EA008938B1

EA008938B1 - Применение кластерина для лечения и/или профилактики периферических неврологических заболеваний

Info

Publication number: EA008938B1
Application number: EA200501528A
Authority: EA
Inventors: Георг Фегер; Урсула Бошерт; Ив Саго; Рубен Папоян
Original assignee: Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н. В.
Priority date: 2003-03-28
Filing date: 2004-03-26
Publication date: 2007-10-26
Also published as: KR20050119149A; US20070134260A1; BRPI0408889A; NO20054913D0; WO2004084932A2; NO20054913L; WO2004084932A3; AU2004224779A1; EP1610810A2; MXPA05010414A; EA200501528A1; JP2006523199A; CN1791422A; CA2519681A1

Abstract

Изобретение относится к применению кластерина или агониста активности кластерина для лечения или профилактики периферических неврологических заболеваний. Кроме того, изобретение относится к применению комбинации кластерина и гепарина для лечения или профилактики периферических неврологических заболеваний.

Description

Область техники

Настоящее изобретение в основном принадлежит к области неврологических заболеваний периферической нервной системы. Оно относится к нейропротективному действию, миелинизации нервных волокон и генерации или регенерации клеток, вырабатывающих миелин. Более конкретно, настоящее изобретение относится к применению кластерина или агониста активности кластерина для производства лекарственного средства, предназначенного для лечения и/или профилактики периферических неврологических заболеваний.

Уровень техники

Периферические неврологические заболевания представляют собой расстройства, относящиеся к периферической нервной системе (ΡΝ8) или периферической нейроглии, поддерживающей ΡΝ8. Периферические невропатии входят в число наиболее распространенных периферических неврологических заболеваний.

Периферическая невропатия представляет собой синдром потери чувствительности, слабость и атрофию мышц, заторможенные глубокие сухожильные рефлексы и вазомоторные симптомы, по отдельности или в любом сочетании.

Заболевание может поражать отдельный нерв (мононевропатия), два или большее количество нервов в отдельных областях (множественная мононевропатия) или многие нервы одновременно (полиневропатия). Первоначальному поражению может подвергаться аксон (например, при сахарном диабете, болезни Лайма, уремии или при действии токсических средств) или миелиновая оболочка шванновской клетки (например, при острой или хронической воспалительной полиневропатии, лейкодистрофиях или синдроме Гийена-Барре). Повреждение мелких немиелинизированных и миелинизированных волокон первоначально приводит к потере температурной и болевой чувствительности; повреждение крупных миелинизированных волокон приводит к моторным или проприоцептивным нарушениям. Отдельные разновидности невропатии (например, вызванные отравлением свинцом, применением дапсона, укусами клещей, порфирией или при синдроме Гийена-Барре) первоначально поражают двигательные нервные волокна; другие разновидности невропатии (например, воспаление нервных узлов задних корешков, вызванное раком, проказой, СПИДом, сахарным диабетом или хронической пиридоксиновой интоксикацией) в первую очередь поражают ганглии задних корешков или чувствительные нервные волокна, порождающие сенсорные симптомы. Кроме того, иногда оказываются затронутыми черепные нервы (например, при синдроме Гийена-Барре, болезни Лайма, сахарном диабете и дифтерии). Отождествление затронутых модальностей помогает определить причину заболевания.

Наиболее распространенной причиной локализованного поражения отдельного нерва является травма. Интенсивная мускульная деятельность или вынужденное чрезмерное растяжение сустава могут вызывать очаговую невропатию, к тому же результату могут приводить повторяющиеся микротравмы (например, тесные защемления небольшими инструментами, чрезмерная вибрация от пневматических отбойных молотков). Давление или вызванный ущемлением паралич, как правило, воздействуют на поверхностные нервы (локтевой, лучевой, малоберцовый), расположенные на костных выступах (например, во время глубокого сна или под анестезией, у худых или истощенных людей и, часто, у алкоголиков) или в тонких каналах (например, при карпальном туннельном синдроме). Причиной вызванного давлением паралича также могут служить опухоли, гиперостозы, гипсовые повязки, костыли или продолжительное пребывание в стесненных позах (например, при работе в саду). Причиной невропатии могут служить кровоизлияние в нерв, воздействие холода или радиации. Причиной мононевропатии может быть непосредственное прорастание опухоли.

Травматические повреждения ΡΝ8 могут происходить в ходе хирургического вмешательства (например, хирургической простатэктомии). Для того чтобы избежать повреждения нервов при проведении нервосберегающей простатэктомии, в процессе операции применяют стимулирование кавернозного нерва для определения пути его прохождения, что служит руководством для хирурга и позволяет ему избежать повреждения нервов (Κ1ο!ζ и Негасйотп, 1998). Исследования по оценке импотенции, вызванной радикальной простатэктомией, показали, что из 503 мужчин, имевших нормальную потенцию, 212 мужчин (42%) начали страдать импотенцией после частичной или полной резекции одного или обоих кавернозных нервов. Когда нервы оставляли неповрежденными, уровень импотенции снизился до 24% (Ошп1ап е! а1., 1991Б; Ошп1ап е! а1., 1991а).

Множественная мононевропатия, как правило, является вторичным заболеванием по отношению к сосудистым коллагеновым расстройствам (например, нодозному (узелковому) полиартерииту, 8ЬЕ (системной красной волчанке), синдрому Шегрена, КА (ревматоидному артриту)), саркоидозу, расстройствам метаболизма (например, диабету, амилоидозу) или инфекционным заболеваниям (например, болезни Лайма, ВИЧ-инфекции). Микроорганизмы могут вызывать множественную мононевропатию путем непосредственного проникновения в нервы (например, в случае проказы). Полиневропатия, обусловленная острыми лихорадочными заболеваниями, может быть вызвана токсином (например, в случае дифтерии) или аутоиммунной реакцией (например, при синдроме Гийена-Барре); полиневропатия, которая иногда следует за иммунизацией, вероятно, также является аутоиммунной.

- 1 008938

К полиневропатии могут приводить токсические средства и расстройства метаболизма. Причиной полиневропатии часто является дефицит витамина В (например, при алкоголизме, бери-бери, злокачественной анемии, дефиците пиридоксина, вызванном изониазидом, синдромах нарушения всасывания в пищеварительном тракте и гиперемезисе беременных). Кроме этого, полиневропатия встречается при гипотиреоидизме, порфирии, саркоидозе, амилоидозе и уремии. Сахарный диабет может вызывать сенсомоторную дистальную полиневропатию (чаще всего), множественную мононевропатию и очаговую мононевропатию (например, окуломоторных или отводящих черепных нервов).

Злокачественные заболевания могут вызывать полиневропатию посредством моноклональной гаммапатии (множественной миеломы, лимфомы), инвазии амилоида, недостаточности питания, или же полиневропатия может возникнуть в качестве паранеопластического синдрома.

Отдельные разновидности мононевропатии - единичная и множественная невропатии - характеризуются болью, слабостью и парестезией в месте расположения пораженного нерва. Множественная мононевропатия является ассиметричной; все нервы могут поражаться одновременно или постепенно. Обширное поражение многих нервов может напоминать полиневропатию.

Паралич локтевого нерва часто бывает вызван травмой нерва в локтевом углублении при частом облокачивании или при асимметричном росте костей после перелома в детстве (замедленный локтевой паралич). Кроме этого, локтевой нерв может быть сдавлен в локтевом тоннеле. Парестезия и пониженная чувствительность может наблюдаться в 5-м и в средней части 4-го пальца; аддуктор большого пальца, абдуктор 5-го пальца, межкостные мышцы являются слабыми и атрофированными. Тяжелый хронический локтевой паралич вызывает деформацию кисти «когтистая кисть». Изучение состояния нервов позволяет идентифицировать участок поражения. Перед хирургическим вмешательством должна быть предпринята попытка консервативного лечения.

Причиной карпального туннельного синдрома является сдавление срединного нерва в ладонной части запястья между поперечной поверхностной карпальной связкой и продольными сухожилиями мышц предплечья, сгибающих руку. Оно может быть односторонним или двухсторонним. Сдавление вызывает парестезию в ладонно-лучевой части руки и боль в запястье и ладони; иногда боль появляется в ближайшем к месту сдавления участке в предплечье и плече. Боль может усиливаться ночью. Может развиться недостаток чувствительности в той части ладони, на которой находятся первые три пальца; мышцы, которые управляют разгибанием и противопоставлением большого пальца, могут стать слабыми и атрофированными. Этот синдром следует отличать от сдавления корешка С-6 из-за шейной радикулопатии.

Паралич малоберцового нерва обычно вызывается сдавлением нерва напротив боковой части шейки малоберцовой кости. Данный паралич наиболее часто наблюдается у истощенных, прикованных к постели пациентов и у худых людей, которые обычно кладут ногу на ногу. Возникает слабость при тыльном сгибании и выворачивании стопы ноги (отвисшая стопа). Иногда появляется недостаточная чувствительность над переднелатеральной частью голени и задней частью стопы или в перепонке между 1- и 2-й плюсневыми костями. В случае невропатий, вызванных сдавлением, как правило, применяют консервативное лечение (например, требуется избегать класть ногу на ногу). Наблюдение за частичными невропатиями часто осуществляют клинически, и улучшение обычно происходит самопроизвольно. Если выздоровление не наступает, может потребоваться хирургическое обследование.

Причиной паралича лучевого нерва («паралич субботней ночи») является сдавление нерва против плечевой кости, например, когда рука закинута за спинку стула, при интоксикации или глубоком сне. Симптомы включают слабость в запястье и разгибателях пальцев (свисающая кисть) и, иногда, потерю чувствительности в тыльной части 1-й дорсальной межкостной мышцы. Лечение сходно с лечением малоберцовой невропатии, вызванной сдавлением.

Полиневропатии являются относительно симметричными, причем они часто поражают сенсорные, моторные и вазомоторные волокна одновременно. Они могут поражать цилиндр или миелиновую оболочку аксона и в любой из форм могут быть острыми (например, синдром Гийена-Барре) или хроническими (например, почечная недостаточность).

Полиневропатия, вызванная расстройствами метаболизма (например, сахарным диабетом) или почечной недостаточностью, развивается медленно, часто на протяжении месяцев или лет. Она часто начинаются с аномалий чувствительности в нижних конечностях и часто сильнее выражена в периферических областях тела по сравнению с центральными. В периферических областях часто заметны покалывание, онемение, жгучие боли, а также недостаточная проприоцепция суставов и вибрационная чувствительность. Боль часто усиливается ночью и может обостряться при прикосновении к пораженной области или при изменениях температуры. В тяжелых случаях существуют объективные признаки потери чувствительности, как правило, в форме симптома «чулок и перчаток». Рефлексы ахиллова сухожилия и прочие глубокие сухожильные рефлексы ослаблены или отсутствуют. При глубокой потере чувствительности могут развиться безболезненные язвы на пальцах или суставах Шарко. Недостаток чувствительности или проприоцепции может вести к аномалиям в походке. Затрудненная моторика приводит к слабости и атрофии периферических мышц. Вегетативная нервная система может быть вовлечена в заболевание селективно или наряду с другими участками нервной системы, и это приводит к ночной диарее, недержанию мочи и кала, импотенции или постуральной гипотензии. Вазомоторные симптомы варьируют

- 2 008938 ся. Кожа может быть бледнее и суше нормальной, иногда с темными пятнами; потение может быть чрезмерным. В тяжелых продолжительных случаях характерны трофические изменения (гладкая и блестящая кожа, пористые или гофрированные ногти, остеопороз).

Алиментарная полиневропатия распространена среди алкоголиков и плохо питающихся людей. Возникающая первоначально аксонопатия может затем вести к демиелинизации и деструкции аксонов у наиболее протяженных и крупных нервов. Неясно, является ли причиной недостаток триамина или другого витамина (например, пиридоксина, пантотеновой кислоты, фолиевой кислоты). Невропатия, вызванная недостатком пиридоксина, обычно проявляется только у людей, принимавших изониазид при туберкулезе; у пиридоксин-дефицитных или пиридоксин-зависимых младенцев могут наблюдаться конвульсии. Атрофия и симметричная слабость периферических конечностей развиваются, как правило, скрыто, но могут прогрессировать и быстро, иногда сопровождаясь потерей чувствительности, парестезией и болью. Боль, спазмы, чувство холода, чувство жжения и онемения в икрах ног могут усиливаться при прикосновении. При неясной этиологии можно давать мультивитамины, но они не приносят гарантированной пользы.

Только сенсорная полиневропатия изредка начинается с периферических болей и парестезии и развивается централизованно, приводя к потере всех форм чувствительности. Она возникает как дистанционный результат карциномы (в особенности бронхогенной), после избыточного приема внутрь пиридоксина (>0,5 г/день), а также при амилсидозе, гипотиреоидизме, миеломе и уремии. Вызванная пиридсксином невропатия прекращается сама по себе, когда прекращается поступление пиридоксина.

Наследственные разновидности невропатии классифицируются как сенсорно-моторные или сенсорные невропатии. Болезнь Шарко-Мари-Тута является наиболее распространенной разновидностью наследственной сенсорно-моторной невропатии. Наименее распространенные разновидности сенсорномоторной невропатии начинаются с рождением и, по большей части, приводят к нетрудоспособности. При редких разновидностях сенсорной невропатии потеря периферической болевой чувствительности и температурной чувствительности выражена сильнее, чем потеря вибрационной чувствительности и ощущения пространства. Основная проблема заключается в увечье ног из-за интенсивных болей, сопровождаемых частыми инфекциями и остеомиелитом.

Наследственные моторные и сенсорные невропатии типов I и II (Болезнь Шарко-Мари-Тута, перонеальная мышечная атрофия) являются относительно распространенными, как правило, аутосомными доминантными расстройствами, которые характеризуются слабостью и атрофией, в первую очередь, в перонеальных и периферических мышцах ног. У пациентов также могут иметься другие дегенеративные заболевания (например, наследственная атаксия Фридрейха) или может иметь место семейная история этих заболеваний. Пациенты типа I проявляют себя в середине детства за счет отвисающей стопы и медленно прогрессирующей атрофии периферических мышц, приводящей к «аистовым ногам». Истощение внутренних мышц рук начинается позднее. Чувствительность к вибрации, боли и температуре снижается по образцу синдрома «чулок и перчаток». Глубокие сухожильные рефлексы отсутствуют. Высокий свод и молоткообразный палец стопы могут быть единственными признаками у наименее подверженных заболеванию членов семей, в которых оно является наследственным. Скорости передачи нервных импульсов замедлены, и задержка реакции периферических мышц увеличена. Присутствует сегментарная демиелинизация и ремиелинизация. Могут быть пальпированы увеличенные периферические нервы. Заболевание развивается медленно и не влияет на продолжительность жизни. Заболевание типа II прогрессирует еще медленнее, причем слабость обычно развивается в поздний период жизни. Пациенты имеют относительно нормальную скорость передачи нервных импульсов, но невысокую амплитуду потенциалов ответной реакции. Биопсия показывает уоллеровское перерождение нервных волокон.

Наследственная моторная и сенсорная невропатия типа III (гипертрофическая интерстициальная невропатия, болезнь Дежерина-Сотта), представляющая собой редкое аутосомальное рецессивное расстройство, начинается в детстве с прогрессирующей слабости, потери чувствительности и отсутствия глубоких сухожильных рефлексов. В начале она напоминает болезнь Шарко-Мари-Тута, но слабость моторики прогрессирует с большей скоростью. Наблюдается демиелинизация и ремиелинизация, что приводит к увеличению периферических нервов и луковицам, наблюдаемым на биопсии нервов.

Характерное сочетание моторной слабости, деформаций стопы, семейной истории и электрофизиологических аномалий подтверждает диагноз. Доступен генетический анализ, но не существует конкретного лечения. Для подготовки молодых пациентов к будущему развитию заболевания могут быть полезны профессиональные консультации. Применение ортопедических скоб помогает скорректировать отвисшую стопу; ортопедическая хирургия может помочь стабилизировать стопу.

Повреждения спинного мозга являются причиной большинства случаев госпитализации по поводу параплегии и тетраплегии. Более 80% случаев возникают в результате дорожно-транспортных происшествий. Клинически признаны две основные группы повреждений: открытые повреждения и закрытые повреждения.

Открытые повреждения вызывают непосредственную травму спинного мозга и корешков нервов. Проникающие раны могут вызвать обширные разрывы и кровоизлияния. Закрытые повреждения являются причиной большинства спинальных травм и, как правило, связаны с переломом/смещением позвоноч

- 3 008938 ного столба, которое обычно обнаруживают рентгенологически. Повреждение спинного мозга зависит от степени повреждения костной ткани, причем можно считать, что оно состоит из двух основных стадий: первоначального повреждения, которое представляет собой ушибы, разрывы нервных волокон и геморрагический некроз, а также вторичного поражения, которое включает экстрадуральную гематому, инфаркт, инфекцию и отек.

Более отдаленные последствия повреждения спинного мозга включают в себя восходящую и нисходящую антероградную дегенерацию поврежденных нервных волокон, посттравматическую сирингомиелию и системные следствия параплегии, такие как инфекции мочевыводящих путей и грудной клетки, пролежни и атрофия мышц.

Демиелинизация связана с функциональным снижением или блокировкой проводимости нервных импульсов.

Многослойная миелиновая оболочка представляет собой специализированную область мембраны плазмы глиальной клетки, обогащенную липидами и бедную белками. Она служит для поддержки аксонов и улучшения эффективности прохождения электрического сигнала в нервной системе, путем предотвращения утечки электрического заряда в окружающую ткань. Перехваты Ранвье представляют собой участки оболочки вдоль длины аксона, в которых наблюдается скачкообразное изменение проводимости.

