EA006368B1 - Химически модифицированные конъюгаты прогенипоэтина - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к химически модифицированным прогенипоэтинам (ProGP), полученным путем связывания водорастворимого полимера с белком. Химически модифицированный белок по настоящему изобретению может обладать намного более продолжительной активностью по увеличению числа нейтрофилов по сравнению с таковой для немодифицированного ProGP, что обеспечивает снижение дозы и благоприятные возможности для режима введения.

Description

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к химической модификации прогенипоэтинов (РгоСР), семейству рекомбинантных белков, которые являются многофункциональными агонистами лиганда Ш3 и рецептора другого кроветворного фактора роста, включая в качестве неограничивающего примера С-С8Р, посредством которой могут изменяться химические и/или физиологические свойства РгоСР. Модифицированные ПЭГ РгоСР могут обладать сниженной скоростью клиренса, увеличенной стабильностью, сниженной антигенностью или комбинацией данных свойств. Семейство белков РгоСР определяется как семейство многофункциональных белков, в состав которого входит агонист рецептора Γ1ΐ3 и агонист рецептора второго кроветворного фактора роста или колониестимулирующего фактора, описанные в ^098/17810, который полностью включен сюда. Настоящее изобретение также относится к способам модификации РгоСР. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, включающим модифицированный РгоСР. Дальнейшим осуществлением является применение модифицированного РгоСР для лечения нарушений кроветворения.

Предпосылки изобретения

Прогенипоэтин может использоваться при лечении общих нарушений кроветворения, включая те, что возникают от химиотерапии или от радиационной терапии (Мас Уйбе, Т. I.; с1 а1., Ехр. Нета1о1. (1999), 27 (10), 1557-1568). РгоСР может также использоваться при трансплантации костного мозга, заживлении ран, лечении ожогов и лечении паразитарной, бактериальной или вирусной инфекции.

Было сделано общее наблюдение, что физиологически активные белки, вводимые в организм, могут проявлять свою фармакологическую активность только в течение краткого периода вследствие высокой скорости их клиренса из организма. Более того, относительная гидрофобность данных белков может ограничивать их стабильность.

В целях снижения скорости клиренса, улучшения стабильности или отмены антигенности терапевтических белков были предложены некоторые способы, в которых белки химически модифицируют водорастворимыми полимерами. Химические модификации данного типа могут эффективно блокировать протеолитический фермент от физического контакта с самим остовом белка, предотвращая таким образом деградацию. Химическое присоединение может эффективно снижать почечный клиренс. Дополнительные преимущества при определенных условиях включают в себя увеличение стабильности и времени циркуляции терапевтического белка, повышение растворимости и снижение иммуногенности. Обзорной статьей, описывающей модификацию и слияние белков, является Егаис18, Росик оп Сго\\111 Рас!огк 3: 4-10 (Мау 1992) (опубликовано МебйспрГ МоипМете Соий. Рпет Вагпе! Ьапе, Ьопбоп N20, 0БП. ИК) .

Полиалкиленоксид, особенно полиэтиленгликоль (ПЭГ), представляет собой одну из таких химических молекул, которые применяли для получения терапевтических белковых продуктов (таким образом, «ПЭГилирование» означает присоединение по крайней мере одной молекулы ПЭГ). Присоединение полиэтиленгликоля, как было показано, защищает против протеолиза, 8аба, е! а1, 1. Регтеп!а1юп Вюепдь пеегтд 71: 137-139 (1991), и доступны способы присоединения нескольких молекул полиэтиленгликоля. См. патент США № 4179337, ЭауД е! а1., Неиммуногенные полипептиды, выданный 18 декабря 1979 г.; и патент США № 4002531, Коуег, Модификация ферментов полиэтиленгликолем и полученный таким образом продукт, выданный 11 января 1977 г. Для обзора см. АЬисйотекг е! а1., ш Епхутек ак Эгидк. (1.8. Но1сегЬегд апб 1. КоЬейк, ебк. рр. 367-383 (1981)).

Использованы другие водорастворимые полимеры, такие как сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли (-1,3-диоксолан), поли(-1,3,6-триоксан), сополимер этилена/малеинового ангидрида, и полиаминокислоты (гомополимеры или произвольные сополимеры).

Описано несколько примеров модифицированных ПЭГ терапевтических белков. А^АСЕN®, модифицированный ПЭГ препарат аденозиндеаминазы, разрешен для лечения тяжелого комбинированного иммунодефицитного заболевания. ОЖ’А8РАР®. модифицированная ПЭГ Ь-аспарагиназа, разрешена для лечения пациентов с гиперчувствительным АБЬ (острым лимфолейнозом). Модифицированная ПЭГ супероксиддисмутаза находится в клинических испытаниях для лечения травмы головы. Модифицированный ПЭГ α-интерферон (патент США 5738846, 5382657) тестируют в клинических испытаниях III фазы для лечения гепатита посредством ПЭГ-Интрона (пэгитрон альфа-2Ь), разрешенного для лечения хронического гепатита С, тогда как еще одна молекула, РЕСА8У8®, пока ожидает разрешения регулирующего органа; сообщается, что модифицированная ПЭГ глюкоцереброзидаза и модифицированный ПЭГ гемоглобин находятся на доклиническом тестировании. Еще одним примером является модифицированный ПЭГ Ш-6; ЕР 0442724, озаглавленный Модифицированный ЫЬ-6, в котором описаны молекулы полиэтиленгликоля, добавленные к Ш-6.

Другим конкретным терапевтическим белком, который химически модифицирован, является гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (С-С8Р). С-С8Р индуцирует быструю пролиферацию и высвобождение нейтрофильных гранулоцитов в кровяное русло и таким образом обеспечивает терапевтический эффект борьбы с инфекцией. В публикации Европейского патента ЕР 0401384, опубликованного 12 декабря 1990 г., озаглавленного Химически модифицированный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, описаны материалы и методы для получения С-С8Р, к которому присоединены моле

- 1 006368 кулы полиэтиленгликоля. Модифицированный С-С8Р и его аналоги также описаны в ЕР 0473268, опубликованном 4 марта 1992 г., озаглавленном Длительное высвобождение фармацевтических композиций, включающих полипептид, ковалентно конъюгированный с водорастворимым полимером, устанавливающем применение различных С-С8Р и его производных, ковалентно конъюгированных с водорастворимым полимером в виде частиц, таким как полиэтиленгликоль. О модифицированном полипептиде, обладающем активностью человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, сообщается в ЕР 0335423, опубликованном 4 октября 1989 г. Патент США 58247 84 относится к способам Νконцевой модификации белков, включая композиции химически модифицированного с Ν-конца С-С8Р. В патенте США 5824778 описан химически модифицированный С-С8Р.

В заявке на выдачу патента Японии Не12 (1990)-30555 описан химически модифицированный человеческий 1Ь-3, обладающий сниженной антигенностью.

Семейство белков РгоСР описано в \УО 98/17810.

Для полиэтиленгликоля было использовано много средств присоединения молекул полиэтиленгликоля к белку. В основном молекулы полиэтиленгликоля присоединяют к белку посредством реакционноспособной группы на белке.

Для такого присоединения подходят аминогруппы, такие как те, что на остатках лизина и на Νконцах. Например, Коуег (патент США № 4002531, выше) заявляет, что восстановительное алкилирование применялось для присоединения молекул полиэтиленгликоля к ферменту. В ЕР 0539167, опубликованном 28 апреля 1993 г., ^Мг1дН(, Имидаты ПЭГ и их белковые производные, заявлено, что пептидные и органические соединения со свободной(-ыми) аминогруппой(-ами) модифицируют имидатными производными ПЭГ или родственных водорастворимых органических полимеров. С'11ато\у е! а1., Вюсоищда!е СЬет. 5: 133-140 (1994) сообщают о модификации иммуноадгезина С'П4 монометоксиполиэтиленгликольальдегидом путем восстановительного алкилирования. Авторы сообщают, что 50% С'П4-1д модифицировалось МеРЕС в условиях, позволяющих осуществлять контроль за степенью модификации ПЭГ (там же на стр. 137). Авторы также сообщают, что связывающая способность модифицированного С'П4-1д ίη νίίτο (по отношению к белку др120) снижалась со скоростью, коррелировавшей со степенью модификации МеРЕС (там же). Патент США № 4904584, 81ι;·ι\ν. выданный 27 февраля 1990 г., относится к модификации некоторого числа остатков лизина в белках для присоединения молекул полиэтиленгликоля через реакционноспособные аминогруппы.

Многие способы присоединения полимера к белку включают применение группы, действующей в качестве связывающей группы. Однако, такие группы могут быть антигенными. Доступен способ с использованием тресил-хлорида, не задействующий связывающей группы, но данный способ, возможно, трудно применять для получения терапевтических продуктов, поскольку использование тресил-хлорида может приводить к продукции токсичных побочных продуктов. См. Ргапс18 е! а1., Ιη: 81аЫ1Цу оГ рго!ет Р11агтасеиОса1х: ίη νίνυ ра(11\уаух оГ бещабаОоп апб хтиещех Гог рго!ет х1аЫ1|/аОоп (Ебх. АЬегп, Т. апб Мапшпд, М.С.) Р1епит, №\у Уогк, 1991). Также, Ое1дабо е! а1., Соирйпд оГ РЕС !о Рго!ет Ву ЛсбсаОоп \νί(1ι Тгеху1 СЫопбе'. Аррйсабоп 1п ОппшпоаГПпЦу Се11 Ргерагабоп, ш 8ерагаОопх Иктд Ацпеопх РЬахе 8у51етх. Аррйсабоп 1п Се11 Вю1оду апб Вю!есЬпо1о§у, РщЬег е! а1., ебх. Р1епит Ргехх, №\у Уогк, Ν.Υ., 1989 рр. 211-213.

См. также, Воке е! а1., Вюсопщда!е СЬепихЦу 2: 154-159 (1991), где сообщается о селективном присоединении линкерной группы карбогидразида к С-концевой карбоксильной группе белкового субстрата (инсулина).

Настоящее изобретение относится к химически модифицированным молекулам РгоСР, характеризующимся сниженной скоростью клиренса, повышенной стабильностью, сниженной антигенностью или комбинацией данных свойств.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к химически модифицированным РгоСР, которые характеризуются улучшением, по крайней мере, одного химического или физиологического свойства, выбранного из сниженной скорости клиренса, повышенной стабильности, сниженной антигенности в качестве неограничивающих примеров. Таким образом, как это описано ниже более подробно, настоящее изобретение характеризуется некоторым количеством аспектов, относящихся к химической модификации РгоСР, а также к специфическим модификациям с использованием различных групп на основе полиэтиленгликоля.

Настоящее изобретение также относится к способам продукции химически модифицированных РгоСР.

Настоящее изобретение также относится к композициям, включающим химически модифицированные РгоСР.

Модифицированный РгоСР по настоящему изобретению может использоваться при лечении нейтропении, тромбоцитопении, мобилизации кроветворных предшественников и стволовых клеток в периферическую кровь, подавления костного мозга и дефицитов кроветворения и иммунодефицитов, в качестве неограничивающих примеров.

- 2 006368

Краткое описание рисунков

Фиг. 1 представляет собой репродукцию профиля элюции при ионообменной хроматографии реакционной смеси ПЭГ-АБЭ с молекулярной массой 30000 и РтоСР-4.

Фиг. 2а представляет собой профиль 8ЕС-НРБС рекомбинантного РтоСР-4.

Фиг. 2Ь представляет собой профиль 8ЕС-НРЬС реакционной смеси ПЭГ-АБЭ с молекулярной массой 30000 и РгоСР-4.

Фиг. 2с представляет собой профиль 8ЕС-НРБС очищенного на ионообменнике модифицированного с Ν-конца одной молекулой ПЭГ-АБЭ с молекулярной массой 30000 РгоСР-4.

Фиг. 3 представляет собой 8Э8-РАСЕ (ПЭГ-АЬЭ массой 30000) - РгоСР-4. Дорожка 1. Белковые стандарты молекулярной массы; Дорожка 2. Пустая; Дорожка 3. РгоСР-4; Дорожка 4. (ПЭГ-АЬЭ с молекулярной массой 30000) - РгоСР-4.

Фиг. 4 представляет собой профиль 8Э8-8ЕС-НРБС очищенного на ионообменнике модифицированного с Ν-конца одной молекулой ПЭГ-АЬЭ с молекулярной массой 30000 РгоСР-4.

На фиг. 5 показан профиль обращенно-фазовой НРЬС модифицированного с Ν-конца одной молекулой ПЭГ-АЬЭ с молекулярной массой 30000 РгоСР-4.

На фиг. 6 показан спектр МАЬЭ1-ТОР очищенного на обращенной фазе модифицированного одной молекулой ПЭГ-АЬЭ с молекулярной массой 30000 мономера РгоСР-4.

На фиг. 7 показан профиль БЕС-НРЬС расщепленного трипсином модифицированного одной молекулой ПЭГ-АЬЭ с молекулярной массой 30000 РгоСР-4.

На фиг. 8 проиллюстрировано сравнение кривых реакции для агониста рецептора Й13, агониста рецептора С-С8Р, совместного добавления агониста рецептора ί!ΐ3 и агониста рецептора С-С8Р, не модифицированного ПЭГ РгоСР-4 и модифицированного одной молекулой ПЭГ-АЬЭ с молекулярной массой 30000 РгоСР-4 в анализе колониеобразующих единиц гранулоцитов/макрофагов (СРИ-СМ), в котором измеряют деление и дифференцировку происходящих из костного мозга человека СЭ34⁺-клеток.

На фиг. 9 проиллюстрировано сравнение кривых концентрации в мышиной плазме для РгоСР-4 и модифицированного одной молекулой ПЭГ-АЬЭ с молекулярной массой 30000 РгоСР-4.

На фиг. 10 сравнивается биологическая активность ίη у1уо немодифицированного ПЭГ РгоСР-4, вводимого мышам ежесуточно, по отношению к модифицированному с Ν-конца одной молекулой ПЭГ АЬЭ с молекулярной массой 30000 РгоСР-4, вводимому раз в трое суток, путем отображения общих количеств лейкоцитов (\УВС) и дендритных клеток (ЭС) в периферической крови и селезенке, определенных через 24 ч после введения дозы.

На фиг. 11 сравнивается кинетика ответа ЭС ίη у1уо для немодифицированного ПЭГ РгоСР-4, вводимого мышам ежесуточно, по отношению к модифицированному с Ν-конца одной молекулой ПЭГ-АЬЭ с молекулярной массой 30000 РгоСР-4, вводимому раз в трое суток, путем отображения общих количеств лейкоцитов (\УВС) и дендритных клеток (ЭС) в периферической крови и селезенке, определенных через 24, 4 8 и 72 ч после введения дозы.

На фиг. 12 показана аминокислотная последовательность РгоСР-4.

Подробное описание изобретения

Прогенипоэтины (РгоСР) представляют собой семейство рекомбинантных белков, которые являются многофункциональными агонистами лиганда Й13 и другого кроветворного фактора роста. Их рекомбинантная продукция и способы применения подробно описаны в \УО 98/17810.

