EA007408B1 - Легочное введение химически модифицированного инсулина - Google Patents

Легочное введение химически модифицированного инсулина Download PDF

Info

Publication number
EA007408B1
EA007408B1 EA200301222A EA200301222A EA007408B1 EA 007408 B1 EA007408 B1 EA 007408B1 EA 200301222 A EA200301222 A EA 200301222A EA 200301222 A EA200301222 A EA 200301222A EA 007408 B1 EA007408 B1 EA 007408B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
insulin
peg
composition
polyethylene glycol
conjugate
Prior art date
Application number
EA200301222A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200301222A1 (ru
Inventor
Джон С. Пэттон
Мей-чанг Куо
Дж. Милтон Харрис
Честер Лич
Кимберли Перкинс
Блэйн Буеч
Original Assignee
Нектар Терапьютикс
Нектар Терапьютикс Ал, Корпорейшен
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Нектар Терапьютикс, Нектар Терапьютикс Ал, Корпорейшен filed Critical Нектар Терапьютикс
Publication of EA200301222A1 publication Critical patent/EA200301222A1/ru
Publication of EA007408B1 publication Critical patent/EA007408B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/28—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

В изобретении предлагаются активные, гидрофильные, модифицированные полимером производные инсулина. Производные инсулина в соответствии с одним из аспектов изобретения пригодны для введения в легкие и имеют фармакокинетические и/или фармакодинамические свойства, которые существенно улучшены по сравнению с природным инсулином.