Процесс ремиелинизации совместно с противовоспалительными путями мог действовать с целью устранения повреждения аксонов и их защиты от нарушения целостности и смерти.

Шванновские клетки представляют собой клетки периферической глии, которые играют поддерживающую роль в периферической нервной системе и принадлежат к сопутствующим клеткам. Шванновские клетки окружают ствол каждого периферического аксона по отдельности, формируя слой миелиновой оболочки вдоль сегментов аксона. Шванновские клетки состоят в основном из липидов или жиров; жир служит изолятором, тем самым увеличивая скорость передачи биоэлектрического потенциала по аксону.

Кроме того, шванновские клетки играют важную роль в процессе регенерации нейронов в периферической нервной системе. Когда аксон гибнет, окружающие его шванновские клетки способствуют его усвоению. После этого остается пустой канал, образованный соседними шванновскими клетками, через который от поврежденного конца может расти новый аксон со скоростью 3-4 мм в день.

Невропатии, как правило, селективны в отношении типа поражаемых нейронов ΡΝδ (например, сенсорных, а не автономных (вегетативных)) и то же самое относятся к подтипу нейронов (маленьких, а не больших). Аксотомия периферических нервов представляет собой животную модель, которую чаще всего используют для оценки нейропротективного воздействия нейротрофических факторов. Травматические повреждения нервов, повреждение нервных сплетений и корешков серьезно осложняют последствия несчастного случая. Кроме того, давление на периферические нервы, которое может вызвать повреждение миелинового слоя, часто наблюдается при таких расстройствах, как кистевой туннельный синдром, или же оно связано с ортопедическими осложнениями, относящимися к позвоночному столбу. Аксотомия вызывает такие явления, как смерть клеток, уменьшение скорости прохождения нервных импульсов через аксон и изменение уровня содержания нейротрансмиттеров в поврежденных нейронах. Повреждения, связанные с разрушением, предусматривают регенерацию, т.е. дополнительный процесс, который вызывает интерес, если речь идет о невропатических состояниях (МсМайоп и Рг1С511су. 1995).

Фундаментальным вопросом в клеточной нейробиологии является регуляция регенерации нервов после повреждения или заболевания. Функциональная регенерация нерва требует не только отрастания и удлинения аксона, но также синтеза нового миелина. Ремиелинизация необходима для восстановления нормальной нервной проводимости, а также для защиты аксонов от новых нейродегенеративных иммунологических воздействий. Первичная цель исследований в области нейродегенеративных расстройств, в конечном счете, состоит в том, чтобы разработать способ воздействия, который предотвращает гибель нейронов, сохраняет фенотип нейронов и восстанавливает повреждения нейронов и миелина. Большое число исследований было посвящено выявлению молекулярных и клеточных механизмов, ответственных за полную регенерацию спинальных двигательных нейронов, целостность которых была нарушена (Рассей и Кеупек, 1990; РипакокЫ е! а1., 1993). Вызванная повреждением экспрессия нейротрофических факторов и соответствующих рецепторов может играть важную роль в возможности регенерации нервов. Предыдущие исследования показали значительное улучшение регенерации нервов под действием различных пептидов, а также непептидных соединений, таких как инсулиноподобный фактор роста (1ОР-1), АСТН (адренокортикотропный гормон), Бе\\'1к е! а1., 1993; 81гапб е! а1., 1993, тестостерон (1опек, 1993), δΚ 57746А (Роигшег е! а1., 1993) и 4-метилкатехин (Напаока е! а1., 1992; КаесЫ е! а1., 1993).

Кластерин представляет собой внеклеточный белок, который также известен как аполипопротеин 1, 8ΟΚ-2, ΤΚΡΜ-2 и δΡ-40,40. Он встречается почти во всех тканях, и ему было дано большое количество наименований в соответствии с источниками, из которых он был выделен (см. обзоры Тгоидакок и Сопок (Тгоидакок апб Сопок, 2002), 1опек и 1отагу (1опек апб 1отагу, 2002)). Несмотря на то что кластерин экспрессируется повсеместно и несмотря на относительно высокое содержание кластерина в сыворотке (100 мкг/мл), его истинная функция остается невыясненной. Было предложено несколько возможных биологических функций кластерина, среди них - способность ингибировать каскад комплемента за счет

- 4 008938 связывания комплемента С9 (Тксйорр с1 а1., 1993), проапоптическая или антиапоптическая активность, в зависимости от исследуемой животной моделл (Нап с1 а1., 2001; Аейтй с1 а1., 2001), ограничение развития и, в более поздних исследованиях, функции сопровождения (Рооп е1 а1., 2002). Также высказывалось предположение о нейропротективной роли кластерина при болезни Альцгеймера (С1апиакори1о8 е1 а1., 1998). В основной форме из единичного транскрипта образуется гетеродимер молекулярной массой 75-80 кДа. Затем полипептидная цепь протеолитически расщепляется для удаления 22-звенного секреторного сигнального пептида, и впоследствии происходит расщепление между остатками 227/228 с образованием двух цепей - α и β, которые собраны вместе с помощью 5-и цистеиновых связей, размещенных в центре каждой из цепей. Полипептид также содержит сайты гликозилирования и ядерные локализации сигнальных последовательностей. Его расщепление, по-видимому, опосредуется эндоцитозным рецептором др330/мегалин/ЬКР2, т.е. членом семейства рецепторов липопротеина низкой плотности (Коиппак е1 а1., 1995).

Гепарин относится к числу мукополисахаридов высокой кислотности, образованных из равных частей сульфатированного Ό-глюкозамина и Ό-глюкуроновой кислоты с сульфаминовыми мостиковыми связями. Молекулярная масса составляет от 6 до 20 тыс. Гепарин присутствует в печени, легких, мастоцитах и т. д. позвоночных животных и может быть выделен оттуда. Его функции не установлены, но он применяется для предотвращения свертывания крови ш у1уо и ш уйто в форме многих различных солей (Меб1еа1 8иЬ.)ес1 Неабшдк (МЕ8Н), 1Шр://\у\у\у.шт.ш11.доу/те811/те8111юте.1ит1). Гепарин натрий (торговые наименования: Липогепин и Ликваэмин) применяют в качестве антикоагулянта при лечении тромбоза.

Кроме этого, существуют гепарины низкой молекулярной массы (ЪМАН), т.е. фрагменты молекул гепарина. Они, как правило, имеют молекулярную массу в диапазоне 4000-6000 кДа. Эти низкомолекулярные фрагменты являются эффективными антитромботическими средствами. Их введение понижает риск кровоизлияния, они имеют более продолжительное время полужизни и их взаимодействия с тромбоцитами уменьшены по сравнению с полноразмерными молекулами гепарина. Помимо этого, они обеспечивают эффективную профилактику общей легочной эмболии (Меб1са1 8иЬ)ес1 Неабшдк (МЕ8Н), 1Шр://\у\у\у.шт.ш11.8оу/те811/те8111юте.1ит1). ЬМАН могут представлять собой, например, надропарин, Ν-ацетилгепарин, ардепарин, цертопарин, далтепарин, эноксапарин, ревипарин и тинзапарин.

К другим разновидностям гепаринов относятся гепариноиды. Они включают в себя вещества естественного происхождения и синтетические полисахариды аналогичной структуры с высоким содержанием сульфатированных фрагментов. Гепариноидные препараты, например данапароид натрий, имеют широкий спектр применений, в том числе в качестве антикоагулянтов и противовоспалительных средств, кроме этого, они, как утверждалось, обладают гиполипедимическими свойствами (Майш6а1е, Т1е Ех1та Рйаттасорое1а, 3011, р. 232).

Интерфероны представляют собой подкласс цитокинов, которые проявляют противовоспалительную, противовирусную и антипролиферативную активность. В соответствии с биохимическими и иммунологическими свойствами, нативные интерфероны человека объединяют в три класса: интерферон-α (лейкоциты), интерферон-β (фибробласты) и интерферон-гамма (иммунный). В настоящее время в Соединенных Штатах и других странах санкционировано применение α-интерферона для лечения лейкоза ворсистых клеток, венерических бородавок (кондиломы остроконечной), саркомы Капоши (разновидности рака, обычно поражающего пациентов, страдающих от синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИДа)), и хронических гепатитов, не являющихся гепатитами А или В.

С другой стороны, интерфероны (ΙΓΝ) представляют собой гликопротеины, выделяемые организмом в ответ на вирусную инфекцию. Они ингибируют размножение вирусов в защищенных клетках. В состав ΙΓΝ входят белки низкой молекулярной массы, поэтому интерфероны удивительно неспецифичны в своем действии, т.е. интерфероны, выделение которых вызвано одним вирусом, эффективны против большого количества других вирусов. Однако интерфероны обладают видовой специфичностью, т. е. интерферон, выделенный в организме одного вида, будет стимулировать противовирусную активность в клетках того же самого или близких видов. Интерфероны стали первой группой цитокинов, которые нашли применение благодаря их потенциальной противоопухолевой и противовирусной активности.

Три основные группы интерферонов носят наименования ΙΓΝ-α, ΙΓΝ-β и ΙΓΝ-γ. Первоначально интерфероны подразделяли на указанные группы в соответствии с типом клеток, в которых вырабатывается тот или иной тип интерферонов (лейкоциты, фибробласты или Т-клетки). Однако стало ясно, что одна и та же клетка может вырабатывать несколько типов интерферонов. Поэтому вырабатываемые лейкоцитами интерфероны в настоящее время называют ΙΓΝ-α, вырабатываемые фибробластами ΙΓΝ-β и вырабатываемые Т-клетками ΙΓΝ-γ. Кроме того, существует четвертый тип интерферонов - лимфобластоидные интерфероны, вырабатываемые в линии клеток №ипа1\уа (выделенных из лимфомы Беркитта), которые, по-видимому, вырабатывают смесь ΙΓΝ, характерных для лейкоцитов и фибробластов.

Сообщалось об интерфероновой единице как о мере активности ΙΓΝ, определенной (до некоторой степени произвольно) как количество интерферона, необходимое для защиты 50% клеток от поражения вирусом.

- 5 008938

Каждый их классов ΙΡΝ включает несколько отдельных типов. Как ΙΡΝ-β, так и ΙΡΝ-γ являются производными одного гена. Различия между отдельными типами, скорее всего, возникают благодаря изменениям в гликозилировании.

ΙΡΝ-α представляют собой наиболее разнообразную группу, включающую около 15 типов. На хромосоме 9 имеется кластер генов ΙΡΝ-α, содержащий по меньшей мере 23 члена, 15 из которых активны и подвергаются транскрипции. Зрелые ΙΡΝ-α не гликозилированы.

Все ΙΡΝ-α и ΙΡΝ-β обладают одной и той же длиной (165 или 166 аминокислотных остатков) и сходной биологической активностью. ΙΡΝ-γ имеет длину 146 аминокислотных остатков и обладает несколько меньшим сходством с классами α и β. Только ΙΡΝ-γ способен осуществлять активацию макрофагов или вызывать созревание киллерных Т-клеток. В сущности, эти новые типы терапевтических средств могут быть названы модификаторами биологического ответа (ВЯМ), поскольку они оказывают воздействие на ответ организма опухоли, влияя на распознавание благодаря иммуномодуляции.

В частности, интерферон фибробластов человека (ΙΡΝ-β) обладает противовирусной активностью и, кроме этого, может стимулировать природные клетки-киллеры, нацеленные против клеток новообразований. Имеется полипептид, массой около 20000 Да, индуцированный вирусами и двухцепочечными РНК. Осгупек с сотрудниками (Оетупск е! а1., 1980) установили полную аминокислотную последовательность белка, исходя из нуклеотидной последовательности гена интерферона фибробластов, клонированного с помощью технологии рекомбинантной ДНК. Эта последовательность имеет длину 166 аминокислотных остатков.

Зйератй и соавт. (Зйератй е! а1., 1981) описали мутацию у основания 842 (СукАТут в положении 141), которая уничтожает его противовирусную активность и вариант клона с делецией нуклеотидов 1119-1121.

Магк и соавт. (Магк е! а1., 1984) внесли искусственную мутацию путем замены основания 469 (Т) на (А), что привело к замене Сук^Зет в положении 17. Сообщалось, что полученный в результате этого ΙΡΝ-β столь же активен, как и нативный ΙΡΝ-β и стабильно сохраняется в течение длительного времени (при -70°С).

Механизмы, с помощью которых интерфероны оказывают свое воздействие, полностью не ясны. Однако в большинстве случаев они действуют, влияя на индукцию или транскрипцию определенных генов и таким образом воздействуя на иммунную систему. Исследования ίη νίίτο показали, что интерфероны способны индуцировать или подавлять образование продуктов 20 генов.

Остеопонтин (ΟΡΝ) представляет собой сильно фосфорилированный сиалопротеин, который является важным компонентом минерализованного внеклеточного матрикса костей и зубов. ΟΡΝ характеризуется наличием последовательности полиаспаргиновой кислоты и участков фосфорилирования Зет/Тйт, которые опосредуют связывание гидроксиапатита, а также высококонсервативных фрагментов Κ.ΟΌ, которые опосредуют клеточное связывание/передачу сигналов. Сообщалось, что ингибиторы остеопонтина применимы для лечения инфекций, иммунных расстройств и заболеваний, аутоиммунных расстройств, включая М3 (рассеянный склероз), различные иммунодефицитные состояния и рак \УО 00/63241. Применение остеопонтина или агониста активности остеопонтина заявлено в \УО 02/92122 с целью производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики неврологических заболеваний.

Воппатй и соавт. (Воппатй е! а1., 1997) наблюдали увеличение экспрессии мРНК кластерина на пораженных участках, которое следует за разрушением седалищного нерва крысы.

Лечение заболеваний ΡΝ8 кластерином до сих пор в уровне технике не рассматривалось.

Сущность изобретения

Задача настоящего изобретения заключается в разработке новых средств для лечения и/или профилактики заболеваний периферической нервной системы.

Изобретение основано на данных, согласно которым белок кластерин оказывает благотворное влияние на периферическую невропатию у животных моделей.

Следовательно, настоящее изобретение относится к применению кластерина или агониста активности кластерина в случае периферических неврологических заболеваний, таких как травматические поражения нервов периферической нервной системы (ΡΝ8) и периферические невропатии.

Помимо этого, в объем настоящего изобретения входит применение молекул нуклеиновых кислот и векторов экспрессии, включающих кластерин, а также клеток, экспрессирующих кластерин, для лечения и/или профилактики периферических неврологических заболеваний.

Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим кластерин и гепарин или интерферон, или остеопонтин, необязательно, вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми наполнителями.

Во втором аспекте настоящего изобретения кластерин может применяться в сочетании с гепарином, интерфероном или остеопонтином для лечения и/или профилактики периферических неврологических заболеваний.

- 6 008938

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 схематически изображает структуру кластерина (на основании данных ВокепЬетд и §11кепкеп, 1995):

А - представляет собой полипептид-предшественник;

В - отображает зрелый полипептид, который представляет собой гетеродимерный гликопротеин массой 75-80 кДа, образованный цепями α (34-36 кДа) и β (36-39 кДа), соединенными антипараллельно 5 дисульфидными мостиками вблизи их центров;

С - показывает последовательность предшественника кластерина человека.

Фиг. 2 показывает массу тела в граммах (г) мыши, страдающей невропатией (невропатической мыши), у которой осуществлено раздавливание седалищного нерва и которую подвергают действию основы лекарственной композиции (кружки), а также вводимого интраперитонеально (ί.ρ.) т-кластерина в количестве 300 мкг/кг (залитые черным треугольники) или 1 мг/кг (залитые черным ромбы).

Контроль: здоровая мышь (залитые черным квадраты).

Фиг. 3 показывает амплитуду в милливольтах (мВ) потенциала сложного мышечного действия у невропатической мыши, которую подвергают действию основы лекарственной композиции, ткластерина ί.ρ. в количестве 300 мкг/кг или 1 мг/кг, 0,01 мкг/кг положительного контрольного соединения (4-МС) или 100 мкг/кг остеопонтина подкожно (к.е).

Контроль: мышь, подвергшаяся имитации операции.

Фиг. 4 показывает задержку в миллисекундах (мс) потенциала сложного мышечного действия у невропатической мыши, которую подвергают действию основы лекарственной композиции, ткластерина ί.ρ. в количестве 300 мкг/кг или 1 мг/кг, 0,01 мкг/кг положительного контрольного соединения (4-МС) или 100 мкг/кг к.е. остеопонтина.

Фиг. 5 показывает длительность в миллисекундах (мс) потенциала сложного мышечного действия у невропатической мыши, которую подвергают действию основы лекарственной композиции, ткластерина ί.ρ. в количестве 300 мкг/кг или 1 мг/кг, 0,01 мкг/кг положительного контрольного соединения (4-МС) или 100 мкг/кг к.е. остеопонтина.

Фиг. 6 показывает количество в процентах (%) распавшихся нервных волокон у невропатической мыши, которую подвергают действию основы лекарственной композиции и т-кластерина в количестве 300 мкг/кг или 1 мг/кг ί.ρ.

Фиг. 7 показывает количество в процентах (%) нераспавшихся нервных волокон у невропатической мыши, которую подвергают действию основы лекарственной композиции и т-кластерина в количестве 300 мкг/кг или 1 мг/кг ί.ρ.

Фиг. 8 показывает амплитуду в милливольтах (мВ) потенциала сложного мышечного действия у невропатической мыши, которую подвергают действию основы лекарственной композиции, 100 мкг/кг, 300 мкг/кг или 1000 мкг/кг к.е. рекомбинантного й-кластерина и 30 мкг/кг к.е. положительного контрольного вещества (рекомбинантного й1Ь-6). Запись данных производят через 1, 2, 3 или 4 недели с момента повреждения седалищного нерва. Данные представлены как средняя общая амплитуда в мВ ± стандартная ошибка. Число мышей в группе п=6, # р<0,01, *р<0,05, **р<0,01.