Белки прогенипоэтины характеризуются формулой

Р|-Б|-В_;. В_;-Б|-В|. В₁-В₂ или В₂-В₁, где В₁ представляет собой полипептид, включающий аминокислотную последовательность модифицированного лиганда Й1-3 формулы

ТЪгС1пАарСуз8егРЬеС1пН1зЗегРго11еЗег5егА8рРЬеА1аУа1Ьу811еАгд

1020 <31иЬеиЗегАврТуг1.еиЬеи(31пА5рТуг₽1‘оУа1ТЬгУа1А1аЗегА5пЬе11а1пА2р

3040

61иС1иЬеиСу8О1уС1уЪеиТгрАгдЬеиУа1ЬеиА1аС1пАгдТгрМеЕС31иАгдЬеи

5060

ЬуаТЬгУа1А1аС1уЗегЬузМеЕС1пС31уЬеиЬеиО1иАгдУа1АзпТ11га1и11еН1э

7080 ₽ЬеУа1Т11гЦузСувА1аР11еС1пРгоРгоРго$егСувЬеиАгд₽йеУа101пТЬгАзп

90100

11е5егАгдЬеиЬеиС1пС1иТЬгЗегС1иа1пЬеиУа1А1аЬеиЬузРгоТгр11еТЬг

110120

АгдО 1пАзпР11еЗегАгдСуеЬеи<31 цЬеиС1 пСугСТпРгоАзгЗегЗегТБгЬеи

130 ЗЕО ТО N0:1

- 3 006368 где Ν-конец соединен с С-концом непосредственно или через линкер (Ь₂), способный соединять Νконец с С-концом и имеющий новые С- или Ν-концы у аминокислот

28-29	42-43	93-94
29-30	64-65	94-95
30-31	65-66	95-96
31-32	66-67	96-97
32-33	86-87	97-98
34-35	87-88	98-99
36-37	88-89	99-100
37-38	89-90	100-101
38-39	90-91	101-102
39-40	91-92	102-103
40-41	92-93	соответственно;
41-42

где К₂ представляет собой фактор, выбранный из группы, состоящей из колониестимулирующего фактора, цитокина, лимфокина, интерлейкина и кроветворного фактора роста;

где Ь₁ представляет собой линкер, способный связывать К₁ с К₂.

Последовательности белка прогенипоэтина может непосредственно предшествовать (метионин^-1), (аланин^-1) или (метионин^-2, аланин^-1).

В предпочтительном осуществлении белки прогенипоэтины характеризуются формулой

Ь| -Ц -К.2, К₂-Ь1 -К], К1-К2 или К2-К1, где К₁ представляет собой полипептид, включающий аминокислотную последовательность модифицированного лиганда Й1-3 формулы

ТЬтС1пАерСуз £ег Рйе<31пН ίε йе г Рго11ейег£е гАзрРЬеА1аУа 1 Ьуз 11еАгд

1020 (31иЬеийегАврТуг1>еиЬеиа1пАарТугРгоУа1Т11гУа1А1а£егАзпЬеиС1пАБр

3040

С1иС1иЬеиСу8С1у131уЬе'аТгрАгдЬеи’Уа1ЬеиА1аа1пАгд7грМеСС1иАгдЬеи

5060

ЬуетЬгУа1А1аО1у£егьузМеСС1пО1уЬеиЬеиб1иАгдУа1А5ПТНг<31и11еН1В

7080

РЬеУа1Т11гЬуБСуБА1аР11еСИпРгоРгоРго5егСузЬеиАгдРкеУа1а1пТЬгА8П

90100

I1е£егАгдЬеиЬеиС1пС1иТЬгйегО1иО1пЬеиУа1А1аьеиьузРготгр!1еТЬг

110120

АгдС1пАвηРЬе3е ГАгдСу5ЬеиС1иЬеиС1пСузС1иРгоАз г£ег5егТЙГЬеи

130 ЗЕ О Ю N0:1 где Ν-конец соединен с С-концом непосредственно или через линкер (Ь₂), способный соединять Νконец с С-концом и имеющий новые С- или Ν-концы у аминокислот

28-29	42-43	93-94
29-30	64-65	94-95
30-31	65-66	95-96
31-32	66-67	. 96-97
32-33	86-87	97-98
34-35	87-88	98-99
36-37	88-89	99-100
37-38	89-90	100-101
38-39	90-91	101-102
39-40	91-92	102-103
40-41	92-93	соответственно;
41-42

где К2 представляет собой полипептид, включающий аминокислотную последовательность модифицированного С-С8Р человека формулы

- 4 006368

10

Хаа

Хаа

Хаа

С1у

Рго

А1а

Зег Зег 20

Ьеи Рго

С1П

Зег

ХсЪс1

Ьеи

Ьеи

Хаа

Хаа

Хаа

С1и

<31п

Уа1

Хаа

Ьуз

хаа

(31п

О1у

хаа

<31у

А1а

30 Хаа

Ьеи

<31п

<31и

Хаа

Ьеи

Хаа

А1а

ТЬг

туг

40 Ьуз

Ьеи

Хаа

Хаа

Хаа

С1и

Хаа

Хаа

Уа1

Хаа

50 Хаа

(31у

Н18

зег

Хаа

(31у

Не

Рго

тгр

во

70

А1а

Рго

Ьеи

Зег

Зег

Хаа

Рго

Зег

Хаа

А1а

Ьеи

Хаа

Ьеи

А1а

О1у

Хаа

Ьеи

Зег

С1п

Ьеи

Ηίε

80 Зег

□ 1у

Ьеи

РЬе

Ьеи

Туг

С1п

С1у

Ьеи

ьеи

90 С1п

А1а

Ьеи

61и

О1у

11е

Зег

Рго

С1и

Ьеи

100 О1у

Рго

ТЬг

Ьеи

Хаа

ТЬг

Ьеи

(31п

Хаа

Аэр

110 Уа1

А1а

Аар

РЬе

А1а

Хаа

ТЬг

11е

Тгр

С1П

120 С1П

МеЬ

С1и

Хаа

Хаа

О1у

Меб

А1а

РГО

А1а

130 Ьеи

С1п

Рго

ТЬг

<31п

<31у

А1а

Мее

Рго

А1а

140 РЬе

А1а

Зег

А1а

Хаа

<31п

Хаа

Хаа

А1а

С1у

150 <31у

Уа1

Ьеи

7а1

А1а

Зег

Хаа

Ьеи

αΐη

Хаа

160 РЬе

Ьеи

Хаа

Хаа

Зег

Туг

Агд

Уа1

Ьеи

Хаа

170 Хаа

Ьеи

А1а

<31п

Рго

5Е0

Ю

ΝΟ:

260

где

Хаа в положении 1 представляет собой ТНг, Бег, Агд, Туг или С1у;

Хаа в положении 2 представляет собой Рго или Ьеи;

Хаа в положении 3 представляет собой Ьеи, Агд, Туг или Бег;

Хаа в положении 13 представляет собой РНе, Бег, Н1к, ТНг или Рго;

Хаа в положении 16 представляет собой Ьук, Рго, Бег, ТНг или Н1к;

Хаа в положении 17 представляет собой Сук, Бег, С1у, А1а, 11е, Туг или Агд;

Хаа в положении 18 представляет собой Ьеи, ТНг, Рго, Н1к, 11е или Сук;

Хаа в положении 22 представляет собой Агд, Туг, Бег, ТНг или А1а;

Хаа в положении 24 представляет собой 11е, Рго, Туг или Ьеи;

Хаа в положении 27 представляет собой Акр, или С1у;

Хаа в положении 30 представляет собой А1а, 11е, Ьеи или С1у;

Хаа в положении 34 представляет собой Ьук или Бег;

Хаа в положении 36 представляет собой Сук или Бег;

Хаа в положении 42 представляет собой Сук или Бег;

Хаа в положении 43 представляет собой Н1к, ТНг, С1у, Уа1, Ьук, Тгр, А1а, Агд, Сук, или Ьеи; Хаа в положении 44 представляет собой Рго, С1у, Агд, Акр, Уа1, А1а, Н1к, Тгр, С1п. или ТНг; Хаа в положении 46 представляет собой С1и, Агд, РНе, Агд, 11е или А1а;

Хаа в положении 47 представляет собой Ьеи или ТНг;

Хаа в положении 49 представляет собой Ьеи, РНе, Агд или Бег;

Хаа в положении 50 представляет собой Ьеи, 11е, Н1к, Рго или Туг;

Хаа в положении 54 представляет собой Ьеи или Н1к;

Хаа в положении 64 представляет собой Сук или Бег;

Хаа в положении 67 представляет собой С1п. Ьук, Ьеи или Сук ;

Хаа в положении 70 представляет собой С1п. Рго, Ьеи, Агд или Бег;

Хаа в положении 74 представляет собой Сук или Бег;

Хаа в положении 104 представляет собой Акр, С1у или Уа1;

Хаа в положении 108 представляет собой Ьеи, А1а, Уа1, Агд, Тгр, С1и или С1у;

Хаа в положении 115 представляет собой ТНг, Н1к, Ьеи или А1а;

Хаа в положении 120 представляет собой С1п. С1у, Агд, Ьук или Н1к;

Хаа в положении 123 представляет собой С1и, Агд, РНе или ТНг;

Хаа в положении 144 представляет собой РНе, Н1к, Агд, Рго, Ьеи, С1и или С1и;

Хаа в положении 14 6 представляет собой Агд или С1и;

Хаа в положении 147 представляет собой Агд или С1и;

- 5 006368

Хаа в положении 156 представляет собой Ηίκ, С1у или Бет;

Хаа в положении 159 представляет собой Бет, Агд, ТЬг, Туг, Уа1 или С1у;

Хаа в положении 162 представляет собой С1и, Ьеи, С1у или Тгр;

Хаа в положении 163 представляет собой Уа1, С1у, Агд или А1а;

Хаа в положении 169 представляет собой Агд, Бег, Ьеи, Агд или Сук;

Хаа в положении 170 представляет собой Ηίκ, Агд или Бег;

где аминокислоты 1-11 с Ν-конца и/или аминокислоты 1-5 с С-конца необязательно удалены из указанной аминокислотной последовательности модифицированного С-СБР человека; и где Ν-конец соединен с С-концом непосредственно или через линкер (Ь₂) , способный соединять Νконец с С-концом и имеющий новые С- или Ν-концы у аминокислот

38-39	62-63	123-124
39-40	63-64	124-125
40-41	64-65	125-126
41-42	65-66	126-127
42-43	66-67	128-129
43-44	67-68	128-129
45-46	68-69	129-130
48-49	69-70	130-131
49-50	70-71	131-132
52-53	71-72	132-133
53-54	91-92	133-134
54-55	92-93	134-135
55-56	93-94	135-136
56-57	94-95	136-137
57-58	95-96	137-138
58-59	96-97	138-139
59-60	97-98	139-140
60-61	98-99	140-141
61-62	99-100	141-142

или 142-143 соответственно;

где Ь1 представляет собой линкер, способный связывать Ш с Я₂.

Еще в одном осуществлении последовательности прогенипоэтина может непосредственно предшествовать (метионин^-1), (аланин^-1) или (метионин^-2, аланин^-1).

В предпочтительном осуществлении В₁ выбран из

5Е0 Ιϋ N0:2, ЗЕО Ю N0:3, ЗЕО Ю N0:4,

5Е0 ГО N0:5, ЗЕО ГО

N0:6, ЗЕО Ю N0:7, ЗЕО Ιϋ N0:8, ЗЕО Ю	N0	:9, ЗЕО	ГО
N0:10, ЗЕО	10	N0:11,	ЗЕО	ГО	N0:12,	ЗЕО	ГО	N0:13,	ЗЕО	ГО
N0:14, ЗЕО	го	N0:15,	ЗЕО	ю	N0:16,	ЗЕО	ГО	N0:17,	ЗЕО	ГО
N0:18, ЗЕО	ю	N0:19,	ЗЕО	го	N0:20,	ЗЕО	10	N0:21,	ЗЕО	ГО
N0:22, ЗЕО	ю	N0:23,	ЗЕО	го	N0:24,	ЗЕО	го	N0:25,	ЗЕО	го
N0:26, ЗЕО	ю	N0:27,	ЗЕО	го	N0:28,	ЗЕО	Ιϋ	N0:29,	ЗЕО	то
N0:30, ЗЕО	го	N0:31,	ЗЕО	го	N0:169,	ЗЕО	I ГО N0:170	ι, ЗЕО
Ιϋ N0:171,	ЗЕО 10 N0:	: 172,	ЗЕО ГО N0:173	, ЗЕО Ю N0:174,

и ЗЕО Ю N0:175.

В предпочтительном осуществлении В₂ представляет собой СМ-СБР, С-СБР, С-СБР Бег¹⁷, лиганд с-тр1 (ТРО) , М-СБР, эритропоэтин (ЕРО), 1Ь-1, 1Ь-4, 1Ь-2, 1Ь-3, вариант 1Ь-3, 1Ь-5, 1Ь 6, 1Ь-7, Ш-8, 1Ь-9, 1Ь-10, 1Ь-11, 1Ь-12, 1Ь-13, 1Ь-15, ЫР, лиганд Д13/11к2, человеческий гормон роста, фактор роста В-клеток, фактор дифференцировки В-клеток, фактор дифференцировки эозинофилов и фактор стволовых клеток (БСР).

В предпочтительном осуществлении белок прогенипоэтин выбран из

ЗЕО

го

N0:

32,

ЗЕО

ГО

N0:33,

ЗЕО

ГО

N0:34,

ЗЕО

ГО

N0:35,

ЗЕО ГО

N0:

36,

ЗЕО

ГО

N0:

37,

ЗЕО ГО

N0:

38,

ЗЕО ГО

N0:

39,

ЗЕО ГО

N0:40,

ЗЕО

го

N0:

41,

ЗЕО

10

N0:42,

ЗЕО

ГО

N0:43,

ЗЕО

ГО

N0:44,

ЗЕО ГО

N0:

45,

ЗЕО

ГО

N0:

46,

ЗЕО ГО

N0:

47,

ЗЕО Ю

N0:

48,

ЗЕО Ю

N0:49,

ЗЕО

ГО

N0:

50,

ЗЕО

ГО

N0:51,

ЗЕО

ГО

N0:52,

ЗЕО

ГО N0:53, 3

ЕО Ю

- 6 006368

N0:54, 3Ε0	ΙΌ	N0:55,	8Ε0	Ю	N0:56,	ΞΕΟ	Ιϋ	N0:57,	ΞΕΟ	Ю
N0:58, ΞΕΟ	ΙΒ	N0:59,	ΞΕΟ	ΙΒ	N0:60,	ΞΕΟ	ΙΌ	N0:61,	ΞΕΟ	ΙΏ
N0:62, ΞΕΟ	ΙΌ	N0:63,	ΞΕΟ	Ю	N0:64,	ΞΕΟ	ΐϋ	N0:65,	ΞΕΟ	Ю
N0:66, ΞΕΟ	Ιϋ	N0:67,	ΞΕΟ	ΙΒ	N0:68,	ΞΕΟ	Ιϋ	N0:69,	ΞΕΟ	Ιϋ
N0:70, ΞΕΟ	ΙΟ	N0:71,	ΞΕΟ	ΙΒ	N0:72,	ΞΕΟ	Ιϋ	N0:73,	ΞΕΟ	Ю
N0:74, ΞΕΟ	Ιϋ	N0:75,	ΞΕΟ	ΙΒ	N0:76,	ΞΕΟ	Ιϋ	N0:77,	ΞΕΟ	Ιϋ
N0:78, ΞΕΟ	Ιϋ	N0:79,	8Ε0	ΙΌ	N0:80,	ΞΕΟ	ΐϋ	N0:81,	ΞΕΟ	ΙΌ
N0:32, ΞΕΟ	ΙΒ	N0:83,	ΞΕΟ	Ю	N0:84,	ΞΕΟ	ΙΏ	N0:85,	ΞΕΟ	Ю
N0:86, ΞΕΟ	Ιϋ	N0:87,	8Ε0	Ю	N0:88,	ΞΕΟ	Ю	N0:89,	ΞΕΟ	Ιϋ
N0:90, ΞΕΟ	Ιϋ	N0:91,	ΞΕΟ	ΙΌ	N0:92,	ΞΕΟ	ΙΏ	N0:93,	ΞΕΟ	ΙΌ
N0:94, ΞΕΟ	Ιϋ	N0:95,	ΞΕΟ	Ю	N0:96,	ΞΕΟ	Ιϋ	N0:97,	ΞΕΟ	Ιϋ
N0:98, ΞΕΟ	Ιϋ	N0:99,	ΞΕΟ	ΙΒ	N0:100,	ΞΕΟ	Ю N0:101	, ΞΕΟ

