде^ой А., 8о1отоп К., Нот В. С, 8отап С., Вегде1коп 1. М., Вйап А. К. апб ЕтЬегд В. V. (1994). Се11. ]ттипо1. 156:357-370.
367. 8сйто\\'кк| К., Егоййсй Ь., Маигег К., Ми11ег V. Е. апб Ескей А. (2002). Месй. Адейд Веу. 123:375-390.

Claims (6)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Пептид, происходящий от антитела против СИ-якорьсодержащего эпитопа, где пептид по меньшей мере на 70% идентичен по последовательности пептиду, представленному в любой из 8ЕО ΙΌ ΝΝ:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 и 96.
  2. 2. Пептид по п.1, где указанное антитело также реагирует с эпитопами, выбранными из группы, состоящей из анти-ТСВ-Vβ-антител, фосфолипида, такого как фосфатидилинозит, фосфатидилсерин или кардиолипин (диацилглицерин), фосфолипидгликана, одноцепочечной ДНК и двухцепочечной ДНК.
  3. 3. Пептид по п.2, где указанное антитело также реагирует с человеческими панкреатическими αклетками, фолликулярными клетками щитовидной железы, клетками мозгового вещества надпочечника, клетками желудочно-кишечного тракта, клетками слюнных желез, клетками яичника, клетками поперечно-полосатой мышцы и клетками соединительной ткани.
  4. 4. Пептид по любому из предшествующих пунктов, который представляет собой ЕаЬ-, Е(аЬ')2-, Еуили ксЕу-фрагмент.
  5. 5. Пептид по любому из предшествующих пунктов, который происходит от гипервариабельной области указанного антитела.
  6. 6. Пептид по п.5, который по меньшей мере на 70% идентичен по последовательности любой из 8ЕО ΙΌ ΝΝ:6, 8, 10, 12, 14, 16, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 86, 88, 90, 92, 94 и 96.
EA200800556A 2005-08-11 2006-08-09 Пептиды, используемые для лечения и диагностики аутоиммунных заболеваний EA015629B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0516527A GB0516527D0 (en) 2005-08-11 2005-08-11 Peptides
GB0609921A GB0609921D0 (en) 2006-05-18 2006-05-18 Peptides
GB0609920A GB0609920D0 (en) 2006-05-18 2006-05-18 Peptides
PCT/GB2006/002977 WO2007017686A2 (en) 2005-08-11 2006-08-09 Tcr-v-beta related peptides for treatment and diagnosis of autoimmune disease

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200800556A1 EA200800556A1 (ru) 2008-10-30
EA015629B1 true EA015629B1 (ru) 2011-10-31

Family

ID=37056087

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200800556A EA015629B1 (ru) 2005-08-11 2006-08-09 Пептиды, используемые для лечения и диагностики аутоиммунных заболеваний

Country Status (18)