Фиг. 9 показывает активность холинацетилтрансферазы (СйАТ) в отсчетах в минуту (срт) на микрограмм белка (сρт/мкг белка) в икроножной мышце с контралатеральной стороны (а) и с ипсилатеральной стороны (Ь) невропатической мыши, которую в течение 4 недель подвергают действию к.е. основы лекарственной композиции, 30 мкг/кг рекомбинантного человеческого 1Ь-6 или рекомбинантного йкластерина в количестве 100, 300 и 1000 мкг/кг. Число мышей в группе п=6, #р<0,1.

Фиг. 10 показывает содержание нейрофиламентов-формы высокой молекулярной массы (ΝΡ-Η) в нанограммах на микрограмм белка (нг ΝΡ-Η/мг белка) в (а) контралатеральном седалищном нерве и в (Ь) проксимальной (выше точки разрушения нерва) и (с) дистальной (ниже точки разрушения нерва) частях ипсилатерального седалищного нерва через 4 недели воздействия на мышь основы лекарственной композиции, 30 мкг/кг рекомбинантного человеческого 1Ь-6 или рекомбинантного й-кластерина в количестве к.е. 100, 300 и 1000 мкг/кг. Число мышей в группе п=6, **р<0,01.

Фиг. 11 показывает содержание основного белка миелина (МВР) в пикограммах на микрограмм белка (пг МВР/мкг общего содержания белков) в органотипических гиппокампальных срезах, обработанных 1 мкг/мл рекомбинантного т-кластерина на 3, 6 и 10 дни обработки (Т3, Т6 и Т10), которые соответствуют 10, 13 и 17 дням ίη νίΐτο (Э1У). Контрольная группа получает нормальную среду (50% МЕМ, 25% ΗΒ88, 25% лошадиной сыворотки). Сходные результаты получают при применении рекомбинантного человеческого кластерина из клеток НЕК или СНО (данные не показаны). Данные представлены в виде среднего общего содержания МВР ± стандартная ошибка; ехр=2, п=12 мышей/группа, ***р<0,001.

Фиг. 12 показывает содержание МВР в пикограммах на микрограмм белка (пг МВР/мкг общего содержания белков) в органотипических гиппокампальных срезах, обработанных 10, 100 и 1000 нг/мл ре

- 7 008938 комбинантного т-кластерина после специфической демиелинизации, вызванной антителами против МОС (противомиелиновый гликопротеин олигодендроцита) в сочетании с комплементом (1дС против МОС + комплемент) или сочетанием иммуноглобулина 1дС нерелевантного изотипа и комплемента (1дС контроль + комплемент). В качестве контроля, необработанная группа получает нормальную среду (50% МЕМ, 25% НВ88, 25% лошадиной сыворотки). т-кластерин применяют на 21 Όΐν (день ίη νίΐτο), за 24 ч до добавления антител и во время обработки; ехр=2, η=15 мышей/группа, *р<0,05, **р<0,01, ***р<0,001.

Сходные результаты получают при применении рекомбинантного человеческого кластерина из клеток НЕК или СНО (данные не показаны).

Фиг. 13 показывает концентрацию й-кластерина в нанограммах на миллилитр (нг/мл), определенную по методике ЕЫ8А, через 5 или 30 мин после внутривенной (ί.ν.) инъекции рекомбинантного йкластерина (300 мкг/кг) при наличии или отсутствии гепарина (7500 ед./кг):

А - гепарин вводят за 5 мин до кластерина (гепарин инъецируют перед кластерином) или совместно с кластерином (кластерин смешан с гепарином). В качестве контроля мышам вводят кластерин отдельно (кластерин), кроме того, кровь собирают и смешивают в пробирке, в которой присутствует или отсутствует гепарин, +/- гепарин (кластерин, собранный в гепарин), η=3 мыши/группа, ***р<0,005;

В - результат введения гепарина (7500 ед./кг) перед отбором крови.

Группа 1: гепарин вводят за 5 мин до кластерина (1 мг/кг).

Группа 2: гепарин вводят через 28 мин после кластерина (1 мг/кг).

Группа 3: только кластерин (1 мг/кг).

а: Однофакторный тест дисперсионного анализа по отношению к группе 1.

й: Однофакторный тест дисперсионного анализа по отношению к группе 2, η=4 мыши/группа, #р<0,1, *р<0,05, **р<0,01.

Аналогичные результаты были получены при введении Ν-ацетилгепарина (данные не показаны).

Подробное описание изобретения

В рамках настоящего изобретения было найдено, что введение кластерина животным моделям ίη νίνο оказывает благотворное воздействие в случае периферических неврологических заболеваний. При введении кластерина мышиной модели с невропатией, вызванной раздавливанием седалищного нерва, все физиологические и морфологические параметры, относящиеся к регенерации, целостности и жизнеспособности нервов, подвергаются позитивному влиянию.

Следовательно, изобретение относится к применению кластерина, а также его изоформы, мутеина, слитого белка, функционального производного, активной фракции, производного циклической перестановки или соли, или агониста активности кластерина для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики периферических неврологических заболеваний.

Термин «кластерин» в рамках настоящего изобретения относится к зрелому полноразмерному кластерину человека или к любой из субъединиц кластерина, или к его фрагменту. Последовательность кластерина человека приводится в настоящем описании как 8ЕС ΙΌ N0:1 приложенного списка последовательностей и на фиг. 1С приложенных чертежей. Кроме того, термин «кластерин» в рамках настоящего изобретения относится к любому кластерину, полученному из животных, например к мышиному, коровьему, свиному, кошачьему или овечьему кластерину, при условии, что он является в достаточной степени идентичным для сохранения кластериновой активности, и при условии, что полученная молекула не является иммуногенной.

Помимо этого, в рамках настоящего изобретения термин «кластерин» относится к биологически активным мутеинам и фрагментам, например к природным α- и β-субъединицам кластерина.

Дополнительно, в рамках настоящего изобретения термин «кластерин» охватывает изоформы, мутеины, слитые белки, функциональные производные, активные фракции или фрагменты, производные циклической перестановки или соли кластерина. Эти изоформы, мутеины, слитые белки или функциональные производные, активные фракции или фрагменты, или производные циклической перестановки сохраняют биологическую активность кластерина. Предпочтительно они имеют улучшенную биологическую активность по сравнению с кластерином дикого типа (натуральным кластерином).

Термин «агонист активности кластерина» в рамках настоящего изобретения относится к молекулам, стимулирующим или имитирующим активность кластерина, таким как агонистические антитела рецептора кластерина или агонисты небольшой молекулярной массы, активирующие передачу сигнала через рецептор кластерина. Рецептором кластерина может быть, например, др330/мегалин/ЬКР2 (Коиииак с1 а1., 1995). Любой агонист, стимулятор или инхансер такого рецептора в рамках настоящего изобретения охвачен термином «агонист активности кластерина».

В рамках настоящего изобретения термин «агонист активности кластерина» дополнительно относится к агентам, усиливающим опосредованную кластерином активность, таким как соединения небольшой молекулярной массы, которые имитируют активность кластерина.

Термины «лечение» и «профилактика» в рамках настоящего изобретения следует понимать как предотвращение, замедление, ослабление, улучшение или обратное развитие одного или нескольких симптомов или причин периферических неврологических заболеваний, а также симптомов, заболеваний или осложнений, сопутствующих периферическим неврологическим заболеваниям. При «лечении» пе

- 8 008938 риферических неврологических заболеваний препараты по настоящему изобретению дают после начала заболевания, тогда как «профилактика» относится к введению препаратов до того, как у пациента могут быть отмечены признаки заболевания.

Термин «периферические неврологические заболевания» в рамках настоящего изобретения охватывает все известные периферические неврологические заболевания, расстройства или повреждения ΡΝ8, включая те, которые подробно описаны в разделе «Уровень техники».

Периферические неврологические заболевания включают в себя расстройства, связанные с дисфункцией ΡΝ8, например заболевания, относящиеся к передаче нервных импульсов, травме нервов, инфекциям ΡΝ8, демиелинизации ΡΝ8 или невропатиям ΡΝ8.

Предпочтительно периферические неврологические заболевания по настоящему изобретению выбраны из группы, состоящей из травматических поражений нервов периферической нервной системы, заболеваний, связанных с демиелинизацией ΡΝ8, а также периферических нейродегенеративных заболеваний и периферических невропатий.

Травматические поражения нервов могут затрагивать ΡΝ8, как описано в разделе «Уровень техники».

К периферическим невропатиям могут относиться синдром потери чувствительности, мышечная слабость и атрофия, сниженные глубокие сухожильные рефлексы и вазомоторные симптомы, сами по себе или в любом сочетании. Они могут быть вызваны, например, алкоголизмом, диабетом или химиотерапевтическим лечением.

Невропатия может поражать отдельный нерв (мононевропатия), два или несколько нервов в отдельных областях (множественная мононевропатия) или многие нервы одновременно (полиневропатия). Первоначальному поражению может подвергаться аксон (например, при сахарном диабете, болезни Лайма, уремии или при действии токсических средств) или миелиновая оболочка шванновской клетки (например, при острой или хронической воспалительной полиневропатии, лейкодистрофиях или синдроме Гийена-Барре). Дополнительные разновидности невропатии, которые могут подвергаться лечению по настоящему изобретению, могут быть вызваны, например, отравлением свинцом, применением дапсона, укусами клещей, порфирией или являться синдромом Гийена-Барре, причем они могут первоначально поражать двигательные нервные волокна. Другие разновидности, например, вызванные воспалением ганглиев задних корешков из-за рака, проказы, СПИДа, сахарного диабета или хронической пиридоксиновой интоксикации, могут в первую очередь поражать ганглии задних корешков или чувствительные нервные волокна, порождая сенсорные симптомы. Помимо этого, могут оказаться затронутыми черепные нервы, например, при синдроме Гийена-Барре, болезни Лайма, сахарном диабете и дифтерии.

Дополнительные периферические неврологические расстройства, например, перечисленные в разделе «Уровень техники», включают невропатии с аномальной миелинизацией, а также кистевой туннельный синдром. Травматические поражения нервов могут сопровождаться ортопедическими осложнениями на позвоночном столбе, причем они также находятся в числе заболеваний по настоящему изобретению.

Кроме того, периферические неврологические расстройства могут быть вызваны наследственными расстройствами метаболизма. Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения периферические неврологические заболевания вызваны наследственными дефектами метаболизма.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления периферическое неврологическое заболевание представляет собой периферическую невропатию, наиболее предпочтительно диабетическую невропатию. Разновидности невропатии, связанные с химиотерапией, также являются предпочтительными заболеваниями по настоящему изобретению.

Термин «диабетическая невропатия» относится к любой форме диабетической невропатии или же к одному или нескольким симптомам (симптому) или заболеваниям (заболеванию), которые сопровождаются или вызваны диабетической невропатией или осложнениями диабета, которые поражают нервы, как подробно описано в разделе «Уровень техники». Диабетическая невропатия может быть полиневропатией. При диабетической полиневропатии одновременно поражено большое количество нервов. Кроме того, диабетическая невропатия может быть мононевропатией. Например, при локализованной мононевропатии болезнь поражает единичный нерв, например окуломсторный или отводящий черепной нерв. Диабетическая мононевропатия также может являться множественной мононевропатией, при которой поражаются два или несколько нервов в отдельных областях.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления периферическое неврологическое расстройство представляет собой заболевание, связанные с демиелинизацией периферической нервной системы (ΡΝ8). Сюда относятся такие заболевания, как хроническая воспалительная демиелинизирующая полирадикулоневропатия (ΟΌΡ), а также острые монофазные расстройства, как, например воспалительная демиелинизирующая полирадикулоневропатия, называемая синдромом Гийена-Барре (СВБ).

Кластерин предпочтительно выбран из пептида, полипептида или белка, выбранного из группы, включающей в себя:

a) полипептид, содержащий 8ЕО ΙΌ ΝΟ:1;

b) полипептид, содержащий аминокислоты с 23 по 449 из 8ЕО ΙΌ ΝΟ:1;

- 9 008938

с) полипептид, содержащий аминокислоты с 35 по 449 из БЕО ΙΌ N0:1;

б) полипептид, содержащий аминокислоты с 23 по 227 из БЕО ΙΌ N0:1;

е) полипептид, содержащий аминокислоты с 35 по 227 из БЕО ΙΌ N0:1;

I) полипептид, содержащий аминокислоты с 228 по 449 из БЕО Ш N0:1;

д) мутеин любого из полипептидов (а)-(Е), аминокислотная последовательность которого идентична по крайней мере одной из последовательностей (а)-(Е) не менее чем на 40, или 50, или 60, или 70, или 80, или 90%;

II) мутеин любого из полипептидов (а)-(1), закодированный последовательностью ДНК, которая гибридизуется с комплементарной областью нативной последовательности ДНК, кодирующей любой из полипептидов (а)-(1), в умеренно жестких условиях или в высокой степени жестких условиях;

ί) мутеин любого из полипептидов (а)-(1), в котором все изменения в аминокислотной последовательности представляют собой консервативные замещения аминокислот в аминокислотных последовательностях (а)-(1);

_)) соли, изоформы, слитый белок, функциональное производное, активную фракцию, производное циклической перестановки любого из полипептидов (а)-(1).

Активные фракции или фрагменты могут включать любую часть или домен кластерина, как, например α- или β-цепи по отдельности или соединенные друг с другом, например, непосредственно, через дисульфидные мостики или с помощью другого подходящего линкера. В число активных фрагментов также входят дифференцированно гликозилированные или сиалилированные формы кластерина.

Специалист в данной области техники поймет, что даже небольших фрагментов кластерина или двух его субъединиц может оказаться достаточно для проявления функций кластерина, так как для этого требуется активный пептид, содержащий необходимые аминокислотные остатки.

Далее, специалист в данной области техники поймет, что мутеины, соли, изоформы, слитые белки, функциональные производные кластерина, активные фракции или производные циклической перестановки кластерина сохранят сходную или даже лучшую биологическую активность по сравнению с кластерином. Биологическая активность кластерина, а также его мутеинов, изоформ, слитых белков или функциональных производных, активных фракций или фрагментов, продуктов циклической перестановки или солей может быть измерена путем анализа совместных культур.

Предпочтительные активные фракции обладают активностью, которая равна или превышает активность полноразмерной молекулы кластерина, или же они обладают дополнительными преимуществами, как, например большей стабильностью, или более низкой токсичностью или иммуногенностью, или их проще получать в значительных количествах, или проще очищать. Специалист в данной области техники поймет, что мутеины, активные фракции и функциональные производные могут быть получены клонированием соответствующей кДНК в подходящих плазмидах и исследованы путем анализа совместных культур, как упоминалось выше.

Белки по настоящему изобретению могут быть гликозилированными или негликозилированными, они могут быть получены из природных источников, таких как жидкости организма, или же предпочтительно они могут быть получены рекомбинантно. Рекомбинантная экспрессия может осуществляться в системах экспрессии прокариотов, таких как Е.соН. или эукариотов, таких как клетки насекомых, и предпочтительно в системах экспрессии млекопитающих, таких как клетки СНО (клетки яичника китайского хомяка) или НЕК (эмбриональные клетки почки человека).

В рамках настоящего изобретения термин «мутеин» относится к аналогам кластерина, в которых один или большее количество аминокислотных остатков натурального кластерина замещены отличающимися аминокислотными остатками или удалены либо один или несколько аминокислотных остатков добавлены к природной последовательности кластерина без заметного изменения активности или образующихся продуктов по сравнению с натуральным кластерином. Эти мутеины получают по известным синтетическим методикам, и/или методикам сайт-специфического мутагенеза, или по любым другим известным методикам, которые подходят для данного случая.

Мутеины кластерина или кодирующие их нуклеиновые кислоты, которые могут применяться в соответствии с настоящим изобретением, включают конечное множество последовательностей, в основном соответствующих исходной, в форме замещенных пептидов или полинуклеотидов, которые могут быть получены обычным специалистом в данной области техники без чрезмерного экспериментирования, общепринятым способом, на основе методик и указаний, изложенных в настоящей заявке.

Мутеины по настоящему изобретению включают белки, закодированные нуклеиновыми кислотами, такими как ДНК или РНК, которые гибридизуются с ДНК или РНК, кодирующими кластерин по настоящему изобретению, в умеренно жестких или высокой степени жестких условиях. Термин «жесткие условия» относится к условиям гибридизации и последующей отмывки, которые специалисты в данной области техники обычно называет «жесткими». См. Аи8иЬе1 е! а1., Ситгеп! Рто1осок ίη Мо1еси1аг Вю1оду, кирга, ш1еткс1епсе, КУ., § 6.3 и 6.4 (1987, 1992) и БатЬгоок 1.С. е! а1. (БатЬгоок, 1.С., Етйксй, Е.Е. и Машабк, Т. (1989) Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬота1огу Мапиа1, Со1б Брппд НагЬог ЬаЬота1огу Ртекк, Со1б Брппд НагЬог, КУ).

- 10 008938

Примеры жестких условий включают, не ограничиваясь перечисленным, условия отмывки при температуре на 12-20°С ниже рассчитанной Т.пл. (температуры плавления) исследуемого гибрида, например

2х88С и 0,5% 8Ό8 в течение 5 мин;

2х88С и 0,1% 8Ό8 в течение 15 мин;

0,1х88С и 0,5% 8Ό8 при 37°С в течение 30-60 мин;

0,1х88С и 0,5% 8Ό8 при 68°С в течение 30-60 мин.