ΙΟ N0:102, ΞΕΟ ΙΒ N0:103, ΞΕΟ ΙΒ N0:104, ΞΕΟ Ю N0:105
ΞΕΟ	ΙΌ N0:106,	5Ε0 Ιϋ	N0:107,	8Ε0 ΙΒ N0:108,	ΞΕΟ	Ю
N0:	109, ΞΕΟ Ю	N0:110,	ΞΕΟ 1Ю	N0:111, ΞΕΟ Ιϋ	N0:	112,
ΞΕΟ	ΙΏ N0:113,	ΞΕΟ Ιϋ	N0:114,	ΞΕΟ ΙΒ N0:115,	ΞΕΟ	Ю
N0:	116, ΞΕΟ Ιϋ	N0:117,	ΞΕΟ Ю	N0:118, ΞΕΟ ΙΒ	N0:	119,
ΞΕΟ	ΙΌ N0:120,	ΞΕΟ Ш	N0:121,	ΞΕΟ ΙΒ N0:122,	5Ε0	ΙΌ
N0:	123, ΞΕΟ ΙΒ	N0:124,	ΞΕΟ ΙΒ	N0:125, ΞΕΟ ΙΒ	N0:	126,
ΞΕΟ	Ιϋ N0:127,	3Ε0 Ιϋ	N0:128,	ΞΕΟ* ΙΒ N0:129,	ΞΕΟ	Ю
N0:	130, ΞΕΟ Ιϋ	N0:131,	ΞΕΟ Ιϋ	N0:132, ΞΕΟ 1Ю	ΝΟ:	133,
3Ε0	ΙΒ N0:134,	ΞΕΟ Ю	N0:135,	ΞΕΟ Ю N0:136,	ΞΕΟ	ΙΒ
N0:	137, ΞΕΟ Ю	N0:138)	ΞΕΟ Ю	N0:139, ΞΕΟ ΙΏ	N0:	140,
ΞΕΟ	Ю N0:141,	ΞΕΟ ΙΒ	ΝΟ:142,	3Ε0 Ιϋ N0:143,	8Ε0	ΙΟ
N0:	144, ΞΕΟ Ю	N0:145,	ΞΕΟ Ιϋ	N0:146, 3Ε0 Ιϋ	N0:	147,
ΞΕΟ	Ιϋ N0:148,	ΞΕΟ Ю	N0:149,	ΞΕΟ Ιϋ N0:150,	ΞΕΟ	Ю
N0:	151, ΞΕΟ ΙΒ	N0:152,	ΞΕΟ ΙΒ	N0:153, ΞΕΟ Ю	N0:	154,
ΞΕΟ	Ιϋ N0:155,	ΞΕΟ ΙΌ	N0:1556,	, ΞΕΟ ΙΒ N0:157,	. ΞΕΟ ΙΒ
N0:	158, ΞΕΟ ΙΒ	N0:159,	ΞΕΟ ΙΌ	N0:160, ΞΕΟ Ιϋ	N0:	161,

8Е0 ΙΏ N0:162, ΞΕΟ ΙΌ N0:163, ΞΕΟ ΙΟ N0:164, 8Ε0 Ιϋ N0:165, ΞΕΟ Ιϋ N0:166, 5Ε0 ΙΌ N0:167, ΞΕΟ ΙΟ N0:168,

ΞΕΟ Ю N0:176, ΞΕΟ Ю N0:177, ΞΕΟ ΙΌ N0:178, ΞΕΟ ΙΟ

N0:179, ΞΕΟ Ιϋ N0:180, 8Ε0 ΙΟ N0:181, ΞΕΟ ΙΟ N0:182,

ΞΕΟ Ιϋ N0:183, ΞΕΟ Ю N0:184, ΞΕΟ Ιϋ N0:185, ΞΕΟ Ιϋ

N0:186, ΞΕΟ Ιϋ N0:187, ΞΕΟ ΙΏ N0:188, ΞΕΟ Ιϋ N0:189,

ΞΕΟ Ю N0:190, ΞΕΟ ΙΌ N0:191, ΞΕΟ Ю N0:192, 3Ε0 Ιϋ

N0:193, ΞΕΟ Ιϋ N0:194, ΞΕΟ ΙΌ N0:195, ΞΕΟ Ю N0:196,

ΞΕΟ Ю N0:197, ΞΕΟ ΙΌ N0:198, ΞΕΟ Ю N0:199, ΞΕΟ Ю

N0:200, 3Ε0 Ιϋ N0:201, ΞΕΟ Ю N0:202, ΞΕΟ ΙΌ N0:203,

ΞΕΟ Ю N0:204, ΞΕΟ ΙΟ N0:205, ΞΕΟ Ю N0:206, ΞΕΟ Ιϋ N0:207, ΞΕΟ ΙΒ N0:208, 5Ε0 ΙΟ N0:209, ΞΕΟ Ιϋ N0:210,

ΞΕΟ Ю N0:211, ΞΕΟ ΙΒ N0:212, ΞΕΟ ΙΒ N0:213, ΞΕΟ ΙΒ

N0:214, ΞΕΟ Ю N0:215, 3Ε0 ΙΒ N0:216, ΞΕΟ Ιϋ N0:217,

ΞΕΟ ΙΟ N0:218, ΞΕΟ ΙΟ N0:219, ΞΕΟ ΙΒ N0:220, ΞΕΟ Ю N0:221, ΞΕΟ ΙΒ N0:222, 3Ε0 Ιϋ N0:223, 3Ε0 ΙΒ N0:224,

ΞΕΟ Ю N0:225, ΞΕΟ ΙΒ N0:226, ΞΕΟ ΙΒ N0:227, ΞΕΟ ΙΌ

N0:228, ΞΕΟ ΙΟ N0:229 и ΞΕΟ Ю N0:230.

- 7 006368

Более предпочтительно, чтобы белок прогенипоэтин представлял собой 8ЕЦ Ш N0:165.

В предпочтительном осуществлении Ш выбран из группы, состоящей из С-С8Р, С-С8Р 8ег¹⁷, СС8Р А1а¹⁷ и лиганда с-тр1 (ТРО).

В предпочтительном осуществлении Ш представляет собой вариант Ш-3 с 8ЕЦ Ш 261. В предпочтительном осуществлении Ш₂ представляет собой вариант Ш-3 с 8ЕЦ Ш N0:256, 8ЕЦ Ш N0:257, 8ЕЦ Ш N0:258 или 8ЕО ГО N0:259.

В предпочтительном осуществлении линкер (Ь₂) выбран из группы, состоящей из

Зег,Азп;

О1у;

ТИг;

С1уЗег;

А1аА1а;

С1у8ег<31у;

С1уО1уО1у;

С1уАзпС1у;

О1уА1аО1у;

<31уТЬгО1у;

А1аЗегА1а;

А1аА1аА1а;

С1у€1уС1у8ег 8Е0 ГО N0:231;

С1уС1уС1у8егС1уС1уС1уЗег 8Е0 ГО N0:232;

О1уС1уС1уЗегО1ув1уО1уЗегО1уС1у01у8ег ЗЕО 10 N0:233;

ЗегС1уО1у5егО1у<Э1уЗег ЗЕО ГО N0:234;

С1иРНеО1уАзпМеЬ ЗЕО ГО N0:235;

С1иРЪе01у01уАвпМеЬ ЗЕО ГО N0:236;

(31иРЬе<31у01уАзпС1уС1уАэпМе(: ЗЕО ГО N0:237;

О1уО1уЗегАврМе1:А1а<31у 8Е0 ГО N0:238;

ВегС1уС1уАзпС1у ЗЕО ГО N0:239;

ЗегО1уа1уАзпО1уЗег01у(31уАзп(31у ЗЕО ГО N0:240;

Зег01у:31уАзпС1уЗегО1у51уАзпС1уЗегС1у<31уАзп<31у

ЗЕО ГО КО :241,·

ЗегО1уС1уЗегО1уЗегС1уС1уЗег(31у ЗЕО ГО N0:242;

5егС1уО1у5ег01уЗегС1уС1уЗегС1уЗегС1уС1уЗег(31у

ЗЕО ГО N0:243;

е1уб1уО1уЗег61уС1у ЗЕО ГО N0:244;

С1у01у01у8ег(31у01уС1у ЗЕО ГО N0:245;

С1уС1уС1уЗегб1уС1уС1уЗег01уС1у ЗЕО ГО N0:246; С1уС1уС1уЗегЭ1ув1уО1у8егО1у<31у01уЗегО1у ЗЕО ГО N0:247;

<31уО1уО1у8егС1у(31уС1у5егО1уС1у<з1уЗег<31уО1уа1у

ЗЕО ГО N0:248;

<31уС1у01уЗег01уС1у01уЗег01уС1уС1у8егС1у01у01у5ег □1уО1уС1уЗегО1у ЗЕО ГО N0:249;

РгоРгоРгоТгр8ег₽гоАгдРгоЬеиС1уА1аТЬгА1аРгоТ11гА1а

01у01пРгоРгоЬеи ЗЕО ГО N0:250;

РгоРгоРгоТгрЗе1гРгоАгдРгоЬеиС1уА1аТНгА1аРгоТЪг

ЗЕО ГО N0:251;

Уа1С1иТЬгУа1РИеН1зАгдУа18егС1пА8р(31уЬеи1>еит11гЗег

ЗЕО ГО N0:252;

01уС1у01уЗег01у01уС1уЗег01у01уС1у5егС1и01у01уС1у ЗегС1иС1у61уа1уЗегС1иО1уС1уО1уЗегС1иС1уС1уО1уЗег О1уС1уС1уЗег ЗЕО ГО N0:253;

ИеЗегсХиРгоЗегСТуРгоИеЗегТЬгПеАзпРгоЗегРгоРго

ЗегЬузС1иЗегН1зЬузЗегРгО; ЗЕО ГО N0:254 и

Ие01иС1уАгд11еЗег<31иРгоЗегв1уРго11еЗегТ11г11еАзп

РгоЗегРгоРго8егЬувС1иЗегН1вЬузЗегРго ЗЕО ГО N0:255,

- 8 006368

Любой очищенный и выделенный РгоСР, который продуцируется клетками-хозяевами, такими как Е. сой и животные клетки, трансформированными или трансфицированными путем использования рекомбинантных генетических методов, может использоваться по настоящему изобретению. Среди них особенно предпочтительным является РгоСР, который продуцируется трансформированной Е. сой. Такой РгоСР может быть получен в больших количествах с высокой чистотой и гомогенностью. Например, указанный выше РгоСР может быть получен способом, раскрытым в \УО 98/17810. Термин по существу имеет следующую аминокислотную последовательность означает, что указанная выше аминокислотная последовательность может включать одну или несколько аминокислотных изменений (делецию, добавление, вставку или замену), пока данные изменения не вызовут каких-либо неблагоприятных функциональных отличий по сравнению с РгоСР. Более предпочтительным является применение РгоСР, по существу характеризующегося аминокислотной последовательностью, в которую включен, по крайней мере, один лизин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота или неспаренный остаток цистеина.

По настоящему изобретению полиэтиленгликоль ковалентно связывают через аминокислотные остатки РгоСР. Данным аминокислотным остатком может являться любой реакционноспособный(-ые) остаток(-ки), содержащий(-ие), например, свободную амино-, карбокси- или сульфгидрильную (тиольную) группу, к которой может привязываться концевая реакционноспособная группа активированного полиэтиленгликоля. Аминокислотные остатки, имеющие свободные аминогруппы, могут включать остатки лизина и/или Ν-концевой аминокислотный остаток, те, что имеют свободную карбоксильную группу, могут включать аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту и/или С-концевые аминокислотные остатки, и имеющие сульфгидрил(тиол) включают такие остатки, как цистеин.

В другом осуществлении для взаимодействия с Ν-концевыми остатками серина используют оксиновые химические способы (Ьет1еих & ВеПо/ζί Т1й Тесй 16: 506-513, 1998).

Полиэтиленгликоль, применяемый по настоящему изобретению, не ограничивается какой-либо конкретной формой или интервалом молекулярной массы. Обычно используют молекулярную массу от 500 до 60000 и предпочтительно от 1 000 до 40000. Полиэтиленгликоль может также представлять собой разветвленный ПЭГ, описанный в патенте США 5932462, патенте США 5342940, патенте США 5643575, патенте США 5919455, патенте США 6113906 и патенте США 5183660.

Полиалкиленоксиды, особенно полиэтиленгликоли, связывают с РгоСР через концевую реакционноспособную группу, которая может оставлять или не оставлять линкерную группу(спейсер) между ПЭГ и белком. Для образования конъюгатов с РгоСР по настоящему изобретению полимеры, такие как полиалкиленоксиды, преобразуют в активированные формы. Реакционноспособная группа представляет собой, например, концевую реакционноспособную группу, которая опосредует связь между химическими группами белка, такими как амино-, карбоксильные или тиольные группы, и полиэтиленгликолем. Обычно одну или обе концевые полимерные гидроксильные группы (т.е. альфа- и омега-концевые гидроксильные группы) преобразуют в реакционноспособные функциональные группы, что позволяет осуществляться ковалентной конъюгации. Данный процесс часто обозначают как активация, и полиэтиленгликолевый продукт, содержащий реакционноспособную группу, здесь и далее обозначают как активированный полиэтиленгликоль. Полимеры, содержащие как α-, и ω-связывающие группы, также обозначают как бис-активированные полиалкиленоксиды и обозначают как бифункциональные. Полимеры, содержащие одну и ту же реакционноспособную группу на α- и ω-концевых гидроксилах, иногда обозначают как гомобифункциональные или гомобис-активированные. Полимеры, содержащие различные реакционноспособные группы на α- и ω-концевых гидроксилах, иногда обозначают как гетеробифункциональные или гетеробис-активированные. Полимеры, содержащие единственную реакционноспособную группу, обозначают как моноактивированные полиалкиленоксиды или монофункциональные. Другие по существу неантигенные полимеры сходным образом активируют или функционализируют.

Активированные полимеры, таким образом, подходят для опосредования связи между химическими группами на белке, такими как α-амино-, карбоксильные и тиольные группы, и полиэтиленгликолем. Бис-активированные полимеры могут таким образом реагировать с двумя молекулами белка или с одной молекулой белка и реакционноспособной небольшой молекулой в другом осуществлении для эффективного образования белковых полимеров или конъюгатов белок-небольшая молекула посредством поперечных связей. Функциональные группы, способные взаимодействовать с Ν-концевыми α-аминогруппами или ε-аминогруппами лизинов, находящихся на РгоСР, включают карбонаты, такие как пнитрофенил или сукцинимидил; карбонилимидазол; азлактоны; циклические имидтиокетоны; изоцианаты или изотиоцианаты и альдегиды. Функциональные группы, способные взаимодействовать с группами карбоновой кислоты, реакционноспособными карбонильными группами и окисленными углеводородными группами на РгоСР, включают первичные амины; и гидразиновые, и гидразидовые функциональные группы, такие как ацилгидразиды, карбазаты, семикарбаматы, тиокарбазаты, и т.д. Меркаптогруппы, если они доступны на РгоСР, также могут использоваться в качестве участков присоединения для подходящих активированных полимеров с реакционноспособными группами, такими как тиолы; малеимиды, сульфоны и фенилглиоксали; см., например, патент США № 5093531, описание которого включено сюда

- 9 006368 в качестве ссылки. Другие нуклеофилы, способные взаимодействовать с электрофильным центром, включают в качестве неограничивающих примеров гидроксил, амино, карбоксил, тиол, активный метилен и тому подобное.