Description

Область применения изобретения
В соответствии с настоящим изобретением предлагаются биологически активные, гидрофильные модифицированные полимером производные инсулина, предназначенные для доставки в легкие за счет ингаляции. В соответствии с настоящим изобретением предлагаются также способы приготовления и применения (введения) таких производных.
Предпосылки к созданию изобретения
Инсулин представляет собой полипептидный гормон, который вырабатывается в β-клетках поджелудочной железы здорового (не страдающего диабетом) человека. Человеческий инсулин представляет собой полипептидный гормон 51 аминокислоты с молекулярным весом около 5800 Да. Молекула инсулина образована из двух пептидных цепей (цепей А и В), имеющих одну интрасубъединичную и две интерсубъединичные дисульфидные связи. Цепь А образована из 21 аминокислоты, в то время как цепь В образована из 30 аминокислот. Две цепи инсулина образуют высоко упорядоченную структуру со множеством α-спиральных областей в обеих А и В цепях. Интересно, что изолированные цепи инсулина являются неактивными. В растворе инсулин может существовать как мономер, димер или гексамер. Инсулин является гексамерным в препаратах с высокой концентрацией, используемых для подкожной терапии, но становится мономерным при его разбавлении жидкостями тела. Инсулин является необходимым для регулирования углеводного обмена веществ за счет снижения уровней глюкозы в крови; системный дефицит инсулина вызывает диабет. Выживание диабетиков зависит от частого и длительного приема инсулина, чтобы поддерживать приемлемые уровни глюкозы в крови.
Известные в настоящее время составы инсулина обладают недостатками, которые могут приводить к серьезным медицинским осложнениям при лечении диабета. Например, стандартный цинковый препарат инсулина, который чаще всего используется диабетиками, существует в виде суспензии микрокристаллов неактивного гексамерного инсулина. Растворение микрокристаллов, которое сопровождается диссоциацией гексамера в форму активного мономера, может приводить к задержанной и индивидуально изменяемой абсорбции инсулина в кровоток (Е. Бш, е! а1., Вюсопщда!е СЬет., 8, 664-672 (1997); Т. ИсЫо, е! а1., Αάν. Эгид Ое1. Веу., 35, 289-306 (1999); К. Н1пбк, е! а1., Вюсопщда!е СЬет., 11, 195-201 (2000)). Составы инсулина также страдают физической нестабильностью, вызванной тенденцией инсулина образовывать фибриллы и нерастворимые осадки. Образование осадка создает особые проблемы в случае составов, предназначенных для использования в насосах инсулина. Составы инсулина также склонны к химической деструкции, например, к не энзиматическому дезамидированию и образованию продуктов превращения с высоким молекулярным весом, таких как ковалентные димеры инсулина (Вгапде, 1., е! а1., РБагт. Век., 9, 715-726 (1992); Вгапде, 1., е! а1., РБагт. Век., 9, 727-734 (1992)). Имеются доказательства того, что сфера иммунологических откликов на инсулин может зависеть от наличия указанных ковалентных агрегатов инсулина (ВоЬЫпк, Э.С., е1 а1., П1аЬе!ек, 36, 838-841 (1987)). Более того, даже высоко очищенный инсулин человека является слегка аллергенным. (К1т, 1Ь1б.)
Кроме отмеченных здесь выше проблем нестабильности состава, существуют также многочисленные недостатки, связанные с применяемой в настоящее время инсулиновой терапией, с точки зрения введения препарата. Инсулин чаще всего вводят за счет подкожного впрыскивания, обычно в брюшную полость или в верхнюю часть бедра. Инсулин может быть также введен внутривенно или внутримышечно. Для того чтобы поддерживать приемлемые уровни содержания глюкозы в крови, зачастую приходится вводить инсулин по меньшей мере один или два раза в день, причем при необходимости проводят и дополнительные введения инсулина. Интенсивное лечение диабета может потребовать даже еще более частых инъекций, при этом пациент контролирует уровни содержания глюкозы в крови с использованием домашнего диагностического комплекта. Отметим, что введение инсулина при помощи впрыскивания (инъекции) нежелательно по ряду соображений. Прежде всего, многим пациентам сложно и тяжело самим проводить инъекции, так часто, как это необходимо для поддержания приемлемых уровней содержания глюкозы в крови. В действительности, многие пациенты типа 2 в течение ряда лет не принимают инсулин из-за навязчивого страха (фобии) перед иглой. Такое нежелание делать инъекции может приводить к несоблюдению предписаний врача, что в наиболее серьезных случаях может представлять угрозу для жизни. Более того, системная абсорбция инсулина после подкожного впрыскивания является относительно медленной и часто составляет от 45 до 90 мин, даже если используют быстродействующие составы инсулина. Поэтому уже давно стоит задача создания альтернативных составов инсулина и нахождения путей его введения, которые исключили бы необходимость самоинъекций и могли бы обеспечить быструю системную абсорбцию инсулина.
В настоящее время уже используют различные типы составов, не предназначенных для подкожного впрыскивания, такие как оральный и назальный составы, однако, отсутствует надежная массовая система доставки инсулина оральным или назальным путем (Ра!!оп, е! а1., Αάν. Эгид ОеБуегу Веу1еетк, 1, 35 (2-3), 235-247 (1999)), главным образом по причине очень медленного и изменчивого бионакопления (Н11к!еб, 1., е! а1., П1аЬе!о1од1а 38, 680-684, (1995)). Несмотря на то, что бионакопление может быть увеличено за счет абсорбции соответствующих усилителей, следует иметь в виду, что эти агенты могут повреждать слизистую оболочку.
- 1 007408
Однако уже появились предназначенные для ингаляции составы инсулина, которые кажутся достаточно многообещающими в преодолении многих из отмеченных здесь выше проблем. Например, в патенте США № 5997848 (Рабой, с1 а1., 1пНа1с Тйегареибс 8у51сш5. 1пс.) описаны составы сухих порошков инсулина, которые (ί) являются физически и химически стабильными при комнатной температуре, и (ίί) после вдыхания (ингаляции) быстро поглощаются эпителиальными клетками альвеолярной области и через них вводятся в систему кровообращения. Описанные быстродействующие составы инсулина и способы их применения позволяют исключить необходимость тягостных самоинъекций. При проведении в течение 3 месяцев исследований эффективности было показано, что такие способы обеспечивают эквивалентный контроль глюкозы зависящих от инсулина диабетиков типа I и типа II по сравнению с подкожным впрыскиванием (Рабоп, е1 а1., Αάν. Эгид Пейуету Кеу1е№, 1, 35 (2-3), 235-247 (1999)). Однако сухие порошковые составы инсулина, описанные в патенте США № 5997848, несмотря на то, что они позволяют решить проблемы нестабильности состава и невыполнения режима пациентом, все еще требуют проведения частых (например, при каждом приеме пищи) ингаляций инсулина для того, чтобы обеспечить эквивалентный контроль уровней глюкозы. Более того, типичный режим дозирования инсулина указанного типа, основанный на быстром действии вдыхаемого инсулина, все еще требует проведения единственной инъекции длительно действующего инсулина перед отходом ко сну, для всех диабетиков типа I и некоторых диабетиков типа II. Таким образом, все еще остается необходимость в активных, растворимых, стабильных формах инсулина, которые не требуют такого частого введения, то есть в составах инсулина длительного действия, преимущественно вводимых за счет ингаляции.
Составы инсулина длительного действия в идеальном случае характеризуются очень медленным началом (вступлением в действие) и продолжительным, относительно плоским пиком действия. Известные в настоящее время впрыскиваемые составы инсулина длительного действия, например ультралент (расширенная суспензия инсулин-цинк) и суспензия протаминцинк-инсулин, являются весьма неудовлетворительными. Эти составы, которые стремятся образовать пик, а не низкую базовую концентрацию, являются непредсказуемыми и типично имеют длительность действия не более суток. Длительный период полувыведения ультралента инсулина делает затруднительным определение оптимального диапазона дозировок, а протаминцинк-инсулин используют редко по причине его непредсказуемого и продолжительного образа действия (Сообща п & Ойшап, Тйе Рйаттасо1од1са1 Вайк оГ Тйегареибск, Νίπΐΐι Еб., Нагбтап и ЫтЫтб, ебк, 1996, р. 1500). Другими впрыскиваемыми составами инсулина длительного действия, исследование которых не привело к успеху, являются составы связанного альбумином инсулина и гексамера кобальт-инсулин (НоГГтап, Α., Ζίν Ε., С1ш. РйагтасокбюЬ 33(4):285-301 (1997)).
Также было проведено исследование ряда легочных составов инсулина длительного действия. Среди них упомянем содержащий липосомы состав с большим избытком липида по сравнению с инсулином (Ыи, Т-Υ, е1 а1., Рйатт. Кек. 10, 228-232, (1993)), пористые производные поли(молочной кислоты-когликолевой кислоты) (РЬСА) частицы инсулина (Ебтатбк, Ό.Α., е1 а1., 8с1епсе 276(5320), 1868-1871 (1997)), распыленные РЬСА наносферы (Ка^акЫта, Υ., е1 а1., 1. СопбоПеб Ке1еаке, 62(1-2): 279-287 (1999)) и фосфолипидные/протаминовые составы инсулина (VаηЬеνе^, К., е1 а1., Ргос. Соп1то1 Ке1. ВюасЬ Ма1ег. 25, 261-262 (1998)). К сожалению, все эти составы оказались неудовлетворительными либо по причине низкого бионакопления, когда проводили эксперименты на мышах, либо из-за различных недостатков составов. Таким образом, существует настоятельная необходимость в оптимизации составов инсулина длительного действия, которые являются биологически активными, физически и химически стабильными, растворимыми в воде, и которые преимущественно являются мономерными. В идеальном случае такие составы преимущественно должны годиться для доставки в легкие.
Краткое изложение изобретения
В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения, предлагаются композиции инсулина для введения в кровообращение большого круга через глубокую область легких. В частности, композиции в соответствии с настоящим изобретением содержат конъюгат инсулина, ковалентно связанный с одной или несколькими молекулами не встречающегося в природе гидрофильного полимера. В соответствии с предпочтительным вариантом не встречающийся в природе гидрофильный полимер, ковалентно связанный с инсулином, представляет собой полиалкиленгликоль, такой как полиэтиленгликоль (ПЭГ), однако, все предложенные здесь варианты равным образом применимы и к другим не встречающимся в природе гидрофильным полимерам.
Как правило, конъюгат инсулин-полимер в соответствии с настоящим изобретением будет иметь улучшенные фармакокинетические и фармакодинамические свойства по сравнению с естественным инсулином, особенно при введении в легкие. В соответствии с одним из вариантов предложенные здесь конъюгаты ПЭГ-инсулин обладают хорошими абсолютными бионакоплениями, когда их вводят в легкие и в глубокую область легких. В соответствии с особым вариантом предложенный конъюгат ПЭГинсулин в соответствии с настоящим изобретением характеризуется абсолютным легочным бионакоплением, которое превышает бионакопление естественного инсулина.
Конъюгат ПЭГ-инсулин в соответствии с настоящим изобретением преимущественно характеризуется тем, что он имеет абсолютное легочное бионакопление, которое по меньшей мере в 1,5-2,0 раза больше, чем бионакопление естественного инсулина. В соответствии с наиболее предпочтительным ва
- 2 007408 риантом, конъюгат ПЭГ-инсулин в соответствии с настоящим изобретением характеризуется тем, что его абсолютное легочное бионакопление больше ориентировочно на 15%, преимущественно больше ориентировочно на 20%, а еще лучше больше ориентировочно на 30%, чем бионакопление естественного инсулина.
В соответствии с еще одним вариантом конъюгат ПЭГ-инсулин в соответствии с настоящим изобретением при его легочном введении имеет Ттах (время, которое требуется для достижения максимальной концентрации), которое по меньшей мере в 1,5 раза больше Ттах для естественного инсулина, преимущественно по меньшей мере в 2 или 3 раза больше, а еще лучше по меньшей мере в 5 раз больше Ттах для естественного инсулина.
ПЭГ для использования в конъюгатах в соответствии с настоящим изобретением может иметь различные характеристики. В соответствии с одним из вариантов настоящего изобретения порция полиэтиленгликоля в предлагаемом конъюгате ПЭГ-инсулин замкнута инертной или не химически активной терминальной группой, такой как алкоксильная группа или в особенности метоксильная группа.
В соответствии с альтернативным вариантом, порция полиэтиленгликоля в конъюгате имеет структуру, которая особенно хорошо подходит для прикрепления к инсулину и содержит линейные полиэтиленгликоли и имеющие множество ветвей или разветвленные полиэтиленгликоли. В соответствии с еще одним вариантом конъюгат ПЭГ-инсулин может содержать две монофункциональнопроизводные молекулы инсулина, взаимосвязанные при помощи диактивированного полиэтиленгликоля (инсулин-ПЭГинсулин). Альтернативно, молекула инсулина с такой структурой в виде гантели может быть дополнительно модифицирована за счет дополнительных ПЭГ.
В соответствии с другим вариантом конъюгат ПЭГ-инсулин в соответствии с настоящим изобретением содержит вилкообразный полиэтиленгликоль, имеющий разветвляющиеся доли у одного конца цепи полимера и две свободных реактивных группы (или множество из двух), связанных с разветвляющимися долями для ковалентного присоединения к инсулину. В этом варианте настоящего изобретения, разветвленная структура полиэтиленгликоля позволяет производить присоединение полимерной цепи к двум или более молекулам инсулина.
Порция полиэтиленгликоля конъюгата инсулина в соответствии с настоящим изобретением при необходимости может содержать одну или несколько распадающихся связей.
Инсулин обычно ковалентно связан с ПЭГ при помощи связующей части, расположенной у конца ПЭГ. Предпочтительными связующими частями в соответствии с настоящим изобретением являются такие, которые подходят для соединения с химически активными аминогруппами инсулина, такими как Ν-гидроксисукцинимид химически активные сложные эфиры, химически активные карбонаты, альдегиды и ацетаты.
В соответствии с еще одним вариантом ПЭГ, ковалентно связанный с инсулином в конъюгате в соответствии с настоящим изобретением, содержит ориентировочно от 2 до 300 субъединиц (ОСН2СН2), преимущественно ориентировочно от 4 до 200 субъединиц, а еще лучше от 10 до 100 субъединиц.
В соответствии с альтернативным вариантом ПЭГ, ковалентно связанный с инсулином, имеет номинальный средний молекулярный вес ориентировочно от 200 до 10000 Да. В соответствии с предпочтительным вариантом ПЭГ имеет номинальный средний молекулярный вес ориентировочно от 200 до 5000 Да. В соответствии с наиболее предпочтительным вариантом ПЭГ имеет номинальный средний молекулярный вес ориентировочно от 200 до 2000 Да или ориентировочно от 200 до 1000 Да.
В соответствии со специфическим вариантом порция инсулина в конъюгате содержит естественный инсулин человека.
В соответствии с еще одним вариантом конъюгат в композиции в соответствии с настоящим изобретением имеет чистоту более ориентировочно 90% (т.е. порция конъюгата в композиции на 90 вес.% или больше содержит один или несколько ПЭГ-инсулинов). Другими словами композиции в соответствии с настоящим изобретением характеризуются высокой степенью чистоты компонента конъюгатного инсулина, т.е. в композиции отсутствуют измеряемые количества свободных разновидностей полиэтиленгликоля и других связанных с ПЭГ загрязнений.
В соответствии с одним из вариантов композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит конъюгат, в котором инсулин ковалентно связан с ПЭГ у одного или нескольких своих аминосайтов. Инсулин, который содержится в композиции в соответствии с настоящим изобретением, может быть монозамещенным (т.е. имеющим только один ПЭГ, ковалентно связанный с ним). Особые монозамещенные конъюгаты ПЭГ-инсулина в соответствии с настоящим изобретением содержат часть полиэтиленгликоля, ковалентно прикрепленную к положению (месту) в молекуле инсулина, выбранном из группы, в которую входят Р11сВ1. 61уА1 и Ьу8В29.
В соответствии с предпочтительным вариантом часть ПЭГ ковалентно прикреплена у РйеВ 1 сайта инсулина. В соответствии с одним из вариантов, по меньшей мере около 75% В-1 Рйе сайтов инсулина ковалентно связаны с ПЭГ. В соответствии с другим вариантом, по меньшей мере около 90% В-1 Рйе сайтов инсулина ковалентно связаны с ПЭГ.
Композиции в соответствии с настоящим изобретением могут также содержать смесь моноконъюгатного и диконъюгатного ПЭГ инсулина, имеющую одну или несколько описанных выше харак
- 3 007408 теристик. Такие композиции могут дополнительно содержать триконъюгатный ПЭГ инсулин. В соответствии с альтернативным вариантом, конъюгат ПЭГ инсулина в соответствии с настоящим изобретением характеризуется скоростью протеолиза (расщепления белков), которая снижена по сравнению с не ПЭГ инсулином или природным инсулином.
Композиция в соответствии с настоящим изобретением может также содержать смесь конъюгата ПЭГ-инсулин и не химически модифицированного или природного инсулина.
Кроме того, за рамки настоящего изобретения не выходит описанная выше композиция в виде аэрозоля.
Композиции в соответствии с настоящим изобретением могут быть растворены или суспендированы в жидкости или в сухой форме и могут дополнительно содержать фармацевтически приемлемый наполнитель.
Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением предлагается биологически активный конъюгат полиэтиленгликоль-инсулин, который годится для введения за счет ингаляции в глубокую область легких.
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения в нем предлагается способ доставки конъюгата ПЭГ-инсулин млекопитающим, которые в нем нуждаются, за счет введения при помощи ингаляции композиции ПЭГ-инсулин в виде аэрозоля.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения в нем предлагается способ получения главным образом не аллергенной композиции инсулина для введения в легкие. Этот способ включает в себя операции создания ковалентной связи инсулина с одной или несколькими молекулами не встречающегося в природе гидрофильного полимера, чтобы получить описанный выше конъюгат, и введения композиции в легкие пациента за счет ингаляции, в результате чего инсулин проходит через легкие и поступает в систему кровообращения.
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения, в нем предлагается способ обеспечения продолжительного действия композиции инсулина, предназначенной для введения в легкие пациента. Этот способ предусматривает создание ковалентной связи инсулина с одной или несколькими молекулами не встречающегося в природе гидрофильного полимера, чтобы получить композицию, которая содержит конъюгат инсулин-гидрофильный полимер, и введение указанной композиции в легкие пациента за счет ингаляции. При проведении операции введения, инсулин проходит через легкие и поступает в систему кровообращения, причем повышенные уровни инсулина в крови поддерживаются по меньшей мере в течение 8 ч после введения.
Конъюгат ПЭГ-инсулин в соответствии с настоящим изобретением в виде аэрозоля, введенный при помощи ингаляции, позволяет производить лечение сахарного диабета (ΌΜ).
Указанные ранее и другие характеристики изобретения будут более ясны из последующего детального описания, данного в качестве примера, не имеющего ограничительного характера и приведенного со ссылкой на сопроводительные чертежи.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показан график скорости ферментативного гидролиза (энзиматической переработки) примерного конъюгата ПЭГ-инсулин (750-2 ПЭГ инсулин) по сравнению с контрольным не модифицированным инсулином, как это описано подробно в примере 6;
на фиг. 2 показан график средних концентраций инсулина в сыворотке после введения внутривенно примерной композиции ПЭГ инсулина (5К ПЭГ инсулин) по сравнению с контрольным не ПЭГ инсулином, как это описано подробно в примере 7;
на фиг. 3 показан график концентраций глюкозы в крови после введения внутривенно примерной композиции ПЭГ инсулина (5К ПЭГ инсулин) по сравнению с контрольным не ПЭГ инсулином, как это описано подробно в примере 7;
на фиг. 4 показан график средних концентраций инсулина в сыворотке после внутритрахеального вливания самцам крыс ПЭГ инсулина (150 мкг на животное, 5К ПЭГ инсулин) по сравнению с не ПЭГ инсулином человека (40 мкг на животное) (пример 8);
на фиг. 5 показан график средних концентраций глюкозы в крови после внутритрахеального вливания самцам крыс ПЭГ инсулина (150 мкг на животное, 5К ПЭГ инсулин) по сравнению с не ПЭГ инсулином человека (40 мкг на животное) (пример 8);
на фиг. 6 показан график средних концентраций инсулина в сыворотке после внутритрахеального вливания самцам крыс ПЭГ инсулина (750-1 ПЭГ инсулин) по сравнению с не ПЭГ инсулином человека (пример 9);
на фиг. 7 показан график средних концентраций глюкозы в крови после внутритрахеального вливания самцам крыс ПЭГ инсулина (750-1 ПЭГ инсулин) по сравнению с не ПЭГ инсулином человека (пример 9);
на фиг. 8 показан график средних концентраций инсулина в сыворотке после внутритрахеального вливания самцам крыс ПЭГ инсулина (750-1 ПЭГ инсулин, 80 и 160 мкг на животное) по сравнению с не ПЭГ инсулином человека (80 мкг на животное) (пример 10);
на фиг. 9 показан график средних концентраций глюкозы в крови после внутритрахеального влива
- 4 007408 ния самцам крыс ПЭГ инсулина (750-1 ПЭГ инсулин, 80 и 160 мкг на животное) по сравнению с не ПЭГ инсулином человека (80 мкг на животное) (пример 10);
на фиг. 10 показан график средних концентраций инсулина в сыворотке после внутритрахеального вливания самцам крыс ПЭГ инсулина (750-2 ПЭГ инсулин, 80 мкг на животное) по сравнению с не ПЭГ инсулином человека (80 мкг на животное) (пример 11);
на фиг. 11 показан график средних концентраций глюкозы в крови после внутритрахеального вливания самцам крыс ПЭГ инсулина (750-1 ПЭГ инсулин, 80 мкг на животное) по сравнению с не ПЭГ инсулином человека (80 мкг на животное) (пример 11);
на фиг. 12 показан график средних концентраций глюкозы в крови после внутритрахеального вливания самцам крыс ПЭГ инсулина (2К ПЭГ инсулин, 300 мкг на животное, 600 мкг на животное, 900 мкг на животное и 1200 мкг на животное) по сравнению с не ПЭГ инсулином человека (80 мкг на животное) (пример 12);
на фиг. 13 показан график средних концентраций инсулина в сыворотке после введения внутривенно примерной композиции ПЭГ инсулина (2К ПЭГ инсулин) по сравнению с не ПЭГ инсулином, как это описано подробно в примере 13;
на фиг. 14 показан график концентраций глюкозы в крови после введения внутривенно примерной композиции ПЭГ инсулина (2К ПЭГ инсулин) по сравнению с не ПЭГ инсулином, как это описано подробно в примере 13.
Подробное описание изобретения
Расчет, синтез и характеристики различных представительных конъюгатов ПЭГ-инсулин были оптимизированы для доставки в легкие. Несмотря на то, что приготовление молекул ПЭГ-инсулин и было описано ранее, использование ковалентного соединения ПЭГ для обеспечения продолжительного действия составов вдыхаемого инсулина не было продемонстрировано ранее. В этом отношении, перед заявителями встала задача создания конъюгатов ПЭГ-инсулин, имеющих оптимальный баланс числа, расположения, структуры и молекулярного веса ПЭГ цепей, ковалентно прикрепленных к молекуле инсулина, для того, чтобы создать композиции инсулина, которые годятся для введения в кровообращение большого круга, преимущественно через глубокую область легких. Удивительным образом в свете изложенного здесь выше, заявители открыли, что некоторые ПЭГ-модифицированные составы инсулина имеют одну или несколько из соответствующих характеристик: (ί) они являются биологически активными, т.е. имеют по меньшей мере около 5% активности естественного инсулина, или преимущественно имеют биологическую активность, которая, по меньшей мере, главным образом поддерживается на уровне активности естественного инсулина или только минимально снижается от него, или предпочтительно имеют биологическую активность, которая превышает активность естественного инсулина, (и) они поглощаются (поступают) из легких в кровоток (а не залипают в легких ), (ш) они являются физически и химически стабильными, (ίν) при введении в легкие указанных составов получают уровни в крови инсулина, которые являются повышенными относительно базового значения, по меньшей мере, через ориентировочно 8 ч после введения, (ν) они являются стойкими к энзиматической атаке со стороны разлагающих инсулин ферментов, и (νί) они имеют повышенный период полувыведения по сравнению с не ПЭГ инсулином, когда их вводят за счет ингаляции. Детали указанных характеристик будут изложены в приведенном далее описании.
I. Определения.
Далее указано значение применяемых в данном описании терминов. Следует иметь в виду, что единичный термин включает в себя и множественные формы, если специально не указано иное.
Термин инсулин включает в себя проинсулин и любой очищенный изолированный (выделенный) полипептид, имеющий, полностью или частично, первичное структурное соответствие инсулину (т.е. смежные серии радикалов аминокислоты) и по меньшей мере одно из биологических свойств встречающегося в природе инсулина. Вообще термин инсулин включает в себя природный и синтетический инсулин, в том числе его гликоформы, а также аналоги, в том числе полипептиды, имеющие одну или несколько модификаций аминокислоты (делеции, вставки или замещения), до тех пор, пока главным образом сохраняется по меньшей мере 80% или больше терапевтической активности, связанной с инсулином полной длины (ранее его химической модификации в соответствии с описанным здесь при помощи гидрофильного, не встречающегося в природе полимера). Инсулины в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены при помощи любого стандартного способа, в том числе (но без ограничения) за счет панкреатической экстракции, рекомбинантной экспрессии и синтеза полипептида ίη νΐίτο ( в пробирке).
Природными или естественными типами инсулина называют инсулин, имеющий последовательность аминокислоты, соответствующую последовательности аминокислоты инсулина, который встречается в природе. Природным или естественным типом инсулина может быть как природный (т.е. выделенный из природного источника), так и синтетический продукт.
Физиологически расщепляемой или разлагаемой связью является слабая связь, которая вступает в реакцию с водой (т. е. гидролизуется) в физиологических условиях. Предпочтительными являются связи, которые имеют период полураспада при гидролизе (при рН 8 и 25°С) ориентировочно менее 30 мин.
- 5 007408
Тенденция связи к гидролизу в воде зависит не только от общего типа сцепления двух центральных атомов, но также и от замещающих групп, прикрепленных к этим центральным атомам. Соответствующие гидролитически нестабильные или слабые связи включают в себя (но без ограничения) карбоксилат эфир, фосфат эфир, ангидриды, ацетали, кетали, асилоксиалкил эфир, имины, ортоэфиры, пептиды и олигонуклеотиды.
Гидролитически стабильной связью называют химическую связь, а обычно ковалентную связь, которая является главным образом стабильной в воде, а именно, не подвергается гидролизу в физиологических условиях в какой-либо существенной степени, в течение продолжительного периода времени. В качестве примеров гидролитически стабильных связей можно привести (но без ограничения) следующие: связи углерод - углерод (например, в алифатических цепях), эфиры, амины, уретаны и т.п. Обычно гидролитически стабильная связь имеет скорость гидролиза ориентировочно менее 1-2% в день при физиологических условиях. Скорость гидролиза представительных химических связей содержится (указана) в большинстве стандартных учебников по химии.
Используемый здесь термин ПЭГ или полиэтиленгликоль относится к любому растворимому в воде поли(алкилен оксиду). В наиболее типичном случае, ПЭГ (полиэтиленгликоли) в соответствии с настоящим изобретением имеют следующую структуру: -СН2СН2О(СН2СН2О)ПСН2СН2-, в которой концевые группы или действительная структура всей доли ПЭГ могут варьировать. Одним из широко применяемых на практике ПЭГ является закрытый на конце ПЭГ, в котором один конец ПЭГ закрыт относительно неактивной группой, а обычно алкоксигруппой, такой как метокси(-ОСН3)группа, в то время как другой конец представляет собой гидроксильную группу, которая может подвергаться химической модификации. Специфические формы ПЭГ, которые используют при приготовлении конъюгатов инсулина в соответствии с настоящим изобретением, такие как разветвленные, линейные, вилочные ПЭГ и т.п., будут описаны далее более подробно.
Термин конъюгат ПЭГ-инсулин относится к ранее определенной молекуле инсулина, имеющей ковалентно связанную или сцепленную с ней по меньшей мере одну часть полиэтиленгликоля, причем такой конъюгат обладает некоторой измеряемой степенью активности инсулина (например, ориентировочно от 2 до 100% или больше от биологической активности естественного инсулина).
Номинальный средний молекулярный вес в контексте гидрофильного, не встречающегося в природе полимера в соответствии с настоящим изобретением, такого как ПЭГ, относится к средней массе молекулы полимера, которую обычно определяют при помощи размерной эксклюзионной хроматографии, анализа светорассеяния или внутренней скорости в 1,2,4-трихлорбензоле. Полимеры в соответствии с настоящим изобретением обычно являются полидисперсными и имеют низкую полидисперсность, составляющую ориентировочно менее 1,05.
Липофильная часть представляет собой ту часть, которая прикреплена к гидрофильному полимеру в соответствии с настоящим изобретением, при помощи разлагаемой или не разлагаемой связи, и главным образом изменяет гидрофильную природу полимера и, следовательно, конъюгата полимеринсулин. Типичные липофильные группы, такие как жирные кислоты, содержат ориентировочно от 12 до 22 атомов углерода.
Главным образом не аллергенный конъюгат инсулина в соответствии с настоящим изобретением обладает пониженной аллергенностью по сравнению с природным инсулином. Аллергенность может быть определена при помощи нахождения титров антител на мышах или преимущественно на кроликах, после введения конъюгата ПЭГ инсулин, по сравнению с не модифицированным инсулином.
Алкильными называют углеводородные цепи, которые обычно имеют длину ориентировочно от 1 до 15 атомов. Углеводородные цепи преимущественно (но не обязательно) насыщены и могут при необходимости иметь связанные с ними дополнительные функциональные группы. Углеводородные цепи могут быть разветвленными или прямыми. Примерные алкильные группы содержат этил, пропил, 1метилбутил, 1-этилпропил и 3-метилпентил. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения конъюгаты, которые содержат алкилированный ПЭГ, а в частности, линейный алкилированный ПЭГ, имеют алкильную часть, которая не образована жирной кислотой и не является липофильной.
Низшей алкильной группой называют алкильную группу, которая содержит от 1 до 5 атомов углерода и может быть как прямой цепью, так и разветвленной цепью, примерами чего являются метил, этил, η-бутил, ί-бутил, ΐ-бутил.
Абсолютное легочное бионакопление представляет собой процент дозы лекарственного препарата (например, конъюгата ПЭГ-инсулин в соответствии с настоящим изобретением), поступивший в легкие, который поглощается и входит в кровоток млекопитающего, по отношению к внутривенней дозе естественного инсулина. Представительными модельными системами, позволяющими определять абсолютные легочные бионакопления, являются крысы, собаки, кролики и обезьяны. Вдыхаемые композиции ПЭГ-инсулин в соответствии с настоящим изобретением характеризуются в соответствии с одним аспектом тем, что их абсолютное легочное бионакопление составляет по меньшей мере около 20% в плазме или в крови, причем абсолютное легочное бионакопление обычно составляет ориентировочно от 10 до 30% или больше. Обычно, в зависимости от специфической природы конъюгата ПЭГ-инсулин, конъюгат
- 6 007408 в соответствии с настоящим изобретением имеет абсолютное легочное бионакопление по меньшей мере около одного из следующих значений: 10, 12, 15, 18, 20, 22, 25, 30, 32, 35% или больше. Абсолютное легочное бионакопление может быть определено путем измерения абсорбции в результате прямого внутритрахеального введения и вливания или за счет ингаляции композиции конъюгата ПЭГ-инсулин.
Фазой распределения по отношению к периоду полувыведения конъюгата ПЭГ-инсулин называют начальную быструю фазу, в ходе которой инсулин исчезает из плазмы. Конечной медленной фазой или фазой удаления периода полувыведения называют медленную фазу, в течение которой инсулин удаляется из тела.
Термин продолжительное действие инсулина относится к инсулину, который обладает действием (т.е. имеет повышенные уровни в крови по сравнению с базой), составляющим по меньшей мере около 6 ч, а преимущественно по меньшей мере около 8 ч.
Выражение уровни глюкозы, которые подавлены, относится к уровням глюкозы в крови (например, после введения конъюгата ПЭГ-инсулин в соответствии с настоящим изобретением), которые опускаются ниже базы или базовых уровней.
Фармацевтически приемлемой солью считают (но без ограничения) соли аминокислот, соли, приготовленные из неорганических кислот, такие как хлорид, сульфат, фосфат, дифосфат, гидробромид и нитрат, или соли, приготовленные из органических кислот, такие как малат, малеат, фумарат, тартрат, сукцинат, этилсукцинат, цитрат, ацетат, лактат, метансульфонат, бензоат, аскорбат, паратолуолсульфонат, пальмоат, салицилат и стеарат, а также эстолат, глюцептат и лактобионат. Аналогично, солями, которые содержат фармацевтически приемлемые катионы, считают (но без ограничения) соли натрия, калия, кальция, магния, алюминия, лития и аммония (в том числе замещенного аммония).
Аминокислотой называют любую кислоту, которая содержит аминогруппу и группу карбоновой кислоты. Несмотря на то, что аминогруппа чаще всего располагается в положении, смежном с карбоксильной функцией, аминогруппа может находиться и в любом другом положении внутри молекулы. Аминокислота может также содержать дополнительные функциональные группы, такие как амино, тио, карбоксильные, карбоксамидные, имидазольные и т. п. Аминокислота может быть синтетической или встречающейся в природе, и может быть использована в ее рацемических или оптически активных (Ό-, или Ь-) формах, имеющих различные соотношения энантиомеров.
Пептиды образованы из двух или нескольких аминокислот, соединенных пептидной связью. Пептиды могут быть гомо- или гетеропептидами (т. е. могут быть образованы из идентичных или различных радикалов аминокислот, в соответствии с приведенным выше определением), и могут иметь переменную длину от двух аминокислот до нескольких сот аминокислот.
Сухим порошком называют порошковую композицию, которая обычно имеет ориентировочно менее 10% влаги.
Композицией, которая годится для доставки в легкие, называют композицию, которую можно распылять в виде аэрозоля, и которую может вдыхать пациент, в результате чего порция частиц аэрозоля проходит в легкие и проникает в нижние дыхательные пути и альвеолы. Такую композицию считают вдыхаемой или подходящей для ингаляции.
Аэрозольными частицами являются жидкие или твердые частицы, которые взвешены в газе, обычно в результате действия (или срабатывания) устройства для ингаляции, такого как ингалятор сухого порошка, пульверизатор, ингалятор контролируемый дозы или распылитель.
Выпущенной дозой или ΕΌ называют подачу (выпуск, доставку) состава лекарственного средства от подходящего ингалятора после его срабатывания. Более конкретно, для составов сухих порошков, ΕΌ является мерой доли порошка в процентах, которая выводится из упаковки единичной дозы и выпускается из наконечника ингалятора. ΕΌ определяют как отношение выпущенной из ингалятора дозы к номинальной дозе (т.е. к массе порошка в единичной дозе, которая была помещена в соответствующий ингалятор до начала его использования). ΕΌ представляет собой параметр, который определяют экспериментально, обычно ίη-νίΐτο, с использованием устройства, которое имитирует получение дозы пациентом. Для определения значения ΕΌ, номинальную дозу сухого порошка, обычно в виде единичной дозы, помещают в подходящий ингалятор сухого порошка (например, такой, как описан в патенте США № 5785049, держатель патента фирма 1пПа1с ТйетареиЦс Зуйешк), а затем ингалятор приводят в действие и распыляют порошок. Полученное облако аэрозоля при помощи вакуума всасывают через тарированный фильтр, прикрепленный к наконечнику ингалятора. Количество порошка, которое осаждается на фильтре, и представляет собой выпущенную дозу. Например, если при введении 5 мг дозы сухого порошка в ингалятор, за счет распыления порошка получают 4 мг порошка на указанном тарированном фильтре, то тогда выпущенная доза для данной композиции сухого порошка равна: 4 мг (доставленная доза)/5 мг (номинальная доза) х 100 = 80%. Для не однородных порошков значения ΕΌ являются индикацией скорее доставки лекарственного средства от ингалятора после его срабатывания, а не доставки сухого порошка, причем эти значения основаны скорее на количестве лекарственного средства, а не на полном весе порошка. Аналогично, для ΜΌΙ и распыляемых лекарственных форм, ΕΌ соответствует проценту лекарственного средства, который отобран из лекарственной формы и выходит из наконечника ингалятора.