Country Link
US (1) US9243062B2 (ru)
EP (3) EP1919952B1 (ru)
JP (2) JP2009505640A (ru)
KR (2) KR101527334B1 (ru)
CN (1) CN105017423B (ru)
AU (1) AU2006277785B2 (ru)
BR (1) BRPI0614366A2 (ru)
CA (1) CA2618796C (ru)
CU (1) CU23793B7 (ru)
CY (1) CY1120640T1 (ru)
DK (1) DK2594591T3 (ru)
EA (1) EA015629B1 (ru)
ES (1) ES2679994T3 (ru)
GB (1) GB2429013C (ru)
HK (1) HK1112628A1 (ru)
IL (3) IL189407A (ru)
NZ (3) NZ566245A (ru)
WO (1) WO2007017686A2 (ru)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
KR101906161B1 (ko) 2005-11-30 2018-10-11 애브비 인코포레이티드 아밀로이드 베타 단백질에 대한 모노클로날 항체 및 이의 용도
RU2442793C2 (ru) 2005-11-30 2012-02-20 Эбботт Лэборетриз АНТИТЕЛА ПРОТИВ ГЛОБУЛОМЕРА Аβ, ИХ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ ЧАСТИ, СООТВЕТСТВУЮЩИЕ ГИБРИДОМЫ, НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ, ВЕКТОРЫ, КЛЕТКИ-ХОЗЯЕВА, СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ УКАЗАННЫХ АНТИТЕЛ, КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ УКАЗАННЫЕ АНТИТЕЛА, ПРИМЕНЕНИЯ УКАЗАННЫХ АНТИТЕЛ И СПОСОБЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ УКАЗАННЫХ АНТИТЕЛ
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
US20100311767A1 (en) 2007-02-27 2010-12-09 Abbott Gmbh & Co. Kg Method for the treatment of amyloidoses
CA2684946C (en) * 2007-05-16 2015-03-31 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Treatment of synucleinopathies
US8613923B2 (en) 2007-06-12 2013-12-24 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
US8048420B2 (en) 2007-06-12 2011-11-01 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
KR20160017126A (ko) * 2007-06-12 2016-02-15 에이씨 이뮨 에스.에이. 모노클로널 항 베타 아밀로이드 항체
CA2701793C (en) 2007-10-05 2017-04-25 Genentech, Inc. Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases
US20110256577A1 (en) * 2008-11-05 2011-10-20 Fujirebio Inc. Method for sensing a biochemical and/or biomechanical process of a biological material and method for analyzing biological materials
ES2684475T3 (es) 2010-04-15 2018-10-03 Abbvie Inc. Proteínas que se unen a beta amiloide
WO2012016173A2 (en) 2010-07-30 2012-02-02 Ac Immune S.A. Safe and functional humanized antibodies
US9062101B2 (en) 2010-08-14 2015-06-23 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid-beta binding proteins
BR112013007514A2 (pt) * 2010-09-29 2019-09-24 Genentech Inc anticorpo isolado, uso da composição e método
RU2635516C2 (ru) * 2011-01-20 2017-11-13 САЙРЕКС ЛАБОРАТОРИЗ, ЭлЭлСи Способы и устройство для обнаружения глютеновой чувствительности и ее дифференцирования с целиакией
KR102437522B1 (ko) * 2012-05-25 2022-08-26 셀렉티스 면역요법을 위한 동종이형 및 면역억제제 저항성인 ｔ 세포의 조작 방법
JP6153019B2 (ja) 2013-01-31 2017-06-28 国立大学法人 東京大学 リゾホスファチジルセリン受容体機能調節活性を有する化合物
CN106488932B (zh) * 2013-12-20 2020-07-14 财团法人生物技术开发中心 α-烯醇化酶特异性抗体及其在癌症治疗中的使用方法
US11166986B2 (en) * 2014-01-31 2021-11-09 Universitat Zurich Use of heliocbacter pylori extract for treating or preventing inflammatory bowel diseases and coeliac disease
JP6369721B2 (ja) 2014-07-04 2018-08-08 国立大学法人 東京大学 リゾホスファチジルセリン誘導体
GB2532426B (en) * 2014-11-18 2016-11-02 Rogers Arpi Therapeutic homodimer and uses thereof
US9527922B2 (en) 2014-12-31 2016-12-27 Development Center For Biotechnology Humanized alpha-enolase specific antibodies and methods of uses in cancer therapy
WO2016108894A1 (en) * 2014-12-31 2016-07-07 Develpment Center For Biotechnology Humanized alpha-enolase specific antibodies and methods of uses in cancer therapy
WO2016117949A1 (ko) 2015-01-21 2016-07-28 (의료)길의료재단 포스파티딜이노시톨포스페이트 결합 물질의 세포 사멸 검출 용도
JP6544669B1 (ja) 2018-03-16 2019-07-17 ディヴェロップメント センター フォー バイオテクノロジー アルファエノラーゼに特異的な抗体及びその使用
WO2019197610A1 (en) 2018-04-13 2019-10-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New vaccinal strategy
CN110885778A (zh) * 2018-09-07 2020-03-17 上海益诺思生物技术股份有限公司 从体外培养的细胞中分离Pig-a基因突变细胞的方法
CA3154387A1 (en) * 2019-09-13 2021-03-18 Tri-Institutional Therapeutics Discovery Institute, Inc. Anti-cd371 antibodies and uses thereof
GB202015755D0 (en) * 2020-10-05 2020-11-18 Rogers Arpi Coronavirus therapy