В одном из предпочтительных осуществлений изобретения связь, основанная на вторичном амине, или амидная связь образуется с использованием Ν-концевых аминогрупп РгоСР или ε-аминогрупп лизина и активированного ПЭГ. В другом предпочтительном аспекте изобретения связь, основанная на вторичном амине, образуется между Ν-концевой первичной аминогруппой РгоСР и ПЭГ-(простой или разветвленной цепью) альдегидом путем восстановления подходящим восстанавливающим агентом, таким как Ναί.’ΝΒΗ₃. NаВНз, пиридинборан и т.д., как описано в Сйатоте е! а1., Вюсоищда!е Сйеи!. 5: 133-140 (1994) и патенте США № 5824784.

В другом предпочтительном осуществлении изобретения полимеры, активированные образующими амид линкерами, такими как сукцинимидиловые сложные эфиры, циклические имидтиокетоны или тому подобное, используют для воздействия на связывание РгоСР с полимером; см., например, патент США № 5349001; патент США № 5405877; и Стееита1б, е! а1., Сп!. Веу. ТЬег. Эгид Сатег 8у§!. 17: 101-161, 2000, которые включены сюда в качестве ссылки. Один из предпочтительных активированных полиэтиленгликолей, который может быть связан со свободными аминогруппами РгоСР, включает Ν-гидроксисукцинилимидполиэтиленгликоль с простой или разветвленной цепью и может быть получен путем активации сложных эфиров янтарной кислоты и полиэтиленгликоля Ν-гидроксисукцинилимидом.

Другие предпочтительные осуществления изобретения относятся к применению других активированных полимеров для образования ковалентных связей полимера с РгоСР через ε-амино- или другие группы. Например, изоцианатные или изотиоцианатные формы терминально активированных полимеров могут использоваться для образования связей с аминогруппами лизина, основанных на мочевине или тиомочевине.

В другом предпочтительном аспекте изобретения с аминогруппами белка образуются карбаматные (уретановые) связи, как описано в патентах США №№ 5122614, 5324844 и 5612640, которые включены сюда в качестве ссылки. Примеры включают полимеры, активированные Ν-сукцинимидилкарбонатом, паранитрофенилкарбонатом и карбонилимидазолом. В другом предпочтительном осуществлении данного изобретения бензотриазолкарбонатное производное ПЭГ связано с аминогруппами на РгоСР.

Другой аспект изобретения относится к пролекарственному средству или форме РгоСР с замедленным высвобождением, состоящим из водорастворимого полимера, такого как полиэтиленгликоль, присоединенного к молекуле РгоСР посредством функционального линкера, который, предположительно, может разрушаться путем ферментативного или рН-направленного гидролиза с высвобождением свободного РгоСР или другого производного РгоСР. Пролекарственное средство также может представлять собой двойное пролекарственное средство (Виибдаагб ίη Лбуаисеб Эгид Эе1Р'егу Ве\зе\\'5 3:39-65, 1989), задействующее применение каскадной латентности. В таких системах в реакцию гидролиза входят начальная лимитирующая скорость (медленная) ферментативная или рН-направленная стадия и вторая стадия, включающая в себя быстрый неферментативный гидролиз, который происходит только после прохождения первой стадии. Такой способный к высвобождению полимер предоставляет белковые конъюгаты, которые являются нестойкими и могут функционировать в качестве депо, которое длительное время высвобождает РгоСР. Такие функциональные линкеры описаны в патенте США 5614549; патенте США 5840900; патенте США 5880131; патенте США 5965119; патенте США 6011042; патенте США 6180095 В1; Сгееп\\а1б В.В. е! а1., 1. Меб. СНет. 42; 3657-3667, 1999; Ьее, 8. е! а1., Вюсоищда!е СНет 12:163-169, 2001; Сагтаи ЛЭ. е! а1., РЕВ8 Ьей. 223:361-365, 1987; ^одЫгеи С е! а1. , Вюсоищса!е СНет. 4:314-318, 1993; ВоЬебз М.1. е! а1., 1. Рйагт. 8с1. 87; 1440-1445, 1998; ΖΙκμ X., ίη Νίπ11ι Ιη!. 8утр. Весеи! Α6ν. Эгид ЭеНуегу 8у§!. 199; Сгееита1б В.В. е! а1., 1. Меб. СНет. 43:475-487, 2000; и Сгееита1б В.В. Сп!. Веν. ТЬег. Эгид Сатег 8у§!. 17:101-161, 2000.

Еще одно осуществление настоящего изобретения представляет собой способ конъюгирования ПЭГ с нуклеофилом, где конъюгирование проводят в присутствии неорганического растворителя. Нуклеофил определяется как белки, включающие в качестве неограничивающих примеров антитела и кроветворные факторы роста, пептиды, ферменты, химические вещества, применяемые в медицине, или органические группы.

Предпочтительно неорганический растворитель представляет собой ацетонитрил, метанол или этанол. Более предпочтительно неорганический растворитель представляет собой ацетонитрил. Предпочтительно концентрация неорганики составляет примерно от 1 до 25%, более предпочтительно примерно от 3 до 13% и более предпочтительно примерно 8%.

Реакции конъюгации, обозначенные как модификации посредством ПЭГ, исторически проводили в растворе с молярным избытком полимера и безотносительно того, где полимер будет присоединяться к белку. Такие общие способы, однако, обычно оказываются неадекватными при конъюгировании биологически активных белков с неантигенными полимерами в плане сохранения достаточной биологической активности. Одним из путей поддержания биологической активности РгоСР является существенное предотвращение в процессе присоединения полимера конъюгации с теми реакционноспособными группами

- 10 006368

РгоСР, которые ассоциированы с участком(-ами) связывания с рецептором. Другим аспектом настоящего изобретения является предоставление способа конъюгирования полиэтиленгликоля с РгоСР, поддерживающего высокие уровни сохраненной активности.

Химические модификации посредством ковалентной связи могут проводиться при любых подходящих условиях, в основном адаптированных к конъюгации биологически активного вещества с активированным полиэтиленгликолем. Реакция конъюгации проводится в относительно мягких условиях для предотвращения инактивации РгоСР. Мягкие условия включают поддержание рН реакционного раствора в интервале от 3 до 10 и температур реакции в интервале примерно от 0 до 37°С. В случаях, где реакционноспособные аминокислотные остатки в РгоСР содержат свободные аминогруппы, указанные выше модификации предпочтительно проводят в подходящих буферах (рН от 3 до 10), неограничивающими примерами которых являются фосфатный, цитратный, ацетатный, сукцинатный или НЕРЕБ, в течение 148 ч при 4-37°С. При взаимодействии Ν-концевых аминогрупп с такими реагентами, как ПЭГ -альдегиды, предпочтительно поддерживается рН 4-7. Активированный полиэтиленгликоль может использоваться в молярном соотношении в 0,05-100 раз, предпочтительно 0,05-0,5 раз, относительно числа свободных аминогрупп РгоСР. С другой стороны, когда реакционноспособные аминокислотные остатки в РгоСР содержат свободные карбоксильные группы, указанную выше модификацию предпочтительно проводят при рН примерно от 3,5 до 5,5, например, модификацию полиоксиэтилендиамином проводят в присутствии карбодиимида (рН 4-5) в течение 1-24 ч при 4-37°С. Активированный полиэтиленгликоль может использоваться в молярном соотношении в 0,05-300 раз относительно числа свободных карбоксильных групп РгоСР.

В особых осуществлениях верхний предел количества полимера, включенного в состав реакционных смесей для конъюгации, составляет примерно от 1:1 до содержания, при котором возможно взаимодействие активированного полимера и РгоСР без образования существенного количества молекул с большой молекулярной массой, т.е. большего, чем примерно 20%, количества конъюгатов, содержащих более приблизительно одной цепи полимера на молекулу РгоСР. Например, в данном аспекте изобретения предполагается, что отношения выше, чем примерно 6:1 , могут использоваться для образования значительных количеств требуемых конъюгатов, которые впоследствии можно изолировать от любых молекул с большой молекулярной массой.

В другом аспекте данного изобретения бифункционально активированные производные ПЭГ могут использоваться для получения полимерных молекул РгоСР-ПЭГ, в которых множественные молекулы РгоСР поперечно связаны через ПЭГ. Хотя описанные здесь условия реакции могут приводить к тому, что значительные количества РгоСР будут немодифицированы, немодифицированный РгоСР может легко возвращен в следующие реакционные смеси для дополнительных реакций конъюгации. Способы по настоящему изобретению неожиданно приводят к получению очень малого, т.е. составляющего менее чем примерно 30% и более предпочтительно менее чем примерно 10% молекул с большой молекулярной массой и молекул, содержащих более одной цепи полимера на РгоСР. Данные условия реакции резко отличаются от тех, что обычно используют для реакций конъюгации с полимерами, где активированный полимер присутствует в молярном избытке в несколько раз по отношению к целевой молекуле. В других аспектах изобретения полимер присутствует в количествах примерно от 0,1 до 50 эквивалентов на эквивалент РгоСР. В других аспектах изобретения полимер присутствует в количествах примерно от 1 до 10 эквивалентов на эквивалент РгоСР.

Реакции конъюгации по настоящему изобретению вначале предоставляют реакционную смесь или смесь молекул, содержащую конъюгаты моно- и ди-ПЭГ -РгоСР, непрореагировавший РгоСР, непрореагировавший полимер и обычно менее приблизительно 20% молекул с большой молекулярной массой. Молекулы с большой молекулярной массой включают конъюгаты, содержащие более одной полимерной цепи и/или полимеризованные молекулы ПЭГ-РгоСР. После удаления непрореагировавших молекул и молекул с большой молекулярной массой получают композиции, содержащие главным образом конъюгаты моно- и ди-полимер-РгоСР. Благодаря тому факту, что данные конъюгаты большей частью содержат единственную цепь полимера, они по существу гомогенны. Данные модифицированные РгоСР обладают по крайней мере примерно 5% от биологической активности ίη νίΙΐΌ. ассоциированной с природным или немодифицированным РгоСР, что измеряют с использованием стандартных анализов клеточной пролиферации, таких как анализы АМЬ, ТР1 и анализ колониеобразующих единиц (патент США 6030812, который включен сюда в качестве ссылки). В предпочтительных аспектах изобретения модифицированные РгоСР обладают примерно 25% от биологической активности ίη νίϋΌ, более предпочтительно, модифицированные РгоСР обладают примерно 50% от биологической активности ίη νίϋΌ, более предпочтительно модифицированные РгоСР обладают примерно 75% от биологической активности ίη νίίΐΌ и наиболее предпочтительно модифицированные РгоСР обладают эквивалентной или повышенной биологической активностью ίη νίΙΐΌ.

Способы по настоящему изобретению предпочтительно охватывают довольно ограниченные отношения полимера к РгоСР. Таким образом, было обнаружено, что конъюгаты РгоСР преимущественно ограничены видами молекул, содержащими только одну цепь полимера. Более того, присоединение полимера к реакционноспособным группам РгоСР происходит существенно чаще, чем при использовании

- 11 006368 сильного молярного избытка полимерного линкера. Немодифицированный РгоСР, присутствующий в реакционной смеси, после гашения реакции конъюгации может восстанавливаться для использования в последующих реакциях с использованием ионообменной хроматографии или гель-фильтрации, или сходных способов разделения.

Модифицированный полиэтиленгликолем РгоСР, то есть химически модифицированный белок по настоящему изобретению, может быть очищен из реакционной смеси общепринятыми способами, которые используются для очистки белков, такими как диализ, высаливание, ультрафильтрация, ионообменная хроматография, гель-хроматография и электрофорез. Ионообменная хроматография является особенно эффективной для удаления непрореагировавших полиэтиленгликоля и РгоСР. В дальнейшем осуществлении изобретения молекулы моно- и диполимер-РгоСР выделяют из реакционной смеси для удаления молекул с большой молекулярной массой и немодифицированного РгоСР. Разделение осуществляют путем помещения смешанных молекул в буферный раствор, содержащий примерно 0,5-10 мг/мл конъюгатов РгоСР-полимер. Подходящие растворы характеризуются рН примерно от 4 до 10. Растворы предпочтительно содержат одну или несколько буферных солей, выбранных из КС1, №С1, К₂НРО₄, КН2РО4, №2НРО4, NаН2РО4, ΝαΗ№₃, №ВСР. СН3СО2Н и ΝαΟΗ.

В зависимости от реакционного буфера раствор конъюгатов РгоСР-полимер вначале может подвергаться замене буфера/ультрафильтрации для удаления любого непрореагировавшего полимера. Например, раствор конъюгата ПЭГ-РгоСР может подвергаться ультрафильтрации через мембрану, отделяющую низкомолекулярные соединения (от 10000 до 30000 Да) для удаления большей части нежелательных веществ, таких как непрореагировавший полимер, поверхностно-активные вещества, если они присутствуют, и тому подобное.

Разделение конъюгатов в смеси, содержащей требуемые виды молекул, предпочтительно проводят с использованием среды для ионообменной хроматографии. Такие среды способны селективно связывать конъюгаты ПЭГ -РгоСР по различию в зарядах, которые могут варьировать до некоторой степени предсказуемым образом. Например, поверхностный заряд РгоСР определяется числом доступных заряженных групп на поверхности белка. Данные заряженные группы обычно служат точкой предполагаемого присоединения конъюгатов полиалкиленоксида. Поэтому конъюгаты РгоСР будут характеризоваться зарядом, отличным от других видов молекул, что обеспечит селективное выделение.

Сильно полярные анионно- и катионнообменные смолы, такие как смолы на основе четвертичного амина или сульфопропила, соответственно, используют для способа по настоящему изобретению. Катионообменные смолы являются особенно предпочтительными. Неограничивающий список катионообменных смол, в том числе коммерчески доступных, подходящих для применения по настоящему изобретению, включает 8Р-Ы1гар®, ЗР ЗерРагоке НР® и 8Р ЗерРагоке® Гак! По\\\ Другие подходящие катионообменные смолы, например З- и СМ-смолы, также могут использоваться. Неограничивающий список анионообменных смол, в том числе коммерчески доступных, подходящих для применения по настоящему изобретению, включает 0-1и1гар'®. О ЗерРагоке НР®, и О ЗерРагоке® Газ! По\\\ Другие подходящие анионообменные смолы, например ΌΕΆΕ-смолы, также могут использоваться.

Например, катионообменная смола предпочтительно упакована в колонку и уравновешена общепринятыми способами. Используют буфер, характеризующийся теми же значениями рН и осмоляльности, что и раствор конъюгированного с РгоСР полимера. Буфер для элюции предпочтительно содержит одну или несколько солей, выбранных из КС1, №С1, К₂НРО₄, КН₂РО₄, №₂НРО₄, NаΗ₂РΟ₄, NаΗСΟ₃, NаВΟ₄ и (ИН₄)₂СО₃. Содержащий конъюгат раствор затем адсорбируется на колонку, причем непрореагировавший полимер и некоторые молекулы с высокой молекулярной массой не задерживаются. По окончании загрузки на колонку воздействуют градиентным потоком буфера для элюции с повышением концентраций соли с целью элюции требуемой фракции конъюгированного с полиалкиленоксидом РгоСР. Элюированные объединенные фракции предпочтительно ограничивают с целью унификации полимерных конъюгатов после стадии катионообменного разделения. Любые неконъюгированные молекулы РгоСР затем могут быть смыты с колонки общепринятыми способами. Если требуется, модифицированные одной или многими молекулами ПЭГ виды РгоСР могут далее разделяться один от другого путем дополнительной ионообменной хроматографии или гель-фильтрации. Также могут использоваться способы, задействующие множественные стадии изократической элюции с повышением концентрации. Множественные стадии изократической элюции с повышением концентрации будут приводить к последовательной элюции конъюгатов ди-РгоСР-полимер и затем конъюгатов МОНО-РгоСР-полимер.