Специалист в данной области техники понимает, что жесткость условий зависит от длины последовательностей олигонуклеотидов ДНК-проб (например, 10-40 оснований) или смешанных проб олигонуклеотидов. Если используют смешанные пробы, предпочтительно вместо 88С применять хлорид тетраметиламмония (ТМАС). См. АикЬе1 выше.

В предпочтительном воплощении любой из таких мутеинов имеет не менее чем 40% идентичность или гомологию с последовательностью 8ΕΟ ГО N0:1 из дополнительного списка последовательностей. Более предпочтительно мутеин имеет не менее чем 50, не менее чем 60, не менее чем 70, не менее чем 80 или наиболее предпочтительно не менее чем 90% идентичность или гомологию с указанной последовательностью.

Идентичность отражает взаимосвязь между двумя или несколькими полипептидными последовательностями, определенную путем сравнения этих последовательностей. В общем, идентичность относится к точному соответствию двух полинуклеотидных или двух полипептидных последовательностей, соответственно, нуклеотид-нуклеотид или аминокислота-аминокислота вдоль сравниваемых последовательностей.

Для последовательностей, у которых не существует точного соответствия, может быть определен процент идентичности. В общем, две сравниваемые последовательности совмещают таким образом, чтобы они давали максимальную корреляцию друг с другом. Для улучшения степени совмещения эта процедура может включать внесение разрывов в одну или обе последовательности. Процент идентичности может быть определен по всей длине каждой из сравниваемых последовательностей (так называемое глобальное совмещение), что особенно удобно для последовательностей одинаковой или сходной длины, или же на определенных, более коротких отрезках (так называемое локальное совмещение), что является более удобным для последовательностей неодинаковой длины.

Способы сравнения идентичности и гомологии двух или нескольких последовательностей хорошо известны в технике. К их числу относятся, например, программы, включенные в состав пакета νίκΐίοηκίη 8ес.|иепсе Апа1у818 Раскаде версия 9.1 ГОегегеих е1 а1., 1984), такие программы, как, например, ΒΕ8ΤΡΙΤ и ОАР могут применяться для определения процента идентичности двух полинуклеотидов, а также процента идентичности и гомологии двух полипептидных последовательностей. ΒΕ8ΤΡΙΤ использует алгоритм «локальной гомологии», разработанный 8тйй и Vаΐе^таη (8тйй и Vаΐе^таη, 1981), и отыскивает отдельную область наилучшего соответствия между двумя последовательностями. Кроме того, в технике известны другие программы для определения идентичности и/или степени подобия между последовательностями, например семейство программ ΒΕΑ8Τ (А118сйи1 е1 а1., 1990; АНксНтВ е1 а1., 1997), доступное на домашней странице NСΒI: \ν\ν\ν.ικΝ.η1ιη.ηί1ι.§ον и ΡΑ8ΤΑ (Реаткощ 1990; Реаткоп и Ыртап, 1988).

Для мутеинов по настоящему изобретению предпочтительными замещениями являются замещения, известные как «консервативные». Консервативные замещения аминокислот в полипептидах кластерина могут включать синонимичные аминокислоты в пределах групп, члены которых имеют в основном сходные физико-химические свойства, так что замена одного члена группы на другой оставит без изменения биологические функции молекулы (ОгаиШата, 1974). Очевидно, что в определенных выше последовательностях также могут быть осуществлены инсерции и делеции аминокислот без изменения их функций, в частности, если инсерции и делеции включают только несколько аминокислот, например менее 30 и предпочтительно менее 10, и при этом не удаляются и не замещаются аминокислоты, которые являются важными для функциональной конформации, например остатки цистеина. Белки и мутеины, содержащие такие делеции и/или инсерции, входят в область действия настоящего изобретения.

Предпочтительно синонимичными аминокислотными группами являются группы, определенные в табл. 1. Более предпочтительно синонимичные аминокислотные группы представляют собой группы, определенные в табл. 2; и наиболее предпочтительно синонимичные аминокислотные группы представляют собой группы, определенные в табл. 3.

- 11 008938

Таблица 1

Предпочтительные группы синонимичных аминокислот

йМИИЖЦрлрт?	Синонимичная группа
Зег	Зег, ТЬг, Оу, Аал
Агд	Агд, 61л, Ьуэ, б!и, НЮ
Ьеи	11«, РЬе, Туг, Μβζ V»! Ьеи
Рго	61у, А1а, ТЬг, Рго
ТЬг	РГО, Зег, А1а, В1у, Н«, С1п, ТЬг
АЬ	61у, ТЬг, Рго, АЬ
Уа1	МЫ. Туг, РЬе, Не, Ьеи, УаГ
С1у	АЮ, ТЬг, Рго, Зег, 61у
11«	МЫ, Туг, РЬе, Уа\|, Ьеи, Не
рме	Тгр, Μβζ Туг, Не, Уа), Ьеи, РЬе
Туг	Тгр, МЫ, РЬе, Не, Уа\|, Ьеи, Туг
Сув	Зег, ТЬг, Суз
НК	61и, Суз, 61п, ТЬг, Агд, НЮ
Оп	СЮ, Ьуз. Аал, НЮ, ТЬг, Агд, 61л
Аап	С1п, Аар, Зег, Азп
Ъув	61и, Б1п, НЮ, Агд. куз
Аар	С1и, Азп, Аар
СЮ	Аар. Ьуз, Азп, 61η, НЮ, Агд, 6*и
МЫ	РЬе, Не, Уа1, Ьеи, МЫ
Тгр	Тгр

Таблица 2

Более предпочтительные группы синонимичных аминокислот

ДМИНУксрртр	Синонимичная группа
Зег	Зег
Агд	НЮ, Ьуа, Агд
Ьеи	Ьеи, Не, РЬе, МЫ
Рго	А1а,Рго
ТЬг	ТЬг
А)а	Рго, Ай
Уа1	Уак Ме1, Не
61у	6»у
Ме	Ме, МЫ, РЬе, УаЬ Ьеи
РЬе	ΜβΙ, Туг, 11«, Ьеи, РЬе
Туг	РЬе, Туг
Суэ	Су», Зег
Н1а	НЮ, БЮ, А/д
61п	6Ю. Б)п, НЮ
Азл	Аар, Аал
Ьуа	Ьуа. Агд
Аар	Аар, Аал
61и	ОЮ.СЮ
МЫ	Мек РЬе, Пе, Уа1. Ьеи
Тгр	Тгр

- 12 008938

Таблица 3

Наиболее предпочтительные группы синонимичных аминокислот

Аминрнирлута Синонимичная групп

Зег	Зег
Агд	Агд
Ьеи	1лц, Йе. Ме!
Рго	Рго
ТЬг	ТЬг
АЬ	Ай
Уа1	7а1
<3*у	в1у
Це	Ив, МЫ, Ьеи
РЬе	РЬе
Туг	Туг
Суя	Суя, Зег
Не	НЬ
<31п	ОШ
Авп	Аяп
Ьу»
Авр	А»р
вы	ЗД
МЫ	МвЬ Не, Ьеи
Тгр	МЫ

Примеры осуществления замен аминокислот в белках, которые могут быть применены для получения мутеинов кластерина, полипептидов или белков для применения по настоящему изобретению, включают стадии любого известного способа, например, описанного в патентах Соединенных Штатов № 4959314, 4588585, 4737462, выданных Магк и соавт., № 5116943 Ко1Й8 и соавт., № 4965195 Матеи и соавт., № 4879111 СНопд и соавт. и № 5017691 Ьее и соавт., а также белки, замещенные лизином, описанные в патенте Соединенных Штатов № 4904584 (8йает и соавт.).

Термин «слитый белок» относится к полипептиду, включающему кластерин или мутеин, или их фрагмент, соединенный с другим белком, который обладает, например, увеличенным временем пребывания в жидкостях организма. Таким образом, кластерин может быть объединен с другим белком, полипептидом и т.п., например с иммуноглобулином или его фрагментом. Те-фрагменты иммуноглобулина являются особенно подходящими для получения ди-или мультимерных слитых белков, включающих 1д. α- и β-Цепи кластерина могут быть связаны, например, с фрагментом иммуноглобулина таким образом, чтобы α- и α-цепи кластерина образовали димер с помощью Те-фрагмента иммуноглобулина.

Термин «функциональные производные» в рамках настоящего изобретения охватывает производные кластерина, его мутеинов и слитых белков, которые могут быть получены из функциональных групп, представляющих собой боковые цепи аминокислотных остатков или Ν- или С-концевых групп, с помощью способов, известных в технике и включенных в настоящее изобретение, при условии, что функциональные производные остаются приемлемыми с фармацевтической точки зрения, т.е. образование производных не уничтожает активность белка, которая в основном сходна с активностью кластерина и не придает токсических свойств составам, содержащим данные производные.

Производные могут содержать, например, боковые цепи полиэтиленгликоля, которые могут маскировать антигенные сайты и продлевать пребывание кластерина в жидкостях организма. Другие производные включают сложные алифатические эфиры, образованные карбоксильными группами, амиды карбоксильных групп, полученные реакцией с аммиаком или первичными или вторичными аминами, Ν-ацильные производные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, образованные ацильными фрагментами (например, алканоильными или карбоциклическими ароильными группами) или Оацильные производные свободных гидроксигрупп (например, производными серинового или треонинового остатков), образованные ацильными фрагментами.

Термин «активные фракции» кластерина, мутеина и слитого белка в рамках настоящего изобретения включает любой фрагмент или любой предшественник полипептидной цепи белковой молекулы в отдельности или совместно с присоединенными молекулами или присоединенными к нему остатками, например остатками сахара или фосфатов, или агрегатами белковых молекул, или остатками сахаров в чистом виде, при условии, что упомянутый фрагмент имеет биологическую активность, в основном сходную с активностью кластерина.

Термин «соли» в рамках настоящего изобретения относится как к солям карбоксильных групп, так и к кислотно-аддитивным солям аминогрупп молекулы кластерина или его аналогов. Соли карбоксильных групп могут быть получены известными в технике способами и включают неорганические соли, например соли натрия, кальция, аммония, железа или цинка и т.п., а также соли органических оснований, образованные, например, аминами, такими как триэтаноламин, аргинин или лизин, пиперидин, прокаин и т.п. Кислотно-аддитивные соли включают, например, соли минеральных кислот, например соляной или

- 13 008938 серной кислоты, а также соли органических кислот, например уксусной или щавелевой кислоты. Любая из подобных солей, безусловно, должна сохранять биологическую активность кластерина, относящуюся к настоящему изобретению, т.е. нейропротективное воздействие при периферических неврологических заболеваниях.

Функциональные производные кластерина могут быть конъюгированы с полимерами для улучшения таких свойств белка, как стабильность, время полужизни, биодоступность, переносимость организмом человека или иммуногенность. Для достижения этой цели кластерин может быть связан, например, с полиэтиленгликолем (РЕС). Присоединение РЕС может быть осуществлено известными способами, описанными, например, в УО 92/13095.

Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения к кластерину присоединен РЕС.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит вставку иммуноглобулина (1д). Вставка может осуществляться непосредственно или через короткий пептидный линкер, который может иметь длину от 1 до 3 аминокислотных остатков или более, например 13 аминокислотных остатков. Упомянутый линкер может представлять собой, например, трипептид с последовательностью Ε-Ε-М (С1и-Рйе-Ме!) или линкерную последовательность из 13 аминокислот, включающую С1и-Рйе-С1у-А1а-С1у-Ееи-Уа1-Ееи-С1у-С1у-С1п-Рйе-Ме!, помещенную, например, между цепями кластерина и иммуноглобулина. Образовавшийся слитый белок обладает улучшенными свойствами, такими как увеличенное время присутствия в жидкостях организма (время полужизни), увеличенная специфическая активность или увеличенный уровень экспрессии. Вставка 1д также может облегчать очистку слитого белка.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления кластерин или же одна, или обе его субъединицы объединены с константной областью молекулы 1д. Предпочтительно они присоединены к областям тяжелой цепи 1дС1 человека, например, таким как области СН2 и СН3. Другие изоформы молекул 1д, такие как 1дС₂ или 1дС₄, или остальные классы 1д, например 1дМ, также подходят для получения слитых белков по настоящему изобретению. Слитые белки могут быть мономерными или мультимерными, гетеро- или гомомультимерными.

Иммуноглобулиновая часть слитого белка может быть дополнительно модифицирована способом, который не активирует связывание комплемента или каскадную реакцию комплемента либо не связывается с Ес-рецепторами.

Далее изобретение относится к применению комбинации кластерина и иммуносупрессорного средства для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики периферических неврологических расстройств, предназначенного для одновременного, последовательного или отдельного применения. К числу иммуносупрессорных средств могут относиться стероиды, метотрексат, циклофосфамид, антилейкоцитарные антитела (например, САМРАТН-1) и т.п.

Дополнительно, изобретение относится к комбинации кластерина и 1Ь-6.

Было показано, что введение гепарина значительно улучшает биодоступность кластерина, следовательно, помимо перечисленного изобретение относится к применению комбинации кластерина и гепарина для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики периферических неврологических расстройств, предназначенного для одновременного, последовательного или отдельного применения.

В рамках настоящего изобретения термин «гепарин» относится ко всем известным в технике гепаринам и гепариноидам, в том числе к описанным в разделе «Уровень техники», например к гепаринам низкой молекулярной массы (ЬМУН).

Далее, изобретение относится к применению комбинации кластерина и интерферона или гепарина для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики периферических неврологических расстройств, предназначенного для одновременного, последовательного или отдельного применения.

В рамках настоящего изобретения термин «интерферон» предназначен для обозначения любой молекулы, определенной в литературе как интерферон, включая, например, любой из видов интерферонов, упомянутых в разделе «Уровень техники». Предпочтительно интерферон может быть человеческим, но, кроме того, он может быть выработан другими биологическими видами при условии, что биологическая активность этих интерферонов подобна активности интерферонов человека, и их молекулы не являются иммуногенными в организме человека.

В частности, в приведенное выше определение включены все виды ΙΕΝ-α, ΙΕΝ-β и ΙΕΝ-γ. ΙΕΝ-β представляет собой предпочтительную разновидность интерферона по настоящему изобретению.

Термин «интерферон-бета (ΙΕΝ-β)» в рамках настоящего изобретения предназначен для обозначения интерферона фибробластов человека, как полученного путем изоляции из жидких биологических сред, так и полученного по методике рекомбинантной ДНК из прокариотических и эукариотических клеток-хозяев, а также солей, функциональных производных, разновидностей, аналогов и фрагментов указанного интерферона.

- 14 008938

Кроме того, для повышения стабильности белков, интерфероны могут быть объединены с полимерами. Конъюгат интерферона-β и полимерного спирта, т.е. полиэтиленгликоля (РЕС), был описан, например, в \νϋ 99/55377.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения интерферон представляет собой интерферон-β (ΙΕΝ-β) и наиболее предпочтительно ΙΕΝ-β 1а.

Кластерин в сочетании с интерфероном предпочтительно применяют одновременно, последовательно или отдельно.

Далее, изобретение относится к применению комбинации кластерина и остеопонтина для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики периферических неврологических расстройств, предназначенного для одновременного, последовательного или отдельного применения.

В рамках настоящего изобретения, термин «остеопонтин» охватывает также мутеины, фрагменты, активные фракции и функциональные производные остеопонтина. Эти белки описаны, например, в νθ 02/092122.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения кластерин применяют в количестве приблизительно от 0,001 до 100, или приблизительно от 1 до 10, или приблизительно 5 мг/кг массы тела.

Далее, изобретение относится к применению молекул нуклеиновых кислот для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики периферических неврологических расстройств, причем молекулы нуклеиновых кислот включают последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептид, содержащий последовательность аминокислот, которая выбрана из группы, включающей в себя:

a) полипептид, содержащий 8ЕО ΙΌ N0:1;

b) полипептид, содержащий аминокислоты с 23 по 449 из 8Е0 ΙΌ N0:1;

c) полипептид, содержащий аминокислоты с 35 по 449 из 8Е0 ΙΌ N0:1;

б) полипептид, содержащий аминокислоты с 23 по 227 из 8Е0 ΙΌ N0:1;

е) полипептид, содержащий аминокислоты с 35 по 227 из 8Е0 ΙΌ N0:1;

I) полипептид, содержащий аминокислоты с 228 по 449 из 8Е0 ΙΌ N0:1;

д) мутеин любого из полипептидов (а)-(Г). аминокислотная последовательность которого идентична по крайней мере одной из последовательностей (а)-(Г) не менее чем на 40, или 50, или 60, или 70, или 80, или 90%;

II) мутеин любого из полипептидов (а)-(Г), закодированный последовательностью ДНК, которая гибридизуется с комплементарной областью нативной последовательности ДНК, кодирующей любой из полипептидов (а)-(Г), в умеренно жестких условиях или весьма жестких условиях;

ί) мутеин любого из полипептидов (а)-(Г), в котором все изменения в аминокислотной последовательности представляют собой консервативные замещения аминокислот в аминокислотных последовательностях (а)-(Г);

_)) изоформы, слитый белок, функциональное производное, активную фракцию, производное циклической перестановки любого из полипептидов (а)-(Г).

Нуклеиновая кислота может, например, вводиться непосредственно как молекулы нуклеиновой кислоты в чистом виде, например, с помощью внутримышечной инъекции.

Далее она может включать векторные последовательности, такие как вирусные последовательности, применимые для экспрессии гена, кодированного молекулой нуклеиновой кислоты, в организме человека, предпочтительно в подходящих клетках или тканях.

Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты дополнительно включает последовательность вектора экспрессии. Последовательности вектора экспрессии хорошо известны в технике, причем они включают дополнительные элементы, служащие для экспрессии представляющего интерес гена. Они могут включать регуляторные последовательности, например промоторные и энхансерные последовательности, последовательности маркера выбора, точки начала мультиплицирования и т.п. Таким образом, для лечения и/или профилактики заболевания применяют терапевтический генный подход. При этом экспрессия кластерина преимущественно будет происходить ίη 8ЙИ.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения вектор экспрессии может быть введен с помощью внутримышечной инъекции.

В соответствии с настоящим изобретением также рассматривается применение вектора для индуцирования и/или повышения эндогенной выработки кластерина в клетках, которые в нормальном состоянии не активны в отношении экспрессии кластерина или экспрессируют незначительные количества кластерина.

Вектор может содержать регуляторные последовательности, которые функционируют в желаемых клетках, чтобы экспрессировать кластерин. Такие регуляторные последовательности могут являться, например, промоторами или энхансерами. В таком случае регуляторные последовательности могут быть введены в подходящие локусы генома путем гомологической рекомбинации, что приводит к функцио

- 15 008938 нальному связыванию регуляторной последовательности с геном, экспрессию которого требуется вызвать или усилить. Эту технологию обычно называют «эндогенной активацией гена» (ЕСЛ), причем она описана, например, в АО 91/09955.

Далее, изобретение относится к применению клеток, которые генетически модифицированы для выработки кластерина, в производстве лекарственного средства для лечения и/или профилактики периферических неврологических заболеваний.

Далее, изобретение относится к применению клеток, которые были модифицированы генетически для выработки кластерина, для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики неврологических заболеваний. Таким образом, для доставки лекарственного средства в соответствующие части организма человека может быть применен клеточный терапевтический подход.

Далее, изобретение относится к фармацевтическим композициям, применимым, в частности, для профилактики и/или лечения периферических неврологических заболеваний, которые содержат терапевтически эффективное количество кластерина, терапевтически эффективное количество гепарина и, кроме того, необязательно, терапевтически эффективное количество иммуносупрессора.

Далее, изобретение относится к фармацевтическим композициям, пригодным, в частности, для профилактики и/или лечения периферических неврологических заболеваний, которые содержат терапевтически эффективное количество кластерина, терапевтически эффективное количество интерферона и, кроме того, необязательно, терапевтически эффективное количество иммуносупрессора.

Далее, изобретение относится к фармацевтическим композициям, применимым, в частности, для профилактики и/или лечения периферических неврологических заболеваний, которые содержат терапевтически эффективное количество кластерина, терапевтически эффективное количество остеопонтина и, кроме того, необязательно, терапевтически эффективное количество иммуносупрессора.

Определением «фармацевтически приемлемый» имеется в виду охватить любой носитель, который не препятствует проявлению эффективности или биологической активности действующего начала и не является токсичным для организма, в который его вводят. Например, при парентеральном введении действующий белок(и) может(ут) быть объединен(ы) в составе лекарственной формы для инъекций с такими средами, как физиологический раствор, раствор декстрозы, альбумин сыворотки и раствор Рингера.

Действующие компоненты фармацевтической композиции по настоящему изобретению могут вводиться пациенту большим числом способов. Пути введения включают интрадермальный, трансдермальный (например, для составов, которые медленно высвобождают действующее начало), внутримышечный, интраперитонеальный, внутривенный, подкожный, пероральный, эпидуральный, топический, интратекальный, ректальный и интраназальный способы. Может быть применен любой другой терапевтически эффективный путь введения, например абсорбция через эпителиальные или эндотелиальные ткани или с помощью генной терапии, при которой пациенту вводят молекулы ДНК, кодирующие действующий агент (например, в виде вектора), которые приводят к экспрессии и секреции действующего агента ίη νίνο. Кроме того, белок(и) по настоящему изобретению может(ут) вводиться совместно с другими компонентами или биологически активными агентами, такими как фармацевтически приемлемые поверхностно-активные вещества, наполнители, носители, разбавители и основы.

Для парентерального введения (например, внутривенного, подкожного, внутримышечного) действующий белок (белки) может быть включен в такие составы, как раствор, суспензия, эмульсия или лиофилизованный порошок, в сочетании с фармацевтически приемлемой парентеральной основой (например, водой, физиологическим раствором, раствором декстрозы) и добавками, которые поддерживают изотоничность (например, маннитом) или химическую стабильность (например, консервантами и буферами). Составы стерилизуют с помощью общепринятых методик.

Кроме того, биодоступность действующего белка(ов) по настоящему изобретению может быть улучшена с применением методик конъюгации, которые увеличивают время полужизни молекулы в организме человека, например, связыванием молекулы белка с полиэтиленгликолем, как описано в заявке на изобретение РСТ АО 92/13095.

Терапевтически эффективные количества действующего белка(ов) будут являться функцией многих переменных, включая тип белка, аффинность белка, любую остаточную цитотоксическую активность, проявляемую антагонистами, путь введения, клиническое состояние пациента (включая желательность поддержания нетоксического уровня эндогенной активности кластерина).

«Терапевтически эффективное количество» представляет собой такое количество, при введении которого кластерин оказывает положительное воздействие на течение периферических неврологических заболеваний. Доза, вводимая пациенту в виде однократной дозы или многих доз, будет изменяться в зависимости от различных факторов, включая фармакокинетические свойства кластерина, путь введения, состояние и характеристики пациента (пол, возраст, масса тела, состояние здоровья, рост), степень развития симптомов, сопутствующее лечение, частота лечения и желаемый результат.

Предпочтительно кластерин может применяться в количестве приблизительно от 0,001 до 10, или приблизительно от 0,01 до 5, или приблизительно от 0,1 до 3, или приблизительно от 1 до 2 мг/кг массы тела. Кроме того, предпочтительными количествами кластерина являются количества приблизительно от 0,1 до 1000, или приблизительно от 1 до 100, или приблизительно от 10 до 50 мкг/кг массы тела.

- 16 008938

Способ введения, который является предпочтительным по настоящему изобретению, представляет собой подкожный способ введения. Внутримышечное введение является дополнительным предпочтительным способом в соответствии с настоящим изобретением.

В других предпочтительных вариантах осуществления кластерин вводят ежедневно или через день.

Дневную дозу часто дают пациенту в виде нескольких отдельных доз или в виде лекарственной формы, обеспечивающей продолжительное выделение действующего начала, которая эффективна для достижения желаемых результатов. Второе и последующие введения могут предусматривать введение той же самой дозы, а также меньшей или большей дозы по сравнению с исходной или предшествующей дозой, введенной пациенту. Второе и последующие введения могут осуществляться перед началом или во время заболевания.

В соответствии с настоящим изобретением кластерин может вводиться пациенту в терапевтически эффективном количестве в профилактических или терапевтических целях предварительно, одновременно и последовательно с другим лечебным режимом или лечебным средством (например, режимы приема многих лекарств), в частности с интерфероном. Действующие агенты, которые вводят одновременно с другими терапевтическими средствами, могут вводиться в составе той же самой или иной композиции.

Далее, изобретение относится к способу лечения периферических неврологических заболеваний, включающему введение пациенту в случае необходимости эффективного количества кластерина или агониста активности кластерина, необязательно, вместе с фармацевтически приемлемым носителем.

Также в рамках настоящего изобретения находится способ лечения периферических неврологических заболеваний, включающий введение пациенту в случае необходимости эффективного количества кластерина или агониста активности кластерина, а также гепарина, необязательно, вместе с фармацевтически приемлемым носителем.

Также в рамках настоящего изобретения находится способ лечения периферических неврологических заболеваний, включающий введение пациенту в случае необходимости эффективного количества кластерина или агониста активности кластерина, а также интерферона, необязательно, вместе с фармацевтически приемлемым носителем.

Кроме того, в рамках настоящего изобретения находится способ лечения периферических неврологических заболеваний, включающий введение пациенту в случае необходимости эффективного количества кластерина или агониста активности кластерина, а также остеопонтина, необязательно, вместе с фармацевтически приемлемым носителем.

Все источники, цитированные в изобретении, включая опубликованные или неопубликованные журнальные статьи или рефераты, заявки на патенты Соединенных Штатов или зарубежных стран, патенты, выданные в Соединенных Штатах или зарубежных странах, а также любые другие источники, полностью включены в настоящее описание с помощью ссылок, включая все данные, таблицы, чертежи и тексты, представленные в цитированных источниках. Кроме того, полное содержание всех источников, цитированных в источниках, которые указаны в настоящем описании, также целиком включено с помощью ссылок.

Ссылки на стадии известных методик и общепринятых методик, известные методики или общепринятые методики ни в коем случае не являются признанием того, что любой аспект, описание или вариант осуществления настоящего изобретения раскрыт, разработан или предложен в данной области техники.

Предшествующее описание конкретных вариантов осуществления показывает общую природу изобретения с такой степенью полноты, что, применяя специальные знания в данной области техники (включая содержание цитированных источников), можно легко модифицировать и/или адаптировать упомянутые конкретные варианты осуществления для различных приложений без отступления от основной концепции настоящего изобретения. Следовательно, подразумевается, что такие адаптации и модификации находятся в смысловом ряду эквивалентов раскрытых вариантов осуществления, основанных на идее или общем направлении, которые представлены в настоящем изобретении. Следует понимать, что фразеология или терминология настоящего описания служит цели описания и не ограничивает рамки изобретения, поэтому терминология или фразеология данного описания должны толковаться сведущими специалистами в свете идей и общего направления, которые представлены в данном изобретении, в сочетании со знаниями обычного специалиста в данной области техники.

Рассмотренное изобретение будет легче понять, если обратиться к примерам, которые предоставлены в качестве иллюстрации и не преследуют цель ограничить настоящее изобретение.

Примеры

Пример 1. Рекомбинантная экспрессия кластерина.

Меченый рекомбинантный мышиный или рекомбинантный человеческий кластерин (соответственно т-кластерин и Ь-кластерин) экспрессируют в клетках НЕК и очищают следующим образом.

Образец культуральной среды (100 мл), содержащий рекомбинантный белок с С-концевой меткой, разбавляют равным объемом холодного буферного раствора А (50 мМ NаН₂ΡΟ4; 600 мМ №С1, 8,7% (масса/объем) глицерина, рН 7,5) до конечного объема 200 мл. Образец фильтруют через 0,22 мкм стерильный фильтр (М1Шроге, 500 мл фильтр) и сохраняют при 4°С в прямоугольной стерильной бутылке для хранения среды (№11депе).

- 17 008938

Очистку выполняют при 4°С на рабочей станции УЖЮЫ (АррНеб ΒίοδνδΙοιιΐδ). соединенной с автоматическим загрузчиком образцов (ЬаЬотайс). Процедура очистки состоит из двух последовательных стадий: специфичной для метки аффинной хроматографии, за которой следует гель-фильтрация на колонке (1,0x10 см) со средой 8ерйабех 6-25 (Атегайат Рйагтааа).

Первая стадия хроматографии приводит к тому, что элюированный белок собирают во фракцию объемом 1,6 мл.

Для проведения второй стадии хроматографии колонку для гель-фильтрации, заполненную 8ерйабех 6-25, регенерируют 2 мл буфера Ό (1,137 мМ ЫаС1, 2,7 мМ КС1, 1,5 мМ КН₂РО₄, 8 мМ Ыа₂НРО₄, рН 7,2) и затем уравновешивают буфером С в количестве 4 объемов колонки (137 мМ ЫаС1, 2,7 мМ КС1, 1,5 мМ КН₂РО₄, 8 мМ Ыа₂НРО₄, 20% (масса/объем) глицерина, рН 7,4). Пиковую фракцию, элюированную из аффинной колонки на первой стадии, автоматически загружают в колонку с 8ерНабех 6-25 с помощью присоединенного к УЖЮЫ загрузчика образцов и белок элюируют буфером С при скорости потока 2 мл/мин. Лишенный солей образец получают в 2,2 мл фракции. Фракцию фильтруют через 0,22 мкм стерильный фильтр для центрифугирования (МзШроге), замораживают и хранят при -80°С. Аликвоту образца анализируют на 8Ό8-ΡΆ6Ε (4-12% гель ΝυΡΑ6Ε, Ыоуех) с помощью окрашивания красителем кумасси и вестерн-блоттинга с антителами, нацеленными на метку.

Окрашивание кумасси. Гель М.1РА6Е окрашивают 0,1% окрашивающим раствором кумасси голубого К250 (30% метанола, 10% уксусной кислоты) при комнатной температуре в течение 1 ч и впоследствии удаляют краситель в 20% метаноле и 7,5% уксусной кислоте до прозрачности фона и ясной видимости полос белка.

Вестерн-блоттинг. После электрофореза белки при помощи электричества переносят с геля на нитроцеллюлозную мембрану при токе 290 мА в течение 1 ч при 4°С. Мембрану блокируют 5% раствором молочного порошка в буфере Е (137 мМ №С1, 2,7 мМ КС1, 1,5 мМ КН₂РО₄, 8 мМ Ν₂ΗΡΟ₄, 0,1% Т\гееп 20, рН 7,4) в течение 1 ч при комнатной температуре и затем инкубируют со смесью 2 нацеленных на метку поликлональных кроличьих антител (6-18 и Н-15, 0,2 мкг/мл каждого, 8ап1а Стих) в 2,5% растворе молочного порошка в буфере Е в течение ночи при 4°С. После дополнительной инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре мембрану промывают буфером Е (3x10 мин) и затем инкубируют с вторичным НКР-конъюгированным антителом, нацеленным на кроличье антитело (ОАКО, НКР 0399), разбавленным 1/3000 в буфере Е, содержащем 2,5% молочного порошка в течение 2 ч при комнатной температуре. После промывания буфером Е (3x10 мин) мембрану обрабатывают набором ЕСЬ (Атег8йат Рйагтааа) в течение 1 мин. Затем мембрану фиксируют на НурегШт (Атегайат Рйагтааа), пленку проявляют и визуально анализируют изображения вестерн-блоттинга.

Анализ белка. Концентрацию белка определяют, применяя комплект для анализа белка ВСА (Р1егсе) с альбумином коровьей сыворотки в качестве стандарта. Средний выход белка составляет 216 мкг очищенного кластерина на 100 мл культуральной среды.

Анализ очищенного белка в невосстанавливающем геле δΌδ-РАбЕ показывает, что рекомбинантный белок имеет гетеродимерную структуру нативного кластерина (не показана).

Пример 2. Защитное воздействие кластерина при невропатии, вызванной разрушением седалищного нерва у мышей.

Сокращения:

СМАР - потенциал сложного мышечного действия;

ЭАС - дней после разрушения нерва;

ОЕ' - дней ίη νίίτο;

ЕМ6 - электромиография;

ЮЕ-1 - инсулиноподобный фактор роста;

ί.ρ. - интраперитонеально;

ί.ν. - внутривенно;

8.с. - подкожно;

б.е.т. - стандартная ошибка среднего значения;

ν8 - против.

Введение.

Настоящее исследование выполняют для того, чтобы оценить регенерацию нервов у мышей, которых подвергают воздействию кластерина в различных дозах. В данной модели положительное воздействие кластерина на выживание нейронов и аксонов (сенсорные и двигательные нейроны), а также на миелинизацию или вызванное макрофагами воспаление могло бы привести к восстановлению двигательной функции. Регенерацию можно измерить по степени восстановления сенсорно-моторных функций и с помощью морфологических исследований. Следовательно, в данном исследовании параллельно осуществляют фиксацию электрофизиологических данных и гистоморфометрический анализ.

- 18 008938

Материалы и методики.

Животные.

Используют 72 женские особи мыши С57Ы/6 Кб в возрасте 8 недель (Е1емаде 1апу1ег, Ье Сепек!-8!1к1е, Ргапсе). Мышей делят на 6 групп (п=12):

a) группа, которой вводят основу лекарственной композиции;

b) группа, которой вводят основу после раздавливания нерва;

c) после раздавливания нерва вводят т-кластерин (300 мкг/кг);

б) после раздавливания нерва вводят т-кластерин (1000 мкг/кг);

е) после раздавливания нерва вводят 4-метилкатехин (10 мкг/кг);

Г) после раздавливания нерва вводят остеопонтин (100 мкг/кг).

Остеопонтин (ΟΡΝ) представляет собой сильно фосфорилированный сиалопротеин, который является важным компонентом минерализованного внеклеточного матрикса костей и зубов. Его применение или применение агониста его активности для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики неврологических заболеваний заявлено в \УО 02092122.

Животных размещают по группам (12 особей в клетке) и содержат в комнате с регулируемой температурой (21-22°С) и повторяющимся циклом свет-темнота (12 ч/12 ч), причем пища и вода доступны в любых количествах. Все эксперименты выполняют в соответствии с установленными рекомендациями.

Повреждение седалищного нерва.

Животных подвергают анестезии с помощью Ер. инъекции хлоргидрата кетамина 60 мг/кг (1та1депе 500®, Кйопе Мепеих, Ьуоп, Ргапсе). Правый седалищный нерв хирургически раскрывают на уровне средней части бедра и раздавливают на 5 мм выше места разделения седалищного нерва на три ветви. Нерв раздавливают дважды в течение 30 с при помощи кровоостанавливающего зажима (ширина 1,5 мм, Коешд, 8!гакЬоигд, Ргапсе), причем между раздавливаниями зажим поворачивают на 90°.

Планирование экспериментов и фармакологического воздействия.

Электромиографическое (ЕМС) исследование проводят один раз до хирургического вмешательства (исходная линия) и один раз в неделю в течение 2 недель после операции.

День хирургического разрушения нерва принимают за день (Ό) 0. В течение 4-х дней после раздавливания нерва не проводят никаких тестов.

Массу тела и соотношение выживших животных фиксируют каждый день.