- 7 007408
Дозу мелких частиц или ΡΡΌ определяют как массовый процент частиц порошка, имеющих аэродинамический диаметр менее чем 3,3 мкм; обычно ΡΡΌ находят за счет измерения при помощи каскадного импактора Андерсена. Этот параметр служит индикацией процента частиц, имеющих самый большой потенциал для проникновения в глубокую область легких пациента, для того, чтобы произошло системное поглощение лекарственного средства.
Диспергируемым или дисперсным порошком называют порошок, имеющий значение ΕΌ, составляющее по меньшей мере около 30%, преимущественно 40-50%, а еще лучше по меньшей мере около 50-60% или больше.
Массовый медианный диаметр или ΜΜΌ служит мерой среднего размера частиц, так как порошки в соответствии с настоящим изобретением обычно являются полидисперсными (т.е. содержат диапазон размеров частиц). Указанные здесь значения ΜΜΌ определены при помощи осаждения центрифугированием, однако, следует иметь в виду, что для измерения среднего размера частиц могут быть использованы любые обычно применяемые виды техники (например, электронная микроскопия, анализ светорассеяния, лазерная дифракция).
Массовый медианный аэродинамический диаметр или ΜΜΆΌ служит мерой аэродинамического размера диспергированных частиц. Аэродинамический диаметр, который используют для описания аэрозольного порошка в терминах его поведения при осаждении, является диаметром сферы единичной плотности, имеющей такую же скорость осаждения в воздухе, что и частица. Аэродинамический диаметр учитывает форму частицы, плотность и физический размер частицы. Используемый здесь термин ΜΜΆΌ относится к середине или к медиане распределения аэродинамических частиц по размерам, причем его определение проводят при помощи каскадного импактора, если не указано иное.
Фармацевтически приемлемый наполнитель или носитель обозначает наполнитель, который при необходимости может быть введен в композиции в соответствии с настоящим изобретением. Предпочтительными для композиций, предназначенных для ингаляции, являются наполнители, которые при поступлении в легкие не создают существенных вредных токсикологических эффектов для пациента, в особенности для легких пациента.
Фармацевтически эффективное количество или физиологически эффективное количество представляет собой количество конъюгата ПЭГ-инсулин, присутствующее в описанной здесь терапевтической композиции, которое необходимо для обеспечения желательного уровня инсулина в кровотоке, чтобы в результате получить заданный уровень глюкозы в крови. Точное количество зависит от множества факторов, например, от особенностей конъюгата ПЭГ-инсулин, использованного устройства доставки, компонентов и физических характеристик терапевтической композиции, ожидаемой популяции пациентов, особенностей пациентов и т.п., и может быть определено специалистами в данной области на основании представленной здесь информации.
II. Гидрофильные, не встречающиеся в природе конъюгаты полимер-инсулин.
Было приготовлено несколько примерных конъюгатов ПЭГ-инсулин в соответствии с настоящим изобретением. Несмотря на то, что полиэтиленгликоль представляет собой предпочтительный полимер для использования в конъюгатах в соответствии с настоящим изобретением, могут быть также применены и другие растворимые в воде, гидрофильные, не встречающиеся в природе полимеры. Среди таких других полимеров, которые подходят для использования в изобретении, можно указать поливинилпирролидон, поливиниловый спирт, полиакрилоилморфолин, полиоксазолин, а также поли(оксиэтилированные полиолы), такие как поли(оксиэтилированный глицерин), поли(оксиэтилированный сорбит) и поли(оксиэтилированная глюкоза). Могут быть также использованы полимеры, которые содержат субъединицы или блоки субъединиц, выбранные из указанных выше растворимых в воде полимеров. Кроме того, могут быть использованы сополимеры полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля. Полимеры в соответствии с настоящим изобретением преимущественно не содержат групп жирных кислот или других липофильных частей.
В следующем разделе показано, что при тщательном выборе одной или нескольких частей ПЭГ, реагентов для образования ПЭГ, сайтов соединения инсулина с ПЭГ, условий образования ПЭГ и при последующей очистке конъюгата могут быть получены композиции ПЭГ-инсулин с желательными клиническими свойствами (с улучшенными фармакокинетическими и/или фармакодинамическими свойствами). Теперь будут рассмотрены специфические характеристики конъюгатов ПЭГ-инсулин в соответствии с настоящим изобретением.
А. Структурные характеристики полимера и полученного конъюгата.
Конъюгат ПЭГ-инсулин в соответствии с настоящим изобретением обычно содержит одну или несколько ПЭГ цепей, каждая из которых имеет молекулярный вес в диапазоне ориентировочно от 200 до 40000 Да, а преимущественно в диапазоне ориентировочно от 200 до 10000 Да. ПЭГ для использования в соответствии с настоящим изобретением будет иметь средний молекулярный вес в одном из следующих диапазонов: ориентировочно от 200 до 10000 Да, ориентировочно от 200 до 7500 Да, ориентировочно от 200 до 6000 Да, ориентировочно от 200 до 5000 Да, ориентировочно от 200 до 3000 Да, ориентировочно от 200 до 2000 Да и ориентировочно от 200 до 1000 Да. Примерные конъюгаты, приготовленные с ПЭГ, имеющими молекулярный вес 5000, 2000 и 750 Да, приведены в примерах 1-4.
- 8 007408
Предпочтительные конъюгаты ПЭГ-инсулин, предназначенные для введения в легкие, содержат часть (составляющую) ПЭГ, имеющую молекулярный вес ориентировочно менее чем 5000 Да, преимущественно ориентировочно менее чем 2000 Да, а еще лучше ориентировочно менее чем 1000 Да. В одном из конкретных вариантов настоящего изобретения конъюгат ПЭГ-инсулин содержит часть ПЭГ, имеющую один из следующих средних молекулярных весов: 200, 300, 400, 500, 600, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000 или 5000. Более высокий молекулярный вес ПЭГ может быть в некоторых случаях менее предпочтительным из-за возможной потери активности молекулы инсулина или, при легочных применениях, снижения эффективности пересечения легких (пример 8).
Несмотря на то, что более низкий молекулярный вес ПЭГ может быть предпочтительным для увеличения бионакопления, высокий молекулярный вес цепей ПЭГ, например, средний молекулярный вес 5000, 10000, 15000, 20000, 25000, 30000 или 40000 Да или больше, хотя обычно и снижает бионакопление естественного инсулина, может быть предпочтительным для увеличения периода полувыведения, особенно в случае впрыскиваемых составов. Можно сказать, что существенное улучшение фармакокинетических параметров, например площади под кривой (АИС), для ПЭГ инсулина с высоким молекулярным весом (по сравнению с природным инсулином), может больше чем компенсировать его уменьшенную активность.
В терминах числа субъединиц, ПЭГ для использования в соответствии с настоящим изобретением типично содержит число (ОСН2СН2) субъединиц в одном из следующих диапазонов: от 2 до ориентировочно 900 субъединиц, ориентировочно от 4 до 200 субъединиц, ориентировочно от 4 до 170 субъединиц, ориентировочно от 4 до 140 субъединиц, ориентировочно от 4 до 100 субъединиц, ориентировочно от 10 до 100 субъединиц, ориентировочно от 4 до 70 субъединиц, ориентировочно от 4 до 45 субъединиц и ориентировочно от 4 до 25 субъединиц.
Конъюгат ПЭГ-инсулин в соответствии с настоящим изобретением может быть монозамещенным (т.е. может иметь ПЭГ, прикрепленный к единственному реактивному сайту инсулина) дизамещенным (т.е. может иметь части ПЭГ, прикрепленные к двум реактивным сайтам), тризамещенным или даже может иметь прикрепление полимера к более чем трем сайтам в молекуле инсулина. Монозамещенный, дизамещенный и тризамещенный инсулин относится также соответственно к ПЭГ мономеру, димеру и тримеру. Однако мультизамещенный инсулин (т.е. инсулин, имеющий части ПЭГ, ковалентно присоединенные к 2 или нескольким сайтам инсулина) обычно (но не обязательно) имеет такие же части ПЭГ, прикрепленные к каждому реактивному сайту. Таким образом, композиции ПЭГ-инсулин могут иметь несколько типов частей ПЭГ, прикрепленных к инсулину. Предпочтительными композициями в соответствии с настоящим изобретением являются композиции, которые главным образом содержат мономерные и/или димерные конъюгаты инсулина. Удивительным образом оказалось, что композиции ПЭГинсулин, которые не являются сайт-специфическими (т.е. содержат смесь разновидностей ПЭГ-инсулин, имеющую ПЭГ, ковалентно связанный с несколькими реактивными сайтами), обладают более высокими фармакокинетическими и фармакодинамическими свойствами по сравнению с природным инсулином, в частности, при введении в легкие (пример 11).
Что касается положения ПЭГ-замещения, то молекула инсулина имеет множество сайтов, подходящих для присоединения ПЭГ, причем амино сайты являются обычно (но не обязательно) наиболее предпочтительными. Специфическими аминогруппами инсулина, подходящими для присоединения ПЭГ, являются два Ν-конца, С1уА1 и Р11сВ1. а также Ьу&В29. Эти сайты в молекуле инсулина также просто называют соответственно как А1, В1 и В29. Электрофильно активированными ПЭГ, предназначенными для использования при соединении с реактивными аминогруппами в молекуле инсулина, являются тРЕС2-АЬП, шРЕС-сукцинимидил пропионат, шРЕС-сукцинимидил бутаноат, шРЕС-СМ-ΗΒΑ-ΝΗΑ, шРЕС-бензотриазол карбонат, тРЕС-ацетальдегид диэтил ацеталь, и т.п. (8йеагтеа!ег Согрогайои, ΗιιπΙδуй1е, А1аЬата).
Композиция в соответствии с настоящим изобретением, может, в соответствии с одним из вариантов, содержать преимущественно (более чем 90%) монозамещенного инсулина, например, моно-А1 инсулина, моно-В1 инсулина или моно-В29 инсулина. Такие композиции могут содержать: ί) моно-А1 инсулин, и) смесь моно-А1 инсулина и моно-В1 инсулина, или ш) смесь моно-А1, моно-В1 и моно-В29 инсулина. Альтернативно, композиция в соответствии с настоящим изобретением может содержать главным образом дизамещенный инсулин, например ди-А1,В1-инсулин, или ди-А1,29-инсулин, или диВ1,В29-инсулин, или любую их комбинацию.
Альтернативно, композиция в соответствии с настоящим изобретением может содержать смесь различных конъюгатов ПЭГ-инсулин (т.е. ПЭГ может быть прикреплен к любой одной комбинации возможных сайтов присоединения). Если использовать в качестве примера амино сайты молекулы инсулина, то композиция в соответствии с настоящим изобретением может содержать один или несколько из следующих конъюгатов ПЭГ-инсулин: моноА1-ПЭГ инсулин, моно-В1-инсулин, моно-В-29-инсулин, диА1,В1-инсулин, ди-А1,В29-инсулин, ди-В1,В29-инсулин, или три-А1,В1,В29-инсулин. В соответствии с одним из вариантов предпочтительными являются такие композиции, которые преимущественно содержат мономеры и димеры.
Представительные композиции могут содержать смеси конъюгатов ПЭГ-инсулин, которые содер
- 9 007408 жат по меньшей мере около 75% комбинированных мономера и димера, по меньшей мере около 80% комбинированных мономера и димера или по меньшей мере ориентировочно от 85 до 90% комбинированных мономера и димера (например, как в примерах 5 и 6).
РНсВ1 является особенно предпочтительным сайтом для химической модификации за счет прикрепления ПЭГ. В частности, композиция конъюгата ПЭГ-инсулин для использования в соответствии с настоящим изобретением может быть также охарактеризована в соответствии с одним из вариантов, как композиция, в которой по меньшей мере около 70% В-1 сайтов в молекуле инсулина ковалентно связаны с ПЭГ, вне зависимости от полного числа разновидностей ПЭГ-инсулин в композиции (см., например, табл. 3А, пример 5). Альтернативными вариантами являются такие, в которых по меньшей мере около 75% В-1 сайтов в молекуле инсулина ковалентно связаны с ПЭГ, или в которых по меньшей мере около 80% В-1 сайтов в молекуле инсулина ковалентно связаны с ПЭГ, или в которых по меньшей мере около 90% В-1 сайтов в молекуле инсулина ковалентно связаны с ПЭГ.
С удивлением заявители обнаружили, что случайные смеси ПЭГ-инсулин (приготовленные за счет случайного прикрепления ПЭГ, а не за счет направленного прикрепления ПЭГ к определенным сайтам), при введении в легкие, в результате создают повышенные уровни инсулина в крови, которые поддерживаются после введения по меньшей мере 6 ч, а обычно по меньшей мере 8 ч или больше. Такие смеси являются предпочтительными не только по причине их благоприятных фармакокинетических и фармакодинамических свойств, но и потому, что их синтез намного проще (не требует проведения множества операций синтеза, не требует использования защитных групп, не требует проведения множества операций очистки и т.п.), чем синтез при сайт-специфическом подходе.
Альтернативными сайтами в молекуле природного инсулина, которые могут быть химически модифицированы за счет ковалентного присоединения ПЭГ, являются следующие: 2С-концы, Агд22В, Н1810В, Нк5А, б1и4А, б1и17А, б1и13В и С1и21В.
В дополнение к природному инсулину, могут быть использованы не природные инсулины, имеющие одно или несколько замещений, инсерций или делеций аминокислоты, при этом появляются дополнительные сайты для химической модификации за счет прикрепления одной или нескольких частей ПЭГ. Этот вариант в соответствии с настоящим изобретением особенно полезен для введения дополнительных, заказных ПЭГ сайтов в молекулу инсулина, например, для образования ПЭГ-инсулина, имеющего повышенную стойкость к ферментному разложению. Такой подход обеспечивает повышенную гибкость в проектировании оптимизированного конъюгата инсулина, имеющего желательный баланс активности, стабильности, растворимости и фармацевтических свойств. Несмотря на то, что мутации могут быть осуществлены (например, за счет сайт-специфического мутагенеза) в любом числе положений внутри молекулы инсулина, предпочтительным является вариант инсулина, в котором любая одна из первых четырех аминокислот в В-цепи замещена цистеиновым радикалом. Затем такие цистеиновые радикалы могут вступать в реакцию с активированным ПЭГ, который является специфическим для реакции с тиоловыми группами, например, с Ν-малеимидил полимером или другой производной, как это описано в патенте США № 5739208 и в публикации АО 01/62827. Примерными сульфгидрил-избирательными ПЭГ для использования в этом конкретном варианте в соответствии с настоящим изобретением являются тРЕб-вильчатый малеимид (тРЕб(МАЕ)2), тРЕб2-вильчатый малеимид (тРЕб2(МАЕ)2), тРЕбмалеимид (шРЕб-МАЕ) и тРЕб2-малеимид (шРЕ62-МАЕ) (811еаг\\Шег Сотротайои). Эти активированные ПЭГ имеют следующие структуры: тРЕб-СОNНСН[СН2СОNН(СН2СН2О)2СН2СН2-МА^], тРЕб2лизин^Н-СН[СН2СО1\1Н(СН2СН2О)2СН2СН2-МАЕ]2, тРЕб-МАБ и тРЕб2-лизин-NНСН2СН2NНС(О)СН2СН2МА^ соответственно.
При необходимости дополнительные мутации последовательности природного инсулина могут быть использованы для повышения биоактивности конъюгата ПЭГ-инсулин, биологическая активность которого несколько снизилась в результате присоединения ПЭГ. Одной из таких мутаций является ТЬт8 в НЕ8. Дополнительные мутации описаны, например, в журнале Э|аЬс1с5 Саге, 13 (9), (1990).
ПЭГ для использования в соответствии с настоящим изобретением могут иметь различные структуры: линейную, вильчатую, разветвленную, гантельную и т.п. Обычно ПЭГ активирован соответствующей активирующей группой, подходящей для соединения с желательным сайтом или сайтами в молекуле инсулина. Активированный ПЭГ будет иметь реактивную группу на конце для реакции с инсулином. Используемый здесь термин связующее звено включает в себя активирующую группу, расположенную у конца ПЭГ для реакции с инсулином, и может, кроме того, включать в себя дополнительные (обычно инертные) атомы, расположенные между частями ПЭГ полимера и активированной группой на конце, что облегчает приготовление активированного ПЭГ. Связующее звено может иметь любое число атомов, однако предпочтительные звенья содержат метилены, введенные между основной цепью ПЭГ и конечной активирующей группой, например, как в тРЕб-сукцинимидил пропионате, тРЕб-бутаноате. Представительные активированные производные ПЭГ и способы конъюгирования этих агентов с лекарственными средствами, такими как инсулин, известны сами по себе и описаны, например, в публикации Ζα1ίρкку, 8., е! а1., Ике о£ Еипейопай/ек Ро1у (Е!1у1епе б1уеок) £от МокШсайоп о£ Ро1урерйкк ίη Ро1уе!1у1епе б1усо1 СЬеткйу: Вю!есЬшса1 и Вютекка1 Аррйсайопк, ί. М. Натк, Р1епц§ Ргекк, №\ν Уогк (1992), апк ίη Акуапсек Эгид Веу1е^8, 16:157-182 (1995).
- 10 007408
В соответствии с особым вариантом настоящего изобретения, в порции ПЭГ конъюгата отсутствует одна или несколько липофильных групп, эффективных для существенного изменения растворимой в воде природы полимера или конъюгата полимер-инсулин. Другими словами, полимер или не инсулиновая порция конъюгата в соответствии с настоящим изобретением может иметь группу атомов, считающихся более липофильными, чем гидрофильными (например, углеродную цепь, содержащую ориентировочно от 2 до 8-12 атомов углерода), однако, если наличие такой группы или групп недостаточно для существенного изменения гидрофильной природы полимера или конъюгата, то тогда такой компонент может содержаться в конъюгатах в соответствии с настоящим изобретением. Другими словами, сам конъюгат инсулина в соответствии с настоящим изобретением характеризуется скорее как гидрофильный, а не как липофильный или амфифильный. Обычно полимерная часть конъюгата инсулина, ранее ее соединения с инсулином, вне зависимости от того, содержит он такую легко объединяющуюся с липидом (1ίρίά-1ονίη§) группу или нет, будет иметь высокий показатель (число) гидрофильного/липофильного баланса (НЬВ). Показатель НЬВ основан на весовом проценте каждого типа группы (гидрофильной или липофильной) в молекуле и обычно имеет значения в диапазоне ориентировочно от 1 до 40. Полимер для использования в конъюгатах в соответствии с настоящим изобретением в целом характеризуется как гидрофильный, вне зависимости от наличия одной или нескольких легко объединяющихся с липидом замещающих групп. В соответствии с одним из вариантов настоящего изобретения, порция полимера конъюгата полимеринсулин характеризуется числом НЬВ свыше 25, преимущественно свыше 30, а еще лучше свыше 35. В некоторых вариантах настоящего изобретения, в которых такой липофильный компонент может присутствовать, этот компонент преимущественно не расположен у конца ПЭГ цепи.
Разветвленные ПЭГ для использования в конъюгатах в соответствии с настоящим изобретением соответствуют описанным в публикации \УО 96/21469. Обычно разветвленные ПЭГ соответствуют формуле В(РЕО-ОН)п, в которой В отображает центральное ядро молекулы, а η равно числу ветвей. Разветвленные ПЭГ имеют центральное ядро, от которого отходят 2 или несколько ПЭГ ветвей. В разветвленной конфигурации, разветвленное полимерное ядро имеет единственный реактивный сайт для прикрепления к инсулину. Разветвленные ПЭГ для использования в соответствии с настоящим изобретением обычно имеют менее четырех ПЭГ ветвей, а преимущественно менее трех ПЭГ ветвей. Преимуществом разветвленных ПЭГ является наличие единственного реактивного сайта, сочлененного с большим, более плотным полимерным облаком, чем в случае линейных ПЭГ. Один из особых типов разветвленного ПЭГ может быть представлен как (МеО-РЕО-)рВ-Х, где р равно 2 или 3, В представляет собой структуру центрального ядра, такую как лизин или глицерин, имеющую прикрепленные к ней 2 или 3 ветви ПЭГ, а X представляет собой любую подходящую функциональную группу, которая активирована или может быть активирована для соединения с инсулином. Особенно предпочтительным разветвленным ПЭГ является шРЕО2-ХН8 (811еаг\\Щег Согрогайоп, Л1аЬаша), имеющий структуру шРЕО2-лизин-сукцинимид.
В еще одной разветвленной архитектуре подвесной ПЭГ имеет реактивные группы для протеинового соединения, размещенные скорее вдоль основной цепи ПЭГ, а не на конце цепей ПЭГ, как в предыдущем примере. Реактивные группы, которые отходят (тянутся) от основной цепи ПЭГ для соединения с инсулином, могут быть такими же или иными. Структуры подвесных ПЭГ могут быть использованы, однако они являются менее предпочтительными, в особенности в случае композиций для ингаляции.
Альтернативно, порция ПЭГ конъюгата ПЭГ-инсулин может иметь вильчатую структуру с разветвленными частями у одного конца полимерной цепи и две свободные реактивные группы (или любое кратное 2), связанные с разветвленными частями для прикрепления к инсулину. Примерные вильчатые ПЭГ описаны в публикации XVО 99/45964. Вильчатый полиэтиленгликоль при необходимости может содержать алкильную или В группу на противоположном конце полимерной цепи. Более конкретно, вильчатый конъюгат ПЭГ-инсулин в соответствии с настоящим изобретением имеет формулу: В-РЕОЬ(У-инсулин)п, где В представляет собой алкил, Ь представляет собой гидролитически стабильную точку ветви, Υ представляет собой связующую группу, которая обеспечивает химическую связь вильчатого полимера с инсулином, а η является кратным 2. Ь может быть единственной группой ядра, такой как -СН-, или может содержать более длиные цепи атомов. Примерные Ь группы содержат лизин, глицерин, пентаэритритол или сорбит. Обычно конкретным атомом ветви в разветвленной части является углерод.
В особом варианте настоящего изобретения, связь вильчатого ПЭГ с молекулой инсулина, (Υ), является гидролитически стабильной. В соответствии с предпочтительным вариантом, η равно 2. Подходящие Υ компоненты, ранее конъюгации с реактивным сайтом инсулина, содержат (но без ограничения) активные эфиры, активные карбонаты, альдегид, изоцианаты, изотиоцианаты, эпоксиды, спирты, малеимиды, винилсульфоны, гидразиды, дитиопиридины и иодацетамиды. Выбор подходящей активирующей группы зависит от намеченного сайта прикрепления в молекуле инсулина и легко может быть определен специалистами в данной области.
Соответствующей Υ группой в полученном конъюгате ПЭГ-инсулин будет та, которую получают в результате реакции активированного вильчатого полимера с подходящим реактивным сайтом в инсулине. Специфическая идентичность такой финальной связи легко может быть определена специалистами в данной области. Например, если реактивный вильчатый ПЭГ содержит активированный эфир, такой как
- 11 007408 сукцинимидный или малеимидный эфир, то конъюгация при помощи амино сайта в инсулине приводит к образованию соответствующей амидной связи. Эти особые вильчатые полимеры являются особенно привлекательными, так как они позволяют получать конъюгаты, имеющие молярное отношение инсулина к ПЭГ, составляющее 2:1 или больше. Такие конъюгаты с меньшей вероятностью блокируют приемный сайт инсулина, но все еще обеспечивают гибкость проектирования, позволяющую защитить инсулин от ферментного разложения, например, за счет воздействии разлагающего инсулин фермента.
В родственном варианте, вильчатый конъюгат ПЭГ-инсулин в соответствии с настоящим изобретением представлен формулой: В-[РЕ6-Т(У-инсулин)2]п. В этом случае Р отображает структуру центрального ядра, имеющую прикрепленный к ней по меньшей мере один конъюгат ПЭГ-диинсулин. Более точно, предпочтительными вильчатыми полимерами в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения являются такие полимеры, в которых п выбрано из группы, в которую входят 1, 2, 3, 4, 5 и 6. Примерные Р структуры центрального ядра могут быть также производными от лизина, глицерина, пентаэритритола или сорбита.
В соответствии с альтернативным вариантом, в любой из рассмотренных здесь представительных структур, химическая связь между инсулином и точкой ветвления полимера может быть разлагаемой (т.е. гидролитически нестабильной).
Альтернативно, одна или несколько разлагаемых связей могут иметься в основной цепи полимера, чтобы позволить генерацию ίη νίνο конъюгата ПЭГ-инсулин, имеющего меньшую цепь ПЭГ, чем в первоначально введенном конъюгате. Такая возможная характеристика конъюгата полимера может быть обеспечена за счет дополнительного управления окончательными желательными фармакологическими свойствами конъюгата после его введения. Например, может быть введен большой и относительно инертный конъюгат (т.е. имеющий одну или несколько цепей ПЭГ с высоким молекулярным весом, прикрепленных к нему, например одну или несколько цепей ПЭГ с молекулярным весом более ориентировочно 10000, причем конъюгат главным образом не имеет биоактивности), который затем гидролизуется в легких или в кровотоке и генерирует биологически активный конъюгат, имеющий часть первоначально присутствующей ПЭГ цепи. За счет этого, свойства конъюгата ПЭГ-инсулин могут быть в некоторой степени более эффективно подогнаны. Например, абсорбция исходного полимерного конъюгата может быть медленной при первоначальном введении, осуществляемом преимущественно (но не обязательно) за счет ингаляции. За счет ίη-νίνο расщепления гидролитически разлагаемой связи, освобождается либо свободный инсулин (в зависимости от положения разлагаемой связи), либо инсулин, имеющий небольшую прикрепленную к нему полиэтиеновую метку, который легче поглощается в легких и/или в крови.
В соответствии с одной из характеристик этого варианта настоящего изобретения, неповрежденный полимер-конъюгат, ранее гидролиза, минимально разлагается при введении, так что гидролиз разлагаемой связи приводит к медленной скорости освобождения активного инсулина в кровоток, в отличие от ферментного разложения инсулина ранее его поступления в кровообращение большого круга.
Соответствующие физиологически разлагаемые связи включают в себя (но без ограничения) эфир, карбонат эфир, карбонат, сульфат, фосфат, ацилоксиалкил эфир, ацеталь и кеталь. Такие конъюгаты будут обладать физиологически разлагаемой связью, которая является стабильной при хранении и при введении. Например, конъюгат ПЭГ-разлагаемая связь-инсулин будет сохранять свою целостность при изготовлении окончательной фармацевтической композиции, при растворении в соответствующем средстве доставки, если его используют, и при введении вне зависимости от пути введения.
Более конкретно, как это описано выше в общем виде, конъюгаты ПЭГ-инсулин, имеющие биоразлагаемые связи и полезные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть представлены следующими структурами: РЕС1-^-РЕС2-инсулин (где РЕС1 и РЕС2 могут быть одинаковыми или различными) или РЕС-^-инсулин, где отображает слабую, биоразлагаемую связь. Эти конъюгаты содержат ветви ПЭГ или участки ветвей ПЭГ, которые могут быть удалены (т.е. разложены) ίη-νίνο. Эти особые модифицированные инсулины являются главным образом биологически не активными в неповрежденном состоянии либо за счет размера неповрежденной части ПЭГ молекулы, либо за счет стерической блокировки активных сайтов в молекуле инсулина при помощи цепи ПЭГ. Однако такие конъюгаты разлагаются при физиологических условиях и выделяют инсулин или биологически активный ПЭГинсулин, который может поглощаться (может быть введен) в кровообращение большого круга, например, из легких. В первой примерной структуре порция РЕС1 может иметь любую из обсуждавшихся различных структур, и обычно имеет молекулярный вес по меньшей мере около 10000 Да, так что конъюгат не поглощается быстро после введения. Порция ПЭГ2 молекулы обычно имеет молекулярный вес ориентировочно менее 5000 Да, преимущественно менее 2000 Да, а еще лучше, менее 1000 Да. Что касается второй примерной структуры, РЕС-\У-инсулин, то порция РЕС обычно имеет молекулярный вес по меньшей мере около 10000 Да или больше.
В соответствии с еще одним специфическим вариантом настоящего изобретения конъюгат ПЭГинсулин имеет гантельную структуру, в которой две части инсулина взаимосвязаны при помощи центрального ПЭГ. Более конкретно, такие конъюгаты могут быть представлены структурой инсулин-ΥРЕС-2-инсулин, где Υ и Ζ представляют собой гидролически стабильные связующие группы, соединяющие инсулин с частями ПЭГ. В особом варианте Ζ представляет собой активированный сульфон,
- 12 007408 который ранее конъюгации подходит (годится) для реакции с тиоловыми группами инсулина (например, с цистеинами). Альтернативно, Υ и Ζ могут быть любой группой, подходящей для ковалентной связи с инсулином. Дополнительные примеры приведены в патенте США № 5900461, который включен в данное описание в качестве ссылки.
Дополнительные представительные моно- и дифункциональные ПЭГ, имеющие линейные или разветвленные структуры и предназначенные для использования при приготовлении конъюгатов в соответствии с настоящим изобретением, могут быть закуплены на фирме Б11саг\та1сг Со грога! ίο η (А1аЬата). Примерные структуры описаны в каталоге на 2001 г. фирмы Б11саг\та1сг Полиэтиленгликоль и производные для биомедицинского применения, который включен в данное описание в качестве ссылки.
В. Приготовление.
Условия проведения реакции для соединения ПЭГ с инсулином зависят от конкретного вида использованной производной ПЭГ, от сайта прикрепления к инсулину и конкретного типа реактивной группы (т.е. лизина по отношению к цистеину), желательной степени пэгиляции (соединения с ПЭГ) и т.п., что легко может быть определено специалистами в данной области.
Как это обсуждается далее более подробно, синтез конъюгатов в соответствии с настоящим изобретением может быть сайт-направленным (примеры 1, 2 и 4) или может быть случайным (пример 3).
Активирующими группами ПЭГ, подходящими для реакции с аминными группами инсулина (например, С1уА1, Р11сВ1. Ьу829В), являются тресилат, алденид, эпоксид, карбонилимидазол, активные карбонаты (например, сукцинимидил карбонат), ацеталь, а также активные эфиры, такие как Νгидроксилсукцинимид (ΝΗ8) и ΝΗδ-производные ПЭГ. Из указанных наиболее химически активными являются ПЭГ карбоксиметил-ΝΗδ, норлейцин-ΝΗδ и сукцинимидил карбонат. Дополнительными ПЭГ реагентами для соединения с инсулином являются ПЭГ сукцинимидил сукцинат и пропионат. ПЭГ активные эфиры, подходящие для использования в соответствии с настоящим изобретением, например, имеющие единственный компонент пропановый или бутановой кислоты, описаны в патенте США № 5672662. Специфические активные эфиры для использования, предназначенные при приготовлении конъюгатов в соответствии с настоящим изобретением, включают в себя тРЕС-сукцинимидил пропионат и тРЕС-сукцинимидил бутаноат (примеры 1-4).
Оптимальные экспериментальные условия для специфического конъюгата легко могут быть определены специалистами при помощи стандартных экспериментов.
Реактивные группы, подходящие для активации ПЭГ-полимера для прикрепления к тиоловой (сульфгидрильной) группе инсулина, включают в себя винилсульфоны, иодацетамид, малеимид и дитиоортопиридин. Особенно предпочтительными реагентами являются ПЭГ винилсульфоны и ПЭГмалеимид. Дополнительные представительные винилсульфоны для использования в соответствии с настоящим изобретением описаны в патенте США № 5739208.
В некоторых случаях композиции в соответствии с настоящим изобретением содержат избирательно соединеннный с ПЭГ инсулин, т.е. результирующие конъюгаты являются главным образом гомогенными по отношению к положению и степени соединения с ПЭГ (по отношению к пэгиляции (рсдуГШоп) = соединению с ПЭГ). Другими словами, сайт избирательная или сайт направленная пэгиляция аминогруппы будет приводить к образованию композиции конъюгата инсулина, в которой первоначально назначенная заданная позиция, например, РйсВГ имеет прикрепленный к ней компонент ПЭГ. В зависимости от назначенного сайта пэгиляции, может быть необходимой стратегия синтетической защиты или ее отсутствия для предотвращения пэгиляции не заданных реактивных сайтов в молекуле инсулина, например, за счет применения защитной группы, такой как !-ВОС (трет-бутоксикарбоксил) или диВОС (дибутоксикарбоксил). Другими подходящими защитными аминогруппами являются карбобензокси (ΟΒΖ), тритил производные, такие как тритил (Тг), диметокситритил (ЭМТт) и т.п. Другие защитные группы, такие как циклические диацильные группы или нитрофенилсульфенил (Νρ§), также могут оказаться полезными для защиты амино функций. Типичный сайт-направленный синтез композиции 5КПЭГ-инсулин описан в примерах 1 и 2.
Такая сайт-направленная химия соединения, которую применяют для создания конъюгатов инсулина в соответствии с настоящим изобретением, позволяет получать композиции, имеющие большую степень замещения в особом реактивном сайте в молекуле инсулина. Эти композиции затем могут быть дополнительно очищены, если это необходимо, чтобы получить композиции высокой чистоты моно- или дифункциональных ПЭГ-инсулинов.
Композицией ПЭГ-инсулин высокой чистоты называют композицию, содержащую конъюгат ПЭГинсулин, который является ориентировочно по меньшей мере на 90% чистым, а преимущественно ориентировочно по меньшей мере на 95% чистым, что определяют при помощи одного из описанных далее аналитических способов. В этом отношении чистота относится к содержимому конъюгата ПЭГ-инсулин. Другими словами, конъюгат ПЭГ-инсулин, который является ориентировочно по меньшей мере на 90% чистым, содержит по меньшей мере около 90 вес.% разновидностей конъюгата ПЭГ-инсулин, в то время как остальные 10% представляют собой загрязнения, которые не являются конъюгатом ПЭГ-инсулин. Конъюгаты ПЭГ-инсулин в соответствии с настоящим изобретением обычно очищают с использованием одной или нескольких технологий очистки, таких как ионообменная хроматография, размерная эксклю
- 13 007408 зионная хроматография, аффинная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия и обратная фазовая хроматография. Полная гомогенность результирующего конъюгата ПЭГ-инсулин (число присутствующих форм инсулин-ПЭГ) может быть определена с использованием одного или нескольких из следующих способов: хроматография, электрофорез, масс-спектрометрия, а в особенности ΜΑΓΌΙΜ8, и ΝΜΚ спектроскопия.
Особенно полезным способом идентификации сайтов модификации инсулина является картирование пептидов при помощи КР-НРЬС (обратная фазовая ВЭЖХ), в сочетании с И8Р тестом идентификации для человеческого инсулина с использованием эндопротеиназы О1и-С (пример 6).
С. Характеристики конъюгатов ПЭГ-инсулин.
В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения, предлагаются композиции конъюгата ПЭГ-инсулин, которые подходят для введения в легкие. Как это показано при помощи ίη-νίνο данных в примерах 7-11, конъюгаты ПЭГ-инсулин в соответствии с настоящим изобретением, когда их вводят в легкие, обладают фармакокинетическими и фармакодинамическими свойствами, улучшенными по сравнению с природным инсулином. Было показано, что инсулин может быть модифицирован при помощи ПЭГ, имеющих молекулярный вес от 5000 до 10000 К или больше, при этом он все еще сохраняет активность. Активность представительного конъюгата ПЭГ-инсулин, а именно, 5К-ПЭГ-инсулин, показана в примере 7. Кроме того, как это показано в приведенных здесь примерах, примерные конъюгаты ПЭГинсулин, которые имеют ПЭГ цепи со средним молекулярным весом в диапазоне от 750 до 2000 Да и до 5000 Да, когда производят их введение внутривенно и в легкие, являются биологически активными, причем они главным образом не остаются в легких при введении в легкие, о чем свидетельствуют измеряемые уровни инсулина в сыворотке, при этом указанные конъюгаты являются эффективными в осуществлении существенного подавления глюкозы (примеры 7-11), причем в некоторых случаях это происходит в течение времени, существенно большего, чем для природного инсулина. Более того, предлагаемые здесь конъюгаты ПЭГ-инсулин, когда их вводят в легкие, быстро начинают действовать (в течение 1 ч после введения). Сводка фармакокинетических и фармакодинамических параметров для примерных композиций ПЭГ-инсулин в соответствии с настоящим изобретением приведена в табл. 13.
Вообще говоря, композиции ПЭГ-инсулин в соответствии с настоящим изобретением обладают одной или несколькими следующими характеристиками.