Температурный интервал для элюции составляет примерно от 4 до 25°С. Предпочтительно элюцию проводят при температуре примерно от 6 до 22°С. Например, элюции фракции ПЭГ-РгоСР детектируют путем поглощения УФ при 280 нм. Сбор фракций может осуществляться путем простых профилей элюции с течением времени.

В способах конъюгирования полимера полиэтиленгликоля с группой РгоСР может использоваться поверхностно-активное вещество. Подходящие поверхностно-активные вещества включают средства ионного типа, такие как додецилсульфат натрия (8Ό8). Также могут использоваться другие ионные поверхностно-активные вещества, такие как додецилсульфат лития, соединения четвертичного аммония, таурохолевая кислота, каприловая кислота, декансульфоновая кислота, и т.д. Также могут использовать- 12 006368 ся неионные поверхностно-активные вещества. Например, могут использоваться такие вещества, как полиоксиэтиленсорбитаны (Тгееп), полиоксиэтиленовые простые эфиры (ТгНон). См. также ЫсидсЬаисг. А Сшбе (о (Не Ргорсгйсз апб Ивее о£ ЭйегдеШв ίη Вю1оду апб ВюсНетЫгу (1992) Са1Ьюс11ст Согр. Единственным ограничением, связанным с поверхностно-активными веществами, используемыми по способам изобретения, является то, что их применяют в условиях и в концентрациях, которые не вызывают существенной. необратимой денатурации РгоСР и не ингибируют конъюгацию полимера полностью. Данные поверхностно-активные вещества присутствуют в реакционных смесях в количествах примерно от 0,01-0,5% предпочтительно от 0,05-0,5% и наиболее предпочтительно примерно от 0,075-0,25%. Также рассматриваются смеси поверхностно-активных веществ.

Полагают, что поверхностно-активные вещества предоставляют временную, обратимую систему защиты в процессе конъюгации полимера. Было показано, что поверхностно-активные вещества эффективны в плане селективного препятствия конъюгации полимера и при этом позволяют осуществляться основанной на лизинах и Ν-конце конъюгации.

Настоящий модифицированный полиэтиленгликолем РгоСР имеет более продолжительный фармакологический эффект, что, вероятно, может объясняться его пролонгированным периодом полужизни ίη у1уо.

ПЭГ-РгоСР по настоящему изобретению предназначен для применения при получении больших количеств дендритных клеток из предшественников, причем данные клетки используются в качестве адъювантов при иммунизации. Дендритные клетки играют важную роль в иммунной системе. Они являются специализированными антиген-презентирующими клетками, наиболее эффективными в активации покоящихся Т-клеток, и являются главными антиген-презентирующими клетками для активации не подвергнутых какому-либо воздействию Т-клеток ίη у1уо и, таким образом, для инициации первичных иммунных ответов. Они эффективно поглощают, процессируют и презентируют растворимые опухолеспецифические антигены (Аг). Дендритные клетки обладают уникальной способностью кластеризовать не подвергнутые какому-либо воздействию Т-клетки и отвечать на первый контакт с Аг быстрой позитивной регуляцией экспрессии главного комплекса гистосовместимости (МНС) и костимуляторных молекул, продукцией цитокинов и миграцией в лимфатические органы. Поскольку дендритные клетки играют центральную роль при сенсибилизации хозяина против неоантигена для СЭ4-зависимого иммунного ответа, они могут также играть ключевую роль в развитии и регуляции противоопухолевого иммунитета.

Дендритные клетки происходят из костномозгового СЭ34+ -предшественника, общего для гранулоцитов и макрофагов, и у человека было установлено существование отдельной колониеобразующей единицы дендритных клеток (СРИ-ЭС), которая дает начало чистым колониям дендритных клеток. Кроме того, описана (СЭ14+)-промежуточная клетка, существующая после СРИ, с потенциалом по дифференцировке по пути дендритной клетки или макрофага в разных условиях по цитокинам. Данный бипотенциальный предшественник присутствует в костном мозге, пуповинной крови и периферической крови. Дендритные клетки могут быть выделены на основе специфических маркеров клеточной поверхности, таких как СЭ1а+. СЭ3-. СЭ4-. СЭ20-. СЭ40+. СЭ80+. и СЭ83+. с целью представления о созревании культивированных дендритных клеток.

Основанные на дендритных клетках стратегии предоставляют способ усиления иммунного ответа против опухолей и инфекционных агентов. СПИД является еще одним заболеванием, при котором могут использоваться основанные на дендритных клетках способы лечения, поскольку дендритные клетки могут играть главную роль в обеспечении репликации ВИЧ-1. Для иммунотерапии требуется получение от пациентов со злокачественными опухолями дендритных клеток, воздействие на них опухолевого Аг ίη νίΙΐΌ, выделенного из хирургически удаленных опухолевых масс, и обратная инъекция данных клеток пациентам с опухолями. В качестве источника опухолевого антигена достаточно относительно грубых мембранных препаратов опухолевых клеток, что исключает необходимость в молекулярной идентификации опухолевого антигена. Опухолевый антиген также может представлять собой синтетические пептиды, углеводы или последовательности нуклеиновой кислоты. Кроме того, сопутствующее введение цитокинов, таких как ПЭГ-РгоСР по настоящему изобретению, может далее способствовать индукции противоопухолевого иммунитета. Предполагается, что данная иммунотерапия может иметь место в варианте ίη у1уо, когда ПЭГ -РгоСР по настоящему изобретению отдельно или с другими кроветворными факторами роста вводят пациенту с опухолью с целью увеличения числа дендритных клеток, и на дендритных клетках презентируется эндогенный опухолевый антиген. Также предсказывается, что иммунотерапия ίη у1уо может осуществляться с использованием экзогенного антигена. Также полагают, что иммунотерапевтическое лечение может включать в себя мобилизацию предшественников дендритных клеток или зрелых дендритных клеток путем введения пациенту ПЭГ-РгоСР по настоящему изобретению отдельно или с другими кроветворными факторами роста, отбора у пациента предшественников дендритных клеток или зрелых дендритных клеток, воздействия на дендритные клетки антигеном и возвращения данных дендритных клеток пациенту. Более того, ранее отобранные дендритные клетки могут культивироваться ех у1уо с ПЭГ -РгоСР по настоящему изобретению отдельно или с другими кроветворными факторами роста для увеличения числа дендритных клеток перед воздействием антигена. Основанные на дендритных клетках стратегии также предоставляют собой способ снижения иммунного отве- |3 006368 та при аутоиммунных заболеваниях.

Исследования дендритных клеток сильно затруднены за счет сложностей получения данных клеток в достаточных количествах и в достаточно чистом виде. В варианте размножения клеток ех νίνο гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (СМ-С8Р) и фактор-некроза опухолей (ΤΝΡ-α) действуют совместно при образовании дендритных клеток ех νίνο из кроветворных предшественников (клеток СЭ34+). извлеченных из костного мозга, пуповинной крови или периферической крови, а лиганд Пк-2/П1-3 и лиганд с-к11 (фактор стволовых клеток [8СР]) действуют синергически с усилением индуцированного СМ-С8Р и ΤΝΡ-α образования дендритных клеток (81епа, 8. е1 а1. Ехрептеп1а1 Нета1о1о§у 23:1463-1471, 1995). Также предоставлен способ размножения еx νίνο предшественников дендритных клеток или зрелых дендритных клеток с использованием ПЭГ-РгоСР по настоящему изобретению с целью обеспечения достаточных количеств дендритных клеток для иммунотерапии.

Более того, имеется наблюдение, что модифицированный полиэтиленгликолем РгоСР по настоящему изобретению может ускорять восстановление от нейтропении. Модифицированный полиэтиленгликолем РгоСР по настоящему изобретению может иметь по существу ту же биологическую активность, что и интактный РгоСР, и, соответственно, может использоваться для тех же применений. Модифицированный полиэтиленгликолем РгоСР характеризуется активностью по увеличению числа нейтрофилов и поэтому он может использоваться при лечении общих нарушений кроветворения, включая те, что возникают вследствие химиотерапии или радиационной терапии. Он также может использоваться при лечении инфекции и при трансплантации костного мозга. Модифицированный РгоСР по настоящему изобретению может использоваться при лечении заболеваний, характеризующихся сниженными уровнями клеток миелоидного, эритроидного, лимфоидного или мегакариоцитарного ряда системы кроветворения или их комбинации. Кроме того, они могут использоваться для активации зрелых миелоидных и/или лимфоидных клеток. В состав состояний, чувствительных к лечению полипептидами по настоящему изобретению, входит лейкопения, снижение числа циркулирующих лейкоцитов (белых клеток) в периферической крови. Лейкопения может индуцироваться путем воздействия некоторых вирусов или излучения. Она часто является побочным эффектом различных форм лечения злокачественных опухолей, например, воздействия химиотерапевтических лекарственных средств, излучения, инфекции или кровотечения. Терапевтическое лечение лейкопении данными модифицированными РгоСР по настоящему изобретению может предотвращать нежелательные побочные эффекты, вызванные лечением доступных в настоящее время лекарственных средств.

Модифицированный РгоСР по настоящему изобретению может использоваться для лечения или профилактики нейтропении и, например, для лечения таких состояний, как апластическая анемия, циклическая нейтропения, идиопатическая нейтропения, синдром Чедиака-Хигаши, системная красная волчанка (СКВ), лейкоз, синдром миелодисплазии и миелофиброз.

Модифицированный РгоСР по настоящему изобретению может использоваться для лечения или профилактики тромбоцитопении. В настоящее время единственными способами терапии тромбоцитопении являются трансфузии тромбоцитов, которые дороги и связаны со значительным риском инфекции (ВИЧ, ВГВ) и аллоиммунизации, и 1Б-11 (№ите§а™), применение которого разрешено при некоторых тромбоцитопениях. Модифицированный РгоСР может ослабить или уменьшить необходимость в трасфузиях тромбоцитов. Тяжелая тромбоцитопения может являться результатом генетических дефектов, таких как анемия Фанкони, синдромы Уискотта-Олдрича или Мэя-Хегглина. Приобретенная тромбоцитопения может являться результатом действия ауто- или аллоантител, как при иммунной тромбоцитопенической пурпуре, системной красной волчанке, гемолитической анемии или несовместимости плода и матери. Кроме того, к тромбоцитопении могут приводить спленомегалия, диссеминированное внутрисосудистое свертывание, тромбозная тромбоцитопеническая пурпура, инфекция или протезирование сердечных клапанов. Тяжелая тромбоцитопения также может являться результатом химиотерапии и/или радиационной терапии злокачественных опухолей. Тромбоцитопения может также являться результатом проникновения в костный мозг карциномы, лимфомы, лейкоза или фиброза.

Модифицированный РгоСР по настоящему изобретению может использоваться для мобилизации кроветворных предшественников и стволовых клеток в периферическую кровь. Показано, что происходящие из периферической крови предшественники являются эффективными при восстановлении пациентов в течение аутологичной трансплантации костного мозга. Показано, что кроветворные факторы роста, включая С-С8Р и СМ-С8Р, увеличивают количество циркулирующих предшественников и стволовых клеток в периферической крови. Это упрощает процедуру сбора периферических стволовых клеток и сильно снижает стоимость процедуры за счет снижения числа требуемых ферезов. Модифицированный РгоСР может использоваться при мобилизации стволовых клеток и дальнейшего увеличения эффективности трансплантации периферических стволовых клеток.

Другое предполагаемое клиническое применение факторов роста состоит в активации кроветворных предшественников и стволовых клеток ίη νίΙΐΌ в целях генной терапии. Для включения интересующего гена в геном кроветворного предшественника или стволовой клетки необходимо стимулировать клеточное деление и репликацию ДНК. Кроветворные стволовые клетки входят в клеточный цикл с

- 14 006368 очень низкой частотой, и это означает, что факторы роста могут использоваться для обеспечения трансдукции гена и усиления таким образом клинических перспектив генной терапии.

Многие лекарственные средства могут вызывать супрессию костного мозга или дефициты кроветворения. Примерами таких лекарственных средств являются А2Т, ΌΌΙ, алкилирующие агенты и антиметаболиты, применяемые при химиотерапии, антибиотики, такие как хлорамфеникол, пенициллин, ганцикловир, дауномицин, и сульфаниламидные средства, фенотиазоны, транквилизаторы, такие как мепробамат, анальгетики, такие как аминопирин и дипирон, противосудорожные средства, такие как фенитоин или карбамазепин, антитироидные средства, такие как пропилтиоурацил и метимазол, и диуретики. Модифицированный РгоСР по настоящему изобретению может использоваться для профилактики или лечения супрессии костного мозга или дефицитов кроветворения, которые часто происходят у пациентов, которых лечат данными лекарственными средствами.

Дефициты кроветворения также могут происходить из-за вирусных, микробных или паразитарных инфекций и в результате лечения заболевания почек или почечной недостаточности, например диализа. Модифицированный РгоСР по настоящему изобретению может использоваться для лечения такого дефицита кроветворения.

Лечение дефицита кроветворения может включать введение пациенту фармацевтической композиции, содержащей модифицированный РгоСР. Модифицированный РгоСР по настоящему изобретению также может использоваться для активации и амплификации клеток - кроветворных предшественников путем обработки данных клеток ίη νίΙΐΌ модифицированным РгоСР по настоящему изобретению перед инъекцией клеток пациенту.

Посредством лечения модифицированным РгоСР по настоящему изобретению также можно благоприятно воздействовать на различные иммунодефициты, например, относящиеся к Т и/или В-лимфоцитам, или иммунные нарушения, например ревматоидный артрит. Иммунодефициты могут быть результатом вирусных инфекций, например НТЬУ-Ι, НТЬУ-ΙΙ, НТЬУ-ΙΙΙ, тяжелого воздействия радиации, противораковой терапии, или результатом другого медицинского воздействия. Модифицированный РгоСР по настоящему изобретению также может использоваться, отдельно или в комбинации с другими факторами кроветворения, при лечении других дефицитов кровяных клеток, включая тромбоцитопению (дефицит тромбоцитов) или анемию. Другие применения данных новых полипептидов заключаются в лечении пациентов, восстанавливающихся после трансплантации костного мозга ίη у1уо и ех у1уо, и в разработке моноклональных или поликлональных антител, получаемых стандартными способами, для диагностического или терапевтического применения.

Модифицированный полиэтиленгликолем РгоСР по настоящему изобретению может составляться с получением фармацевтических средств, содержащих также фармацевтически приемлемый разбавитель, средство для получения изотонического раствора, средство для поддержания условий рН и тому подобное, с целью введения их пациенту. Указанные выше фармацевтические средства могут вводиться подкожно, внутримышечно, внутривенно или перорально, в зависимости от цели лечения. Доза также может основываться на типе и состоянии нарушения пациента, подлежащего лечению, причем в норме она может составлять от 0,1 до 50 мг для инъекции и от 0,1 мг до 5 г для перорального введения для взрослого человека.

Присоединенные полимерные вещества также предпочтительно являются водорастворимыми при комнатной температуре. Неограничивающий список таких полимеров включает гомополимеры полиалкиленоксидов, такие как полиэтиленгликоль или полипропиленгликоли, полиоксиэтиленированные полиолы, их сополимеры и блоксополимеры, при том что водорастворимость блоксополимеров сохраняется.

В качестве альтернативы основанным на ПЭГ полимерам могут использоваться эффективно неантигенные материалы, такие как декстран, поливинилпирролидоны, полиакриламиды, поливиниловые спирты, основанные на углеводородах полимеры, и тому подобное. Активация α- и ω-концевых групп данных полимерных веществ, конечно, может осуществляться способами, сходными с теми, что применяются для преобразования полиалкиленоксидов, и, таким образом, будет понятна обычным специалистам в данной области.

Обычным специалистам в данной области будет ясно, что указанный выше список является сугубо иллюстративным и что охватываются все полимерные материалы с описанными здесь свойствами. Для целей настоящего изобретения эффективно неантигенные означает все материалы, которые в данной области рассматривают как нетоксичные и не вызывающие существенного иммунного ответа у млекопитающих.

Определения

Далее следует список сокращений и соответствующие им значения, которые применяются здесь взаимозаменяемо:

г - грамм(-ы);

мг - миллиграмм(-ы);

мл - миллилитр(-ы);

КТ - комнатная температура;

- 15 006368

ПЭГ - полиэтиленгликоль.

Полное содержание всех публикаций, патентов и патентных заявок, цитируемых в данном описании, включено сюда в качестве ссылки, как если бы каждая отдельная публикация, патент или патентная заявка были бы конкретно и индивидуально обозначены, как включенные в качестве ссылки.

Хотя указанное выше изобретение было описано в некоторых подробностях путем иллюстрации и приведения примеров с целью облегчения восприятия, специалист в данной области в свете изложения данного изобретения легко поймет, что могут быть сделаны изменения и модификации без уклонения от сущности и объема настоящего изобретения. Последующие примеры предоставляются лишь с иллюстративными целями и не предназначены для ограничения объема изобретения, который описан выше в широком смысле.

В последующих примерах полипептид РгоОР представляет собой РгоСР-4. аминокислотная последовательность которого показана на фиг. 12. Очевидно, что другие представители семейства РгоОР можно также модифицировать ПЭГ сходным образом, как это описано в последующих примерах.

Примеры

Пример 1. РгоОР-ПЭГ с линейной цепью, имеющий молекулярную массу 30000.

ί

ОСН₂СН₂СН

ПЭГ-альдегид с молекулярной массой 5000, 20000 и 30000.

В данном примере демонстрируется способ получения по существу гомогенных препаратов модифицированного одной молекулой ПЭГ с Ν-конца РгоОР путем восстановительного алкилирования. Реагент метокси-линейный ПЭГ-пропиональдегид с молекулярной массой, примерно равной 30000, (8йеагча1ег Ро1утег§ 1пс.) избирательно связывали посредством восстановительного аминирования с Νконцом РгоОР, пользуясь преимуществом различия относительного значения рКа первичного амина на Ν-конце по сравнению со значениями рКа первичных аминов в ε-положении аминогруппы остатков лизина. Белок РгоОР, растворенный до 1-5 мг/мл в 10 мМ сукцинате натрия, рН 5,0, или в 10 мМ сукцинате натрия (Ι. Т. Вакег, РЫШркЬигд, Нью-Джерси), 8%-ном ацетонитриле (Вигбкк апб 1аск§оп, Мизкедоп, Мичиган), рН 5,0, подвергали взаимодействию с метокси-ПЭГ-пропиональдегидом, М-РЕО-ЛЬО, (8йеагча1ег Ро1утег§ 1пс., НипкуШе, Алабама) путем добавления твердого М-РЕО-ЛЬЭ с получением относительного молярного соотношения ПЭГ:РгоОР (димер), равного 2-12:1. Реакции катализировали путем добавления матричного раствора 1 М №ιί’ΝΒΗ4 (81дта СйепйсаР Сент-Луис, Миссури), разведенного в Н₂О до конечной концентрации, равной 10 мМ.

Реакции проводили в темноте при 4°С в течение 18-24 ч. Реакции останавливали добавлением 1 М Тгк-основания (81дта СйепйсаР Сент-Луис, Миссури) до конечной концентрации Тгк, равной 50 мМ, и конечного рН, равного 8,5.

Пример 2. РгоОР-ПЭГ с линейной цепью, имеющий молекулярную массу 20000.

Реагент метокси-ПЭГ-пропиональдегид, где ПЭГ представляет собой ПЭГ с линейной цепью и молекулярной массой 20000, (8йеагча1ег Ро1утег§ 1пс.) присоединяли к Ν-концу РгоОР с использованием процедуры, описанной для примера 1 .

Пример 3. РгоОР-ПЭГ с линейной цепью, имеющий молекулярную массу 50000.

Реагент метокси-ПЭГ-пропиональдегид, где ПЭГ представляет собой ПЭГ с линейной цепью и молекулярной массой 50000, (Е1цка) присоединяли к Ν-концу РгоОР с использованием процедуры, описанной для примера 1 .

Пример 4. РгоОР-ПЭГ с разветвленной цепью, имеющий молекулярную массу 40000.

ПЭГ2-АЬП, молекулярная масса 40000

Реагент (ПЭГ2-АЬП) метокси-ПЭГ -пропиональдегид, где ПЭГ представляет собой ПЭГ с разветвленной цепью и молекулярной массой 40000, (ПЭГ2-АЬП) (8йеагча1ег Ро1утег§ 1пс.) присоединяли к Νконцу РгоОР с использованием процедуры, описанной для примера 1.

Пример 5. РгоОР-ПЭГ с линейной цепью, имеющий молекулярную массу 20000.

- 16 006368

8РЛ-ПЭГ 5 с молекулярной массой 20000

В данном примере демонстрируется способ получения по существу гомогенных препаратов модифицированного одной молекулой ПЭГ прогенипоэтина (РгоСР) с использованием активных сложных эфиров Ν-гидроксисукцинимидила (ΝΗ8). Маточный раствор белка РгоСР растворяли до 1-5 мг/мл в 10 мМ сукцинате натрия, рН 5,0, титровали до рН 7,2 путем добавления 0,25 М буфера НЕРЕ8. Затем раствор подвергали взаимодействию с метокси-ПЭГ-сукцинимидилпропионатом (БРА-ПЭГ) путем добавления твердого БРА-ПЭГ с получением относительного молярного отношения ПЭГ :прогенипоэтин, равного 6,5:1. Реакции проводили при 4°С в течение 1 ч. Реакции останавливали путем снижения рН до 4,0 посредством 0,1 Н уксусной кислоты или путем добавления 5 х молярного избытка ТГ18-НС1. Подобным образом в отношении ПЭГ молекулярной массой 20000 может использоваться СМ-ΗΒΑ-ΝΗδ 5. Двойные эфиры мПЭГ

мПЭГ-СМ-ΗΒΆ-ΝΗδ

Пример 6. РгоСР (биотин-ПЭГ с линейной цепью, имеющий молекулярную массу 3400).

Биотин-ПЭГ-ΝΗδ с молекулярной массой 3400

Реагент с молекулярной массой 3400 биотин-ПЭГ-СОг-ИНБ (311еаг\\а1ег Ро1утег§ 1пс.) присоединяли к РгоСР с использованием процедуры, описанной для примера 5.

Пример 7. РгоСР-ПЭГ с разветвленной цепью, имеющий молекулярную массу 10000.

ПЭГ2-НН8 с молекулярной массой 10000, 20000 и 40000

Разветвленный ПЭГ2-НН8 с молекулярной массой 10000 (§йеаг^а!ег Ро1утег§ 1пс.) присоединяли РгоСР с использованием процедуры, описанной для примера 5.

Пример 8. РгоСР-ПЭГ с разветвленной цепью, имеющий молекулярную массу 20000.

Разветвленный ПЭГ2-БРА с молекулярной массой 20000 (§йеаг^а!ег Ро1утег§ 1пс.) присоединяли РгоСР с использованием процедуры, описанной для примера 5.

Пример 9. РгоСР-ПЭГ с разветвленной цепью, имеющий молекулярную массу 40000.

Разветвленный ПЭГ2-БРА с молекулярной массой 40000 (§йеаг^а!ег Ро1утег§ 1пс.) присоединяли РгоСР с использованием процедуры, описанной для примера 5.

Пример 10. РгоСР-ПЭГ с линейной цепью, имеющий молекулярную массу 20000.

ВТС-ПЭГ с молекулярной массой 20000

ВТС-ПЭГ с молекулярной массой 20000 (§йеаг^а!ег Ро1утег§ 1пс.) присоединяли к РгоСР с исполь

- 17 006368 зованием процедуры, описанной для примера 4. В данном примере демонстрируется способ получения по существу гомогенных препаратов модифицированного ПЭГ прогенипоэтина (РгоСР) с использованием производных бензотриазола карбоната и ПЭГ.

Пример 11. РгоСР-ПЭГ с линейной цепью, имеющий молекулярную массу 5000.

ПЭГ-88 с молекулярной массой 5000

Сукцинимидилсукцинат-ПЭГ (88-ПЭГ) массой 5000 (811саг\га1сг Ро1утег8 1пс.) присоединяли к РгоСР с использованием процедуры, описанной для примера 5. В данном примере демонстрируется способ получения по существу гомогенных препаратов модифицированного ПЭГ прогенипоэтина (РгоСР) с использованием гидролизуемой связи.

Пример 12. РгоСР-ПЭГ с линейной цепью, имеющий молекулярную массу 20000.

ПЭГ-гидразид с молекулярной массой 20000

В данном примере демонстрируется способ получения по существу гомогенных препаратов модифицированного ПЭГ прогенипоэтина (РгоСР) с использованием метокси-ПЭГ-гидразида, ΗΖ-ПЭГ, с молекулярной массой 20000 (811еаг\га1ег Ро1утег§ 1пс.). Маточный раствор белка РгоСР растворяли до концентрации 1-5 мг/мл в 10 мМ сукцинате натрия, рН 5,0. Данный раствор затем подвергали взаимодействию с ΗΖ-ПЭГ путем добавления твердого вещества с получением относительного молярного отношения ПЭГ : прогенипоэтин, составляющего 6,5-26:1. Реакции катализировали карбодиимидом (ЕЭС. ЕОАС) в конечной концентрации 2 мМ. Реакции проводили при 4°С в течение 2 ч. Реакции останавливали путем снижения рН до 4 0,1 н уксусной кислотой.

Примеры 13. Виды молекул, модифицированные несколькими молекулами ПЭГ.

По примерам 1-4 также получали модифицированные РгоСР, содержащие две присоединенные молекулы ПЭГ или более (модифицированные несколькими молекулами ПЭГ), и отделяли их от видов молекул, модифицированных одной молекулой ПЭГ, с использованием анионообменной хроматографии. Модифицированные РгоСР, содержащие две присоединенные молекулы ПЭГ или более (модифицированные несколькими молекулами ПЭГ), также отделяли от видов молекул, модифицированных одной молекулой ПЭГ, с использованием катионообменной хроматографии.

Модифицированные РгоСР, содержащие две присоединенные молекулы ПЭГ или более (модифицированные несколькими молекулами ПЭГ), также могут быть получены по примерам 5-13 и могут быть очищены способом, сходным с таковым для примеров 1 -4.

Пример 14. Очистка модифицированного ПЭГ РгоСР.

Модифицированные ПЭГ молекулы РгоСР очищали от реакционной смеси до >95% (8ЕС-анализ) с использованием единственной стадии ионообменной хроматографии.

Анионообменная хроматография.

Модифицированные одной молекулой ПЭГ-альдегида массой 30 кДа, 20 кДа и 5 кДа молекулы РгоСР очищали от реакционной смеси до >95% (8ЕС-анализ) с использованием единственной стадии анионообменной хроматографии. Модифицированный ПЭГ РгоСР очищали от немодифицированного РгоСР и модифицированных несколькими ПЭГ молекул РгоСР с использованием анионообменной хроматографии (фигура 1). Типичную реакционную смесь РгоСР-ПЭГ-альдегида массой 30 кДа (50-350 мг белка), описанную выше, очищали на высокоэффективной колонке с С-8ер11аго5е (ХК 26/20, объем слоя 70 мл, Атегайата Рйагтааа Вю1есй, Р|5са1а\\'ау, Нью-Джерси), уравновешенной 50 мМ Тп5. рН 8,5 (буфер А). Реакционную смесь разбавляли 5x50 мМ Тгй с 8% ацетонитрилом, рН 8,5, и загружали на колонку со скоростью потока, равной 10 мл/мин. Колонку промывали 5 объемами колонки буфера А, а затем 5 объемами колонки буфера А, содержащего 30 мМ ЫаСЕ Впоследствии различные молекулы РгоСР элюировали из колонки 20 объемами колонки буфера А и линейным градиентом ИаС1, представляющим собой 30-130 мМ. Измеряли поглощение элюируемого раствора при 280 нм (А₂₈₀) и собирали фракции объемом 12 мл. Фракции объединяли по степени модификации ПЭГ, например, моно-, ди-, три- и т.д. (как оценивается в примере 15). рН объединенной фракции снижали до 7,5 с использованием 1 М НС1 и затем ее концентрировали до 1-5 мг/мл в концентраторе Отедасе11 с перемешиванием в ячейке и фильтром 10 кДа (Г1Йгоп Тесйпо1оду Согрогайоп, ИоПйЬогоидй, Массачусетс). Концентрацию белка в объединенной фракции определяли по А₂₈₀ с использованием коэффициента экстинкции 0,97%. Общий выход очищенного модифицированного одной молекулой ПЭГ-альдегида массой 30 кДа РгоСР по данному способу составлял 25-30%.

Катионообменная хроматография.

- 18 006368

Катионообменную хроматографию проводили на высокоэффективной колонке с 8Р 8ерйагохе (Рйагтааа ХК 26/20, объем слоя 70 мл), уравновешенной 10 мМ ацетатом натрия, рН 4,5 (буфер С). Реакционную смесь разбавляли 10х буфером С и загружали на колонку со скоростью потока 5 мл/мин. Затем колонку промывали 5 объемами колонки буфера С, а затем 5 объемами колонки 12%-ного буфера Ό (10 мМ ацетат, рН 4,5, 1 М №С1). Впоследствии молекулы ПЭГ-РгоСР элюировали из колонки линейным градиентом от 12 до 27% буфера Ό в 20 объемах колонки. Измеряли поглощение элюируемого раствора при 280 нм (А280) и собирали фракции объемом 10 мл. Фракции объединяли по степени модификации ПЭГ (моно-, ди-, три-, и т.д.), обменивали буфер на 10 мМ ацетат с рН 4,5 и концентрировали до 1-5 мг/мл в ячейке с перемешиванием, присоединенной к мембране Аписом ΥМ10. Концентрацию белка в объединенной фракции определяли по А при 280 нм с использованием коэффициента экстинкции 0,71. Общий выход очищенного модифицированного одной молекулой ПЭГ РгоСР по данному способу составлял от 10 до 50%.

Пример 15. Биохимическая характеристика.

Очищенные объединенные фракции модифицированного ПЭГ РгоСР характеризовали посредством δΌδ-РАСЕ (фиг. 3), гель-фильтрации неденатурирующих и денатурирующих условиях (фиг. 2, 4), ВРНРЬС (фиг. 5), трипсинового картирования (фиг. 7) и МАЙШ-ТОР (6).

Высокоэффективная жидкостная хроматография по принципу гель-фильтрации (8ЕС-НРЬС). 8ЕС-НРЬС при неденатурирующих условиях.

Реакционную смесь метокси-ПЭГ-пропиональдегида с молекулярной массой 30 кДа и РгоСР подвергали анионообменной очистке и конечные очищенные продукты оценивали с использованием 8ЕСНРЬС при неденатурирующих условиях (фигура 2а, 2Ь). Аналитическую 8ЕС-НРЬС при неденатурирующих условиях проводили с использованием колонки 8ирегбех 200 НВ 10/30 (Атегхйат Рйагтааа В1о!есй, Р|хса1а\\ау, Нью-Джерси) в 50 мМ Тих, рН 7,5, 150 мМ №1С1 при скорости потока, равной 0,4 мл/мин.