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995006067A1 (en) * 1993-08-21 1995-03-02 Imperial Cancer Research Technology Limited Monoclonal antibodies for use in diagnosis and treatment of colorectal cancer
WO1998020025A1 (en) * 1996-11-05 1998-05-14 University Of Massachusetts Diagnostic methods for screening patients for scleroderma
US5795965A (en) * 1991-04-25 1998-08-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reshaped human to human interleukin-6 receptor
WO1999005175A2 (en) * 1997-07-21 1999-02-04 Matossian Rogers Arpi Diagnosis and treatment of diseases using anti-anti-t-cell receptor vbeta anti-bodies or peptides which are recognized by said antibodies, and endocrine secretion regulatory protein i (esrp1)
WO2001014424A2 (en) * 1999-08-24 2001-03-01 Medarex, Inc. Human ctla-4 antibodies and their uses
WO2002081496A2 (es) * 2001-04-06 2002-10-17 Centro De Inmunologia Molecular Anticuerpos recombinantes asociados a gangliósidos. su uso en el diagnóstico y tratamiento de tumores
WO2003024388A2 (en) * 2001-09-20 2003-03-27 Cornell Research Foundation, Inc. Methods and compositions for treating and preventing skin disorders using binding agents specific for psma
WO2004029093A2 (en) * 2002-09-30 2004-04-08 Immunomedics, Inc. Humanized anti-granulocyte mn-3 antibody and uses thereof
WO2004094473A2 (en) * 2003-04-23 2004-11-04 Medarex, Inc. Humanized antibodies to interferon alpha receptor-1 (ifnar-1)
WO2005011735A1 (en) * 2003-07-29 2005-02-10 Morphotek, Inc. Antibodies and methods for generating genetically altered antibodies with enhanced effector function

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
HU218717B (hu) 1989-03-17 2000-11-28 E. I. Du Pont De Nemours And Co. Nukleinsav-termelést fokozó növényi eredetű génfragmentek és eljárás előállításukra
SE9102074D0 (sv) * 1991-07-03 1991-07-03 Kabi Pharmacia Ab Tomour antigen specific antibody
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
US5891623A (en) * 1992-11-09 1999-04-06 Consorzio Per Le Biotecnologie Diagnosis and treatment of AIDS onset
US5362865A (en) 1993-09-02 1994-11-08 Monsanto Company Enhanced expression in plants using non-translated leader sequences
US5693506A (en) 1993-11-16 1997-12-02 The Regents Of The University Of California Process for protein production in plants
US6001809A (en) 1994-07-11 1999-12-14 Elan Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of leukocyte adhesion
US5885966A (en) * 1995-06-07 1999-03-23 Dlo Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid Peptide, immunogenic composition and vaccine or medical preparation, a method to immunise animals against the hormone LHRH, and analogs of the LHRH tandem repeat peptide and their use as vaccine
IL121041A0 (en) 1997-06-09 1997-11-20 Yeda Res & Dev Immunogenic compositions for induction of anti-tumor immunity
DE19739685A1 (de) 1997-09-10 1999-03-11 Eichel Streiber Christoph Von Monoklonale Antikörper zur Therapie und Prophylaxe von Erkrankungen durch Clostridium difficile
US7083950B2 (en) * 1998-09-25 2006-08-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity fusion proteins and therapeutic and diagnostic methods for use
US6703491B1 (en) * 1999-03-17 2004-03-09 Exelixis, Inc. Drosophila sequences
CN1382259A (zh) 1999-10-12 2002-11-27 康奈科斯优化研究和发展有限公司 检测粪便中抗酸微生物的改进方法
EP1130032A1 (en) * 2000-02-28 2001-09-05 Gesellschaft für biotechnologische Forschung mbH (GBF) Single-chain antibodies recognizing the human vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2/KDR)
GB0006398D0 (en) 2000-03-16 2000-05-03 Novartis Ag Organic compounds
JP2001299349A (ja) * 2000-04-19 2001-10-30 Suntory Ltd 新規組換え型抗体とそのｃｄｒのアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子
US20040115196A1 (en) * 2001-04-18 2004-06-17 Yoshiaki Fukuda Novel recombinant antibodies, amino acid sequences of cdrs thereof and genes encoding the same
JP4619651B2 (ja) * 2001-06-01 2011-01-26 コーネル・リサーチ・ファンデーション・インコーポレイテッド 前立腺特異的膜抗原に対する修飾抗体およびその使用
DK3483183T3 (da) * 2002-03-01 2021-06-21 Immunomedics Inc Immunokonjugat omfattende humaniserede rs7-antistoffer
CN1681529B (zh) * 2002-07-26 2012-09-19 沃尔特及伊莱萨霍尔医学研究院 免疫组合物及其诊断和治疗用途
US20040136998A1 (en) * 2002-10-30 2004-07-15 Bander Neil H. Methods and compositions for treating or preventing insulin-related disorders using binding agents specific for prostate specific membrane antigen
WO2005035732A2 (en) * 2003-02-19 2005-04-21 Dyax Corporation Papp-a ligands
KR100500283B1 (ko) * 2003-03-25 2005-07-11 이뮤노믹스 주식회사 인간 4-1비비 분자에 대한 인간화 모노클로날 폴리펩티드 및 이를 포함하는 약학 조성물
AU2004294893A1 (en) * 2003-06-06 2005-06-16 Oncomax Acquisition Corp. Antibodies specific for cancer associated antigen SM5-1 and uses thereof
JP2007509042A (ja) 2003-09-29 2007-04-12 ザ・レジェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・カリフォルニア 造血前駆細胞の接着、分化および遊走を変化させるための方法
CA2744754A1 (en) * 2008-12-09 2010-06-17 Pfizer Vaccines Llc Ige ch3 peptide vaccine