Конъюгаты ПЭГ-инсулин в соответствии с настоящим изобретением поддерживают, по меньшей мере, измеряемую степень специфической активности. Другими словами, конъюгат ПЭГ-инсулин в соответствии с настоящим изобретением имеет ориентировочно от 2 до 100% специфической активности естественного инсулина. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения конъюгат ПЭГ-инсулин имеет по меньшей мере 10% или больше биологической активности не модифицированного, природного инсулина и является главным образом не аллергенным. Биоактивность конъюгата в соответствии с настоящим изобретением преимущественно лежит в диапазоне от 5 до по меньшей мере около 20% или больше биоактивности естественного инсулина. Биоактивность конъюгата в соответствии с настоящим изобретением может быть определена косвенно, например за счет контроля (измерения) уровней глюкозы и инсулина в крови, что позволяет получать на их основе соответствующие фармакодинамические и/или фармакокинетические данные, или за счет радиоиммунологического или изотопного иммунологического обследования (К1).
При анализе концентраций инсулина в сыворотке после введения конъюгата ПЭГ-инсулин, например, в легкие, описанные здесь конъюгаты обычно имеют пик (т.е. достигают Стах или самой высокой точки на кривой концентрации) в промежутке ориентировочно от 2 до 8 ч после введения дозы, а более типично, в промежутке ориентировочно от 3 до 6 ч или около того. Более того, химически модифицированные инсулины в соответствии с настоящим изобретением, а в особенности предлагаемые здесь составы инсулина продолжительного действия эффективно обеспечивают как измеряемый эффект понижения уровней глюкозы, так и поддержание концентраций инсулина в течение большего промежутка времени, чем природный инсулин. Более конкретно, конъюгат ПЭГ-инсулин после введения в легкие обеспечивает повышенные уровни инсулина (выше базы или выше базовых уровней) в течение по меньшей мере около 6 ч, а преимущественно по меньшей мере в течение 8 ч после введения. Конъюгат ПЭГ-инсулин после введения в легкие преимущественно обеспечивает повышенные уровни инсулина в крови в течение продолжительного периода времени, составляющего по меньшей мере 9, 10, 12 ч или по меньшей мере 14 ч после введения, причем повышенные (выше базы) уровни конъюгата инсулина могут быть обнаружены в крови в течение указанного продолжительного периода времени после введения. Представительные композиции, которые обладают указанными характеристиками, приведены в примерах.
Как уже было упомянуто здесь ранее, конъюгат инсулина в соответствии с настоящим изобретением является эффективным для снижения уровней содержания глюкозы в крови. Обратимся теперь к способности композиций в соответствии с настоящим изобретением поддерживать пониженное содержание глюкозы в крови. Конъюгат ПЭГ инсулин после введения, например, в легкие эффективно поддерживает уровни содержания глюкозы в крови ниже базовых уровней в течение по меньшей мере 6 ч после введение. Более конкретно, композиция ПЭГ-инсулин в соответствии с настоящим изобретением эффективно поддерживает уровни содержания глюкозы в крови ниже базовых уровней в течение по меньшей мере 8
- 14 007408 ч, преимущественно по меньшей мере 10 ч, а еще лучше по меньшей мере 12 ч или больше после введения.
Более того, составы ПЭГ-инсулин в соответствии с настоящим изобретением показывают абсолютное легочное бионакопление, которое превышает соответствующую характеристику природного инсулина. В частности, предложенный здесь состав ПЭГ-инсулин имеет абсолютное легочное бионакопление, которое ориентировочно по меньшей мере в 1,2 раза больше, чем соответствующая характеристика естественного инсулина, преимущественно ориентировочно по меньшей мере в 1,5 раза больше, чем соответствующая характеристика естественного инсулина, а еще лучше ориентировочно по меньшей мере в 2 или в 2,5-3 раза больше, чем соответствующая характеристика естественного инсулина. (Поясняющие данные приведены в табл. 13).
III. Составы.
Композиции конъюгатов полимер-инсулин в соответствии с настоящим изобретением могут быть введены в чистом виде или в терапевтических/ фармацевтических композициях, которые содержат дополнительные наполнители, растворители, стабилизаторы и т.п., в зависимости от конкретного вида введения и лекарственной формы. Данные конъюгаты могут быть введены как парентерально, так и не парентерально. Специфическими путями введения могут быть оральный, ректальный, буккальный, топический, назальный, офтальмический, подкожный, внутримышечный, внутривенный, трансдермальный и легочный. Наиболее предпочтительными являются парентеральный и легочный пути.
Фармацевтические составы для млекопитающих и преимущественно для человека содержат по меньшей мере один конъюгат ПЭГ-инсулин в соответствии с настоящим изобретением, совместно с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, которые описаны далее более подробно, в особенности для легочных композиций. Составы в соответствии с настоящим изобретением, например, для парентерального введения, обычно представляют собой жидкие растворы или суспензии, в то время как вдыхаемые составы для легочного введения обычно представляют собой жидкости или порошки, причем порошковые составы обычно являются предпочтительными. Дополнительные, хотя и менее предпочтительные композиции химически модифицированных инсулинов в соответствии с настоящим изобретением включают в себя сиропы, кремы, мази, таблетки и т.п.
Используют составы и соответствующие дозы инсулина с различной концентрацией биоактивности инсулина. Вводимый инсулин измеряют в единицах инсулина фармакопеи США (И8Р) и в единицах И8Р инсулина человека (И); одна единица инсулина равна количеству, которое требуется для снижения концентрации глюкозы в крови голодного кролика до 45 мг/мл (2,5 мМ). Типичные концентрации препаратов инсулина для инъекций имеют от 30 до 100 единиц на мл, что эквивалентно ориентировочно 3,6 мг инсулина на мл. Количество инсулина, которое требуется для достижения желательного физиологического действия в теле пациента, зависит не только от особенностей пациента и его заболевания (например, от того, является ли он диабетиком типа I или типа II), но и от активности и конкретного типа использованного инсулина. Например, диапазоны дозировки обычного инсулина (быстрого действия) составляют ориентировочно от 2 до 0,3 и инсулина на килограмм веса тела пациента в день. Композиции в соответствии с настоящим изобретением позволяют в соответствии с одним из аспектов эффективно обеспечивать у проходящих терапию пациентов концентрации глюкозы в крови на голодный желудок ориентировочно от 90 до 140 мг/дл и послеобеденное значение около 250 мг/мл. Точные дозировки могут быть определены специалистами с учетом фармакодинамики и фармакокинетики конкретного конъюгата инсулина, используемого при определенном пути введения, причем дозировки легко могут быть откорректированы по данным периодического контроля уровней глюкозы.
Индивидуальные дозы (для одной ингаляции) для вдыхаемых составов конъюгата инсулина обычно лежат в диапазоне ориентировочно от 0,5 до 15 мг конъюгата инсулина, причем желательную полную дозу обычно получают за счет ориентировочно 1-10 вдохов, а преимущественно ориентировочно за счет 1-4 вдохов. В среднем, полная доза конъюгата ПЭГ-инсулин, получаемого за счет ингаляции при одном приеме, лежит в диапазоне от 10 до 400И, причем каждая индивидуальная доза или единичная доза (соответствующая единственной ингаляции) содержит ориентировочно от 5 до 400И.
А. Вдыхаемые составы химически модифицированного инсулина.
Как уже было упомянуто здесь ранее, предпочтительным путем введения конъюгатов инсулина в соответствии с настоящим изобретением является ингаляция в легкие. Теперь будут более подробно описаны конкретные компоненты составов, а также характеристики устройств доставки.
Количеством конъюгата инсулина в составе является такое количество, которое необходимо для образования терапевтически эффективного количества инсулина в единичной дозе, позволяющего обеспечить по меньшей мере один из терапевтических эффектов естественного инсулина, т.е. способность контролировать уровни глюкозы в крови вблизи нормогликемии. На практике, это количество сильно варьирует в зависимости от конкретного конъюгата инсулина, его активности, тяжести излечиваемого заболевания диабетом, популяции пациентов, стабильности состава и т.п. Композиция обычно может содержать ориентировочно от 1 до 99 вес.% конъюгата ПЭГ-инсулин, типично ориентировочно от 2 до 95 вес.% конъюгата, а еще лучше ориентировочно от 5 до 85 вес.% конъюгата, причем это содержание зависит также от относительных количеств наполнителей и добавок, которые имеются в композиции.
- 15 007408
Более конкретно, композиция типично имеет одно из следующих процентных содержаний ПЭГинсулин: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 вес.% или больше. Порошковая композиции преимущественно содержит по меньшей мере около 60%, например ориентировочно от 60 до 100 вес.% ПЭГ-инсулина. Следует иметь в виду, что несколько типов инсулина могут быть использованы в описанных здесь составах, причем термин агент или инсулин не исключает использования двух или нескольких типов инсулина или комбинаций инсулина с другим активным агентом. (Например, приведенные для пояснения составы ПЭГ-инсулин могут также содержать и природный инсулин).
А.1. Наполнители.
Композиции в соответствии с настоящим изобретением содержат, в большинстве случаев, один или несколько наполнителей. Предпочтительными наполнителями являются углеводы как в единственном числе, так и в сочетании с другими наполнителями или добавками. Представительными углеводами для использования в качестве наполнителей в композициях в соответствии с настоящим изобретением являются сахара, производные сахаров, такие как альдиты, альдоновые кислоты, эстерифицированные сахара и сахарные полимеры. Примерными углеводными наполнителями, подходящими для использования в соответствии с настоящим изобретением, являются, например, моносахариды, такие как фруктоза, мальтоза, галактоза, глюкоза, Б-манноза, сорбоза, и т.п.; дисахариды, такие как лактоза, сахароза, трегалоза, целлобиоза, и т.п.; полисахариды, такие как рафиноза, мелецитоза, мальтодекстрины, декстраны, крахмалы, и т.п.; а также альдиты, такие как маннитол, ксилитол, мальтит, лактит, ксилитол сорбит (глюцит), пиранозил сорбит, миоинозит и т.п. Предпочтительными являются не восстанавливающие сахара, сахара, которые могут образовывать главным образом сухую аморфную или стекловидную фазу при соединении с конъюгатом инсулина, и сахара, имеющие относительно высокие температуры стеклования Тдк (например, имеющие Тдк выше 40°С, преимущественно выше 50°С, более преимущественно выше 60°С, еще более преимущественно выше 70°С, а еще лучше имеющие Тдк 80°С или выше).
Дополнительными наполнителями могут быть аминокислоты, пептиды и в особенности олигомеры, которые содержат от 2 до 9 аминокислот, а преимущественно тетрамеры и пентамеры, и полипептиды, все из которых могут быть гомо- или гетеро-разновидностями. Представительными аминокислотами являются глицин (д1у), аланин (а1а), валин (уа1), лейцин (1еи), изолейцин (Не), метионин (те!), пролин (рго), фенилаланин (рке), триптофан (!гр), серин (кег), треонин (1кг). цистеин (сук), тирозин (!уг), аспарагин (акр), глутаминовая кислота (д1и), лизин (1ук), аргинин (агд), гистидин (к1к), норлейцин (пог), а также их модифицированные формы. Особенно предпочтительной аминокислотой является лейцин.
Также предпочтительными для использования в качестве наполнителей во вдыхаемых композициях являются ди- и трипептиды, которые содержат два или несколько лейцильных радикалов, как это описано в заявке на патент РСТ/Б8 00/09785 фирмы 1пка1е Ткегареикс 8ук!етк.
Также предпочтительными являются ди- и трипептиды, имеющие температуру стеклования выше ориентировочно 40°С, преимущественно выше ориентировочно 50°С, более преимущественно выше ориентировочно 60°С, а еще лучше выше ориентировочно 70°С.
Несмотря на то, что они и являются менее предпочтительными по причине ограниченной растворимости в воде, в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы пептиды, повышающие стабильность и характеристики аэрозоли, такие как тетрамеры и пентамеры, которые содержат любую комбинацию описанных выше аминокислот. Более предпочтительные тетрамеры и пентамеры содержат два или несколько радикалов лейцина. Радикалы лейцина могут занимать любое положение в пептиде, в то время как остальные (т.е. не лейцильные) положения аминокислот заняты любыми из указанных здесь выше аминокислот, при условии, что полученный 4-тег или 5-тег имеет растворимость в воде по меньшей мере около 1 мг/мл. Не лейцильными аминокислотами в 4-тег или 5-тег преимущественно являются гидрофильные аминокислоты, такие как лизин, за счет чего повышается растворимость пептида в воде.
Полиаминокислоты, а в особенности те, которые содержат любую из указанных здесь выше аминокислот, также могут быть использованы в качестве стабилизаторов. Предпочтительными полиаминокислотами являются такие, как полилизин, полиглутаминовая кислота и поли(1ук, а1а).
Дополнительными наполнителями и добавками, полезными в композициях и в способах в соответствии с настоящим изобретением, являются (но без ограничения) протеины, не биологические полимеры и биологические полимеры, которые могут присутствовать изолированно (в единственном числе) или в комбинации. Подходящими наполнителями являются описанные ХУО 96/32096 и \УО 98/16205. Предпочтительными являются наполнители, имеющие температуры стеклования (Тд), свыше ориентировочно 35°С, преимущественно свыше ориентировочно 40°С, более преимущественно свыше ориентировочно 45°С, а еще лучше свыше ориентировочно 55°С.
Примерные протеиновые наполнители содержат альбумины, такие как альбумин человеческой сыворотки (Н8А), рекомбинантный человеческий альбумин (гНА), желатин, казеин, гемоглобин и т.п. Композиции могут также содержать буфер или агент подстройки рН, а типично (но не обязательно) соль, приготовленную из органической кислоты или щелочи. Представительными буферами являются соли органической кислоты, такой как лимонная кислота, аскорбиновая кислота, глюконовая кислота, угольная кислота, винная кислота, янтарная кислота, уксусная кислота или фталевая кислота. Другими подхо
- 16 007408 дящими буферами являются Тп8, трометамин гидрохлорид, борат, глицерин фосфат и фосфат. Подходящими буферами являются также аминокислоты, такие как глицин.
Композиции в соответствии с настоящим изобретением могут также содержать дополнительные полимерные наполнители и добавки, например поливинилпирролидоны, производные целлюлозы, такие как гидроксиметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза и гидроксипропилметилцеллюлоза, ИсоШ (полимерные сахара), гидроксиэтилкрахмал (НЕ8), декстраты (например, циклодекстрины, такие как 2гидроксипропилф-циклодекстрин и сульфобутилэфирф-циклодекстрин), полиэтиленгликоли и пектин.
Композиции также могут дополнительно содержать ароматизирующие вещества, вещества, корригирующие вкус и запах лекарственного средства, неорганические соли (например, хлорид натрия), противомикробные средства (например, бензалькониум хлорид), подсластители, антиоксиданты, антистатики, поверхностно-активные вещества (например, полисорбаты, такие как ΤνΕΕΝ 20 и ΤνΕΕΝ 80, и плюроники, такие как Р68 и Р88, выпускаемые фирмой ВА8Р), сорбит эфиры, липиды (например, фосфолипиды, такие как лецитин и другие фосфатидилхолины и фосфатидилэтаноламины, но преимущественно не в липосомной форме), жирные кислоты и эфиры жирных кислот, стероиды (например, холестерин), и хелатные добавки (например, ΕΌΤΑ, цинк и другие такие подходящие катионы). Использование некоторых дизамещенных фосфатидилхолинов для создания перфорированных микроструктур (т.е. полых, пористых микросфер) описано далее более подробно. Другие фармацевтические наполнители и/или добавки, которые подходят для использования в композициях в соответствии с настоящим изобретением, перечислены в следующих публикациях: 8с1епсе & Ргасбсе оГ РЬагтасу, 194Ь еб., Аббате & Χνίΐΐίαιηχ (1995), и РЬ.у81с1ап'8 ЭеА КеГегепсе, 52пб еб., Меб1са1 Есопоткз, Моп1уа1е, N1 (1998).
В соответствии с одним из вариантов композиция в соответствии с настоящим изобретением может не иметь способствующих проникновению (внутрь тела человека) веществ, которые могут вызывать раздражение и являются токсическими при высоких уровнях, которые часто являются необходимыми для обеспечения существенного усиления абсорбции. Специфическими способствующими проникновению веществами, которые могут отсутствовать в композициях в соответствии с настоящим изобретением, являются подобные детергенту вещества, такие как дезоксихолат, лаурет-9, ЭЭРС, гликохолат и фусидаты. Однако некоторые вещества, которые защищают инсулин от ферментного разложения, например, ингибиторы протеазы и пептидазы, такие как альфа-1 антипротеаза, каптоприл, триорфан, и ингибиторы Ηΐν протеазы, могут, в некоторых вариантах настоящего изобретения, быть введены в составы ПЭГинсулин в соответствии с настоящим изобретением. В соответствии с еще одним вариантом, конъюгаты ПЭГ-инсулин в соответствии с настоящим изобретением могут не содержать липосом, липидных матриц и инкапсулирующих веществ.
Как правило, фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением содержат ориентировочно от 1 до 99 вес.% наполнителя, преимущественно ориентировочно от 5 до 98 вес.% наполнителя, а еще лучше ориентировочно от 15 до 95 вес.% наполнителя. Предпочтительная сухая распыляемая композиция содержит ориентировочно от 0 до 50 вес.% наполнителя, а преимущественно от 0 до 40 вес.% наполнителя. Как правило, в готовой фармацевтической композиции желательно иметь высокую концентрацию инсулина. Обычно оптимальное количество наполнителя и добавки определяют экспериментально, т. е. путем приготовления композиций, которые содержат различные количества наполнителей (в диапазоне от низких до высоких), изучения химической и физической стабильности ПЭГинсулина, ММАЭ и дисперсности фармацевтических композиций; после этого исследуют диапазон, в котором могут быть получены оптимальные характеристики аэрозоли, но без существенного ухудшения стабильности инсулина.
А.2. Приготовление сухих порошков.
Составы сухих порошков в соответствии с настоящим изобретением, которые содержат конъюгат ПЭГ-инсулин, могут быть приготовлены при помощи любой из многих известных технологий сушки, а преимущественно при помощи распылительной сушки. Распылительную сушку составов проводят, например, в соответствии с описанным в руководстве 8ргау Огутд НапбЬоок, 5'1' еб., К. Мав1ег8, 1о1т ΧνίΚ.ν & 8опз, 1пс., ΝΥ, ΝΥ (1991) и в публикациях Р1а(х, К., е! а1., 1п1етабопа1 Ра1еп1 РиЫюабоп Νϋ8. νθ 97/41833 (1997) и \\Ό 96/32149 (1996).
Распылительную сушку растворов конъюгатов ПЭГ-инсулин проводят в обычной распылительной сушилке, например, в такой как сушилка, которая может быть закуплена на фирмах ΝίΐΌ А/8 (Дания) и ВисЫ (Швейцария) и т.д., причем после сушки получают дисперсный, сухой порошок. Оптимальные условия для распылительной сушки растворов ПЭГ-инсулин зависят от компонентов состава и обычно определяются экспериментально. Газом, который обычно используют для распылительной сушки материала, является воздух, хота могут быть использованы и инертные газы, такие как азот или аргон. Более того, температуры как на входе, так и на выходе газа, используемого для распылительной сушки материала, выбирают таким образом, чтобы не происходило существенное разложение ПЭГ-инсулина в распыленном материале. Эти температуры обычно выбирают экспериментально, но как правило температура на входе лежит в диапазоне ориентировочно от 50 до 200°С, в то время как температура на выходе лежит в диапазоне ориентировочно от 30 до 150°С. Предпочтительное давление распыления лежит в диапазоне ориентировочно от 20 до 150 ρβί, а преимущественно ориентировочно от 30-40 до 100 рек Типичным
- 17 007408 давлением распыления может быть одно из следующих (ρκί): 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 или выше.
Вдыхаемые композиции ПЭГ-инсулин, имеющие описанные здесь характеристики, могут быть получены также за счет сушки некоторых компонентов состава, что приводит к образованию перфорированной микроструктуры порошка, как это описано в публикации ЭДО 99/16419, которая включена в данное описание в качестве ссылки.
Порошки с перфорированной микроструктурой обычно содержат полученные при помощи распылительной сушки полые микросферы, имеющие относительно тонкую пористую стенку, которая ограничивает большую внутреннюю пустоту. Порошки с перфорированной микроструктурой могут быть диспергированы в выбранной суспендирующей среде (такой как не водное и/или фторированное вспенивающее вещество), чтобы получить стабилизированную дисперсию до проведения распыления.
Использование имеющих относительно низкую плотность перфорированных (или пористых) микроструктур или микрочастиц существенно снижает силы притяжения между частицами, в результате чего снижаются сдвигающие усилия, повышается текучесть и дисперсность полученных порошков и уменьшается деградация за счет флокуляции, седиментации или разрушения (расслаивания) эмульсии стабилизированных дисперсий порошков.
Альтернативно, композиция ПЭГ-инсулин для введения в легкие может содержать аэродинамически легкие частицы, которые описаны в патенте США № 6136295.
Порошковый состав в соответствии с настоящим изобретением может быть также приготовлен при помощи лиофильной сушки, вакуумной сушки, распылительной сублимационной сушки, сверхкритической обработки жидкости (например, как это описано в патенте США № 6063138), сушки на открытом воздухе, или других форм сушки выпариванием.
В соответствии с еще одним подходом сухие порошки могут быть приготовлены путем агломерирования компонентов порошка, просеивания материалов для получения агломератов, сферонизации для получения более сферического агломерата и сортировки по крупности для получения однородно распределенного по размерам продукта, как это описано, например, в публикации АЫпеск, С, с1 ак, 1п1егпа1юпа1 РСТ РиЬйсайоп Νο. ЭДО 95/09616, 1995, которая включена в данное описание в качестве ссылки.
Сухие порошки могут быть также приготовлены путем перемешивания, размалывания, просеивания или струйного размалывания компонентов состава в виде сухого порошка.
После образования композиции сухого порошка преимущественно содержат в сухих (т.е. с относительно низкой влажностью) условиях во время приготовления, обработки и хранения. Вне зависимости от использованного процесса сушки, этот процесс должен преимущественно привести к созданию вдыхаемых, высоко дисперсных частиц, содержащих химически модифицированный инсулин в соответствии с описанным здесь ранее.
А.3. Характеристики составов сухого порошка.
Порошки в соответствии с настоящим изобретением дополнительно характеризуются различными особенностями, в том числе одной или несколькими из следующих существенных особенностей: (ί) стабильные высокие дисперсности, которые поддерживаются даже при хранении, (и) малые размеры аэродинамических частиц (ΜΜΑΌδ), (ш) повышенная доза мелких частиц, причем порошки имеют высокое процентное содержание частиц с размерами ΜΜΑΌ менее чем 3,3 мкм. Все указанные параметры способствуют улучшенной способности порошка проникать в ткани нижних дыхательные путей (т. е. в альвеолы) и проходить далее в кровообращение большого круга. Эти физические характеристики вдыхаемых порошков в соответствии с настоящим изобретением, которые обсуждаются далее более подробно, являются важными для максимального повышения эффективности введения аэрозолей таких порошков в глубокую область легких.
Сухие порошки в соответствии с настоящим изобретением образованы из аэрозольных частиц, которые могут эффективно проникать в легкие. Частицы в соответствии с настоящим изобретением имеют массовый медианный диаметр (ΜΜΌ) ориентировочно менее 20-30 мкм, или менее чем 20 мкм, или ориентировочно менее чем 10 мкм, преимущественно ориентировочно менее чем 7,5 мкм, более преимущественно ориентировочно менее чем 4 мкм, а еще лучше ориентировочно менее чем 3,5 мкм, а обычно в диапазоне от 0,1 до 5 мкм. Предпочтительные порошки образованы из частиц, имеющих ΜΜΌ ориентировочно от 0,2 до 4,0 мкм. В некоторых случаях порошки содержат также не вдыхаемые частицы носителя, такие как лактоза, причем не вдыхаемые частицы обычно имеют размер ориентировочно более 40 мкм.
Порошки в соответствии с настоящим изобретением дополнительно характеризуются тем, что распределение частиц аэрозоли по размерам имеет массовый средний аэродинамический диаметр (ΜΜΑΌ) ориентировочно менее 10 мкм, преимущественно ориентировочно менее 5 мкм, более преимущественно менее 4,0 мкм, еще более преимущественно менее 3,5 мкм, а еще лучше менее 3 мкм. Массовый средний аэродинамический диаметр порошков ΜΜΑΌ обычно лежит в диапазоне от 0,1 до 10 мкм, преимущественно ориентировочно от 0,2 до 5,0 мкм, более преимущественно ориентировочно от 1,0 до 4,0 мкм, а еще лучше, ориентировочно от 1,5 до 3,0 мкм. Малые аэродинамические диаметры обычно могут быть получены за счет комбинации оптимальных условий распылительной сушки и выбора наполнителей и их
- 18 007408 концентрации.
Порошки ПЭГ-инсулин в соответствии с настоящим изобретением дополнительно характеризуются тем, что порошковая композиция для ингаляции обычно имеет объемную плотность ориентировочно от 0,1 до 10 г/см3, преимущественно ориентировочно от 0,1 до 2 г/см3, а еще лучше, ориентировочно от 0,15 до 1,5 г/см3.
Порошки обычно имеют содержание влаги ориентировочно ниже 20 вес.%, типично ориентировочно ниже 10 вес.%, а преимущественно ориентировочно ниже 5 вес. %. Предпочтительные порошки в соответствии с настоящим изобретением имеют содержание влаги ниже одного из следующих вес.%: 15, 10, 7, 5 или 3. Такие имеющие низкое содержание влаги порошки имеют повышенную стабильность при упаковке и хранении.
Кроме того, способ распылительной сушки и применяемые стабилизаторы позволяют эффективно создавать высоко диспергируемые составы ПЭГ-инсулин. Для порошковых составов, выпущенная доза (ΕΌ) типично превышает 30%, а преимущественно превышает 40%. Предпочтительные порошки в соответствии с настоящим изобретением имеют ΕΌ выше 50%, а часто выше 60%.
Описанные здесь композиции имеют высокую физическую и химическую стабильность, что позволяет обеспечивать высокое качество аэрозоли в течение времени. В том, что касается химической стабильности, то входящий в состав композиции конъюгат ПЭГ-инсулин после распылительной сушки деградирует ориентировочно не более чем на 15%. Другими словами, порошок будет иметь по меньшей мере около 85% неповрежденного конъюгата ПЭГ-инсулин, преимущественно по меньшей мере около 90 или 95% неповрежденного конъюгата, а еще лучше по меньшей мере около 97% или больше неповрежденного конъюгата ПЭГ-инсулин. Процесс распылительной сушки приводит к получению порошков, имеющих ориентировочно менее 10% агрегатов полного протеина, т.е. более 90 вес.% химически модифицированного инсулина будут находиться в мономерной форме.
Что касается параметров аэрозоли, то композиции в соответствии с настоящим изобретением характеризуются снижением выпущенной дозы ориентировочно не более чем на 20%, преимущественно ориентировочно не более чем на 15%, а еще лучше ориентировочно не более чем на 10% после хранения в условиях окружающей среды в течение трех месяцев.
А.4. Введение композиции.
Описанные здесь составы ПЭГ-инсулин могут быть введены с использованием любого подходящего ингалятора сухого порошка (ΌΡΙ). т.е. ингалятора, в котором вздох пациента используют для транспортирования (переноса, введения) сухого порошка лекарственного средства в легкие. Предпочтительные устройства для ингаляции сухого порошка фирмы 1пйа1е Тйегареийс 8ук!етк описаны в следующих патентах: Ра!!оп, 18., е! а1.,И.8. Ра!еп! Νο. 5,458,135, Ос!. 17, 1995; 8тйй, Α. Ε., е! а1.,И.8. Ра!еп! Νο. 5,740,794, Арг. 21, 1998; и 8тйй, Α. Ε., е!. а1., и.8. Ра!еп! Νο. 5,785,049, 1и1у 28, 1998. При введении с использованием устройства такого типа, порошковое лекарство содержится в емкости, имеющей прокалываемую крышку или другую поверхность доступа, а преимущественно в блистерной упаковке или контейнере, причем емкость может содержать одну единичную дозу или множество единичных доз. Удобные способы заполнения большого числа полостей (т.е. упаковок для единичной дозы) дозированным сухим порошком лекарственного средства описаны, например, в публикации Рагкк, Ό.Ε, е! а1, 1п!егпайопа1 Ра!еп! Риййсайоп АО 97/41031, Νον. 6, 1997, которая включена в данное описание в качестве ссылки.
Другие средства введения дисперсии сухого порошка в легкие описаны, например, в следующих патентах: №\\ό11, Κ.Ε., е! а1., Еигореап Ра!еп! Νο. ЕР 129985, 8ер!. 7, 1988; Нобкоп, Р.О., е! а1., Еигореап Ра!еп! Νο. ΕР 472598, 1и1у 3, 1996; Сосохха, 8., е! а1., Εи^οреаη Ра!еп! Νο. ΕР 467172, Арп1 6, 1994, и Ь1оу6, ЬТ. е! а1. и.8. Ра!еп! Νο. 5,522,385, .Типе 4, 1996. Для доставки сухих порошков ПЭГ-инсулин подходят также такие устройства для ингаляции, как АкЧа-Эгасо ΤυΚΒυΗΑΕΕΚ. Этот тип устройства подробно описан в следующих патентах: У1йапеп, К., υ.8. Ра!еп! Νο. 4,668,218, Мау 26, 1987; Ае!!егйп, К., е! а1., υ.8. Ра!еп! Νο. 4,667,668, Мау 26, 1987; и АейегПп, К., е! а1., υ.8. Ра!еп! Νο. 4,805,811, Рей. 21, 1989. Среди других подходящих устройств можно упомянуть такие ингаляторы сухого порошка, как Ко!айа1ег® (61ахо), П18си8® (61ахо), а также ингаляторы 8р1гок™ (Эига Рйагтасеийсак) и 8р1пйа1ег ® (Р18опк). Также годятся и устройства, в которых используют поршень для подачи воздуха для увлечения порошкового лекарственного средства, для подъема лекарственного средства с несущего сита за счет пропускания воздуха через сито, или для перемешивания воздуха с порошковым лекарственным средством в смесительной камере, с последующим приемом порошка пациентом через наконечник устройства, как это описано, например, в патенте США № 5388572.
Вдыхаемая композиция ПЭГ-инсулин может быть также введена с использованием герметичного ингалятора отмеренной дозы (ΜΌΙ), например ингалятора отмеренной дозы типа Уеп!о1т®, который содержит раствор или суспензию лекарственного средства в фармацевтически инертной транспортирующей жидкости, например в хлорфторуглероде или фторуглероде, как это описано в следующих патентах: Еаийе, е! а1., υ.8. Ра!еп! № 5320094, .Типе 14, 1994, и Кийкатеп, К.М., е! а1., υ.8. Ра!еп! № 5672581 (1994).
Альтернативно, описанные здесь ПЭГ-инсулины могут быть растворены или суспендированы в
- 19 007408 растворителе, например в воде или в солевом растворе, и введены за счет пульверизации. В качестве примера пульверизаторов для доставки аэрозольного раствора можно привести АЕВх™ (ЛгаШдт), ИНгаνβηΐ® (ΜαΙΙίηΚΓοάΙ). Рап ЬС Р1觙 или Рап ЬС 81аг™ (Рап СтЬН. ФРГ), ΌβνίΙΝδδ Ри1то-А16е, и Асот II® (Μа^^ие8ΐ Μеά^са1 РгобисЩ.
Как уже было упомянуто здесь ранее, описанные здесь конъюгаты ПЭГ-инсулин могут быть введены парентерально при помощи внутривенной инъекции, или, что менее предпочтительно, при помощи внутримышечной инъекции или за счет подкожного впрыскивания. Точные компоненты каждого из таких составов легко могут быть определены специалистами в данной области. Среди подходящих типов составов для введения парентерально можно указать готовые растворы для инъекции, сухие порошки для комбинации с растворителем перед использованием, готовые суспензии для инъекции, сухие нерастворимые композиции для комбинации с носителем перед использованием, а также концентраты эмульсий и жидкостей для разбавления перед введением. Например, вводимый при помощи инъекции раствор композиции ПЭГ-инсулин в соответствии с настоящим изобретением может содержать композицию, растворенную в водном разбавителе (носителе), таком как водный раствор хлорида. Отметим, что раствор К1п§ег8, раствор глюкозы для инъекции, лактатный раствор Ктпдега и т.п., могут содержать один или несколько фармацевтически приемлемых совместимых наполнителей или добавок, которые уже были упомянуты здесь ранее.
IV. Полезность.
Композиции в соответствии с настоящим изобретением являются полезными, когда их вводят при помощи любого подходящего пути введения, а преимущественно за счет ингаляции или за счет инъекции в терапевтически эффективном количестве млекопитающим для лечения сахарного диабета, а в частности, диабета типа I или типа II.
Отметим, что все статьи, книги, патенты и другие публикации, на которые имеются ссылки в данном описании, включены в данное описание в качестве ссылки.
Приведенные далее примеры служат для пояснения изобретения, но ни в коей мере не имеют характера, ограничивающего объем патентных притязаний.
Примеры
Материалы и способы.
Реагенты полиэтиленгликоля были закуплены на фирме 8Неаг\га1ег Со грога! ίο η (Нип1этШе, А1аЬата).
Человеческий инсулин был закуплен на фирме Эю8уп1Ъ, Шс.
Пример 1. Синтез П1-Ы“А1,№29-1-Вос- инсулина.
Композиция, которая содержит в первую очередь моно-ПЭГ-инсулин, была приготовлена сайтспецифическим образом, как это показано в примерах 1 и 2, с использованием примерного линейного 5000 Да полиэтиленгликоля.
Сначала был приготовлен дизащищенный инсулин следующим образом. 602 мг человеческого инсулина (0,103 ммоль) были растворены в 3,0 мл безводного диметилсульфоксида (ΌΜ8Θ), содержащего 166 мкл триэтиламина. 50 мкл ди-терт-бутилдикарбоната (0,215 ммоль) были добавлены в раствор инсулина. После выдержки в течение 60 мин при комнатной температуре, реакционный раствор был влит в 240 мл ацетона, после чего добавили 3 капли 6 М НС1 для того, чтобы началась флокуляция. Осадок был отделен при помощи фильтрации и высушен в вакууме. Реакционный продукт был очищен при помощи препаративной ВЭЖХ с использованием колонки \Уа1ег5 25 х 100 мм С18 (средний размер частиц 15 мкм; размер пор 100 А). Смеси ацетонитрила и 0,1% ТРА в деионизированной воде были использованы как элюенты со скоростью 3,0 мл/мин. Продукт был собран, дистиллирован для удаления ацетонитрила и затем лиофилизован. Выход составил 164,8 мг (26,7%, Μν ~6000 при помощи ΜΛΡΌ!).
Пример 2. Синтез конъюгата моно-ПЭГ-инсулин тРЕС-5К-8РА-РРеВ1 Ы“В1-метоксиполи (этиленгликоль)5К-инсулин (тРЕС5К-РРеВ1-инсулин).
150 мг (около 0,025 ммоль) вновь очищенного ди-Ы“А1,ХеВ29-1-Вос-инсулина из примера 1 были растворены в 4 мл ΌΜ8Θ, содержащего 95 мкл триэтиламина. 169 мг (0,32 ммоль) тРЕС-8РА-5000 (тРЕСсукцинимидил пропионат, тРЕС-О-СН2СН2С(О)О-сукцинимид, ΜΨ 5000) были добавлены в раствор инсулина. После инкубации в течение ночи (29 ч) при комнатной температуре, полученное производное тРЕС-инсулин было разбавлено до 100 мл при помощи деионизированной воды, после чего провели диализ при помощи деионизированной воды в течение 4 ч и затем лиофилизацию. Лиофилизованный продукт вновь растворили в 4 мл безводного ТРА и выдерживали в атмосфере Ν2 при 0°С в течение 1,5 ч для удаления Вос-защитных групп. Незащищенный тРЕС-инсулин был разбавлен до 50 мл при помощи деионизированной воды, после чего вновь провели диализ при помощи 0,1% ΝΗ/НСОз и деионизированной воды в течение ночи. Лиофилизация позволяет получить белый порошок. Выход составил 117,6 мг (41,6%, Μν ~11311,6 при помощи ΜΛ^^I).
Процент моноконъюгатного инсулина, найденный на основании спектральных данных, составляет ориентировочно 90%, что подтверждает сайт-специфическую природу данного синтетического подхода. Дополнительные характеристики приведены в примере 5. Содержание инсулина в готовом продукте со
- 20 007408 ставляет 51,3%. Для упрощения, И“В1-метоксиполи(этиленгликоль)5К-пропионамидоинсулин или будет называться далее в этом описании как 5К ПЭГ инсулин.
Пример 3. Синтез конъюгата тРЕ0-2К-8РА-инсулин.
Следующий подход был использован для приготовления ПЭГ-инсулина не сайт-специфическим (т.е. случайным) образом, с использованием примерного линейного полиэтиленгликоля, имеющего молекулярный вес ориентировочно 2000 Да. 0,1012 г инсулина (ΜΑ 5826 Оа, 0,01737 ммоль) были растворены в 0,5 мл безводного ΌΜ8Ο и обработаны 50 мкл триэтиламина (0,3587 ммоль, молярный избыток в 20 раз). К указанной реакционной смеси добавили 52 мг т-8РА-2000 (тΡΕ0-сукцинимидил пропионат, 8Неаг\\'а1ег Согрогайоп, ΜΑ ~2000 Оа, 0,02605 ммоль, молярный избыток в 1,5 раза). Смесь перемешивали около 17 ч при комнатной температуре в атмосфере азота. Реакционная смесь затем была растворена в 0,1% ТЕЛ до полного объема 5,5 мл и очищена при помощи обратной фазовой ВЭЖХ с использованием колонки С-18 и элюента ацетонитрил/0,1% ТЕА. Обратная фазовая ВЭЖХ позволяет обнаружить смесь как моно- (с одним прикрепленным ПЭГ), так и ди- (с двумя прикрепленными ПЭГ) ПЭГ-продуктов, при этом была получена композиция 2К ПЭГ инсулин.
