EA014103B1 - Конъюгат, включающий белок и полимер или его производное (варианты), способ его получения, применение конъюгата и содержащая его фармацевтическая композиция - Google Patents

Конъюгат, включающий белок и полимер или его производное (варианты), способ его получения, применение конъюгата и содержащая его фармацевтическая композиция Download PDF

Info

Publication number
EA014103B1
EA014103B1 EA200601670A EA200601670A EA014103B1 EA 014103 B1 EA014103 B1 EA 014103B1 EA 200601670 A EA200601670 A EA 200601670A EA 200601670 A EA200601670 A EA 200601670A EA 014103 B1 EA014103 B1 EA 014103B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
group
polymer
protein
conjugate
kda
Prior art date
Application number
EA200601670A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200601670A1 (ru
Inventor
Вольфрам Айхнер
Мартин Шиммел
Франк Хаккет
Эльмар КРАУС
Норберт Цандер
Рональд Франк
Харальд Конрадт
Клаус Лангер
Микеле Орландо
Клаус Зоммермейер
Original Assignee
Фрезениус Каби Дойчланд Гмбх
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Фрезениус Каби Дойчланд Гмбх filed Critical Фрезениус Каби Дойчланд Гмбх
Publication of EA200601670A1 publication Critical patent/EA200601670A1/ru
Publication of EA014103B1 publication Critical patent/EA014103B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Изобретение относится к конъюгатам гидроксиалкилкрахмала и белка, причем эти конъюгаты образованы ковалентной связью между гидроксиалкилкрахмалом или производным гидроксиалкилкрахмала и белком. Настоящее изобретение также относится к способу получения этих конъюгатов, содержащей их фармацевтической композиции и к применению этих конъюгатов.