С момента повреждения нерва до конца исследования ежедневно интраперитонеально (Ер.) вводят т-кластерин (рекомбинантный т-кластерин из клеток НЕК) или 4-метилкатехин, в то время как ежедневную инъекцию остеопонтина осуществляют подкожно (к.с.).

На второй неделе 4 животных из каждой группы умерщвляют и препарируют седалищный нерв для выполнения морфологического анализа.

Фиксация электрофизиологических параметров.

Фиксацию электрофизиологических параметров осуществляют с применением электромиографа (ЕМС) №игота!ю 2000М (Иап!ес, Ьек Ийк, Ргапсе). Мышам проводят анестезию с помощью интраперитонеальной инъекции 100 мг/кг хлоргидрата кетамина (1та1депе 500®, Кйопе Мепеих, Ьуоп, Ргапсе). Температуру тела поддерживают на уровне 30°С с помощью нагревательной лампы и контролируют с помощью контактного термометра (Ошск, ВюЫоск 8с1еп!гйс, Шкйсй, Ргапсе), размещенного на хвосте.

Потенциал сложного мышечного действия (СМАР) измеряют в икроножной мышце после однократной 0,2 мс стимуляции седалищного нерва сверхмаксимальной интенсивности (12,8 мА). Измеряют амплитуду (мВ), задержку (мс) и длительность (время, необходимое для завершения процесса деполяризации и реполяризации) потенциала действия. Амплитуда является показателем числа активных двигательных единиц, тогда как задержка на периферии косвенно отражает проводимость двигательных нервов и скорости передачи нервно-мышечных импульсов.

Морфометрический анализ.

Морфометрический анализ осуществляют через 2 недели после раздавливания нерва. Для этого анализа используют четырех случайно выбранных мышей из каждой группы. Мышам осуществляют анестезию с помощью интраперитонеальной инъекции 100 мг/кг 1та1депе 500®. 5 мм участок седалищного нерва препарируют для гистологии. Ткань фиксируют в течение ночи 4% водным раствором глутарового альдегида (81дта, Ь'1к1е б'АЬеаи-Сйекпек, Ргапсе) в фосфатном буферном растворе (рН 7,4) и сохраняют в 30% растворе сахарозы при 4°С вплоть до использования. Нерв фиксируют в 2% тетроксиде осмия (81дта, Ь'1к1е б'АЬеаи-Сйекпек, Ргапсе) в фосфатном буфере в течение 2 ч, дегидратируют последовательным промыванием спиртовыми растворами и помещают в Ероп. Затем ткани подвергают действию температуры 70°С в течение 3 дней для полимеризации. С помощью микротома выполняют поперечный срез толщиной 1,5 мкм, окрашивают его 1% раствором толуидинового синего (81дта, Ь'1к1е б'АЬеаиСйекпек, Ргапсе) в течение 2 мин, дегидратируют и помещают на предметное стекло ЕикйЕ Поперечный срез получают из середины разрушенного участка нерва. Морфометрический анализ и подсчет волокон осуществляют по всей площади среза нерва, применяя программное обеспечение для полуавтоматического цифрового анализа изображений (Вюсот, Ргапсе). Анализируют соотношение разрушенных и не

- 19 008938 разрушенных миелинизированных нервных волокон. Миелинизированные волокна, имеющие аксоплазму в виде многих долек и/или неравномерное миелиновое покрытие, рассматривают в качестве волокон, подвергающихся процессу распада. Рассчитывают следующие параметры: площадь аксона, площадь миелина и площадь нервного волокна (суммарная площадь аксона и миелина).

Анализ данных.

Общий анализ данных осуществляют, применяя однофакторный или дисперсионный анализ (ΑΝΟνΑ), а также односторонний ΑΝΟνΑ и непараметрические тесты (тест Манна-Уитни). Тест Дунет та применяют при дальнейшем аппроксимировании. Был установлен уровень значимости р<0,05. Результаты выражают в виде среднее значение ± стандартная ошибка среднего значения (к.е.т.).

Результаты.

Все животные выжили после процедуры раздавливания нерва. В ходе исследований несколько мышей скончались:

на 2-й второй день - мышь № 8 из группы, которой после раздавливания нерва вводят остеопонтин, и мышь № 12 из группы, которой после раздавливания нерва вводят т-кластерин 1 мг/кг;

на 7-й день - мышь № 9 из группы, которой после раздавливания нерва вводят основу лекарственной композиции, и из-за анестетика мышь № 9 из группы, которой после раздавливания нерва вводят ткластерин в количестве 1 мг/кг.

Масса животных.

Как показано на фиг. 2, все животные демонстрируют легкое уменьшение массы тела в течение 2-3 дней после хирургического вмешательства. Затем животные демонстрируют последовательное восстановление массы тела. Воздействие различных доз т-кластерина не вызывает каких-либо заметных изменений в массе тела мышей, подвергшихся раздавливанию седалищного нерва, по сравнению с мышами, которым не вводят т-кластерин.

Электрофизиологические измерения.

Амплитуда потенциала сложного мышечного действия (фиг. 3).

У животных, которым была проведена имитация операции, не отмечено заметных изменений в амплитуде СМАР на протяжении всего эксперимента. В противоположность этому раздавливание седалищного нерва вызвало резкое уменьшение амплитуды СМАР, с падением >90% на 7- и 14-й день по сравнению с соответствующими показателями для мышей с имитацией операции. Если мышей с раздавленным седалищным нервом подвергают воздействию кластерина в количестве 300 мкг/кг или 1 мг/кг, или остеопонтина в количестве 100 мкг/кг, они демонстрируют значительное увеличение (примерно в 1,5 раза) амплитуды СМАР по сравнению с мышами, которые не подвергаются воздействию указанных веществ. Аналогично, введение 4-МС также повышает амплитуду СМАР у мышей с раздавленным нервом, но в меньшей степени, по сравнению с кластерином или остеопонтином.

Задержка сложного мышечного потенциала действия (фиг. 4).

У мышей с имитацией операции не отмечено ухудшения задержки СМАР на протяжении исследования. В противоположность этому мыши с раздавленным седалищным нервом показывают время задержки СМАР в 1,2 раза большее, чем мыши с имитацией операции. У мышей с раздавленным седалищным нервом, которые подвергаются действию кластерина или остеопонтина, время задержки СМАР значительно уменьшается по сравнению с аналогичным показателем мышей, которым не вводят указанные препараты. На 7-й день этот результат мог бы наблюдаться после применения 0,3 мг/кг кластерина и 0,1 мг/кг остеопонтина. На 14-й день обе концентрации кластерина оказываются эффективными.

Длительность потенциала сложного мышечного действия (фиг. 5).

У мышей с имитацией операции длительность СМАР статистически не отличается от исходного значения. В противоположность этому мыши с раздавленным седалищным нервом показывают значительное увеличение длительности СМАР, особенно на 14-й день, когда длительность более чем в 3 раза превышает этот параметр у животных с имитацией операции.

Если мышей с раздавленным седалищным нервом подвергают действию кластерина в количестве 300 мкг/кг или остеопонтина, они демонстрируют значительное уменьшение длительности СМАР по сравнению с животными с раздавленным нервом, которым давали основу лекарственной композиции.

Морфометрический анализ.

Морфометрический анализ выполняют после прекращения эксперимента на 14-й день.

Количество распавшихся (фиг. 6) и нераспавшихся нервных волокон в процентах (фиг. 7).

Как показано на фиг. 6, процентное количество распавшихся волокон в седалищном нерве мышей с имитацией операции (контроль) составляет <20%. Когда седалищный нерв подвергают раздавливанию, количество распавшихся волокон значительно возрастает и достигает 60% (раздавливание/основа лекарственной композиции). Введение мышам 300 мкг/кг или 1 мг/кг кластерина вызывает значительное уменьшение количества распавшихся волокон по сравнению с группой, которой кластерин не вводят.

Наоборот, соотношение нераспавшихся волокон у животных с имитацией операции (контроль) в 2 раза превышает аналогичный показатель у мышей с раздавленным седалищным нервом, которым вводят основу лекарственной композиции (раздавливание/основа) (фиг. 7). Введение кластерина в количестве 300 мкг/кг или 1 мг/кг вызывает значительное увеличение плотности нераспавшихся волокон.

- 20 008938

Выводы.

Модель раздавливания нерва представляет собой чрезвычайно точную модель периферической невропатии. Сразу же после раздавливания большая часть нервных волокон, имеющих значительный диаметр, оказываются разрушенными из-за механических повреждений, что ведет к сильному уменьшению амплитуды СМАР. Время задержки СМАР не подвергается немедленному влиянию, но демонстрирует рост на протяжении 14 дней из-за дополнительного распада нервных волокон малого диаметра за счет вторичного, иммунно-опосредованного распада (макрофаги, гранулоциты). Длительность СМАР увеличивается на 7-й день и достигает наивысшего значения на 14-й день. На 21-й день (не показано) повреждение от раздавливания подвергается регенерации - дополнительному процессу, представляющему интерес в связи с невропатическими состояниями.

Кластерин демонстрирует защитное действие в модели раздавливания нерва у мышей по всем измеренным параметрам. Морфологические исследования, выполненные через 2 недели после раздавливания нерва, показывают существенное уменьшение процентного соотношения распавшихся нервных волокон и увеличение общего количества волокон. Кластерин столь же эффективен, как и контрольная молекула, примененная в данном исследовании, т.е. 4-метилкатехин. Положительное влияние на функциональное и гистологическое восстановление, возможно, имеет место благодаря тому, что кластерин влияет на следующее:

непосредственную защиту волокон от вторичного иммунно-опосредованного распада;

ускорение ремиелинизации и защиту аксонов;

ускорение регенерации/прорастания поврежденных аксонов;

ускорение уничтожения остатков разрушенного миелинового слоя макрофагами;

на модуляцию ответа макрофагов на аксотомию.

Пример 3. Подкожное введение кластерина ускоряет функциональное восстановление после раздавливания седалищного нерва.

Введение.

Для изучения долгосрочных результатов воздействия кластерина на регенерацию нервов вторую группу мышей подвергают воздействию кластерина путем ежедневного (5 раз в неделю, 8.с.) введения рекомбинантного человеческого кластерина, выработанного клетками НЕК.

Материалы и методики.

Мышей делят на 6 групп (п=6) следующим образом:

a) раздавливают нерв и вводят основу лекарственной композиции;

b) раздавливают нерв и вводят й-1Ь6> (30 мкг/кг);

c) раздавливают нерв и вводят й-кластерин (0,1 мг/кг);

ά) раздавливают нерв и вводят й-кластерин (300 мкг/кг);

е) раздавливают нерв и вводят й-кластерин (1 мг/кг).

Воспроизводят методики, описанные в примере 2, за исключением того, что вместо интраперитонеальной инъекции рекомбинантного мышиного кластерина животные получают подкожную инъекцию (100 мкл/мышь) рекомбинантного человеческого кластерина, выработанного в клетках НЕК (й-кластерина). Основой лекарственной композиции служит раствор 0,9% ΝαΟΊ и 0,02% В8А. В качестве положительного контроля применяют рекомбинантный человеческий 1Ь-6 (30 мкг/кг, 8.с). Параметры электромиографии и массу тела определяют, как описано выше.

Потенциал сложного мышечного действия (СМАР) измеряют в икроножной мышце после однократной 0,2 мс стимуляции седалищного нерва сверхмаксимальной интенсивности (12,8 мА). Различные параметры, т.е. амплитуду (мВ), задержку (мс) и длительность потенциала сложного мышечного действия измеряют в соответствии в описанным выше, на 0, 7, 14, 21 и 28 дни после раздавливания нерва, в икроножной мышце со стороны раздавленного нерва (ипсилатеральной) и в икроножной мышце с противоположной стороны (контралатеральной).

Активность холинацетилтрансферазы (СйАТ).

После 4 недель воздействия препаратов, описанных в примере 3, мышей подвергают анестезии и умерщвляют. Контралатеральные и ипсилатеральные икроножные мышцы собирают и анализируют на активность холинацетилтрансферазы (СйАТ), которая является индикатором иннервации нейронов. Активность СйАТ измеряют в соответствии с протоколом, описанным Соп1гега8 и сотрудниками (Соп1гега8 е1 а1., 1995), за исключением того, что исключают холодный ацетил-СоА и добавляют 0,25 нмоль ³Н-ацетил-СоА, что соответствует активности 0,05 мкКи.

Нейрофиламенты - формы высокой молекулярной массы (ΝΕ-Н).

ΝΕ-Н и их фосфорилированные аналоги являются индикаторами зрелости аксонов (Кгебегег а1 а1., 1996). После 4 недель воздействия препаратов, описанных в примере 3, мышей подвергают анестезии и умерщвляют. Нервы собирают, экстрагируют в тройном детергентном буфере и образцы анализируют на содержание белка с помощью комплекта для анализа белка ^егсе) и количественно определяют ΝΕ-Н способом «сэндвич-ЕЫ§А».

- 21 008938

Для анализа ΝΕ-Η способом ЕЫ8А применяют следующий протокол исследований: иммобилизованное антитело, т.е. мышиное моноклональное антитело 8М1 31 (απΗ-ΝΕ-Η, фосфорилированное 1/2500, 81етЬегдег), инкубируют в ΡΒ8 в течение ночи при 4°С. Планшеты блокируют ΡΒ8, содержащим 1% В8А, в течение 1 ч. После инкубации с образцами в течение 2 ч антитела, служащие для определения, т.е. кроличьи поликлональные антитела N 4142 апй-ΝΕ (1/1000, 8щта). разбавляют РВ8-В8А, инкубируют в течение 2 ч и обнаруживают пероксидазой после инкубации с конъюгированными кроличьими антителами против ΗΚΡ (1/3000, 81дта, разбавлены РВ8-В8А в течение 1 ч). Все оптические плотности, зарегистрированные на длине волны 492 нм, соотносят со стандартной кривой коровьего ΝΕ-Η (8щта) и затем определяют содержание белка в каждом образце.

Результаты.

Электрофизиологические измерения.

Амплитуда потенциала сложного мышечного действия (фиг. 8).

Через 1 неделю после раздавливания нерва между животными, которым вводят 1Ь-6 (30 мкг/кг), й-кластерин (100, 300 или 1000 мкг/кг) или основу лекарственной композиции, не выявляется значительных различий в амплитуде СМАР. От 15- до 28-го дня мыши с раздавленным седалищным нервом, подвергшиеся действию кластерина и 1Ь-6, демонстрируют последовательное увеличение амплитуды СМАР. Через 4 недели амплитуда СМАР мыши, которой вводят кластерин, демонстрирует очень значительное увеличение по сравнению с мышами, которым кластерин не вводят.

Задержка потенциала сложного мышечного действия.

Задержку потенциала сложного мышечного действия измеряют у невропатических мышей, которым вводят основу, рекомбинантный человеческий 1Ь-6 (30 мкг/кг) или й-кластерин (100, 300 и 1000 мкг/кг). Измерения в ипсилатеральной и контралатеральной мышцах осуществляют спустя 1, 2, 3 или 4 недели после повреждения седалищного нерва. Результаты приведены в табл. 4.

Таблица 4

	Задержка (мс)		Задержка (мс)
Контралатеральная мышца	Ипсилатеральная мышца
7д	14д	21 д	28 д	7д	14 д	21 д	28 д
Основа	0,79 0,04	0,85 0,03	0,87 0,04	0,79 0,06	Основа	0,97#а 0,098	0,97 0,07	1,32*а 0,09*	1,08а 0,06
й-ГГ.6	0,77	0,81	0,74	0,77	Ь-1Ь6	0,95	0,91	0,91*Ъ	0,081 *Ь
30 мкг/кг	0,04	0,05	0,03	0,05	30 мкг/кг	0,09	0,04	0,10	0,04
Кластерин	0,80*Ь	0,79	0,74	0,69	Кластерин	0,93	0,89	1,04*Ь	0,94
0,1 мг/кг	0,02	0,05	0,06	0,01	0,1 мг/кг	0,06	0,0]	0,08	0,07
Кластерин	0,83	0,88	0,87	0,70	Кластерин	0,92	0,90	0,89**Ь	0,90#Ъ
0,3 мг/кг	0,04	0,02	0,02	0,04	0,3 мг/кг	0,09	0,04	0,05	0,03
Кластерин	0,85	0,86	0,79	0,76	Кластерин	0,83	0,91	1,04*Ь	0,97 Ь
1 мг/кг	0,04	0.03	0,03	0,05	1 мг/кг	0,04	0,03	0,06	0,06

а: однофакторный тест ΑΝΟνΑ относительно значений для контралатеральной мышцы;

Ь: однофакторный тест ΑΝΟνΑ относительно группы, которой вводят основу;

цифры, отображенные наклонным шрифтом, отражают стандартную ошибку (8Б);

Ν=6 мышей/группа;

#р<0,1, *р<0,05, **р<0,01, ***р<0,005.

У мышей, которым вводят 0,1 мг/кг кластерина, в ходе исследования не наблюдается ухудшение времени задержки СМАР в контралатеральной мышце за исключением 7-го дня. В противоположность этому на ипсилатеральной стороне задержка СМАР возрастает после раздавливания нерва. У мышей, которых подвергают действию 1Ь-6 и кластерина, ипсилатеральная задержка СМАР значительно снижена по сравнению с задержкой у мышей, которые не подвергаются действию указанных препаратов. На 21- и 28-й дни введение рекомбинантного й-1Ь-6 и кластерина (1 и 0,3 мг/кг) значительно улучшает восстановление времени задержки.

Длительность потенциала сложного мышечного действия.

Как и в случае описанной выше задержки, длительность потенциала сложного мышечного действия измеряют во всех группах на контралатеральной и ипсилатеральной сторонах, причем результаты приведены в табл. 5.