Выход: 68 мг.
Содержание инсулина, найденное при помощи обратной фазовой ВЭЖХ, 50,5 мг.
Пример 4. Синтез конъюгата ιηΡΕΟ-750 Оа -8РА-инсулин.
Композиция, которая главным образом образована за счет пэгиляции инсулина у В1 сайта, был приготовлена сайт-специфическим образом, с использованием представительного модификатора из полиэтиленгликоля, а именно линейного 750 Да полиэтиленгликоля, имеющего конец из сукцинимидил пропионата, подходящий для ковалентного соединения с инсулином.
А. Синтез ди-ЫА1,ХВ29-1-Вос-инсулина.
Дизащищенный инсулин был приготовлен следующим образом. 602 мг человеческого инсулина (0,103 ммоль) были растворены в 3,0 мл безводного диметилсульфоксида (ΌΜ8Ο), содержащего 166 мкл триэтиламина. 50 мкл ди-терт-бутилдикарбоната (0,215 ммоль) были добавлены в раствор инсулина. После выдержки в течение 60 мин при комнатной температуре, реакционный раствор был влит в 240 мл ацетона. После этого добавили 3 капли 6 М НС1 для того, чтобы началась флокуляция. Осадок был отделен при помощи фильтрации и высушен в вакууме. Реакционный продукт был очищен при помощи препаративной ВЭЖХ с использованием колонки Аа1ег5 25х 100 мм С18 (средний размер частиц 15 мкм; размер пор 100 А). Смеси ацетонитрила и 0,1% ТЕА в деионизированной воде были использованы как элюенты со скоростью 3,0 мл/мин. Продукт был собран, дистиллирован для удаления ацетонитрила и затем лиофилизован. Выход составил 164,8 мг (26,7%, ΜΑ ~6000 при помощи ΜΑΕΌΙ).
4В. Синтез конъюгата тРΕ0-750 Иа-8РА-РЬеВ1-инсулин.
63,4 мг (-0,01056 ммоль) вновь очищенного ди-Ы“А1,№В29-1-Вос-инсулина из примера 4 были растворены в 0,5 мл ΌΜ8Ο, содержащего 200 мкл триэтиламина. 33 мг (0,03173 ммоль, ΜΑ т8РА750 около 10400а) тРΕ0-8РΑ-750 (тРΕ0-сукцинимидил пропионат, тРЕО-О-СН2СН2С(О)О-сукцинимид, ПЭГ Μ А 750) были добавлены в раствор инсулина. После инкубации в течение ночи (29 ч) при комнатной температуре 300 мкл ТЕА были добавлены в реакционную смесь и полученное производное тРΕ0инсулин было осаждено в 100 мл этилового эфира и высушено в вакууме. Выход составил около 28,5 мг при содержании инсулина 21,3 мг, которое было определено при помощи обратной фазовой ВЭЖХ (33,6%, ΜΑ ~6639,3 Оа при помощи ЮАРО!). Для упрощения полученную композицию далее называют как 750 ПЭГ инсулин.
Два различных синтеза были проведены на этом материале с использованием описанной выше методологии синтеза, с одним исключением: один синтез был проведен при молярном отношении тРΕ08РА-750 к инсулину, составляющем 7:1, в то время как другой синтез был проведен при молярном отношении тРΕ0-8РΑ-750 к инсулину, составляющем 3:1. Полученные при этом композиции были названы здесь как 750-1 ПЭГ инсулин (молярное отношение реагента ПЭГ к инсулину составляет 7:1) и 750-2 ПЭГ инсулин (молярное отношение реагента ПЭГ к инсулину составляет 3:1).
Пример 5. Измерение характеристик примерной композиции ПЭГ-инсулин.
При помощи различных аналитических техник были определены дополнительные характеристики описанных выше композиций конъюгата ПЭГ-инсулин.
Масс-спектрометрия была использована для оценки относительных количеств моно-, ди- и триконъюгатного инсулина (также называемого как мономер, димер и тример ПЭГ инсулина), присутствующих в каждой из композиций, на основании относительных площадей под пиками. Полученные результаты приведены ниже в табл. 1.
- 21 007408
Таблица 1
Относительные количества моно-, ди- и триконъюгатного инсулина, определенные при помощи масс-спектрометрии
Композиция ПЭГ-Инсулин % моноконъюгата % диконъюгата % триконъюгата
5К ПЭГ инсулин 91 4 не определен
750-1 ПЭГ инсулин 46 39 15
750-2 ПЭГ инсулин 60 32 8
2К ПЭГ инсулин 51 45 не определен
Размерная эксклюзионная хроматография (8ЕС) была проведена для описанных выше композиций 750-1, 750-2 и 2К ПЭГ-инсулин, с использованием двух колонок 8Ьобех 8ЕС (номер детали КА-802.5), собранных последовательно в системе хроматографии Аа!егк 2690 НРБС. Подвижная фаза образована из 22% ледяной уксусной кислоты и 33% ацетонитрила (по объему) в воде. Данные хроматографического анализа были использованы в качестве альтернативного подхода для определения относительных количеств моно-, ди- и триконъюгатного инсулина в каждой из указанных композиций. Полученные результаты приведены ниже в табл. 2. Как можно видеть из сравнения данных табл. 1 и 2, два различных способа дают практически совпадающие результаты для относительных количеств конъюгата каждого типа, присутствующих в композициях.
Таблица 2 Относительные количества моно-, ди- и триконъюгатного инсулина, определенные при помощи эксклюзионной хроматографии высокого давления (НР-8ЕС)
Тип инсулина % моноконъюгата % диконъюгата % триконъюгата Другое, %
ПЭГ 750-1 48 47 5 0
ПЭГ 750-2 66 26 7 2
ПЭГ 2000 40 51 не определен 9
Были проведены дополнительные исследования для определения распределения конъюгатов с различным положением в трех примерных композициях, т.е. для определения степени замещения в каждом из трех возможных сайтов прикрепления, а именно А-1 О1у, В-1 РЬе или В-29 Бук. Дитиотреит (ЭТТ, 81§та) был использован для восстановления (ослабления) дисульфидных связей в образцах инсулина, что приводит к разрыву ковалентных связей между цепями инсулина А и В.
Для проведения реакций восстановления, образцы ПЭГ-инсулин были растворены в 8 М мочевине, которая содержит 0,4 М гидрокарбоната аммония с эквивалентной массой инсулина около 0,2 мг/мл для каждой конъюгатной разновидности. ЭТТ растворили в воде (7 мг/мл) для образования водного раствора ЭТТ. Затем одну часть раствора ЭТТ добавляли к пяти частям каждого из растворов и проводили реакцию восстановления при 50°С в течение 15 мин. Восстановленные композиции 750 ПЭГ инсулин были алкилированы при помощи иодацетамида (81§та). Шесть частей растворов ПЭГ-инсулин вводили в реакцию с одной частью 100 мМ иодацетамида до проведения хроматографии и ферментативного гидролиза. После этого проводили анализ продуктов реакции при помощи ВЭЖХ. Процент конъюгации с каждой из А или В цепей инсулина определяли на основании количества инсулина А или В цепи, которое элюировало позже, чем контроль (и которое можно приписать конъюгации с полиэтиленгликолем). Эти поздние элюирующие пики поэтому отсутствуют при ожидаемых временах удержания в контроле. Относительные площади под пиками использовали для определения процента конъюгации полиэтиленгликоля с цепью А или В инсулина.
Для дальнейшего исследования количества ПЭГ, прикрепленного к В-29 Бук, по отношению к количеству ПЭГ, прикрепленному к В1-РЬе, восстановленные и алкилированные А и В цепи композиций 750-1 и 750-2 ПЭГ-инсулин после описанного выше ЭТТ-восстановления, были дополнительно гидролизованы при помощи упорядоченной энзим эндопротеиназы О1и-С (81§та). Был приготовлен раствор, который содержит 0,125 мкг/мкл энзима в водном гидрокарбонате аммония. До добавки раствора энзима, концентрация инсулина в каждой из смесей после реакции восстановления составляла 0,05 мкг/мкл в 8 М мочевине, которая содержит 0,4 М гидрокарбоната аммония. Затем добавили 1 часть раствора энзима в 40 частей раствора инсулина. Ферментативный гидролиз при помощи энзима эндопротеиназы О1и-С приводит к получению фрагментов пептида инсулина А1-А4, А5-А17, А18-А21, В1-В13, В14-В21 и В22В30.
Фрагменты, которые были получены за счет ферментативного гидролиза в А и В цепях композиций
- 22 007408
750-1 и 750-2 ПЭГ инсулин, были проанализированы при помощи ВЭЖХ, чтобы найти полное распределение сайтов прикрепления ПЭГ к инсулину для каждой из указанных композиций. Процент отсутствующих пиков по сравнению с контролем служит оценкой количества фрагмента, связанного с ПЭГ, так как этот фрагмент может элюировать в любом месте на хроматограмме.
Таблица ЗА Распределение сайтов прикрепления ПЭГ для примерных составов ПЭГ-инсулин
Тип инсулина % А1 сайтов прикрепления % В-1 сайтов прикрепления % В-29 сайтов прикрепления
ПЭГ 750-1 30 95 21
ПЭГ 750-2 11 95 15
ПЭГ 2000 63 85 *
* нет данных ферментативного гидролиза, идет только пониженное восстановление
Числа в табл. ЗА основаны на возможности 100% конъюгации каждого сайта. Например, каждая из моноразновидностей имеет 3 возможных конфигурации (моно-А1, моно-В1 и моно-В-29), а каждый из диконъюгатов имеет 3 конфигурации (ди-А1, В-1; ди-А-1, В-29 и ди-В-1, В-29). Если провести рассмотрение данных в табл. ЗА, например, для ПЭГ-750-1, то для всех возможных разновидностей, присутствующих в композиции, 95% конъюгатов ПЭГ-инсулин имеют полиэтиленгликоль, ковалентно прикрепленный у В-1 сайта.
Таблица 3В Различные возможные разновидности конъюгата
Типы Моно-конъюгат Ди-конъюгат Три- конъюгат Полимер с высоким молекулярным весом (ΉΜν/Ρ'1
Разновидности 1 2 3 4 5 6 7 8
Точки конъюгации А-1 В-1 В-29 (А-1 + В- 1) (А-1 + В- 29) (В-1 + В- 29) (А-1 + В-1 ТВ- 29) Конъюгатные димеры инсулина
Пример 6. Сравнение скорости ферментативного гидролиза 750-2 ПЭГ-инсулина с немодифицированным инсулином.
Было проведено сравнение скорости ферментативного гидролиза 750-2 ПЭГ-инсулина, при использовании химотрипсина, с соответствующей характеристикой инсулина.
Контрольный раствор инсулина и композиция ПЭГ 750-2 инсулин были приготовлены при концентрации 1 мг/мл в фосфатном буферном солевом растворе при рН 7,8. Был приготовлен также ферментный раствор химотрипсина при концентрации 1 мг/мл в 1 мМ НС1. Добавляли 1 часть ферментного раствора к 20 частям раствора инсулина. Небольшие аликвоты перемешанного раствора отбирали каждый час.
Была применена обратная фазовая ВЭЖХ с использованием колонки С-18 с подвижной фазой, которая содержит перхлорат натрия, фосфорную кислоту и ацетонитрил. Градиент ацетонитрила был использован для элюирования ассортимента разновидностей ПЭГ-инсулин в группе слегка разрешенных линий, контролируемых при 214 нм. Эта группа пиков (линий) была проинтегрирована вручную как один пик и помечена как ПЭГ-инсулин. При проведении ферментативного гидролиза имеется потеря неповрежденных ПЭГ-инсулина и инсулина, что показано на графике (фиг. 1). Была произведена оценка их периода полураспада в присутствии химотрипсина.
Промежуток времени, который требуется для ферментативного гидролиза половины концентрации основного компонента композиции 750-2 ПЭГ-инсулин, в 5 раз больше аналогичной характеристики для немодифицированного инсулина. Другими словами, требуется в 5 раз больше времени для ферментативного гидролиза при помощи химотрипсина половины концентрации данного ПЭГ-инсулина, чем для обычного инсулина. Эти результаты показывают потенциал конъюгатов ПЭГ-инсулин для продолжительного времени удержания в альвеолах за счет повышенной стойкости к протеолитической деградации по сравнению с немодифицированным инсулином.
Пример 7. Оценка концентраций глюкозы в крови и инсулина в сыворотке после внутривенного введения композиции 5К ПЭГ-инсулин крысам (Р-2001-015).
Это исследование было проведено для того, чтобы определить, сохраняется ли активность инсулина в композиции 5К ПЭГ-инсулин после химической модификации с использованием цепи примерного 5К полиэтиленгликоля, и изучить дозы и кривые отклика глюкозы для указанных композиций после их внутривенного введения.
Для опытов были использованы самцы крыс 8ргадие Г)а\с1еу (325-350 г) с предварительно введен
- 23 007408 ным в яремную вену или в бедренную вену [1УС/ГУС] катетером, имеющие входное отверстие под кожей, выходящее у задней части шеи, которые были закуплены в лаборатории Н1111ор ЬаЬ Атша1з 1пс. (Р.О. Вох 183, 8со11ба1е, Р 15683). Введенные в яремную вену канюли были заполнены раствором (заполнителем просвета) фармацевтического качества поливинил-пирролидона (РУР - МУ 40000), физиологическим раствором и гепарином натрия, для того, чтобы поддерживать открытое состояние. Затем удаляли пробку из нейлонового волокна, закрывающую канюлю, и заменяли ее тупой канюлей \1опо|ес! 23Ох1 (УУВ #53498-484) на день проведения исследований. Испытательная система включает в себя 1 самца крысы, выбранного случайным образом для группы плацебо, 2 самцов крысы, выбранных случайным образом для группы инсулина без пэгиляции, и 4 самцов крысы, выбранные случайным образом для группы ПЭГ-инсулин. Источником ПЭГ-инсулина для этого исследования был выбран 5К ПЭГ-инсулин из примера 2. Дозы вводили внутривенно.
Число/Пол животных
День 1: 1М/группа для группы плацебо 1
2М/группа для группы 2;
4М/группа для групп 3-5
Животным не давали пищи в течение 12-18 ч до начала испытаний. Человеческий инсулин (ЭюзупГЪ) до использования хранился при -20°С. 5К ПЭГ-инсулин (пример 2) до использования хранился также при -20° С. Были приготовлены два различных раствора:
Растворы для внутривенного введения.
Человеческий инсулин без пэгиляции (1,0 мг/мл исходный раствор): 1,0 мл РВ8 (фосфатно-солевой буферный раствор) был добавлен к 1.0 мг порошка инсулина.
5К ПЭГ инсулин: (1.0 мг/мл человеческого инсулина, причем концентрация основана скорее на инсулине, а не на конъюгате): 6,0 мл РВ8 были добавлены к 11,7 мг порошка 5К ПЭГ инсулина.
Животные были анестезированы за счет вдыхания изофлурана. Внутривенные дозы (300 мкг на животное) вводили через бедренную вену (ГУС) катетером и затем перевязывали катетер для исключения перекрестного заражения при взятиях крови. Все пробы крови отбирали через яремную вену (1УС) катетером. Фосфатно-солевой буферный раствор (РВ8) вводили группе 1 с внутривенной дозой 300 мкл. Человеческий инсулин без пэгиляции вводили группе 2 с внутривенной дозой 20 мкг на животное. Состав ПЭГ-человеческий инсулин вводили группе 3 с внутривенной дозой 20 мкг на животное, группе 4 с внутривенной дозой 40 мкг на животное и группе 5 с внутривенной дозой 30 мкг на животное. Пробы крови (около 500 мкл) отбирали из яремной вены (УС) катетером в промежутке времени от 2 до 0,25 ч до введения дозы и через 10, 15, 30, 60, 120 и 180 мин после введения дозы. Небольшое количество крови помещали на испытательную полоску для глюкозы, чтобы определить содержание глюкозы в крови при помощи монитора глюкозы О1исоше1ег Г1пе (Вауег Согр., Е1каг1, ΙΝ). Остаток пробы помещали в пробирки сепаратора сыворотки, которые вводили в центрифугу для разделения крови. Затем сыворотку сливали в пробирку сепарации и анализировали при помощи радиоиммунологического или изотопного иммунологического обследования (В1А). Срединное и стандартное (8Ώ) отклонения вычисляли с использованием М1сгозой® Ехсе1 2000.
Таблица 4 Сводка экспериментов т-угуо
В таблице приведены действительные вводимые дозы и номера использованных животных в группах. Исследование было проведено в течение одного дня.
Номер Группы Композиция Путь введения Полная дневная доза Инсулина (мкг на животное Число животных/ Пол
1 Плацебо внутривенно 0 1М
2 Не ПЭГ инсулин внутривенно 20 2М
3 ПЭГ инсулин внутривенно 20 4М
4 ПЭГ инсулин внутривенно 40 4М
5 ПЭГ инсулин внутривенно 30 4М
Полученные результаты показывают, что композиция 5К ПЭГ инсулина обладает биоактивностью, т.е. молекула инсулина остается активной после модификации с использованием полиэтиленгликоля, что можно видеть по ее способности снижать уровни глюкозы в крови. Средние концентрации инсулина в сыворотке после введения внутривенно ПЭГ инсулина зависят от дозы. Наблюдали также зависимость от дозы снижения уровней глюкозы. Сводка этих результатов показана на фиг. 2 и 3. На фиг. 2 показан график средних концентраций инсулина в сыворотке после введения внутривенно указанных композиций ПЭГ-инсулин по сравнению с не ПЭГ инсулином.
На фиг. 3 показан график концентраций глюкозы в крови после введения внутривенно описанных выше композиций.
- 24 007408
Пример 8. Введение 5К ПЭГ инсулина в легкие (Р-2001-017).
Примерный 5К ПЭГ инсулин был введен крысам внутритрахеально для того, чтобы определить (ί) сохраняется ли его активность после введения в легкие, и (ίί) его воздействие, если оно есть, на концентрации инсулина в сыворотке и глюкозы в крови при непосредственной доставке в легкие.
Исходные растворы.
Не ПЭГ инсулин: 1 мл РВ8 был добавлен к 1,0 мг порошка инсулина для приготовления исходного раствора. Исходный раствор инсулина (контроль) был приготовлен в день проведения исследования.
5К ПЭГ инсулин: 4,0 мл РВ8 были добавлены к 7,8 мг порошка 5К ПЭГ инсулина для получения исходного раствора 1 мг/мл (в пересчете на инсулин).
Дозировочные растворы.
мкг на животное инсулина: за 2 ч до введения дозы, 667 мкл исходного раствора инсулина были добавлены к 4,33 мл РВ8.
150 мкг на животное инсулина В-1: за 2 ч до введения дозы, 2,5 мл исходного раствора 5К ПЭГ инсулина были добавлены к 2,5 мл РВ8.
Интратрахеальное вливание.
Была осуществлена легкая анестезия крыс с использованием вдыхаемого 3,0-5,0% изофурана (АЬЬоИ ЬаЬога^опез), смешанного с кислородом, в течение ориентировочно 5 мин в камере для анестезии из плексигласа. Введение проводили за счет инсерции зонда (иглы) для кормления (Роррег & 8опз 1пс.; 18x3 ^2-шарик 1/4 мм, \е\у Нуйе Рагк, ΝΥ 11040), снабженного шприцом 1 мл, в рот крысы ниже трахеи, непосредственно над основным килем. Правильность введения зонда для кормления в трахею определяли за счет нахождения неровностей хрящевых колец под кожей горла с использованием шарика зонда для кормления. С использованием данного способа дозы вводили в легкие, после чего зонд для кормления удаляли.
Четырнадцать (N=7 в группе) не получавших пищи самцов крыс (НШ1ор ЬаЬ Атта1з, 8сойзйа1е, РА (300-350 г)) с постоянно введенными в яремную вену катетерами (1УС) были использованы в этом исследовании. Человеческий инсулин без пэгиляции был введен животным группы 1 при дозе 40 мкг на 300 мкл. Состав ПЭГ-человеческий инсулин был введен животным группы 2 при дозе 150 мкг на 300 мкл. Пробы крови (около 500 мкл) отбирали в промежутке времени от 2 до 0,25 ч до введения дозы и через 15, 30, 60, 120, 240, 360, 480 и 720 мин после введения дозы. Небольшое количество крови помещали на испытательную полоску для глюкозы, чтобы определить содержание глюкозы в крови при помощи монитора глюкозы С1исоте1ег ЕШе (Вауег Согр., Е1каг1, ΙΝ). Остаток пробы помещали в пробирки сепаратора сыворотки, которые (после разделения крови) анализировали при помощи радиоиммунологического или изотопного иммунологического обследования. Срединное и стандартное (8Ό) отклонения вычисляли с использованием М1сгозой® Ехсе1 2000. Животные 2 и 3 были исключены из исследования по причине забитого (засоренного) катетера.
Таблица 5 Сводка экспериментов на крысах ΐη-νΐνθ
В таблице приведены действительные вводимые дозы и номера использованных животных в группах.
Номер группы. Тип инсулина Путь введения Число животных/ Пол Полная дневная доза Инсулина (мкг на животное) Число дней
1 Инсулин Интратрахеально 7М 40 1
2 5КПЭГ Инсулин Интратрахеально 7М 150 1
Таблица 6
Уровни доз ΐη-νΐνΘ
Номер группы. Тип инсулина Полная дневная доза инсулина (мкг на животное) Объем дозы (мкл) Концентрация дозировочного раствора (мкг/мл)
1 Инсулин 40 300 133.33
2 5К ПЭГ Инсулин 150 300 500
Средние концентрации инсулина в сыворотке и (глюкозы) в крови после интратрахеального введения инсулина и 5К ПЭГ инсулина показаны соответственно на графиках фиг. 4 и 5. Полученные результаты показывают, что композиции ПЭГ-инсулин в соответствии с настоящим изобретением обладают
- 25 007408 активностью при введении в легкие и при нахождении в легких. Фармакокинетические данные дополнительно показывают, что ПЭГ инсулин не только проходят через легкие в кровоток, но и сохраняют при этом свою активность, о чем свидетельствует обнаруженные в сыворотке уровни инсулина, соответствующие не эндогенному инсулину. Уровни инсулина в крови, наблюдаемые в течение около 1 ч после интратрахеального введения, свидетельствуют о том, что ПЭГ инсулин главным образом не удерживается в легких и проходит через легкие в кровоток вскоре после введения. Полученные результаты показывают, что ПЭГ инсулин при его введении в легкие эффективно снижает уровни глюкозы в крови. Однако в данном примере ПЭГ инсулин оказался менее эффективным, чем не ПЭГ инсулин, в дозах, вводимых для снижения уровней глюкозы в крови. Кривые как фармакокинетического, так фармакодинамического отклика для введенного интратрахеально ПЭГ инсулина несколько похожи на соответствующе кривые не ПЭГ инсулина, однако на основании профилей, показанных на фиг. 4, представляется, что ПЭГ инсулин имеет более длительное действие, чем не ПЭГ инсулин. Дополнительная оптимизация объемов доз и особых полиэтиленгликолевых модификаторов для конкретного химически модифицированного инсулина легко может быть обеспечена специалистами в данной области, на основании представленной здесь информации и в зависимости от требований к назначенньм дозам, определенной популяции населения, тяжести излечиваемого заболевания и т.д.
Пример 9. Введение 750-1 ПЭГ инсулина в легкие (Р-2001-025).
Представительная композиция 750-1-ПЭГ инсулин была введена крысам внутритрахеально для того, чтобы изучить воздействие композиции, в которой инсулин ковалентно соединен с одной или несколькими цепями полиэтиленгликоля, имеющими молекулярный вес около 1000 Да или меньше, при введении указанной композиции в легкие.
Исследование на крысах ίη-νίνο было проведено главным образом в соответствии с описанным в примере 8. Точные условия эксперимента и вводимые дозы указаны в следующих табл. 7 и 8.
Таблица 7
Номер группы Тип инсулина Путь Введения Число животных/ Пол Полная дневная доза инсулина (мкг на животное) Число дней
1 Инсулин Интратрахеально 2М 80 1
2 750-1 ПЭГ Инсулин Интратрахеально 4М 100 1
3 750-1 ПЭГ Инсулин Интратрахеально 4М 300 1
4 750-1 ПЭГ Инсулин Интратрахеально 4М 500 1
Таблица 8
Номер группы. Тип инсулина Полная дневная доза инсулина (мкг на животное) Объем Дозы (мкл) Концентрация дозирующего раствора (мкг/мл)
1 Инсулин 80 300 266.67
2 750-1 ПЭГ Инсулин 100 300 333.33
3 750-1 ПЭГ Инсулин 300 300 1000.00
4 750-1 ПЭГ Инсулин 500 300 1666.67
Концентрации инсулина в сыворотке и глюкозы в крови после введения инсулина и 750-1 ПЭГ инсулина интратрахеально показаны соответственно на графиках фиг. 6 и 7. Если рассматривать график средних концентраций инсулина в сыворотке на фиг. 6, то природный инсулин или не ПЭГ инсулин дос
- 26 007408 тигают своей максимальной концентрации в сыворотке ориентировочно через 15 мин, в то время как композиции ПЭГ-инсулин достигают своей максимальной концентрации в сыворотке через 6 ч (100 мкг на животное) и через 8 ч (300 мкг на животное). Это говорит о продолжительном действии этих композиций при их введении в легкие за счет ингаляции. Как это показано на фиг. 6, не модифицированный инсулин возвращается к базовому значению ориентировочно через 6 ч после введения, в то время как уровни инсулина для композиции ПЭГ-инсулин через 6 ч существенно превышают базовый уровень (превышают ориентировочно в 3-7 раз или больше базовое значение). Более того, интратрахеальное введение композиции ПЭГ-инсулин приводит к удержанию повышенных уровней соматического инсулина, которые не возвращаются к базовому уровню даже через 12 ч после введения. На самом деле, уровни ПЭГ инсулина более чем в 3 раза превышают базовое значение (т.е. значение для не модифицированного инсулина) как через 8, так и через 12 ч. Соответствующие результаты показаны на графике фиг. 6.
Подводя итог, можно сказать, что при введении в легкие, 750-1 ПЭГ инсулин приводит к увеличению уровней соматического инсулина по сравнению с не модифицированным инсулином. Более того, уровни соматического инсулина для группы ПЭГ инсулина все еще существенно превышают базовый уровень даже через 12 ч. Другими словами, повышенные уровни инсулина поддерживаются для группы ПЭГ инсулина в течение времени, по меньшей мере в 2 раза превышающего время действия не модифицированного инсулина. Эти данные дополнительно показывают, что поступающий в легкие ПЭГ инсулин является биологически активным и создает более продолжительные соматические уровни инсулина по сравнению с не модифицированным инсулином.
График средних концентраций глюкозы в крови после интратрахеального введения не ПЭГ инсулина по сравнению с 750-1 ПЭГ инсулином показан на фиг. 7. Уровни глюкозы в крови хорошо коррелируют с уровнями инсулина в сыворотке для группы ПЭГ инсулина. (Другими словами, можно наблюдать, что повышенные уровни инсулина в сыворотке соответствуют понижению уровней глюкозы в крови). При рассмотрении фиг. 7 можно отметить, что композиции ПЭГ-инсулин в соответствии с настоящим изобретением, когда их вводят перорально в легкие, начинают быстро действовать, аналогично природному инсулину, а не имеют замедленное начало действия аналогично многим типичным составам длительного действия. Другими словами, снижение уровней глюкозы происходит вскоре после введения. Кроме того, в то время как природный или не ПЭГ инсулин достигает максимального снижения уровней глюкозы ориентировочно через 2 ч, ПЭГ инсулин достигает максимального снижения уровней глюкозы по меньшей мере через 4, 6 и 8 ч для соответствующих доз 500, 100 и 300 мкг. Таким образом, промежуток времени до максимального снижения уровней глюкозы в крови для ПЭГ инсулина, когда его вводят в легкие, удлиняется в 2-4 раза по сравнению с соответствующим промежутком для не ПЭГ инсулина. В общем и целом, снижение уровней глюкозы за счет 750-1 ПЭГ инсулина в течение периода 12 ч существенно больше по сравнению с не модифицированным инсулином. Через 8 ч уровни глюкозы главным образом возвращаются к нормальным для не модифицированного инсулина, в то время как уровни глюкозы для группы ПЭГ-инсулин остаются в 1,3-3 раза ниже, чем для не модифицированного инсулина. Уровни глюкозы для группы ПЭГ-инсулин не возвращаются к базовому уровню даже через 12 ч, что свидетельствует о более продолжительном подавлении глюкозы при помощи композиций химически производного инсулина в соответствии с настоящим изобретением.
Пример 10. Введение 750-1 ПЭГ инсулина в легкие (Р-2002-001).
При проведении исследования, аналогичного описанному в примере 9, интратрахеальное введение крысам 750-1-ПЭГ инсулина проводили при меньших дозах, чем в примере 9.
Интратрахеальное исследование крыс ίπ-νίνο проводили главным образом так, как это описано здесь ранее в примере 8. Точные условия эксперимента и вводимые дозы указаны в следующих табл. 9 и 10.
Таблица 9
Номер группы Тип инсулина Путь введения Число Животных/ Пол Полная дневная доза инсулина (мкг на животное) Число дней
1 Инсулин Интратрахеально 5М 80 1
2 750-1 ПЭГ инсулин Интратрахеально 5М 80 1
3 750-1 ПЭГ инсулин Интратрахеально 5М 160 1
- 27 007408
Таблица 10
Номер группы Тип инсулина Полная дневная доза инсулина (мкг на животное) Объем Дозы (мкл) Концентрация дозирующего раствора (мкг/мл)
1 Инсулин 80 300 266.7
2 750-1 ПЭГ инсулин 80 300 266.7
3 750-1 ПЭГ инсулин 160 300 533.3
Концентрации инсулина в сыворотке и глюкозы в крови после интратрахеального введения не модифицированного инсулина и 750-1 ПЭГ инсулина показаны соответственно на графиках фиг. 8 и 9. Если рассматривать график средних концентраций инсулина в сыворотке, показанный на фиг. 8, то природный инсулин или не ПЭГ инсулин достигают своей максимальной концентрации в сыворотке ориентировочно через 15 мин, в то время как композиции ПЭГ-инсулин достигают своей максимальной концентрации в сыворотке через 2 ч (80 мкг на животное) и через 6 ч (160 мкг на животное). Другими словами, время, которое необходимо для достижения максимальных уровней инсулина в сыворотке для ПЭГ-модифицированного инсулина, увеличивается в 8-24 раз по сравнению с природным или не ПЭГ инсулином, когда его вводят в кровообращение большого круга через легкие. Как это показано на фиг. 8, не модифицированный инсулин возвращается к базовому значению ориентировочно через 12 ч после введения, в то время как уровни инсулина для группы ПЭГ-инсулин в 2,5-3,5 раза превышают базовое значение через те же 12 ч. Уровни инсулина для группы ПЭГ-инсулин не возвращаются к базовому значению даже ориентировочно через 25 ч, что свидетельствует об увеличении продолжительности действия в 2 раза для группы ПЭГ инсулин по сравнению с не модифицированным инсулином. Соматические уровни инсулина поддерживаются в случае группы ПЭГ инсулин в течение времени, которое вдвое или в 2 раза (25 ч вместо 12 ч) превышает время действия не модифицированного инсулина. Через ориентировочно 6 ч, уровни инсулина для двух групп ПЭГ-инсулин практически соответствуют введенным дозам (то есть концентрации инсулина для группы 160 мкг на животное ориентировочно в 2 раза превышают концентрации инсулина для группы 80 мкг на животное).
График средних концентраций глюкозы в крови после интратрахеального введения не ПЭГ инсулина по сравнению с 750-1 ПЭГ инсулином показан на фиг. 9.
Через 25 ч после введения уровни глюкозы для обеих групп ПЭГ инсулина все еще остается пониженным и не возвращается к базовому уровню, в отличие от не модифицированного инсулина. Таким образом, как это показано в примере 9, полные профили ПЭГ инсулина свидетельствуют о продолжительном подавлении глюкозы в течение времени свыше 25 ч. Через 8 ч уровни глюкозы для не модифицированного инсулина практически возвращаются к нормальным, в то время как уровни глюкозы для групп ПЭГ инсулина остаются ориентировочно в 1,5 ниже, чем для не модифицированного инсулина. Эти результаты дополнительно показывают, что модифицированный инсулин с одним или несколькими компонентами полиэтиленгликоля обеспечивает хорошее бионакопление в легких и создает соматические уровни инсулина с большой длительностью, а также обеспечивает длительное подавление глюкозы.
Пример 11. Введение 750-2 ПЭГ инсулина в легкие (Р-2002-003).
Представительная композиция 750-2 ПЭГ инсулин была введена крысам внутритрахеально. Задачей настоящего исследования является изучение воздействия различных доз ПЭГ инсулина по сравнению с не ПЭГ инсулином, при непосредственном введении в легкие. Крысы получали по 80 мкг того и другого инсулина на животное. Исследование на крысах ίη-νίνο было проведено главным образом в соответствии с описанным в примере 8. Точные условия эксперимента и вводимые дозы указаны в следующих табл. 11 и 12.
Таблица 11
Номер группы Тип инсулина Путь введения Число Животных/ Пол Полная дневная доза инсулина (мкг на животное) Число дней
1 Инсулин Интратрахеально 7М 80 1
2 750-2 ПЭГ инсулин Интратрахеально 7М 80 1
- 28 007408
Таблица 12
Номер группы Тип инсулина Полная дневная доза инсулина (мкг на животное) Объем дозы (мкл) Концентрация дозирующего раствора (мкг/мл)
1 Инсулин 80 300 266.7
2 750-2 ПЭГ инсулин 80 300 266.7
График средних концентраций инсулина в сыворотке после внутритрахеального вливания, для случая как не ПЭГ инсулина, так и 750-2 ПЭГ инсулина при дозе 80 мкг на животное, показан на фиг. 10. График средних концентраций глюкозы в крови после внутритрахеального вливания, для случая как не ПЭГ инсулина, так и 750-2 ПЭГ инсулина при дозе 80 мкг на животное, показан на фиг. 11. Были получены результаты, аналогичные полученным в примерах 9 и 10.
Фармакокинетические параметры для примеров 10 и 11 показаны далее в табл. 13. Бионакоплением является абсолютное бионакопление (т.е. по сравнению с введенным внутривенно инсулином).
Таблица 13
Средние фармакокинетические параметры для инсулина в сыворотке
Пример Тип инсулина Путь введения Доза мкг/животное Смах мки/мл ТмАХ тт АИС* мки.мин/мл Абсолютное бионакопление
9(Р- 2001- 25) Инсулин ГТ 80 56 15 12878
9 750-1 ПЭГ ΙΤ 100 64 368 27954
9 750-1 ПЭГ ΙΤ 300 160 188 50691
9 750-1 ПЭГ ΙΤ 500 3474 184 255881
10 (Р- 2002- 001) Инсулин ΙΤ 80 132 15 28167
10 750-1 ПЭГ ΙΤ 80 56 210 36818
10 750-1 ПЭГ ΙΤ 160 117 78 60713
IV КеГ. Р-2002- 002 Инсулин IVй 20 3057 5 44388
IV КеГ. 750-2 ПЭГ IV 20 2638 7 63190
IV КеГ. 750-2 ПЭГ IV 30 3510 5 62746
11 (Р- 2002- 003) инсулин ΙΤ 80 89 24 22203 12.5
11 750-2 ПЭГ [Т 80 164 73 57639 32** 32***
интратрахеально хх внутривенно * резко выделяющиеся значения исключены из комплекта данных.
** относительно внутривенной дозы 20 мкг/животное. Резко выделяющиеся значения с отклонением 22% исключены.
*** относительно внутривенной дозы 30 мкг/животное. Резко выделяющиеся значения оставлены.
- 29 007408
Абсолютное бионакопление вычисляли по формуле (АиС)/(АИС ίν 1пк) X (Эоке ίν тк)/(Эоке), в которой ίν 1пк - внутривенное введение инсулина.
Пример 12. Введение 2К ПЭГ инсулина в легкие (Р-2002-010).
Другая примерная композиция 2К ПЭГ инсулин была использована для интратрахеального введения крысам. Использованный в этом исследовании 2К ПЭГ инсулин был приготовлен в соответствии с описанным в примере 3. Животные получали 80 мкг не ПЭГ инсулина на животное, а также соответственно 300 мкг на животное, 600 мкг на животное, 900 мкг на животное и 1200 мкг на животное 2К ПЭГ инсулина. Исследование на крысах ш-угуо было проведено главным образом в соответствии с описанным в примере 8. Точные условия эксперимента и вводимые дозы указаны в следующих табл. 14 и 15.
Таблица 14
Номер группы Тип инсулина Путь Введения Число Животных/ Пол Полная дневная доза инсулина (мкг на животное) Число дней
1 Инсулин интратрахеально 3 80 1
2 ПЭГ 2Κ-Ι инсулин интратрахеально 3 600 1
3 ПЭГ 2Κ-Ι инсулин интратрахеально 3 80 1
4 ПЭГ 2Κ-Ι инсулин интратрахеально 3 160 1
5 ПЭГ 2Κ-Ι инсулин интратрахеально 3 300 1
6 ПЭГ 2Κ-Ι инсулин | интратрахеально 3 900 1
7 ПЭГ 2Κ-Ι инсулин интратрахеально 3 1200 1
Таблица 15
Номер группы Тип инсулина Полная дневная доза инсулина (мкг на животное) Объем дозы (мкл) Концентрация дозирующего раствора (мкг/мл)
1 Инсулин 80 300 0.267
2 ПЭГ 2Κ-Ι инсулин 600 300 2.0
3 ПЭГ 2Κ-Ι инсулин 80 300 0.267
4 ПЭГ 2Κ-Ι инсулин 160 300 0.533
5 ПЭГ 2Κ-Ι инсулин 300 300 1.0
6 ПЭГ2К-1 инсулин 900 300 3.0
7 ПЭГ 2Κ-Ι инсулин 1200 300 4.0
График средних концентраций глюкозы в крови после интратрахеального введения показан на фиг.
12. Хорошие отклики на введение дозы были получены для композиции ПЭГ инсулина, введенной в легкие, при этом более высокие дозы 2К ПЭГ инсулина приводят к большему снижению концентрации глюкозы в крови. Несмотря на то, что точка максимального подавления глюкозы на кривой и была достигну
- 30 007408 та ориентировочно через 3 ч как для ПЭГ, так и для не ПЭГ композиций, профили ПЭГ инсулина по отношению к не ПЭГ инсулину существенно отличаются по длительности подавления глюкозы. В частности, ориентировочно через 6 ч, три более высокие дозы 2К ПЭГ инсулина (600, 900 и 1200 мкг на животное) приводят к существенному снижению уровней глюкозы по сравнению с не ПЭГ инсулином. Эти результаты дополнительно показывают, что продолжительное соматическое действие может быть обеспечено за счет введения ПЭГ инсулина в легкие.
Пример 13. Оценка концентраций инсулина в сыворотке и глюкозы в крови после внутривенного введения 2К ПЭГ инсулина крысам (Р-2002-009).
Это исследование было проведено для дальнейшего изучения активности инсулина в примерной композиции 2К ПЭГ инсулина, а также для того, чтобы показать, что внутривенное введение дозы ПЭГ человеческого инсулина (ПЭГ 2К-1) эффективно снижает уровни глюкозы в крови до концентрации около 30-40 мг/дл.
Был осуществлен протокол испытаний, аналогичный описанному в примере 7, с использованием композиций, групп животных и доз, указанных в следующих табл. 16 и 17.
Таблица 16
Номер группы Тип инсулина Путь введения Число животных/ Пол Полная дневная доза инсулина (мкг на животное) Число дней
1 Инсулин внутривенно 2М 20 1
2 ПЭГ2К-1 инсулин внутривенно 2М 20 1
3 ПЭГ2К-1 инсулин внутривенно 2М 30 1
4 ПЭГ2К-1 инсулин внутривенно 2М 40 1
5 ПЭГ2К-1 инсулин внутривенно 2М 80 1
6 ПЭГ2К-1 инсулин внутривенно 2М 160 1
Таблица 17
Номер группы Контроль/ Тест Полная дневная Доза инсулина (мкг на животное) Объем дозы (мкл) Концентрация дозирующего раствора (мкг/мл)
1 Инсулин 20 300 67
2 ПЭГ2 К-1 инсулин 20 300 67
3 ПЭГ2 К-1 инсулин 30 300 100
4 ПЭГ2 К-1 инсулин 40 300 133
5 ПЭГ2 К-1 инсулин 80 300 267
6 ПЭГ2 К-1 инсулин 160 300 533
График средних концентраций инсулина в сыворотке после внутривенного введения не ПЭГ инсулина и 2К ПЭГ инсулина при дозах 20 мкг на животное (не ПЭГ инсулин) и 20, 30 и 40 мкг на животное
- 31 007408 (2К ПЭГ инсулин) показан на фиг. 13. График средних концентраций глюкозы в крови после внутривенного введения не ПЭГ инсулина и 2К ПЭГ инсулина при указанных дозах показан на фиг. 14.