Description

Настоящее изобретение относится к конъюгатам гидроксиалкилкрахмала и белка, причем эти конъюгаты образованы ковалентной связью между гидроксиалкилкрахмалом или производным гидроксиалкилкрахмала и белком. Настоящее изобретение также относится к способу получения этих конъюгатов и к применению этих конъюгатов.
Общепринято считать, что стабильность белков может быть улучшена, и иммунный ответ против этих белков уменьшен, когда эти белки присоединены к полимерным молекулам. В XVО 94/28024 раскрыто, что физиологически активные белки, модифицированные полиэтиленгликолем (ПЭГ), демонстрируют сниженную иммуногенность и антигенность и циркулируют в кровотке значительно дольше, чем неконъюгированные белки, то есть имеют сниженную скорость выведения.
В νθ 02/09766 раскрыты, среди прочих, биологически совместимые соединения белок-полимер, которые получают конъюгацией биологически активного белка с биологически совместимым полимерным производным. Используемые биологически совместимые полимеры представляют собой высоко реакционноспособные разветвленные полимеры, и полученные конъюгаты содержат длинный линкер между полимерным производным и белком. Как биологически совместимые полимеры, описаны полимеры формулы (Р-ОСН2СО-ПН-СНК.-СО-)п-Ь-рк-Л, в которых Р и О обозначают полимерные остатки, и к может быть равен 1 или 0. Для Р и О указаны полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, полиоксиэтилен, политриметиленгликоль, полимолочная кислота и ее производные, полиакриловая кислота и ее производные, полиаминокислота, поливиниловый спирт, полиуретан, полифосфазен, поли(Ь-лизин), полиалкиленоксид, полиакриламид и водорастворимые полимеры, такие как декстран или полисахарид. Как белки, среди прочих, указаны альфа, бета и гамма интерфероны, факторы крови, цитокины, такие как интерлейкины, 6-С8Р, 6М-С8Р. В примерах VО 02/09766 раскрыты только производные моно-, ди- и триполиэтиленгликоля, которые присоединяются исключительно к интерферону и эпидермальному фактору роста, и человеческому гормону роста.
В VО 94/01483 раскрыты биологически совместимые полимерные конъюгаты, которые образованы ковалентным связыванием биологически неактивного полимера или производного полимера с фармацевтически чистым, синтетическим гидрофильным полимером через определенные типы химических связей. Как встречающиеся в природе полимеры и их производные указаны полисахариды, такие как гиалуроновая кислота, протеогликаны, такие как хондроитинсульфаты А, В и С, хитин, гепарин, сульфат гепарина, декстраны, такие как циклодекстран, гидроксиэтилцеллюлоза, простой эфир целлюлозы и крахмал, липиды, такие как триглицериды и фосфолипиды. Как синтетические полимеры описаны, среди прочих, полиэтилен и его производные, имеющие среднюю молекулярную массу от приблизительно 100 до приблизительно 100 000. Как белки, связанные с полимером или полимерным производным, описаны цитокины и факторы роста, включая интерфероны, факторы некроза опухоли, интерлейкины, колониестимулирующие факторы, факторы роста, такие как экстракт остеогенного фактора, эпидермальный фактор роста, трансформирующий фактор роста, происходящий из тромбоцитов фактор роста, кислый фактор роста фибробластов и другие. Во всех рабочих примерах VО 94/01483, в качестве полимера используются производные полиэтиленгликолей.
В VО 96/11953 раскрыты химически модифицированные на Ν-конце белковые соединения и способы их получения. В частности, описаны композиции С-С8Р. которые образуются в результате соединения водорастворимого полимера к Ν-концу С-С8Р. В контексте VО 96/11953 также раскрыты консенсусные соединения интерферона, связанного по Ν-концу с водорастворимыми полимерами. Хотя в VО 96/11953 перечислен широкий ряд водорастворимых полимеров (например сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксилметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (как гомополимеры, так и статистические сополимеры), поли(п-винил пирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры полипропиленгликоля, сополимеры, полипропиленоксид/этиленоксид или полиоксиэтилированные многоатомные спирты), только ПЭГилированный С-С8Р или композиции консенсусного ΙΡΝ описаны в рабочих примерах VО 96/11953.
VО 97/30148 относится к конъюгатам полипептида со сниженной аллергенностью, включающим полимерную молекулу носителя, соединенную с двумя или больше полипептидными молекулами. Эти конъюгаты являются предпочтительно частью композиций, используемых на рынке средств персонального ухода. Указанные конъюгаты получают, активируя полимерную молекулу носителя, вводя в реакцию две или более молекул полипептида с активированной полимерной молекулой носителя и блокируя остаточные активные группы на конъюгате. В качестве полимерной молекулы носителя в VО 97/30148 перечислен широкий ряд соединений, включая такие различные группы соединений, как природные или синтетические гомополимеры, такие как многоатомные спирты, полиамины, многоосновные карбоновые кислоты и гетерополимеры, включающие по меньшей мере две различные присоединенные группы. Приведенные примеры включают звездообразные ПЭГ, разветвленные ПЭГ, поливиниловые спирты, поликарбоксилаты, поливинилпирролидоны и поли-Э,Ь-аминокислоты. Среди прочих также раскрыты декстраны, такие как карбоксиметилдекстран, целлюлозы, такие как гидроксиэтилцеллюлоза или гидроксипропилцеллюлоза, продукты гидролиза хитозана, крахмалы, такие как гидроксиэтилкрахмалы или гидроксипропилкрахмалы, гликоген, агароза, гуаровая смола, инулин, пуллулан, ксантановая смола, кар
- 1 014103 рагенин, пектин, альгиновая кислота и т.д. Как полипептиды, явно раскрыты только некоторые ферменты.
Ва1б\\'ш 1. Е. с1 а1., Те!гайебгои, νοί. 27 (1981), рр. 1723-1726 описывает химическую модификацию декстрана и гидроксиэтилкрахмала с получением альдегидзамещенных полимеров, которым позволяют реагировать с гемоглобином, с получением растворимых полимерсвязанных гемоглобинов.
Показано, что они способны связывать кислород, но эксперименты по перфузии сердца ясно показали, что полимерсвязанные гемоглобины не подходят для использования в качестве заменителей крови.
В \νϋ 99/49897 описаны конъюгаты гемоглобина, образованные путем реакции полисахаридов, таких как декстран или гидроксиэтилкрахмал, с аминогруппами гемоглобина. Как функциональные группы полисахарида используются альдегидные группы, полученные окислительным размыканием сахаридного кольца. В качестве предпочтительного используемого восстановителя раскрыт борандиметиламин. Кроме того, ЭДО 99/49897 ограничен исключительно гемоглобином.
XV О 03/074087 относится к способу соединения белков с модифицированным полисахаридом, являющимся производным крахмала. Связывание между белком и полисахаридом, гидроксиалкилкрахмалом, является ковалентной связью, которая формируется между концевой альдегидной группой или функциональной группой, полученной в результате химической модификации указанной концевой альдегидной группы молекулы гидроксиалкилкрахмала, и функциональной группой белка. Как реакционноспособная группа белка, раскрыты аминогруппы, тиогруппы и карбоксильные группы, а альдегидные группы белка не упомянуты. Кроме того, хотя указан широкий ряд возможностей различных связей в форме многих списков, включая различные функциональные группы, теоретически подходящие различные линкерные молекулы и различные химические процедуры, рабочие примеры описывают только две альтернативы: сначала используется окисленный гидроксиэтилкрахмал, который непосредственно присоединяют к белкам, используя этилдиметиламинопропил карбодиимидную (ЕОС) активацию, или используется неокисленный гидроксиэтилкрахмал, который непосредственно присоединяют к белку, образуя основание 8сЫ££, которое затем восстанавливают до соответствующего амина. Таким образом, рабочие примеры \νϋ 03/074087 не раскрывают отдельный конъюгат, соединенный через тиогруппу или карбоксильную группу белка, а также не описывают конъюгат, включающий гидроксиэтилкрахмал, белок и одну или более линкерных молекул.
Почти вся литература относительно способов соединения полимера с белком описывает способы ПЭГилирования и ПЭГилированные белки (например, альфа интерфероны, бета интерфероны). Несмотря на прогресс способов соединения и использование монофункциональных молекул ПЭГ, общий недостаток ПЭГилированных лекарственных средств состоит в том, что пути метаболизма ПЭГ как неприродного полимера детально не известны.
Некоторые из патентов описывают модификацию интерферона замещением аминокислот, повышением гликозилирования или формированием мультимеров. Эти способы требуют высоко технологических усилий (рекомбинантные методики) и могут привести к новым соединениям, которые заметно отличаются от природных белков (например, интерферона) и могут показывать другие свойства.
Кроме того, в уровне техники описано получение, например, комплексных соединений между ΙΕΝбета и полисахаридами через получение комплексного соединения с металлом. Однако комплексные соединения не настолько же стабильны как ковалентные конъюгаты и содержат металлические ионы (например, Ζη2+), что может иметь нежелательные побочные эффекты.
Таким образом, цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы преодолеть указанные недостатки этих методик конъюгации и получить конъюгаты бета-интерферона, основанные на хорошо определенном, биоразлагаемом, водорастворимом полимере, который ковалентно соединен с белком.
Другая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы преодолеть указанные недостатки этих методик конъюгации и получить конъюгаты альфа-интерферона, основанные на хорошо определенном, биоразлагаемом, водорастворимом полимере, который ковалентно соединен с белком.
Другая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы преодолеть указанные недостатки этих методик конъюгации и получить АТ III конъюгаты, основанные на хорошо определенном, биоразлагаемом, водорастворимом полимере, который ковалентно соединен с белком.
Другая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы преодолеть указанные недостатки этих методик конъюгации и получить конъюгаты ОМ-С8Е, основанные на хорошо определенном, биоразлагаемом, водорастворимом полимере, который ковалентно соединен с белком.
Другая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы преодолеть указанные недостатки этих методик конъюгации и получить конъюгаты А1АТ, и/или ίΡΑ, и/или АРС, и/или фактора VII, и/или фактора VIII, и/или фактора IX, основанные на хорошо определенном, биоразлагаемом, водорастворимом полимере, который ковалентно соединен с белком.
Другая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы разработать способы получения этих конъюгатов.
Поэтому, настоящее изобретение относится к способу получения конъюгата, содержащего белок и полимер или его производное, в котором полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал (НА8), предпочтительно гидроксиэтилкрахмал, предпочтительно гидроксиэтилкрахмал, имеющий молекуляр
- 2 014103 ную массу от 2 до 200 кДа, предпочтительно от 4 до 130 кДа, более предпочтительно от 4 до 70 кДа, причем способ включает введение в реакцию по меньшей мере одной функциональной группы А полимера или его производного по меньшей мере с одной функциональной группой Ζ белка, и таким образом образование ковалентной связи, причем Ζ выбирают из группы, состоящей из альдегидной группы и кетогруппы, и причем А включает аминогруппу, образующую указанную связь с Ζ, и белок выбирают из группы, состоящей из бета ΙΡΝ, 6М-С8Р, АРС, 1РА, А1АТ, АТ III, фактора VII, фактора VIII и фактора IX.
Соответственно, настоящее изобретение также относится к конъюгату, который может быть получен согласно способу, описанному выше.
Белки, которые могут быть конъюгированы согласно изобретению, могут быть охарактеризованы следующим образом.
Интерфероны-цитокины, которые опосредуют противовирусные, антипролиферативные и иммуномодулирующие активности в ответ на вирусную инфекцию и другие биологические возбудители. В отличие от альфа ΓΡΝ, бета ΓΡΝ является очень видоспецифичным. Есть два подтипа бета ΓΡΝ, бета 1а ΓΡΝ и бета 1Ь +Ν. В отношении промышленного получения, главное различие между бета 1а ΓΡΝ и бета 1Ь ΓΡΝ заключается в соответствующих клеточных системах, используемых для их получения, с последствиями в отношении гликозилирования и количества аминокислот. Бета 1а ΓΡΝ продуцируется клетками млекопитающих и получает обозначение 1а, потому что его аминокислотная последовательность идентична аминокислотной последовательности природного бета-интерферона. Бета 1Ь ΓΡΝ продуцируется бактериями. Интерфероны, как большинство других белков млекопитающих, претерпевает посттрансляционную модификацию путем гликозилирования. Бактерии, однако, не обладают способностью к гликозилированию белков, и, таким образом, бета 1Ь +Ν не включает боковые углеводные цепи, обнаруживаемые в природном материале. Бета 1а +Ν имеет 166 аминокислот и молекулярную массу приблизительно 22 500 Д, бета 1Ь ΓΡΝ имеет 165 аминокислот и молекулярную массу приблизительно 18 500 Д, потому что в бета 1Ь ΓΡΝ вследствие бактериального способа получения отсутствует Ν-концевой метионин, а также и гликозилирование. Аминокислотная последовательность человеческого бета-интерферона приведена, например, в ЕР 0218825 А1. О кристаллической структуре бета-интерферона сообщали в: Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А 94 (1997) рр. 11813-11818, ВюейешШгу, Кагрикак М., Νοίΐο М., ВегИоп С.В., Ме1ег А., ЫрксошЬ Α.Ν., Сое1х 8. Коммерческие препараты бета-интерферона - Ве1акегои (бета 1Ь ШИ), Ауопех и КеЬ1Р (бета 1а ШЫ). Бета-интерферон 1Ь получают бактериальным брожением штамма Е. сой, который несет генно-инженерную плазмиду, содержащую ген человеческого интерферона бета кег17. Нативный ген, был получен из человеческих фибробластов и изменен путем замены серином остатка цистеина в положении 17. Бета 1а интерферон получают технологией рекомбинантной ДНК генноинженерных клеток Яичника Китайского хомячка (СНО), в которые был введен человеческий ген бетаинтерферона. Аминокислотная последовательность бета 1а +Ν идентична аминокислотной последовательности природного человеческого бета-интерферона, полученного из фибробластов. Природный бетаинтерферон и бета 1а интерферон гликозилированы и каждый содержит единственную углеводную часть комплексного соединения, Ν-связанного по Акп80. Препараты бета-интерферона показаны для лечения рассеянного склероза рецидивирующего/ремитирующего течения. Однако существует множество серьезных побочных эффектов, связанных с введением лекарственных продуктов на основе бетаинтерферона. Кроме того, они вводятся инъекцией (внутримышечный или подкожной), приводя к дополнительным рискам. Уменьшение побочных эффектов и облегчение (например, снижение частоты) введения являются целью многочисленных работ, проводимых с целью улучшения свойств бета ΓΡΝ. Полимерная модификация белков представляет собой методику, которую используют, чтобы улучшить свойства белков. Основной используемой методикой является модификация интерферона с помощью полиэтиленгликоля, известная как ПЭГилирование.
Формы альфа ΓΡΝ естественным образом продуцируются бимоноцитами/макрофагами, лимфобластными клетками, фибробластами и множеством других типов клеток после индукции вирусами, нуклеиновыми кислотами, глюкокортикоидными гормонами и другими индукторами. Известно по меньшей мере 23 различных варианта альфа ΓΡΝ. Индивидуальные белки имеют молекулярные массы 19-26 кДа и состоят из белков с длинами 156-166 или 172 аминокислот. Все подтипы альфа ΓΡΝ обладают общей консервативной областью последовательности между положениями аминокислот 115-151, в то время как амино-концевые концы являются изменчивыми. Многие подтипы альфа ΓΡΝ отличаются по их последовательностям только в одном или двух положениях. Дисульфидные связи образуются между цистеинами в положениях 1/98 и 29/138. Дисульфидная связь 29/138 является существенной для биологической активности, в то время как связь 1/98 может быть восстановлена без влияния на биологическую активность. Все формы альфа ΓΡΝ содержат потенциальный сайт гликозилирования, но большинство подтипов не гликозилированы. В отличие от гамма ΓΡΝ, белки альфа ΓΡΝ стабильны при рН 2. Промышленное получение альфа ΓΡΝ осуществляют, используя генетически модифицированную Е. со11. Поскольку бактерии не обладают способностью к гликозилированию белков, оба варианта альфа +Ν (альфа 2а +Ν и альфа 2Ь ΓΡΝ), которые используются в одобренных лекарственных продуктах, являются негликозилированными. Главный недостаток обычного альфа ΓΡΝ - побочные эффекты. Много работы было проведено
- 3 014103 по улучшению препаратов альфа-интерферона, которые показаны для лечения Гепатита С. Полимерная модификация белков представляет собой методику, которую используют, чтобы улучшить свойства белков. Основной используемой методикой является модификация интерферона с помощью полиэтиленгликоля, известная как ПЭГилирование. Два коммерчески доступных варианта ПЭГилированного ΙΕΝ-альфа - ΡΕΟΙηΐτοη (8Р) и Редакук (Воске).
Антитромбин III (АТ III) - ингибитор серинпротеазы, который ингибирует тромбин и фактор Ха (Ттау1к, Аппи. Веу. Вюскет. 52: 655, 1983). В меньшей степени, также ингибируются фактор !Ха, XI;·!. ХПа, !РА, урокиназа, трипсин, плазмин и калликреин (Мепаске, 8етш. Нета1о1. 28: 1, 1991; Мепаске, ТгапкГикюп 32:580, 1992; Такт, Агск. Вюскет. Вюркук. 175: 737, 1976). Человеческий АТ III синтезируется в печени как одноцепочечный гликопротеид из 432 аминокислот с молекулярной массой (ММ) приблизительно 58000 Д. Его нормальная плазменная концентрация находится в пределах диапазона 14-20 мг/дл (ВокепЬегд, Веу. Нета!о1. 2 : 351, 1986; Мигапо, ТктотЬ. Век.18: 259, 1980). Белок несет три дисульфидных связи (Сук 8-128, Сук 21-95, Сук 247-430) и четыре Ν-связанных углеводных цепи (Акп 96, -135, -155, -192), которые составляют 15% полной массы (Бгапхеп, 1. Вю1. Скет. 255: 5090, 1980; Ре!егкоп, Тке Ркукю1одюа1 кбиккюпк оГ В1ооб Соади1акоп апб Б1Ьтшо1ук1к, Е1кеу1ет/ №Пк-Но11апб Вютеб1са1 Ргекк 1979, р 43). Антитромбин представляет собой ингибитор серинпротеиназы серпинового типа, который имеет главное значение в контроле коагуляции крови. АТ III представляет собой самое массовое эндогенное противокоагулирующее средство, циркулирующее в человеческой плазме, и участвует в регулировании свертывания и в физиологических и в патологических состояниях (Ора1, С'гк. Саге Меб. 2002, 30:325). Он циркулирует в двух формах с низкой тромбин-ингибирующей способностью (Р1ке, 1. Вю1. Скет. 272: 19562, 1997; Егкба1-Ваб_щ, Беб. Ргос. 44: 404, 1985) (85-95% альфа изоформы с 4 биантеннальными, моно- и дисиалилированными олигосахаридными цепями, 5-15% - бета-изоформа с высоким сродством к гепарину, негликозилированная по Акп 135, 2-6 концевых сиаловых связей). Небольшая фракция циркулирующего АТ III обычно связывается с протеогликанами на поверхности клеток эндотелия сосудов. Эти протеогликаны являются в основном гепарансульфатами, молекулами, структурно подобными гепарину, которые в состоянии катализировать ингибирование тромбина таким же образом, как гепарин. АТ III, связывающийся с хорошо определенными пентасахаридными звеньями гепарина, вызывает конформационное изменение белка (Скоау, Апп. ΝΥ Асаб. 8ск 370: 644, 1981; Скоау, Вюскет. Вюркук. Век. Соттип. 116: 492,1983; О1коп, 1. Вю1. Скет. 266:6353, 1991; Ваиег, 8етш. Нета!о1. 28: 10, 1991; Саге11, ТкготЬ. Наеток!. 78:516, 1997). Это связывание катализирует 1000-кратное усиление ингибирующей активности АТ по отношению к тромбину и Фактору Ха (ВокепЬегд, Беб. Ргос. 44: 404, 1985; В_)отк, АпШктотЬш апб ге1а(еб шЫЬйотк оГ соади1акоп рто1ешакек ш Ватеб, 8а1уекеп (ебк.): Рто1ешаке ШЫЬйотк, уо1. 17, Атк!егбат, Тке №1кет1апбк Е1кеу1ет 8аепсе РиЬкккетк (Вютебюа1 Оеу1кюп) 1986, р. 489; О1коп, 1. Вю1. Скет. 267: 12528, 1992). Эта локализация фракции АТ на эндотелиальной поверхности, где обычно производятся ферменты внутреннего каскада коагуляции, позволяет АТ III быстро нейтрализовывать эти гемостатические ферменты и защищать естественные поверхности против формирования тромба. Таким образом, ключевые свойства АТ III в предотвращении событий, связанных с образованием тромбов, заключаются в его способности связываться с гепариновым катализатором, претерпевать конформационное изменение, которое изменяет его ингибирующие свойства, и необратимо связываться тромбин или Фактор Ха, таким образом ингибируя их активность.
АТ III также имеет противовоспалительные свойства, несколько из которых следуют из его действий на каскад коагуляции (Воешэкск, В1ооб Соади1 Б1Ьтшо1ук1к. 2002,13: 657). Активированные коагуляционные протеазы, такие как активированный фактор X и тромбин, способствуют воспалению, например путем высвобождения провоспалительных медиаторов. Ингибирование этих протеаз АТ III предотвращает их определенное взаимодействие с клетками и последующие реакции (Воет1кск, В1ооб Соади1 Б1Ьтшо1ук1к. 2002, 13:657). Противовоспалительные свойства АТ III независимого от коагуляции включают прямые взаимодействия с клетками, приводящие к высвобождению, например, простациклина. Связывание АТ III с недавно идентифицированным клеточным рецептором, купбесап-4, приводит к интерференции с внутриклеточным сигналом, индуцируемым медиаторами, такими как липополисахариды и, таким образом, к даун-модуляции воспалительного ответа (Воетэкск, В1ооб Соади1 Б1Ьтшо1ук1к. 2002,13 : 657). Помимо анализа структуры свободного АТ III, было проведено много исследований сайтов комплексообразования с олигосахаридными звеньями гепарина вследствие важности комплексного соединения гепарин-АТ III для физиологической функции АТ III (Скоау, Апп. ΝΥ Асаб. 8с( 370: 644, 1981; Скоау, Вюскет. Вюркук. Век.Со.М. Мпип. 116:492, 1983; О1коп, 1. Вю1. Скет. 266:6353, 1991; Ваиег, 8етш. Нета!о1. 28:10, 1991; Саге11, ТкготЬ. Наеток!. 78:516, 1997). АТ III может быть получен с помощью обычной методики фракционирования человеческой плазмы. Афинная хроматография (гепарин-сефароза) с использованием высокого сродства гепарина к АТ III, с последующей термической обработкой для вирусной инактивации, используется для отделения от плазмы. Более свежими альтернативами, пригодными для получения АТ III, являются рекомбинантные технологии получения, которые обеспечивают более безопасный доступ к этому терапевтическому Белку (Ьеу1, 8епш1 ТкготЬ Неток! 27:405, 2001). АТгуп™ рекомбинантный человеческий АТ III (гк АТ III), получаемый Сеп/уте Ттапкдешск Согр. (ОТС) от трансгенных коз. Были проведены детализированные исследования по сравнению структурных и функцио
- 4 014103 нальных свойств полученного из плазмы АТ III (рй АТ III) и гй АТ III (Ебтиибк, Βίοοά, 91:4561, 1998). Основанный на этих экспериментах гй АТ III структурно идентичен рй АТ III за исключением гликозилирования. Структуры олигоманнозы были обнаружены на Аки 155 трансгенного материала, тогда как комплексные структуры обнаружены в случае белка, полученного из плазмы. Некоторые из звеньев галактозы рб АТ III замещены звеньями СаШас в гй АТ III. Более высокая степень фукозилирования в гй АТ III представляет собой другое отличие. Наконец, структура сиалилирования обоих белков отличается двумя признаками: гй АТ III является менее сиалилированным и содержит как Ν-ацетил-, так и Νгликолилнейраминокислоты. Это структурное различие между двумя углеводными частями обеих молекул также приводит к различным биохимическим свойствам. Следующие препараты АТ III доступны на европейском больничном рынке. (Источник: ШБ-АТС дгоир 2001):КуЬегши (АгсШк Вейпид), АТ III (Вах!ег, СгИок), А1епаЦу (Рйагтааа), Ае1о11ие (БРВ), СпГок (АиЬш).
Фактор VII участвует во внутреннем каскаде коагуляции крови протеиназ и поддерживает гемостаз, активируя внешний путь каскада коагуляции. Р VII преобразуется в фактор VII;! фактором Ха, фактором ХПа, фактором БХа или тромбином за счет незначительного протеолиза. В присутствии тканевого фактора и ионов кальция фактор VII;·! затем преобразовывает фактор X в фактор Ха ограниченным протеолизом. Фактор VII;·! также преобразует фактор IX в фактор !Ха в присутствии тканевого фактора и кальция. Фактор VII представляет собой витамин К-зависимый гликопротеин, состоящий из 406 аминокислотных остатков (МА 50 кДальтон). Фактор VII получают или обычной экстракцией из донорской человеческой плазмы или, совсем недавно, используя рекомбинантные системы. Νονο №гбкк использует клетки почки детеныша хомяка (ВНК) для получения NονοБеνеи. Экспрессируемый в форме одноцепочечного белка из 406 аминокислот с номинальной молекулярной массой 55 кДа (ТЫт, Б. е! а1., Вюейеткйу 27: 77857793 (1988). Молекула несет четыре боковых углеводных цепи. Две О-связанные боковые углеводные цепи на Бег 52,60 и две Ν-связанные боковые углеводные цепи на Аки 145, 322 (ТЫт, Б. е! а1., Вюейетк1гу 27: 7785-7793 (1988)).
Фактор VIII участвует во внутреннем каскаде коагуляции крови протеиназ и служит ко-фактором в реакции фактора IX;·! преобразования фактора X в активную форму, фактор Ха, который в конечном счете приводит к формированию сгустка фибрина. Нехватка или неустойчивость фактора VIII приводят к гемофилии А, общему рецессивному х-сцепленному нарушению коагуляции. Частота гемофилии А составляет 1-2 на 10000 рождений младенцев мужского пола во всех этнических группах. Пациенты или действительно экспрессируют уровни фактора VIII значительно ниже нормального, или принадлежат к так называемой группе сгт (сгокк-геасйид та!епа1) положительных пациентов (приблизительно 5% пациентов), которые имеют значительное количество фактора VIII в плазме (по меньшей мере 30% от нормы), но белок является нефункциональным. Приблизительно 50% всех пациентов имеют тяжелую гемофилию с активностью фактора VIII менее 1% от нормы; у них часто возникают спонтанные кровотечения в суставы, мышцы и внутренние органы.
Умеренная гемофилия А, которая встречается у 30-40% пациентов, связана с активностью 5-30% от нормы. Кровотечения наблюдаются только после значительной травмы или хирургического вмешательства. Умеренно тяжелая гемофилия встречается приблизительно у 10% пациентов; здесь активность фактора VIII составляет 2-5% от нормы, и кровотечения наблюдаются уже после незначительной травмы.
У человека период полураспада фактора VIII ίη νίνο обычно составляет 10-15 ч, но должно быть отмечено, что высвобождение, стабильность и кинетика разложения находятся также под влиянием другого фактора - фактора νаи АШеЬгаиб.
Фактор VIII получают или обычной экстракцией из донорской человеческой плазмы или, совсем недавно, используя рекомбинантные системы. Вауег использует клетки почки детеныша хомяка (ВНК) для продукции Κο^^ί^ тогда как Вах!ег использует клетки Яичника Китайского хомячка (СНО) для продукта ЯесοтЬ^иаΐе, представляющего собой полноразмерный одноцепочечный белок из 2351 аминокислот с номинальной молекулярной массой 267 кДа (ΓοοΕ е! а1., 1984, №ииге 312:342) или в других версиях, где полный В-домен или его части делетированы для того, чтобы получить продукт, который более стабилен и дает более высокий выход продукции (Вйайаейагууа е! а1. 2003, СШРБ 4/3: 2-8). Продуктпредшественник процессируется в две цепи полипептида 200 и 80 кДа в аппарате Гольджи и эти две цепи, соединенные ионом(ами) металла, экспрессируются в крови (КаиГтаи е! а1., 1988, I. Вю1. Сйет., 263: 6352).
Прокоагулянтная активность требует дальнейшего расщепления тромбина для получения фрагментов 54 и 44 кДа тяжелой цепи плюс фрагмента 72 кДа легкой цепи (А1у е! а1., 1992, Ргос. Ν;ι!1. Асаб. Бек ИБА: 4933). В концентратах фактора VIII, полученных из человеческой плазмы, были таким образом описаны несколько фрагментированных полностью активных форм фактора VIII (АгНецтои е! а1., 1986, Ргос. Ν;ι!1. Асаб, Бс1. 83: 2979).
Общий побочный эффект введения плазматического или рекомбинантного фактора VIII - иммунологические реакции у весьма большого числа пациентов (до 30%), что снижает терапевтическое значение. В прошлом были предприняты различные попытки обеспечить толерантность пациентов пероральной индукцией толерантности, но результаты были не слишком обнадеживающими. Новые генетические средства стимулирования толерантности были предложены, но еще не нашли широкого применения.
- 5 014103
Предполагается, что гезилированный белок будет иметь более низкую степень иммуногенности и может, таким образом, уменьшить это осложнение.
Фактор VIII очень богат остатками лизина (более чем 220 из 2350 аминокислот; см. приложение 1), что может использоваться для подхода восстановительного аминирования.
Фактор IX представляет собой витамин К-зависимый белок плазмы, который участвует во внутреннем пути коагуляции крови, преобразовывая фактор X в его активную форму в присутствии ионов Са(2+), фосфолипидов и фактора ЩНа. Фактор IX представляет собой гликопротеид с приблизительной молекулярной массой 55 000 Да, состоящий из 415 аминокислот в одиночной цепи (Уокййаке 8. е! а1., ВюсйешМгу 24: 3736-3750 (1985)). Фактор IX получают или обычной экстракцией из донорской человеческой плазмы, или, совсем недавно, используя рекомбинантные системы. \Ууе1й использует клетки яичника Китайского хомячка (СНО) для продукции ВеηеЕIX®. Он имеет первичную аминокислотную последовательность, которая является идентичной аллельной форме А1а148 фактора IX, полученного из плазмы, и имеет структурные и функциональные характеристики, подобные таковым эндогенного фактора IX. Белок несет восемь боковых углеводных цепей. Шесть боковых углеводных цепей О-связаны с 8ег 53,61 и с Треонином 159, 169, 172, 179, и две боковых углеводных цепи Ν-связаны с Акп 157, 167 (Уокййаке 8. е! а1., ВюейетЩту 24:3736-3750 (1985); Ва11апб А. е! а1., Еиг I Вюсйет. 1988; 172 (3): 56572).
Человеческий гранулоцит-макрофаг колониестимулирующий фактор (ЙОМ-С8Е) - ранний действующий фактор, существенный для регуляции и дифференцировки предшественников гематопоэтических клеток, а также для того, чтобы стимулировать функциональную активацию популяций зрелых клеток. Он был клонирован и экспрессирован в клетках дрожжей, бактерий, насекомых, растений и млекопитающих, приводя к белку, варьирующем по структуре, составу, периоде полураспада в сыворотке и функциониям ίη νίνο (Бопайие, В. Е.; ХУапд, Е. А.; КаиГтап, В. I.; Еои1сй, Ь.; Беату; ^Йек-О1аппей1, I. 8.; МеБедег. М.; Нетаск, В. М.; 81ешЬппк, Б. В.; 8йате, О.; Катеп, В.; С1агк, 8. СА. С ЕГГес!к о! Ν-йпкеб сагЬойубга!ек оп Не ш νί\Ό ргорегйек оГ йцтап ОМ-С8Е.Со1б 8рйпд НагЬог 8утр. Онапк Вю1. 1986, 51, стр. 685-692). Природный и полученный из клеток млекопитающих ЙОМ-С8Е представляет собой белок из 127 аминокислот и содержит как О-, так и Ν-гликаны. Он является очень гетерогенным вследствие различных состояний заполнения одного или двух сайтов Ν-гликозилирования и сайта О-гликозилирования (Огапц1осу1е-шасгорйаде со1опу кйти1а!тд ГасЮг Ггот йцтап 1утрйосу1ек Бау1оп, I.; Бцгйгкеп, и.; Вигдекк, А.; №се, Е.; Могк!уп, О. СеЬоп, I.; №со1а, Ν.; ^агб, М.; Оагбпег, I.; Бетркеу, Р.; Тйе еГГес! оГд1усоку1айоп оп гесерЮг Ьтбшд апб Ью1одюа1 асН'йу. I; Вю1. Сйет. 1990, 265, 4483-4491; Во1е оГ сагЬойубга1е т Не Гцпсйоп оГ йцтап Огапц1осу1е-Масгорйаде Со1опу-8йтц1айпд Еас!ог. Вюсйет1кйу Каикйапкку, К.; О'Нага, Р. I.; Най, С. Е.; Еогкйап, I. V.; Надеп, Е. 8. 1987, 26, рр. 4861-4867; Агтйаде, I. О.; Етегдшд аррйсайопк оГ гесотЬтагИ йцтап дгапц1осу1е-тасгорйаде со1опу-кйти1айпд ГасЮг. В1ооб 1998, 92, стр. 4491-4508). Этот лимфокин представляет клинический интерес благодаря его потенциалу в лечении миелолейкоза и его способности стимулировать продукцию гранулоцитов и макрофагов у пациентов, страдающих иммуннодефицитом или с иммунитетом, подавленным заболеванием или радиацией и/или химиотерапией (рассмотренный, Моопеп, Р.; Мегтоб, I. I.; Етк1, I. Е.; Нйксйг М.; БеБатайег, I. Е. Пчсгеакеб Ью1одюа1 асйуйу оГ бед1усоку1а!еб гесотЬшап! йцтап дгапц1осу1е-тасгорйаде со1опу-кйтц1айпд ГасЮг ргобисеб Ьу уеак! ог ашта1 се11к. Ргос. №11. Асаб. 8сЕ И8 1987, 84, рр. 4428-4431). Некоторые исследования позволили предложить, что ЙОМ-С8Е, не содержащий Ν-связанного углевода, имеет значительно более высокую удельную активность т уйго по сравнению с нативным рекомбинантным цитокином (Агтйаде, 1.О.; Етегдшд аррйсайопк оГ гесотЬтап! йцтап дгапц1осу1е-тасгорйаде со1опу-кйтц1айпд ГасЮг. В1ооб 1998, 92, стр. 4491-4508; Окато!о, М.; №1каг М.; Nакауата, С; Уападг Н.; Ма!кш, Н.; №дисйг Н.; М11б, М.; 8ака1, I.; Кабо!а, К.; Еикш, М.; Нага, Н. гликозилированный гесотЬтагИ йцтап Огапц1осу1е-Масгорйаде Со1опу-8йтц1айпд Еас!ог Рцййсайоп апб сйагас1епха1юп оГ 1йгее Гогтк оГ бШегепбу. Агсй. Вюсйет. Вюрйук. 1991, 286, стр. 562-568; Ноудаигб, Б.; Мойепкеп, В. Т.; 8сЫйег, 8.; №ккеп, ΝΤ. Сйшса1 рйагтасок!пейс к!иб1ек оГ а йитап йаеторо1ейс дго^И ГасЮг, ОМ-С8Е. Еиг. I. Сйп. Ην. 1992, 22, рр. 45-49). Однако, есть многочисленные доказательства, подтверждающие ключевую роль углеводных цепей в функциях ЙОМ-С8Е, такие как фармакокинетика (СеЬоп, I.; №со1а, Ν.; ^агб, М.; Оагбпег, I.; Бетркеу, Р.; Бау1оп, I.; Бцгйгкеп, и.; Вигдекк, А.; №се, Е.; Могк!уп, О. Огапи1осу1е-тасгорйаде со1опу кйти1айпд ГасЮг Гот йитап 1утрйосу1ек. Тйе еГГес! оГ д1усоку1айоп оп гесерЮг Ьтбшд апб Ью1одюа1 асйуйу. I Вю1. Сйет. 1990, 265, рр. 4483-4491; Ноудаагб, Б.; Мойепкеп, В. Т.; 8сЫйег, 8.; №ккеп, Ν. I. Сйшса1 рйагтасокшейс к!иб1ек оГ а йитап 1аеторо1ейс дго\\1й ГасЮг, ОМ-С8Е. Еиг. I. С1ш. Ην. 1992, 22, рр. 45-49; Бепгйпдег, С; ТеШоГГ V.; СеИай/, Н. Н., Рокоту, В.; 8адеЬ1е1, 8.; НаЬег1, С.; ^11таппк, V., Б1йегепйа1 асйуайоп оГ !йе епбодепоик 1еико1пепе ЬюкупИеык Ьу 1\\ό бШегеп! ргерагайопк оГ Огапц1осу1е-Масгорйаде Со1опу8йтц1айпд Еас!ог ш йеа1!йу гойцИеегк. В1ооб 1993, 81 рр. 2007-2013), токсичность (Бепхйпдег С.; ТеШоГГ V.; СеИай/, Н. Н., Рокоту, В.; 8адеЬ1е1, 8.; НаЬег1, С.; V^1таηηк, V., Б1йегепйа1 асйуайоп оГНе епбодепоик 1еико1пепе ЬюкупИеык Ьу 1\\ό бШегеп! ргерагайопк оГ Огапц1осу1е-Масгорйаде Со1опу8йтц1айпд Еас!ог ш йеа1!йу гойиПеегк. В1ооб 1993, 81 рр. 2007-2013) и иммуногенность (Бопайие, В. Е.; Vаηд, Е. А.; КаиГтап, В. ί.; Еои1сй, Б.; Беагу, А. С.; Vйек-О^аηηей^, I. 8.; МеНедег, М.; Нетаск, В. М.; 81ешЬгшпс, Б. В.; 8йа\\\ О.; Катеп, В.; С1агк, 8. С Ейес1к оГΝ-йпкеб сагЬойубга1ек оп Не ш νί\Ό ргорегйек
- 6 014103 ок Питан СМ-С8Б. Со1б 8ргшд НагЬог 8утр. βιιαηΐ. ΒίοΙ. 1986, 51, рр. 685-692; Всуо11с11а. В.; ЬапссЫаВоЬЫо. Ь.; Мовса(о, 8.; Сепиа, А.; ЫЬегаИ, А. Ыа1ига1 апб (кегару-шбисеб ап(1-СМ-С8Б апб ап(1-С-С8Б ап(|Ьоб1ев ίη китап вегит. Ьеикет1а апб Ьутркота 1997, 26, рр. 29-34; Вадпкаттаг, Р.; Бпевеп, Н-Р; Бгоебш, 1-Е.; Ьекуей, А-Κ.; Наввап, М.; Оев(егЬогд, А.; Ме11в(еб(, Н. 1пбисПоп ок апИ-гесотЫпап! китап Сгапи1осу(е-Масгоркаде Со1опу-8(кт11а(тд Бас(ог (ЕвскепсЫа сок-бепуеб) ап(1Ьоб1ев апб с11шса1 еккес(в ш поп 1ттипосотргот18еб ра(1еп(в., В1ооб 1994 84, рр.4078-4087; ^абкета, М.;Н)е1т 8код, А-Ь.; В1гб, С.; ВадпЬаттаг, Р.; ЫЩекогв, М.; Сатев-Оав, В.; Ме11в(еб(, Н.; Ткогре, В. 1ттиподешсЦу ок Сгапи1осу(еМасгоркаде Со1опу-8(кт11а(тд Бас(ог (СМ-С8Б) ргобис(в ш ра(1еп(в ипбегдошд сотЬтакоп 1кегару \νί(1ι СМ-С8Б. С11шса1 Сапсег Вевеагск 1999, 5, рр.1351-1361; СпЬЬеп, 1. С.; Пеуеге1х, 8.; Ткотав, N. 8. В.; Ке1т, М.; 1опев, Н. М.; Со1бв(опе, А. Н.; Ьшск, Ό. С. Оеуе1ортеп1 ок ап(1Ьоб1ев (о ипрго(ес(еб д1усову1а(юп вйев оп гесотЫпап! СМ-С8Б. Ьапсе( 1990, 335, рр. 434-437). Ввиду антигенности, о которой часто сообщали в отношении клинических продуктов СМ-С8Б от Е. сок и от дрожжей, предложенная стратегия химической модификации представляет собой многообещающий подход для этого продукта, включая полученный от немлекопитающих систем экспрессии. Препараты СМ-С8Б доступны под названиями Ьеикше (1ттипех) и Ьеисотах (Шуагкв). СМ-С8Б используется в восстановлении спинного мозга после трансплантации костного мозга, неудачи или задержки приживления трансплантата костного мозга, мобилизации и после трансплантации аутогенных клеток-предшественников периферической крови, и после индукционной химиотерапии у взрослых старшего возраста с острым миелогенным лейкозом.
Альфа1-антитрипсин (А1АТ, также называемый ингибитором альфа1-протеиназы) представляет собой ингибитор протеиназы, который, как показано, ингибирует фактически все сывороточные протеиназы млекопитающих (Ттау1в Апп. Веу. Вюскет. 52 (1983) р. 655), включая нейтрофилэластазу, тромбин, факторы Ха и Х1а. А1АТ - одноцепочечный гликопротеид, синтезируемый в печени, с 394 аминокислотами и молекулярной массой 53 кДа. Плазменная концентрация - в пределах диапазона 1-1,3 г/л. Наличие только одного цистеина в целом белке не позволяет формирование внутримолекулярных дисульфидных связей. Молекула несет три боковых углеводных цепи (Авп 46, 83, 247) (Меда 1. Вю1. Скет. 255 (1980) р. 4057; Меда 1. Вю1. Скет. 255 (1980) р.4053; Саге11 БЕВ8 Ьейегв 135 (1981), р. 301; Нобдев ВюскетБку 21 (1982) р. 2805), что составляет 12% молекулярной массы. Были открыты два типа углеводных цепей, имеющих, соответственно, би- или триантеннальную структуру (Нобдев 1. Вю1. Скет. 254 (1979) р. 8208). Человеческий А1АТ встречается в по меньшей мере двенадцати различных формах в общей популяции. Эта микрогетерогенность является результатом различных количеств обоих типов углеводных цепей. Ключевой функцией является активность по контролю над нейтрофилэластазой (Ттау1в Апп. Веу. Вюскет. 52 (1983) р. 655). Неконтролируемая активность эластазы приводит к атакам тканей эпителия с необратимыми повреждениями в результате. В ходе инактивации А1 АТ действует как субстрат для эластазы, связываясь с активным центром протеазы, которая, в результате образования этого комплекса, дезактивируется. Дефицит А1АТ вызывает, например, эмфизему легких, которая связана с повреждением легочного эпителия. Распределение обоих типов боковых углеводных цепей А1АТ по трем сайтам Νгликозилирования А1АТ разное для каждого изотипа А1АТ. Обычно получение А1АТ осуществляют путем фракционирования человеческой плазмы с использованием различных стадий афинной хроматографии. Однако, более свежий путь получения А1 АТ заключается в использовании рекомбинантных методик. РРЬ Ткетареийсв разработал способ, позволяющий восстановить рекомбинантный человеческий А1АТ (гНА1АТ) из молока трансгенной овцы (О1тап Вюскет. 8ос. 8утр. 63 (1998) р. 141; ТеЬЬий Сигг. Орш. Мо1. Ткег. 2 (2000), р. 199; Сагуег Су(о(ескпо1оду 9 (1992) р. 77; \Упдк( Вю(ескпо1оду (ΝΥ) 9 (1991), р. 830). В отношении белковой части молекулы гкА1АТ показывает идентичность структуры с рбА1АТ. Однако, как и в случае других полученных рекомбинантных челевеческих белков, имеются отличия в боковых углеводных цепях, особенно в отношении количества остатков сиаловой кислоты.
Активатор плазминогена тканевого типа ((РА) представляет собой трипсиноподобную серинпротеазу, играющую важную роль в лизисе сгустков. В присутствии сгустка фибрина (РА превращает плазминоген в плазмин, который разлагает фибрин. (РА проявляет повышенную активность в присутствии фибрина и, как следствие, вызывает фибрин-специфическую активацию плазминогена (М.^. 8ре11тап, Ь.1. Вава, С.К. Ьеопатб, РА. Скаке1, IV. О'Соппог, Тке 1оитпа1 ок Вю1одюа1 Скеш1вйу 264 (1989), р. 14100). Плазмин солюбилизирует фибрин, приводя к образованию продуктов распада фибрина. Через механизм положительной обратной связи фибрин усиливает свой собственный распад путем стимуляции опосредуемой (РА активации плазминогена (В.Р 8(е\уаг( е( а1. Тке 1оитпа1 ок Вю1одюа1 Скетзвйу 275 (2000), рр. 10112-10120). к(РА является физиологическим активатором фибринолиза, присутствующим в различных типах тканей. Он представляет собой гликопротеин с молекулярной массой приблизительно 68 кДа. В нативной форме (РА существует в одноцепочечной форме (вшд1е-скаш (1ввие-(уре рБвтшодеп ас(1уа(от, вс(РА), которая путем расщепления плазмина по пептидному мостику Агд 275-11е 276 может быть превращена в двухцепочечную структуру ((ето-скаш йввие-(уре рБвтшодеп ас(1уа(от, !с(РА). Для терапии фибринолиза его получают рекомбинантным путем в виде г(РА (тесотЬшап! (1ввие-(уре р1ав1пкюдеп ас(1уа!от). Существуют различные типы (РА, демонстрирующие структурные различия в строении углеводов. Тип I (РА имеет Ν-связанные олигосахариды на аминокислотах Авп117, Авп184 и Авп448. Тип II (РА гликозилирован по Авп117 и Авп448. Оба типа содержат О-связанный остаток фукозы на Ткг61 (К. Моп
- 7 014103 е! а1. ТНе 1оита1 οί Вю1ощса1 Сйеш1к1ту 270 (1995), рр. 3261-3267). Структура углеводов кРА, экспрессируемого в СНО-клетках, была исследована и показала широкую разновидность ди-, три- и тетраантеннальных структур цепей сахаров (М. 8ре11шап, Ь. 1. Вака, С. К. Ьеопатб, 1. А. Сйаке1, 1. V. О'Соппог, Т11е 1оитпа1 ок Вю1ощса1 СйешШту 264 (1989) р. 14100). Первичная структура !РА содержит несколько цистеинов, которые, как полагают, являются поперечно сшитыми, плюс свободный остаток цистеина в сайте 83, который может взаимодействовать с другим кРА, образуя димер. Несколько результатов указывают, что выведение ш у|уо кРА зависит от структуры углеводов, особенно от олигосахарида с высоким содержанием маннозы, присоединенного в сайте Акп117. Другой предложенный механизм выведения включает распознавание О-связанного остатка фукозы в Тйт61 высокоафинным рецептором на гепатоцитах. Этот остаток расположен близко к Сук83. Был разработан получаемый биоинженерным путем кРА (ΤΝΚ-кРА), чтобы увеличить период полураспада. Сайт гликозилирования в положении 117 был перемещен в положение 103 путем замены Аспарагина в сайте 117 Глутамином и Треонина в сайте 103 - Аспарагином. ΤΝΚ-кРА устойчив к инактивации ингибитором активатора плазмогена 1 из-за замещения тетрааланина в протеазном домене (ТНе 1оитпа1 ок Вю1ощса1 СйешШту В. 1. 81е\уаг1 е! а1. 275 (2000), рр. 10112-10120). ТМ<-1рА встречается на рынке как Тепее1ер1аке® (Воейтшдег 1пде1йе1ш) и может вводиться в качестве единственного внутривенного болюса, в то время как кРА должен вводиться в качестве болюса, сопровождаемого инфузией.
Активированный Белок°С (АРС) представляет собой модулятор коагуляции и воспаления, связанного с тяжелым сепсисом. Активированный Белок С преобразуется из своего неактивного предшественника (белок С) тромбином, спаренным с тромбомодулином. Этот комплекс отщепляет короткую Νконцевую форму пептида активации от тяжелой цепи белка С, приводя к активированному белку С. Дротрекогин альфа (активированный) представляет собой активированный рекомбинантный белок С человека (ЛАРС) с аминокислотной последовательностью, идентичной полученному активированному белку плазмы С и с похожими свойствами. Активированный белок С продается Е11 Ы11у как Хщпк®. Его получают на человеческой линии клеток (НЕК293), в которую вводят векторы экспрессии белка С. Эта особая линия клеток использовалась благодаря способности выполнить правильный ряд сложных посттрансляционных модификаций, которые требуются для функциональной активности. Рекомбинантный активированный человеческий белок°С представляет собой гликопротеин с 2 цепями, содержащий 4 сайта Ν-гликозилирования и 12 дисульфидных мостиков. Тяжелая цепь содержит 250 аминокислот, из которых семь остатков являются цистеинами, и имеет три сайта Ν-гликозилирования (Аки-248, Акп-313 и Акп-329). Семь остатков цистеина образуют три дисульфидных мостика в составе тяжелой цепи и один дисульфидный мостик между цепями. Легкая цепь содержит один Ν-связанный сайт гликозилирования (Акп-97) и 17 остатков цистеина, которые образуют восемь дисульфидных мостиков в составе легкой цепи и один дисульфидный мостик с тяжелой цепью. Первые девять остатков глутаминовой кислоты в легкой цепи гамма-карбоксилированы (С1а), а аспарагиновая кислота 71 бета-гидроксилирована. ЛАРС имеет аминокислотную последовательность, идентичную полученному из плазмы человеческому активированному белку С, но отличается от последнего по структуре гликозилирования. Активированный белок°С представляет собой протеазу, принадлежащую семейству серинпротеаз и играет главную роль в регулировании коагуляции. Основанием для антитромботической функции активированного белка С служит его способность ингибировать функцию тромбина. Кроме того, активированный белок С является важным модулятором воспаления, связанного с тяжелым сепсисом. Эндогенные ингибиторы серинпротеазы являются естественными ингибиторами для активированного белка С, из-за которых активированный белок С имеет очень короткий циркулирующий период полураспада активности (менее 30 мин) ш у|уо. Выведение активированного белка С из кровообращения опосредуется комбинацией по меньшей мере трех процессов, включая ингибирование ферментативной активности активированного белка С эндогенными протеазными ингибиторами, выведение активированного белка С и/или комплексов активированный белок С-ингибиторы серинпротеазы такими органами как печень и почки, и разложение активированного белка С и/или комплексов активированный белок С-ингибиторы серинпротеазы циркулирующими или тканевыми протеазами. Результаты, показанные в Фазе I клинических исследований с 24часовой инфузией со скоростью 24 мкг/кг/ч, обнаруживают концентрацию динамического равновесия в плазме 70 нг/мл. Период полураспада ЛАРС, измеренный в конце инфузии, составлял 0,5-1,9 ч. Концентрации ЛАРС в плазме упали ниже порога чувствительности 10 нг/мл в течение 2 ч после завершения инфузии. Вследствие его короткого физиологического и фармакокинетического периода полураспада, активированный белок С вводится непрерывно инфузией в определенных количествах для поддержания желаемой концентрации в плазме в клиническом использовании в терапии сепсиса. Некоторые усилия были предприняты, чтобы улучшить фармакокинетический профиль активированного белка С. Например, Ό. Т. Ветд е! а1. Ргос. №Л Асаб. 8с1. И8А 100 (2003), рр. 4423-4428, описывают инженерный вариант активированного белка С с длительным плазменным периодом полураспада.
В контексте настоящего изобретения, термин гидроксиалкилкрахмал (НА8), относится к производному крахмала, которое было замещено по меньшей мере одной гидроксиалкильной группой. Предпочтительный гидроксиалкилкрахмал согласно настоящему изобретению имеет строение согласно формуле (I)
- 8 014103
в которой восстановительный конец молекулы крахмала показан в неокисленной форме, и концевое сахаридное звено показано в ацетальной форме, которая, в зависимости от, например, растворителя, может быть в равновесии с альдегидной формой.
Термин гидроксиалкилкрахмал в настоящем изобретении не ограничен соединениями, где концевая углеводная часть включает гидроксиалкильные группы Κι, К2 и/или К3, как изображено, для краткости, в формуле (I), но также относится к соединениям, в которых по меньшей мере одна гидроксильная группа, имеющаяся в концевой углеводной части и/или в остальной части молекулы крахмала, НА8', замещена гидроксиалкильной группой Κι, Κ2 или Κ3.
Гидроксиалкилкрахмал, включающий две или более различных гидроксиалкильных групп, также может использоваться.
По меньшей мере одна гидроксиалкильная группа в составе НА8 может содержать две или более гидроксильных групп. Согласно предпочтительному варианту осуществления по меньшей мере одна гидроксиалкильная группа в составе НА8 содержит одну гидроксильную группу.
Выражение гидроксиалкилкрахмал также включает производные, в которых алкильная группа является моно- или полизамещенной. В этом контексте предпочтительно алкильная группа замещена галогеном, особенно фтором или арильной группой. Кроме того, концевая гидроксильная группа гидроксиалкильной группы может быть эстерифицирована или этерифицирована.
Кроме того, вместо алкила также могут использоваться прямые или разветвленные замещенные или незамещенные алкеновые группы.
Гидроксиалкилкрахмал представляет собой эфирное производное крахмала. Кроме указанных эфирных производных также в контексте настоящего изобретения могут использоваться другие производные крахмала. Например, пригодны производные, которые включают этерифицированные гидроксильные группы. Эти производные могут быть, например, производными незамещенных моно- или дикарбоновых кислот с 2-12 атомами углерода или их замещенных производных. Особенно пригодны производные незамещенных одноосновных карбоновых кислот с 2-6 атомами углерода, особенно производные уксусной кислоты. В этом контексте предпочтительны ацетилкрахмал, бутирилкрахмал и пропиноилкрахмал.
Кроме того, предпочтительны производные незамещенных дикарбоновых кислот с 2-6 атомами углерода.
В случае производных дикарбоновых кислот, предпочтительно вторая карбоксильная группа дикарбоновой кислоты также этерифицирована. Кроме того, производные сложных моноалкиловых эфиров дикарбоновых кислот являются также подходящими в контексте настоящего изобретения.
Для замещенных моно- или дикарбоновых кислот, группы заместителя могут быть предпочтительно теми же самыми, как указано выше для замещенных алкильных остатков.
Методики эстерификации крахмала известны в уровне техники (см., например, К1етт Ό. с1 а1, Сотргсйспмус Се11и1о8е Сйет181гу, Уо1. 2,1998, \У1п1еу-УСН. ХУешйепп. Ыете Уогк, особенно глава 4,4, ШепйсаИоп о£ Се11и1о8е (Ι8ΒΝ 3-527-29489-9)).
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, используется гидроксиалкилкрахмал согласно формуле (I).
В формуле (I) сахаридное кольцо, описанное подробно, и остаток, обозначенный НА8' вместе представляют предпочтительную молекулу гидроксиалкилкрахмала. Другие сахаридные кольцевые структуры, включенные в НА8', могут быть теми же самыми или отличными от подробно описанного сахаридного кольца.
Что касается остатков Κ, К2 и К3 согласно формуле (I), нет никаких определенных ограничений. Согласно предпочтительному варианту осуществления Κ1, Κ2 и Κ3 обозначают независимо водород или гидроксиалкильную группу, гидроксиарильную группу, гидроксиаралкильную группу или гидроксиалкарильную группу, имеющие от 2 до 10 атомов углерода в соответствующем алкильном остатке, или группу (СН2СН2О)п-Н, в которой п обозначает целое число, предпочтительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Водород и гидроксиалкильная группа, содержащая от 2 до 10, являются предпочтительными. Более предпочтительно, гидроксиалкильная группа имеет от 2 до 6 атомов углерода, более предпочтительно от 2 до 4 атомов углерода и еще более предпочтительно от 2 до 4 атомов углерода. Гидроксиалкилкрахмал поэтому предпочтительно включает гидроксиэтилкрахмал, гидроксипропилкрахмал и гидроксибутилкрахмал, причем гидроксиэтилкрахмал и гидроксипропилкрахмал являются особенно предпочтительными, и гидроксиэтилкрахмал является наиболее предпочтительным.
Алкил, арил, аралкил и/или алкарил может быть прямым или разветвленным и, в случае необходимости, соответствующим образом замещенным.
- 9 014103
Поэтому, настоящее изобретение также относится к способу, как описано выше, где Κι, К2 и К3 обозначают независимо водород или прямую или разветвленную гидроксиалкильную группу с от 1 до 6 атомов углерода.
Таким образом, Κ1, К2 и К3 предпочтительно могут представлять собой гидроксигексил, гидроксипентил, гидроксибутил, гидроксипропил, такой как 2-гидроксипропил, 3-гидроксипропил, 2-гидроксиизопропил, гидроксиэтил, такой как 2-гидроксиэтил, и особенно предпочтительны водород и 2гидроксиэтил.
Поэтому, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где Κ1, К2 и К3 обозначают независимо водород или 2-гидроксиэтил, причем особенно предпочтителен вариант осуществления, в котором по меньшей мере один остаток Κ1, К2 и К3 представляет собой 2гидроксиэтил.
Гидроксиэтилкрахмал (НЕ8) является наиболее предпочтительным для всех вариантов осуществления настоящего изобретения.
Поэтому, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых полимер представляет собой гидроксиэтилкрахмал, и производное полимера - производное гидроксиэтилкрахмала.
Гидроксиэтилкрахмал (НЕ8) представляет собой производное природного амилопектина и разлагается альфа-амилазой в организме. НЕ8 представляет собой замещенное производное углеводного полимера амилопектина, который присутствует в кукурузном крахмале в концентрации до 95 вес.%. НЕ8 показывает выгодные биологические свойства и используется как средство восполнения объема крови и в терапии гемодилюции в клиниках (Зошшегшеуег е! а1., 1987, 1<гапксп11аи5р11агта/1с. 8 (8), 271-278; и \Се1б1ег и др., 1991, Аг/пепп.-Еогзсйипд/Огид Кез., 41, 494-498).
Амилопектин состоит из частей глюкозы, в которой в главной цепи присутствуют альфа-1,4гликозидные связи, а в местах разветвлений находятся альфа-1,6-гликозидные связи. Физико-химические свойства этой молекулы главным образом определяются типом гликозидных связей. Вследствие разрезания альфа-1,4-гликозидной связи образуются спиральные структуры приблизительно с шестью мономерами глюкозы на виток. Физико-химические, а также биохимические свойства полимера могут быть изменены путем замещения. Введение группы оксиэтила может быть осуществлено с помощью щелочного гидроксиэтилирования. Адаптацией условий реакции возможно задействовать другую реакционную способность соответствующей гидроксильной группы в незамещенном мономере глюкозы относительно гидроксиэтилирования. Вследствие этого факта, специалист может ограниченно влиять на структуру замещения.
НЕ8 главным образом характеризуется распределением молекулярной массы и степенью замещения. Есть две возможности описания степени замещения:
1. Степень замещения может быть описана относительно части замещенных мономеров глюкозы по отношению ко всем частям глюкозы.
2. Степень замещения может быть описана как молярное замещение, в котором описано число оксиэтильных групп на часть глюкозы.
В контексте настоящего изобретения, степень замещения, обозначенная Ό8, относится к молярному замещению, как описано выше (см. также 8оттегтеуег е! а1., 1987, Кгапкепйаизрйагта71е, 8 (8), 271-278, как процитировано выше, в особенности р. 273).
Растворы НЕ8 присутствуют, как полидисперсные композиции, в которых каждая молекула отличается от другой в отношении степени полимеризации, количества и структуры участков разветвления и структуры замещения. НЕ8 поэтому представляет собой смесь соединений с различной молекулярной массой. Следовательно, конкретный раствор НЕ8 определяется средней молекулярной массой с помощью статистических средств. В этом контексте, Мп вычисляют как среднее арифметическое в зависимости от количества молекул. Альтернативно, М„ (или М^), средний вес, представляет собой единицу, которая зависит от массы НЕ8.
В контексте настоящего изобретения, гидроксиэтилкрахмал может предпочтительно иметь в среднем молекулярную массу (средний вес) от 1 до 300 кДа. Гидроксиэтилкрахмал может также демонстрировать предпочтительную молярную степень замещения от 0,1 до 3, предпочтительно от 0,1 до 2, более предпочтительно от 0,1 до 0,9, предпочтительно, от 0,1 до 0,8 и предпочтительное отношение между замещениями С2:С6 в диапазоне от 2 до 20 относительно гидроксиэтильных групп.
Термин средняя молекулярная масса, используемая в контексте настоящего изобретения, относится к массе, определяемой согласно способу ЕАЕЕ8-(лазерное рассеяние света под малым углом)-СРС как описано в 8отшегтеуег е! а1., 1987, Кгапкепйаизрйагта71е, 8 (8), 271-278; и \Се1б1ег е! а1., 1991, Агхпепп.-Еогзсйипд/Огид Кез., 41,494-498. Для средних молекулярных масс 10 кДа и менее дополнительно выполняли калибровку со стандартом, который был предварительно квалифицирован ЕАЕЬЗ-СРС.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, средняя молекулярная масса используемого гидроксиэтилкрахмала составляет от 1 до 300 кДа, предпочтительно от 2 до 200 кДа, более предпочтительно от 3 до 100 кДа, более предпочтительно от 4 до 70 кДа.
Примером НЕ8, имеющего в среднем молекулярную массу приблизительно 130 кДа, является НЕ8
- 10 014103 со степенью замещения от 0,2 до 0,8, такой как 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8, предпочтительно от 0,4 до 0,7, такой как 0,4, 0,5, 0,6 или 0,7.
Примером НЕ8 со средней молекулярной массой приблизительно 130 кДа является Уо1иуеп® от Егекешик. Уо1иуеп® - искусственный коллоид, используемый, например, для заполнения объема, применяемым в терапевтических целях для терапии и профилактики гиповолемии. Характеристиками Уо1иуеп® являются средняя молекулярная масса 130000 +/-20000 Д, молярное замещение 0,4 и отношение С2:С6 приблизительно 9:1.
Поэтому, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгатам, как описано выше, в которых гидроксиалкилкрахмал является гидроксиэтилкрахмалом, имеющим среднюю молекулярную массу от 4 до 100 кДа, предпочтительно 4-70 кДа.
Предпочтительные диапазоны средней молекулярной массы составляют, например, 4-70 кДа или 10-70 кДа, или 12-70 кДа, или 18-70 кДа, или 50-70 кДа, или 4-50 кДа, или 10-50 кДа, или 12-50 кДа, или 18-50 кДа, или 4-18 кДа, или 10-18 кДа, или 12-18 кДа, или 4-12 кДа, или 10-12 кДа, или 4-10 кДа.
Согласно особенно предпочтительным вариантам осуществления настоящего изобретения, средняя молекулярная масса используемого гидроксиэтилкрахмала находится в диапазоне от более 4 кДа и менее 70 кДа, например, приблизительно 10 кДа, или в диапазоне от 9 до 10 кДа, или от 10 до 11 кДа, или от 9 до 11 кДа, или приблизительно 12 кДа, или в диапазоне от 11 до 12 кДа, или от 12 до 13 кДа, или от 11 до 13 кДа, или приблизительно 18 кДа, или в диапазоне от 17 до 18 кДа, или от 18 до 19 кДа, или от 17 до 19 кДа, или около 30 кДа, или в диапазоне от 29 до 30, или от 30 до 31 кДа, или около 50 кДа, или в диапазоне от 49 до 50 кДа, или от 50 до 51 кДа, или от 49 до 51 кДа.
Относительно верхнего предела молярной степени замещения (Ό8), также возможны значения до 3,0, такие как 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 или 2,0, предпочтительны значения ниже 2,0, более предпочтительны значения ниже 1,5, еще более предпочтительны значения ниже 1,0, такие как 0,7, 0,8 или 0,9.
Поэтому, предпочтительные диапазоны молярной степени замещения составляют от 0,1 до 2 или от 0,1 до 1,5, или от 0,1 до 1,0, или от 0,1 до 0,9, или от 0,1 до 0,8. Более предпочтительные диапазоны молярной степени замещения составляют от 0,2 до 2 или от 0,2 до 1,5, или от 0,2 до 1,0, или от 0,2 до 0,9, или от 0,2 до 0,8. Еще более предпочтительные диапазоны молярной степени замещения составляют от 0,3 до 2 или от 0,3 до 1,5, или от 0,3 до 1,0, или от 0,3 до 0,9, или от 0,3 до 0,8. Еще более предпочтительные диапазоны молярной степени замещения составляют от 0,4 до 2, или от 0,4 до 1,5, или от 0,4 до 1,0, или от 0,4 до 0,9, или от 0,4 до 0,8.
Что касается степени замещения (Όδ), Ό8 составляет предпочтительно по меньшей мере 0,1, более предпочтительно по меньшей мере 0,2 и более предпочтительно по меньшей мере 0,4. Предпочтительны диапазоны Ό8 от 0,1 до 0,8, более предпочтительно от 0,2 до 0,8, более предпочтительно от 0,3 до 0,8 и еще более предпочтительно от 0,4 до 0,8, еще более предпочтительно от 0,1 до 0,7, более предпочтительно от 0,2 до 0,7, более предпочтительно от 0,3 до 0,7 и более предпочтительно от 0,4 до 0,7. Особенно предпочтительные значения Ό8 составляют, например, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8, причем наиболее предпочтительно 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8, еще более предпочтительно 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8, еще более предпочтительно 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8 и например 0,4 и 0,7 являются особенно предпочтительными.
В контексте настоящего изобретения данное значение молярной степени замещения, такое как 0,8, может быть точным значением или может быть понято как находящееся в диапазоне от 0,75 до 0,84. Поэтому, например, данное значение 0,1 может быть точным значением 0,1 или может находиться в диапазоне от 0,05 до 0,14, данное значение 0,4 может быть точным значением 0,4 или составлять от 0,35 до 0,44, или данное значение 0,7 может быть точным значением 0,7 или находиться в диапазоне от 0,65 до 0,74.
Особенно предпочтительными комбинациями молекулярной массы гидроксиалкилкрахмала, предпочтительно гидроксиэтилкрахмала, и его степени замещения Ό8 являются, например, 10 кДа и 0,4 или 10 кДа и 0,7, или 12 кДа и 0,4, или 12 кДа и 0,7, или 18 кДа и 0,4, или 18 кДа и 0,7, или 30 кДа и 0,4, или 30 кДа и 0,7, или 50 кДа и 0,4, или 50 кДа и 0,7, или 100 кДа и 0,7.
Что касается отношения замещения С2:С6, указанное замещение находится предпочтительно в диапазоне от 2 до 20, более предпочтительно в диапазоне от 2 до 15 и еще более предпочтительно в диапазоне от 3 до 12.
Согласно следующему варианту осуществления настоящего изобретения также могут использоваться смеси гидроксиэтилкрахмалов, имеющих разные средние молекулярные массы и/или разные степени замещения и/или разные отношения замещения С2: С6. Поэтому, могут использоваться смеси гидроксиэтилкрахмалов, имеющих разные средние молекулярные массы и разные степени замещения и разные отношения замещения С2:С6, или имеющие разные средние молекулярные массы и разные степени замещения и одинаковое или почти одинаковое отношение замещения С2:С6, или имеющие разные средние молекулярные массы и одинаковую или почти одинаковую степень замещения и разные отношения замещения С2:С6, или имеющие одинаковую или почти одинаковую среднюю молекулярную массу и раз
- 11 014103 ные степени замещения и разные отношения замещения С2:С6, или имеющие разные средние молекулярные массы и одинаковую или почти одинаковую степень замещения и одинаковое или почти одинаковое отношение замещения С2:С6, или имеющие одинаковую или почти одинаковую среднюю молекулярную массу и разные степени замещения и одинаковое или почти одинаковое отношение замещения С2:С6, или имеющие одинаковую или почти одинаковую среднюю молекулярную массу и одинаковую или почти одинаковую степень замещения и разные отношения замещения С2:С6, или имеющие почти одинаковую среднюю молекулярную массу и почти одинаковую степень замещения и почти одинаковое отношение замещения С2:С6.
В различных конъюгатах и/или различных способах согласно настоящему изобретению могут использоваться различные гидроксиалкилкрахмалы, предпочтительно различные гидроксиэтилкрахмалы и/или различные смеси гидроксиалкилкрахмалов, предпочтительно различные смеси гидроксиэтилкрахмалов.
Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения функциональная группа Ζ белка является альдегидной группой или кетогруппой. Поэтому, настоящее изобретение относится к способу и конъюгатам, как описано выше, в которых функциональная группа Ζ белка является альдегидной группой или кетогруппой.
Хотя нет никаких общих ограничений относительно местоположения альдегидной группы или кетогруппы в пределах белка, альдегидная группа или кетогруппа, согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, расположены в боковой углеводной цепи белка. Поэтому, в контексте этого варианта осуществления, используется гликозилированный белок.
В качестве гликозилированного белка предпочтительны гликозилированные формы бета ΙΕΝ, такие как природный человеческий бета ΙΕΝ или бета 1а ΣΕΝ, природный или полученный из эукариотической клетки ИСМ-С8Е, содержащий как Ν-, так и О-гликаны, рекомбинантный человеческий активированный белок С(ЛЛРС), представляющий собой гликопротеин с 2 цепями, содержащий 4 сайта Ν-гликозилирования, человеческий !РЛ (111РЛ) или рекомбинантный человеческий !РЛ (гЫРЛ) такой как тип I !РЛ, имеющий олигосахариды, Ν-связанные с аминокислотами Лки117, Лки184 и Лки448 или тип II 1РЛ. являющийся гликозилированным по Лки117 и Лки448, плазменный А1АТ или рекомбинантный человеческий А1ат (ράΑΙΑΤ или ΛΑ1ΑΤ), рекомбинантный человеческий АТ III (ΛΑΤ), фактор VII, фактор VIII и фактор IX.
Гликозилированные формы бета ΓΕΝ, ΑΤ III и СМ-С8Р являются особенно предпочтительными.
В контексте настоящего изобретения, термин гликозилированный белок, то есть белок, имеющий боковую углеводную цепь, относится к белкам, включающим углеводные части, такие как гидроксиальдегиды или гидроксикетоны, а также к их химическим модификациям (см. Рбшрр Сйет1е1ех1кои; ТЫете Vе^1ад 81ийдай, Сеттаиу, 9(Н ебйюи 1990, ^1ите 9, 2281-2285 и процитированную там литературу). Кроме того, он также относится к производным природных углеводных частей, таких как галактозы, Ν-ацетилнейраминокислоты и Ν-ацетилгалактозамин и т.п.
В еще более предпочтительном варианте осуществления альдегидная группа или кетогруппа составляют часть остатка галактозы боковой углеводной цепи. Этот остаток галактозы может быть сделан доступным для реакции с функциональной группой А в составе полимера или производного полимера путем удаления концевых сиаловых кислот с последующим окислением, как описано далее.
В другом предпочтительном варианте осуществления полимер или производное полимера, включающее функциональную группу А, связано с остатком сиаловой кислоты боковых углеводных цепей, предпочтительно с остатком сиаловой кислоты боковой углеводной цепи.
Окисление концевых углеводных частей может быть выполнено химическим или ферментативным путем.
Способы химического окисления углеводных частей полипептидов известны в уровне техники и включают обработку перйодатом (С11ато\у е1 а1., 1992, 1. Βίο1. Сйет., 267, 15916-15922).
Химическим окислением, в принципе, возможно окислить любую углеводную часть, концевую или нет. Однако, выбирая умеренные условия реакции, возможно предпочтительно окислить концевую сиаловую кислоту боковой углеводной цепи, с получением альдегидной группы или кетогруппы.
Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения указанные умеренные условия реакции касаются реакции белка с подходящим водным раствором перйодата, имеющим предпочтительную концентрацию перйодата в диапазоне от 1 до 50 мМ, более предпочтительно от 1 до 25 мМ и особенно предпочтительно от 1 до 10 мМ, например, приблизительно 1 мМ, и при предпочтительной температуре реакции от 0 до 40°С и особенно предпочтительно от 0 до 21°С, например приблизительно 0°С, и с предпочтительным временем реакции от 5 мин до 5 ч, более предпочтительно от 10 мин до 2 ч и особенно предпочтительно от 10 мин до 1 ч, например приблизительно 1 ч. Предпочтительное молярное отношение перйодат:белок составляет от 1:200 до 1:1 и более предпочтительно от 1:50 до 1:5, например, приблизительно 15:1.
Поэтому настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых, до реакции белка и полимера или производного полимера, гликозилированный белок вводят в реакцию с раствором перйодата, чтобы получить белок, имеющий альдегидную группу или кетогруппу,
- 12 014103 расположенную в окисленной боковой углеводной цепи, причем указанную реакцию предпочтительно проводят в умеренных условиях реакции окисления. Термин умеренные условия реакции, как используется в этом контексте, относится к, например, 1 мМ раствору перйодата и температуре реакции 0°С, в отличие от жестких условий, таких как 10 мМ раствор перйодата и температура реакции 20-25°С.
Альтернативно боковая углеводная цепь может быть окислена ферментативно. Ферменты для окисления отдельной боковой углеводной цепи известны в уровне техники, например, в случае галактозы фермент является галактозоксидазой. Если требуется окислить концевые части галактозы, то будет в конечном счете необходимо удалить концевые сиаловые кислоты (частично или полностью), если полипептид был получен в клетках, способных к присоединению сиаловых кислот к углеводным цепям, например, в клетках млекопитающих или в клетках, которые были генетически модифицированы, чтобы быть способными к присоединению сиаловых кислот к углеводным цепям. Химические или ферментативные способы удаления сиаловых кислот известны в уровне техники (Сйар1ш апк Кеппеку (екк.), 1996, СатЬоЬукга1е Апа1у818: а ргасйса1 арргоасй, особенно Сйар1ет 5 Моп1теш11, 61усорто1ет8, рр. 175-177; 1КЬ Ргезз Ртаскса1 арргоасй зепек (Ι8ΒΝ 0-947946-44-3)) .
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, альдегидная группа или кетогруппа могут быть расположены на Ν-конце белка и доступны для окисления. Особенно в случае, когда содержащая гидроксигруппу, аминокислота, такая как треонин или серин, расположена на Ν-конце белка в положении 1, может быть выполнено окисление указанной Ν-концевой аминокислоты, приводя к указанной кетогруппе или альдегидной группе, предпочтительно, альдегидной группе. В качестве способа химического окисления соответствующей Ν-концевой аминокислоты, может быть использован любой подходящий способ, причем предпочтительно окисление с перйодатом, в мягких условиях окисления.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения указанные умеренные условия реакции касаются реакции белка с подходящим водным раствором перйодата, имеющим предпочтительную концентрацию перйодата в диапазоне от 1 до 50 мМ, более предпочтительно от 1 до 25 мМ и особенно предпочтительно от 1 до 10 мМ, например, приблизительно 1 мМ и при предпочтительной температуре реакции от 0 до 40°С и особенно предпочтительно от 0 до 21°С, например приблизительно 0°С, и при предпочтительном времени реакции от 5 мин до 5 ч, более предпочтительно от 10 мин до 2 ч и особенно предпочтительно от 10 мин до 1 ч, например приблизительно 1 ч. Предпочтительное молярное отношение перйодат: белок составляет от 1:200 до 1:1 и более предпочтительно от 1:50 до 1:5, например приблизительно 15:1.
Поэтому, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых альдегидная группа или кетогруппа расположены в боковой углеводной цепи белка и/или в Νконцевой-группе белка.
Структура олигосахаридов белков, продуцируемых в эукариотических клетках и, таким образом, гликозилированных пост-трансляционно, не идентична белкам, полученным от человека. Кроме того, многие гликозилированные белки не имеют желательного количества концевых остатков сиаловых кислот, маскирующих дальнейшую углеводную часть, такую как остаток галактозы. Эти дальнейшие углеводные части, такие как остаток галактозы, однако, если не замаскированы, являются возможно ответственными за недостатки, такие как более короткий плазменный период полураспада белка при возможных использованиях белка в качестве лекарственного средства. Неожиданно было обнаружено, что, путем получения конъюгата белка, сформированного полимером гидроксиалкилкрахмала, предпочтительно полимером гидроксиэтилкрахмала, который ковалентно связан, например, оксимной связью, как раскрыто ниже, с углеводной частью боковой углеводной цепи белка, или непосредственно или посредством по меньшей мере одного линкерного соединения, такого как одно или два линкерных соединения, возможно преодолеть, по меньшей мере, указанный недостаток. Следовательно, предполагается, что, соединяя полимер гидроксиалкилкрахмала или его производного, предпочтительно полимер гидроксиэтилкрахмала или его производного, по меньшей мере с одной боковой углеводной цепью гликозилированного белка, можно компенсировать недостаток подходящих концевых остатков углевода, расположенных в боковой углеводной цепи. Согласно другому аспекту изобретения, получая соответствующий конъюгат полимера гидроксиалкилкрахмала или его производного, предпочтительно полимера гидроксиэтилкрахмала или его производного, соединенный с оксиленной углеводной частью, как описано выше, не только компенсируют указанный недостаток, но получают конъюгат белка, имеющий лучшие характеристики в желаемой области применения, чем соответствующий природный белок. Поэтому соответствующие конъюгаты согласно изобретению имеют компенсационный и даже синергический эффект на белок. Также возможно, что даже белки, которые являются идентичными человеческим белкам или которые являются человеческими белками, не имеют желаемого количества подходящих маскирующих концевых углеводных остатков, таких как остатки сиаловой кислоты, в природных углеводных частях. В таких случаях, получая соответствующие конъюгаты полимера гидроксиалкилкрахмала или его производного, предпочтительно полимера гидроксиэтилкрахмала или его производного, соединенного с оксиленной углеводной частью, как описано выше, не только преодолевают и компенсируют этот недостаток искусственно полученного белка, но улучшают характеристики природного белка. Что касается функциональной группы
- 13 014103 гидроксиалкилкрахмала, предпочтительно гидроксиэтилкрахмала или его производного, которая присоединяется к альдегидной группе или кетогруппе окисленной углеводной части белка, можно обратиться к описанию функциональных групп А, как раскрыто ниже. Эта общая концепция не только применима к гликозилированному С-С8Е, но и в принципе ко всем гликозилированным белкам, имеющим указанную нехватку концевых остатков углевода. Среди прочих, может быть упомянут эритропоэтин (ЕРО), интерферон бета 1а (бета ΙΕΝ 1а), ΑΤΙΙΙ, фактор VIII, альфа1-антитрипсин (А1АТ), 111ΡΛ или СМ-С8Е.
Кроме того, настоящее изобретение также относится к конъюгату, образованному ковалентным присоединением гидроксиалкилкрахмала, предпочтительно гидроксиэтилкрахмала или его производного, к одной окисленной углеводной части белка, причем указанный белок или выделяют из естественных источников, или получают экспрессией в эукариотических клетках, таких как клетки млекопитающих, насекомых или в дрожжевых клетках, причем указанная углеводная часть имеет по меньшей мере одну кетогруппу или альдегидную группу, причем конъюгат имеет в желаемой области применения, предпочтительно, в применении в качестве лекарственного средства, такие же или лучшие характеристики по сравнению с соответствующим немодифицированным белком.
В случае, если функциональная группа Ζ белка представляет собой альдегидную группу или кетогруппу, функциональная группа полимера или его производного включает аминогруппу согласно структуре -ΝΗ-.
Поэтому, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых функциональная группа А, способная вступать в реакцию в случае необходимости с окисленным восстанавливающим концом полимера, включает аминогруппу согласно структуре -ΗΝ-.
Согласно одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения эта функциональная группа А представляет собой группу, имеющую структуру Β'-ΝΗ-, где К.' обозначает водород или алкил, циклоалкил, арил, аралкил, арилциклоалкил, алкарил или циклоалкиларил, где циклоалкил, арил, аралкил, арилциклоалкил, алкарил или циклоалкиларил может быть связан непосредственно с группой ΝΗ или, согласно другому варианту осуществления, может быть связан кислородным мостиком с группой ΝΗ. Алкил, циклоалкил, арил, аралкил, арилциклоалкил, алкарил или циклоалкиларил может быть соответствующим образом замещен. В качестве предпочтительных заместителей могут быть указаны галогены, такие как Е, С1 или Вг. Особенно предпочтительным остатком К' является водород, алкильная и алкоксигруппы и еще более предпочтительным - водород и незамещенные алкильная и алкоксигруппы.
Среди алкила и алкокси предпочтительны группы с 1, 2, 3, 4, 5 или 6 атомами С. Более предпочтительны метил, этил, пропил, изопропил, метокси, этокси, пропокси и изопропокси. Особенно предпочтительны метил, этил, метокси, этокси и особое предпочтение отдается метилу или метокси.
Поэтому, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых К' обозначает водород или метил или метоксигруппу.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, функциональная группа А имеет структуру Β'-ΝΗ-Β-, где Β предпочтительно включает структурную единицу -ΝΗ- и/или структурную единицу -(С=С)-, где С обозначает О или 8, и/или структурную единицу -8О2-. Согласно более предпочтительным вариантам осуществления, функциональная группа Β выбрана из группы, состоящей из
н <3 о О 11 —Ν—8— Н II О
и дд с
где, если С присутствует дважды, она обозначает независимо О или 8.
Поэтому, предпочтительными функциональными группами А, включающими аминогруппу -ΝΗ2, являются, например,
где С обозначает О или 8 и, если присутствует дважды, независимо О или 8, и Β' является метилом. Особенно предпочтительными функциональными группами А, включающими аминогруппы, являются аминооксигруппы
- 14 014103
Η,Ν χ N 2 Η причем наиболее предпочтительна группа Η2Ν-Ο-, и гидразидная группа
Н нХ у Θ где С предпочтительно обозначает О.
Поэтому, настоящее изобретение также относится к способу, как описано выше, в котором функциональная группа Ζ белка представляет собой альдегидную группу или кетогруппу, и функциональная группа А представляет собой аминооксигруппу или гидразидную группу. Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, А представляет собой аминооксигруппу.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к конъюгату, как описано выше, в котором функциональная группа Ζ белка представляет собой альдегидную группу или кетогруппу, и функциональная группа А представляет собой аминооксигруппу или гидразидную группу. Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, А представляет собой аминооксигруппу.