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5795965A (en) * 1991-04-25 1998-08-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reshaped human to human interleukin-6 receptor
WO1995006067A1 (en) * 1993-08-21 1995-03-02 Imperial Cancer Research Technology Limited Monoclonal antibodies for use in diagnosis and treatment of colorectal cancer
WO1998020025A1 (en) * 1996-11-05 1998-05-14 University Of Massachusetts Diagnostic methods for screening patients for scleroderma
WO1999005175A2 (en) * 1997-07-21 1999-02-04 Matossian Rogers Arpi Diagnosis and treatment of diseases using anti-anti-t-cell receptor vbeta anti-bodies or peptides which are recognized by said antibodies, and endocrine secretion regulatory protein i (esrp1)
WO2001014424A2 (en) * 1999-08-24 2001-03-01 Medarex, Inc. Human ctla-4 antibodies and their uses
WO2002081496A2 (es) * 2001-04-06 2002-10-17 Centro De Inmunologia Molecular Anticuerpos recombinantes asociados a gangliósidos. su uso en el diagnóstico y tratamiento de tumores
WO2003024388A2 (en) * 2001-09-20 2003-03-27 Cornell Research Foundation, Inc. Methods and compositions for treating and preventing skin disorders using binding agents specific for psma
WO2004029093A2 (en) * 2002-09-30 2004-04-08 Immunomedics, Inc. Humanized anti-granulocyte mn-3 antibody and uses thereof
WO2004094473A2 (en) * 2003-04-23 2004-11-04 Medarex, Inc. Humanized antibodies to interferon alpha receptor-1 (ifnar-1)
WO2005011735A1 (en) * 2003-07-29 2005-02-10 Morphotek, Inc. Antibodies and methods for generating genetically altered antibodies with enhanced effector function

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AAB38291, 20.10.2004, [Naydeno v Internet 02.10.2008], Naydeno v Internet: <URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov, Baza Dannykh: Protein, Blast *
AAG30627, 07.11.2000 [Naydeno v Internet 02.10.2008], Naydeno v Internet: <URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?tool..., Baza Dannykh: Protein, Blast *
AAO60116, 07.03.2004, [Naydeno v Internet 02.10.2008], Naydeno v Internet: <URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov, Baza Dannykh: Protein, Blast *
CAA65007, 14.08.1996 [Naydeno v Internet 02.10.2008], Naydeno v Internet: <URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov, Baza Dannykh: Protein, Blast *
Q54265, 01.11.1996 [Naydeno v Internet 02.10.2008], Naydeno v Internet: <URL:http://srs.ebi.ac.uk/srsbin/cgi-bin, Baza Dannykh: Uniprot *
RN 483478-39-3, 30.01.2003, [Naydeno v Internet 02.10.2008], Naydeno v Internet:<URL:http://stnweb.fiz-karlsruhe.de, Baza Dannykh: STN, Registry *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2594591A3 (en) 2013-08-21
WO2007017686A3 (en) 2007-07-19
EP1919952A2 (en) 2008-05-14
KR101527334B1 (ko) 2015-06-09
EA200800556A1 (ru) 2008-10-30
CY1120640T1 (el) 2019-12-11
GB0615831D0 (en) 2006-09-20
IL189407A0 (en) 2008-06-05
CU20080021A7 (es) 2011-02-24
IL222879A (en) 2015-08-31
CA2618796C (en) 2018-01-02
NZ566245A (en) 2012-04-27
JP5738333B2 (ja) 2015-06-24
JP2009505640A (ja) 2009-02-12
KR20140048338A (ko) 2014-04-23
EP2594591B1 (en) 2018-06-06
CN105017423B (zh) 2019-06-04
EP1919952B1 (en) 2016-02-17
IL222880A0 (en) 2012-12-31
US9243062B2 (en) 2016-01-26
EP2594591A2 (en) 2013-05-22
CN105017423A (zh) 2015-11-04
IL222880A (en) 2015-08-31
IL222879A0 (en) 2012-12-31
AU2006277785B2 (en) 2012-07-12
EP2578602A2 (en) 2013-04-10
DK2594591T3 (en) 2018-07-30
IL189407A (en) 2013-01-31
WO2007017686A2 (en) 2007-02-15
BRPI0614366A2 (pt) 2009-10-06
US20090304577A1 (en) 2009-12-10
NZ595386A (en) 2013-08-30
EP2578602B1 (en) 2016-10-19
GB2429013C (en) 2012-11-28
HK1112628A1 (zh) 2008-09-12
GB2429013A (en) 2007-02-14
AU2006277785A1 (en) 2007-02-15
CA2618796A1 (en) 2007-02-15
EP2578602A3 (en) 2013-07-31
ES2679994T3 (es) 2018-09-03
GB2429013B (en) 2010-05-05
JP2013163673A (ja) 2013-08-22
KR20080039978A (ko) 2008-05-07
NZ595387A (en) 2013-04-26
CU23793B7 (es) 2012-03-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA015629B1 (ru) Пептиды, используемые для лечения и диагностики аутоиммунных заболеваний
Lim et al. Pompe disease: from pathophysiology to therapy and back again
US20110104156A1 (en) Methods and materials for treating autoimmune and/or complement mediated diseases and conditions
US20090208501A1 (en) Anti-Pathogen Immunoadhesins
US20160130334A1 (en) Notch inhibition in the treatment and prevention of obesity
US8182809B1 (en) Methods for treating cancer by inhibiting MIC shedding
EP0766735B1 (en) Class bi and ci scavenger receptors
AU2016250423A1 (en) Secreted aP2 and methods of inhibiting same
JP2013139474A (ja) 新生細胞における新規なグリコシル化ペプチド標的
US8084228B2 (en) Nogo-B receptor antagonists
JPH04502626A (ja) 細胞溶解阻害タンパク質（ｃｌｉ）、該タンパク質のためのｄｎａ塩基配列決定コード化、ならびに該タンパク質を得るためのプラスミド、宿主生物体および方法
JP4171228B2 (ja) 可溶型ｒａｇｅ測定法
EP1634951B1 (en) Novel protein
WO2006075172A2 (en) Methods for identifying compounds capable of modulating cftr/ck2 interaction and/or cftr phosphorylation by ck2
US5831051A (en) Receptor for peptide hormones involved in energy homeostasis, and method and compositions for use thereof
US6350859B1 (en) Class BI and CI scavenger receptors
JP4559775B2 (ja) 新規蛋白質
WO2011071992A1 (en) Inhibition of tumor angiogenesis by inhibition of peroxiredoxin 1 (prx1)
JP2011068568A (ja) がん作用性パラスポリン−２受容体及びその利用
JP2015054824A (ja) Ｍｅｒｓコロナウイルス感染症予防治療剤

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): KG MD TJ

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): KZ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AZ BY