Claims (70)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Композиция инсулина для легочного введения, содержащая конъюгат инсулина, ковалентно связанный с одной или несколькими молекулами не встречающегося в природе гидрофильного полимера.
  2. 2. Композиция инсулина по п.1, в которой указанный конъюгат не имеет жирно-кислотного липофильного компонента.
  3. 3. Композиция инсулина по п.1, в которой указанный не встречающийся в природе гидрофильный полимер представляет собой полиалкиленгликоль.
  4. 4. Композиция инсулина по п.1, в которой указанный не встречающийся в природе гидрофильный полимер представляет собой полиэтиленгликоль.
  5. 5. Композиция инсулина по п.2, в которой указанный не встречающийся в природе гидрофильный полимер представляет собой полиэтиленгликоль.
  6. 6. Композиция по п.4, отличающаяся тем, что ее абсолютное легочное бионакопление больше, чем у естественного инсулина.
  7. 7. Композиция по п.6, отличающаяся тем, что ее абсолютное легочное бионакопление по меньшей мере в 2 раза больше, чем у естественного инсулина.
  8. 8. Композиция по п.4, отличающаяся тем, что ее абсолютное легочное бионакопление превышает 15%.
  9. 9. Композиция по п.8, отличающаяся тем, что ее абсолютное легочное бионакопление превышает 30%.
  10. 10. Композиция по п.4, отличающаяся тем, что после ее введения в легкие получают время, необходимое для достижения максимальной концентрации, по меньшей мере в 3 раза больше, чем в случае естественного инсулина.
  11. 11. Композиция по п.10, отличающаяся тем, что после ее введения в легкие получают время, необходимое для достижения максимальной концентрации, по меньшей мере в 5 раз больше, чем в случае естественного инсулина.
  12. 12. Композиция по п.4, в которой указанный полиэтиленгликоль метилирован на концах.
  13. 13. Композиция по п.4, в которой указанный полиэтиленгликоль метилирован на концах при помощи алкоксильной группы.
  14. 14. Композиция по п.4, в которой указанный полиэтиленгликоль выбран из группы, в которую входят линейный полиэтиленгликоль, разветвленный полиэтиленгликоль, вильчатый полиэтиленгликоль и гантельный полиэтиленгликоль.
  15. 15. Композиция по п.14, в которой указанный полиэтиленгликоль содержит биоразлагаемую связь.
  16. 16. Композиция по п.14, в которой указанный полиэтиленгликоль содержит число (ОСН2СН2) субъединиц, выбранное из группы, в которую входят ориентировочно от 2 до 300 субъединиц, ориентировочно от 4 до 200 субъединиц и ориентировочно от 10 до 100 субъединиц.
  17. 17. Композиция по п.14, в которой указанный полиэтиленгликоль имеет номинальный средний молекулярный вес ориентировочно от 200 до 10000 Да.
  18. 18. Композиция по п.14, в которой указанный полиэтиленгликоль является линейным.
  19. 19. Композиция по п.17, в которой указанный полиэтиленгликоль имеет номинальный средний молекулярный вес ориентировочно от 200 до 5000 Да.
  20. 20. Композиция по п.17, в которой указанный полиэтиленгликоль имеет номинальный средний молекулярный вес ориентировочно от 200 до 2000 Да.
  21. 21. Композиция по п.17, в которой указанный полиэтиленгликоль имеет номинальный средний молекулярный вес ориентировочно от 200 до 1000 Да.
  22. 22. Композиция по п.4, в которой указанный инсулин представляет собой природный инсулин.
  23. 23. Композиция по п.4, в которой указанный конъюгат имеет чистоту более 90%.
  24. 24. Композиция по п.4, в которой указанный инсулин ковалентно связан с полиэтиленгликолем у одного или нескольких своих аминосайтов.
  25. 25. Композиция по п.24, в которой по меньшей мере около 75% В-1Р11С сайтов в инсулине ковалентно связаны с полиэтиленгликолем.
  26. 26. Композиция по п.25, в которой по меньшей мере около 90% В-1Р11С сайтов в инсулине ковалентно связаны с полиэтиленгликолем.
  27. 27. Композиция по п.24, которая содержит смесь монозамещенного и дизамещенного инсулинов.
  28. 28. Композиция по п.27, которая дополнительно содержит тризамещенный инсулин.
  29. 29. Композиция по п.4, в которой указанный инсулин ковалентно связан с полиэтиленгликолем за счет связующего компонента, расположенного у конца указанного полиэтиленгликоля.
  30. 30. Композиция по п.29, в которой инсулин ковалентно связан с полиэтиленгликолем при помощи амидной связи.
    - 32 007408
  31. 31. Композиция по п.4 в аэрозольной форме.
  32. 32. Композиция по п.4 в жидкой или сухой форме.
  33. 33. Композиция по п.4, которая дополнительно содержит фармацевтически приемлемый наполнитель.
  34. 34. Композиция по п.4 в распыляемой сухой форме.
  35. 35. Способ получения композиции по п.4, включающий взаимодействие полиэтиленгликоля с инсулином, в котором используют полиэтиленгликоль, который до соединения с инсулином обладает активированным связующим компонентом у одного конца, пригодным для ковалентного соединения с инсулином.
  36. 36. Способ по п.35, в котором указанный активированный связующий компонент пригоден для соединения с реактивными аминогруппами инсулина.
  37. 37. Способ по п.36, в котором указанный активированный связующий компонент содержит реактивную функциональную группу, выбранную из Ν-гидроксисукцинимид активных эфиров, активных карбонатов, альдегидов или ацеталей.
  38. 38. Способ доставки инсулина млекопитающим, включающий в себя следующие операции: получение аэрозольной композиции инсулина по п.4 и введение указанной аэрозольной композиции инсулина за счет ингаляции для того, чтобы обеспечить осаждение в легких и абсорбцию из легких пациента.
  39. 39. Способ введения инсулина нуждающемуся в нем пациенту, в котором используют композицию, содержащую конъюгат инсулин-гидрофильный полимер, и вводят ее путем ингаляции указанной композиции в легкие пациента, причем в результате указанного введения инсулин проходит через легкие и поступает в кровоток.
  40. 40. Способ по п.39, в котором указанный гидрофильный полимер представляет собой полиалкиленгликоль.
  41. 41. Способ по п. 39, в котором указанный гидрофильный полимер представляет собой полиэтиленгликоль.
  42. 42. Способ по п.39, при котором повышенные уровни инсулина в крови поддерживаются по меньшей мере в течение 10 ч после введения.
  43. 43. Способ по п.39, при котором указанные повышенные уровни инсулина в крови поддерживаются по меньшей мере в течение 12 ч после введения.
  44. 44. Способ по п.39, при котором дополнительно уровни глюкозы в крови пациента снижаются по меньшей мере на 10 ч после введения.
  45. 45. Способ по п.44, при котором дополнительно уровни глюкозы в крови пациента снижаются по меньшей мере на 12 ч после введения.
  46. 46. Способ по п.39, в котором операция введения представляет собой введение указанной композиции в аэрозольной форме.
  47. 47. Способ по п.39, который дополнительно включает в себя операцию получения аэрозоля перед его введением.
  48. 48. Способ по п.39, при котором указанный конъюгат при введении в легкие дополнительно характеризуется тем, что он имеет абсолютное легочное бионакопление больше, чем у природного инсулина.
  49. 49. Способ по п.39, в котором указанный коньюгат содержит одну или более молекул метилированного на конце полиэтиленгликоля.
  50. 50. Способ по п.39, в котором полиэтиленгликоль выбран из группы, в которую входят линейный, разветвленный, вильчатый и гантельный полиэтиленгликоли.
  51. 51. Способ по п.39, в котором указанный конъюгат не имеет липофильной части.
  52. 52. Способ по п.39, в котором указанная композиция не имеет липофильного компонента.
  53. 53. Способ по п.39, в котором полиэтиленгликоль имеет биоразлагаемую связь.
  54. 54. Способ по п.39, в котором полиэтиленгликоль содержит число (ОСН2СН2) субъединиц, выбранное из группы, в которую входят ориентировочно от 2 до 300 субъединиц, ориентировочно от 4 до 200 субъединиц и ориентировочно от 10 до 100 субъединиц.
  55. 55. Способ по п.39, в котором полиэтиленгликоль имеет номинальный средний молекулярный вес ориентировочно от 200 до 10000 Да.
  56. 56. Способ по п.39, в котором полиэтиленгликоль имеет номинальный средний молекулярный вес ориентировочно от 200 до 5000 Да.
  57. 57. Способ по п.39, в котором полиэтиленгликоль имеет номинальный средний молекулярный вес ориентировочно от 200 до 2000 Да.
  58. 58. Способ по п.39, в котором полиэтиленгликоль имеет номинальный средний молекулярный вес ориентировочно от 200 до 1000 Да.
  59. 59. Способ по п.39, в котором полиэтиленгликоль ковалентно присоединен к инсулину у одного или нескольких его реактивных аминосайтов.
  60. 60. Способ по п.59, в котором полиэтиленгликоль соединен с инсулином у одного или нескольких его реактивных аминосайтов за счет связи, выбранной из группы, в которую входят амид, уретан и мети
    - 33 007408 ленамино.
  61. 61. Способ по п.39, в котором по меньшей мере около 75% В-1РЬе сайтов в инсулине ковалентно связаны с полиэтиленгликолем.
  62. 62. Способ по п.61, в котором по меньшей мере около 90% В-1РЬе сайтов в инсулине ковалентно связаны с полиэтиленгликолем.
  63. 63. Способ по п.39, в котором указанная композиция содержит смесь монозамещенного и дизамещенного инсулинов.
  64. 64. Способ по п.63, в котором композиция дополнительно содержит тризамещенный инсулин.
  65. 65. Способ по п.39, в котором указанный коньюгат содержит связующий компонент, присоединяющий полиэтиленгликоль к инсулину, который имеет длину ориентировочно от 2 до 20 атомов.
  66. 66. Способ по п.39, в котором операция введения предусматривает введение указанной композиции при помощи ингалятора сухого порошка.
  67. 67. Способ по п.39, в котором операция введения предусматривает введение указанной композиции при помощи ингалятора отмеренной дозы.
  68. 68. Способ по п.39, в котором операция введения предусматривает введение указанной композиции при помощи распылителя.
  69. 69. Способ по п.39, в котором композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый наполнитель.
  70. 70. Способ по п.39, в соответствии с которым в результате введения композиции указанного конъюгата через 1 ч после введения получают уровни инсулина в сыворотке, которые по меньшей мере в 2 раза
EA200301222A 2001-05-21 2002-05-21 Легочное введение химически модифицированного инсулина EA007408B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US29242301P 2001-05-21 2001-05-21
PCT/US2002/016464 WO2002094200A2 (en) 2001-05-21 2002-05-21 Pulmonary administration of chemically modified insulin