В результате реакции аминооксигруппы полимера или производного полимера с альдегидной группой или кетогруппой белка, образуется оксимная связь.
Поэтому, настоящее изобретение также относится к конъюгату, как описано выше, в котором ковалентная связь между белком и полимером или полимерным производным представляет собой оксимную связь, которая образуется в результате реакции функциональной группы Ζ белка, причем указанная функциональная группа Ζ является альдегидной группой или кетогруппой, и функциональной группой А полимера или производного полимера, причем указанная функциональная групп А представляет собой аминооксигруппу.
В результате реакции гидразидной группы полимера или производного полимера с альдегидной группой или кетогруппой белка образуется гидразиновая связь.
Поэтому, настоящее изобретение также относится к конъюгату, как описано выше, в котором ковалентная связь между белком и полимером или полимерным производным представляет собой гидразиновую связь, которая образуется в результате реакции функциональной группы Ζ белка, причем указанная функциональная группа Ζ является альдегидной группой или кетогруппой, и функциональной группой А полимера или производного полимера, причем указанная функциональная группа А представляет собой гидразидную группу.
Чтобы вводить функциональную группу А в полимер, не существует никаких определенных ограничений, при условии, что полученное производное полимера включает функциональную группу А.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, функциональную группу А вводят в полимер, вводя полимер в реакцию, по меньшей мере, с бифункциональным соединением, одна функциональная группа которого способна реагировать по меньшей мере с одной функциональной группой полимера, и по меньшей мере одна другая функциональная группа указанного, по меньшей мере, бифункционального соединения является функциональной группой А или способна к тому, чтобы быть химически модифицированной с получением функциональной группы А.
Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления, полимер вводят в реакцию, по меньшей мере, с бифункциональным соединением на его в случае необходимости окисленном восста навливающем конце.
В случае, если полимер вводят в реакцию с его неокисленным восстанавливающим концом, полимер предпочтительно имеет строение
причем в формуле (I) включена альдегидная форма неокисленного восстанавливающего конца.
В случае, если полимер вводят в реакцию с его окисленным восстанавливающим концом, полимер предпочтительно имеет строение согласно формуле (11а)
и/или согласно формуле (11Ь)
- 15 014103
Окисление восстанавливающего конца полимера, предпочтительно гидроксиэтилкрахмала, может быть выполнено согласно любому способу или комбинации способов, которые приводят к соединениям, имеющим указанные структуры (Па) и/или (ПЬ).
Хотя окисление может быть выполнено согласно любому подходящему способу или способам, приводящим к окисленному восстанавливающему концу гидроксиалкилкрахмала, его предпочтительно осуществляют, используя щелочной раствор йода как описано, например, в ΌΕ 19628705 А1, соответствующее содержание которых (пример А, столбец 9, строки 6-24) включено в настоящее описание путем ссылки.
В качестве функциональной группы, по меньшей мере, бифункционального соединения, которая является способной вступать в реакцию в случае необходимости с окисленным восстанавливающим концом полимера, может использоваться любая функциональная группа, которая является способной к образованию химической связи в случае необходимости с окисленным восстанавливающим концом гидро ксиалкилкрахмала.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения эта функциональная группа включает химическую структуру -ΝΗ-.
Поэтому, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых функциональная группа, по меньшей мере, бифункционального соединения, причем указанная функциональная группа, являющаяся способной вступать в реакцию в случае необходимости с окисленным восстанавливающим концом полимера, включает структуру -ΝΗ-.
Согласно одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения эта функциональная группа, по меньшей мере, бифункционального соединения представляет собой группу, имеющую структуру Β'-ΝΗ-, где В' обозначает водород или алкил, циклоалкил, арил, аралкил, арилцик лоалкил, алкарил или циклоалкиларил, где циклоалкил, арил, аралкил, арилциклоалкил, алкарил или циклоалкиларил может быть связан непосредственно с группой ΝΗ или, согласно другому варианту осуществления, может быть связан с группой ΝΗ кислородным мостиком. Алкил, циклоалкил, арил, аралкил, арилциклоалкил, алкарил или циклоалкиларил может быть соответствующим образом замещен. В качестве предпочтительных заместителей могут быть указаны галогены, такие как Е, С1 или Вг. Особенно предпочтительные остатки В' представляют собой водород, алкил и алкокси, и еще более предпочтительный - водород и незамещенный алкил и алкокси.
Среди алкила и алкокси предпочтительны группы с 1, 2, 3, 4, 5 или 6 атомами С. Более предпочтительны метил, этил, пропил, изопропил, метокси, этокси, пропокси и изопропокси. Особенно предпочтительны метил, этил, метокси, этокси и особое предпочтение отдается метилу или метокси.
Поэтому, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых В' обозначает водород или метил или метоксигруппу.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, функциональная группа, по меньшей мере, бифункционального соединения имеет структуру Β'-ΝΗ-Β-, где В предпочтительно включает структурную единицу -ΝΗ- и/или структурную единицу -(С=С)-, где С обозначает О или 8, и/или структурную единицу -8О2-. Согласно более предпочтительным вариантам осуществления, функциональная группа В выбрана из группы, состоящей из
где, если С присутствует дважды, она независимо обозначает О или 8.
Поэтому, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых функциональная группа по меньшей мере бифункционального соединения, причем указанная функциональная группа является способной вступать в реакцию в случае необходимости с окисленным восстанавливающим концом полимера, выбрана из группы, состоящей из
- 16 014103
где С обозначает О или 8 и, если пристутствует дважды, обозначает независимо О или 8 и К' явля ется метилом.
Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения функциональная группа, по меньшей мере, бифункционального соединения, причем указанная функциональная группа является способной вступать в реакцию в случае необходимости с окисленным восстанавли вающим концом полимера и включает аминогруппу, является аминооксигруппами
Η,Ν N 2 Н причем особенно предпочтительна группа Н2№О-, или гидразидной группой
Н η2ν γ с где С предпочтительно обозначает О.
Поэтому настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых функциональная группа Ζ белка представляет собой альдегидную группу или кетогруппу, и функциональная группа, по меньшей мере, бифункционального соединения, причем указанная функциональная группа является способной вступать в реакцию в случае необходимости с окисленным восстанавливающим концом полимера, является аминооксигруппой или гидразидной группой, предпочтительно аминооксигруппой.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к конъюгату, как описано выше, в котором функциональная группа Ζ белка представляет собой альдегидную группу или кетогруппу, и функциональная группа, по меньшей мере, бифункционального соединения, причем указанная функциональная группа является способной вступать в реакцию в случае необходимости с окисленным восстанавливающим концом полимера, является аминооксигруппой или гидразидной группой, предпочтительно аминооксигруппой.
Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, по меньшей мере, бифункциональное соединение вводят в реакцию с полимером на его неокисленном вос станавливающем конце.
Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, по меньшей мере, бифункциональное соединение, которое вступает в реакцию окисленным восстанавливающим концом полимера, включает функциональную группу А.
По меньшей мере бифункциональное соединение может быть введено в реакцию сначала с полимером с получением производного полимера, которое затем вводят в реакцию с белком через функциональную группу А. Также возможно вводить в реакцию, по меньшей мере, бифункциональное соединение через функциональную группу А сначала с белком, с получением производного белка, которое затем вводят в реакцию с полимером по меньшей мере через одну функциональную группу остатка по меньшей мере бифункционального соединения, включенного в производное белка.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, по меньшей мере, бифункциональное соединение сначала вводят в реакцию с полимером.
Поэтому настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, причем указанный способ дополнительно включает введение в реакцию полимера на его неокисленном восстанавливающем конце, по меньшей мере, с бифункциональным связывающим соединением, содержащим функциональную группу, способную вступать в реакцию с неокисленным восстанавливающим концом полимера, и группу А, до реакции производного полимера, содержащего А, и белка, содержащего Ζ.
Термин полимер (или НА8) вступает в реакцию через восстанавливающий конец или полимер (или НА8), вступает в реакцию через селективно окисленный восстанавливающий конец в контексте настоящего изобретения относится к способу, согласно которому полимер (или НА8) вступает в реакцию преимущественно через (селективно окисленный) восстанавливающий конец.
Этот термин преимущественно через (селективно окисленный) восстанавливающий конец относится к способам, согласно которым статистически более 50%, предпочтительно по меньшей мере 55%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 65%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпоч
- 17 014103 тительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, например 95%, 96%, 97%, 98% или 99% молекул гидроксиалкилкрахмала, используемых для данных реакций, вступают в реакцию через по меньшей мере один (селективно окисленный) восстанавливающий конец на молекулу полимера (или НЛ8), где данная молекула полимера (или НЛ8), которая вступает в реакцию по меньшей мере через один восстанавливающий конец, может быть введена в реакцию в той же самой данной реакции по меньшей мере через одну другую подходящую функциональную группу, которая содержится в указанной молекуле полимера (или НЛ8) и которая не является восстанавливающим концом. Если одна или более молекул полимера (или НЛ8) вступает в реакцию по меньшей мере через один восстанавливающий конец одновременно по меньшей мере через одну другую подходящую функциональную группу, которая содержится в этой (этих) молекуле(ах) полимера (или НЛ8) и которая не является восстанавливающим концом, статистически предпочтительно более 50%, предпочтительно по меньшей мере 55%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 65%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, например 85, 96, 97, 98 или 99% всех реагирующих функциональных групп этих молекул полимера (или НЛ8), причем указанные функциональные группы включают восстанавливающие концы, являются восстанавливающими концами.
Термин восстанавливающий конец, используемый в контексте настоящего изобретения, относится к концевой альдегидной группе молекулы полимера (или НЛ8), которая может присутствовать в виде альдегидной группы и/или в форме соответствующего ацеталя. В случае, когда восстанавливающий конец является окисленным, альдегидная или ацетальная группа находится в форме карбоксильной группы и/или соответствующего лактона.
Функциональная группа по меньшей мере бифункционального связывающего соединения, которая вступает в реакцию с полимером, и функциональная группа А, по меньшей мере, бифункционального связывающего соединения, которая вступает в реакцию с функциональной группой Ζ белка, могут быть разделены любым подходящим спейсером. Среди прочих, спейсер может быть в случае необходимости замещенным, линейным, разветвленным и/или циклическим углеводородным остатком. Обычно углеводородный остаток имеет до 60, предпочтительно до 40, более предпочтительно до 20, более предпочтительно до 10, более предпочтительно до 6 и особенно предпочтительно до 4 атомов углерода. Если присутствуют гетероатомы, разделяющая группа включает обычно от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 8, более предпочтительно 1-6, более предпочтительно 1-4 и особенно предпочтительно от 1 до 2 гетероатомов. В качестве гетероатома предпочтителен О. Углеводородный остаток может включать в случае необходимости разветвленную алкильную цепь или арильную группу, или циклоалкильную группу, содержащую, например, от 5 до 7 атомов углерода, или аралкильную группу, алкарильную группу, где алкильная часть может быть прямой и/или циклической алкильной группой. Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, функциональные группы отделены линейной углеводородной цепью, имеющей 4 атома углерода. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения функциональные группы отделены линейной углеводородной цепью, имеющей 4 атома углерода и по меньшей мере один, предпочтительно один гетероатом, особенно предпочтительно атом кислорода.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления, по меньшей мере, бифункциональное связывающее соединение представляет собой гомобифункциональной связывающее соединение. Поэтому настоящее изобретение также относится к способу получения конъюгата, как описано выше, в котором по меньшей мере бифункциональное связывающее соединение представляет собой гомобифункциональное соединение.
Таким образом, относительно указанных предпочтительных функциональных групп связывающего соединения, указанное гомобифункциональное связывающее соединение предпочтительно включает либо две аминооксигруппы Н2Ы-О-, либо две аминооксигруппы Κ'-Θ-ΝΉ-, или две гидразидные группы Н2Ы-МН-(С=С)-, причем предпочтительны аминооксигруппы Н2№О- и гидразидные группы ^N-N4(С=О) и особенно предпочтительны аминооксигруппы Н2№О-.
Среди всех возможных гомобифункциональных соединений, содержащих две гидразидные группы Н2N-NН-(С=О)-, предпочтительны гидразиды, где две гидразидные группы разделены углеводородным остатком, имеющим до 60, предпочтительно до 40, более предпочтительно до 20, более предпочтительно до 10, более предпочтительно до 6 и особенно предпочтительно до 4 атомов углерода.
Более предпочтительно углеводородный остаток имеет 1-4 атома углерода, например 1, 2, 3 или 4 атома углерода. Наиболее предпочтительно, углеводородный остаток имеет 4 атома углерода. Поэтому предпочтительно гомобифункциональное соединение согласно формуле
- 18 014103 о
о
В вышеописанном варианте осуществления, где альдегидная группа или кетогруппа белка вступают в реакцию с соединением, включающим две гидразидные группы Η2Ν-ΝΗ-(ί'=Θ)-. особенно предпочтительными гидроксиэтилкрахмалами являются, например, гидроксиэтилкрахмалы, имеющие в среднем молекулярную массу приблизительно 10 кДа и Ό8 приблизительно 0,4. Также возможны, например, гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 10 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 18 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 12 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 12 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 18 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 30 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 30 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу около 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу около 100 кДа и Ό8 приблизительно 0,7.
Относительно каждой из этих комбинаций средней молекулярной массы и Ό8, также предпочтительна величина Ό8 приблизительно 0,8.
Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения бифункциональное связывающее соединение представляет собой карбогидразид
О Η,ΝΧ ,Α. χΝΗ, 2 N N 2
Η Η
В вышеописанном варианте осуществления, где альдегидная группа или кетогруппа белка вступают в реакцию с карбогидразидом, особенно предпочтительные гидроксиэтилкрахмалы представляют собой, например, гидроксиэтилкрахмалы, имеющие в среднем молекулярную массу около 10 кДа и Ό8 приблизительно 0,4. Также возможны, например, гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 10 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 18 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 12 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 12 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 18 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 30 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 30 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 100 кДа и Ό8 приблизительно 0,7.
Относительно каждой из этих комбинаций средней молекулярной массы и Ό8, также предпочтительна величина Ό8 приблизительно 0,8.
Как описано выше, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых, по меньшей мере, бифункциональное связывающее соединение представляет собой гомобифункциональное соединение и включает две аминооксигруппы. Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых, по меньшей мере, бифункциональное связывающее соединение представляет собой гомобифункциональное соединение и включает две аминооксигруппы ΗΝ-О-.
Как описано выше, полимер предпочтительно вступает в реакцию на его восстанавливающем конце, который не является окисленным до реакции с бифункциональным связывающим соединением. Поэтому, реакция предпочтительного гомобифункционального соединения, включающего две аминооксигруппы Н2М-О-, с полимером приводит к производному полимера, включающему оксимную связь.
Поэтому, в случае, если функциональной группой Ζ белка является альдегидная группа или кетогруппа, которая предпочтительно вступает в реакцию с аминооксигруппой производного полимера, на
- 19 014103 стоящее изобретение также относится к конъюгату, как описано выше, причем указанный конъюгат включает полимер и белок, причем каждый присоединен ковалентной связью к связавшемуся соединению посредством оксимной или циклической аминной связью.
Среди всех возможных гомобифункциональных соединений, содержащих две аминооксигруппы Н2NО-, предпочтительны бифункциональные соединения, где две аминооксигруппы разделены углеводородным остатком, содержащим от 1 до 60, предпочтительно от 1 до 40, более предпочтительно от 1 до 20, более предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 6 и особенно предпочтительно 1-4 атомами углерода. Более предпочтительно углеводородный остаток имеет 1-4 атома углерода, например, 1, 2, 3 или 4 атома углерода. Наиболее предпочтительно,углеводородный остаток имеет 4 атома углерода. Еще более предпочтительно углеводородный остаток имеет по меньшей мере один гетероатом, более предпочтительно один гетероатом и наиболее предпочтительно один атом кислорода. Особенно предпочтительно соединение О-[2-(2-аминооксиэтокси)этил]гидроксиламин согласно формуле
Поэтому, настоящее изобретение относится к конъюгату, как описано выше, причем указанный
причем НА8' предпочтительно является НЕ8'. Особенно предпочтительные гидроксиэтилкрахмалы представляют собой, например, гидроксиэтилкрахмалы, имеющие в среднем молекулярную массу приблизительно 10 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 10 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 12 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 12 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 18 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 18 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 30 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 30 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 100 кДа и Ό8 приблизительно 0,7.
Относительно каждой из этих комбинаций средней молекулярной массы и Ό8, также предпочтительна величина Ό8 приблизительно 0,8.
В описанном выше варианте осуществления, где альдегидная группа или кетогруппа белка вступают в реакцию с гидроксиамино-группой полимера или производного полимера, особенно предпочтительные гидроксиэтилкрахмалы представляют собой, например, гидроксиэтилкрахмалы, имеющие в среднем молекулярную массу приблизительно 10 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, и гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 10 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, и гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 18 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, и гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,7. Также возможны, например, гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 12 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 12 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 18 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 30 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 30 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем моле
- 20 014103 кулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 100 кДа и Ό8 приблизительно 0,7.
В качестве белков наиболее предпочтительны гликозилированный бета ΙΕΝ, гликозилированный ΑΤ ΙΙΙ и гликозилированный СМ-С8Е. Поэтому, в случае, если гидроксиалкилкрахмал является предпочтительно гидроксиэтилкрахмалом, настоящее изобретение также относится к конъюгату
и/или конъюгату и/или конъюгату и/или конъюгату и/или конъюгату
и/или конъюгату
ΗΕ8' наиболее предпочтительно происходит независимо для каждого белка от гидроксиэтилкрахмала, имеющего в среднем молекулярную массу приблизительно 10 кДа и Ό8 приблизительно 0,4 и/или гидроксиэтилкрахмала, имеющего в среднем молекулярную массу приблизительно 10 кДа и/или Ό8 приблизительно 0,7 и/или гидроксиэтилкрахмала, имеющего в среднем молекулярную массу приблизительно 18 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, и/или гидроксиэтилкрахмала, имеющего в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, и/или гидроксиэтилкрахмала, имеющего в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, и/или гидроксиэтилкрахмала, имеющего в среднем молекулярную массу приблизительно 100 кДа и Ό8 приблизительно 0,7.
Реакцию полимера на его неокисленном восстанавливающем конце со связавшим соединением, особенно в случае, когда указанное связывающее соединение представляет собой гомобифункциональное связывающее соединение, включающее две аминооксигруппы Η2Ν-Ο-, предпочтительно осуществляют в водной системе.
Термин водная система в контексте настоящего изобретения относится к растворителю или смеси растворителей, включающих воду в диапазоне по меньшей мере от 10 вес.%, предпочтительно по меньшей мере 50 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 80 вес.%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90 вес.% или до 100 вес.%, в расчете на массу используемых растворителей. Предпочтительной реакционной средой является вода.
Согласно другому варианту осуществления, может использоваться по меньшей мере один другой растворитель, в котором ΗΑ8, предпочтительно ΗΕ8, растворим. Примерами этих растворителей явля
- 21 014103 ются, например, ΌΜΕ, диметилацетамид или диметилсульфоксид.
Что касается температур, используемых в ходе реакции, никаких определенных ограничений не существует, при условии, что реакция приводит к желаемому производному полимера.
В случае, если полимер вступает в реакцию с гомобифункциональным связывающим соединением, включающим две аминооксигруппы ΗΝ-О-, предпочтительно О-[2-(2-аминооксиэтокси)этил]гидроксиламином, температура находится предпочтительно в диапазоне от 5 до 45°С, более предпочтительно, в диапазоне от 10 до 30°С и особенно предпочтительно в диапазоне от 15 до 25°С.
Время реакции для реакции полимера с гомобифункциональным связывающим соединением, включающим две аминооксигруппы Η2Ν-Ο-, предпочтительно О-[2-(2-аминооксиэтокси)этил]гидроксиламином, может быть адаптировано к определенным потребностям и находится обычно в диапазоне от 1 ч до 7 дней, предпочтительно в диапазоне от 1 ч до 3 дней и более предпочтительно от 2 до 48 ч.
Значение рН для реакции полимера с гомобифункциональным связывающим соединением, включающим две аминооксигруппы Η2Ν-Ο-, предпочтительно О-[2-(2-аминооксиэтокси)этил]гидроксиламином, может быть адаптировано к определенным потребностям, таким как химическая природа реагентов. Значение рН находится предпочтительно в диапазоне от 4,5 до 6,5.
Частными примерами указанных условий реакции являются, например, температура реакции приблизительно 25°С и рН приблизительно 5,5.
Подходящее значение рН реакционной смеси может быть отрегулировано путем добавления по меньшей мере одного подходящего буфера. Среди предпочтительных буферов могут быть указаны ацетат натрия, фосфатные или боратные буферы.
Как только производное полимера, включающее полимер и связанное с ним бифункциональное связывающее соединение, сформировалось, оно может быть выделено из реакционной смеси по меньшей мере одним подходящим способом. В случае необходимости, производное полимера может быть осаждено до выделения по меньшей мере одним подходящим способом.
Если производное полимера сначала осаждают, возможно, например, ввести реакционную смесь в контакт по меньшей мере с одним растворителем или смесью растворителей, отличным от растворителя или смеси растворителей, присутствующего в реакционной смеси, при подходящих температурах, например, со смесью ацетон/этанол в подходящих объемных отношениях, например 1/1 об./об., или с изопропанолом, при подходящих температурах, например, от -20 до 50°С или от 0 до 25°С. Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, если в качестве растворителя используется водная среда, предпочтительно вода, реакционную смесь вводят в контакт со смесью 2-пропанола при температуре предпочтительно в диапазоне от - 20 до +50°С и особенно предпочтительно в диапазоне от 0 до 25°С.
Выделение производного полимера может быть осуществлено подходящим способом, который может включать одну или более стадий. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения производное полимера сначала отделяют от реакционной смеси или смеси реакционной смеси, например, с водной смесью 2-пропанола, подходящим способом, таким как центрифугирование или фильтрация. На второй стадии, отделенное производное полимера может быть подвергнуто дальнейшей обработке, такой как последующая обработка, например диализ, центробежная фильтрация или фильтрация под давлением, ионообменная хроматография, хроматография с обратной фазой, ВЭЖХ, МРЬС, гель-фильтрация и/или лиофилизация. Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления отделенное производное полимера сначала диализируют, предпочтительно против воды, и затем лиофилизируют, пока содержание растворителя в продукте реакции не станет достаточно низким согласно желаемым спецификациям продукта. Лиофилизация может быть осуществлена при температуре от 20 до 35°С, предпочтительно от 20 до 30°С.
Таким образом выделенное производное полимера затем вводят в реакцию через функциональную группу А, с функциональной группой Ζ белка, причем Ζ является альдегидной группой или кетогруппой. В особенно предпочтительном случае, когда А обозначает аминооксигруппу Η2Ν-Ο- для получения оксимной связи между полимерным производным и белком, реакцию предпочтительно осуществляют в водной среде, предпочтительно воде, при предпочтительной температуре в диапазоне от 0 до 40°С, более предпочтительно от 4 до 25°С и особенно предпочтительно от 15 до 25°С. Значение рН реакционной среды находится предпочтительно в диапазоне от 4 до 10, более предпочтительно в диапазоне от 5 до 9 и особенно предпочтительно в диапазоне от 5 до 7. Время реакции находится предпочтительно в диапазоне от 1 до 72 ч, более предпочтительно в диапазоне от 1 до 48 ч и особенно предпочтительно в диапазоне от 4 до 24 ч.
Конъюгат может быть подвергнут дальнейшей обработке, такой как последующая обработка, например диализ, центробежная фильтрация или фильтрация под давлением, ионообменная хроматография, хроматография с обратной фазой, ВЭЖХ, МРЬС, гель-фильтрация и/или лиофилизация.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения функциональная группа Ζ белка представляет собой аминогруппу, и белок выбирают из группы, состоящей из альфа ΙΕΝ, бета ΙΕΝ, СМ-С8Е, АРС, ΐΡΑ, А1АТ, АТ III, фактора VII, фактора VIII и фактора IX. Поэтому, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых функциональная группа Ζ белка
- 22 014103 представляет собой аминогруппу, и белок выбирают из группы, состоящей из альфа ΓΕΝ, бета ΓΕΝ, СМС8Е, АРС, ΐΡΑ, А1АТ, АТ III, фактора VII, фактора VIII и фактора IX.
Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения функциональная группа А, реагирующая с функциональной группой Ζ, являющейся аминогруппой, представляет собой реакционноспособную карбоксильную группу. Поэтому настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых функциональная группа Ζ представляет собой аминогруппу, и функциональная группа А полимера или производного полимера представляет собой реакционноспособную карбоксильную группу.
Согласно первому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, реакционноспособная карбоксильная группа введена в полимер путем селективного окисления полимера на его восстанавливающем конце.
Поэтому полимер, в который введена реакционноспособная карбоксильная группа, предпочтительно имеет строение согласно формуле (Па)
и/или согласно формуле (ПЬ)
Окисление восстанавливающего конца полимера согласно формуле (I)
предпочтительно гидроксиэтилкрахмала, может быть осуществлено согласно любому способу или комбинации способов, которые приводят к соединениям, имеющим указанные структуры (Па) и/или (ПЬ).
Хотя окисление может быть выполнено согласно любому подходящему способу или способам, приводящим к окисленному восстанавливающему концу гидроксиалкилкрахмала, его предпочтительно осуществляют, используя щелочной раствор йода, как описано, например, в ΌΕ 19628705 А1, соответствующее содержание которой (пример А, столбец 9, строки 6-24) включено в настоящее описание путем ссылки.
Введение реакционноспособной карбоксильной группы в полимер, который является селективно окисленным на его восстанавливающем конце, может быть выполнено любыми возможными способами.
Окисленный полимер может использоваться как таковой или в форме соли, такой как соль щелочного металла, предпочтительно натриевая и/или калиевая соль.
Согласно предпочтительному способу согласно настоящему изобретению, полимер, который является селективно окисленным на его восстанавливающем конце, вводят в реакцию на окисленном восстанавливающем конце по меньшей мере с одним спиртом, предпочтительно по меньшей мере с одним кислым спиртом. Более предпочтительными являются кислые спирты, имеющие величину рКА в диапазоне от 6 до 12, более предпочтительно от 7 до 11 при 25°С. Молекулярная масса кислого спирта находится предпочтительно в диапазоне от 80 до 500 г/моль, более предпочтительно от 90 до 300 г/моль и особенно предпочтительно от 100 до 200 г/моль.
Подходящими кислыми спиртами являются все спирты Н-О-ВА, имеющие кислотный протон и способные вступать в реакцию с окисленным полимером, с получением соответствующего реакционноспособного сложного эфира полимера, предпочтительно согласно формуле
- 23 014103
еще более предпочтительно согласно формуле
Предпочтительными спиртами являются Ν-гидроксисукцинимиды, такие как Ν-гидроксисукцинимид или сульфо-Ы-гидроксисукцинимид, соответствующим образом замещенные фенолы, такие как пнитрофенол, о,п-динитрофенол, о,о'-динитрофенол, трихлорфенол, такой как 2,4,6-трихлорфенол или 2,4,5-трихлорфенол, трифторфенол, такой как 2,4,6-трифторфенол или 2,4,5-трифторфенол, пентахлорфенол, пентафторфенол или гидроксиазолы, такие как гидроксибензотриазол. Особенно предпочтительны Ν-гидроксисукцинимиды, причем наиболее предпочтительны Ν-гидроксисукцинимид и сульфо-Νгидроксисукцинимид. Все спирты могут использоваться индивидуально или в виде подходящей комбинации двух или более спиртов. В контексте настоящего изобретения также возможно использовать соединение, которое высвобождает соответствующий спирт, например, путем добавления диэфиров угольных кислот.
Поэтому настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых полимер, который селективно окислен на его восстанавливающем конце, активирован путем введения в реакцию окисленного полимера с кислым спиртом, предпочтительно с Ν-гидроксисукцинимидом и/или сульфо-Л-гидроксисукцинимидом.
Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, полимер, который является селективно окисленным на его восстанавливающем конце, вступает в реакцию на окисленном восстанавливающем конце по меньшей мере с одним диэфиром угольной кислоты ВВ-О(С=О)-О-Вс, где ВВ и ВС могут быть одинаковыми или разными.
Предпочтительно, этот способ дает реакционноспособные полимеры соответственно формуле
ОВ-1
ИАЗ'ч о \ 1””” 7^-он
н Н
н о
где НА8' предпочтительно представляет собой НЕ8'.
В качестве подходящего соединения диэфира угольной кислоты могут использоваться соединения, чьи спиртовые компоненты представляют собой независимо Ν-гидроксисукцинимиды, такие как Νгидроксисукцинимид или сульфо-Л-гидроксисукцинимид, соответствующим образом замещенные фенолы, такие как п-нитрофенол, о,п-динитрофенол, о,о'-динитрофенол, трихлорфенол, такой как 2,4,6трихлорфенол или 2,4,5-трихлорфенол, трифторфенол, такой как 2,4,6-трифторфенол или 2,4,5трифторфенол, пентахлорфенол, пентафторфенол или гидроксиазолы, такие как гидроксибензотриазол. Особенно предпочтительны Ν,Ν'-дисукцинимидилкарбонат и сульфо-М^'-дисукцинимидилкарбонат, причем наиболее предпочтителен Ν,Ν'-дисукцинимидилкарбонат.
Поэтому настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых полимер, который селективно окислен на его восстанавливающем конце, активирован путем реакции окисленного полимера с Ν,Ν'-дисукцинимидилкарбонатом.
Кислый спирт вступает в реакцию с окисленным полимером или солью окисленного полимера в молярном отношении кислый спирт:полимер предпочтительно от 5:1 до 50:1, более предпочтительно от 8:1 до 20:1, при предпочтительной температуре реакции от 2 до 40°С, более предпочтительно от 10 до 30°С и особенно предпочтительно от 15 до 25°С. Время реакции находится предпочтительно в диапазоне от 1 до 10 ч, более предпочтительно от 2 до 5 ч, более предпочтительно от 2 до 4 ч и особенно от 2 до 3 ч.
Соединение диэфира угольной кислоты вступает в реакцию с окисленным полимером или солью окисленного полимера в молярном отношении соединение диэфира:полимер предпочтительно от 1:1 до 3:1, более предпочтительно от 1:1 до 1,5:1. Время реакции находится предпочтительно в диапазоне от 0,1 до 12 ч, более предпочтительно от 0,2 до 6 ч, более предпочтительно от 0,5 до 2 ч и особенно от 0,75 до 1,25 ч.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, реакцию окисленного полимера с кислым спиртом и/или диэфиром угольной кислоты осуществляют по меньшей мере в
- 24 014103 одном апротонном растворителе, особенно предпочтительно в безводном апротонном растворителе, имеющем содержание воды не более 0,5 вес.%, предпочтительно не более 0,1 вес.%. Подходящими растворителями являются, среди прочих, диметилсульфоксид (ДМСО), Ν-метилпирролидон, диметилацетамид (ДМА), диметилформамид (ДМФ) и смеси двух или более этих соединений. Температуры реакции находятся предпочтительно в диапазоне от 2 до 40°С, более предпочтительно от 10 до 30°С.
Для осуществления реакции окисленного полимера по меньшей мере с одним кислым спиртом используют по меньшей мере один дополнительный активатор.
Подходящими активаторами являются, среди прочих, карбонилдиимидазол, карбодиимиды, такие как диизопропилкарбодиимид (ДИК), дициклогексилкарбодиимиды (ДЦК), 1-этил-3-(3диметиламинопропил)карбодиимид (ЭДК), причем наиболее предпочтительны дициклогексилкарбодиимид (ДЦК) и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (ЭДК).
Поэтому, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер, который является окисленным на его восстанавливающем конце, вступает в реакцию с кислым спиртом в присутствии дополнительного активатора, с получением реакционноспособного полимера сложного эфира.
Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения реакцию окисленного полимера с диэфиром угольной кислоты и/или кислым спиртом осуществляют при низкой активности основания, которая может быть определена путем добавления реакционной смеси к воде при объемном отношении воды к реакционной смеси 10:1. До добавления вода, которая не включает по существу буфера, имеет значение рН 7 при 25°С. После добавления реакционной смеси и измеряя значение рН, получают активность основания реакционной смеси, имеющую величину предпочтительно не более 9,0, более предпочтительно не более 8,0 и особенно предпочтительно не более 7,5.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, окисленный полимер вступает в реакцию с Ν-гидрокси сукцинимидом в сухом ДМА в отсутствие воды с ЭДК, с селективным получением полимера сложного эфира Ν-гидроксисукцинимида согласно формуле
где более предпочтительно НА8' представляет собой НЕ8'.
Неожиданным образом эта реакция не дает побочных продуктов, происходящих из реакций ЭДК с группами ОН НЕ8, и реакция перегруппировки О-ацилизомочевины, образованной ЭДК и окисленным полимером, в соответствующую Ν-ацилмочевину неожиданно оказывается подавленной.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения окисленный полимер вступает в реакцию с Ν,Ν'-дисукцинимидилкарбонатом в безводном ДМФ и в отсутствие активатора, с селективным получением полимера сложного эфира Ν-гидроксисукцинимида согласно формуле
где более предпочтительно НА8' представляет собой НЕ8'.
Реакционноспособный полимер, как описано выше, предпочтительно далее вступает в реакцию по меньшей мере с одной аминогруппой белка, с получением амидной связи. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, реакционноспособный полимер вступает в реакцию с одной аминогруппой белка.
Аминогруппа белка может быть аминогруппой подходящего аминокислотного остатка белка, такого как остаток лизина или гистидина, или аминогруппой, расположенной на Ν-конце белка.
Поэтому, настоящее изобретение относится к конъюгату, предпочтительно имеющему строение согласно формуле
ОК;
%-ОН
о \ 1 Н
Κ,.Ο-Χ-γ- —г]— N—Бе лок
Н окз II
Н О
в которой атом Ν амидной связи происходит из аминогруппы белка, причем НА8' предпочтительно представляет собой НЕ8', причем гидроксиэтилкрахмал предпочтительно является гидроксиэтилкрахма
- 25 014103 лом, имеющим в среднем молекулярную массу приблизительно 10 кДа и ОБ приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмалом, имеющим в среднем молекулярную массу приблизительно 10 кДа и ОБ приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмалом, имеющим в среднем молекулярную массу приблизительно 12 кДа и ОБ приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмалом, имеющим в среднем молекулярную массу приблизительно 12 кДа и ОБ приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмалом, имеющим в среднем молекулярную массу приблизительно 18 кДа и ОБ приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмалом, имеющим в среднем молекулярную массу приблизительно 18 кДа и ОБ приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмалом, имеющим в среднем молекулярную массу приблизительно 30 кДа и ОБ приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмалом, имеющим в среднем молекулярную массу приблизительно 30 кДа и ОБ приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмалом, имеющим в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и ОБ приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмалом, имеющим в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и ОБ приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмалом, имеющим в среднем молекулярную массу приблизительно 100 кДа и ОБ приблизительно 0,7.
Относительно каждой из этих комбинаций средней молекулярной массы и ОБ также предпочтительна величина ОБ приблизительно 0,8.
Особенно предпочтительный белок, присоединенный через указанную амидную связь к гидроксиалкилкрахмалу, предпочтительно гидроксиэтилкрахмалу, представляет собой АТ III. Поэтому настоящее изобретение также относится к конъюгату
в котором атом Ν амидной связи происходит из аминогруппы АТ III и где НАБ' предпочтительно представляет собой НЕБ' и еще более предпочтительно, гидроксиэтилкрахмал, имеющий молекулярную массу приблизительно 10 кДа и величину ОБ приблизительно 0,4.
В описанном выше варианте осуществления, где аминогруппа белка вступает в реакцию с реакционноспособной карбоксильной группой полимера или производного полимера, особенно предпочтительными гидроксиэтилкрахмалами являются, например, гидроксиэтилкрахмалы, имеющие в среднем молекулярную массу приблизительно 10 кДа и ОБ приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмалы, имеющие в среднем молекулярную массу приблизительно 18 кДа и ОБ приблизительно 0,8. Также возможны гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 10 кДа и ОБ приблизительно 0,7 и гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 18 кДа и ЭБ приблизительно 0,4, и гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и ОБ приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и ОБ приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 12 кДа и ОБ приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 12 кДа и ОБ приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 18 кДа и ОБ приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 30 кДа и ОБ приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 30 кДа и ОБ приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и ОБ приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и ОБ приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 100 кДа и ОБ приблизительно 0,7.
Относительно каждой из этих комбинаций средней молекулярной массы и ОБ, также предпочтительна величина ОБ приблизительно 0,8.
Реакцию реакционноспособного полимера с белком можно осуществить, комбинируя реакционную смесь получения реакционноспособного полимера, то есть без выделения реакционноспособного полимера, включающую по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 30 и еще более предпочтительно по меньшей мере 50 вес.% реакционноспособного полимера, с водным раствором белка. Предпочтительные водные растворы белка включают от 0,05 до 10, более предпочтительно от 0,5 до 5 и особенно предпочтительно от 0,5 до 2 вес.% белка при предпочтительном рН от 5,0 до 9,0, более предпочтительно от 6,0 до 9,0 и особенно предпочтительно от 7,5 до 8,5.
Согласно настоящему изобретению, также возможно очистить реакционноспособный полимер по меньшей мере однократным, предпочтительно многократным осаждением по меньшей мере с одним подходящим осаждающим агентом, таким как безводный этиловый спирт, изопропанол и/или ацетон, с получением твердого вещества, включающего по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 30 и еще более предпочтительно по меньшей мере 50 вес.% реакционноспособного полимера.
Очищенный реакционноспособный полимер может быть добавлен к водному раствору белка. Также
- 26 014103 возможно добавить раствор очищенного реакционноспособного полимера к водному раствору белка.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, реакцию реакционноспособного полимера с белком, с получением амидной связи осуществляют при температуре от 2 до 40°С, более предпочтительно от 5 до 35°С и особенно от 10 до 30°С и при предпочтительном рН от 7,0 до 9,0, предпочтительно от 7,5 до 9,0 и особенно предпочтительно от 7,5 до 8,5, при предпочтительном времени реакции от 0,1 до 12 ч, более предпочтительно от 0,5 до 5 ч, более предпочтительно от 0,5 до 3 ч, еще более предпочтительно от 0,5 до 2 ч и особенно предпочтительно от 0,5 до 1 ч, при этом молярное отношение реакционноспособный полимер сложного эфира: белок составляет предпочтительно от 1:1 до 70:1, более предпочтительно от 5:1 до 50:1 и особенно предпочтительно от 10:1 до 50:1.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения, полимер, который является селективно окисленным на его восстанавливающем конце, вступает в реакцию на окисленном восстанавливающем конце с азолидом, таким как карбонилдиимидазол или карбонилдибензимидазол, с получением полимера, имеющего реакционноспособную карбоксильную группу. В случае карбонилдиимидазола, получают реакционноспособное производное полимера согласно формуле
в которой НА8' предпочтительно представляет собой НЕ8'. Имидазолид, происходящий из реакции полимера с азолидом, может избирательно вступать в реакцию с аминогруппой белка, с получением амидной связи. Также возможна реакция с гидроксильной группой белка, в случае присутствия последней, с получением сложноэфирной связи, или с тиогруппой белка, с получением тиоэфирной связи, или с карбоксильной группой белка, в случае пристутствия последней, с получением связи -(С=О)-О-(С=О)-.
В указанном описанном варианте осуществления, где азолид используется, чтобы ввести реакционноспособную карбоксильную группу в полимер или полимерное производное, особенно предпочтительными гидроксиэтилкрахмалами являются, например, гидроксиэтилкрахмалы, имеющие в среднем молекулярную массу приблизительно 10 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 10 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 18 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 30 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 30 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 12 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 12 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 18 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 100 кДа и Ό8 приблизительно 0,7.
Относительно каждой из этих комбинаций средней молекулярной массы и Ό8, также предпочтительна величина Ό8 приблизительно 0,8.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения, полимер, имеющий реакционноспособную карбоксильную группу А, происходящую из реакции селективно окисленного восстанавливающего конца полимера с одним из указанных соединений, предпочтительно по меньшей мере с одним из кислых спиртов и/или по меньшей мере одним из соединений диэфира угольной кислоты, может быть связан с функциональной группой Ζ белка по меньшей мере через одно линкерное соединение. В случае, если используется линкерное соединение, указанное соединение представляет собой, по меньшей мере, бифункциональное соединение, имеющее по меньшей мере одну функциональную группу Εί, способную вступать в реакцию с функциональной группой А производного полимера, и по меньшей мере одну функциональную группу Е2, способную вступать в реакцию с функциональной группой Ζ белка, или функциональную группу Е2, способную быть химически модифицированной для обеспечения возможности вступать в реакцию с функциональной группой Ζ белка. Химическая модификация может быть осуществлена, например, реакцией функциональной группы Е2 с функциональной группой Е3 дополнительного линкерного соединения или окислением или восстановлением подходящей функциональной группы Е2. В случае, если используется по меньшей мере одно линкерное соединение, реакция не ограничена аминогруппой белка, но, в зависимости от химической природы функциональных групп линкерного соединения или линкерных соединений, может использоваться, чтобы образовать связь с каждой подходящей функциональной группой белка, такой как карбоксильная группа, реакционноспособная
- 27 014103 карбоксильная группа, альдегидная группа, кетогруппа, тиогруппа, аминогруппа или гидроксильная группа. В случае, если используются два линкерных соединения, первое линкерное соединение имеет по меньшей мере одну функциональную группу Р1, способную вступать в реакцию с реакционноспособной карбоксильной группой А полимера, такой как аминогруппа, тиогруппа, гидроксильная группа или карбоксильная группа. Кроме того, первое линкерное соединение имеет по меньшей мере одну другую функциональную группу Р2, которая является способной вступать в реакцию по меньшей мере с одной функциональной группой Р3 второго линкерного соединения. Относительно функциональной группы Р2, должны быть упомянуты, среди прочих, следующие функциональные группы:
С-С-двойные связи, или С-С-тройные связи, или ароматические С-С-связи; тиогруппа или гидроксильные группы;
гидразид алкилсульфокислоты, гидразид арилсульфокислоты;
1.2- диолы;
1.2- аминоспирты;
1.2- аминотиоспирты;
азиды;
аминогруппа -NН2 или производные аминогрупп, включающие структурное звено -ΝΉ-, такие как аминоалкильные группы, аминоарильная группа, аминоаралкильные группы или алкариламиногруппы;
гидроксиламиногруппа -О-ΝΉ^ или производные гидроксиламиногруппы, включающие структурное звено -О-ΝΉ-, такие как гидроксилалкиламиногруппы, гидроксилариламиногруппы, гидроксиларалкиламиногруппы или гидроксиалкариламиногруппы;
алкоксиаминогруппы, арилоксиаминогруппы, аралкилоксиаминогруппы или алкарилоксиаминогруппы, каждая из которых включает структурное звено -ΝΉ-О-;
остатки, имеющие карбонильную группу, -О-С.'(=С)-М. в которой С обозначает О или 8, и М обозначает, например,
-ОН или -8Н;
алкоксигруппу, арилоксигруппу, аралкилоксигруппу или алкарилоксигруппу;
алкилтиогруппу, арилтиогруппу, аралкилтиогруппу или алкарилтиогруппу; алкилкарбонилоксигруппу, арилкарбонилоксигруппу, аралкилкарбонилоксигруппу, алкарилкарбонилоксигруппу;
активированные сложные эфиры, такие как сложные эфиры гидроксиламинов, имеющих имидную структуру, такие как Ν-гидроксисукцинимид или имеющие структурное звено О-Ν, где N является частью гетероарильного соединения или, когда С=О и О отсутствует, такие как соединения арилокси с замещенным остатком арила, такие как пентафторфенил, паранитрофенил или трихлорфенил;
где О отсутствует или обозначает ΝΉ или гетероатом, такой как 8 или О;
-ΝΠ-Ν^ или -ΝΉ-ΝΉ-;
-ΝΟ<
нитрильная группа;
карбонильные группы, такие как альдегидная группа или кетогруппа;
карбоксильная группа;
группа -№=С=О или группа -№=С=8; винилгалидные группы, такие как винилйодид или винилбромид или трифлат;
-С С-Н;
-(С=NН2С1)-Оалкил;
группы -(С=О)-СН2-На1, где На1 обозначает С1, Вг или I;
где Р3 обозначает группу, способную к образованию химической связи с одной из указанных групп и предпочтительно выбрана из указанных групп. Кроме того, второе линкерное соединение имеет по меньшей мере одну функциональную группу, которая является способной вступать в реакцию с функциональной группой Ζ белка, которая представляет собой, например, аминогруппу, тиогруппу, карбоксильную группу, реакционноспособную карбоксильную группу, альдегидную группу, кетогруппу или гидроксильную группу. В случае, если одно линкерное соединение используется для ковалентного связывания полимера и белка, полимер может вступать в реакцию с линкерным соединением, и полученное
- 28 014103 производное полимера вступает в реакцию с белком, или белок может вступать в реакцию с линкерным соединением, и полученное производное белка вступает в реакцию с полимером. В случае, если используются два линкерных соединения, Ь1 и Ь2, возможно осуществлять реакцию полимера с Ь1, реакцию полученного производного полимера с Ь2 и реакцию полученного производного полимера с белком, или реакцию белка с Ь2, реакцию полученного производного белка с Ь1 и реакцию полученного производного белка с полимером. Также возможно осуществлять реакцию полимера с Ь1 и реакцию белка с Ь2 и реакцию производного полимера с производным белка. Кроме того, возможно осуществлять реакцию Ь1 с Ь2, реакцию полученного соединения с полимером и полученного производного полимера - с белком. Кроме того, возможно осуществлять реакцию Ь1 с Ь2, реакцию полученного соединения с белком и полученного производного белка - с полимером.
В указанном описанном варианте осуществления, где линкерное соединение используется в комбинации с кислым спиртом и/или диэфиркарбонатом и/или азолидом, особенно предпочтительными гидроксиэтилкрахмалами являются, например, гидроксиэтилкрахмалы, имеющие в среднем молекулярную массу приблизительно 10 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 10 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 18 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 12 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 12 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 18 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 30 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 30 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 100 кДа и Ό8 приблизительно 0,7.
Относительно каждой из этих комбинаций средней молекулярной массы и Ό8, также предпочтительна величина Ό8 приблизительно 0,8.
В соответствии со вторым предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения относительно введения реакционноспособной карбоксильной группы в полимер, реакционноспособную карбоксильную группу вводят в полимер, восстанавливающий конец которого не является окисленным, путем реакции по меньшей мере одной гидроксильной группы полимера с диэфиром угольной кислоты.
Поэтому, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых А представляет собой реакционноспособную карбоксильную группу, и где А вводят в полимер, восстанавливающий конец которого не является окисленным, путем реакции по меньшей мере одной гидроксильной группы полимера по меньшей мере с одним диэфиром угольной кислоты КВ-О-(С=О)-ОКС, в котором КВ и КС могут быть одинаковыми или разными.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения, полимер, восстанавливающий конец которого не является окисленным, вступает в реакцию по меньшей мере по одной гидроксильной группе с азолидом, таким как карбонилдиимидазол, карбонил-ди-(1,2,4-триазол) или карбонилдибензимидазол, с получением полимера, имеющего реакционноспособную карбоксильную группу.
В качестве подходящих соединений диэфира угольной кислоты могут использоваться соединения, спиртовые компоненты которых представляют собой независимо Ν-гидроксисукцинимиды, такие как Νгидроксисукцинимид или сульфо-№гидроксисукцинимид, соответствующим образом замещенные фенолы, такие как п-нитрофенол, о,п-динитрофенол, о,о'-динитрофенол, трихлорфенол, такой как 2,4,6трихлорфенол или 2,4,5-трихлорфенол, трифторфенол, такой как 2,4,6-трифторфенол или 2,4,5трифторфенол, пентахлорфенол, пентафторфенол или гидроксиазолы, такие как гидроксибензотриазол.
Особенно предпочтительны симметрические соединения диэфира угольной кислоты, где КВ и КС таким образом являются одинаковыми. Спиртовой компонент диэфира угольной кислоты предпочтительно выбирают из группы, состоящей из Ν-гидроксисукцинимида, Ν-гидрокси сукцинимид сульфоната, Ν-гидроксибензотриазола и нитро- и галогензамещенных фенолов. Среди прочих, предпочтительны нитрофенол, динитрофенол, трихлорфенол, трифторфенол, пентахлорфенол и пентафторфенол. Особенно предпочтительны Ν,Ν'-дисукцинимидил карбонат и сульфо-^№-дисукцинимидилкарбонат, и наиболее предпочтительным является Ν,Ν'-дисукцинимидилкарбонат.
Неожиданно было обнаружено, что было возможно, особенно в предпочтительных диапазонах рН, приведенных выше, особенно при рН ниже 7 и большем или равном 4, осуществлять реакцию производного полимера преимущественно с аминогруппой, расположенной на Ν-конце белка. Термин преимущественно в контексте настоящего изобретения относится к варианту осуществления, где по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85% доступных Ν-концевых аминогрупп вступают в реакцию через восстановительное аминирование. Также возможно вводить в реакцию по меньшей мере 90%,
- 29 014103 или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99% доступных Ν-концевых аминогрупп. Хотя нельзя полностью исключить присоединение к аминогруппам, отличным от Ν-концевых аминогрупп, предполагается, что соединение через восстановительное аминирование согласно настоящему изобретению при рН ниже 7, предпочтительно ниже 6, происходит главным образом селективно по Ν-концевым аминогруппам. В частности, эти условия реакции предпочтительны для белков, которые являются стабильными в этих условиях. Если белок, например, является лабильным к кислоте, таким как альфа1-антитрипсин, тогда предпочтительно выбирать адекватные условия реакции, в частности, рН от менее 7,5 до более 5.
Поэтому, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых белок включает Ν-концевую аминогруппу и по меньшей мере одну другую аминогруппу, причем указанный конъюгат включает полимер, преимущественно присоединяемый к Ν-концевой аминогруппе.
Поэтому настоящее изобретение также относится к способу получения конъюгата, причем указанный способ включает реакцию полимера или производного полимера, включающего альдегидную группу, в водной среде с аминогруппой белка в присутствии восстанавливающего агента, причем указанный восстанавливающий агент предпочтительно является NаСNВΗ3.
Согласно первому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, согласно которому полимер включает по меньшей мере две альдегидные группы, которые вводят в полимер реакцией окислительного размыкания кольца, полимер предпочтительно включает по меньшей мере одну структуру согласно формуле
Согласно этому варианту осуществления настоящего изобретения, могут быть использованы любые окислительные агенты или комбинация окислительных агентов, которые являются способными к окислению по меньшей мере одного сахаридного кольца полимера, с получением открытого сахаридного кольца, имеющего по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две альдегидные группы. Эта реакция иллюстрируется в соответствии со следующей реакционной схемой, которая показывает сахаридное кольцо полимера, которое окисляют с получением открытого кольца, имеющего две альдегидные группы:
Подходящие окисляющие агенты включают, среди прочих, перйодаты, такие как перйодаты щелочных металлов или смеси двух или более этих соединений, причем предпочтительными являются перйодат натрия и перйодат калия.
Поэтому, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых полимер подвергнут реакции окислительного размыкания кольца с использованием перйодата, с получением производного полимера, имеющего по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две альдегидные группы.
Для этой реакции окисления полимер может использоваться с его восстанавливающим концом как в окисленной, так и в неокисленной форме, причем неокисленная форма является предпочтительной.
Поэтому, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых полимер используется с его восстанавливающим концом в неокисленной форме.
Температура реакции находится в предпочтительном диапазоне от 0 до 40°С, более предпочтительно от 0 до 25°С и особенно предпочтительно от 0 до 5°С. Время реакции находится в предпочтительном диапазоне от 1 мин до 5 ч и особенно предпочтительно от 10 мин до 4 ч. В зависимости от желаемой степени окисления, то есть количества альдегидных групп, получаемых в результате реакции окисления, молярное отношение перйодат: полимер может быть выбрано соответствующим образом.
Поэтому, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых реакцию окислительного размыкания кольца осуществляют при температуре от 0 до 5° С.
Реакцию окисления полимера с перйодатом предпочтительно осуществляют в водной среде, наиболее предпочтительно в воде.
Поэтому, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых реакцию окислительного размыкания кольца осуществляют в водной среде. Подходящее значение рН реакционной смеси может быть отрегулировано путем добавления по меньшей мере одного подходящего буфера. Среди предпочтительных буферов могут быть указаны ацетат натрия, фосфатные или
- 30 014103 боратные буферы.
Гидроксиэтилкрахмал, подвергнутый указанной реакции окислительного размыкания кольца, предпочтительно представляет собой гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 10 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 10 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 12 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 12 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 18 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 18 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 30 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 30 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 100 кДа и Ό8 приблизительно 0,7.
Относительно каждой из этих комбинаций средней молекулярной массы и Ό8, также предпочтительна величина Ό8 приблизительно 0,8.
Полученное производное полимера может быть очищено от реакционной смеси по меньшей мере одним подходящим способом. В случае необходимости, производное полимера может быть осаждено до выделения по меньшей мере одним подходящим способом.
Если производное полимера сначала осаждают, возможно, например, осуществить контакт реакционной смеси по меньшей мере с одним растворителем или смесью растворителей, отличным от растворителя или смеси растворителей, присутствующих в реакционной смеси, при подходящих температурах. Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, где в качестве растворителя используется водная среда, предпочтительно, вода, реакционную смесь вводят в контакт с 2-пропанолом или со смесью ацетона и этанола, предпочтительно, смесью 1:1 (об./об.), что указывает на равные объемы указанных соединений, при температуре, предпочтительно в диапазоне от -20 до +50°С и особенно предпочтительно в диапазоне от -20 до 25°С.
Выделение производного полимера может быть осуществлено подходящим способом, который может включать одну или более стадий. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, производное полимера сначала отделяют от реакционной смеси или смеси реакционной смеси с, например, водной смесью 2-пропанола, подходящим способом, таким как центрифугирование или фильтрация. На второй стадии, отделенное производное полимера может быть подвергнуто дальнейшей обработке, такой как последующая обработка, например, диализ, центробежная фильтрация или фильтрация под давлением, ионообменная хроматография, хроматография с обратной фазой, ВЭЖХ, МРЬС, гель-фильтрация и/или лиофилизация. Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления, отделенное производное полимера сначала диализируют, предпочтительно против воды, и затем лиофилизируют, пока содержание растворителя в продукте реакции не станет достаточно низким согласно желаемым спецификациям продукта. Лиофилизация может быть выполнена при температуре от 20 до 35°С, предпочтительно от 20 до 30°С.
Согласно предпочтительному варианту осуществления, окисленный полимер, полученный в реакции окисления, очищают, используя по меньшей мере один подходящий способ, такой как ультрафильтрация и/или диализ, чтобы, например, удалить нежелательные низкомолекулярные соли и полимерные компоненты, что, таким образом, также является средством контроля диапазона молекулярной массы окисленного полимера.
Окисленный полимер может использоваться непосредственно для реакции с белком или его соответственно регенерируют на первой стадии, например, путем лиофилизации, и повторно растворяют в воде для конъюгации с белком на второй стадии. Относительно соединения по меньшей мере одной аминогруппы белка по меньшей мере с одной альдегидной группой полимера путем восстановительного аминирования, можно обратиться к приведенному выше детализированному раскрытию относительно определенных параметров реакции восстановительного аминирования, таких как рН или температура. Согласно особенно предпочтительным вариантам осуществления настоящего изобретения, восстановительное аминирование предпочтительно осуществляют при температуре от 0 до 5°С, такой как приблизительно 4°С, при рН приблизительно от 4,5 до 5,5, таком как приблизительно 5,0, и при времени реакции приблизительно 20-30 ч, например приблизительно 24 ч.
Согласно второму предпочтительному варианту осуществления полимер вступает в реакцию, по меньшей мере, с бифункциональным соединением, включающим по меньшей мере одну функциональную группу М, способную вступать в реакцию с полимером, и по меньшей мере одну функциональную группу О, которая является альдегидной группой, кетогруппой или группой полуацеталя и которая вступает в реакцию с аминогруппой белка в реакции восстановительного аминирования.
Предпочтительно использовать соединения, имеющие, помимо альдегидной группы или кетогруп
- 31 014103 пы или группы полуацеталя, по меньшей мере одну карбоксильную группу или по меньшей мере одну реакционноспособную карбоксильную группу, предпочтительно одну карбоксильную группу или одну реакционноспособную карбоксильную группу. Альдегидная группа или кетогруппа или группа полуацеталя и карбоксильная группа или реакционноспособная карбоксильная группа могут быть отделены любым подходящим спейсером. Среди прочих, спейсер может быть в случае необходимости замещенным прямым, разветвленным и/или циклическим углеводородным остатком. Обычно углеводородный остаток имеет от 1 до 60, предпочтительно от 1 до 40, более предпочтительно от 1 до 20, более предпочтительно от 2 до 10, более предпочтительно от 2 до 6 и особенно предпочтительно от 2 до 4 атомов углерода. Если гетероатомы присутствуют, разделяющая группа включает обычно от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 8 и особенно предпочтительно от 1 до 4 гетероатомов. Углеводородный остаток может включать в случае необходимости разветвленную алкильную цепь или арильную группу, или циклоалкильную группу, содержащую, например, от 5 до 7 атомов углерода, или аралкильную группу, алкарильную группу, где алкильная часть может быть прямой и/или циклической алкильной группой.
Согласно предпочтительному варианту осуществления, углеводородный остаток представляет собой алкильную группу, имеющую 2-6 и предпочтительно 2-4 атома углерода. Также возможно, что между альдегидной или кетогруппой и карбоксильной группой нет атомов углерода. Альтернативно, углеводородный остаток может быть замещенной или незамещенной циклической углеводородной группой, имеющей 3-11 атомов углерода, предпочтительно 3-6 или 3-5 атомов углерода. Когда циклическая углеводородная группа является замещенной, заместитель может быть выбран из группы, состоящей из замещенной или незамещенной амино- или алкоксигруппы. В случае наличия заместителей их число предпочтительно составляет 1-3. Далее, алкильная и/или циклическая углеводородная группа может содержать один или более гетероатомов, таких как О или 8, в частности О. В этом случае присутствуют предпочтительно 1-3, в частности 1 или 2 гетероатома.
Предпочтительные соединения в этом контексте выбраны из следующей группы соединений:
Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления, углеводородный остаток представляет собой остаток арила, имеющий 5-7 и предпочтительно 6 атомов углерода. Наиболее предпочтительно, углеводородный остаток представляет собой бензольный остаток. Согласно этому предпочтительному варианту осуществления, карбоксильная группа и альдегидная группа могут быть расположены в бензольном ядре в положениях 1,4, положениях 1,3 или положениях 1,2, предпочтительно в положениях 1,4.
В качестве реакционноспособной карбоксильной группы могут быть упомянуты реакционноспособный сложный эфир, изотиоцианат или изоцианат. Предпочтительные реакционноспособные сложные эфиры получены из Ν-гидроксисукцинимидов, таких как Ν-гидроксисукцинимид или сульфо-Νгидроксисукцинимид, соответствующим образом замещенных фенолов, таких как п-нитрофенол, о,пдинитрофенол, о,о'-динитрофенол, трихлорфенол, такой как 2,4,6-трихлорфенол или 2,4,5-трихлорфенол, трифторфенол, такой как 2,4,6-трифторфенол или 2,4,5-трифторфенол, пентахлорфенол, пентафторфенол или гидроксиазолов, таких как гидроксибензотриазол. Особенно предпочтительны Ν-гидрокси сукцинимиды и наиболее предпочтительны Ν-гидроксисукцинимид и сульфо-Ν-гидрокси сукцинимид. Все спирты могут использоваться индивидуально или в виде подходящей комбинации двух или более этих соединений. В качестве реакционноспособных сложных эфиров особенно предпочтительны пентафторфениловый сложный эфир и сложный эфир Ν-гидроксисукцинимида.
- 32 014103
Частными примерами по меньшей мере бифункционального соединения, включающего карбоксильную группу, которая может быть введена в реакцию с получением реакционноспособной карбоксильной группы, являются соединения 1-11 из вышеприведенного списка. В этом контексте термин карбоксильная группа также относится к лактону и внутреннему ангидриду соединения дикарбоновой кислоты.
Таким образом, согласно предпочтительному варианту осуществления, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых полимер вступает в реакцию с формилбензойной кислотой.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых полимер вступает в реакцию с пентафторфениловым эфиром формилбензойной кислоты.
Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых полимер вступает в реакцию с эфиром Νгидроксисукцинимида и формилбензойной кислоты.
Согласно еще одному варианту осуществления, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых полимер вступает в реакцию с 4-(4-формил-3,5диметоксифенокси)масляной кислотой.
Гидроксиэтилкрахмал, подвергаемый реакции с соединением, включающим М, причем М предпочтительно является карбоксильной группой или реакционноспособной карбоксильной группой, а О является альдегидной группой или кетогруппой или группой полуацеталя, является наиболее предпочтительно гидроксиэтилкрахмалом, имеющим в среднем молекулярную массу приблизительно 10 кДа и Ό8 приблизительно 0,7. Также возможны гидроксиэтилкрахмалы, имеющие среднюю молекулярную массу приблизительно 10 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 12 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 12 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 18 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 18 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 30 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 30 кДа, и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 100 кДа и Ό8 приблизительно 0,7.
Что касается каждой из этих комбинаций средней молекулярной массы и Ό8, также предпочтительна величина Ό8 приблизительно 0,8.
Особенно предпочтительно гидроксиалкилкрахмал, еще более предпочтительно гидроксиэтилкрахмал используют с их восстанавливающим концом в окисленной форме.
Полученное производное полимера с альдегидной группой или кетогруппой, или группой полуацеталя, затем вводят в реакцию с аминогруппой белка посредством восстановительного аминирования. Что касается соединения по меньшей мере одной аминогруппы белка с по меньшей мере одной альдегидной группой или кетогруппой, или группой полуацеталя полимера в ходе восстановительного аминирования, можно обратиться к приведенному выше подробному описанию особых параметров реакции восстановительного аминирования, таких как рН или температура. Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, реакцию с аминогруппой белка предпочтительно проводят при температуре от 0 до 40°С, более предпочтительно от 0 до 25°С и особенно предпочтительно от 4 до 21°С. Время реакции предпочтительно составляет от 30 мин до 72 ч, более предпочтительно от 2 до 48 ч и особенно предпочтительно от 4 до 17 ч. Как растворитель для реакции, предпочтительна водная среда. Значение рН реакционной среды находится предпочтительно в диапазоне от 4 до 9, более предпочтительно от 4 до 8 и особенно предпочтительно от 4,5 до 5,5.
Согласно третьему предпочтительному варианту осуществления, полимер вступает в реакцию в случае необходимости на его окисленном восстанавливающем конце, по меньшей мере, с бифункциональным соединением, включающим аминогруппу М и функциональную группу О, причем указанная аминогруппа М вступает в реакцию в случае необходимости с окисленным восстанавливающим концом полимера и причем функциональная группа О химически модифицирована с получением производного полимера, несущего альдегидную функциональную группу, которое вступает в реакцию с аминогруппой белка путем восстановительного аминирования.
Относительно функциональной группы О, следующие функциональные группы должны быть упомянуты, среди прочих:
С-С-двойные связи, или С-С-тройные связи, или ароматические С-С-связи;
тиогруппа или гидроксильные группы;
гидразид алкилсульфокислоты, гидразид арилсульфокислоты;
1,2-диолы;
- 33 014103
1.2- аминотиоспирты;
азиды;
1.2- аминоспирты;
аминогруппа -ΝΗ2 или производные аминогрупп, включающие структурное звено -ΝΉ-, такие как аминоалкильные группы, аминоарильная группа, аминоаралкильные группы или алкариламиногруппы;
гидроксиламиногруппа -О-ΝΉ^ или производные гидроксиламиногруппы, включающие структурное звено -О-ИН-, такие как гидроксилалкиламиногруппы, гидроксилариламиногруппы, гидроксиларалкиламиногруппы или гидроксиалкариламиногруппы;
алкоксиаминогруппы, арилоксиаминогруппы, аралкилоксиаминогруппы или алкарилоксиаминогруппы, каждая из которых включает структурное звено -ИН-О-;
остатки, имеющие карбонильную группу, -О-С(=С)-М, в которой С обозначает О или 8, и М обозначает, например,
-ОН или -8Н;
алкоксигруппу, арилоксигруппу, аралкилоксигруппу или алкарилоксигруппу;
алкилтиогруппу, арилтиогруппу, аралкилтиогруппу или алкарилтиогруппу;
алкилкарбонилоксигруппу, арилкарбонилоксигруппу, аралкилкарбонилоксигруппу, алкарилкарбонилоксигруппу;
активированные сложные эфиры, такие как сложные эфиры гидроксиламинов, имеющих имидную структуру, такие как Ν-гидроксисукцинимид, или имеющие структурное звено О-Ν, где N является частью гетероарильного соединения или, когда С=О и О отсутствует, такие как соединения арилокси с замещенным остатком арила, такие как пентафторфенил, паранитрофенил или трихлорфенил;
где О отсутствует или обозначает ΝΉ или гетероатом, такой как 8 или О;
-ΝΉ-ΝΉ2 или -ΝΉ-ΝΉ-;
-ΝΟ2;
нитрильная группа;
карбонильные группы, такие как альдегидная группа или кетогруппа;
карбоксильная группа;
группа ^=С=О или группа ^=С=8;
винилгалидные группы, такие как винилйодид или винилбромид или трифлат;
ОС-11;
-(С=NН2С1)-О-алкил;
группы -(С=О)-СН2-На1, где На1 обозначает С1, Вг или I;
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, термин «функциональная группа р» относится к функциональной группе О, которая включает химическую структуру ΝΠ-.
Согласно одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, функциональная группа М представляет собой группу, имеющую структуру Κ'-ΝΉ-, где Κ' обозначает водород или алкил, циклоалкил, арил, аралкил, арилциклоалкил, алкарил или циклоалкиларил, причем циклоалкил, арил, аралкил, арилциклоалкил, алкарил или циклоалкиларил может быть связан непосредственно с группой Ν4 или, согласно другому варианту осуществления, может быть связан с группой Ν4 кислородным мостиком. Этот алкил, циклоалкил, арил, аралкил, арилциклоалкил, алкарил или циклоалкиларил может быть соответствующим образом замещен. В качестве предпочтительных заместителей могут быть упомянуты галогены, такие как Е, С1 или Вг. Особенно предпочтительными остатками Κ' являются водород, алкил и алкоксигруппа, и еще более предпочтительными - водород и незамещенная алкильная и алкоксигруппы.
Среди алкила и алкокси предпочтительны группы с 1, 2, 3, 4, 5 или 6 атомами С, более предпочтительны метил, этил, пропил, изопропил, метокси, этокси, пропокси и изопропокси.
Особенно предпочтительны метил, этил, метокси, этокси и особое предпочтение отдается метилу или метокси.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения, функциональная группа М имеет структуру Κ'-Ν4-Κ-, где Κ предпочтительно включает структурное звено -Ν4- и/или структурное звено -(С=С)-, где С обозначает О или 8, и/или структурное звено -8О2-. Частными примерами функ- 34 014103 циональной группы Я являются
где, если С присутствует дважды, она независимо обозначает О или 8.
Поэтому, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как указано выше, в которых функциональная группа М выбрана из группы, состоящей из
где С обозначает О или 8 и, если присутствует дважды, независимо обозначает О или 8, и Я' обо значает метил.
Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, функциональная группа М обозначает аминогруппу -ΝΗ2.