- 22 008938

Таблица 5

	Длительность (мс)		Длительность (мс)
Контралатеральная мышца	Ипсилатеральная мышца
7 д	14д	21 д	28 д	7 д	14 д	21 д	28 д
Основа	2,0 0,1	2,5 0,2	2,9 0,2	2,9 0,2	Основа	3,5#а 0.7	4,4**а 0,4	3,8 0,8	3,0 0,2
Ь-1Ь6	2,5 #Ь	2,0*Ь	3,0	2,9	Ь-11,6	2,6	3,6	3,4	3,0
30 мкг/кг	0,3	0,2	0,2	0.1	30 мкг/кг	0,2	0,3	0,1	0,1
Кластерин	2,5*Ь	2,0*Ь	2,9	2,9	Кластерин	2,7	4,1	3,2	2,9
0,1 мг/кг	0,2	0,1	0,3	0,1	0,1 мг/кг	0,1	0,5	0,2	0,3
Кластерин	2,3*Ь	2,2	2,9	3,0	Кластерин	2,7	3,9	2,8***Ь	3,4
0,3 мг/кг	0,1	0,2	0.2	0.1	0,3 мг/кг	0,1	0,4	0,1	0,2
Кластерин	2,1	2,1	2,6	2,9	Кластерин	2,6	3,4#Ь	з,о#ь	3,1
1 мг/кг	0.1	0,2	0,3	0.1	1 мг/кг	0,2	0,4	0,2	0,2

й: однофакторный тест ΑΝΟνΑ относительно тропны, которой вводят основу; цифры, отображенные наклонным шрифтом, отражают стандартную ошибку (8Б); N=6 мышей/группа;

#р<0,1, *р<0,05, **р<0,01, ***р<0,005.

В группе, которой вводят основу лекарственной композиции, длительность ипсилатерального СМАР возрастает после повреждения нерва и возвращается к контралатеральному значению спустя 4 недели. Действие кластерина (1 и 0,3 мг/кг) уменьшает общий рост длительности СМАР и ускоряет восстановление.

Активность холинацетилтрансферазы (СйАТ) (фиг. 9).

Через 4 недели после раздавливания нерва активность СйАТ в ипсилатеральной икроножной мышце (фиг. 9а) полностью не восстанавливается. Воздействие кластерина в небольшой степени (р<0,1) способствует восстановлению активности СйАТ в икроножной мышце. У мышей, подвергающихся действию й-кластерина, содержание СйАТ в контралатеральной мышце оказывается повышенным по сравнению с животными, которым вводится основа лекарственной композиции (фиг. 9й).

Нейрофиламенты - форма с высокой молекулярной массой (ΝΕ-Н), фиг. 10.

Через 4 недели после раздавливания нерва в группе, которую подвергают действию основы, уровни ΝΕ-Н в проксимальной части седалищного нерва (над участком раздавливания нерва; фиг. 10й) и в дистальной части (ниже участка раздавливания нерва; фиг. 10с) не отличаются от уровней ΝΕ-Н в контралатеральном нерве (фиг. 10а). Воздействие кластерина увеличивает содержание ΝΕ-Н в контралатеральной стороне и в проксимальной части раздавленного нерва.

Выводы.

Данные результаты, как и результаты, полученные после 15 дней воздействия (пример 2), подчеркивают лечебное действие кластерина в модели раздавливания нерва. В зависимости от времени воздействия результат может быть заметен во всех исследованных параметрах потенциала сложного мышечного действия (СМАР), а именно в задержке, длительности и амплитуде. Кроме того, воздействие кластерина также увеличивает содержание СйАТ и ΝΕ-Н в раздавленном и контралатеральном нервах. В изменении массы тела не наблюдается каких-либо неблагоприятных эффектов (данные не показаны).

Пример 4. Кластерин стимулирует образование основного белка миелина (МВР) в созревающих культурах гиппокампальных срезов.

Введение.

Регуляция регенерации нервов после повреждения или заболевания требует не только прорастания и удлинения аксонов, но также синтеза нового миелина. Миелинизация необходима для нормальной проводимости нервных импульсов и защиты аксонов, например, от эксайтотоксичности или иммунологических поражений. Поскольку восстановление миелина в основном представляет собой рекапитуляцию онтогенетических событий (Саре11о с1 а1., 1997; Кийи с1 а1., 1993), культуры органотипических гиппокампальных срезов используют для имитации развития миелинизации. Более точно за уровнем основного белка миелина (МВР), т.е. белка, типичного для зрелых олигодендроцитов и шванновских клеток, наблюдают с помощью ЕБ18А.

Материалы и методики.

Культуры органотипических гиппокампальных срезов.

Культуры органотипических гиппокампальных срезов получают в соответствии со способом δΐορρίηί и соавт. (δΐορρίηί е! а1., 1991). Вкратце, гиппокамп получают из мышей С57/В16 в возрасте 5 дней.

- 23 008938

Применяя прибор для резки тканей Μοίΐίναίη. получают срезы толщиной 500 мкм. Затем срезы располагает на вкладышах М1111се11-СМ, которые помещают в 6-луночные планшеты, содержащие 1 мл культуральной среды (50% МЕМ, 25% НВ88, 25% лошадиной сыворотки). Культуры сохраняют в 5% атмосфере СО₂ при 37°С в течение 6 дней и затем температуру понижают до 33°С. Среду меняют каждые 3 дня.

Развитие миелинизации.

Изучают способность кластерина увеличивать миелинизацию, которая обычно наблюдается в течение первых 3 недель ίη νίΐτο.

Во-первых, с 7- по 17-й дни срезы обрабатывают т-кластерином (1 мкг/мл, 100 нг/мл и 10 нг/мл) в среде, содержащей лошадиную сыворотку (25%). Обработку повторяют каждые 2 дня.

В конце обработки (т.е. на 3-, 6- и 10-й дни обработки, соответствующие 10, 13 и 17 дням ίη νίΐτο, соответственно) срезы (6 срезов в группе) растворяют в тройном детергентном буфере и содержание МВР определяют способом МВР ЕЫ8А.

Эксперимент проводят дважды, причем результаты показаны на фиг. 11.

Сходные результаты получают в том случае, когда данные эксперименты повторяют с рекомбинантным человеческим кластерином, полученным в клетках НЕК или СНО, вместо рекомбинантного мышиного кластерина (данные не показаны).

МВР ЕЫ8А.

В различные моменты времени после лизиса, образцы анализируют на содержание белка с помощью комплекта для анализа белка (Р1егсе) и с целью количественного определения МВР способом «сэндвич ЕЫ8А».

Применяют следующий протокол анализа МВР-ЕЫ8А. Иммобилизованное антитело, т.е. мышиное моноклональное антитело против МВР (1/5000; СДетюоп), разбавляют в РВ8 и инкубируют в течение ночи при 4°С. Ячейки блокируют РВ8, содержащим 1% В8А, в течение 1 ч. Разбавленные РВ8 образцы инкубируют в течение 2 ч. Используемое для определения антитело, т. е. кроличье поликлональное антитело против МВР (1/300; 2утеб), разбавленное РВ8-В8А, инкубируют в течение 2 ч и выявляют с помощью пероксидазы после инкубации с конъюгированным кроличьим антителом против НКР (1/3000, 81дта; разбавленным РВ8-В8Л, 1 ч). Все оптические плотности, зарегистрированные на длине волны 492 нм, соотносят со стандартной кривой МВР (1пУйгодеп) и затем определяют содержание белка в каждом из образцов.

Результаты.

В исходный момент времени гиппокампальные срезы мышей Р4 (4 дня с момента рождения) не экспрессируют МВР в обнаруживаемом количестве. По мере созревания гиппокампальных срезов уровень МВР, определяемый способом ЕЫ8Л, возрастает и достигает стабильного состояния через 21 день ίη νίΐτο (Όΐν, данные не показаны).

Добавление к культуральной среде 10, 100 и 1000 нг/мл рекомбинантного Д-кластерина на 7, 10 или 14 Όΐν увеличивает содержание МВР в культурах гиппокампальных срезов, как определено с помощью анализа МВР-ЕЫ8А, который проводят через три дня после добавления белка. Содержание МВР в срезах, обработанных 1 мкг/мл т-кластерина, показано на фиг. 11. Прирост содержания МВР перестает быть заметным на 21-й день ίη νίΐτο, когда заканчивается образование миелина (данные не показаны).

Аналогичные результаты получены для остальных концентраций т-кластерина (10 и 100 нг/мл) и для Д-кластерина (данные не показаны).

Выводы.

Кластерин стимулирует образование МВР в культурах гиппокампальных срезов, не влияя при этом на общее содержание МВР, обнаруженное в зрелых гиппокампальных срезах.

Пример 5. Кластерин защищает гиппокампальные срезы от демиелинизации, вызванной антителом против МОС и комплементом детеныша хомяка.

Введение.

Разрушение миелина, которое представляет собой характерную особенность хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатии (СГОР) и синдрома Гийена-Барре (СВ8), возникает, как полагают, из-за наличия аутоиммунной реакции против нервов, которая включает компоненты миелина (Но е! а1., 1998; К\\'а е1 а1., 2003; 81еск е1 а1., 1998). Для имитации вызванной антителами демиелинизации ίη νίΐτο создают систему, в которой культуры органотипических гиппокампальных срезов в течение 2 дней обрабатывают антителами против МОС (противомиелиновый гликопротеин олигодендроцита) в сочетании с комплементом детенышей хомяка. Обработка приводит к специфической демиелинизации, тогда как обработка изотипом соответствующего регулирующего иммуноглобулина не вызывает заметной демиелинизации. Эту систему применяют для испытания защитного воздействия кластерина. В данном примере кластерин добавляют за 1 день, а также одновременно с демиелинизирующей обработкой и наблюдают за уровнями МВР с помощью способа ЕЫ8А (см. подробности в примере 4).

- 24 008938

Материалы и методики.

Протокол демиелинизации.

Срезы, приготовленные по методике примера 4 (раздел культуры органотипических гиппокампальных срезов), обрабатывают на завершающем этапе развития миелинизации, который наступает на 21-й день ш νίΐτο (Όΐν).

Демиелинизацию вызывают путем обработки срезов антителами против МОС в сочетании с комплементом детеныша хомяка (1/60-1/30 в зависимости от объема порции, СЬ-3441, Себаг1апе) в течение дней в среде, содержащей 25% лошадиную сыворотку.

В качестве контроля срезы обрабатывают 1дС1, т.е. нерелевантными антителами (60 мкг/мл; М-7894, 81дта), и комплементом, или же срезы оставляют необработанными.

В конце обработки срезы (5 срезов в группе) растворяют в тройном детергентном буфере и определяют уровень содержания миелина с помощью МВР ЕЫ8А.

Рекомбинантный мышиный кластерин в концентрации 1 мкг/мл, 100 или 10 нг/мл применяют для обработки срезов за 24 ч до демиелинизации, а также добавляют во время обработки (всего в течение дней).

Данный эксперимент проводят 3 раза, его результаты показаны на фиг. 12.

Аналогичные результаты получают при повторении данных экспериментов с применением рекомбинантного человеческого кластерина, выработанного в клетках НЕК или СНО, вместо рекомбинантного мышиного кластерина (данные не показаны).

Результаты.

Результаты данного эксперимента показаны на фиг. 12. Добавление к среде небольшого количества кластерина, составляющего 10 нг/мл, во время обработки срезов комбинацией антитело против МОС/комплемент в значительной степени защищает от демиелинизации.

Выводы.

В модели аутоиммунно-опосредованной демиелинизации кластерин защищает от демиелинизации, вызванной антителом против МОС и комплементом.

Пример 6. Совместная инъекция кластерина с гепарином.

Введение.

Известно, что в сыворотке кластерин связывается с несколькими белками (обзор см. Тгоидакок апб Сопок, 2002 и 1опек апб 1отату, 2002) и предоставляет несколько предполагаемых сайтов связывания (см. фиг. 1, схема по КокепЬегд и Збкепкеп. 1995). Полагают, что четыре сайта из их числа являются областями, связывающими гепарин. Для исследования влияния этих гепаринсвязывающих областей на биодоступность кластерина изучают влияние гепарина, в данном случае Ыс.|иет1пе (КосЬе), на фармакокинетику кластерина.

Материалы и методики.

Первый эксперимент.

Три группы (по 3 мыши в группе) женских особей мышей С57/В16 в возрасте 8 недель массой 20 г подвергают следующим ί.ν. инъекциям:

Группа 1: гепарин (7500 ед./кг) в 100 мкл 0,9% №01 за 5 мин до инъекции Ь-кластерина (300 мкг/кг) в 100 мкл 0,9% №С1.

Группа 2: смешанный раствор Ь-кластерина (300 мкг/кг) и гепарина (7500 ед./кг) в 100 мкл 0,9% №С1.

Группа 3: только 300 мкг/кг Ь-кластерина.

Кровь собирают в пробирку через 5 и 30 мин после инъекции кластерина. Кровь мышей, принадлежащих к трем группам, собирают в пробирки либо с гепарином, либо без него (+/-гепарин). После этого наличие кластерина определяют с помощью теста ЕЫ8А, описанного ниже.

Второй эксперимент.

Три группы (по 4 мыши в группе) женских особей мышей С57/В16 в возрасте 8 недель массой 20 г подвергают следующим ί.ν. инъекциям:

Группа 1: гепарин (7500 ед./кг) в 100 мкл 0,9% №С1 за 5 мин до инъекции Ь-кластерина (1 мг/кг) в 100 мкл 0,9% №С1. Группа 1 получает смешанный раствор кластерина (1 мг/кг) + гепарина (7500 ед./кг) в 100 мкл 0,9% №С1.

Группа 2: 1 мг/кг Ь-кластерина. Гепарин (7500 ед./кг) инъецируют через 28 мин после инъекции Ькластерина (за 2 мин до 30-минутного момента взятия пробы крови).

Группа 3: только 300 мкг/кг Ь-кластерина.

Кровь собирают через 5 и 30 мин после инъекции кластерина. Затем за уровнем содержания кластерина наблюдают с помощью теста ЕЫ8А, описанного ниже.

Кластерин ЕЫ8А.

Анализ по методике «сэндвич-ЕЬКА» проводят с применением моноклональных антител 41Ό (1/1000-50 мкл, ирк1а1е N.05-354), которые служат иммобилизованными антителами. Остаточные сайты связывания блокируют при комнатной температуре в блокирующем буфере (1% В8А (фракция ν)/0,1% Т\гееп-20 в 0,5М №С1). Образцы сыворотки, содержащей рекомбинантный человеческий кластерин, под

- 25 008938 вергают тестированию в последовательных разбавлениях в РВ8. Вслед за четырьмя промывками в растворе РВ8/0,05% Ттеееп-20. Маркерный конъюгат биотина (1/1000, 01аден N.34440) применяют в качестве выявляющего антитела. За наличием выявляющих антител наблюдают с помощью 8бер!аг1Нп-НРВ (1/5000 в РВ8, БАК0 Р0397) в течение 1 ч при комнатной температуре, с последующей реакцией 0РБ (81дта).

Результаты.

Как показано на фиг. 13 А, предварительная инкубация кластерина с гепарином (кластерин, смешанный с гепарином) или предварительная инъекция гепарина перед инъекцией кластерина (гепарин инъецируют перед кластерином) в значительной степени улучшает (р<0,005) биодоступность кластерина. В противоположность этому накопление кластерина в пробирке, содержащей гепарин, не изменяет измеренный уровень содержания кластерина.

Когда гепарин вводят перед повторным отбором крови (группа 2 из второго эксперимента, фиг. 13В), уровень содержания обнаруженного в сыворотке кластерина значительно ниже (р<0,05), чем в том случае, когда гепарин инъецируют совместно с кластерином. Тем не менее, гепарин, инъецированный перед отбором крови, слегка повышает уровень обнаруживаемого кластерина по сравнению с введением только кластерина (р<0,1).

Выводы.

Введение гепарина значительно увеличивает биодоступность кластерина (фиг. 13А). Однако для того чтобы эффект от введения гепарина был максимальным, его следует вводить перед введением кластерина или совместно с ним (фиг. 13В).

Ссылки

1. АВксбий 8.Р., СЫт V., МШег, V., Муегк, Ε.ν., апб Ыртап, БЧ. Вакю 1оса1 абдптеп! кеагсб !оо1. 1. Мо1. Вю1., 1990, 215, 403-410.

2. А1!ксби1, 8.Р., Маббеп, Т.Ь., 8сбаГГег, А.А., 2йапд, 1., 2йапд, Ζ., МШет, V., апб Ыртап, БЧ. Сарреб ВЬА8Т апб Р8!-ВЕА8Т: а пете депетабоп оГ рто!ет ба!аЬаке кеатсб ргодгатк. ШсЮс Ас1бк Век., 1997, 25, 3389-3402.

3. Воппагб, А.8., Сбап, Р., апб Роп!ате, М. Ехртеккюп оГ с1ик!епп апб С4 т^А биттд та! репрбега1 пегге тедепетабоп. Iттиηορба^тасο1οду, 1997, 38, 81-86.

4. Саре11о, Е., УоккиЫ, В.В., МсРабапб, Η.Ρ., апб Вате. С.8. Ми1бр1е кс1егок1к: те-ехргеккюп оГ а беге1ортеп1а1 депе т сбготс 1екюпк согге1а!ек тебб тетуебпабоп. Апп. №ита1., 1997, 41, 797-805.

5. Сопбетак, Р.С., 8!еГГ1ег, С., Уи, Е., СаШкоп, Κ., 8!опд, Б., апб УаидЫ, !Ы 8ук!етю абт1шк!табоп оГ тЫСР-1 епбапсеб тедепетабоп айет кс1абс пегге стикб ш тюе. 1 Р1агтасо1 Ехр Т1ег., 1995, 274, 1443-1449.

6. Бегупск, В., Соп!еп!, 1., БеС1егсд, Е., Уо1скаей, С., Тагетшет, 1., Бегок, В., апб Р1етк, V. По1абоп апб кбисНте оГ а битап йЬтоЫак! биегГегоп депе. №Ыте, 1980, 285, 542-547.

7. Бегетеих, 1., НаеЬетб, Р., апб 8тйЫек, 0. А сотргебепкйе ке1 оГ кецнепсе апа1ук1к ргодгатк Гог Не; УАХ. №.1с1ею Лабк Век., 1984, 12, 387-395.

8. Ратесе!!, IV. апб Кеупек, ВЧ. Репрбега1 пегге тедепетабоп. Аппи. Вег. №итока, 1990, 13, 43-60.

9. Роитшет, I, 81етЬетд, В., СаНЫет, Т., Кеапе, Р.Е., Сиххк и., Соибе, Р.Х., ВоидаиЙ, Ι., МаГГгапб

1.Р., 8оиЬбе. Р., апб Ье Риг. С. РгоЮсбге еГГес1к оГ 8В 57746А ш сеп1га1 апб репрбега1 тобе1к оГ пеигобедепетабге Нкотбетк ш гобеп!к апб рпта!ек. №игокаепсе, 1993, 55, 629-641.

10. РипакокЫ, Н., Ракет I, ВагЬапу, С., Т1ттикк, I, Ζасб^^ккοη, 0., Уегде, У.М., апб Регккоп, Н. Б1ГГегепба1 ехртеккюп оГ тВNАк Гог пеитоборЫпк апб 1бе1г гесерЮгк аГ!ег ахоЮту оГ Не каабе пегге. I Се11 Вю1., 1993, 123, 455-465.

11. С1аппакорои1ок, Р., Когай, Е., Ргепсб, 1Е., У1агб, Ι., НоГ, Р.В., апб Воигак, С. Рокк1Ь1е пеигорго!есйге го1е оГ с1ик1епп ш А1хбенпег'к б1кеаке: а диапНабге йппшпосу1осбепйса1 кШбу. Ас!а №игораИо1. (Вег1), 1998, 95, 3 87-394.

12. СтапИат, В. Атто ааб бГГГегепсе Гогти1а Ю бе1р ехр1а1 п рго!ет его1ибоп. 8аепсе, 1974, 185, 862-864.

13. Нап, В.Н., БеМабок, В.В., Бидап, Ь.Ь, К1т-Нап, 18., Вгепбха, В.Р., Ргуег, 1.Б., К1егкоп, М., С1ттйо, I, Ошск, К., Нагтопу, !А., Агопоте, ВЧ., апб Нобхтат Б.М. С1ик!епп сопбгЬНек Ю сакраке-3тберепбеп! Ьгат ш_)шу Го11отетд пеопа!а1 бурох1а-1ксбепйа. №1 Меб., 2001, 7, 338-343.

14. Напаока, Υ., 0бк Т., Ригикатеа, 8., Ритикатеа, Υ., НауакЫ, К., апб Ма!кикига. 8. ЕГГес! оГ 4те1бу 1са1есбо1 оп каабс пегге дтотеИ ГасЮг 1еге1 апб тоЮг пегге сопбисбоп ге1ос11у ш ехрептеп!а1 б1аЬебс пеигора!Ыс ргосекк ш га!к. Ехр. №ита1., 1992, 115, 292-296.

15. Но, Т^., МсКбапп, С.М., апб Стбйп, IV. Нитап аиЮнптипе пеитора!Ыек. Аппи Вег №игока., 1998, 21, 187-226.

16. 1опек, К.1. Весогегу Ггот Гааа1 рага1ук1к Гоботетд сгикб т)игу оГ Не Гааа1 пегге ш баткЮгк: б1ГГегепба1 еГГес!к оГ депбег апб апбгодеп ехрокиге. Ехр. №игай 1993, 121, 133-138.

17. 1опек, 8.Е. апб 1отату, С. С1ик!епп. ΙΗ 1. Вюсбет. Се11 Вю1., 2002, 34, 427-431.

18. КаесЫ, К., Ригикатеа, Υ., [кедатк В., Nакати^а, К, 0тае, Р., НакЫто!о, Υ., НауакЫ, К., апб Ригикатеа, 8. Рбаттасо1одюа1 тбисбоп оГ рбукю1одюа11у асбге пегге дготеИ ГасЮг т га! реарбега1 пеггоик кук!ет. 1. Рбагтасо1. Ехр. Тбег., 1993, 264, 321-326.

- 26 008938

19. К1ок, Ь. апб Негксйот, Б. Еаг1у ехрепепсе \νίΐ1ι шбаорегабуе сауегпоик пегуе кбти1абоп \νίΐ1ι реш1е !итексепсе топйоппд !о 1тргоуе пегуе краппд биппд габ1са1 ргок!а!ес!оту. Иго1оду, 1998, 52, 537542.

20. Коиппак, М.2., Ьоиктоуа, Е.В, Б!еГапккоп, Б., Нагтопу, ТА., Вге^ег, В.Н., Бб1ск1апб, 0.К., апб Агдгауек, ХУ.Б. 1бепббсабоп оГ д1усорго!еш 330 ак ап епбосубс гесер!ог Гог аро11рорго!ет 1/с1ик1епп. 1. Вю1. Сйет., 1995, 270, 13070-13075.

21. Кийп, 6., Ые, А., ^11тк, Б., апб Ми11ег, Н.\У. Соехргеккюп оГ РМР22 депе \νί11ι МВР апб Р0 биппд бе поуо туе1таЬоп апб пегуе герай. 6йа, 1993, 8, 256-264.

22. К^а, М.Б., уап Бсйа1к, Ι.Κ, Ие 1опде, В.К., Вгапб, А., Ка1ауб_реуа, Ь., уап Векеп, К, Уегтеи1еп, М., апб Ваак, Р. Аи!о1ттипогеасбуйу !о Бсйетапп се11к ш рабеп!к \νί11ι 1пГ1атта!огу пеигораФ1ек. Вгат, 2003, 126, 361-375.

23. Ье^к, М.Е., №ГГ, КТ., Соп!гегак, Р.С., Б!опд, И.В., 0ррепйе1т, Κ.ν., ОгеЬоте, Р.Е., апб УаидЙ, И. 1пки1т-бке дгслхФ Гас1ог-1: ро1еп(1а1 Гог !геа!теп! оГ то!ог пеигопа1 бйогбегк. Ехр. №ига1., 1993, 124, 73-88.

24. МсМайоп, Б.В. апб Рг1ек(1еу, IV. Рег1р6ега1 пеигора!Ыек апб пеигоборЫс ГасЮгк: ашта1 тобе1к апб сйшса1 регкресбуек. Сигг. 0рш. №игоЬю1., 1995, 5, 616-624.

25. Реагкоп, ν.Κ. Кар1б апб кепкЙ1хе кедиепсе сотрапкоп \νί11ι РАБТР апб РАБТА. Ме!йобк Еп/хтоЕ 1990, 183, 63-98.

26. Реагкоп, ν.Κ. апб Ыртап, ИЯ. 1тргоуеб 1оо1к Гог Ью1одюа1 кедиепсе сотрапкоп. Ргос. №П. Асаб. Бс1. ИБА, 1988, 85, 2444-2448.

27. Рооп, Б., Тге^еек, Т.М., '№11коп, М.К., Еак!егЬгоок-Бтйй, Б.В., апб Сагуег, ТА. С1ик!епп 1к ап ех1гасе11и1аг сйарегопе Ла! кресШсабу 1п1егас1к \νίΐ1ι к1оМу-аддгедабпд рго!етк оп 1Не1г оГГ-Го1бшд ра!йетау. РЕЕБ Ьеб., 2002, 513, 259-266.

28. Ршп1ап, И.М., Ерк!ет, II., Сабег, В.Б., апб Vа1кй, Р.С. Бехиа1 Гипсбоп Гоботапд габ1са1 ргок!а!ес1оту: шПиепсе оГ ргекегуабоп оГ пеигоуакси1аг Ьипб1ек. Т Иго1., 1991а, 145, 998-1002.

29. Ои1п1ап, И.М., №1коп, Β.Τ, апб Vа1кй, Р.С Сауетоик пегуе дгайк гек!оге егесб1е Гипсбоп ш бепегуа!еб га!к. I Иго1., 1991Ь, 745, 380-383.

30. КокепЬегд, М.Е. апб Б11кепкеп, Т С1ик!епп: рйукю1одю апб ра!йорйукю1одю сопк1бегабопк. 1п!. Т Вюсйет. Се11 Вю1., 1995, 27, 633-645.

31. Бйерагб, Н.М., Ьеипд, И., Б!еЬЬтд, К, апб 6оеббе1, Ό.ν. А кшд1е атто ас1б сйапде ш ШЫ-Ье!а1 аЬобкйек йк апбу1га1 асбуйу. Книге, 1981, 294, 563-565.

32. Бтйй, Т.Р. апб Vа!е^таη, М.Б. 1бепбйсабоп оГ соттоп то1еси1аг киЬкедиепсек. Т Мо1. Вю1., 1981, 147, 195-197.

33. Б!еск, АЛ., Бсйаегеп-'№1етегк, К, апб Набипд, Н.Р. Иетуебпабпд шГ1атта!огу пеигора!Ыек, шс1ибтд 6ш11ат-Вагге купбготе. Сигг 0рш №иго1., 1998, 11, 311-318.

34. Б1орр1п1, Ь., Виейк, Р.А., апб Ми11ег, И. А к1тр1е те!йоб Гог огдапо!ур1с сийигек оГ пегуоик бккие. 1 №игоксГ Ме!йобк, 1991, 37, 173-182.

35. Ббапб, Р.Ь., Ьее, Б.Т, Ьее, Т.Б., 2иссагеШ, Ь.А., Ап1опа\х1сй Р.Т, Ките, I, апб V^11^атк, К.А. №п-согбсо1гор1с АСТН рерббек тоби1а!е пегуе бехе1ортеп1 апб гедепегабоп. Вех. №игоксГ, 1993, 4, 321363.

36. Тгоидакок, 1.Р. апб 6опок, Е.Б. С1ик!епп/аро11рорго!еш 1 ш йитап адшд апб сапсег. 1п!. Т Вюсйет. Се11 Вю1., 2002, 34, 1430-1448.

37. Тксйорр, I, Сйопп, А., Негбд, Б., апб Ргепсй, Ь.Е. С1ик!епп, !йе йитап ароброрго!еш апб сотр1етеп! 1пй1Ьйог, Ьтбк !о сотр1етеп! С7, С8 Ье!а, апб !йе Ь боташ оГ С9. I 1ттипо1., 1993, 151, 2159-2165.

38. Агопоте, В., Тксйорр, I, Воигак, С., ^агб-Ьеуеид1е, I., Ргепсй, Ь.Е., апб 61аппакорои1ок, Р. 1пй1Ь1боп оГ рок!-1ксйет1с Ьгат идшу Ьу с1ик!епп оуегехргеккюп. №11 Меб., 2001, 7, 977-979.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Применение средства, обладающего активностью кластерина, которое выбрано из агониста активности кластерина, кластерина, его изоформы, мутеина, слитого белка, функционального производного, активной фракции, производного циклической перестановки, или его соли для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики периферического неврологического заболевания.
2. Применение по п.1, в котором периферическое неврологическое заболевание выбрано из группы, состоящей из травматических повреждений нервов периферической нервной системы (Р^), заболеваний, связанных с демиелинизацией Р№, периферических невропатий и периферических нейродегенеративных заболеваний.
3. Применение по п.1 или 2, где периферическое неврологическое заболевание вызвано наследственным нарушением метаболизма.
4. Применение по любому из предшествующих пунктов, где периферическое неврологическое заболевание представляет собой периферическую невропатию.
5. Применение по п.4, где периферическая невропатия представляет собой диабетическую невропа

- 27 008938 тию.
6. Применение по п.4, где периферическая невропатия представляет собой невропатию, вызванную химиотерапией.
7. Применение по любому из предшествующих пунктов, в котором кластерин выбран из группы, состоящей из:

a) полипептида, содержащего 8Е0 ΙΌ ΝΟ:1;

b) полипептида, содержащего аминокислоты с 23 по 449 из 8ЕО ΙΌ ΝΟ:1;

c) полипептида, содержащего аминокислоты с 35 по 449 из 8ЕО ΙΌ ΝΟ:1;

б) полипептида, содержащего аминокислоты с 23 по 227 из 8ЕО ΙΌ ΝΟ:1;

е) полипептида, содержащего аминокислоты с 35 по 227 из 8ЕО ΙΌ ΝΟ:1;

Г) полипептида, содержащего аминокислоты с 228 по 449 из 8ЕО ΙΌ ΝΟ:1;

д) мутеина любого из полипептидов (а)-(Г), аминокислотная последовательность которого идентична по крайней мере одной из последовательностей (а)-(Г) не менее чем на 40, или 50, или 60, или 70, или 80, или 90%;

11) мутеина любого из полипептидов (а)-(Г), закодированного последовательностью ДНК, которая гибридизуется с комплементарной областью нативной последовательности ДНК, кодирующей любой из полипептидов (а)-(Г), в умеренно жестких условиях или в высокой степени жестких условиях;

ί) мутеина любого из полипептидов (а)-(Г). в котором все изменения в аминокислотной последовательности представляют собой консервативные замещения аминокислот в аминокислотных последовательностях (а)-(Г);

_)) соли или изоформы, слитого белка, функционального производного, активной фракции или производного циклической перестановки любого из полипептидов (а)-(Г).
8. Применение по п.7, где функциональное производное содержит фрагмент РЕС.
9. Применение по п.7 или 8, где слитый белок содержит слияние с иммуноглобулином (Ι§).
10. Применение по любому из предыдущих пунктов, где лекарственное средство дополнительно содержит гепарин для одновременного, последовательного или отдельного применения.
11. Применение по любому из предыдущих пунктов, где лекарственное средство дополнительно содержит интерферон и/или остеопонтин для одновременного, последовательного или отдельного применения.
12. Применение по п.11, где интерферон представляет собой интерферон-β.
13. Применение по любому из предыдущих пунктов, где кластерин применяют в количестве приблизительно от 0,001 до 100, или приблизительно от 1 до 10, или приблизительно 5 мг/кг массы тела.
14. Применение молекулы нуклеиновой кислоты для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики периферического неврологического заболевания, где молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид, который включает в себя последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из:

a) полипептида, содержащего 8ЕО ΙΌ ΝΟ:1;

b) полипептида, содержащего аминокислоты с 23 по 449 из 8ЕО ΙΌ ΝΟ:1;

c) полипептида, содержащего аминокислоты с 35 по 449 из 8ЕО ΙΌ ΝΟ:1;

б) полипептида, содержащего аминокислоты с 23 по 227 из 8ЕО ΙΌ ΝΟ:1;

е) полипептида, содержащего аминокислоты с 35 по 227 из 8ЕО ΙΌ ΝΟ:1;

Г) полипептида, содержащего аминокислоты с 228 по 449 из 8ЕО ΙΌ ΝΟ:1;

д) мутеина любого из полипептидов (а)-(Г). аминокислотная последовательность которого идентична по крайней мере одной из последовательностей (а)-(е) не менее чем на 40, или 50, или 60, или 70, или 80, или 90%;

1) мутеина любого из полипептидов (а)-(Г). закодированного последовательностью ДНК, которая гибридизуется с комплементарной областью нативной последовательности ДНК, кодирующей любой из полипептидов (а)-(Г), в умеренно жестких условиях или в высокой степени жестких условиях;

ί) мутеина любого из полипептидов (а)-(Г). в котором все изменения в аминокислотной последовательности представляют собой консервативные замещения аминокислот в аминокислотных последовательностях (а)-(Г), или изоформы, слитого белка, функционального производного, активной фракции, или производного циклической перестановки любого из полипептидов (а)-(Г).
15. Применение по п.14, где молекула нуклеиновой кислоты дополнительно содержит последовательность вектора экспрессии.
16. Применение вектора для индуцирования и/или улучшения эндогенной выработки в клетках кластерина или агониста активности кластерина в производстве лекарственного средства для лечения и/или профилактики периферического неврологического заболевания.
17. Применение по любому из пп.14-16 для генной терапии.
18. Применение клетки, которая подверглась генетической модификации для выработки средства, обладающего активностью кластерина, которое выбрано из кластерина или агониста активности кластерина, в производстве лекарственного средства для лечения и/или профилактики периферического неврологического заболевания.

- 28 008938
19. Фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики периферического неврологического заболевания, содержащая кластерин или агонист активности кластерина, а также гепарин, необязательно вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми наполнителями.
20. Фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики периферического неврологического заболевания, содержащая кластерин или агонист активности кластерина, а также интерферон, необязательно вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми наполнителями.
21. Фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики периферического неврологического заболевания, содержащая кластерин или агонист активности кластерина, а также остеопонтин, необязательно вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми наполнителями.
22. Способ лечения периферического неврологического заболевания, включающий введение пациенту в случае необходимости эффективного количества кластерина или агониста активности кластерина, необязательно вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
23. Способ лечения периферического неврологического заболевания, включающий введение пациенту в случае необходимости эффективного количества кластерина или агониста активности кластерина, а также гепарина, необязательно вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
24. Способ лечения периферического неврологического заболевания, включающий введение пациенту в случае необходимости эффективного количества кластерина или агониста активности кластерина, а также интерферона, необязательно вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
25. Способ лечения периферического неврологического заболевания, включающий введение пациенту в случае необходимости эффективного количества кластерина или агониста активности кластерина, а также остеопонтина, необязательно вместе с фармацевтически приемлемым носителем.