Модификация ПЭГ сильно повышает гидродинамический объем белка, что приводит к сдвигу к более короткому времени задержки. Два вида молекул, модифицированных ПЭГ, наблюдали в реакционной смеси ПЭГ-альдегида с молекулярной массой 30 кДа и РгоСР вместе с немодифицированным РгоСР. Данные модифицированные ПЭГ и немодифицированные молекулы разделяли путем хроматографии на 0-8ерйагохе (фиг. 1), и впоследствии было показано, что полученный в результате очищенный модифицированный одной молекулой ПЭГ-альдегида с молекулярной массой 30 кДа РгоСР элюировался в виде единственного пика при 8ЕС-НРЬС в неденатурирующих условиях (чистота > 95%, фиг. 2с). Стадия хроматографии на Ц-8ерйагохе эффективно удаляла свободный ПЭГ, немодифицированный ПЭГ димер РгоСР и модифицированные несколькими молекулами ПЭГ виды молекул от модифицированного одной молекулой ПЭГ РгоСР.

8ЕС-НРЬС с денатурацией δΌδ.

8ЕС с денатурацией δΌδ, при которой диссоциирует нековалентный димер РгоСР, использовали для демонстрации того, что модифицированный одной молекулой ПЭГ-альдегида с молекулярной массой 30 кДа РгоСР модифицирован ПЭГ только на одной субъединице (мономере) димера РгоСР (фиг. 4). δΗΟ-ΜΕΡ-Ο при денатурирующих условиях проводили тем же способом, как описано для δЕС-НР^С, при неденатурирующих условиях за исключением того, что в составе используемого буфера был 0,1% δΌδ. Элюцию белка отслеживали измерением поглощения при 220 нм. Очищенный модифицированный одной молекулой ПЭГ-альдегида с молекулярной массой 30 кДа РгоСР, который элюируется как единственный пик на δЕС при неденатурирующих условиях, разделялся на модифицированную ПЭГ субъединицу и не модифицированную ПЭГ субъединицу (как идентифицировано ниже) в денатурирующих условиях.

δΌδ-РАСЕ.

δΌδ-РАСЕ, при котором диссоциирует нековалентный димер РгоСР, использовали для демонстрации чистоты и того, что РгоСР-ПЭГ-альдегид массой 30 кДа модифицирован ПЭГ только по одной субъединице (мономеру) димера РгоСР (фигура 3). δΌδ-РАСЕ проводили на 12%-ных Тпх-глициновых гелях толщиной 1 мм (1№Йгодеп, Карлсбад, Калифорния) в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях и окрашивали с использованием набора для окрашивания гелей Nονеx Со11о1ба1 Соотахх1е™ С-250 Ппсйгодеп, Карлсбад, Калифорния). Очищенный модифицированный одной молекулой ПЭГ-альдегида массой 30 кДа РгоСР, который элюируется в виде единого пика при δЕС в неденатурирующих условиях, разделяется на модифицированную ПЭГ субъединицу и немодифицированную ПЭГ субъединицу.

Обращенно-фазовая НРЬС (ВР-НРьС).

ВР-НРЬС проводили на колонке Рйепотепех 1ирйег С₁₈ (4,6 х 250 мм, размер частиц 5 мкм) при температуре 50°С; образцы загружали на колонку, уравновешенную 40% ацетонитрилом, 0,1% ТРА, при 1 мл/мин. Колонку промывали 3 мл 58%-ного ацетонитрила. Впоследствии белок элюировали градиентом от 58 до 63% ацетонитрила в течение 27 мин.

Препаративную и аналитическую ВР-НРЬС проводили на колонке 1ирйег С₁₈, 4,6x250 мм, размер частиц 5 мкм, (Рйепотепех, Тоггапсе, Калифорния) при температуре 50°С. Образцы загружали на колонку, уравновешенную 40% ацетонитрилом, 0,1% ТРА, при 1 мл/мин. Колонку промывали 3 мл 58%-ного

- 19 006368 ацетонитрила. Впоследствии белок элюировали градиентом от 58 до 63% ацетонитрила в течение 27 мин. Элюируемый растворитель тестировали, измеряя поглощение при 214 нм. Очищенный РЕО-РгоОР, который элюируется в виде единственного пика при 8ЕС в неденатурирующих условиях, разделяется (фиг. 5) на модифицированную ПЭГ субъединицу и немодифицированную ПЭГ субъединицу (как определено выше) при денатурирующих условиях. Для подтверждения идентичности каждого вида молекулы пики от элюции КР-НРЬС (фиг. 5) собирали для экспериментов с использованием МАЬЭЬТОЕ М8 и Νконцевого секвенирования.

Ν-концевое секвенирование и пептидное картирование.

Химию автоматической деградации по Эдману использовали для определения ИН₂-концевой белковой последовательности (8ОР 400.324). Для деградации использовали секвенатор Аррйеб Вюкук1етк Мобе1 494 Ргес1ке (Регкш Е1тег, \Ме11ек1еу, Массачусетс). Соответствующие производные РТН-АА идентифицировали посредством КР-НРЬС-анализа в режиме он-лайн с использованием РТН-анализатора Аррйеб Вюкук1етк Мобе1 140С, соединенного с РТН-С18-колонкой Е1тег/Вго\\п1ее с внутренним диаметром 2,1 мм. Результатом Ν-концевого секвенирования пика КР-НРЬС (фиг. 5), соответствующего правильной массе ПЭГ-РгоОР, являлись два сигнала. Основной сигнал (выход примерно 75%) характеризовался ожидаемой для ПЭГ -РгоОР последовательностью, за исключением отсутствия Ν-концевой аминокислоты. Данный результат является ожидаемым для белка, модифицированного ПЭГ с Ν-конца. Остаток первого цикла был невыявляемым вследствие присоединенной группы ПЭГ. Более слабый сигнал (выход примерно 25%) характеризовался правильной Ν-концевой аминокислотной последовательностью. Имея ввиду то, что пик, собранный после КР-НРЬС, является на 100% модифицированным ПЭГ, эти данные указывают на то, что 75% модификации ПЭГ осуществляется по Ν-концу, при том, что остаток, очевидно, характеризуется связыванием по одному из нескольких возможных остатков лизина.

Расщепление трипсином.

Модифицированный ПЭГ РгоОР расщепляли в концентрации 1 мг/мл трипсином (Рготеда) в РВ8 модификации Дульбекко (Р1егее), 10 мМ Тпк. рН 7,5 (Ыдта). Трипсин использовали в отношении 50:1 перерастворенным в 40% АСЫ (В&1), 0,1% ΤΓΑ (Р1егее). После расщепления в течение ночи при 37°С добавляли вторую аликвоту трипсина, и раствор снова расщепляли в течение ночи при 37°С. Расщепление останавливали 5% 1,0н. НС1 (Е1кйег), и, если необходимо, продукт расщепления хранили при 4°С до применения. 175 мкл наносили на колонку ТокоНаак 3000Р\У. уравновешенную 35% АСИ, 0,1% ТЕ А, при 0,5 мл/мин, и элюировали в течение 50 мин (фиг. 7). Фракции собирали вручную от 0 до 25 мин. Фракцию, содержащую модифицированные ПЭГ фрагменты, подвергали секвенированию по Эдману. Данные результаты указывали на то, что примерно 77% конъюгации с ПЭГ происходило по альфааминогруппе Ν-концевого аланина, при том, что оставшиеся 23% распределялись как 14% на К284, 5% на К201 и 4% на К252.

Времяпролетная масс-спектрометрия по принципу опосредованной матрицей лазерной десорбцииионизации (МАЬЭЬТОЕ М8).

Очищенные при помощи КР-НРЬС модифицированные ПЭГ, немодифицированные ПЭГ мономеры РгоОР концентрировали и примерно 1 мкл концентрата наносили на мишень для МАЬЭ1 с 3,5диметокси-4-гидроксикоричной кислотой в качестве матрицы. Спектры получали с использованием Регкербуе Вюкук1етк Уоуадег МАЬЭЬТОЕ (Регкербуе Вюкук1етк) путем детекции положительно заряженных ионов в линейном режиме. Сто двадцать три сканирования было собрано и усреднено. Массы вычисляли с использованием В8А в качестве стандарта. Путем МАЬЭЬТОЕ М8 подтверждали правильные массы каждой субъединицы, как модифицированного одной молекулой ПЭГ массой 30000 Да мономера РгоОР-4 (ПЭГ-РгоОР) (фиг. 6) и ^модифицированного ПЭГ мономера РгоОР-4 (данные не показаны). Элюирумый ранее пик характеризовался молекулярной массой 71 000 Да, соответствующей ПЭГ массой 32000 Да плюс РгоОР-4 массой 39000 Да. Элюируемый позднее пик характеризовался молекулярной массой, правильной для РгоОР-4 (39000 Да).

Пример 16. Анализ пролиферации клеток ВаЕ3/О-С8ЕК.

Мышиные клеточные линии ВаЕ3, трансфицированные генами, кодирующими рецептор О-С8Е человека (тВаЕ3/йО-С8ЕК), использовали для оценки активности агониста 11С-С8Е. Клетки тВаЕЗ/ЕСС8ЕК высевали при 2,5х10⁴ клеток/лунку в 96-луночные планшеты для микротитрования, содержащие серийное разведение РгоОР и модифицированного ПЭГ РгоОР. Через Т = 56 ч клетки подвергали воздействию [метил-³Н]-тимидином при 0,5 мКи на лунку в течение 18 ч. Содержимое планшетов собирали на стекловолоконные фильтровальные матрасы и измеряли включенную радиоактивность путем сцинтилляционной спектроскопии. Среда анализа для клеточных линий состояла из 1МЭМ, дополненной бычьим сывороточным альбумином (В8А) (ВоеЕтшдег Мапийе1т, Индианаполис, Индиана), 500 мкг/мл, человеческим трансферрином (8щта, 81. Ьошк, Монтана), 100 мкг/мл, липидной составляющей, включавшей в себя 2,5 мл фосфатидилхолина/мл В8А, и 50 мМ 2-меркаптоэтанолом. Активность ПЭГ РгоОР в качестве агониста рецептора О-С8Е усиливалась по сравнению с РгоОР-4 (таблица 1). Значение ЕС₅₀ для ПЭГРгоОР (0,005 нМ) было примерно в 4 раза ниже (р < 0,05), чем то, что было определено для РгоОР-4 (0,021 нМ).

Пример 17. Анализ клеточной пролиферации Ва£3/Е113.

- 20 006368

Химерную молекулу рецептора Р113/С-СБР конструировали с использованием внеклеточного и трансмембранного доменов человеческого Р1!3, лидерной последовательности человеческого 1Ь-3 и цитоплазматического домена рецептора человеческого С-СБР. Полученную в результате конструкцию использовали для трансфекции линии лимфоидных клеток мыши ВаГ/3. По описанному протоколу продуцировали стабильные клоны ВаГ/3, которые пролиферировали в ответ на человеческий РЬ, но не на другие протестированные человеческие цитокины. Данную клональную линию использовали для анализа присущей РгоСР и модифицированному ПЭГ РгоСР активности агониста Р1!3. Клетки высевали при 2,5-10⁴ клеток/лунку в 96-луночные планшеты для микротитрования, содержащие серийные разведения каждого фактора роста в бессывороточной ΙΜΌΜ, дополненной человеческим трансферрином (100 мкг/мл), липидной составляющей, включавшей в себя 2,5 мл фосфатидилхолина/мл бычьего сывороточного альбумина (500 мкг/мл), и 50 мкМ 2-меркаптоэтанолом. Через 56 ч клетки подвергали воздействию [метил-³Н]-тимидином при 0,5 мкКи на лунку в течение 14-18 ч, собирали и измеряли включенную радиоактивность путем сцинтилляционной спектроскопии.

Модифицированные ПЭГ формы РгоСР сохраняли биологическую активность РгоСР-4 (табл. 1).

Таблица 1. Сравнение индуцируемой РгоСР-4 и модифицированного ПЭГ-АЬБ массой 30 кДа РгоСР-4 (пример 1) клеточной пролиферации

	ВАГЗ/Е1Р		ВАГЗ/С-СЗГ
	Среднее ЕС50 (п=12)	Средняя относ, эффективность	Среднее ЕС50 (п=9)	Средняя относ. эффективность
Г-ЙС-СЗГ	>200	не оценивали	0,025 ± 0,010	1,00
г-кК1РЗ	0,03 + 0,03	1,00	>2,0	не оценивали
РгоСР	0,25 + 0,17*	0,16 4- 0,17	0,021 ± 0,013*	1,16 ± 0,98
пэг- РгоСР-4	0,63 ± 0,48*	0,05 ± 0,03	0,005 ± 0,003*	8,37 ± 5,78

Пример 18. Клоногенные анализы КОЕ-ГМ.

Размножение кроветворных предшественников демонстрировали с использованием происходящих из костного мозга человека клеток СО34 + в анализе колониеобразующих единиц гранулоцитов/макрофагов (КОЕ-ГМ), в котором клоногенные предшественники делятся и дифференцируются в полужидкой среде в ответ на действие факторов роста. Свежие образцы костномозговой (КМ) жидкости получали при сотрудничестве с Б1. Ьошк ишмегШу Меб1са1 БсЬоо1. Фракции мононуклеарных клеток получали после центрифугирования в градиенте плотности с использованием Нсо11-Нурас.|ие. Затем клетки СО34+ (стволовые и предшественники) выделяли путем позитивного отбора с использованием набора реагентов для стволовых клеток 1ко1ех 50 (Вах1ег НеаНЬсаге Со^оиНои, ОеегДеМ, Иллинойс). По данной процедуре получали обогащенный клеточный продукт, в котором >90% клеток экспрессировали антиген клеточной поверхности СО34+. Данные клетки СО34+ высевали на чашки для тканевой культуры размером 35 мм (10000 клеток/чашку) в Ме1ЬоСи11 Н4230 (Б!етСе11 ТесЬηо1од^е8, Ванкувер, Британская Колумбия), содержащей 0,9% метилцеллюлозы в среде Дульбекко, модифицированной по Есоме (1М0М) , 30% РВБ, 1% ВБА, 1 мМ 2-меркаптоэтанола и 2 мМ Ь-глутамина.

Культуры инкубировали с факторами роста в течение 10-12 суток при 37°С в увлажненном воздухе, содержащем 5% СО₂. Концентрации соответствующих агонистов рецептора в экспериментах с совместным добавлением являются эквимолярными на указанном уровне концентрации. Кроветворные колонии (>50 клеток) подсчитывали с использованием обратного микроскопа. Индуцированная ПЭГ-РгоСР дифференцировка и размножение кроветворных клеток-предшественников в колониеобразующие единицы гранулоцитарных/макрофагальных клеток (КОЕ-ГМ) была равной ответу, вызванному РгоСР-4 или одновременным введением человеческого Д13-лиганда и ЬС-СБР (фиг. 8).

Пример 19. Введение факторов роста для исследования фармакокинетики (РК).

Самок мышей С57ВБ/6 (возраст 8-12 недель, СЬаг1ек Ищет, Ва1е1дЬ, Северная Каролина) держали в виварии РЬагтааа. РгоСР и модифицированный ПЭГ РгоСР разводили в РВБ (Ь1£е ТесЬио1од1е8, Сганб Шайб, Нью-Йорк) и вводили мышам в дозе 100 мкг/инъекцию. Мышам вводили единственную подкожную дозу (БС).

ЕЫБА РгоСР.