Термин аминогруппа Ц относится к функциональной группе О. которая включает химическую структуру -ΝΗ-.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, функциональная группа О представляет собой группу, имеющую структуру Я'-ΝΗ-, где Я' обозначает водород или алкил, циклоалкил, арил, аралкил, арилциклоалкил, алкарил или циклоалкиларил, причем циклоалкил, арил, аралкил, арилциклоалкил, алкарил или циклоалкиларил может быть связан непосредственно с группой ΝΗ или, согласно другому варианту осуществления, может быть связан с группой ΝΗ кислородным мостиком. Алкил, циклоалкил, арил, аралкил, арилциклоалкил, алкарил или циклоалкиларил может быть соответствующим образом замещен. В качестве предпочтительных заместителей могут быть упомянуты галогены, такие как Р, С1 или Вг. Особенно предпочтительными остатками Я' являются водород, алкил и алкокси, и еще более предпочтительными - водород и незамещенный алкил и алкокси.
Среди алкила и алкокси предпочтительны группы с 1, 2, 3, 4, 5, или 6 атомами С. Более предпочтительны метил, этил, пропил, изопропил, метокси, этокси, пропокси и изопропокси. Особенно предпочтительны метил, этил, метокси, этокси и особое предпочтение отдается метилу или метокси.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения, функциональная группа О имеет структуру Я'-NΗ-Я-, где Я предпочтительно включает структурное звено -ΝΗ- и/или структурное звено -(С=С)-, где С обозначает О или 8, и/или структурное звено -8Ο2-. Согласно более предпочтительным вариантам осуществления, функциональная группа Я выбрана из группы, состоящей из
где, если С присутствует дважды, она независимо обозначает О или 8.
Поэтому настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как указано выше, в которых функциональная группа О выбрана из группы, состоящей из
- 35 014103 где С обозначает О или 8 и, если присутствует дважды, независимо обозначает О или 8, и К' обозначает метил.
Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения функциональная группа О представляет собой аминогруппу -ΝΗ2.
Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, и М, и О включают аминогруппу -ΝΗ-. Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления, и М, и О представляют собой аминогруппу -ΝΗ2Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, соединение, включающее М и О, представляет собой гомобифункциональное соединение, более предпочтительно гомобифункциональное соединение, включающее в качестве функциональных групп группы М и О, наиболее предпочтительно аминогруппу -ΝΗ2, или согласно другим вариантам осуществления гидроксиламиногруппу -О-ΝΗ или группу
Н
У
Θ где С предпочтительно обозначает О. Частными примерами этих соединений, включающих М и О, являются или или
Гидроксиэтилкрахмал, подвергнутый реакции с соединением, включающим М, причем М предпочтительно является аминогруппой -ΝΗ- и более предпочтительно является аминогруппой -ΝΗ2, еще более предпочтительно и М, и О включают аминогруппу -ΝΗ- и особенно предпочтительно и М, и О включают аминогруппу -ΝΗ2, является предпочтительно гидроксиэтилкрахмалом, имеющим среднюю молекулярную массу приблизительно 10 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмалом, имеющим в среднем молекулярную массу приблизительно 10 кДа и Ό8 приблизительно 0,7. Также возможны гидроксиэтилкрахмалы, имеющие среднюю молекулярную массу приблизительно 12 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 12 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 18 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 18 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу приблизительно 30 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 30 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 100 кДа и Ό8 приблизительно 0,7.
Относительно каждой из этих комбинаций средней молекулярной массы и Ό8, также предпочтительна величина Ό8 приблизительно 0,8.
В случае, если и М, и О обозначают аминогруппу -ΝΗ2, М и О могут быть разделены любым подходящим спейсером. Среди прочих, спейсер может быть в случае необходимости замещенным прямым, разветвленным и/или циклическим углеводородным остатком. Обычно углеводородный остаток имеет от 1 до 60, предпочтительно от 1 до 40, более предпочтительно от 1 до 20, более предпочтительно от 2 до 10, более предпочтительно от 2 до 6 и особенно предпочтительно от 2 до 4 атомов углерода. Если присутствуют гетероатомы, разделяющая группа обычно включает от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 8 и особенно предпочтительно от 1 до 4 гетероатомов. Углеводородный остаток может включать в случае необходимости разветвленную алкильную цепь или арильную группу, или циклоалкильную группу, содержащую, например, от 5 до 7 атомов углерода, или аралкильную группу, алкарильную группу, где алкил может быть прямой и/или циклической алкильной группой. Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления, углеводородный остаток представляет собой алкильную цепь из от 1 до 20, предпочтительно от 2 до 10, более предпочтительно от 2 до 6 и особенно предпочтительно от 2 до 4 ато мов углерода.
Поэтому, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых полимер вступает в реакцию с 1,4-диаминобутаном, 1,3-диаминопропаном или 1,2-диаминоэтаном
- 36 014103 с получением производного полимера.
Согласно первой альтернативе функциональная группа М, являющаяся аминогруппой ΝΗ2, вступает в реакцию с окисленным восстанавливающим концом полимера с получением амидогруппы, связывающей полимер и соединение, включающее М и О.
Согласно второй альтернативе функциональная группа М, являющаяся аминогруппой ΝΗ2, вступает в реакцию с неокисленным восстанавливающим концом полимера через восстановительное аминирование, приводящее к иминогруппе, которую затем предпочтительно гидрируют, с получением аминогруппы, причем иминогруппа и аминогруппа, соответственно, связывают полимер и соединение, включающее М и О. В этом случае, возможно, что функциональная группа О является аминогруппой. В случае, если это полученное производное полимера должно быть подвергнуто последующей реакции, по меньшей мере, с бифункциональным соединением через карбоксильную группу или реакционноспособную карбоксильную группу, как описано далее, или другую группу, по меньшей мере, бифункционального соединения, которая должна реагировать с аминогруппой, предпочтительно, соединение, включающее М и Ц, является первичным амином, который в качестве функциональной группы содержит только одну аминогруппу. В этом частном случае, хотя соединение содержит только одну функциональную группу, оно рассматривается как бифункциональное соединение, содержащее М и Ц, где М представляет собой аминогруппу, содержащуюся в соединении, подвергнутом восстановительному аминированию с восстанавливающим концом полимера, и где О представляет собой вторичную аминогруппу, образующуюся в результате восстановительного аминирования и последующего гидрирования.
Согласно третьей альтернативе, неокисленный восстанавливающий конец полимера вступает в реакцию с аммиаком через восстановительное аминирование, приводящее к концевой иминогруппе полимера, которую затем предпочтительно гидрируют с получением концевой аминогруппу полимера и, таким образом, концевой первичной аминогруппы. В этом частном случае аммиак рассматривается как бифункциональное соединение, включающее М и Ц, где М представляет собой ΝΗ2, имеющуюся в используемом аммиаке, и где О представляет собой первичную аминогруппу, образующуюся в результате восстановительного аминирования и последующего гидрирования.
Реакцию, по меньшей мере, бифункционального соединения, содержащего М и Ц, с полимером предпочтительно осуществляют при температуре от 0 до 100°С, более предпочтительно от 4 до 80°С и особенно предпочтительно от 20 до 80°С; время реакции предпочтительно составляет от 4 ч до 7 дней, более предпочтительно от 10 ч до 5 дней и особенно предпочтительно от 17 до 4 ч. Молярное отношение, по меньшей мере, бифункциональное соединение: полимер находится предпочтительно в диапазоне от 10 до 200, особенно от 50 до 100.
Как растворитель для реакции, по меньшей мере, бифункционального соединения с полимером предпочтительным является по меньшей мере один апротонный растворитель, особенно предпочтительно безводный апротонный растворитель, имеющий содержание воды не более 0,5 вес.%, предпочтительно не более 0,1 вес.%. Подходящими растворителями являются, среди прочих, диметилсульфоксид (ДМСО), Ν-метилпирролидон, диметилацетамид (ДМА), диметилформамид (ДМФ) и смеси двух или более этих соединений.
Как растворитель для реакции, по меньшей мере, бифункционального соединения с полимером также может использоваться водная среда.
Согласно предпочтительному варианту осуществления, производное полимера, включающее полимер и по меньшей мере бифункциональное соединение, химически модифицируют по свободной функциональной группе Ц, с получением производного полимера, включающего альдегидную группу или кетогруппу или группу полуацеталя. Согласно этому варианту осуществления, предпочтительно вводить в реакцию производное полимера по меньшей мере с одним, по меньшей мере, бифункциональным соединением, которое включает функциональную группу, способную вступать в реакцию с функциональной группой О и альдегидной группой или кетогруппой или группой полуацеталя.
В качестве, по меньшей мере, бифункционального соединения является подходящим любое соединение, которое содержит альдегидную группу или кетогруппу или группу полуацеталя и по меньшей мере одну функциональную группу, которая является способной к образованию связи с функциональной группой О производного полимера. По меньшей мере одну функциональную группу выбирают из того же самого пула функциональных групп, что и Ц, и ее выбирают таким образом, чтобы она могла вступать в реакцию с О. В предпочтительном случае, когда О является аминогруппой -ΝΗ2, предпочтительно использовать соединение, содержащее, кроме альдегидной группы или кетогруппы или группы полуацеталя, по меньшей мере одну карбоксильную группу или по меньшей мере одну реакционноспособную карбоксильную группу, предпочтительно одну карбоксильную группу или одну реакционноспособную карбоксильную группу. Альдегидная группа или кетогруппа или группа полуацеталя и карбоксильная группа или реакционноспособная карбоксильная группа могут быть разделены любым подходящим спейсером. Среди прочих, спейсер может быть в случае необходимости замещенным прямым, разветвленным и/или циклическим углеводородным остатком. Обычно углеводородный остаток содержит от 1 до 60, предпочтительно от 1 до 40, более предпочтительно от 1 до 20, более предпочтительно от 2 до 10, более предпочтительно от 2 до 6 и особенно предпочтительно от 2 до 4 атомов углерода. Если гетероа
- 37 014103 томы присутствуют, разделяющая группа включает обычно от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 8 и особенно предпочтительно от 1 до 4 гетероатомов. Углеводородный остаток может включать в случае необходимости разветвленную алкильную цепь или арильную группу, или циклоалкильную группу, содержащую, например, от 5 до 7 атомов углерода, или аралкильную группу, алкарильную группу, где алкильная часть может быть прямой и/или циклической алкильной группой.
Согласно предпочтительному варианту осуществления, углеводородный остаток представляет собой алкильную группу, имеющую 2-6 и предпочтительно 2-4 атома углерода. Также возможно, что между альдегидной или кетогруппой и карбоксильной группой не содержится атомов углерода. Альтернативно, углеводородный остаток может быть замещенной или незамещенной циклической углеводородной группой, имеющей 3-11 атомов углерода, предпочтительно 3-6 или 3-5 атомов углерода. Когда циклическая углеводородная группа является замещенной, заместитель может быть выбран из группы, состоящей из замещенной или незамещенной амино- или алкоксигруппы. Если присутствуют заместители, их число предпочтительно составляет 1-3. Далее, алкил и/или циклическая углеводородная группа может содержать один или более гетероатомов, таких как О или 8, в частности О. В этом случае, предпочтительно присутствуют 1-3, в частности 1 или 2, гетероатома. Предпочтительные соединения в этом контексте выбраны из следующей группы соединений:
о
11
Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления углеводородный остаток представляет собой остаток арила, имеющий 5-7 и предпочтительно 6 атомов углерода. Наиболее предпочтительно углеводородный остаток представляет собой бензольный остаток. Согласно этому предпочтительному варианту осуществления карбоксильная группа и альдегидная группа могут быть расположены в бензольном ядре в положениях 1,4, в положениях 1,3 или в положениях 1,2, предпочтительно в положениях 1,4.
Как реакционноспособная карбоксильная группа, могут быть упомянуты реакционноспособный сложный эфир, изотиоцианаты или изоцианат. Предпочтительные реакционноспособные сложные эфиры получены из Ν-гидроксисукцинимидов, таких как Ν-гидроксисукцинимид или сульфо-Ы-гидроксисукцинимид, соответствующим образом замещенных фенолов, таких как п-нитрофенол, о,п-динитрофенол, о,о'-динитрофенол, трихлорфенол, такой как 2,4,6-трихлорфенол или 2,4,5-трихлорфенол, трифторфенол, такой как 2,4,6-трифторфенол или 2,4,5-трифторфенол, пентахлорфенол, пентафторфенол, или гидроксиазолов, таких как гидроксибензотриазол. Особенно предпочтительны Ν-гидрокси сукцинимиды, и наиболее предпочтительны Ν-гидроксисукцинимид и сульфо-Л-гидроксисукцинимид. Все спирты могут использоваться индивидуально или в виде подходящей комбинации двух или более этих соединений. В качестве реакционноспособных сложных эфиров особенно предпочтительны пентафторфениловый сложный эфир и сложный эфир Ν-гидроксисукцинимида.
Согласно определенному варианту осуществления, функциональная группа, которая является способной к образованию химической связи с функциональной группой О. причем О предпочтительно является ΝΗ2 или производным аминогруппы, включающим структурное звено -ΝΗ-, таким как аминоалкильные группы, аминоарильная группа, аминоаралкильные группы, или алкариламиногруппы, в особенности -ΝΗ2, является реакционноспособной карбоксильной группой.
В этом случае, функциональную группу, которая является способной к образованию химической связи с функциональной группой О и которая является карбоксильной группой, вводят в реакцию соответствующим образом, чтобы получить реакционноспособную карбоксильную группу, как описано выше. Поэтому предпочтительно подвергают по меньшей мере одно бифункциональное соединение, которое включает карбоксильную группу и альдегидную группу или кетогруппу или группу полуацеталя,
- 38 014103 реакции, в которой карбоксильная группа преобразуется в реакционноспособную карбоксильную группу, и полученное, по меньшей мере, бифункциональное соединение очищают и вводят в реакцию с функциональной группой О производного полимера.
Частными примерами, по меньшей мере, бифункционального соединения, включающего карбоксильную группу, которая может быть введена в реакцию с получением реакционноспособной карбоксильной группы, являются соединения 1-11 из списка, приведенного выше. В этом контексте, термин карбоксильная группа также относится к лактону и внутреннему ангидриду соединения дикарбоновой кислоты.
Таким образом, согласно предпочтительному варианту осуществления, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых производное полимера, содержащее О, причем О является аминогруппой -ΝΗ2, далее вступает в реакцию с формилбензойной кислотой.
Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых производное полимера, включающее О, причем О является аминогруппой, далее вступает в реакцию с пентафторфениловым эфиром формилбензойной кислоты.
Согласно еще одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых производное полимера, включающее О, причем О является аминогруппой, далее вступает в реакцию с эфиром Ν-гидроксисукцинимида и формилбензойной кислоты.
Согласно еще одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых производное полимера, включающее О, причем О является аминогруппой, далее вступает в реакцию с 4-(4-формил-3-5-диметоксифенокси)масляной кислотой.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых производное полимера, включающее О, причем О является аминогруппой -ΝΗ2, далее вступает в реакцию с бифункциональным соединением, которое является биологически совместимым соединением, выбранным из группы, состоящей из альфа-кетокарбоновых кислот, сиаловых кислот или их производных и пиридоксаль-фосфата.
Что касается альфа-кето-карбоновых кислот, они представляют собой предпочтительно альфа-кетокарбоновые кислоты, полученные из аминокислот, и могут в большинстве случаев также быть обнаружены в организме человека.
Предпочтительные альфа-кето-карбоновые кислоты, полученные из аминокислот, выбирают из группы, состоящей из кето-валина, кето-лейцина, кето-изолейцина и кето-аланина. Карбоксильная группа альфа-кето-карбоновых кислот реагирует с группой О полимера, являющейся аминогруппой. Образуется амидогруппа. Остающаяся свободная кетогруппа альфа-кето-карбоновой кислоты может затем реагировать с функциональной группой белка, в особенности аминогруппой. Образуется иминогруппа, которая может быть гидрирована.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых производное полимера, включающее О, причем О является аминогруппой, далее вступает в реакцию с альфа-кето-карбоновой кислотой.
Что касается сиаловых кислот или их производных, они предпочтительно биологически совместимы, в особенности они представляют собой сахара, обнаруживаемые в организме человека, которые являются Ν- и/или О-ацетилированными. В предпочтительном варианте осуществления нейраминовые кислоты или сиаловые кислоты представляют собой Ν-ацетилнейраминовые кислоты. Эти соединения показывают желаемую жесткость благодаря пиранозной структуре, достаточную, чтобы выполнять функцию спейсера. С другой стороны, может быть возможно ввести альдегидную группу в эти соединения через селективное окисление. Сиаловые кислоты обнаруживаются в организме человека, например, как концевые моносахариды в гликановых цепях гликозилированных белков.
В предпочтительном варианте осуществления, сиаловая кислота может быть селективно окисленной до альдегидной группы.
Способы селективного окисления сиаловых кислот или нейраминовых кислот известны в уровне техники, например, из Ь. ^. 1ацие5, В. Р. Кгексо, ^. \Уе11пег СагЬоЬубга!е КекеагсЬ, 83 (1980), 21-32 и Т. Макиба, 8. 8ЫЬиуа, Μ.ΑΓηί, 8. УокЫба, Т. Тото/а/уа, Α. ОЬио, М. УатакЬйа, Т. Нопба, Вюогдашс & Меб1С1иа1 СЬет18йу Ьейегк, 13 (2003), 669-673.
Предпочтительно окисление сиаловой кислоты может быть осуществлено до реакции с полимером, содержащим О, где О является аминогруппой.
В случае необходимости окисленная сиаловая кислота может затем быть введена в реакцию по ее группе карбоновой кислоты с аминогруппой полимера.
Полученные соединения содержат альдегидную группу, которая может затем быть введена в реакцию восстановительного аминирования с аминогруппой белка.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых производное полимера, включающее О, причем О является аминогруппой, далее вступает в реакцию с в случае необходимости окисленной сиаловой кислотой.
Что касается пиридоксальфосфата (РуР), он представляет собой высоко биологически совместимое
- 39 014103 бифункциональное соединение и также называется витамином В6, РуР-кофермент, который участвует в реакциях переаминирования, декарбоксилирования, рацемизации и в многочисленных модификациях боковых цепей аминокислоты. Все ферменты, для которых необходим РуР, действуют через образование основания 8сЫ£Ра между аминокислотой и ко-ферментом.
Фосфатная группа РуР может быть введена в реакцию с аминогруппой полимера, предпочтительно гидроксиалкилкрахмала, особенно гидроксиэтилкрахмала, с образованием фосфорамида. Альдегидная группа РуР может затем быть введена в реакцию с аминогруппой белка, образуя основание 8сЬ1£Та, которое может затем быть восстановлено. В предпочтительном варианте осуществления, конъюгат имеет структуру -НΕ8-NН-Р(О)2-О-(пиридоксаль)-СН-NН-белок.
В случае РуР, функциональную группу О полимера предпочтительно вводят в полимер при помощи диаминосоединения, как описано выше.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых производное полимера, включающее О, причем О является аминогруппой, далее вступает в реакцию с пиридоксаль-фосфатом.
В качестве растворителя для реакции производного полимера, включающего аминогруппу и, например, формилбензойной кислоты, предпочтительным является по меньшей мере один апротонный растворитель или по меньшей мере один полярный растворитель.
Подходящими растворителями являются, среди прочих, вода, диметилсульфоксид (ДМСО), Νметилпирролидон, диметилацетамид (ДМА), диметилформамид (ДМФ) и смеси двух или более этих соединений.
Как растворитель для реакции производного полимера, включающего аминогруппу, и, по меньшей мере, бифункционального соединения, включающего карбоксильную группу, также возможно использовать водную среду. Термин водная среда в этом контексте настоящего изобретения относится к растворителю или смеси растворителей, включающих воду в диапазоне по меньшей мере от 10 вес.%, или по меньшей мере 20 вес.%, или по меньшей мере 30 вес.%, или по меньшей мере 40 вес.%, или по меньшей мере 50 вес.%, или по меньшей мере 60 вес.%, или по меньшей мере 70 вес.%, или по меньшей мере 80 вес.%, или по меньшей мере 90 вес.%, или до 100 вес.% в расчете на массу используемых растворителей.
Реакцию предпочтительно осуществляют при температуре от 0 до 40°С, более предпочтительно от 0 до 25°С и особенно предпочтительно от 15 до 25°С при времени реакции предпочтительно от 0,5 до 24 ч и особенно предпочтительно от 1 до 17 ч.
Согласно предпочтительному варианту осуществления реакцию осуществляют в присутствии активатора. Подходящими активаторами являются, среди прочих, карбодиимиды, такие как диизопропил карбодиимид (Э1С), дициклогексил карбодиимиды (ОСС), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (БОС), причем особенно предпочтителен диизопропилкарбодиимид (Э1С).
Полученное производное полимера может быть очищено от реакционной смеси по меньшей мере одним подходящим способом. В случае необходимости производное полимера может быть осаждено до выделения по меньшей мере одним подходящим способом.
Если производное полимера сначала осаждают, можно, например, осуществить контакт реакционной смеси по меньшей мере с одним растворителем или смесью растворителей, отличным от растворителя или смеси растворителей, имеющихся в реакционной смеси, при подходящих температурах. Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, когда в качестве растворителя используется водная среда, предпочтительно вода, реакционную смесь вводят в контакт с 2пропанолом, или со смесью ацетона и этанола, предпочтительно смесью 1:1 (об./об.), что указывает на равные объемы указанных соединений, при температуре, предпочтительно, в диапазоне от -20 до +50°С и особенно предпочтительно в диапазоне от -20 до 25°С.
Выделение производного полимера может быть осуществлено подходящим способом, который может включать одну или более стадий. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения производное полимера сначала отделяют от реакционной смеси или смеси реакционной смеси с, например, водной смесью с 2-пропанолом, подходящим способом, таким как центрифугирование или фильтрация. На второй стадии отделенное производное полимера может быть подвергнуто дальнейшей обработке, такой как последующая обработка, например диализ, центробежная фильтрация или фильтрация под давлением, ионообменная хроматография, хроматография с обратной фазой, ВЭЖХ, МРБС, гель-фильтрация и/или лиофилизация. Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления отделенное производное полимера сначала диализируют, предпочтительно против воды, и затем лиофилизируют, пока содержание растворителя в продукте реакции не станет достаточно низким согласно желаемым спецификациям продукта. Лиофилизация может быть выполнена при температуре от 20 до 35°С, предпочтительно от 20 до 30°С.
Полученное производное полимера с альдегидной группой или кетогруппой или группой полуацеталя впоследствии вступает в реакцию с аминогруппой белка через восстановительное аминирование. Относительно соединения по меньшей мере одной аминогруппы белка по меньшей мере с одной альдегидной группой или кетогруппой или группой полуацеталя полимера путем восстановительного аминирования, можно обратиться к приведенному выше подробному описанию относительно определенных
- 40 014103 параметров реакции восстановительного аминирования, таких как рН или температура. Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения восстановительное аминирование осуществляют при температуре от 0 до 10°С, например от 1 до 8°С или от 2 до 6°С, например приблизительно 4°С при рН приблизительно от 4,5 до 5,5, например приблизительно 5,0. Время реакции составляет приблизительно 10-20 ч, например от 12 до 19 ч или от 14 до 18 ч, например приблизительно 17 ч или приблизительно от 20 до 30 ч, например приблизительно 24 ч.
Таким образом, согласно указанным предпочтительным вариантам осуществления, настоящее изобретение также относится, в случае, если полимер вступает в реакцию через его окисленный восстанавливающий конец, к конъюгату согласно формуле
Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления, полимер является гидроксиэтилкрахмалом, то есть, НА8' представляет собой НЕ8', и и=2, 3 или 4, наиболее предпочтительно 4, как описано выше. Поэтому в случае, если полимер вступает в реакцию через его окисленный восстанавливающий конец, настоящее изобретение также относится к конъюгату согласно формуле
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящее изобретение также относится, в случае, если полимер вступает в реакцию через его окисленный восстанавливающий конец, к конъюгату согласно формуле
в которой и=2, 3 или 4, причем является независимо водородом или метоксигруппой и т=0 в случае, если В4 обозначает водород и т=1 в случае, если В4 обозначает метокси, причем НА8 предпочтительно представляет собой НЕ8'.
В каждой из формул, приведенных выше, азот, присоединенный к белку, происходит из аминогруппы белка, с которым производное полимера связано через альдегидную группу.
Относительно указанных вариантов осуществления, согласно которым функциональные группы М и О включают аминогруппу -ЫН2, также возможно, что М является аминогруппой -№Н2 и О включает бета-гидроксиаминогруппу -СН(ОН)-СН2-ХН2 и предпочтительно представляет собой бета-гидроксиаминогруппу.
Поэтому, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых аминогруппа О соединения, включающего две аминогруппы Ми О, является бета-гидроксиаминогруппой -СН(ОН)-СН2-ЫН2.
В этом случае М и О могут быть отделены любым подходящим спейсером. Среди прочих, спейсер может быть в случае необходимости замещенным прямым, разветвленным и/или циклическим углеводородным остатком. Обычно углеводородный остаток имеет от 1 до 60, предпочтительно от 1 до 40, более предпочтительно от 1 до 20, более предпочтительно от 2 до 10, более предпочтительно от 1 до 6 и особенно предпочтительно от 1 до 2 атомов углерода. Если гетероатомы присутствуют, разделяющая группа включает обычно от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 8 и особенно предпочтительно от 1 до 4 гетероатомов. Углеводородный остаток может включать в случае необходимости разветвленную алкильную цепь или арильную группу или циклоалкильную группу, содержащую, например, от 5 до 7 атомов углерода, или аралкильную группу, алкарильную группу, где алкильная часть может быть прямой и/или циклической алкильной группой. Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления углеводородный остаток представляет собой алкильную цепь от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 6, более предпочтительно от 1 до 4 атомов углерода и особенно предпочтительно от 1
- 41 014103 до 2 атомов углерода. Еще более предпочтительно М и О отделены метиленовой группой.
Поэтому настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых полимер вступает в реакцию с 1,3-диамино-2-гидроксипропаном.
В случае, если полимер вступает в реакцию через его окисленный восстанавливающий конец, в результате получают производное полимера согласно формуле
особенно предпочтительно с НА8' = НЕ8'.
Реакцию, по меньшей мере, бифункционального соединения, включающего М и О, особенно предпочтительно 1,3-диамино-2-гидроксипропана, с полимером предпочтительно осуществляют при температуре от 40 до 120°С, более предпочтительно от 40 до 90°С и особенно предпочтительно от 60 до 80°С. Время реакции предпочтительно составляет от 17 до 168 ч, более предпочтительно от 17 до 96 ч и особенно предпочтительно от 48 до 96 ч. Молярное отношение, по меньшей мере, бифункциональное соединение: полимер находится предпочтительно в диапазоне от 200:1 до 10:1, особенно от 50:1 до 100:1.
Как растворитель для реакции, по меньшей мере, бифункционального соединения с полимером предпочтительным является по меньшей мере один апротонный растворитель, предпочтительно безводный апротонный растворитель, имеющий содержание воды не более 0,5 вес.%, предпочтительно не более 0,1 вес.%. Подходящими растворителями являются, среди прочих, диметилсульфоксид (ДМСО), Νметилпирролидон, диметилацетамид (ДМА), диметилформамид (ДМФ) и смеси двух или более этих соединений.
Бета-гидроксиаминогруппа О производного полимера обычно может быть введена в реакцию, по меньшей мере, с бифункциональным соединением, включающим по меньшей мере одну функциональную группу, способную вступать в реакцию с О, и также включающим по меньшей мере одну функциональную группу, являющуюся альдегидной группой или кетогруппой или группой полуацеталя, или функциональную группу, которая может быть модифицирована с получением альдегидной группы или кетогруппы, или группы полуацеталя. Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения бета-гидроксиаминогруппу непосредственно химически модифицируют с получением альдегидной группы путем химического окисления.
Это окисление можно осуществлять со всеми подходящими оксиляющими агентами, которые являются способными к преобразованию бета-гидроксиаминогруппы в альдегидную группу. Предпочтительными окисляющими реагентами являются перйодаты, такие как перйодаты щелочных металлов. Особенно предпочтительным является перйодат натрия, который предпочтительно используется в виде водного раствора. Этот раствор предпочтительно имеет концентрацию перйодата от 1 до 50 мМ, более предпочтительно от 1 до 25 мМ и особенно предпочтительно от 1 до 10 мМ. Окисление осуществляют при температуре от 0 до 40°С, предпочтительно от 0 до 25°С и особенно предпочтительно от 4 до 20°С.
Полученное производное полимера может быть очищено от реакционной смеси по меньшей мере одним подходящим способом. В случае необходимости, производное полимера может быть осаждено до выделения по меньшей мере одним подходящим способом.
Если производное полимера сначала осаждают, возможно, например, ввести в контакт реакционную смесь по меньшей мере с одним растворителем, или смесью растворителей, отличным от растворителя или смеси растворителей, присутствующих в реакционной смеси, при подходящих температурах. Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, если в качестве растворителя используется водная среда, предпочтительно вода, реакционную смесь вводят в контакт с 2-пропанолом или со смесью ацетона и этанола, предпочтительно со смесью 1:1 (об./об.), что указывает на равные объемы указанных соединений, при температуре, предпочтительно в диапазоне от -20 до +50°С и особенно предпочтительно в диапазоне от -20 до 25°С.
Выделение производного полимера может быть осуществлено подходящим способом, который может включать одну или более стадий. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения производное полимера сначала отделяют от реакционной смеси или смеси реакционной смеси, например, с водной смесью с 2-пропанолом, подходящим способом, таким как центрифугирование или фильтрация. На второй стадии, отделенное производное полимера может быть подвергнуто дальнейшей обработке, такой как последующая обработка, например диализ, центробежная фильтрация или фильтрация под давлением, ионообменная хроматография, хроматография с обратной фазой, ВЭЖХ, МРЬС, гель-фильтрация и/или лиофилизация. Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления отделенное производное полимера сначала диализируют, предпочтительно против воды, и затем лиофилизируют, пока содержание растворителя в продукте реакции не станет достаточно низким согласно желаемым спецификациям продукта. Лиофилизация может быть осуществлена при температуре
- 42 014103 от 20 до 35°С, предпочтительно от 20 до 30°С.
Поэтому настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых окисление бета-гидроксиаминогруппы О осуществляют, используя перйодат.
Поэтому настоящее изобретение также относится к способу получения конъюгата, в котором в случае, если полимер использовался с окисленным восстанавливающим концом, производное полимера, имеющее бета-гидроксиаминогруппу, особенно предпочтительно
ОК·!
НА8Ч %он
о \ н он
н Окз II
и О
и особенно где ΗΑ8'=ΗΕ8', окисляют, предпочтительно перйодатом, до производного полимера, имеющего альдегидную группу, особенно предпочтительно
и особенно где ΗΑ8' = ΗΕ8'.
Согласно настоящему изобретению также возможно вводить в реакцию соединение, включающее структуру 1-амино-2-гидрокси, изображенную выше, по меньшей мере, с бифункциональным соединением, включающим карбоксильную группу или реакционноспособную карбоксильную группу и альдегидную, кето- или ацетальную группу, описанную выше, чтобы получить производное полимера, которое может быть подвергнуто восстановительному аминированию с аминогруппой белка.
Полученное производное полимера с альдегидной группой А затем вступает в реакцию с белком. Поэтому настоящее изобретение также относится к способу получения конъюгата, причем указанный способ включает введение в реакцию производного полимера, имеющего бета-гидроксиаминогруппу, в случае, если полимер использовался с окисленным восстанавливающим концом, особенно предпочтительно, согласно формуле
и особенно с ΗΑ8'=ΗΕ8', с аминогруппой белка.
Полученное производное полимера с альдегидной группой впоследствии вступает в реакцию с аминогруппой белка через восстановительное аминирование. Относительно соединения по меньшей мере одной аминогруппы белка по меньшей мере с одной альдегидной группой полимера восстановительным аминированием можно обратиться к подробному раскрытию, приведенному выше.
Таким образом, согласно указанному предпочтительному варианту осуществления, настоящее изобретение также относится к конъюгату согласно формуле
особенно, где ΗΑ8'=ΗΕ8', в случае, когда полимер используется с окисленным восстановительным концом. В вышеприведенной формуле азот, связанный с белком, происходит из аминогруппы белка, с которым производное полимера связано через альдегидную группу.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения полимер сначала вводят в ре акцию с подходящим соединением с получением первого производного полимера, содержащего по меньшей мере одну реакционноспособную карбоксильную группу. Затем это первое производное полимера вводят в реакцию с другим, по меньшей мере, бифункциональным соединением, причем по меньшей мере одна функциональная группа этого другого соединения реагирует по меньшей мере с одной реакционноспособной карбоксильной группой производного полимера, и по меньшей мере одна другая функциональная группа другого соединения является альдегидной группой или кетогруппой или группой полуацеталя, или представляет собой функциональную группу, которая химически модифицирована с получением альдегидной группы или кетогруппы или группы полуацеталя, и причем полученное про
- 43 014103 изводное полимера, включающее указанную альдегидную группу или кетогруппу или группу полуацеталя, вступает в реакцию через восстановительное аминирование, как описано выше, по меньшей мере с одной аминогруппой белка. Также возможно изменить последовательность реакций соответствующих соединений друг с другом.
Согласно первой альтернативе для указанного другого варианта осуществления, полимер, включающий по меньшей мере одну реакционноспособную карбоксильную группу, получают селективным окислением полимера на его восстанавливающем конце и последующим введением окисленного полимера, представляющего собой лактон
и/или карбоновую кислоту
или подходящую соль карбоновой кислоты, такую как соль щелочного металла, предпочтительно такую как натриевая и/или калиевая соль, и причем НА8' предпочтительно представляет собой НЕ8', в реакцию с подходящим соединением, с получением полимера, включающего по меньшей мере одну реакционноспособную карбоксильную группу.
Окисление полимера, предпочтительно гидроксиэтилкрахмала, может быть осуществлено согласно любому способу или комбинации способов, которые приводят к соединениям, имеющим указанные структуры (11а) и/или (11Ь).
Хотя окисление может быть осуществлено согласно любому подходящему способу или способам, приводящим к окисленному восстанавливающему концу гидроксиалкилкрахмала, его предпочтительно осуществляют, используя щелочной раствор йода, как описано, например, в ОЕ 19628705 А1, соответствующее содержание которого (пример А, столбец 9, строки 6-24) включено в настоящее описание путем ссылки.
Введение реакционноспособной карбоксильной группы в полимер, который является селективно окисленным на его восстанавливающем конце, может быть осуществлено любыми возможными способами и с использованием любых подходящих соединений.
Согласно частному варианту способа по изобретению, полимер, который является селективно окис ленным на его восстанавливающем конце, вступает в реакцию на окисленном восстанавливающем конце по меньшей мере с одним спиртом, предпочтительно по меньшей мере с одними кислым спиртом, таким как кислые спирты, имеющие величину рКА в диапазоне от 6 до 12 или от 7 до 11 при 25°С. Молекулярная масса кислого спирта может составлять от 80 до 500 г/моль, например от 90 до 300 г/моль или от 100 до 200 г/моль.
Подходящими кислыми спиртами являются все спирты Н-О-КА, имеющие кислотный протон и способные вступать в реакцию с окисленным полимером, с получением соответствующего реакционноспособного сложного эфира полимера, предпочтительно, согласно формуле
еще более предпочтительно, согласно формуле
Предпочтительными спиртами являются Ν-гидроксисукцинимиды, такие как Ν-гидроксисукцинимид или сульфо-№гидроксисукцинимид, соответствующим образом замещенные фенолы, такие как пнитрофенол, о,п-динитрофенол, о,о'-динитрофенол, трихлорфенол, такой как 2,4,6-трихлорфенол или
- 44 014103
2,4,5-трихлорфенол, трифторфенол, такой как 2,4,6-трифторфенол или 2,4,5-трифторфенол, пентахлорфенол, пентафторфенол или гидроксиазолы, такие как гидроксибензотриазол. Особенно предпочтительны Ν-гидроксисукцинимиды, и наиболее предпочтительны Ν-гидроксисукцинимид и сульфо-Νгидроксисукцинимид. Все спирты могут использоваться индивидуально или в виде подходящей комбинации двух или более из этих соединений. В контексте настоящего изобретения также возможно использовать соединение, которое выделяет соответствующий спирт, например, добавляя диэфиры угольной кислоты.
Поэтому настоящее изобретение также относится к способу, как описано выше, в котором полимер, который селективно окислен на его восстанавливающем конце, активирован реакцией окисленного полимера с кислым спиртом, предпочтительно, с Ν-гидроксисукцинимидом и/или сульфо-Ы-гидроксисукцинимидом.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, полимер, который является селективно окисленным на его восстанавливающем конце, вступает в реакцию на окисленном восстанавливающем конце по меньшей мере с одним диэфиром угольной кислоты Кв-О-(С=О)-О-ЯС, причем Кв и КС могут быть одинаковыми или разными. Предпочтительно, этот способ приводит к реакционноспособным полимерам согласно формуле
где НА8' предпочтительно представляет собой НЕ8'.
В качестве подходящих соединений диэфира угольной кислоты могут использоваться соединения, спиртовые компоненты которых представляют собой независимо Ν-гидроксисукцинимиды, такие как Νгидроксисукцинимид или сульфо-Ц-гидроксисукцинимид, соответствующим образом замещенные фенолы, такие как п-нитрофенол, о,п-динитрофенол, о,о'-динитрофенол, трихлорфенол, такой как 2,4,6-трихлорфенол или 2,4,5-трихлорфен, трифторфенол, такой как 2,4,6-трифторфенол или 2,4,5-трифторфенол, пентахлорфенол, пентафторфенол или гидроксиазолы, такие как гидроксибензотриазол. Особенно предпочтительный Ν,Ν'-дисукцинимидилкарбонат и сульфо-Ν,Ν'-дисукцинимидилкарбонат, причем Ν,Ν'дисукцинимидилкарбонат является особенно предпочтительным.
Поэтому, настоящее изобретение также относится к способу, как описано выше, в котором полимер, который селективно окислен на его восстанавливающем конце, активирован реакцией окисленного полимера с Ν,Ν'-дисукцинимидилкарбонатом.
Кислый спирт вступает в реакцию с окисленным полимером или солью окисленного полимера в молярном отношении кислый спирт:полимер предпочтительно от 5:1 до 50:1, более предпочтительно от 8:1 до 20:1, при предпочтительной температуре реакции от 2 до 40°С, более предпочтительно от 10 до 30°С и особенно предпочтительно от 15 до 25°С. Время реакции находится предпочтительно в диапазоне от 1 до 10 ч, более предпочтительно от 2 до 5 ч, еще более предпочтительно от 2 до 4 ч и особенно предпочтительно от 2 до 3 ч.
Соединение диэфира угольной кислоты реагирует с окисленным полимером или солью окисленного полимера в молярном отношении диэфир: полимер обычно от 1:1 до 3:1, например от 1:1 до 1,5:1, Время реакции обычно составляет от 0,1 до 12 ч, например от 0,2 до 6 ч или от 0,5 до 2 ч или от 0,75 до 1,25 ч.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, реакцию окисленного полимера с кислым спиртом и/или диэфиром угольной кислоты осуществляют в по меньшей мере одном апротонном растворителе, таком как безводный апротонный растворитель, имеющий содержание воды не более 0,5 вес.%, предпочтительно не более 0,1 вес.% Подходящими растворителями являются, в числе прочих, диметилсульфоксид (ДМСО), Ν-метилпирролидон, диметилацетамид (ДМА), диметилформамид (ДМФ) и смеси двух или более из этих соединений. Температура реакции предпочтительно составляет от 2 до 40°С, более предпочтительно от 10 до 30°С.
Для проведения реакции окисленного полимера по меньшей мере с одним кислым спиртом используют по меньшей мере один дополнительный активирующий агент.
Походящими активирующими агентами являются, в числе прочих, карбонилдиимидазол, карбодиимиды, такие как диизопропилкарбодиимид (ДИК), дициклогексилкарбодиимиды (ДЦК), 1-этил-3-(3диметиламинопропил)карбодиимид (ЭДК), причем наиболее предпочтительными являются дициклогексилкарбодиимиды (ДЦК) и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (ЭДК).
Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу, как описано выше, где полимер, окисленный на его восстанавливающем конце, вводят в реакцию с кислым спиртом в присутствии дополнительного активирующего агента, получая реакционноспособный сложный эфир полимера.
В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения, реакцию окисленного полимера с диэфиром угольной кислоты и/или кислым спиртом проводят при низкой активности основа
- 45 014103 ния, которая может быть определена путем добавления реакционной смеси к воде с объемной долей воды к реакционной смеси 10:1. До добавления вода, которая не содержит, по существу, какого-либо буфера, имеет значение рН 7 при 25°С. После добавления реакционной смеси и путем измерения значения рН, получают активность основания реакционной смеси, имеющую значение предпочтительно не более 9,0, более предпочтительно не более 8,0 и особенно предпочтительно не более 7,5.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения окисленный полимер вступает в реакцию с Ν-гидрокси сукцинимидом в сухом ДМА в отсутствие воды с ЭДК, с селективным получением сложного эфира полимера Ν-гидроксисукцинимида согласно формуле
более предпочтительно с НА8', представляющим собой НЕ8'.
Неожиданным образом, эта реакция не дает побочных продуктов, происходящих из реакций ЭДК с группами ОН НЕ8, и реакция перегруппировки О-ацилизомочевины, образованной ЭДК и окисленным полимером, в соответствующую Ν-ацилмочевину неожиданным образом оказывается подавленной.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения окисленный полимер вступает в реакцию с Ν,Ν'-дисукцинимидилкарбонатом в сухом ДМФ в отсутствие воды и в отсутствие активатора, с селективным получением сложного эфира полимера Ν-гидроксисукцинимида согласно формуле
более предпочтительно, где НА8' представляет собой НЕ8'.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения полимер, который является селективно окисленным на его восстанавливающем конце, вступает в реакцию на окисленном восстанавливающем конце с азолидом, таким как карбонилдиимидазол или карбонилдибензимидазол, с получением полимера, имеющего реакционноспособную карбоксильную группу. В случае карбонилдиимидазола в результате получают реакционноспособное производное полимера имидазолида согласно формуле
в которой НА8' предпочтительно представляет собой НЕ8'.
Согласно второй альтернативе для указанного другого варианта осуществления настоящего изобретения относительно введения по меньшей мере одной реакционноспособной карбоксильной группы в полимер, реакционноспособную карбоксильную группу вводят в полимер, восстанавливающий конец которого не является окисленным, путем реакции по меньшей мере одной гидроксильной группы полимера с диэфиром угольной кислоты.
Поэтому настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, в которых реакционноспособную карбоксильную группу вводят в полимер, восстанавливающий конец которого не является окисленным, путем реакции по меньшей мере одной гидроксильной группы полимера по меньшей мере с одним диэфиром угольной кислоты Вв-О-(С=О)-О-Вс, в котором ВВ и ВС могут быть одинаковыми или разными.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения полимер, восстанавливающий конец которого не является окисленным, вступает в реакцию по меньшей мере по одной гидроксильной группе с азолидом, таким как карбонилдиимидазол, карбонил-ди-(1,2,4-триазол) или карбонилдибензимидазол, с получением полимера, имеющего реакционноспособную карбоксильную группу.
В качестве подходящих соединений диэфира угольной кислоты могут использоваться соединения, спиртовые компоненты которых независимо являются Ν-гидроксисукцинимидами, такими как Νгидрокси сукцинимид или сульфо-И-гидроксисукцинимид, соответствующим образом замещенными фенолами, такими как п-нитрофенол, о,п-динитрофенол, о,о'-динитрофенол, трихлорфенол, такой как 2,4,6-трихлорфенол или 2,4,5-трихлорфенол, трифторфенол, такой как 2,4,6-трифторфенол или 2,4,5трифторфенол, пентахлорфенол, пентафторфенол, или гидроксиазолами, такими как гидроксибензотриа
- 46 014103 зол.
Особенно предпочтительны симметрические соединения диэфира угольной кислоты, в которых КВ и Кс, таким образом, являются одинаковыми. Спиртовой компонент диэфира угольной кислоты предпочтительно выбирают из группы, состоящей из Ν-гидрокси сукцинимида, Ν-гидроксисукцинимидсульфоната, Ν-гидроксибензотриазола, и нитро- и галогензамещенных фенолов. Среди прочих, предпочтительными являются нитрофенол, динитрофенол, трихлорфенол, трифторфенол, пентахлорфенол и пентафторфенол. Особенно предпочтительны Ν,Ν'-дисукцинимидилкарбонат и сульфо-Н^-дисукцинимидилкарбонат, причем Ν,Ν'-дисукцинимидилкарбонат является наиболее предпочтительным.
Поэтому настоящее изобретение также относится к способу получения конъюгата, включающему введение в реакцию полимера, предпочтительно гидроксиэтилкрахмала, на его в случае необходимости окисленном восстанавливающем конце с соединением, выбранным из группы, состоящей из кислых спиртов, диэфиров угольной кислоты и азолидов, с получением производного полимера, включающего по меньшей мере одну реакционноспособную карбоксильную группу, введение в реакцию указанного производного полимера по меньшей мере с одним, по меньшей мере, бифункциональным соединением, с получением производного полимера, включающего альдегидную группу или кетогруппу или группу полуацеталя, или функциональную группу, которая может быть химически модифицирована с получением альдегидной группы или кетогруппы или группу полуацеталя, в случае необходимости химическую модификацию указанной функциональной группы, с получением производного полимера, включающего альдегидную группу или кетогруппу или группу полуацеталя, и введение в реакцию производного полимера, включающего альдегидную группу или кетогруппу или группу полуацеталя, с аминогруппой белка через восстановительное аминирование.
Соответственно, настоящее изобретение также относится к конъюгату, включающему полимер, предпочтительно гидроксиэтилкрахмал, и белок, которые ковалентно связаны друг с другом, который может быть получен способом получения конъюгата, причем указанный способ включает введение в реакцию полимера, на его в случае необходимости окисленном восстанавливающем конце, с соединением, выбранным из группы, состоящей из кислых спиртов, диэфиров угольной кислоты и азолидов, с получением производного полимера, включающего по меньшей мере одну реакционноспособную карбоксильную группу, введение в реакцию указанного производного полимера по меньшей мере с одним, по меньшей мере, бифункциональным соединением, с получением производного полимера, включающего альдегидную группу или кетогруппу или группу полуацеталя, или функциональную группу, которая может быть химически модифицирована с получением альдегидной группы или кетогруппы или группы полуацеталя, в случае необходимости химическую модификацию указанной функциональной группы с получением производного полимера, включающего альдегидную группу или кетогруппу или группу полуацеталя, и введение в реакцию производного полимера, включающего альдегидную группу или кетогруппу или группу полуацеталя, с аминогруппой белка через восстановительное аминирование.
Частным примером соединения, имеющего функциональную группу ?! и функциональную группу Е2, которую окисляют с получением альдегидной группы, является, например, соединение, имеющее аминогруппу в качестве Е1 и бета-гидроксиаминогруппу в качестве Р2. Особенно предпочтительным примером является 1,3-диамино-2-гидроксипропан. Это окисление можно осуществить со всеми подходящими окисляющими агентами, которые являются способными к преобразованию бетагидроксиаминогруппы в альдегидную группу. Предпочтительными окисляющими реагентами являются перйодаты, такие как перйодаты щелочных металлов. Особенно предпочтительным является перйодат натрия, который предпочтительно используется в виде водного раствора. Этот раствор имеет предпочтительную йодатную концентрацию от 1 до 50 мМ, более предпочтительно от 1 до 25 мМ и особенно предпочтительно от 1 до 10 мМ. Окисление осуществляют при температуре от 0 до 40°С, предпочтительно от 0 до 25°С и особенно предпочтительно от 4 до 20°С.
Полученное производное полимера может быть очищено от реакционной смеси по меньшей мере одним подходящим способом. В случае необходимости, производное полимера может быть осаждено до выделения по меньшей мере одним подходящим способом.
Если производное полимера сначала осаждают, возможно, например, осуществить контакт реакционной смеси по меньшей мере с одним растворителем или смесью растворителей, отличных от растворителя или смеси растворителей, присутствующих в реакционной смеси, при подходящих температурах. Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, где в качестве растворителя используется водная среда, предпочтительно вода, реакционную смесь вводят в контакт с 2-пропанолом или со смесью ацетона и этанола, предпочтительно смесью 1:1 (об./об.), что указывает на равные объемы указанных соединений, при температуре предпочтительно в диапазоне от -20 до +50°С и особенно предпочтительно в диапазоне от -20 до 25°С.
Выделение производного полимера может быть осуществлено подходящим способом, который может включать одну или более стадий. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения производное полимера сначала отделяют от реакционной смеси или смеси реакционной смеси с, например, водной смесью с 2-пропанолом, подходящим способом, таким как центрифугирование или фильтрация. На второй стадии отделенное производное полимера может быть подвергнуто даль
- 47 014103 нейшей обработке, такой как последующая обработка, например, диализ, центробежная фильтрация или фильтрация под давлением, ионообменная хроматография, хроматография с обратной фазой, ВЭЖХ, МРЬС, гель-фильтрация и/или лиофилизация. Согласно еще более предпочтительному варианту осуще ствления отделенное производное полимера сначала диализируют, предпочтительно против воды, и затем лиофилизируют, пока содержание растворителя в продукте реакции не станет достаточно низким согласно желаемым спецификациям продукта. Лиофилизация может быть осуществлена при температуре от 20 до 35°С, предпочтительно от 20 до 30°С.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения функциональная группа Ζ белка, которая вступает в реакцию с функциональной группой А полимера или производного полимера, представляет собой тиоловую группу, причем белок выбирают из группы, состоящей из альфа ΙΕΝ, бета ΙΕΝ, ίΡΑ и А1АТ. Наиболее предпочтительны альфа ΙΕΝ и бета ΙΕΝ.
Тиоловая группа также может присутствовать в белке. Кроме того, возможно ввести тиоловую группу в белок согласно подходящему способу. Среди прочих, могут быть упомянуты химические способы. Если дисульфидная связь присутствует в белке, возможно восстановить 8-8-структуру, чтобы получить тиоловую группу. Также возможно трансформировать аминогруппу, присутствующую в полипептиде, в группу 8Η реакцией полипептида через аминогруппу с соединением, которое имеет по меньшей мере две разные функциональные группы, одна из которых способна вступать в реакцию с аминогруппой, а другая является группой 8Η или предшественником группы 8Η. Также возможно ввести группу 8Η мутацией белка, например, введением в белок цистеина или подходящей 8Шфункциональной аминокислоты или удалением цистеина из белка таким образом, чтобы воспрепятствовать образованию другим цистеином в белке дисульфидной связи.
Наиболее предпочтительно полимер связан со свободным цистеином белка, особенно предпочтительно, со свободным цистеином в положении 17 бета ΙΕΝ (в случае вариантов с цистеином в положении 17), с цистеином в положении 1 и/или 98 альфа ΙΕΝ.
Согласно первому варианту осуществления функциональная группа Ζ белка представляет собой тиоловую группу, а функциональная группа А полимера представляет собой галогенацетильную группу, и причем А вводят путем реакции полимера на его в случае необходимости окисленном восстанавливающем конце, по меньшей мере, с бифункциональным соединением, имеющим по меньшей мере две функциональные группы, каждая из которых включает аминогруппу, с получением производного полимера, имеющего по меньшей мере одну функциональную группу, включающую аминогруппу, и введения в реакцию производного полимера с моногалогензамещенной уксусной кислотой и/или реакционноспособным моногалоген-замещенным производным уксусной кислоты.
Относительно, по меньшей мере, бифункционального соединения, имеющего по меньшей мере две функциональные группы, каждая из которых включает аминогруппу, пригодными являются все соединения, которые могут вступать в реакцию с полимером на его в случае необходимости восстанавливающем конце, с получением производного полимера, включающего аминогруппу, которая может быть введена в реакцию с моногалогензамещенной уксусной кислотой и/или реакционноспособным моногалогензамещенным производным уксусной кислоты.
Согласно предпочтительному варианту осуществления одна функциональная группа, по меньшей мере, бифункционального соединения, причем указанная функциональная группа реагирует в случае необходимости с окисленным восстанавливающим концом полимера, выбрана из группы, состоящей из
где С обозначает О или 8 и, если присутствует дважды, независимо О или 8, и Β' обозначает метил.
Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения функциональной группой, по меньшей мере, бифункционального соединения, причем указанная функциональная группа реагирует в случае необходимости с окисленным восстанавливающим концом, является аминогруппа -ΝΗ2. Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления эта функциональная группа, наиболее предпочтительно аминогруппа, реагирует с окисленным восстанавливающим кон цом полимера.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, функциональной группой, по меньшей мере, бифункционального соединения, причем указанная функциональная группа реагирует с моногалогензамещенной уксусной кислотой и/или реакционноспособным моногалогензамещенным производным уксусной кислоты, является аминогруппа -ΝΗ2.
Функциональные группы, которые предпочтительно обе являются аминогруппой -ΝΗ2, по меньшей
- 48 014103 мере, бифункционального соединения, причем указанные функциональные группы реагируют с полимером на его в случае необходимости окисленном восстанавливающем конце, предпочтительно окисленном восстанавливающем конце, и моногалогензамещенная уксусная кислота и/или реакционноспособное моногалогензамещенное производное уксусной кислоты, могут быть разделены любым подходящим спейсером. Среди прочих, спейсер может быть в случае необходимости замещенным прямым, разветвленным и/или циклическим углеводородным остатком. Подходящими заместителями являются, среди прочих, алкил, арил, аралкил, алкарил, галоген, карбонил, ацил, карбокси, сложный карбоксиэфир, гидрокси, тио, алкокси- и/или алкилтиогруппы. Обычно углеводородный остаток имеет от 1 до 60, предпочтительно от 1 до 40, более предпочтительно от 1 до 20, более предпочтительно от 2 до 10, более предпочтительно от 2 до 6 и особенно предпочтительно от 2 до 4 атомов углерода. Если гетероатомы присутствуют, разделяющая группа включает обычно от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 8 и особенно предпочтительно от 1 до 4 гетероатомов. Углеводородный остаток может включать в случае необходимости разветвленную алкильную цепь или арильную группу или циклоалкильную группу, содержащую, например, от 5 до 7 атомов углерода, или аралкильную группу, алкарильную группу, где алкильная часть может быть прямой и/или циклической алкильной группой. Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления, углеводородный остаток представляет собой алкильную цепь, содержащую от 1 до 20, предпочтительно от 2 до 10 и особенно предпочтительно от 2 до 8 атомов углерода. Таким образом, предпочтительными, по меньшей мере, бифункциональными соединениями являются бифункциональные аминосоединения, особенно предпочтительно 1,8-диаминооктан, 1,7-диаминогептан, 1,6диаминогексан, 1,5-диаминопентан, 1,4-диаминобутан, 1,3-диаминопропан и 1,2-диаминоэтан. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления, по меньшей мере, бифункциональное соединение представляет собой диаминополиэтиленгликоль, предпочтительно диаминополиэтиленгликоль согласно формуле
Η2Ν-(СН2-СН2-О)т-сн2-сн2-мн2 в которой т обозначает целое число, т предпочтительно 1, 2, 3 или 4.
Поэтому настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых полимер вступает в реакцию с 1,8-диаминооктаном, 1,7-диаминогептаном, 1,6-диаминогексаном, 1,5-диаминопентаном, 1,4-диаминобутаном, 1,3-диаминопропаном и 1,2-диаминоэтаном на его окисленном восстанавливающем конце с получением производного полимера согласно формуле
где п=2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8, и особенно предпочтительно, полимер представляет собой НЕ8.
Поэтому настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых полимер вступает в реакцию с Н2№(СН2-СН2-О)т-СН2-СН2-ИН2 на его окисленном восстанавливающем конце, где ш обозначает 1, 2, 3 или 4, с получением производного полимера согласно формуле
где ш=1, 2, 3 или 4, и особенно предпочтительно, полимер представляет собой НЕ8.
Окисление восстанавливающего конца полимера, предпочтительно гидроксиэтилкрахмала, может быть осуществлено согласно любому способу или комбинации способов, которые приводят к соединениям, имеющим структуры (11а) и/или (11Ь):
„ /0К1
НА8< ,χν-Δ
о \ (Па)
н ок, Аэ
н
ок.
н /
НА8Ч Д-ΔΧ 1 Б-он
О \ (ЛЬ)
\ соон
Н ок.
н
Хотя окисление может быть осуществлено согласно любому подходящему способу или способам,
- 49 014103 приводящим к окисленному восстанавливающему концу гидроксиалкилкрахмала, его предпочтительно осуществляют, используя щелочной раствор йода, как описано, например, в ΌΕ 19628705 А1, соответствующее содержание которой (пример А, столбец 9, строки 6-24) включено в настоящее описание путем ссылки.
Производное полимера, следующее из реакции полимера, по меньшей мере, с бифункциональным соединением, далее вступает в реакцию с моногалогензамещенной уксусной кислотой и/или реакционноспособным моногалогензамещенным производным уксусной кислоты.
В качестве моногалогензамещенной уксусной кислоты или реакционноспособной кислоты предпочтительны С1-замещенная, Вг-замещенная и Езамещенная уксусная кислота.
Если галогензамещенная кислота используется как таковая, предпочтительно вводить в реакцию кислоту с полимерным производным в присутствии активатора. Подходящими активаторами являются, среди прочих, карбодиимиды, такие как диизопропилкарбодиимид (ДИК), дициклогексилкарбодиимиды (ДЦК), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (ЭДК), причем наиболее предпочтительными являются дициклогексилкарбодиимид (ДЦК) и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (ЭДК).
Поэтому настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых полимер, предпочтительно НЕ8, вступает в реакцию с диаминосоединением, предпочтительно диаминоалканом с 2-8 атомами углерода или Н2N-(СН2-СН2-Ο)т-СН2-СН2-NН2, где т=1, 2, 3 или 4, и полученное производное полимера реагирует с Вг-замещенной и Езамещенной уксусной кислотой в присутствии активатора, предпочтительно ЭДЦ.
Поэтому настоящее изобретение также относится к производному полимера согласно формуле
где Х=С1, Вг или I, п=2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8, причем полимер особенно предпочтительно представляет собой НЕ8, или производному полимера согласно формуле
где Х=С1, Вг или I, т=1, 2, 3 или 4, причем полимер особенно предпочтительно представляет собой НЕ8.
Реакцию производного полимера с замещенной галогеном уксусной кислотой предпочтительно осуществляют в водной системе, предпочтительно воде, при предпочтительном рН от 3,5 до 5,5, более предпочтительно от 4,0 до 5,0 и особенно предпочтительно от 4,5 до 5,0; и предпочтительной температуре реакции от 4 до 30°С, более предпочтительно от 15 до 25°С и особенно предпочтительно от 20 до 25°С; и при предпочтительном времени реакции от 1 до 8 ч, более предпочтительно от 2 до 6 ч и особенно предпочтительно от 3 до 5 ч.
Реакционная смесь, включающая производное полимера, которое включает полимер, по меньшей мере, бифункциональное соединение и замещенную галогеном уксусную кислоту, может также использоваться для реакции с белком. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения производное полимера отделяют от реакционной смеси, предпочтительно ультрафильтрацией, последующим осаждением, дополнительной промывкой и высушиванием в вакууме.
Реакцию производного полимера с белком осуществляют при предпочтительном рН от 6,5 до 8,5, более предпочтительно от 7,0 до 8,5 и особенно предпочтительно от 7,5 до 8,5; и предпочтительной температуре реакции от 4 до 30°С, более предпочтительно от 15 до 25°С и особенно предпочтительно от 20 до 25°С; и при предпочтительном времени реакции от 0,5 до 8 ч, более предпочтительно от 1 до 6 ч и особенно предпочтительно от 2 до 5 ч.
Реакция производного полимера с тиоловой группой белка приводит к тиоэфирной связи между полимерным производным и белком.
Поэтому настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых полимер, предпочтительно НЕ8, вступает в реакцию с диамино-соединением, предпочтительно диаминоалканом с 2-8 атомами углерода или Н2N-(СН2-СН2-Ο)т-СН2-СН2-NН2, где т=1, 2, 3 или 4, полученное производное полимера вступает в реакцию с Вг-замещенной и Езамещенной уксусной кислотой в присутствии активатора, предпочтительно ЭДЦ, и полученное производное полимера вступает в реакцию с тиоловой группой белка, с получением конъюгата, включающего тиоэфирную связь между белком и полимерным производным.
Поэтому настоящее изобретение также относится к конъюгату согласно формуле
- 50 014103
где п=2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8, причем полимер особенно предпочтительно представляет собой НЕ8, а белок представляет собой альфа бета ШЛ, 1РА или А1АТ, предпочтительно альфа +Ν или бета ΨΝ, атом 8 происходит из свободного цистеина в положении 17 бета 1а ΓΡΝ или доступного свободного цистеина, или к конъюгату согласно формуле
где т=1, 2, 3 или 4, причем полимер особенно предпочтительно представляет собой НЕ8, а белок представляет собой альфа бета 1РА или А1АТ или АРС, предпочтительно альфа +Ν или бета ΨΝ, атом 8 происходит, например, от свободного цистеина в положении 17 бета 1а ΓΡΝ.
Гидроксиэтилкрахмал представляет собой предпочтительно гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 10 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 10 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 12 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 12 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 18 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 18 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 30 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 30 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 100 кДа и Ό8 приблизительно 0,7.
Относительно каждой из этих комбинаций средней молекулярной массы и Ό8, также предпочтительна величина Ό8 приблизительно 0,8.
Согласно второму варианту осуществления, функциональная группа Ζ белка представляет собой тиоловую группу, и функциональная группа А полимера включает малеимидную группу.
Согласно этому варианту осуществления, существуют несколько возможностей получения конъюгата. В целом, полимер вступает в реакцию на его в случае необходимости окисленном восстанавливающем конце по меньшей мере с одним, по меньшей мере, бифункциональным соединением, причем это, по меньшей мере, бифункциональное соединение включает одну функциональную группу, которая может вступать в реакцию в случае необходимости с окисленным восстанавливающим концом полимера, и по меньшей мере одну функциональную группу, которая или включает малеимидную группу, или химически модифицирована с получением производного полимера, которое включает малеимидную группу. Согласно предпочтительному варианту осуществления, указанная функциональная группа химически модифицирована с получением производного полимера, которое включает малеимидную группу.
Поэтому настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, путем введения в реакцию производного полимера, включающего малеимидную группу, с тиоловой группой белка, причем указанный способ включает введение в реакцию полимера на его в случае необходимости окисленном восстанавливающем конце, по меньшей мере, с бифункциональным соединением, включающим функциональную группу и, которая может вступать в реакцию в случае необходимости с окисленным восстанавливающим концом, причем, по меньшей мере, бифункциональное соединение дополнительно включает функциональную группу Α, которая может быть химически модифицирована с получением малеимидной группы, причем способ дополнительно включает химическую модификацию функциональной группы Α с получением малеимидной группы.
Относительно функциональной группы и, может быть использована любая функциональная группа, которая может вступать в реакцию в случае необходимости с окисленным восстанавливающим концом полимера.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, функциональная группа и включает химическую структуру -ΝΗ-.
Поэтому настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, в ко
- 51 014103 торых функциональная группа и включает структуру -№Н-.
Согласно одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения функциональная группа и представляет собой группу, имеющую структуру В'-№Н-, где В' обозначает водород или алкил, циклоалкил, арил, аралкил, арилциклоалкил, алкарил или циклоалкиларил, где циклоалкил, арил, аралкил, арилциклоалкил, алкарил или циклоалкиларил может быть связан непосредственно с группой ИН или согласно другому варианту осуществления может быть связан с группой №Н кислородным мостиком. Алкил, циклоалкил, арил, аралкил, арилциклоалкил, алкарил или циклоалкиларил может быть соответствующим образом замещен. В качестве предпочтенных заместителей могут быть названы галогены, такие как Е, С1 или Вг. Особенно предпочтительными остатками В' являются водород, алкильная и алкоксигруппы, и еще более предпочтительными - водород и незамещенные алкильная и алкоксигруппы.
Среди алкила и алкокси предпочтительны группы, содержащие 1, 2, 3, 4, 5 или 6 атомов С, более предпочтительны метил, этил, пропил, изопропил, метокси, этокси, пропокси и изопропоксигруппы. Особенно предпочтительны метил, этил, метокси, этокси, и особое предпочтение отдается метилу или метокси.
Поэтому настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых В' является водородом или метилом или метоксигруппой.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения функциональная группа и имеет структуру В'-ХН-В-, где В предпочтительно включает структурное звено -ХНи/или структурное звено -(С=С)-, где С обозначает О или 8, и/или структурное звено -8О2-. Согласно более предпочтительным вариантам осуществления функциональная группа В выбрана из группы, состоящей из
Θ Θ
где, если С присутствует дважды, он независимо обозначает О или 8.
Поэтому настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых функциональная группа и выбрана из группы, состоящей из
где С обозначает О или 8 и, если присутствует дважды, независимо О или 8, и В' обозначает метил.
Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, и включает аминогруппу -Ν^.
Согласно варианту осуществления настоящего изобретения функциональную группу ν, по меньшей мере, бифункционального соединения химически модифицируют путем реакции производного полимера, включающего ν, с другим, по меньшей мере, бифункциональным соединением, включающим функциональную группу, способную вступать в реакцию с ν, и дополнительно включающим малеимид ную группу.
Относительно функциональной группы ν и функциональной группы указанного другого, по меньшей мере, бифункционального соединения, которая может вступать в реакцию с ν, среди прочих должны быть упомянуты следующие функциональные группы:
С-С-двойные связи или С-С-тройные связи, или ароматические С-С-связи;
тиогруппа или гидроксильная группа;
гидразид алкилсульфокислоты, гидразид арилсульфокислоты;
1.2- диолы;
1.2- аминоспирты;
1.2- аминотиоспирты;
азиды;
аминогруппа -ЫН2 или производные аминогрупп, включающие структурное звено -МН-, такие как аминоалкильные группы, аминоарильная группа, аминоаралкильные группы или алкариламиногруппы; гидроксиламиногруппа -О-ХН2, или производные гидроксиламиногруппы, включающие структурное звено -О-ЫН-, такие как гидроксилалкиламиногруппы, гидроксилариламиногруппы, гидроксиларал
- 52 014103 киламиногруппы или гидроксиалкариламиногруппы;
алкоксиаминогруппы, арилоксиаминогруппы, аралкилоксиаминогруппы или алкарилоксиаминогруппы, каждая из которых включает структурное звено -ΝΗ-О-;
остатки, имеющие карбонильную группу, -Ц-С(=С)-М, в которой С обозначает О или Б, и М обозначает, например,
-ОН или -БН;
алкоксигруппу, арилоксигруппу, аралкилоксигруппу или алкарилоксигруппу;
алкилтиогруппу, арилтиогруппу, аралкилтиогруппу или алкарилтиогруппу;
алкилкарбонилоксигруппу, арилкарбонилоксигруппу, аралкилкарбонилоксигруппу, алкарилкарбонилоксигруппу;
активированные сложные эфиры, такие как сложные эфиры гидроксиламинов, имеющих имидную структуру, такие как Ν-гидроксисукцинимид, или имеющие структурное звено О-Ν, где Ν является частью гетероарильного соединения или, когда С=О и О отсутствует, такие как соединения арилокси с замещенным остатком арила, такие как пентафторфенил, паранитрофенил или трихлорфенил;
где О отсутствует или обозначает ΝΗ или гетероатом, такой как Б или О;
-ΝΗ-ΝΗ2 или -ΝΗ-ΝΗ-;
-ΝΟ2;
нитрильная группа;
карбонильные группы, такие как альдегидная группа или кетогруппа;
карбоксильная группа;
группа -Ы=С=О или группа -Ы=С=Б;
винилгалидные группы, такие как винилйодид или винилбромид или трифлат;
-С С-Н;
-(С=ИН2С1)-Оалкил;
группы -(С=О)-СН2-На1, где На1 обозначает С1, Вг или I;
-СН=СН-БО2-;
дисульфидная группа, включающая структуру -Б-Б-;
группа 0 группа где А и функциональная группа другого, по меньшей мере, бифункционального соединения, соответственно, представляют собой группу, способную к образованию химической связи с одной из указанных групп.
Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, А включает аминогруппу -ИН2.
Согласно предпочтительным вариантам осуществления настоящего изобретения, и А, и другая функциональная группа представляют собой группы из списка групп, приведенного выше.
Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения одна из этих функциональных групп представляет собой тиогруппу. В этом частном случае другая функциональная группа предпочтительно выбрана из группы, состоящей из
Ν—
О
где На1 обозначает С1, Вг или I, предпочтительно Вг или I.
Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, одна из этих функциональных групп выбрана из группы, состоящей из реакционноспособного сложного эфира, такого как сложный эфир гидроксиламинов, имеющих имидную структуру, таких как Ν-гидроксисукцинимид, или имеющих структурное звено О-Ν, где Ν - часть гетероарильного соединения, или такого как арилоксисоединение с замещенным остатком арила, такого как пентафторфенил, паранитрофенил или трихлорфенил, или карбоксильной группы, которая в случае необходимости преобразована в реакционноспособный сложный эфир. В этом частном случае другая функциональная группа включает химическую структуру -Ν4-.
Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, А включает структуру -Ν4-, а другое, по меньшей мере, бифункциональное соединение включает реакционноспособный сложный эфир и малеимидную группу.
Относительно функциональной группы А, включающей структуру -Ν4-, можно обратиться к функциональной группе, как описано выше, причем А может быть такой же или отличной от и. Согласно
- 53 014103 предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, и и являются одинаковыми. Более предпочтительно, и и, и включают аминогруппу. Особенно предпочтительно и и, и обозначают аминогруппу -ΝΉ2.
Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, полимер может быть введен в реакцию, по меньшей мере, с бифункциональным соединением, включающим и и ^, на его неокисленном восстанавливающем конце в водной среде. Согласно предпочтительному варианту осуществления, где и и обе обозначают аминогруппу, реакцию осуществляют, используя полимер с восстанавливающим концом в окисленной форме по меньшей мере в одном апротонном растворителе, особенно предпочтительн, в безводном апротонном растворителе, имеющем содержание воды не более 0,5 вес.%, предпочтительно не более 0,1 вес.%. Подходящими растворителями являются, среди прочих, диметилсульфоксид (ДМСО), Ν-метилпирролидон, диметилацетамид (ДМА), диметилформамид (ДМФ) и смеси двух или более из этих соединений.
Особенно в случае, если и и, и обозначают аминогруппу -ΝΉ2, и и могут быть разделены любым подходящим спейсером. Среди прочих, спейсер может быть в случае необходимости замещенным прямым, разветвленным и/или циклическим углеводородным остатком. Подходящими заместителями являются, среди прочих, алкил, арил, аралкил, алкарил, галоген, карбонил, ацил, карбокси, сложный карбоксиэфир, гидрокси, тио, алкокси и/или алкилтио-группа. Обычно углеводородный остаток имеет от 1 до 60, предпочтительно от 1 до 40, более предпочтительно от 1 до 20, более предпочтительно от 2 до 10, более предпочтительно от 2 до 6 и особенно предпочтительно от 2 до 4 атомов углерода. Если гетероатомы присутствуют, разделяющая группа включает обычно от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 8 и особенно предпочтительно от 1 до 4 гетероатомов. Углеводородный остаток может включать в случае необходимости разветвленную алкильную цепь или арильную группу или циклоалкильную группу, содержащую, например, от 5 до 7 атомов углерода, или может быть аралкильной группой, алкарильной группой, где алкильная часть может быть прямой и/или циклической алкильной группой. Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления, углеводородный остаток представляет собой алкильную цепь, содержащую от 1 до 20, предпочтительно от 2 до 10, более предпочтительно от 2 до 6 и особенно предпочтительно от 2 до 4 атомов углерода.