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200301222A1 EA200301222A1 (ru) 2004-08-26
EA007408B1 true EA007408B1 (ru) 2006-10-27

Family

ID=23124608

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200301222A EA007408B1 (ru) 2001-05-21 2002-05-21 Легочное введение химически модифицированного инсулина

Country Status (35)

Country Link
US (3) US6838076B2 (ru)
EP (1) EP1395294A4 (ru)
JP (1) JP2004535401A (ru)
KR (1) KR20030097876A (ru)
CN (2) CN101045166A (ru)
AP (1) AP1763A (ru)
AR (1) AR033903A1 (ru)
AU (1) AU2002303869B2 (ru)
BG (1) BG108494A (ru)
BR (1) BR0209896A (ru)
CA (1) CA2447236A1 (ru)
CO (1) CO5540371A2 (ru)
CZ (1) CZ20033182A3 (ru)
EA (1) EA007408B1 (ru)
EC (1) ECSP034855A (ru)
GE (1) GEP20063917B (ru)
HR (1) HRP20030949A2 (ru)
HU (1) HUP0400442A2 (ru)
IL (2) IL158862A0 (ru)
IS (1) IS7043A (ru)
LT (1) LT5153B (ru)
LV (1) LV13197B (ru)
MA (1) MA26185A1 (ru)
MX (1) MXPA03010649A (ru)
MY (1) MY137181A (ru)
NO (1) NO20035157D0 (ru)
NZ (1) NZ529572A (ru)
OA (1) OA13136A (ru)
PL (1) PL366911A1 (ru)
SK (1) SK15532003A3 (ru)
TN (1) TNSN03116A1 (ru)
TR (1) TR200400295T2 (ru)
WO (1) WO2002094200A2 (ru)
YU (1) YU98503A (ru)
ZA (1) ZA200309085B (ru)