- 21 006368

Концентрации белков РгоСР и модифицированного ПЭГ РгоСР в плазме мышей определяли с использованием сэндвич-метода ЕЫБА. 96-луночные планшеты для микротитрования покрывали 150 мл/лунку аффинно очищенного поликлонального антитела козы против Р113-лиганда, разведенного до 1 мкг/мл в 100 мМ ЫаНСОз, рН 8,2. Планшеты инкубировали в течение ночи при комнатной температуре в увлаженной камере и блокировали в течение одного часа при 37°С фосфатно-солевым буфером, содержащим 3% ВБА и 0,05% полиоксиэтиленсорбитана монолаурата (Тгееи 20), рН 7,4. Планшеты промывали четыре раза 150 мМ раствором №10’1, содержащим 0,05% Тгоееи 20 (буфер для промывки). Образцы плазмы РК разводили в буфере для анализа (РВБ, 0,1% ВБА, 0,01% Тгоееи 20), рН 7,4, и титровали 1:2 в матрице для анализа, состоящей из объединенной мышиной плазмы. Плазменные концентрации матрицы и образцов уравнивали по процентному содержанию. Планшеты инкубировали в течение 2,5 ч при 37°С в увлажненной камере, затем промывали 4 раза буфером для промывки. Аффинно очищенное поликлональное антитело козы против агониста человеческого рецептора С-СБР, конъюгированное с пероксидазой хрена, разводили 1:10000 (0,25-0,05 мкг/мл) в буфере для анализа и в каждую лунку добавляли 150 мкл. Планшеты инкубировали в течение 1,5 ч при 37°С в увлажненной камере. Лунки опустошали и каждую лунку снова промывали четыре раза буфером для промывки. Каждую лунку затем загружали 150 мкл раствора субстрата пероксидазы ТМВ. Планшеты инкубировали при комнатной температуре примерно в течение 10 мин и считывали при тестируемой длине волны 650 нм в многоканальном спектрофотометре для планшетов микротитрования (Мо1еси1аг Эеу1сек СогрогаЕои). Концентрации иммунореактивного РгоСР в неисследованных образцах РК рассчитывали из стандартной кривой для РгоСР-4 или ПЭГ-РгоСР с использованием программы подгонки кривой по четырем параметрам Мо1еси1аг Иеуюек.

Анализ данных по фармакокинетике.

Параметры РК, приведенные в табл. 2, определяли посредством неразделенного анализа с использованием \Ут№г11т (версия 3.0, РНагкщЫ. СНаре1 Н111, Северная Каролина). Данные по концентрации в плазме (и=3) усредняли и проводили один анализ РК на среднем значении. Очевидный окончательный период полужизни (1_1/2) выбирали вручную во время неразделенного анализа путем визуального обследования логарифмически-линейного графика зависимости концентрации в плазме от времени. Сравнение фармакокинетики РгоСР-4 и ПЭГ-РгоСР показано на фиг. 9 и табл. 2. Эти данные показывают, что единичная доза ПЭГ-РгоСР, равная 100 мкг, введенная мыши подкожно, характеризуется продленным временем пребывания в плазме по сравнению с таковым для РгоСР-4. Через 48 ч концентрация ПЭГ-РгоСР в плазме была примерно в 70 раз выше, чем для РгоСР-4. Детектируемый уровень ПЭГ-РгоСР наблюдали через 96 ч после дозировки, в то время как РгоСР-4 не детектировали через 72 ч. Такие значения РК, как конечный период полужизни (ΐ_1/2), клиренс (С1), время достижения максимальной концентрации (Т_тах) и максимальная концентрация (С_тах), для ПЭГ-РгоСР и РгоСР-4 существенно не отличались. Таким образом, модификация ПЭГ продлевает время, в течение которого белок циркулирует в крови мыши.

Таблица 2. Сравнение фармакокинетики РгоСР-4 и ПЭГ -РгоСР-4 (пример 1) у мышей.

	Мыши(η)	Доза (мкг/ мышь)	Т*тах	С*тах	лис (I)	СЪ/Г	νά/Ε	ΐ-1/2	С48 ч
РгоСР	3	100	8	28000	529	0, 189	0, 944	3,46	72
ПЭГ- РгоСР -4	3	100	(б) 24а	19500	720	0,139	0, 977	4,87	4744
ПЭГ- РгоСР -4	3	100	8	40500	1080	0,0926	0,657	4,92	4181

Введение факторов роста для исследования фармакодинамики (РИ).

Самок мышей С57ВБ/6 (возраст 8-12 недель, СНаг1ек Кгуег, Ва1е1дН, Северная Каролина) содержали в виварии РРагтааа. РгоСР-4 и ПЭГ-РгоСР разводили в РВБ (Ь1Ре ТесНио1од1ек, Сгаий Ыаий, Нью-Йорк) и вводили мышам в дозах, варьирующих от 100 до 500 мкг/инъекцию. Мышам делали подкожные (БС) инъекции следующим образом: РгоСР-4 вводили ежесуточно на 0-6 сутки или на 0-9 сутки (0,1 мг/инъекцию); ПЭГ-РгоСР вводили на 0, 3 и 6 сутки или на 0, 3, 6 и 9 сутки (0,3 мг/инъекцию); ПЭГРгоСР вводили на 0 сутки или на 0 и 5 сутки (0,5 мг/инъекцию). Контроль в виде носителя вводили ежесуточно на 0-9 сутки с использованием РВБ (0,1 мл/инъекцию).

Переработка периферической крови и селезенки.

Периферическую кровь собирали от анестезированных посредством СО2 мышей в покрытые гепарином пробирки путем пункции сердца. Селезенки собирали от подвергнутых эвтаназии животных непосредственно после сбора крови. Подсчет общего числа лейкоцитов (^ВС) проводили на цельной крови с

- 22 006368 использованием устройства для подсчета клеток (Сои1!ег ΖΜ, М1ат1 Ьакек, Флорида). Эритроциты лизировали с использованием 0,15 М гипотонического раствора хлорида аммония (8!ет Се11 ТесЬио1оду, Ванкувер, Британская Колумбия). Клетки собирали центрифугированием (300хд в течение 10 мин) и промывали холодной 1МЭМ (ЫГе ТесЬио1од1е8, Сгаиб Ыаиб, Нью-Йорк), содержащей 2% РВ8 (1МОМРВ8, Вюргобисй Гог 8аеисе, Индианаполис, Индиана). Селезенки собирали и перерабатывали в холодной 1МЭМ-РВ8, гомогенизировали до клеточной суспензии и фильтровали через нейлоновое сито с отверстием 70 мкм. Эритроциты лизировали с использованием гипотонического раствора хлорида аммония, клетки селезенки промывали холодной 1МЭМ-РВ8 и фильтровали через сито с отверстием 70 мкм. Клетки селезенки ресуспендировали в 25 мл буфера ГМЭМ, содержащего 2% В8А, и подсчитывали с целью определения числа спленоцитов в селезенке.

Реагенты для проточной цитометрии.

Моноклональные антитела, конъюгированные с флуорохромом или биотином, приобретали от РЬагттдеи (8аи И1едо, Калифорния). ΟΌ16/ΟΌ32 (антитело к Рс-рецептору ΙΙ/ΙΙΙ, блок Рс), конъюгированные с Р!ТС антитела против СП11с/НЬ3 и конъюгированные с РЕ антитела против МНС класса ΙΙ (ΙА^Ь//АР6-120.1) использовали в концентрации 1-5 мкг/мл. Подходящие по изотипу контроли использовали для разных комбинаций антител.

Реакции общих лейкоцитов (\УВС) и дендритных клеток (ИС) в селезенке были сходными для ПЭГРгоСР, вводимого каждые третьи сутки, по сравнению с РгоСР-4, вводимым ежесуточно (фиг. 10). Относительная реакция ИС в периферической крови на 10 сутки была выше для ПЭГ-РгоСР, вводимого каждые третьи сутки, по сравнению с РгоСР-4, вводимым ежесуточно. Кинетики мобилизации ИС (фиг. 11) были сходными для РгоСР-4 и ПЭГ-РгоСР-4 (пример 1) в селезенке; тогда как в периферической крови кинетики модификации ИС были модифицированы для ПЭГ-РгоСР-4 (пример 1), вводимого каждые третьи сутки, по сравнению с РгоСР-4, вводимым ежесуточно.

Claims (26)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Конъюгат прогенипоэтина, характеризующийся по крайней мере одной молекулой водорастворимого полимера, ковалентно присоединенной по крайней мере к одному аминокислотному остатку биологически активного полипептида прогенипоэтина.
2. 2. Конъюгат прогенипоэтина по п.1, где указанный полимер представляет собой молекулу полиэтиленоксида.
3. 3. Конъюгат прогенипоэтина по п.2, где указанная молекула полиэтиленоксида представляет собой молекулу полиэтиленгликоля.
4. 4. Конъюгат прогенипоэтина по п.3, где полиэтиленгликоль присоединен к аминокислотному остатку, имеющему свободную амино-, карбоксильную или сульфгидрильную группу(-ы).
5. 5. Конъюгат прогенипоэтина по п.4, где указанный полиэтиленгликоль конъюгирован посредством активированного полиэтиленгликоля.
6. 6. Конъюгат прогенипоэтина по п.5, где указанный активированный полиэтиленгликоль выбран из группы, состоящей из паранитрофенила, сукцинимидила, карбонилимидазола, азлактонов, циклических имидтиокетонов, изоцианатов, изотиоцианатов, альдегидов, первичных аминов, гидразина, ацилгидразидов, карбазатов, семикарбаматов, тиокарбазатов, тиолов, малеимидов, сульфонов и фенилглиоксалей.
7. 7. Конъюгат прогенипоэтина по п.6, где указанный активированный полиэтиленгликоль выбран из группы, состоящей из сукцинимидила, карбонилимидазола, альдегидов, ацилгидразидов, карбазатов, семикарбаматов и малеимидов.
8. 8. Конъюгат прогенипоэтина по п.7, где указанный полиэтиленгликоль характеризуется молекулярной массой примерно от 0,5 до 100 кДа.
9. 9. Конъюгат прогенипоэтина по п.8, где указанный полиэтиленгликоль характеризуется молекулярной массой примерно от 3,4 до 40 кДа.
10. 10. Конъюгат прогенипоэтина по п.4, где указанный полиэтиленгликоль является разветвленным полимером.
11. 11. Конъюгат прогенипоэтина по п.10, где разветвленный полимер полиэтиленгликоля характеризуется молекулярной массой примерно от 10 до 40 кДа.
12. 12. Конъюгат прогенипоэтина по п.4, где указанный полиэтиленгликоль является бифункциональным полимером.
13. 13. Конъюгат прогенипоэтина по пп.1-11 или 12, где указанный полипептид прогенипоэтин характеризуется формулой

    В₁-Ь₁-В₂, В₂-Ь₁-В₁, В₁-В₂ или В₂-В₁, где В₁ представляет собой полипептид, включающий модифицированную аминокислотную последовательность лиганда Г1!-3 формулы

    - 23 006368

    ТЬгС1пАзрСуз5ег₽Ье61пН1зЗегРго11е5егЗегАзрРйеА1а17а1Ьуа11еАгд

    1020

    01иЬеиЗегАзртугЬеиЬеиа1пАзрТугРго17а1Т11ГУа1А1аЗегАзпЬеие1пАбр

    3040

    С1иС1иЬеиСувС1уС1уЬеиТгрАгдЬеиУа1ЪеиА1а61пАтдТгрМе1:С1иАгдЬеи

    5060

    ЬузТ11гУа1А1аС1уЗегЬузМеСО1пО1уЬеиЬеиС1иАгдУа1АзпТЬгС1и11еН1з

    7080

    РкеУа1ТЬгЬу8СузА1аРИе<31пРгоРгоРго8егСувЬеиАгдРЬеУа1С1пТ11гАзп

    50100

    11еЗегАгдЬеиЬеиС1пС1иТкгЗега1иС1п1₁еиУа1А1аЬеиЬуеРгоТгр11еТЬг

    110120

    АгдС1пАзпР11еЗегАгдСузЬеиС1иЬеиа1пСуз01пРгоАзгЗегЗегТЬгЬеи

    130 ЗЕО Ю N0:1 где Ν-конец присоединен к С-концу непосредственно или через линкер (Ь₂), способный соединять Νконец с С-концом и имеющий новые С- или Ν-концы у аминокислот

    28-29 42-43 93-94 29-30 64-65 94-95 30-31 65-66 95-96 31-32 66-67 96-97 32-33 86-87 97-98 34-35 87-88 98-99 36-37 88-89 99-100 37-38 89-90 100-101 38-39 90-91 101-102 39-40 91-92 102-103 40-41 92-93 соответственно; 41-42

    где К₂ представляет собой фактор, выбранный из группы, состоящей из колониестимулирующего фактора, цитокина, лимфокина, интерлейкина и кроветворного фактора роста;

    где Ь₁ представляет собой линкер, способный связывать К₁ с К₂;

    и указанному белку прогенипоэтину может непосредственно предшествовать (метионин^-1), (аланин^-1) или (метионин^-2, аланин^-1).
14. 1 4. Композиция, включающая белок прогенипоэтин по пп. 1 -11 или 1 2, и по крайней мере один фармацевтически приемлемый носитель.
15. 1 5. Способ лечения пациента, имеющего нарушение кроветворения, предусматривающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества конъюгата прогенипоэтина по пп.1-11 или 1 2.
16. 16. Способ по п.15, где указанное нарушение кроветворения представляет собой нейтропению, лейкопению, тромбоцитопению или анемию.
17. 1 7. Способ по п. 1 6, где указанное нарушение кроветворения представляет собой результат химиотерапии, радиационной терапии или применения лекарственных средств, подавляющих костный мозг.
18. 18. Способ лечения пациента, восстанавливающегося и/или страдающего от трансплантации костного мозга, ожога, ранения, паразитарной, бактериальной или вирусной инфекции, предусматривающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества конъюгата прогенипоэтина по пп. 1 -11 или 1 2.
19. 19. Способ мобилизации кроветворных предшественников и стволовых клеток в периферическую кровь, предусматривающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества конъюгата прогенипоэтина по пп.1-11 или 12.
20. 20. Способ продукции дендритных клеток, включающий стадии

    a) отделения кроветворных клеток-предшественников или клеток ί.Ό34+ от других клеток и

    b) культивирования указанных кроветворных клеток-предшественников или клеток СЭ34+ в ростовой среде, содержащей кроветворный белок по пп.1-11 или 12.
21. 21 . Способ по п.20, дополнительно включающий стадию

    c) воздействия на указанные культивируемые кроветворные клетки-предшественники или клетки ί.Ό34+ антигена.
22. 22. Способ по п.20, где указанная ростовая среда дополнительно содержит один или несколько факторов, выбранных из группы, состоящей из СМ-С8Р, 1Ь-4, ΤΝΡ-α, фактора стволовых клеток (8СР), лиганда Г11-3, 1Ь-3, варианта 1Ь-3, белка слияния - варианта 1Ь-3 и многофункционального агониста рецепторов.
23. 23. Способ по п.21, где указанная ростовая среда дополнительно содержит один или несколько фак- 24 006368 торов, выбранных из группы, состоящей из СМ-С8Б, 1Б-4, ΤΝΡ-α, фактора стволовых клеток (8СБ), лиганда Γ1Ϊ-3, 1Б-3, варианта 1Б-3, белка слияния - варианта 1Б-3 и многофункционального агониста рецепторов.
24. 24. Способ лечения человека, имеющего опухоль, инфекцию или аутоиммунное заболевание, включающий стадию введения указанному человеку кроветворного белка по пп.1-11 или 12.
25. 25. Способ по п.24, дополнительно включающий введение одного или нескольких факторов, выбранных из группы, состоящей из СМ-С8Б, 1Б-4, ΤΝΡ-α, фактора стволовых клеток (8СБ), лиганда Γ1Ϊ-3, 1Б-3, варианта 1Б-3, белка слияния - варианта 1Б-3 и многофункционального агониста рецепторов.
26. 26. Способ конъюгирования полиэтиленгликоля с нуклеофилом, где конъюгацию проводят в присутствии неорганического растворителя.