Поэтому настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, в которых полимер вступает в реакцию по его окисленному восстанавливающему концу с 1,4диаминобутаном, 1,3-диаминопропаном или 1,2-диаминоэтаном, с получением производного полимера согласно формуле
где п=2, 3 или 4, а полимер предпочтительно представляет собой НЕ8.
Согласно указанному предпочтительному варианту осуществления, производное полимера, включающее аминогруппу, далее вступает в реакцию, по меньшей мере, с бифункциональным соединением, включающим реакционноспособную сложноэфирную группу и малеимидную группу. Реакционноспособная сложноэфирная группа и малеимидная группа могут быть разделены подходящим спейсером. Относительно выбора этого спейсера можно обратиться к описанию спейсеров между функциональными группами и и Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, реакционноспособная сложноэфирная группа и малеимидная группа разделены углеводородной цепью, содержащей от 1 до 10, предпочтительно от 1 до 8, более предпочтительно от 1 до 6, более предпочтительно от 1 до 4, более предпочтительно от 1 до 2 и особенно предпочтительно 1 атом углерода. Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления, реакционноспособный сложный эфир представляет собой сложный эфир сукцинимида, и согласно особенно предпочтительному варианту осуществления, по меньшей мере, бифункциональное соединение, включающее малеимидную группу и реакционноспособную сложноэфирную группу, представляет собой сложный эфир N-(альфа-малеимидацетокси) сукцинимида.
Поэтому настоящее изобретение также относится к конъюгату, включающему белок и полимер, согласно формуле
где п=2, 3 или 4, предпочтительно 4, причем полимер предпочтительно представляет собой НЕ8, белок представляет собой альфа ΒΝ, бета ΒΝ, !РА или А1АТ, предпочтительно альфа ΒΝ или бета ΨΝ,
- 54 014103 и причем атом 8 в формуле выше происходит, например, от Суз17 бета 1а ΓΕΝ.
Гидроксиэтилкрахмал представляет собой предпочтительно гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 10 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 10 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 12 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 12 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 18 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 18 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 30 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 30 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 50 кДа и Ό8 приблизительно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий в среднем молекулярную массу приблизительно 100 кДа и Ό8 приблизительно 0,7.
Относительно каждой из этих комбинаций средней молекулярной массы и Ό8, также предпочтительна величина Ό8 приблизительно 0,8.
Реакцию производного полимера, включающего малеимидную группу, с тиоловой группой белка предпочтительно осуществляют в буферизованной водной системе, при предпочтительном рН от 5,5 до 8,5, более предпочтительно от 6 до 8 и особенно предпочтительно от 6,5 до 7,5, и предпочтительной температуре реакции от 0 до 40°С, более предпочтительно от 0 до 25 и особенно предпочтительно от 4 до 21°С, и при предпочтительном времени реакции от 0,5 до 24 ч, более предпочтительно от 1 до 20 ч и особенно от 2 до 17 ч. Подходящее значение рН реакционной смеси может быть отрегулировано путем добавления по меньшей мере одного подходящего буфера. Среди предпочтительных буферов могут быть упомянуты ацетат натрия, фосфатные или боратные буферы, содержащие либо мочевину в предпочтительной концентрации от 0 до 8 М, более предпочтительно от 2 до 8 М и особенно предпочтительно от 4 до 8 М и/или содержащие 8Ό8 в предпочтительной концентрации от 0 до 1% (вес./об.), более предпочтительно от 0,4 до 1% (вес./об.) и особенно предпочтительно от 0,8 до 1% (вес./об.).
Конъюгат может быть подвергнут дальнейшей обработке, такой как последующая обработка, например, диализ, центробежная фильтрация или фильтрация под давлением, ионообменная хроматография, хроматография с обратной фазой, ВЭЖХ, МРЬС, гель-фильтрация и/или лиофилизация.
В способах получения конъюгата по изобретению степень превращения в указанных описанных способах может быть по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80% и, в частности, 95% или даже больше, например, по меньшей мере 98% или 99%.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, включающему белок и полимер или его производное, где полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал (НА8), и белок выбирают из группы, состоящей из бета ΙΕΝ, СМ-С8Е, АРС, !РА, А1АТ, АТ III, фактора VII, фактора VIII и фактора IX, причем указанный конъюгат имеет структуру согласно формуле
и/или
где К1, К2 и К3 независимо обозначают водород или гидроксиалкильную группу, гидроксиарильную группу, гидроксиаралкильную группу или гидроксиалкарильную группу, содержащую от 2 до 10 атомов углерода, предпочтительно водород или гидроксиалкильную группу, более предпочтительно водород или гидроксиэтильную группу, причем С выбирают из группы, состоящей из О и 8, предпочтительно О, и причем Ь представляет собой в случае необходимости соответствующим образом замещенный прямой, разветвленный и/или циклический углеводородный остаток, в случае необходимости включающий по меньшей мере один гетероатом, предпочтительно алкил, арил, аралкил, гетероарил, гетероаралкил, имеющий от 2 до 60 атомов углерода.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, как описано выше, где -Ь- обозначает -(СН2)п-,
- 55 014103 где 1'1=2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, предпочтительно 2, 3, 4, 5, 6, более предпочтительно 2, 3, 4 и особенно предпочтительно 4.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, включающему белок и полимер или его производное, в котором полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал (НА8), и белок выбирают из группы, состоящей из бета ΙΕΝ, СМ-С8Р, АРС, !РА, А1АТ, АТ III, фактора VII, фактора VIII и фактора IX, причем указанный конъюгат имеет структуру согласно формуле
и/или
где К1, В2 и В3 независимо обозначают водород или гидроксиалкильную группу, гидроксиарильную группу, гидроксиаралкильную группу или гидроксиалкарильную группу, содержащую от 2 до 10 атомов углерода, предпочтительно водород или гидроксиалкильную группу, более предпочтительно водород или гидроксиэтильную группу, и причем С выбирают из группы, состоящей из О и 8, предпочтительно О.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, включающему белок и полимер или его производного, в котором полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал (НА8), и белок выбирают из группы, состоящей из бета ШЫ, СМ-С8Р, АРС, !РА, А1АТ, АТ III, фактора VII, фактора VIII и фактора IX, причем указанный конъюгат имеет структуру согласно формуле
и/или
где Βί, В2 и В3 независимо обозначают водород или гидроксиалкильную группу, гидроксиарильную группу, гидроксиаралкильную группу или гидроксиалкарильную группу, содержащую от 2 до 10 атомов углерода, предпочтительно водород или гидроксиалкильную группу, более предпочтительно водород или гидроксиэтильную группу, и причем Ь обозначает в случае необходимости соответствующим образом замещенный прямой, разветвленный и/или циклический углеводородный остаток, в случае необходимости включающий по меньшей мере один гетероатом, предпочтительно алкил, арил, аралкил, гетероарил, гетероаралкил, содержащий от 2 до 60 атомов углерода.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату как описано выше, где -Ь- обозначает -[(СВгВьЦСЫСВсВА-, где Ва, ВЬ, Вс, Вб независимо обозначают водород, алкил, арил, предпочтительно водород, причем С выбирают из группы, состоящей из О и 8, предпочтительно О, и где т=1, 2, 3 или 4, причем остатки Ва и ВЬ могут быть одинаковыми или разными в т групп СВаВЬ;
п=0-20, предпочтительно 0-10, более предпочтительно 1, 2, 3, 4, 5, наиболее предпочтительно 1 или 2;
о=0-20, предпочтительно 0-10, более предпочтительно 1, 2, 3, 4, 5, наиболее предпочтительно 1 или 2, причем остатки Вс и Вб могут быть одинаковыми или разными в о групп СВсВб;
причем целые числа для п и о выбирают таким образом, чтобы в формуле, приведенной выше, не было перокси-звеньев, например, чтобы п и о одновременно не обозначали 0.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, как описано выше, где Ва, ВЬ, Вс, Вб обозначают водород, т=2, п=1 и о=2.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, включающему белок и полимер или его производное, в котором полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал (НА8), и белок выбирают из группы, состоящей из альфа ШЛ, бета ШЛ, СМ-С8Р АРС, !РА, А1АТ, АТ III, фактора VII, фактора VIII и
- 56 014103 фактора IX, причем указанный конъюгат имеет структуру согласно формуле
где К1, К2 и К3 независимо обозначают водород или гидроксиалкильную группу, гидроксиарильную группу, гидроксиаралкильную группу или гидроксиалкарильную группу, содержащую от 2 до 10 атомов углерода, предпочтительно водород или гидроксиалкильную группу, более предпочтительно водород или гидроксиэтильную группу.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, включающему белок и полимер или его производное, в котором полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал (НА8), и белок выбирают из группы, состоящей из альфа ΙΡΝ, бета ΙΡΝ, СМ-С8Р, АРС, 1РА, А1АТ, АТ III, фактора VII, фактора VIII и фактора IX, имеющему структуру согласно формуле
где К1, К2 и К3 независимо обозначают водород или гидроксиалкильную группу, гидроксиарильную группу, гидроксиаралкильную группу или гидроксиалкарильную группу, содержащую от 2 до 10 атомов углерода, предпочтительно водород или гидроксиалкильную группу, более предпочтительно водород или гидроксиэтильную группу, и в котором связь -О-(С=О)- образована реакцией карбоксильной группы или реакционноспособной карбоксильной группы с гидроксильной группой молекулы НА8.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, включающему белок и полимер или его производное, в котором полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал (НА8), и белок выбирают из группы, состоящей из альфа ^Ν, бета ^Ν, СМ-С8Р, АРС, 1РА, А1АТ, АТ III, фактора VII, фактора VIII и фактора IX, причем указанный конъюгат имеет структуру согласно формуле
и/или
где К1, К2 и К3 независимо обозначают водород или гидроксиалкильную группу, гидроксиарильную группу, гидроксиаралкильную группу или гидроксиалкарильную группу, содержащую от 2 до 10 атомов углерода, предпочтительно водород или гидроксиалкильную группу, более предпочтительно водород или гидроксиэтильную группу, и где Ь обозначает в случае необходимости замещенный прямой, разветвленный и/или циклический углеводородный остаток, в случае необходимости включающий по меньшей мере один гетероатом, содержащий от 1 до 60 предпочтительно от 1 до 40, более предпочтительно от 1 до 20, более предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 6, более предпочтительно от 1 до 2 атомов углерода и особенно предпочтительно 1 атом углерода, причем Ь, в частности, является СН2.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, включающему белок и полимер или его производное, в котором полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал (НА8), и белок выбирают из группы, состоящей из альфа ^Ν, бета ^Ν, СМ-С8Р, АРС, 1РА, А1АТ, АТ III, фактора VII, фактора VIII и фактора IX, причем указанный конъюгат имеет структуру согласно формуле
где К1, К2 и К3 независимо обозначают водород или гидроксиалкильную группу, гидроксиарильную группу, гидроксиаралкильную группу или гидроксиалкарильную группу, содержащую от 2 до 10 атомов углерода, предпочтительно водород или гидроксиалкильную группу, более предпочтительно водород
- 57 014103 или гидроксиэтильную группу, и где Ь1 и Ь2 независимо обозначают в случае необходимости замещенный прямой, разветвленный и/или циклический углеводородный остаток, в случае необходимости включающий по меньшей мере один гетероатом, включающий алкильную, арильную, аралкильную, гетероалкильную и/или гетероаралкильную часть, причем указанный остаток содержит от 1 до 60, предпочтительно от 1 до 40, более предпочтительно от 1 до 20, более предпочтительно от 1 до 10 атомов углерода, и где Ό обозначает связь, предпочтительно, ковалентную связь, образованную соответствующей функциональной группой Е2, связанной с Ь1, и соответствующей функциональной группой Е3, связанной с Ь2.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, как описано выше, в котором Ь1 обозначает -(СН2)П-, где п=2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, предпочтительно 2, 3, 4, 5, 6, более предпочтительно 2, 3, 4 и особенно предпочтительно 4.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, как описано выше, в котором Ь2 включает в случае необходимости замещенную арильную часть, предпочтительно, арильную часть, содержащую 6 атомов углерода, причем наиболее предпочтительно Ь2 представляет собой С6Н4.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, как описано выше, в котором выбрана из группы, состоящей из следующих:
С-С-двойные связи или С-С-тройные связи, или ароматические С-С-связи;
тиогруппа или гидроксильные группы;
гидразид алкилсульфокислоты, гидразид арилсульфокислоты;
1.2- диолы;
1.2- аминотиоспирты;
азиды;
1.2- аминоспирты;
аминогруппа -ΝΗ2 или производные аминогрупп, включающие структурное звено -ΝΗ-, такие как аминоалкильные группы, аминоарильная группа, аминоаралкильные группы или алкариламиногруппы;
гидроксиламиногруппа Ό-ΝΗ2, или производные гидроксиламиногруппы, включающие структурное звено -О-ΝΗ-, такие как гидроксилалкиламиногруппы, гидроксилариламиногруппы, гидроксиларалкиламиногруппы или гидроксиалкариламиногруппы;
алкоксиаминогруппы, арилоксиаминогруппы, аралкилоксиаминогруппы или алкарилоксиаминогруппы, каждая из которых включает структурное звено -ΝΗ-О-;
остатки, имеющие карбонильную группу, Ю-С(=С)-М, в которой С обозначает О или 8, и М обозначает, например,
-ОН или -8Η;
алкоксигруппу, арилоксигруппу, аралкилоксигруппу или алкарилоксигруппу;
алкилтиогруппу, арилтиогруппу, аралкилтиогруппу или алкарилтиогруппу;
алкилкарбонилоксигруппу, арилкарбонилоксигруппу, аралкилкарбонилоксигруппу, алкарилкарбонилоксигруппу;
активированные сложные эфиры, такие как сложные эфиры гидроксиламинов, имеющих имидную структуру, такие как Ν-гидроксисукцинимид, или имеющие структурное звено О-Ν, где Ν является частью гетероарильного соединения или, когда С=О и О отсутствует, такие как соединения арилокси с замещенным остатком арила, такие как пентафторфенил, паранитрофенил или трихлорфенил;
где О отсутствует или обозначает ΝΗ или гетероатом, такой как 8 или О;
-ΝΗ-ΝΗ2 или -ΝΗ-ΝΗ-;
-ΝΟ2;
нитрильная группа;
карбонильные группы, такие как альдегидная группа или кетогруппа;
карбоксильная группа;
группа -Л=С=О или группа -Л=С=8;
винилгалидные группы, такие как винилйодид или винилбромид или трифлат;
-С С-Н;
-(С=NΗ2С1)-Оалкил;
группы -(С=О)-СН2-Иа1, где Ηα1 обозначает С1, Вг или Ι;
-С^ОТ^-;
дисульфидная группа, включающая структуру -8-8-;
группа
- 58 014103
группа где Р3 обозначает функциональную группу, способную к образованию химической связи с Р2 и предпочтительно выбрана из указанной группы, причем Р2 предпочтительно включает звено -ΝΗ-, более предпочтительно включает аминогруппу, Р3 предпочтительно включает звено -(С=С)-, более предпочтительно -(ΟΟ)-, более предпочтительно звено -(С=С)-С-, еще более предпочтительно -(ΟΟ)-Ο-, и наиболее предпочтительно, -(ΟΟ)-Ο, и Ό является особенно предпочтительно амидной связью.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, включающему белок и полимер или его производное, в котором полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал (ИА8), и белок выбирают из группы, состоящей из альфа ШИ, бета ^Ν, СМ-С8Р, АРС, 1РА, А1АТ, АТ III, фактора VII, фактора VIII и фактора IX, причем указанный конъюгат имеет структуру согласно формуле
НА5---С--N--Белок' где атом углерода звена -0Η2-ΝΗ- происходит от альдегидной группы, которая была введена в полимер реакцией окисления с размыканием кольца, и где атом азота происходит от аминогруппы белка, причем ΗΑ8 относится к молекуле ΗΑ8 без атома углерода указанного альдегида, участвующего в ре акции.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, включающему белок и полимер или его производное, в котором полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал (ИА8), и белок выбирают из группы, состоящей из альфа ШЫ, бета ШЫ, 1РА, А1АТ, фактора VII и фактора IX, причем указанный конъюгат имеет структуру согласно формуле
где Я1, Я2 и Я3 независимо обозначают водород или гидроксиалкильную группу, гидроксиарильную группу, гидроксиаралкильную группу или гидроксиалкарильную группу, содержащую от 2 до 10 атомов углерода, предпочтительно водород или гидроксиалкильную группу, более предпочтительно водород или гидроксиэтильную группу, и где Ь обозначает в случае необходимости замещенный прямой, разветвленный и/или циклический углеводородный остаток, в случае необходимости включающий по меньшей мере один гетероатом, включающий алкильную, арильную, аралкильную, гетероалкильную и/или гетероаралкильную часть, причем указанный остаток содержит от 2 до 60, предпочтительно от 2 до 40, более предпочтительно от 2 до 20, более предпочтительно от 2 до 10 атомов углерода, и причем атом серы происходит из остатка цистеина или дисульфидной группы белка.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, как описано выше, где -Ь- обозначает
-[ (СКаЯьиСк [СЯсКа] о-, где Яа, ЯЬ, Яс, Яа независимо обозначают водород, алкил, арил, предпочтительно водород, причем С выбирают из группы, состоящей из О и 8, предпочтительно О, и где т=1, 2, 3 или 4, причем остатки Яа и ЯЬ могут быть одинаковыми или разными в т групп СЯаЯЬ; п=1-20, предпочтительно 1-10, более предпочтительно 1, 2, 3 или 4;
о=1-20, предпочтительно 1-10, более предпочтительно 1, 2, 3, 4, 5, более предпочтительно 1 или 2, более предпочтительно 1, причем остатки Яс и Яд могут быть одинаковыми или разными в о групп СЯСЯд; или где п=0, и о=2-20, предпочтительно 2-10, более предпочтительно 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8, причем остатки Яс и Κ,ι могут быть одинаковыми или разными в о групп СЯсЯ|.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, включающему белок и полимер или его производное, в котором полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал (ИА8), и белок выбирают из группы, состоящей из альфа ШИ, бета ШИ, 1РА, А1АТ, фактора VII и фактора IX, причем указанный конъюгат имеет структуру согласно формуле
где Я1, Я2 и Я3 независимо обозначают водород или гидроксиалкильную группу, гидроксиарильную группу, гидроксиаралкильную группу или гидроксиалкарильную группу, содержащую от 2 до 10 атомов
- 59 014103 углерода, предпочтительно водород или гидроксиалкильную группу, более предпочтительно водород или гидроксиэтильную группу, и где Ь обозначает в случае необходимости замещенный прямой, разветвленный и/или циклический углеводородный остаток, в случае необходимости включающий по меньшей мере один гетероатом, включающий алкильную, арильную, аралкильную, гетероалкильную и/или гетероаралкильную часть, причем указанный остаток содержит от 2 до 60, предпочтительно от 2 до 40, более предпочтительно от 2 до 20, более предпочтительно от 2 до 10 атомов углерода, и причем атом серы происходит из остатка цистеина или дисульфидной группы белка.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, как описано выше, где -Ь- обозначает ~ [ (п [ СКсКд ] о- г где Ка, КЬ, Кс, независимо обозначают водород, алкил, арил, предпочтительно водород, причем С выбирают из группы, состоящей из О и 8, предпочтительно О, и где т=1, 2, 3 или 4, наиболее предпочтительно 2, причем остатки Ка и КЬ могут быть одинаковыми или разными в т групп (СКаКЬ);
п=1-20, предпочтительно 1-10, более предпочтительно 1, 2, 3 или 4;
О=1-20, предпочтительно 1-10, более предпочтительно 1, 2, 3, 4, 5, более предпочтительно 1 или 2, наиболее предпочтительно 1, причем остатки К и могут быть одинаковыми или разными в о групп СКсКа; или где п=0, и о=2-20, предпочтительно 2-10, более предпочтительно 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8, причем остатки Кс и Ка могут быть одинаковыми или разными в о групп СКсКб.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, как описано выше, в котором гидроксиалкилкрахмал является гидроксиэтилкрахмалом.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, как описано выше, в котором гидроксиэтилкрахмал имеет молекулярную массу от 2 до 200 кДа, предпочтительно от 4 до 130 кДа, более предпочтительно от 4 до 70 кДа.
Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к конъюгату, как описано выше, или конъюгату, который может быть получен способом, как описано выше, для использования в способе для лечения организма животных или человека.
Конъюгаты согласно изобретению могут быть по меньшей мере на 50% чистыми, более предпочтительных по меньшей мере на 70% чистыми, еще более предпочтительно по меньшей мере на 90%, в особенности по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% чистыми. В самом предпочтительном варианте осуществления, конъюгаты могут быть на 100% чистыми, то есть в них не присутствует какихлибо других побочных продуктов.
Поэтому, согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей в терапевтически эффективном количестве конъюгат, как описано выше, или конъюгат, который может быть получен способом как описано выше.
Все конъюгаты белок-ΗΑ8 согласно настоящему изобретению вводятся подходящими способами, такими как, например, энтеральный, парэнтеральный или легочный способы, предпочтительно, вводятся внутривенным, подкожным или внутримышечным путями. Конкретный выбранный путь будет зависеть от подлежащего лечению состояния. Предпочтительно, конъюгаты вводят вместе с подходящим носителем, таким как известные в уровне техники (например как используется в биофармацевтических препаратах первого поколения/немодифицированных, не содержащих албумина или с альбумином в качестве эксципиента), подходящим растворителем, таким как стерильные растворы для внутривенного, внутримышечного или подкожного применения. Необходимая дозировка будет зависеть от серьезности подлежащего лечению состояния, индивидуальной реакции пациента, используемого способа введения и т.п. Специалист в состоянии установить правильную дозировку на основании на его общих знаний.
Согласно другому аспекту, настоящее изобретение также относится к применению конъюгата ΗΑ8-, предпочтительно НЕ8-белок, как описано выше, или конъюгата ΗΑ8-, предпочтительно НЕ8-белок, который может быть получен способом, как описано выше, в котором белок представляет собой Фактор VIII, для получения лекарственного средства для лечения гемофилии А.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение также относится к применению конъюгата ΗΑ8ΑΤ III, как описано выше, или конъюгата ΗΑ8-белок, который может быть получен способом, как описано, для получения лекарственного средства для лечения наследственного ΑΤ III дефицита, окклюзионного заболевания вен, ожогов и резистентности к гепарину при аорто-коронарном шунтировании ΥΑΒΠ), перфорации кишечника в результате травмы или желудочно-кишечной хирургии; диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС) и/или сепсиса, а также для профилактики формирования микросгустка, связанного с вентиляционной терапией.
Фармацевтическая композиция, включающая конъюгат ΗΑ8-ΑΤ III по изобретению, может поэтому использоваться в этих целях.
Согласно другому аспекту, настоящее изобретение также относится к применению конъюгата ΗΑ8-, предпочтительно НЕ8-белок, как описано выше или конъюгата ΗΑ8-, предпочтительно НЕ8-белок, ко
- 60 014103 торый может быть получен способом, как описано выше, в котором белок представляет собой А1 АТ, для получения лекарственного средства для лечения эмфиземы, муковисцидоза, аллергического дерматита и/или бронхита. Фармацевтическая композиция по изобретению, включающая НА8-А1 АТ-конъюгат по изобретению, может также использоваться в этих целях.
Согласно другому аспекту, настоящее изобретение также относится к применению конъюгата НА8-, предпочтительно, НЕ8-белок как описано выше или конъюгата НА8-, предпочтительно, НЕ8-белок, который может быть получен способом как описано выше, в котором белок представляет собой ίΡΑ, для получения лекарственного средства для лечения инфарктов миокарда (сердечные приступы), тромбоза, тромбоэмболии или окклюзионных заболеваний, особенно окклюзионных заболеваний артерий.
Согласно другому аспекту, настоящее изобретение также относится к применению конъюгата НА8-, предпочтительно НЕ8-белок, как описано выше, или конъюгата НА8-, предпочтительно НЕ8-белок, который может быть получен способом как описано выше, в котором белок представляет собой АРС, для получения лекарственного средства для лечения тяжелого сепсиса, тромбоза, тромбоэмболии или окклюзионных заболеваний, особенно окклюзионных заболеваний артерий.
Согласно другому аспекту, настоящее изобретение также относится к применению конъюгата НА8-, предпочтительно НЕ8-белок, как описано выше, или конъюгата НА8-, предпочтительно НЕ8белок, который может быть получен способом, как описано выше, в котором белок представляет собой альфа ΙΕΝ, для получения лекарственного средства для лечения лейкемии, например волосатоклеточного лейкоза, хронического миелогенного лейкоза, множественной миеломы, фолликулярной лимфомы, рака, например, карциноидной опухоли, злокачественной меланомы и гепатита, например, хронического гепатита В и хронического гепатита С.
Согласно другому аспекту, настоящее изобретение также относится к применению конъюгата НА8-, предпочтительно НЕ8-белок, как описано выше, или конъюгата НА8-, предпочтительно НЕ8-белок, который может быть получен способом как описано выше, в котором белок представляет собой бета ΙΕΝ, для получения лекарственного средства для лечения рассеянного склероза, предпочтительно рецидивирующих форм рассеянного склероза.
Изобретение далее относится к применению конъюгата СМ-С8Е-НА8, как описано выше, для получения лекарственного средства для восстановления спинного мозга после трансплантации костного мозга или индукционной химиотерапии у лиц старшего возраста с острым миелогенным лейкозом, неудачей или задержкой приживления трансплантата костного мозга, мобилизацией и после трансплантации аутогенных клеток-предшественников периферической крови.
Настоящее изобретение также относится к применению конъюгата НА8-Фактор VII для получения лекарственного средства для лечения эпизодов у пациентов с гемофилией А или В с ингибиторами фактора VIII или фактора IX.
Настоящее изобретение также относится к применению конъюгата НА8-Фактор VII для получения лекарственного средства для борьбы и профилактики геморрагических эпизодов у пациентов с гемофилией В (например, врожденный дефицит фактора IX или Рождественское заболевание), включая борьбу и профилактику кровотечений в хирургии.
Изобретение далее иллюстрируется в соответствии со следующими фигурами, таблицами и примерами, которые никоим образом не ограничивают охват настоящего изобретения.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 показывает анализ 8И8-РАСЕ конъюгатов НЕ8-бета ΓΕΝ, полученных согласно примеру 1.2. Для гель-электрофореза использовали ХСе11 8иге Ьоск Μίηί Се11 ВпуЦгодеп СтЬН, Карлсруэ, И) и блок питания Сопкой Е143 (ΕΌΝδΟΚΤην. Тигпйои!, В). 12% гель Вй-Тпк вместе с ΜΟΡδ 8И8 разгоняющим буфером в восстанавливающих условиях (оба Пп'Цгодеп СтЬН, Карлсруэ, И) использовали согласно инструкции производителя.
Дорожка А. Белковый маркер 8ееВ1ие®Р1ик2 Цпуйгодеп СтЬН, Карлсруэ, И). Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188, 98, 62, 49, 38, 28, 17, 14, 6, 3 кДа.
Дорожка В. Сырой продукт после конъюгации окисленного бета ΣΕΝ с производным НЕ8, полученным, как описано в примере 1.1(а).
Дорожка С. Сырой продукт после конъюгации окисленного бета ΣΕΝ с производным НЕ8, полученным, как описано в примере 1.1(Ь).
Дорожка И. Сырой продукт после конъюгации окисленного бета ΣΕΝ с производным НЕ8, полученным, как описано в примере 1.1(с).
Дорожка Е. Сырой продукт после конъюгации окисленного бета ΣΕΝ с производным НЕ8, полученным, как описано в примере 1.1(ά).
Дорожка Е. Сырой продукт после конъюгации окисленного бета ΣΕΝ с производным НЕ8, полученным, как описано в примере 1.1(е).
Дорожка С. Сырой продукт после конъюгации окисленного бета ΣΕΝ с производным НЕ8, полученным, как описано в примере 1.1(ί).
Дорожка Н. Сырой продукт после конъюгации окисленного бета ΣΕΝ с производным НЕ8, полученным, как описано в примере
- 61 014103
Дорожка I. Сырой продукт после конъюгации окисленного бета ΙΡΝ с производным НЕ8, полученным, как описано в примере 1.1(1).
Дорожка 1. Сырой продукт после конъюгации окисленного бета ΙΡΝ с производным НЕ8, полученным, как описано в примере 1.1(1).
Дорожка К. Окисленный бета ΙΡΝ, полученный как в примере 1.2(а).
Фиг. 2 показывает анализ 808-РАСЕ конъюгатов НЕ8-бета ΙΡΝ, полученных согласно примеру 1.4. Для гель-электрофореза использовали ХСе11 8иге Ьоск Μίηί Се11 ОпсЦгодеп ОтЬН, Карлсруэ, Ό) и блок питания Сопкой Е143 (СО^ОКТпс, ТигпйоиЕ Β). 12% геля Βίκ-Ίηκ вместе с МОР8 8Ό8 разгоняющим буфером в восстанавливающих условиях (оба [псйгодеп ОтЬН, Карлсруэ, Ό) использовали согласно инструкции производителя. Образцы с объемом более 15 мкл были сконцентрированы в вакууме до этого объема.
Дорожка А. Белковый маркер 8ееВ1ие®Р1ик2 Цпсйгодеп ОтЬН, Карлсруэ, Ό). Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188, 98, 62, 49, 38, 28, 17, 14, 6, 3 кДа.
Дорожка Н. Конъюгация ΙΡΝ-бета с альдегид-НЕ8, синтезируемым, как описано в примере 1.3(а).
Дорожка Ι. Конюгация ΙΡΝ-бета с альдегид-НЕ8, синтезируемым, как описано в примере 1.3(Ь).
Дорожка 1. Контроль: ΙΡΝ-бета, обработанный боргидридом натрия без альдегид-НЕ8.
Фиг. 3 показывает анализ δΌδ-РАОЕ конъюгатов НЕ8-АТ ΙΙΙ, полученных согласно примеру 2.2. Для гель-электрофореза использовали ХСе11 8иге Ьоск М1ш Се11 ОпсЦгодеп ОтЬН, Карлсруэ, Ό) и блок питания Сопкой Е143 (СО^ОИТпс, Тигпйои!, В). ШРаде 3-8% Тпк-Ацетатный гель вместе с ТпкАцетатным 8Ό8 разгоняющим буфером в восстанавливающих условиях (оба [псйгодеп ОтЬН, Карлсруэ, Ό) использовали согласно инструкции производителя.
Дорожка А. Белковый маркер 8ееВ1ие®Р1ик2 (!пс11годеп ОтЬН, Карлсруэ, Ό). Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188, 98, 62, 49, 38, 28, 17, 14, 6, 3 кДа.
Дорожка В. Сырой продукт после конъюгации окисленного АТ ΙΙΙ с производным НЕ8, полученным, как описано в примере 2.1(а).
Дорожка С. Сырой продукт после конъюгации окисленного АТ ΙΙΙ с производным НЕ8, полученным, как описано в примере 2.1(Ь).
Дорожка Ό. Сырой продукт после конъюгации окисленного АТ ΙΙΙ с производным НЕ8, полученным, как описано в примере 2.1(с).
Дорожка Е. Сырой продукт после конъюгации окисленного АТ ΙΙΙ с производным НЕ8, полученным, как описано в примере 2.1(к).
Дорожка Ρ. Сырой продукт после конъюгации окисленного АТ ΙΙΙ с производным НЕ8, полученным, как описано в примере 2.1(е).
Дорожка О. Сырой продукт после конъюгации окисленного АТ ΙΙΙ с производным НЕ8, полученным, как описано в примере 2.1(1).
Дорожка Н. Сырой продукт после конъюгации окисленного АТ ΙΙΙ с производным НЕ8, полученным, как описано в примере 2.1(д).
Дорожка Ι. Сырой продукт после конъюгации окисленного АТ ΙΙΙ с производным НЕ8, полученным, как описано в примере 2.1(11).
Дорожка К. Окисленный АТШ О1усоТйега, согласно примеру 2.2.
Фиг. 4 показывает анализ δΌδ-РАОЕ конъюгатов НЕ8-АТ ΙΙΙ, полученных согласно примеру 2.4. Для гель-электрофореза использовали ХСе11 8иге Ьоск М1ш Се11 Цпсйгодеп ОтЬН, Карлсруэ, Ό) и блок питания Сопкой Е143 (СОК8ОКТпс, Тигпйои!, В). 3-8% Тпк-Ацетатный гель вместе с Тпк-Ацетатным 8Ό8 разгоняющим буфером в восстанавливающих условиях (оба Шсйгодеп ОтЬН, Карлсруэ, Ό) использовали согласно инструкции производителя.
Дорожка А: Белковый маркер 8ееВ1ие®Р1ик2 ОпсЦгодеп ОтЬН, Карлсруэ, Ό). Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188, 98, 62, 49, 38, 28, 17, 14, 6, 3 кДа.
Дорожка В. Конъюгация АТ ΙΙΙ с альдегид-НЕ8, синтезируемым, как описано в примере 2.3(а).
Дорожка С. Конъюгация АТ ΙΙΙ с альдегид-НЕ8, синтезируемым, как описано в примере 2.3(Ь).
Дорожка Ό. Контроль: АТ ΙΙΙ согласно примеру 2.3, обработанный боргидридом натрия без альдегид-НЕ8.
Фиг. 5 показывает хроматограмму НРОРС (Высокоэффективная гель-проникающая хроматография) относительно АТ ΙΙΙ, очищенного от глицерина согласно примеру 2.5 (результаты УФ и МАЬЬ8 детектора в виде единой хроматограммы, ось Х обозначает время/минут).
Следующие параметры использовались в анализе НРОРС.
Столбец. Супероза 12 НК 10/30 300 х 10 мм Ι.Ό. (Рйагшааа).
Элюент: 27,38 мМ №2НРО4; 12,62 мМ NаН2РΟ4; 0,2 М №С1; 0,005% Ν;ιΝ3 в 1 л деминерализованной воды.
Поток: 0,24 мл/ч.
Детектор 1: детектор МАЬЬ8.
Детектор 2: УФ (280 нм).
- 62 014103
Детектор 3: ΒI (детектор показателя преломления).
Фиг. 6 показывает хроматограмму НРСРС (Высокоэффективная Гель-проникающая хроматография) относительно конъюгата АТ III согласно примеру 2.5 (детектор МАЬЬ8 в верхней хроматограмме, УФ детектор в нижней хроматограмме, ось X обозначает время/мин).
Следующие параметры использовались в анализе НРСРС.
Столбец. Супероза 12 НВ 10/30 300 х 10 мм ΕΌ. (Рйагтааа).
Элюент: 27,38 мМ Ка2НРО4; 12,62 мМ NаΗ2ΡО4; 0,2 М №С1; 0,005% №1Ν3, в 1 л деминерализованной воды.
Поток: 0,24 мл/ч.
Детектор 1: Детектор МАЬЬ8.
Детектор 2: УФ (280 нм).
Детектор 3: ΒI (детектор показателя преломления).
Фиг. 7 показывает анализ 8Э8-РАСЕ конъюгатов НЕ8-СМ-С8Р, полученных согласно примеру 3.2. Для гель-электрофореза использовали ХСе11 8иге Ьоск Μίηί Се11 (^йгодеи СтЬН, Карлсруэ, Ό) и блок питания Соикой Е143 (СОЫ8ОВТ№, Тигийои!, В). 12% геля В1к-Тпк вместе с МОР8 8Ό8 разгоняющим буфером в восстанавливающих условиях (оба ^Иго^еи СтЬН, Карлсруэ, Ό) использовали согласно инструкции производителя.
Дорожка А. Белковый маркер 8ееВ1ие®Р1ик2 (^йгодеи СтЬН, Карлсруэ, Ό). Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188, 98, 62, 49, 38, 28, 17, 14, 6, 3 кДа.
Дорожка В. Сырой продукт после конъюгации окисленного СМ-С8Р с производным НЕ8, полученным, как описано в примере 3.1(а).
Дорожка С. Сырой продукт после конъюгации окисленного СМ-С8Р с производным НЕ8, полученным, как описано в примере 3.1(Ь).
Дорожка Ό. Сырой продукт после конъюгации окисленного СМ-С8Р с производным НЕ8, полученным, как описано в примере 3.1(с).
Дорожка Е. Сырой продукт после конъюгации окисленного СМ-С8Р с производным НЕ8, полученным, как описано в примере 3.1(ά).
Дорожка Р. Сырой продукт после конъюгации окисленного СМ-С8Е с производным НЕ8, полученным, как описано в примере 3.1(е).
Дорожка С. Сырой продукт после конъюгации окисленного СМ-С8Р с производным НЕ8, полученным, как описано в примере 3.1(ί).
Дорожка Н. Сырой продукт после конъюгации окисленного СМ-С8Р с производным НЕ8, полученным, как описано в примере 3.1(д).
Дорожка I. Сырой продукт после конъюгации окисленного СМ-С8Р с производным НЕ8, полученным, как описано в примере 3.1(д).
Дорожка 1. Сырой продукт после конъюгации окисленного СМ-С8Р с производным НЕ8, полученным, как описано в примере 3. 1(11).
Дорожка К. Окисленный СМ-С8Р согласно примеру 3.2.
Фиг. 8 показывает анализ 8Э8-РАСЕ конъюгатов НЕ8-СМ-С8Р, полученных согласно примеру 3,4, Для гель-электрофореза использовали ХСе11 8иге Ьоск М1ш Се11 (^йгодеи СтЬН, Карлсруэ, Ό) и блок питания Соикой Е143 (СОЫ8ОВТ№, Тигийои!, В). 12% геля В1к-Тпк вместе с МОР8 8Ό8 разгоняющим буфером в восстанавливающих условиях (оба Iиν^ΐ^οдеи СтЬН, Карлсруэ, Ό) использовали согласно инструкции производителя. Образцы объемом более 15 мкл концентрировали в вакууме до этого объема.
Дорожка А. Белковый маркер 8ееВ1ие1®Р1ик2 (^йгодеи СтЬН, Карлсруэ, Ό). Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188, 98, 62, 49, 38, 28, 17, 14, 6, 3 кДа.
Дорожка Н. Конъюгация СМ-С8Р с альдегид-НЕ8, синтезируемым, как описано в примере 3.3(а).
Дорожка I. Конъюгация СМ-С8Р с альдегид-НЕ8, синтезируемым, как описано в примере 3.3(Ь).
Дорожка 1. Контроль: СМ-С8Р согласно примеру 3.4, обработанный боргидридом натрия без альдегид-НЕ8.
Фиг. 9 показывает анализ 8Э8-РАСЕ конъюгатов бета ΣΕΝ, полученных согласно примеру 3.4. Для гель-электрофореза использовали ХСе11 8иге Ьоск М1ш Се11 (^йгодеи СтЬН, Карлсруэ, Ό) и блок питания Соикой Е143 (СОЫ8ОВТ№, Тигийои!, В). 12% геля В1к-Тпк вместе с МОР8 8Ό8 разгоняющим буфером в восстанавливающих условиях (оба Iиν^ΐ^οдеи СтЬН, Карлсруэ, Ό) использовали согласно инструкции производителя.
Дорожка А. Белковый маркер 8ееВ1ие®Р1ик2 (^йгодеи СтЬН, Карлсруэ, Ό). Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188, 98, 62, 49, 38, 28, 17, 14, 6, 3 кДа.
Дорожка В. Сырой продукт после конъюгации окисленного бета с производным гидроксиламино-НЕ8, полученным, как описано в примере 1.1(с).
Дорожка С. Окисленный бета ШЫ.
Фиг. 10 показывает 8Э8-РАСЕ в геле очищенного ВЭЖХ с обратной фазой НА8-модифицированный ΕΕΝ-β (клетки СНО). Стрелка указывает положение миграции немодифицированного ΨΗ-β, по
- 63 014103 видимому, вследствие форм с отсутствующими концевыми производными сиаловой кислоты, тогда как НА8 модифицированный ΓΕΝ-β был обнаружен в виде широкой диффузной окрашенной Кумасси области, охватывающей молекулярные массы 35-120 кДа.
Фиг. 11 показывает анализ НРАЕС-РАО Ν-связанных олигосахаридов, ферментатавно высвобождаемых из НА8-модифицированный ΓΕΝ-β.
Фиг. 12А показывает анализ 808-РАСЕ антитромбина III: 1 = необработанный АТ III; 2 = обработанный перйодатом АТ III; 3 = НА8-модифицированный АТ III; 10 мкг каждого наносили на 10%-ый полиакриламидный гель.
Фиг. 12В показывает анализ 8О8-РАСЕ антитромбина III: 1 = необработанный АТ III; 2 = обработанный перйодатом АТ III; 3 = НА8-модифицированный АТ III; 10 мкг каждого наносили на 10%-ый полиакриламидный гель. 1+, 2+ и 3+ указывает образцы АТ III после де-К-гликозилирования с полипептад-И-гликозидазой.
Фиг. 13 показывает анализ НРАЕС-РАО Ν-связанных гликанов из образцов АТ III, полученных после обработки полипептид-Ν-гликозидазой, как описано в примере 6.6.Ь). 1 = Ν-гликаны из необработанного АТ III; 2 = Ν-гликаны из умеренно обработанного перйодатом АТ III; 3 = Ν-гликаны из НА8модифицированного АТ III. А = область элюирования нейтральных олигосахаридов, включающих олигоманнозные гликаны (с 6-9 остатками маннозы). В = область элюирования моносиалилированных Νгликанов; С = область элюирования дисиалилированных Ν-гликанов; Ό = область элюирования трисиалилированных Ν-гликанов. Элюирование НА8-модифицированных Ν-гликанов обозначена линией № 3.
Фиг. 14 показывает анализ НРАЕС-РАО десиалилированных Ν-гликанов (после умеренной обработки кислотой согласно примеру 6.6.с)), полученных от образцов АТ III после обработки полипептид-Νгликозидазой (пример 5.6.Ь)). 1 = Ν-гликаны от необработанного АТ III; 2 = Ν-гликаны от умеренно обработанного перйодатом АТ III; 3 = Ν-гликаны от НА8-модифицированного АТ. На линии № 1 пиковое элюирование в момент времени 16 мин соответствует Ν-ацетилнейраминовой кислоте, пик в 38 мин представляет Ν-гликолилнейраминовую кислоту. Главный пик в 19 мин представляет двухантенную структуру с проксимальной а1-6-связанной фукозой. Остальные пики соответствуют двухантенным без фукозы, двухантенным минус 1 галактоза и олигоманнозным структурам с главным образом 6-9 остатками маннозы. Положение элюирования НА8-модифицированных производных сиаловой кислоты обозначена на линии №.3.
Фиг. 15 показывает анализ 8О8-РАСЕ НА8 (10 кДа)-модифицированного (10 кДа) СМ-С8Б 1 = элюат ВЭЖХ с обратной фазой; 2 = элюат ВЭЖХ с обратной фазой после расщепления полипептид-Νгликозидазой; 3 = элюат ВЭЖХ с обратной фазой после мягкой обработки кислотой. Скобка указывает СМ-С8Б, который является, по-видимому, НА8-модифицированным по окисленным перйодатом остаткам сиаловой кислоты, присоединенным к О-гликанам.
Фиг. 16 показывает анализ НРАЕС-РАО Ν-гликанов, выделенных из СМ-С8Б.
Линия 1 = необработанный белок; линия 2 = умеренно окисленный перйодатом СМ-С8Б; НА8 (10 кДа)-модифицированный СМ-С8Б после очистки ВЭЖХ с обратной фазой. Стрелки А-Е указывают положения элюирования асиало, моно-, ди-, три- и тетрасиалоолигосахаридов. Олигосахаридный состав исходного материала по существу соответствует описанному в ссылке Богпо е! а1., 2004.
Фиг. 17 показывает гель-электрофорез сырых продуктов после конъюгации окисленного АТШ с производными НЕ8 согласно примеру 8.3.
Для гель-электрофореза использовали ХСе11 8иге Ьоск М1ш Се11 Цпуйгодеп СтЬН, Карлсруэ, Ώ) и блок питания Сопкой Е143 (СО^ОВТпу, ТшпйоиГ, В). NυΡаде 3-8% Тпк-Ацетатный гель вместе с ТпкАцетатным 8Ώ8 разгоняющим буфером в восстанавливающих условиях (оба Шуйгодеп СтЬН, Карлсруэ, Ώ) использовали согласно инструкции производителя. Гель окрашивали Вой-синим (Саг1 ВоГк СтЬН + Со.КС, Карлсруэ, Ώ) согласно инструкции изготовителя.
Дорожка А. Белковый маркер Вой-Магк 8ТАНОАКО (Саг1 ВоГк СтЬН + Со.КС, Карлсруэ, Ώ) Маркер молекулярной массы сверху вниз: 200, 119, 66, 43, 29, 20, 14,3 кДа.
Дорожка В. Сырой продукт после конъюгации окисленного АТШ с производным НЕ8, полученным, как описано в примере 8.1(а).
Дорожка С. Сырой продукт после конъюгации окисленного АТШ с производным НЕ8, полученным, как описано в примере 8.1(Ь).
Дорожка Ώ. Сырой продукт после конъюгации окисленного АТШ с производным НЕ8, полученным, как описано в примере 8.1(с).
Дорожка Е. Сырой продукт после конъюгации окисленного АТШ с производным НЕ8, полученным, как описано в примере 8.1(б).
Дорожка Б. Сырой продукт после конъюгации окисленного АТШ с производным НЕ8, полученным, как описано в примере 8.1(е).
Дорожка С. Сырой продукт после конъюгации окисленного АТШ с производным НЕ8, полученным, как описано в примере 8.1(Г).
Дорожка Н. Сырой продукт после конъюгации окисленного АТШ с производным НЕ8, полученным
- 64 014103 как описано в примере 8.1(д).
Дорожка К. Контроль реакции.
Фиг. 18 показывает результаты примера 9 (анализ сырых конъюгатов а1АТ-НЕ8, полученных как описано в примере 9.5 гель-электрофорезом).
Для гель-электрофореза использовали ХСе11 8иге Ьоск Μίηί Се11 ([пуЦгодеп СтЬН, Карлсруэ, Ό) и блок питания Ро\\'ег Рас 200 (Β^о-Κаά, Мюнхен, Ό). 3-8% Так-Ацетатный гель вместе с Тпк-Ацетатным 8Ό8 разгоняющим буфером в восстанавливающих условиях (оба Iην^ΐ^одеη СтЬН, Карлсруэ, Ό) использовали согласно инструкции производителя.
Дорожка А. Неокрашенный 8Э8-РАСЕ Белковый маркер 6.5-200 кДа (8ΕΚУА Е1ек1горкогек1к СтЬН, Гейдельберг, Ό) маркер молекулярной массы сверху вниз: 200, 116, 67, 45, 29, 21, 14,3, 6,5 кДа.
Дорожка В. Конъюгация с альдегид-НЕ8, как описано в примере 9.5.
Дорожка С. Конъюгация с НЕ8 как описано в примере 9.6.
Фиг. 19 показывает результаты примера 9 (анализ фракций В1-С6, собранных после ионообменной хроматографии (см. пример 9.7)).
Условия гель-электрофореза см. фиг. 18.
Дорожка А. Неокрашенный 8Э8-РАСЕ Белковый маркер 6.5-200 кДа (8ΕΚУА Е1екЕоркогек1к СтЬН, Гейдельберг, Ό) маркер молекулярной массы сверху вниз: 200, 116, 67, 45, 29, 21, 14,3, 6,5 кДа.
Дорожка В. Фракция В1.
Дорожка С. Фракция С1.
Дорожка Ό. Фракция С2.
Дорожка Е. Фракция С3.
Дорожка Е. Фракция С4.
Дорожка С. Фракция С5.
Дорожка Н. Фракция С6.
Дорожка I. А1АТ (СТС ВюПегареиЕск Шс, ЕгаттдЕат, МА, партия Номер 080604А).
Фиг. 20 показывает остаточную ферментативную активность νκ. концентрация Рго1аь11п Н8 (Вауег У11а1 СтЬН,. Леверкузен, Германия, Партия Номер Р^НА43), А1АТ (СТС ВюШегареиЕск Шс, Егаттд1ат, МА, партия Номер и аНЕ8-А1АТ-коньюгат, синтезируемый, как описано в примере 9.5).
Фиг. 21 показывает анализ 8Э8-РАСЕ сырого конъюгата альфа1АТ-НЕ8, полученного как описано в примере 10.5 Для гель-электрофореза использовали ХСе11 8иге Ьоск Μίηί Се11 Ц^хЕодеп СтЬН, Карлсруэ, Ό) и блок питания Ро\\'ег Рас 200 (Β^о-ΚаΕ, Мюнхен, Ό). 3-8% Так-Ацетатный гель вместе с ТакАцетатным 8Ό8 разгоняющим буфером в восстанавливающих условиях (оба Iην^ΐ^одеη СтЬН, Карлсруэ, Ό) использовали согласно инструкции производителя.
Дорожка А. Неокрашенный 8Э8-РАСЕ Белковый маркер 6.5-200 кДа (8ΕΚУА Е1екЕоркогек1к СтЬН, Гейдельберг, Ό) маркер молекулярной массы сверху вниз: 200, 116, 67, 45, 29, 21, 14,3, 6,5 кДа.
Дорожка В. альфа1АТ (СТС ВюШегареиЕск Шс, ЕгатшдЕат, МА, партия Номер 080604А).
Дорожка С. Конъюгация с Малеимид-НЕ8 как описано в примере 10.5.
Дорожка Ό. Конъюгация с Малеимид-НЕ8 как описано в примере 10.5 (двойная концентрация).
Фиг. 22 показывает анализ фракций А, В и С, собранных после ионообменной хроматографии (см. пример 10.7) Для гель-электрофореза использовали ХСе11 8иге Ьоск М1ш Се11 Ц^хЕодеп СтЬН, Карлсруэ, Ό) и блок питания Ро\\'ег Рас 200 (Β^о-ΚаΕ, Мюнхен, Ό). 3-8% Тпк-Ацетатный гель вместе с ТпкАцетатным 8Ό8 разгоняющим буфером в восстанавливающих условиях (оба Iην^ΐ^одеη СтЬН, Карлсруэ, Ό) использовали согласно инструкции производителя.
Дорожка 1. Неокрашенный 8Э8-РАСЕ Белковый маркер Магк12® 2,5-200 кДа (^хЕодеп СтЬН, Карлсруэ, Ό) маркер молекулярной массы сверху вниз: 200, 116, 97, 66, 55, 36, 31, 21, 14, 4 кДа.
Дорожка 2. Фракция А.
Дорожка 3. Фракция В.
Дорожка 4. Фракция С.
Дорожка 5. альфа1АТ (СТС ВюШегареиЕск Ею, ЕгаттдЕат, МА, партия Номер 080604А).
Примеры
Пример 1. Синтез конъюгатов бета ГОК
Пример 1.1. Синтез производных гидроксиэтилкрахмала с функциональными гидроксиаминогруппами.
Пример 1.1(а). Синтез гидроксиламино НЕ810/0.4 г НЕ810/0.4 (МВ = 10000 Д, Ό8 = 0,4, 8иргато1 Рагейега1 СоИоЛк СтЬН, ΚоκЬаск-ΚоΕке^т, Ό) растворяли в 17 мл 0,1 М ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,2, и добавляли 20 ммоль О-[2-(2аминооксиэтокси)этил]гидроксиламина. После взбалтывания в течение 19 ч при 22°С, реакционная смесь была добавлена к 100 мл охлажденной на льду смеси 1:1 ацетона и этанола (об./об.). Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 50 мл воды, диализировали в течение 21 ч против воды (8паке8кт Фа1уЕк ФЬтд, отсечка 3,5 кДа, РегЬю 8аепсек ЭеШксЫапб СтЬН, Бонн, Ό) и лиофилизировали.
- 65 014103
Молекулярная масса НЕ810/0.4 при измерении с ЬАЬЬ8-6РС составила 8500 Да, и Ό8 составила 0,41.
Пример 1.1(Ь). Синтез гидроксиламино НЕ810/0.7 г НЕ810/0.7 (МА = 10000 Да, Ό8 = 0,7, 8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о16к СтЬН, КокЬасй-Кобйет, Ό) растворяли в 18 мл 0,1М ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,2, и добавляли 20 ммоль О-[2-(2аминооксиэтокси)этил]гидроксиламина. После взбалтывания в течение 19 ч при 22°С, реакционная смесь была добавлена к 100 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола (об./об.). Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 50 мл воды, диализировали в течение 21 ч против воды (8паке8к1п 61а1у818 1иЬтд, отсечка 3,51 кДа, РегЬю 8аепсек ЭеШксЫапб СтЬН, Бонн, Ό) и лиофилизировали.
Молекулярная масса НЕ810/0.7 при измерении с ЬАЬЬ8-6РС составила 10500 Да и Ό8 составила 0,76.
Пример 1.1(с). Синтез гидроксиламино НЕ850/0.7 г НЕ850/0.7 (МА = 50000 Д, Ό8 = 0,7, 8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о16к СтЬН, КокЬасй-Кобйет, Ό) растворяли в 20 мл 0,1М ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,2, и добавляли 4 ммоль О-[2-(2аминооксиэтокси)этил]гидроксиламина. После взбалтывания в течение 19 ч при 22°С, реакционная смесь была добавлена к 100 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола (об./об.). Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 50 мл воды, диализировали в течение 21 ч против воды (8паке8к1п 61а1у818 1иЬшд, отсечка 3,5 кДа, РегЬю 8аепсек ЭеШксЫапб СтЬН, Бонн, Ό) и лиофилизировали.
Молекулярная масса НЕ850/0.7 при измерении с ЬАЬЬ8-6РС составила 47000 Да, и Ό8 составила 0,76.
Пример 1.1(6). Синтез гидроксиламино НЕ850/0.4.
г НЕ850/0.4 (МА = 50000 Да, Ό8 = 0,4, 8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о16к СтЬН, КокЬасй-Кобйет, Ό) растворяли в 20 мл 0,1М ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,2, и добавляли 4 ммоль О-[2-(2аминооксиэтокси)этил]гидроксиламина. После взбалтывания в течение 17,5 ч при 22°С, реакционная смесь была добавлена к 70 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола (об./об.). Осажденный продукт собирали центрифугированием при 0°С, промывали 30 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола (об./об.), повторно растворяли в 50 мл воды, диализировали в течение 19,5 ч против воды (8паке8к1п 61а1у818 1иЬтд, отсечение 3,5 кДа, РегЬю 8аепсек ЭеШксЫапб СтЬН, Бонн, Ό) и лиофилизировали.
Молекулярная масса НЕ850/0.4 при измерении с ЬАЬЬ8-6РС составила 56000 Да, и Ό8 составила 0,41.
Пример 1.1(е). Синтез гидроксиламино НЕ818/0.4.
Окисленный НЕ8 получали как описано в ЭЕ 19628705 А1. 200 мг окисленного НЕ818/0.4 (МА = 18000 Д, Ό8 = 0,4) нагревали при 80°С в вакууме в течение 17 ч и растворяли в сухом диметилсульфоксиде (2 мл) (Р1ика, 8|дта-А16псИ СИенне СтЬН, ТаиШгсйеп, Ό). К раствору добавляли 2 ммоль О-[2-(2аминооксиэтокси)этил]гидроксиламина. После инкубации в течение 5 дней при 65°С, реакционную смесь добавлена к 20 мл охлажденного на льду 2-пропанола и инкубировали при -20°С в течение 1 ч. Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали охлажденным на льду 2пропанолом (42 мл), повторно растворяли в 10 мл воды, диализировали в течение 27 ч против воды (8паке8к1п 61а1у818 1иЬтд, отсечка 3,5кДа, РегЬю 8аепсек ЭеШксЫапб СтЬН, Бонн, Ό) и лиофилизировали.
Молекулярная масса НЕ818/0.4 при измерении с ЬАЬЬ8-6РС составила 18000 Да и Ό8 составила 0,41.
Пример 1.1(1). Синтез гидразидо НЕ810/0. 4.
Окисленный НЕ8 получали, как описано в ЭЕ 19628705 А1, 200 мг окисленного НЕ810/0,4 (МА = 10000 Д, Ό8 = 0,4, 8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о16к СтЬН, КокЬасй-Кобйет, Ό) нагревали при 80°С в вакууме в течение 17 ч и растворяли в сухом диметилсульфоксиде (2 мл) (Р1ика, 8|дта-А16псИ СИенне СтЬН, ТаиШгсйеп, Ό). К раствору добавляли 2 ммоль дигидразида адипиновой кислоты (Ьапсак1ег 8уп1Ие818 СтЬН, Франкфурт на Майне Ό). После инкубации в течение 5 дней при 65°С, реакционную смесь добавляли к 20 мл охлажденного на льду 2-пропанола и инкубировали при -20°С в течение 1 ч. Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали охлажденным на льду 2-пропанолом (42 мл), повторно растворяли в 10 мл воды, диализировали в течение 27 ч против воды (8паке8кт 61а1у818 1иЬтд, отсечка 3,5 кДа, РегЬю 8с1епсек ОеиЕксЫапб СтЬН, Бонн, Ό) и лиофилизировали.
Молекулярная масса НЕ8 10/0.4 при измерении с ЬАЬЬ8-6РС составила 11000 Д, и Ό8 составила 0,41.
Пример 1.1(д). Синтез карбогидразидо НЕ810/0.4.
Окисленный НЕ8 получали, как описано в ЭЕ 19628705 А1. 200 мг окисленного НЕ8 10/0.4 (МА = 10000 Да, Ό8 = 0,4, 8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о16к СтЬН, КокЬасй-Кобйет, Ό) нагревали при 80°С в вакууме в течение 17 ч и растворяли в сухом диметилсульфоксиде (2 мл) (Р1ика, 8|дта-А16псИ СИеиие СтЬН, ТаиШгсйеп, Ό). К раствору добавляли 2 ммоль карбогидразида (Р1ика, 8щта-А16пс11 СИеиие
- 66 014103
СтЬН, ТаиГкпсйеи, Ό). После инкубации в течение 5 дней при 65°С, реакционную смесь добавляли к 20 мл охлажденного на льду 2-пропанола и инкубировали при -20°С в течение 1 ч. Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали охлажденным на льду 2-пропанолом (42 мл), повторно растворяли в 10 мл воды, диализировали в течение 27 ч против воды (БиакеБкт б1а1ук1к !иЬтд, отсечка 3,5 кДа, РегЬю Баеисек ОеШксШамб СтЬН, Бонн, Ό) и лиофилизировали.
Молекулярная масса НЕБ10/0,4 при измерении с ЬАЬЬБ-СРС составила 11000 Да, и ОБ составила 0,41.
Пример 1.1(й). Синтез гидразидо НЕБ10/0.4.
200 мг НЕБ10/0.4 (МА = 10000 Д, ОБ = 0,4, Бирин^ Рагеи!ега1 Οο11οι68 СтЬН, ΚοкЬасй-Κοбйе^т, Ό) растворяли в 2 мл 0,1М ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,2. К раствору добавляли 2 ммоль дигидразида адипиновой кислоты (Ьаисайег БугНйекк СтЬН, Франкфурт на Майне Ό). После перемешивания в течение 19 ч при 22°С, реакционную смесь добавляли к 21 мл охлажденного на льду 2-пропанола и инкубировали при -20°С в течение 1 ч. Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали охлажденным на льду 2-пропанолом (42 мл), повторно растворяли в 10 мл воды, диализировали в течение 27 ч против воды (БиакеБкт б1а1укк ЫЬшд, отсечка 3,5 кДа, РегЬю Баеисек ПеиксЫаиб СтЬН, Бонн, Ό) и лиофилизировали.
Молекулярная масса НЕБ 10/0.4 при измерении с ЬАЬЬБ-СРС составила 8500 Д, и ЬБ составила 0,41.
Пример 1.1(1). Синтез карбогидразидо НЕБ10/0.4.
200 мг НЕБ10/0.4 (МА = 10000 Да, ЬБ = 0,4, Биргш^ Рагеи!ега1 Οο11οι6κ СтЬН, ΚοкЬасй-Κοбйе^т, Ό) растворяли в 2 мл 0,1М ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,2. К раствору добавляли 2 ммоль карбогидразида (Р1ика, Б1дта-А1бпсй Сйет1е СтЬН, ТаиГкхгсйеи, Ό). После перемешивания в течение 19 ч при 22°С, реакционную смесь добавляли к 21 мл охлажденного на льду 2-пропанола и инкубировали при -20°С в течение 1 ч. Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали охлажденным на льду 2-пропанолом (42 мл), повторно растворяли в 10 мл воды, диализировали в течение 27 ч против воды (БиакеБкт б1а1укк ЫЬшд, отсечка 3,5 кДа, РегЬю Баеисек ПеиксЫаиб СтЬН, Бонн, Ό) и лиофилизировали.
Молекулярная масса НЕБ 10/0.4 при измерении с ЬАЬЬБ-СРС составила 8500 Да, и ЬБ составила 0,41.
Пример 1.2. Синтез конгъюгатов бета ШИ.
Пример 1.2(а). Окисления бета ШЫ.
Рекомбинантный человеческий интерферон бета-1а, включающий аминокислотную последовательность, идентичную выведенным на рынок продуктам АVΟNЕX™ (ВЮСЕМ) и КеЬгГ (Бегом) экспрессировали в линии клеток СНО, трансфицированной, как описано (ЭШтаг е! а1., 1989), и очищали, как описано в примере 6.1. Окисление осуществляли, по существу, как описано в примере 6.2, с последующим буферным обменом, как описано в примере 6.3.
Пример 1.2(Ь). Реакция окисленного ^Ν-бета из примера 1.2(а) с производными НЕБ из примеров 1.1(а)-1.1(1).
К 25,9 мкл раствора окисленного ^Ν-бета в ацетате натрия в качестве буфера (0,1 М), рН 5,5, добавляли 5,27 мкл раствора НЕБ-производного в 0,1 ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,5, и раствор инкубировали в течение 16,5 ч при 22°С. Использовали следующие концентрации:
78,9 мг/мл для производных НЕБ, полученных согласно примеру 1.1(а), 1.1(Ь), 1.1(Г), 1.1(д), 1.1(й) и 1.1(1);
395 мг/мл для производных НЕБ, полученных согласно примеру 1.1(с) и 1.1(6);
142 мг/мл для производных НЕБ, полученных согласно примеру 1.1(е).
Соответствующую реакционную смесь анализировали гель-электрофорезом (см. фиг. 1).
Пример 1.3 Синтез производных гидроксиэтилкрахмала с алдегидными функциональными группами.
Пример 1.3(а) Синтез альдегид-НЕБ10/0.4 из амино-НЕБ10/0.4 и 4-формилбензойной кислоты.
Оксо-НЕБ10/0.4 (МА = 10 кДа, ЬБ = 0,4) получали с использованием Биргш^ Рагеи!ега1 Οο11οι6κ СтЬН, Κ.οкЬасй-Κοбйе^т, Ό; согласно ЬЕ 19628705 А1, Молекулярная масса НЕБ 10/0.4 при измерении с ЬАЬЬБ-СРС составила 14500 Д и ЬБ составила 0,41.
5,1 г (0,51 ммоль) оксо-НЕБ10/0.4 растворяли в безводном метилсульфоксиде (15 мл) (ДМСО, Р1ика, Бщта-А1бпс11 Сйет1е СтЬН, ТаиГкЬсйеи, Ό), и добавляли по каплям в атмосфере азота к раствору 5,1 мл (51 ммоль) 1,4-диаминобутана в безводном диметилсульфоксиде (10 мл) и перемешивали при 40°С в течение 19 ч. Реакционную смесь добавляли к смеси этанола (80 мл) и ацетона (80 мл). Полученный осадок отделяли центрифугированием, промывали смесью этанола (20 мл) и ацетона (20 мл) и повторно растворяли в 80 мл воды. Раствор диализировали в течение 4 дней против воды (БиакеБкт б1а1у818 1иЬтд, отсечка 3,5 кДа, РегЬю Бс1еисе Оег1!кс111аг1б СтЬН, Бонн, Ό) и затем лиофилизировали. Выход составил 67% (3,4 г) амино-НЕБ10/0.4.
150 мг 4-формилбензойной кислоты и 230 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба А1бпсй, Б1дтаА1бг1сй Сйет1е СтЬН, ТаиГкпсйеи, Ό) растворяли в 10 мл Ν,Ν-диметилформамида (для синтеза пепти
- 67 014103 дов, Βίοδοίνβ, Vа1кеη8^аа^ά, ΝΕ) и добавляли 204 мкл Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимид. После инкубации при 21°С в течение 30 мин, добавляли 1 г амино-НЕ8 10/0.4. После взбалтывания в течение 19 ч при 22°С, реакционную смесь добавляли к 84 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола (об./об.). Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 50 мл воды, диализировали в течение 2 дней против воды (8паке8кш Ыа1у818 ЫЬшд, отсечка 3,5кД, РегЫо 8с1епсе5 Оси15с111апб СтЬН, Бонн, Ό) и лиофилизировали.
Пример 1.3(Ь). Синтез альдегид-НЕ810/0.4 путем окисления перйодатом НЕ810/0.4, окисленного на его восстанавливающем конце.
Оксо-НЕ810/0.4 (МV = 10 кДа Ό8 = 0,4) получали с использованием 8иргато1 Рагеп1ега1 Со11о1Й5 СтЬН, Ко5Ьасй-Коййе1т, Ό; согласно ОЕ 19628705 А1, Молекулярная масса НЕ8 10/0.4 при измерении с ЕАЕЬ8-СРС составила 8500 Да, и Ό8 составила 0,41.
300 мг оксо-НЕ810/0.4 растворяли в 15 мл 20 мМ фосфата натрия в качестве буфера, рН 7,2, 64,2 мг перйодата натрия (Р1ика, 8фта-А1(1пс11 О'кепие СтЬН, ТаЫкпскеп, Ό) растворяли в 15 мл того же самого буфера. Оба раствора смешивали и после инкубации в течение 30 мин при 21°С добавляли глицерин (2 мл), и реакционную смесь инкубировали при 21°С в течение 10 мин. Реакционную смесь диализировали в течение 24 ч против воды (8паке8кт Ыа1у818 ЫЬтд, отсечка 3,5 кДа, РегЫо 8аепсе8 Оеи^сЫапб СтЬН, Бонн, Ό) и лиофилизировали.
Пример 1.4. Синтез конъюгатов ΚΝ бета восстановительным аминированием с использованием гидроксиэтилкрахмала с альдегидными функциональными группами, синтезированного согласно примерам 1.3(а) и 1.3(Ь).
Рекомбинантный человеческий интерферон бета-1а, включающий аминокислотную последовательность, идентичную представленным на рынке продуктам АVОNЕX (ВЮСЕК) и КеЫЕ (8егопо), экспрессировали в линии клеток СНО, трансфицированной как описано (ОЫтаг е1 а1., 1989), и очищали, как описано в примере 6.1.
К 40 мкл раствора бета +Ν в 0,1 М ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,0 (0,5 мг/мл) добавляли 5 мкл раствора НЕ8-производного (синтезированного, как описано в примерах 1,3 (а) или 1,3(Ь)) в том же самом буфере (200 мг/мл). Смесь охлаждали до 4°С и добавляли 9 мкл 120 мМ раствора цианоборгидрида натрия в том же самом буфере при 4°С, и смесь инкубировали в течение 24 ч при 4°С. Сырую реакционную смесь анализировали гель-электрофорезом. Наблюдали успешную конъюгацию, на что указывает миграция белка на дорожке в сторону более высокой молекулярной массы (см. фиг. 2). Увеличенная ширина полосы является следствием распределения молекулярных масс используемого производного НЕ8 и количества производных НЕ8, связанных с белком.
Пример 1.5. Описания биоанализа противовирусной активности бета ΨΝ.
Общие замечания
В европейской Фармакопее в настоящее время приводятся только анализы на определение активности Интерферона-α и Интерферона-γ. Однако, поскольку противовирусный потенциал Интерферона-α измерен в этих тестах с использованием биоанализа цитопатического действия ш νίΙΐΌ (СРЕ), как описано в приложении 2001 (глава 5, 6), и поскольку это применимо для лекарственных продуктов ^Ν-β, одобренных к настоящему времени, противовирусная активность может быть проверена по аналогии с Интерфероном-α.
Противовирусная активность ΚΝ-β может быть проверена путем использования биоанализа ш νίΙΐΌ специфического цитопатического действия, например, с клетками рака легкого (А549) и вируса энцефаломиокардита (ЕМСУ). Другие возможные комбинации, которые могут использоваться для определения противовирусной активности интерферонов, представляют собой линии клеток VI8Н или линии клеток МаЫп-ОагЬу бычьей почки (МОВК) и V8V (вирус везикулярного стоматоза).
Анализ противовирусной активности интерферона - конспект
На первой стадии противовирусную активность ш νίΙΐΌ НЕ8-IΡN-бета-конъюгатов сравнивали с немодифицированным ΨΝ-бета.
В анализе СРЕ (М^ΒК/V8V), сравнивали разведения стандартного интерферона и конъюгата НЕ8Ш^бета. Клетки были предварительно обработаны тестируемыми образцами за приблизительно 48 ч до введения в контакт с вирусом.
После инкубационного периода (приблизительно 22 ч), был оценен защитный эффект интерферона против цитопатического действия вируса.
Анализ противовирусной активности интерферона - подробности эксперимента
Были выполнены следующие стадии:
растворы интерферона были предварительно разбавлены в клеточной культуральной среде для клеток МОВК (1:10). Эти растворы были последовательно разбавлены 1:2-1:2, 097, 152 (=1:221);
повтора (100 мкл в каждую лунку);
добавляли свежие обработанные трипсином клетки МОВК (5000 клеток/лунка в 50 мкл).
Инкубация: 48 ч при 37°С;
добавляли 50 мкл предварительно разбавленного раствора V8V (250 вирусов/лунка).
- 68 014103
Инкубация: 22 ч при 37°С;
определение защитного эффекта интерферона против вирусного цитопатического действия; подсчет титра интерферона с использованием способа 8реагтап-КагЬег'а.
Контроль:
МОВК-клетки с растворами интерферона, без добавления вируса (отрицательный контроль);
МОВК-клетки без интерферона с вирусом (положительный контроль).
Результаты
Два образца бета-интерферона и соответствующие НЕ8-конъюгаты были проверены в анализе СРЕ с использованием двух различных разведений (приблизительно 1000000 М.Ед./мл и 200 000 М.Ед./мл).
Титр интерферона вычисляли согласно формуле 8реагтап'а и КагЬег'а. Было вычислено отношение активностей различных образцов. Принимая во внимание предполагаемую специфическую активность образцов, концентрации ЕС50, при которых 50% клеток оказывались защищены против вирусной инкубации, вычисляли и сравнивали (данные не показаны).
Модифицированный ΣΡΝ-бета сохранил биоактивность.
Пример 2. Синтез конъюгатов АТ III.
Пример 2.1. Синтез производных гидроксиэтилкрахмала, содержащих функциональные гидроксиаминогруппы.
Пример 2.1(а). Синтез гидроксиламино НЕ810/0.4.
г НЕ8 10/0.4 (М^ = 10000 Д, Ό8 = 0,4, 8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о16з СтЬН, КозЬасй-Кобйе1т, Ό) растворяли в 17 мл 0,1М ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,2, и добавляли 20 ммоль О-[2-(2аминооксиэтилокси)этил]гидроксиламина. После взбалтывания в течение 19 ч при 22°С, реакционную смесь добавляли к 100 мл охлажденной на льду смеси 1:1 ацетона и этанола (об./об.). Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 50 мл воды, диализировали в течение 21 ч против воды (8паке8кт б1а1уз1з 1иЫпд, отсечка 3,5 кДа, РегЬю 8с1епсез ОеШзсЫапб СтЬН, Бонн, Ό) и лиофилизировали.
Молекулярная масса НЕ810/0.4 при измерении с ЬАЬЬ8-6РС составила 8500 Да, и Ό8 составила 0,41.
Пример 2.1(Ь). Синтез гидроксиламино НЕ810/0.7.
г НЕ810/0.7 (М^ = 10000 Д, Ό8=0,7, 8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о16з СтЬН, КозЬасй-Ко6йе1т, Ό) растворяли в 18 мл 0,1М ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,2, и добавляли 20 ммоль О-[2-(2аминооксиэтокси)этил]гидроксиламина. После взбалтывания в течение 19 ч при 22°С, реакционную смесь добавляли к 100 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола (об./об.). Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 50 мл воды, диализировали в течение 21 ч против воды (8паке8кт б1а1уз1з 1иЫпд, отсечка 3,5 кДа, РегЬю 8с1епсез ОеШзсЫапб СтЬН, Бонн, Ό) и лиофилизировали.
Молекулярная масса НЕ810/0.7 при измерении с ЬАЬЬ8-6РС составила 10500 Да, и Ό8 составила 0,76.
Пример 2.1 (с). Синтез гидроксиламино НЕ850/0,7.
г НЕ850/0,7 (М^ = 50000 Да, Ό8 = 0,7, 8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о16з СтЬН, КозЬасй-Кобйет, Ό) растворяли в 20 мл 0,1М ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,2, и добавляли 4 ммоль О-[2-(2аминооксиэтокси)этил]гидроксиламина. После взбалтывания в течение 19 ч при 22°С, реакционную смесь добавляли к 100 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола (об./об.). Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 50 мл воды, диализировали в течение 21 ч против воды (8паке8к1п б1а1уз1з !иЬшд, отсечка 3,5 кДа, РегЬю 8с1епсез Пеи!зсЫапб СтЬН, Бонн, Ό) и лиофилизировали.
Молекулярная масса НЕ850/0.7 при измерении с ЬАЬЬ8-6РС составила 47000 Да, и Ό8 составила 0,76.
Пример 2.1(6). Синтез гидроксиламино НЕ818/0.4.
Окисленный НЕ8 получали, по существу, как описано в ОЕ19628705А1, 200 мг окисленного НЕ818/0.4 (М^ = 18000 Да, Ό8 = 0,4) нагревали при 80°С в вакууме в течение 17 ч и растворяли в 2 мл сухого ДМСО (Б1ика, 8щта-А1бпс11 СИенне СтЬН, Таи1к1гсйеп, Ό). К раствору добавляли 2 ммоль О-[2(2-аминооксиэтокси)этил]гидроксиламина. После инкубации в течение 5 дней при 65°С, реакционную смесь добавляли к 20 мл охлажденного на льду 2-пропанола и инкубировали при -20°С в течение 1 ч. Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали 42 мл охлажденного на льду 2пропанола, повторно растворяли в 10 мл воды, диализировали в течение 27 ч против воды (8иаке8кш 61а1уз1з !иЬшд, отсечка 3,5 кД, РегЬю 8с1епсез ^еи!зсЫаиά СтЬН, Бонн, Ό) и лиофилизировали.
Молекулярная масса НЕ818/0.4 при измерении с ЬАЬЬ8-6РС составила 18000 Да, и Ό8 составила 0,41.
Пример 2.1(е). Синтез гидразидо НЕ810/0.4.
Окисленный НЕ8 получали, по существу, как описано в ОЕ19628705А1, 200 мг окисленного НЕ810/0.4 (М^ = 10000 Д, Ό8 = 0,4, 8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о16з СтЬН, КозЬасй-Кобйет, Ό) нагревали при 80°С в вакууме в течение 17 ч и растворяли в 2 мл сухого ДМСО (Б1ика, 8щта-А1бпс11 Сйетге
- 69 014103
СтЬН, ТаиГкисНеп, Ό). К раствору добавляли 2 ммоль дигидразида адипиновой кислоты (ЬапсакГег 8упШеА СтЬН, Франкфурт на Майне Ό). После инкубации в течение 5 дней при 65°С, реакционную смесь добавляли к 20 мл охлажденного на льду 2-пропанола и инкубировали при -20°С в течение 1 ч. Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали охлажденным на льду 2-пропанолом (42 мл), повторно растворяли в 10 мл воды, диализировали в течение 27 ч против воды (8паке8кт б1а1ук15 ЫЬтд, отсечка 3,5 кДа, РегЫо 8с1епсек ОеШксЫапб СтЬН, Бонн, Ό) и лиофилизировали.
Молекулярная масса НЕ810/0.4 при измерении с ЬАЬЬ8-СРС сосотавила 11000 Д, и Ό8 составила 0,41.
Пример 2.1(к). Синтез карбогидразидо НЕ810/0.4.
Окисленный НЕ8 получали по существу как описано в ИЕ19628705А1, 200 мг окисленного НЕ810/0.4 (М^ = 10000 Д, Ό8 = 0,4, 8иргато1 РагеШега1 Со11оИк СтЬН, ВокЬасй-Вобйе1т, Ό) нагревали при 80°С в вакууме в течение 17 ч и растворяли в сухом ДМСО (2 мл) (Р1ика, 8щта-А1бпс11 Скепие СтЬН, Τаиί1^^сйеи, Ό). К раствору добавляли 2 ммоль карбогидразида (Ника, 8щта-А1бпс11 Сйепйе СтЬН, Τаикк^^сйеи, Ό). После инкубации в течение 5 дней при 65°С, реакционную смесь добавляли к 20 мл охлажденного на льду 2-пропанола и инкубировали при -20°С в течение 1 ч. Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали охлажденным на льду 2-пропанолом (42 мл), повторно растворяли в 10 мл воды, диализировали в течение 27 ч против воды (8паке8кт б1а1ук15 ГиЬшд, отсечка 3,5 кДа, РегЫо 8с1епсек ИеиГксШапб СтЬН, Бонн, Ό) и лиофилизировали.
Молекулярная масса НЕ810/0.4 при измерении с ЬАЬЬ8-СРС составила 11000 Д, и Ό8 составила 0,41.
Пример 2.1(д). Синтез гидразидо НЕ810/0.4.
200 мг НЕ810/0.4 (М^ = 10000 Д, Ό8 = 0,4, 8иргато1 РагеШега1 Со11о1бк СтЬН, ВокЬасй-Вобйе1т, Ό) растворяли в 2 мл 0,1М ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,2. К раствору добавляли 2 ммоль дигидразида адипиновой кислоты (ЪапсакГег 8уиΐйеκ^κ СтЬН, ЕгаЫский/Мат Ό). После перемешивания в течение 19 ч при 22°С, реакционную смесь добавляли к 21 мл охлажденного на льду 2-пропанола и инкубировали при -20°С в течение 1 ч. Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали охлажденным на льду 2-пропанолом (42 мл), повторно растворяли в 10 мл воды, диализировали в течение 27 ч против воды (8паке8кт Ыа1ук15 ЫЬтд, отсечка 3,5 кДа, РегЫо 8с1епсек ИеиГксШапб СтЬН, Бонн, Ό) и лиофилизировали.
Молекулярная масса НЕ810/0.4 при измерении тей1ЬАЬЬ8-СРС составила 8500 Да, и Ό8 составила 0,41.
Пример 2.1(11). Синтез карбогидроазидо НЕ810/0.4.
200 мг НЕ810/0.4 (М\У = 10000 Д, Ό8 = 0,4, 8иргато1 РагеШега1 Со11о1бк СтЬН, ВокЬасй-Вобйе1т, Ό) растворяли в 2 мл 0,1М ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,2. К раствору добавляли 2 ммоль карбогидразида (Ийка, 8щта-А1бпс11 С1ет1е СтЬН, ТаикЕггсйеп, Ό). После перемешивания в течение 19 ч при 22°С, реакционную смесь добавляли к 21 мл охлажденного на льду 2-пропанола и инкубировали при -20°С в течение 1 ч. Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали охлажденным на льду 2-пропанолом (42 мл), повторно растворяли в 10 мл воды, диализировали в течение 27 ч против воды (8паке8кш Ыа1ук15 ЫЬтд, отсечка 3,5 кДа, РегЫо 8с1епсек ЭегиксЫапб СтЬН, Бонн, Ό) и лиофилизировали.
Молекулярная масса НЕ810/0.4 при измерении с ЬАЬЬ8-СРС составила 8500 Да и Ό8 составила 0,41.
Пример 2.2. Синтез конгъюгатов АТ III.
Пример 2.2(а). Окисление АТ III.
Используемым АТ III был рекомбинантный человеческий АТ III (АТгуп® от СТС ВюГйегареийск). Окисление проводили по существу так же, как описано в примере 7.2, с последующим буферным обменом, как описано в примере 7.3.
Пример 2.2(Ь). Реакции окисленного АТ III из примера 3,2(а) с производными НЕ8 из примеров 3.1(а)-3.1(1).
К 4 мкл раствора окисленного АТ III в 0,1М ацетате натрия в качестве буфера, рН 5,5, добавляли 3 мкл раствора НЕ8-производного в 0,1М ацетате натрия в качестве буфера, рН 5,5 и раствор инкубировали в течение 16,5 ч при 22°С. Использовали следующие концентрации:
(ί) 57 мг/мл для производных НЕ8, полученных согласно примеру 3.1(а), 3.1(Ь), 3.1(е), 3.1(к), 3.1(д) и 3.1(1);
(й) 287 мг/мл для производных НЕ8, полученных согласно примеру 3.1(с);
(ΐϊϊ) 103 мг/мл для производного НЕ8 согласно примеру 3.1(6);
Реакционную смесь анализировали гель-электрофорезом (см. фиг. 3).
Пример 2.3. Синтез конгъюгата АТ III.
Пример 2.3(а). Синтез альдегид-НЕ810/0.4 из амино-НЕ810/0,4 и 4-формилбензойной кислоты. Альдегид-НЕ810/0.4 получали согласно примеру 1.3(а).
Пример 2.3 (Ь). Синтез альдегид-НЕ810/0.4 из амино-НЕ810/0.4 и 4-формилбензойной кислоты.
Альдегид-НЕ810/0.4 был получен согласно примеру 1.3(Ь).
- 70 014103
Пример 2.4. Синтез конгъюгатов АТ III восстановительным аминированием с гидроксиэтилкрахмалом, содержащим альдегидные функциональные группы, синтезируемым согласно примерам 2.3 (а) и 2,3(Ь).
Используемым АТ III был рекомбинантный человеческий АТ III (АТгуп® от ОТС ВюНегареийск).
К 6,67 мкл раствора АТ III в 0,1М ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,0 (3 мг/мл), добавляли 1,73 мкл раствора НЕ8-производного (синтезируемого, как описано в примерах 2.3(а) или 2.3(Ь)) в том же самом буфере (200 мг/мл). Смесь охлаждали до 4°С и добавляли 1,68 мкл 120 мМ раствора цианоборгидрида натрия в том же самом буфере при 4°С, и смесь инкубировали в течение 24 ч при 4°С. Сырую реакционную смесь анализировали гель-электрофорезом. Наблюдали успешную конъюгацию, на что указывает миграция полосы белка к более высокой молекулярной массе (см. фиг. 4). Увеличенная ширина полосы является следствием распределения молекулярных масс используемого производного НЕ8 и количества производных НЕ8, связанных с белком.
Пример 2.5. Синтез конъюгатов АТ III реакцией гидроксиэтилкрахмала, имеющего реакционноспособную сложноэфирную группу, с АТ III.
В этом примере использовали раствор АТ III с концентрацией приблизительно 25 мг/мл в 5 мМ буфера цитрата натрия, 66 мМ глицерина, 67 мМ №С1, рН приблизительно 7.
Используемым АТ III был рекомбинантный человеческий АТ III (АТгуп® от ОТС ВюНегареийск).
АТ III был очищен от нежелательного глицерина ультрафильтрацией с фосфатным буфером, рН 7,2, и с использованием мембраны с отсечением 10 кДа. Конечная концентрация полученного очищенного раствора составляла приблизительно 25 мг/1,25 мл. Качество белка контролировали анализом НРОРС (см. фиг. 5).
В анализе НРОРС использовались следующие параметры:
Колонка: Супероза 12 НВ 10/30 300 х 10 мм ΓΌ. (Рйагшааа).
Элюент: 27,38 мМ №2НРО4; 12,62 мМ NаН2РО4; 0,2 М ИаС1; 0,005% Ν;ιΝ3 в 1 л деминерализованной воды.
Поток: 0,24 мл/ч.
Детектор 1: детектор МАЬЬ8.
Детктор 2: УФ (280 нм).
Детектор 3: ВТ.
Оксо-НЕ810/0.4 (МV = 10,559 Д, Ό8 = 0,4) получали с использованием 8иргато1 РагепТега1 Со11о1бк ОтЬН, ВокЬасй-Вобйе1т, И; согласно ИЕ 19628705 А1. Степень окисления оксо-НЕ8 составляла 95%.
мг оксо-НЕ810/0.4 растворяли в 0,2 мл безводного ДМФ. К этому раствору добавляли 2,6 мг Ν,Ν'-дисукцинимидил карбоната, и смесь перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре.
0,5 мл 0,1М раствора бикарбоната натрия добавляли к 0,5 мл раствора АТ III, получая раствор, имеющий концентрацию приблизительно 10 мг/мл АТ III, рН 8.2. К этому раствору добавляли раствор, содержащий реакционноспособный оксо-НЕ8, полученный, как описано выше, порциями по 50 мкл до завершения реакции, что наступает после, приблизительно, 30 мин. Затем рН смеси устанавливали на рН 7 с использованием 0,1н. НС1 и замораживали при -18°С, до анализа НРОРС (высокоэффективная гельпроникающая хроматография), который показал выход конъюгатов приблизительно 60%. Этот результат показан на фиг. 6.
В анализе НРОРС использовались следующие параметры:
Колонка: Супероза 12 НВ 10/30 300 х 10 мм Σ.ϋ. (Рйагшааа).
Элюент: 27,38 мМ №2НРО4; 12,62 мМ NаН2РО4; 0,2 М ИаС1; 0,005% №%. в 1 л деминерализованной воды.
Поток: 0,24 мл/ч.
Детектор 1: детектор МАЬЬ8.
Детектор 2: УФ (280 нм).
Детектор 3: ВТ
Пример 3. Синтез конъюгатов ОМ-С8Е.
Пример 3.1. Синтез производных гидроксиэтилкрахмала, содержащих функциональные гидроксиаминогруппы.
Пример 3.1(а). Синтез гидроксиламино НЕ810/0.4.
г НЕ810/0.4 (МV = 10000 Д, Ό8 = 0,4, 8иргато1 РагепТега1 Со11о1бк ОтЬН, ВокЬасй-Вобйе1т, И) растворяли в 17 мл 0,1М ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,2 и добавляли 20 ммоль О-[2-(2аминооксиэтокси)этил]гидроксиламина. После взбалтывания в течение 19 ч при 22°С, реакционную смесь добавляли к 100 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола (об./об.). Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 50 мл воды, диализировали в течение 21 ч против воды (8паке8кт б1а1ук1к ТиЬшд, отсечка 3,5 кДа, РегЬю 8аепсек ИеиТксЫапб ОтЬН, Бонн, И) и лиофилизировали.
Молекулярная масса НЕ810/0.4 при измерении с ЬАЬЬ8-ОРС составила 8500 Да, и Ό8 составила 0,41.
- 71 014103
Пример 3.1(Ь). Синтез гидроксиламино ΗΕ810/0.7.
г ΗΕ8 10/0,7 (М^ = 10000 Д, Ό8 = 0,7, 8иргато1 Рагеп1ега1 Со11о1б§ СтЬИ Βο^αΛ-ΒοάΗβΜ, Ό) растворяли в 18 мл 0,1М ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,2, и добавляли 20 ммоль О-[2-(2аминооксиэтокси)этил]гидроксиламина. После взбалтывания в течение 19 ч при 22°С, реакционную смесь добавляли к 100 мл охлажденной на льду смеси 1:1 ацетона и этанола (об./об.). Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 50 мл воды, диализировали в течение 21 ч против воды (8паке8кт б1а1ум8 1иЬшд, отсечка 3,5 кДа, РегЫо 8с1епсе5 ОеийсЫапб СтЬИ Бонн, Ό) и лиофилизировали.
Молекулярная масса ΗΕ810/0.7 при измерении с ΕΑΕΕΑ^Ρί’ составила 10500 Да, и Ό8 составила 0,76.
Пример 3.1(с). Синтез гидроксиламино ΗΕ850/0.7.
г ΗΕ850/0.7 (М^ = 50000 Да, Ό8 = 0, 7, 8иргато1 Рагеп1ега1 Со11о1б§ СтЬИ Βο8Ъасй-Βοάйе^т, Ό) растворяли в 20 мл 0,1М ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,2, и добавляли 4 ммоль О-[2-(2аминооксиэтокси)этил]гидроксиламина. После взбалтывания в течение 19 ч при 22°С, реакционную смесь добавляли к 100 мл охлажденной на льду смеси 1:1 ацетона и этанола (об./об.). Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 50 мл воды, диализировали в течение 21 ч против воды (8паке8кт б1а1у818 1иЫпд, отсечка 3,5 кДа, РегЫо 8с1епсе5 ОеийсЫапб СтЬИ Бонн, Ό) и лиофилизировали.
Молекулярная масса ΗΕ850/0.7 при измерении с ^Α^^8-СΡС составила 47000 Да, и Ό8 составила 0,76.
Пример 3.1(6). Синтез гидроксиламино ΗΕ850/0.4.
г ΗΕ850/0.4 (М^ = 50000 Да, Ό8 = 0,4, 8иргато1 Рагеп1ега1 Со11о16§ СтЬИ Βο8ЪасЫΒοάйе^т, Ό) растворяли в 20 мл 0,1М ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,2, и добавляли 4 ммоль О-[2-(2аминооксиэтокси)этил]гидроксиламина. После взбалтывания в течение 17,5 ч при 22°С, реакционную смесь добавляли к 70 мл охлажденной на льду смеси 1:1 ацетона и этанола (об./об.). Осажденный продукт собирали центрифугированием при 0°С, промывали 30 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола (об./об.), повторно растворяли в 50 мл воды, диализировали в течение 19,5 ч против воды (8иаке8кш б1а1у818 1иЫид, отсечка 3,5 кДа, РегЫо 8с1епсе5 БеийсИктб СтЬИ Бонн, Ό) и лиофилизировали.
Молекулярная масса ΗΕ850/0.4 при измерении с ^Α^^8-СΡС составила 56000 Да, и Ό8 составила 0,41.
Пример 3.1(е). Синтез гидроксиламино ΗΕ818/0.4.
Окисленный ΗΕ8 был получен, как описано в ΌΕ 19628705 Α1, 200 мг окисленного ΗΕ818/0.4 (М^ = 18000 Да, Ό8 = 0,4) нагревали при 80°С в вакууме в течение 17 ч и растворяли 2 мл сухого ДМСО (Ийка, 8^дта-Α1ά^^сй СИенне СтЬИ Τаиίк^^сйеи, Ό). К раствору добавляли 2 ммоль О-[2-(2аминооксиэтокси)этил]гидроксиламина. После инкубации в течение 5 дней при 65°С, реакционную смесь добавляли к 20 мл охлажденного на льду 2-пропанола и инкубировали при -20°С в течение 1 ч. Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали охлажденным на льду 2пропанолом (42 мл), повторно растворяли в 10 мл воды, диализировали в течение 27 ч против воды (8паке8кш б1а1у818 ШЪшд, отсечка 3,5 кДа, РегЫо 8с1епсе5 БеиБсИктб СтЬИ Бонн, Ό) и лиофилизировали.
Молекулярная масса ΗΕ818/0.4 при измерении с ^Α^^8-СΡС составила 18000 Да и Ό8 составила 0,41.
Пример 3.1(ί). Синтез гидразидо ΗΕ810/0.4.
Окисленный ΗΕ8 получали, по существу, как описано в ΌΕ 19628705 А1, 200 мг окисленного ΗΕ810/0.4 (М^ = 10000 Да, Ό8 = 0,4, 8иргато1 Рагеп1ега1 Со11оЫ5 СтЬИ Βο8ЪасЫΒοάйе^т, Ό) нагревали при 80°С в вакууме в течение 17 ч и растворяли в 2 мл сухого ДМСО (Ийка, 8^дта-Α1ά^^сй СИенне СтЬИ Τаиίк^^сйеи, Ό). К раствору добавляли 2 ммоль дигидразида адипиновой кислоты (БапсаМег 8упЫе515 СтЬИ Франкфурт на Майне Ό). После инкубации в течение 5 дней при 65°С, реакционную смесь добавляли к 20 мл охлажденного на льду 2-пропанола и инкубировали при -20°С в течение 1 ч. Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали охлажденным на льду 2-пропанолом (42 мл), повторно растворяли в 10 мл воды, диализировали в течение 27 ч против воды (8паке8кш бк11у515 ШЬтд, отсечка 3,5 кДа, РегЫо 8с1епсе5 ^еиΐ8сЫаиά СтЬИ Бонн, Ό) и лиофилизировали.
Молекулярная масса ΗΕ810/0.4 при измерении с ^Α^^8-СΡС составила 11000 Ό и Ό8 составила 0,41.
Пример 3.1(д). Синтез карбогидразидо ΗΕ810/0.4.
Окисленый ΗΕ8 получали как описано в ΌΕ 19628705 Α1, 200 мг окисленного ΗΕ810/0.4 (М^ = 10000 Д, Ό8 = 0,4, 8иргато1 Рагеп1ега1 Со11о16§ СтЬИ Βο8ЪасЫΒοάйе^т, Ό) нагревали при 80°С в вакууме в течение 17 ч и растворяли в сухом ДМСО (2 мл) (Б1ика, 8^дта-Α1ά^^сй СИение СтЬИ Τаиίк^^сйеи, Ό). К раствору добавляли 2 ммоль карбогидразида (Б1ика, 8^дта-Α1ά^^сй СИенне СтЬИ Τаиίк^^сйеи, Ό). После инкубации в течение 5 дней при 65°С, реакционную смесь добавляли к 20 мл охлажденного на льду 2-пропанола и инкубировали при -20°С в течение 1 ч. Осажденный продукт собирали центрифуги- 72 014103 рованием при 4°С, промывали 42 мл охлажденного на льду 2-пропанола, повторно растворяли в 10 мл воды, диализировали в течение 27 ч против воды (8паке8кш 61а1ук1к ЛЬшд, отсечка 3,5 кДа, РегЬю 8с1епсек ИеийсЫаиб СтЬН, Бонн, И) и лиофилизировали.
Молекулярная масса НЕ810/0.4 при измерении с ^Α^^8-СРС составила 11000 Да, и Ό8 составила 0,41.
Пример 3.1(11). Синтез гидразидо НЕ810/0.4.
200 мг НЕ810/0.4 (М\У = 10000 Д, Ό8 = 0,4, 8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о1бк СтЬН, КокЬасЬ-Ко6Ье1т, И) растворяли в 2 мл 0,1М ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,2. К раствору добавляли 2 ммоль дигидразида адипиновой кислоты (Ьапсак!ег 8упШек1к СтЬН, Франкфурт на Майне И). После перемешивания в течение 19 ч при 22°С, реакционную смесь добавляли к 21 мл охлажденного на льду 2-пропанола и инкубировали при -20°С в течение 1 ч. Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали охлажденным на льду 2-пропанолом (42 мл), повторно растворяли в 10 мл воды, диализировали в течение 27 ч против воды (8иаке8кш 61а1ук1к ЛЬтд, отсечка 3,5 кДа, РегЬю 8аепсек ИеийсЫапб СтЬН, Бонн, И) и лиофилизировали.
Молекулярная масса НЕ810/0.4 при измерении с ^Α^^8-СРС составила 8500 Да, и Ό8 составила 0,41.
Пример 3.1(1). Синтез карбогидразидо НЕ810/0.4.
200 мг НЕ810/0.4 (М\У = 10000 Д, Ό8 = 0,4, 8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о16к СтЬН, КокЬасЬ-Ко6Ье1т, И) растворяли в 2 мл 0,1М ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,2. К раствору добавляли 2 ммоль карбогидразида (Р1ика, 8^дта-Α1ά^^сЬ СНепие СтЬН, ТаиШгсНеп, И). После перемешивания в течение 19 ч при 22°С, реакционную смесь добавляли к 21 мл охлажденного на льду 2-пропанола и инкубировали при -20°С в течение 1 ч. Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали охлажденным на льду 2-пропанолом (42 мл), повторно растворяли в 10 мл воды, диализировали в течение 27 ч против воды (8иаке8кш 61а1ук1к ЛЬтд, отсечка 3,5 кДа, РегЬю 8аепсек ИеийсЫапб СтЬН, Бонн, И) и лиофилизировали.
Молекулярная масса НЕ8 10/0.4 при измерении с ^Α^^8-СРС составила 8500 Да, и Ό8 составила 0,41.
Пример 3.2. Синтез конгъюгатов СМ-С8Р.
Пример 3.2(а) Окисление СМ-С8Р.
СМ-С8Р очищали, как описано в примере 7.1. Окисление проводили, по существу, как описано в примере 7.2, с последующим буферным обменом, как описано в примере 7.3.
Пример 3.2(Ь). Реакция окисленного СМ-С8Р из примера 4.2(а) с производными НЕ8 из примеров 4.1(а)-4.1(1).
К 27 мкл раствора окисленного СМ-С8Р в 0,1М ацетате натрия в качестве буфера, рН 5,5, добавляли 3,81 мкл раствора НЕ8-производного в 0,1М ацетате натрия в качестве буфера, рН 5,5, и раствор инкубировали в течение 16,5 ч при 22°С. Использовали следующие концентрации:
(ί) 78,9 мг/мл для производных НЕ8, полученных согласно примеру 3/1(а), 3/1(Ь), 3/1(1), 3/1 (д), 3/1(1) и 3/1(1);
(ίί) 395 мг/мл для производных НЕ8, полученных согласно примеру 3.1(с) и 3.1(6);
(ίίί) 142 мг/мл для производного НЕ8, полученного согласно примеру 3.1(е).
Реакционную смесь анализировали гель-электрофорезом (см. фиг. 7).
Пример 3.3. Синтез конъюгатов СМ-С8Р.
Пример 3.3(а). Синтез альдегид-НЕ810/0/4 из амино-НЕ810/0/4 и 4-формилбензойной кислоты. Альдегид-НЕ810/0/4 получали согласно примеру 1.3(а).
Пример 3.3(Ь). Синтез альдегид-НЕ810/0/4 из амино-НЕ810/0/4 и 4-формилбензойной кислоты. Альдегид-НЕ8 10/0/4 получали согласно примеру 1.3(Ь).
Пример 3.4 Синтез конъюгатов СМ-С8Р восстановительным аминированием с гидроксиэтилкрахмалом, содержащим альдегидные функциональные группы, синтезируемым согласно примерам 3.3 (а) и 3.3(Ь).
К 20 мкл раствора СМ-С8Р в 0,1М ацетате натрия в качестве буфера, рН 5,0 (1 мг/мл), добавляли 1,91 мкл раствора НЕ8-производного (синтезируемого, как описано в примерах 3.3(а) или 3.3(Ь)) в том же самом буфере (200 мг/мл). Смесь охлаждали до 4°С и добавляли 4,38 мкл 120 мМ раствора цианоборгидрида натрия в том же самом буфере при 4°С, и смесь инкубировали в течение 24 ч при 4°С. Сырую реакционную смесь анализировали гель-электрофорезом. Наблюдали успешную конъюгацию, на что указывает миграция полосы белка к более высокой молекулярной массе (см. фиг. 8). Увеличенная ширина полосы является следствием распределения молекулярных масс используемого производного НЕ8 и количества производных НЕ8, связанных с белком.
Пример 4. Синтез конъюгатов ΑΤ III, бета ΣΡΝ и СМ-С8Р с гидроксиэтилкрахмалом, содержащим функциональные гидроксиламиногруппы.
Пример 4.1. Синтез гидроксиэтилкрахмала, содержащего функциональные гидроксиламиногруппы.
(a) Гидроксиламино НЕ810/0.4 синтезировали, как описано выше в примере 1.1(а).
(b) Гидроксиламино НЕ850/0.7 синтезировали, как описано выше в примере 1.1(с).
- 73 014103
Пример 4.2. Синтез конъюгат бета ΙΕΝ с гидроксиламино НЕ850/0.7 согласно примеру 4.1(Ь).
К 1190 мкл раствора окисленного бета ΙΕΝ в 0,1М ацетате натрия в качестве буфера, рН 5,5 (полученного после стадии примера 5.3), добавляли раствор 81,4 мг гидроксиламино НЕ850/0,7 в 200 мкл 0,1М ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,5, и раствор инкубировали в течение 19 ч при 22°С.
Реакционную смесь анализировали гель-электрофорезом (см. фиг. 9).
Пример 4.3. Синтез конъюгата АТ III с гидроксиламино НЕ810/0.4 согласно примеру 4.1(а).
К 500 мкл раствора окисленного АТ III в 0,1М ацетате натрия в качестве буфера, рН 5,5 (полученного после стадии примера 6.3), добавляли раствор 21,6 мг гидроксиламино НЕ810/0.4 в 1500 мкл 0,1М ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,5, и раствор инкубировали в течение 20,5 ч при 22°С.
Пример 4.4. Синтез кончлогата СМ-С8Е с гидроксиламино НЕ810/0.4 согласно примеру 4.1(а).
К 720 мкл раствора окисленного СМ-С8Е в 0,1М ацетате натрия в качестве буфера, рН 5,5 (полученного после стадии примера 7.3), добавляли раствор 14,0 мг гидроксиламино НЕ810/0.4 в 180 мкл 0,1М ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,5, и раствор инкубировали в течение 18 ч при 22°С.
Пример 5. Дальнейшая характеристика конгъюгатов ГЕ№бета-1а.
Пример 5.1(а). Очистка и анализ человеческого рекомбинантного бета-интерферона.
Рекомбинантный человеческий интерферон бета-1а, включающий аминокислотную последовательность, идентичную продуктам АVОNЕX™ (ВЮСЕК) и ВеЬ1к (8егопо), экспрессировали в линии клеток СНО, трансфицированных, как описано (Шйтаг е( а1., 1989). ΒΝ-β очищали трехстадийной процедурой, включающей адсорбцию супернатанта культуры на Синюю Сефарозу, элюирование 0,05М №фосфатным буфером рН 7,0, содержащим 0,7М №1С1 + 60% этиленгликоля, и хроматографию на колонке с 10 мл ЕЕ Хелата цинка при температуре окружающей среды. Колонку предварительно уравновешивали с 30 мл 20 мМ №1-фосфатного буфера, 0,3М №С1, рН 7,4. Образец наносили после разбавления 1:2 с 15 мл 20 мМ №-фосфата, рН 7,2-7,5. Затем колонку промывали 25 мл 20 мМ №-фосфата, 0,3М №С1, рН 7,4, с последующим элюированием I (20 мл 0,1М №-ацетата, 0,5 М №С1, рН 5,9) и элюированием II (15 мл 0,1М №-ацетата, 0,5М №С1, рН 4,7). Финальная очистка осуществляли ВЭЖХ с обратной фазой на колонке Vубас С4, уравновешенной в 0,1% ТФК (растворитель А) с использованием градиента 0-100% растворителя В (80% ацетонитрила в 0,1% ТФК).
Пример 5.1(Ь).
Используемый ^Ν-бета 1а имел чистоту > 95% (на основании анализа 8Ό8 РАСЕ и ВЭЖХ с обратной фазой, и содержал < 5% димеров (невосстанавливающие условия)). Углеводные структуры препарата были по существу теми же самыми, как в АVОNЕX™ и показали присутствие 42% двухантенных структур, 16% двухантенных минус проксимальная фукоза, 12% трехантенных, 7% четырехантенных и 9% трехантенных с 1 повтором Ν-ацетиллактозамина (остальные 12% были представлены агалактоструктурами и малыми количествами цепей с периферической фукозой). На основании реакции НРАЕСРАЭ приблизительно 14% олигосахаридных цепей были асиало-цепями, 21% - моносиало, 35% - дисиало и 19% - трисиало. Малые количества тетрасиало-структур также присутствовали. Значительное большинство сиаловых кислот было обнаружено в форме Ν-ацетилнейраминовой кислоты и в препарате присутствовало < 5% Ν-гликолилнейраминовой кислоты, поэтому используемый препарат напоминает больше продукт АVОNЕX™, так как ВеЬ1к (продукт 8егопо) содержит > 15% Ν-гликолилнейраминовой кислоты (данные не показаны).
Пример 5.2. Окисление перйодатом Ν-ацетилнейроаминовых кислотных остатков умеренной перйодатной обработкой IЕN-β-1а из клеток СНО.
К 500 мкг/мл раствора ΨΝ-β (в 0,1М №1-ацетата в качестве буфера рН 5,5, предварительно охлажденного и сохраняемого при 0°С) добавляли охлажденный на льду раствор 10 мМ натрий-метаперйодата, с получением конечной концентрации 1 мМ натрий-мета-перйодата. Смесь инкубировали при 0°С в течение 1 ч в ванне со льдом в темноте и реакцию завершали добавлением 20 мкл глицерина и инкубировали в течение еще 5 мин. Затем образцы ΓΕΝ-β концентрировали, используя концентрирующую единицу V^νавр^η как описано ниже.
Пример 5.3. Буферный обмен окисленного перйодатом [ΕΝ-β 1а для последующего НЕ8 илирования
Буферный обмен осуществляли, используя 0,5 мл ^уаврт 2 единицы концентратора (^уаврт АС, Ганновер, Германия) с полиэфирсульфоновой (РЕ8) мембраной и отсечением 10 кДа. Сначала, единицу концентратора промывали добавлением 0,5 мл 0,1М Nа-ацетатного буфера рН 5,5 и центрифугированием при 4000 об/мин при 6°С в Медакиде 1,0В (Кепбго ЬаЬога(огу Е^и^ршеη(. Ов(егобе, Германия). Затем 0,5 мл окисленного перйодатом раствора ΣΕΝ-β добавляли к единице концентратора и центрифугировали при 4000 об/мин в течение 25 мин, до достижения по меньшей мере 5-кратной концентрации. 0,1М №1ацетатный буфер рН 5,5 добавляли к концентрату до конечного объема 0,5 мл, который центрифугировали, как описано выше. Цикл центрифугирования повторяли 3 раза, конечный концентрат удаляли и переносили в 2 мл пластиковый пузырек (ЕррепбогТк, Германия) и сохраняли на льду до дальнейшего использования в реакции НА8-модификации.
Пример 5.4. Синтез конъюгатов НА8 и ΒΝ-β.
Синтез осуществляли, как описано выше в примере 4.2.
- 74 014103
Пример 5.5. Отделение ΗΕ8 илированного ΓΕΝ-β и избытка производных ΗΑ8 от сред инкубации перйодат-окисленного белка с гидроксиламино-ИЕ8 50/0.7.
Резюме. Разгон на ВЭЖХ с обратной фазой осуществляли при комнатной температуре, используя оборудование АКТА ехр1огег 10 и объемную скорость потока 1,25 мл/мин. Аликвоты инкубационных смесей, содержащие 400 мкг ΣΕΝ-β были нанесены на С18-фазовую колонку 250 мм х 10 мм, уравновешенную с 1,25 СV 11% растворителя В (0,1% ТФК, 90% ацетонитрила) и 89% Растворителя А (0,1% ТФК). Вводили образцы (приблизительно 1,25 мл) и пробоотборную петлю промывали 11 мл 11%-ого растворителя В. После промывки колонки 0,2 СУ 11% растворителя В, наносили линейный градиент от 11% до 90% растворителя В на 2 С¥. Элюирование колонки продолжали при использовании 0,8 СV 90% растворителя В, и наконец колонку повторно уравновешивали с 1,0 СV 11% Растворителя В.
Белки [ΕΝ-β белки, элюируемые в объеме 7,5 мл при концентрации 62% растворителя В. Восстановление белка составило 60% (ΗΕ8 ^Ν-β ί,’ΗΟ) на основании специфической пиковой области 790 тАи х мл х мг-1, которая была получена со стандартным препаратом ^Ν-β на С4-фазной колонке при использовании того же самого оборудования.
Материалы и методы для примера 5,5.
Оборудование и Материалы.
Оборудование: АКТА 10 (Атегзйат Рйагтааа Биотехнология):
насос Р-903;
Мешалка М-925, с камерой на 0,6 мл;
УФ-монитор-900, с проточной кюветой на 10 мм;
монитор рН/С-900;
фракционный коллектор Ргас-900;
пробоотборная петля 2 мл;
8оП\уаге Ишсогп Vе^8^оη 3,21.
Колонка: 250 мм х 10 мм, Мас11егеу-№ще1 250-1/2-10 Кис1ео811 7 С18, кат. номер 715002, номер партии 4020854.
Объем колонки: 20 мл.
Объемная скорость потока: 1,25 мл/мин.
Растворитель А: 0,1% ТФК в ВЭЖХ-воде.
Растворитель В: 90% ацетонитрила, 0,1% ТФК ВЭЖХ-воде.
Способ для ВЭЖХ с обратной фазой согласно примеру 5.5
Объем Стадия Растворитель А Растворитель В
0,25 СТ Уравновешивание 89% 11%
11 мл Впрыск образца 89% 11%
Фракционирование 89% 11%
0,20 СТ Вымывание несвязанного образца 89% 11%
2,00 СТ Линейный градиент 89-10% 11-90%
0,80 СТ Изократичес кий градиент 10% 90%
Финальное фра кцио ниров ание 10% 90%
1,00 СТ Повторное уравновешивание 89% 11%
Детекция: А 280 НМ
А 221 нм
А 206 нм
Проводимость
Фракционирование: 1,25 мл/фракция
Пример 5.6. Аналитические эксперименты.
Пример 5.6(а). Высвобождение Ν-связанных олигосахаридов с рекомбинантным полипептидом Νгликозидазой (Яосйе, Реп/Ьегд, Германия).
К 100-120 мкг нативного, окисленного перйодатом или ΗΑ8-модифицированного ΕΡΝ-β^ в 50 мМ №-фосфатного буфера рН 7,2 добавляли 25 мкл рекомбинантного полипептида Ν-гликозидазы (Яосйе, Реп/Ьегд, Германия; 250 ед/250 мкл, партия: 101610420). Реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 12-18 ч и высвобождение Ν-гликозидсвязанных олигосахаридов проверяли с помощью анализа 8Э8-РАСЕ 3-5 мкг белка в восстанавливающих условиях и последующего окрашивания полос белка Си
- 75 014103 ним Кумасси (Саг1 Ко111 СтЬН Карлсруэ, Германия) и детекции специфического сдвига полосы белка ΣΕΝ-бета к положению миграции Ν-дегликозилированной формы.
Пример 5.6(Ь).
Высвобожденные Ν-гликаны отделяли от полипептида добавлением 3 объемов -20°С 100% этанола и инкубацию при -20°С осуществляли в течение по меньшей мере 2 ч. Осажденный белок удаляли центрифугированием при 13000 об/мин в течение 10 мин при 4°С. Осадок центрифугирования затем промывали дважды 500 мкл охлажденного на льду 70% этанола. Олигосахариды в объединенных супернатантах высушивали в вакуумной центрифуге (концентратор 8реей Уас, 8ауап1 Шк^итеШк Мс., США). Образцы гликанов обессоливали, используя картриджи НурегсагЬ (100 или 200 мг) следующим образом: до использования, картриджи промывали три раза 500 мкл 80% (об./об.) ацетонитрила в 0,1% (об./об.) ТФК, с последующими тремя промывками 500 мкл воды. Образцы разбавляли водой до конечного объема по меньшей мере 300 мкл перед загрузкой на картриджи. Их тщательно промывали водой. Олигосахариды элюировали с 1,2 мл 25% ацетонитрила, содержащего 0,1% (об./об.) ТФК. Элюируемые олигосахариды нейтрализовывали с 2М ΝΗ4ОН и высушивали в концентраторе 8реей Уас. Их сохраняли при -20°С в Н2О.
Пример 5.6(с). Умеренный кислотный гидролиз.
Умеренный кислотный гидролиз олигосахаридов (высвобождение сиаловых кислот и НА8модифицированных производных сиаловых кислот из Ν-гликанов) осуществляли следующим образом: аликвоты обессоленных олигосахаридов или НА8-модифицированных олигосахаридов смешивали с тем же самым объемом 10 мМ Н28О4 и инкубировали в течение 90 мин при 80°С. После нейтрализации с 50 мМ №1ОН десиалилированную смесь гликанов высушивали в концентраторе 8реей Уас и доводили до соответствующей концентрации для анализа в НРАЕС-РАЭ (высоко-рН-анионобменная хроматография с импульсным амперометрическим обнаружением). Для последующего анализа МАБГО/ТОЕ Μδ образцов нейтральных олигосахаридов (0,05-1 нмоль) опресняли, используя малые колонки НурегсагЬ, полученные путем добавления 25-40 мкл графитизированного углерода в наконечниках пипетки на 200 мкл.
Пример 5.6(ά). Картирование олигосахарида путем НРАЕС-РАЭ (высоко-рН-анионобменная хроматография с импульсным амперометрическим обнаружением).
Систему ВюЬС (Июпех, 8ипЪууа1е), состоящую из автоматической пипетки А850, тепловой камеры А850, электрохимического детектора ЕИ50, насоса градиента С850, 8оП\гаге СЬготе1еоп СНготаЮдгарНу Мападетеп! 8ук1ет, использовали наряду с разделительной колонкой СагЬоРас РА-100 (4 х 250 мм) и предварительной колонкой СагЬоРас РА-100 (4 х 50 мм). Два различных режима использовались для картирования и для количественной оценки олигосахаридов.
I) Асиало-режим.
Нейтральные олигосахариды были подвергнуты НРАЕС-РАЭ картированию с использованием градиента растворителя А (200 мМ №ОН) и растворителя В (200 мМ №1ОН плюс 600 мМ №1-ацетат) как изображено в следующей таблице.
Таблица. Градиент для картирования нейтральных олигосахаридов
Время [мин] Растворитель А [%] Растворитель В [%]
0 100 0
5 100 0
35 80 20
45 70 30
47 0 100
52 0 100
53 100 0
60 100 0
Скорость потока: 1 мл/мин
- 76 014103
Потенциалы детектора для электрохимического детектора
Таблица. Потенциалы детектора для олигосахаридов
II) Олиго-режим.
Нативные олигосахариды были подвергнуты НРАЕС-РАО картированию с использованием градиента растворителя С (100 мМ №1ОН) и растворителя О (100 мМ №1ОН плюс 600 мМ Nа-ацетат) как изображено в следующей таблице.
Таблица. Картирование градиента нативных (сиалилированных) олигосахаридов
Потенциалы детектора для электрохимического детектора.
Таблица. Потенциалы детектора для олигосахаридов
Определенные пиковые области (пС х мин х нмоль-1) вычисляли, используя факторы ответа, полученные с определенными стандартами олигосахарида (дисиалилированная двухантенная, трисиалилированная трехантенная и тетрасиалилированная четырехантенная структуры, включающие и не включающие Ν-ацетиллактозаминные повторы (ΝίιιιΙζ е! а1., 1993, 8сйгоеГег е! а1., 1999, СгаЬепкогк! е! а1., 1999).
Результаты для НА8-модифицированного ΓΕΝ-β
После ВЭЖХ с обратной фазой в фазе С-18 НА8-модифицированный ^Ν-β был обнаружен во фракциях 32-37, выход НΑ8-ΓΕN-β вычисляли.
Стрелка на фиг. 10 указывает положение миграции немодифицированного ШН-в, по-видимому, вследствие форм, в которых отсутствуют концевые производные сиаловых кислот, тогда как НА8
- 77 014103 модифицированный ΙΡΝ-β был обнаружен в виде широкой диффузной Кумасси-окрашенной области, охватывающей молекулярные массы 35 кДа-120 кДа.
Фракции 32-37 из элюата ВЭЖХ с обратной фазой объединяли и концентрировали в концентратор 8реек Уас после нейтрализации. Как правило, 100-200 мкг аликвот образца ΙΡΝ-β высушивали и растворяли в 50 мМ №1-фосфата рН 7,2 плюс 0,05% Т\тееп-20 и инкубировали с полипептидом Ν-гликозидазой в течение 20-30 ч при 37°С. Полученные олигосахариды были подвергнуты НРАЕС-РАЭ анализу (пример 5.6к) до и после умеренной кислотной обработки.
Как изображено на фиг. 11, материал олигосахарида от НА8-модифицированного ΙΡΝ-β, элюируемый после 52 мин из колонки в условиях, где асиало, моно-, ди- и трисиалилированные были обнаружены в моменты времени 16-20 мин, 21-26 мин, 28-33 мин и 34-38 мин, соответственно. После умеренной кислотной обработки олигосахаридного образца в условиях, в которых достигается полное высвобождение сиаловых кислот, ожидаемый нейтральный сложный тип Ν-гликанов ΙΡΝ-β был обнаружен в профиле НРАЕС-РАЭ, и высвобожденное НА8-производное было обнаружено во времени удерживания 46-49 мин (с использованием градиента Асиало-режима, см. пример 5.6кГ), это указывает, что НА8 присоединен к Ν-связанным олигосахаридам ΙΡΝ-β через кислотную лабильную связь, как и ожидалось (фиг. 13).
Пример 6. Дальнейшая характеристика конъюгатов АТ ΙΙΙ.
Пример 6.1 Человеческий АТ ΙΙΙ.
Используемым АТ ΙΙΙ был рекомбинантный человеческий АТ ΙΙΙ (АТгуп® от ОТС ВюШетареийск).
Пример 6.2. Перйодатное окисление остатков Ν-Ацетилнейраминовой кислоты умеренной обработкой перйодатом АТ ΙΙΙ.
Окисление перйодатом осуществляли, по существу, как описано для ΙΡΝ-бета в примере 5.2.
Пример 6.3. Буферный обмен окисленного перйодатом АТ ΙΙΙ для последующего НЕ8 илирования. Буферный обмен осуществляли, по существу, как описано для ΙΡΝ-бета в примере 5.3.
Пример 6.4. Синтез конъюгатов НА8 и АТ ΙΙΙ.
Синтез осуществляли, как описано выше в примере 4.3.
Пример 6.5 Ионообменная хроматография АТ ΙΙΙ для отделения НА8-модифицированного АТ ΙΙΙ от избытка НА8-реактива.
7.5.1. Буферный обмен образцов антитромбина ΙΙΙ для последующей очистки ионообменной хроматографией осуществляли, используя концентраторы УКакрт (10000 МА СО РЕ8, кат. номер Ушакшепсе. У80602, номер партии 03У80633). Образцы из реакций НА8-модификации (2 мг АТ ΙΙΙ в 1, 6 мл) разбавляли до 5 мл буфером А (20 мМ Ν-морфолинопропансульфокислота, рН 8,0, установленный с №ОН, МОР8). Образцы концентрировали согласно рекомендациям изготовителя приблизительно до 0,4-0,6 мл и стадию разбавления/концентрации повторяли дважды. Наконец, образцы белка вымывали из концентратора.
7.5.2. Очистку образца АТ ΙΙΙ осуществляли при температуре окружающей среды, используя систему АКТА ехр1огег 10 (Атегкйат Р1агтас1а Вю1ес1), состоящую из насоса Р-903, мешалки М-925, с камерой на 0,6 мл, монитора УФ-900 наряду с проточной кюветой на 10 мм, монитора рН/С-900, пробоотборного насоса Р-950 и пробоотборной петлей на 5 мл. Система АКТА управлялась 8ой^ате ишсотп Уеткюп 3,21. Инкубационную смесь в буфере (20 мМ МОР8, рН 8,0) подавали при объемной скорости потока 0,6 мл/мин на колонку, содержащую 2 мл 0-8ер11агоке Ρакΐ Е1о\у (Атегкйат, код 17-0510-01, партия 254665) столбец (Атегкйат Вюкаепсек С10/10) уравновешенную с 6 СУ буфера А, при объемной скорости потока 1 мл/мин. Колонку промывали с 6 СУ буфера А при объемной скорости потока 0,8 мл/мин, и элюирование осуществляли при использовании 4 СУ буфера В (0,5 М №1С1 в 20 мМ Ш-фосфата, рН 6,5) при объемной скорости потока 0,6 мл/мин. Колонку регенерировали при использовании 4 СУ буфера С (1,5 М №1С1 в 20 мМ ^-фосфата, рН 6,5) при объемной скорости потока 0,6 мл/мин и повторно уравновешивали с буфером А. Белок АТ ΙΙΙ элюировали из колонки в объеме приблизительно 4 мл.
Способ
Объем Стадия Буфер Скорость потока.
1 εν Уравновешивание 100% буфера А 1,0 мл/мин
Начало фракционирования 100% буфера А 1,0 мл/мин
10 мл Загрузка образца Образец в буфере А 0,б мл/мин
6 СУ Вымывание несвязанного образца 100% буфера А 0,8 мл/мин
4 СУ Элюиро ва ние 100% буфера В 0,6 мл/мин
4 СУ Регенерация (Элюирование 2) 100% буфера С 0,6 мл/мин
Остановка фракционирования 10 0 % буфера С 0,6 мл/мин
5 СУ Повторное уравновешивание 100% буфера А 1,0 мл/мин
- 78 014103
Буфер А. 20 мМ МОР8/№ОН рН 8,0; Буфер В: 20 мМ БТа-фосфат, 0,5 М №01, рН 6,5; Буфер С: 20 мМ Ма-фосфат, 1,5 М ШСк рН 6,5. Элюирование белка детектировали при А280 нм и собирали 1 мл фракций.
Пример 6.6. Аналитические эксперименты.
Пример 6.6(а). Высвобождение Ν-гликанов из немодифицированного, окисленного перйодатом и НА8-модифицированого образцов АТ III осуществляли с использованием рекомбинанта.
300-600 мкг образцов АТ III восстанавливали в присутствии 5 мМ дитиоэритрита в течение 10 мин при 90°С при рН 8,1 в присутствии 0,6% 8Ό8, после чего добавляли № 40 до конечной концентрации 0,6%. К 0,3-0,6 мг нативных, окисленных перйодатом или НА8-модифицированных АТ III в 50 мМ Νιфосфатного буфера рН 7,2 добавляли 40 мкл рекомбинантного полипептида Ν-гликозидазы (Восйе, Ре^Ьегд, Германия; 250 ед/250 мкл; партия: 101610420). Реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 12-18 ч и высвобождение Ν-гликозидно связанных олигосахаридов проверяли анализом 8Ό8РАСЕ 5-10 мкг белка в восстанавливающих условиях и последующим окрашиванием полос белка Синим Кумасси (Саг1 ВоШ СтЬН Карлсруэ, Германия), и обнаружением специфического сдвига белка АТ III к положению миграции Ν-дегликозилированной формы белка.
Пример 6.6(Ь).
Высвобожденные Ν-гликаны отделяли от полипептида добавлением 3 объемов -20°С 100% этанола и инкубировали при -20°С в течение по меньшей мере 2 ч. Осажденный белок удаляли центрифугированием при 13 000 об/мин в течение 10 мин при 4°С. Осадок после центрифугирования промывали дважды 500 мкл охлажденного на льду 70% этанола. Олигосахариды в объединенных супернатантах высушивали в вакуумной центрифуге (концентратор 8рееб Vас, 8ауаи1 Iикΐ^итеиΐк Шс, США). Образцы гликанов обессоливали, используя картриджи НурегсагЬ (100 или 200 мг) следующим образом: до использования картриджи промывали три раза 500 мкл 80% (об./об.) ацетонитрила в 0,1% (об./об.) ТФК, с последующим трехкратным промыванием 500 мкл воды. Образцы разбавляли водой до конечного объема по меньшей мере 300 мкл перед загрузкой на картриджи. Их тщательно промывали водой. Олигосахариды элюировали с 1,2 мл 25% ацетонитрила, содержащего 0,1% (об./об.) ТФК. Элюируемые олигосахариды нейтрализовывали с 2М НН4ОН и высушивали в концентраторе 8рееб Vас. Их сохраняли при -20°С в Н2О.
Пример 6.6(с). Умеренный кислотный гидролиз.
Умеренный кислотный гидролиз олигосахаридов (высвобождение сиаловых кислот и НА8модифицированных производных сиаловых кислот из Ν-гликанов) осуществляли следующим образом: аликвоты обессоленных олигосахаридов или НА8-модифицированных олигосахаридов смешивали с тем же самым объемом 10 мМ Н28О4 и инкубировали в течение 90 мин при 80°С. После нейтрализации с 50 мМ №ЮН смесь десиалилированных гликанов высушивали в концентраторе 8рееб Vас и доводили до соответствующей концентрации для анализа в НРАЕС-РАЭ (высокий-рН-анионобменная хроматография с импульсным амперометрическим обнаружением). Для последующего анализа МАБШ/ТОР М8 образцов нейтральных олигосахаридов (0,05-1 нмоль) обессоливали, используя малые колонки НурегсагЬ, полученные путем добавления 25-40 мкл графитизированного углерода в 200 мкл наконечниках пипетки.
Пример 6.6(6). Картирование олигосахарида НРАЕС-РАЭ (высокий-рН-анионобменная хроматография с импульсным амперометрическим обнаружением).
Систему ВюЬС, (Июиех, Саннивейл), состоящую из автоматической пипетки А850, тепловой камеры А850, электрохимического детектора ЕИ50, насоса градиента С850, 8оП\гаге С1готе1еои СйготаЮдгарйу Маиадетеи! 8ук1ет; использовали наряду с разделительными колонками СагЬоРас РА-100 (4 х 250 мм) и предварительными колоками СагЬоРас РА-100 (4 х 50 мм). Два различных режима использовали для картирования и для количественной оценки олигосахаридов.
I) Асиало-режим.
Нейтральные олигосахариды были подвергнуты НРАЕС-РАЭ картированию с использованием градиента растворителя А (200 мМ №ЮН) и растворителя В (200 мМ КаОН плюс 600 мМ Ка-ацетата), как изображено в следующей таблице.
Таблица. Градиент картирования из нейтральных олигосахаридов
- 79 014103
Потенциалы детектора для электрохимического детектора.
Таблица. Потенциалы детектора для олигосахаридов
Нативные олигосахариды были подвергнуты картированию НРАЕС-РАО с использованием градиента растворителя С (100 мМ №1ОН) и растворителя О (100 мМ №1ОН плюс 600 мМ Nа-ацетата), как изображено в следующей таблице.
Таблица. Картирование градиента нативных (сиалилированных) олигосахаридов
Потенциалы детектора для электрохимического детектора.
Таблица. Потенциалы детектора для олигосахаридов
Специфические пиковые области (пС х мин х нмоль-1) вычисляли, используя факторы ответа, полученные с определенными стандартами олигосахаридов (дисиалилированная двухантенная, трисиалилированная трехантенная и тетрасиалилированная четырехантенная структуры, включающие и не включающие Ν-ацетиллактозаминные повторы (Νίιιι!ζ е! а1., 1993, 8сйгоеГег е! а1., 1999, СгаЬепкогк! е! а1., 1999)).
Результаты
НА8 модификация АТ III приводит к значительному сдвигу молекулярных масс в 8О8-РАСЕ, указывающему на ковалентное присоединение НА8 к белку (см. фиг. 12А).
Ионообменной хроматографией АТ III, подвергнутого НА8-модификации, получали фракцию АТ III (> 85% выход на основании сравнения с необработанным АТ III).
Ν-дегликозилирование необработанного АТ III, обработанного перйодатом АТ III и НА8модифицированного АТ III в результате анионного обмена на Р-сефарозе, приводит к сопоставимому сдвигу молекулярной массы в 8О8-РАСЕ как изображено на фиг. 12В.
Освобожденные Ν-гликаны образцов АТ III выделяли путем адсорбции на и элюирования из картриджей НурегсагЬ и подвергнуты анализу НРАЕС-РАО. Нативные Ν-гликаны из НА8
- 80 014103 модифицированного АТ III показывают наличие всех пиков нейтральных олигосахаридов, обнаруживаемых в контрольных образцах (см. линию 1 на фиг. 13). После умеренной кислотной обработки, все три препарата Ν-гликанов показали очень близкую структуру нейтральных олигосахаридов, что указывает кислотную лабильную природу НА8-модификации, которая является совместимой с НА8-модификацией в производных сиаловых кислот олигосахаридов (см. фиг. 14). Сходство десиалилированных структур подтверждали анализом МАЙШ/ТОЕ (данные не показаны).
Пример 7. Дальнейшая характеристика конъюгатов ОМ-С8Е.
Пример 7.1. Описание ОМ-С8Е.
Человеческий рекомбинантный ОМ-С8Е получали после экспрессии в клетках СНО К1 по существу как описано Еогпо е! а1., 2004, (ОшЛегтпа Еогпо, Мапе1а Во11ай Еодойп, Магсок Оддего, Вюагбо КгаТ_)е, Маппа ЕТс^етдагау, Нага1б 8. СопгабТ, МапГгеб ΝίιηΙζ (2004) Ν- апб О-11пкеб сагЬойубгаТек апб д1усоку1айоп кйе оссирапсу ш гесотЬтагИ йитап Огапи1осуТе-Масгорйаде Со1опу-8Т1ти1айпд ГасЮг кесгеТеб Ьу а СЫпеке йатк!ег огагу се11 1те; Еиг б Вюсйет, 271 (5), 907-919), и имеет описанные там структуры углеводов.
Рекомбинантный ОМ-С8Е может также быть очищен обычными хроматографическими стадиями, например, как описано в: ОкатоТо, М., №1кай М., №1сауата, С., Уапад1, Н., МаТкш, Н., №дисЫ, Н., №1ткг М., 8ака1, I., КабоТа, К., Рикш, М. & Нага, Н. (1991) РигШсайоп апб сйа^асТе^^ζайοη оГ !йгее Гогтк оГ б1ГГегеп(1у д1усоку1аТеб гесотЬтагИ йитап Огапц1осуТе-Масгорйаде Со1опу-8йти1айпд ЕасТог. АгсйАек оГ ВюсйетШгу апб Вюрйукюк 286, 562-568.
Аминокислотная последовательность человеческого ОМ-С8Р, используемого в этом исследовании:
1АРА В8Р8Р8ТрР№, Е11\’ХАЮЕАВ ВЕЕХЕ81ЮТА АЕМЖТУЕЩ 8ЕМЕОЕОЕРТ СРОТВРЕРУК О6РВ68РУКР КОРБТММА8Н УКР)11СРРТРЕ ТЗСАТрПТЕ Е8РКЕХРК16Р ЬЬЩРРПС^^рЕш (согласно ссылке Еогпо еТ а1., см. выше).
Пример 7.2. Окисление перйодатом остатков Ν-ацетилнейраминовой кислоты умеренной обработкой перйодатом рекомбинантного ОМ-С8Е.
К 0,80 мг/мл раствора ОМ-С8Е в 0,1М №1-ацетата рН 5,5, сохраняемого при 0°С, добавляли ледяной раствор 10 мМ натрий-мета-перйодата, получая конечную концентрацию 1мМ натрий-мета-перйодата. Смесь инкубировали при 0°С в течение 1 ч в ванне со льдом в темноте и реакцию завершали добавлением 20 мкл глицерина и инкубировали еще в течение 5 мин.
Пример 7.3 Буферный обмен окисленного перйодатом 6М-С8Е для последующей НА8модификации.
Буферный обмен осуществляли, используя 5 мл концентратор V^νакр^η 6 (ХАакрт АО, Ганновер, Германия) с полиэфирсульфоновой (РЕ8) мембраной. Единицу концентратора промывали добавлением 5 мл 0,1М №-ацетатного буфера рН 5,5 и центрифугированием единицы концентратора при 4000 об./мин при 6°С в МедаГиде 1,0В (Кепбго ЬаЬогаТогу ЕдшртепТ, ОкТегобе, Германия). Затем в единицу концентратора добавляли 1-5 мл окисленного перйодатом раствора ОМ-С8Е и центрифугировали при 4000 об./мин в течение 25 мин до достижения 5-кратной концентрации. К концентрату добавляли 4 мл 0,1 М Νιацетатного буфера рН 5,5, и концентрат центрифугировали как описано выше. Цикл центрифугирования повторяли трижды, полученный концентрат удаляли и переносили в пластиковую ампулу на 2,0 мл, после промывания единицы концентратора 2 раза с использованием каждый раз 150 мкл №-ацетатного буфера рН 5,5; объем белка доводили с помощью №-ацетатного буфера до рН 5,5.
Пример 7.4. Синтез конъюгатов НА8 и ОМ-С8Е.
Синтез осуществляли, как описано выше в примере 4.4.
Пример 7.5. Очистка ОМ-С8Е после НА8-модификации.
Отделение НА8-модифицированного ОМ-С8Е от избытка активированных производных НЕ8 от инкубаций окисленного перйодатом белка с гидроксиламино-НЕ810/0.7.
Резюме. Разгон осуществляли при комнатной температуре, используя оборудование АКТА ехр1огег 10 и объемную скорость потока 25 мл/мин. Аликвоты инкубационных смесей с 400 мкг ΓΕΝ-β наносили на С18-фазовую колонку 250 мм х 10 мм, уравновешенную с 1,25 Ον 11% элюента В (0,1% ТФК, 90% ацетонитрила) и 89% элюента А (0,1% ТФК). Вводили образцы (приблизительно 1,25 мл), и пробоотборную петлю промывали 11 мл 11% элюента В. После промывания колонки 0,2 ϋν 11% элюента В использрвали градиент от 11 до 90% элюента В более 2 С^. Элюирование колонки было продолжено при использовании 0,8 Πν 90% элюента В, и наконец колонку повторно уравновешивали с 1,0 СV 11% элюента В.
Белок ОМ-С8Е, элюируемый в объеме 7,5 мл при концентрации% элюента В. Выход белка составил 60% (НЕ8 ОМ-С8Е) в расчете на стандартный препарат ОМ-С8Е, который разгоняли на колонке при использовании того же самого градиента.
Материалы и методы для примера 7.5.
Оборудование и материалы.
Оборудование. АКТА ехр1огег 10 (Атегкйат Рйагтааа ВюТесй), с: насосом Р-903;
- 81 014103 мешалкой М-925, с камерой на 0,6 мл;
монитором УФ-900, с проточной кюветой на 10 мм;
монитором рН/С-900;
фракционным коллектором Ргас-900;
пробоотборной петлей 2 мл;
8ой^аге Ишсогп Vе^8^οп 3,21;
Колонка: 250 мм х 10 мм, Масйегеу-№§е1 250-1/2-10 №с1ео811 7 С18, Кат. номер 715002, партия ромер 4020854;
объем колонки: 20 мл;
объемная скорость потока: 1,25 мл/мин;
растворитель А: 0,1% ТФК в ВЭЖХ-воде;
растворитель В: 90% ацетонитрил, 0,1% ТФК в воде для ВЭЖХ.
Способ разгона в ВЭЖХ с обратной фазой по примеру 7.5
Объем Стадия Растворитель А Растворитель В
0,25 СТ Уравновешивание 89% 11%
11 мл Впрыск образца 89% 11%
Фракционирование 89% 11%
0,20 СТ Вымывание несвязанного образца 89% 11%
2,00 СТ Линейный градиент 89-10% 11-90%
0,80 СТ Изократический градиент 10% 90%
Конец фракционирования 10% 90%
1, 00 СТ Повторное уравновешивание 89% 11%
Детекция: 280 нм; 221 нм; 206 нм.
Проводимость:
объем фракции: 1,25 мл/фракция.
Результаты примера 7.5
Отделение в ВЭЖХ с обратной фазой СМ-С8Р (пример 7.5) от избытка НА8(10 кДа)-производного приводит к фракциям 26-32, которые содержат весь НА8-модифицированный СМ-С8Р, элюированный из колонки. Структура 808-РАСЕ белка после НА8-модификации показывает широкую диффузную полосу в области молекулярной массы между 35-90 кДа, тогда как немодифицированный СМ-С8Р показывает структуру негликозилированных, моно-№гликозилированных и ди^-гликозилированных форм (фиг. 17, см. Рогпо е1 а1., 2004).
Пример 7.6. Аналитические эксперименты.
a) Высвобождение Ν-связанных олигосахаридов с рекомбинантным полипептидом Ν-гликозидазой.
К 200 мкг-1 мг нативного, окисленного перйодатом или НА8-модифицированного СМ-С8Р в 50 мМ №-фосфатного буфера рН 7,2 добавляли 25 мкл рекомбинантного полипептида Ν-гликозидазы (Коске, Реп/Ьег^, Германия; 250 единиц/250 мкл партия: 101610420). Реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 12-18 ч и высвобождение Ν-гликозидно связанных олигосахаридов проверяли 808-РАСЕ анализом 5-10 мкг белка в восстанавливающих условиях и последующим окрашиванием полос белка Синим Кумасси (Саг1 КоШ СтЬН Карлсруэ, Германия) и детекцией сдвига полосы белка СМ-С8Р к положению миграции Ν-дегликозилированный формы белка (см. фиг. 15).
b) Выделение и обессоливание раствора ферментативно высвобожденных Ν-гликанов и НА8модифицированных Ν-гликанов.
Высвобожденные Ν-гликаны отделяли от полипептида добавлением 3 объемов холодного 100% этанола и инкубацией при -20°С в течение по меньшей мере 2 ч. Осажденный белок удаляли центрифугированием при 13000 об./мин в течение 10 мин при 4°С. Осадок после центрифугирования промывали дважды по 500 мкл охлажденного на льду 70% этанола. Олигосахариды в объединенных супернатантах высушивали в вакуумной центрифуге (Концентратор 8рееБ Vас, 8аνаηΐ [п51гитеп18 Ыс, США). Образцы гликанов обессоливали, используя картриджи НурегсагЬ (100 или 200 мг) следующим образом: до использования картриджи промывали три раза по 500 мкл 80% (об./об.) ацетонитрила в 0,1 (об./об.) ТФК, с последующим тремя промывками по 500 мкл воды. Образцы разбавляли водой до конечного объема по меньшей мере 300 мкл перед загрузкой на картриджи. Их тщательно промывали водой (83 объема картриджа). Олигосахариды элюировали с 1,2 мл 25% ацетонитрила, содержащего 0,1% (об./об.) ТФК. Элюируемые олигосахариды нейтрализовывали с 2М NН4ОН и высушивали в концентраторе 8рееБ Vас. Их сохраняли при -20°С в Н2О до дальнейшего использования.
- 82 014103
с) Умеренный кислотный гидролиз олигосахаридов (удаление сиаловых кислот и НА8модифицированных производных сиаловых кислот из олигосахаридов).
Аликвоты опресненных олигосахаридов смешивали с равным объемом 10 мМ Н28О4 и инкубировали в течение 90 мин при 80°С. После нейтрализации с 50 мМ №ОН десиалилированные гликаны высушивали в 8рееб Уас и доводили до соответствующей концентрации для анализа в НРАЕС-РАЭ (высокий-рН-анионобменная хроматография с импульсным амперометрическим обнаружением). Для анализа ΜА^^I/ТΟΕ-Μ8 нейтральные Ν-гликаны обессоливали, используя наконечники пипеток, содержащие 20-30 мкл материала НурегсагЬ для адсорбции, промывали и элюировали с 25% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте в Н2О.
б) Картирование олигосахаридов путем НРАЕС-РАЭ (высокий-рН-анионобменная хроматография с импульсным амперометрическим обнаружением).
Картирование и количественную оценку олигосахаридов осуществляли, по существу, как описано в примере 6.6.б).
Результаты
Очищенный ВЭЖХ с обратной фазой материал из примера 7.5, использовали, чтобы продемонстрировать модификацию белка с НА8-производными по его углеводной цепи через окисленные сиаловые кислоты. Композиционный анализ моносахаридов газовым хроматографическим анализом их триметилсиалилированных производных показывает наличие глюкозы и моно- и дигидроксиэтилированных производных глюкозы, а также маннозы, галактозы и Ν-ацетилглюкозамина и малые количества Νацетилгалактозамина.
Анализ НРАЕС-РАЭ нативных олигосахаридов, высвобожденных из НА8-модифицированного СМ-С8Е, демонстрирует пик, соответствующий НА8-модификации олигосахаридов комплексного типа (см. фиг. 16).
После умеренной кислотной обработки нейтральные Ν-гликаны СМ-С8Е были обнаружены в образце НА8-модифицированного белка, и также элюирование НА8-модифицированного производного в момент времени 47-49 мин.
Пример 8. Синтез АТ Ш-конъюгатов.
Пример 8.1 Синтез гидроксиламино-НЕ8 производных.
Пример 8.1(а) Синтез гидроксиламино НЕ810/0.
0,8 г НЕ810/0.4 (М^ = 10000 Да, Ό8=0,4, 8иргато1 Ратеп1ега1 Со11о1бк СтЬН, ΚоκЬасЬ-ΚобЬе^т, Ό) растворяли в 8 мл 0,1М ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,5, и добавляли 8 ммоль О-[2-(2аминооксиэтокси)этил]гидроксиламина. После взбалтывания в течение 19 ч при 22°С, реакционную смесь добавляли к 40 мл 2-пропанола при -20°С. Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 50 мл воды, диализировали в течение 45 ч против воды (8паке8кт б1а1уЕк ШЬтд, отсечка 3,5 кДа, РетЬю 8с1епсек ЭеШксЫапб СтЬН, Бонн, Ό) и лиофилизировали. Выход продукта составил 73%.
Молекулярная масса НЕ810/0.4 при измерении с ЬАЬЬ8-СРС составила 8500 Да и Ό8 составила 0,41.
Пример 8.1(Ь). Синтез гидроксиламино НЕ810/0.7.
1,06 г НЕ810/0.7 (М\У = 10000 Да, Ό8 = 0,7, 8иргато1 Ратеп1ега1 Со11о1бк СтЬН, ΚоκЬасЬ-ΚобЬе^т, Ό) растворяли в 10 мл 0,1М ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,5, и добавляли 10,9 ммоль О-[2-(2аминооксиэтокси)этил]гидроксиламина. После взбалтывания в течение 19 ч при 22°С, реакционную смесь добавляли к 40 мл 2-пропанола при -20°С.
Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 50 мл воды, диализировали в течение 45 ч против воды (8паке8кт б1а1ук1к ШЬтд, отсечка 3,5 кДа, РетЬю 8с1епсек ЭеШксЫапб СтЬН, Бонн, Ό) и лиофилизировали. Выход продукта составил 60%.
Молекулярная масса НЕ810/0.7 при измерении с ЬАЬЬ8-СРС составила 10500 Да и Ό8 составила 0,76.
Пример 8.1(с). Синтез гидроксиламино НЕ830/0.4.
г НЕ830/0.4 (М^ = 30000 Да, Ό8 0,4, 8иргато1 Рагеп1ета1 Со11о1бк СтЬН, ΚоκЬасЬ-ΚобЬе^т, Ό) растворяли в 18 мл 0,1М ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,5, и добавляли 6,67 ммоль О-[2-(2аминооксиэтокси)этил]гидроксиламина.
После взбалтывания в течение 15,5 ч при 22°С реакционную смесь добавляли к 80 мл 2-пропанола при -20°С. Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 50 мл воды, диализировали в течение 45 ч против воды (8паке8кш б1а1ук1к 1иЬшд, отсечка 3,5 кДа, РетЬю 8с1епсек ЭеШксЫапб СтЬН, Бонн, Ό) и лиофилизировали. Выход продукта составил 83%.
Молекулярная масса НЕ830/0.4 при измерении с ЬАЬЬ8-СРС составила 33000 Да и Ό8 составила 0,41.
Пример 8.1(б). Синтез гидроксиламино НЕ830/0.7.
г НЕ830/0.7 (М^ = 30000 Да, Ό8 0,7, 8иргато1 Рагеп1ета1 Со11о1бк СтЬН, ΚоκЬасЬ-ΚобЬе^т, Ό) растворяли в 18 мл 0,1М ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,5, и добавляли 6,67 ммоль О-[2-(2аминооксиэтокси)этил]гидроксиламина.
- 83 014103
После взбалтывания в течение 15 ч при 22°С, реакционную смесь добавляли к 80 мл 2-пропанола при -20°С. Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 50 мл воды, диализировали в течение 45 ч против воды (8паке8кш Ыа1у818 ЫЪшд, отсечка 3,5 кДа, РегЫо 8с1епсе8 Оеи15с111ап1 СтЬИ Бонн, Ό) и лиофилизировали. Выход продукта составил 86%.
Молекулярная масса ΗΕ830/0.7 при измерении с ЬАЬЬ8-СРС составила 31000 Да и Ό8 составила 0,76.
Пример 8.1(е). Синтез гидроксиламино ΗΕ850/0.4 г ΗΕ850/0.4 (МА = 50000 Да, Ό8 = 0,4, 8иргато1 Рагеп1ега1 Со11о1Й8 СтЬИ, Яо8ЬасЫЯо1йе1т, Ό) растворяли в 20 мл 0,1М ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,5, и добавляли 4 ммоль Ο-[2-(2аминооксиэтокси)этил]гидроксиламина. После взбалтывания в течение 19,5 ч при 22°С, реакционную смесь добавляли к 80 мл 2-пропанола при -20°С. Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 50 мл воды, диализировали в течение 45 ч против воды (8паке8кт Ыа1у818 ЫЪтд, отсечка 3,5 кДа, РегЫо 8аепсез ПеиГзсЫап! СтЬИ Бонн, Ό) и лиофилизировали. Выход продукта составил 94%.
Молекулярная масса ΗΕ850/0.4 при измерении с ЬАЬЬ8-СРС составила 56000 Да, и Ό8 составила 0,41.
Пример 8.1(ί). Синтез гидроксиламино ΗΕ850/0.7.
2,5 г ΗΕ850/0.7 (МА = 50000 Д, Ό8 = 0,7, 8иргато1 Рагеп1ега1 Со11оЫ8 СтЬИ Яо8ЬасЫЯо1йе1т, Ό) растворяли в 25 мл 0,1М ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,5, и добавляли 5 ммоль О-[2-(2аминооксиэтокси)этил]гидроксиламина. После взбалтывания в течение 19,5 ч при 22°С реакционную смесь добавляли к 80 мл 2-пропанола при -20°С. Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 50 мл воды, диализировали в течение 45 ч против воды (8паке8кт Ыа1у818 ЫЪтд, отсечка 3,5 кДа, РегЫо 8Ыепсе8 Оеи18сЫап4 СтЬИ Бонн, Ό) и лиофилизировали. Выход продукта составил 85%.
Молекулярная масса ΗΕ850/0.7 при измерении с ЬАЬЬ8-СРС составила 47000 Да, и Ό8 составила 0,76.
Пример 8.1(д). Синтез гидроксиламино ΗΕ810/0,7.
г ΗΕ810/0,7 (МА = 10000 Да, Ό8 = 0,7, 8иргато1 Рагеп1ега1 Со11оЫ8 СтЬИ Яо8ЬасЫЯо1йе1т, Ό) растворяли в 18 мл 0,1М ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,2, и добавляли 20 ммоль Ο-[2-(2аминооксиэтокси)этил]гидроксиламина. После взбалтывания в течение 19 ч при 22°С, реакционную смесь добавляли к 100 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола (об./об.). Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 50 мл воды, диализировали в течение 21 ч против воды (8паке8кт Ыа1у818 ЫЫпд, отсечка 3,5 кДа, РегЫо 8Ыепсе8 Пеи18сЫап! СтЬИ Бонн, Ό) и лиофилизировали. Выход продукта не определяли.
Молекулярная масса ΗΕ810/0.7 при измерении с ЬАЬЬ8-СРС составила 10500 Да и Ό8 составила 0,76.
Пример 8.2. Синтез производных альдегид-ΗΕ8.
Пример 8.2(а). Синтез амино ΗΕ810/0.7.
6,02 г оксо-ΗΕ810/0.7 (МА = 10000 Да, Ό8 = 0,7, 8иргато1 Рагеп1ега1 Со11оЫ8 СтЬИ Яо8ЬасйЯо1йе1т, Д, полученного согласно ΌΕ 19628705 А1), растворяли в атмосфере азота в сухом диметилсульфоксиде (32 мл) (Р1ика, 8щта-А1<1пс11 СИение СтЬИ Таи1к1гсйеп, Ό) и добавляли 6,03 мл 1,4диаминобутан. После перемешивания при 40°С в течение 17 ч реакционную смесь добавляли к 150 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола (об./об.). Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали 40 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола (об./об.) и собирали центрифугированием. Сырой продукт растворяли в 80 мл воды, диализировали в течение 4 дней против воды (8паке8кт Ыа1у818 ЫЫпд, отсечка 3,5 кДа, РегЫо 8Ыепсе8 Оеи18сЫап4 СтЬИ Бонн, Ό) и лиофилизировали. Выход продукта составил 52%.
Молекулярная масса ΗΕ810/0.7 при измерении с ЬАЬЬ8-СРС составила 15000 Да и Ό8 составила 0,76.
Пример 8.2(Ь). Синтез альдегид ΗΕ810/0.7.
150 мг 4-формилбензойной кислоты и 230 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба АИпсй, 81дтаАИпсй СИение СтЬИ Таи£к1гсйеи, Ό) растворяли в 10 мл Ν,Ν-диметилформамида (для пептидного синтеза, Вю8о1уе, Vа1кеη8\νаа^ά. ΝΕ) и добавляли 204 мкл Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимида (Р1ика, 81дтаАИпсй Скепие СтЬИ ТаиΠс^^с11еη. Ό). После инкубации при 21°С в течение 30 мин, добавляли 1 г амино ΗΕ810/0.7 (синтезируемого, как описано в 9,2 (а)). После взбалтывания в течение 19 ч при 22°С, реакционную смесь добавляли к 84 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола (1:1) (об./об.). Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 50 мл воды, диализировали в течение 2 дней против воды (8паке8кт Ыа1у818 ЫЪтд, отсечка 3,5 кДа, РегЫо 8аепсе8 ^еиΐ8сЫаиά СтЬИ Бонн, Ό) и лиофилизировали. Выход продукта составил 83%.
Пример 8.2(с). Синтез амино ΗΕ850/0.7.
6,09 г оксо-ΗΕ850/0.7 (МА = 50000 Да, Ό8 = 0,7, 8иргато1 Рагеп1ега1 Со11оЫ8 СтЬИ Яо8ЬасйЯо1йе1т, Ό, получаемого согласно ΌΕ 19826705 А1 с адаптацией молярных отношений ингредиентов)
- 84 014103 растворяли в атмосфере азота в 32 мл сухого диметилсульфоксида (Ийка, 8щта-А16пс11 СИение СтЬН, ТаиΠс^^с11еη. Ό), и добавляли 1,22 мл 1,4-диаминобутана. После перемешивания при 40°С в течение 17 ч реакционную смесь добавляли к 150 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола (1:1) (об./об.). Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали 40 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола (1:1) (об./об.) и собирали центрифугированием. Сырой продукт растворяли в 80 мл воды, диализировали в течение 4 дней против воды (8иаке8к^и 61а1уз1з !иЬтд, отсечка 3,5 кДа, РегЬю 8с1епсез ^еи!зсЫаи6 СтЬН, Бонн, Ό) и лиофилизировали. Выход продукта составил 67%.
Молекулярная масса НЕ850/0.7 при измерении с ЬАЬЬ8-6РС составила 57000 Да и Ό8 составила 0,76.
Пример 8.2(6). Синтез альдегид НЕ850/0.7.
124 мг 4-формилбензойной кислоты и 174 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба А16пск 81дтаА16пс11 СНеипе СтЬН, Таиίк^^сйеи, Ό) растворяли в 38 мл Ν,Ν-диметилформамида (для пептидного синтеза, Вюзоке, Vа1кеиз^аа^6, ΝΕ) и добавляли 155 мкл Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимида (Е1ика, 81дтаА16пс11 СНеипе СтЬН, Таиίк^^сйеи, Ό). После инкубации при 21°С в течение 30 мин добавляли 3,8 г амино НЕ850/0.7 (синтезируемого, как описано в 8,2 (с)). После взбалтывания в течение 19 ч при 22°С, реакционную смесь добавляли к 160 мл охлажденной на льду смеси 1:1 ацетона и этанола (об./об.). Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 20 мл Ν,Νдиметилформамида и осаждали с 80 мл охлажденной на льду смеси (1:1) ацетона и этанола (об./об.), как описано выше. После центрифугирования осадок растворяли в 50 мл воды, диализировали в течение 2 дней против воды (8иаке8к^и 61а1уз1з !иЬтд, отсечка 3,5 кДа, РегЬю 8с1епсез ^еи!зсЫаи6 СтЬН, Бонн, Ό) и лиофилизировали. Выход продукта составил 77%.
Пример 8.3. Синтез АТ Ш-конъюгатов с использованием стратегии гликанов.
Пример 8.3(а). Реакция окисленного АТ III с продуктами реакции примеров 9.1(а)-9.1(д).
К 685 мкл раствора окисленного АТ III в 0,1М ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,5 (С1усоТйега, В52 рец-ох 8ТМ 412-366, 4,375 мг/мл, см. пример 2.2), добавляли 814 мкл 0,1М ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,5, и 1,5 мл раствора НЕ8-производного в 0,1М ацетате натрия в качестве буфера, рН 5,5, и раствор инкубировали в течение 26 ч при 22°С.
Использовали следующие конечные концентрации НЕ8:
0,46 мг/мл для производных НЕ8, полученных согласно примеру 9.1(а) и 9.1(Ь);
1,38 мг/мл для производных НЕ8, полученных согласно примеру 9.1(с) и 9.1(6);
9,1 мг/мл для производного НЕ8, полученного согласно примеру 9.1(е);
10,5 мг/мл для производного НЕ8, полученного согласно примеру 9.1(£);
17,25 мг/мл для производного НЕ8, полученного согласно примеру 9.1(д);
мг/мл НЕ850/0.7 (8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о16з СтЬН, КозЬасй-Ко6йе1т, Ό) в качестве контроля реакции. Молекулярная масса НЕ850/0,7 при измерении с ЬАЕЬ8-СРС составила 47000 Д, и Ό8 составила 0,76.
Соответствующую реакционную смесь анализировали гель-электрофорезом (см. фиг. 17).
Пример 8.4. Синтез АТ Ш-конъюгатов восстановительным аминированием.
Пример 8.4(а). Буферный обмен.
АТШ (А!гуп, СТС ВюШегареибсз, Егаттдйат, МА, США) растворяли в 10 мл воды, чтобы получить раствор 25 мг/мл АТ III в 5 мМ цитрата натрия, 67 мМ глицина и 68 мМ хлорида натрия, рН 7,0, 1 мл этого раствора разбавляли 0,1М холодного ацетата натрия в качестве буфера, рН 5,0, концентрировали диафильтрацией при 4°С до 4 мл с концентратором ^уазрт 20 мл (ν82001, 10КД М^СО, мембрана РЕ8, ^уазаепсе АС, Ганновер, Ό) и повторно разбавляли до 20 мл с буфером. Эту диафильтрацию повторяли дважды. Конечная концентрация на последней стадии диафильтрация составила 3 мг/мл.
Пример 8.4(Ь). Реакция АТ III с продуктами реакции примера 8.2(Ь) и 8.2(6).
К 1 мл раствора АТ III, после буферного обмена в 0,1М ацетата натрия в качестве буфера рН 5,0 добавляли 1 мл раствора НЕ8-производного в 0,1М ацетате натрия в качестве буфера, рН 5,0 и 1 мл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия в том же самом буфере, и раствор инкубировали в течение 15,5 ч при 4°С. Все растворы были охлаждены до 0°С перед смешиванием.
Использовали следующие конечные концентрации НЕ8.
мг/мл для производного НЕ8, полученного согласно примеру 9.2(Ь);
64,7 мг/мл для производного НЕ8, полученного согласно примеру 9.2(6);
64,7 мг/мл НЕ850/0.7 (8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о16з СтЬН, КозЬасй-Ко6йе1т, Ό) в качестве контроля реакции.
Соответствующую реакционную смесь анализировали гель-электрофорезом.
Пример 9. Конъюгаты А1АТ (а1АТ, альфа1аТ), синтезируемые через восстановительное аминирование.
Пример 9.1. Синтез амино-НЕ8 (А) из окисленного НЕ8.
6,09 г оксо-НЕ8 (М^ = 57000,000 Да, Ό8 = 0,76, 8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о16з СтЬН, КозЬасИКо6йе1т, Германия, полученного согласно ОЕ 19628705 А1) нагревали в течение ночи при 80°С в вакууме, растворяли в атмосфере азота в 32 мл сухого диметилсульфоксида (Е1ика, 8щта-А16пс11 Сйетге
- 85 014103
СтЬН, ТаиГкпсйеи, Ό) и добавляли 1,22 мл 1,4-диаминобутан (Р1ика, Б1дта-А1бпсй Сйет1е СтЬН, ТаиГкпсйеи, Ό). После перемешивания при 40°С в течение 17 ч реакционную смесь добавляли к 150 мл охлажденной на льду смеси 1:1 ацетона и этанола (об./об.). Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали 40 мл охлажденной на льду смеси 1:1 ацетона и этанола (об./об.) и собирали центрифугированием. Сырой продукт растворяли в 80 мл воды, диализировали в течение 4 дней против воды (БиакеБкт б1а1у818 ЫЬтд, отсечка 3,5 кДа, РегЬю Баеисек Пеи!ксй1аиб СтЬН, Бонн, Ό) и лиофилизировали. Выход изолированного продукта составил 82%.
Пример 9.2. Синтез альдегид-НЕБ (А) из амино-НЕБ (А) из примера 9.1.
125 мг 4-формилбензойной кислоты и 174 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба А1бпсй, Б1дтаА1бпсй Сйет1е СтЬН, ТаиГкпсйеи, Ό) растворяли в 38 мл Ν,Ν-диметилформамида (для пептидного синтеза, Вюбюке, Vа1кег15\νаа^б. ΝΣ), и добавляли 155 мкл Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимида (Р1ика, Б1дтаА1бпсй Сйет1е СтЬН, ТаиГкпсйеи, Ό). После инкубации при 21°С в течение 30 мин, добавляли 3,8 г амино-НЕБ (А) (полученного, как описано в примере 9,1). После взбалтывания в течение 19 ч при 22°С, реакционную смесь добавляли к 160 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола (об./об.). Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 20 мл Ν,Νдиметилформамида и осаждали с 80 мл охлажденной на льду смеси 1:1 ацетона и этанола (об./об.), как описано в примере 9.1. После центрифугирования осадок растворяли в 50 мл воды, диализировали в течение 2 дней против воды (БиакеБкт б1а1у818 !иЬтд, отсечка 3,5 кДа, РегЬю Биеисек ОеШксШамб СтЬН, Бонн, Ό) и лиофилизировали. Выход выделенного продукта составил 77%.
Пример 9.3. Синтез амино-НЕБ (В) из окисленного НЕБ.
г оксо-НЕБ (МА = 57кД, ОБ = 0,76, Бирин^ Рагеи!ега1 Εο11οι6κ СтЬН, ΚοкЬасй-Κοбйе^т, Ό, полученного согласно ЭЕ 19628705 А1), нагревали в течение ночи при 80°С в вакууме, растворяли в атмосфере азота в 52 мл сухого диметилсульфоксида (Р1ика, Б1дта-А1бпсй Сйет1е СтЬН, ТаиГкпсйеи, Ό), и добавляли 2 мл 1,4-диаминобутана (Р1ика, Б1дта-А1бпсй Сйет1е СтЬН, ТаиГкпсйеи, Ό). После перемешивания при 40°С в течение 17 ч реакционную смесь добавляли к 350 мл охлажденного на льду 2пропанола (Саг1 Ρο!1ι СтЬН + Οο. КС, Карлсруэ, Ό). Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали с 80 мл охлажденного на льду 2-пропанола и собирали центрифугированием. Сырой продукт растворяли в 80 мл воды, диализировали в течение 2 дней против воды (БиакеБкт б1а1у818 !иЬтд, отсечка 3,5 кДа, РегЬю Биеисек ОеШксШамб СтЬН, Бонн, Ό) и лиофилизировали. Выход выделенного продукта составил 85%.
Пример 9.4. Синтез альдегид-НЕБ (В) из амино-НЕБ (В) из примера 9.3.
153 мг 4-формилбензойной кислоты и 241 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба А1бпсй, Б1дтаА1бпсй Сйет1е СтЬН, ТаиГкпсйеи, Ό) растворяли в 51 мл Ν,Ν-диметилформамида (для пептидного синтеза, Β^ο8ο1νе, Vа1кег18\νаа^б. ΝΕ) и добавляли 170 мкл Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимида (Р1ика, Б1дтаА1бпсй Сйет1е СтЬН, ТаиГкпсйеи, Ό). После инкубации при 21°С в течение 30 мин, добавляли 5,1 г амино-НЕБ (В) (полученного, как описано в примере 9.3). После взбалтывания в течение 16 ч при 22°С, реакционную смесь добавляли к 360 мл охлажденной на льду смеси 1:1 ацетона и этанола (об./об.). Осажденный продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 50 мл воды и осаждали с 360 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола (об./об.), как описано в примере 9.1. После центрифугирования, осадок растворяли в 50 мл воды, диализировали в течение 2 дней против воды (БиакеБк1и б1а1ук18 !иЬтд, отсечка 3,5 кДа, РегЬю Баеисек ОегПксйктб СтЬН, Бонн, Ό) и лиофилизировали. Выход выделенного продукта составил 87%.
Пример 9.5. Конъюгация альдегид-НЕБ (А) и (В) с А1АТ путем восстановительного аминирования.
Смесь 189 мг альдегид-НЕБ (В) (полученного, как описано в примере 9.4) и 172 мг альдегид-НЕБ (А) (полученного как описано в примере 9.2) растворяли в 2,88 мл буфера реакции (0,1М фосфата натрия, 150 мМ хлорида натрия, рН 7,2). При 20°С добавляли 1,67 мл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия в том же самом буфере, затем 0,455 мл раствора А1АТ (с (А1АТ) = 11,0 мг/мл в 0,1М фосфате натрия в качестве буфера, 150 мМ хлорида натрия, рН 7,2, А1АТ = гй А1АТ, СТС Вю!йегареийск Ыс, Ргаттдйат, МА, 1οΐ Νο.080604Λ). Смесь инкубировали при 20°С. Через 17 ч добавляли дополнительно
6,7 мг цианоборгидрида натрия, растворенного в 200 мкл буфера реакции и смесь дополнительно инкубировали в течение 24 ч при той же температуре. 10 мкл этого раствора анализировали по истечение общего времени инкубации 25 ч гель-электрофорезом (см. фиг. 18).
Пример 9.6. Конъюгация НЕБ с А1АТ путем восстановительного аминирования (контроль реакции).
362 мг НЕБ (МА = 42 кДа, ОБ = 0,41, Бирии^ Рагеи!ега1 Εο11οι6κ СтЬН, Κο8Ьасй-Κοбйе^т, Ό) растворяли в 2,88 мл буфера реакции (0,1М фосфата натрия, 150 мМ хлорида натрия, рН 7,2). При 20°С добавляли 1,67 мл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия в том же самом буфере, затем 0,455 мл раствора А1АТ (с (А1АТ)=11,0 мг/мл в 0,1 М фосфата натрия в качестве буфера, 150 мМ хлорида натрия, рН 7,2, а1АТ=гйа1АТ, СТС ВюШегареийск Шс, Ргаттдйат, МА, 1οΐ №.080604А). Смесь инкубировали при 20°С. Через 17 ч добавляли дополнительно 6,7 мг цианоборгидрида натрия, растворенного в 200 мкл буфера реакции, и смесь дополнительно инкубировали в течение 24 ч при той же температуре. 10 мкл этого раствора анализировали по истечение общего времени инкубации 25 ч гель-электрофорезом (см. фиг.
- 86 014103
19).
Пример 9.7. Очистка конъюгата НЕ8-А1АТ ионообменной хроматографией (ШС).
Конъюгаты А1АТ очищали ионообменной хроматографией на колонке Н1Тгар О НР с использованием хроматографической системы АКТА-Ехр1огег (обе Атегкйат Вюкаепсек). Очистку осуществляли в соответствии с выделением А1АТ из плазмы человека, как описано в Скеп, Наттопб, Ьапд апб ЬеЬшд, РцгШсайоп о! а1-Рго!е1паке Iηк^Ь^ΐο^ Ггош Нитап Р1акта Бгасйоп БУ-1 Ьу йп Ехскапде Скгота1одгарку, Уох8апдшшк 1998, 74, 232-241.
Получение образца: ионный обмен на колонке Н1Ргер 26/10 ЭекаЫпд (Атегккат Вюкаепсек) в комбинации с хроматографической системой АКТА-Ехр1огег с использованием 20 мМ фосфата натрия, 20 мМ хлорида натрия, рН 8, в качестве элюента.
Ионный обмен осуществляли после разбавления сырой реакционной смеси (полученной, как описано в примере 9,5, приблизительно 5 мл) обессоленной водой до конечного объема 10 мл с использованием следующих параметров: Колонка:
Скорость потока:
Элюент:
Объем пробы:
Н1Ргер 26/10 ϋβ331ίίη9 мл/мин мМ фосфата натрия мМ хлорида натрия рН 8 мл
Фракционирование элюата: 2,5 мл
Уравновешивание: 5 объемов колонки
Продолжительность элюирования: 2 объема колонки
Первые 14 мл элюента объединяли и добавляли буфер связывания до получения конечного объема мл. Этот раствор, содержащий приблизительно 5 мг белка, очищали ШС, используя следующие параметры:
Колонка: Н1Тгар > о н₽ 1 МЛ
Скорость потока: 1 мл/мин
Буфер связывания (ЕС) : 20 мМ фосфата натрия
20 мМ хлорида натрия
рН 8
Буфер элюирования (БЭ) : 20 мМ фосфата натрия
М хлорида натрия
рН 8
Объем пробы: 20 мл
Минимальное фракционирование потока: 2 мл
Фракционирование элюата: 1 мл
Начальная концентрация БЭ: 0%
Уравновешивание: 5 объемов колонки
Вымывание несвязанного образца: 15 мл
Целевая концентрация БЭ: 15%
Протяженность градиента: 20 мл
Фракции, собранные после хроматографии, были проанализированы с помощью 8Э8-РАСЕ. Фракции, содержащие конъюгат НЕ8-А1АТ, были объединены (элюирующий объем от 40 до 47 мл, соответствующих фракциям В1-С6, см. фиг. 19). В некоторых из объединенных фракций было обнаружено малое количество непрореагировавшего А1АТ. Начальная концентрация объединенной фракции после хроматографии, определенной ВСА (Р1егсе Кат. Номер 23225), с использованием А1АТ (СТС Вю!11егареийск Шс, Бит^кат, МА, партия номер 080604А) в качестве эталона, составляла 170 мкг/мл. После разбавления и буферного обмена в 20 мМ фосфата натрия, 150 мМ хлорида натрия, рН 7,2, полученная концентрация белка составила 54,5 мкг/мл (ВСА (Р1егсе с А1АТ от СТС в качестве эталона)). Этот конечный раствор использовался для определения ингибирующей эффективности конъюгата.
Пример 9.8 Определение ингибирующей способности ш уйго конъюгата НЕ8-А1АТ в отношении эластазы гранулоцита человека.
Тесты эластаз-ингибирующей активности конъюгатов были выполнены согласно Сакй11о е! а1., Апа1. Вюскет. 1979, 99, 53-64, с использованием Тесап иУ-УТ8-Р1а!егеабег Мобе1 8иппке.
- 87 014103
Это исследование основано на высвобождении п-нитроанилина из №Ме1-О-сукцинил-А1а-А1а-РгоУа1-р^О2-анилина, катализируемом эластазой. Этот гидролиз может сопровождаться увеличением поглощения при 405 нм. Начальная степень гидролиза находится в близкой корреляции к активности фермента. Исследование осуществляли в отсутствие и в присутствии различных концентраций тестируемого ингибитора. Уменьшение ферментативной активности в соответствии с ингибирующей активностью тестируемых веществ представлено в уменьшении наклона графика А405 νκ время. Остаточная эластазная активность в присутствии определенной концентрации ингибитора представлена наклоном кривой ингибирования, разделенным на наклон неингибированной кривой. Существует линейная корреляция между остаточной ферментативной активностью и концентрацией ингибитора. При использовании линейной регрессии, может быть достигнута линейная гладкая линия, и остаточная ферментативная активность для данной концентрации ингибитора может быть вычислена. Этим путем можно сравнить ингибирующую активность (= 1-остаточная ферментативная активность) различных ингибиторов при той же самой концентрации (см. фиг. 20). Использовали следующие параметры:
Концентрация субстрата: 1,5 мМ
Эластазная активность: 7,5 мЕд.
Длина волны: 405 нм
Температура:20°С
Временной интервал:15 с
Кинетические циклы:25
Режим измерения: центр
Тест-раствор состоял из 300 мкл буфера (0,1М Нерек, 0,5М №С1, 0,05% (мас./об.) ТгПоп Х-100, рН 7,5), содержащего 10% ДМСО, 1,5 мМ №Ме1-О-сукцинил-А1а-А1а-Рго-Уа1-р^О2-анилина, 7,5 мЕд. эластазы и различные количества ингибиторов.
Эластаза была приобретена у 8егуа Е1ес1горДогек1к СтЬН, Не1йе1Ьегд. Все другие вещества были приобретены у 81дта АИпсЬ, ТаиПйгсНеп.
Ингибирующая активность конъюгата, синтезируемого, как описано в примере 9.5, была проверена в сравнении с Рго1акйп® Н8 (Вауег УДа1 СтЬН, Ьеуегкикеп, Германия, партия номер РК4НА43) в качестве эталона и с А1АТ (СТС ВюШегареийск Шс, Егаттдйат, МА, партия номер 080604А) в качестве исходного материала для конъюгации. График остаточная ферментативная активность ν8. концентрация приведен на фиг. 20. Линейность для всех кривых была К2 > 0,98. Внизу приведены КС-значения и ингибирование эластазы для с (ингибитор) = 1 мкг/мл, а также ингибирующая активность исходного материала и конъюгата относительно эталона. Данные, приведенные в таблице ниже, ясно демонстрируют, что основная часть активности А1АТ сохраняется после конъюгации с НЕ8.
Таблица примера 9.8
Ингибитор Уравнение для плавной прямой линии 1С5О [мкг/мл] Ингибирование эластазы с(ингибитор)= 1мкг/мл [%] Ингибирующая активность по отношению к Проластину
[%]
Проластин Υ=- 0,6754х+0,9627 0, 685 71, 3
αΙΑΤ Υ— 0,5046х+0,9558 0,903 54,9 77,0
НЕЗ-А1АТконьюгат Υ=- 0,3757Х+0,9627 1,232 41, 3 57,9
Пример 9.9. Определение периода полужизни ш νί\Ό конъюгата НЕ8-гй альфа1АТ по сравнению с гЬ альфа1АТ и полученным из плазмы альфа1АТ.
В качестве подопытного организма использовали самок мышей в возрасте 8-10 недель (ВАЬВ/сО1аНкй, Наг1ап СтЬН, Вогсйеп, Германия) (42 мыши, 14 на группу). Массу тела каждого животного измеряли непосредственно перед введением различных образцов растворов. 100 мкл 50 мкг/мл раствора образцов, показанных ниже, в буфере рН = 7,2 (20 ммоль фосфата натрия, 150 ммоль хлорида натрия) были введены внутривенно в хвостовую вену мышей.
Образец 1: гЬ альфа1АТ (СТС ВюШегареийск Шс, Егатшдйат, МА, партия Номер 080604А).
Образец 2: конъюгат гЬ альфа1АТ-НЕ8, полученный согласно примеру 13.5.
Образец 3: полученный из плазмы Ь альфа1АТ (8ЕКУА Е1есйорйогек1к СтЬН, Не1йе1Ьегд, Германия).
В моменты времени 1, 2, 4, 10, 24, 31,5 и 48 ч после инъекции, две мыши каждой группы забивались, и целые пробы крови (~500 мкл) были забраны из сердца животных. Сыворотку получали, используя МюгоуеИе® 500 Ζ-Се1 (8агк(еШ, МтЬгесЫ, Германия). Образцы сыворотки сохраняли при -80°С до
- 88 014103 начала измерения концентрации альфа1 АТ.
Концентрации альфа1АТ детектировали, используя коммерчески доступный альфа 1АТ-ЕЫ8А (Иптипб1адпов(1к, Вепвкеш, Германия) на основании инструкций изготовителя.
Полученные результаты демонстрируют значительное увеличение периода полужизни в плазме для конъюгата гк альфа1АТ-НЕ8 по сравнению с не модифицированным исходным материалом гк альфа1АТ. Измеренный период полужизни конъюгата находится в том же самом диапазоне, что и вслучае полученного из плазмы альфа1АТ согласно следующей таблице.
Таблица примера 9.9. Период полужизни в плазме образцов 1-3
Пример 10.1. Синтез гидроксиэтилкрахмала с функциональными аминогруппами.
Оксо-НЕ8 (М^ = 41 000 Д, Ό8 = 0,76) получали с использованием 8иргато1 Рагеп(ега1 Со11о1бв СшЬН, ВовЬаск-Вобкет, Ό; согласно ЦЕ 196 28 705 А1.
К раствору 0,51 г оксо-НЕ8 (19,15 мкмоль) в 2 мл сухого диметилсульфоксида (ДМСО, Асгов Огдашс В'¥ГВА, Сее1, В) добавляли по каплям в атмосфере азота 200 мкл (19,9 ммоль) 1,4-диаминобутана (Асгов Огдашс В'¥ЬА, Сее1, В) и смесь перемешивали в течение 24 ч при 70°С. Реакционную смесь добавляли к 20 мл холодного ацетона (0°С). Полученный осадок отделяли фильтрацией, промывали ацетоном (40 мл) и повторно растворяли в 20 мл воды. Раствор диализировали в течение одного дня против воды (8паке8кт б1а1ув1в (иЬтд, отсечка 4-6 кДа, РегЬю 8с1епсе Эеи(вск1апб СшЬН, Бонн, Ό) и лиофилизировали. Выход составил 80% (0,41 г) амино-НЕ8.
Очистку продукта осуществляли нанесением на колонку Н1Ргер26/10 ЭеваИтд (100 мМ, Атегвкат В1овс1епсе) с использованием системы АКТА ехр1огег (Атегвкат Вюваепсе). Для этого колонку Н1Ргер 26/10 ОеваШпд уравновешивали с раствором 0,1М №1С1 (10 мл/мин), и вводили амино-НЕ8 в 0,1 М ШИ (5 мг/мл, объем инъекции 10 мл). Объединенные фракции амино-НЕ8 вводили в колонку Н1Ргер 26/10 ПеваШпд, уравновешенную с водой (объем инъекции 10 мл). Объединенные фракции НЕ8 снова вводили в тех же самых условиях в колонку. Чистый продукт лиофилизировали, и количество амина определяли дериватизацией с 2,4,6-тринитробензолсульфокислотой (Т№8А (Р1егсе), [ηв(^ис(^οηв Т№8А номер продукта 28997), и Вос-Ьув-ОН для калибровки. Количество амина составляет 34,02 нмоль/мг (92%).
Пример 10.2. Синтез гидроксиэтилкрахмала с йодоацетильными функциональными группами.
К раствору 101,9 мг гидроксиэтилкрахмала с функциональными аминогруппами (амино-НЕ8 мкмоль, полученный в примере 10.1) в 5 мл 0,1 М №ьСО3 (рН = 8.3) вводили 12,63 мг сложный эфир йодоуксусной кислоты и Ν-гидроксисукцинимида (44,65 мкмоль, 8181113, Таиккпскеп, Германия). Смесь перемешивали при комнатной температуре в темноте в атмосфере азота в течение 15 ч. В водный раствор вводили 15 мл воды, и очистку продукта осуществляли введением в колонку Н1Ргер 26/10 ЭеваИтд (Атегвкат Вюваепсев). Для этого колонку Н1Ргер 26/10 ЭеваИтд (100 мм) уравновешивали с 0,1М раствора М№С1 (10 мл/мин), и вводили гидроксиэтилкрахмал с йодоацетильными функциональными группами (объем инъекции 10 мл). Объединенные фракции йодоацетил-НЕ8 вводили в колонку Н1Ргер 26/10 ЭеваШпд, уравновешенную с водой, и объединенные фракции повторно вводили в тех же самых условиях в колонку. Чистый продукт лиофилизировали, и количество йодоацетила косвенно определяли количественным анализом амина с 2,4,6-тринитробензолсульфокислотой, как описано выше. Количество амина составляет 1,65 нмоль/мг, что соответствует количеству йодоацетила 32,37 нмоль/мг (95%).
Пример 10.3. Синтез малеимид-НЕ8 из амино НЕ8 примера 10.1.
мг амино НЕ8 (полученного, как описано в примере 10.1) с расчетным содержанием амина ~29 нмольмг-1, растворяли в 450 мкл буфера реакции (0,1М фосфата натрия, 150 мМ №С1, 5,0 М ЕЭТА, рН 7,0). Отдельно 9 мг сложного эфира N-[α-малеимидоацетокси]сукцинимида (АМА8, А1бпск, 81дтаА1бпск Скетче СтЬН, Таиккпскеп, Ό) растворяли в 200 мкл сухого ДМСО (Асгов Огдатсв В'¥ГВА, Сее1, В). Эти два раствора были объединены вместе.
Полученный раствор оставляли при перемешивании в течение 100 мин при 22°С и в течение следующих 20 мин при 40°С. Полученный раствор разбавляли до объема 5 мл и вводили в обессоливающую колонку, используя систему АКТА ехр1огег (Атегвкат Вюваепсев), для удаления непрореагировавших АМА8, ΝΉ8 и ДМСО.
Для этого колонку Н1Ргер 26/10 ЭеваИтд (100 мм, Атегвкат Вюваепсев) уравновешивали с буфером реакции (0,1М фосфата натрия, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ ЕЭТА, рН 7,0), и вводили раствор малеимид-НЕ8 (объем инъекции 5 мл) и фракционировали. Были выбраны следующие параметры очистки:
- 89 014103
Колонка:
Объемная скорость потока:
Элюент:
Н1Ргер 26/10 Сеза1Р1пд мл/мин буфер 0,1М фосфата натрия
150 мМ Хлорида натрия мМ ЕСТА
рН - 7,0
Объем образца: 5, 0 мл
Фракционирование элюата: 2,5 мл
Уравновешивание: 0,5 объемов колонки
Продолжительность элюирования: 2,0 объема колонки
Объединенные фракции НЕ8 (7 мл) повторно вводили в тех же самых условиях для гарантии отсутствия ΑМΑ8, ИН8 и ДМСО в конечном растворе. Вторая очистка приводит к 10 мл чистого МалеимидНЕ8, готового для соединения с альфа1АТ.
Элюированный полимер затем концентрировали до конечного объема 250 мкл в том же самом буфере.
Пример 10.4а. Восстановление альфа1АТ с ИЬ-дитиотреитолом (ЭТТ).
К раствору альфа1АТ (с (альфа1АТ) = 5,0 мг в 0,5 мл 0,1М фосфата натрия в качестве буфера, 150 мМ хлорида натрий, рН 7,2, альфа1АТ = гН альфа1АТ, поставляемый СТС ВюШегареийск Лс, РгаттдНат, МΑ, партия Номер 080604А), добавляли 4 мл буфера реакции (0,1М фосфата натрия, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ Е^ΤΑ, рН 7,0) и 68,77 мг ЭТТ (81дта ТаиШгсНеп, Германия). Смесь инкубировали при 20°С в течение 2 ч и восстановленный белок очищали эксклюзионной (гель-проникающей) хроматографией (8ЕС) с использованием системы АКТЛ ехр1огег (Ате/кНат Вюкаепсек). Для этого колонку Н1Ргер 26/10 ЭекаЫпд (100 мм, Αте^кНат Вюкаепсек) уравновешивали с раствором 0,1М фосфата натрия в качестве буфера, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ Е^ΤΑ, рН 7,0 и вводили раствор восстановленного белка (объем инъекции 4,5 мл) и фракционировали. Были выбраны следующие параметры очистки:
Колонка: Н1Ргер 26/10 ОезаФбдпд
Объемная скорость потока: 10 мл/мин
Элюент: буфер 0,1М фосфата натрия
150 мМ Хлорида натрия мМ ΕϋΤΑ рН = 7,0
Объем образца:
Фракционирование элюата:
Уравновешивание:
4.5 мл
2.5 мл
0,5 объемов колонки
Продолжительность элюирования
колонки
Объединенные фракции белка (8 мл) повторно вводили в тех же самых условиях для гарантии отсутствия ЭТТ в растворе белка. Вторая очистка приводит к 10 мл раствора чистого восстановленного α1ΑΤ с приблизительной концентрацией 0,5 мг/мл и используется для соединения с малеимидо НЕ8, как описано в примере 10.5.
Пример 10.4Ь. Предварительная обработка α1ΑΤ с иммобилизированным Трис-(2-карбоксиэтил)фосфин-гидрохлоридом (ТСЕР) и выделения тиола, содержащего белок.
Альфа1АТ (СТС ВюШегареийск Лс, РгаштдНат, МΑ, партия Номер 080604А) обрабатывали иммобилизированным ТСЕР (Р1егсе 77712, 2 мл жидкого раствора геля на мг белка), чтобы восстановить потенциальные дисульфидные связи.
Иммобилизированный ТСЕР получали, как описано производителем, используя буфер рН 7,0 (100 мМ фосфата натрия, 150 мМ хлорида натрия и 5 мМ Е^ΤΑ). Восстановление осуществляли согласно инструкциям изготовителя.
Восстановленный белок инкубировали с активированной тиолом сефарозой ^те^Нат Вюкаепсек 71-7106-00; 0,15 г геля на мг белка), чтобы ковалентно связать тиол, содержащий белок. Несвязанный белок вымывали буфером, содержащим 100 мМ фосфата натрия, 150 мМ хлорида натрия и 5 мМ Е^ΤΑ, рН 7, до исчезновения белка из элюата. Для детекции белка использовали ВСА-тест (Р1егсе). Белок, связавшийся с колонкой, высвобождали и элюировали с использованием буфера рН 7,0 (100 мМ фосфата натрия, 150 мМ хлорида натрия и 5 мМ Е^ΤΑ), содержащего 20 мМ ТСЕР.
Пример 10.5. Получение конъюгата НЕ8-альфа1АТ из Малеимид-НЕ8 примера 10.3 через образование цистеиновой связи.
- 90 014103
725 нмоль Малеимид-НЕ8 (полученного, как описано в примере 10.3) растворяли в 250 мкл буфера реакции (0,1М фосфата натрия, 150 мМ ΝηΟ, рН 7,0), добавляли к 1540 мкл 0,5 мгмл-1 раствора альфа1АТ в том же самом буфере. Белок предварительно инкубировали с ОТТ, как описано в примере Т8/4а). Реакционную смесь перемешивали при 22°С в течение 18 ч, затем реакцию останавливали замораживанием жидким азотом и сохраняли при -80°С. Реакционную смесь анализировали гель-электрофорезом (см. фиг. 21).
Пример 10.6. Получение конъюгата НЕ8-аАТ из йодацетамидо НЕ8 примера 10.2 через образование цистеиновой связи.
мг йодоацетамид НЕ8 (полученного, как описано в примере 10.2) с расчетным содержанием йода ~16 нмольмг-1, растворяли в 1,0 мл буфера реакции (1,0М карбоната натрия, 2,0 мМ ЕЭТА, рН 8,3) и 2,5 мл дистиллированной воды. 500 мкл раствора 3 мгмл-1 альфа1АТ (предварительно обработанного, как описано в примере 10.4Ь) в 0,1М фосфата натрия в качестве буфера, 150 мМ №1С1 (рН 7,0) смешивали с раствором полимера, и, наконец, добавляли 500 мкл раствора, содержащего 7,2 мг ТСЕР (А16псй, 81дтаА16псИ СИенне СтЬН, ТаиШгсйеп, Ό), чтобы получить конечную концентрацию на 5 мМ восстановителя. Реакционную смесь оставляли в отсутствии света и при перемешивании в течение 18 ч при комнатной температуре. После этого реакцию останавливали замораживанием жидким азотом и сохраняли при -80°С.
Пример 10.7. Очистка конъюгата НЕ8-альфа1 АТ, полученного из йодоацетамидо НЕ8 примера 10.2 через образование цистеиновой связи.
Получение образца: буферный обмен на колонке Н1Ргер 26/10 ОекаШпд (АтегкИат Вюкаепсек) в комбинации с системой хроматографии АКТА-Ехр1огег, используя 20 мМ фосфата натрия, 20 мМ хлорида натрия, рН 8 в качестве элюента.
Буферный обмен осуществляли с сырой реакционной смесью (полученной, как описано в примере Т8/6, приблизительно 4 мл) с использованием следующих параметров:
Колонка: НФРтер 26/10 ЦезаЗЫпд
Объемная скорость потока:
Элюент:
Объем образца:
Фракционирование элюата:
Уравновешивание:
мл/мин мМ фосфата натрия ыМ Хлорида натрия рН = 8,0 мл
2,5 мл объемов колонки объема колонки
Продолжительность элюирования: 2
Фракции от 6 до 16 мл объединяли. Избыток НЕ8-производных удаляли йонобменной хроматографией, используя следующие параметры:
Колонка: НФТгар 0 НР 1 МЛ
Скорость потока: 1 мл/мин
Связывающий Буфер (СБ): 20 мМ фосфата натрия
20 мМ Хлорида натрия
рН 8
Буфер Элюирования (БЭ): 20 мМ фосфата натрия
1М хлорида натрия
рН 8
Пустая петля с:
мл
Фракционирование Потока: 2 мл
Фракционирование элюата: 1 мл
Начальная концентрация БЭ: 0%
Уравновешивание:
объемов колонки
Вымывание несвязанного образца: 15 мл
Целевая концентрация БЭ: 15%
Длина градиента:
мл
Фракции от 43 до 73 мл собирали и концентрировали до конечного объема 10 мл ультрацентрифугированием. После обессоливания раствора, как описано выше (объем образца 10 мл, собранные фракции содержат первые 14 мл), осуществляли вторую ионообменную хроматографию для отделения конъюгатов от несвязанного белка, используя следующие параметры:
- 91 014103
Колонка:
Скорость потока:
Связывающий Буфер (СБ) :
Буфер Элюирования (БЭ):
Пустая петля с:
Фракционирование Потока:
Фракционирование элюата:
Начальная концентрация БЭ:
Уравновешивание:
ШТгар й НР 1 мл мл/мин мМ фосфата натрия мМ Хлорила натрия рН 8 мМ фосфата натрия
1М хлорида натрия рН 8 мл мл мл
0% объем колонки
Вымывание несвязанного образца: 2 мл
Целевая концентрация БЭ: 5-15%
Длина градиента: 100 мл
Следующие фракции собирали и анализировали анализом 8Э8-РЛСЕ (см. фиг. 22): А: 26-32 мл; В: 37-45 мл; С: 55-65 мл.

Claims (21)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ получения конъюгата, содержащего белок и полимер или его производное, в котором полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал (НА8), предпочтительно гидроксиэтилкрахмал, предпочтительно гидроксиэтилкрахмал, имеющий молекулярную массу от 2 до 200 кДа, предпочтительно от 4 до 130 кДа, более предпочтительно от 4 до 70 кДа, причем способ включает введение в реакцию по меньшей мере одной функциональной группы А полимера или его производного по меньшей мере с одной функциональной группой Ζ белка с образованием ковалентной связи, причем Ζ выбирают из группы, состоящей из альдегидной группы и кетогруппы, и А включает аминогруппу, образующую связь с Ζ, и белок выбирают из группы, состоящей из бета ΛΝ, СМ-С8Р, АРС, !РА, А1АТ, АТ III, фактора VII, фактора VIII и фактора IX, причем производное полимера получено введением функциональной группы А в полимер путем реакции полимера на его возможно окисленном восстанавливающем конце, по меньшей мере, с бифункциональным соединением, причем одна функциональная группа, по меньшей мере, бифункционального соединения содержит химическую структуру -ΝΉ- и вступает в реакцию с возможно окисленным восстанавливающим концом полимера, а по меньшей мере одна другая функциональная группа, по меньшей мере, бифункционального соединения представляет собой функциональную группу А или химически модифицирована с образованием функциональной группы А.
  2. 2. Способ по п.1, в котором альдегидная группа или кетогруппа расположены в боковой углеводной цепи белка и/или в Ν-концевой группе белка и в котором А обозначает аминооксигруппу или гидразидную группу.
  3. 3. Способ по п.2, дополнительно включающий окисление боковой углеводной цепи белка и/или окисление Ν-концевой группы белка, с получением альдегидной группы или кетогруппы, в котором реакцию окисления предпочтительно осуществляют ферментативно или с использованием перйодата, в случае необходимости, после удаления концевой сиаловой кислоты.
  4. 4. Способ по п.2 или 3, дополнительно включающий введение в реакцию полимера на его неокисленном восстанавливающем конце, по меньшей мере, с бифункциональным связывающим соединением, включающим функциональную группу, способную вступать в реакцию с неокисленным восстанавливающим концом полимера и группой А, до реакции производного полимера, включающего А, с белком, включающим Ζ, причем, по меньшей мере, бифункциональное соединение представляет собой гомобифункциональное соединение, предпочтительно гомобифункциональное соединение, включающее две аминооксигруппы, более предпочтительно гомобифункциональное соединение, представляющее собой О-[2-(2-аминооксиэтокси)этил]гидроксиламин.
  5. 5. Способ по п.4, в котором реакцию полимера, по меньшей мере, с бифункциональным связывающим соединением осуществляют в водной среде, причем реакция предпочтительно приводит к образованию оксимной связи и/или оксиаминной связи.
  6. 6. Конъюгат, полученный способом по одному из пп.1-5.
  7. 7. Конъюгат, включающий белок и полимер или его производное, в котором полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал (НА8) и белок выбран из группы, состоящей из бета ΛΝ, СМ-С8Р, АРС, !РА, А1АТ, АТ III, фактора VII, фактора VIII и фактора IX, причем конъюгат имеет структуру формулы
    - 92 014103 и/или где В1, В2 и В3 независимо обозначают водород или гидроксиалкильную группу, гидроксиарильную группу, гидроксиаралкильную группу или гидроксиалкарильную группу, содержащую от 2 до 10 атомов углерода, предпочтительно водород или гидроксиалкильную группу, более предпочтительно водород или гидроксиэтильную группу, причем С выбран из группы, состоящей из О и 8, предпочтительно О, и причем Ь обозначает алкил, арил, аралкил, гетероарил или гетероаралкил, содержащий от 2 до 60 атомов углерода, причем -Ь- предпочтительно обозначает -(СН2)и-, где и=2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, предпочтительно 2, 3, 4, 5, 6, более предпочтительно 2, 3, 4, и особенно предпочтительно 4.
  8. 8. Конъюгат, включающий белок и полимер или его производное, в котором полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал (НА8), и белок выбран из группы, состоящей из бета СМ-С8Р, АРС, !РА, А1АТ, АТ III, фактора VII, фактора VIII и фактора IX, причем конъюгат имеет структуру формулы и/или в которой В1, В2 и В3 независимо обозначают рильную группу, гидроксиаралкильную группу или гидроксиалкарильную группу, содержащую от 2 до 10 атомов углерода, предпочтительно водород или гидроксиалкильную группу, более предпочтительно водород или гидроксиалкильную группу, гидроксиаводород или гидроксиэтильную группу, и в которой С выбран из группы, состоящей из О и 8, предпочтительно О.
  9. 9. Конъюгат, включающий белок и полимер или его производное, в котором полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал (НА8), и белок выбран из группы, состоящей из бета СМ-С8Р, АРС, !РА, А1АТ, АТ III, фактора VII, фактора VIII и фактора IX, причем конъюгат имеет структуру формулы и/или в которой В1, В2 и В3 независимо обозначают водород или гидроксиалкильную группу, гидроксиа- 93 014103 рильную группу, гидроксиаралкильную группу или гидроксиалкарильную группу, содержащую от 2 до 10 атомов углерода, предпочтительно водород или гидроксиалкильную группу, более предпочтительно водород или гидроксиэтильную группу, и в которой Ь обозначает алкил, арил, аралкил, гетероарил или гетероаралкил, содержащий от 2 до 60 атомов углерода, причем -Ь - предпочтительно обозначает
    -[(СВаВ^тС^СВсВаГ-, где В,, Β, Вс, В6 независимо обозначают водород, алкил, арил, предпочтительно водород, где С выбран из группы, состоящей из О и 8, предпочтительно О, и где т = 1, 2, 3 или 4, причем остатки Ва и ΒЪ могут быть одинаковыми или разными в группах СΒаΒЪ;
    п = от 0 до 20, предпочтительно от 0 до 10, более предпочтительно 1, 2, 3, 4, 5, наиболее предпочтительно 1 или 2;
    о = от 0 до 20, предпочтительно от 0 до 10, более предпочтительно 1, 2, 3, 4, 5, наиболее предпочтительно 1 или 2, причем остатки Вс и В6 могут быть одинаковыми или разными в группах СВсВ6;
    причем целые числа для п и о выбраны таким образом, чтобы в приведенной выше формуле не образовывалось пероксидных звеньев, например п и о не могут быть одновременно равны 0, и более предпочтительно, в котором Ва, ВЬ, Вс, В6 обозначают водород, т=2, п=1 и о=2.
  10. 10. Конъюгат по одному из пп.7-9, в котором гидроксиалкилкрахмал представляет собой гидроксиэтилкрахмал, предпочтительно гидроксиэтилкрахмал, имеющий молекулярную массу от 2 до 200 кДа, предпочтительно от 4 до 130 кДа, более предпочтительно от 4 до 70 кДа.
  11. 11. Конъюгат по п.6 для применения в способе лечения организма человека или животных.
  12. 12. Фармацевтическая композиция, включающая в терапевтически эффективном количестве конъюгат по п.6, в случае необходимости дополнительно включающая по меньшей мере один фармацевтически приемлемый разбавитель, адъювант или носитель.
  13. 13. Применение конъюгата ΗΑ8-белок по одному из пп.6-10, предпочтительно конъюгата ΗΕ8белок, в котором белок представляет собой бета ΙΕΝ, для получения лекарственного средства для лечения рассеянного склероза, предпочтительно рецидивирующих форм рассеянного склероза.
  14. 14. Применение конъюгата ΗΑ8-белок по одному из пп.6-10, предпочтительно конъюгата ΗΕ8белок, в котором белок представляет собой СМ-С8Е, для получения лекарственного средства для восстановления спинного мозга после трансплантации костного мозга или индукционной химиотерапии у лиц старшего возраста с острым миелогенным лейкозом, неудачей или задержкой приживления трансплантата костного мозга, мобилизацией и после трансплантации аутогенных клеток-предшественников периферической крови.
  15. 15. Применение конъюгата ΗΑ8-белок по одному из пп.6-10, предпочтительно конъюгата ΗΕ8белок, в котором белок представляет собой АРС, для получения лекарственного средства для лечения тяжелого сепсиса, тромбоза, тромбоэмболии или окклюзионных заболеваний, особенно окклюзионных заболеваний артерий.
  16. 16. Применение конъюгата ΗΑ8-белок по одному из пп.6-10, предпочтительно конъюгата ΗΕ8белок, в котором белок представляет собой ΦΑ, для получения лекарственного средства для лечения инфарктов миокарда (сердечные приступы), тромбоза, тромбоэмболии или окклюзионных заболеваний, особенно окклюзионных заболеваний артерий.
  17. 17. Применение конъюгата ΗΑ8-белок по одному из пп.6-10, предпочтительно конъюгата ΗΕ8белок, в котором белок представляет собой А1 АТ, для получения лекарственного средства для лечения эмфиземы, муковисцидоза, аллергического дерматита и/или бронхита.
  18. 18. Применение конъюгата ΗΑ8-белок по одному из пп.6-10, предпочтительно конъюгата ΗΕ8белок, в котором белок представляет собой ΑΤ ΙΙΙ, для получения лекарственного средства для лечения наследственного дефицита, окклюзионного заболевания вен, ожогов и резистентности к гепарину при аортокоронарном шунтировании (ΟΑΒΟ), предупреждения образования микросгустков, связанного с вентиляционной терапией, лечения перфорации кишечника в результате травмы или желудочнокишечной хирургии; диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС) и/или сепсиса.
  19. 19. Применение конъюгата ΗΑ8-белок по одному из пп.6-10, предпочтительно конъюгата ΗΕ8белок, в котором белок представляет собой фактор УП, для получения лекарственного средства для лечения эпизодов у пациентов, страдающих гемофилией А или В, с ингибиторами фактора УШ или фактора ΙΧ.
  20. 20. Применение конъюгата ΗΑ8-белок по одному из пп.6-10, предпочтительно конъюгата ΗΕ8белок, в котором белок представляет собой фактор УШ, для получения лекарственного средства для лечения гемофилии.
  21. 21. Применение конъюгата ΗΑ8-белок по одному из пп.6-10, предпочтительно конъюгата ΗΕ8белок, в котором белок представляет собой фактор ΙΧ, для получения лекарственного средства для борьбы и профилактики геморрагических эпизодов у пациентов с гемофилией В, предпочтительно с врожденным дефицитом фактора ΙΧ или Рождественским заболеванием, включая борьбу и профилактику кровотечений в хирургии.
EA200601670A 2004-03-11 2005-03-11 Конъюгат, включающий белок и полимер или его производное (варианты), способ его получения, применение конъюгата и содержащая его фармацевтическая композиция EA014103B1 (ru)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US55217404P 2004-03-11 2004-03-11
EP04005849 2004-03-11
PCT/EP2004/008821 WO2005014655A2 (en) 2003-08-08 2004-08-06 Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
ARP040102853A AR045450A1 (es) 2003-08-08 2004-08-09 Conjugados de almidon de hidroxialquilo y una proteina
PCT/EP2005/002637 WO2005092390A2 (en) 2004-03-11 2005-03-11 Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200601670A1 EA200601670A1 (ru) 2007-02-27
EA014103B1 true EA014103B1 (ru) 2010-10-29

Family

ID=34924480

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200601670A EA014103B1 (ru) 2004-03-11 2005-03-11 Конъюгат, включающий белок и полимер или его производное (варианты), способ его получения, применение конъюгата и содержащая его фармацевтическая композиция

Country Status (13)

Country Link
US (2) US8017739B2 (ru)
EP (3) EP1799267B1 (ru)
JP (1) JP4937105B2 (ru)
KR (1) KR101303620B1 (ru)
CN (1) CN1933857B (ru)
AR (2) AR045450A1 (ru)
AU (1) AU2005226844B2 (ru)
BR (1) BRPI0508628A (ru)
CA (1) CA2558725A1 (ru)
EA (1) EA014103B1 (ru)
ES (1) ES2438216T3 (ru)
TW (1) TW200600518A (ru)
WO (2) WO2005014655A2 (ru)

Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10209822A1 (de) * 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209821A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
WO2004024761A1 (en) * 2002-09-11 2004-03-25 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Hasylated polypeptides, especially hasylated erythropoietin
DE10256558A1 (de) * 2002-12-04 2004-09-16 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Ester von Polysaccharid Aldonsäuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung zur Kopplung an pharmazeutische Wirkstoffe
BRPI0413450A (pt) * 2003-08-08 2006-10-17 Fresenius Kabi De Gmbh conjugados de hidroxialquil amido e g-csf
WO2005014655A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
JP5191729B2 (ja) * 2004-03-11 2013-05-08 フレゼニウス・カビ・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング 還元的アミノ化によって製造される、ヒドロキシアルキルデンプンとタンパク質とのコンジュゲート
EP1732609B1 (en) * 2004-03-11 2012-07-11 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
AU2006222187A1 (en) * 2005-03-11 2006-09-14 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Production of bioactive glycoproteins from inactive starting material by conjugation with hydroxyalkylstarch
EP1762250A1 (en) * 2005-09-12 2007-03-14 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and an active substance, prepared by chemical ligation via thiazolidine
US8795680B2 (en) * 2006-07-21 2014-08-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods for conjugation of oligosaccharides or polysaccharides to protein carriers through oxime linkages via 3-deoxy-D-manno-octulsonic acid
CA2690554C (en) 2007-06-26 2016-08-16 Baxter International Inc. Hydrolysable polymeric fmoc - linker
EP2197919B1 (en) 2007-08-27 2014-04-09 ratiopharm GmbH Liquid formulation of g-csf conjugate
EP3705125B1 (en) * 2007-12-04 2023-07-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides
EP2070950A1 (en) * 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation
EP2070951A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Method for producing a hydroxyalkyl starch derivatives with two linkers
NZ598193A (en) * 2007-12-27 2012-12-21 Baxter Int Chemically Modified Factor IX
US8790701B2 (en) * 2008-04-28 2014-07-29 Surmodics, Inc. Poly-α(1→4)glucopyranose-based matrices with hydrazide crosslinking
MX2010012044A (es) * 2008-05-06 2011-05-19 Octapharma Ag Complejo que comprende proteinas de union a heparina y conjugados de heparina-almidon de hidroxialquilo.
GB0811743D0 (en) 2008-06-26 2008-07-30 Hemosol Biopharma Inc Composition
EP2166085A1 (en) 2008-07-16 2010-03-24 Suomen Punainen Risti Veripalvelu Divalent modified cells
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
ES2856055T3 (es) * 2009-07-27 2021-09-27 Baxalta GmbH Glicopolisialilación de proteínas diferentes de las proteínas de coagulación de la sangre
EP2459226B1 (en) 2009-07-27 2016-06-29 Lipoxen Technologies Limited Glycopolysialylation of proteins other than blood coagulation proteins
WO2012005838A1 (en) 2010-07-07 2012-01-12 Thermo Fisher Scientific Gmbh Analyte mass spectrometry quantitation using a universal reporter
EP2591008A1 (en) * 2010-07-09 2013-05-15 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates comprising hydroxyalkyl starch and a cytotoxic agent and process for their preparation
TWI534152B (zh) * 2010-07-30 2016-05-21 巴克斯特國際公司 用於肟連接的親核性催化劑
ES2800983T3 (es) 2010-12-22 2021-01-07 Baxalta GmbH Materiales y métodos para conjugar un derivado de ácido graso soluble en agua con una proteína
JP2014521594A (ja) 2011-05-25 2014-08-28 アミリン・ファーマシューティカルズ，リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 長持続期間デュアルホルモンコンジュゲート
EP3412314A1 (en) * 2011-05-27 2018-12-12 Baxalta GmbH Therapeutic proteins conjugated to polysialic acid and methods of preparing same
WO2013004607A1 (en) 2011-07-01 2013-01-10 Bayer Intellectual Property Gmbh Relaxin fusion polypeptides and uses thereof
GB201208370D0 (en) 2012-05-14 2012-06-27 Ucb Pharma Sa Antibodies
US9353165B2 (en) * 2012-07-25 2016-05-31 Grifols, S.A. Purification of cell culture derived alpha1 protease inhibitor
CZ2012842A3 (cs) 2012-11-27 2014-08-20 Contipro Biotech S.R.O. Nanomicelární kompozice na bázi C6-C18-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy C6-C18-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy nanomicelární kompozice a stabilizované nanomicelární kompozice a použití
GB201315487D0 (en) 2013-08-30 2013-10-16 Ucb Pharma Sa Antibodies
EP3050893B1 (en) 2013-09-24 2020-02-26 Ajinomoto Co., Inc. Glycoamino acid and use thereof
GB201320066D0 (en) 2013-11-13 2013-12-25 Ucb Pharma Sa Biological products
CZ305153B6 (cs) * 2014-03-11 2015-05-20 Contipro Biotech S.R.O. Konjugáty oligomeru kyseliny hyaluronové nebo její soli, způsob jejich přípravy a použití
CZ2014451A3 (cs) 2014-06-30 2016-01-13 Contipro Pharma A.S. Protinádorová kompozice na bázi kyseliny hyaluronové a anorganických nanočástic, způsob její přípravy a použití
JP7086601B2 (ja) * 2014-10-21 2022-06-20 ジェンノヴァ バイオファーマシューティカルズ リミテッド 組換えｔｎｋ－ｔｐａ（テネクテプラーゼ）の単離及び商業生産のための新規精製方法
CZ309295B6 (cs) 2015-03-09 2022-08-10 Contipro A.S. Samonosný, biodegradabilní film na bázi hydrofobizované kyseliny hyaluronové, způsob jeho přípravy a použití
GB201508180D0 (en) 2015-05-13 2015-06-24 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
CZ2015398A3 (cs) 2015-06-15 2017-02-08 Contipro A.S. Způsob síťování polysacharidů s využitím fotolabilních chránicích skupin
CZ306662B6 (cs) 2015-06-26 2017-04-26 Contipro A.S. Deriváty sulfatovaných polysacharidů, způsob jejich přípravy, způsob jejich modifikace a použití
GB201522394D0 (en) 2015-12-18 2016-02-03 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201610198D0 (en) 2016-06-10 2016-07-27 Ucb Biopharma Sprl Anti-ige antibodies
CZ308106B6 (cs) 2016-06-27 2020-01-08 Contipro A.S. Nenasycené deriváty polysacharidů, způsob jejich přípravy a jejich použití
JP6852397B2 (ja) * 2016-12-28 2021-03-31 株式会社島津製作所 分析用試料の調製方法および分析方法
CN113646051A (zh) 2018-10-16 2021-11-12 Ucb生物制药有限责任公司 重症肌无力的治疗方法
KR102107339B1 (ko) 2019-09-05 2020-05-07 주식회사 건바이오 생체 적합성, 조직 부착성, 생분해성 및 유착방지 효과가 개선된 유착방지제 및 이를 포함하는 유착 방지제 분사 장치
GB202001447D0 (en) 2020-02-03 2020-03-18 Ucb Biopharma Sprl Antibodies

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999049897A1 (en) * 1998-03-31 1999-10-07 Hemosol Inc. Hemoglobin-polysaccharide conjugates
WO2002080979A2 (de) * 2001-03-16 2002-10-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Hydroxyalkylstärke-wirkstoff-konjugate
WO2003074087A1 (de) * 2002-03-06 2003-09-12 Biotechnologie - Gesellschaft Mittelhessen Mbh Kopplung von proteinen an ein modifiziertes polysaccharid
EP1398328A1 (en) * 2002-09-11 2004-03-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives
EP1424086A1 (en) * 2002-11-26 2004-06-02 Ethicon, Inc. Hemostatic wound dressing containing aldehyde-modified polysaccharide and hemostatic agents
WO2005014655A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein

Family Cites Families (198)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3191291A (en) * 1959-01-21 1965-06-29 Continental Can Co Art of producing very thin steel and like sheets in wide strips
CH397115A (de) * 1960-10-04 1965-08-15 Hoechst Ag Verfahren zur Herstellung wasserunlöslicher Farbstoffe
GB1385403A (en) 1971-07-14 1975-02-26 Unilever Ltd Process for preparing oxidised carbohydrates
GB1419080A (en) 1972-12-29 1975-12-24 Cheminova As Chemical compounds having juvenile hormone activity
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4125492A (en) * 1974-05-31 1978-11-14 Pedro Cuatrecasas Affinity chromatography of vibrio cholerae enterotoxin-ganglioside polysaccharide and the biological effects of ganglioside-containing soluble polymers
US4001401A (en) * 1975-02-02 1977-01-04 Alza Corporation Blood substitute and blood plasma expander comprising polyhemoglobin
US4061736A (en) * 1975-02-02 1977-12-06 Alza Corporation Pharmaceutically acceptable intramolecularly cross-linked, stromal-free hemoglobin
US4001200A (en) * 1975-02-27 1977-01-04 Alza Corporation Novel polymerized, cross-linked, stromal-free hemoglobin
US4053590A (en) * 1975-02-27 1977-10-11 Alza Corporation Compositions of matter comprising macromolecular hemoglobin
US4068321A (en) 1975-09-24 1978-01-17 Robert Laliberte Adjustable pants
CA1055932A (en) * 1975-10-22 1979-06-05 Hematech Inc. Blood substitute based on hemoglobin
DE2616086C2 (de) 1976-04-13 1986-04-03 Dr. Eduard Fresenius, Chemisch-pharmazeutische Industrie KG, 6380 Bad Homburg Substanz zur Verwendung in einem kolloidalen Blutvolumenersatzmittel aus Hydroxyethylstärke und Hämoglobin
GB1578348A (en) * 1976-08-17 1980-11-05 Pharmacia Ab Products and a method for the therapeutic suppression of reaginic antibodies responsible for common allergic
FR2378094A2 (fr) 1977-01-24 1978-08-18 Inst Nat Sante Rech Med Nouveaux reactifs biologiques constitues par des supports solides sur lesquels sont couples des composes organiques comportant un residu glucidique
EP0019403B1 (en) 1979-05-10 1985-07-31 American Hospital Supply Corporation Hydroxyalkyl-starch drug carrier
DE3029307A1 (de) * 1980-08-01 1982-03-04 Dr. Eduard Fresenius, Chemisch-pharmazeutische Industrie KG, 6380 Bad Homburg Haemoglobin enthaltendes blutersatzmittel
US4454161A (en) * 1981-02-07 1984-06-12 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Process for the production of branching enzyme, and a method for improving the qualities of food products therewith
JPS57206622A (en) * 1981-06-10 1982-12-18 Ajinomoto Co Inc Blood substitute
IE56026B1 (en) 1982-10-19 1991-03-27 Cetus Corp Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins
EP0127839B1 (en) 1983-05-27 1992-07-15 THE TEXAS A&amp;M UNIVERSITY SYSTEM Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
DK171029B1 (da) 1983-10-11 1996-04-22 Fidia Spa Hyaluronsyrefraktion, fremgangsmåde til fremstilling deraf samt ophthalmiske præparater indeholdende hyaluronsyrefraktion
US4703008A (en) * 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4952496A (en) * 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
IL77081A (en) 1984-12-04 1999-10-28 Genetics Inst AND sequence encoding human erythropoietin, a process for its preparation and a pharmacological preparation of human erythropoietin
DE3501616A1 (de) 1985-01-17 1986-07-17 Schering AG, 1000 Berlin und 4709 Bergkamen Verfahren zur herstellung von hydroxylamin-derivaten
US4667016A (en) * 1985-06-20 1987-05-19 Kirin-Amgen, Inc. Erythropoietin purification
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5217998A (en) * 1985-07-02 1993-06-08 Biomedical Frontiers, Inc. Composition for the stabilization of deferoxamine to chelate free ions in physiological fluid
US4863964A (en) * 1985-07-02 1989-09-05 Biomedical Frontiers, Inc. Method for the stabilization of deferoxamine to chelate free ions in physiological fluid
GB8529546D0 (en) * 1985-11-30 1986-01-08 Beecham Group Plc Compounds
GB8610551D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Hoffmann La Roche Polypeptide & protein derivatives
IT1203814B (it) 1986-06-30 1989-02-23 Fidia Farmaceutici Esteri dell'acido alginico
FR2600894B1 (fr) * 1986-07-02 1989-01-13 Centre Nat Rech Scient Conjugues macromoleculaires d'hemoglobine, leur procede de preparation et leurs applications
US5214132A (en) * 1986-12-23 1993-05-25 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
US5362853A (en) * 1986-12-23 1994-11-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
US4836964A (en) 1987-07-02 1989-06-06 Tsai Son Kung Method of producing a bow holding handle
JP2594123B2 (ja) * 1987-09-12 1997-03-26 株式会社林原生物化学研究所 減感作剤
EP0307827A3 (en) 1987-09-15 1989-12-27 Kuraray Co., Ltd. Novel macromolecular complexes, process for producing same and medicinal use of such complexes
IL84252A (en) 1987-10-23 1994-02-27 Yissum Res Dev Co Phospholipase inhibiting compositions
US4904584A (en) * 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
DK110188D0 (da) 1988-03-02 1988-03-02 Claus Selch Larsen High molecular weight prodrug derivatives of antiinflammatory drugs
US4994278A (en) 1988-03-04 1991-02-19 Noven Pharmaceuticals, Inc. Breathable backing
US5541297A (en) 1988-04-01 1996-07-30 Immunomedics, Inc. Therapeutic conjugates of toxins and drugs
FR2630329B1 (fr) 1988-04-20 1991-07-05 Merieux Inst Conjugues macromoleculaires d'hemoglobine, leur procede de preparation et leurs applications
IT1219942B (it) 1988-05-13 1990-05-24 Fidia Farmaceutici Esteri polisaccaridici
US4900780A (en) * 1988-05-25 1990-02-13 Masonic Medical Research Laboratory Acellular resuscitative fluid
US4925677A (en) * 1988-08-31 1990-05-15 Theratech, Inc. Biodegradable hydrogel matrices for the controlled release of pharmacologically active agents
US5420105A (en) * 1988-09-23 1995-05-30 Gustavson; Linda M. Polymeric carriers for non-covalent drug conjugation
US5218092A (en) * 1988-09-29 1993-06-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains
DE3836600A1 (de) 1988-10-27 1990-05-03 Wolff Walsrode Ag Kohlensaeureester von polysacchariden und verfahren zu ihrer herstellung
ATE135370T1 (de) * 1988-12-22 1996-03-15 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US6261800B1 (en) * 1989-05-05 2001-07-17 Genentech, Inc. Luteinizing hormone/choriogonadotropin (LH/CG) receptor
WO1990015628A1 (en) 1989-06-14 1990-12-27 Cetus Corporation Polymer/antibiotic conjugate
DE19975071I2 (de) * 1989-06-16 2000-02-03 Fresenius Ag Hydroxyethylstaerke als Plasmaexpander Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung als kolloidales Plasmaersatzmittel
JP2896580B2 (ja) 1989-08-25 1999-05-31 チッソ株式会社 アミロース―リゾチームハイブリッドと活性化糖およびその製造法
JP2838800B2 (ja) * 1989-09-02 1998-12-16 株式会社林原生物化学研究所 減感作剤
KR100263845B1 (ko) 1989-10-13 2000-08-16 스튜어트 엘.왓트 에리트로포이에틴 동형체와 그의 제조방법 및 그를 포함하는제약학적 조성물
JP2975632B2 (ja) 1990-03-30 1999-11-10 生化学工業株式会社 グリコサミノグリカン修飾プロテイン
US5169784A (en) 1990-09-17 1992-12-08 The Texas A & M University System Baculovirus dual promoter expression vector
JP3357362B2 (ja) 1990-12-19 2002-12-16 アドバンスド・マグネティクス・インク 多糖類を用いる治療薬のターゲティング
DK130991D0 (da) * 1991-07-04 1991-07-04 Immunodex K S Polymere konjugater
US5281698A (en) * 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
DE4130807A1 (de) * 1991-09-17 1993-03-18 Wolff Walsrode Ag Verfahren zur herstellung von polysaccharidcarbonaten
WO1993024476A1 (en) 1992-06-04 1993-12-09 Clover Consolidated, Limited Water-soluble polymeric carriers for drug delivery
EP0648239A4 (en) 1992-07-02 1995-09-27 Collagen Corp BIOCOMPATIBLE POLYMERIC CONJUGATES.
US6172208B1 (en) * 1992-07-06 2001-01-09 Genzyme Corporation Oligonucleotides modified with conjugate groups
AU5098193A (en) 1992-09-01 1994-03-29 Berlex Laboratories, Inc. Glycolation of glycosylated macromolecules
GB2270920B (en) * 1992-09-25 1997-04-02 Univ Keele Alginate-bioactive agent conjugates
WO1994013697A1 (en) 1992-12-07 1994-06-23 Magainin Pharmaceuticals, Inc. Treatment of septic shock with conjugated biologically active peptides
NZ250375A (en) 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
FI935485A (fi) * 1992-12-09 1994-06-10 Ortho Pharma Corp PEG-hydratsoni- ja PEG-oksiimisidoksen muodostavat reagenssit ja niiden proteiinijohdannaiset
CA2110543A1 (en) 1992-12-09 1994-06-10 David E. Wright Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives thereof
EP0601417A3 (de) * 1992-12-11 1998-07-01 Hoechst Aktiengesellschaft Physiologisch verträglicher und physiologisch abbaubarer, Kohlenhydratrezeptorblocker auf Polymerbasis, ein Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung
US5581476A (en) * 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
JP2594241B2 (ja) 1993-03-16 1997-03-26 ヘモソール インコーポレイテッド 酸化開環サッカライドによるヘモグロビンの選択的架橋
WO1994028024A1 (en) 1993-06-01 1994-12-08 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
US5621039A (en) * 1993-06-08 1997-04-15 Hallahan; Terrence W. Factor IX- polymeric conjugates
ZA946122B (en) 1993-08-17 1995-03-20 Amgen Inc Erythropoietin analogs
GB9317618D0 (en) 1993-08-24 1993-10-06 Royal Free Hosp School Med Polymer modifications
US5840900A (en) * 1993-10-20 1998-11-24 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
AU691225B2 (en) 1993-11-10 1998-05-14 Schering Corporation Improved interferon polymer conjugates
JPH07188291A (ja) 1993-12-27 1995-07-25 Hayashibara Biochem Lab Inc 蛋白質とその製造方法並びに用途
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
EP0788375A2 (en) 1994-11-09 1997-08-13 Robin Ewart Offord Functionalized polymers for site-specific attachment
AU709008B2 (en) 1994-12-22 1999-08-19 Access Pharmaceuticals, Inc. Complexes of dermatan sulfate and drugs, giving improved pharmacokinetics
US5876980A (en) * 1995-04-11 1999-03-02 Cytel Corporation Enzymatic synthesis of oligosaccharides
US6214331B1 (en) * 1995-06-06 2001-04-10 C. R. Bard, Inc. Process for the preparation of aqueous dispersions of particles of water-soluble polymers and the particles obtained
US5736533A (en) * 1995-06-07 1998-04-07 Neose Technologies, Inc. Bacterial inhibition with an oligosaccharide compound
WO1996040662A2 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Cellpro, Incorporated Aminooxy-containing linker compounds and their application in conjugates
WO1997021452A2 (en) 1995-12-14 1997-06-19 Advanced Magnetics, Inc. Macromolecular prodrugs of nucleotide analogs
US5723589A (en) * 1995-12-21 1998-03-03 Icn Pharmaceuticals Carbohydrate conjugated bio-active compounds
CN1273589C (zh) 1996-02-15 2006-09-06 诺沃奇梅兹有限公司 多肽缀合
JP3737518B2 (ja) 1996-03-12 2006-01-18 ピージー−ティーエックスエル カンパニー， エル．ピー． 水溶性パクリタキセルプロドラッグ
CA2251742C (en) 1996-04-15 2001-12-11 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Drug complex
US5795397A (en) 1996-05-06 1998-08-18 National Starch And Chemical Investment Holding Corporation Chemically derivatized maltodextrins
US5696152A (en) 1996-05-07 1997-12-09 Wisconsin Alumni Research Foundation Taxol composition for use as organ preservation and cardioplegic agents
TW517067B (en) 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
DE19628705A1 (de) * 1996-07-08 1998-01-15 Fresenius Ag Neue Sauerstoff-Transport-Mittel, diese enthaltende Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugate, Verfahren zu deren Herstellung, sowie deren Verwendung als Blutersatzstoffe
US5770645A (en) * 1996-08-02 1998-06-23 Duke University Medical Center Polymers for delivering nitric oxide in vivo
US5851984A (en) 1996-08-16 1998-12-22 Genentech, Inc. Method of enhancing proliferation or differentiation of hematopoietic stem cells using Wnt polypeptides
AU743469C (en) 1996-08-30 2004-02-12 Rolf Bald Mirror-symmetrical selection and evolution of nucleic acids
DE69730152T2 (de) 1996-09-30 2005-11-03 University Of Arkansas, Fayetteville Verfahren zur erzeugung aktiver immunität durch vakzinkonjugate
DE19640791A1 (de) 1996-10-02 1998-04-16 Syntesome Ges Fuer Medizinisch Glycokonjugate als Inhibitoren der viralen Zelladhäsion
WO1998020905A2 (en) 1996-11-08 1998-05-22 Biomedical Frontiers, Inc. Treatment of iron overload disorders
US6011008A (en) * 1997-01-08 2000-01-04 Yissum Research Developement Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Conjugates of biologically active substances
ATE200030T1 (de) 1997-01-29 2001-04-15 Polymasc Pharmaceuticals Plc Pegylationsverfahren
US5952347A (en) * 1997-03-13 1999-09-14 Merck & Co., Inc. Quinoline leukotriene antagonists
US6299881B1 (en) * 1997-03-24 2001-10-09 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Uronium salts for activating hydroxyls, carboxyls, and polysaccharides, and conjugate vaccines, immunogens, and other useful immunological reagents produced using uronium salts
JPH10287554A (ja) 1997-04-16 1998-10-27 Sankyo Co Ltd 機能性リポソーム
US5990237A (en) * 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
EP0998303B1 (en) 1997-06-12 2006-02-15 Innovata PLC Polymer-drug conjugate for the treatment of cancer
CA2299271C (en) * 1997-08-07 2009-02-03 University Of Utah Prodrugs and conjugates of thiol- and selenol- containing compounds and methods of use thereof
US5847110A (en) 1997-08-15 1998-12-08 Biomedical Frontiers, Inc. Method of reducing a schiff base
IL135148A0 (en) 1997-10-03 2001-05-20 Galenica Pharmaceuticals Inc A polysaccharide conjugate and pharmaceutical compositions containing the same
US6875594B2 (en) * 1997-11-13 2005-04-05 The Rockefeller University Methods of ligating expressed proteins
US6624142B2 (en) * 1997-12-30 2003-09-23 Enzon, Inc. Trimethyl lock based tetrapartate prodrugs
DE19808079A1 (de) 1998-02-20 1999-08-26 Schering Ag Hydroxyethylstärke-Konjugate, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Mittel
US6596135B1 (en) * 1998-03-05 2003-07-22 Asahi Glass Company, Limited Sputtering target, transparent conductive film, and method for producing the same
US6153655A (en) * 1998-04-17 2000-11-28 Enzon, Inc. Terminally-branched polymeric linkers and polymeric conjugates containing the same
FR2781767B1 (fr) 1998-07-31 2000-10-13 Valois Sa Dispositif de distribution de produit fluide
FR2783838B1 (fr) 1998-09-25 2000-12-01 Roquette Freres Procede de preparation d'un melange d'enzymes de branchement de l'amidon extraites d'algues
US6660843B1 (en) * 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6261594B1 (en) * 1998-11-25 2001-07-17 The University Of Akron Chitosan-based nitric oxide donor compositions
EP1035137A1 (en) 1999-03-12 2000-09-13 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Method for the reductive amination of polysaccharides
NZ514021A (en) * 1999-04-26 2001-09-28 Neurosearch As Heteroaryl diazacycloalkanes, their preparation and use
FR2792941B1 (fr) 1999-04-30 2001-07-27 Roquette Freres Polymeres solubles de glucose branches et leur procede d'obtention
US6818630B1 (en) 1999-06-18 2004-11-16 Ml Laboratories Plc Biologically active materials
CZ299516B6 (cs) 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
US7279176B1 (en) * 1999-09-02 2007-10-09 Rice University Nitric oxide-producing hydrogel materials
US20020065410A1 (en) * 1999-12-02 2002-05-30 Antrim Richard L. Branched starches and branched starch hydrolyzates
US6555660B2 (en) * 2000-01-10 2003-04-29 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
US6749865B2 (en) * 2000-02-15 2004-06-15 Genzyme Corporation Modification of biopolymers for improved drug delivery
ATE429251T1 (de) 2000-03-21 2009-05-15 Loibner Hans Dr Polysaccharid-polypeptid konjugat
US6586398B1 (en) * 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
JP2001294601A (ja) 2000-04-11 2001-10-23 Akita Prefecture 高度分岐澱粉と該高度分岐澱粉の製造方法
JP2002003398A (ja) 2000-04-17 2002-01-09 Ltt Institute Co Ltd 徐放製剤、その製造法及びワクチン
WO2001083522A2 (en) 2000-05-01 2001-11-08 Eidgenossisch Technische Hochschule Zurich Growth factor modified protein matrices for tissue engineering
DE10023051B4 (de) 2000-05-11 2004-02-19 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren zur Herstellung von Fluoresceinisothiocyanat-Sinistrin, dessen Verwendung und Fluoresceinisothiocyanat-Sinistrin enthaltende diagnostische Zubereitung
US6242482B1 (en) 2000-06-05 2001-06-05 United Therapeutics Corporation Prostaglandin compounds and derivatives thereof, compositions containing the same and method of using the same for the treatment of congestive heart failure
KR100396983B1 (ko) 2000-07-29 2003-09-02 이강춘 고반응성의 가지 달린 고분자 유도체 및 고분자와 단백질또는 펩타이드의 접합체
DE10041541A1 (de) 2000-08-24 2002-03-14 Michael Duchene Rekombinante Allergene aus der Motte Plodia interpunctella
US6417347B1 (en) * 2000-08-24 2002-07-09 Scimed Life Systems, Inc. High yield S-nitrosylation process
EP1315513B1 (en) 2000-09-08 2011-03-09 Amylin Pharmaceuticals, Inc. "pseudo"-native chemical ligation
WO2002028841A2 (en) 2000-10-02 2002-04-11 Molecular Probes, Inc. Reagents for labeling biomolecules having aldehyde or ketone moieties
IT1319666B1 (it) 2000-11-17 2003-10-23 Pharma Biotech Ltd Addotti di antibiotici con polimeri polisaccaridici naturali in formadi soluzioni acquose.
DE10105921A1 (de) 2001-02-09 2002-08-14 Braun Melsungen Ag An Kolloide gebundene Arzneiwirkstoffe
DE10126158A1 (de) 2001-05-30 2002-12-12 Novira Chem Gmbh Eine Methode zur Synthese von Gemischen einfach aktivierter und nicht aktivierter Polyoxyalkylene zur Modifizierung von Proteinen
DE10129369C1 (de) 2001-06-21 2003-03-06 Fresenius Kabi De Gmbh Wasserlösliches, einen Aminozucker aufweisendes Antibiotikum in Form eines Pol ysaccharid-Konjugats
DE10135694A1 (de) 2001-07-21 2003-02-06 Supramol Parenteral Colloids Amphiphile Stärke-und Hydroxyethylstärke-Konjugate
US6908963B2 (en) 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7125843B2 (en) * 2001-10-19 2006-10-24 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugates including more than one peptide
NZ532027A (en) 2001-10-10 2008-09-26 Neose Technologies Inc Remodeling and glycoconjugation of peptides
US7179617B2 (en) * 2001-10-10 2007-02-20 Neose Technologies, Inc. Factor IX: remolding and glycoconjugation of Factor IX
DE50214456D1 (de) 2001-10-26 2010-07-08 Noxxon Pharma Ag Modifizierte l-nukleinsäure
US6375846B1 (en) * 2001-11-01 2002-04-23 Harry Wellington Jarrett Cyanogen bromide-activation of hydroxyls on silica for high pressure affinity chromatography
DE10155098A1 (de) 2001-11-09 2003-05-22 Supramol Parenteral Colloids Mittel zur Prävention von mykotischen Kontaminationen bei der Zell- und Gewebekultur bakteriellen, pflanzlichen, animalischen und humanen Ursprungs, bestehend aus Polyen-Makrolid-Konjugaten mit Polysacchariden
AU2002357806A1 (en) 2001-12-11 2003-06-23 Sun Bio, Inc. Novel monofunctional polyethylene glycol aldehydes
US6916962B2 (en) * 2001-12-11 2005-07-12 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
US20050085432A1 (en) 2001-12-26 2005-04-21 Aviva Lapidot Methods of using conjugates of saccharides and acetamidino or guanidino compounds for treating bacterial infections
DE10207072A1 (de) 2002-02-20 2003-08-28 Supramol Parenteral Colloids Stärkederivate, ihre Konjugate und Verfahren zur Herstellung derselben
DE10209822A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
ATE368066T1 (de) 2002-03-13 2007-08-15 Beijing Jiankai Technology Co Hydrophiles polymerderivat mit y-verzweigung und herstellungsverfahren dafür; obige verbindung enthaltender medizinischer verbundwerkstoff
DE10217994A1 (de) 2002-04-23 2003-11-06 Supramol Parenteral Colloids Konjugate von hyperverzweigten Polysacchariden
AU2003249692B2 (en) 2002-06-03 2008-07-31 The Institute For Systems Biology Methods for quantitative proteome analysis of glycoproteins
EP1534269B1 (en) 2002-07-19 2013-10-30 The General Hospital Corporation Oxime conjugates and methods for their formation and use
ES2897470T3 (es) * 2002-09-09 2022-03-01 Nektar Therapeutics Alcanales poliméricos solubles en agua
EP1591467A1 (en) 2002-09-09 2005-11-02 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugate between a polyethylene glycol having a terminal alkanal group and a human growth hormone
ES2214166T1 (es) * 2002-09-11 2004-09-16 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Polipeptidos has-ilados, especialmente, eriptropoyetina has-ilada.
DE10242076A1 (de) 2002-09-11 2004-03-25 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh HAS-Allergen-Konjugate
EP1549350B1 (en) * 2002-10-08 2008-09-24 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Pharmaceutically active oligosaccharide conjugates
DE10254745A1 (de) 2002-11-23 2004-06-03 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Imidazolide von Polysaccharid Aldonsäuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung zur Kopplung an pharmazeutische Wirkstoffe
DE10256558A1 (de) 2002-12-04 2004-09-16 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Ester von Polysaccharid Aldonsäuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung zur Kopplung an pharmazeutische Wirkstoffe
DE10302520A1 (de) 2003-01-23 2004-08-05 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Kohlensäurediester von Stärkefraktionen und deren Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung zur Kopplung an pharmazeutische Wirkstoffe
BRPI0413450A (pt) * 2003-08-08 2006-10-17 Fresenius Kabi De Gmbh conjugados de hidroxialquil amido e g-csf
KR101154343B1 (ko) 2003-08-08 2012-07-05 프레제니우스 카비 도이치란트 게엠베하 히드록시알킬 스타치 및 ｇ-ｃｓｆ의 컨쥬게이트
WO2005014024A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of a polymer and a protein linked by an oxime linking group
JP2007501811A (ja) 2003-08-08 2007-02-01 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 治療的な関心対象のタンパク質に対する遅延分子の選択的な化学物質接合のためのガラクトースオキシダーゼの使用。
EP1713508A2 (en) 2004-01-29 2006-10-25 Biosynexus Incorporated Use of amino-oxy functional groups in the preparation of vaccine conjugates
CA2555467C (en) 2004-02-09 2012-10-09 Noxxon Pharma Ag Process for the production of conjugates from polysaccharides and polynucleotides
DE102004009783A1 (de) 2004-02-28 2005-09-15 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Hyperverzweigte Stärkefraktion, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Konjugate mit pharmazeutischen Wirkstoffen
TW200603818A (en) 2004-03-11 2006-02-01 Fresenius Kabi De Gmbh Conjugates of hydroxyethyl starch and erythropoietin
EP1732609B1 (en) 2004-03-11 2012-07-11 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
JP5191729B2 (ja) * 2004-03-11 2013-05-08 フレゼニウス・カビ・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング 還元的アミノ化によって製造される、ヒドロキシアルキルデンプンとタンパク質とのコンジュゲート
WO2005112954A1 (en) 2004-05-14 2005-12-01 William Marsh Rice University Nitric oxide releasing compositions and associated methods
AU2006222187A1 (en) 2005-03-11 2006-09-14 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Production of bioactive glycoproteins from inactive starting material by conjugation with hydroxyalkylstarch
US7341720B2 (en) 2005-04-06 2008-03-11 Genzyme Corporation Targeting of glycoprotein therapeutics
EP1762250A1 (en) 2005-09-12 2007-03-14 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and an active substance, prepared by chemical ligation via thiazolidine
WO2007053292A2 (en) 2005-10-31 2007-05-10 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Polysaccharide-derived nitric oxide-releasing carbon-bound diazeniumdiolates
JP2009093397A (ja) * 2007-10-09 2009-04-30 Panasonic Corp タッチパネル及びこれを用いた入力装置
EP2070950A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation
EP2070951A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Method for producing a hydroxyalkyl starch derivatives with two linkers
MX2011003738A (es) 2008-10-07 2011-09-30 Rexahn Pharmaceuticals Inc Conjugados hpma-docetaxel o gemcitabine y sus usos asociados.

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999049897A1 (en) * 1998-03-31 1999-10-07 Hemosol Inc. Hemoglobin-polysaccharide conjugates
WO2002080979A2 (de) * 2001-03-16 2002-10-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Hydroxyalkylstärke-wirkstoff-konjugate
WO2003074087A1 (de) * 2002-03-06 2003-09-12 Biotechnologie - Gesellschaft Mittelhessen Mbh Kopplung von proteinen an ein modifiziertes polysaccharid
EP1398328A1 (en) * 2002-09-11 2004-03-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives
EP1398327A1 (en) * 2002-09-11 2004-03-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Method of producing hydroxyalkyl starch derivatives
WO2004024761A1 (en) * 2002-09-11 2004-03-25 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Hasylated polypeptides, especially hasylated erythropoietin
EP1424086A1 (en) * 2002-11-26 2004-06-02 Ethicon, Inc. Hemostatic wound dressing containing aldehyde-modified polysaccharide and hemostatic agents
WO2005014655A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein

Also Published As

Publication number Publication date
AR045450A1 (es) 2005-10-26
WO2005092390A3 (en) 2006-06-08
US20110200555A1 (en) 2011-08-18
WO2005014655A3 (en) 2005-06-16
KR101303620B1 (ko) 2013-09-16
AU2005226844A1 (en) 2005-10-06
EP2270036A2 (en) 2011-01-05
WO2005092390A9 (en) 2006-12-28
KR20060129078A (ko) 2006-12-14
EA200601670A1 (ru) 2007-02-27
CN1933857B (zh) 2011-01-05
JP2007527891A (ja) 2007-10-04
US8017739B2 (en) 2011-09-13
AU2005226844B2 (en) 2011-09-08
EP1799267A2 (en) 2007-06-27
TW200600518A (en) 2006-01-01
CN1933857A (zh) 2007-03-21
US20090047251A1 (en) 2009-02-19
WO2005014655A2 (en) 2005-02-17
ES2438216T3 (es) 2014-01-16
CA2558725A1 (en) 2005-10-06
EP2270036A3 (en) 2012-03-28
BRPI0508628A (pt) 2007-08-07
WO2005092390A2 (en) 2005-10-06
US8840879B2 (en) 2014-09-23
JP4937105B2 (ja) 2012-05-23
AR048006A1 (es) 2006-03-15
EP1799267B1 (en) 2013-10-23
EP2270037A2 (en) 2011-01-05
EP2270037A3 (en) 2011-12-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA014103B1 (ru) Конъюгат, включающий белок и полимер или его производное (варианты), способ его получения, применение конъюгата и содержащая его фармацевтическая композиция
TWI417303B (zh) 經由還原胺化作用製得之羥烷基澱粉及蛋白質的接合物
JP7054407B2 (ja) オキシム連結のための求核触媒
KR101832937B1 (ko) 혈액 응고 단백질 복합체
EA018222B1 (ru) Производные гидроксиалкилкрахмала и способ их получения
JP6711935B2 (ja) オキシム連結のための求核触媒
RU2744370C2 (ru) Конъюгаты белков свертывания крови
TW201247709A (en) Therapeutic proteins with increased half-life and methods of preparing same
JPH0463053B2 (ru)
EA006368B1 (ru) Химически модифицированные конъюгаты прогенипоэтина
MXPA06010189A (en) Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein, prepared by reductive amination

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): BY RU