Families Citing this family (121)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6057287A (en) 1994-01-11 2000-05-02 Dyax Corp. Kallikrein-binding "Kunitz domain" proteins and analogues thereof
US20060171899A1 (en) * 1998-12-10 2006-08-03 Akwete Adjei Water-stabilized aerosol formulation system and method of making
US9006175B2 (en) 1999-06-29 2015-04-14 Mannkind Corporation Potentiation of glucose elimination
OA13136A (en) * 2001-05-21 2006-12-13 Nektar Therapeutics Pulmonary administration of chemically modified insulin.
EP1270012A1 (en) * 2001-06-21 2003-01-02 Pfizer Products Inc. Use of pulmonary administration of insulin for treatment of diabetes
JP4959919B2 (ja) * 2001-12-21 2012-06-27 スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー 官能基を有するポリエチレングリコール賦形剤を用いた医薬用エアロゾル組成物
DE60318938T2 (de) 2002-03-20 2009-01-22 Mannkind Corp., Valencia Inhalationsgerät
EP2298278B1 (en) 2002-06-07 2015-11-11 Dyax Corp. Prevention and reduction of blood loss and inflammatory response
US7153829B2 (en) 2002-06-07 2006-12-26 Dyax Corp. Kallikrein-inhibitor therapies
CN1767857A (zh) * 2003-02-26 2006-05-03 尼克塔治疗亚拉巴马公司 聚合物－因子ⅷ部分共轭物
US9040664B2 (en) * 2003-04-11 2015-05-26 Antriabio, Inc. Materials and methods for preparing protein-polymer conjugates
EP1491554A1 (en) * 2003-06-23 2004-12-29 CONARIS research institute AG PEGylated soluble gp130-dimers useful as a medicament
PT1663281E (pt) * 2003-08-29 2014-03-17 Dyax Corp Inibidores de proteases poli-peguilados
CA2537113A1 (en) * 2003-08-29 2005-03-10 Dyax Corp. Modified protease inhibitors
GB0328629D0 (en) * 2003-12-10 2004-01-14 Medpharm Ltd Metered dose inhalation preparations
WO2005115477A2 (en) 2004-04-13 2005-12-08 Quintessence Biosciences, Inc. Non-natural ribonuclease conjugates as cytotoxic agents
EP2626368B1 (en) * 2004-07-19 2016-12-21 Biocon Limited Insulin-oligomer conjugates, formulations and uses thereof
EP1786784B1 (en) 2004-08-20 2010-10-27 MannKind Corporation Catalysis of diketopiperazine synthesis
CA2578175C (en) 2004-08-23 2014-10-14 Mannkind Corporation Diketopiperazine salts, diketomorpholine salts or diketodioxane salts for drug delivery
US20060046852A1 (en) * 2004-08-26 2006-03-02 Rowe Richard E Wide area gaming system
US7235530B2 (en) 2004-09-27 2007-06-26 Dyax Corporation Kallikrein inhibitors and anti-thrombolytic agents and uses thereof
US8245758B2 (en) * 2006-10-30 2012-08-21 GM Global Technology Operations LLC Coulomb damped disc brake rotor and method of manufacturing
US20080206342A1 (en) * 2005-01-10 2008-08-28 Rosemary Kovelesky Compositions and Methods For Increasing the Bioavailability of Pulmonarily Administered Insulin
EP1843790A2 (en) * 2005-01-27 2007-10-17 Novo Nordisk A/S Insulin derivatives conjugated with structurally well defined branched polymers
TWI376234B (en) * 2005-02-01 2012-11-11 Msd Oss Bv Conjugates of a polypeptide and an oligosaccharide
WO2006082205A1 (en) 2005-02-02 2006-08-10 Novo Nordisk A/S Insulin derivatives
ES2428510T3 (es) 2005-02-02 2013-11-08 Novo Nordisk A/S Derivados de insulina
WO2006097521A1 (en) * 2005-03-18 2006-09-21 Novo Nordisk A/S Pegylated single-chain insulin
US20060271011A1 (en) * 2005-05-25 2006-11-30 Mock Bradley D Methods and apparatus for indicating when a disposable component of a drug delivery system needs to be replaced
US7803404B2 (en) 2005-09-14 2010-09-28 Mannkind Corporation Method of drug formulation based on increasing the affinity of active agents for crystalline microparticle surfaces
US8168592B2 (en) * 2005-10-21 2012-05-01 Amgen Inc. CGRP peptide antagonists and conjugates
US20070136092A1 (en) * 2005-11-30 2007-06-14 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Computational and/or control systems related to individualized pharmaceutical and nutraceutical selection and packaging
US8340944B2 (en) * 2005-11-30 2012-12-25 The Invention Science Fund I, Llc Computational and/or control systems and methods related to nutraceutical agent selection and dosing
US20070289258A1 (en) * 2006-06-14 2007-12-20 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Individualized pharmaceutical selection and packaging
US20070124176A1 (en) * 2005-11-30 2007-05-31 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Computational and/or control systems and methods related to nutraceutical agent selection and dosing
US20110145009A1 (en) * 2005-11-30 2011-06-16 Jung Edward K Y Methods and systems related to transmission of nutraceutical associatd information
US7974856B2 (en) 2005-11-30 2011-07-05 The Invention Science Fund I, Llc Computational systems and methods related to nutraceuticals
US10296720B2 (en) * 2005-11-30 2019-05-21 Gearbox Llc Computational systems and methods related to nutraceuticals
US20070174128A1 (en) * 2005-11-30 2007-07-26 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Computational and/or control systems related to individualized pharmaceutical and nutraceutical selection and packaging
US20080114577A1 (en) * 2005-11-30 2008-05-15 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Computational methods and systems associated with nutraceutical related assays
US8000981B2 (en) 2005-11-30 2011-08-16 The Invention Science Fund I, Llc Methods and systems related to receiving nutraceutical associated information
US20080033763A1 (en) * 2005-11-30 2008-02-07 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Methods and systems related to receiving nutraceutical associated information
US20080052114A1 (en) * 2005-11-30 2008-02-28 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Computational systems and methods related to nutraceuticals
US20070124218A1 (en) * 2005-11-30 2007-05-31 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Computational and/or control systems related to individualized nutraceutical selection and packaging
US8068991B2 (en) * 2005-11-30 2011-11-29 The Invention Science Fund I, Llc Systems and methods for transmitting pathogen related information and responding
US7927787B2 (en) * 2006-06-28 2011-04-19 The Invention Science Fund I, Llc Methods and systems for analysis of nutraceutical associated components
US20080004905A1 (en) * 2006-06-28 2008-01-03 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Methods and systems for analysis of nutraceutical associated components
US8297028B2 (en) 2006-06-14 2012-10-30 The Invention Science Fund I, Llc Individualized pharmaceutical selection and packaging
US7827042B2 (en) * 2005-11-30 2010-11-02 The Invention Science Fund I, Inc Methods and systems related to transmission of nutraceutical associated information
RU2457854C2 (ru) 2005-12-30 2012-08-10 Цзэньсунь (Шанхай) Сайенс Энд Текнолоджи Лимитед Длительное высвобождение нейрегулина для улучшения сердечной функции
BRPI0707991B8 (pt) 2006-02-22 2021-05-25 Mannkind Corp métodos de preparação de um medicamento em pó seco com uma propriedade farmacêutica melhorada, dito pó seco e uso de uma quantidade efetiva do pó seco
US20070292404A1 (en) * 2006-03-27 2007-12-20 Biosynexus Incorporated Antimicrobial polymer conjugates
JP2009541333A (ja) 2006-06-23 2009-11-26 クインテセンス バイオサイエンシーズ インコーポレーティッド 修飾リボヌクレアーゼ
EP1873166B1 (en) 2006-06-30 2010-09-08 CONARIS research institute AG Improved sgp 130Fc dimers
EP2049151A4 (en) * 2006-07-17 2010-03-24 Quintessence Biosciences Inc METHOD AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF CANCER
EP2049149B1 (en) * 2006-07-31 2015-04-15 Novo Nordisk A/S Pegylated extended insulins
JP2009545329A (ja) * 2006-08-04 2009-12-24 ファーマシーネ，インコーポレイテッド 長い半減期の組換え型ブチリルコリンエステラーゼ
CN101541830A (zh) 2006-09-22 2009-09-23 诺沃-诺迪斯克有限公司 蛋白酶抗性的胰岛素类似物
WO2008067158A2 (en) 2006-11-13 2008-06-05 Auxagen, Inc. METHOD TO PROMOTE HAIR GROWTH AND/OR DELAY OR TREAT HAIR LOSS BY ADMINISTERING A TGF-β ANTAGONIST OR INHIBITOR
WO2008084051A1 (en) * 2007-01-12 2008-07-17 Novo Nordisk A/S Mixtures of pegylated insulin and fast acting insulin for pulmonary administration
KR101508617B1 (ko) * 2007-02-28 2015-04-06 세리나 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 활성화된 폴리옥사졸린 및 이를 포함하는 조성물
US20140011964A1 (en) 2007-02-28 2014-01-09 Serina Therapeutics, Inc. Activated Polyoxazolines and Conjugates and Compositions Comprising the Same
WO2008132224A2 (en) 2007-04-30 2008-11-06 Novo Nordisk A/S Method for drying a protein composition, a dried protein composition and a pharmaceutical composition comprising the dried protein
WO2009020434A1 (en) * 2007-08-07 2009-02-12 Nanomaterials Technology Pte Ltd A process for making micro-sized protein particles
WO2009029656A1 (en) * 2007-08-27 2009-03-05 Auxagen, Inc. METHODS FOR INHIBITING TGF-β
CA2702043A1 (en) * 2007-10-08 2009-04-16 Quintessence Biosciences, Inc. Compositions and methods for ribonuclease-based therapies
AU2008313248B2 (en) 2007-10-16 2012-04-26 Biocon Limited An orally administerable solid pharmaceutical composition and a process thereof
WO2009065126A2 (en) * 2007-11-16 2009-05-22 Boston Protein Solutions Excipients for protein stabilization
WO2009112583A2 (en) 2008-03-14 2009-09-17 Novo Nordisk A/S Protease-stabilized insulin analogues
EP2910571B1 (en) 2008-03-18 2016-10-05 Novo Nordisk A/S Protease stabilized, acylated insulin analogues
US8488661B2 (en) * 2008-06-13 2013-07-16 Verizon Patent And Licensing Inc. Systems and methods for data streaming
US8485180B2 (en) 2008-06-13 2013-07-16 Mannkind Corporation Dry powder drug delivery system
EP2570147B1 (en) 2008-06-13 2017-10-18 MannKind Corporation A dry powder inhaler and system for drug delivery
TWI451876B (zh) * 2008-06-13 2014-09-11 Lilly Co Eli 聚乙二醇化之離脯胰島素化合物
US9364619B2 (en) 2008-06-20 2016-06-14 Mannkind Corporation Interactive apparatus and method for real-time profiling of inhalation efforts
TWI614024B (zh) 2008-08-11 2018-02-11 曼凱公司 超快起作用胰島素之用途
CN102159219B (zh) * 2008-09-16 2015-06-24 圣路易斯大学 提高转化生长因子-β信号发送的方法
US20110171312A1 (en) * 2008-09-19 2011-07-14 Nektar Therapeutics Modified therapeutic peptides, methods of their preparation and use
WO2010033207A1 (en) * 2008-09-19 2010-03-25 Nektar Therapeutics Polymer conjugates of therapeutic peptides
WO2010039985A1 (en) 2008-10-01 2010-04-08 Quintessence Biosciences, Inc. Therapeutic Ribonucleases
WO2010078373A1 (en) 2008-12-29 2010-07-08 Mannkind Corporation Substituted diketopiperazine analogs for use as drug delivery agents
US8314106B2 (en) 2008-12-29 2012-11-20 Mannkind Corporation Substituted diketopiperazine analogs for use as drug delivery agents
AU2010203712A1 (en) 2009-01-06 2010-07-15 Dyax Corp. Treatment of mucositis with kallikrein inhibitors
PL2405963T3 (pl) 2009-03-11 2014-04-30 Mannkind Corp Urządzenie, układ i sposób pomiaru oporu inhalatora
KR20180079458A (ko) 2009-06-12 2018-07-10 맨카인드 코포레이션 한정된 비표면적을 갖는 디케토피페라진 마이크로입자
BR112012001988A2 (pt) * 2009-07-31 2017-05-09 Sanofi Aventis Deutschland composição de insulina de ação prolongada
WO2011012718A1 (en) 2009-07-31 2011-02-03 Ascendis Pharma As Prodrugs comprising an insulin linker conjugate
CN102917699A (zh) 2009-10-13 2013-02-06 密执安大学评议会 树枝状聚合物组合物和合成方法
EP2496295A1 (en) 2009-11-03 2012-09-12 MannKind Corporation An apparatus and method for simulating inhalation efforts
CA2784861A1 (en) 2009-12-21 2011-07-14 Pharmathene, Inc. Recombinant butyrylcholinesterases and truncates thereof
RS62853B1 (sr) 2010-01-06 2022-02-28 Takeda Pharmaceuticals Co Proteini koji vezuju kalikrein plazme
US9981017B2 (en) 2010-04-02 2018-05-29 Hanmi Science Co., Ltd. Insulin conjugate using an immunoglobulin fragment
AR081066A1 (es) 2010-04-02 2012-06-06 Hanmi Holdings Co Ltd Conjugado de insulina donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
RU2531455C2 (ru) 2010-06-21 2014-10-20 Маннкайнд Корпорейшн Системы и способы доставки сухих порошковых лекарств
EP2438930A1 (en) 2010-09-17 2012-04-11 Sanofi-Aventis Deutschland GmbH Prodrugs comprising an exendin linker conjugate
AU2012204202A1 (en) 2011-01-06 2013-07-11 Dyax Corp. Plasma kallikrein binding proteins
EP2686003A2 (en) 2011-03-15 2014-01-22 Novo Nordisk A/S Human insulin analogues and derivatives comprising cysteine substitutions
CN102675452B (zh) * 2011-03-17 2015-09-16 重庆富进生物医药有限公司 具持续降血糖和受体高结合的人胰岛素及类似物的偶联物
CN105667994B (zh) 2011-04-01 2018-04-06 曼金德公司 用于药物药盒的泡罩包装
WO2012174472A1 (en) 2011-06-17 2012-12-20 Mannkind Corporation High capacity diketopiperazine microparticles
AU2012328885B2 (en) 2011-10-24 2017-08-31 Mannkind Corporation Methods and compositions for treating pain
CN102504022A (zh) * 2011-11-30 2012-06-20 苏州元基生物技术有限公司 含有保护赖氨酸的胰岛素原及使用其制备胰岛素的方法
CN104364260B (zh) 2012-04-11 2017-02-22 诺和诺德股份有限公司 胰岛素制剂
US9457096B2 (en) 2012-07-06 2016-10-04 Consejo Nacional De Investigaciones Cientificas Y Tecnicas (Concet) Protozoan variant-specific surface proteins (VSP) as carriers for oral drug delivery
CN108057154B (zh) 2012-07-12 2021-04-16 曼金德公司 干粉药物输送***和方法
US10159644B2 (en) 2012-10-26 2018-12-25 Mannkind Corporation Inhalable vaccine compositions and methods
JP6735561B2 (ja) 2012-12-03 2020-08-05 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーションＭｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ． Ｏ−グリコシル化カルボキシ末端部分（ｃｔｐ）ペプチド系のインスリンおよびインスリン類似体
CA2906817C (en) 2013-03-15 2022-01-18 Mannkind Corporation Microcrystalline diketopiperazine compositions and methods
US9925144B2 (en) 2013-07-18 2018-03-27 Mannkind Corporation Heat-stable dry powder pharmaceutical compositions and methods
JP2016530930A (ja) 2013-08-05 2016-10-06 マンカインド コーポレイション 通気装置及び方法
JP6822839B2 (ja) 2013-09-13 2021-01-27 ザ・スクリップス・リサーチ・インスティテュート 修飾された治療剤、及びその組成物
ES2676065T3 (es) 2013-10-07 2018-07-16 Novo Nordisk A/S Nuevo derivado de un análogo de la insulina
AU2014364589B2 (en) 2013-12-18 2020-02-27 The California Institute For Biomedical Research Modified therapeutic agents, stapled peptide lipid conjugates, and compositions thereof
US10307464B2 (en) 2014-03-28 2019-06-04 Mannkind Corporation Use of ultrarapid acting insulin
US10561806B2 (en) 2014-10-02 2020-02-18 Mannkind Corporation Mouthpiece cover for an inhaler
MA41116A (fr) 2014-12-01 2017-10-10 Ferring Bv Compositions d'inhibiteur de trans-signalisation par l'il-6 sélectif
PL3226888T3 (pl) 2014-12-01 2021-11-02 Ferring B.V. Podawanie selektywnego transsygnałowego inhibitora IL-6
US11286307B2 (en) 2015-12-11 2022-03-29 Takeda Pharmaceutical Company Limited Plasma kallikrein inhibitors and uses thereof for treating hereditary angioedema attack
WO2017180708A1 (en) * 2016-04-12 2017-10-19 Cell and Molecular Tissue Engineering, LLC Systems, methods and products for minimizing tissue reactions and tissue injury at an infusion site
US10918756B2 (en) * 2016-11-02 2021-02-16 Dow Global Technologies Llc Solid non-aqueous gel air odorizer
MA49116A (fr) 2016-12-16 2020-03-25 Novo Nordisk As Compositions pharmaceutiques contenant de l'insuline

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4839341A (en) * 1984-05-29 1989-06-13 Eli Lilly And Company Stabilized insulin formulations
US6427681B1 (en) * 1993-01-29 2002-08-06 Aradigm Corporation Method of use of monomeric insulin as a means for improving the reproducibility of inhaled insulin

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4654324A (en) 1981-08-27 1987-03-31 Eli Lilly And Company Human proinsulin pharmaceutical formulations
DOP1982004086A (es) 1981-08-27 1988-03-22 Lilly Co Eli Formula farmaceutica que comprende insulina humana y proinsulina humana
US4652548A (en) 1981-08-27 1987-03-24 Eli Lilly And Company Pharmaceutical formulations comprising human insulin, human C-peptide, and human proinsulin
US5342940A (en) * 1989-05-27 1994-08-30 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Polyethylene glycol derivatives, process for preparing the same
ATE136315T1 (de) 1989-05-27 1996-04-15 Sumitomo Pharma Verfahren für die herstellung von polyethylenglykolderivate und modifizierte proteine.
US5652214A (en) * 1989-06-05 1997-07-29 Cephalon, Inc. Treating disorders by application of insulin-like growth factors and analogs
US5766897A (en) * 1990-06-21 1998-06-16 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Cysteine-pegylated proteins
JP3051145B2 (ja) * 1990-08-28 2000-06-12 住友製薬株式会社 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド
US6565841B1 (en) 1991-03-15 2003-05-20 Amgen, Inc. Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
US5681811A (en) 1993-05-10 1997-10-28 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5359030A (en) 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5565215A (en) * 1993-07-23 1996-10-15 Massachusettes Institute Of Technology Biodegradable injectable particles for imaging
DE69533987T2 (de) * 1994-05-20 2006-03-16 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc., Tosu Protein oder polypeptid, verfahren zur seiner herstellung und entsprechende zwischenprodukte
US5730990A (en) * 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
US5874064A (en) * 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
DE19628143A1 (de) 1996-07-12 1998-01-15 Basf Ag Verfahren zur Herstellung einer wäßrigen Polymerisatdispersion
JP2001508783A (ja) 1997-01-29 2001-07-03 ポリマスク・ファーマシューティカルズ・パブリック・リミテッド・カンパニー Ｐｅｇ化法
ATE243711T1 (de) 1997-10-24 2003-07-15 Novo Nordisk As Aggregate von menschlichen insulinderivaten
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
EP1100522B1 (en) 1998-07-27 2016-12-07 Emisphere Technologies, Inc. Pulmonary delivery of active agents
EP1137431A1 (en) * 1998-12-04 2001-10-04 Provalis UK Limited Pharmaceutical compositions containing insulin
IL143962A0 (en) 1999-01-08 2002-04-21 Emisphere Tech Inc Polymeric delivery agents and delivery agent compounds
US6309633B1 (en) 1999-06-19 2001-10-30 Nobex Corporation Amphiphilic drug-oligomer conjugates with hydroyzable lipophile components and methods for making and using the same
US7169889B1 (en) * 1999-06-19 2007-01-30 Biocon Limited Insulin prodrugs hydrolyzable in vivo to yield peglylated insulin
US6323311B1 (en) * 1999-09-22 2001-11-27 University Of Utah Research Foundation Synthesis of insulin derivatives
WO2001068141A2 (en) 2000-03-17 2001-09-20 Maxygen Aps Dispersions of polypeptide conjugates
JP2004531550A (ja) * 2001-05-11 2004-10-14 アラダイム コーポレーション 吸入によって送達されるタンパク質の、分子性状の最適化方法および製剤
OA13136A (en) * 2001-05-21 2006-12-13 Nektar Therapeutics Pulmonary administration of chemically modified insulin.
US6828297B2 (en) 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of insulin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
ES2307779T3 (es) * 2001-08-16 2008-12-01 Baxter International Inc. Formulaciones de microparticulas a base de propelentes.

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4839341A (en) * 1984-05-29 1989-06-13 Eli Lilly And Company Stabilized insulin formulations
US6427681B1 (en) * 1993-01-29 2002-08-06 Aradigm Corporation Method of use of monomeric insulin as a means for improving the reproducibility of inhaled insulin

Also Published As

Publication number Publication date
WO2002094200A3 (en) 2003-02-20
BG108494A (en) 2004-07-30
EP1395294A2 (en) 2004-03-10
NO20035157D0 (no) 2003-11-20
OA13136A (en) 2006-12-13
KR20030097876A (ko) 2003-12-31
AP1763A (en) 2007-08-02
TR200400295T2 (tr) 2005-04-21
MXPA03010649A (es) 2005-10-05
US20030216542A1 (en) 2003-11-20
HRP20030949A2 (en) 2005-04-30
CN1314445C (zh) 2007-05-09
ZA200309085B (en) 2004-11-22
MA26185A1 (fr) 2004-07-01
ECSP034855A (es) 2004-03-23
HUP0400442A2 (hu) 2005-03-29
JP2004535401A (ja) 2004-11-25
CN1582171A (zh) 2005-02-16
EP1395294A4 (en) 2006-01-11
CN101045166A (zh) 2007-10-03
CO5540371A2 (es) 2005-07-29
LV13197B (en) 2004-10-20
IL158862A (en) 2008-07-08
AR033903A1 (es) 2004-01-07
MY137181A (en) 2009-01-30
CZ20033182A3 (cs) 2004-09-15
US20030118510A1 (en) 2003-06-26
AP2003002918A0 (en) 2003-12-31
US6890518B2 (en) 2005-05-10
US20050152848A1 (en) 2005-07-14
US6838076B2 (en) 2005-01-04
IL158862A0 (en) 2004-05-12
PL366911A1 (en) 2005-02-07
BR0209896A (pt) 2004-08-17
WO2002094200A2 (en) 2002-11-28
CA2447236A1 (en) 2002-11-28
YU98503A (sh) 2006-05-25
LT5153B (lt) 2004-08-25
SK15532003A3 (sk) 2004-06-08
GEP20063917B (en) 2006-09-11
EA200301222A1 (ru) 2004-08-26
IS7043A (is) 2003-11-19
LT2003107A (en) 2004-05-25
NZ529572A (en) 2006-02-24
AU2002303869B2 (en) 2007-08-16
TNSN03116A1 (en) 2005-12-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA007408B1 (ru) Легочное введение химически модифицированного инсулина
AU2002303869A1 (en) Pulmonary administration of chemically modified insulin
JP5721432B2 (ja) アミノ酸含有アルキレングリコール反復単位を含むアシル部を有するインスリン
EP2262539B1 (en) Insulin albumin conjugates
JP5688969B2 (ja) プロテアーゼに対して安定しているペグ化インスリンアナログ
ES2542146T3 (es) Insulinas extendidas PEGiladas.
EP2344200A2 (en) Modified therapeutics peptides, methods of their preparation and use
KR20050042013A (ko) 레티노산의 수용성 중합체 콘쥬게이트
EP2017288A1 (en) Protease stabilized, pegylated insulin analogues
KR20020032604A (ko) 폴리머 안정화 신경펩타이드
US20220152155A1 (en) Formulations for bovine granulocyte colony stimulating factor and variants thereof
JP2007524607A (ja) 凝固因子の吸入による血友病処置
JP2007524607A6 (ja) 凝固因子の吸入による血友病処置
WO2008084051A1 (en) Mixtures of pegylated insulin and fast acting insulin for pulmonary administration
RU2574667C2 (ru) Пролекарства, содержащие конъюгат инсулина и линкера

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU